ES2985965T3

ES2985965T3 - Plantas productoras de frutos sin semillas

Info

Publication number: ES2985965T3
Application number: ES17726583T
Authority: ES
Inventors: Alberto Sirizzotti; Richard Berentsen; Hendrik Vriezen
Original assignee: Nunhems BV
Current assignee: Nunhems BV
Priority date: 2016-05-26
Filing date: 2017-05-19
Publication date: 2024-11-08
Anticipated expiration: 2037-05-19
Also published as: US20190194672A1; BR112018074101A2; IL262975B; MA44031B1; ZA201808577B; CN109476715A; EA201892624A1; AU2017269647B2; EP3464333B1; WO2017202715A1; US20240018539A1; NZ748603A; EP3464333C0; KR20190008958A; US11761018B2; HRP20241072T1; RS65779B1; MA44031A1; CN109476715B; IL262975B2

Abstract

La presente invención se refiere a plantas productoras de frutos sin semillas. La presente invención también comprende métodos para la producción de dichas plantas y el uso de ácidos nucleicos que codifican proteínas similares a ciclina SDS para la producción de frutos sin semillas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Plantas productoras de frutos sin semillas

La presente invención está dirigida a plantas productoras de frutos sin semillas. La presente invención también comprende procedimientos para la producción de dichas plantas y el uso de ácidos nucleicos que codifican proteínas similares a la ciclina SDS para la producción de frutos sin semillas.

La mayoría de los frutos comerciales sin semillas se han desarrollado a partir de plantas cuyos frutos contienen normalmente numerosas semillas duras relativamente grandes distribuidas por la pulpa del fruto. Las frutas sin semillas son, por ejemplo, la sandía, el tomate, el pepino, la berenjena, la uva, el plátano y los cítricos, como la naranja, el limón y la lima. Como el consumo de frutas sin semillas suele ser más fácil y cómodo, se consideran valiosas.

El desarrollo del fruto comienza normalmente cuando uno o más óvulos del compartimento ovular de la flor son fecundados por núcleos espermáticos procedentes del polen.

Los frutos sin semillas pueden ser el resultado de dos fenómenos diferentes. En algunos casos, el fruto se desarrolla sin fecundación del óvulo por el polen, fenómeno conocido como partenocarpia. En otros casos, se producen frutos sin semillas tras la polinización cuando se inhibe el crecimiento de la semilla (embrión y/o endospermo) o la semilla muere prematuramente, mientras que el resto del fruto continúa creciendo (estenospermocarpia). A diferencia de la partenocarpia, la estenospermocarpia requiere polinización para iniciar el crecimiento del fruto.

Los frutos de naranja sin semillas son un ejemplo de partenocarpia. Algunas variedades de naranjas (por ejemplo, Navel) no producen polen viable. Sin embargo, pueden sufrir polinización cruzada con polen de otras variedades. Si en un huerto sólo se cultiva la variedad androestéril, no habrá polinización y se producirán frutos partenocárpicos sin semillas. La propagación de los naranjos respectivos suele realizarse por esquejes, seguidos de injertos en otro portainjertos.

Los plátanos sin semillas son triploides. Aunque la polinización en algunos casos puede ser normal y, la gran mayoría de los frutos no tiene semillas. Esto se explica por los conjuntos desiguales de cromosomas (3x) que conducen a una división incorrecta de los cromosomas durante la meiosis y, como consecuencia, a la producción de polen no viable. Sin fertilización, los plátanos triploides también son capaces de cuajar y desarrollar frutos sin semillas. Incluso cuando se produce la polinización, como mucho uno de cada trescientos frutos comprende unas pocas semillas. Esto puede deberse a que el polen triploide no es viable, por las razones explicadas. Por lo tanto, las plantas de plátano pueden considerarse en general partenocárpicas. Las plantas de plátano se suelen propagar asexualmente a partir de brotes laterales o chupones en la base del tallo principal, que pueden eliminarse y replantarse para continuar con el cultivar. Los cultivadores también propagan los plátanos mediante el cultivo de tejidos, sobre todo para producir material libre de enfermedades.

El pepino sin semillas, la calabaza sin semillas y la berenjena sin semillas son ejemplos de cultivos que pueden producir frutos sin semillas sin polinización (partenocarpia), por ejemplo, en condiciones en las que la polinización se ve dificultada (por ejemplo, bajas temperaturas). No obstante, se puede producir fruta de calidad comercial en estas condiciones.

Sin embargo, todos estos cultivos pueden producir frutos con semillas tras la polinización. Por lo tanto, estos cultivos son partenocárpicos facultativos. La propagación de los cultivos puede realizarse por autopolinización o polinización cruzada, propagaciónin vitroe injerto.

De los mutantes del tomate también es sabido que pueden producir frutos sin semillas en condiciones en las que la polinización/fertilización normal se ve afectada (por ejemplo, en circunstancias de baja temperatura). Por lo tanto, estos mutantes también son partenocárpicos facultativos. Los mutantes conocidos por mostrar este fenotipo sonpat, pat-2y elsistemapat-3/pat-4. Se desconocen los genes subyacentes a estas mutaciones y el sistemapat-3/pat-4parece depender de múltiples loci.

La partenocarpia también se ha introducido en varias especies vegetales mediante modificación genética. La expresión de una triptófano monooxigenasabacteriana(iaaM)que confiere síntesis de auxina bajo el control del promotorDefH9específico del óvulo y la placenta sí indujo la partenocarpia en pepinos (Yin et al., 2006, Clular & molecular Biotech. Letters 11, 279-290), berenjena (Acciarri et al., 2002, B<m>C Biotech. 2(4)), tomate (Rotino et al., 2005, BMC Biotech. 5(32)) y tabaco.

Estas plantas transgénicas demuestran la importancia de las hormonas vegetales en el desarrollo de semillas y frutos. Es bien sabido que el desarrollo de las semillas y los frutos, además de otros factores, está fuertemente controlado por varias hormonas vegetales. La partenocarpia, incluida la consecuencia lógica de la ausencia de semillas en el fruto, también puede inducirse, por ejemplo, mediante la aplicación exógena de hormonas vegetales, en particular auxina o giberelina (Ruan et al., Trends in Plant Sci. 17(11), 1360-1385).

Las sandías sin semillas producidas por obtentores son ejemplos de cultivos estenospermo-carpáceos. Las plantas normales de sandía son diploides (2n). Las sandías que producen frutos sin semillas son híbridos producidos por el cruce de una planta de sandía diploide masculina (2n) con una planta de sandía tetraploide femenina (4n). Las semillas híbridas F1 resultantes son triploides (3n). La inducción del cuajado en las plantas híbridas F1 requiere polinización. Como las plantas híbridas F1 triploides (3n) no producen polen fértil, es necesario plantar en el mismo campo las llamadas plantas polinizadoras o polinizadoras. Las plantas polinizadoras son diploides (2n). Por lo general, en un plan determinado debe plantarse una proporción de plantas polinizadoras por planta híbrida de aproximadamente 1 a 3 para proporcionar polen suficiente para polinizar todas las plantas híbridas F1. La polinización cruzada entre el polinizador diploide (2n) y las flores de la planta hembra híbrida triploide (3n) induce la fructificación y conduce a la producción de frutos triploides sin semillas en la planta híbrida triploide. Los parentales diploide (2n) y tetraploide (4n) del híbrido F1 producen frutos con semilla y pueden propagarse independientemente el uno del otro por autopolinización.

Las uvas sin semillas pueden producirse a partir de plantas partenocárpicas o estenospermocárpicas. La variedad Corinto Negro es partenocárpica, mientras que la Sultanina es estenospermocárpica. En general, las plantas de vid se reproducen por esquejes e injertos sucesivos en otro patrón.

Las irregularidades en la meiosis pueden ser un factor que lleve a las plantas a producir frutos sin semillas. En Zhang et al. (2012, Scientia Horticultura 140, 107-114) se da un ejemplo de plantas que producen frutos sin semillas, desvelando sandías sin semillas. Se obtuvo un mutante macho y hembra estéril (MFS) a partir de la progenie de un híbrido F1 tras irradiar sus semillas con rayos gamma. El polen del mutante MFS no era viable en absoluto. Las plantas MFS producen frutos sin semillas cuando se polinizan con polen de plantas macho fértiles. Por lo tanto, la planta de sandía MFS puede clasificarse como estenospermocárpica. Los óvulos también eran casi totalmente inviables, ya que casi no se produjeron semillas tras la polinización cruzada de mutantes MFS con polen de diferentes plantas fértiles masculinas. En el mutante MFS se observó una sinapsis incompleta y una separación anormal de las cromátidas durante la meiosis, y se vio que eran la causa de la esterilidad masculina y femenina. Los genes responsables de los efectos presentes en el mutante MFS no han sido identificados, pero parece probable que el fenotipo en el mutante MFS se deba a un único gen recesivo.

Pradillo et al. (2014, Frontiers in Plant Sci. 5, Article 23, do: 10.3389/fpls.2014.00023) revisa los conocimientos en la técnica sobre los genes que intervienen en la recombinación homóloga durante la meiosis enArabidospsis.

Azumi et al. (2002, EMBO J. 21(12), 3081-3095) describen el aislamiento de un mutante deArabidopsisque presenta defectos en la sinapsis y la formación de bivalentes en la meiosis masculina y defectos similares, aunque en menor medida, en la meiosis femenina. La mutación se denominó"Solo Dancers" (sds)y se demostró que procedía de un único gen recesivo. Los mutantes SDS son estériles en el sexo masculino y presentan un fuerte deterioro de la fertilidad femenina. Las plantas homocigóticas para la mutaciónsdsson androestériles pero, al menos en menor medida, fértiles en cuanto a las hembras, lo que se demostró mediante polinización cruzada de la planta mutantesdscon polen de plantas fértiles en cuanto a los machos. Por lo tanto, los mutantes SDS son estériles en cuanto a los machos y muy poco fértiles en cuanto a las hembras. Se identificó que el gensdspertenece a los genes que codifican proteínas de tipo ciclina y se ha demostrado que interactúa con las CDK deArabidopsis,las proteínas Cdc2a y Ccdc2b. Sin embargo, el SDS ha sido identificado como una nueva proteína de tipo ciclina desconocida hasta ahora. De Muyt et al. (2009, PLOS genet. 5(9) e1000654, doi: 10.1371/joumal.pgen. 1000654) confirma que el mutantesdsde Arabidopsis tiene un defecto de recombinación en la meiosis y sugiere que el defecto está causado por una mala asignación de otra proteína (AtDMC1) en las células durante la meiosis.

De la discusión anterior es evidente que los factores que determinan si las plantas producen frutos sin semillas son múltiples por naturaleza y pueden residir en varias causas, por ejemplo, morfológicas, fisiológicas y/o genéticas.

Para producir frutos sin semillas en cultivos estenospermocárpicos, una parte de flor femenina de una planta debe ser polinizada. Los cultivos estenospermocárpicos actuales son androestériles. En consecuencia, además de la planta hembra, debe cultivarse en el mismo campo otra planta macho fértil (polinizadora o polinizadora). Como la superficie utilizada para las plantas polinizadoras va en detrimento de la superficie disponible para las plantas femeninas productoras de frutos sin semillas, el rendimiento por superficie cultivada se reduce. En general, las plantas polinizadoras son plantas normales que también pueden autopolinizarse. Sin embargo, los frutos de las plantas polinizadoras producen semillas. En la sandía, las plantas polinizadoras son normalmente diploides (2n), que al autopolinizarse producen frutos con semillas, que en algunos casos también pueden cosecharse y venderse por separado (véase documento WO2012069539). Por razones comerciales, estos frutos con semillas de las plantas polinizadoras no deben mezclarse con los frutos sin semillas. Por lo tanto, hay que asegurarse de que los frutos sin semillas y los frutos con semillas se separen en el momento de la cosecha o después de ella, lo que puede dificultar o imposibilitar la cosecha a máquina o requerir una etapa de procesamiento adicional después de la cosecha. Estas precauciones adicionales aumentan los costes de los insumos en la producción de fruta sin semillas. Además, las plantas polinizadoras se desarrollan de modo que florezcan y produzcan suficiente polen viable al mismo tiempo que florece la planta femenina y su estigma puede aceptar polen para la inducción de la fructificación. Por lo tanto, la planta polinizadora tiene que coincidir con la planta hembra productora de frutos sin semillas en cuanto a floración y época de fecundación. Si el tiempo de floración del pantano polinizador y de la planta hembra respectiva no está suficientemente sincronizado, la polinización no tendrá lugar o sólo tendrá lugar en una cantidad insuficiente de casos. Como resultado, la planta femenina estenospermocárpica produce menos frutos. Además, es bien conocido en la técnica que las condiciones climáticas, como la lluvia, el calor, etc., pueden influir en la producción de polen de una planta polinizadora de forma diferente al tiempo de fertilidad del estigma de la planta femenina genotípicamente diferente. Por lo tanto, las condiciones climáticas también pueden provocar la asincronía del tiempo de fertilidad del polinizador y de la planta hembra, con el efecto de reducir el rendimiento.

Las desventajas respectivas no son aplicables a las plantas de la invención descritas en la presente invención a continuación.

Es, por tanto, un objeto de la invención superar las desventajas de las plantas productoras de frutos sin semillas que se cultivan actualmente.

En una población de plantas de sandía diploide M2 mutagenizadas se observó una planta que producía frutos sin semillas. La planta mutante se designó EMB1. Inesperadamente, el polen de dicha planta podría utilizarse para realizar retrocruzamientos. Por lo tanto, a diferencia de las plantas productoras de frutos sin semillas conocidas en el arte, las plantas desveladas en la presente memoria son fértiles masculinas. Los retrocruzamientos se autopolinizaron y el 25% de las plantas obtenidas de ellos produjeron frutos sin semillas. Se identificó un alelo mutante(embl) que causaba el fenotipo de fruto sin semillas, es decir, cuando las plantas diploides homocigóticas paraembl (emb1/emb1)se autopolinizaban o eran polinizadas por polen de otra planta, producían frutos diploides sin semillas. Por lo tanto, el fenotipo de fruto sin semilla se produce en plantas homocigóticas para una mutación recesiva en el aleloembl.La proteína de tipo salvaje codificada por el alelo de tipo salvaje correspondiente al alelo mutanteemblde la invención tiene algunas similitudes, pero también diferencias significativas con las proteínas ciclina SDS y, por lo tanto, se designó "proteína similar a ciclina SDS". La identidad de secuencia entre la proteína ciclina SDS y sus secuencias de ácido nucleico codificantes conocidas en la técnica y las secuencias respectivas de las proteínas similares a la ciclina SDS desveladas en la presente memoria es baja. Con respecto al efecto fenotípico en las plantas, las plantas conocidas en la técnica, que tienen una mutación en una proteína ciclina SDS, tienen un fenotipo estéril masculino, mientras que las plantas desveladas en la presente memoria, que tienen una mutación en una proteína similar a la ciclina SDS, son fértiles masculinas.

Una primera realización de la presente invención se refiere a células vegetales, partes de plantas y plantas, caracterizadas en que las células vegetales o plantas tienen una actividad disminuida de una proteína similar a la ciclina SDS en comparación con las células vegetales y plantas que comprenden una proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre funcional, como se establece en las reivindicaciones anexas.

En el contexto de la presente invención, se entenderá por "proteína similar a la ciclina SDS" una proteína que, cuando su actividad está disminuida o su expresión está totalmente eliminada en una planta, conduce (por ejemplo, en una planta homocigótica para una secuencia nucleotídica mutante que codifica una proteína similar a la ciclina SDS) a la producción de polen fértil masculino por esa planta, pero al mismo tiempo conduce a la producción de frutos sin semillas de dicha planta, cuando se autopoliniza.

En el contexto de la presente invención, "actividad disminuida" de una proteína significará una disminución de la actividad de una proteína similar a la ciclina SDS en comparación con una célula vegetal de tipo silvestre correspondiente o una planta de tipo silvestre correspondiente. La disminución comprenderá en un aspecto un knockout completo de la expresión génica, o la producción de una pérdida de función o de una proteína similar a la ciclina SDS de función disminuida, por ejemplo, una proteína similar a la ciclina SDS truncada puede tener pérdida de función o función disminuida. Una disminución de la actividad puede ser una disminución de la expresión de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS (también denominada knock-down), o un knock-out de la expresión de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS y/o una disminución de la cantidad de una proteína similar a la ciclina SDS en las células o una disminución de la función o pérdida de la función en la actividad enzimática de una proteína similar a la ciclina SDS en las células.

Por "knock-out" o "knock-out completo" se entenderá que la expresión del gen respectivo ya no es detectable.

"Pérdida de función (en la actividad enzimática)" significará en el contexto de la presente invención que la proteína, aunque presente en cantidades iguales o similares a una proteína de tipo silvestre correspondiente, ya no evoca su efecto, es decir, los alelos mutantes cuando están presentes en forma homocigótica en una planta diploide, la planta es fértil masculina pero sólo produce frutos sin semillas tras la polinización. Los términos "no funcional" y "pérdida de actividad" tendrán el mismo significado que "pérdida de función". Los tres términos se utilizan indistintamente en la presente memoria. Por lo tanto, cuando se hace referencia a un gen similar a la ciclina SDS que codifica una proteína no funcional, el gen puede expresarse, pero la proteína codificada no es funcional, por ejemplo, debido a que la proteína está truncada o comprende una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos en comparación con la proteína similar a la ciclina SDS silvestre.

"Disminución de la función (en la actividad enzimática)" o "función reducida" significará en el contexto de la presente invención que la proteína, aunque esté presente en cantidades iguales o similares a una proteína de tipo silvestre correspondiente, ya no evoca su efecto, es decir, cuando está presente en forma homocigótica en una planta diploide, la planta es fértil masculina pero sólo produce frutos sin semillas tras la polinización.

"Dominio conservado" se refiere a dominios proteicos conservados, como los dominios Cyclin_N (pfam00134) y Cyclin_C (pfam02984). Estos dominios pueden encontrarse, por ejemplo, en la Base de Datos de Dominios Conservados del NCBI (world wide web en ncbi.nlm.nih.gov/cdd).

"Generación M1" o "plantas M1" en el contexto de la presente invención se referirá a la primera generación que se produce directamente a partir del tratamiento mutagénico. Una planta cultivada a partir de semillas tratadas con un mutágeno, por ejemplo, es representativa de una generación M1.

"Generación M2" o "planta M2" se referirá en la presente memoria a la generación obtenida de la autopolinización de la generación M1. Una planta cultivada a partir de semillas obtenidas de una planta M1 autógama representa una planta M2.

La disminución de la expresión puede, por ejemplo, determinarse midiendo la cantidad de transcritos de ARN que codifican proteínas similares a la ciclina SDS, por ejemplo, mediante análisis Northern blot o RT-PCR. En este caso, una reducción significa preferentemente una reducción de la cantidad de transcritos en al menos un 50%, en particular en al menos un 70%, preferentemente en al menos un 85% y particularmente preferentemente en al menos un 95%.

La disminución de la cantidad de una proteína similar a la ciclina SDS, que se traduce en una actividad reducida de estas proteínas en las células vegetales o plantas en cuestión, puede determinarse, por ejemplo, mediante procedimientos inmunológicos como el análisis Western blot, ELISA (Ensayo por Inmunoabsorción ligado a Enzimas) o RIA (Ensayo Radioinmune). Aquí, una disminución significa preferentemente una reducción de la cantidad de proteínas similares a la ciclina SDS en al menos un 50%, en particular en al menos un 70%, preferentemente en al menos un 85% y particularmente preferentemente en al menos un 95%.

Los procedimientos para la fabricación de anticuerpos que reaccionan específicamente con una proteína designada, es decir, que se unen específicamente a dicha proteína, son conocidos por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, Lottspeich and Zorbas (Eds.), 1998, Bioanalytik, Spektrum akad, Verlag, Heidelberg, Berlin, ISBN 3-8274 0041-4). Varias empresas ofrecen la fabricación de estos anticuerpos como servicio contractual.

Con respecto a la presente invención, una disminución de la actividad de una proteína similar a la ciclina SDS en una planta de acuerdo con la invención también puede determinarse por el fenotipo de la planta. Las plantas homocigotas para un alelo mutante que codifica la proteína similar a la ciclina SDS o que tiene una actividad disminuida de una proteína similar a la ciclina SDS, producen frutos sin semillas y son fértiles masculinas (producen polen viable).

En una realización, la actividad disminuida de una proteína que tiene una función similar a la ciclina SDS está disminuida en las células vegetales o plantas de acuerdo con la invención en comparación con las correspondientes células vegetales de tipo silvestre o plantas de tipo silvestre.

En el contexto de la presente invención, el término "célula vegetal de tipo silvestre" o "planta de tipo silvestre" significa que las células vegetales o plantas en cuestión se utilizaron como material de partida para la producción de las células vegetales o plantas de acuerdo con la invención, es decir, su información genética, aparte de la(s) modificación(es) o mutación(es) (genética(s)) introducida(s), corresponde a la de una célula vegetal o planta de acuerdo con la invención. En un aspecto, la planta de tipo silvestre o célula vegetal de tipo silvestre es una planta que comprende una proteína similar a la ciclina SDS completamente funcional, por ejemplo, en lo que respecta a las plantas o células vegetales de sandía, una planta de sandía diploide que produce la proteína de SEQ ID NÚM.: 2 y que produce frutos con semillas tras la autopolinización. O con respecto a las plantas de melón, pepino, tomate o pimiento, que se describen en la presente memoria pero no están de acuerdo con la invención, tales como plantas o células de melón una planta diploide de melón que produce la proteína de SEQ ID NÚM.: 6, o con respecto a las plantas o células de pepino una planta diploide de pepino que produce la proteína de SEQ ID NÚM.: 12, o con respecto a las plantas o células de tomate una planta diploide de tomate que produce la proteína de SEQ ID NÚM.: 19, o con respecto a las plantas o células de pimiento una planta diploide que produce la proteína de SEQ ID NÚM.: 20.

En relación con la presente invención, el término "correspondiente" significa que, en la comparación de varios objetos, los objetos en cuestión que se comparan entre sí se han mantenido en las mismas condiciones. En relación con la presente invención, el término "correspondiente" junto con célula vegetal de tipo silvestre o planta de tipo silvestre significa que las células vegetales o plantas, que se comparan entre sí, se han criado en las mismas condiciones de cultivo, que tienen la misma edad (de cultivo) y que su información genética, aparte de la(s) modificación(es) o mutación(es) (genética(s)) introducida(s), corresponde a la de una célula vegetal o planta de acuerdo con la invención. En caso de que las secuencias de ácido nucleico de las moléculas de ARN y ADN se comparen entre sí o se diga que se corresponden entre sí, es bien sabido en la técnica que una timina (T) en una molécula de ADN es equivalente a una uridina (U) en una molécula de ARN. Así, una T en una secuencia de ADN debe entenderse sustituida por una U en una secuencia de ARN yviceversa,cuando dichas moléculas se comparan entre sí.

Preferentemente en las realizaciones de acuerdo con la invención, la proteína similar a la ciclina SDS de una célula vegetal de tipo silvestre, parte de planta o planta de tipo silvestre está codificada por moléculas de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en:

a) moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NÚM.: 2 (proteína similar a la ciclina SDS de la sandía) o con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NÚM.: 6 (proteína similar a la ciclina SDS del melón) o SEQ ID NÚM.: 12 (proteína similar a la ciclina SDS del pepino) o SEQ ID NÚM.: 19 (proteína similar aSolanum lycopersicumciclina SDS) o SEQ ID NÚM.: 20(proteína similar aCapsicum annuumciclina SDS), pero que no está de acuerdo con invención;

b) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína cuya secuencia tiene una identidad de al menos el 60%, preferentemente de al menos el 70%, más preferentemente de al menos el 80%, aún más preferentemente de al menos el 90%, o particularmente preferentemente de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NÚM.: 2 o con la secuencia indicada en SEQ ID NÚM.: 6 o SEQ ID NÚM.: 12 o SEQ ID NÚM.: 19 o SEQ ID NÚM.: 20, pero que no está de acuerdo con invención;

c) moléculas de ácido nucleico, que comprenden la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NÚM.: 1 o una secuencia complementaria de la misma;

d) moléculas de ácido nucleico que tienen una identidad de al menos el 70%, más preferentemente de al menos el 80%, aún más preferentemente de al menos el 90% o particularmente preferentemente de al menos el 95% con las secuencias de nucleótidos descritas en c);

e) moléculas de ácido nucleico, que hibridan con al menos una cadena de las moléculas de ácido nucleico descritas en a) o c) en condiciones estrictas;

f) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos se desvía de la secuencia de las moléculas de ácido nucleico identificadas en a) o b) debido a la degeneración del código genético; y

g) moléculas de ácido nucleico, que representan fragmentos, variantes alélicas y/o derivados de las moléculas de ácido nucleico identificadas en a), b), c) o d).

La secuencia genómica de nucleótidos mostrada bajo SEQ ID NÚM.: 1, y la secuencia codificante como se indica en SEQ ID NÚM.: 1, codifica una proteína similar a la ciclina SDS de tipo salvaje deCitrullus lanatus(sandía) que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra bajo SEQ ID NÚM.: 2. La SEQ ID NÚM.: 5, que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con invención, muestra la secuencia codificante que codifica una proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre deCucumis melo(melón) que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NÚM.: 6. SEQ ID NÚM.: 12, que se describe en la presente memoria, pero que no está de acuerdo con la invención, muestra la ciclina de tipo salvaje SDS como la proteína deCucumis sativus(pepino). SEQ ID NÚM.: 19, que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con la invención, muestra la ciclina de tipo silvestre SDS como proteína de Solanum lycopsersicum (tomate). SEQ ID NÚM.: 20, que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con la invención, muestra la ciclina de tipo silvestre SDS como proteína de Capsicum annuum (pimiento).

Las células vegetales, partes de plantas o plantas descritas en la presente memoria pueden ser células vegetales de cualquier especie o plantas de cualquier especie. Las células vegetales descritas en la presente memoria pueden ser células vegetales monocotiledóneas y dicotiledóneas, las plantas descritas en la presente memoria pueden ser plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Preferentemente, las células vegetales descritas en la presente memoria son células vegetales de hortalizas (células vegetales de hortalizas) o las plantas son plantas vegetales, en particular hortalizas como tomate, cebolla, puerro, ajo, zanahorias, pimiento, espárrago, alcachofa, apio, pepino, melón, calabaza, calabacín, lechuga, sandía, espinaca, col(Brassica olerácea),ensalada de maíz, berenjena y okra. Más preferentes son las células vegetales descritas en la presente memoria que proceden de hortalizas (células vegetales vegetales) o de plantas vegetales de la familia delas Cucurbitáceaso de la familia delas Solanáceas.Las células vegetales y plantas más preferentes descritas en la presente memoria comprenden lacalabaza(Cucurbita pepo, Cucurbtita maxima, Cucurbita moschata, Lagenaria siceraria),el melón(Cucumis melo),el pepino(Cucumis sativus),la sandía(Citrullus lanatus),tomate(Solanum lycopersicum)o pimiento(Capsicum annuum)células vegetales o plantas, en particular se prefieren células vegetales de sandía(Citrullus lanatus)o plantas de sandía(Citrullus lanatus),tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas. En una realización, las plantas y las células vegetales son plantas cultivadas de estas especies, como líneas endocriadas o variedades con buenas características agronómicas, especialmente que produzcan productos para comercialización (por ejemplo, frutos) de buena calidad y uniformidad.

Otra realización de la presente invención se refiere a plantas y partes de plantas que comprenden células vegetales de acuerdo con la invención, tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas.

Otra realización de la presente invención es una célula vegetal o planta, como se establece en las reivindicaciones anexas, caracterizada porque la célula vegetal o planta tiene una actividad disminuida de una proteína similar a la ciclina SDS en comparación con una célula vegetal de tipo silvestre o planta de tipo silvestre correspondiente, en la que la proteína similar a la ciclina SDS de una célula vegetal de tipo silvestre o planta de tipo silvestre correspondiente está codificada por moléculas de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en

a) Moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NÚM.: 2 (proteína similar a la ciclina SDS de la sandía) o una proteína con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NÚM.: 6 (proteína similar a la ciclina SDS del melón) o SEQ ID NÚM.: 12 (proteína similar a la ciclina SDS del pepino) o SEQ ID NÚM.: 19 (proteína similar a la ciclina SDS de Solanum lycopersicum) o SEQ ID NÚM.: 20 (proteína similar a la ciclina SDS de Capsicum annuum), pero que no están de acuerdo con la invención;

b) Moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína cuya secuencia tiene una identidad de al menos el 60%, preferentemente de al menos el 70%, más preferentemente de al menos el 80%, aún más preferentemente de al menos el 90% o particularmente preferentemente de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NÚM.: 2 o con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NÚM.: 6 o SEQ ID NÚM.: 12 o SEQ ID NÚM.: 19 o SEQ ID NÚM.: 20 pero que no están de acuerdo con la invención;

d) Moléculas de ácido nucleico, que tienen una identidad de al menos el 70%, más preferentemente al menos el 80%, aún más preferentemente al menos el 90% o particularmente preferentemente al menos el 95% con las secuencias de nucleótidos descritas en c);

e) Moléculas de ácido nucleico, que hibridan con al menos una hebra de las moléculas de ácido nucleico descritas en a), b), c), o d) en condiciones estrictas de al menos un lavado en 0,2X SSC a una temperatura de al menos 50°C durante 20 min;

f) Moléculas de ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos se desvía de la secuencia de las moléculas de ácido nucleico identificadas en a) o b) debido a la degeneración del código genético.

La "identidad de secuencia" y la "similitud de secuencia" pueden determinarse mediante la alineación de dos secuencias peptídicas o nucleotídicas utilizando algoritmos de alineación global o local. Las secuencias pueden considerarse "sustancialmente idénticas" o "esencialmente similares" cuando se alinean de forma óptima, por ejemplo, con los programas GAP o BESTFIT o con el programa "Needle" de Emboss (utilizando los parámetros por defecto, véase más adelante) y comparten al menos un determinado porcentaje mínimo de identidad de secuencia (como se define más adelante). Estos programas utilizan el algoritmo de alineación global de Needleman and Wunsch para alinear dos secuencias en toda su longitud, maximizando el número de coincidencias y minimizando el número de huecos. En general, se utilizan los parámetros por defecto, con una penalización de creación de hueco = 10 y una penalización de extensión de hueco = 0,5 (tanto para alineaciones de nucleótidos como de proteínas). Para los nucleótidos la matriz de puntuación por defecto utilizada es DNAFULL y para las proteínas la matriz de puntuación por defecto es Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 10915-10919). Las alineaciones de secuencias y las puntuaciones de los porcentajes de identidad de secuencia pueden determinarse, por ejemplo, utilizando programas informáticos, tales como EMBOSS, disponible en la web ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/). Como alternativa, la similitud o identidad de secuencias similar puede determinarse mediante búsquedas en bases de datos (por ej., EMBL GenBank) por el uso de algoritmos comúnmente conocidos y formatos de salida tales como FASTA, BLAST, etc., pero las coincidencias deben recuperarse y alinearse por pares para comparar la identidad de secuencias. Dos proteínas o dos dominios de proteínas, o dos secuencias de ácidos nucleicos tienen una "identidad de secuencia sustancial" si el porcentaje de identidad de secuencia es al menos del 58 %, del 60 %, del 70 %, del 80 %, del 90 %, del 95%, del 98%, del 99% o más (determinado por "Needle" de Emboss utilizando parámetros por defecto, es decir, penalización por creación de hueco = 10, penalización por extensión de hueco = 0,5, utilizando la matriz de puntuación DNAFULL para ácidos nucleicos y Blosum62 para proteínas). Dichas secuencias también se denominan aquí "variantes" o "variantes alélicas" o "derivados". Pueden identificarse otras variantes alélicas de los genes/alelos codificantes de la proteína similar a la ciclina SDS y de las proteínas similares a la ciclina SDS distintas de las secuencias específicas de ácido nucleico y proteína desveladas en la presente memoria. Por lo tanto, por ejemplo, las proteínas similares a la ciclina SDS que tienen una identidad de secuencia sustancial con la proteína de SEQ ID NÚM.: 2, o a la proteína de SEQ ID Nú M.: 6, o a la proteína de SEQ ID NÚM.: 12, o a la proteína de SEQ ID NÚM.: 18, o a la proteína de SEQ ID NÚM.: 19 son variantes de la proteína proporcionada.

Pueden existir variantes alélicas en otras células o plantas vegetales cultivadas, en particular hortalizas como el tomate, la cebolla, el puerro, el ajo, la zanahoria, el pimiento, el espárrago, la alcachofa, la calabaza, el calabacín, el apio nabo, el pepino, el melón, la lechuga, la sandía, la espinaca, las especies de col(Brassica),la ensalada de maíz y el quimbombó. Las mutaciones en dichas variantes alélicas del gen que codifica la proteína similar a la ciclina SDS tienen el mismo efecto sobre la fertilidad masculina y femenina y la producción de frutos sin semillas en otras plantas hortícolas. En particular, pueden existir variantes alélicas de un gen similar a la ciclina SDS en células vegetales o plantas de la familiaCucurbitaceae, como melón(Cucumis melo), pepino(Cucumis sativus),sandía(Citrullus lanatus),calabaza(Cucurbita pepo, Cucurbtita maxima, Cucurbita moschata, Lagenaria siceraria),pueden existir variantes alélicas preferentes particulares de un gen similar a la ciclina SDS en células vegetales de sandía(Citrullus lanatus), melón (Cucumis melo)o pepino(Cucumis sativus) o plantas de sandía(Citrullus lanatus)o melón(Cucumis melo)o pepino(Cucumis sativus).Además, también pueden existir variantes alélicas de un gen similar a la ciclina SDS en células vegetales o plantas de la familia de las solanáceas, como el tomate (Solanum lycopersicum) o parientes silvestres del tomate (S. pimpinelli, S. cheesmaniae, S. galapagense, S. pimpinellifolium, S. chmielewskii, S.

habrochaites, S. neorickii y S. pennelli, S. arcanum, S. chilense, S. comeliomulleri, S. huaylasense y S. peruvianum), pimiento (Capsicum annuum), Solanum melongena (berenjena), Solanum tuberosum (patata), etc.

También pueden existir variantes alélicas en otras plantas cultivadas, como los cultivos archivados (por ejemplo, las especies Brassica, el maíz, el arroz, la soja, el trigo, la cebada, el algodón, el tabaco, el café, etc.) o los cultivos frutales (por ejemplo, la uva, la manzana, la ciruela, los cítricos, la fresa, etc.).

Se observa que las proteínas similares a la ciclina SDS de las Cucurbitáceas tienen una alta identidad de secuencia entre sí (al menos 70% para las secuencias proporcionadas) y las proteínas similares a la ciclina SDS de las Solanáceas también tienen una alta identidad de secuencia entre sí. Por otra parte, la identidad de secuencia entre las secuencias de Cucurbitaceae y Solanaceae no es alta (40% o menos), véase la Tabla A a continuación.

Tabla A - Identidad de secuencias de proteínas similares a la ciclina SDS (alineación por pares mediante Needleman and Wunsch)

Las "condiciones estrictas de hibridación" pueden utilizarse para identificar secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas a una secuencia de nucleótidos determinada. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán distintas en circunstancias diferentes. Por lo general, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C inferiores al punto de fusión térmica (Tf) para las secuencias específicas a una fuerza iónica y un pH definidos. La Tm es la temperatura (con una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50 % de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente adaptada. Generalmente, se elegirán condiciones rigurosas en las que la concentración de sal sea de aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y la temperatura sea de al menos 60 °C. La reducción de la concentración de sal y/o el aumento de la temperatura aumentan la rigurosidad. Las condiciones rigurosas para las hibridaciones de ARN-ADN (transferencias Northern utilizando una sonda, por ejemplo, de 100 nt) son, por ejemplo, las que incluyen al menos un lavado en 0,2X SSC a 63 °C durante 20 minutos o condiciones equivalentes. Las condiciones rigurosas para la hibridación de ADN-ADN (transferencias Southern utilizando una sonda, por ejemplo, de 100 nt) son, por ejemplo, las que incluyen al menos un lavado (normalmente 2) en 0,2X SSC a una temperatura de al menos 50 °C, de modo habitual aproximadamente 55 °C, durante 20 min o condiciones equivalentes. Véase también Sambrook et al. (1989) y Sambrook and Russell (2001).

Una disminución de la actividad de una proteína similar a la ciclina SDS en células vegetales o plantas de acuerdo con la invención también puede lograrse por un efecto de silenciamiento génico.

En otra realización de la invención, la disminución de la actividad de una proteína similar a la ciclina SDS en células vegetales o plantas de acuerdo con la invención está causada por un efecto de silenciamiento génico.

Las células vegetales de acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con la invención que tienen una actividad disminuida de una proteína similar a la ciclina SDS pueden producirse por diferentes procedimientos que causan un efecto de silenciamiento génico conocido por el experto en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, la expresión de un ARN antisentido correspondiente o de una construcción de ARN de doble cadena (tecnología ARNi), el suministro de moléculas de ácido nucleico o vectores, que imparten un efecto de co-supresión, la expresión de una ribozima construida correspondientemente que divide transcritos específicos, que codifican una proteína similar a la ciclina SDS.

La disminución de la actividad de la proteína similar a la ciclina SDS en células vegetales y plantas de acuerdo con la invención puede producirse expresando una secuencia antisentido en las células vegetales o plantas respectivas.

La disminución de la actividad de la proteína similar a la ciclina SDS en células vegetales y plantas de acuerdo con la invención puede producirse mediante la expresión simultánea de moléculas de ARN en sentido y antisentido (tecnología de ARNi) del gen diana respectivo a reprimir, preferentemente del gen o alelo codificador de la proteína similar a la ciclina SDS.

Además de esto, se sabe queen plantala formación de moléculas de ARN de doble cadena de secuencias promotoras puede conducirin transa la metilación e inactivación transcripcional de copias homólogas de este promotor (Mette et al., EMBO J. 19, (2000), 5194-5201). La disminución de la actividad de la proteína similar a la ciclina SDS en células vegetales y plantas de acuerdo con la invención puede producirse mediante la expresión simultánea de moléculas de ARN sentido y antisentido (tecnología ARNi) de secuencias promotoras que inician la transcripción del gen diana respectivo que debe reprimirse, preferentemente del gen o alelo que codifica la proteína similar a la ciclina SDS.

Las ribozimas también se han descrito en la técnica para disminuir la expresión de proteínas escindiendo moléculas de ARN que codifican el gen diana.

Más adelante se tratarán las respectivas tecnologías de silenciamiento génico conocidas por un experto en la técnica, que son aplicables a las células vegetales o plantas de acuerdo con la invención.

"Efecto de silenciamiento génico" se refiere a una regulación a la baja o inhibición completa de la expresión génica del gen o familia de genes diana. Las células vegetales o plantas silenciadas producen cantidades inferiores de transcritos traducibles (incluido el ARNm) para un gen o alelo diana respectivo, en comparación con las células vegetales de tipo silvestre correspondientes o las plantas de tipo silvestre correspondientes. La menor cantidad de transcritos traducibles (incluido el ARNm) puede deberse a la degradación selectiva de los respectivos transcritos.

Se entenderá por "gen o alelo diana" el gen o alelo o familia de genes (o uno o más alelos específicos del gen) que debe modularse para conferir a un organismo (por ejemplo, una célula vegetal o una planta) la producción de un fenotipo deseado. Con respecto a las plantas productoras de frutos sin semillas androestériles, por ejemplo, (a) gen(es) diana o (a) alelo(s) diana es(son) el(los) gen(es) que codifica(n) la proteína de la línea ciclina SDS.

En otra realización de la invención, la disminución de la actividad de una proteína similar a la ciclina SDS en células vegetales o plantas de acuerdo con la invención está causada por procedimientos de inmunomodulación.

Otra forma posible de reducir la actividad enzimática de las proteínas en células vegetales o plantas es el denominado procedimiento de inmunomodulación. Es sabido que la expresiónin plantade anticuerpos que reconocen específicamente una proteína vegetal provoca una disminución de la actividad de las proteínas en cuestión. A continuación, se describen las respectivas tecnologías conocidas por los expertos en la técnica.

Otra realización de la invención, son células vegetales o plantas, como se establece en las reivindicaciones anexas, caracterizadas porque comprenden un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS. El alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS puede estar presente en estado homocigoto o heterocigoto. En un aspecto, el alelo mutante codifica una proteína similar a la ciclina SDS que tiene función disminuida o pérdida de función de la proteína mutante codificada. El alelo mutante puede codificar una proteína con uno o más aminoácidos sustituidos, insertados o eliminados, lo que da lugar a una proteína con función disminuida o pérdida de función en comparación con la proteína de tipo silvestre (funcional). En un aspecto, el alelo mutante resulta en la producción de una proteína truncada similar a la ciclina SDS, cuya proteína truncada tiene función disminuida o pérdida de función. En otro aspecto, el alelo mutante codifica una proteína con uno o más aminoácidos sustituidos, insertados o eliminados en un dominio conservado de la proteína similar a la ciclina SDS, como el dominio ciclina_N (pfam00134) o el dominio ciclina C (pfam02984). El dominio Cyclin_N y el dominio Cyclin_C de una proteína pueden ser identificados por el experto, por ejemplo, mediante un BLASt proteína contra proteína en el sitio web del NCBI (world wide web en blast.ncbi.nlm.nih.gov) o buscando en la Base de Datos de Dominios Conservados del NCBI (world wide web en ncbi.nlm.nih.gov/cdd).

En la SEQ ID NÚM.: 2 el dominio Cyclin_N va del aminoácido 388 al aminoácido 463 y el dominio Cyclin_C va del aminoácido 466 al 531.

Un BLAST proteína a proteína proporciona los dominios Cyclin N y Cyclin_C de la consulta de búsqueda utilizada, incluyendo la alineación de la secuencia consultada con el dominio. Cabe señalar que "de" un determinado número "a" otro número incluye los puntos finales, es decir, incluye el primer y el último número mencionados. Por lo tanto, para cualquiera de las secuencias de proteínas proporcionadas en la presente memoria, o para otras secuencias variantes (por ejemplo, proteínas que comprenden al menos un 70%, 80%, 90%, 95% o más de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de proteínas proporcionadas en la presente memoria, por ejemplo, SEQ ID NÚM.: 2, 6, 12, 19 o 20) se pueden determinar los dominios Cyclin_N y Cyclin_C.

En SEQ ID NÚM.: 6 el dominio Cyclin_N va del aminoácido 351 al aminoácido 481 y el dominio Cyclin_C va del aminoácido 486 al aminoácido 577.

En la SEQ ID NÚM.: 12 el dominio Cyclin_N va del aminoácido 343 al aminoácido 473 y el dominio Cyclin_C va del aminoácido 478 al aminoácido 569.

En la SEQ ID NÚM.: 19 el dominio Cyclin_N va del aminoácido 362 al aminoácido 494 y el dominio Cyclin_C va del aminoácido 499 al 584.

En la SEQ ID NÚM.: 20 el dominio Cyclin_N va del aminoácido 332 al aminoácido 464 y el dominio Cyclin_C va del aminoácido 469 al 554.

Las plantas en las que el alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS está presente en un estado heterocigoto, producirán semillas y serán fértiles masculinas. Por lo tanto, esas plantas pueden utilizarse para introducir el alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS en otras plantas o pueden utilizarse para introducir otros rasgos en la planta en la que está presente el alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS. Estas plantas también pueden utilizarse para propagar plantas que comprendan un alelo mutante de un gen codificador similar a SDS de la ciclina. El 50% de la descendencia autopolinizada en cada caso seguirá portando el alelo mutante de un gen codificador de la proteína similar a la ciclina SDS en estado heterocigótico. Por lo tanto, las plantas en las que está presente el alelo mutante de un gen que codifica la proteína similar a la ciclina SDS son útiles, por ejemplo, en la cría.

Por lo tanto, una realización de la invención se refiere a células vegetales o plantas de acuerdo con la invención, como se establece en las reivindicaciones anexas, que son heterocigotas para un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS.

En una realización preferente de la invención, la actividad disminuida de una proteína similar a la ciclina SDS en células vegetales o plantas de acuerdo con la invención, como se establece en las reivindicaciones anexas, se debe o es causada por o es el efecto de un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS presente en células vegetales o plantas, respectivamente.

En un aspecto, las células vegetales o plantas de acuerdo con la invención, como se establece en las reivindicaciones anexas, son homocigóticas para el alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS que codifica una disminución de función de una proteína similar a la ciclina SDS o una pérdida de función de una proteína similar a la ciclina SDS. Las plantas de acuerdo con la invención que son homocigóticas para un alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS producen frutos sin semillas tras la polinización con polen propio o polen obtenido de una planta diferente (por ejemplo, de una planta de tipo silvestre).

Por lo tanto, otra realización de la invención se refiere a células vegetales o plantas de acuerdo con la invención, como se establece en las reivindicaciones anexas, que son homocigotas para un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS.

Un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS hace que una planta sea fértil masculina, pero produzca frutos sin semillas, cuando la planta es homocigota para el alelo mutante. Con respecto a las realizaciones de la invención, la mutación en el alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS puede ser cualquier mutación, incluidas deleciones, truncamientos, inserciones, mutaciones puntuales, mutaciones sin sentido, mutaciones con sentido erróneo o no sinónimas, mutaciones de sitio de empalme, mutaciones de cambio de marco y/o mutaciones en secuencias reguladoras. Preferentemente, la mutación en el alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS es una mutación puntual y/o una mutación de sitio de empalme. La mutación puede producirse en una secuencia de ADN que comprende la secuencia codificante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS o en una secuencia de ARN que codifica una proteína similar a la ciclina SDS o puede producirse en el aminoácido de una proteína similar a la ciclina SDS. Con respecto a una secuencia de ADN de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS, la mutación puede producirse en la secuencia codificante (cds, compuesta por los exones) o en secuencias no codificantes como las regiones no traducidas 5'- y 3'-, intrones, promotores, potenciadores, etc. de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS. Con respecto al ARN que codifica una proteína similar a la ciclina SDS, la mutación puede producirse en el pre-ARNm o en el ARNm. En un aspecto, el alelo mutante da lugar a que la proteína tenga una pérdida de función o una disminución de la función debido a que uno o más aminoácidos se sustituyen, insertan y/o eliminan, por ejemplo, dando lugar a que uno o más aminoácidos se sustituyan, inserten o eliminen en el dominio conservado Cyclin_N y/o Cyclin_C. Por ejemplo, el truncamiento de la proteína para causar la deleción del dominio Ciclina _C, o parte del mismo, o el dominio Ciclina_N y el dominio Ciclina_C o parte del dominio Ciclina N y el dominio Ciclina_C dará lugar a una pérdida de función o disminución de la función de la proteína.

Por lo tanto, otra realización de la invención se refiere a células vegetales o plantas de acuerdo con la invención, como se establece en las reivindicaciones anexas, que comprenden un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS caracterizado porque el alelo mutante comprende o efectúa una o más de las mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en

a) una deleción, truncamiento, inserción, mutación puntual, mutación no sentido, mutación sin sentido o no sinónima, mutación de sitio de empalme, mutación de desplazamiento de marco en la secuencia genómica;

b) una mutación en una o más secuencias reguladoras;

c) una deleción, truncamiento, inserción, mutación puntual, mutación sin sentido, mutación sin sentido o no sinónima, mutación de sitio de empalme, mutación de desplazamiento de marco en la secuencia codificante;

d) una deleción, truncamiento, inserción, mutación puntual, mutación sin sentido, mutación sin sentido o no sinónima, mutación de sitio de empalme, mutación de desplazamiento de marco en el ARNpre-m o ARNm; y/o

e) una deleción, truncamiento, inserción o sustitución de uno o más aminoácidos en la proteína similar a la ciclina SDS.

En comparación con SEQ ID NÚM.: 1, uno de los alelos mutantes de un gen codificador de proteína similar a ciclina SDS desvelado en la presente memoria como una realización (presente en la planta de sandía mutante EMB1), tiene una mutación puntual (sustitución de G por A) en la posición de nucleótido 2185 en SEQ ID NÚM.: 1. El ARNm transcrito del alelo mutante desvelado de un gen codificador de proteína similar a ciclina SDS se muestra bajo SEQ ID NÚM.: 3. Los nucleótidos correspondientes en la posición 2186 a 2201 del alelo de tipo silvestre del gen que codifica la proteína similar a la ciclina SDS mostrado bajo la SEQ ID NÚM.: 1 no están presentes en el ARNm mostrado bajo la SEQ ID NÚM.: 3. Por lo tanto, la mutación puntual encontrada en el alelo mutante del gen que codifica la proteína similar a la ciclina SDS provoca una deleción de 16 nucleótidos en el ARNm transcrito a partir del alelo mutante en comparación con el ARNm transcrito a partir del correspondiente alelo de tipo silvestre. La deleción en el ARNm transcrito a partir del alelo mutante se explica por la mutación de un sitio de empalme que da lugar al empalme alternativo del ARNm respectivo. Además, la deleción de 16 nucleótidos en el ARNm transcrito a partir del alelo mutante desvelado del gen que codifica la proteína similar a la ciclina SDS provoca un desplazamiento de marco en el marco de lectura del ARNm transcrito a partir del alelo mutante en comparación con el ARNm transcrito a partir del alelo de tipo silvestre correspondiente. La proteína traducida a partir del alelo de tipo silvestre del gen codificador de la proteína similar a la ciclina SDS se muestra bajo SEQ ID NÚM.: 2. La proteína traducida a partir del alelo mutante del gen codificador de la proteína similar a la ciclina SDS se muestra bajo la SEQ ID NÚM.: 4. La secuencia de nucleótidos correspondiente que codifica los aminoácidos 358 a 363 (Ile-Leu-Arg-Phe-Glu-Glu) en la SEQ ID NÚM.: 2 no está presente en la<s>E<q>ID NÚM.: 4 y, debido al cambio de marco en el marco de lectura, el resto de la secuencia de aminoácidos es diferente y los aminoácidos 364 a 562 de la SEQ ID NÚM.: 2 se sustituyen por los 8 aminoácidos aberrantes Asn-Trp-Thr-Met-Lys-Lys-Pro-Ile en la SEQ ID NÚM.: 4 (es decir, los aminoácidos 358 a 365 de la SEQ ID NÚM.: 4). La proteína mutante similar a la ciclina SDS es mucho más corta, sólo 365 aminoácidos, en comparación con la proteína de tipo silvestre de 562 aminoácidos. Por lo tanto, la secuencia de aminoácidos de la proteína mutante ciclina similar a SDS como se muestra en SEQ ID NÚM.: 4 comprende supresiones de aminoácidos y sustituciones de aminoácidos en comparación con la proteína ciclina similar a SDS de tipo silvestre que se muestra en SEQ ID NÚM.: 2. Además, el cambio de marco en el marco de lectura del ARNm transcrito a partir del alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la SDS provoca una mutación sin sentido que crea un codón de parada prematuro (nucleótidos 1096 a 1098 en SEQ ID NÚM.: 3), lo que lleva a que la secuencia de aminoácidos codificada por el alelo mutante se trunque en 197 aminoácidos en el extremo C-terminal en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente codificada por el alelo de tipo silvestre que se muestra en SEQ ID NÚM.: 2. Por lo tanto, en comparación con la proteína de tipo silvestre, los 205 aminoácidos del extremo C-terminal de la proteína de tipo silvestre se sustituyen por 8 aminoácidos diferentes (aberrantes) en el extremo C-terminal debido al desplazamiento de marco, lo que da lugar a una proteína mutante que es 197 aminoácidos más corta que la proteína de tipo silvestre. La proteína mutante está, por tanto, truncada en comparación con la proteína de tipo silvestre, ya que faltan 205 aminoácidos del C-terminal de tipo silvestre en la proteína mutante. De la proteína de tipo silvestre sólo los aminoácidos del exón 1 (aminoácidos 1 a 357 de SEQ ID NÚM.: 2) siguen presentes en la proteína mutante. Esto significa que tampoco están presentes los dominios proteicos conservados Cyclin_N y Cyclin_C, lo que significa que la proteína mutante no tiene función (es decir, el alelo mutante es un alelo de pérdida de función) o tiene una función disminuida.

En resumen, específicamente desvelada aquí para ejemplificar la aplicación es en un aspecto una secuencia de ácido nucleico de un alelo mutante de un gen codificador de proteína similar a ciclina SDS que tiene una mutación puntual (sustitución de nucleótidos) comparada con la secuencia de ácido nucleico del correspondiente gen codificador de proteína similar a ciclina SDS de tipo silvestre. La mutación puntual en el alelo mutante del gen que codifica la proteína similar a la ciclina SDS provoca una mutación del sitio de empalme que conduce al empalme alternativo del ARNprem respectivo. El empalme alternativo provoca un cambio de marco en el marco de lectura abierto del ARNm transcrito a partir del alelo mutante del gen que codifica la proteína similar a la ciclina SDS. El cambio de marco en el marco de lectura abierto del ARNm transcrito a partir del alelo mutante del gen codificador de la proteína similar a la ciclina SDS provoca la deleción de nucleótidos, la sustitución de nucleótidos (mutaciones sin sentido o no sinónimas) y la creación de una mutación sin sentido que crea un codón de parada prematuro en el ARNm transcrito a partir del alelo mutante del gen codificador de la proteína similar a la ciclina s Ds en comparación con el ARNm transcrito a partir del correspondiente gen codificador de la proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre. La respectiva secuencia de aminoácidos de la proteína traducida a partir del ARNm transcrito a partir del gen mutante codificador de la proteína similar a la ciclina SDS muestra deleción de aminoácidos, sustitución de aminoácidos y truncamiento de la secuencia de aminoácidos en el extremo C en comparación con la secuencia de aminoácidos traducida a partir del ARNm transcrito a partir del correspondiente gen codificador de la proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre. Como la mutación puntual se encuentra en el primer intrón, los aminoácidos codificados por el exón 2, exón 3 y exón 4 de la proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre faltan en el mutante, es decir, sólo los aminoácidos codificados por el exón 1 de la proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre están presentes en la proteína mutante.

En la sandía, el exón 1 de la proteína similar a la ciclina SDS codifica los aminoácidos 1 a 357 de SEQ ID NÚM.: 2; en el melón, el exón 1 de la proteína similar a la ciclina SDS codifica los aminoácidos 1 a 338 de SEQ ID NÚM.: 6; en pepino el exón 1 de la ciclina SDS como proteína codifica los aminoácidos 1 a 330 en SEQ ID NÚM.: 12; en el tomate, el exón 1 de la proteína similar a la ciclina SDS codifica los aminoácidos 1 a 350 en SEQ ID NÚM.: 19; en el pimiento, el exón 1 de la proteína similar a la ciclina SDS codifica los aminoácidos 1 a 320 en SEQ ID NÚM.: 20.

Además de la planta mutante EMB 1 de sandía descrita anteriormente en la presente memoria (y en los ejemplos), se ha generado por mutagénesis otra planta de sandía, que comprende una mutación diferente en el gen que codifica la proteína similar a la ciclina SDS. El mutante comprende una sustitución nucleotídica de C (citosina) a T (timina) en el nucleótido 1687 de SEQ ID NÚM.: 1, lo que provoca que el codón "cag" (que codifica el aminoácido glutamina, aminoácido 224 de la proteína de tipo silvestre) se transforme en "tag", que es un codón de parada. El ADNc mutante se muestra en la SEQ ID NÚM.: 17 y la proteína truncada, que comprende sólo parte de los aminoácidos codificados por el exón 1 (es decir, sólo los aminoácidos 1 a 223 en lugar de los aminoácidos 1 a 357), se muestra en la SEQ ID NÚM.: 18. Al igual que en la planta mutante EMB1, los dos dominios conservados, los dominios ciclina N y ciclina C, faltan en la proteína mutante. También este mutante resulta en una pérdida de función de la ciclina SDS como proteína (o al menos en una disminución de la función).

En un aspecto de la invención, el alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS tiene una mutación que conduce a que uno o más o todos los aminoácidos que codifican el dominio ciclina_N y/o ciclina_C se supriman o se sustituyan por aminoácidos diferentes que en el tipo silvestre. En un aspecto, el alelo mutante da lugar a una proteína truncada que carece total o parcialmente del dominio Cyclin_N y/o total o parcialmente del dominio Cyclin_C. Por ejemplo, el alelo mutante contiene una mutación que conduce a un codón de parada prematuro, por lo que todo o parte del dominio Cyclin_N y/o todo o parte del dominio Cyclin_C ya no están presentes en la proteína resultante.

En un aspecto, el alelo mutante es un alelo mutante del gen similar a la ciclina SDS de sandía de SEQ ID NÚM.: 1 y deriva en la proteína de la SEQ ID NÚM.: 4 o en la proteína de la SEQ ID NÚM.: 18.

En un aspecto de la invención, el alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS tiene una mutación que conduce a la ausencia de los aminoácidos que codifican los exones 2, 3 y/o 4 de la proteína de tipo silvestre. Por lo tanto, en un aspecto, el alelo mutante codifica una proteína similar a la ciclina SDS truncada / o una proteína que comprende una deleción, que carece de los aminoácidos codificados por los exones 2, 3 y/o 4 de la proteína de tipo silvestre, es decir, carece de los aminoácidos 358 a 413 de SEQ ID NÚM.: 2 (exón 2) o de los aminoácidos 339 a 394 de SEQ ID NÚM.: 6 (exón 2) que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con invención, los aminoácidos 331 a 386 de SEQ ID NÚM.: 12 (exón 2) que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con invención, los aminoácidos 351 a 407 de SEQ ID NÚM.: 19 (exón 2) que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con invención, los aminoácidos 321 a 377 de SEQ ID NÚM.: 20 (exón 2) que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con invención, y/o los aminoácidos 414 a 469 de SEQ ID NÚM.: 2 (exón 3) o los aminoácidos 395 a 493 de SEQ ID NÚM.: 6 (exón 3) que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con invención o los aminoácidos 387 a 485 de SEQ ID NÚM.: 12 que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con invención, los aminoácidos 408 a 506 de la SEQ ID NÚM.: 19 (exón 3) que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con invención, los aminoácidos 378 a 476 de la SEQ ID NÚM.: 20 (exón 3) que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con invención, y/o los aminoácidos 470 a 562 de la SEQ ID NÚM.: 2 (exón 4) o los aminoácidos 494 a 577 de la SEQ ID NÚM.: 6 (exón 4) que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con invención o los aminoácidos 486 a 569 de SEQ ID NÚM.: 12 (exón 4) que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con invención, los aminoácidos 507 a 590 de SEQ ID NÚM.: 19 (exón 4) que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con invención, los aminoácidos 477 a 560 de SEQ ID NÚM.: 20 (exón 4) que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con invención. Opcionalmente, el alelo mutante codifica una proteína similar a la ciclina SDS truncada / o una proteína que comprende una deleción, que además carece total o parcialmente de los aminoácidos que codifican el exón 1, es decir, los aminoácidos 1 a 357 de SEQ ID NÚM.: 2 o los aminoácidos 1 a 338 de SEQ ID NÚM.: 6 que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con invención o los aminoácidos 1 a 330 de SEQ ID NÚM.: 12 que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con invención o los aminoácidos 1 a 350 de SEQ ID NÚM.: 19 que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con invención, o los aminoácidos 1 a 320 de SEQ ID NÚM.: 20 que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con invención. Las correspondientes regiones de aminoácidos codificadas por los exones 1, 2, 3 y 4 de otras proteínas similares a la ciclina SDS, por ejemplo, de ortólogos de otras especies, pueden identificarse mediante alineación por pares del ADN genómico o de las secuencias de aminoácidos. Cabe señalar que sólo para SEQ ID NÚM.: 2 se determinó que los exones eran exones reales (separados por intrones en el ADN genómico), mientras que para las otras secuencias los exones se determinaron por alineación y pueden no ser los exones reales, sino que son más bien los aminoácidos correspondientes a los exones de SEQ ID NÚM.: 2 y, por lo tanto, también pueden denominarse simplemente regiones de aminoácidos de la proteína.

En una realización preferente de la invención, el alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS tiene, o resulta en, una mutación en el extremo 5' de su secuencia codificante (que codifica el extremo N de la proteína). Más preferentemente, el alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS tiene, o resulta en, una mutación puntual y/o un truncamiento en el extremo 5'de su secuencia codificante. Es bien conocido en la técnica que una mutación en el codón de inicio (ATG) de un gen tendrá el efecto de que el gen respectivo no se traduzca en una proteína respectiva de longitud completa. Para la traducción se puede utilizar el siguiente codón de inicio posible (ATG), pero esto conducirá a un truncamiento de la secuencia de aminoácidos de la proteína en el extremo N-terminal, en caso de que el siguiente ATG aparezca en el mismo marco de lectura o a la producción de una proteína que tenga una secuencia de aminoácidos diferente.

En ambos casos, la mutación respectiva en el extremo 5' conducirá a la producción de una proteína con actividad enzimática disminuida o perdida. En una realización preferente de la invención, el alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS tiene una mutación en el codón de inicio. La mutación en el codón de inicio puede ser una mutación puntual en cualquiera de sus tres nucleótidos o una deleción/truncamiento de al menos el primero, al menos el primero y el segundo o al menos los tres nucleótidos del codón de inicio.

Otras realizaciones preferentes de la invención son alelos mutantes de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS que da lugar a una deleción en el extremo 3'de su secuencia codificante (que codifica el C-terminal de la proteína). Como el dominio conservado Cyclin_C está presente en el extremo C-terminal de la proteína, un truncamiento que resulte en la ausencia de parte del dominio Cyclin_C (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o más aminoácidos del dominio Cyclin_C o incluso todo el dominio Cyclin_C) dará lugar a que la proteína tenga una función reducida o ninguna función. Un truncamiento más largo en el C-terminal, dará lugar incluso a que se elimine parte o la totalidad del dominio Cyclin_N, lo que igualmente dará lugar a que la proteína tenga una función reducida o nula. Sólo hay cinco aminoácidos entre los dominios Cyclin_C y Cyclin_N. Un truncamiento de unos 90 o más aminoácidos del C-terminal da lugar a que la mayoría de las proteínas similares a la ciclina SDS carezcan del dominio Ciclina_C y truncamientos más largos de 95, 100, 110 o más aminoácidos darán lugar a que el dominio Ciclina_N se elimine al menos parcialmente. Como se ha mencionado anteriormente, tales truncamientos se incluyen en la presente memoria, ya que conducen a una proteína de función reducida o sin función. Como se ha mencionado anteriormente, para comprobar si la proteína tiene una función reducida o no tiene función, la planta mutante homocigótica para el alelo mutante puede someterse a pruebas fenotípicas para ver si se produce el fenotipo esperado.

Preferentemente, los alelos mutantes de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS producen un truncamiento de al menos 10, 20, 30, 40 o 50 nucleótidos, preferentemente de al menos 100 nucleótidos, más preferentemente de al menos 200 nucleótidos, aún más preferentemente de al menos 300 nucleótidos, aún más preferentemente de al menos 400 nucleótidos y más preferentemente de al menos 500 nucleótidos, en particular preferentemente de al menos 615 nucleótidos en el extremo 3' de la secuencia codificante de la proteína. Un truncamiento en 591 nucleótidos de una secuencia codificante se traduce en un truncamiento en 197 aminoácidos para la respectiva secuencia proteica. Un ejemplo preferido para una proteína similar a ciclina SDS que tiene un truncamiento de 197 aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína similar a ciclina SDS de tipo silvestre correspondiente (SEQ ID NÚM.: 2) se muestra bajo SEQ ID NÚM.: 4. Otro ejemplo es un truncamiento de 339 aminoácidos (es decir, 1017 nucleótidos de la región codificante) en comparación con la correspondiente proteína similar a<s>D<s>de tipo silvestre (SEQ ID NÚM.: 2) se muestra en SEQ ID NÚM.: 18.

En una realización, el alelo mutante de un gen que codifica la proteína similar a la ciclina SDS tiene cualquiera de las mutaciones mencionadas anteriormente en una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NÚM.: 2 (dando lugar a que la proteína codificada comprenda una deleción o truncamiento en comparación con el tipo silvestre), o en cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína que comprenda al menos un 70%, 80%, 90%, 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NÚM.: 2, como por ejemplo SEQ ID NÚM.: 6 que se describe en la presente memoria pero que no está de acuerdo con la invención, que tiene un 71% de identidad de secuencia con SEQ ID NÚM.: 2.

En otro aspecto descrito pero no reivindicado, el alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS tiene cualquiera de las mutaciones mencionadas anteriormente en una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NÚM.: 6 (dando lugar a que la proteína codificada comprenda una deleción o truncamiento en comparación con el tipo silvestre), o en cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína que comprenda al menos un 70%, 80%, 90%, 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NÚM.: 6.

En otro aspecto descrito pero no reivindicado, el alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS tiene cualquiera de las mutaciones mencionadas anteriormente en una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NÚM.: 12 (dando lugar a que la proteína codificada comprenda una deleción o truncamiento en comparación con el tipo silvestre), o en cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína que comprenda al menos un 70%, 80%, 90%, 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NÚM.: En otro aspecto descrito pero no reivindicado, el alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS tiene cualquiera de las mutaciones mencionadas anteriormente en una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NÚM.: 19 (dando lugar a que la proteína codificada comprenda una deleción o truncamiento en comparación con el tipo silvestre), o en cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína que comprenda al menos un 70%, 80%, 90%, 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NÚM.: 19.

En otro aspecto descrito pero no reivindicado, el alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS tiene cualquiera de las mutaciones mencionadas anteriormente en una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NÚM.: 20 (dando lugar a que la proteína codificada comprenda una deleción o truncamiento en comparación con el tipo silvestre), o en cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína que comprenda al menos un 70%, 80%, 90%, 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NÚM.: 20.

En una realización preferente adicional, el alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS tiene cualquiera de las mutaciones mencionadas anteriormente en la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NÚM.: 1 o en una secuencia que tiene una identidad de al menos el 70%, más preferentemente al menos el 80%, aún más preferido al menos el 90% o particularmente preferido al menos el 95% con la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NÚM.: 1. En un aspecto, un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS comprende una mutación en la secuencia de ácido nucleico mostrada bajo SEQ ID NÚM.: 1 o en una secuencia variante que tiene una identidad de al menos 70%, más preferentemente 80%, aún más preferente 90% o particularmente preferente 95% con la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NÚM.: 1 en la que el nucleótido guanina (G) en la posición nucleotídica número 2185 en SEQ ID NÚM.: 1 se sustituye por adenina (A), citosina (C) o timina (T), más preferentemente el nucleótido guanina (G) en la posición nucleotídica número 2185 en SEQ ID NÚM.: 1, o el nucleótido equivalente en una secuencia variante, se sustituye por adenina (A). Más preferentemente, el alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS tiene la secuencia de ácido nucleótido mostrada en SEQ NO 1, aparte de que el nucleótido guanina (G) en la posición nucleotídica número 2185 en SEQ ID NÚM.: 1 se sustituye por adenina (A), citosina (C) o timina (T), más particularmente preferido el nucleótido guanina (G) en la posición nucleotídica número 2185 en SEQ ID NÚM.: 1 se sustituye por adenina (A). En un aspecto diferente, un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS comprende una mutación en la secuencia de ácido nucleico mostrada bajo SEQ ID NÚM.: 1 o en una secuencia variante que tiene una identidad de al menos 70%, más preferentemente 80%, aún más preferido 90% o particularmente preferido 95% con la secuencia de ácido nucleico mostrada bajo SEQ ID NÚM.: 1 en que en el alelo mutante de un gen codificador de proteína similar a SDS el nucleótido citosina (C) en el nucleótido 1687, o el nucleótido equivalente en una secuencia variante, es reemplazado por un nucleótido diferente, preferentemente por timina (T).

Otra realización de la invención se refiere a células vegetales, partes de plantas o plantas que comprenden o sintetizan un ARNm que codifica una proteína similar a la ciclina SDS, en el que el ARNm que codifica una proteína similar a la ciclina SDS tiene una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en

a) una mutación por deleción

b) una mutación sin sentido o no sinónima;

c) una mutación de desplazamiento de marco; y/o

d) una mutación sin sentido.

En una realización preferente de la invención, las células vegetales, partes de plantas o plantas de acuerdo con la invención comprenden o sintetizan un ARNm que codifica una proteína similar a la ciclina SDS que tiene una o más de las mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en

a) una mutación por deleción

b) una mutación sin sentido o no sinónima;

c) una mutación de desplazamiento de marco; y/o

d) una mutación sin sentido.

Con respecto a las supresiones y sustituciones de uno o más nucleótidos, las células vegetales o plantas de acuerdo con la invención comprenden o sintetizan preferentemente un ARNm que codifica una proteína similar a la ciclina SDS, en que el ARNm comprende una supresión de al menos 1, al menos 2, al menos 4, al menos 5, al menos 7, al menos 8, al menos 10, al menos 11, al menos 13, al menos 14 o preferentemente al menos 16 nucleótidos en comparación con el ARNm que codifica una proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre. En un aspecto, los nucleótidos suprimidos en el ARNm son uno o más nucleótidos del exón 1, exón 2, exón 3 y/o exón 4 de la proteína similar a la ciclina SDS y/o los nucleótidos suprimidos en el ARNm son uno o más nucleótidos del dominio Ciclina_N o Ciclina_C de la proteína similar a la ciclina SDS. En un aspecto, los nucleótidos son nucleótidos del exón 2, por ejemplo, uno o más o todos los nucleótidos que comienzan en el nucleótido 2186 y terminan en el nucleótido 2201 de SEQ ID NÚM.: 1.

Preferentemente, las células vegetales o plantas de acuerdo con la invención comprenden o sintetizan un ARNm que codifica una proteína similar a la ciclina SDS, caracterizada porque el ARNm comprende una mutación de cambio de marco y/o una mutación sin sentido. La mutación sin sentido crea un codón de parada prematuro y, por tanto, un truncamiento de la secuencia codificante del ARNm. Una realización preferente de la invención se refiere a células vegetales o plantas de acuerdo con la invención que comprenden un ARNm que codifica una proteína similar a la ciclina SDS, caracterizada porque el ARNm comprende un truncamiento de la secuencia codificante. El truncamiento de la secuencia de codificación del ARNm de una proteína similar a la ciclina SDS preferentemente es un truncamiento de al menos 100 nucleótidos, preferentemente de al menos 200 nucleótidos, más preferentemente de al menos 300 nucleótidos, aún más preferentemente de al menos 400 nucleótidos y aún más preferentemente de al menos 500 nucleótidos, en particular preferentemente de al menos 591 nucleótidos en comparación con el ARNm que codifica una proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre. En un aspecto, el truncamiento de la secuencia codificante del ARNm provoca la ausencia de los exones 2, 3 y 4; o la ausencia de los exones 3 y 4; o la ausencia del exón 4. En otro aspecto, el truncamiento de la secuencia codificante del ARNm provoca la ausencia de todo o parte del exón 1, todo el exón 2, todo el exón 3 y todo el exón 4. En otro aspecto, la mutación de cambio de marco hace que todo o parte del exón 2 se encuentre en un marco de lectura diferente. En otro aspecto, la mutación de cambio de marco hace que todo o parte del exón 3 y/o el exón 4 se encuentren en un marco de lectura diferente. El cambio de marco puede estar causado por la deleción de uno o más nucleótidos (cualquier número que no sea una multitud de tres, como 1,2, 4, 5, 7, 8, 10, etc.), por lo que se cambia el marco de lectura.

En una realización preferente, las células vegetales, partes de plantas o plantas de acuerdo con la invención comprenden o sintetizan un ARNm que codifica una proteína similar a la ciclina SDS cuyo ARNm tiene al menos un 70%, más preferentemente al menos un 80%, aún más preferido al menos un 90% o particularmente preferido al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia codificante correspondiente indicada en SEQ ID NÚM.: 1 con el requisito previo de que el ARNm que codifica una proteína similar a la ciclina SDS comprenda una mutación sin sentido o un codón de parada prematuro. En una realización, el codón de parada se encuentra en el exón 1 de SEQ ID NÚM.: 1, por ejemplo, en los nucleótidos 1687 a 1689. En otra realización preferente, las células vegetales, partes de plantas o plantas de acuerdo con la invención comprenden o sintetizan un ARNm que codifica una proteína similar a la ciclina SDS cuyo ARNm tiene al menos un 70%, más preferentemente al menos un 80%, aún más preferido al menos un 90% o particularmente preferido al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia codificante indicada en SEQ ID NÚM.: 3, con el requisito previo de que los nucleótidos 1096 a 1098 en SEQ ID NÚM.: 3 representen un codón de parada. En la realización más preferente de la invención, las células vegetales o plantas de acuerdo con la invención comprenden o sintetizan un ARNm que codifica una proteína similar a la ciclina SDS cuyo ARNm tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NÚM.: 3.

En otra realización de la invención, las células vegetales o las plantas de acuerdo con la invención, como se establece en las reivindicaciones adjuntas, comprenden o sintetizan un ARNm que codifica una proteína similar a la ciclina SDS que tiene una o más mutaciones, en que el ARNm se transcribe a partir de un alelo mutante de un gen que codifica la proteína similar a la ciclina SDS. Comprenden estas realizaciones de la invención células vegetales, partes de plantas o plantas de acuerdo con la invención que comprenden o sintetizan un ARNm transcrito a partir de un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS, caracterizado porque el ARNm comprende una mutación de deleción y/o una mutación sin sentido o no sinónima y/o una mutación de desplazamiento de marco y/o una mutación sin sentido, en comparación con la correspondiente secuencia codificante (ADN) del alelo mutante del gen codificador de la proteína similar a la ciclina SDS a partir del cual se transcribe el ARNm. Por lo tanto, en un aspecto se engloba cualquier mutación que afecte al empalme del pre-ARNm, es decir, que modifique el proceso normal de empalme del pre-ARNm, dando lugar a una molécula de ARNm diferente.

Con respecto a las mutaciones de deleción, las células vegetales o plantas de acuerdo con la invención en un aspecto comprenden o sintetizan un ARNm transcrito a partir de un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS, en el que el ARNm comprende una deleción de al menos 1, al menos 2 al menos 4, al menos 5, al menos 7, al menos 8, al menos 10, al menos 11, al menos 13, al menos 14 o al menos 16 nucleótidos en comparación con la correspondiente secuencia codificante (ADN) del alelo mutante del gen codificador de la proteína similar a la ciclina SDS a partir del cual se transcribe el ARNm. En un aspecto, los nucleótidos eliminados en el ARNm son uno o más nucleótidos del exón 1, exón 2, exón 3 y/o exón 4 de la proteína similar a la ciclina SDS. En un aspecto, los nucleótidos son nucleótidos del exón 2, por ejemplo, uno o más o todos los nucleótidos que comienzan en el nucleótido 2186 y terminan en el nucleótido 2201 de SEQ ID NÚM.: 1.

Preferentemente, las células vegetales o plantas de acuerdo con la invención comprenden o sintetizan un ARNm transcrito a partir de un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS, caracterizado porque el ARNm comprende una mutación de desplazamiento de marco y/o una mutación sin sentido en comparación con la secuencia codificante (ADN) del alelo mutante del gen codificador de la proteína similar a la ciclina SDS a partir del cual se transcribe el ARNm. La mutación sin sentido crea un codón de parada prematuro en el ARNm que provoca un truncamiento en el extremo 3' de la secuencia codificante del ARNm y un truncamiento de una proteína similar a la ciclina SDS en el extremo C-terminal. Una realización preferente de la invención se refiere, por tanto, a células vegetales o plantas de acuerdo con la invención que comprenden o sintetizan un ARNm transcrito a partir de un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS, caracterizado porque el ARNm comprende un truncamiento de la secuencia codificante en comparación con la secuencia codificante (ADN) del alelo mutante del gen codificador de la proteína similar a la ciclina SDS a partir del cual se transcribe el ARNm. El truncamiento de la secuencia codificante de ARNm de un gen codificante de una proteína similar a la ciclina SDS preferentemente es un truncamiento de al menos 100 nucleótidos, más preferentemente de al menos 200 nucleótidos, aún más preferentemente de al menos 300 nucleótidos, más preferentemente de al menos 400 nucleótidos y más preferentemente de al menos 500 nucleótidos, en particular preferentemente de al menos 591 en comparación con la secuencia codificante (ADN) del alelo mutante del gen codificante de la proteína similar a la ciclina SDS a partir del cual se transcribe el ARNm. En un aspecto, el truncamiento de la secuencia codificante del ARNm provoca la ausencia de los exones 2, 3 y 4; o la ausencia de los exones 3 y 4; o la ausencia del exón 4. En otro aspecto, el truncamiento de la secuencia codificante del ARNm provoca la ausencia de todo o parte del exón 1, todo el exón 2, todo el exón 3 y todo el exón 4. En otro aspecto, la mutación de cambio de marco hace que todo o parte del exón 2 se encuentre en un marco de lectura diferente. En otro aspecto, la mutación de cambio de marco hace que todo o parte del exón 3 y/o el exón 4 se encuentren en un marco de lectura diferente. El cambio de marco puede estar causado por la deleción de uno o más nucleótidos (cualquier número que no sea una multitud de tres, como 1,2, 4, 5, 7, 8, 10, etc.), por lo que se cambia el marco de lectura.

En otra realización preferente, las células vegetales o plantas de acuerdo con la invención, tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas, comprenden o sintetizan un ARNm que tiene una identidad de al menos el 70%, más preferentemente de al menos el 80%, aún más preferido al menos 90% o particularmente preferido al menos 95% con la correspondiente secuencia codificante (ADN) indicada en SEQ ID NÚM.: 1 con el prerrequisito de que la secuencia de ARNm comprende al menos una mutación sin sentido o un codón de parada prematuro en comparación con la correspondiente secuencia codificante (ADN) indicada en SEQ ID NÚM.: 1, preferentemente, la mutación sin sentido se produce en las posiciones nucleotídicas 1096 a 1098 en SEQ ID NÚM.: 3. En un aspecto, el codón de parada prematura se encuentra en los nucleótidos 1687 a 1689 de SEQ ID NÚM.: 1. En una realización preferente particular de la invención, las células vegetales o plantas de acuerdo con la invención comprenden un ARNm que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada bajo SEQ ID NÚM.: 3.

Una "secuencia codificante de ARNm" tendrá el significado común descrito en la presente memoria. Una secuencia codificadora de ARNm corresponde a la secuencia codificadora de ADN respectiva de un gen/alelo, con la salvedad de que la timina (T) se sustituye por uracilo (U).

Para cualquiera de las mutaciones o combinaciones de mutaciones descritas anteriormente (por ejemplo, deleción de nucleótidos que da lugar a un desplazamiento de marco), se entiende que dan lugar a causar una disminución de la función o una pérdida de función en la actividad de la proteína similar a la ciclina SDS en células vegetales, partes de plantas o plantas de acuerdo con la invención.

Otra realización de la invención se refiere a células vegetales, partes de plantas o plantas, que comprenden o sintetizan una proteína similar a la ciclina SDS, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos de la proteína similar a la ciclina SDS comprende una mutación en comparación con la correspondiente proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre. La mutación en la proteína similar a la ciclina SDS causa una disminución o pérdida de función en la actividad de una proteína similar a la ciclina SDS en células vegetales, partes de plantas o plantas de acuerdo con la invención.

Son particularmente preferentes las células vegetales, partes de plantas o plantas de acuerdo con la invención que comprenden o sintetizan una proteína similar a la ciclina SDS, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos de la proteína similar a la ciclina SDS comprende una mutación en comparación con la correspondiente proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre.

La mutación en la proteína similar a la ciclina SDS puede ser una sustitución, inserción, deleción y/o truncamiento de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre. En una realización preferente de la invención, la secuencia de aminoácidos de la proteína similar a la ciclina SDS comprende una deleción o truncamiento, más preferido un truncamiento en el extremo N-terminal y/o C-terminal, aún más preferido un truncamiento en el C-terminal. Preferentemente faltan al menos 10, al menos 25, preferentemente al menos 50, 60, 70, 80, 90 o 100, más preferentemente al menos 150 y aún más preferentemente al menos 197 o al menos 200, 250, 300 o 339 aminoácidos en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos en comparación con la correspondiente proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre. Con respecto al C-terminal, la mutación en la proteína similar a la ciclina SDS es una truncación de al menos 25, preferentemente al menos 50, 60, 70, 80, 90, preferentemente al menos 100, más preferentemente al menos 150 y aún más preferentemente de al menos 197 o al menos 200, 250, 300 o 339 aminoácidos en comparación con la correspondiente proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre. En otro aspecto, la mutación en la proteína similar a la ciclina SDS hace que los aminoácidos codificados por los exones 2, 3 y 4 estén ausentes; o que los aminoácidos codificados por los exones 3 y 4 estén ausentes; o que los aminoácidos codificados por el exón 4 estén ausentes. En otro aspecto, la mutación provoca que todos o parte de los aminoácidos codificados por el exón 1, todos los aminoácidos codificados por el exón 2, todos los aminoácidos codificados por el exón 3 y todos los aminoácidos codificados por el exón 4 estén ausentes. En otro aspecto, la mutación da lugar a que todos o parte de los aminoácidos codificados por el exón 2 sean sustituidos por aminoácidos diferentes (por ejemplo, debido a un desplazamiento del marco de lectura). En un aspecto diferente, la mutación hace que los aminoácidos codificados por todo o parte del exón 3 y/o el exón 4 sean sustituidos por aminoácidos diferentes (por ejemplo, debido a un desplazamiento del marco de lectura). En otro aspecto, la mutación provoca la ausencia total o parcial del dominio Cyclin_C y/o Cyclin_N. En otro aspecto diferente, la mutación da lugar a que el dominio Cyclin_C y/o Cyclin_N comprenda uno o más aminoácidos sustituidos, insertados o eliminados.

Se proporcionan además células vegetales, partes de plantas o plantas de acuerdo con la invención y como se establece en las reivindicaciones adjuntas que comprenden o sintetizan una proteína similar a la ciclina SDS que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada bajo SEQ iD NÚM.: 4 o bajo SEQ ID NÚM.: 18.

Por lo tanto, otra realización de la invención se refiere a células vegetales o plantas seleccionadas de la especie sandía, como se establece en las reivindicaciones adjuntas, y descritas para las especies melón, pepino, tomate y pimiento (que son especies que no están de acuerdo con la invención) que comprenden un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS caracterizado en que el alelo mutante comprende o efectúa una o más de las mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en

b) una mutación en una o más secuencias reguladoras;

El alelo mutante anterior da como resultado una actividad disminuida de la proteína similar a la ciclina SDS mutante en comparación con la proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre. La disminución de la actividad se debe a un bloqueo de la expresión del gen similar a la ciclina SDS, a un bloqueo de la expresión del gen, a una pérdida de función de la proteína mutante codificada similar a la ciclina SDS o a una disminución de la función de la proteína mutante similar a la ciclina SDS.

En un aspecto, en el que la célula vegetal o planta es sandía, el alelo mutante de la proteína similar a la ciclina SDS es un alelo mutante del alelo que codifica la proteína de SEQ ID NÚM.: 2 o una proteína que comprende identidad de secuencia sustancial con SEQ ID NÚM.: 2, preferentemente al menos el 60%, 70%, 80%, 90% de identidad de secuencia cuando las dos secuencias de longitud completa de la proteína funcional similar al SDS se alinean por pares.

En otro aspecto descrito en la presente memoria, pero no de acuerdo con la invención, la célula vegetal o planta es melón, el alelo mutante de la proteína similar a la ciclina SDS es un alelo mutante del alelo que codifica la proteína de SEQ ID NÚM.: 6 o una proteína que comprende identidad de secuencia sustancial con SEQ ID NÚM.: 6, preferentemente al menos el 60%, 70%, 80%, 90% de identidad de secuencia cuando las dos secuencias de longitud completa de la proteína funcional similar al SDS se alinean por pares.

En otro aspecto descrito en la presente memoria, pero no de acuerdo con la invención, la célula vegetal o planta es pepino, el alelo mutante de la proteína similar a la ciclina SDS es un alelo mutante del alelo que codifica la proteína de SEQ ID NÚM.: 12 o una proteína que comprende identidad de secuencia sustancial con SEQ ID NÚM.: 12, preferentemente al menos el 60%, 70%, 80%, 90% de identidad de secuencia cuando las dos secuencias de longitud completa de la proteína funcional similar al SDS se alinean por pares.

En otro aspecto descrito en la presente memoria, pero no de acuerdo con la invención, la célula vegetal o planta es tomate, el alelo mutante de la proteína similar a la ciclina SDS es un alelo mutante del alelo que codifica la proteína de SEQ ID NÚM.: 19 o una proteína que comprende identidad de secuencia sustancial con SEQ ID NÚM.: 19, preferentemente al menos el 60%, 70%, 80%, 90% de identidad de secuencia cuando las dos secuencias de longitud completa de la proteína funcional similar al SDS se alinean por pares.

En otro aspecto descrito en la presente memoria, pero no de acuerdo con la invención, la célula vegetal o planta es pimiento, el alelo mutante de la proteína similar a la ciclina SDS es un alelo mutante del alelo que codifica la proteína de SEQ ID NÚM.: 20 o una proteína que comprende identidad de secuencia sustancial con SEQ ID NÚM.: 20, preferentemente al menos el 60%, 70%, 80%, 90% de identidad de secuencia cuando las dos secuencias de longitud completa de la proteína funcional similar al SDS se alinean por pares.

En un aspecto, la planta de sandía de acuerdo con la invención, o la planta de melón, pepino, tomate o pimiento descrita, pero no de acuerdo con la invención, comprende el alelo mutante similar a ciclina SDS en forma heterocigótica. En otro aspecto, la planta de sandía de acuerdo con la invención, o la planta de melón, pepino, tomate o pimiento descrita, pero no de acuerdo con la invención, comprende el alelo mutante similar a ciclina s Ds en forma homocigótica, por lo que la planta produce frutos sin semillas tras la polinización con polen propio o de otro tipo. En un aspecto preferente, el alelo mutante similar a la ciclina SDS es un knock out (es decir, el gen no se expresa) o el alelo codifica una proteína similar a la ciclina SDS no funcional.

Las semillas a partir de las cuales pueden cultivarse dichas plantas, tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas, están incluidas en la presente memoria, así como los frutos sin semillas producidos a partir de dichas plantas cuando el alelo está en forma homocigótica o los frutos con semillas producidos a partir de dichas plantas cuando el alelo está en forma heterocigótica. También se proporcionan cualesquiera partes de plantas, como se establece en las reivindicaciones adjuntas", tales como esquejes, propagaciones vegetativas, células, etc. que comprendan al menos un alelo mutante similar a la ciclina SDS en su genoma.

También se proporcionan en la presente memoria células propagadoras y no propagadoras que comprenden al menos una copia de un alelo mutante similar a ciclina SDS. Se entiende que dichas células propagadoras o no propagadoras pueden formar parte de un órgano vegetal o de una planta entera, o pueden aislarse, por ejemplo, en un cultivo celular o tisular.

Las semillas, plantas y partes de plantas proporcionadas en la presente memoria, que comprenden al menos un alelo mutante similar a la ciclina SDS en su genoma, son preferentemente plantas agronómicamente útiles, por ejemplo, líneas endógamas, líneas de cría, variedades o cultivares o híbridos F1. Preferentemente que tengan buenas características agronómicas, especialmente que produzcan frutos comercializables de buena calidad y uniformidad.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "variedad" o "cultivar" designa una agrupación de plantas dentro de un único taxón botánico del rango más bajo conocido, que puede definirse por la expresión de las características resultantes de un genotipo o una combinación de genotipos determinados.

La planta "híbrida F1" (o semilla híbrida F1) es la generación obtenida del cruce de dos líneas progenitoras endogámicas. Por lo tanto, las semillas híbridas F1 son semillas a partir de las cuales crecen plantas híbridas F1. Los híbridos F1 son más vigorosos y de mayor rendimiento, debido a la heterosis. Las líneas endogámicas son fundamentalmente homocigóticas en la mayoría de los loci del genoma.

Una "línea vegetal" o "línea de cría" se refiere a una planta y su progenie. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "línea endogámica" se refiere a una línea de plantas que se ha autofecundado repetidamente y es casi homocigótica. Así, una "línea endogámica" o "línea parental" se refiere a una planta que ha sido sometida a varias generaciones (por ejemplo, al menos 5, 6, 7 o más) de endogamia, dando lugar a una línea de plantas con una gran uniformidad.

El alelo similar a la ciclina SDS de la sandía se localiza en el cromosoma 7 (entre los nucleótidos 7450185 y 7445051) del genoma. La localización cromosómica puede determinarse realizando un BLAST con el genoma completo (por ejemplo, en la web icugi.org/pub/genome/watermelon/97103). El alelo similar a la ciclina SDS del pepino también parece estar localizado en el cromosoma 5 (entre los nucleótidos 848447 y 852718) del genoma del pepino (world wide web en icugi.org/pub/genome/cucumber/Chinese_long/).

Para la sandía, puede obtenerse un alelo mutante de un gen codificador de la proteína similar a la ciclina SDS a partir de las semillas de sandía que sean heterocigotas u homocigotas para el alelo mutante del gen codificador de la proteína similar a la ciclina SDS, depositado bajo NCIMB 42532. Puede obtenerse un alelo de tipo silvestre de un gen codificador de la proteína similar a la ciclina SDS a partir de las semillas de sandía que sean heterocigotas u homocigotas para el gen codificador de la proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre, depositado bajo NCIMB 42532. Para las semillas depositadas se designóemblalalelo respectivo de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS. Pueden generarsede novootros alelos mutantes de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS, por ejemplo, por mutagénesis o por otros procedimientos conocidos por el experto en la técnica. Esto se aplica a cualquier especie vegetal.

Un ejemplo de generación de otro alelo mutante similar a SDSde novoen sandía se proporciona en los Ejemplos. Aquí, los inventores generaron una población mutante mutagenizando semillas de sandía y luego utilizaron el TILLING para identificar una planta que comprendía un alelo mutante similar al SDS. El alelo identificado comprende un reemplazo de nucleótido individual en el nucleótido 1687 de SEQ ID NÚM.: 1, que conduce a un codón de parada. El alelo mutante codifica así una proteína truncada similar a la ciclina SDS que comprende sólo los aminoácidos 1 a 223 de la proteína de tipo silvestre (véase SEQ ID NÚM.: 18).

Las células vegetales, partes de plantas o plantas o progenie de las mismas obtenibles/obtenidas a partir de semillas que son heterocigotas u homocigotas para un alelo de un gen que codifica una proteína similar a la SDS, depositado bajo NCIMB 42532 son también una realización de la invención. En una realización preferente, las células vegetales, partes de plantas o plantas o progenie de las mismas obtenidas a partir de semillas depositadas bajo NCIMB 42532 son homocigotas para un alelo mutante que codifica un gen similar a la ciclina SDS. Otra realización comprendida de la invención se refiere a células vegetales, partes de plantas o plantas, homocigotas para un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS obtenido/obtenible tras cruzar una planta de sandía obtenida a partir de semillas del depósito número de acceso NCIMB 42532 con otra planta. Preferentemente, las células vegetales o plantas obtenidas/obtenibles tras cruzar una planta obtenida a partir de semillas del depósito con número de acceso NCIMB 42532 con otra planta se autopolinizan posteriormente y, opcionalmente, en una etapa adicional se seleccionan plantas que producen frutos sin semillas y/o se seleccionan plantas que son homocigóticas para un alelo mutante de un gen codificador similar a la ciclina SDS.

El término "alelo(s)" significa cualquiera de una o más formas alternativas de un gen en un locus particular, todos los cuales alelos se relacionan con un rasgo o característica en un locus específico. En una célula diploide de un organismo, los alelos de un determinado gen se encuentran en un lugar específico, o locus (loci en plural) en un cromosoma. Un alelo está presente en cada cromosoma del par de cromosomas homólogos. Una especie vegetal diploide puede comprender un gran número de alelos diferentes en un locus concreto. Puede tratarse de alelos idénticos del gen (homocigóticos) o de dos alelos diferentes (heterocigóticos).

"Alelo de tipo silvestre" se refiere en la presente memoria a una versión de un gen que codifica una proteína completamente funcional (proteína de tipo silvestre). Una secuencia de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS completamente funcional es, por ejemplo, la secuencia codificante de las secuencias de la proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre mostradas bajo SEQ ID NÚM.: 1 (de sandía cultivada) y SEQ ID Nú M.: 5 (de melón cultivado). La secuencia de aminoácidos codificada por este gen codificador de la proteína ciclina SDS like de tipo silvestre se representa en SEQ ID NÚM.: 2 o SEQ ID NÚM.: 6, respectivamente. Otras proteínas similares a la ciclina SDS de tipo silvestre se muestran bajo SEQ ID NÚM.: 12 (pepino), SEQ ID NÚM.: 19 (tomate) y la SEQ ID NÚM.: 20 (pimiento). Otras secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas similares a la ciclina SDS completamente funcionales (es decir, alelos variantes o variantes alélicas) existen en otras plantas y pueden comprender una identidad de secuencia sustancial con al menos la secuencia codificante de las secuencias de ácido nucleico mostradas bajo SEQ ID NÚM.: 1 o SEQ ID NÚM.: 5 o con las secuencias de aminoácidos mostradas bajo SEQ ID NÚM.: 2 o SEQ ID NÚM.: 6 o SEQ ID NÚM.: 12, o la SEQ ID NÚM.: 19 o SEQ ID NÚM.: 20. Por ejemplo, la proteína similar a la ciclina SDS de pepino cultivado de la SEQ ID NÚM.: 12 tiene un 86% de identidad de secuencia de aminoácidos con la proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre de melón (SEQ ID NÚM.: 6) y un 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con la proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre de sandía (SEQ ID NÚM.: 2).

Un "alelo mutante" debe entenderse en relación con la presente invención como un alelo que tiene una mutación en comparación con el alelo de tipo silvestre correspondiente. Un ejemplo de un ARNm transcrito a partir de un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS se muestra bajo la SEQ ID NÚM.: 3. La correspondiente secuencia de aminoácidos codificada por el ARNm mostrado en SEQ ID NÚM.: 3 se muestra en SEQ ID NÚM.: 4.

El término "locus" (loci plural) significa un lugar o lugares específicos o un sitio en un cromosoma donde, por ejemplo, se encuentra un gen o un marcador genético.

Una "mutación" en una molécula de ácido nucleico (ADN o ARN) es un cambio de uno o más nucleótidos en comparación con la secuencia de tipo silvestre correspondiente, por ejemplo, por sustitución, deleción o inserción de uno o más nucleótidos. Los ejemplos de este tipo de mutación son la mutación puntual, la mutación no sentido, la mutación sin sentido, la mutación en el lugar de empalme, la mutación de cambio de marco o una mutación en una secuencia reguladora.

Una "molécula de ácido nucleico" tendrá el significado común en la técnica. Está compuesto por nucleótidos que comprenden uno de los azúcares desoxirribosa (ADN) o ribosa (ARN).

Una "mutación puntual" es la sustitución de un único nucleótido, o la inserción o deleción de un único nucleótido.

Una "mutación sin sentido" es una mutación (puntual) en una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína, por la que un codón en una molécula de ácido nucleico se cambia por un codón de parada. Esto provoca la presencia de un codón de parada prematuro en el ARNm y da lugar a la traducción de una proteína truncada. Una proteína truncada puede tener una función disminuida o una pérdida de función.

Una "mutación sin sentido o no sinónima" es una mutación (puntual) en una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína, por la que se cambia un codón para codificar un aminoácido diferente. La proteína resultante puede tener una función disminuida o una pérdida de función.

Una "mutación de sitio de empalme" es una mutación en una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína, por la que se modifica el empalme del ARNpre-ARNm, dando como resultado un ARNm que tiene una secuencia de nucleótidos diferente y una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos diferente a la de tipo silvestre. La proteína resultante puede tener una función disminuida o una pérdida de función.

Una "mutación de cambio de marco" es una mutación en una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína por la que se cambia el marco de lectura del ARNm, dando lugar a una secuencia de aminoácidos diferente. La proteína resultante puede tener una función disminuida o una pérdida de función.

Una "deleción" en el contexto de la invención significará que en cualquier lugar de una secuencia de ácido nucleico determinada falta al menos un nucleótido en comparación con la secuencia nucleica de la secuencia de tipo silvestre correspondiente o que en cualquier lugar de una secuencia de aminoácidos determinada falta al menos un aminoácido en comparación con la secuencia de aminoácidos de la secuencia (de tipo silvestre) correspondiente.

Por "truncamiento" se entenderá que falta al menos un nucleótido en el extremo 3' o en el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos en comparación con la secuencia nucleica de la correspondiente secuencia de tipo silvestre o que falta al menos un aminoácido en el extremo N o en el extremo C de la proteína en comparación con la secuencia de aminoácidos de la correspondiente proteína de tipo silvestre, en que en un truncamiento extremo 3' o C-terminal al menos el primer nucleótido en el extremo 5' o el primer aminoácido en el extremo N-terminal, respectivamente, sigue presente y en un truncamiento extremo 5' o N-terminal al menos el último nucleótido en el extremo 3' o el último aminoácido en el C-terminal, respectivamente, sigue presente. El extremo 5' viene determinado por el codón ATG utilizado como codón de inicio en la traducción de una secuencia de ácido nucleico de tipo silvestre correspondiente.

Por "sustitución" se entenderá que al menos un nucleótido de una secuencia de ácido nucleico o un aminoácido de una secuencia proteica es diferente en comparación con la correspondiente secuencia de ácido nucleico de tipo silvestre o la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo silvestre, respectivamente, debido a un intercambio de un nucleótido en la secuencia codificante de la proteína respectiva.

Por "inserción" se entenderá que la secuencia de ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos de una proteína comprende al menos un nucleótido o aminoácido adicional en comparación con la correspondiente secuencia de ácido nucleico de tipo silvestre o la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo silvestre, respectivamente.

"Codón de parada prematuro" en el contexto de la presente invención significa que un codón de parada está presente en una secuencia codificante (cds) que está más cerca del codón de inicio en el extremo 5'en comparación con el codón de parada de una secuencia codificante de tipo silvestre correspondiente.

Una "mutación en una secuencia reguladora", por ejemplo, en un promotor o potenciador de un gen, es un cambio de uno o más nucleótidos en comparación con la secuencia de tipo silvestre, por ejemplo, por sustitución, deleción o inserción de uno o más nucleótidos, que conduce, por ejemplo, a la disminución o ausencia de transcripción de ARNm del gen.

"Homocigoto" se refiere en la presente memoria a que todas las copias de un gen o alelo dado en un locus cromosómico correspondiente en una célula o un organismo son idénticas. "Homocigoto para un alelo mutante" significa que todas las copias del alelo mutante respectivo en el locus cromosómico correspondiente en una célula o un organismo son idénticas.

"Heterocigoto" se refiere en la presente memoria a que al menos una copia de un gen o alelo dado en un locus cromosómico específico en una célula o un organismo es diferente de las otras copias del gen(es) o alelo(s) en el locus/loci correspondiente en el otro cromosoma(s). "Heterocigoto para un alelo mutante" significa que al menos un alelo en un locus cromosómico específico en una célula o un organismo tiene una secuencia diferente a la del alelo o alelos en el locus/loci correspondiente en el otro cromosoma o cromosomas.

Una "mutación en una proteína" es un cambio de uno o más residuos de aminoácidos en comparación con la secuencia de tipo silvestre, por ejemplo, por sustitución, deleción, truncamiento o inserción de uno o más residuos de aminoácidos.

Los procedimientos biotecnológicos para introducir mutaciones en un gen/alelo deseado de una célula vegetal o planta son conocidos en la técnica. Por lo tanto, se pueden producir alelos mutantes de un gen codificador de la proteína similar a la ciclina SDS en células vegetales o plantas utilizando estos procedimientos. Los ejemplos de tales tecnologías son, en particular, las técnicas de mutagénesis o las enzimas que inducen roturas de ADN de doble cadena (enzima inductora de roturas de ADN de doble cadena (DSBI)) en el genoma de las plantas. Las tecnologías conocidas y practicadas son las endonucleasas de corte raro y las endonucleasas de corte raro a medida, incluidas, entre otras, las endonucleasas homing, también denominadas meganucleasas, los efectores similares a activadores de la transcripción fusionados al dominio catalítico de una nucleasa (TALEN) y los denominados sistemas CRISPR/Cas.

Todas estas tecnologías son aptas para introducir una mutación en genes de células vegetales o plantas. Por lo tanto, las células vegetales y las plantas de acuerdo con la invención que tienen un alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS, en el que la mutación en el alelo mutante se introdujo mediante endonucleasas de corte raro o endonucleasas de corte raro a medida son también una realización de la invención. Por lo que respecta a las endonucleasas de corte raro a medida, la mutación en el alelo mutante de una proteína similar a la ciclina SDS se ha introducido preferentemente mediante una meganucleasa, un TALEN o un sistema CRISPR/Cas.

Como se usa en la presente memoria, una "enzima inductora de rotura de ADN de doble cadena (DSBI)" es una enzima capaz de inducir una rotura de ADN de doble cadena en una secuencia de nucleótidos particular, llamada "sitio de reconocimiento". Las endonucleasas de corte raro son enzimas DSBI que tienen un sitio de reconocimiento de entre 14 y 70 nucleótidos consecutivos, por lo que su frecuencia de corte es muy baja, incluso en genomas de gran tamaño, como la mayoría de los genomas vegetales.

Las "endonucleasas homing, también llamadas meganucleasas", constituyen una familia de tales endonucleasas de corte raro. Pueden estar codificadas por intrones, genes independientes o secuencias intermedias, y presentan llamativas propiedades estructurales y funcionales que las distinguen de las enzimas de restricción más clásicas, generalmente procedentes de sistemas bacterianos de restricción-modificación de tipo II. Sus sitios de reconocimiento presentan una asimetría general que contrasta con la simetría diádica característica de la mayoría de los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción. Se ha demostrado que varias endonucleasas homing codificadas por intrones o inteínas promueven el homing de sus respectivos elementos genéticos en sitios alélicos intronless o inteinless. Al realizar una rotura de doble cadena específica en los alelos intrón o interón, estas nucleasas crean extremos recombinogénicos, que participan en un proceso de conversión génica que duplica la secuencia codificante y conduce a la inserción de un intrón o una secuencia intermedia en el ADN.

En la Tabla I del documento WO 03/004659 (páginas 17 a 20) se proporciona una lista de otras meganucleasas de escisión raras y sus respectivos sitios de reconocimiento, entre las que se incluyen I-Sce I, I-Chu I, I-Dmo I, I-Cre I, I-Csm I, PI-Fli I, Pt-Mtu I, I-Ceu I, I-Sce II, I-Sce III, HO, PI-Civ I, PI-Ctr I, PI-Aae I, PI-BSU I, PI-DhaI, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-Mch I, PI-Mfu I, PI-Mfl I, PI-Mga I, PI-Mgo I, PI-Min I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm I, PI-Mth I, PI-Mtu I, PI-Mxe I, PI-Npu I, PI-Pfu I, PI-Rma I, PI-Spb I, PI-Ssp I, PI-Fac I, PI-Mja I, PI-Pho I, PI-Tag I, PI-Thy I, PI-Tko I o PI-Tsp I.

Además, existen procedimientos para diseñar "endonucleasas de corte raro a medida" que reconocen básicamente cualquier secuencia de nucleótidos diana de elección. En pocas palabras, las enzimas de restricción quiméricas pueden prepararse utilizando híbridos entre un dominio zinc-finger diseñado para reconocer una secuencia de nucleótidos específica y el dominio no específico de clivaje de ADN de una enzima de restricción natural, como FokI. Tales procedimientos se han descrito, por ejemplo, en los documentos WO 03/080809, WO94/18313 o WO95/09233 y en Isalan et al., 2001, Nature Biotechnology 19, 656- 660; Liu et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530). Las meganucleasas a medida pueden producirse por selección a partir de una biblioteca de variantes, como se describe en el documento WO2004/067736. También pueden obtenerse meganucleasas a medida con especificidad de secuencia y afinidad de unión al ADN alteradas mediante diseño racional, como se describe en el documento WO2007/047859.

Otro ejemplo de endonucleasas diseñadas a medida incluyen las llamadas "nucleasas TALE (TALEN)", que se basan en efectores similares a activadores de transcripción (TALE) del género bacterianoXanthomonasfusionados al dominio catalítico de una nucleasa (por ejemplo FOKI). La especificidad de unión al ADN de estas TALE se define por diresiduos de repetición variable (RVD) de unidades de repetición de 34/35 aminoácidos dispuestas en tándem, de forma que un RVD reconoce específicamente un nucleótido en el ADN diana. Las unidades de repetición pueden ensamblarse para reconocer básicamente cualquier secuencia diana y fusionarse a un dominio catalítico de una nucleasa para crear endonucleasas específicas de secuencia (véanse, por ejemplo, Boch et al., 2009, Science 326:p1509-1512; Moscou and Bogdanove, 2009, Science 326:p1501; Christian et al., 2010, Genetics 186:p757-761; y los documentos WO10/079430, WO11/072246, WO2011/154393, WO11/146121, WO2012/001527, WO2012/093833, W O2012/104729, WO2012/138927, WO2012/138939). El documento WO2012/138927 describe además TALEN monoméricos (compactos) y TALEN con diversos dominios catalíticos y combinaciones de los mismos.

Recientemente, se ha descrito un nuevo tipo de sistema de endonucleasas personalizable; el denominado "sistema CRISPR/Cas", que emplea una molécula especial de ARN (ARNcr) que confiere especificidad de secuencia para guiar la escisión de una nucleasa Cas9 asociada (Jinek et al, 2012, Science 337:p816-821). Estas endonucleasas de corte raro diseñadas a medida también se denominan endonucleasas de corte raro de origen no natural.

Otro procedimiento conocido en la técnica para introducir mutaciones en un gen/alelo de una célula vegetal o planta es la denominada "mutagénesisin v ivo". En la presente memoria se describen a continuación las tecnologías correspondientes.

Las células vegetales o plantas de acuerdo con la invención que tienen un alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS, en el que la mutación en el alelo mutante se introdujo por mutagénesisin vivo,son también una realización de la invención.

Varias tecnologías comúnmente conocidas en la técnica son adecuadas para crear mutaciones de inserción en células vegetales o plantas.

Otras realizaciones de la invención son células vegetales y plantas de acuerdo con la invención que tienen un alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS, en el que la mutación en el alelo mutante se introdujo por mutagénesis de inserción.

Las células vegetales de acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con la invención que tienen un alelo mutante de un gen que codifica la proteína similar a la ciclina SDS pueden producirse mediante la denominada mutagénesis de inserción. En particular, la inserción de transposones y secuencias de ADN de transferencia (ADN-T) en genes/alelos que codifican proteínas similares a la ciclina SDS son adecuadas para disminuir la expresión y/o la actividad de los respectivos genes/alelos en los que se integran (Thorneycroft et al., 2001, Journal of experimental Botany 52 (361), 1593-1601).

A continuación, en la presente memoria se tratarán las respectivas tecnologías conocidas por un experto en la técnica.

Por "mutagénesis de inserción" debe entenderse, en particular, la inserción de transposones o del denominado ADN de transferencia (ADN-T) en un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS, mediante la cual, como resultado de la misma, disminuye la actividad de una proteína similar a la ciclina SDS en la célula en cuestión o se produce una proteína similar a la ciclina SDS no funcional.

En otra realización preferente, las plantas de acuerdo con la invención son plantas macho fértiles.

Las plantas de acuerdo con la invención son macho fértiles y producen frutos sin semillas cuando el alelo mutante similar a la ciclina SDS está presente en forma homocigótica. La ventaja de las plantas macho fértiles sobre las plantas macho estériles es que producirán polen viable y, por lo tanto, no es necesario plantar una segunda planta, llamada polinizadora, en el mismo campo para inducir el cuajado y el desarrollo de los frutos en la planta hembra productora de frutos sin semillas. De este modo, toda la superficie cultivada puede sembrarse con plantas que produzcan frutos sin semillas, lo que se traduce en un aumento del rendimiento de frutos sin semillas por superficie cultivada. También se da la sincronía de floración y época de fecundación para las partes masculina y femenina de la planta, ya que los óvulos y el polen son producidos por la misma planta. Esto garantiza una polinización suficiente para producir la mayor cantidad posible de frutos.

En el contexto de la presente invención, por "planta macho fértil" debe entenderse una planta que produce polen viable. Que se produce polen viable o fértil puede demostrarse, por ejemplo, utilizando el polen de la planta respectiva para la polinización cruzada de otra planta diferente y obteniendo semillas viables de este cruce.

El fenotipo productor de frutos sin semillas de las plantas de acuerdo con la invención en un aspecto no sólo se genera en plantas diploides sino también en plantas poliploides. En un aspecto, las plantas de acuerdo con la invención producen frutos sin semillas también cuando tienen diferente grado de ploidía. Por lo tanto, queda bien entendido que las células vegetales o las plantas de acuerdo con la invención comprenden plantas que tienen cualquier grado de ploidía que comprende plantas con grado de ploidía par (2n, 4n, 6n, 8n etc.) y plantas con grado de ploidía impar (3n, 5n etc.). En un aspecto, el gen mutante que codifica la proteína similar a la ciclina SDS es homocigótico en plantas diploides, pero en otro aspecto la proteína mutante similar a la SDS es homocigótica en plantas poliploides, como las sandías tetraploides. "Homocigoto en plantas poliploides" significa que el locus de cada cromosoma comprende el alelo mutante y no el alelo de tipo silvestre del gen.

La poliploidización está muy extendida en las plantas. Es responsable del aumento de la diversidad genética y de la producción de especies que muestran un aumento de la robustez, el tamaño, el vigor y la resistencia a las enfermedades. Las ventajas evidentes de las plantas poliploides son la heterosis y la redundancia de genes.

Un número de cultivos de hoy en día han sufrido una o más duplicaciones genómicas. Algunos ejemplos son el algodón (factor de multiplicación x6), la patata (x2, x3), el trigo panificable (x3), las semillas oleaginosas (x3), el maíz (x2), la soja (x2), el girasol (x2), el plátano (x2), la manzana (x2) y el café (x2)(Renny-Byfield 7 Wendel, 2014, American J. Botany, 101(10), 1711-1725).

En particular, en el cultivo de vegetales, la poliploidía en varias plantas se indujo mediante el uso de productos químicos como colchicina, colchamina, orizalina, colcemid, trifluralina o amiprofosmetil. Los ejemplos de duplicaciones del genoma en vegetales producidos mediante el uso de productos químicos son las coles de Bruselas diploides a partir de plantas haploides (2x), los guisantes tetraploides (2x), las sandías tetraploides (2x), las sandías almizcleras tetraploides (2x), cebollas tetraploides (2x), cocoyams octaploides (4x), calabazas serpiente tetraploides (2x), calabazas estriadas triploides y tetraploides (1,5x, 2x), pepinos tetraploides (2x) y judías francesas tetraploides (2x)(Kazi, 2015, J. Global Biosciences 4(3), 1774-1779).

Las plantas que comprenden un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS pueden producirse por diversos procedimientos comúnmente conocidos por un experto en la técnica. Estos procedimientos comprenden la utilización de semillas depositadas con el número de acceso NCIMB 42532. Una ventaja particular de estas semillas depositadas es que las plantas cultivadas a partir de las semillas que contienen el alelo mutante serán macho fértiles. Por lo tanto, el alelo mutante del gen codificador de la proteína similar a la ciclina SDS presente en dichas plantas puede introducirse en otras plantas utilizando el polen de plantas que comprenden un alelo mutante del gen codificador de la proteína similar a la ciclina SDS para fertilizar otras plantas, en particular otras plantas de sandía, especialmente sandías cultivadas. Dado que el alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS es recesivo, la producción de frutos sin semillas sólo se observa si no hay ningún alelo dominante de tipo silvestre de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS en la planta respectiva. Por lo tanto, en el caso de que un alelo de tipo silvestre de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS esté presente en las plantas, éstas producen frutos con semillas. Cuando se transfiere un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS de una semilla diploide, homocigota para un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS (por ejemplo, del depósito con número de acceso NCIMB 42532 o de su progenie) a otra planta que no contiene un alelo mutante recesivo de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS, la generación F1 será heterocigota y no mostrará el fenotipo de fruto sin semilla. En primer lugar, es necesario autopolinizar la F1 para obtener plantas que presenten el fenotipo de fruto sin semilla debido a la presencia de dos copias (homocigoto) del alelo mutante recesivo.

Una planta diploide que comprende dos copias de un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS puede usarse para hacer una planta tetraploide que comprende cuatro copias de un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina s Ds . Tal tetraploide tendrá el mismo fenotipo que el diploide, es decir, producirá frutos sin semillas (que son tetraploides) y polen viable.

Cuando se transfiere un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS de una planta tetraploide a otra planta tetraploide que no comprende el alelo mutante recesivo de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS, la generación F1 será heterocigota y no mostrará el fenotipo de fruto sin semilla. Nuevamente, el fenotipo de fruto sin semilla sólo se observará en la generación obtenida a partir de la generación F1 autopolinizada.

Como se ha mencionado, las plantas tetraploides que comprenden un fenotipo de fruto sin semilla pueden generarse duplicando los cromosomas de una planta diploide homocigótica para un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS (p. ej. a partir de semillas homocigóticas para un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina s Ds del depósito número de acceso NCIMB 42532 o a partir de plantas homocigóticas para un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS obtenidas tras cruzar una planta obtenida a partir de semillas del depósito número de acceso NCIMB 42532 con otra planta y, opcionalmente, autopolinizando posteriormente las plantas obtenidas de dicho cruce). Las plantas tetraploides así obtenidas comprenden cuatro copias de un alelo mutante de un gen mutante codificador de la proteína similar a la ciclina SDS.

Se entiende comúnmente en la técnica que las células de reproducción sexual de las plantas (polen y óvulo) comprenden un conjunto de cromosomas que es la mitad del conjunto de las células restantes de dicha planta. El polen y los óvulos de las plantas pueden regenerarse en plantas enteras. Por lo tanto, en el caso de las plantas con un grado de ploidía par, suele ser posible reducir el grado de ploidía a la mitad al regenerar el polen o los óvulos. A partir de plantas de acuerdo con la invención que tienen un grado de ploidía par (por ejemplo, 2n, 4n, 6n, 8n, etc.) se pueden producir plantas que tienen un conjunto biseccionado de cromosomas (por ejemplo, 1n, 2n, 3n, 4n, etc., respectivamente) mediante regeneración de polen u óvulos.

Las plantas diploides de acuerdo con la invención pueden, por ejemplo, regenerarse a partir de células de polen u óvulo que comprendan un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS, obteniéndose el polen o las células de óvulo de una planta tetraploide que comprenda un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS. Preferentemente, las células de polen u óvulo obtenidas de una planta tetraploide comprenden el alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS en estado homocigoto. Las plantas diploides derivadas pueden utilizarse posteriormente en la mejora genética y en la generación de plantas con un fenotipo de fruto sin semillas.

Se pueden producir plantas triploides cruzando una planta diploide (2n) de acuerdo con la invención con una planta tetraploide (4n) de acuerdo con la invención. Las semillas de plantas híbridas procedentes de dicho cruce serán triploides (3n). Preferentemente, las plantas diploides (2n) y tetraploides (4n) de acuerdo con la invención cruzadas entre sí son ambas homocigóticas para un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS. Las semillas triploides resultantes (y las plantas triploides cultivadas a partir de las semillas) tendrán tres copias del alelo mutante. La planta diploide utilizada para producir un híbrido triploide puede, por ejemplo, ser plantas obtenidas/obtenibles a partir de semillas que sean homocigotas para un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS obtenido a partir de semillas del depósito número de acceso NCIMB 42532.

Las plantas (p. ej. diploides, triploides o tetraploides, u otra ploidía) y partes de plantas (tales como frutos) que comprenden un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS obtenible/obtenido por uno de los procedimientos que se acaban de describir son también una realización de la invención. También las semillas a partir de las cuales se pueden cultivar dichas plantas constituyen una realización de la invención.

En una realización preferente de la invención, las células vegetales o plantas de acuerdo con la invención tienen un grado de ploidía par, preferentemente, son diploides (2n) o tetraploides (4n).

Las plantas con un grado impar de ploidía, por ejemplo, las plantas triploides (3n) son comúnmente estériles masculinas y femeninas, porque durante la meiosis los cromosomas no pueden dividirse por igual entre las células hijas. La ventaja de las plantas con un grado de ploidía par, por ejemplo, plantas diploides (2n) o tetraploides (4n) sobre las plantas con un grado de ploidía impar, por ejemplo, plantas triploides (3n), es que las plantas con un grado de ploidía par pueden producir polen viable y/u óvulos viables. Como consecuencia, las plantas con un grado de ploidía par pueden cultivarse sin necesidad de una segunda planta polinizadora diferente, necesaria para inducir la fructificación y el desarrollo de la planta con un grado de ploidía impar. Las plantas polinizadoras también producirán frutos que, por lo general, darán semillas. Estos frutos con semillas deben separarse de los frutos sin semillas en el momento de la cosecha o después de ella. Por lo tanto, las plantas con un grado de ploidía par tienen la ventaja sobre las plantas con un grado de ploidía impar de que no es necesario separar los frutos con semillas no deseados producidos por las plantas polinizadoras de los frutos sin semillas deseados.

"Grado de ploidía par" en el contexto de la presente invención significa que el número de conjuntos cromosómicos homólogos presentes en una célula u organismo cuando se divide por dos da como resultado un número entero. Por lo tanto, las células u organismos son diploides (2n), tetraploides (4n), hexaploides (6n), octaploides (8n), etc.

"Grado de ploidía impar" en el contexto de la presente invención significa que el número de conjuntos de cromosomas homólogos presentes en una célula u organismo cuando se divide por dos no da como resultado un número entero. Por lo tanto, las células u organismos son haploides (1n), triploides (3n), etc.

"Célula vegetal diploide o planta" en el contexto de la presente invención significa una planta, parte(s) vegetal(es) vegetativa(s), fruto o semilla o célula vegetal, que tiene dos conjuntos de cromosomas correspondientes, designados aquí como 2n.

"Célula o planta tetraploide" en el contexto de la presente invención significa una planta, parte(s) vegetal(es) vegetativa(s), fruto o semilla o célula vegetal, que tiene cuatro juegos de cromosomas correspondientes, designados aquí como 4n.

Las células vegetales de acuerdo con la invención pueden ser aquellas células vegetales que pueden regenerarse en una planta entera o aquellas que no pueden regenerarse en plantas enteras. Por lo tanto, las células vegetales de acuerdo con la invención pueden ser aquellas células vegetales que no son aptas para regenerar una planta entera.

En una realización preferente, las plantas de acuerdo con la invención son fértiles masculinas y tienen un grado de ploidía par. Preferentemente, las plantas de acuerdo con la invención son fértiles masculinas y son diploides (2n) o tetraploides (4n).

En otra realización preferente, las plantas de acuerdo con la invención son plantas estenospermocárpicas. Más preferentemente, las plantas de acuerdo con la invención son plantas estenospermocárpicas fértiles masculinas. Aún es más preferente que las plantas de acuerdo con la invención sean fértiles masculinas, estenospermocárpicas y tengan un grado de ploidía par. En particular, son preferentes las plantas de acuerdo con la invención que son fértiles masculinas, estenospermocárpicas, diploides (2n) o tetraploides (4).

Las plantas estenospermocárpicas producen frutos sin semillas. Las plantas estenospermocárpicas fértiles macho tienen la ventaja sobre las plantas estenospermocárpicas conocidas de que no necesitan una planta polinizadora diferente cultivada en la misma zona, pero que sin embargo producen frutos sin semillas. Las plantas polinizadoras producirán frutos con semillas no deseadas, que habrá que separar de los frutos sin semillas. Por lo tanto, las plantas estenospermocárpicas macho fértiles tienen la ventaja de que no hay competencia por el espacio de cultivo y los nutrientes entre una planta que produce los frutos sin semillas deseados y las plantas polinizadoras, lo que aumenta el rendimiento de los frutos sin semillas deseados por superficie de plantación disponible.

"Estenospermocarpia" se entiende generalmente en la técnica y también debe entenderse en relación con la presente invención en el sentido de que la inducción del cuajado y desarrollo de los frutos requiere polinización, pero sin que los frutos produzcan semillas maduras o viables. Las semillas maduras o viables no se desarrollan en las plantas estenospermocárpicas debido a la detención del desarrollo de la semilla o a la degradación de los óvulos y/o embriones y/o endosperma o al aborto de los óvulos y/o embriones y/o endosperma antes de alcanzar la madurez.

La partenocarpia debe diferenciarse de la estenospermocarpia. "Partenocarpia" se entiende generalmente en la técnica y también debe entenderse en relación con la presente invención para describir el desarrollo de frutos sin fecundación del óvulo femenino. No es necesario un proceso de polinización para producir frutos que, sin embargo, como consecuencia de la falta de polinización, carecen de semillas.

En otra realización preferente de la invención, las plantas de acuerdo con la invención producen frutos sin semillas.

Los frutos de las plantas de acuerdo con la invención pueden contener estructuras con apariencia de semilla. Estas estructuras con aspecto de semilla suelen ser blancas y blandas, a diferencia de las semillas de las plantas silvestres, que son duras y de color marrón oscuro o negro. Las estructuras con aspecto de semilla en los frutos de las plantas de acuerdo con la invención se denominan a veces semillas vacías. Sin embargo, no son verdaderas semillas, porque no comprenden un embrión viable, sino que son estructuras que se originan a partir del tegumento del óvulo.

En una realización más preferente de la invención, las plantas de acuerdo con la invención producen frutos sin semillas y/o son fértiles masculinas y/o tienen un grado uniforme de ploidía y/o son estenospermocárpicas. Las plantas aún más preferentes de acuerdo con la invención producen frutos sin semillas, son fértiles masculinas, son diploides (2n) o tetraploides (4n) y son estenospermocárpicas.

El término "fruto" en su significado botánico se suele entiende como una estructura portadora de semillas desarrollada a partir del ovario de las flores de las angiospermas.

Un "fruto sin semillas", tal como se utiliza comúnmente en la técnica y en particular en la cría, aunque contradice de alguna manera el significado botánico de "fruto", debe entenderse en el contexto de la presente invención como un fruto sin semillas maduras o viables. Las semillas maduras o viables pueden germinar en el suelo en condiciones adecuadas para la planta respectiva y convertirse en plantas. Esta prueba puede utilizarse para determinar si una planta produce frutos sin semillas. Los frutos sin semillas no producirán semillas que germinen y se conviertan en una planta en condiciones adecuadas para la planta respectiva.

Al conocer el gen causante de la producción de frutos sin semillas desvelado en la presente memoria, ahora es posible producir plantas productoras de frutos sin semillas mediante diversos procedimientos conocidos. Estos procedimientos pueden basarse en la producción y selección de plantas con alelos mutantes que codifiquen proteínas similares a la ciclina SDS no funcionales o alelos mutantes que codifiquen proteínas similares a la ciclina SDS con disminución o pérdida de función, o mediante el uso de agentes de mutación convencionales como productos químicos, radiación de alta energía (por ejemplo, rayos X, radiación de neutrones, radiación gamma o radiación UV). También es posible mediante tecnología genética producir plantas con proteínas similares a la ciclina SDS no funcionales o con una actividad disminuida de las proteínas similares a la ciclina SDS.

Las plantas de acuerdo con la invención pueden producirse introduciendo una o más mutaciones en un alelo de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS.

Un aspecto es un procedimiento para la producción de una planta de sandía, como se establece en la reivindicación 6 anexa, que comprende las etapas de

a) introducir mutaciones en una población de plantas de sandía

b) seleccionar una planta macho fértil que produzca frutos sin semillas

c) verificar si la planta seleccionada en b) tiene una mutación en un alelo que codifica un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS y seleccionar una planta que comprenda dicha mutación, y opcionalmente

d) plantar/cultivar las plantas obtenidas en c), en el que el alelo de tipo silvestre del gen codifica una proteína similar a la ciclina SDS que comprende al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de las proteínas seleccionadas del grupo de: SEQ ID NÚM.: 2

Sin embargo, en un aspecto el orden de las etapas también puede ser diferente.

Por lo tanto, en un aspecto, un procedimiento para la producción de una planta de sandía, tal como se establece en la reivindicación 5 anexa, que comprende las etapas de

a) introducir mutaciones en una población de plantas de sandía

b) identificar una planta que tiene una mutación en un alelo que codifica un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS, en la que el alelo de tipo silvestre del gen codifica una proteína similar a la ciclina SDS que comprende al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de las proteínas seleccionadas del grupo de: SEQ ID NÚM.: 2 y

c) determinar si la planta es macho fértil y si produce frutos sin semillas y

d) seleccionar una planta que contenga al menos una copia del alelo mutante de la etapa b).

El alelo mutante, cuando está en forma homocigota, resulta en la producción de frutos sin semillas. La planta que contiene el alelo es macho fértil.

En un aspecto, el alelo de tipo silvestre del gen codifica una proteína similar a la ciclina SDS que comprende al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de las proteínas seleccionadas del grupo de: SEQ ID NÚM.: 2

"Población de plantas" significará en el contexto de la presente invención más de una planta entera y comprenderá también partes de plantas, frutos, semillas o células vegetales. Las partes de la planta, los frutos, las semillas o las células de la planta proceden en cada caso de más de una planta, lo que significa que, en lo que respecta a una "población de partes de la planta, frutos, semillas o células de la planta", las partes de la planta, los frutos, las semillas o las células de la planta, respectivamente, no se obtienen de una sola planta, sino de una pluralidad de plantas.

Las sustancias químicas que pueden utilizarse para producir mutaciones inducidas químicamente y las mutaciones resultantes del efecto de los mutágenos correspondientes se describen, por ejemplo, en Ehrenberg and Husain, 1981, (Mutation Research 86, 1-113), Müller, 1972 (Biologisches Zentralblatt 91 (1), 31-48). La producción de mutantes del arroz utilizando radiación gamma, etilmetano sulfonato (EMS), N-metil-N-nitrosurea o azida sódica (NaN3) se describe, por ejemplo, en Jauhar and Siddiq (1999, Indian Journal of Genetics, 59 (1), 23-28), en Rao (1977, Cytologica 42, 443 450), Gupta and Sharma (1990, Oryza 27, 217-219) y Satoh and Omura (1981, Japanese Journal of Breeding 31 (3), 316-326). La producción de mutantes de trigo utilizandoNaN3 o hidrazida maleica se describe en Arora et al. (1992, Annals of Biology 8 (1), 65-69). En Scarascia-Mugnozza et al.se presenta una visión general de la producción de mutantes de trigo utilizando diferentes tipos de radiación rica en energía y sustancias químicas . (1993, Mutation Breeding Review 10, 1-28). Svec et al. (1998, Cereal Research Communications 26 (4), 391-396) describe el uso de la N-etil-N-nitrosurea para producir mutaciones en el triticale. El uso de MMS (ácido metilmetano sulfónico) y radiación gamma para la producción de mutantes de mijo se describe en Shashidhara et al. (1990, Journal of Maharashtra Agricultural Universities 15 (1), 20-23).

La fabricación de mutantes en especies vegetales, que se propagan principalmente de forma vegetativa, se ha descrito, por ejemplo, para las patatas, que producen un almidón modificado (Hovenkamp-Hermelink et al. (1987, Theoretical and Applied Genetics 75, 217-221) y para la menta con mayor rendimiento de aceite o calidad de aceite modificada (Dwivedi et al., 2000, Journal of Medicinal and Aromatic Plant Sciences 22, 460-463).

Todos estos procedimientos son básicamente adecuados en el procedimiento de producción de una planta de acuerdo con la invención para producir alelos mutantes en genes que codifican una proteína similar a la ciclina SDS. En el procedimiento para la producción de una planta de acuerdo con la invención preferentemente la población mutante se produce aplicando etilmetano sulfonato (EMS) a plantas o semillas de plantas para introducir mutaciones.

La selección de plantas que produzcan frutos sin semillas puede realizarse mediante un simple cribado/fenotipado visible de los frutos. Dado que el fenotipo de ausencia de semillas sólo se observa en condiciones homocigóticas, es preferente la autofecundación de la población de plantas mutagenizadas antes del fenotipado. Que una planta produce polen fértil puede demostrarse, por ejemplo, utilizando el polen de la planta respectiva para la polinización cruzada de otra planta fértil femenina diferente. En caso de que las semillas de este cruce sean viables, el polen utilizado en las polinizaciones cruzadas era fértil. Las mutaciones en los alelos apropiados, en particular en los alelos de los genes que codifican la proteína similar a la ciclina SDS, pueden encontrarse con la ayuda de procedimientos conocidos por el experto en la técnica. En particular, pueden utilizarse para ello análisis basados en hibridaciones con sondas (Southern Blot), amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secuenciación de secuencias genómicas relacionadas y búsqueda de intercambios de nucleótidos individuales. Un procedimiento de identificación de mutaciones basado en patrones de hibridación es, por ejemplo, la búsqueda de diferencias en la longitud de los fragmentos de restricción (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) (Nam et al., 1989, The Plant Cell 1 ,699 705; Leister and Dean, 1993, The Plant Journal 4 (4), 745-750). Un procedimiento basado en la PCR es, por ejemplo, el análisis de las diferencias de longitud de fragmentos amplificados (polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados, AFLP)(Castiglioni et al., 1998, Genetics 149, 2039-2056; Meksem et al., 2001, Molecular Genetics and Genomics 265, 207-214; Meyer et al., 1998, Molecular and General Genetics 259, 150-160). El uso de fragmentos amplificados extirpados con endonucleasas de restricción (Secuencias Polimórficas Amplificadas Escindidas, CAPS) también puede utilizarse para la identificación de mutaciones (Konieczny and Ausubel, 1993, The Plant Journal 4, 403 410; Jarvis et al., 1994, Plant Molecular Biology 24, 685-687; Bachem et al., 1996, The Plant Journal 9 (5), 745-753). Los procedimientos para la determinación de SNP han sido descritos porQi et al. (2001, Nucleic Acids Research 29 (22), e116) Drenkard et al. (2000, Plant Physiology 124, 1483-1492) y Cho et al. (1999, Nature Genetics 23, 203-207), entre otros.

Los procedimientos que permiten investigar varias plantas en busca de mutaciones en determinados genes en poco tiempo son especialmente adecuados. Este procedimiento, denominado TILLING (Lesiones Locales Inducidas por Objetivos EN Genomas), ha sido descrito por McCallum et al. (2000, Plant Physiology 123, 439-442).

Es bien conocido en la técnica, que hoy en día también otros procedimientos son útiles para identificar células vegetales de acuerdo con la invención y plantas de acuerdo con la invención que tienen un alelo mutante de un gen codificador de proteína similar a SDS de ciclina. Estos procedimientos comprenden, por ejemplo, los denominados enfoques de cribado directo. En los enfoques de cribado directo se produce una población mutante. Las plantas de la población mutante, por ejemplo, las plantas M2, se seleccionan para obtener plantas que produzcan frutos sin semillas, que luego se cruzan con varias líneas endocriadas diferentes para producir una población de asignación. A continuación, la población de asignación se analiza mediante procedimientos bien conocidos en la técnica para identificar el alelo causante del fenotipo de fruto sin semillas. Otros procedimientos para identificar si una célula vegetal o planta comprende un alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS comprenden la secuenciación de los alelos respectivos y análisis de marcadores SNP con procedimientos comunes en la técnica y, por ejemplo, discutidos en Thomson (2014, Plant Breeding and Biotechnology 2,195-212).

Estos procedimientos son básicamente adecuados para identificar células vegetales de acuerdo con la invención y plantas de acuerdo con la invención que tienen un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS.

El cultivo de las plantas macho fértiles, productoras de frutos sin semillas que tienen un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS identificada en el procedimiento para la producción de una planta de acuerdo con la invención puede realizarse por procedimientos convencionales en un invernadero o en el campo.

El cultivo y/o propagación de estas plantas puede realizarse por procedimientos comunes en la técnica como, por ejemplo, por esquejes, cultivosin vitrode tejidos, células, protoplastos, embriones o callos o micropropagación o por injerto de esquejes en un patrón diferente.

En una realización preferente de la invención, los procedimientos para la producción de una planta de acuerdo con la invención se utilizan para producir plantas de acuerdo con la invención. Las realizaciones preferentes descritas anteriormente para las plantas de acuerdo con la invención son, en consecuencia, aplicables a los procedimientos para la producción de una planta de acuerdo con la invención.

Las plantas obtenibles/obtenidas por el procedimiento para la producción de una planta de acuerdo con la invención son también una realización de la invención.

Varios procedimientos disponibles en tecnología genética ofrecen posibilidades adicionales para producir plantas con alelos mutantes de un gen codificador de proteínas similares a la ciclina SDS o con proteínas similares a la ciclina SDS no funcionales o con una actividad disminuida de proteínas similares a la ciclina SDS o que muestren una expresión disminuida de proteínas similares a la ciclina SDS.

Todos estos procedimientos se basan en la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña o de varias moléculas de ácido nucleico extrañas en el genoma de células vegetales o plantas y, por lo tanto, son básicamente adecuados para producir células vegetales de acuerdo con la invención y plantas de acuerdo con la invención.

Un aspecto adicional descrito en la presente memoria, pero no de acuerdo con la invención, por lo tanto se refiere a un procedimiento para producir una planta que comprende las etapas de

a) introducción de una molécula extraña de ácido nucleico en una planta, en la que la molécula extraña de ácido nucleico se elige del grupo que consiste en

i) moléculas de ADN, que codifican al menos un ARN antisentido, que efectúa una reducción de la expresión de un gen endógeno que codifica una proteína similar a la ciclina SDS;

ii) moléculas de ADN, que mediante un efecto de co-supresión conducen a la reducción de la expresión de un gen endógeno que codifica una proteína similar a la ciclina SDS;

iii) moléculas de ADN, que codifican al menos una ribozima, que divide transcritos específicos de un gen endógeno que codifica una proteína similar a la ciclina SDS;

iv) moléculas de ADN, que codifican simultáneamente al menos un ARN antisentido y al menos un ARN sentido, en el que dicho ARN antisentido y dicho ARN sentido forman una molécula de ARN de doble cadena, que efectúa una reducción de la expresión de un gen endógeno que codifica una proteína similar a la ciclina SDS que tiene (tecnología ARNi);

v) moléculas de ácido nucleico introducidas mediante mutagénesisin vivo,que conducen a una mutación o a una inserción de una secuencia heteróloga en un gen endógeno que codifica una proteína similar a la ciclina SDS, en el que la mutación o inserción produce una reducción de la expresión de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS o da lugar a la síntesis de una proteína similar a la ciclina SDS inactiva;

vi) moléculas de ácido nucleico, que codifican un anticuerpo, en el que el anticuerpo produce una disminución de la actividad de un gen endógeno que codifica una proteína similar a la ciclina SDS debido a la unión del anticuerpo a una proteína endógena similar a la ciclina SDS,

vii) moléculas de ADN que contienen transposones, en las que la integración de estos transposones da lugar a una mutación o una inserción en un gen endógeno que codifica una proteína similar a la ciclina SDS, lo que produce una reducción de la expresión de un gen endógeno que codifica una proteína similar a la ciclina SDS, o da lugar a la síntesis de una proteína similar a la ciclina SDS inactiva;

viii) moléculas de ADN-T que, debido a su inserción en un gen endógeno que codifica una proteína similar a la ciclina SDS, efectúan una reducción de la expresión de un gen endógeno que codifica una proteína similar a la ciclina SDS, o dan lugar a la síntesis de una proteína similar a la ciclina SDS inactiva, y/o

ix) moléculas de ácido nucleico que codifican endonucleasas de corte raro o endonucleasas de corte raro a medida, preferentemente una meganucleasa, un TALEN o un sistema CRISPR/Cas

b) seleccionar una planta que produzca frutos sin semillas, opcionalmente

c) verificar si la planta seleccionada en b) tiene una actividad disminuida de una proteína similar a la ciclina SDS en comparación con las plantas de tipo silvestre en cuyo genoma no se han integrado moléculas de ácido nucleico extrañas, y opcionalmente

d) cultivar las plantas obtenidas en c).

En un aspecto descrito en la presente memoria, pero que no está de acuerdo con invención, el procedimiento que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña en una célula vegetal se refiere a un procedimiento para la producción de una planta fértil masculina, lo que significa que tiene lugar la selección de una planta que sea fértil masculina y produzca frutos sin semillas (en la etapa b y/o c).

La disminución de la actividad de las proteínas similares a la ciclina SDS en las células vegetales o plantas descritas en la presente memoria, pero que no está de acuerdo con invención, o en el procedimiento descrito en la presente memoria, pero que no está de acuerdo con invención, que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña en una célula vegetal puede producirse mediante la expresión de constructos antisentido o de cosupresión.

Para inhibir la expresión de genes por medio de la tecnología antisentido o de co-supresión, se puede utilizar, por ejemplo, una molécula de ADN que incluya toda la secuencia codificante para una proteína similar a la ciclina s Ds , incluyendo cualquier secuencia flanqueante existente, así como moléculas de ADN, que incluyan sólo partes de la secuencia codificante, por lo que estas partes deben ser lo suficientemente largas para producir un efecto antisentido o un efecto de co-supresión respectivamente en las células. En general, son adecuadas las secuencias con una longitud mínima de 20 pb o 21 pb (o nucleótidos), preferentemente una longitud mínima de al menos 100 pb (o nucleótidos), particularmente preferentemente de al menos 500 pb (o nucleótidos). Por ejemplo, las moléculas de ADN tienen una longitud de 21-100 pb (o nucleótidos), preferentemente de 100-500 pb (o nucleótidos), particularmente preferentemente más de 500 pb (o nucleótidos).

El uso de secuencias de ADN, que tienen un alto grado de identidad con las secuencias endógenas que ocurren en la célula vegetal y que codifican proteínas similares a la ciclina SDS, también es adecuado para preparaciones antisentido o de co-supresión. La identidad mínima debe ser superior a aproximadamente el 65%, preferentemente superior al 80%. Es preferente utilizar secuencias con identidades de al menos el 90%, en particular entre el 95% y el 100%. El significado del término "identidad de secuencia" se define en la presente memoria.

Además, el uso de intrones, es decir, de áreas no codificantes de genes, que codifican para proteínas similares a la ciclina SDS, también es concebible para lograr un efecto antisentido o de co-supresión. El uso de secuencias intrónicas para inhibir la expresión génica de genes que codifican proteínas de la biosíntesis del almidón se ha descrito, por ejemplo, en las solicitudes internacionales de patente WO97/04112, WO97/04113, WO98/37213, WO98/37214.

El experto en la técnica sabe cómo conseguir un efecto antisentido y de co-supresión. Por ejemplo, el procedimiento de inhibición por co-supresión se ha descrito en Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344), Niebel et al., (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91-103), Flavell et al. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 43-46), Palaqui and Vaucheret (Plant. Mol. Biol. 29 (1995), 149-159), Vaucheret et al., (Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 311-317), de Borne et al. (Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 613-621).

La expresión de ribozimas para reducir la actividad de enzimas particulares en células también es conocida por el experto en la técnica, y se describe, por ejemplo, en el documento EP-B1 0321201. La expresión de ribozimas en células vegetales se ha descrito, por ejemplo, en Feyter et al. (Mol. Gen. Genet. 250, (1996), 329-338).

La disminución de la actividad de las proteínas similares a la ciclina SDS en las células vegetales o plantas descritas en la presente memoria, pero que no está de acuerdo con invención, o en el procedimiento descrito en la presente memoria, pero que no está de acuerdo con invención, que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña en una célula vegetal también puede producirse mediante la expresión simultánea de moléculas de ARN en sentido y antisentido (tecnología de ARNi) del gen diana respectivo que debe reprimirse, preferentemente del gen que codifica la proteína similar a la ciclina SDS.

Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante el uso de construcciones quiméricas, que contienen "repeticiones invertidas" del gen diana respectivo o partes del gen diana. En este caso, las construcciones genéricas codifican moléculas de ARN sentido y antisentido del gen diana respectivo. El ARN sentido y el ARN antisentido se sintetizan simultáneamenteen la plantacomo una molécula de ARN, en la que el ARN sentido y el ARN antisentido están separados entre sí por un espaciador, y son capaces de formar una molécula de ARN de doble cadena.

Se ha demostrado que la introducción de constructos de ADN de repetición invertida en el genoma de células vegetales o plantas es un procedimiento muy eficaz para reprimir los genes correspondientes a los constructos de ADN de repetición invertida (Waterhouse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, (1998), 13959-13964; Wang and Waterhouse, Plant Mol. Biol. 43, (2000), 67-82; Singhet al., Biochemical Society Transactions Vol.28 parte 6 (2000), 925- 927; Liu et al., Biochemical Society Transactions Vol. 28 part 6 (2000), 927-929); Smith et al., (Nature 407, (2000), 319-320; solicitud de patente internacional WO99/53050 A1). Las secuencias en sentido y antisentido del gen diana o de los genes diana también pueden expresarse por separado mediante promotores similares o diferentes (Nap, J-P et al, 6th International Congress of Plant Molecular Biology, Quebec, 18th-24th June, 2000; Poster S7-27, Presentation Session S7). La disminución de la actividad de las proteínas similares a la ciclina SDS en las células vegetales descritas en la presente memoria, pero que no se ajustan a la invención, o en las plantas descritas en la presente memoria, pero que no se ajustan a la invención, también puede lograrse mediante la producción de moléculas de ARN de doble cadena. A este respecto, se introducen preferentemente en el genoma de las plantas "repeticiones invertidas" de moléculas de ADN de genes o ADNc codificantes de proteínas similares a la ciclina SDS, en las que las moléculas de ADN (gen o ADNc codificante de proteínas similares a la ciclina SDS o fragmentos de estos genes o ADNc) que han de transcribirse están bajo el control de un promotor, que controla la expresión de dichas moléculas de ADN.

Por lo tanto, en la presente memoria también se describen fragmentos de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas similares a la ciclina SDS. Dichos fragmentos tienen diversos usos, por ejemplo, como cebadores o sondas, o pueden incorporarse a vectores de transformación y utilizarse para generar plantas que produzcan frutos sin semillas.

Tales fragmentos de moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas similares a la ciclina SDS pueden ser de varios tamaños, por ejemplo, al menos 10 nucleótidos, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500 nucleótidos o más.

Además de esto, se sabe que la formación de moléculas de ARN de doble cadena a partir de moléculas de ADN promotor en plantasin transpuede conducir a la metilación e inactivación transcripcional de copias homólogas de estos promotores, que se denominarán en lo sucesivo promotores diana (Mette et al., EMBO J. 19, (2000), 5194 5201). Por lo tanto, es posible reducir la expresión génica de un gen diana particular (por ejemplo, el gen que codifica la proteína similar a la ciclina SDS), que está naturalmente bajo el control de este promotor diana, desactivando el promotor diana. Esto significa que, en este caso, las moléculas de ADN, que incluyen los promotores diana de los genes a reprimir (genes diana), a diferencia de la función original de los promotores en las plantas, no se utilizan como elementos de control para la expresión de genes o ADNc, sino que se utilizan ellas mismas como moléculas de ADN transcribibles.

Para la producción de moléculas de ARN promotor diana de doble cadenaen planta,que pueden producirse allí como moléculas de ARN en horquilla, se utilizan preferentemente construcciones que contienen las "repeticiones invertidas" de las moléculas de ADN promotor diana, en las que las moléculas de ADN promotor diana están bajo el control de un promotor que controla la expresión génica de dichas moléculas de ADN promotor diana. Estos constructos se introducen posteriormente en el genoma de las plantas. La expresión de las "repeticiones invertidas" de dichas moléculas de ADN promotor diana in plantaconduce a la formación de moléculas de ARN promotor diana de doble cadena (Mette et al., EMBO J. 19, (2000), 5194-5201). El promotor diana puede inactivarse por este medio. Por consiguiente, la disminución de la actividad de las proteínas similares a la ciclina SDS en células vegetales y plantas también puede lograrse mediante la introducción de moléculas de ARN de doble cadena de secuencias promotoras de genes codificadores de proteínas similares a la ciclina SDS en células vegetales o plantas. A este respecto, las "repeticiones invertidas" de moléculas de ADN promotor de genes codificantes de proteínas similares a la ciclina SDS se introducen preferentemente en el genoma de las plantas, en las que las moléculas de ADN promotor diana (promotor de un gen codificante de proteínas similares a la ciclina SDS) que deben transcribirse están bajo el control de un promotor, que controla la expresión de dichas moléculas de ADN promotor diana.

Para inhibir la expresión de genes mediante la expresión simultánea de moléculas de ARN en sentido y antisentido (tecnología ARNi), se puede utilizar, por ejemplo, una molécula de ADN que incluya toda la secuencia codificante para una proteína similar a la ciclina SDS, incluyendo cualquier secuencia flanqueante existente, así como moléculas de ADN, que incluyan sólo partes de la secuencia codificante, por lo que estas partes deben ser lo suficientemente largas para producir un efecto denominado ARNi en las células. Las partes del gen codificante de la proteína similar a la ciclina SDS pueden elegirse entre secuencias codificantes, secuencias no traducidas descendentes o ascendentes, intrones, promotores y/o potenciadores. En general, son adecuadas las secuencias con una longitud mínima de 20 pb (o nucleótidos), preferentemente una longitud mínima de al menos 25 pb (o nucleótidos), particularmente preferentemente de al menos 50 pb (o nucleótidos). Por ejemplo, las moléculas de ADN tienen una longitud de 20 a 25 pb (o nucleótidos), preferentemente de 26 a 50 pb (o nucleótidos), particularmente preferentemente superior a 50 pb (o nucleótidos).

El uso de secuencias de ADN, que tienen un alto grado de identidad con las secuencias endógenas que ocurren en las células vegetales y que codifican una proteína similar a la ciclina SDS, también es adecuado para la expresión simultánea de moléculas de ARN sentido y antisentido (tecnología ARNi). La identidad mínima debe ser superior a aproximadamente el 65%, preferentemente superior al 80%. Especialmente es preferente el uso de secuencias con identidades de al menos el 90%, en particular entre el 95% y el 100%. Las secuencias, que contienen tramos sucesivos de secuencias de ácidos nucleicos comprendidas por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada bajo SEQ ID NÚM.: 1, son particularmente adecuadas para inhibir genes codificantes de proteínas similares a la ciclina SDS mediante la tecnología de ARNi.

La disminución de la actividad de proteínas similares a la ciclina SDS en células vegetales y plantas o en el procedimiento descrito en la presente memoria, pero que no está de acuerdo con invención, que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña en una célula vegetal puede lograrse mediante la llamada "mutagénesisin vivo",en la que un oligonucleótido híbrido ARN-ADN ("Quimeroplasto") se introduce en células vegetales(Kipp, P.B. et al., Poster Session at the "5th International Congress of Plant Molecular Biology, 21st-27th September 1997, Singapore; R. A. Dixon and C.J. Arntzen, meeting report on "Metabolic Engineering in Transgenic Plants", Keystone Symposia, Copper Mountain, CO, USA, TIBTE<c>H 15, (1997), 441-447; solicitud de patente internacional WO 9515972; Kren et al., Hepatology 25, (1997), 1462-1468; Cole-Strauss et al., Science 273, (1996), 1386-1389; Beetham et al., 1999, PNAS 96, 8774-8778).

Una parte de los componentes de ADN del oligonucleótido de ARN-ADN es homóloga a una secuencia de ácido nucleico de un gen codificador de proteína similar a la ciclina SDS endógena, pero, en comparación con la secuencia de ácido nucleico de un gen codificador de proteína similar a la ciclina SDS endógena, tiene una mutación o contiene una región heteróloga, que está rodeada por las regiones homólogas. Por emparejamiento de bases de las regiones homólogas del oligonucleótido de ARN-ADN y la molécula de ácido nucleico endógena seguido de recombinación homóloga, la mutación o región heteróloga contenida en los componentes de ADN del oligonucleótido de ARN-ADN puede transferirse al genoma de una célula vegetal. Esto conduce a una disminución de la actividad de una o más proteínas similares a la ciclina SDS.

La disminución de la actividad de las proteínas similares a la ciclina SDS en células vegetales y plantas o en el procedimiento descrito en la presente memoria, pero que no está de acuerdo con invención, que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña en una célula vegetal puede lograrse introduciendo moléculas de ácido nucleico que codifican antagonistas/inhibidores de las proteínas similares a la ciclina SDS en una célula vegetal. El experto en la técnica sabe que puede conseguir una disminución de la actividad de proteínas similares a la ciclina SDS mediante la expresión de derivados no funcionales, en particular mutaciones transdominantes, de dichas proteínas, y/o mediante la expresión de antagonistas/inhibidores de dichas proteínas. Los antagonistas/inhibidores de dichas proteínas incluyen, por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o moléculas con características de enlace similares. Por ejemplo, se ha utilizado un anticuerpo scFv citoplasmático para modular la actividad de la proteína fitocromo A en plantas de tabaco modificadas genéticamente (Owen, Bio/Technology 10 (1992), 790-4; Review: Franken, E, Teuschel, U. and Hain, R., Current Opinion in Biotechnology 8, (1997), 411-416; Whitelam, Trends Plant Sci. 1 (1996), 268-272; Conrad and Manteufel, Trends in Plant Science 6, (2001), 399-402; De Jaeger et al., Plant Molecular Biology 43, (2000), 419-428). La disminución de la actividad de una enzima de ramificación en plantas de patata mediante la expresión de un anticuerpo específico ha sido descrita por Jobling et al. (Nature Biotechnology 21, (2003), 77-80). En este caso, el anticuerpo estaba provisto de una secuencia diana plastidial, de modo que se garantizaba la inhibición de las proteínas localizadas en los plástidos.

La disminución de la actividad de proteínas similares a la ciclina SDS en células vegetales y plantas o en el procedimiento descrito en la presente memoria, pero que no está de acuerdo con invención, que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña en una célula vegetal puede lograrse introduciendo moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de transposón en la célula vegetal. La inserción de secuencias de transposones en la secuencia de un gen endógeno codificador de una proteína similar a la ciclina SDS, producirá una reducción en la expresión de una proteína endógena similar a la ciclina SDS.

Los transposones pueden ser transposones endógenos (homólogos a la planta) y también aquellos que no se dan de forma natural en dicha célula (heterólogos a la planta) pero que en cada caso tienen que ser introducidos en una célula vegetal o planta mediante procedimientos de ingeniería genética, como la transformación de una célula, por ejemplo. La modificación de la expresión de los genes mediante transposones es conocida por los expertos en la técnica. En Ramachandran and Sundaresan (2001, Plant Physiology and Biochemistry 39, 234-252) se presenta una visión general del uso de transposones endógenos y heterólogos como herramientas en biotecnología vegetal. La posibilidad de identificar mutaciones en las que genes específicos han sido inactivados por mutagénesis de inserción de transposones se presenta en una visión general de Maes et al. (1999, Trends in Plant Science 4 (3), 90-96). La producción de mutantes de arroz con la ayuda de transposones endógenos es descrita por Hirochika (2001, Current Opinion in Plant Biology 4, 118-122). La identificación de genes de maíz con la ayuda de retrotransposones endógenos es presentada, por ejemplo, por Hanley et al. (2000, The Plant Journal 22 (4), 557-566). La posibilidad de fabricar mutantes con ayuda de retrotransposones y los procedimientos de identificación de mutantes son descritos por Kumar and Hirochika (2001, Trends in Plant Science 6 (3), 127-134). La actividad de los transposones tecnológicos (artificiales) en diferentes especies se ha descrito tanto para dicotiledóneas como para monocotiledóneas: por ejemplo, para el arroz(Greco et al., 2001, Plant Physiology 125, 1175-1177; Liu etal., 1999 , Molecular and General Genetics 262, 413-420; Hiroyuki et al., 1999, The Plant Journal 19 (5), 605-613; Jeon und Gynheung, 2001, Plant Science 161, 211-219), cebada (2000, Koprek et al., The Plant Journal 24 (2), 253-263)Arabidopsis thaliana(Aarts et al., 1993, Nature 363, 715-717, Schmidt und Willmitzer, 1989, Molecular and General Genetics 220, 17-24; Altmann et al., 1992, Theoretical and Applied Genetics 84, 371-383; Tissier et al.,1999 , The Plant Cell 11, 1841-1852), tomate (Belzile und Yoder, 1992, The Plant Journal 2 (2), 173-179) y patata (Frey et al., 1989, Molecular and General Genetics 217, 172 177; Knapp et al., 1988, Molecular and General Genetics 213, 285-290).

Básicamente, las células vegetales y las plantas pueden producirse tanto con la ayuda de transposones homólogos como heterólogos.

En conjunción con la presente invención, las células vegetales y las plantas descritas en la presente memoria, pero que no se ajustan a la invención, también pueden producirse mediante el uso de la denominada mutagénesis de inserción (artículo de resumen: Thomeycroft et al., 2001, Journal of experimental Botany 52 (361), 1593-1601). La disminución de la actividad de las proteínas similares a la ciclina s Ds en células vegetales y plantas o en el procedimiento descrito en la presente memoria, pero que no está de acuerdo con invención, que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña en una célula vegetal puede lograrse introduciendo moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de ADN-T en la célula vegetal.

La mutagénesis por inserción de ADN-T se basa en el hecho de que ciertas secciones (ADN-T) de los plásmidos Ti deAgrobacteriumpueden integrarse en el genoma de las células vegetales. El lugar de integración en el cromosoma de la planta no está definido, sino que puede tener lugar en cualquier punto. Si el ADN-T se integra en una parte del cromosoma, que constituye una función génica, entonces esto puede conducir a un cambio en la expresión génica y, por tanto, también a un cambio en la actividad de una proteína codificada por el gen en cuestión. En particular, la integración de un ADN-T en el área codificante de una proteína a menudo provoca que la proteína correspondiente ya no pueda ser sintetizada en absoluto, o ya no sea sintetizada en forma activa, por la célula en cuestión. El uso de inserciones de ADN-T para producir mutantes se describe, por ejemplo, paraArabidopsis thaliana(Krysan et al., 1999, The Plant Cell 11, 2283-2290; Atipiroz-Leehan and Feldmann, 1997, Trends in genetics 13 (4), 152-156; Parinov and Sundaresan, 2000, Current Opinion in Biotechnology 11, 157-161) y arroz (Jeon and An, 2001, Plant Science 161,211 219; Jeon et al., 2000, The Plant Journal 22 (6), 561-570). Los procedimientos para identificar mutantes, que se han producido con la ayuda de la mutagénesis por inserción de ADN-T, se describen, entre otros, por Young et al., (2001, Plant Physiology 125, 513-518), Parinov et al. (1999, The Plant cell 11,2263-2270), Thorneycroft et al. (2001, Journal of Experimental Botany 52, 1593-1601), y McKinney et al. (1995, The Plant Journal 8 (4), 613-622).

Los mutantes de inserción de ADN-T se han producido en grandes cantidades paraArabidopsis thaliana,por ejemplo, y están disponibles en diferentes colecciones de cultivos ("Stock centre", por ejemplo, Salk Institute Genomic Analysis Laboratory, 10010 N. Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, http://signal.salk.edu/).

La mutagénesis T-ADN es básicamente adecuada para la producción de células vegetales y plantas que tienen una actividad disminuida de una proteína similar a la ciclina SDS.

En relación con la presente invención, se entiende que el término "molécula de ácido nucleico extraña" significa una molécula de ácido nucleico que no se encuentra de forma natural en las células o plantas vegetales de tipo silvestre correspondientes, o que no se encuentra de forma natural en la disposición espacial particular en las células o plantas vegetales de tipo silvestre, o que está localizada en un lugar del genoma de la célula o planta vegetal en el que no se encuentra de forma natural. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico extraña es una molécula recombinante, que consta de diferentes elementos, cuya combinación o disposición espacial específica no se da de forma natural en las células vegetales o en las plantas.

En principio, una molécula de ácido nucleico extraña puede ser cualquier molécula de ácido nucleico que efectúe una disminución en la actividad de una proteína similar a la ciclina SDS. Este tipo de moléculas de ácido nucleico se han descrito anteriormente en la presente memoria.

En relación con la presente invención, el término "genoma" debe entenderse como la totalidad del material genético presente en una célula vegetal. Es sabido por el experto en la técnica que, además del núcleo celular, otros compartimentos (por ejemplo, los plástidos o la mitocondria) también contienen material genético.

Existe un gran número de técnicas para la introducción de ADN en una célula huésped vegetal. Estas técnicas incluyen la transformación de células vegetales con ADN-T utilizandoAgrobacterium tumefaciensoAgrobacterium rhizogenescomo medio de transformación, la fusión de protoplastos, la inyección de ácidos nucleicos, la electroporación de ácidos nucleicos, la introducción de ácidos nucleicos mediante el enfoque biolístico, así como otras posibilidades.

El uso de la transformación de células vegetales mediada por Agrobacteria ha sido intensamente investigado y adecuadamente descrito en el documento EP 120516; Hoekema, IN: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46 y por An et al. EMBO J. 4, (1985), 277-287. Para la transformación de la patata, véase, por ejemplo, Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8, (1989), 29 33.

También se ha descrito la transformación de plantas monocotiledóneas mediante vectores basados en la transformación deAgrobacterium(Chan et al., Plant Mol. Biol. 22, (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6, (1994) 271 282; Deng et al, Science in China 33, (1990), 28-34; Wilmink et al., Plant Cell Reports 11, (1992), 76-80; May et al., Bio/Technology 13, (1995), 486-492; Conner and Domisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555; Ritchie et al, Transgenic Res. 250, (1996), 252-338). Un sistema alternativo a la transformación de plantas monocotiledóneas es la transformación mediante el enfoque biolístico (Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37-48; Vasil e ta l., Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24, (1994), 317-325; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625-631), la transformación de protoplastos, la electroporación de células parcialmente permeabilizadas y la introducción de ADN mediante fibras de vidrio. En particular, la transformación del maíz se ha descrito muchas veces en la literatura (cf. por ejemplo documentos WO95/06128, EP0513849, EP0465875, EP0292435; Frommetal., Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2, (1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc et al., Theor. Appl. Genet.

250, (1996), 721-338). También se ha descrito ya la transformación con éxito de otros tipos de cereales, por ejemplo, para la cebada (Wan and Lemaux, véase más arriba; Ritala et al., véase más arriba; Krens et al., Nature 296, (1982), 72-74) y para el trigo (Nehra et al., Plant J. 5, (1994), 285-297; Becker et al., 1994, Plant Journal 5, 299-307). Todos los procedimientos anteriores son adecuados en el marco de la presente invención. La transformación de cultivos vegetales también se conoce comúnmente en la técnica. En Curtis (2012, Springer Science & Business Media, ISBN: 1402023332, 9781402023330) además de otros, se desvelan procedimientos para la transformación de café, piña, pera, rábano, zanahoria, guisante, col, coliflor y sandía. La transformación de cultivos vegetales como el plátano, los cítricos, el mango, la papaya, la sandía, el aguacate, la uva, el melón (dulce), el kiwi, el café y el cacao se ha descrito en Pua and Davey (2007, Springer Science & Business Media, ISBN: 3540491619, 9783540491613).

Para expresar moléculas de ácido nucleico, como las que confieren un efecto de silenciamiento génico o se utilizan para introducir mutaciones en un alelo en células vegetales o plantas, estos ácidos nucleicos están preferentemente unidos a secuencias reguladoras de ADN, incluidas las que inician la transcripción en células vegetales (promotores). Al mismo tiempo, el promotor puede elegirse para que la expresión tenga lugar de forma constitutiva o sólo en un tejido determinado, en una fase concreta del desarrollo de la planta o en un momento determinado por influencias externas. El promotor puede ser homólogo o heterólogo tanto con respecto a la planta como con respecto a la molécula de ácido nucleico. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico no suelen estar presentes de forma natural en las plantas, sino que son moléculas de ácido nucleico recombinantes, lo que significa que la combinación de diferentes elementos genéticos (por ejemplo, secuencias codificantes, secuencia complementaria de ARNi, promotores) que comprende la molécula de ácido nucleico no están presentes en esta combinación en la naturaleza.

Los promotores adecuados son comúnmente conocidos en la técnica, por ejemplo, el promotor del ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor y el promotor de ubiquitina del maíz para la expresión constitutiva, el promotor de patatina B33(Rocha-Sosa et al., e Mb O J. 8 (1989), 23-29) para la expresión específica del tubérculo de la patata o un promotor que sólo garantiza la expresión en tejidos fotosintéticamente activos, por ejemplo, el promotor ST-LS1(Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) o, para la expresión específica del endospermo, del promotor HMG del trigo, del promotor USP, del promotor phaseolin, de los promotores de los genes de la zeína del maíz (Pedersen et al., Cell 29 (1982), 1015-1026; Quatroccio et al., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93), promotor de la glutelina (Leisy et al., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng et al., Plant J. 4 (1993), 357-366; Yoshihara et al., FEBS Lett. 383 (1996), 213-218) o el promotor shrunken-1(Werr et al., EMBO J. 4 (1985), 1373-1380). Sin embargo, también pueden utilizarse promotores que sólo se activan en un momento determinado por influencias externas (véase, por ejemplo, el documento WO 9307279). Los promotores de proteínas de choque térmico, que permiten una inducción sencilla, pueden ser de especial interés en este caso. Además, pueden utilizarse promotores específicos de semillas, como el promotor USP deVicia faba,que garantiza una expresión específica de semillas enVicia fabay otras plantas (Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Baumlein et al., Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 459-621).

La molécula de ácido nucleico recombinante también puede contener una secuencia de terminación (señal de poliadenilación), que se utiliza para añadir una cola poli-A a la transcripción. Se atribuye a la cola poli-A una función en la estabilización de los transcritos. Los elementos de este tipo están descritos en la literatura (cf. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) y pueden intercambiarse a voluntad.

También pueden estar presentes secuencias intrón, por ejemplo entre el promotor y la región codificante. Tales secuencias de intrones pueden conducir a la estabilidad de la expresión y a una mayor expresión en las plantas (Callis et al., 1987, Genes Devel. 1, 1183-1200; Luehrsen, y Walbot, 1991, Mol. Gen. Genet. 225, 81-93; Rethmeier, et al., 1997; Plant Journal. 12(4): 895-899; Rose and Beliakoff, 2000, Plant Physiol. 122 (2), 535-542; Vasil et al., 1989, Plant Physiol. 91, 1575-1579; XU et al., 2003, Science in China Series C Vol.46 No.6, 561-569). Las secuencias de intrones adecuadas son, por ejemplo, el primer intrón del genshldel maíz, el primer intrón del gen 1 de la poliubiquitina del maíz, el primer intrón del genepspsdel arroz o uno de los dos primeros intrones del gen PAT1 deArabidopsis.

Lo que se ha descrito en la presente memoria en relación con la verificación de si una planta tiene una mutación en una secuencia de ácido nucleico o un gen o alelo que codifica una proteína similar a la ciclina SDS y para el crecimiento/cultivo de las plantas para el procedimiento para producir una planta de acuerdo con la invención también es aplicable aquí para el procedimiento descrito en la presente memoria, pero que no está de acuerdo con la invención, que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña en una célula vegetal de acuerdo con la invención.

En otro aspecto, los procedimientos para producir una planta y el procedimiento descrito en la presente memoria, pero que no está de acuerdo con invención, que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña en una célula vegetal comprenden una etapa adicional que consiste en la producción de otras plantas a partir de las plantas obtenidas de la etapa d) en cada uno de los procedimientos. Las plantas adicionales producidas se caracterizan porque comprenden al menos un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS o porque tienen una actividad disminuida de una proteína similar a la ciclina SDS debido a la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña como la descrita anteriormente en la presente memoria. Estas plantas adicionales pueden producirse mediante reproducción vegetativa (agámica) o generativa (gámica, sexual). Para la propagación vegetativa son adecuados, por ejemplo, esquejes, cultivosin vitrode tejidos, células, protoplastos, embriones o callos, procedimientos de micropropagación, rizomas o tubérculos. Otros materiales de propagación incluyen, por ejemplo, frutos, semillas, plántulas, que sean heterocigotos u homocigotos para un alelo mutante de una ciclina s Ds como los genes que codifican la proteína, etc.

Las técnicas de propagación vegetativa (agámica), incluida la micropropagación de plantas, son bien conocidas en la técnica y, por ejemplo, se han descrito para el plátano, los cítricos, el mango, la papaya, el aguacate y el melón (dulce) en Pua and Davey (2007, Springer Science & Business Media, ISBN: 3540491619, 9783540491613). Sultana and Rhaman (2012, lA p Lambert Academic Publishing, ISBN-13: 978-3-8484-3937-9) desvelan, por ejemplo, diversos procedimientos de cultivo de tejidos y micropropagación de sandías.

Las plantas obtenibles/obtenidas por un procedimiento descrito en la presente memoria que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña en una célula vegetal, también se describen en la presente memoria pero no son una realización de la invención.

Otro aspecto descrito en la presente memoria se refiere a un procedimiento de propagación de plantas frutales sin semillas que comprende las etapas de

a) obtener semillas a partir de las cuales crece una planta de acuerdo con la invención u obtener semillas depositadas bajo el número de accesión NCIMB 42532 o progenie de las mismas,

b) cultivar plantas a partir de las semillas obtenidas en la etapa a),

c) seleccionar plantas productoras de frutos sin semillas a partir de las plantas cultivadas en la etapa b),

d) propagar las plantas seleccionadas en la etapa c) mediante un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en

i) injertar partes de plantas seleccionadas en la etapa c) en otro portainjertos,

ii) cultivar partes de las plantas seleccionadas en la etapa c) en cultivo de tejidosin vitroy, opcionalmente, regenerar nuevas plantas a partir del cultivo de tejidos,

iii) opcionalmente, producir cultivos de embriones o callos a partir de partes de plantas seleccionadas en la etapa c) y, opcionalmente, regenerar nuevas plantas a partir del cultivo de tejidos,

iv) opcionalmente, producir más plantas mediante técnicas de micropropagación.

La propagación de partes de plantas mediante injerto y propagación y, opcionalmente, la regeneración de plantas mediante procedimientos de cultivo de tejidos son bien conocidos en la técnica. Estos procedimientos se describen en diversas publicaciones científicas y se reseñan y resumen en varios libros científicos, como por ejemplo Smith (2012, Academic Press, ISBN-13: 978-0124159204), Gayatri & Kavyashree (2015, Alpha Science International Ltd, Is Bn-13: 978-1842659618), etc. En el caso de la sandía, los procedimientos respectivos se describen, por ejemplo, en Sultana and Rhaman (2012, LAP Lambert Academic Publishing, ISBN-13: 978-3848439379).

Las plantas o partes de plantas obtenibles/obtenidas por procedimientos para propagar plantas productoras de frutos sin semillas de acuerdo con la invención son también una realización de la invención.

Otra realización de la invención se refiere a material de propagación de plantas de acuerdo con la invención, y/o material de propagación de plantas que comprenden células vegetales de acuerdo con la invención, tal como se establece en la reivindicación 10 anexa. Una realización específica comprendida de la invención es material de propagación de plantas obtenibles/obtenidas a partir de semillas depositadas bajo el número de acceso NCIMB 42532, preferentemente material de propagación de plantas obtenibles/obtenidas a partir de semillas depositadas bajo el número de acceso NCIMB 42532 siendo heterocigotas u homocigotas para el alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS. También está comprendido en la invención el material de propagación de plantas heterocigotas u homocigotas para un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS, en el que el material de propagación se obtiene/puede obtenerse a partir de plantas procedentes de un cruce de una planta obtenida a partir de semillas del depósito número de acceso NCIMB 42532 con otra planta.

La expresión "material de propagación" comprende aquellos componentes de la planta aptos para generar progenie por vía vegetativa (agámica) o generativa (gámica, sexual). Para la propagación vegetativa son adecuados, por ejemplo, esquejes, cultivosin vitrode tejidos, células, protoplastos, embriones o callos, procedimientos de micropropagación, rizomas o tubérculos. Otros materiales de propagación incluyen, por ejemplo, frutos, semillas, plántulas, homocigóticos o heterocigóticos para un alelo mutante de una proteína similar a SDS de ciclina que codifica un gen, etc. En un aspecto, el material de propagación adopta la forma de esquejes que se propagan mediante injerto en otro portainjerto o material de cultivo de tejidosin vitro,en particular cultivos de embriones. En particular, es preferente el material de propagación en forma de material de cultivo de tejidosin vitro,en particular cultivos de embrionesin vitro.Una planta producida por propagación vegetativa también se define en la presente memoria planta propagada. Especialmente las plantas en las que el alelo mutante similar a la ciclina SDS está presente en forma homocigota se propagan preferentemente por vía vegetativa (ya que sus frutos carecen de semillas).

Otra realización de la invención se refiere a partes de plantas de acuerdo con la invención, y/o partes de plantas que comprenden células vegetales de acuerdo con la invención, tal como se establece en la reivindicación 9 adjunta. Otra realización comprendida de la invención se refiere a partes de plantas obtenibles/obtenidas a partir de semillas depositadas con el número de acceso NCIMB 42532 (o de su progenie), preferentemente partes de plantas obtenibles/obtenidas a partir de semillas depositadas con el número de acceso NCIMB 42532 (o de su progenie) que son heterocigotas u homocigotas para el alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS. También están comprendidas en la invención partes vegetales de plantas heterocigotas u homocigotas para un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS, en las que las partes vegetales se obtienen/pueden obtenerse a partir de plantas procedentes de un cruce de una planta obtenida a partir de semillas del depósito número de acceso NCIMB 42532 con otra planta.

Otra realización de la invención se refiere a un procedimiento para la producción de un fruto sin semillas que comprende el cultivo de una planta de acuerdo con la invención y/o el cultivo de una planta que comprende células vegetales de acuerdo con la invención como se establece en la reivindicación 13 anexa, permitiendo que la planta sea polinizada y cosechando el fruto sin semillas. La planta cultivada en el procedimiento para producir frutos sin semillas de acuerdo con la invención es homocigota para un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS.

Inesperadamente, se ha descubierto que la polinización de plantas que comprenden un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS en estado homocigótico con polen de una planta diferente dará lugar a que la planta produzca frutos sin semillas. No es decisivo si el estigma de una planta homocigota para un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS es polinizado por polen que comprende un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS o por polen que comprende un alelo de tipo silvestre de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS. En cualquier caso, independientemente del genotipo del polen, la planta hembra que sea homocigótica para un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS producirá frutos sin semillas. Incluso cuando se polinizan cruzadamente con polen de plantas de tipo silvestre, las plantas de acuerdo con la invención que son homocigóticas para un alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS producirán frutos sin semillas. Por lo tanto, al cultivar plantas de acuerdo con la invención, en cualquier caso, se obtendrán frutos sin semillas.

En relación con la presente invención, se entenderá por "invernadero" un edificio o compartimento utilizado para el cultivo de plantas que tiene un techo y paredes de material transparente consistente en vidrio, plástico, polietileno, mirilla, red o similar. Los invernaderos pueden tener o no otros equipos técnicos de calefacción, refrigeración, sombreado, riego automático, fertilización, ajuste de la concentración de dióxido de carbono, etc. Los invernaderos con cualquier tipo de equipamiento técnico estarán incluidos en el término "invernadero" utilizado en la presente memoria.

Otra realización de la invención se refiere a frutos de u obtenibles/obtenidos a partir de plantas de acuerdo con la invención, y/o frutos que comprenden células vegetales de acuerdo con la invención o frutos de plantas obtenibles/obtenidos a partir de una planta obtenida/obtenible por un procedimiento de acuerdo con la invención para propagar plantas productoras de frutos sin semillas o un fruto obtenible/obtenido por un procedimiento de acuerdo con la invención para la producción de un fruto sin semillas como se establece en la reivindicación 11 adjunta. Otra realización comprendida de la invención se refiere a frutos de plantas obtenibles/obtenidas a partir de semillas depositadas bajo el número de acceso NCIMB 42532 (o progenie de las mismas), preferentemente frutos de plantas obtenibles/obtenidas a partir de semillas depositadas bajo el número de acceso NCIMB 42532 (o progenie de las mismas) siendo heterocigotas u homocigotas para el alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS. También están comprendidos en la invención los frutos heterocigotos u homocigotos para un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS, en los que los frutos se obtienen/pueden obtenerse de plantas procedentes de un cruce de una planta obtenida a partir de semillas del depósito con número de acceso NCIMB 42532 con otra planta. Los frutos pueden ser heterocigotos para un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS y producir frutos con semillas o pueden ser homocigotos para un alelo de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS y producir frutos sin semillas. Los frutos heterocigotos para un alelo de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS pueden utilizarse para propagar plantas que comprendan un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS. Preferentemente, los frutos de acuerdo con la invención son homocigotos para un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS y/o producen frutos sin semillas. Los frutos sin semillas, por razones lógicas, no son aptos para el cultivo de otras plantas a partir de estos frutos. Por lo tanto, una realización de la invención se refiere a la fruta de acuerdo con la invención que es una fruta sin semilla que no es elegible para la propagación o que no puede propagarse o que es un no propagación.

Como se establece en la reivindicación 8 adjunta, otra realización de la invención se refiere al uso de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína similar a ciclina SDS seleccionada del grupo que consiste en

a) Moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NÚM.: 2,

b) Moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína cuya secuencia tiene una identidad de al menos el 60%, preferentemente de al menos el 70%, más preferentemente de al menos el 80%, aún más preferentemente de al menos el 90% o particularmente preferente de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos dada bajo SEQ ID NÚM.: 2;

c) Moléculas de ácido nucleico, que comprenden la secuencia de nucleótidos mostrada bajo SEQ ID NÚM.: 1 o SEQ ID NÚM.: 3 o SEQ ID NÚM.: 17 o una secuencia complementaria;

d) Moléculas de ácido nucleico, que tienen una identidad de al menos el 70%, más preferentemente al menos el 80%, aún más preferentemente al menos el 90% o particularmente preferentemente al menos el 95% con las secuencias de ácido nucleico descritas en c);

e) Moléculas de ácido nucleico, que hibridan con al menos una hebra de las moléculas de ácido nucleico descritas en a) o c) en condiciones estrictas de al menos un lavado en 0,2X SSC a una temperatura de al menos 50°C durante 20 min;

f) Moléculas de ácido nucleico, cuya secuencia de nucleótidos se desvía de la secuencia de las moléculas de ácido nucleico identificadas en c) o d) debido a la degeneración del código genético; y

g) Moléculas de ácido nucleico, que representan fragmentos de al menos 20 nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico identificadas en a) o en c)

para la producción de una planta que produzca frutos sin semillas.

En una realización preferente del uso de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína similar a la ciclina SDS, la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína similar a la ciclina SDS se utiliza para la producción de plantas de acuerdo con la invención, en una realización preferente particular, el uso de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína similar a la ciclina SDS se utiliza para la producción de plantas que producen frutos sin semillas de acuerdo con la invención.

En otras realizaciones preferentes, se utiliza una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína similar a la ciclina SDS para la producción de una parte de planta de acuerdo con la invención o un fruto de acuerdo con la invención.

En otra realización preferente, se utiliza una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína similar a la ciclina SDS en cualquiera de los procedimientos de la invención descrita en la presente memoria. Las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína similar a la ciclina SDS pueden, por ejemplo, utilizarse en un procedimiento de acuerdo con la invención para la producción de una planta o en un procedimiento de acuerdo con la invención para propagar plantas productoras de frutos sin semillas de acuerdo con la invención o en un procedimiento de acuerdo con la invención para la producción de un fruto sin semillas.

En otro aspecto descrito en la presente memoria, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína similar a la ciclina SDS se utiliza para identificar si una célula vegetal o planta comprende un alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS o si una célula vegetal o planta sintetiza un ARNm mutante que codifica una proteína similar a la ciclina SDS o si una célula vegetal o planta tiene una actividad disminuida de una proteína similar a la ciclina SDS. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína similar a la ciclina SDS se utiliza para identificar si una planta productora de frutos sin semillas comprende un alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS o si una planta sintetiza un ARNm mutante que codifica una proteína similar a la ciclina SDS o si una planta tiene una actividad disminuida de una proteína similar a la ciclina SDS. El modo en que pueden identificarse estas plantas se ha descrito anteriormente y es aplicable en consecuencia.

Las realizaciones preferentes relativas a moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas similares a la ciclina SDS se han descrito anteriormente en la presente memoria y son aplicables para los usos de acuerdo con la invención en consecuencia.

En un aspecto descrito aquí se divulga un procedimiento de cribado para identificar y/o seleccionar semillas, plantas o partes de plantas o ADN de tales semillas, plantas o partes de plantas que comprenden en su genoma un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS.

El procedimiento comprende el cribado a nivel de ADN, ARN (o ADNc) o proteína utilizando procedimientos conocidos, con el fin de detectar la presencia del alelo mutante. Existen muchos procedimientos para detectar la presencia de un alelo mutante de un gen.

Por ejemplo, si existe una diferencia de nucleótido único (polimorfismo de nucleótido único, SNP) entre el alelo de tipo silvestre y el mutante, puede utilizarse un ensayo de genotipado SNP para detectar si una planta o parte de una planta o célula comprende el nucleótido de tipo silvestre o el nucleótido mutante en su genoma. Por ejemplo, los marcadores de SNP se pueden detectar fácilmente utilizando un ensayo KASP (véase www.kpbioscience.co.uk) u otros ensayos de genotipado de SNP Para desarrollar un ensayo KASP se pueden seleccionar, por ejemplo, 70 pares de bases aguas arriba y 70 pares de bases aguas abajo del SNP y se pueden diseñar dos cebadores directos específicos de alelo y un cebador inverso específico de alelo. Véase, por ejemplo, Allen et al. 2011, Plant Biotechnology J. 9, 1086 1099 especialmente p097-1098 para el procedimiento de ensayo KASP

Pueden utilizarse igualmente otros ensayos de genotipado. Por ejemplo, puede utilizarse un ensayo de genotipado de SNP TaqMan, un ensayo de fusión de alta resolución (HRM), matrices de genotipado de SNP (por ejemplo, Fluidigm, Illumina, etc.) o secuenciación de ADN.

El genotipado de plantas diploides o partes de plantas (células, hojas, ADN, etc.) puede distinguir genotipos SNP, por ejemplo, plantas o partes que comprenden CC para el nucleótido 1687 de SEQ ID NÚM.: 1 (homocigoto para el nucleótido de tipo silvestre) pueden distinguirse de las plantas o partes que comprenden CT para el nucleótido 1687 de SEQ ID N<ú>M.: 1 (heterocigoto para el nucleótido mutante) en su genoma. El genotipado de plantas tetraploides o partes de plantas (células, hojas, ADN, etc.) puede realizarse de la misma manera que para diploides, utilizando por ejemplo un ensayo KASP para distinguir genotipos SNP, por ejemplo plantas o partes de plantas que comprenden CCCC para nucléotido 1687 de SEQ ID NÚM.: 1 (homocigoto para el nucleótido de tipo silvestre) pueden distinguirse de las plantas o partes que comprenden otros genotipos para el SNP, por ejemplo c Cc A, CCAA, etc. en su genoma. Lo mismo ocurre con los triploides. Lo mismo ocurre con otros poliploides.

En los procedimientos anteriores, las plantas, células vegetales y partes de plantas que comprenden al menos una copia de un alelo mutante de un gen codificador de una proteína similar a la ciclina SDS, son plantas de sandía, especialmente sandía cultivada, por ejemplo, sandía cultivada diploide, tetraploide o triploide.

Las plantas de sandía pueden ser líneas de cría o variedades. El alelo mutante de un gen que codifica la proteína ciclina similar a la SDS puede generarse en, o introducirse en (por ejemplo, a partir de semillas depositadas bajo NCIMB42532 o progenie de las mismas), cualquier sandía cultivada para producir líneas o variedades que comprendan el alelo mutante de la proteína similar a la SDS, preferentemente en forma homocigótica. Las sandías cultivadas producen frutos de diversos tamaños (por ejemplo, muy pequeños, como se describe en el documento WO2012069539, por ejemplo, inferior a 0,9 kg o incluso igual o inferior a 0,65 kg; tamaño personal de aproximadamente 3-7 libras, es decir, de aproximadamente 1,4 a 3,2 kg; tamaños de nevera de aproximadamente 6 12 libras, es decir, de aproximadamente 2,7 a 5,5 kg; y tamaños más grandes de hasta 35 libras, es decir, de aproximadamente 15,9 kg), colores de pulpa de fruta y formas de fruta y con diferentes colores de corteza. Por lo tanto, el alelo mutante puede introducirse en sandías cultivadas que produzcan cualquier forma de fruto (por ejemplo, alargado, ovalado, ovalado alargado, en bloque, en bloque alargado, esférico o redondo), superficie del fruto (por ejemplo, surcada, lisa), color de la pulpa (por ejemplo, rojo, rojo oscuro, rojo escarlata, rojo coral, naranja, salmón o rosa, amarillo, amarillo canario o blanco), color de la corteza (por ejemplo, verde claro, verde oscuro, verde con rayas estrechas, medianas o anchas, tipos grises, con o sin manchas, amarillo dorado, corteza tipo Crimson, corteza tipo Jubilee, corteza tipo Allsweet, etc.). verde claro; verde oscuro; verde rayado con rayas estrechas, medias o anchas; tipos grises; con o sin manchas; amarillo dorado; corteza tipo Crimson, corteza tipo Jubilee; corteza tipo Allsweet; negro/verde oscuro), espesor de la corteza, dureza de la corteza, dibujo de la corteza (por ejemplo, rayado, no rayado, en red), estructura de la pulpa / firmeza de la pulpa, contenido en licopeno y/o vitaminas, diferentes relaciones azúcar/ácido, muy buen sabor de la fruta, etc. mediante mejora genética. Véase Guner and Wehner 2004, Hort Science 39(6): 1175-1182en particular las páginas 1180-1181, en las que se describen los genes de las características de los frutos. Por lo general, los objetivos de selección más importantes son la precocidad, el alto rendimiento de la fruta, la alta calidad interna de la fruta (buen color uniforme, alto contenido de azúcar, proporción adecuada de azúcar y acidez, buen sabor, alto contenido de vitaminas y licopeno, textura firme de la pulpa, textura no fibrosa de la pulpa, ausencia de defectos tales como corazón hueco, necrosis de la corteza, podredumbre del extremo de la flor o punto de cruz y buenas características de la corteza y resistencia al agrietamiento). Los frutos producidos por la línea o variedad son preferentemente frutos comercializables. En un aspecto, el brix promedio es de al menos 6,0, 7,0, 8,0 o al menos 9,0, preferentemente al menos 10,0, más preferentemente al menos 11,0 o más.

El color de la fruta puede ser cualquier color, tal como rojo, rojo oscuro, rojo escarlata, rojo coral, naranja, salmón, rosa, rojo rosado, amarillo, amarillo canario o blanco. Preferiblemente, el color de la pulpa de la fruta es uniforme.

Información sobre depósitos

Las semillas diploides deCitrullus lanatusde plantas que segregan un alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS han sido depositadas por Nunhems B.V. en virtud del Tratado de Budapest con el número de acceso NCIMB 42532 en el NCI<m>B Ltd., Bucksburn Aberdeen AB21 9YA, Escocia, el 27 de enero de 2016. Para el depósito de semillas se designóemblal alelo del gen codificador de la proteína similar a la ciclina SDS. Se aplica la solución de Experto.

Las semillas depositadas se obtuvieron de un retrocruce autopolinizado de una planta homocigótica para el alelo mutanteemblcon plantas homocigóticas para el alelo de tipo silvestreem bl. Por lo tanto, el 25% de las semillas depositadas son homocigóticas para el alelo mutanteembly producen frutos sin semillas, el 50% son heterocigóticas para el alelo mutante y el 25% son homocigóticas para el alelo de tipo silvestre, que codifica la proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre.

El acceso a los depósitos estará disponible durante la tramitación de la presente solicitud para las personas que el Comisionado de Patentes y Marcas determine que tienen derecho a ellos previa solicitud.

Sujeto a 37 C.F.R. § 1.808(b), todas las restricciones impuestas por el depositante sobre la disponibilidad al público de uno o más depósitos se eliminarán irrevocablemente tras la concesión de la patente al brindar acceso a los mismos. Los depósitos se mantendrás durante un periodo de 30 años, o 5 años después de la solicitud más reciente o durante la vida ejecutiva de la patente, si ésta es más larga, y se sustituirá si alguna vez deja de ser viable durante ese periodo. El solicitante no renuncia a ningún derecho concedido en virtud de esta patente en la presente solicitud o en virtud de la Ley de Protección de Variedades Vegetales (7 USC 2321et seq.).

Descripción de la secuencia

Descripción de las figuras

Fig. 1

Frutos de sandía de plantas de tipo silvestre (1A), plantas de tipo silvestre comparadas con frutos de plantas mutantes EMB1 (1B), rodaja de fruto sin semilla de una planta mutante EMB1 (1C) y semilla abierta sin embrión de una planta mutante EMB1 (1D).

Fig. 2

Alineación de secuencias comparando las secuencias obtenidas para los números de muestra 114, 115, 116 y 117. El número en la parte superior derecha indica la posición del nucleótido en la secuencia correspondiente mostrada bajo SEQ NO 1. Los números de muestra 116 y 117 proceden de plantas mutantes EMB1. Los números de muestra 114 y 115 proceden de plantas silvestres.

Fig. 3

Análisis electroforético de los productos PCR obtenidos a partir del ADNc de los números de muestra 114, 115, 116 y 117 en un gel de poliacrilamida. Los números de muestra 114 y 115 proceden de plantas silvestres. Los números de muestra 116 y 117 proceden de plantas mutantes EMB1.

Procedimientos generales

1. Aislam iento del ARN

El tejido ovárico joven se cortó en trozos pequeños, se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -80°C hasta su uso posterior. Los trozos de tejido congelados se trituraron con pistón y mortero en nitrógeno líquido para mantener el polvo congelado. se utilizaron 100 mg del polvo para aislar el ARN total utilizando un kit de aislamiento de ARN vegetal de acuerdo con el protocolo del fabricante (RNeasy Plant Mini Kit, Qiagen).

2. Preparación del ADNc

El ARN se trató con DNasa (TURBODNA-free, Ambion) y se utilizaron 0,9 |jg de ARN para la transcripción inversa de acuerdo con los protocolos del fabricante (iScript cDNA Synthesiskit, BioRad).

3. PCR sobre ADNc

La PCR se realizó en un volumen total de 20 j l de tampón (tampón de reacción Phire, Thermo Fisher Scientific) que contenía 0,2 mM de dNTP, 0,4 j l de ADN Polimerasa Phire Hot Start II (Thermo Fisher Scientific), 0,25 jM de cada cebador y 0,4 j l de mezcla de ADNc. Tras una etapa inicial de desnaturalización de 30 minutos a 90°C, se realizaron 40 ciclos de l0 segundos a 98°C, 15 segundos a 60°C y 30 segundos a 72°C y se finalizó la reacción con 3 minutos a 72°C.

4. Secuenciación

El tamaño del producto PCR se analizó utilizando el sistema QIAxcel Advanced (Qiagen) y la mezcla de reacción PCR se envió a un proveedor de servicios para su secuenciación (BaseClear, NL).

Ejemplos

1. Aislam iento de mutantes de frutos sin semillas

Se estableció una población mutante tratando aproximadamente 10.000 semillas de sandía de una línea endogámica (WMZD0048TYY, abreviada TYY en lo sucesivo) con EMS varias horas y lavando posteriormente las semillas en agua corriente del grifo durante 30 minutos. Después, las semillas se mantuvieron húmedas hasta su siembra en el suelo. Se cultivaron plantas M1 a partir de las semillas mutagenizadas, se autopolinizaron y se cosecharon las semillas (generación M2). Se sembraron ocho semillas de cada una de las 3000 familias M2 cultivadas y se aislaron las plantas mutantes que producían frutos sin semillas. Una de estas plantas mutantes fue designada EMB1. La propagación de la planta mutante EMB1 se realizó injertando esquejes de la planta mutante EMB1 en portainjertos de plantas de sandía no mutagenizadas.

2. Confirmación del fenotipo de fruto sin semilla

El mutante EMB1 se retrocruzó con la línea endogámica TYY original de sandía no mutada, utilizando polen del mutante EMB1 (generación BC1). el 25% de las plantas cultivadas a partir de la generación BC1 autógama produjeron frutos sin semillas.

También se utilizó polen del mutante EMB1 para su cruce con diferentes líneas endógamas de sandía con el fin de establecer una población de asignación. el 25% de las plantas autógamas de la población de asignación produjeron frutos sin semillas.

Los resultados de los respectivos retrocruzamientos y cruces en los que se utilizó polen del mutante EMB1 para fertilizar otras líneas endógamas demuestran claramente que el polen del mutante EMB1 es fértil.

En otros cruces se utilizaron plantas mutantes EMB 1, homocigotas para el alelo mutanteemblcomo progenitor femenino y se polinizaron con polen de otras líneas diferentes. el 100% de las plantas de cada uno de estos cruces produjo frutos sin semillas.

Los resultados obtenidos de los diferentes cruces muestran que la mutaciónemblse debe a un único alelo recesivo. Los resultados también demuestran que el fenotipo de fruto sin semillas se mantiene cuando se utiliza polen de plantas productoras de semillas para fertilizar plantas mutantes EMB1. Por tanto, el fenotipo de fruto sin semilla no se debe al polen aberrante del mutante EMB1, sino que puede atribuirse a defectos en el desarrollo embrionario.

3. Identificación del gen causante del fenotipo de fruto sin semilla

Se analizó la población de asignación establecida polinizando diferentes líneas endocriadas de sandía con polen de la planta mutante EMB 1 y se detectó un polimorfismo nuclear único (SNP) en la secuencia genómica mostrada bajo SEQ ID NÚM.: 1. SEQ ID NÚM.: 1 muestra la secuencia del alelo de tipo silvestre. En el alelo respectivo de la planta mutante EMB1, el nucleótido guanina (G) en la posición número 2185 de la SEQ ID NÚM.: 1 se sustituye por adenina (A).

4. Análisis del ARNm transcrito a partir de alelos emb1

Se cosecharon capullos de flores de diferente tamaño de plantas cultivadas en el campo. Los números de muestra 114 y 115 son capullos de flores de plantas de la línea endogámica original, designada TYY, que se utilizó para la mutagénesis. TYY representan, por tanto, plantas de tipo silvestre que comprenden alelosemblde tipo silvestre. Los números de muestra 115 y 116 son capullos florales de plantas mutantes EMB1 productoras de frutos sin semillas que comprenden alelosemblmutantes. En la Tabla 1 se ofrece una visión general de los fenotipos, el material recolectado y analizado para los respectivos números de muestra.

Tabla 1

Se aisló ARN de los capullos de flores de los diferentes números de Muestra. se utilizaron 700ng de ARN para cada uno de los números de muestra para la síntesis de ADNc. Se realizó una reacción de PCR utilizando los cebadores A4532 (SEQ ID NÚM.: 7) y A4533 (SEQ ID NÚM.: 8) en cada una de las muestras de ADNc obtenidas. Los cebadores se diseñaron para amplificar una parte del aleloemblde la secuencia codificante indicada en SEQ ID NÚM.: 1. Los productos de la PCR se analizaron en un gel de poliacrilamida que se muestra en la figura 3. De la Figura 3 se deduce claramente que los números de muestra 116 y 117 dieron lugar a un fragmento de PCR más corto que todos los demás números de muestra. Esto indicaba claramente que el ARNm del alelo mutanteemblcomprende una deleción de nucleótidos en comparación con el correspondiente alelo de tipo silvestre en los números de muestra 114 y 115.

5. análisis de la secuencia de ADNc de los alelos em bl

El ADNc de los Números de Muestra 114, 115, 116 y 117 fue secuenciado utilizando el cebador A4532 mostrado bajo SEQ ID NÚM.: 7, el cebador A4538 mostrado bajo SEQ ID NÚM.: 11, el cebador A4534 SEQ ID NÚM.: 9 y el cebador A4535 SEQ ID NÚM.: 10. Las secuencias obtenidas de cada uno de los números de muestra 116 y 117 se muestran bajo el SEQ ID NÚM.: 3 como molécula de ARNm. Las secuencias obtenidas de cada uno de los números de muestra 114 y 115 son idénticas a la secuencia codificante indicada en SEQ ID NÚM.: 1. La comparación de las secuencias obtenidas de los números de muestra 114, 115, 116 y 117 mostró que las secuencias de cada uno de los números de muestra 116 y 117 tienen una deleción de 16 nucleótidos consecutivos en comparación con las secuencias de cada uno de los números de muestra 114 y 115. Además, las secuencias de cada una de las Muestras Número 116 y 117 tienen un desplazamiento de marco que causa un codón de parada prematuro en la secuencia codificante, en comparación con las secuencias de cada una de las Muestras Número 114 y 115. En la Fig. 2 se muestra una alineación de las partes de la secuencia en cuestión.

Se concluye, que el alelo mutanteemblde los Números de Muestra 116 y 117 se transcribe en un ARNm que tiene una deleción, un cambio de marco en el marco de lectura y un codón de parada prematuro comparado con el ARNm transcrito del alelo de tipo silvestre de los Números de Muestra 114 y 115. Además, puede observarse en la Fig. 2 que el ARNm transcrito a partir del alelo mutanteemblde los números de muestra 116 y 117 codifica una proteína en la que se intercambian 8 aminoácidos en comparación con la proteína codificada por el ARNm transcrito a partir del alelo de tipo silvestre de los números de muestra 114 y 115.

6. Generación de otra planta mutante de sandía

Conociendo la secuencia del gen similar a SDS de ciclina fue posible generar otros alelos mutantes en el gen similar a SDS. La población TILLING mutagenizada por EMS se examinó con cebadores diseñados en un dominio en el que las mutaciones EMS podían convertir un codón codificador de aminoácidos en un codón de parada.

Cebador directo: CGAAGAGAAAGGATTAGACGTTG (SEQ ID NÚM.: 21)

Cebador inverso: TCTGAGCAGTCAGTATCAGACG (SEQ ID NÚM.: 22)

Se identificó una planta que comprendía un alelo mutante similar a la ciclina SDS. El alelo identificado comprende un reemplazo de nucleótido individual en el nucleótido 1687 de SEQ ID NÚM.: 1, que conduce a un codón de parada. El alelo mutante codifica así una proteína truncada similar a la ciclina SDS que comprende sólo los aminoácidos 1 a 223 de la proteína de tipo silvestre de SEQ ID NÚM.: 2. El ADNc del alelo mutante se proporciona en SEQ ID NÚM.: 17 y la proteína truncada codificada por el alelo mutante se proporciona en SEQ ID NÚM.: 18.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula vegetal de sandía, caracterizada por que la célula vegetal comprende un alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS, en la que el alelo mutante comprende una mutación en una o más secuencias reguladoras que da como resultado una expresión génica disminuida o ninguna expresión génica en comparación con un alelo de tipo silvestre correspondiente, o en la que el alelo mutante codifica una proteína que comprende una deleción, truncamiento, inserción o sustitución de uno o más aminoácidos, en comparación con la proteína codificada por el alelo de tipo silvestre, dando lugar a una función reducida o pérdida de función de la proteína similar a la ciclina SDS, cuya función reducida o pérdida de función conduce a la producción de frutos sin semillas de una planta de sandía, en la que la proteína similar a la ciclina SDS del alelo de tipo silvestre está codificada por moléculas de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en:

a) moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NÚM.: 2;

b) moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína cuya secuencia tiene una identidad de al menos el 60% con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NÚM.: 2;

d) moléculas de ácido nucleico, que tienen una identidad de al menos el 70% con las secuencias de ácido nucleico descritas en c);

e) moléculas de ácido nucleico, que hibridan con al menos una cadena de las moléculas de ácido nucleico descritas en a) o c) en condiciones estrictas de al menos un lavado en 0,2X SSC a una temperatura de al menos 50°C durante 20 min; y

2. Una célula vegetal de sandía de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS codifica una proteína en la que uno o más aminoácidos se insertan, sustituyen o suprimen en el dominio conservado Ciclina C y/o en el dominio Ciclina N de la proteína o en la que todo o parte del dominio Ciclina_C y/o del dominio Ciclina_N están ausentes.

3. Una planta de melón que comprende células vegetales de melón de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.

4. Una semilla a partir de la cual puede cultivarse una planta de sandía de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Procedimiento para la producción de una planta de sandía que comprende las etapas de:

a) introducir mutaciones en una población de plantas de sandía,

b) identificar una planta que tiene una mutación en un alelo que codifica un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS, en el que el alelo de tipo silvestre del gen codifica una proteína similar a la ciclina SDS que comprende al menos un 60% de identidad de secuencia con la proteína de SEQ ID NÚM.: 2, y c) determinar si la planta es macho fértil y si produce frutos sin semillas y

6. Procedimiento para la producción de una planta de sandía que comprende las etapas de:

a) introducir mutaciones en una población de plantas de sandía,

b) seleccionar una planta macho fértil que produzca frutos sin semillas,

d) cultivar las plantas obtenidas en c),

en el que el alelo de tipo salvaje del gen codifica una proteína similar a la ciclina SDS que comprende al menos un 60% de identidad de secuencia con la proteína de SEQ ID NÚM.: 2.

7. Una planta de sandía obtenida por el procedimiento de las reivindicaciones 5 o 6.

8. Uso de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína similar a la ciclina SDS seleccionada del grupo que consiste en:

c) Moléculas de ácido nucleico, que comprenden la secuencia de nucleótidos mostrada bajo SEQ ID NÚM.: 1 o SEQ ID NÚM.: 3 o SEQ ID Nú M.: 17 o una secuencia complementaria de SEQ ID NÚM.: 1 o SEQ ID NÚM.: 3 o SEQ ID NÚM.: 17;

g) Moléculas de ácido nucleico, que representan fragmentos de al menos 20 nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico identificadas en a) o en c),

para la producción de una planta que produzca frutos sin semillas.

9. Partes de plantas que comprenden células vegetales de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, o partes de plantas de acuerdo con la reivindicación 7, en las que dichas partes comprenden células que tienen una mutación en un alelo de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS.

10. Material de propagación que comprende células vegetales de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, o material de propagación obtenible a partir de una planta de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 7, en el que dicho material de propagación comprende células que tienen una mutación en un alelo de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS.

11. Un fruto que comprende una célula vegetal de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 o un fruto obtenible a partir de una planta de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 7 o un fruto obtenible a partir de material de propagación de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Una planta de sandía de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicha planta es homocigota para el alelo mutante del gen que codifica la proteína similar a la ciclina SDS.

13. Procedimiento para la producción de un fruto sin semilla que comprende cultivar una planta de acuerdo con la reivindicación 12 y permitir la polinización de dicha planta y cosechar el fruto sin semilla.

14. La planta de acuerdo con la reivindicación 3 o la semilla de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la planta o la semilla es una planta de sandía cultivada diploide, triploide o tetraploide.

15. La célula vegetal de sandía de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el alelo mutante codifica una proteína en la que faltan al menos 25, preferentemente al menos 50, 60, 70, 80, 90 o 100, más preferentemente al menos 150 aminoácidos del extremo N-terminal o del extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos en comparación con la correspondiente proteína similar a la ciclina SDS de tipo silvestre.

16. Una planta, parte de planta o semilla de sandía que comprende la célula vegetal de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende un alelo mutante de un gen que codifica una proteína similar a la ciclina SDS, en la que el alelo mutante codifica una proteína truncada que carece de los aminoácidos 358 a 562 de la proteína de tipo silvestre de SEQ ID NÚM.: 2 o que carece de los aminoácidos 224 a 562 de la proteína de tipo salvaje de SEQ ID N<ú>M.: 2.

17. La planta, parte de planta o semilla de sandía de acuerdo con la reivindicación 16, en la que el alelo mutante codifica la proteína de SEQ ID NÚM.: 4 o de la SEQ ID NÚM.: 18.

18. La planta, parte de planta o semilla de sandía de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, en la que el alelo mutante está en forma homocigótica.

19. Un procedimiento para la producción de un fruto sin semillas que comprende cultivar una planta de sandía de acuerdo con la reivindicación 18 y permitir la polinización de dicha planta y cosechar el fruto sin semillas.