RS65804B1 - Humanizovana anti-il-1r3 antitela - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na humanizovana anti-IL-1R3 antitela i njihovu upotrebu.

Osnovne informacije

[0002] Dodatni protein receptora interleukina 1 (IL1RAP), takođe nazvan IL1R3, je koreceptor receptora interleukina 1 tipa 1 (IL1R1) i neophodan je za prenos signalizacije IL-1. Nakon vezivanja IL-1, IL-1R1 se asocira sa IL-1RAcP formirajući funkcionalni signalni receptorski kompleks, koji stimuliše aktivnost NFkB.

[0003] IL-33, njegov receptor ST2 i IL-1RAcP takođe formiraju kompleks (IL-33/ST2/IL-1RAcP) sa sličnom aktivnošću u pogledu aktivacije NFkB kao kompleks IL-1β/IL-1R1/IL-1RAcP. IL-36 (IL-36α (IL-1F6), IL-36β (IL-1F8) i IL-36y (IL-1F9)), njihovi receptori IL-36R i IL-1RAcP takođe formiraju kompleks (IL-36/Il-36R/IL-1RAcP) sa sličnom aktivnošću u pogledu aktivacije NFkB kao kompleks IL-1β/IL-1R1/IL-1RAcP.

[0004] Humani NF-kB je važan regulator ekspresije nekoliko gena uključenih u upalu, imunološki odgovor i apoptozu. Stoga je disfunkcija NFkB uključena u patologiju različitih bolesti, uključujući autoimune bolesti, neurodegenerativne bolesti, upale i karcinome. Na primer, u tretmanu osteoartritisa (OA), NF-kB put je važna meta. Dakle, agensi koji regulišu humani NFkB put putem inhibicije signalne aktivnosti humanog IL-1R1jIL-1RAcP kompleksa predstavljaju moguće tretmane za različite ljudske bolesti. Konkretno, neutralizirajuća antitela visokog afiniteta bi bili odlični terapeutski agensi.

[0005] Već više od 15 godina pokušavaju se generisati funkcionalna monoklonska antitela protiv humanog IL1RAcP. Međutim, mnogi pokušaji nisu uspeli i postojeća antitela i dalje pokazuju različite nedostatke. WO199623067 se odnosi na IL-1RAcP antitelo, koje se specifično vezuje za mišji IL-1 receptorski dodatni protein. Primeri 15 i 16 opisuju pokušaj generisanja anti-humanih IL-1RAcP antitela, koja neutrališu IL-1 biološku aktivnost. Međutim, takvo antitelo nije predviđeno WO199623067, i primer 16 koji opisuje IL-1 indukovani IL-6 test je samo hipotetički. Do-Young Yoon D-Y i Charles A. Dinarello CA opisuju u J. Immunol.1998; 160:3170-3179 poliklonska antitela na domene II i III mišjeg IL-1RAcP koji inhibiraju IL-1beta aktivnost, ali se ne vezuju. Međutim, pri višim koncentracijama IL-1beta (1000 pg/ml), ovaj poliklonski antiserum nije blokirao proliferaciju D10S ćelija. (D10S je subklon mišje D10.G4.1 pomoćne T-ćelije koja se razmnožava do subfemomolarnih (atomolarnih) koncentracija IL-1 beta ili alfa u odsustvu mitogena, videti Orencole SF and Dinarello CA; Cytokine 1 (1989) 14-22). Jaras M. et al., PNAS 107 (2010) 16280-16285 opisuju upotrebu zečjeg poliklonskog anti-IL1RAcP antitela KMT-1 za ubijanje CM L matičnih ćelija. Ovo antitelo indukuje ADCC na IL1RAcP-nezavisan način uzrokovan njegovim zečjim Fc delom. Jaras et al. očekuju da će „potencijalna buduća terapeutska antitela koja ciljaju IL1RAP pokazati nisku toksičnost na normalnim hematopoetskim ćelijama“. Poliklonska zečja antitela protiv mišjeg IL-1RAcP takođe su pomenuta u Do-Young Yoon and Charles A. Dinarello, Journal of Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 40, No. 4, July 2007, pp.562-570.

[0006] WO2002064630 se odnosi i na IL-1RAcP i njegovu upotrebu, ali nisu opisana antitela protiv IL-1RAcP. WO2004022718 i WO2009120903 teoretski pominju da bi antitela protiv CSF1R, IL13RA1, IL1RAP, IFNAR1, IL5R, INSR, IL1RL1, LTK i TACSTD1 mogla biti generisana u skladu sa najnovijim dostignućima. Međutim, ovde takođe nije opisano antitelo protiv IL-1RAcP. WO2011021014 i WO 2012098407 (američki patent 20140017167) odnose se na poliklonski anti-humani IL-1RAcP antiserum KMT-1 (videti Jaras et al.2010) i njegovu upotrebu. WO2014100772 se odnosi na vezivanje anti-IL-1RAcP antitela za IL-1RAcP. Međutim, nije opisana aktivnost u pogledu inhibicije bilo kog funkcionalnog kompleksa signalnog receptora (kao što je IL-1β/IL-1R1/IL-1RAcP) koji stimuliše aktivnost NFkB. Američki patent 6280955 se odnosi na IL-1RAcP i njegovu upotrebu, ali opet nisu opisana antitela protiv IL-1RAcP. Američki patent 7390880 pominje N-terminalni fragment IL1RAcP, ali takođe ne opisuje antitela protiv IL-1RAcP.

[0007] WO2004100987 se odnosi na upotrebu antagonista interleukina-I (IL-1) u pripremi leka za tretman neointimalne hiperplazije i na upotrebu antagonista IL-1 za tretman neointimalne hiperplazije. Kao takav antagonist, anti-IL-1RAcP antitelo je predloženo, ali nije dalje opisano.

Američki patent 2003026806 se odnosi na antitela koja se vezuju za IL-1. WO2002064630 se odnosi i na IL-1 antagonist mrava na IL-1RAcP protein. Iako se pominje upotreba IL-1RAcP za skrining na IL-1RAcP antagoniste, takav metod ili antagonist nije otkriven.

[0008] Ovo pokazuje da je bilo izuzetno teško identifikovati monoklonska antitela sa visokim afinitetom, visokom specifičnošću i snažnom neutralizacionom aktivnošću protiv IL-1R3. Ovaj pronalazak obuhvata humanizovano IL-1R3 antitelo, sa visokim afinitetom i specifičnošću za IL-1R3, sa snažnom IL-1R3 neutralizacionom aktivnošću 3 i poboljšanom stabilnošću.

Sažetak pronalaska

[0009] Obim ovog pronalaska definisan je u priloženim patentnim zahtevima.

[0010] Ovaj pronalazak se odnosi na humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-1R3 ili njegov fragment ili derivat ili polipeptid koji sadrži najmanje deo navedenog antitela koji je dovoljan da pruži specifičnost vezivanja IL-1R3. Navedeno antitelo inhibira IL-1R3 indukovanu aktivnost NFkB. Takođe inhibira aktivnost NFkB stimulisanu IL-1alfa, IL-1beta, IL-33 i/ili IL-36.

[0011] Pronalazak se dalje odnosi na antitelo u skladu sa pronalaskom za upotrebu u tretman bolesti posredovane IL-1R3.

[0012] Ovaj pronalazak takođe obuhvata farmaceutsku kompoziciju koja se sastoji od farmaceutski prihvatljivog nosača i terapeutski efikasne količine navedenog antitela.

Definicije

[0013] Termin „zec“ prema pronalasku označava životinju članova taksonomskog reda Lagomorpha, koji uključuje porodice (divlje zečeve i zečeve) i Ochotonidae (pike), poželjno iz roda Oryctolagus.

[0014] Termin „antitelo“ obuhvata različite oblike struktura antitela, uključujući, ali ne ograničavajući se na, cela antitela i fragmente antitela sve dok pokazuje svojstva u skladu sa pronalaskom.

[0015] Termin „zečje monoklonsko antitelo “prema pronalasku označava monoklonsko antitelo proizvedeno imunizacijom zeca i izolovano iz ćelije koja proizvodi antigen pomenutog zeca, kao i takvo antitelo koje se dalje modifikuje, poželjno humanizovano antitelo, himerno antitelo, njegov fragment ili dalje genetski modifikovano i rekombinantno proizvedeno antitelo sve dok se zadržavaju karakteristična svojstva prema pronalasku. Poželjno je da je antitelo iz B ćelije ili zečje hibridomske ćelije navedenog zeca.

[0016] Termin „ćelija koja proizvodi antitela“ prema pronalasku označava B ćeliju zeca koja proizvodi antitela, poželjno B ćeliju ili zečju hibridomsku ćeliju.

[0017] „Nativna antitela“ su obično heterotetramerni glikoproteini sastavljeni od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Svaki laki lanac je povezan sa teškim lancem jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok broj disulfidnih veza varira među teškim lancima različitih izotipova imunoglobulina. Svaki teški i lagani lanac takođe ima redovno razmaknute disulfidne mostove unutar lanca. Svaki teški lanac na jednom kraju ima varijabilni domen (VH) praćen nizom konstantnih domena. Svaki laki lanac ima varijabilni domen na jednom kraju (VL) i konstantni domen na drugom kraju. Konstantni domen lakog lanca je poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, a varijabilni domen lakog lanca je poravnat sa varijabilnim domenom teškog lanca. Veruje se da određeni aminokiselinski ostaci formiraju interfejs između varijabilnih domena lakog lanca i teškog lanca.

[0018] „Procenat (%) identiteta aminokiselinske sekvence“ u odnosu na peptidnu ili polipeptidnu sekvencu se definiše kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidata koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u specifičnoj peptidnoj ili polipeptidnoj sekvenci, nakon poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identiteta sekvence, i ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnanje u svrhu određivanja procenta identiteta sekvence aminokiselina može se postići na različite načine koji su u okviru struke, na primer, korišćenjem javno dostupnog računarskog softvera kao što su BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver.

[0019] Termin „VL (ili VH) region“ ima isto značenje kao VL (ili VH) domen.

[0020] Termini „Fc receptor“ ili „FcR“ prema pronalasku odnose se na humani receptor koji se vezuje za Fc region antitela. FcR se vezuju za IgG antitela i uključuju receptore FcyRI, FcyRII i FcγRIII podklasa, uključujući alelne varijante i alternativno spojene oblike ovih receptora. FcyRII receptori uključuju FcyRIIA („aktivirajući receptor“) i FcyRIIB („inhibitorni receptor“), koji imaju slične sekvence aminokiselina koje se prvenstveno razlikuju u njihovim citoplazmatskim domenima. Aktivirajući receptor FcyRIIA sadrži aktivacioni motiv na bazi imunoreceptora tirozina (itam) u svom citoplazmatskom domenu. Inhibicioni receptor FcyRIIB sadrži motiv inhibicije na bazi imunoreceptora tirozina (ITIM) u svom citoplazmatskom domenu (videti razmatranja u M. Daeron, Annu. Rev. Immunol.

15:203-234 (1997)). FcRIIIA (CD16a) posreduje ADCC. FcR se razmatraju u Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al, Immunomethods 4:25-34 (1994); i de Haas et al, J. Lab. CHn. Med. 126:330-41 (1995). Ovi i svi drugi FcR su obuhvaćeni terminom „FcR“ u ovom dokumentu. Termin takođe uključuje neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za prenos majčinskih IgG na fetus (Guyer et al, J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al, J. Immunol. 24:249 (1994)) i posreduje sporiji katabolizam, čime se produžava poluvreme eliminacije.

[0021] Termin „efektorske funkcije antitela“ ili „efektorska funkcija“ kako se ovde koristi odnosi se na funkciju kojoj doprinosi Fc efektorski domen IgG (npr. Fc region imunoglobulina). Takva funkcija se može izvršiti, na primer, vezivanjem Fc efektorskog domena za Fc receptor na imunološkoj ćeliji sa fagocitnom ili litičkom aktivnošću ili vezivanjem Fc efektorskog domena za komponente komplementarnog sistema. Tipične efektorske funkcije su ADCC, ADCP i CDC.

[0022] „Fragment antitela“ se odnosi na molekul koji nije netaknuto antitelo koji se sastoji od dela netaknutog antitela koji se vezuje za antigen na koji se netaknuto antitelo vezuje. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diatela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela (npr. ScFv); i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.

[0023] „Antitelo koje se vezuje za isti epitop“ kao referentno antitelo odnosi se na antitelo koje blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen u testu kompetitivnosti za 50% ili više, i obrnuto, referentno antitelo blokira vezivanje antitela za njegov antigen u testu kompetitivnosti za 50% ili više. Ovde je dat primer testa kompetitivnosti.

[0024] „Citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela“ i „ADCC“ odnose se na reakciju posredovanu ćelijama u kojoj nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimiraju FcR (npr. prirodne ćelije ubice (NK), neutrofili i makrofagi) prepoznaju vezano antitelo na ciljnoj ćeliji i zatim izazivaju lizu ciljne ćelije. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcyRIII, dok monociti eksprimiraju FcyRI, FcyRII i FCYRIII.

[0025] Termin „ćelijska fagocitoza zavisna od antitela“ i „ADCP“ se odnose na proces kojim se ćelije obložene antitelima internalizuju, bilo u celini ili delimično, fagocitnim imunološkim ćelijama (npr. makrofagima, neutrofilima i dendritskim ćelijama) koje se vezuju za Fc region imunoglobulina.

[0026] C1q" je polipeptid koji uključuje mesto vezivanja za Fc region imunoglobulina. C1q zajedno sa dve serinske proteaze, C1r i C1s, formira kompleks C1, prvu komponentu puta citotoksičnosti zavisnog od komplementa (CDC). Humani C1q se može kupiti komercijalno od, npr. Quidel, San Diego, Kalifornija.

[0027] „Klasa“ antitela odnosi se na tip konstantnog domena ili konstantnog regiona koji poseduje njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko njih se može dalje podeliti u podklase (izotipove), npr. IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina nazivaju se a, δ, ε, γ i µ, respektivno.

[0028] „Efektivna količina“ agensa, npr. farmaceutske formulacije, odnosi se na količinu koja je efikasna, u dozama i tokom perioda neophodnih za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata.

[0029] Termin „Fc region“ se ovde koristi za definisanje C-terminalnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji sadrži najmanje deo konstantnog regiona. Termin obuhvata domorodačke sekvencijalne Fc regione i varijantne Fc regione. Osim ako nije drugačije navedeno ovde, numeracija aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je u skladu sa sistemom numeracije EU, koji se naziva i EU indeks, kao što je opisano u Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

[0030] „Varijanta Fc regiona“ obuhvata sekvencu aminokiselina koja se razlikuje od sekvence „nativnog“ ili „divljeg“ Fc regiona na osnovu najmanje jedne „modifikacije aminokiselina“ kako je ovde definisano. Termin „Fc-varijanta“ koji se ovde koristi odnosi se na polipeptid koji se sastoji od modifikacije u Fc domenu. Fc varijante ovog pronalaska definisane su u skladu sa modifikacijama aminokiselina koje ih sačinjavaju. Tako je, na primer, P329G Fc varijanta sa supstitucijom prolina sa glicinom na poziciji 329 u odnosu na matični Fc polipeptid, pri čemu je numerisanje u skladu sa indeksom EU. Identitet aminokiseline divljeg tipa može biti neodređen, u kom slučaju se pomenuta varijanta naziva P329G. Za sve pozicije o kojima se govori u ovom pronalasku, numerisanje je prema indeksu EU. Indeks EU ili indeks EU kao u Kabatu ili šemi numeracije EU odnosi se na numeraciju antitela EU (Edelman, et al., Proc Natl Acad Sci USA 63 (1969) 78-85. Modifikacija može biti adicija, delecija ili supstitucija. Supstitucije mogu uključivati prirodne aminokiseline i aminokiseline koje se ne pojavljuju prirodno. Varijante mogu sadržati neprirodne aminokiseline. Primeri uključuju američki patent br.6,586,207; WO 98/48032; WO 03/073238; američki patent 2004/0214988 A1; WO 05/35727 A2; WO 05/74524 A2; Chin, J.W., et al., Journal of the American Chemical Society 124 (2002) 9026-9027; Chin, J.W., and Schultz, P.G., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137; Chin, J.W., et al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024; i, Wang, L., and Schultz, P.G., Chem. (2002) 1-10.

[0031] Termin „polipeptid koji sadrži Fc region“ odnosi se na polipeptid, kao što je antitelo ili imunoadhezin (videti definicije u nastavku), koji se sastoji od Fc regiona.

[0032] Termini „Fc receptor“ ili „FcR“ se koriste za opisivanje receptora koji se vezuje za Fc region antitela. FcR koji se vezuje za IgG antitelo (gama receptor) uključuje receptore FcyRI, FcyRII i FcyRIII podklase, uključujući alelne varijante i alternativno spojene oblike ovih receptora. FcyRII receptori uključuju FcyRIIA („aktivirajući receptor“) i FcyRIIB („inhibitorni receptor“), koji imaju slične sekvence aminokiselina koje se prvenstveno razlikuju u njihovim citoplazmatskim domenima. Aktivirajući receptor FcyRIIA sadrži aktivacioni motiv na bazi imunoreceptora tirozina (itam) u svom citoplazmatskom domenu.

Inhibicioni receptor FcyRIIB sadrži motiv inhibicije na bazi imunoreceptora tirozina (ITIM) u svom citoplazmatskom domenu (videti razmatranja u Daeron, M., Annu. Rev. Immunol. 15 (1997) 203-234). FcR se razmatraju u Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492; Capel, et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; and de Haas, et al., J. Lab. Clin. Med.126 (1995) 330-41. Ostali FcR, uključujući one koji će biti identifikovani u budućnosti, ovde su obuhvaćeni terminom „FcR“. Termin takođe uključuje neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za transfer IgG majke na fetus Guyer, et al., J. Immunol. 117 (1976) 587 and Kim, et al., J. Immunol. 24 (1994) 249).

[0033] Pod „IgG Fc ligandom“ koji se ovde koristi podrazumeva se molekul, poželjno polipeptid, iz bilo kog organizma koji se vezuje za Fc region IgG antitela da bi formirao Fc/Fc ligand kompleks. Fc ligandi uključuju, ali nisu ograničeni na FcyR, FcyR, FcyR, FcRn, Clq, C3, manan vezujući lektin, manozni receptor, stafilokokni protein A, streptokokni protein G i virusni FcyR. Fc ligandi takođe uključuju homologe Fc receptora (FcRH), koji su porodica Fc receptora koji su homologni FcyRs (Davis, et al., Immunological Reviews 190 (2002) 123-136). Fc ligandi mogu uključivati neotkrivene molekule koji vezuju Fc. Posebni IgG Fc ligandi su FcRn i Fc gama receptori. Pod „Fc ligandom“ koji se ovde koristi podrazumeva se molekul, poželjno polipeptid, iz bilo kog organizma koji se vezuje za Fc region antitela da bi formirao Fc/Fc ligand kompleks.

[0034] Pod „Fc gama receptorom“, „FcyR“ ili „FcgammaR“, kako se ovde koristi, podrazumeva se svaki član porodice proteina koji se vezuju za IgG region antitela Fc i kodiran je FcyR genom. Kod ljudi ova porodica uključuje, ali nije ograničena na FcyRI (CD64), uključujući izoforme FcyRIA, FcyRIB i FcyRIC; FcyRII (CD32), uključujući izoforme FcyRIIA (uključujući alotipove H131 i R131), FcyRIIB (uključujući FcyRIIB-I i FcyRIIB-2) i FcyRllc; i FcyRIII (CD 16), uključujući izoforme FcyRIIIA (uključujući alotipe VI 58 i F158) i FcyRIIIb (uključujući alotipe FcyRIIB-NAI i FcyRIIB-NA2) (Jefferis, et al., Immunol Lett 82 (2002) 57-65), kao i sve neotkrivene humane FcyR ili FcyR izoforme ili alotipove. FcyR može biti iz bilo kog organizma, uključujući, ali ne ograničavajući se na ljude, miševe, pacove, zečeve i majmune. FcyR miševa uključuju, ali nisu ograničeni na FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD 16) i FCYRIII-2 (CD 16-2), kao i sve neotkrivene FcyR miševa ili FcyR izoforme ili alotipove.

[0035] Pod „FcRn“ ili „neonatalni Fc receptor“ kako se ovde koristi podrazumeva se protein koji se vezuje za IgG antitelo Fc region i koji je bar delimično kodiran FcRn genom. FcRn može biti iz bilo kog organizma, uključujući, ali ne ograničavajući se na ljude, miševe, pacove, zečeve i majmune. Kao što je poznato u struci, funkcionalni FcRn protein se sastoji od dva polipeptida, koji se često nazivaju teški lanac i laki lanac. Laki lanac je beta-2-mikroglobulin, a teški lanac je kodiran FcRn genom. Ako ovde nije drugačije navedeno, FcRn ili FcRn protein se odnosi na kompleks FcRn teškog lanca sa beta-2-mikroglobulinom.

[0036] „Imunokonjugat“ označava antitelo konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih agenasa, kao što su hemoterapijski agens, lek, agens za inhibiciju rasta, toksin, drugo antitelo ili radioaktivni izotop.

[0037] „Fragmenti antitela“ obuhvataju deo antitela pune dužine, poželjno njegove varijabilne regione, ili barem njegovo mesto vezivanja za antigen. Primeri fragmenata antitela uključuju diatela, Fab fragmente i jednolančane molekule antitela. scFv antitela su, npr. opisana u Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88.

[0038] Termini „monoklonsko antitelo“ ili „skompozicija monoklonskog antitela“ koji se ovde koriste odnose se na preparat molekula antitela pojedinačne kompozicije aminokiselina.

[0039] Termin „humanizovano antitelo“ ili „humanizovana verzija antitela“ odnosi se na antitela u kojima je humani varijabilni region modifikovan tako da obuhvata CDR antitela u skladu sa pronalaskom. U poželjnom otelotvorenju, CDR VH i VL su presađeni u okvirni region humanog antitela da bi se pripremilo „humanizovano antitelo“. Videti npr. Riechmann, L., et al, Nature 332 (1988) 323-327; and Neuberger, M.S., et al, Nature 314 (1985) 268-270. Varijabilni okvirni regioni teškog i lakog lanca mogu se izvesti iz istih ili različitih sekvenci humanih antitela. Sekvence humanih antitela mogu biti sekvence prirodnih lhumanih antitela. Varijabilni regioni humanog teškog i lakog lanca navedeni su npr. u Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology (2000) - Appendix IP A.1P.1-A.1P.37 i dostupni su putem IMGT, međunarodnog ImMunoGeneTics informacionog sistema<®>(http://imgt.cines.fr) ili putem http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk.

[0040] Termini „specifično vezivanje, protiv ciljnog ili antitciljnog antitela “, kao što se ovde koristi, odnose se na vezivanje antitela za odgovarajući antigen (cilj), mereno ELISA testom, pri čemu navedeni ELISA test poželjno obuhvata oblaganje odgovarajućeg antigena na čvrstu podlogu, adicija navedenog antitela pod uslovima koji omogućavaju formiranje imunog kompleksa sa odgovarajućim antigenom ili proteinom, otkrivanje navedenog imunog kompleksa merenjem vrednosti optičke gustine (OD) korišćenjem sekundarnog antitela koje se vezuje za antitelo u skladu sa pronalaskom i korišćenjem razvoja boje posredovanog peroksidazom.

[0041] Termin „antigen“ prema pronalasku odnosi se na antigen koji se koristi za imunizaciju ili protein koji se sastoji od navedenog antigena kao dela njegove proteinske sekvence. Na primer, za imunizaciju se može koristiti fragment ekstracelularnog domena proteina (npr. prvih 20 aminokiselina), a za detekciju/test i slično može se koristiti ekstracelularni domen proteina ili protein pune dužine.

[0042] Termin „specifično vezivanje“ ili „specifično prepoznat“ ovde znači da antitelo pokazuje značajan afinitet za antigen i, poželjno, ne pokazuje značajnu unakrsnu reaktivnost.

[0043] „Značajan“ afinitet vezivanja uključuje vezivanje sa afinitetomod najmanje 10exp7M<-1>, konkretno najmanje 10exp8M<-1>, konkretnije najmanje 10exp9M<-1>, ili još konkretnije najmanje 10exp10M<-1>.

[0044] Antitelo koje „ne pokazuje značajnu unakrsnu reaktivnost“ je ono koje se neće značajno vezati za nepoželjni drugi protein. Antitelo specifično za epitop prema pronalasku, na primer, neće značajno unakrsno reagovati sa drugim epitopima na IL-1R3. Specifično vezivanje može se odrediti u skladu sa bilo kojim sredstvima priznatim u struci za određivanje takvog vezivanja, npr. testovima kompetitivnosti vezivanja (npr. ELISA).

[0045] Svi termini vezani za proteine koji se ovde koriste odnose se na humane proteine. Ako se misli na protein druge vrste, to se izričito napominje.

[0046] Termin „IL-1alfa“, kako se ovde koristi, odnosi se na humani IL-1 (UniProtKB P01583). Termin „IL-1beta“, kako se ovde koristi, odnosi se na humani IL-1beta (UniProtKB P01584). IL-1 stimuliše proliferaciju timocita indukovanjem oslobađanja IL-2, sazrevanja i proliferacije B-ćelija i aktivnosti faktora rasta fibroblasta. IL-1 proteini su uključeni u inflamatorni odgovor, identifikovani kao endogeni pirogeni (UniProtKB).

[0047] Termin „IL-33“, kako se ovde koristi, odnosi se na humani IL-33 (UniProtKB O95760), citokin koji se vezuje za receptor IL1RL1/ST2 i šalje signale putem njega, što zauzvrat aktivira signalne puteve NF-kappa-B i MAPK u ciljnim ćelijama (UniProtKB).

[0048] ermin „IL-36“, kako se ovde koristi, odnosi se na humani IL-36alfa (UniProtKB Q9UHA7, IL-36beta (UniProtKB Q9NZH7) i ili IL-36gama (UniProtKB Q9NZH8). IL-36 su citokini koji se vezuju za receptor IL1RL2/IL-36R i signaliziraju ga, što zauzvrat aktivira signalne puteve NF-kappa-B i MAPK u ciljnim ćelijama povezanim sa proinflamatornim odgovorom. Čini se da je IL-36 uključen u inflamatorni odgovor kože tako što deluje na keratinocite, dendritičke ćelije i indirektno na T ćelije kako bi podstakao infiltraciju tkiva, sazrevanje ćelija i proliferaciju ćelija (UniProtKB).

[0049] Termin „NFkB“ kako se ovde koristi, odnosi se na humani nuklearni faktor NF-kappa-B, koji se sastoji od podjedinice p105 (P19838) i podjedinice p100 (Q00653).

[0050] „Inhibicija NFkB“ se meri u skladu sa pronalaskom kao inhibicija ekspresije gena luciferaze zavisne od NFkB u humanim ćelijama. Takve metode su npr. opisane u Windheim M. et al., Mol. Cell. Biol.28 (2008) 1783-1791; Huang J. et al. PNAS USA 94 (1997) 12829-12832; Xiaoxia L. et al., Mol. Cell, Biol. 19 (1999) 4643-4652. Ako se ovde misli na mišji NFkB, to se izričito napominje.

[0051] „Varijabilni region (ili domen) antitela prema pronalasku“ (varijabilni region lakog lanca (VL), varijabilni region teškog lanca (VH)) kako se ovde koristi označava svaki od parova regiona lakog i teškog lanca koji su direktno uključeni u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni regioni lakog i teškog lanca imaju istu opštu strukturu i svaki region se sastoji od četiri okvirna (FR) regiona čije su sekvence široko očuvane, povezane sa tri regiona koji određuju komplementarnost, CDR. Antitelo prema pronalasku se sastoji od VH regiona i VL regiona ili njihovih delova, koji su zajedno dovoljni za specifično vezivanje za odgovarajući antigen.

[0052] Termin „deo antitela koji se vezuje za antigen“ kada se ovde koristi odnosi se na aminokiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Deo antitela koji se vezuje za antigen se poželjno sastoji od aminokiselinskih ostataka iz „regiona koji određuju komplementarnost“ ili „CDR“. CDR sekvence su definisane prema Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Koristeći ovaj sistem numeracije, stvarna linearna sekvenca aminokiselina može sadržati manje ili dodatne aminokiseline koje odgovaraju skraćivanju ili inserciji u FR ili CDR varijabilnog regiona.

[0053] Fraze „parenteralna primena“ i „primenjeno parenteralno“ kako se ovde koriste podrazumevaju načine primene osim enteralne i topikalne primene, obično injekcijom, i uključuju, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.

[0054] Termin „karcinom“ koji se ovde koristi može biti, na primer, karcinom pluća, karcinom pluća nemalih ćelija (NSCL), bronhioloalviolarni karcinom pluća, karcinom kostiju, karcinom pankreasa, karcinom kože, karcinom glave ili vrata, kožni ili intraokularni melanom, karcinom materice, karcinom jajnika, karcinom rektuma, karcinom analnog regiona, karcinom stomaka, karcinom želuca, karcinom debelog creva, karcinom dojke, karcinom materice, karcinom jajovoda, karcinom grlića materice, karcinom vagine, karcinom vulve, Hodgkinova bolest, karcinom jednjaka, karcinom tankog creva, karcinom endokrinog sistema, karcinom štitne žlezde, karcinom paratiroidne žlezde, karcinom nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, karcinom uretre, karcinom penisa, karcinom prostate, karcinom bešike, karcinom bubrega ili uretera, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom bubrežne karcinoma, mezoteliom, hepatocelularni karcinom, karcinom žuči, neoplazme centralnog nervnog sistema (CNS), tumori kičmene ose, gliom moždanog stabla, multiformni glioblastom, astrocitomi, švanomi, ependimone, meduloblastomi, meningiomi, skvamozne ćelije karcinoma, adenomi hipofize, limfoma, limfocitne leukemije, uključujući refraktorne verzije bilo kog od gorenavedenih karcinoma, ili kombinacije jednog ili više gorenavedenih karcinoma.

Detaljan opis pronalaska

[0055] Sve reference u opisu na metode tretmana odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku za tretmana ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnozu).

[0056] Humanizacija antitela koja potiču od imunizovanih sisara je neophodna kao karakteristika kvaliteta u razvoju, kada su navedena antitela namenjena za upotrebu kao humani terapeutici. Cilj humanizacije je da se originalne karakteristike (specifičnost vezivanja, aktivnost) antitela zadrže što je više moguće, uz smanjenje imunoloških neželjenih efekata koji se mogu javiti prilikom uvođenja nehumanizovanih antitela izvedenih iz drugih organizama u ljude. Ovaj pronalazak se zasniva na poznatoj strategiji humanizacije graftovanja CDR.

[0057] Ovde je paralelno proizvedena velika količina aktivnih humanizovanih antitela i izabrani su glavni kandidati za dalju procenu.

[0058] Kao što je navedeno u uvodu ove primene, izuzetno je teško identifikovati monoklonska antitela sa visokim afinitetom, visokom specifičnošću i snažnom neutralizacionom aktivnošću protiv IL-1R3. Ovaj pronalazak obuhvata humanizovano IL-1R3 antitelo, sa visokim afinitetom i specifičnošću za IL-1R3, sa snažnom aktivnošću neutralizacije IL-1R3 3 i poboljšanom stabilnošću kako je definisano u priloženim patentnim zahtevima.

[0059] Konkretno, obelodanjeno je humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-1R3 ili njegov fragment ili derivat koji sadrži najmanje deo navedenog antitela koji je dovoljan da pruži specifičnost vezivanja IL-1R3, a sastoji se od:

a) varijabilnog regiona teškog lanca (VH) koji se sastoji od komplementarnih regiona koji se sastoje od CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3

pri čemu CDR-H1 region obuhvata sekvencu aminokiselina izabranu iz grupe SEQ ID NO: 69 - 85,

pri čemu CDR-H2 region obuhvata sekvencu aminokiselina izabranu iz grupe SEQ ID NO: 86 - 102,

i pri čemu CDR-H3 region obuhvata sekvencu aminokiselina izabranu iz grupe SEQ ID NO: 103 - 119; i

b) varijabilnog regiona lakog lanca (VL) koji se sastoji od komplementarnih regiona koji se sastoje od CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3

pri čemu CDR-L1 region obuhvata sekvencu aminokiselina izabranu iz grupe SEQ ID NO: 120-136,

pri čemu CDR-L2 region obuhvata sekvencu aminokiselina izabranu iz grupe SEQ ID NO: 137-153, i

pri čemu CDR-L3 region obuhvata sekvencu aminokiselina izabranu iz grupe SEQ ID NO: 154-170 i 175.

[0060] U jednom otelotvorenju, antitelo pronalaska obuhvata supstituciju na poziciji 2 CDR-L3. Navedena supstitucija može biti supstitucija cisteina sa serinom.

[0061] Štaviše, otkriveno je humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-1R3 ili njegov fragment ili derivat koji sadrži najmanje deo navedenog antitela koji je dovoljan da pruži specifičnost vezivanja IL-1R3, pri čemu antitelo obuhvata varijabilni region teškog lanca (VH) koji je najmanje 60% identičan, poželjno najmanje 70% identičan, poželjnije najmanje 80% identičan, poželjnije najmanje 90% identičan VH regionu izabranom iz grupe koja se sastoji od VH regiona SEQ ID NO: 1 do 34 i SEQ ID NO:173.

[0062] Dalje obelodanjeno je humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-1R3 ili njegov fragment ili derivat koji sadrži najmanje deo navedenog antitela koji je dovoljan da pruži specifičnost vezivanja IL-1R3, obuhvata sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (VH) koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence aminokiselina izabranih iz grupe VH sekvenci u skladu sa pronalaskom.

[0063] U određenim otelotvorenjima, VH sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, pri čemu antitelo zadržava sposobnost da se specifično veže prema pronalasku za odgovarajući antigen.

[0064] Dalje obelodanjeno ovde je humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-1R3 ili njegov fragment ili derivat koji sadrži najmanje deo navedenog antitela koji je dovoljan da pruži specifičnost vezivanja IL-1R3, pri čemu antitelo obuhvata varijabilni region lakog lanca (VL) koji je najmanje 60% identičan, poželjno najmanje 70% identičan, poželjnije najmanje 80% identičan, poželjnije najmanje 90% identičan VL regionu izabranom iz grupe koja se sastoji od VL regiona SEQ ID NO: 35 do 68 i 174.

[0065] U drugom otelotvorenju, humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-1R3 ili njegov fragment ili derivat koji sadrži najmanje deo navedenog antitela koji je dovoljan da pruži specifičnost vezivanja IL-1R3, sastoji se od varijabilnog regiona lakog lanca (VL) koji ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence aminokiselinske sekvence VL sekvenci u skladu sa pronalaskom.

[0066] U određenim otelotvorenjima, VL sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, pri čemu antitelo zadržava sposobnost vezivanja specifično za odgovarajući antigen.

[0067] U određenim otelotvorenjima, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, umetnuto i/ili izbrisano u navedenim VL sekvencama. U određenim otelotvorenjima, susptitucije, insercije ili delecije se javljaju u regionima izvan CDR (tj. u FR). Pronalazak takođe obuhvata afinitetno sazrela antitela koja se mogu proizvesti u skladu sa metodama poznatim u struci. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) opisuje sazrevanje afiniteta mešanjem domena VH i VL. Nasumičnu mutagenezu CDR i/ili ostataka okvira opisali su: Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci, USA 91 : 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 1 55 : 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); i Hawkins et al., J. Mol. Biol.226:889-896 (1992) i WO2010108127.

[0068] U određenim otelotvorenjima, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, umetnuto i/ili izbrisano u svakoj od navedenih VH ili VL sekvenci. U jednom otelotvorenju, antitelo pronalaska se sastoji od supstitucije na poziciji 90 VH ili VL sekvence. Poželjno je da aminokiselina na poziciji 90 bude susptituisana serinom. Ova supstitucija je poželjno na poziciji 90 varijabilnog regiona lakog lanca (VL). U poželjnom otelotvorenju, cistein na poziciji 90 SEQ ID. NO: 62 supstituisan je serinom. Međutim, antitela ovog pronalaska nisu ograničena na supstituciju aminokiselina na poziciji 90, već mogu da obuhvataju bilo koju supstituciju, deleciju ili inserciju koje dovodi do funkcionalnog antitela koje poseduje svojstva antitela ovog pronalaska. Stoga, VL i VH sekvence antitela ovog pronalaska takođe mogu da obuhvataju dalje mutacije na različitim pozicijama.

[0069] U određenim otelotvorenjima, supstitucije, insercije ili delecije se javljaju u regionima izvan CDR (tj. u FR).

[0070] Dalje su obelodanjene supstitucije, insercije ili delecije koje se javljaju u regionima unutar CDR. Dalje obelodanjeno je antitelo koje se sastoji od supstitucije na poziciji 2 CDR-L3. Ova supstitucija može biti cistein u serin. Jedno obelodanjivanje navedene zamene je u SEQ ID NO: 164.

[0071] Dalje obelodanjeno je humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-1R3 ili njegov fragment ili derivat koji sadrži najmanje deo navedenog antitela koji je dovoljan da pruži specifičnost vezivanja IL-1R3, pri čemu antitelo obuhvata varijabilni region teškog lanca (VH) koji se sastoji od sekvence aminokiselina izabrane iz grupe SEQ ID NO: 1 do 34 i 173.

[0072] Poželjno, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca (VH) je SEQ ID NO:1, alternativno SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, ili SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33,ili alternativno SEQ ID NO:34 ili 173.

[0073] Štaviše, ovde obelodanjeno je humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-1R3 ili njegov fragment ili derivat koji sadrži najmanje deo navedenog antitela koji je dovoljan da pruži specifičnost vezivanja IL-1R3, pri čemu antitelo obuhvata varijabilni region lakog lanca (VL) koji se sastoji od sekvence aminokiselina izabrane iz grupe SEQ ID NO: 35 do 68 i 174.

[0074] Još poželjnije, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca (VL) je SEQ ID NO:35, ili SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, ili alternativno SEQ ID NO:68 ili 174.

[0075] Ovde obelodanjeno humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-1R3 ili njegov fragment ili derivat koji sadrži najmanje deo navedenog antitela koji je dovoljan da pruži specifičnost vezivanja IL-1R3, takođe obuhvata region VH i region VL koji se sastoji od odgovarajućih CDR1, CDR2 i CDR3 regiona antitela izabranih iz grupe koja se sastoji od MAB-15-0139, MAB-15-0106MAB-15-0108, MAB-15-0110, MAB-15-0117, MAB-15-0121, MAB-15-0140, MAB-15-0115, MAB-15-0125, MAB-15-0119, MAB-15-0109, MAB-15-0097, MAB-15-0135, MAB-15-0133, MAB-15-0107, MAB-15-0128, MAB-15-0116, MAB-16-0004, MAB-16-0009, MAB-16-0028, MAB-16-0031, MAB-16-0043, MAB-16-0049, MAB-16-0045, MAB-16-0040, MAB-16-0036, MAB-16-0046, MAB-16-0030, MAB-16-0021, MAB-16-0019, MAB-16-0015, MAB-16-0027, MAB-16-0048, MAB-16-0041, MAB-16-0149, MAB-16-0150.

[0076] Ovde obelodanjeno humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-1R3 ili njegov fragment ili derivat koji sadrži najmanje deo navedenog antitela koji je dovoljan da pruži specifičnost vezivanja IL-1R3, sadrži SEQ ID NO.: 1 i 35, ili SEQ ID NO.: 2 i 36. Antitelo koje je ovde obelodanjeno takođe može da sadrži SEQ ID NO.: 3 i 37, ili SEQ ID NO.: 4 i 38, ili SEQ ID NO.: 5 i 39., ili SEQ ID NO.: 6 i 40., ili SEQ ID NO.: 7 i 41., ili SEQ ID NO.: 8 i 42, ili SEQ ID NO.: 9 i 43, ili SEQ ID NO.: 10 i 44, ili SEQ ID NO.: 11 i 45, ili SEQ ID NO.: 12 i 46. Alternativno, antitelo može da sadrži SEQ ID NO.: 13 i 47, ili SEQ ID NO.: 14 i 48, ili SEQ ID NO.: 15 i 49, ili SEQ ID NO.: 16 i 50, ili SEQ ID NO.: 17 i 51, ili SEQ ID NO.: 18 i 52, ili SEQ ID NO.: 19 i 53, ili SEQ ID NO.: 20 i 54, ili SEQ ID NO.: 21 i 55, ili SEQ ID NO.: 22 i 56, ili SEQ ID NO.: 23 i 57, ili SEQ ID NO.: 24 i 58, ili SEQ ID NO.: 25 i 59, ili SEQ ID NO.: 26 i 60, ili SEQ ID NO.: 27 i 61.

[0077] Alternativno, antitelo može da sadrži SEQ ID NO.: 28 i 62, ili SEQ ID NO.: 29 i 63, ili SEQ ID NO.: 30 i 64, ili SEQ ID NO.: 31 i 65, ili SEQ ID NO.: 32 i 66, ili SEQ ID NO.: 33 i 67, ili SEQ ID NO.: 34 i 68.

[0078] Najpoželjnije, humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-1R3 ili njegov fragment ili derivat koji sadrži najmanje deo navedenog antitela koji je dovoljan da pruži specifičnost vezivanja IL-1R3 sastoji se od sekvenci konstantnog regiona CR-H (SEQ ID NO.

172) i CR-L (SEQ ID NO.171) i regiona VH izabranog iz grupe SEQ ID NO: 1 do 34 i 173 i regiona VL izabranog iz grupe SEQ ID NO: 35 do 68 i 174.

[0079] Humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-1R3 ili njegov fragment ili derivat koji sadrži najmanje deo navedenog antitela koji je dovoljan za specifičnost vezivanja IL-1R3, takođe obuhvata sekvence konstantnog regiona CR-H (SEQ ID NO.172) i CR-L (SEQ ID NO.171) i region VH i region VL koji se sastoji od odgovarajućih CDR1, CDR2 i CDR3 regiona antitela izabranih iz grupe koja se sastoji od MAB-15-0139, MAB-15-0106, MAB-15-0108, MAB-15-0110, MAB-15-0117, MAB-15-0121, MAB-15-0140, MAB-15-0115, MAB-15-0125, MAB-15-0119, MAB-15-0109, MAB-15-0097, MAB-15-0135, MAB-15-0133, MAB-15-0107, MAB-15-0128, MAB-15-0116, MAB-16-0004, MAB-16-0009, MAB-16-0028, MAB-16-0031, MAB-16-0043, MAB-16-0049, MAB-16-0045, MAB-16-0040, MAB-16-0036, MAB-16-0046, MAB-16-0030, MAB-16-0021, MAB-16-0019, MAB-16-0015, MAB-16-0027, MAB-16-0048, MAB-16-0041, MAB-16-0149 i MAB-16-150.

[0080] Prema poželjnoj terapeutskoj primeni antitela prema pronalasku, efektorske funkcije (kao što je ADCC) antitela pronalaska su smanjene ili nedostaju. Za razliku od drugih antitela prethodne tehnike, kao što je CAN04 (npr. WO 2015/132602 A1), antitela pronalaska ne pokazuju povećane efektorske funkcije i ne uključuju ADCC.

[0081] Poželjno, humanizovana antitela prema pronalasku pokazuju smanjenu ili nikakvu signalizaciju Fcy-receptora.

[0082] Stoga se pronalazak odnosi i na humanizovano antitelo, pri čemu navedeno antitelo obuhvata najmanje aminokiselinske supstitucije na L234A i L235A humanog IgG1 Fc regiona ili S228P i L235E humanog IgG4 Fc regiona.

[0083] U jednom otelotvorenju prema pronalasku, antitelo je humanizovano IgG1LALAantitelo.

[0084] U jednom otelotvorenju prema pronalasku, humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-1R3 ili njegov fragment ili derivat koji sadrži najmanje deo navedenog antitela koji je dovoljan da pruži specifičnost vezivanja IL-1R3, inhibira aktivnost NFkB indukovanu IL-1R3.

[0085] U drugom otelotvorenju, humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-1R3 ili njegov fragment ili derivat koji sadrži najmanje deo navedenog antitela koji je dovoljan da pruži specifičnost vezivanja IL-1R3, vezuje se za isti epitop kao antitelo izabrano iz grupe antitela MAB-15-0139, MAB-15-0106, MAB-15-0108, MAB-15-0110, MAB-15-0117, MAB-15-0121, MAB-15-0140, MAB-15-0115, MAB-15-0125, MAB-15-0119, MAB-15-0109, MAB-15-0097, MAB-15-0135, MAB-15-0133, MAB-15-0107, MAB-15-0128, MAB-15-0116, MAB-16-0004, MAB-16-0009, MAB-16-0028, MAB-16-0031, MAB-16-0043, MAB-16-0049, MAB-16-0045, MAB-16-0040, MAB-16-0036, MAB-16-0046, MAB-16-0030, MAB-16-0021, MAB-16-0019, MAB-16-0015, MAB-16-0027, MAB-16-0048, MAB-16-0041, MAB-16-0149 i MAB-16-150.

[0086] Antitela prema pronalasku imaju prednost da budu veoma potentna kada je u pitanju vezivanje za njihovu metu. Pokazuju jaku sposobnost vezivanja za svoj antigen, IL1R3, ali ne i za druge receptore. Vezujuća svojstva antitela su proučavana u biohemijskim imunosorbentnim testovima vezanim za enzime (ELISA) i analizi vezivanja ćelija (protočna citometrija) i prikazana su na slikama 2, 6 i 7.

[0087] Poželjna antitela prema pronalasku pokazuju polovinu maksimalne efektivne koncentracije (EC50) manju od 30ng/ml, poželjno manju od 20ng/ml. U drugim otelotvorenjima, ona pokazuju EC50 manji od 15ng/ml, 10ng/ml ili manji od 5ng/ml. Poželjno antitelo prema pronalasku pokazuje EC5016,3ng/ml u biohemijskom ELISA eksperimentu (videti sliku 7).

[0088] Antitela prema pronalasku takođe pokazuju veoma snažno vezivanje za svoj antigen u eksperimentima u kojima se humani IL1R3 eksprimira u različitim ćelijskim linijama dok se antitela ne vezuju za ćelijske linije koje ne eksprimiraju humani IL1R3 (npr. NIH-3T3, videti sliku 5).

[0089] U ćelijskoj liniji visoke ekspresije IL1R3 SK-MEL-30 (videti sliku 6, primer 8) antitela pokazuju EC50 od poželjno manje od 400 ng/ml, poželjnije manje od 350 ng/ml, ili manje od 310 ng/ml.

[0090] U jednom poželjnom otelotvorenju obuhvaćenom pronalaskom, antitelo u skladu sa pronalaskom inhibira aktivnost IL-1alfa i/ili IL-1beta stimulisanu NFkB. Slike 3, 4 i 8 prikazuju jaku inhibitornu aktivnost antitela prema pronalasku.

[0091] U jednom otelotvorenju, humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-1R3 ili njegov fragment ili derivat koji sadrži najmanje deo navedenog antitela koji je dovoljan da pruži specifičnost vezivanja IL-1R3, inhibira aktivnost NFkB stimulisanu IL-1alfa.

[0092] U drugom otelotvorenju, humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-1R3 ili njegov fragment ili derivat koji sadrži najmanje deo navedenog antitela koji je dovoljan da pruži specifičnost vezivanja IL-1R3 inhibira aktivnost stimulisanu IL-1beta NFkB.

[0093] Poželjno je da antitelo prema pronalasku inhibira aktivnost IL-1beta stimulisanu NFkB u HEK293T/17-FR ćelijama sa EC50 manjim od 100 ng/ml, poželjno manjim od 95 ng/ml, 85 ng/ml, 75 ng/ml, 65 ng/ml, 55ng/ml, 45 ng/ml, 35 ng/ml, 25 ng/ml, 20ng/ml i najpoželjnije manjim od 15 ng/ml (npr. videti sliku 3).

[0094] Dalje je poželjno da antitelo prema pronalasku inhibira aktivnost IL-1alfa stimulisanu NFkB sa EC50 manjom od 1000 ng/ml, poželjno manjom od 500 ng/ml, 300 ng/ml, 200 ng/ml, a najpoželjnije manjom od 100 ng/ml (npr. videti sliku 8) u A549-NFkB-RE-Luc ćelijama.

[0095] Dalje je poželjno da antitelo prema pronalasku inhibira aktivnost IL-1beta stimulisanu NFkB sa EC50 manjom od 700 ng/ml, poželjno manjom od 600 ng/ml, 300 ng/ml, 200 ng/ml, 100 ng/ml i najpoželjnije manjom od 50 ng/ml u A549-NFkB-RE-Luc ćelijama (npr. videti sliku 8).

[0096] Pronalazak takođe obuhvata humanizovano antitelo, pri čemu navedeno antitelo inhibira aktivnost NFkB stimulisanu kompleksom izabranim iz grupe koja se sastoji od IL1β/IL-1R1/IL-1RAcP, IL-1α/IL-1R1/IL-1RAcP IL-33/ST2/IL-1RAcP, i/ili IL-36/Il-36R/IL-1RAcP.

[0097] Štaviše, humanizovano antitelo prema pronalasku inhibira u koncentraciji od 10 µg/ml (izotip IgG kunića ima molekularnu težinu od 150 KD) ekspresiju NFkB u lizatima ćelija A549-NFkB-RE-Luc (Steady-Glo<™>test sistem za luciferazu; Promega; kat. br. E2510) stimulisano sa 0,1 ng/ml humanog IL-1alfa, humanog IL-1beta, IL-33 i/ili IL-36 (molekularna težina videti UniProtKB/Swiss-Prot), za 50% ili više, poželjno za 70% ili više, poželjno za 80% ili poželjnije za 90% i više, i poželjnije za 95% ili više, povezano sa istim testom bez navedenog antitela prema pronalasku.

[0098] U jednom otelotvorenju, humanizovano antitelo prema pronalasku inhibira IL-1alfa, IL-1beta, IL-33 i/ili IL-36, respektivno, stimulisanu aktivnost luciferaze u HEK 293T/17 ćelijama (HEK 293T/17-FR ćelije transficirane luciferazom pod kontrolom reporter gena NF-kB), HEK-Blue-IL33<™>ćelijama (Invivogen) ili HEK-293/17-IF ćelijama

[0099] Poželjno, navedena IL-1alfa, stimulisana aktivnost luciferaze je inhibirana za 50% ili više, poželjno za 70% ili više, poželjno za 80% ili više, poželjno za 90% i više, a poželjnije za 95% ili više. Poželjno, navedena IL-1alfa, stimulisana aktivnost luciferaze je inhibirana za 95%.

[0100] Poželjno, navedena IL-1beta, stimulisana aktivnost luciferaze je inhibirana za 50% ili više, poželjno za 70% ili više, poželjno za 80% ili više, poželjno za 90% i više, a poželjnije za 95% ili više. Poželjno, navedena IL-1beta, stimulisana aktivnost luciferaze je inhibirana za 95%.

[0101] Poželjno, navedena IL-33, stimulisana aktivnost luciferaze je inhibirana za 50% ili više, poželjno za 70% ili više, poželjno za 80% ili više, poželjno za 90% i više, a poželjnije za 95% ili više. Poželjno, navedena IL-33, stimulisana aktivnost luciferaze je inhibirana za 95%.

[0102] Poželjno, navedena IL-36, stimulisana aktivnost luciferaze je inhibirana za 50% ili više, poželjno za 70% ili više, poželjno za 80% ili više, poželjno za 90% i više, a poželjnije za 95% ili više. Poželjno, navedena IL-36, stimulisana aktivnost luciferaze je inhibirana za 95%.

[0103] Štaviše, antitela prema pronalasku inhibiraju oslobađanje IL-6 posredovano humanim IL-1a i IL-1b i superiorna su u odnosu na poliklonska antitela. Ova snažna inhibitorna aktivnost data je i prikazana na slici 9. U ovim eksperimentima, vrednosti EC50 pokazuju da su humanizovana anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitela superiorna u odnosu na goveđe-antihumano-IL1-R3 poliklonsko antitelo AF676 (R&D Systems). U poželjnim otelotvorenjima pronalaska, antitela inhibiraju oslobađanje humanog IL posredovanog IL-6 sa EC50 manjim od 2500 ng/ml, poželjno manjim od 1500 ng/ml, manjim od 1000 ng/ml, manjim od 600 ng/ml, manjim od 400 ng/ml ili manjim od 300 ng/ml. Takođe je poželjno da antitela pronalaska inhibiraju oslobađanje humanog IL-1b posredovanog IL-6 sa EC50 manjim od 500 ng/ml, poželjno manjim od 400 ng/ml, manjim od 300 ng/ml, manjim od 200 ng/ml ili manjim od 150 ng/ml.

[0104] U drugom otelotvorenju prema pronalasku, antitela inhibiraju NfkB signalizaciju posredovanu humanim IL-33. Slika 10 ilustruje inhibitornu aktivnost odabranih antitela prema pronalasku u HEK-Blue-IL33<™>ćelijama i pokazuje superiornost u odnosu na poliklonska antitela. U poželjnim otelotvorenjima pronalaska, antitela inhibiraju humanu IL-33 posredovanu NfkB signalizaciju sa EC50 manjom od 20000 ng/ml, poželjno manjom od 18000 ng/ml, manjom od 3000 ng/ml, manjom od 1000 ng/ml, manjom od 500 ng/ml ili manjom od 400 ng/ml.

[0105] Antitela pronalaska takođe mogu inhibirati humanu IL-36 posredovanu NfkB signalizaciju (slika 11). Poželjno je da inhibiraju NfkB signalizaciju posredovanu humanim IL-36 na EC50 manjoj od 100 ng/ml, poželjno manjoj od 50 ng/ml, manjoj od 40 ng/ml, manjoj od 30 ng/ml, manjoj od 20 ng/ml ili manjoj od 15 ng/ml.

[0106] Iznenađujuće, pronalazači su otkrili da antitela prema pronalasku inhibiraju oslobađanje citokina posredovano različitim stimulansima. Na primer, antitela inhibiraju oslobađanje citokina posredovano IL-1a, IL-33 i IL-36a. Rezultati izabranog antitela prikazani su na slici 12. Na primer, antitelo MAB-16-0030 inhibira oslobađanje citokina posredovano sa sva tri stimulansa, dok IL-1Ra utiče samo na oslobađanje citokina posredovano sa IL-1a.

[0107] Bolesti povezane sa akutnom ili hroničnom upalom održavaju se ili uspostavljaju delovanjem više citokina istovremeno ili uzastopno. Rani „alarmini“ kao što su IL-1a i IL-33 mogu izazvati druge citokine uključujući IL-1b i IL-36 za uspostavljanje jakog inflamatornog okruženja. Stoga, istovremena inhibicija signalizacije posredovana višestrukim citokinima vrši efikasnu kontrolu inflamatornih procesa. Ključni aspekt antitela pronalaska je da inhibiraju višecitokinsku signalizaciju putem blokade IL1R3 receptora.

[0108] Vezivanje antitela za imunološke ćelije može rezultirati iscrpljivanjem ćelija i štetnim efektima, npr. direktnom indukcijom apoptotičkih signalnih puteva, stimulacijom prekomernog oslobađanja citokina ili ćelijskom citotoksičnošću zavisnom od antitela (ADCC) posredovanom efektorskom funkcijom antitela.

[0109] Shodno tome, još jedan aspekt antitela pronalaska je da ona ne izazivaju iscrpljivanje imunih ćelija, posredovano direktnom indukcijom apoptotičkih signalnih puteva, stimulacijom prekomernog oslobađanja citokina ili ćelijskom citotoksičnošću zavisnom od antitela posredovanom efektorskom unkcijom antitela.

[0110] Važno je da antitela prema pronalasku ne utiču na održivost imunoloških ćelija. Na primer, oni ne utiču na vijabilnost humanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) ) i ne izazivaju oslobađanje IL-6 u PBMC (videti sliku 13).

[0111] Antitela prema pronalasku ne inhibiraju samo funkcionalnu aktivaciju oslobađanja citokina u različitim ćelijskim linijama kao što je gore opisano, već i u PMBC ili celim krvnim ćelijama donatora. Oni inhibiraju oslobađanje citokina posredovano različitim specifičnim ili složenim stimulansima. Na primer, oni inhibiraju aktivaciju PBMC stimulisanih sa LPS, termički inaktiviranim Candida albicans, IL-12/IL-33 ili anti-CD3/CD28 antitelima (videti slike 14 i 15).

[0112] Takođe, u jednom otelotvorenju, humanizovana anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitela prema pronalasku mogu da inhibiraju oslobađanje IFNg, IL-6, TNF-a, IL-13, IL-17 i IL-10 u reakcijama mešovitih limfocita (videti sliku 16).

[0113] Štaviše, antitela prema pronalasku su posebno korisna za tretman bolesti kod kojih je disregulacija cilja, IL1R3, osnovni razlog.

[0114] Stoga se ovaj pronalazak dalje odnosi na humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-1R3 ili njegov fragment ili derivat koji sadrži najmanje deo navedenog antitela koji je dovoljan da pruži specifičnost vezivanja IL-1R3, za upotrebu u tretmanu bolesti posredovane IL-1R3.

[0115] Ovaj pronalazak takođe obuhvata metod tretmana bolesti posredovane IL-1R3 kod pacijenta, koji se sastoji od primene na pacijentu farmaceutski efikasne količine antitela, ili njegovog derivata ili fragmenta u skladu sa pronalaskom.

[0116] Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja se sastoji od farmaceutski prihvatljivog nosača i terapeutski efikasne količine humanizovanog antitela koje se specifično vezuje za IL-1R3 ili njegov fragment ili derivat koji sadrži najmanje deo navedenog antitela koji je dovoljan da pruži specifičnost vezivanja IL-1R3, prema pronalasku.

[0117] Kao što se ovde koristi, „farmaceutski nosač“ uključuje sve rastvarače, disperzione medije, premaze, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije i slično koji su fiziološki kompatibilni. Poželjno je da je nosač pogodan za intravenoznu, intramuskularnu, subkutanu, parenteralnu, kičmenu ili epidermalnu primenu (npr. injekcijom ili infuzijom).

[0118] Kompozicija ovog pronalaska može se primeniti različitim metodama poznatim u struci. Kao što će biti cenjeno od strane kvalifikovanog stručnjaka, put i/ili način primene će se razlikovati u zavisnosti od željenih rezultata. Da bi se jedinjenje pronalaska primenilo određenim putevima primene, možda će biti potrebno obložiti jedinjenje ili ga istovremeno primeniti materijalom kako bi se sprečila njegova inaktivacija. Na primer, jedinjenje se može primeniti na subjektu u odgovarajućem nosaču, na primer, liposomima ili razblaživaču. Farmaceutski prihvatljivi razblaživači uključuju fiziološki rastvor i vodeni puferski rastvor. Farmaceutski nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za privremenu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzije. Upotreba takvih medija i agenasa za farmaceutski aktivne supstance poznata je u struci.

[0119] Fraze „parenteralna primena“ i „primenjeno parenteralno“ kako se ovde koriste podrazumevaju načine primene osim enteralne i topikalne primene, obično injekcijom, i uključuju, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.

[0120] Ove kompozicije takođe mogu da sadrže adjuvanse kao što su konzervansi, agensi za vlaženje, emulgatori i agensi za dispergovanje. Prevencija prisustva mikroorganizama može se obezbediti kako postupcima sterilizacije, supra, tako i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer, parabena, hlorobutanola, fenola, sorbinske kiseline i slično. Takođe može biti poželjno uključiti izotonične agense, kao što su šećeri, natrijum hlorid i slično u kompozicije. Pored toga, produžena apsorpcija farmaceutskog oblika za ubrizgavanje može se postići uključivanjem agenasa koji odlažu apsorpciju kao što su aluminijum monostearat i želatin. Bez obzira na izabrani put primene, jedinjenja ovog pronalaska, koja se mogu koristiti u odgovarajućem hidratisanom obliku, i/ili farmaceutske kompozicije ovog pronalaska, formulisana su u farmaceutski prihvatljive oblike doziranja konvencionalnim metodama poznatim stručnjacima u predmetnoj oblasti. Stvarni nivoi doziranja aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama ovog pronalaska mogu se menjati tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna za postizanje željenog terapeutskog odgovora za određenog pacijenta, kompoziciju i način primene, bez toksičnosti za pacijenta. Izabrani nivo doze zavisiće od različitih farmakokinetičkih faktora, uključujući aktivnost određenih kompozicija ovog pronalaska, način primene, vreme primene, brzinu izlučivanja određenog jedinjenja koje se koristi, trajanje tretmana, druge lekove, jedinjenja i/ili materijale koji se koriste u kombinaciji sa određenim kompozicijama koje se koriste, starost, pol, težinu, stanje, opšte zdravstveno stanje i prethodnu medicinsku istoriju pacijenta koji se tretira i slične faktore dobro poznate u medicinskoj struci.

[0121] Jedan aspekt pronalaska je farmaceutska kompozicija prema pronalasku za upotrebu u tretmanu karcinoma, kako je definisano u ovoj prijavi.

[0122] Drugi aspekt pronalaska je metoda tretmana bolesti posredovane IL-1R3 kod pacijenta, koja se sastoji od primene farmaceutske kompozicije na pacijentu u skladu sa pronalaskom.

[0123] Takve bolesti posredovane IL-1R3 mogu uključivati karcinom. U literaturi je opisano da je negativna prognoza i progresija kod karcinoma povezana sa povećanim nivoima IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36 i/ili povećanom ekspresijom IL-1R3.

[0124] Termin „karcinom“ koji se ovde koristi može biti, na primer, karcinom pluća, karcinom pluća nemalih ćelija (NSCL), bronhioloalviolarni karcinom pluća, karcinom kostiju, karcinom pankreasa, karcinom kože, karcinom glave ili vrata, kožni ili intraokularni melanom, karcinom materice, karcinom jajnika, karcinom rektuma, karcinom analnog regiona, karcinom stomaka, karcinom želuca, karcinom debelog creva, karcinom dojke, karcinom materice, karcinom jajovoda, karcinom grlića materice, karcinom vagine, karcinom vulve, Hodgkinova bolest, karcinom jednjaka, karcinom tankog creva, karcinom endokrinog sistema, karcinom štitne žlezde, karcinom paratiroidne žlezde, karcinom nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, karcinom uretre, karcinom penisa, karcinom prostate, karcinom bešike, karcinom bubrega ili uretera, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom bubrežne karcinoma, mezoteliom, hepatocelularni karcinom, karcinom žuči, neoplazme centralnog nervnog sistema (CNS), tumori kičmene ose, gliom moždanog stabla, multiformni glioblastom, astrocitomi, švanomi, ependimone, meduloblastomi, meningiomi, skvamozne ćelije karcinoma, adenomi hipofize, limfoma, limfocitne leukemije, uključujući refraktorne verzije bilo kog od gorenavedenih karcinoma, ili kombinacije jednog ili više gorenavedenih karcinoma. Poželjno je da je takav karcinom leukemija, karcinom dojke, karcinom debelog creva, karcinom pluća ili karcinom pankreasa. Najpoželjniji karcinom je leukemija.

[0125] U jednom otelotvorenju, bolest posredovana IL-1R3 izabrana je iz grupe koja se sastoji od leukemije, karcinoma dojke, karcinoma debelog creva, karcinoma pluća, karcinoma pankreasa, karcinoma jetre, karcinoma nemalih ćelija pluća, kolorektalnog karcinoma, karcinoma stomaka, karcinoma želuca, karcinoma dojke pozitivnog na estrogenske receptore, karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata, mezotelioma, karcinoma žučne kese, karcinoma jajnika, karcinoma bešike, karcinoma prostate, karcinoma štitne žlezde, Hodgkinove bolesti, MALT limfoma, karcinoma pljuvačnih žlezda ili melanoma.

[0126] Neki tumori su uzrokovani ili promovisani tumorskim ćelijama mikrookruženja koje luče inflamatorne citokine kao što su IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36. U nekim slučajevima, ekspresija takvih citokina rezultira stvaranjem otpornosti tumora. Istovremena upotreba inhibitora citokina i antitumorskih jedinjenja značajno poboljšava stopu odgovora na takve tretmane ili može prekinuti otpornost tumora. Ovo je predviđeno ovim pronalaskom jer se postiže širok spektar inhibicije signalizacije indukovane citokinima. Takva aktivnost u indikacijama karcinoma se ne postiže direktnom aktivnošću iscrpljivanja ćelija karcinoma, već inhibicijom upale povezane sa karcinomom modulacijom signalnih puteva IL1R3. Antitela ovog pronalaska pružaju veoma poželjan profil aktivnosti jer omogućavaju efikasnu inhibiciju hronične upale povezane sa karcinomom i, istovremeno, izbegavaju neželjena dejstva, jer ne pokazuju funkciju efektora antitela i stoga ne utiču na vijabilnost ciljnih ćelija koje eksprimiraju IL-1R3.

[0127] Stoga, u jednom otelotvorenju ovog pronalaska, antitelo ili farmaceutska kompozicija se koristi za tretman pacijenata, pri čemu pacijenti imaju tumor, kao što je čvrsti tumor, i pokazuju nedovoljan odgovor ili otpornost tumora na citotoksičnu, citostatičnu ili ciljanu/imunoterapiju.

[0128] U jednom aspektu pronalaska, humanizovano antitelo i/ ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku, namenjeni su za upotrebu u tretmanu karcinoma u kombinaciji sa jednim ili više citotoksičnih, citostatskih ili ciljanih jedinjenja protiv karcinoma. Upotreba inhibitora citokina i citotoksičnih, citostatskih ili ciljanih antitumorskih jedinjenja značajno poboljšava stopu odgovora na takve tretmane ili može prekinuti otpornost tumora.

[0129] U takvim aspektima pronalaska, karcinom se poželjno bira iz grupe koja se sastoji od karcinoma pankreasa, karcinoma jetre, karcinoma pluća (povezanog sa upalom izazvanom azbestom, infekcijama, pušenjem, silicijumom), karcinoma pluća nemalih ćelija, karcinoma kolorektalnog karcinoma/karcinoma povezanog sa kolitisom (povezanog sa inflamatornom bolešću creva), karcinoma stomaka, karcinoma želuca, karcinoma želuca povezanog sa hroničnim gastritisom, karcinoma dojke pozitivnog na estrogen receptore, karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata, mezotelioma, karcinoma žučne kese (povezanog sa hroničnim holecistitisom povezanim sa kamencem u žuči), karcinoma jajnika, karcinoma bešike, karcinoma prostate povezanog sa infekcijom E.coli, karcinoma štitnjače, Hodgkinove bolesti, MALT limfoma, karcinoma pljuvačkih žlezda, melanoma, endometrioze povezane sa endometrijalnim karcinomom, Barrettovog ezofagitisa povezanog sa ezofagalnim karcinomom.

[0130] U jednom aspektu metode ovog pronalaska, IL1R3 antitelo ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku primenjuje se istovremeno sa jednim ili više citotoksičnih, citostatskih ili ciljanih antikancerogenih agenasa. U drugom aspektu, antitelo ili farmaceutska kompozicija se primenjuje sekvencijalno sa jednim ili više citotoksičnih, citostatskih ili ciljanih antikancerogenih agenasa.

[0131] U drugom slučaju, poželjno je da se antitelo primeni nakon tretmana sa jednim ili više citotoksičnih, citostatskih ili ciljanih antikancerogenih agenasa.

[0132] Citotoksični ili citostatički agensi prema pronalasku mogu biti taksani, antraciklini, alkilirajući agensi, inhibitori histon deacetilaze, inhibitori topoizomeraze, inhibitori kinaze, nukleotidni analozi, peptidni antibiotici, agensi na bazi platine i inhibitori kontrolnih tačaka.

[0133] Poželjno je da ciljani antikancerogeni agensi budu izabrani između jednog od sledećih ili njihovih kombinacija: anti-EGFR jedinjenja kao što su cetuksimab, gefitinib, erlotinib, lapatinib, panitumumab i anti-HER2 jedinjenja kao što su trastuzumab, ado-trastuzumab emtanzin, pertuzumab.

[0134] Dalje je poželjno da ciljani antikancerogeni agensi budu inhibitori kontrolnih tačaka. One mogu biti, ali nisu ograničene na: anti-PD1 jedinjenja kao što su pembrolizumab i nivolumab, i anti-PDL1 jedinjenja kao što su atezolizumab, avelumab i Durvalumab, i anti-CTLA-4 jedinjenja kao što su ipilimumab i Tremelimumab.

Primeri:

[0135] Sledeći primeri se koriste zajedno sa slikama i tabelama za ilustraciju pronalaska.

Primer 1: Određivanje specifičnih antitela P013_03 (humani IL-1R3) u supernatantima B-ćelija

Princip testa:

[0136] NUNC Maxisorp mikrotiterske ploče sa 384 bunara su obložene sa P013_03. Nakon procesa blokiranja, specifična antitela iz supernatanata B-ćelija se vezuju za antigen, a zatim ih detektuje POD-označeno antitelo. Uzorci se testiraju 1:2 razblaženi.

Materijali:

[0137]

Ploče: NUNC Maxisorp ploče sa 384 bunara; kat. br.464718

Proteini: P013-03 (konc.1.5mg/ml; test konc. 0.5µg/ml)

Standardno P013-02 (konc.1mg/ml; početna test konc.2µg/ml)

antitelo:

Antitela za Anti-zečji IgG, celokupno antitelo specifično za vrstu povezano sa peroksidazom detekciju: (od magarca) (ECL); GE; kat. br.NA9340; test razblaženje: 1:5000

Procedura:

[0138]

1. Dodajte 12,5 µL P013-03 (0,5 µg/ml) u PBS u NUNC Maxisorp ploču sa 384 bunara i inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi.

2. Isperite 3x puferom za ispiranje od 90 µl.

3. Dodajte pufer za blokiranje od 90 µl u svaki bunar i inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi.

4. Isperite 3x puferom za ispiranje.

5. Dodajte standardno antitelo od 12,5 µl u razblaženjima 1:2 ili uzorak 1:2 razblažen u Elisa puferu i inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi.

6. Isperite 3x puferom za ispiranje.

7. Dodajte 12,5 µL 1:5000 POD-antitelo u Elisa pufer i inkubirajte 1 sat na sobnoj temeperaturi.

8. Isperite 6x puferom za ispiranje.

9. Dodajte 15 µl TMB.

10. Dodajte 15 µL HCl nakon dovoljnog razvoja.

11. Očitajte apsorbanciju na 450nm/620nm.

Primer 2: Identifikacija P013-specifičnih antitela koja inhibiraju P013-receptor eksperimentom sa reporter luciferazom

Princip testa:

[0139] 293T/17-FR ćelije, koje eksprimiraju NF-kB-RE reporter luciferaze svica, zasejane su u poli-D-lizin-ćelijske ploče kulture. Nakon stimulacije P013, lizat 293T/17-FR se testira na aktivirani NF-kB pomoću Steady-Glo test kompleta za luciferazu. Supernatanti sa funkcionalnim antitelima vezuju se za P013 i inhibiraju aktivaciju NF-kB, što se vidi u slabom signalu. Uzorci se testiraju 1:2 razblaženi u P013 rastvoru.

Materijali:

Ploče: Ćelijska ploča: PDL Costar ploča ćelijske kulture sa 384 bunara; kat. br.3844

Test ploča: Lumitrak bela ploča sa 384 bunara; Corning; kat. br.3572

Ćelije: 293T/17-FR; test konc. 250,000 ćelija/ml

Što je ćelijska pasaža viša, signal je niži!

Proteini: P013_05 (konc.0.03mg/ml; test konc.115pg/ml; radna konc.230pg/ml)

Standardna antitela: P013_06 (konc.0.2mg/ml; početna radna konc.6µg/ml)

Komplet: Steady-Glo test sistem za luciferazu; Promega; kat. br. E2510

Medijum ćelije: DMEM medijum; PAN Biotech; kat. br. P04-04510

FCS: Fetalni goveđi serum, HyClone; Thermo; kat. br. St30070.03

293T/17-FR medijum: DMEM medijum, 10% FCS, (+ 20µg/ml higromicina-B, samo za kultivaciju)

Kondicionirani medijum B-ćelija (MAB Discovery)

Uzorci: razblaženje 1:2 sa P013_05 u DMEM-medijumu 10% FCS

Procedura:

[0141]

1. Postupak ćelijske kulture:

Razdvojite konfluentne 293T/17-FR ćelije svakog ponedeljka (zasejte: 5x106 ćelija/T175 tikvica) i petka (zasejte: 3x106 ćelija/ T175 tikvica) koristeći tripsin/EDTA (inkubirajte samo 30 sekundi na sobnoj temperaturi).

2. Zasejte ćelije (0.25x106 ćelija/ml) u 25 µl DMEM 10% FCS na PDL-ploču sa 384 bunara (Corning kat. br.3844) i inkubirajte preko noći na 37°C i 5% CO2.

3. Aspirirajte medijum i dodajte uzorak od 12.5 µl ili P013_06 u razblaženje 1:3 u kondicioniranom medijumu ili samo kondicionirani medijum i inkubirajte 30 minuta na 37°C i 5% CO2 (program: 3 Aspiracija i transfer uzorka)

4. Dodajte 12,5 µl P013_05 u DMEM 10%FCS i inkubirajte 5 sati na 37°C i 5% CO2 (program: 4_Dodajte P013_05).

5. Uravnotežite kultivisane ćelije na sobnoj temperaturi 10 min.

6. Dodajte 25 µl Steady-Glo reagensa i pomešajte nekoliko puta sa pipetom (program:

6_Steady Glo)

7. Sačekajte 5 minuta pre prenosa supernatanta od 45 µl na lumitrak belu ploču sa 384 bunara (Corning kat. br.3572) (program: 7_Transfer 45ul)

8. Izmerite luminiscenciju u Tecan čitaču: Vreme integracije: 0.5sec

Primer 3: Određivanje specifičnih antitela huIL1RaP, msIL1RaP, CD134 i CD137 u supernatantima B-ćelija

Princip testa:

[0142] NUNC Maxisorp mikrotiterske ploče sa 384 bunara su obložene ciljnim proteinom. Nakon procesa blokiranja, specifična antitela iz supernatanata B-ćelija se vezuju za mete, a zatim ih detektuje POD-označeno antitelo.

Materijali:

Procedura:

[0144]

1. Dodajte 12,5 µL 0,25 µg/ml ili 1 µg/ml proteina razblaženog u PBS u NUNC Maxisorp ploču sa 384 bunara i inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi.

2. Isperite 3x puferom za ispiranje od 90 µl.

3. Dodajte pufer za blokiranje od 90 µl u svaki bunar i inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi.

4. Isperite 3x puferom za ispiranje od 90 µl. Ploče se mogu čuvati u suvom stanju do 6 nedelja na -20 °C zapečaćene aluminijumskom folijom.

5. Dodajte 12,5 µL standardnog antitela u koracima razblaživanja 1:2 ili uzorak (razblažen u Elisa puferu) i inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi.

6. Isperite 3x puferom za ispiranje od 90 µl.

7. Dodajte 12,5 µL 1:5000 POD-antitelo u Elisa pufer i inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi.

8. Isperite 6x puferom za ispiranje od 90 µL.

9. Dodajte 15 µl TMB.

10. Dodajte 15 µL HCl nakon 15 minuta razvoja.

11. Očitajte apsorbanciju na 450nm/620nm

Primer 4: Inhibicija ekspresije NFκB stabilnih transfektovanih ćelija A549-NFκB-RE-Luc nakon stimulacije IL-1 (α/β)

Princip testa:

[0145] A549-NFκB-RE-Luc stabilne transficirane ćelije (Signosis) se pipetiraju u ploču sa 384 bunara i inkubiraju preko noći. Drugog dana je dozvoljeno vezivanje anti-IL1R3 antitela za stabilne transficirane ćelije A549-NFkB-RE-Luc, koje se zatim stimulišu dodavanjem IL-1 (α ili β). To rezultira transkripcijom gena luciferaze usled aktivacije signalnog puta NFκB i može se meriti ćelijskom lizom i dodavanjem luciferina.

[0146] Testira se da li antitela mogu da inhibiraju aktivaciju NFkB puta i samim tim smanje signal luminiscencije.

Materijali:

Ploče: TC-tretirane, plitke, bele, sterilne polistirenske mikroploče sa 384 bunara sa ravnim dnom Cornin kat. br.3570

Procedura:

[0148]

1. Kultivišite stabilne transficirane ćelije A549-NFκB-RE-Luc (1.7E+04 ćelije/cm<2>tokom 3 dana; 2.28E+04 ćelije/cm<2>tokom 2 dana) u ćelijskom medijumu. Ne prelazite 10 pasaža!

2. Stavite 40.000 A549-NFkB-RE-Luc stabilnih transfektovanih ćelija u 25 µL medijuma po bunaru (konc. = 1,6×10<6>ćelija/ml) u belu ploču tretiranu kulturom ćelija sa 384 bunara sa ravnim dnom.

Inkubirajte preko noći na 37°C/5% CO2.

3. Aspirirajte medijum sa ploče i dodajte 10 µL uzorka ili standarda u medijum u ploči pomoću CyBio robota za pipetiranje (program: „Uklanjanje medijuma i transfer uzorka” u folderu P026/NFkB). Inkubirajte 1 sat na 37°C/5% CO2.

4. Dodajte 10 µL IL-1 (α ili β) u medijum u ploči pomoću CyBio robota za pipetiranje (program: „Transfer iz rezervoara“ u folderu P026/NFkB) (radna konc.: 0,2 ng/ml; test konc.: 0,1 ng/ml) i inkubirajte 5 sati na 37°C/5% CO2.

Pre izvođenja koraka 4, rastvoriti Steady-Glo supstrat u Steady-Glo puferu u skladu sa Steady-Glo protokolom i uravnotežite ovaj rastvor i test ploču na sobnoj temperaturi.

5. Dodajte 20 µL Steady-Glo smeše, temeljno promešajte kako biste garantovali pravilnu lizu ćelija. Inkubirajte na sobnoj temperaturi, 10 min.

6. Odredite relativne jedinice luminiscencije svakog bunara, koristeći čitač mikropločica podešen na vreme integracije od 500 ms (program: Lumineszenz-384).

Primer 5: IL-6 sekrecija ćelija A549 nakon stimulacije sa IL-1 (α/β)

Princip testa:

[0149] Ćelije A549 se pipetiraju u ploču sa 384 bunara i inkubiraju anti-IL1R3 antitelima. Nakon toga, ćelije se stimulišu sa IL-1 (α ili β) i izlučuju IL-6 u medijum za testiranje. Količina IL-6 se meri IL-6 ELISA testom.

Materijali:

[0150]

Procedura:

Stimulacija ćelija

[0151]

1. Stavite 6.000 A549 ćelija u 25 µL medijuma po bunaru (konc. = 2,4×10<5>ćelija/mL) u ploču ćelijske kulture. Inkubirajte preko noći na 37°C/5% CO2.

2. Aspirirajte medijum sa ploče i dodajte 12,5 µL uzorka ili standarda u medijum u ploči.

Inkubirajte 3 sat na 37°C/5% CO2.

3. Dodajte 12,5 µL IL-1 (α ili β) u ploču (radna konc.: 0,2 ng/ml; test konc.: 0,1 ng/ml) i inkubirajte 48 sati na 37°C/5% CO2.

4. Aspirirajte medijum i prenesite u obloženu i blokiranu Elisa ploču (korak 9).

Alternativno, supernatanti se mogu čuvati na -80°C u PP-ploči do nedelju dana.

Priprema Elisa ploče

[0152]

5. Razblažite antitelo za hvatanje do koncentracije od 2 µg/ml u PBS. Odmah obložite Maxisorp ploču sa 384 bunara sa 12,5 µL razblaženog antitela za hvatanje po bunaru. Zatvorite ploču i inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi.

6. Aspirirajte svaki bunar i operite puferom za ispiranje, ponavljajući postupak dva puta za ukupno tri ispiranja. Isperite svaki bunar puferom za ispiranje (90 µL) pomoću automatskog uređaja za ispiranje. Potpuno uklanjanje tečnosti u svakom koraku je od suštinskog značaja za dobre performanse. Nakon poslednjeg ispiranja, uklonite preostali pufer za ispiranje usisavanjem ili okretanjem ploče i brisanjem čistim papirnim ubrusima.

7. Blokirajte ploče dodavanjem pufera za blokiranje od 90 µL u svaki bunar. Inkubirajte na sobnoj temperaturi najmanje 1 sat.

8. Ponovite aspiraciju/ispiranje kao u koraku 6. Ploče su sada spremne za dodavanje uzorka. Obložene i blokirane ploče mogu se čuvati na -20°C u suvom stanju do mesec dana.

Test postupak

[0153]

9. Dodajte 12,5 µL čistog uzorka ili IL-6 standarda razblaženog u Elisa puferu (EB) po bunaru. Pokrijte i inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi.

10. Ponovite aspiraciju/ispiranje kao u koraku 6 pripreme Elisa ploče.

11. Dodajte 12,5 µL antitela za detekciju, razblaženog u EB, u svaki bunar. Pokrijte i inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi.

12. Ponovite aspiraciju/ispiranje kao u koraku 6 pripreme Elisa ploče.

13. Dodajte 12,5 µL 1:40 razblaženog Streptavidin-HRP u Elisa pufer u svaki bunar. Pokrijte ploču i inkubirajte 20 minuta na sobnoj temperaturi. Izbegavajte postavljanje ploče na direktno svetlo.

14. Ponovite aspiraciju/ispiranje kao u koraku 6 pripreme Elisa ploče.

15. Dodajte 15 µL rastvora supstrata (TMB) u svaki bunar. Inkubirajte 20 minuta na sobnoj temperaturi.

16. Dodajte 15 µL Stop rastvora (HCl, 1 M) u svaki bunar. Lagano tapkajte po ploči kako biste osigurali temeljno mešanje.

17. Odmah odredite optičku gustinu svakog bunara, koristeći čitač mikropločica podešen na 450 nm. Ako je dostupna korekcija talasne dužine, podesite na 540 nm ili 570 nm (program: TMB stop 384 citokin). Očitavanja izvršena direktno na 450 nm bez korekcije mogu biti veća i manje tačna.

Primer 6: Određivanje karakteristika vezivanja specifičnih antitela huIL1RaP testom kompetitivnosti

Princip testa:

[0154] NUNC Maxisorp mikrotiterske ploče sa 384 bunara su obložene referentnim antitelima Can04. Za to vreme His-označeni ciljni protein je predinkubiran drugim antitelima za testiranje i anti-HIS-POD antitelima. Nakon toga se ova predinkubaciona smeša dodaje u test ploču i nakon dovoljnog vremena razvoja meri se apsorbancija na 450 nm/620 nm.

Materijali:

Ploče: NUNC Maxisorp ploče sa 384 bunara; kat. br.464718

Antitela za Can04 (MAB Discovery GmbH; CEP At br.184; konc.1 mg/ml; test konc.100 oblaganje: ng/ml)

Protein: huIL1RaP-His protein (P026_01; Fuzija_1_lanac_A homodimer huIL1RaP-His

Antitela za anti-HIS POD antitela (monoklonalni anti-poliHistidin peroksidazni konjugat; detekciju: Sigma; kat. br. A7058; konc.7,5 mg/ml; test konc.: 3,33µg/ml)

Procedura:

[0156]

12. Pripremite predinkubacionu smešu i inkubirajte 2 sata na sobnoj temperaturi.

a. Predinkubacija (u ploči sa 384 bunara)

i. Pomešajte 10 µl serije razblaženja sekundarnih antitela (razblaženje 1:2; početna radna konc.: 3 µg/ml) u ELISA puferu ili BLANK sa

ii. 10 µl His-označenog proteina (test konc.62.5 ng/ml) i

iii. 10 µl anti-HIS POD antitela (test konc.: 3.33 µg/ml) i inkubirajte 1 sat na sobnoj teperaturi.

13. U međuvremenu, obložite NUNC MAXISORP ploču sa 20 µl antitela za oblaganje (Can04; test konc.100ng/ml) u PBS i inkubirajte 1 sat na sobnoj teperaturi.

14. Isperite 3x puferom za ispiranje od 90 µl.

15. Blokirajte sa puferom za blokiranje od 90 µl 1 sat na sobnoj teperaturi.

16. Isperite 3x puferom za ispiranje.

17. Dodajte 20 µl predinkubacione smeše u ELISA pufer 1 sat na sobnoj temperaturi.

18. Isperite 6x puferom za ispiranje.

19. Dodajte 25 µL TMB.

20. Dodajte 25 µL HCl nakon dovoljnog razvoja.

21. Očitajte apsorbanciju na 450 nm/620 nm.

Primer 7: IL12 kontra skrining

Princip testa:

[0157] IL12 vezivo se koristi kao kontra skrining. HER proteini su označeni linkerom, huFc i His (HER1 nema His-oznaku) poput IL12 proteina. Antitela koja se vezuju za oznaku su pozitivna u oba testa, dok se antitela specifična za antigen samo vezuju za HER proteine, a ne za IL12.

Materijali:

[0158]

Ploče: NUNC Maxisorp ploče sa 384 bunara; kat. br.464718

Proteini: Rekombinantni humani IL-12 Rβ1 Fc himera; R&D Systems; kat. br.839-B1;

test konc.0,5µg/mL

Standardna IL-12Rbeta1 antitelo; GeneTex; kat. br. GTX103917; 1mg/mL; početna test atitela: konc. 500ng/mL (zatim razblaženja 1:2)

Antitela za Uzorci: Anti-zečji IgG, Fab2fragment specifičan za vrstu povezan sa detekciju: peroksidazom (od magarca) (ECL); GE; kat. br. NA9340; test razblaženje:

Uzorci: Razblaživanje u Elisa puferu zavisi od projekta (za visoko koncentrovane IgG se preporučuje razblaženje 1:2)

Procedura:

[0159]

1. Dodajte 12,5 µL 0,5 µg/ml HER proteina u PBS u NUNC Maxisorp ploču sa 384 bunara i inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi.

2. Isperite 3x puferom za ispiranje.

3. Dodajte pufer za blokiranje od 90 µl u svaki bunar i inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi.

4. Isperite 3x puferom za ispiranje. Ploče se mogu zamrznuti na nekoliko nedelja na -20°C zapečaćene aluminijumskom folijom.

5. Dodajte standardno antitelo od 12,5 µL u razblaženja 1:2 ili uzorak razblažen u ELISA puferu i inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi (zamrznute ploče treba odmrznuti neposredno pre primene uzorka).

6. Isperite 3x puferom za ispiranje.

7. Dodajte 12,5 µL 1:5000 POD-antitelo u Elisa pufer i inkubirajte 1 sat na sobnoj temeperaturi.

8. Isperite 6x puferom za ispiranje.

9. Dodajte 15 µl TMB.

10. Dodajte 15 µL HCl nakon dovoljnog razvoja (zavisno od projekta; test IL12 nije kraći od drugih testova).

11. Očitajte apsorbanciju na 450nm/620nm.

Primer 8: Analiza vezivanja ćelija

[0160] Ćelije A549 i NIH-3T3 su kultivisane u DMEM 10% FCS. HEK-293 ćelije su kultivisane u DMEM 15% FCS i SK-MEL-30 u RPMI 10% FBS. Ćelije su sakupljene korišćenjem Accumax (Sigma), isprane sa PBS i resuspendovane u puferu za mrlje (BD Pharmingen). Anti-IL-1R3 antitela su inkubirana sa ćelijama u puferu za mrlje 30 minuta na 4°C u koncentraciji od 10 µg/ml. Za EC50 SK-MEL-30 analizu vezivanja ćelija, ćelije su inkubirane u seriji razblaženja 1:2 počevši od 20 µg/ml. Ćelije su isprane puferom za mrlje i inkubirane sa Alexa-488 označenim kozjim-anti-humanim sekundarnim antitelima (Dianova) tokom 30 minuta na 4°C. Ćelije su isprane puferom za mrlje i resuspendovane u puferu koji sadrži 1:100 razblaženu DRAQ7 (Abcam) mrlju mrtvih ćelija. Ćelije su analizirane pomoću BD Accuri C6 protočnog citometra. Izračunavanje krive uklapanja i EC50 izvršeno je pomoću programa Excel (Microsoft) i XLfit (IDBS).

Primer 9: Biohemijski ELISA test humanog-IL-1R3

[0161] NUNC Maxisorp ploče sa 384 bunara su obložene rekombinantnim Fc-označenim hIL-1R3 (Ser21-Glu359) u koncentraciji od 0,25 µg/ml u PBS tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane tri puta sa puferom za pranje (PBS 0,1% Tween) i blokirane sa PBS, 0,2% BSA, 0,05% Tween tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon tri ispiranja puferom za ispiranje, antitela su dodata u ELISA pufer (PBS, 0,5% BSA, 0,05% Tween) u koncentracijama u rasponu od 6 do 0,03 µg/ml (serija razblaženja 1:3) i inkubirana su 60 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane tri puta puferom za ispiranje, nakon čega je usledila inkubacija sa anti-humanim-IgG peroksidazom vezanim, specifičnim za vrstu F(ab)2 fragmentom (koza, AbD Serotec) u razblaženju od 1:5000 u ELISA puferu tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane šest puta puferom za ispiranje pre dodavanja rastvora supstrata TMB (Invitrogen, 15 µl/bunar). Nakon 5 minuta inkubacije, dodat je stop rastvor (1M HCl, 15 µl/bunar) i izmerena je apsorbancija (450nm/620nm) pomoću čitača ploča Tecan M1000. Krive uklapanja i proračun EC50 urađeni su pomoću programa Excel (Microsoft) i XLfit (IDBS).

Primer 10: Funkcionalni neutralizacioni test IL-1α i IL-1β

[0162] A-549-NFκB-RE-Luc (Signoza) kultivisani su u DMEM, 10% FCS, 1% Pen/Strep tokom 5 dana pre nego što su zasejani u bele, polistirenske mikroploče tretirane kulturom tkiva sa 384 bunara sa ravnim dnom, pri gustini ćelija od 40.000 ćelija/bunar u medijumu od 25 µl. Ćelije su inkubirane preko noći na 37°C/5% CO2. Medijum je uklonjen aspiracijom i monoklonska ili poliklonska (kozji-anti-humani-IL-1R3, AF676, R&D Systems) antitela dodata u različitim koncentracijama u zapremini medijuma od 10 µl i inkubirana 60 minuta na 37°C/5% CO2. Rekombinantni humani IL-1α ili IL-1β (R&D Systems) proteini su dodati u medijum od 10 µl do konačne koncentracije od 0,1 ng/ml i ploče su inkubirane 5 sati na 37°C/5% CO2. 20µl Steady-Glo<™>(Promega) rastvora je dodato u svaki bunar, temeljno promešano i ploče su inkubirane 10 minuta na sobnoj temperaturi pre nego što je luminiscencija izmerena pomoću Tecan M1000 čitača ploča. Krive uklapanja i proračun EC50 urađeni su pomoću programa Excel (Microsoft) i XLfit (IDBS).

Primer 11: Funkcionalni neutralizacioni test IL-1α i IL-1β- Test oslobađanja IL6 A-549

[0163] A549 ćelije su zasejane pri gustini od 6.000 ćelija/bunar u medijumu od 25 µl u prozirnim pločama tretiranim ćelijskom kulturom sa 384 bunara (Corning) u DMEM, 10% FCS, 1% Pen/Strep. Ćelije su inkubirane preko noći na 37°C/5% CO2. Medijum je uklonjen aspiracijom i dodata su monoklonska ili poliklonska (kozji-anti-humani-IL-1R3, AF676, R&D Systems) antitela u različitim koncentracijama u zapremini od 12,5 µl medijuma i inkubirana tri sata na 37°C/5% CO2. Rekombinantni humani IL-1α ili IL-1β (R&D Systems) proteini su dodati u medijum od 12,5 µl do konačne koncentracije od 0,1 ng/ml i ploče su inkubirane 48 sati na 37°C/5% CO2. Nivoi izlučenog humanog IL-6 u ćelijskom supernatantu mereni su pomoću DuoSet humanog IL-6 ELISA kompleta (R&D Systems, kat. br. DY206-05) prema uputstvu proizvođača. Krive uklapanja i proračun EC50 urađeni su pomoću programa Excel (Microsoft) i XLfit (IDBS).

Primer 12: Test funkcionalne neutralizacije IL-33

[0164] HEK-Blue<™>IL-33 ćelije (InvivoGen) su kultivisane u DMEM, 10% FCS tokom 5 dana pre nego što su zasejane u mikroploče tretirane ćelijskom kulturom sa 384 bunara sa ravnim dnom (Corning) pri gustini ćelija od 25.000 ćelija po bunaru u medijumu od 15 µl. Različite koncentracije monoklonskih ili poliklonalnih (kozji-anti-humani-IL-1R3, AF676, R&D Systems) antitela su dodate u zapremini od 5 µl medijuma i ploče su inkubirane 60 minuta na 37°C/5% CO2. Rekombinantni humani IL-33 (R&D Systems) protein je dodat u medijum od 5 µl do konačne koncentracije od 5 ng/ml i ploče su inkubirane preko noći na 37°C/5% CO2. Supernatanti ćelija od 5 µl preneti su u prozirne, polistirenske NBS<™>mikroploče sa ravnim dnom (Corning) koje sadrže 20 µl 2xQUANTI-plavog reagensa (InvivoGen). Ploče su inkubirane na 37°C 45 minuta i optička gustina je izmerena na 655 nm pomoću čitača ploča Tecan M1000. Krive uklapanja i proračun EC50 urađeni su pomoću programa Excel (Microsoft) i XLfit (IDBS).

Primer 13: Test funkcionalne neutralizacije IL-36

[0165] HEK293/17-IF ćelije (MAB Discovery GmbH) su kultivisane u DMEM, 10% FCS, 20 µg/ml higromicina tokom 5 dana pre nego što su zasejane u bele ploče tretirane ćelijskom kulturom sa 384 bunara sa ravnim dnom (Corning) pri gustini ćelija od 30.000 ćelija/bunar u medijumu od 20 µl. Ćelije su inkubirane preko noći na 37°C/5% CO2. Medijum je uklonjen aspiracijom i dodate su različite koncentracije monoklonskih ili poliklonalnih (kozji-antihumani-IL-1R3, AF676, R&D Systems) antitela u zapremini od 10 µl medijuma. Ploče su inkubirane 60 minuta na 37°C/5% CO2. Rekombinantni humani IL-36g (R&D Systems) protein dodat je u medijum od 10 µl do konačne koncentracije od 15 ng/ml i ploče su inkubirane 5 sati na 37°C/5% CO2. 20µl Steady-Glo<™>(Promega) rastvora je dodato u svaki bunar, temeljno promešano i ploče su inkubirane 10 minuta na sobnoj temperaturi pre nego što je luminiscencija očitana pomoću čitača ploča Tecan M1000. Krive uklapanja i proračun EC50 urađeni su pomoću programa Excel (Microsoft) i XLfit (IDBS).

Primer 14: Neutralizacija IL-1α, IL-33 i IL-36α

[0166] Funkcije anti-IL-1R3 antitela su testirane na tri različite ćelijske linije sa IL-1α, IL-33 ili IL-36α da bi se utvrdio uticaj na signalne puteve koji uključuju tri IL-1 receptora (IL-1R1, -R4 ili -R6) zavisno od IL-1R3 za signalizaciju.

[0167] Humana epitelna ćelijska linija pluća A549 je stimulisana IL-1α kao model bolesti zavisnih od IL-1, kao što su autoinflamatorne bolesti. Ćelijska linija je kultivisana u T75 tikvicama (37°C, 5% CO2) u kompletnom F-12K medijumu (10%FCS, 1% Pen/Strep) i podeljena u proseku 2 puta nedeljno, ne prelazeći 15 pasaža pre ispitivanja. A549 ćelije su zasejane (50,000/bunar) u ploče sa 96 bunara sa ravnim dnom, mirovane 3 sata pre predinkubacije 1 sat sa MAB-16-0030 (20 µg/ml - 1 µg/ml) ili IL-1Ra (10 µg/ml). Ćelije su zatim stimulisane rekombinantnim humanim IL-1α (50pg/ml, Peprotech) tokom 24 sata pre sakupljanja supernatanata i testiranja proizvodnje IL-6 (Duoset ELISA, RnD Systems).

[0168] Humana linija mastocita (HMC-1) je istražena za indukciju proizvodnje IL-8 zavisnu od IL-33. Ćelijska linija je kultivisana u T75 tikvicama (37°C, 5% CO2) u kompletnom Iscove modifikovanom Dulbeccos medijumu (IMDM, 10%FCS, 1% Pen/Strep) i podeljena u proseku 3 puta nedeljno, bez gustine ćelija iznad 2*10<6>/mL i ne prelazeći više od 15 pasaža pre testiranja. HMC-1 ćelije su zasejane (30,000/bunar) u ploče sa 96 bunara sa ravnim dnom, odmorene 3 sata pre predinkubacije 1 sat sa MAB-16-0030 (20 µg/ml - 1 µg/ml) ili IL-1Ra (10 µg/ml). Ćelije su zatim stimulisane rekombinantnim humanim IL-33 (20ng/ml, RnD systems) tokom 24 sata pre sakupljanja supernatanata i testiranja za proizvodnju IL-8 (Duoset ELISA, RnD Systems).

[0169] Uticaj na signalizaciju IL-36 istražen je korišćenjem humane keratinocitne ćelijske linije (HaCaT). Ćelijska linija je kultivisana u T75 tikvicama (37°C, 5% CO2) u kompletnom DMEM (10%FCS, 1% Pen/Strep) i podeljena u proseku 3 puta nedeljno ne prelazeći više od 15 pasaža pre testiranja. HaCaT ćelije su zasejane (50,000/bunar) u ploču sa 96 bunara sa ravnim dnom, odmorene 3 sata pre predinkubacije 1 sat sa MAB-16-0030 (20 µg/ml - 1 µg/ml) ili IL-1Ra (10 µg/ml). Ćelije su zatim stimulisane rekombinantnim humanim IL-36α (50ng/ml, RnD systems) tokom 24 sata pre sakupljanja supernatanata i testiranja za proizvodnju IL-8 (Duoset ELISA, RnD systems).

Primer 15: Održivost i IL-6 oslobađanje PBMC

[0170] Uticaj anti-hIL-1R3 antitela MAB-16-0030 na održivost nestimulisanih PBMC (500,000/bunar) od tri zdrava donora testiran je konvencionalnim testom redukcije MTT. Ukratko, PBMC (200 µL) su inkubirani samo medijumom ili MAB-16-0030 (20 µg/ml). Nakon 24 sata, 3 i 5 dana, PBMC su inkubirani 2 sata sa MTT (20 µL), pre merenja apsorbancije na 570nM na ELISA čitaču. Koristeći poznatu linearnost između apsorbancije i vijabilnih ćelija koje konvertuju MTT, broj vijabilnih ćelija je izračunat samo pomoću medijuma kao kontrolnog podešenog na 100%. Istog dana MTT analize, supernatanti iz PBMC inkubiranih pod istim uslovima i od istih donora, sakupljeni su i naknadno testirani za proizvodnju IL-6 (Duoset Elisa, RnD systems) kako bi se procenio svaki mogući stimulativni efekat samog MAB-16-0030.

Primer 16: Funkcionalna blokada PBMC

[0171] Sveže izolovani PBMC od zdravih donora korišćeni su za procenu uticaja MAB-16-0030 na humane ćelije stimulisane različitim antigenima. Za sve stimulanse, eksperimenti su sprovedeni korišćenjem 500,000 PBMC/bunar, stimulišući u ukupnoj zapremini od 200 µL. Ćelije su zasejane i inkubirane ili samo medijumom, MAB-16-0030 (20 - 0,1 µg/ml) ili IL-1Ra (10 µg/ml) tokom 1 sata pre stimulacije. Korišćeni su sledeći stimulansi; LPS (10ng/ml, 24 sata, RPMI bez FCS), antihumani CD3/CD28 (1,25µg/ml; 0,5 µg/ml (eBioscience) 3 dana, RPMI 10%FCS), IL-12 /-33 (2ng/ml; 20ng/ml (Peprotech;RnD Systems)), 3 dana, RPMI 10%FCS) ili toplotno inaktivirana Candida albicans (0,5*10<6>/ml, 5 dana, RPMI 10%FCS). Nakon stimulacije, supernatanti su sakupljeni i testirani za proizvodnju citokina korišćenjem Duoset Elisa (RnD Systems) u skladu sa protokolom proizvođača.

Primer 17: Funkcionalna blokada imunih ćelija u punoj krvi

[0172] Toplotno inaktivirana Candida albicans korišćena je za stimulaciju pune krvi. Sveže sakupljena krv zdravih donora (EDTA epruvete) distribuirana je u epruvetama za mikrocentrifugu (250 µL/ epruveta) i prethodno inkubirana samo medijumom (RPMI, bez FCS), MAB-16-0030 (20- 0,1 µg/ml) ili IL-1Ra (10 µg/ml) tokom 1 sata pre stimulacije sa Candida albicans (0,5*10<6>/mL) do konačne zapremine od 1ml. Nakon inkubacije od 24 sata (37°C, 5% CO2), supernatanti su sakupljeni i testirani za proizvodnju citokina pomoću ELISA testa (Duoset, RnD Systems).

Primer 18: Reakcije mešovitih limfocita (MLR)

[0173] PBMC zdravih, nepodudarnih donora pomešani su u odnosu 1:1 (250.000 /donator) i inkubirani 5 dana (RPMI, 10%FCS) samo sa MAB-16-0030 (201 µg/ml) ili IL-1Ra (10 µg/ml). Proizvodnja citokina je testirana korišćenjem Quansys multipleks platforme u skladu sa protokolom proizvođača.

Legenda slika

[0174]

Sl. 1: Sekvence (aminokiseline u jednoslovnom kodu)

Kompletne sekvence varijabilnih regiona (VR):

Teški lanac: VH komp

Laki lanac: VL kompl

Komplementarne determinantne regije (CDR):

Konstantne regije (CR):

Laki lanac: 171

Teški lanac: 172

Na sledećim slikama, AF676 je komercijalni preparat poliklonskog antitela kupljen preko sledećeg linka: https://www.rndsystems.com/products/human-il-1-racp-il-1-r3-antibody af676

Sl. 2: Humani IL-1R3 ELISA

Mikrotiterska ploča sa 384 bunara je obložena humanim proteinom Il-1R3 koji predstavlja humani ekstracelularni domen IL-1R3 (0,5 mg/ml, najmanje 1 sat). Nakon intenzivnog koraka ispiranja praćenog korakom blokiranja, dodata su antitela (12,5 µl po bunaru) i inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Nevezano antitelo je intenzivno isprano. Količina vezanog antitela je identifikovana inkubacijom mikrotiterske ploče sa anti-humanim antitelima označenim peroksidazom (1 sat na sobnoj temperaturi). Reakcija peroksidaze započeta je dodavanjem TMB i merenjem apsorbancije na 450nm/620 nm.

Da bi se osiguralo vezivanje specifično za humani IL-1R3, paralelno je izveden kontra skrining koji koristi protein IL12 sa identičnim karakteristikama. Postavka testa je bila identična kao što je gore opisano. Supernatanti B-ćelija koji se vezuju za humani IL-1R3, ali ne i za IL12, smatraju se aktivnim.

Sl. 3: HEK293 reporter test

HEK293T/17-FR ćelije su bile stabilno transficirane sa pGL4.32[Iuc2P/NF-κB-RE/Hygro] vektorom (Promega) i zasejane u PDL Costar ploče za ćelijske kulture sa 384 bunara, nakon čega je usledila 30-minutna inkubacija sa antitelima. Ćelije su zatim stimulisane IL-1β tokom 5 sati pre nego što je aktivnost NF-kB određena korišćenjem Steady-Glo test kompleta za luciferazu (Promega) u skladu sa protokolom proizvođača.

Sl. 4: NFκB test reporter luciferaze korišćenjem stabilne ćelijske linije A549

A549-NFkB-RE-Luc stabilne transficirane ćelije (kupljene od Signosis) su kultivisane 3 dana (1.7E 04 ćelije/cm<3>). TC-tretirane, plitke, bele, polistirenske mikroploče sa 384 bunara sa ravnim dnom (Corning), napunjene su sa 4×10<4>ćelija po bunaru. Nakon perioda kultivacije od 10 sati, ćelije su inkubirane antitelima 1 sat pre nego što su ćelije stimulisane sa 10 µl IL-1β još 5 sati. NFkB modulacija je izmerena pomoću Steady-Glo<™>test sistema za luciferazu (Promega) određivanjem relativnih jedinica luminiscencije svakog bunara u odnosu na nestimulisane ćelije.

Sl. 5: Analiza vezivanja ćelija: vezivanje za ćelije koje eksprimiraju IL-1R3

Humanizovana anti-lL-1R3 IgG1-LALA antitela su testirana na vezivanje za ćelijske linije sa različitim gustinama IL-1R3 receptora pomoću protočne citometrije. Humanizovana anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitela se vezuju za ćelijske linije sa niskom i visokom ekspresijom IL-1R3. Antitela se ne vezuju za NIH-3T3 ćelije miša. Eksperimenti su sprovedeni prema metodi opisanoj u primeru 8.

Sl. 6: Analiza vezivanja ćelija: Vezivanje ćelija na ćelijskoj liniji visoke ekspresije humanog IL-1R3 SK-MEL-30

Vrednosti vezivanja ćelija EC50 humanizovanih anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitela određene su vezivanjem za ćelijsku liniju sa visokom ekspresijom IL-1R3 SK-MEL-30 pomoću protočne citometrije. Humanizovana anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitela MAB-16-0030 i MAB-16-0149 pokazuju vezivanje ćelija od 307 i 306 ng/ml, respektivno. Eksperimenti su sprovedeni prema metodi opisanoj u primeru 8.

Sl. 7: Biohemijski ELISA test humanog-IL-1R3

Vezivanje humanizovanih anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitela na rekombinantni humani IL-1R3 protein testirano je biohemijskim ELISA testom. Primeri antitela pokazuju vrednosti vezivanja EC50 od 16,3ng/ml i 29,1ng/ml, respektivno. Eksperimenti su sprovedeni prema metodi opisanoj u primeru 9.

Sl. 8: Inhibicija signalizacije NfKB posredovane humanim IL-1a i IL-1b u ćelijama A549-NFkB-RE-Luc

Funkcionalna neutralizacija IL-1a i IL-1b je testirana u testu reporter gena zasnovanom na ćelijama koristeći A549-NFkB-RE-Luc ćelije stimulisane sa 0,1 ng/ml IL-1a i IL-1b, respektivno. Humanizovana anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitela pokazuju vrednosti EC50 superiorne u odnosu na gooveđe-anti-humano-IL1-R3 poliklonsko antitelo AF676 (R&D Systems). Eksperimenti su sprovedeni prema metodi opisanoj u primeru 10.

Sl. 9: Funkcionalni neutralizacioni test IL-1α i IL-1β - Inhibicija oslobađanja IL-6 posredovanog humanim IL-1a i IL-1b od strane ćelija A-549

Neutralizacija IL-1a i IL-1b posredovanog ćelijskog oslobađanja IL-6 humanizovanim anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitelima testirana je pomoću A-549 ćelija. Vrednosti EC50 pokazuju da su humanizovana anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitela superiorna u odnosu na gooveđe-antihumano-IL1-R3 poliklonsko antitelo AF676 (R&D Systems). Eksperimenti su sprovedeni prema metodi opisanoj u primeru 11.

Sl. 10: Test funkcionalne neutralizacije IL-33 - Inhibicija humane NfkB signalizacije posredovane IL-33 u HEK-Blue-IL33<™>ćelijama

Neutralizacija ćelijske signalizacije posredovane IL-33 humanizovanim anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitelima testirana je pomoću IL-33 stimulisanog reporter gena HEK-Blue-IL33<™>ćelija (InvivoGen). Vrednosti EC50 pokazuju da su humanizovana anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitela superiorna u odnosu na gooveđe-anti-humano-IL1-R3 poliklonsko antitelo AF676 (R&D Systems). Eksperimenti su sprovedeni prema metodi opisanoj u primeru 12.

Sl. 11: IL-36 funkcionalni neutralizacioni test - Inhibicija humane IL-36 posredovane NfkB signalizacije u HEK-293/17-IF ćelijama

Neutralizacija ćelijske signalizacije posredovane IL-36 humanizovanim anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitelima testirana je pomoću IL-36g stimulisanog reporter gena HEK-293/17-IF ćelija. Tipična humanizovana anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitela pokazuju vrednosti EC50 superiorne u odnosu na gooveđe-anti-humano-IL1-R3 poliklonsko antitelo AF676 (R&D Systems). Eksperimenti su sprovedeni prema metodi opisanoj u primeru 13.

Sl. 12: Neutralizacija oslobađanja ćelijskih citokina posredovano IL-1a, IL-33 i IL-36a Neutralizacija oslobađanja ćelijskih citokina posredovanih IL-1a, IL-33 i IL-36a testirana je pomoću specifičnih ćelijskih sistema zavisnih od IL-1a, IL-33 i IL-36a. Inhibicija oslobađanja citokina od strane reprezentativnog humanizovanog anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitela prema pronalasku (MAB-16-0030) je testirana i upoređena sa IL-1Ra. Dok je antitelo prema pronalasku uspelo da inhibira oslobađanje citokina posredovano sa sva tri stimulansa, IL-1Ra je uticao samo na oslobađanje citokina posredovano IL-1a. Eksperimenti su sprovedeni prema metodi opisanoj u primeru 14.

Sl. 13: Vijabilnost i IL-6 oslobađanje nestimulisanog PBMC tretiranog humanizovanim anti-IL-1R3 IgGl-LALA antitelima

Vezivanje antitela na imunološke ćelije može dovesti do iscrpljivanja ćelija i štetnih efekata, npr. direktnom indukcijom apoptotičkih signalnih puteva, stimulacijom prekomernog oslobađanja citokina ili ćelijskom citotoksičnošću zavisnom od antitela (ADCC). Da bi se isključilo da humanizovana anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitela direktno utiču na održivost PBMC, ispitivana je održivost PBMC tri donora i oslobađanje IL-6 nakon inkubacije sa različitim koncentracijama reprezentativnog humanizovanog anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitela prema pronalasku (MAB-16-0030) tokom 1,3 i 5 dana. MAB-16-0030 nije uticao ni na održivost ni na oslobađanje IL-6. Ovi rezultati potvrđuju da humanizovana anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitela blokiraju funkciju IL-1R3 na imunološkim ćelijama bez posrednog iscrpljivanja ćelija i indukcije ćelijskih štetnih efekata. Eksperimenti su sprovedeni prema metodi opisanoj u primeru 15.

Sl. 14: Funkcionalna blokada PBMC aktivirana različitim stimulansima

Da bi se testiralo da li humanizovana anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitela inhibiraju aktivaciju PBMC stimulisanih specifičnim ili kompleksnim stimulansima, PBMC 10 donora su stimulisani sa LPS, toplotno inaktiviranom Candida albicans, IL-12/IL-33 ili anti-CD3/CD28 antitelima. Reprezentativno humanizovano anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitelo prema pronalasku uspelo je da inhibira oslobađanje citokina posredovano svim testiranim stimulansima. Eksperimenti su sprovedeni prema metodi opisanoj u primeru 16.

Sl. 15: Funkcionalna blokada imunoloških ćelija u punoj krvi aktivirana sa Candida albicans

Da bi se testiralo da li humanizovana anti-lL-1R3 IgG1-LALA antitela inhibiraju aktivaciju imunih ćelija u punoj krvi, puna krv 8 donora je stimulisana toplotno inaktiviranom Candida albicans. Reprezentativno humanizovano anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitelo prema pronalasku prikazanom na slici, bilo je u stanju da inhibira otpuštanje IL-6 citokina izazvanog kandidom. Eksperimenti su sprovedeni prema metodi opisanoj u primeru 17.

Sl. 16: Blokada oslobađanja citokina u mešovitim reakcijama limfocita (MLR)

Sposobnost humanizovanih anti-lL-1R3 IgG1-LALA antitela da blokiraju oslobađanje različitih citokina testirana je u reakcijama mešovitih limfocita (MLR) koristeći PBMC zdravih, neuporedivih donora. Reprezentativno humanizovano anti-IL-1R3 IgG1-LALA antitelo prema pronalasku prikazanom na slici bilo je u stanju da inhibira oslobađanje IFNg, IL-6, TNF-a, IL-13, IL-17 i IL-10. Eksperimenti su sprovedeni prema metodi opisanoj u primeru 18.

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-1R3 ili njegov fragment ili derivat koji sadrži najmanje deo navedenog antitela koji je dovoljan da pruži specifičnost vezivanja IL-1R3, pri čemu se antitelo, fragment antitela ili derivat antitela sastoji od tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca izabrana iz grupe koja se sastoji od

(1) CDR1H prema SEQ ID NO: 77, CDR2H prema SEQ ID NO: 94, CDR3H prema SEQ ID NO: 111, CDR1L prema SEQ ID NO: 128, CDR2L prema SEQ ID NO: 145, i CDR3L prema SEQ ID NO: 162,

(2) CDR1H prema SEQ ID NO: 79, CDR2H prema SEQ ID NO: 96, CDR3H prema SEQ ID NO: 113, CDR1L prema SEQ ID NO: 130, CDR2L prema SEQ ID NO: 147, i CDR3L prema SEQ ID NO: 175, i

(3) CDR1H prema SEQ ID NO: 81, CDR2H prema SEQ ID NO: 98, CDR3H prema SEQ ID NO: 115, CDR1L prema SEQ ID NO: 132, CDR2L prema SEQ ID NO: 149, i CDR3L prema SEQ ID NO: 166.

2. Humanizovano antitelo prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo, fragment antitela ili derivat antitela obuhvata varijabilni region teškog lanca (VH) koji je najmanje 90% identičan regionu VH izabranom iz grupe koja se sastoji od

(1) VH regiona prema SEQ ID NO: 26,

(2) VH regiona prema SEQ ID NO: 28, i

(3) VH regiona prema SEQ ID NO: 30;

pri čemu antitelo, fragment antitela ili derivat antitela dalje obuhvata varijabilni region lakog lanca (VL) koji je najmanje 90% identičan regionu VL izabranom iz grupe koja se sastoji od (1) VL regiona prema SEQ ID NO: 60,

(2) VL regiona prema SEQ ID NO: 174, i

(3) VL regiona prema SEQ ID NO: 64.

3. Humanizovano antitelo, fragment antitela ili derivat antitela prema patentnom zahtevu 2, pri čemu antitelo obuhvata varijabilni region teškog lanca (VH) koji se sastoji od sekvence aminokiselina izabrane iz grupe koja se sastoji od

(1) VH regiona prema SEQ ID NO: 26,

(2) VH regiona prema SEQ ID NO: 28, i

(3) VH regiona prema SEQ ID NO: 30.

4. Humanizovano antitelo, fragment antitela ili derivat antitela prema patentnim zahtevima 2 ili 3, pri čemu antitelo obuhvata varijabilni region lakog lanca (VL) koji se sastoji od sekvence aminokiselina izabrane iz grupe koja se sastoji od

(1) VL regiona prema SEQ ID NO: 60,

(2) VL regiona prema SEQ ID NO: 174, i

(3) VL regiona prema SEQ ID NO: 64.

5. Humanizovano antitelo, fragment antitela ili derivat antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, pri čemu se humanizovano antitelo, fragment antitela ili derivat antitela sastoji od tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca izabrana između CDR1H prema SEQ ID NO: 79, CDR2H prema SEQ ID NO: 96, CDR3H prema SEQ ID NO: 113, CDR1L prema SEQ ID NO: 130, CDR2L prema SEQ ID NO: 147, i CDR3L prema SEQ ID NO: 175, poželjno se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (VL) koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 174 i varijabilnog regiona teškog lanca (VH) koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:28.

6. Humanizovano antitelo, fragment antitela ili derivat antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 koji inhibira (i) IL-1R3 indukovanu NFkB aktivnost, (ii) IL-1alfa, IL-1beta, IL-33 i/ili IL-36 stimulisanu NFkB aktivnost i/ili (iii) NFkB aktivnost stimulisanu kompleksom izabranim iz grupe koja se sastoji od IL-1β/IL-1R1/IL-1RAcP, IL-1α/IL-1R1/IL-1RAcP IL-33/ST2/IL-1RAcP i/ili IL-36/Il-36R/IL-1RAcP.

7. Humanizovano antitelo, fragment antitela ili derivat antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu navedeno antitelo inhibira u koncentraciji od 10 µg/ml ekspresije NFkB u A549-NFkB-RE-Luc ćelijskim lizatima stimulisanim sa 0,1 ng/ml humanog IL-1alfa, humanog IL-1beta, IL-33 i/ili IL-36, za 50% ili više, poželjno za 60% ili više, poželjno za 70% ili više, poželjno za 80% ili više, poželjno za 90% i više, i poželjnije za 95% ili više, u vezi sa istim testom bez navedenog antitela.

8. Humanizovano antitelo, fragment antitela ili derivat antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu navedeno antitelo inhibira IL-1alfa, IL-1beta, IL-33 i/ili IL-36, respektivno, stimulisalo je aktivnost luciferaze u HEK293T/17 ćelijama transficiranim luciferazom pod kontrolom reporter gena NF-kB.

9. Humanizovano antitelo, fragment antitela ili derivat antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu navedeno antitelo sadrži najmanje supstitucije aminokiselina na L234A i L235A humanog IgG1 Fc regiona ili S228P i L235E humanog IgG4 Fc regiona.

10. Humanizovano antitelo, fragment antitela ili derivat antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, pri čemu je antitelo humanizovano IgG1LALAantitelo.

11. Humanizovano antitelo, fragment antitela ili derivat antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, pri čemu je antitelo IgG4 antitelo.

12. Humanizovano antitelo, fragment antitela ili derivat antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva za upotrebu u tretmanu bolesti posredovane IL-1R3, posebno bolesti posredovane IL-1R3 izabrane iz grupe koja se sastoji od karcinoma pluća, karcinoma nemalih ćelija pluća (NSCL), karcinoma bronhioloalviolarnih ćelija pluća, karcinoma kostiju, karcinoma pankreasa, karcinoma kože, karcinoma glave ili vrata, kožnog ili intraokularnog melanoma, karcinoma materice, karcinoma jajnika, karcinoma rektuma, karcinoma analnog regiona, karcinoma stomaka, karcinoma želuca, karcinoma debelog creva, karcinoma dojke i karcinoma materice.

13. Farmaceutska kompozicija koja se sastoji od farmaceutski prihvatljivog nosača i terapeutske efikasne količine antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11.

14. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 13 za upotrebu u tretmanu bolesti posredovane IL-1R3, posebno bolesti posredovane IL-1R3 izabrane iz grupe koja se sastoji od karcinoma pluća, karcinoma pluća nemalih ćelija (NSCL), karcinoma pluća bronhioloalviolarnih ćelija, karcinoma kostiju, karcinoma pankreasa, karcinoma kože, karcinoma glave ili vrata, kožnog ili intraokularnog melanoma, karcinoma materice, karcinoma jajnika, karcinoma rektuma, karcinoma analnog regiona, karcinoma stomaka, karcinoma želuca, karcinoma debelog creva, karcinoma dojke i karcinoma materice.

15. Humanizovano antitelo, fragment antitela ili derivat antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 13 za upotrebu u tretmanu karcinoma u kombinaciji sa jednim ili više citotoksičnih, citostatskih ili ciljanih jedinjenja protiv karcinoma.