RS65788B1 - Soj cutibacterium acnes i njegove medicinske upotrebe - Google Patents

Description

Opis

OBLAST OVOG PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na izabrani bakterijski soj koji pripada rodu Cutibacterium, vrsti acnes i na njegovu medicinsku upotrebu i na farmaceutske i nutritivne kompozicije koje sadrže isti soj.

[0002] Ovaj pronalazak potiče od mikrobiološkog polja i nalazi svoje primene u farmaceutskoj industriji, kozmetici i nutritivnim granama.

[0003] Konkretno, ovaj pronalazak se odnosi ili na izabrani soj Cutibacterium acnes i na postbiotike i fragmente ćelijskog zida soja koji putem strukturnih mikrobioloških komponenti i/ili proizvodnjom supstanci pospešuju rast ćelija fibroblasta. Soj iz ovog pronalaska, fragmenti njegovog zida i njegovi postbiotici imaju anti-inflamatorna i antibakterijska dejstva. Poželjno, izabrani bakterijski soj ili fragmenti njegovog zida su za topikalnu primenu za lečenje dermatoloških poremećaja, infekcija ili povreda kože.

POZADINA

[0004] Zapaljenje je suštinski biološki odgovor na štetan stimulus ili povredu tkiva organizma koja može biti izazvana spoljašnjim uzrocima poput kontakta sa iritirajućim agensima ili mikroorganizmima.

Zapaljenje se smatra zaštitnim odgovorom tela usmerenim ka eliminisanju uzroka povrede tkiva, čišćenju nekrotičnih tkiva oštećenih od prvobitnog udara i zapaljenskog procesa, i pokretanju popravke tkiva. Ovaj odgovor organizma uključuje imune ćelije i molekularne posrednike.

[0005] Za sada se zapaljenje tretira sistemskom ili topikalnom primenom nesteroidnih ili steroidnih antiinflamatornih lekova. Uprkos širokoj primeni anti-inflamatornih agenasa, postoje neki preostali rizici da se zapaljenje može nastaviti i nakon tretiranja anti-inflamatornim lekovima. Osim toga, antiinflamatorno tretiranje nije bez neželjenih dejstava ni u slučaju lokalne primene ni u slučaju sistemske primene.

[0006] Proteklih godina pojava neželjenih dejstava u slučaju topikalne primene je u porastu zbog zloupotrebe ili pogrešne upotrebe steroidnih krema čiji je cilj lečenje zapaljenja kože.

[0007] Samim tim sada postoji potreba za novim proizvodima koji imaju anti-inflamatorno dejstvo na čiju upotrebu i tokom produženog vremenskog perioda ne utiču ozbiljna neželjena dejstva.

[0008] Slični problemi nastaju u dermatologiji i ginekologiji, u slučaju infekcija kože ili sluzokože.

[0009] Zloupotreba antibiotskih proizvoda za topikalnu upotrebu u lečenju infekcija kože je povećala broj slučajeva otpornosti na lokalnu antibiotičku terapiju, zbog čega su lekari bili primorani da prepisuju antibiotike druge generacije.

[0010] Samim tim sada postoji potreba za novim proizvodima koji imaju anti-inflamatorno i/ili po mogućstvu antimikrobijsko dejstvo, koji su alternativa za komercijalno dostupnim lekovima.

[0011] Jedan od ciljeva ovog pronalaska je obezbeđivanje proizvoda koji poseduje anti-inflamatorno i po mogućstvu antimikrobijsko ili anti-gljivično delovanje, čija je upotreba uglavnom nema neželjena dejstva. Takođe je poželjno obezbediti proizvod koji je aktivan u kontroli humane mikrobiote.

[0012] Još jedan cilj ovog pronalaska je u obezbeđivanju nesteroidnog proizvoda sa anti-inflamatornim dejstvima, koji je konkretno namenjen za lokalnu primenu na koži ili sluzokožama poput vaginalnih sluzokoža.

[0013] Ovaj drugi je, uopšteno, usmeren protiv patogenih bakterija i/ili gljivica, koji deluje, u zavisnosti od cilja, ili kao baktericidalni ili bakteriostatski ili kao fungicidni ili fungistatski agens.

[0014] Sa druge strane, suprotstavljanjem patogenima, postiže se brže obnavljanje uslova homeostaze putem normalizacije rezidentnog mikrobioma.

SAŽETAK OVOG PRONALASKA

[0015] Ovaj pronalazak potiče iz saznanja da odabrani bakterijski soj roda Cutibacterium, vrste acnes, podstiče proliferaciju fibroblasta i ima sposobnost mešanja u rast većine uobičajenih bakterija i gljivica, posebno onih koje utiču na ljudsku kožu.

[0016] Posebno odabrani bakterijski soj Cutibacterium acnes kako je definisan u zahtevu 1, fragmenti njegovog ćelijskog zida ili postbiotici ili kompozicija koja ih sadrži kako je ovde definisano, pokazuju regulaciju imunološkog sistema u kombinaciji sa poboljšanim inhibitorskim efektom na patogene mikroorganizme kože. Ovi efekti delimično su povezani sa mešanjem soja sa dodatkom patogena na ćelije domaćina.

[0017] Pored toga, pronalazači su došli do zaključka da živi ili ubijeni bakterijski sojevi ili deo njih kao što su fragmenti njihovog zida ovog pronalaska proizvodi supstance ili sporedne proizvode koji pospešuju rast I migraciju ćelija fibroblasta. Ova osobina dodatno podržava upotrebu odabranog soja ili supstanci koje on proizvodi kao imunomodulatorne agense i čini ga pogodnim kandidatom za primene u dermatološkom ili ginekološkom polju, posebno u lečenju bakterijskih ili gljivičnih infekcija kože, posebno Candida albicans ili bakterijskih infekcija.

[0018] Shodno tome, ovaj pronalazak obezbeđuje, u prvom aspektu, bakterijski soj roda Cutibacterium vrste acnes deponovan pod pristupnim brojem (ili brojem prijave) DSM 28251 kod međunarodnog nadležnog organa za deponovanje Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, ili varijantu koja je suštinski izvedena iz pomenutog soja.

[0019] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje medicinske upotrebe pomenutog bakterijskog soja Cutibacterium acnes, deponovanog pod pristupnim brojem DSM 28251. U skladu sa ovim aspektom, soj iz ovog pronalaska namenjen je za topikalnu ili sistemsku primenu.

[0020] Sistemska administracija predstavlja put primene leka, ishrane uključujući i soj iz ovog pronalaska u sistem cirkulacije tako da celo telo bude obuhvaćeno. Primena može da se izvede enteralnom, oralnom primenom ili parenteralnom primenom, na primer, putem injekcije, infuzije ili implantacije.

[0021] Topikalna primena ili aplikacija je poželjan način primene za Cutibacterium acnes DSM 28251 prema ovom pronalasku. Cutibacterium acnes DSM 28251, postbiotik, fragmenti ćelijskog zida i kompozicije koje sadrže isto od njihovih fragmenata mogu da se nanose na kožu u bilo kojim oblicima pogodnim za topikalnu primenu.

[0022] U skladu sa drugim aspektom, ovaj pronalazak omogućava za sojeve ili varijante bakterijskog soja DSM 28251 kako je prethodno navedeno, koji su suštinski izvedeni spontanim mutacijama, indukovanom mutacijom ili odabirom, hibridizacijom i odabirom ili drugim postupcima genetske manipulacije, i koji se mogu pratiti do njega. U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na postbiotike pomenutog soja i medicinske ili nutritivne upotrebe istih.

[0023] Bakterijski soj, prema ovom pronalasku, može biti izolovan i odabran sa zdrave kože, među mnoštvom sojeva koji ulaze u sastav mikrobioma kože.

[0024] Prema opet drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na bakterijski soj Cutibacterium acnes, deponovan pod pristupnim brojem DSM 28251 kod međunarodnog nadležnog organa za deponovanje Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, ili varijantu koja je suštinski izvedena iz pomenutog soja, za upotrebu u sprečavanju ili lečenju inflamatorne bolesti ili infekcije, naročito kože ili sluzokože.

[0025] Poželjno, bakterijski soj ovog pronalaska pronalazi primene u dermatološkoj i ginekološkoj oblasti, na primer u lečenju zapaljenja kože ili sluzokože ili infekcija od bakterija, gljivica ili protozoe. Određenije, gornji soj je efektivan u sprečavanju i ili lečenju infekcija naročito kože.

[0026] Odabrani soj ovog pronalaska je efektivan u lečenju gljivičnih infekcija, naročito kandidijaze uzrokovane kvascima roda Candida spp, posebno Candida albicans, ili dermatofitima poput vrsta Malassezia spp, koje su među najčešćim uzročnicima oportunističkih infekcija ljudskog tela. Osim toga, ovaj odabrani soj koristi se u lečenju gljivičnih infekcija koje su otporne na antifungalne proizvode dostupne na tržištu.

[0027] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje proktološku upotrebu Cutibacterium acnes DSM 28251, posebno toplotom ubijenog, postbiotika ili fragmenta zida ovog soja, ili topikalne kompozicije istog, naročito u lečenju hemoroida, analnih ragada ili ožiljaka na koži.

[0028] U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na kompoziciju hijaluronske kiseline sa fragmentom bakterijskog zida C.acnes DSM 28251, posebno za upotrebu u lečenju rana, ogrebotina, ulceracija kože, na primer dekubitisa. Još jedan aspekt ovog pronalaska odnosi se na kozmetičku upotrebu pomenutog bakterijskog soja radi poboljšanja estetskog izgleda kože, poput crvenila ili kuperoze.

[0029] Prema drugom aspektu ovaj pronalazak se odnosi na nutritivne upotrebe pomenutog identifikovanog soja ili postbiotika dobijenog od njega.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0030] Ovaj pronalazak će sad biti detaljnije opisan uz pozivanje na priložene crteže, u kojima:

Fig.1 prikazuje stubičaste grafikone vrednosti septuma iz primera 1, izračunate pomoću image j softvera;

Fig.2 prikazuje stubičaste grafikone sa oblašću ispod septuma iz primera 1, izračunatu pomoću image j softvera;

Fig.3 prikazuje stubičaste grafikone koji ilustruju in vitro efekte na rast krive S. aureus, E. coli i C. albicans dodavanjem u pologe za kulturu različite koncentracije toplotno-ubijenog C. acnes DSM 28251. Fig.4 ilustruje pripremu supernatanta od Staphylococcus aureus koji se koristi u ispitivanju iz primera 3. Fig.5A i 5B prikazuju grafikone koji ilustruju stopu preživljavanja larvi Galleria mellonella nakon injekcije supernatanta iz kultura S. aureus ATCC BAA1680 (At) i S. aureus ATCC 29213 (B) prethodno inkubiranih sa formulacijama ispitivanim 1h prema primeru 4. "Supernatans+oblikA" označava supernatant inkubiran sa LimpiAD A, "Supernatans+oblikD" za supernatant inkubiran sa formulacijom LimpiAD D, "Supernatans+zid" supernatant inkubiran sa aktivnim komponentama LimpiAD, "Supernatans" pozitivna kontrola, "Podloga" za samu kultivacionu podlogu (bez bakterijske kulture), "Fiziološki rastvor" za lažnu terapiju.

Fig.6A i 6B prikazuju grafikone koji ilustruju stopu preživljavanja larvi Galleria mellonella nakon injekcije sa supernatantima iz S. aureus ATCC BAA1680 (A) i S.aureus ATCC 29213 (B) kulture prethodno inkubirane sa ispitivanim formulacijama tokom 4 sata, prema primeru 4. "Supernatans+oblikA" označava supernatant inkubiran sa formulacijom LimpiAD A (kako je definisano u primeru 4), "Supernatans+oblikD" za supernatant inkubiran sa LimpiAD D, "Supernatans+zid" supernatant inkubiran sa aktivnim komponentama LimpiAD, "Supernatans" pozitivna kontrola, "Podloga" za samu kultivacionu podlogu (bez bakterijske kulture), "Fiziološki rastvor" za lažnu terapiju.

Fig.7 prikazuje ekspresiju ciljanih gena "normalizovanih" na kontrolu, izraženu kao višestruko povećanje ili smanjenje, kako je navedeno u primeru 4.

Fig.8 prikazuje pet grafikona, od kojih svaki ilustruje uporedne krive rasta sojeva Staphylococcus aureus (tri različita soja), Staphylococcus epidermidis i Candida albicans inokulisanih sa (plus kontrola bez sojeva) supernatantima iz sedam poznatih sojeva Cutibacterium acnes i (uporedni) soj Cutibacterium acnes DSM 28251;

Fig.9 prikazuje pet grafikona, pri čemu svaki ilustruje uporedne krive rasta tri soja Staphylococcus aureus, jednog soja Staphylococcus epidermidisa i jednog soja Candida albicans, svaki u podlozi inokulisanoj sa sedam različitih toplotno-ubijenih poznatih sojeva Cutibacterium acnes i sa sojem Cutibacterium acnes DSM 28251 (uporedni termički uništeni soj).

Fig.10 prikazuje pet grafikona, pri čemu svaki ilustruje uporedne krive rasta tri soja Staphylococcus aureus, jedan soja Staphylococcus epidermidis i jednog soja Candida albicans, svaki u podlozi inokulisanoj fragmentima bakterijskog zida dobijenim homogenizacijom i odvajanjem gradijenta koje sledi sedam različitih poznatih sojeva Cutibacterium acnes i sojem Cutibacterium acnes DSM 28251 (uporedni fragmenti bakterijskog zida).

DETALJAN OPIS OVOG PRONALASKA

[0031] U prvom aspektu, ovaj pronalazak se bavi sojem koji pripada rodu Cutibacterium vrste acnes, koji je zaveden pod pristupnim brojem DSM 28251 (ID 19-401) kod međunarodnog nadležnog organa za deponovanje Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, ili varijantom koja je suštinski izvedena iz pomenutog soja.

[0032] Ovaj pronalazak se takođe bavi postbiotikom kako je definisan u patentnim zahtevima 2, 3 i ćelijskim zidom kako je definisan u patentnim zahtevima 4, 5.

[0033] Navedeni bakterijski soj ima i anti-inflamatorno dejstvo in vivo, i barem antimikrobijsko dejstvo in vitro. Ćelijski zid ili postbiotik dobijen iz ovog soja takođe ima ova dejstva.

[0034] Navedena dejstva su dokazana eksperimentalnim ispitivanjima koje su sproveli pronalazači i koja su prijavljena u sledećim primerima. Ovi testovi pružaju naučnu osnovu za korišćenje pomenutog bakterijskog soja kao anti-inflamatornog, imunomodulatornog i antimikrobnog agensa, posebno za topikalne primene.

[0035] U određenim aspektima ovog pronalaska, obezbeđena je kompozicija, posebno farmaceutska ili nutritivna kompozicija, koja sadrži soj/zid ili postbiotik kako je ovde definisano.

[0036] U skladu sa drugim aspektom, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu prethodno identifikovanog soja/zida/postbiotika kao leka i na njegove medicinske upotrebe, posebno kako je definisano u zahtevima 9-13.

[0037] Intrinzična svojstva odabranog bakterijskog soja obezbeđuju anti-inflamatorno dejstvo koje omogućava lekaru da leči širok spektar bolesti, posebno one lokalizovane na koži ili sluzokoži ljudskog tela.

[0038] Pored toga, antibakterijska i/ili bakteriostatska svojstva odabranog soja čine ga korisnim u lečenju infekcija, posebno kožnih i sluzokožnih infekcija. Odabrani soj se pokazao efikasnim protiv uobičajenih bakterija, posebno gram-pozitivnih bakterija, posebno koko bakterija kao što je Staphylococcus aureus, ili protiv Escherichia coli i gljivica kao što su gljivice roda Candida.

[0039] Soj prema ovom pronalasku je genotipski karakterisan i može se jasno i definisano identifikovati prema specifičnim karakteristikama koje su identifikovane unutar genoma. Ovaj soj je spontano evoluirao, bez ikakvog direktnog mešanja ili genetske manipulacije, i poseduje relevantne karakteristike za industrijsku primenu. Kako bi se verifikovale i utvrdile karakteristike DSM 28251 soja, i kako bi se isključila moguća preklapanja ovog soja sa sojevima opisanim u prethodnoj literaturi, genotipska karakterizacija je izvršena od strane DSMZ.

[0040] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kozmetičku upotrebu topikalne kompozicije kako je definisano u zahtevima 7, 8, posebno za kozmetičko tretiranje ili prevenciju osetljive kože, crvene kože, kuperoze, suve kože, posebno lica ljudskog bića.

[0041] U određenim aspektima, ovaj pronalazak se takođe bavi sojem ili postbiotikom DSM 28251 C. acnes soja za medicinske upotrebe u lečenju:

- ginekološke bolesti kao što je vaginitis, vaginalna infekcija ili upala ili

- proktološkog poremećaja na primer hemoroida, analnih ragada ili ožiljaka na koži ili perianalne regije ili

- rana, povreda, ogrebotina, ulceracije kože, na primer dekubitisa ili za lečenje rana.

Definicije u ovom pronalasku:

[0042]

- "Soj DSM 28251" se odnosi na bakterijski soj roda Cutibacterium, vrste acnes, koji je prijavljen 18. decembra 2013. godine (identifikaciona referenca ULTIMO) i pretvoren u depozit u skladu sa Budimpeštanskim sporazumom 22. decembra 2019. godine, sa pristupnim brojem DSM 28251 kod međunarodnog nadležnog organa za deponovanje Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Cutibacterium acnes je obično gram-pozitivna bakterija. - "genetska manipulacija" podrazumeva svaku tehničku intervenciju usmerenu na proces sticanja specifičnih genetskih karakteristika koje se manifestuju kao odgovarajuće fenotipske osobine, pri čemu tehničke intervencije obuhvataju (Sturley & Young, 1986): (i) ukrštanje prirodnih sojeva, praćeno selekcijom; (ii) proizvodnju hibrida, praćenu selekcijom; (iii) transformaciju, tj. unošenje egzogenog DNK u hromozome ili u mitohondrijalni genom, ili drugih genetskih elemenata poput plazmida; (iv) indukovanu slučajnu mutagenezu obično praćenu selekcijom i/ili proizvodnjom hibrida (Nevoigt, 2008), koja se može dodati kao dodatni način manipulacije;

- "izvedena varijanta" podrazumeva varijantu soja bakterije Cutibacterium acnes, deponovanu u DSMZ sa pristupnim brojem DSM 28251, koja može da se prati nazad do njega putem profilisanja mikrosatelita DNK ili zbog karakteristične genetičke osobine koja je detektabilna sekvenciranjem genoma i upoređivanjem analiza.

- "podloga za rast" (sinonimi: podloga, podloga za rast / bujon za kultivaciju/ bujon za rast) se odnosi na supstrat koji sadrži sva jedinjenja (faktore) koji su potrebni mikroorganizmu, naročito bakteriji kao što je gram+ bakterija za replikaciju ćelija što dovodi do povećanog broja pojedinačnih ćelija i rasta populacije. Faktori potrebni mikroorganizmima za njihov rast u podlozi uglavnom pripadaju kategorijama: izvor ugljenika, sličan izvor azota (sastavljen i od amonijaka i slobodnih amino kiselina, poslednje poznate i kao FAN), vitamini i soli (traktalementi). Uobičajeni izvori ugljenika su melasa šećerne trske, melasa repe, ekstrakt ječmenog slada i ekstrakt pšeničnog slada.

[0043] Kompozicija nevitalne ćelije/ nežive ćelije, ćelijskih ekstrakata, ćelijskog lizata je strogo povezana sa jedinstvenim metaboličkim i fiziološkim svojstvima DSM 28251 soja.

- "Postbiotici" označavaju nežive bakterijske proizvode, uključujući metaboličke sporedne proizvode koje izlučuju mikroorganizmi poput soja deponovanog u DSMZ sa pristupnim brojem DSM 28251, koji imaju biološko dejstvo u domaćinu ili kada se primenjuju na tkivu ljudskog tela poput kože.

[0044] Postbiotici takođe obuhvataju materijale soja Cutibacterium DSM 28251, uključujući ćelije ubijene toplotom, supernatant mehanički lizovanih ćelija ili fragmente ćelijskog zida. Postbiotici obezbeđuju fiziološke koristi domaćinu i mogu da se koriste za formulaciju kompozicije za medicinske ili kozmetičke upotrebe i za oralnu i/ili topikalnu primenu kako je ovde opisano.

[0045] Postbiotik soja Cutibacterium DSM 28251 može da se dobije prema opštoj proceduri/postupku koji uključuje sledeće faze:

bakterijski soj se uzgaja u podlozi ili bujonu kako bi se dobila suspenzija.

[0046] Suspenzija se centrifugira u epruvetama, upotrebom konvencionalne tehnologije.

[0047] Na kraju centrifugiranja, dobija se stratifikacija suspenzije. Granula koja sadrži ćelije taloži se na dnu epruvete sa gornjim slojem koji sadrži supernatant, tj. tečnost / podlogu za kulturu.

[0048] Supernatant se zatim uklanja, ostavljajući granule nataložene na dnu epruvete, koje se sakupljaju i peru vodom. Granule se zatim ponovo suspenduju u fiziološkom (slanom) rastvoru kako bi se dobile ćelije, i dalje se centrifugiraju radi uklanjanja preostale podloge za kulturu. Ćelije suspendovane u vodi mehanički se tretiraju mehaničkim mešačem, kao što je Ultratturrax (mehanička liza).

[0049] Mehaničkom lizom ćelijskog zida oslobađa se sadržaj ćelija i dobija se postbiotik (supernatant.

[0050] Konkretni načini ostvarivanja ove procedure su dati u detaljnom opisu i primerima u nastavku. - "nosač" se odnosi na ekscipijens, vehikulum, razblaživač ili adjuvans, koji može biti prisutan u kompoziciji ovog pronalaska.

- "nutritivni proizvod" označava proizvod, koji poboljšava nutritivni status i može da se koristi kao podrška funkcionalnom dejstvu jednog ili više organa ljudskog tela unutar fizioloških granica.

- "odabrani bakterijski soj" ili "soj" kako se ovde pominje označava soj iz ovog pronalaska deponovan kod DSMZ sa pristupnim brojem DSM 28251.

- "ćelijski zid" ili "zid bakterijskog soja (ovog pronalaska)" označava ćelijski zid soja Cutibacterium acnes deponovan pod pristupnim brojem DSM 28251.

[0051] Zid soja ovog pronalaska može biti razbijen na delove ili fragmente. Pojam "fragment" označava deo zida soja DSM 28251 ovog pronalaska. Fragment takođe može da označava ćelijski lizat zida soja DSM 28251.

[0052] Fragment ili ćelijski lizat zida soja DSM 28251 može da se dobije konvencionalnim ili opštim postupcima razbijanja ćelija, na primer kao što je opisano u nastavku:

bakterije u bujonu ili podlozi za kulturu se peru i delipidiraju obično korišćenjem soxhlet ekstraktora. Delipidirane bakterije se zatim suspenduju u vodi i podvrgavaju se mehaničkoj lizi, na primer mehaničkim mešačem, na primer Ultratturrax-om, a sadržaj se tretira amonijum-sulfatom radi taloženja fragmenata bakterijskog zida.

[0053] Fragmenti se zatim mogu očistiti, na primer, pranjem vodom kako bi se dobili fragmenti zida.

[0054] Konkretan postupak za dobijanje zida fragmenta soja C. acnes DSM 28251 je opisan u primeru 6.

[0055] Odgovarajuće uništenje/razbijanje soja ili njegovog zida može se postići ili izlaganjem soja iz ovog pronalaska mehaničkim postupcima/lizama ili nemehaničkim postupcima/lizama.

Razbijanje soja mehaničkim postupcima/aparatom

[0056] Odgovarajući mehanički postupci za razbijanje (lizu) ćelijskog zida ovog soja i dobijanje fragmenata zida uključuju ili postupke uništavanja ćelija u čvrstom okruženju ili postupke uništavanja ćelija u tečnom okruženju.

[0057] Postupci uništavanja ćelija u čvrstom okruženju uključuju upotrebu mlinova sa kuglicama, X-prese ili Hughes prese.

[0058] Postupci uništavanja ćelija u tečnom okruženju uključuju sonikaciju i postupke visokog pritiska, uključujući Hughes presu ili francusku presu i/ili homogenizaciju sa homogenizatorom ili pomoću mikrofluidnog homogenizatora.

[0059] Tehnika sa mlinom sa kuglicama (ili abrazija) obično uključuje mešanje suspenzije soja sa staklenim kuglicama.

[0060] Obično, razbijanje ćelijskog zida pomoću postupka sa mlinom sa kuglicama se izvodi u mlinu sa kuglicama koji obuhvata obloženu komoru za mlevenje sa obrtnom osovinom koja prolazi kroz njen centar. Osovina je opremljena mešač(em)ima koji prenose kinetičku energiju na kuglice u komori, čime ih primorava da se sudaraju jedne sa drugima (Chisti & Moo-Young, 1986; Middelberg, 1995).

Odgovarajuće kuglice mogu biti prečnika 0,10-0,15 mm za efikasno razbijanje bakterija. Velike industrijske aparature mogu koristiti kuglice prečnika 0,4-0,6 mm zbog mehanizma za razdvajanje kuglica od suspenzije (Kula & Shutte, 1987). Odgovarajuća brzina vrha je najmanje 10 m<-1>za razbijanje bakterija (Kula & Shutte, 1987). Koncentracije ćelija mogu varirati od 40-50% mokre mase u bujonu koji se uvodi u komoru.

[0061] Odgovarajući postupci uništavanja ćelija u čvrstom okruženju takođe obuhvataju sonikaciju i postupke visokog pritiska, uključujući Hughes presu ili francusku presu, u kojima je zamrznuta suspenzija ćelija pogurana kroz mali otvor visokim pritiscima (Engler, 1985).

[0062] Sonikacija uključuje upotrebu ultrazvuka, zvučnih talasa obično sa frekvencijom većom od 15-20 kHz koji mogu razbijati zid ćelije u suspenziji. Odgovarajuća akustična snaga, na primer, kada se sonikuje 5-30 mL 20% bakterijske suspenzije u konvencionalnoj tečnoj podlozi sa 35-95 W akustične snage.

[0063] Alternativno, mehaničko razbijanje može da se postigne u homogenizatoru sa ventilom pod visokim pritiskom prolaskom ćelijske suspenzije soja pod visokim pritiskom kroz podesivi, ograničeni izduvni ventil, kako je opisao Engler, 1985. Obično, osnovni model homogenizatora obuhvata pumpu sa pozitivnim pomakom koja potiskuje suspenziju ćelija kroz centar ventila i preko njegove površine.

Podešavanje sile na ventilu kontroliše pritisak. Fluid teče radijalno preko ventila i udara u udarni prsten (Middelberg, 1995). Razbijanje potiče od nespecifičnog kidanja ćelijskog zida.

[0064] Primer tipa homogenizatora je model Manton-Gaulin APV (Middelberg, 1995). Na primer, temperatura se podiže za oko 21C po 10MPa u homogenizatoru. Jak je uticaj radnog pritiska na proces razbijanja u homogenizatoru. Radom homogenizatora pod visokim pritiskom, moguće je da se smanji broj prolaza ćelijske suspenzije kroz homogenizator za dati stepen raspadanja (Chisti & Moo-Young, 1986; Bury et al., 2001).

[0065] Mikrofluidni homogenizator takođe može biti korišćen kao oprema za dobijanje fragmentiranog ćelijskog zida. U ovom aparatu, dva toka ćelijske suspenzije udaraju se velikom brzinom o nepomičnu površinu, a energetski ulaz se gotovo trenutno rasipa na mestu udara što dovodi do razbijanja ćelija (Middelberg, 1995; Agerkvist & Enfors, 1990). Vreme zadržavanja soja suspenzije u komori za razbijanje mikrofluidizera, koja je najtopliji deo uređaja, iznosi 25-40 ms. Hlađenje na licu mesta može da se postigne uranjanjem komore za razbijanje u ledenu kupku (Sauer et al., 1989; Geciova, lično iskustvo). Udeo razbijenih ćelija povećava se sa povećanjem pritiska i broja prolaza.

Razbijanje soja nemehaničkim postupcima

[0066] Nemehanički postupak se zasniva na dekompresiji koja se postiže uvođenjem potkritičnog gasa ili nadkritičnog gasa pod pritiskom u ćelije, što dovodi do razbijanja nakon otpuštanja primenjenog pritiska širenjem.

[0067] Drugi nemehanički način razbijanja ćelijskog zida može da se postigne osmotskim šokom, pri čemu se suspenzija ćelije-soja razblaži u tečnoj podlozi/bujonu nakon izjednačavanja visokog osmotskog pritiska u uobičajenim uslovima.

[0068] Alternativni postupak za lizu ćelija je termoliza koja uključuje tretiranje ćelija toplotom u konvencionalnim uslovima. Drugi nemehanički način lize ćelija može da se postigne hemijskom permeabilizacijom, posebno sa supstancom izabranom od antibiotika kao što su beta-laktamski antibiotici, na primer penicilin, helatni agensi kao što je EDTA, kaotropi kao što su urea, gvanidin, etanol, deterdženti kao što su serija Triton X, natrijum-dodecilsulfat, natrijum-laurilsarkozinat, rastvarači kao što su toluen, aceton, hloroform, hidroksidi kao što je natrijum-hidroksid, hipohloriti kao što je natrijumhipohlorit i njihove mešavine.

[0069] Ćelijska liza soja takođe može da se postigne enzimskom lizom, na primer, korišćenjem proteaze i glukanaze koje prvo napadaju kompleks manoproteinskog ćelijskog zida, a zatim glukansku srž(Kitamura, 1982). Pogodan proizvod za lizu zida soja je komercijalni proizvod Zymolase-20T (Seikagaku America, Inc., Rockville, MD). Lizozim takođe može da se koristi za lizu slojeva peptidoglikana jer katalizuje hidrolizu b-1,4-glikozidnih veza.

[0070] U skladu sa poželjnim načinom ostvarivanja fragment zida soja C.acnes DSM 28251 može da se dobije tretiranjem bakterijskog soja amonijum sulfatom, poželjno na temperaturi nižoj od sobne temperature, na primer u opsegu od 10 do 2°C, a nakon tretiranja suspenzija se poželjno centrifugira i talog fragmenta se sakuplja.

[0071] Poželjno, pre tretiranja amonijum sulfatom, soj C.acnes DSM 28251 se suši i centrifugira opciono sa vodom. Opciono, nakon centrifugiranja, supernatant nastao centrifugiranjem se zagreva na primer na temperaturi od 40 do 95°C, poželjno na 75-85°C, a zatim se hladi na primer hladnom vodom, poželjno na 3 do 15°C. Nakon toga, faza taloženja se izvodi inkubacijom sa rastvorom amonijum sulfata u koncentraciji od 20 do 60 % v/v na primer na 2 do 10°C. Poželjno, nakon inkubacije dobijena suspenzija se centrifugira i talog fragmenta može da se sakupi. Na primer, bakterijska granula se delipidira tretiranjem soxhlet-om pomoću organskih rastvarača izabranih iz grupe koju čine etar-etanol, hloroform, metanol-hloroform i njihove smeše, zatim se suši na primer pod haubom laminarnog protoka. Nakon sušenja, granula se homogenizuje u 2 faze Ultratturrax tretiranjem, poželjno 1 minut po svakoj, pri čemu se dodaje destilovana voda, poželjno u odnosu 1:2 p/V. Nakon centrifugiranja, supernatant se zagreva na 80°C, a zatim hladi pod hladnom vodom, poželjno na 3 do 15°C, i na kraju na ledu. Nakon toga, faza taloženja fragmenta se izvodi inkubacijom sa 40% v/v hladnog amonijum sulfata tokom 24 sata na 4°C. Nakon inkubacije, suspenzija se centrifugira, a talog fragmenta se sakuplja i liofilizuje

[0072] U nekim načinima ostvarivanja, fragment ćelijskog zida Cutibacterium acnes deponovanog pod pristupnim brojem DSM 28251 se delipidira, odnosno tretira tako da se ili ukloni ili značajno redukuje lipidni sastojak ćelijskog zida bakterije pomoću hemijskih/biotehničkih tehnika. Na primer, delipidirani fragmenti ćelijskog zida Cutibacterium acnes deponovanog pod pristupnim brojem DSM 28251 se delipidiraju pre drobljenja kako bi se proizveli fragmenti ćelijskog zida. Obično, delipidirani fragmenti ćelijskog zida ovog soja sadrže šećere i peptidne lance, obično povezane u glikopeptide koji formiraju pleten u mrežu. Tipični šećeri ćelijskog zida uključuju N-acetilmuraminsku kiselinu i N-acetilglukozamin.

FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE

[0073] Bakterijski soj DSM 28251 i njegovi suštinski izvedeni sojevi ili fragment ili dobijen postbiotik se pokazuju kao izuzetno korisni za industrijsku primenu u pripremi farmaceutskih kompozicija, posebno za topikalnu primenu.

[0074] Prema jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata bakterijski soj kao što je prethodno definisani fragment ili dobijeni postbiotik i farmaceutski ili fiziološki prihvatljiv ekscipijens. Fiziološki ili farmaceutski prihvatljivi nosač, razblaživač ili ekscipijens mogu biti odabrani na osnovu načina primene za koju je namenjena dobijena farmaceutska kompozicija.

[0075] Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska obuhvataju bilo koje kompozicije napravljene mešanjem ovde definisanog soja, njegovog fragmenta ili njegovog postbiotika prema ovom pronalasku i farmaceutski prihvatljivog nosača. Takve kompozicije su pogodne za farmaceutsku upotrebu kod životinja ili ljudi.

[0076] Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska sadrže terapijski efektivnu količinu soja, kako je prethodno definisano, ili njegovog fragmenta/postbiotika, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0077] Farmaceutska kompozicija opciono može da sadrži druge aktivne sastojke. Pojam "nosač" se odnosi na vehikulum, ekscipijens, razblaživače, ili adjuvans sa kojim se terapijski ili aktivni sastojak daje. Bilo koji nosač i/ili ekscipijens pogodan za oblik pripreme poželjan za davanje je u razmatranju za upotrebu sa ovde otkrivenim sojevima/zidom/postbiotikom.

[0078] Nosač može da poprimi širok spektar oblika u zavisnosti od oblika pripreme željenog za primenu, npr. oralni ili parenteralni, uključujući intravenski. Pri pripremi kompozicija za oralni dozni oblik, mogu da se koriste bilo koji uobičajeni farmaceutski agensi, kao što su, na primer, voda, glikoli, ulja, alkoholi, arome, konzervansi, boje i slično u slučaju oralnih tečnih preparata, kao što su, na primer, suspenzije, eliksiri i rastvori; ili nosači kao što su skrob, šećeri, mikrokristalna celuloza, razblaživači, agensi za granulaciju, lubrikanti, veziva, sredstva za dispergovanje i slično u slučaju oralnih čvrstih preparata kao što su, na primer, praškovi, tvrde i meke kapsule i tablete, pri čemu su čvrsti oralni preparati poželjniji od tečnih preparata.

[0079] U određenim načinima ostvarivanja, soj/ćelijski zid/postbiotik ovog pronalaska može da se kombinuje kao aktivni sastojak u intimnoj smeši sa odgovarajućim farmaceutskim nosačem i/ili ekscipijensom prema konvencionalnim tehnikama farmaceutskog pravljenja jedinjenja.

[0080] Kompozicije uključuju kompozicije pogodne za parenteralnu, uključujući subkutanu, intramuskularnu i intravensku, plućnu, nazalnu, rektalnu, topikalnu ili oralnu primenu. Pogodan način primene u bilo kojem datom slučaju zavisiće delimično od prirode i ozbiljnosti stanja koje se leči i prirode aktivnog sastojka. Primer načina davanja je oralni način davanja. Kompozicije mogu biti upakovane na odgovarajući način u obliku dozne jedinice i pripremljene bilo kojim od postupaka dobro poznatih u farmaceutskoj industriji. Poželjne kompozicije uključuju kompozicije pogodne za oralno, parenteralno, topikalno, subkutano ili plućno davanje, u obliku nazalne ili bukalne inhalacije. Kompozicije mogu da se pripreme bilo kojim od postupaka dobro poznatih u farmaceutskoj industriji.

[0081] Farmaceutske kompozicije mogu biti u obliku tableta, pilula, kapsula, rastvora, suspenzija, emulzija, praškova, supozitorija, i formulacija sa produženim oslobađanjem.

[0082] Po želji, tablete mogu da se oblože standardnim vodenim ili nevodenim tehnikama. U određenim načinima ostvarivanja, takve kompozicije i preparati mogu da sadrže najmanje 0,1 posto soja. Procenat aktivnog soja/zida/postbiotika u takvim kompozicijama, naravno, može da varira i uobičajeno može biti između oko 0,1 posto do oko 60 posto 0,5 do 20mas.% jedinice. Količina aktivnog soja/zida/postbiotika u takvim terapeutski korisnim kompozicijama je takva da će se postići terapeutski aktivna doza.

Soj/zid/postbiotik takođe može da se primenjuje intranazalno kao, na primer, tečne kapi ili sprej.

[0083] Tablete, pilule, kapsule i slično takođe mogu sadrže veziva poput gume tragakanta, akacije, kukuruznog skroba ili želatina; ekscipijense poput dikalijum-fosfata; agense za dispergovanje poput kukuruznog skroba, krompirskog skroba, alginatne kiseline; lubrikant kao što je magnezijum-stearat; i zaslađivač poput saharoze, laktoze ili sakarina. Kada je dozni oblik kapsula, ona može da sadrži, osim prethodno navedenih materijala, tečni nosač poput masnog ulja. Razni drugi materijali mogu biti prisutni kao sredstva za oblaganje ili radi modifikovanja fizičkog oblika dozne jedinice. Na primer, tablete mogu da se oblože šelakom, šećerom ili oboma. Sirup ili eliksir mogu da sadrže, pored aktivnog sastojka, saharozu kao zaslađivač, metil i propilparabene kao konzervanse, boju i aromu poput arome višnje ili narandže. Da bi se sprečilo raspadanje tokom prolaska kroz gornji deo gastrointestinalnog trakta, kompozicija može biti enterički obložena formulacija.

[0084] U okviru ovog pronalaska, poželjne su topikalne upotrebe. Shodno tome, u određenim poželjnim načinima ostvarivanja, kompozicija je za topikalnu primenu. Kod ove primene, kompozicija koja sadrži soj/zid/postbiotik kako je ovde definisano može da se nanosi na kožu ljudi.

[0085] Kompozicije za topikalnu primenu obuhvataju, ali bez ograničenja na, masti, kreme, losione, rastvore, paste, gelove, štapiće, lipozome, nanočestice, flastere, zavoje i obloge za rane. U određenim načinima ostvarivanja, topikalna formulacija sadrži pojačivač penetracije.

[0086] Kompozicije za pulmonalnu primenu obuhvataju, ali bez ograničenja na, kompozicije suvog praha koje se sastoje od praha soja/fragmenta/postbiotika, i praha odgovarajućeg nosača i/ili lubrikanta.

Kompozicije za pulmonarnu primenu mogu da se udišu iz bilo kojeg odgovarajućeg uređaja za suvi prašak za inhalaciju koji je poznat stručnjaku iz ove oblasti.

[0087] Obično kompozicija za topikalnu upotrebu može da sadrži količinu prethodno identifikovanog bakterijskog soja od 0,00001% do 10%, od 0,0001 do 3%, od 0,1 do 2mas.% u odnosu na ukupnu masu kompozicije.

[0088] Kompozicija za topikalnu primenu može biti u čvrstom, polučvrstom ili tečnom obliku. Pogodni oblici u čvrstom obliku uključuju kreme, gelove, masti, paste, pomade, kreme, flastere.

[0089] Kompozicija za lokalnu primenu u tečnom obliku, može biti u obliku losiona, gelova, suspenzija, emulzija.

[0090] U slučaju tečnih ili polutečnih formulacija, bakterijski soj može biti razblažen u nosaču u fiziološki prihvatljivom tečnom obliku poput vode, alkohola, hidroalkoholnog ili glicerilnog rastvora ili pomešan sa drugim tečnostima pogodnim za lokalnu primenu.

[0091] Kao primer, kompozicije ovog pronalaska u tečnom obliku mogu biti pripremljene rastvaranjem ili dispergovanjem bakterijskog soja ili njegovog sporednog proizvoda u vodi i/ili alkoholu. Tečna kompozicija može biti izbalansirana na odgovarajući pH opseg, poželjno odabran od 5 do 7, kako bi bila kompatibilna sa pH vrednošću kože, a zatim filtrirana i upakovana u odgovarajuće kontejnere poput bočica ili ampula.

[0092] U jednom načinu ostvarivanja, formulacija za lokalnu primenu je u obliku kreme ili emulzije koja sadrži bakterijski soj nošen u odgovarajućem nosaču.

[0093] Prema drugim načinima ostvarivanja, kompozicija ovog pronalaska je u obliku za sistemsku primenu, posebno za oralnu primenu. U tim slučajevima, kompozicija sadrži bakterijski soj kao što je prethodno definisano, i jedan ili više vehikuluma ili ekscipijenasa pogodnih za sistemsku primenu.

[0094] Primena ovih kompozicija se izvodi prema protokolu i u dozama dovoljnim da smanje ciljanu bolest kod subjekta.

[0095] U nekim načinima ostvarivanja, u farmaceutskim kompozicijama ovog pronalaska aktivna supstanca ili aktivne supstance su generalno formulisane u doznim jedinicama. Dozna jedinica može da sadrži od 0,00001 do 1000 mg soja/zida/postbiotika po doznoj jedinici za dnevnu primenu.

[0096] U nekim načinima ostvarivanja, količine koje su efikasne za topikalnu formulaciju zavisiće od težine bolesti, poremećaja ili stanja, prethodne terapije, zdravstvenog stanja pojedinca i odgovora na lek. U nekim načinima ostvarivanja, doza je u opsegu od 0,001mas.% i do oko 60mas.% formulacije.

[0097] Kada se koristi u kombinaciji sa jednim ili više drugih aktivnih sastojaka, soj/zid/postbiotik ovog pronalaska i drugi aktivni sastojak mogu da se koriste u nižim dozama nego kada se svaki koristi samostalno.

[0098] Što se tiče formulacija za različite načine primene, postupci i formulacije za primenu lekova, su otkriveni u Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, Gennaro et al. Eds., Mack Publishing Co., 1985, and Remington’s Pharmaceutical Sciences, Gennaro AR ed.20th Edition, 2000, Williams

& Wilkins PA, USA, i Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins Eds. , 2005; i kod Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 8th Edition, Lippincott Williams & Wilkins Eds., 2005.

[0099] U određenim načinima ostvarivanja, kompozicija ovog pronalaska za oralnu primenu predstavlja nutritivni ili dijetetski ili nutraceutikalni proizvod.

[0100] Primeri načina ostvarivanja i poželjni postupci ovog pronalaska su opisani u nastavku kako bi se ilustrovao ovaj pronalazak.

PRIMER 1

[0101] In vitro potencijalna migracija humanih ćelija fibroblasta stimulisanih supernatantom izvedenim iz kulture bakterijskog soja pristupnog broja DSM 28251.

Cilj ispitivanja

[0102] Jedan od mehanizama delovanja supernatanta kulture bakterijskog soja sa pristupnim brojem DSM 28251 pripisuje se postbiotskom efektu. Pojam "postbiotik" se odnosi na metaboličke sporedne proizvode mikroorganizama, posebno bakterija i/ili probiotika. Obično, postbiotici se proizvode metaboličkim dejstvom ili fermentacijom bakterija poput probiotika (živih mikroorganizama koji izazivaju korisne efekte za domaćine kada se primenjuju u odgovarajućim količinama).

[0103] Postbiotici igraju izuzetno važnu ulogu u regulisanju zdravlja i održavanju zdrave mikrobiote.

[0104] Jedan od ciljeva ovog istraživanja je procena postbiotskog efekta na migraciju imortalizovanih humanih fibroblastnih ćelija kože, kako bi se procenilo da li supernatant dobijen iz kulture bakterijskog soja sa pristupnim brojem DSM 28251 pospešuje migraciju ove ćelijske linije.

Ispitivani uzorci

[0105] Supernatant izveden iz kulture Bacteria soja sa pristupnim brojem DSM 28251.

Materijali i postupci

Bakterije

[0106] Bakterijski soj sa pristupnim brojem DSM 28251 ovog pronalaska je uzgajan u podlozi bujona sa moždano-srčanom infuzijom (BHI) preko noći na 37°C, a zatim je radi procene postbiotskog efekta supernatant iz bakterijskog rasta centrifugiran, a zatim filtriran (0,45 µm) radi uklanjanja bakterijskih ćelija. Pre upotrebe, određena količina je posejana na BHI agaru i inkubirana 24 sata na 37°C kako bi se proverila odsutnost mikrobijskog rasta.

Ćelijska linija

[0107] Nemutagene humanee fibroblastne ćelije kože održavane su u posudama za kulturu površine 25 cm2 u Dulbekovoj modifikovanoj Iglovoj podlozi (DMEM) sa dodatkom 1% L-glutamina 200 mM, penicilina (100U/mL), streptomicina (100 µg/mL) i 10% FBS. Ćelije, nakon pranja sa DPBS, su odvojene na sobnoj temperaturi pomoću 0,25% tripsin-EDTA rastvora 1X, a zatim su posmatrane pod invertnim mikroskopom dok se sloj ćelija ne rasprši (obično u roku od 5 minuta). Ćelije su bile zasejane u µ-sud (prečnika 35 mm) koji sadrži umetak za kulturu (kod.81176 Ibidi, Giemme, Italija). Umetak za kulturu se sastoji od dva bunarčića; kada su oba bunarčića ispunjena prionulim ćelijama, nakon uklanjanja umetka za kulturu stvara se prazan kanal (prostor) za ćelije od približno 500 µm. Suspenzija ćelija je pripremljena sa gustinom od 3-7 × 105 ćelija/mL, primenjena u dva bunarčića umetka za kulturu (70 µL/poklopac) i čuvana na 37°C u 5% CO2 u DMEM-u sa dodatkom 1% L-glutamina 200 mM, penicilina (100U/mL), streptomicina (100 µg/mL) i 10% FBS. Nakon 24 sata odgovarajućeg pričvršćivanja ćelija, umetak za kulturu se uklanja pomoću sterilnih pinceta i µ-sud se napuni podlogom (2 mL).

Ćelijski eksperiment za analizu migracije

[0108] Ćelije su tretirane supernatantom, prethodno filtriranim, dobijenim iz kulture bakterija Aileens, razblaženim u odnosu 1:10 i 1:100 sa DPBS-om (Dulbekov fiziološki rastvor fosfata). Dalje, fibroblasti tretirani BHI podlogom razblaženom u odnosu 1:10 i 1:100 sa DPBS-om korišćeni su kao kontrola.

[0109] Ćelije će se održavati još 24 sata. Opseg migracije ćelija će biti fotografisan digitalnom mikroskopskom okularom i izmeren pomoću softvera za analizu slike, Image J (verzija 1.45s, dostavljena od strane Nacionalnog instituta za zdravlje, SAD). Svaka slika će zatim biti transformisana u negativ korišćenjem funkcije softvera, a zatim merena. Eksperimenti su sprovedeni u triplikatu i rezultati su izraženi kao srednja vrednost ± standardna greška (SE). Studentov T-test će se koristiti za statističku značajnost. Vrednosti p>0,05 će se smatrati statistički značajnom.

Rezultati

[0110] Dobijeni rezultati pokazuju da supernatant bakterijskog soja sa pristupnim brojem DSM 28251 razblažen u odnosu 1:10 i 1:100 sa DPBS-om pospešuje migraciju ćelija (Fig.1 i 2). Dalje, BHI razblažen u odnosu 1:10 i 1:100 sa DPBS-om ne utiče na migraciju fibroblasta.

PRIMER 2

[0111] Dejstvo toplotno-ubijenog bakterijskog soja koji je deponovan pod pristupnim brojem DSM 28251 sa DSMZ na rast humanih patogenih mikroorganizama.

Materijal i postupci

[0112] Bakterijski soj je uzgajan u podlozi bujona sa moždano-srčanom infuzijom (BHI) preko noći na 37°C a zatim toplotno-ubijen na 60°C za 1 sat.

[0113] Kultura je isprana vodom kako bi se isprala podloga, a zatim je kultura bez podloge razblažena na 10<7>, 10<6>i 10<5>CFU/ml kako u Muller Hinton (MH) tako i u Sabouraud podlozi. Inokulum S. aureus ATCC 29213 i E. coli ATCC 11775 od 10<5>ćelija/ml je uzgajan u triplikatu u konačnoj zapremini od 150 µl svake razblažene kulture u ploči sa 96 bunarčića za svako Muller Hinton razblaženje toplotno-ubijene kulture. Slično tome, inokulumi C. albicans od 10<5>ćelija/ml su uzgajani u triplikatu u 10<7>, 10<6>i 10<5>razblaženjima toplotno-ubijene bakterijske kulture u Sabouraud podlozi. Kao kontrole, proizvedeni su triplikati svih razblaženja na obe podloge, kao i kontrole za rast sojeva proizvedene inokulacijom od 10<5>ćelija/ml S. aureus-a, E. coli-a i C. albicans-a u konačnoj zapremini od 150 µl Muller Hinton i Sabouraud podloge, tim redom. Optička gustina (O.D.) na talasnoj dužini od 600 nm je izmerena za svaku posudu pre (T0) i posle 3, 6, 20 i 24 sata (T3, T6, T20, T24) inkubacije na 37°C. Rast, kao trend vrednosti O.D., posmatran za svaki soj u podlozi dodatoj toplotno-ubijenom soju, upoređen je sa rastom u samo Muller Hinton ili samo Sabouraud podlozi.

[0114] Sposobnost bakterijskog soja sa pristupnim brojem DSM 28251 da ometa ili inhibira mikrobijski rast bakterija i gljivica koje se često nalaze na ljudskoj koži (videti ispitivane bakterijske sojeve) ispitivana je spektrofotometrijskom metodom koju su opisali Hall et al.

[0115] Inhibicija mikrobijskog rasta procenjivana je u polistirenskim pločama sa 96 bunarčića. Serijska razblaženja tindalizovane smeše (od 10<7>do 10<5>CFU/ml) inokulisana su sa ispitivanim mikroorganizmima, zajedno sa samim mikroorganizmima (kontrola) i podlogom (slepa kontrola). Svi mikrobijski sojevi su ispitivani u skladu sa smernicama CLSI (Clinical Standard Laboratory Institute) [3,4].

[0116] U definisanim intervalima (3, 6, 20 i 24 sata), vršeno je spektrofotometrijsko očitavanje na 600 nm. Rezultati su prikazani kao krive rasta (samo mikroorganizam) i krive inhibicije (mikroorganizam i koncentracije tindalizata). Svaki eksperiment je sproveden u osam kopija i ponovljen tri puta, pri čemu su rezultati izraženi kao srednja vrednost ± standardna devijacija (SD).

Ispitivani bakterijski sojevi:

[0117]

- Staphylococcus aureus

- Candida albicans

- Escherichia coli

[0118] Rezultati su prikazani na priloženoj Fig.3.

[0119] Kao što je prikazano na Fig.3, dodavanje bakterijskog soja sa pristupnim brojem DSM 28251 prema ovom pronalasku kulturama S aureus usporava na dozno zavisan način logaritamsku fazu rasta.

[0120] Slični rezultati su pronađeni sa C. albicans.

[0121] Ovi eksperimentalni podaci idu u prilog inhibitornom efektu za bakterijski soj sa pristupnim brojem DSM 28251 prema ovom pronalasku.

[0122] Uporedni test sa samom podlogom za kultivisanje (tj. bez 28251 soja).

PRIMER 3

Ispitivanja sa formulacijama koje sadrže soj DSM 28251 ovog pronalaska na rast C. albicans Materijal i postupci

Ispitivane formulacije

[0123]

A) osnovna formula (bez soja DSM 28251 )

B) formula sa 1% soja DSM 28251

C) formula sa 2,5 % soja DSM 28251

D) formula sa 2,5% soja DSM 28251 (2x C40)

[0124] Osnovna formula formulacije sadrži vodu, kaprilni/kaprinski triglicerid, glicerin i šea puter. Postupak

[0125] Svaka formulacija je dodata u agar podlogu (20%) u pločama sa 4 odeljka. Četiri odeljka su korišćena za sejanje različitih razblaženja gljiva (10-5 do 10-8 CFU/ml), pri čemu su ista razblaženja sejana na podlogama bez formulacija, kao kontrola. Nakon inokulacije, ploče sa formulacijama su inkubirane na 37°C tokom 48 sati. Rast gljivica u podlogama sa formulacijama je proveren u poređenju sa kontrolom. Osim toga, pH same podloge i formule/podloge su zabeležene, kako bi se proverilo moguće mešanje sa prelaskom sa virulentnogm stanja u nevirulentno stanje kod C. albicans.

Rezultati

[0126] U kontrolnoj grupi, primećeno je jasno formiranje brojnih kolonija sa uobičajenom belom i zamagljenom morfologijom (2x109 CFU/ml).

[0127] Na osnovu mikroskopskih nalaza, primećene su karakteristične ćelijske morfologije patogenog mikroorganizma sa proizvodnjom gljivičnih hifa.

[0128] Za sve ispitivane formulacije, primećeno je formiranje neprozirne patine sa nedostatkom formiranja hifa, što su karakteristike povezane sa prelaskom patogena iz virulentnog stanja u nevirulentno stanje.

[0129] Štaviše, pH same podloge (S) za kulturu je slična pH vrednostima podloge formula; stoga, promena pH vrednosti ne izgleda da je obuhvaćena fenotipskom promenom.

Zaključci

[0130] Kod C. albicans, primećena je varijacija u morfologiji kolonija: u odsustvu formulacija, primećene su uobičajene kolonije sa mlečnim izgledom, dok je u prisustvu formulacija dobijena homogena i prozirna patina. Ova varijacija je takođe potvrđena i na mikroskopskom nivou, bez formulacija, mikroorganizam je primećen kao kvasac i kao plesan (prisustvo hifa), dok je u prisustvu formula primećen samo kao kvasac.

[0131] Ovo zapažanje je dokaz inhibitorskog dejstva na rast Candida albicans formulacija koje sadrže odabrani soj ovog pronalaska.

PRIMER 4

Inhibitorno dejstvo formulacije koja sadrži soj DSM 28251 (LimpiAD) protiv toksina/katabolita koje proizvodi S. aureus: Galleria mellonella in vivo ispitivanje i određivanje ekspresije gena

Uvod

[0132] Ispitano je potencijalno dejstvo formule i aktivne supstance kao agenasa sposobnih da smanje efekte toksina S. aureus-a na specifični biološki cilj. S. aureus je jedan od najpoznatijih mikroorganizama u etiologiji i razvoju atopijskog dermatitisa. Jedan od njegovih glavnih patogenetskih mehanizama je proizvodnja širokog spektra toksina.

[0133] Ispitivana LimpiAD formula sadrži vodu, kaprilni/kaprinski triglicerid, glicerin i šea puter.

[0134] U tu svrhu, izveden je in vivo test koristeći larve Galleria mellonella. Veći voskov moljac Galleria mellonella (G. mellonella) predstavlja model organizma koji je već validiran za eksperimente infekcije bakterijama i za ispitivanja farmakološke toksičnosti. On predstavlja ključni alat za preliminarno ispitivanje novih jedinjenja i brzu i pouzdanu procenu potencijalne inhibitorske aktivnosti i time bi trebalo da smanji broj potrebnih eksperimenata upotrebom modela sisara.

[0135] Larve G. mellonella pružaju višestruke opcije za laku isporuku patogena, poput topikalne primene, oralne primene i injekcije. Mikroorganizam može biti direktno ubrizgan u larvalni hemokel i stoga, larve primaju poznatu količinu patogena.

[0136] Još jedna prednost modela G. mellonella je mogućnost procene ekspresije gena koji su povezani sa imunitetom i stresom. Stoga, kako bismo istražili delovanje uređaja na larve G. mellonella inokulisane supernatantom S. aureus, sproveli smo qPCR analizu kako bismo procenili efekat LimpiAD-a na gene imuniteta i stresa kod G. mellonella. Izabrali smo gene koji igraju ključnu ulogu u imunološkim odgovorima insekata na infekcije: fagocitozu, regulaciju citokina, adheziju ćelija i inhibitor metaloproteinaza.

Materijal i postupci

Ispitivani mikrobijski sojevi i uslovi za kulture

[0137] Staphylococcus aureus ATCC BAA1680 i Staphylococcus aureus ATCC 29213 su uzgajane u podlozi bujona sa moždano-srčanom infuzijom (BHI) i inkubirane preko noći u termalnim uslovima na 37°C.

[0138] Priprema supernatanata: Kulture oba Staphylococcus soja centrifugirane su na 5000 obrtaja u minuti tokom 5 minuta preko noći. Preostale bakterijske ćelije su uklonjene sterilizacijom filterom (0,22 µm) i razblažene u fiziološkom rastvoru u odnosu (1:2).

[0139] Razblaženi supernatanti su pomešani (1:5 w/v) sa tri različite formulacije (tabela 1):

- LimpiAD A (osnovna formula, bez aktivne komponente);

- LimpiAD D (sa 2,5% aktivne komponente);

- sama aktivna komponenta.

[0140] Nakon inkubacije formulacija od 1h i 4h, supernatanti su sakupljeni centrifugiranjem i korišćeni za inokulaciju larvi Galleria mellonella. Tretirane larve ubrizganim supernatantima (bez formulacije) i samom kulturom podloge (bujon sa moždano-srčanom infuzijom) u odnosu 1:2 su korišćene kao kontrole (Fig.25).

[0141] Za procenu preživljavanja larvi G. mellonella, larve su odabrane na osnovu mase i veličine, i podeljene u eksperimentalne grupe navedene u tabeli 1. Larve su inokulisane injekcijom pomoću dozatora za ponovno doziranje opremljenog špricom sa insulinom (BD, Wellington) i ultrafinom iglom od 1 mL kroz poslednju nogu larvi. Nakon inokulacije, larve za svako stanje su inkubirane u Petrijevim sudovima na 35°C, a preživljavanje je praćeno narednih 96 sati.

Određivanje ekspresije gena: qPCR

[0142] Tri preživele larve za svaku grupu (kontrola, fiziološki rastvor; inficirani, supernatant ATCC BAA1680; tretirani supernatantom ATCC BAA1680 S aureus) su sakupljene 96 sati nakon tretiranja. RNK je ekstrahovana u TRI Reagent-u (Sigma Aldrich) u skladu sa protokolom proizvođača. Ekstrakti RNK su kvantifikovani spektrofotometrijski, a zatim reverzno transkribovani u cDNK pomoću ReadyScript™ cDNK sintetičke mešavine (Sigma Aldrich)

[0143] Imenovane funkcije prajmera i sekvence korišćene u ekspresiji gena su navedene u tabeli 2. Ekspresioni sklopovi gena u odnosu na referentni gen EF1 su određeni u normalizovanim uzorcima pomoću Rotor-Gene Q - QIAGEN, sa PowerSYBR® (AppliedBiosystems). Uslovi ciklusa bili su 95°C 5 min, zatim 42 ciklusa: 95°C 5 sec, žarenje 10 sec, 72°C 20 sec. Početno snižavanje temperature od 1°C po ciklusu sa 65°C za prvih 5 ciklusa, je dovelo do optimalne amplifikacije za sva mesta. Sva eksperimentalna ispitivanja su izvršena u triplikatima za tri različita merenja [7].

Tabela 2. Prajmeri korišćeni za analizu ekspresije gena kod larvi Galleria mellonella Prajmer Postupak Funkcija Ushodni prajmer Nishodni prajmer

[0144] Priprema supernatanta i S. aureus koji se koriste u ispitivanju su ilustrovani na Fig.5.

Preživljavanje larvi

[0145] U poređenju sa kontrolnim grupama, supernatanti koji su prethodno inkubirani tokom jednog sata sa ispitivanim formulama su bili dosta manje smrtonosni.

[0146] Samim tim povećanje preživljavanja larvi S. aureus ATCC BAA1680 se pripisuje dejstvu aktivnih komponenti.

[0147] Slično tome, nakon 4 sata inkubacije, dejstvo osnovne formule A je potvrđeno na manjem nivou, dok je formula D potvrdila veće preživljavanje larvi.

[0148] Vezano za soj S. aureus ATCC 29213, takođe je potvrđeno manje dejstvo osnovne formule A u odnosu na ostale ispitivane formule. U ovom slučaju, aktivne komponente su dovele do većeg povećanja preživljavanja larvi u poređenju sa formulom D kako u prethodnim tretiranjima od 1h tako i od 4h.

[0149] Sveukupno ovi rezultati su ukazivali da bi aktivne komponente mogle da se mešaju sa patogenezom povezanom sa toksinima /katabolitima koje proizvodi S. aureus ATCC BAA1680. Štaviše, dejstvo bi moglo da se primeti već nakon 1 sata inkubacije za oba soja kao i za soj S. aureus ATCC 29213, pri čemu se intenzitet mešanja pokazao jačim, kako je interakcija sa toksinima/katabolitima u supernatantima potencijalno duže trajala (Fig.27-28).

[0150] Obrnuto, gen sa 18 točkova je bio hipo-eksprimiran (99,98%) u inficiranoj grupi u poređenju sa tretiranom grupom. Prethodna inkubacija sa LimpiAD-om značajno je povećala ekspresiju ovog gena koji je uključen u adheziju i migraciju ćelija.

Određivanje ekspresijom gena

[0151] Ekspresija dva gena povezana sa metaboličkim stresom IMPI i GLUT nije značajno promenjena u poređenju sa kontrolom u oba grupe, kako je prikazano na Fig.7. Dakle, LimpiAD ne menja ekspresiju ovih gena. Ekspresija dva gena povezana sa urođenim imunitetom bila je različito eksprimirana u inficiranoj grupi u odnosu na tretiranu grupu. CITOK gen koji reguliše inflamatorne citokine (B kaskada NF-kappa) bio je prekomerno eksprimiran (93,8%) u inficiranoj grupi u poređenju sa tretiranom grupom. Dakle, LimpiAD je smanjio ekspresiju proinflamatornih citokina.

Tabela 3. Ekspresija gena G. mellonalla nakon tretiranja sa LimpiAD/inficirani

Zaključak

[0152] Infekcije patogenim sojevima Staphylococcus aureus smatraju se štetnim faktorom u atopijskom dermatitisu jer ovi mikroorganizmi, proizvodeći katabolite, stimulišu oslobađanje inflamatornih citokina i doprinose oštećenju epidermalne barijere i manifestaciji karakterističnih simptoma bolesti.

[0153] Dobijeni rezultati ukazuju da komponente LimpiAD smanjuju efekat katabolita koje proizvodi S. aureus na preživljavanje ubrizganih larvi G. mellonella.

[0154] Dalje, tretiranje sa LimpiAD je smanjilo ekspresiju pro-inflamatornih citokina i povećalo je ekspresiju gena sa 18 točkova koji je uključen u adheziju i migraciju ćelija. Podaci dobijeni iz ekspresije gena metaboličkog stresa i imuniteta pružaju dodatne dokaze o mehanizmu delovanja uređaja LimpiAD.

PRIMER 5

Uporedno in vitro ispitivanje

[0155] Uporedno ispitivanja sa tindalizovanim sojem C. acnes DSM 28251 u poređenju sa drugim cutibacterium sojevima na rast patogenih mikroorganizama kože.

Cilj ovog ispitivanja

[0156] Inhibitorsko dejstvo toplotno-ubijenih bakterija soja C. acnes DSM 28251 na bakterije koje kolonizuju kožu upoređivano je sa dejstvom četiri različita soja iste vrste (Cutibacterium sojevi sa istom kompozicijom peptidoglikana) i sojem C. granulosum koji su veoma bliski sa evolutivne tačke gledišta (filogenetska blizina).

[0157] Cilj ovog ispitivanja je bio da se oceni da li soj C. acnes DSM 28251 ima svojstva koja su specifična ili poboljšana u poređenju sa drugim vrstama sa filogenetskom bliskošću.

[0158] U tu svrhu, četiri soja Cutibacterium spp. (tri Cutibacterium acnes i jedan Cutibacterium granulosum) koji se razlikuju od soja DSM 28251, ili po filotipu ili po filogenetskoj udaljenosti, su odabrani i ispitivani (ispitivani soj).

[0159] Ispitivanjem su takođe bila obuhvaćena dva soja C. acnes (DSM 30738 i 30753) čije karakteristike nisu poznate, mada pripadaju istoj vrsti kao soj DSM 28251 ovog pronalaska.

PATOGENI MIKROORGANIZMI NA KOŽI

[0160] Inhibitorsko dejstvo gorenavedenih šest Cutibacterium sojeva je ispitivano u odnosu na sledećih pet mikroorganizama koji su dobro poznati i široko rasprostranjeni kožni patogeni:

- S. aureus ATCC 29213

- S. aureus ATCC BAA-1680

- S. aureus DSM 20491

- S. epidermidis ATCC 12228

- Candida albicans ATCC 90028

MATERIJAL I POSTUPCI

Priprema bakterija ubijenih toplotom (Cutibacterium)

[0161] Ispitivane Cutibacterium su ubijene tindalizacijom (frakcionom sterilizacijom).

[0162] Svi sojevi Cutibacterium su uzgajani u BHI (Brain Heart Infusion) bujonu sa 20% dodatka na temperaturi od 37°C do maksimalne eksponencijalne faze rasta verifikovane spektrofotometrijskim očitavanjem (O.D.600 nm). Posle toga, podloga je uklonjena centrifugiranjem i obrađena radi ispitivanja supernatanta. Bakterijska granula je oprana u fiziološkom rastvoru (NaCl 0.9%) do potpunog uklanjanja bilo kog rezidualnog supernatanta a zatim razblažena do koncentracije od 0,5McFarland (1,5×10<8>CFU/ml).

[0163] Titrirani inokulum je podvrgnut tindalizaciji.

[0164] Postupak tindalizacije uključivao je zagrevanje na 80°C tokom 30 minuta radi uništavanja vegetativnih oblika, nakon čega je usledio period inkubacije na 37°C tokom 24 sata radi pospešivanja klijanja preostalih vegetativnih ćelija koje nisu uništene termičkom obradom, a zatim je materijal ponovo zagrejan na 80°C tokom 30 minuta. Ceo termički ciklus ponovljen je 3 puta. Alikvot tindalizovanog materijala posejan je na kolumbijskom agaru sa krvlju i inkubiran na 37°C u aerobiozi tokom 24 sata radi provere odsustva mikrobnog rasta i pravilne primene postupka. Tindalizovane bakterijske ćelije imaju inaktiviranu replikacionu i enzimatsku sposobnost, ali zadržavaju svoju ćelijsku strukturu i zid, stoga su fiziološki intaktne i, iz tog razloga, imunološki aktivne.

Ocena dejstva ubijenih sojeva na rast patogenih mikroorganizama

[0165] Sposobnost toplotno-ubijenih sojeva C. acnes da ometaju i/ili inhibiraju rast ispitivanih sojeva Staphylococcus i soja C. albicans procenjivana je korišćenjem spektrofotometrijske metode.

[0166] Toplotno-ubijeni sojevi su ispitivani korišćenjem iste podloge za rast (BHI bujon, dopunjen sa 20% koncentracije) kroz sledeći postupak:

Toplotno-ubijene bakterije su prethodno razblažene do finalne koncentracije od 10<5>CFU/ml, a zatim inokulisani patogenim mikroorganizmima kože na sledeći način.

[0167] U triplikatu, svaki bunarčić je inokulisano 100 µl aktivnih kultura ispitivanih sojeva S. aureus ATCC@ BAA-1680 ™, S. aureus DSM 20491, S. aureus ATCC® 29213 ™, S. epidermidis ATCC@ 12228 ™ i C. albicans ATCC® 90028 ™. Svaki bakterijski soj je prethodno uzgajan na BHI podlozi na 37°C do faze eksponencijalnog rasta, a zatim su ćelije sakupljene centrifugiranjem na 3000 o/m tokom 5 minuta. Granule su ponovo suspendovane u svežoj BHI podlozi kako bi se dobile suspenzije sa koncentracijom od 1×10<5>CFU/m.

[0168] Ove suspenzije su korišćene kao inokulumi u bunarčićima ploče sa 96 bunarčića.

[0169] Ploče sa 96 bunarčića su pripremljene u triplikatima, svaka sa eksperimentalnim kontrolama, tj. samim inokulumom sojeva bez dodatnih fragmenata, i "slepim probama" eksperimenta (BHI podloga sa svakim fragmentom) za spektrofotometrijsku kalibraciju.

[0170] Optička gustina na 600 nm (O.D.600 nm) je izmerena pomoću sistema VICTOR Multilabel Plate Reader (PerkinElmer) i smatralo se da predstavlja vrednost rasta u 0 vremenu (T0) za svaki soj i tretiranje. Naknadna merenja su vršena nakon 2, 4, 6, 8, 18, 20, 22 i 24 sata tokom perioda inkubacije. O.D. vrednosti su normalizovane u odnosu na slepe probe i kontrole, a zatim analizirane kako bi se procenio trend rasta različitih mikroorganizama sa/ bez (CTR) fragmenata zida. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± S.D. (standardna devijacija), a krive rasta su dobijene analizom nelinearne regresije pomoću Sigmoidalne funkcije pogodne za bakterijski rast. Analize su izvršene pomoću softvera Graph Pad Prism verzija 7.0a.

REZULTATI

[0171] Krive rasta patogenih mikroorganizama kože u prisustvu i odsustvu (kontroli) toplotno-ubijenih bakterija sojeva Cutibacterium su prikazane na Fig.9. Prva kvalitativna procena AUC pokazuje da toplotno-ubijene bakterije C. acnes DSM 28251 imaju poboljšani inhibitorski efekat na mikrobijski rast za sve ispitivane patogene mikroorganizme kože.

[0172] U tabeli 2a u nastavku je data kvantitativna procena AUC za svaki izvedeni soj protiv svih ispitivanih mikroorganizama. Ovi podaci potvrđuju ono što je prikazano na Fig.9, pri čemu toplotnoubijene bakterije dobijene iz C. acnes DSM 28251 pokazuju značajan uticaj/inhibitorkso dejstvo na rast svih ispitivanih mikroorganizama kože.

Tabela 2a. Vrednosti oblasti ispod krive (AUC) i relativne standardne greške (svetlo plava) krivih rasta prikazane na slici 2 sa/ bez (kontrola) toplotno-ubijenih bakterija. Skala boja za svaki soj pokazuje opseg vrednosti AUC: od manje (tamno crvene) do veće (tamno zelene) vrednosti AUC.

[0173] Procenat smanjenja rasta u poređenju sa kontrolnim uslovima prikazan je u tabeli 2b. Ovi podaci potvrđuju gore navedene rezultate, ističući poboljšano dejstvo toplotno-ubijenih bakterija C. acnes DSM 28251 u odnosu na uobičajene sojeve C. acnes.

Tabela 2b. Procenat smanjenja rasta u odnosu na kontrolni uslov (bez inokulacije toplotno uništenih bakterija). Skala boja za svaki soj pokazuje opseg smanjenja: od većeg (tamno crvene) do manjeg (tamno zelene) smanjenja rasta (%).

PRIMER 6

[0174] Uporedno ispitivanje iz primera 5 je ponavljano pomoću postbiotika/supernatanta svih sojeva C. acnes (umesto toplotno-ubijenih sojeva iz primera 5).

Cilj ispitivanja

[0175] Upoređeno je inhibitorsko dejstvo postbiotika/supernatanta dobijenih iz istih šest sojeva Cutibacterium iz primera 5 na iste patogene mikroorganizme kože.

[0176] Cilj ovog ispitivanja je da oceni da li postbiotik iz soja C. acnes DSM 28251 ima poboljšano inhibitorsko dejstvo na patogene mikroorganizme kože u poređenju sa postbioticima iz uzoraka C acnes iz primera 5.

MATERIJAL I POSTUPCI

[0177] Priprema postbiotika C. acnes DSM 28251.

[0178] Bakterijski supernatanti prethodno dobijeni iz Cutibacterium sojeva su podvrgnuti filtraciji (filtera od 0,22 µm) radi uklanjanja svih ćelijskih ostataka; sterilnost je potvrđena odsustvom bakterijskog rasta nakon inokulacije na kolumbijskom agaru sa krvlju i inkubacije na 37°C u aerobiozi tokom 24 sata za svaku ispitivanu količinu supernatanta.

[0179] Radi isključivanja bilo kakvih interferencija zbog proizvodnje kiselih supstanci tipičnih za neke sojeve Cutibacterium spp., pH svakog supernatanta je pažljivo izmeren i, ako je potrebno, neutralisan 1M rastvorom natrijum-hidroksida.

[0180] Spektrofotometrijska ocena dejstva postbiotika na rast patogenih mikroorganizama.

[0181] Procenjena je sposobnost postbiotika poreklom iz C. acnes sojeva navedenih u primeru 5 da ometaju i/ili inhibiraju rast istih Staphylococcus sojeva i soja C. albicans koji su prijavljeni u primeru 5 korišćenjem spektrofotometrijske metode.

[0182] Postbiotici su ispitivani korišćenjem iste podloge za rast kao u primeru 5 (BHI bujon, dopunjen koncentracijom od 20%) kroz sledeći postupak: supernatanti su razblaženi u odnosu 1:10 u BHI bujonu, a zatim inkubirani sa ispitivanim mikroorganizmima kože.

[0183] U triplikatu, inokulisano je 100 μl aktivnih kultura patogenih mikroorganizama kože: S. aureus ATCC@ BAA-1680 ™, S. aureus DSM 20491, S. aureus ATCC® 29213 ™, S. epidermidis ATCC® 12228 ™ i C. albicans ATCC® 90028 ™. Svaki bakterijski soj je prethodno uzgajan u BHI podlozi na 37°C do faze eksponencijalnog rasta, a zatim su ćelije sakupljene centrifugiranjem na 3000 o/min tokom 5 minuta. Granula je ponovo suspendovana u svežoj BHI podlozi kako bi se dobile suspenzije sa koncentracijom od 1×10<5>CFU/ml.

[0184] Ove suspenzije su korišćene kao inokulumi u bunarčićima ploče sa 96 bunarčića.

[0185] U triplikatu su pripremljene ploče sa 96 bunarčića, svaka sa eksperimentalnim kontrolama,tj samim inokulom soja, i "slepim probama" eksperimenta (BHI podloga sa svakim fragmentom) radi spektrofotometrijske kalibracije.

[0186] Optička gustina na 600 nm (O.D.600 nm) je izmerena korišćenjem sistema VICTOR Multilabel Plate Reader (PerkinElmer) i smatra se da predstavlja vrednost rasta u nula vremenu (T0) za svaki soj i tretiranje. Naknadna merenja su vršena nakon 2, 4, 6, 8, 18, 20, 22 i 24 sata tokom inkubacionog perioda. Vrednosti O.D. su normalizovane u odnosu na slepe probe i kontrolne uzorke, a zatim analizirane radi procene trenda rasta različitih mikroorganizama sa/ili bez (CTR) fragmenta ćelijskog zida. Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti ± S.D. (standardna devijacija), a krive rasta su dobijene nelinearnom regresionom analizom koristeći sigmoidnu funkciju pogodnu za rast bakterija. Analize su izvršene uz pomoć softvera Graph Pad Prism verzije 7.0a.

REZULTATI

[0187] Krive rasta patogenih mikroorganizama kože u prisustvu i odsustvu (kontrole) postbiotika soja C. acnes DSM 28251 su prikazane na Fig.8.

[0188] Prva kvalitativna procena AUC (oblast ispod krive) pokazuje da probiotik (supernatant) dobijen od soja C. acnes DSM 28251 ima najveće inhibitorsko dejstvo na rast mikroorganizama za većinu ispitivanih patogenih mikroorganizama.

[0189] Tabela 1a prikazuje kvantitativnu procenu AUC za svaki supernatant. Ove vrednosti potvrđuju ono što je prikazano na Fig.1. Zapravo, postbiotik/supernatant C. acnes DSM 28251 inhibira rast svih ispitivanih bakterija kože više nego drugi ispitivani supernatanti, sa jedinom izuzetkom soja C. albicans ATCC 90028 (koji inhibira derivat DSM 30738).

Tabela 1a

ola

[0190] Tabela 1a. Vrednosti oblasti ispod krive (AUC) i relativne standardne greške (svetlo plava) kriva rasta prikazane na Fig.1 sa/ili bez (kontrole) bakterijskog supernatanta. Skala boja za svaki soj označava opseg vrednosti AUC: od manjih (tamno crvene) do većih (tamno zelene) vrednosti AUC.

[0191] Procenat smanjenja rasta u odnosu na kontrolne uslove dobijen ispitivanim supernatantima prikazan je u Tabeli 1b. Ovi podaci takođe potvrđuju rezultate o kojima je do sada bilo reči, dodatno ističući da je dejstvo supernatanta DSM 30738 na soj C. albicans ATCC 90028 samo nešto veće i stoga uporedivo sa dejstvom supernatanta C. acnes DSM 28251.

Tabela 1b. Procenat smanjenja rasta u odnosu na kontrolne uslove (bez inokulacije supernatanta). Skala boja za svaki soj označava opseg smanjenja: od većeg (tamno crvene) do manjeg (tamno zelene) smanjenja rasta (%).

REZULTATI

[0192] Prva kvalitativna procena AUC pokazuje da postbiotik/supernatant C. acnes DSM 28251 ima poboljšani inhibitorski efekat na mikrobijski rast za sve ispitivane patogene mikroorganizme kože.

PRIMER 7

[0193] Uporedno ispitivanje iz primera 5 je ponovljeno koristeći fragmente ćelijskog zida svih ispitivanih sojeva C. acnes (umesto toplotno-ubijenih sojeva iz primera 5).

Cilj ovog ispitivanja

[0194] Cilj ovog ispitivanja je bio da se uporedi inhibitorsko dejstvo fragmenata zida ćelije istih šest sojeva Cutibacterium iz primera 5 na iste patogene mikroorganizme kože iz primera 5.

[0195] Cilj ovog ispitivanja je bio da se oceni da li fragment zida bakterije iz soja C. acnes DSM 28251 ima poboljšano inhibitorsko dejstvo na patogene mikroorganizme kože u poređenju sa fragmentom zida bakterije uporednog soja C. acnes iz primera 5.

MATERIJAL I POSTUPCI

Priprema fragmenata zida C. acnes DSM 28251 i uporednih C acnes sojeva.

[0196] C. acnes DSM 28251 soj i Cutibacterium sojevi ATCC@ 11829, DSM 16379, DSM 30738, DSM 30753 i DSM 1897, su uzgajane na 37°C u BHI podlozi dopunjenoj 20% u koncentraciji.

[0197] Kultivacija je izvedena u šarži i sistemima za povećanje zapremina od 5 do 1000 ml i postupak je produžavan sve dok nije dobijena konzistentna bakterijska masa (u proseku 2 dana pri većim zapreminama inokuluma). Dobijene bakterijske granule su zatim prikupljene i podvrgnute standardizovanom postupku kako bi se dobili fragmenti zida od značaja, kao što je opisano u nastavku. Nakon toga, izolovani fragmenti će biti označeni kataloškim kodom odgovarajućeg soja.

[0198] Konkretno, izolovanje fragmenata zida je izvedeno kao što je opisano u nastavku.

[0199] Bakterijske granule su prvo podvrgnute postupku delipidacije soxhlet tretiranjem upotrebom organskog rastvarača (poput etar-etanola, hloroforma, methanol-hloroforma, ili njihovih mešavina), nakon čega su osušene pod laminarnim protokom vazduha. Nakon sušenja, granule su homogenizovane u dve faze Ultratturrax tretiranja (svaka faza traje od 20 sekundi do 10 minuta), uz dodatak destilovane vode (u razmeri od 1:2 p/V). Nakon centrifugiranja, supernatant je zagrejan na 80°C, ohlađen u ledenoj vodi (po mogućstvu na temperaturama od 3 do 15°C), i na kraju stavljen na led. Zatim je izvedena faza precipitacije fragmenata inkubiranjem supernatanta sa 15-40% v/v hladnog amonijum sulfata tokom 24 sata na 4°C. Nakon inkubacije, suspenzija je centrifugirana, a precipitirani fragmenti su sakupljeni i liofilizirani

[0200] Lyofilizirani uzorci su konačno sterilizovani putem ad hoc postupka u više faza (-80°C ultrazamrzavanje, 80°C pregrevanje, sterilizacija U.V. svetlom tokom 1 sata). Na kraju su korišćeni za postavljanje eksperimenta, kako je opisano u nastavku.

Spektrofotometrijska ocena dejstva postbiotika na rast patogenih mikroorganizama.

[0201] Dejstvo zidnih fragmenata poreklom iz sojeva C. acnes (videti gore) u mešanju i/ili inhibiciji rasta istih Staphylococcus sojeva i soja C. albicans koji su navedeni u primeru 5, procenjeno je pomoću spektrofotometrijske metode.

[0202] Zidni fragmenti su ispitivani upotrebom iste podloge za rast kao u primeru 5 (BHI bujon, sa dodatkom od 20% u koncentraciji) putem sledećeg postupka: zidni fragmenti su praškasti i emulzirani u BHI podlozi za rast pri finalnoj koncentraciji od 10 mg/ml. Alikvoti od 100 µl su dodati u bunarčiće ploče sa 96 bunarčića sa ravnom dnom.

[0203] U triplikatu, po 100 µl aktivnih kultura kožnih patogenih mikroorganizama S. aureus ATCC@ BAA-1680™, S. aureus DSM 20491, S. aureus ATCC@ 29213™, S. epidermidis ATCC @ 12228™ i C. albicans ATCC@ 90028™ je inokulisano u bunrčiće svakog fragmenta. Svaki bakterijski soj je prethodno uzgajan u BHI podlozi na 37°C do faze eksponencijalnog rasta, a zatim su ćelije sakupljene centrifugiranjem na 3000 o/m tokom 5 minuta. Granula je ponovo suspendovana u svežoj BHI podlozi kako bi se dobile suspenzije koncentracije 1×105 CFU/ml.

[0204] Ove suspenzije su korišćene kao inokulumi u bunarčićima ploče sa 96 bunarčića.

[0205] Ploče sa 96 bunarčića su pripremljene u triplikatima, svaki sa eksperimentalnim kontrolama, tj. inokulumom sojeva samih bez dodatih fragmenata, i "slepim probama" eksperimenta (BHI podloga sa svakim fragmentom) za spektrofotometrijsku kalibraciju.

[0206] Optička gustina na 600 nm (O.D.600 nm) merena je koristeći VICTOR Multilabel Plate Reader (PerkinElmer) sistem i uzeta je kao vrednost rasta u vremenu nula (T0) za svaki soj i tretiranje. Naknadna merenja su vršena nakon 2, 4, 6, 8, 18, 20, 22 i 24 sata tokom inkubacionog perioda. O.D. vrednosti su normalizovane u odnosu na "slepe probe" i kontrolne uzorke, a zatim su analizirane kako bi se procenio trend rasta različitih mikroorganizama sa/ bez (CTR) zidnih fragmenata. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± S.D. (standardna devijacija), a krive rasta su dobijene analizom nelinearne regresije pomoću sigmoidalne funkcije pogodne za bakterijski rast. Analize su urađene pomoću softvera Graph Pad Prism verzija 7.0a.

REZULTATI (C. fragmenti zida akni)

[0207] Krive rasta kožnih bakterija uzgajanih sa i bez (CTR) raznovrsnih ispitivanih zidnih fragmenata prikazane su na Fig.10. Na osnovu preliminarne kvalitativne procene parametra "Oblasti ispod krive" (AUC), ističe se kako za većinu ispitivanih kožnih mikroorganizama fragment DSM 28251 proizvodi najveće inhibitorsko dejstvo na mikrobijski rast.

[0208] Umesto toga, u tabeli 3a u nastavku su prikazani rezultati kvantitativne procene istog parametra AUC za sve ispitivane kožne mikroorganizme. Izračunate vrednosti AUC-a potvrđuju hipotezu formulisanu kroz kvalitativnu procenu. Fragment zida bakterijske ćelije DSM 28251 pokazao je veći inhibitorski efekat na rast bakterija u odnosu na druge ispitivane fragmente.

[0209] Ulazeći dublje u procenu inhibicije rasta, vrednosti prikazane u tabeli 3b predstavljaju procente smanjenja rasta (%) u odnosu na kontrolne uslove za svaki soj, koji se smatra 100% stopom rasta u specifičnim eksperimentalnim uslovima. Upoređivanje procenata smanjenja rasta bilo je u skladu sa zaključkom o kojem je prethodno bilo reči o većem inhibitorskom efektu fragmenta soja DSM 28251.

[0210] Iako fragment dobijen iz C. acnes DSM 30738 soja pokazuje bliske vrednosti inhibicije u odnosu na DSM 28251 fragment, procenat inhibicije ovog drugog uvek dovodi do većeg, takođe boljeg učinka protiv S. aureus ATCC BAA-1680 soja (82, 43% za DSM 30738 u odnosu na 94,95% za DSM 28251).

Tabela 3a. Vrednosti oblasti ispod krive (AUC) i relativne standardne greške (svetlo plava) krivih rasta prikazane na Fig.3 sa/ bez (kontrola) fragmenata bakterijskog zida. Skala boja za svaki soj pokazuje opseg vrednosti AUC-a: od manje (tamno crvena) do veće (tamno zelene) vrednosti AUC-a.

Tabela 3b. Procenat smanjenja rasta u poređenju sa kontrolnom grupom (bez fragmenta inokuluma). Skala boja za svaki soj pokazuje opseg smanjenja: od glavnog (tamno crveno) do manjeg (tamno zeleno) smanjenja rasta. (%).

Claims (19)

Patentni zahtevi

1. Bakterijski soj, koji predstavlja Cutibacterium acnes deponovan pod pristupnim brojem za deponovanje DSM 28251 kod međunarodnog nadležnog organa za deponovanje Leibniz-Institut DSMZ -Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.

2. Postbiotski proizvod koji obuhvata ćelije ubijene toplotom ili supernatant mehanički lizovanih ćelija, ili fragmente ćelijskog zida bakterijskog soja prema zahtevu 1.

3. Postbiotski proizvod prema zahtevu 2 pri čemu se lizovane ćelije dobijaju mehaničkom lizom ćelijskog zida.

4. Fragment ćelijskog zida bakterijskog soja prema zahtevu 1.

5. Bakterijski soj prema zahtevu 1 naznačen time, što nije aktiviran, poželjno tindalizacijom.

6. Bakterijski soj prema zahtevu 1 ili postbiotski proizvod prema zahtevu 2 ili fragment ćelijskog zida prema zahtevu 4 za upotrebu kao lek.

7. Kompozicija koja obuhvata efektivnu količinu Cutibacterium acnes deponovanog pod pristupnim brojem za deponovanje DSMZ 28251 prema zahtevu 1, ili njegov postbiotski proizvod prema zahtevu 2 ili fragment njegovog ćelijskog zida prema zahtevu 4 i fiziološki prihvatljiv nosač.

8. Kompozicija prema zahtevu 7 pri čemu je ta kompozicija topikalna kompozicija poželjno u obliku krema, pene, masti, paste, praška, gela, rastvora, ovuma, kupke ili emulzije.

9. Kompozicija kao što je navedena u zahtevu 7 za upotrebu kao lek.

10. Kompozicija prema zahtevu 7 za upotrebu u tretiranju inflamatorne ili alergijske bolesti ili infekcije.

11. Kompozicija prema zahtevu 7 za upotrebu u topikalnom tretiranju inflamatorne ili alergijske bolesti kože ili sluzokože.

12. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 10-11 u sprečavanju ili tretiranju bakterijske ili gljivične infekcije kože ili sluzokože.

13. Kompozicija za upotrebu kao što je navedena u zahtevu 12 pri čemu je ta kožna bolest ekcem, atopijski dermatitis, akne, seborejični dermatitis, rozacea, psorijaza, eritem, kožni osip.

14. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 12 za tretiranje gljivične infekcije kože ili sluzokože, naročito infekcije kandidom.

15. Kompozicija prema zahtevu 7 ili 8 za upotrebu u tretiranju ginekološke bolesti koja predstavlja vaginalnu infekciju, upalu.

16. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 15 pri čemu je ta ginekološka bolest vaginitis.

17. Kompozicija prema zahtevu 7 ili 8 za proktološku upotrebu u tretiranju hemoroida, analnih ragada ili ožiljaka po koži.

18. Kompozicija prema zahtevu 7 ili 8 za upotrebu u tretiranju rana, povreda, ogrebotina, ulceracija kože, ili dekubitisa ili za zarastanje rana.

19. Postbiotski proizvod koji predstavlja ukupni supernatant koji može da se dobije postupkom fermentacije bakterijskog soja prema zahtevu 1.