RS65893B1 - Pneumokokni polisaharidi i njihova primena u imunogenim konjugatima polisaharid-proteinski nosač - Google Patents

Pneumokokni polisaharidi i njihova primena u imunogenim konjugatima polisaharid-proteinski nosač

Info

Publication number
RS65893B1
RS65893B1 RS20240956A RSP20240956A RS65893B1 RS 65893 B1 RS65893 B1 RS 65893B1 RS 20240956 A RS20240956 A RS 20240956A RS P20240956 A RSP20240956 A RS P20240956A RS 65893 B1 RS65893 B1 RS 65893B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
polysaccharide
kda
protein
pneumococcal
protein carrier
Prior art date
Application number
RS20240956A
Other languages
English (en)
Inventor
Richard J Porambo
Chitrananda Abeygunawardana
Luwy Kavuka Musey
Michael J Kosinski
Yadong Adam Cui
Patrick Mchugh
Janelle Konietzko
Original Assignee
Merck Sharp & Dohme Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=65634964&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS65893(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Merck Sharp & Dohme Llc filed Critical Merck Sharp & Dohme Llc
Publication of RS65893B1 publication Critical patent/RS65893B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak obezbeđuje konjugat polisaharid-proteinski nosač koji ima polisaharide iz serotipa 24F Streptococcus pneumoniae. Konjugati polisaharid-protein iz ovog serotipa mogu biti uključeni u multivalentne pneumokokne konjugovane vakcine.
STANJE TEHNIKE PRONALASKA
[0002] Streptococcus pneumoniae, jedan primer inkapsulirane bakterije, značajan je uzrok ozbiljne bolesti širom sveta.1997, Centeri za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC) procenili su da je bilo 3,000 slučajeva pneumokoknog meningitisa, 50,000 slučajeva pneumokokne bakterijemije, 7,000,000 slučajeva pneumokokne upale srednjeg uha i 500,000 slučajeva pneumokokne pneumonije godišnje u Sjedinjenim Državama. Videti izveštaj Centara za kontrolu i prevenciju bolesti, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1997, 46(RR-8):1-13. Štaviše, komplikacije ovih bolesti mogu biti značajne prema nekim studijama koje prijavljuju do 8% mortaliteta i 25% neuroloških posledica sa pneumokoknim meningitisom. Videti Arditi i sarad., 1998, Pediatrics 102:1087-97.
[0003] Multivalentne pneumokokne polisaharidne vakcine koje su licencirane dugi niz godina, pokazale su se neprocenjivim u prevenciji pneumokokne bolesti kod odraslih, posebno, kod starijih i onih sa visokoim rizikom. Međutim, odojčad i mala deca slabo reaguju na nekonjugovane pneumokokne polisaharide. Bakterijski polisaharidi su imunogeni nezavisni od T-ćelija, izazivaju slab ili nikakav odgovor kod odojčadi. Hemijska konjugacija bakterijskog polisaharidnog imunogena sa proteinskim nosačem pretvara imuni odgovor u odgovor zavisan od T-ćelija kod odojčadi. Toksoid difterije (DTx, hemijski detoksifikovana verzija DT) i CRM197 su opisani kao proteinski nosači za bakterijske polisaharidne imunogene zbog prisustva epitopa koji stimulišu T-ćelije u njihovim aminokiselinskim sekvencama.
[0004] Pneumokokna konjugovana vakcina, Prevnar<®>, koja sadrži 7 najčešće izolovanih serotipova (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F i 23F) koji u jednom trenutku izazivaju invazivnu pneumokoknu bolest kod male dece i odojčadi, prvi put je licencirana u Sjedinjenim Državama u februaru 2000. Nakon univerzalne upotrebe Prevnar<®>-a u Sjedinjenim Državama došlo je do značajnog smanjenja invazivne pneumokokne bolest kod dece zbog serotipova prisutnih u Prevnar<®>-u. Videti izveštaj Centara za kontrolu i prevenciju bolesti, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005, 54(36):893-7. Međutim, sa Prevnar<®>-om postoje ograničenja u pokrivenosti serotipovima u određenim regionima sveta i neki dokazi o određenim serotipovima u nastajanju u Sjedinjenim Državama (na primer, 19A i drugi). Videti O'Brien i sarad., 2004, Am J Epidemiol 159:634-44; Whitney i sarad., 2003, N Engl J Med 348:1737-46; Kyaw i sarad., 2006, N Engl J Med 354:1455-63; Hicks i sarad., 2007, J Infect Dis 196: 1346-54; Traore i sarad., 2009, Clin Infect Dis 48:S181-S189.
[0005] Prevnar 13<®>je 13-valentna pneumokokna konjugovana vakcina polisaharid-protein koja uključuje serotipove 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F i 23F. Videti, npr., objavu američke patentne prijave sa brojem US 2006/0228380 A1, Prymula i sarad., 2006, Lancet 367:740-48 i Kieninger i sarad., Safety and Immunologic Non-inferiority of 13-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Given as a 4-Dose Series in Healthy Infants and Toddlers, predstavljeno na 48. godišnjem ICAAC/ISDA i 46. godišnjem sastanku, Vašington DC, Oktobar 25-28, 2008. Videti takođe, Dagan i sarad., 1998, Infect Immun. 66: 2093-2098 i Fattom, 1999, Vaccine 17:126.
[0006] S. pneumoniae je karakterisana u više od devedeset serotipova na osnovu strukture kapsularnog polisaharida. Lista poznatih pneumokoknih kapsularnih polisaharidnih struktura je data u Geno, 2015, Clinical Microbiology Reviews 28:871-899. Geno stavlja na uvid javnosti kapsularn polisaharid serotipa 24F S. pneumoniae.
[0007] Kamerling i sarad.,: "Pneumococcal Polysaccharides: A Chemical View", 1995, ISBN: 978-0-913113-85-1 stavlja na uvid javnosti kapsularni polisaharid serotipa 24F S. pneumoniae.
[0008] Sadašnje multivalentne pneumokokne konjugovane vakcine su efikasne u smanjenju učestalosti pneumokokne bolesti povezane sa onim serotipovima prisutnim u vakcinama. Međutim, rasprostranjenost pneumokoka koje eksprimiraju serotipove koji nisu prisutni u vakcini raste. Shodno tome, postoji potreba da se identifikuju i okarakterišu pneumokokni serotipovi u nastajanju radi uključivanja u buduće vakcine.
REZIME PRONALASKA
[0009] Predmetni pronalazak obezbeđuje konjugat polisaharid-proteinski nosač koji ima polisaharide serotipa 24F iz Streptosoccus pneumoniae. Predmetni pronalazak se delimično zasniva na strukturnoj identifikaciji kapsularnih polisaharida iz ovog serotipa.
[0010] Shodno teme, predmetni pronalazak obezbeđuje polisaharid sa sledećom jedinicom koja se ponavlja:
konjugovan sa proteinskim nosačem.
[0011] U određenim tehničkim rešenjima, polisaharid ima između 5 i 5000 ponavljajućih jedinica. U određenim aspektima, polisaharid ima između 10 i 3,000, 20 i 2,000, 50 do 1,500 ili 100 do 1,000 ponavljajućih jedinica.
[0012] U određenim tehničkim rešenjima, polisaharid ima molekulsku masu od 5 kDa do 5,000 kDa. U određenim aspektima, polisaharid ima molekulsku masu od 10 kDa do 2,000 kDa, 50 kDa do 1,500 kDa ili 100 kDa do 1,000 kDa.
[0013] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje aktivirane polisaharide dobijene prema bilo kom od prethodnih tehničkih rešenja gde se polisaharid aktivira hemijskim reagensom da bi se proizvele reaktivne grupe za konjugaciju sa linkerom ili proteinskim nosačem. U određenim tehničkim rešenjima, aktivacija se dešava na arabinitolu-1-PO4. U određenim tehničkim rešenjima, polisaharid se aktivira perjodatom. U određenim aspektima ovog tehničkog rešanje, aktivacija se dešava na ugljeniku na položaju 2 arabinitola-1-PO4.
[0014] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje konjugate polisaharid-protein u kojima su polisaharidi ili aktivirani polisaharidi kao što je prethodno predviđeno konjugovani sa proteinskim nosačem. U određenim aspektima, proteinski nosač se bira od CRM197, fragmenta B toksina difterije (DTFB), DTFB C8, toksoida difterije (DT), tetanus toksoida (TT), fragmenta C od TT, toksoida pertusisa, toksoida kolere, LT E. coli, ST E. coli i egzotoksina A iz Pseudomonas aeruginosa. U jednom specifičnom aspektu, proteinski nosač je CRM197.
[0015] U određenim aspektima, konjugati polisaharid-protein se dobijaju primenom hemizma reduktivne aminacije u vodenim uslovima ili u aprotičnom rastvaraču kao što je dimetil sulfoksid (DMSO). U specifičnom aspektu, konjugati polisaharid-protein se dobijaju primenom hemije reduktivne aminacije u DMSO-u.
[0016] Ovde je takođe opisana multivalenta imunogena kompozicija koja sadrži nekonjugovane polisaharide ili konjugate polisaharid-protein iz serotipa 24F Streptococcus pneumoniae, i nekonjugovane polisaharide ili konjugate polisaharid-protein od jednog ili više serotipa 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18B, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24B, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F i 38 Streptococcus pneumoniae. Multivalenta imunogena kompozicija može da sadrži nekonjugovane polisaharide ili konjugate polisaharid-proteinski nosač, ali ne i spoj oba. Multivalenta imunogena kompozicija može da sadrži smešu nekonjugovanih polisaharida ili konjugata polisaharidproteinski nosač. Multivalentna imunogena kompozicija može imati do 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ili 90 serotipova.
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
[0017]
Slike 1A-B prikazuju grafički prikaz ponavljajuće jedinice strukture A) polisaharida serotipa 24F S. pneumoniae; i B) perjodatom aktivirane ponavljajuće strukture serotipa 24F S. pneumoniae. Imajte na umu da struktura prikazana na slici 1B treba da pokaže preovlađujuće aktivno mesto (kao aktivirani saharid). Unutar polisaharidnog lanca, nije neophodno da se sve ponavljajuće jedinice aktiviraju kao što je prikazano na Slsci 1B.
Slika 2 prikazuje jedno-dimenzionalni 1H NMR spektar na 600 MHz kapsularnog polisaharida iz serotipa 24F u S. pneumoniae D2O na 50°C. Označeni su signali koji proizilaze iz internih standarda (DMSO i DSS-d6), rezidualne vode (HOD) i drugih preostalih komponenti iz procesa prečišćavanja; etanola (EtOH), izopropanola (IPA) i acetata. Manji signali označeni sa * su posledica ostataka ćelijskog zida S. pneumoniae kao što su C-polisaharid i/ili peptidoglikani.
Slika 3 prikazuje jednodimenzionalni (1D)<1>H NMR region identiteta koji će se koristiti za identifikacije serotipa 24F S. pneumoniae. Označeni su položaji signala svakog anomernog protona ponavljajuće jedinice iz svakog ostatka monosaharida.
Slika 4 prikazuje delimični dvodimenzionalni (2D)<1>H -<13>C NMR spektar korelacije višestrukih veza za serotip 24F S. pneumoniae koji uspostavlja kovalentne veze između ostataka šećera u strukturi koja se ponavlja. Na slici su označene korelacije koje uspostavljaju glikozidne veze. Slika 5 prikazuje uspostavljanje fosfodiestarskih veza u kapsularnoj polisaharidnoj ponavljajućoj jedinici serotipa 24F S. pneumoniae.
Slika 6 Gornji spektar; 1D TOCSY aktiviranog polisaharida serotipa 24F sa ekscitacijom centriranom na piku pri 5.19 ppm pokazujući pojedinačnu korelaciju sa signalom na 3.86 ppm. Donji spektar je standardni 1D protonski spektar serotipa 24F koji identifikuje triplet na 5.19 ppm.
Slika 7 Gornji spektar prikazuje 1D TOCSY aktiviranog polisaharida serotipa 24F sa ekscitacijom centriranom na signalu na 5.19 ppm. Donja slika je višestruko uređen gHSQCAD. Popunjeni ovalni delovi su metil i metin grupe, otvoreni ovali su metileni.
Slika 8 prikazuje ELISA titre IgG antitela (posle doze 2) za zečeve imunizovane sa monovalentnim serotipovima S. pneumoniae konjugovanim sa CRM197 i formulisanim sa aluminijum fosfatnim adjuvansom (APA). Stubići grešaka predstavljaju geometrijsku srednju vrednost 95% intervala pouzdanosti.
Slika 9 prikazuje specifične titre OPA za sterotip (posle doze 2) za zečeve imunizovane sa monovalentnim serotipovima S. pneumoniae konjugovanim sa CRM197 i formulisanim sa aluminijum fosfatnim adjuvansom (APA). Stubići grešaka predstavljaju geometrijsku srednju vrednost 95% intervala pouzdanosti.
Slika 10 prikazuje zaštitu od intratrahealnog izazivanja serotipa 24F S. pneumoniae C57BL/6 miševa imunizovanih sa 24F-CRM197 monovalentnom konjugovanom vakcinom formulisanom sa aluminijum fosfatnim adjuvansom (APA). Mantel Cox logrank test ukazuje da su miševi C57BL/6 imunizovani sa 24F-CRM197/APA vakcinom značajno zaštićeni od izazivanja u poređenju sa miševima imunizovanim APA (P=0.0004) i miševima koji nisu bili imunizovani (P<0.0001).
Slika 11 prikazuje zaštitu od intratrahealnog izazivanja serotipa 24F S. pneumoniae CD-1 miševa imunizovanih sa 24F-CRM197 monovalentnom konjugovanom vakcinom formulisanom sa aluminijum fosfatnim adjuvansom (APA). Mantel Cox logrank test ukazuje da su CD-1 miševi imunizovani sa 24F-CRM197/APA vakcinom značajno zaštićeni od izazivanja u poređenju sa miševima imunizovanim APA (P=0.0099) i miševima koji nisu bili imunizovani (P=0.0076). Slika 12 prikazuje zaštitu od intratrahealnog izazivanja serotipa 24F S. pneumoniae kod Swiss Webster miševa imunizovanih sa 24F-CRM197 monovalentnom konjugovanom vakcinom formulisanom sa aluminijum fosfatnim adjuvansom (APA). Mantel Cox logrank test ukazuje da su Swiss Webster miševi imunizovani sa 24F-CRM197/APA vakcinom bili značajno zaštićeni od izazivanja u poređenu sa miševima imunizovanim APA (P<0.0001) i miševima koji nisu bili imunizovani (P=0.0002).
Slika 13 prikazuje specifičan serotip (serotipovi 16F, 23A, 23B, 24F, 31 S. pneumoniae) pre imunizacije, geometrijskih srednjih vrednosti titara PD1 i PD2 antitela za zečeve imunizovane sa multivalentnom pneumokoknom konjugovanom vakcinom (2 µg/PnPs). Stubići grešaka predstavljaju geometrijske srednje vrednosti 2 standardne greške titra svakog serotipa (X-osa). Slika 14 prikazuje specifičan serotip (serotipovi 16F, 23A, 23B, 24F, 31 S. pneumoniae) pre imunizacije, OPA razblaženih titara PD1 i PD2 za zečeve imunizovane sa multivalentnom pneumokoknom konjugovanom vakcinom (2 µg/PnPs). Simboli označavaju pojedinačne titre a stubići greške predstavljaju 95% interval pouzdanosti (CIs) geometrijskih srednjih vrednosti titara (GMTs).* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, ns=nije značajno.
DETALJAN OPIS PREDMETNOG PRONALASKA
[0018] Predmetni pronalazak je delimično zasnovan na identifikaciji nove strukture(a) pneumokoknog polisaharida pomoću NMR tehnologije. Veruje se da je struktura koja je ovde data prva identifikacija ili prva ispravna identifikacija serotipa 24F S. pneumoniae.
[0019] Polisaharid serotipa 24F S. pneumoniae je dobijen iz odgovarajućeg soja i prečišćen. Dobijeni (i prečišćeni) polisaharidi su korišćeni za generisanje pojedinačnih konjugata Ps-CRM197. Serotip 24F S. pneumoniae ima jedinstven polisaharid, što rezultuje jedinstvenim postupkom dobijanja konjugata. U studijama na životinjama pokazano je da su dobijeni konjugat(i) imunogeni.
[0020] Kako se ovde koristi, pojam "polisaharid" (Ps) podrazumeva uključivanje bilo kog antigenskog saharidnog elementa (ili antigenske jedinice) koji se obično koristi u oblasti imunoloških i bakterijskih vakcina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, "saharid", "oligosaharid", "polisaharid", "liposaharid", "lipo-oligosaharid (LOS)", "lipopolisaharid (LPS)", "glikozilat", "glikokonjugat", "derivatizovani ili aktivirani polisaharid ili oligosaharid", i slično. Osim ako nije drugačije naznačeno, nomenklatura polisaharida korišćena ovde prati preporuke IUB-IUPAC Zajedničke komisije za biohemijsku nomenklaturu (JCBM - Joint Commission on Biochemical Nomenclature) iz 1980. Videti JCBN, 1982, J. Biol. Chem.257:3352-3354.
[0021] Kako se ovde koristi, "imunogena kompozicija" se odnosi na kompoziciju koja sadrži antigen, kao što je bakterijski kapsulirani polisaharid ili konjugat polisaharid-protein, koji ima sposobnost da izazove imuni odgovor kod domaćina kao što je sisar, bilo humoralno ili ćelijski posredovano, ili na oba načina. Imunogena kompozicija može poslužiti za senzibilizaciju domaćina predstavljanjem antigena u saradnji sa MHC molekulima na površini ćelije. Pored toga, antigen specifične T-ćelije ili antitela mogu da se generišu kako bi se omogućila buduća zaštita imunizovanog domaćina. Imunogene kompozicije tako mogu zaštititi domaćina od infekcije bakterijama, smanjiti ozbiljnost infekcije ili mogu zaštititi domaćina od smrti usled bakterijske infekcije. Imunogene kompozicije se takođe mogu koristiti za stvaranje poliklonskih ili monoklonskih antitela, koja se mogu koristiti za prenošenje pasivnog imuniteta prema subjektu. Imunogene kompozicije se takođe mogu koristiti za generisanje antitela koja su funkcionalna izmereno ubijanjem bakterija u bilo kom modelu efikasnosti na životinjama ili putem opsonofagocitnog testa ubijanja.
[0022] Kako se ovde koristi, pojam "izolovan" u vezi sa polisaharidom se odnosi na izolovanje kapsularnog polisaharida specifičnog za serotip S. pneumoniae iz prečišćenog polisaharida primenom tehnika prečišćavanja poznatih u oblasti, uključujući primenu centrifugiranja, dubinske filtracije, precipitacije, ultrafiltracije, tretmana sa aktivnim ugljem, dijafiltracije i/ili hromatografije na koloni. Generalno izolovani polisaharid se odnosi na delimično uklanjanje proteina, nukleinskih kiselina i nespecifičnog endogenog polisaharida (C-polisaharida). Izolovani polisaharid sadrži manje od 10%, 8%, 6%, 4% ili 2% proteinskih nečistoća i/ili nukleinskih kiselina. Izolovani polisaharid sadrži manje od 20% C-polisaharida u odnosu na polisaharide specifične za tip.
[0023] Kako se ovde koristi, pojam "prečišćen" u vezi sa bakterijskim kapsuliranim polisaharidom se odnosi na prečišćavanje polisaharida iz ćelijskog lizata postupcima kao što su centrifugiranje, precipitacija i ultrafiltracija. Generalno, prečišćeni polisaharid se odnosi na uklanjanje ostataka ćelija i DNK.
[0024] Kako se ovde koristi, pojam "Mm" se odnosi na prosečnu molekulsku masu i tipično se izražava u Da ili kDa. Mm uzima u obzir da veći molekul sadrži više ukupne mase uzorka polimera nego manji molekuli. Mm se može odrediti tehnikama kao što je statističko rasejanje svetlosti, rasejanje neutrona pod malim uglom, rasejanje rendgenskih zraka i brzina sedimentacije.
[0025] Kako se ovde koristi, pojam "Mn" se odnosi na brojnu vrednost prosečne molekulske težine i tipično se izražava u Da ili kDa. Mn se izračunava uzimanjem ukupne težine uzorka koja je podeljena sa brojem molekula u uzorku i može se odrediti tehnikama kao što su gel permeacijska hromatografija, viskozimetrija preko (Mark-Huvinkove jednačine), koligativne metode kao što je osmometrija pritiska pare, određivanje krajnje grupe ili protonski NMR. Mm/Mn odražava polidisperznost.
[0026] Kako se ovde koristi, pojam "molarni odnos" je razlomak koji se obično izražava kao decimala na deseti ili stoti deo. Na primer, molarni odnos od 0 ili 0.1 do 1.0 izražen u desetinama će uključivati bilo koji od 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 ili 1.0.
[0027] Kako se ovde koristi, skraćenica "PnPs" se odnosi na pneumokokni polisaharid.
[0028] Kako se ovde koristi, pojam "sadrži" kada se koristi sa imunogenom kompozicijom predmetnog pronalaska odnosi se na uključivanje bilo kojih drugih komponenti (podložno ograničenjima jezika "sastoji se od" za smešu antigena) kao što su adjuvansi i ekscipijensi. Pojam "sastoji se od" kada se koristi sa smešom multivalentnog konjugata polisaharid-protein predmetnog pronalaska odnosi se na smešu koja ima te posebne konjugate polisaharidnog proteina S. pneumoniae i nema drugih konjugata polisaharidnog proteina S. pneumoniae iz drugog serotipa.
[0029] Kako se ovde koristi, fraza "aktivno mesto" na šećeru znači da to mesto može biti hemijski modifikovano da bi se formirala reaktivna grupa. Aktivno mesto uzima u obzir preferiranu tendenciju aktivacionog agensa da reaguje na određenom mestu.
[0030] Kako se ovde koristi, fraza "aktivirani polisaharid" se odnosi na polisaharid koji je hemijski modifikovan da formira reaktivne grupe u polisaharidnom lancu. Aktivirani polisaharid ne znači nužno da su sva dostupna aktivna mesta hemijski modifikovana.
[0031] Kako se ovde koristi, fraza "stepen aktivacije" na polisaharidnom lancu odnosi se na ukupan odnos između broja aktiviranih hemijskih grupa i broja ponavljajućih jedinica na polisaharidnom lancu.
[0032] Osim ako nije drugačije naznačeno, svi opsezi koji su ovde dati uključuju navedene donje i gornje granice.
[0033] Analiza monosaharida serotipa 24F S. pneumoniae pokazala je Glc, Rha, GlcN, Rib (riboza), i Rib-ol-P (riboza fosfat) kao sastojke (ali informacije o strukturi nisu dostupne). Videti Kamerling, 2000, Pneumococcal polysaccharides: a chemical view, str. 81-114. Kod Tomasz (izd), Streptococcus pneumoniae molecular biology & mechanisms of disease. Mary Ann Liebert, Inc., Larchmont, Njujork. Struktura identifikovana u primerima je u skladu sa prethodno identifikovanim sastavom saharida. Do sada nisu bile dostupe informacije o strukturi za polisaharide serotipa 24A ili 24B radi poređenja.
[0034] Identifikacija strukture ovog(ih) polisaharidnog(ih) serotipa(ova) može omogućiti njihovu inkorporaciju u pneumokokne vakcine, bilo nekonjugovanih ili kao konjugat polisaharid-protein. Konjugovane vakcine koje sadrže streptokokne i pneumokokne Ps su dobro poznate u oblasti. Videti npr., U.S. Pat. Br.6,248,570; 5,866,135; i 5,773,007.
Kapsularni polisaharidi
[0035] Kapsularni polisaharidi iz serotipa(ova) iz Steptococcus pneumoniae predmetnog pronalaska mogu se dobiti standardnim tehnikama poznatim stručnjacima u oblasti. Na primer, polisaharidi se mogu izolovati iz bakterija i mogu se odrediti u određenoj meri poznatim metodama (videti, npr., evropski patent objavljen pod brojevima EP497524 i EP497525); i poželjno mikrofluidizacijom koja se postiže upotrebom homogenizatora ili hemijskom hidrolizom. U jednom tehničkom rešenju, sojevi S. pneumoniae koji odgovaraju svakom polisaharidnom serotipu se uzgajaju u medijumu na bazi soje. Pojedinačni polisaharidi se zatim prečišćavaju kroz standardne korake uključujući centrifugiranje, precipitaciju i ultrafiltraciju. Videti, npr., objavu američke patentne prijave sa brojem 2008/0286838 i U.S. pat. br.5,847,112. Polisaharidi se mogu dimenzionisati kako bi se smanjio viskozitet i/ili poboljšala filtrabilnost naknadnih konjugovanih proizvoda. Hemijska hidroliza se može sprovesti korišćenjem sirćetne kiseline. Mehaničko dimenzionisanje se može izvršiti korišćenjem homogenizacije sa rezanjem pod visokim pritiskom.
[0036] U nekim tehničkim rešenjima, prečišćeni polisaharidi pre konjugacije imaju Molekulsku masu između 5 kDa i 4,000 kDa. Molekulska masa se može izračunati hromatografijom sa isključenjem po veličini (SEC- size exclusion hromatografija) u kombinaciji sa detektorom višeugaonog rasipanja svetlosti (MALS- multiangle light scattering detector) i detektorom indeksa prelamanja (RI- refractive index detector). U drugim takvim tehničkim rešenjima, polisaharid ima prosečnu Molekulsku masu između 10 kDa i 4,000 kDa; između 50 kDa i 4,000 kDa; između 50 kDa i 3,000 kDa; između 50 kDa i 2,000 kDa; između 50 kDa i 1,500 kDa; između 50 kDa i 1,000 kDa; između 50 kDa i 750 kDa; između 50 kDa i 500 kDa; između 100 kDa i 4,000 kDa; između 100 kDa i 3,000 kDa; između 5 kDa i 2,000 kDa; između 10 kDa i 2,000 kDa; između 50 kDa i 2,000 kDa; između 100 kDa i 2,000 kDa; između 100 kDa i 1,500 kDa; između 100 kDa i 1,000 kDa; između 100 kDa i 750 kDa; između 100 kDa i 500 kDa; između 100 i 400 kDa; između 200 kDa i 4,000 kDa; između 200 kDa i 3,000 kDa; između 200 kDa i 2,000 kDa; između 200 kDa i 1,500 kDa; između 200 kDa i 1,000 kDa; ili između 200 kDa i 500 kDa. U određenim tehničkim rešenjima, polisaharid ima Molekulsku masu od 50 kDa do 5,000 kDa. U određenim aspektima, polisaharid ima molekulsku masu od 10 kDa do 2,000 kDa, 50 kDa do 1,500 kDa ili 75 kDa do 200 kDa.
[0037] U određenim tehničkim rešenjima, polisaharid serotipa 24F S. pneumoniae ima između 5 i 2,000 ponavljajućih jedinica. U određenim aspektima, polisaharid ima između 15 i 1,500, 20 i 400, 30 do 300, 40 do 250, ili 50 do 200 ponavljajućih jedinica.
Proteinski nosač
[0038] Polisaharidi iz jednog ili više serotipova mogu biti konjugovani sa proteinskim nosačem ("Pr") da bi se poboljšala imunogenost kod dece, starijih i/ili imunokompromitovanih subjekata. Kada se više od jednog serotipa koristi u multivalentnoj kompoziciji, serotipovi se mogu dobiti sa istim proteinskim nosačem ili različitim proteinskim nosačima. Svaki kapsularni polisaharid istog serotipa je obično konjugovan sa istim proteinskim nosačem.
[0039] U posebnom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, CRM197 se koristi kao proteinski nosač. CRM197 je netoksična varijanta toksina difterije (DT). Protein nosač CRM197 je mutantni oblik DT koji postaje netoksičan supstitucijom jedne aminokiseline u Fragmentu A na ostatku 52. U jednom tehničkom rešenju, proteinski nosač CRM197 je izolovan iz soja C7 (β197) kultura Corynebacterium diphtheria gajenih u medijumu na bazi kasamino kiselina i ekstrakta kvasca. U drugom tehničkom rešenju, CRM197 se dobija rekombinantno u skladu sa metodama opisanim u U.S. pat. br. 5,614,382. Obično se CRM197 prečišćava kombinacijom ultrafiltracije, precipitacijom amonijum sulfatom i jonizmenjivačkom hromatografijom. U nekim tehničkim rešenjima, CRM197 se dobija u Pseudomonas fluorescens korišćenjem Pfenex Expression Technology<™>(Pfenex Inc., San Dijego, Kalifornija).
[0040] Drugi pogodni proteinski nosači uključuju dodatne inaktivirane bakterijske toksine kao što su DT, fragment B toksoida difterije (DTFB- Diphtheria toxoid fragment B), TT (tetanus toksid) ili fragment C od TT, toksoid pertusisa, toksoid kolere (npr., kao što je opisano u objavi međunarodne prijave patenta koja je objavljena pod brojem WO 2004/083251), LT E. coli (enterotoksin nestabilan na toploti), ST E. coli (enterotoksin stabilan na toploti) i egzotoksin A iz Pseudomonas aeruginosa. Bakterijski proteini spoljne membrane kao što su kompleks c spoljne membrane (OMPC - outer membrane complex c), porini, proteini koji vezuju transferin, pneumokokni površinski protein A (PspA; videti objavu međunarodne patentne prijave sa brojem WO 02/091998), pneumokokni adhezioni protein (PsaA), C5a peptidaza iz grupe A ili grupe B streptokoka, ili protein D Haemophilus influenzae, pneumokokni pneumolizin (Kuo i sarad., 1995, Infect Immun 63; 2706-13) uključujući sloj detoksifikovan na neki način na primer dPLY-GMBS (videti objavu međunarodne patentne prijave sa brojem WO 04/081515) ili dPLY-formol, PhtX, uključujući PhtA, PhtB, PhtD, PhtE i fuzije Pht proteina na primer PhtDE fuzije, PhtBE fuzije (videti objave međunarodnih patentnih prijava sa brojevima WO 01/98334 i WO 03/54007), takođe se mogu koristiti. Drugi proteini, kao što su ovalbumin, hemocijanin iz školjke (KLH-keyhole limpet hemocyanin), goveđi serumski albimin (BSA) ili prečišćeni proteinski derivat tuberkulina (PPD), PorB (iz N. meningitidis), PD (protein D Haemophilus influenzae; videti, npr., evropski patent sa brojem EP 0 594 610 B), ili njihovi imunološki funkcionalni ekvivalenti, sintetički peptidi (videti evropske patente sa brojevima EP0378881 i EP0427347), proteini toplotnog šoka (videti objave međunarodnih patentnih prijava sa brojevima WO 93/17712 i WO 94/03208), proteini pertussis-a (videti objavu međunarodne patentne prijave sa brojem WO 98/58668 i evropski patent sa brojem EP0471177), citokini, limfokini, faktori rasta ili hormoni (videti objavu međunarodne patentne prijave sa brojem WO 91/01146), veštački proteini koji sadrže višestruke humane CD4+ T ćelijske epitope iz različitih antigena izvedenih od patogena (videti Falugi i sarad., 2001, Eur J Immunol 31:3816-3824) kao što je protein N19 (videti Baraldoi i sarad., 2004, Infect Immun 72:4884-7), proteini koji apsorbuju gvožđe (videti objavu međunarodne patentne prijave sa brojem WO 01/72337), toksin A ili B iz C. difficile (videti objavu međunarodne patentne prijave sa brojem WO 00/61761) i flagelin (videti Ben-Yedidia i sarad., 1998, Immunol Lett 64:9) se takođe mogu koristiti kao proteinski nosači.
[0041] Drugi DT mutanti se takođe mogu koristiti kao proteinski nosač, kao što su CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida i sarad., 1973, J Biol Chem 218:3838-3844); CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 i CRM107 i druge mutacije koje su opisali Nicholls i Youle u Genetically Engineered Toxins, Izd: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; delecija ili mutacija Glu-148 u Asp, Gln ili Ser i/ili Ala 158 u Gly i druge mutacije stavljene na uvid javnosti u U.S. pat. br.
4,709,017 ili U.S. pat. br.4,950,740; mutacija najmanje jednog ili više ostataka Lys 516, Lys 526, Phe 530 i/ili Lys 534 i druge mutacije stavljene na uvid javnosti u U.S. pat. br.5,917,017 ili U.S. pat. br.6,455,673; ili fragment stavljen na uvid javnosti u U.S. Pat. Br.5,843,711.
[0042] Tamo gde se koriste multivalentne vakcine, drugi proteinski nosač se može koristiti za jedan ili više antigena. Drugi proteinski nosač je poželjno protein koji je netoksičan i nereaktogeni i koji se može dobiti u dovoljnoj količini i čistoći. Drugi proteinski nosač je takođe konjugovan ili spojen sa antigenom, npr., polisaharidom S. pneumoniae da bi se poboljšala imunogenost antigena. Proteini nosači treba da budu podložni standardnim procedurama konjugacije. U jednom tehničkom rešenju, svaki kapsularni polisaharid koji nije konjugovan sa prvim proteinskim nosačem je konjugovan sa istim drugim proteinskim nosačem (npr., svaki kapsularni molekul polisaharida je konjugovan sa jednim proteinskim nosačem). U drugom tehničkom rešenju, kapsularni polisaharidi koji nisu konjugovani sa prvim proteinskim nosačem su konjugovani sa dva ili više proteina nosača (svaki kapsularni molekul polisaharida je konjugovan sa jednim proteinskim nosačem). U takvim tehničkim rešenjima, svaki kapsularni polisaharid istog serotipa je tipično konjugovan sa istim proteinskim nosačem.
Konjugacija
[0043] Pre konjugacije, prečišćeni polisaharidi se mogu hemijski aktivirati da bi saharidi mogli da reaguju sa proteinskim nosačem i formiraju aktivirani polisaharid. Kako se ovde koristi, pojam "aktivirani polisaharid" se odnosi na polisaharid koji je hemijski modifikovan kako je opisano u nastavku da bi se omogućila konjugacija sa linkerom ili proteinskim nosačem. Prečišćeni polisaharidi mogu po izboru biti povezani sa linkerom. Jednom aktiviran ili povezan sa linkerom, svaki kapsularni polisaharid se posebno konjuguje sa proteinskim nosačem da bi se formirao glikokonjugat. Polisaharidni konjugati se mogu dobiti poznatim tehnikama kuplovanja.
[0044] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje aktivirane polisaharide dobijene bilo kojim od prethodnih tehničkih rešenja gde se polisaharid aktivira hemijskim reagensom da bi se dobile reaktivne grupe za konjugaciju sa linkerom ili proteinskim nosačem. U određenim tehničkim rešenjima, aktivacija se dešava na arabinitolu-1-PO4. U određenim tehničkim rešenjima, polisaharid se aktivira perjodatom. U određenim aspektima ovog tehničkog rešanje, aktivacija se dešava na ugljeniku u položaju 2 arabinitola-1-PO4. Videti sliku 1B za strukturu polisaharida serotipa 24F aktiviranog perjodatom. Formiranje aldehida pretežno na drugom ugljeniku bilo je iznenađujuće po tome što zahteva selektivno cepanje 2,3-ugljenika sa vicinalnim diolima ili poželjno kontinuirane serije oksidacije na ugljenicima sa višim brojevima sa vicinalnim diolima (ili aldehidom) do konačne oksidacije na 2. ugljeniku arabinitol šećera. U određenim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje aktivirane polisaharide i smeše aktiviranih polisaharida gde je više od 50%, 60%, 70% ili 80% aldehidnih grupa (kroz aktivaciju perjodatom) na arabinitolu. U jednom aspektu ovog tehničkog rešenja, aktivirani polisaharid ima strukturu kao što je prikazano na slici 1B.
[0045] U određenim tehničkim rešenjima, polisaharid može biti kuplovan sa linkerom da bi formirao intermedijer polisaharid-linker u kome je slobodni kraj linkera estarska grupa. Linker je, prema tome, onaj u kome je najmanje jedan terminus estarska grupa. Drugi terminus je odabran tako da može da reaguje sa polisaharidom da bi se formirao intermedijer polisaharid-linker.
[0046] U određenim tehničkim rešenjima, polisaharid može biti spojen sa linkerom korišćenjem primarne amino grupe u polisaharidu. U ovom slučaju, linker tipično ima estarsku grupu na oba kraja. Ovo omogućava da se odigra kuplovanje reakcijom jedne od estarskih grupa sa primarnom amino grupom u polisaharidu nukleofilnom acilnom supstitucijom. Reakcija rezultuje intermedijerom polisaharid-linker u kome je polisaharid kuplovan sa linkerom preko amidne veze. Linker je stoga bifunkcionalni linker koji obezbeđuje prvu estarsku grupu za reagovanje sa primarnom amino grupom u polisaharidu i drugu estarsku grupu za reakciju sa primarnom amino grupom u molekulu nosača. Tipičan linker je diestar N-hidroksisukcinimid adipinske kiseline (SIDEA).
[0047] U određenim tehničkim rešenjima, kuplovanje se takođe može odvijati indirektno, tj. sa dodatnim linkerom koji se koristi za derivatizaciju polisaharida pre kuplovanja sa linkerom. Polisaharid je kuplovan za dodatni linker korišćenjem karbonil grupe na redukcionom kraju polisaharida. Ovo kuplovanje obuhvata dva koraka: (a1) reagovanje karbonil grupe sa dodatnim linkerom; i (a2) reagovanje slobodnog kraja dodatnog linkera sa linkerom. U ovim tehničkim rešenjima, dodatni linker obično ima primarnu amino grupu na oba kraja, čime se omogućava da se korak (a1) odvija reakcijom jedne od primarnih amino grupa sa karbonil grupom u polisaharidu reduktivnom aminacijom. Koristi se primarna amino grupa koja je reaktivna sa karbonilnom grupom u polisaharidu. Pogodne su hidrazidne ili hidroksilamino grupe. Ista primarna amino grupa je obično prisutna na oba kraja dodatnog linkera. Reakcija rezultuje intermedijerom polisahariddodatni linker u kome je polisaharid kuplovan sa dodatnim linkerom preko C-N veze.
[0048] U određenim tehničkim rešenjima, polisaharid se može kuplovati sa dodatnim linkerom korišćenjem različite grupe u polisaharidu, posebno karboksilne grpe. Ovo kuplovanje se sastoji od dva koraka: (a1) reagovanje grupe sa dodatnim linkerom; i (a2) reagovanje slobodnog kraja dodatnog linkera sa linkerom. U ovom slučaju, dodatni linker obično ima primarnu amino grupu na oba kraja, čime se omogućava da se korak (a1) odvija reagovanjem jedne od primarnih amino grupa sa karboksilnom grupom u polisaharidu EDAC aktivacijom. Koristi se primarna amino grupa koja je reaktivna sa EDAC-aktiviranom karboksilnom grupom u polisaharidu. Pogodna je hidrazid grupa. Ista primarna amino grupa je obično prisutna na oba kraja dodatnog linkera. Reakcija dovodi do intermedijera polisaharid-dodatni linker u kome je polisaharid kuplovan sa dodatnim linkerom preko amidne veze.
[0049] U jednom tehničkom rešenju, hemijska aktivacija polisaharida i naknadna konjugacija sa proteinskim nosačem reduktivnom aminacijom može se postići sredstvima opisanim u američkim patentima sa brojevima 4,365,170, 4,673,574 i 4,902,506, objavama američkih patentnih prijava sa brojevima 2006/0228380, 2007/184072, 2007/0231340 I 2007/0184071, i objavama međunarodnih patentnih prijava sa brojevima WO2006/110381, WO2008/079653 i WO2008/143709. Hemizam može da podrazumeva aktivaciju pneumokoknog polisaharida reakcijom sa bilo kojim oksidacionim agensom čija je primarna hidroksilna grupa na aldehidu, kao što je TEMPO u prisustvu oksidansa (WO2104/097099), ili reagovanjem dve vicinalne hidroksilne grupe na aldehidima, kao što je perjodat (uključujući natrijum perjodat, kalijum perjodat ili perjodnu kiselinu). Reakcije dovode do nasumične oksidacije primarnih hidroksilnih grupa ili nasumičnog oksidativnog cepanja vicinalnih hidroksilnih grupa ugljenih hidrata sa formiranjem reaktivnih aldehidnih grupa.
[0050] U ovom tehničkom rešenju, kuplovanje za proteinski nosač je reduktivnom aminacijom preko direktne aminacije na lizilnim grupama proteina. Na primer, konjugacija se izvodi reakcijom smeše aktiviranog polisaharida i proteina nosača sa redukcionim agensom kao što je natrijum cijanoborohidrid u prisustvu nikla. Reakcija konjugacije se može odvijati u vodenom rastvoru ili u prisustvu dmetil sulfoksida (DMSO). Videti, npr., objave američkih patentnih prijava sa brojevima US2015/0231270 i US2011/0195086 i evropski patent sa brojem EP 0471 177 B1. Neizreagovani aldehidi se zatim prekrivaju dodatkom jakog redukcionog sredstva, kao što je natrijum borohidrid.
[0051] Redukciona aminacija uključuje dva koraka, (1) oksidaciju polisaharida da bi se formirali reaktivni aldehidi, (2) redukciju imina (Šifove baze) formiranog između aktiviranog polisaharida i proteinskog nosača da bi se formirala stabilna aminska konjugovana veza. Pre oksidacije, polisaharid se po izboru smanjuje u veličini. Mogu se koristiti mehaničke metode (npr. homogenizacija) ili hemijska hidroliza. Hemijska hidroliza se može sprovesti korišćenjem sirćetne kiseline. Korak oksidacije može uključivati reakciju sa perjodatom. Za potrebe predmetnog pronalaska, pojam "perjodat" uključuje i perjodat i perjodnu kiselinu; pojam takođe uključuje i metaperjodat (IO4-) i ortoperjodat (IO6<5->) i uključuje različite soli perjodata (npr. , natrijum perjodat i kalijum perjodat). U jednom tehničkom rešenju kapsularni polisaharid se oksiduje u prisustvu metaperjodata, poželjno u prisustvu natrijum perjodata (NaIO4). U drugom tehničkom rešenju kapsularni polisaharid se oksiduje u prisustvu ortoperjodata, poželjno u prisustvu perjodne kiseline.
[0052] U jednom tehničkom rešenju, oksidacioni agens je stabilno nitroksil ili nitroksid radikalsko jedinjenje, kao što su piperidin-N-oksi ili pirolidin-N-oksi jedinjenja, u prisustvu oksidansa za selektivnu oksidaciju primarnih hidroksila (kao što je opisano u, na primer, u objavi međunarodne patentne prijave sa brojem WO 2014/097099). U pomenutoj reakciji, stvarni oksidans je N-oksoamonijumova so, u katalitičkom ciklusu. U jednom aspektu, pomenuta stabilna nitroksil ili nitroksid radikalska jedinjenja su piperidin-N-oksi ili pirolidin-N-oksi jedinjenja. U jednom aspektu, pomenuto stabilno nitroksil ili nitroksid radikalsko jedinjenje nosi TEMPO (2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloksi) ili PROXYL (2,2,5,5-tetrametil-1-pirolidiniloksi) deo. U jednom aspektu, pomenuto stabilno nitroksil radikalsko jedinjenje je TEMPO ili njegov derivat. U jednom aspektu, pomenuti oksidans je molekul koji nosi N-halo deo. U jednom aspektu, pomenuti oksidans je odabran iz grupe koja se sastoji od N-hlorosukcinimida, N-bromosukcinimida, N-jodosukcinimida, dihloroizocijanurinske kiseline, 1 ,3,5-trihloro-1 ,3,5-triazinan-2,4,6-triona, dibromoizocijanurinske kiseline, 1,3,5-tribromo-1 ,3,5-triazinan-2,4,6-triona, dijodoizocijanurinske kiseline i 1 ,3,5-trijodo-1,3,5-triazinan-2,4,6-triona. Poželjno navedeni oksidans je N- hlorosukcinimid.
[0053] U određenim aspektima, oksidacioni agens je 2,2,6,6-tetrametil-1 -piperidiniloksi (TEMPO) slobodni radikal i N- hlorosukcinimid (NCS) kao kooksidans (kao što je opisano u objavi međunarodnog patenta sa brojem WO2014/097099). Prema tome u jednom aspektu, glikokonjugati iz S. pneumoniae se mogu dobiti postupkom koji obuhvata korake: a) reagovanje saharida sa 2,2,6,6-tetrametil-1 -piperidiniloksi (TEMPO) i N-hlorosukcinimidom (NCS) u vodenom rastvaraču radi dobijanja aktiviranog saharida; i b) reagovanje aktiviranog saharida sa proteinskim nosačem koji sadrži jednu ili više amino grupa (navedeni postupak je posle toga označen kao "TEMPO/NCS-reduktivna aminacija").
[0054] Po izboru reakcija oksidacije se kvenčuje dodavanjem agensa za kvenčovanje. Agens za kvenčovanje se može izabrati od vicinalnih diola, 1,2-aminoalkohola, aminokiselina, glutationa, sulfita, bisulfata, ditionita, metabisulfita, tiosulfata, fosfita, hipofosfita ili fosforne kiseline (kao što su glicerol, etilen glikol, propan-1,2-diol, butan-1,2-diol ili butan-2,3-diol, askorbinska kiselina).
[0055] Drugi korak procesa konjugacije za reduktivnu aminaciju je redukcija iminske (Šifove baze) veze između aktiviranog polisaharida i proteinskog nosača da bi se formirala stabilna konjugovana veza (tzv. reduktivna aminacija), korišćenjem redukujućeg agensa. Redukujući agensi koji su pogodni uključuju cijanoborohidride (kao što je natrijum cijanoborohidrid) ili natrijum borohidrid. U jednom tehničkom rešenju redukujući agens je natrijum cijanoborohidrid.
[0056] U određenim tehničkim rešenjima postupaka predmetnog pronalaska, reakcija reduktivne aminacije se izvodi u aprotičnom rastvaraču (ili smeši aprotičnih rastvarača). U jednom tehničkom rešenju, reakcija redukcije se izvodi u rastvaraču DMSO-u (dimetil sulfoksidu) ili u DMF-u (dimetilformamidu). Rastvarač DMSO ili DMF se može koristiti za rekonstruisanje aktiviranog polisaharida i proteinskog nosača, ako je liofilizovan. U jednom tehničkom rešenju, aprotični rastvarač je DMSO.
[0057] Na krju reakcije redukcije, u konjugatima mogu ostati neizreagovane aldehidne grupe koje se mogu prekriti ili kvenčovati, korišćenjem odgovarajućeg sredstva za prekrivanje ili kvenčovanje. U jednom tehničkom rešenju ovaj agens za prekrivanje ili kvenčovanje je natrijum borohidrid (NaBH4). Odgovarajuće alternative uključuju natrijum triacetoksiborohidrid ili natrijum ili cink borohidrid u prisustvu Bronšted Luisove kiseline), amin borane kao što su piridin boran, 2-pikolin boran, 2,6-diboran-metanol, dimetilamin-boran, t-BuMe'PrN-BH3, benzilamin-BH3ili 5-etil-2-metilpiridin boran (PEMB) ili borohidridnu izmenjivačku smolu.
[0058] Glikokonjugati dobijeni primenom reduktivne aminacije u aprotičnom rastvaraču se generalno koriste u multivalentnim pneumokoknim konjugatnim vakcinama. Pema tome, u određenim tehničkim rešenjima za multivalentne kompozicije gde nisu svi serotipovi pripremljeni u aprotičnom rastvaraču, reakcija redukcije za preostale serotipove se izvodi u vodenom rastvaraču (npr., odabranom od PBS (fosfatno puferovan slani rastvor), MES (2-(N-morfolino)etansulfonska kiselina), HEPES, (4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonska kiselina), Bis-tris, ADA (N-(2-Acetamido)iminodisirćetna kiselina), PIPES (piperazin-N,N'-bis(2-etansulfonska kiselina)), MOPSO (3-morfolino-2-hidroksipropansulfonska kiselina), BES (N,N-bis(2-hidroksietil)-2-aminoetansulfonska kiselina), MOPS (3-(N-morfolino)propansulfonska kiselina), DIPSO (3-Bis(2-hidroksietil) amino-2-hidroksipropan-1-sulfonska kiselina), MOBS (4-(N-morfolino)butansulfonska kiselina), HEPPSO (N-(2-hidroksietil)piperazin-N-(2-hidroksipropansulfonska kiselina)), POPSO (piperazin-1,4-bis(2-hidroksi-3-propansulfonska kiselina)), TEA (trietanolamin), EPPS (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-propansulfonska kiselina), bicin ili HEPB, na pH između 6.0 i 8.5, 7.0 i 8.0, ili 7.0 i 7.5).
[0059] U nekim tehničkim rešenjima, glikokonjugati predmetnog pronalaska sadrže polisaharid koji ima Molekulsku masu između 10 kDa i 10,000 kDa. U drugim takvim tehničkim rešenjima, polisaharid ima Molekulsku masu između 25 kDa i 5,000 kDa. U drugim takvim tehničkim rešenjima, polisaharid ima Molekulsku masu između 50 kDa i 1,000 kDa. U drugim takvim tehničkim rešenjima, polisaharid ima Molekulsku masu između 70 kDa i 900 kDa. U drugim takvim tehničkim rešenjima, polisaharid ima Molekulsku masu između 100 kDa i 800 kDa. U drugim takvim tehničkim rešenjima, polisaharid ima Molekulsku masu između 200 kDa i 600 kDa. U daljim takvim tehničkim rešenjima, polisaharid ima Molekulsku masu od 100 kDa do 1,000 kDa; 100 kDa do 900 kDa; 100 kDa do 800 kDa; 100 kDa do 700 kDa; 100 kDa do 600 kDa; 100 kDa do 500 kDa; 100 kDa do 400 kDa; 100 kDa do 300 kDa; 150 kDa do 1,000 kDa; 150 kDa do 900 kDa; 150 kDa do 800 kDa; 150 kDa do 700 kDa; 150 kDa do 600 kDa; 150 kDa do 500 kDa; 150 kDa do 400 kDa; 150 kDa do 300 kDa; 200 kDa do 1,000 kDa; 200 kDa do 900 kDa; 200 kDa do 800 kDa; 200 kDa do 700 kDa; 200 kDa do 600 kDa; 200 kDa do 500 kDa; 200 kDa do 400 kDa; 200 kDa do 300; 250 kDa do 1,000 kDa; 250 kDa do 900 kDa; 250 kDa do 800 kDa; 250 kDa do 700 kDa; 250 kDa do 600 kDa; 250 kDa do 500 kDa; 250 kDa do 400 kDa; 250 kDa do 350 kDa; 300 kDa do 1 ,000 kDa; 300 kDa do 900 kDa; 300 kDa do 800 kDa; 300 kDa do 700 kDa; 300 kDa do 600 kDa; 300 kDa do 500 kDa; 300 kDa do 400 kDa; 400 kDa do 1,000 kDa; 400 kDa do 900 kDa; 400 kDa do 800 kDa; 400 kDa do 700 kDa; 400 kDa do 600 kDa; ili 500 kDa do 600 kDa.
[0060] U određenim tehničkim rešenjima, reakcija konjugacije se izvodi reduktivnom aminacijom pri čemu se nikl koristi za veću efikasnost reakcije konjugacije i za pomoć u uklanjanju slobodnog cijanida. Poznato je da prelazni metali formiraju stabilne komplekse sa cijanidom i poznato je da poboljšavaju reduktivnu metilaciju proteinskih amino grupa i formaldehida sa natrijum cijanoborohidridom (S Gidley i sarad., Biochem J. 1982, 203: 331-334; Jentoft i sarad. Anal Biochem. 1980, 106: 186-190). Kompleksiranjem rezidualnog, inhibitornog cijanida, dodavanje nikla povećava potrošnju proteina tokom konjugacije i dovodi do stvaranja većih, potencijalno više imunogenih konjugata.
[0061] Pogodni alternativni hemizmi uključuju aktivaciju saharida sa 1-cijano-4-dimetilamino piridinijum tetrafluoroboratom (CDAP) da bi se formirao cijanat estar. Aktivirani saharid tako može biti kuplovan direktno ili preko spejser (linker) grupe sa amino grupom na proteinskom nosaču. Na primer, spejser može biti cistamin ili cisteamin da bi se dobio tiolovani polisaharid koji bi mogao biti kuplovan sa nosačem preko tioetarske veze dobijene nakon reakcije sa proteinskim nosačem aktiviranim maleimidom (na primer korišćenjem GMBS) ili haloacetilovanim proteinskim nosačem (na primer korišćenjem jodoacetimida [npr. etil jodoacetimid HCl] ili N-sukcinimidil bromoacetata ili SIAB, ili SIA, ili SBAP). Poželjno, cijanat estar (po izboru napravljen CDAP hemizmom) je kuplovan sa heksan diaminom ili dihidrazidom adipinske kiseline (ADH) i amino-derivatizovani saharid je konjugovan sa proteinskim nosačem korišćenjem karbodiimid (npr., EDAC ili EDC) hemizma preko karboksilne grupe na proteinskom nosaču. Takvi konjugati su opisani u objavama međunarodnih patentnih prijava sa brojevima WO 93/15760, WO 95/08348 i WO 96/29094; i Chu i sarad., 1983, Infect. Immunity 40:245-256.
[0062] Druge pogodne tehnike koriste karbodiimide, hidrazide, aktivne estre, norboran, pnitrobenzojevu kiselinu, N-hidroksisukcinimid, S--NHS, EDC, TSTU. Mnogi su opisani u objavi međunarodne patentne prijave sa brojem WO 98/42721. Konjugacija može uključivati karbonil linker kojii se može formirati reakcijom slobodne hidroksilne grupe saharida sa CDI (Videti Bethell i sarad., 1979, J. Biol. Chem. 254:2572-4; Hearn i sarad., 1981, J. Chromatogr.
218:509-18) praćeno reakcijom sa proteinom da bi se formirala karbamatna veza. Ovo može uključivati redukciju anomernog kraja na primarnoj hidroksilnoj grupi, opcionu zaštitu/uklanjanje zaštite primarne hidroksilne grupe, reakciju primarne hidroksilne grupe sa CDI da bi se formirao CDI karbamatni intermedijer i kuplovanje CDI karbamatnog intermedijera sa amino grupom na proteinu.
[0063] Nakon konjugacije (reakcija redukcije i po izboru reakcija prekrivanja ili kvenčovanja), glikokonjugati mogu biti prečišćeni (obogaćeni u odnosu na količinu konjugata polisaharidprotein) različitim tehnikama poznatim stručnjaku u oblasti. Ove tehnike uključuju dijalizu, operacije koncentrovanja/dijafiltracije, filtraciju tangencionalnog protoka, ultrafiltraciju, precipitaciju/eluiranje, hromatografiju na koloni (jonizmenjivačku hromatografiju, multimodalnu jonizmenjivačku hromatografiju, DEAE, ili hidrofobnu interakcijsku hromatografiju) i dubinsku filtraciju. Videti, npr., američki patent sa brojem 6,146,902. U jednom tehničkom rešenju, glikokonjugati se prečišćavaju dijafilitracijom ili jonizmenjivačkom hromatografijom ili hromatografijom sa isključenjem po veličini.
[0064] Jedan način da se okarakterišu glikokonjugati predmetnog pronalaska je broj ostataka lizina u proteinskom nosaču (npr., CRM197) koji postaju konjugovani sa saharidom, što se može okarakterisati kao niz konjugovanih lizina (stepen konjugacije). Dokazi za modifikaciju lizina proteina nosača, zbog kovalentnih veza sa polisaharidima, mogu se dobiti analizom aminokiselina korišćenjem rutinskih metoda koje su poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Konjugacija rezultuje smanjenjem broja oporavljenih ostataka lizina, u poređenju sa početnim materijalom proteina nosača koji se koristi za generisanje konjugovanih materijala. U poželjnom tehničkom rešenju, stepen konjugacije glikokonjugata predmetnog pronalaska je između 2 i 15, između 2 i 13, između 2 i 10, između 2 i 8, između 2 i 6, između 2 i 5, između 2 i 4, između 3 i 15, između 3 i 13, između 3 i 10, između 3 i 8, između 3 i 6, između 3 i 5, između 3 i 4, između 5 i 15, između 5 i 10, između 8 i 15, između 8 i 12, između 10 i 15 ili između 10 i 12. U jednom tehničkom rešenju, stepen konjugacije glikokonjugata predmetnog pronalaska je oko 2, oko 3, oko 4, oko 5, oko 6, oko 7, oko 8, oko 9, oko 10, oko 11, oko 12, oko 13, oko 14 ili oko 15. U poželjnom tehničkom rešenju, stepen konjugacije glikokonjugata predmetnog pronalaska je između 4 i 7. U nekim takvim tehničkim rešenjima, proteinski nosač je CRM197.
[0065] Glikokonjugati predmetnog pronalaska se takođe mogu okarakterisati odnosom (masa/masa) saharida prema protein nosaču. U nekim tehničkim rešenjima, odnos polisaharida i proteina nosača u glikokonjugatu (m/m) je između 0.4 i 2.0 U nekim takvim tehničkim rešenjima, proteinski nosač je CRM197. Glikokonjugati i imunogene kompozicije predmetnog pronalaska mogu da sadrže slobodni saharid koji nije kovalentno konjugovan sa proteinskim nosačem, ali je ipak prisutan u kompoziciji glikokonjugata. Slobodni saharid može biti nekovalentno povezan sa (tj., nekovalentno vezan za, adsorbovan za, ili zarobljen u ili sa) glikokonjugatom.
[0066] U poželjnom tehničkom rešenju, glikokonjugat sadrži manje od oko 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ili 15% slobodnog polisaharida u poređenju sa ukupnom količinom polisaharida. U poželjnom tehničkom rešenju glikokonjugat sadrži manje od oko 25% slobodnog polisaharida u poređenju sa ukupnom količinom polisaharida. U poželjnom tehničkom rešenju glikokonjugat sadrži manje od oko 20% slobodnog polisaharida u poređenju sa ukupnom količinom polisaharida. U poželjnom tehničkom rešenju glikokonjugat sadrži manje od oko 15% slobodnog polisaharida u poređenju sa ukupnom količinom polisaharida.
Multivalente vakcine konjugata polisaharid-protein
[0067] Ovde su takođe opisane, multivalentne polisaharidne vakcine koje sadrže nekonjugovane polisaharide ili konjugate polisaharid-protein iz serotipa 24F Streptococcus pneumoniae i kapsularne polisaharide iz jednog ili više od serotipova 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18B, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24B, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F i 38 S. pneumoniae bilo kao slobodni polisaharidi, komponenta konjugata polisaharid-protein ili njihova kombinacija, da bi se obezbedila multivalentna pneumokokna vakcina. Imunogena kompozicija može da sadrži, sastoji se u suštini, ili se sastoji od kapsularnih polisaharida od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 ili 44 serotipa S. pneumoniae pojedinačno konjugovanih sa jednim ili više proteinskog nosača. Poželjno je da saharidi iz određenog serotipa nisu konjugovani sa više od jednog proteinskog nosača.
[0068] Nakon što su pojedinačni glikokonjugati prečišćeni, oni se mešaju da bi se formulisala imunogena kompozicija predmetnog pronalaska. Ovi pneumokokni konjugati se dobijaju odvojenim procesima i serijski se formulišu u formulaciju pojedinačne doze.
Farmaceutske/vakcinske kompozicije
[0069] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje kompozicije, uključujući farmaceutske, imunogene i vakcinske kompozicije koje sadrže, u suštini se sastoje od, ili alternativno, sastoje se od bilo koje kombinacije serotipa polisaharida S. pneumoniae opisane gore zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i adjuvansom.
[0070] Formulisanje konjugata polisaharid-protein predmetnog pronalaska može se postići korišćenjem postupaka poznatih u struci. Na primer, pojedinačni pneumokokni konjugati mogu biti formulisani sa fiziološki prihvatljivim nosačem za dobijanje kompozicije. Primeri takvih nosača uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu, puferovani rastvor soli u vodi, poliole (npr., glicerol, propilen glikol, tečni polietilen glikol) i rastvore dekstroze.
[0071] Kompozicija vakcine može biti formulisana u L-histidinskom puferu sa natrijum hloridom.
[0072] Kao što je ovde definisano, "adjuvans" je supstanca koja služi za poboljšanje imunogenosti imunogene kompozicije. Imunološki adjuvans može pojačati imuni odgovor na antigen koji je slabo imunogen kada se administrira sam, npr., izazivajući nedostatak ili slabe titre antitela ili ćelijski posredovan imuni odgovor, povećava titre antitela na antigen, i/ili smanjuje dozu antigena efikasnog za postizanje imunog odgovora kod pojedinca. Prema tome, adjuvansi se često daju da pojačaju imuni odgovor i dobro su poznati stručnjacima u oblasti. Pogodni adjuvansi za poboljšanje efikasnosti kompozicije uključuju, ali nisu ograničeni na:
(1) soli aluminijuma (stipsa), kao što su aluminijum hidroksid, aluminijum fosfat, aluminijum sulfat, itd.;
(2) formulacije emulzije ulje-u-vodi (sa ili bez drugih specifičnih imunostimulirajućih agenasa kao što su muramil peptidi (definisani u nastavku) ili komponente bakterijskog ćelijskog zida), kao što je, na primer, (a) MF59 (objava međunarodne patentne prijave sa brojem WO 90/14837), koji sadrži 5% skvalena, 0.5% Tween 80 i 0.5% Span 85 (po izboru koji sadrži različite količine MTP-PE) formulisane u submikronske čestice korišćenjem mikrofluidizatora kao što je Model 110Y mikrofluidizer (Microfluidics, Njuton, MA), (b) SAF, koji sadrži 10% skvalena, 0.4% Tween 80, 5% pluronsko blokiranog polimera L121, i thr-MDP bilo mikrofluidizovanog u submikronsku emulziju ili vorteksovanog da bi se stvorila emulzija veće veličine čestice, (c) adjuvans Ribi<™>sistem (RAS), (Corixa, Hamilton, MT) koja sadrži 2% skvalena, 0.2% Tween 80, i jednu ili više komponenti bakterijskog ćelijskog zida iz grupe koja se sastoji od 3-O-deaciliranog monofosforilipida A (MPL<™>) opisanog u američkom patentu sa brojem 4,912,094, trehaloza dimikolata (TDM), i skeleta ćelijskog zida (CWS), poželjno MPL+CWS (Detox<™>); i (d) Montanide ISA;
(3) saponinske adjuvanse, kao što su Quil A ili STIMULON<™>QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (videti, npr., U.S. pat. br. 5,057,540) koji se mogu koristiti, ili čestice generisane od njih kao što je ISCOM (imunostimulišući kompleksi formirani kombinacijom holesterola, saponina, fosfolipida i amfipatskih proteina) i Iscomatrix<®>(koji imaju suštinski istu strukturu kao ISCOM ali bez proteina);
(4) bakterijske lipopolisaharide, sintetičke analoge lipida A kao što su jedinjenja aminoalkil glukozamin fosfat (AGP), ili njihovi derivati ili analozi, koji su dostupni kod Corixa-a, koji su opisani u američkom patentu sa brojem 6,113,918; jedan takav AGP je 2-[(R)-3-tetradekanoiloksitetradekanoilamino]etil 2-deoksi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3-tetradekanoiloksitetradekanoil]-2-[(R)-3-- tetradekanoiloksitetradekanoilamino]-b-D-glukopiranozid, koji je takođe poznat kao 529 (ranije poznat kao RC529), koji je formulisan kao vodeni oblik ili kao stabilna emulzija;
(5) sintetičke polinukleotide kao što su oligonukleotidi koji sadrže CpG motiv(e) (američki patent sa brojem 6,207,646);
(6) citokine, kao što su interleukini (npr., IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, itd.), interferoni (npr., gama interferon), faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF), faktor stimulacije kolonije makrofaga (M-CSF), faktor nekroze tumora (TNF), kostimulatorni molekuli B7-1 i B7-2, itd; i
(7) komplement, kao što je trimer komponente komplementa C3d.
[0073] Adjuvans može biti smeša 2, 3 ili više, prethodno navedenih adjuvansa, npr., SBAS2 (emulzija ulje-u-vodi koja takođe sadrži 3-deacilovani monofosforil lipid A i QS21).
[0074] Muramil peptidi uključuju, ali nisu ograničeni na, N-acetil-muramil-L-treonil-D- (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanin-2-(1',2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroksifosforiloksi)-etilamin (MTP-PE), itd.
[0075] Adjuvans može biti so aluminijuma. Adjuvans soli aluminijuma može biti vakcina istaložena stipsom ili vakcina adsorbovana stipsom. Adjuvansi soli aluminijuma su dobro poznati u oblasti i opisani su, na primer, u Harlow, E. i D. Lane (1988; Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory) i Nicklas, W. (1992; Aluminum salts. Research in Immunology 143:489-493). So aluminijuma uključuje, ali nije ograničena na, hidratisani aluminijum oksid, hidrat aluminijum oksida, aluminijum oksid trihidrat (ATH), aluminijum hidrat, aluminijum trihidrat, Alhydrogel<®>, Superfos, Amphogel<®>, aluminijum (III) hidroksid, aluminijum hidroksifosfat (Aluminijum Fosfat Adjuvans (APA)), amorfni aluminijum oksid, trihidratisani aluminijum oksid ili trihidroksialuminijum.
[0076] APA je vodena suspenzija aluminijum hidroksifosfata. APA se proizvodi mešanjem aluminijum hlorida i natrijum fosfata u zapreminskom odnosu 1:1 da bi se istaložio aluminijum hidroksifosfat. Nakon procesa mešanja, veličina materijala se smanjuje pomoću mešalice sa visokim rezanjem kako bi se postigla monodisperzna distribucija čestica po veličini. Proizvod se zatim dijafiltrira naspram slanog rastvora i steriliše parom.
[0077] Komercijalno dostupan Al(OH)3(npr. Alhydrogel<®>ili Superfos of Denmark/Accurate Chemical and Scientific Co., Vestburi, Njujork) može se koristiti za adsorbovanje proteina. Adsorpcija proteina može zavisiti, od pI (izoelektrični pH) proteina i pH medijuma. Protein sa nižim pI se jače adsorbuje na pozitivno naelektrisani jon aluminijuma od proteina sa višim pI. Soli aluminijuma mogu: uspostaviti depo Ag koji se polako oslobađa u period od 2-3 nedelje, biti uključene u nespecifičnu aktivaciju makrofaga i aktivaciju komplementa, i/ili stimulisati urođeni imuni mehanizam (moguće putem stimulacije mokraćne kiseline). Videti, npr., Lambrecht i sarad., 2009, Curr Opin Immunol 21:23.
[0078] Monovalentni vodeni konjugati u masi se obično mešaju zajedno i razblažuju. Kada se razblaži, serija se sterilno filtrira. Adjuvans aluminijum fosfata se dodaje aseptički da bi se dostigla ciljana konačna koncentracije od 4 µg/mL za sve serotipove S. pneumoniae osim serotipom 6B, koji je razblažen do ciljanih 8 µg/mL, i konačne koncentracije od 250 µg/mL. Formulisana serija sa adjuvansom će se puniti u bočice ili špriceve.
[0079] Adjuvans može biti nukleotidna sekvenca koja sadrži CpG, na primer, oligonukleotid koji sadrži CpG, posebno, oligodeokinukleotid koji sadrži CpG (CpG ODN). Adjuvans može biti ODN 1826, koji se može nabaviti od Coley Pharmaceutical Group.
[0080] "Nukleotid koji sadrži CpG," "Oligonukleotid koji sadrži CpG," " oligonukleotid CpG" i slični termini se odnose na molekul nukleotida dužine 6-50 nukleotida koji sadrži deo nemetilovanog CpG. Videti, npr., Wang i sarad., 2003, Vaccine 21:4297. Bilo koja druga definicija pojma prihvaćena u oblasti je namerna. Oligonukleotidi koji sadrže CpG-e uključuju modifikovane oligonukleotide koristeći bilo koje sintetičke internukleozidne veze, modifikovanu bazu i/ili modifikovani šećer.
[0081] Postupci za upotrebu CpG oligonukleotida su dobro poznati u oblasti i opisani su, na primer, u Sur i sarad., 1999, J Immunol. 162:6284-93; Verthelyi, 2006, Methods Mol Med.
127:139-58; i Yasuda i sarad., 2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.23:89-110.
Administriranje/doziranje
[0082] Kompozicije i formulacije predmetnog pronalaska mogu se koristiti za zaštitu ili lečenje ljudi podložnih infekciji, npr., pneumokoknoj infekciji, pomoću administriranja vakcine sistemskim ili mukoznim putem. U jednom tehničkom rešenju, predmetna objava obezbeđuje postupak indukovanja imunog odgovora na konjugat kapsularnog polisaharida S. pneumoniae, koji obuhvata administriranje čoveku imunološki efikasne količine imunogene kompozicije predmetnog pronalaska. U drugom tehničkom rešenju, predmetna objava obezbeđuje postupak vakcinacije čoveka protiv pneumokokne infekcije, koji obuhvata korak administriranja čoveku imunološki efikasne količine imunogene kompozicije predmetnog pronalaska.
[0083] Optimalne količine komponenti za određenu vakcinu mogu se utvrditi standardnim studijama koje uključuju posmatranje odgovarajućih imunoloških odgovora kod subjekata. Na primer, u drugom tehničkom rešenju, doza za humanu vakcinaciju je određena ekstrapolacijom podataka iz studija na životinjama na podatke iz studija na ljudima. U drugom tehničkom rešenju, doza se određuje empirijski.
[0084] "Efikasna količina" kompozicije predmetnog pronalaska se odnosi na dozu potrebnu za izazivanje antitela koja značajno smanjuju verovatnoću ili ozbiljnost infektivnosti mikroba, npr., S. pneumoniae, tokom naknadnog izazivanja.
[0085] Postupci predmetne objave mogu se koristiti za prevenciju i/ili smanjenje primarnih kliničkih sindroma uzrokovanih mikrobima, npr., S. pneumoniae, uključujući i invazivne infekcije (meningitis, pneumoniju i bakterijemiju) i neinvazivne infekcije (akutna upala srednjeg uha i sinusitis).
[0086] Administriranje kompozicija predmetnog pronalaska može uključiti jednu ili više od: injekcija intramuskularnim, intraperitonealnim, intradermalnim ili subkutanim putevima; ili administriranjem preko sluzokože u oralne/alimentarne, respiratorne ili genitourinarne traktove. U jednom tehničkom rešenju, intranazalno administriranje se koristi za lečenje pneumonije ili upale srednjeg uha (pošto se nazofaringealni prenos pneumokoka može efikasnije sprečiti, čime se smanjuje infekcija u njenoj najranijoj fazi).
[0087] Količina konjugata u svakoj dozi vakcine je odabrana kao količina koja indukuje imunoprotektivni odgovor bez značajnih neželjenih efekata. Takva količina može varirati u zavisnosti od serotipa pneumokoka. Generalno, za konjugate na bazi polisaharida, svaka doza će sadržati 0.1 do 100 µg svakog polisaharida, posebno 0.1 do 10 µg, a preciznije 1 do 5 µg. Na primer, svaka doza može da sadrži 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 ili 750 ng ili 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7.5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 µg svakog polisaharida.
[0088] Optimalne količine komponenti za određenu vakcinu mogu se utvrditi standardnim studijama koje uključuju posmatranje odgovarajućih imunoloških odgovora kod subjekata. Na primer, u drugom tehničkom rešenju, doza za humanu vakcinaciju je određena ekstrapolacijom podataka iz studija na životinjama na podatke iz studije na ljudima. U drugom tehničkom rešenju, doza se određuje empirijski.
[0089] U jednom tehničkom rešenju, doza soli aluminijuma je 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70, 100, 125, 150, 200, 300, 500 ili 700 µg ili 1, 1.2, 1.5, 2, 3, 5 mg ili više. U još jednom tehničkom rešenju, doza soli aluminijuma opisana gore je po µg rekombinantnog proteina.
[0090] Generalno, svaka doza od 0.5 mL je formulisana tako da sadrži: 2 µg svakog polisaharida S. pneumoniae, osim polisaharida serotipa 6B od 4 µg; oko 32 µg CRM197 proteina nosača (npr., 32 µg ± 5 µg, ± 3 µg, ± 2 µg ili ± 1 µg); 0.125 mg elementarnog aluminijuma (0.5 mg aluminijum fosfata) adjuvansa; i natrijum hlorid i L-histidinski pufer. Koncentracija natrijum hlorida je oko 150 mM (npr., 150 mM ± 25 mM, ± 20 mM, ± 15 mM, ± 10 mM ili ± 5 mM) i oko 20 mM (npr., 20 mM ± 5 mM, ± 2.5 mM, ± 2 mM, ± 1 mM ili ± 0.5 mM) L-histidinskog pufera.
[0091] Prema bilo kom od postupaka predmetne objave i u jednom tehničkom rešenju, subjekt je čovek. U određenim tehničkim rešenjima, humani pacijent je novorođenče (manje od 1 godine starosti), beba (približno 12 do 24 meseca), ili malo dete (približno 2 do 5 godina). U drugim tehničkim rešenjima, humani pacijent je stariji pacijent (> 65 godina). Kompozicije ovog predmetnog pronalaska su takođe pogodne za primenu kod starije dece, adolescenata i odraslih (npr., uzrasta od 18 do 45 godina ili 18 do 65 godina).
[0092] U jednom tehničkom rešenju postupaka predmetne objave, kompozicija predmetnog pronalaska se administrira kao pojedinačna inokulacija. U drugom tehničkom rešenju, kompozicija se administrira dva puta, tri puta ili četiri puta ili više, u adekvantnom razmaku. Na primer, kompoziccija se može administrirati u intervalima od 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 meseci ili bilo koja njihova kombinacija. Raspored imunizacije može da prati onaj predviđen za vakcine protiv pneumokoka. Na primer, rutinski raspored za odojčad i bebe protiv invazivne bolesti izazvane S. pneumoniae je 2, 4, 6 i 12-15 meseci starosti. Prema tome, u poželjnom tehničkom rešenju, kompozicija se administrira kao serija od 4-doze u dobi od 2, 4, 6 i 12-15 meseci.
[0093] Kompozicije ovog predmetnog pronalaska mogu takođe uključivati jedan ili više proteina iz S. pneumoniae. Primeri proteina S. pneumoniae pogodni za inkluziju uključuju one identifikovane u objavama međunarodnih patentnih prijava sa brojevima WO 02/083855 i WO 02/053761.
Formulacije
[0094] Kompozicije predmetnog pronalaska se mogu administrirati subjektu pomoću jednog ili više postupaka poznatih stručnjaku u oblasti, kao što su parenteralni, transmukozni, transdermalnio, intramuskularni, intravenozni, intradermalni, intranazalni, subkutani, intraperitonealni, i formulisati u skladu sa tim.
[0095] U jednom tehničkom rešenju, kompozicije predmetnog pronalaska se administriraju putem epidermalne injekcije, intramuskularne injekcija, intravenske, intraarterijske, subkutane injekcije ili intrarespiratorne mukozne injekcije tečnog preparata. Tečne formulacije za injekciju uključuju rastvore i slično.
[0096] Kompozicija predmetnog pronalaska može biti formulisana kao bočice sa pojedinačnom dozom, bočice sa više doza ili kao unapred napunjeni špricevi.
[0097] U drugom tehničkom rešenju, kompozicije predmetnog pronalaska se administriraju oralno, i stoga su formulisane u obliku pogodnom za oralno administriranje, tj., kao čvrsti ili tečni preparat. Čvrste oralne formulacije uključuju tablete, kapsule, pilule, granule, pelete i slično. Tečne oralne formulacije uključuju rastvore, suspenzije, disperzije, emulzije, ulja i slično.
[0098] Farmaceutski prihvatljivi nosači za tečne formulacije su vodeni ili nevodeni rastvori, suspenzije, emulzije ili ulja. Primeri nevodenih rastvarača su propilen glikol, polietilen glikol i organski estri za injekcije kao što je etil oleat. Vodeni nosači uključuju vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući rastvor vode u soli i puferovane medijume. Primeri ulja su ulja životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, na primer, ulje od kikirikija, sojino ulje, maslinovo ulje, suncokretovo ulje, ulje riblje jetre, drugo morsko ulje, ili lipid iz mleka ili jaja.
[0099] Farmaceutska kompozicija može biti izotonična, hipotonična ili hipertonična. Međutim, često je poželjno da farmaceutska kompozicija za infuziju ili injekciju bude u suštini izotonična kada se administrira. Stoga, za skladištenje farmaceutska kompozicija može poželjno biti izotonična ili hipertonična. Ako je farmaceutska kompozicija hipertonična za skladištenje, može se razblažiti da postane izotonični rastvor pre administriranja.
[0100] Izotonični agens može biti jonski izotonični agens kao što je so ili nejonski izotonični agens kao što je ugljeni hidrat. Primeri jonskih izotoničnih agenasa uključuju ali nisu ograničeni na NaCl, CaCl2, KCl i MgCl2. Primeri nejonskih izotoničnih agenasa uključuju ali nisu ograničeni na saharozu, trehalozu, manitol, sorbitol i glicerol.
[0101] Takođe je poželjno da bar jedan farmaceutski prihvatljiv aditiv bude pufer. Za neke svrhe, na primer, kada je farmaceutska kompozicija namenjena za infuziju ili injekciju, često je poželjno da kompozicija sadrži pufer, koji je sposoban da puferuje rastvor do pH vrednosti u opsegu od 4 do 10, kao što je 5 do 9, na primer 6 do 8.
[0102] Pufer može na primer biti odabran iz grupe koja se sastoji od Tris, acetatnog, glutamatnog, laktatnog, maleatnog, tartratnog, fosfatnog, citratnog, karbonatnog, glicinatnog, L-histidinskog, glicinskog, sukcinatnog i trietanolaminskog pufera.
[0103] Pufer se dalje može, na primer, odabrati od USP kompatiblnih pufera za parenteralnu primenu, posebno, kada je farmaceutska formulacija za parenteralnu primenu. Na primer pufer se može odabrati iz grupe koja se sastoji od jednobaznih kiselina kao što su sirćetna, benzoeva, glukonska, glicerinska i mlečna; dvobaznih kiselina kao što su akonitinska, adipinska, askorbinska, ugljena, glutaminska, jabučna, jantarna i vinska, polibaznih kiselina kao što su limunska i fosforna; i baza kao što su amonijak, dietanolamin, glicin, trietanolamin i Tris.
[0104] Parenteralni nosači (za subkutanu, intravensku, intraarterijsku ili intramuskularnu injekciju) uključuju rastvor natrijum hlorida, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum hlorid, Ringerov rastvor laktata i fiksna ulja. Intravenski nosači uključuju fluid i punioce hranjivih materija, punioce elektrolita kao što su oni na bazi Ringerove dekstroze, i slično. Primeri su sterilne tečnosti kao što su voda i ulja, sa ili bez dodataka surfaktanta i drugih farmaceutski prihvatljivih adjuvanasa. Uopšteno govoreći, voda, slani rastvor, vodeni rastvor dekstroze i srodni rastvori šećera, glikoli kao što su propilen glikoli ili polietilen glikol, Polisorbat 80 (PS-80), Polisorbat 20 (PS-20) i Poloksamer 188 (P188) su poželjni tečni nosači, posebno za rastvore za injekcije. Primeri ulja su ulja životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, na primer, ulje od kikirikija, sojino ulje, maslinovo ulje, suncokretovo ulje, ulje riblje jetre, drugo morsko ulje, ili lipid iz mleka ili jaja.
[0105] Formulacije mogu takođe da sadrže surfaktant. Poželjni surfaktanti uključuju, ali nisu ograničeni na: surfaktante polioksietilen sorbitan estre (obično se nazivaju Tweens), posebno PS-20 i PS-80; kopolimere etilen oksida (EO), propilen oksid (PO), i/ili butilen oksid (BO), koji se prodaju pod trgovačkim imenom DOWFAX<™>, kao što su linearni EO/PO blok kopolimeri; oktoksinoli, koji mogu da variraju u broju ponavljajućih etoksi (oksi-1,2-etandiil) grupa, pri čemu je oktoksinol-9 (Triton X-100, ili t-oktilfenoksipolietoksietanol) od posebnog interesa; (oktilfenoksi)polietoksietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolipidi kao što je fosfatidilholin (lecitin); nonilfenol etoksilati, kao što su serije Tergitol<™>NP; polioksietilen masni etri izvedeni iz lauril, cetil, stearil i oleil alkohola (poznati kao Brij surfaktanti), kao što je trietilenglikol monolauril etar (Brij 30); i sorbitan estri (obično poznati kao SPAN), kao što su sorbitan trioleat (Span 85) i sorbitan monolaurat. Poželjni surfaktant za uključivanje u emulziju je PS-20 ili PS-80.
[0106] Mogu se koristiti smeše surfaktanata, npr. smeša PS-80/Span 85. Kombinacija polioksietilen sorbitan estra kao što je polioksietilen sorbitan monooleat (PS-80) i oktoksinola, kao što je t-oktilfenoksipolietoksietanol (Triton X-100) je takođe pogodna. Druga korisna kombinacija lauret 9 plus polioksietilen sorbitan estar i/ili oktoksinol.
[0107] Poželjne količine surfaktanata su: polioksietilen sorbitan estri (kao što je PS-80) 0.01 do 1% m/v, posebno oko 0.1% m/v; oktil- ili nonilfenoksi polioksietanoli (kao što je Triton X-100, ili drugi deterdženti iz serija Triton) 0.001 do 0.1% m/v, posebno 0.005 do 0.02% m/v; polioksietilen etri (kao što je lauret 9) 0.1 do 20% m/v, poželjno 0.1 do 10% m/v i posebno 0.1 do 1% m/v ili oko 0.5% m/v.
[0108] Možda će biti potrebno optimizovati izbor surfaktanta za različite lekove i lekovite supstance. Za multivalentne vakcine koje sadrže 15 ili više polisaharidnih serotipova S. pneumoniae, poželjni su PS-20 i P188. Izbor hemizama koja se koristi za dobijanje konjugata takođe može uticati na stabilizaciju formulacije. Konkretno, kao što je ilustrovano u nastavku, pneumokokni konjugati polisaharid-protein pripremljeni u vodenom ili DMSO rastvaraču i kombinovani u multivalentnoj kompoziciji pokazuju značajne razlike u stabilnosti u zavisnosti od određenih surfaktantnih sistema koji se koriste za formulaciju.
[0109] Za formulacije koje su ovde opisane, poloksamer generalno ima molekulsku masu u opsegu od 1,100 Da do 17,400 Da, od 7,500 Da do 15,000 Da ili od 7,500 Da do 10,000 Da. Poloksamer se može odabrati od poloksamera 188 ili poloksamera 407. Konačna koncentracija poloksamera u formulacijama predmetnog pronalaska je od 0.001 do 5% m/v, ili 0.025 do 1% m/v. Sistem surfaktanta koji sadrži poloksamer mora dalje da sadrži poliol. U određenim aspektima, poliol je propilen glikol i ima konačnu koncentraciju od 1 do 20% m/v. U određenim aspektima, poliol je polietilen glikol 400 i ima konačnu koncentraciju od 1 do 20% m/v.
[0110] Pogodni polioli za formulacije su polimerni polioli, posebno polietar dioli uključuju, ali nisu ograničeni na, propilen glikol i polietilen glikol, polietilen glikol monometil etre. Propilen glikol je dostupan u rasponu molekulskih masa monomera od -425 Da do -2,700 Da. Polietilen glikol i polietilen glikol monometil etar su takođe dostupni u rasponu molekulskih masa u rasponu od ~200 Da do -35,000 Da uključujući ali ne ograničavajući se na PEG200, PEG300, PEG400, PEG1000, PEG MME 550, PEG MME 600, PEG MME 2000, PEG MME 3350 i PEG MME 4000. Poželjni polietilen glikol je polietilen glikol 400. Konačna koncentracija poliola u formulacijama može biti 1 do 20% m/v ili 6 do 20% m/v.
[0111] Formulacija takođe sadrži pH-puferovani rastvor soli u vodi. Pufer može biti, na primer, odabran iz grupe koja se sastoji od Tris, acetatnog, glutamatnog, laktatnog, maleatnog, tartratnog, fosfatnog, citratnog, karbonatnog, glicinatnog, L-histidinskog, glicinskog, sukcinatnog, HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonske kiseline), MOPS (3-(N-morfolino)propansulfonske kiseline), MES (2-(N-morfolino)etansulfonske kiseline) i trietanolaminskog pufera. Pufer je sposoban da puferuje rastvor do pH vrednosti u opsegu od 4 do 10, 5.2 to 7.5 ili 5.8 do 7.0. U određenim aspektima, pufer je odabran iz grupe koja se sastoji od fosfata, sukcinata, L-histidina, MES, MOPS, HEPES, acetata ili citrata. Pufer se dalje može, na primer, odabrati od USP kompatibilnih pufera za parenteralnu primenu, posebno, kada je farmaceutska formulacija za parenteralnu primenu. Koncentracije pufera će se kretati od 1 mM do 50 mM ili 5 mM do 50 mM. U određenim aspektima, pufer je L-histidin u konačnoj koncentraciji od 5 mM do 50 mM, ili sukcinat u konačnoj koncentraciji od 1 mM do 10 mM. U određenim aspektima, L-histidin je u konačnoj koncentraciji od 20 mM ± 2 mM.
[0112] Dok je rastvor soli u vodi (tj., rastvor koji sadrži NaCl) poželjan, druge soli pogodne za formulaciju uključuju ali nisu ograničene na, CaCl2, KCl i MgCl2i njihove kombinacije. Nejonski izotonični agensi koji uključuju ali ne ograničavaju se na saharozu, trehalozu, manitol, sorbitol i glicerol mogu se koristiti umesto soli. Pogodni opsezi soli uključuju, ali nisu ograničeni na 25 mM do 500 mM ili 40 mM do 170 mM. U jednom aspektu, rastvor soli u void je NaCl, po izboru prisutan u koncentraciji od 20 mM do 170 mM.
[0113] U poželjnom tehničkom rešenju, formulacije sadrže L-histidinski pufer sa natrijum hloridom.
[0114] U drugom tehničkom rešenju, farmaceutska kompozicija se isporučuje u sistemu sa kontrolisanim oslobađanjem. Na primer, agens se može administrirati primenom intravenske infuzije, transdermalnog flastera, lipozoma, ili drugim načinima administriranja. U drugom tehničkom rešenju, koriste se polimerni materijali; npr. u mikrosferama ili implantu.
[0115] Kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe uključiti jedan ili više proteina iz S. pneumoniae. Primeri protein S. pneumoniae pogodni za inkluziju uključuju one identifikovane u objavi međunarodne patentne prijave sa brojevima WO 02/083855 i WO 02/053761.
Analitičke metode
Analiza molekulske mase i koncentracije konjugata korišćenjem HPSEC/UV/MALS/RI testa
[0116] Uzorci konjugata se injektiraju i odvajaju hromatografijom visokih performansi sa isključenjem veličine (HPSEC - high performance size-exclusion hromatografija). Detekcija se postiže detektorima ultraljubičaste svetlosti (UV), višeugaonog rasejanja svetlosti (MALS) i indeksa prelamanja (RI) u serijama. Koncentracija proteina se izračunava iz UV280 korišćenjem koeficijenta ekstinkcije. Koncentracija polisaharida je razbijena na sastojke od RI signala (kojima doprinose i protein i polisaharid) korišćenjem dn/dc faktora koji predstavljaju promenu indeksa prelamanja rastvora sa promenom koncentracije rastvorene supstance prijavljene u mL/g. Prosečna molekulska masa uzoraka je izračunata pomoću softvera Astra (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, Kalifornija) korišćenjem izmerene koncentracije i informacije o rasejanju svetlosi po celom piku uzorka. Postoji više oblika prosečnih vrednosti molekulske mase za polidisperzne molekule. Na primer, broj prosečne molekulske mase Mn, masa prosečne molekulske mase Mm, i z-prosečna molekulska masa Mz (Molecules, 2015, 20:10313-10341). Osim ako nije navedeno, pojam "molekulska masa", kako se koristi u celoj specifikaciji, je prosečna masa molekulske mase.
Određivanje potrošnje lizina u konjugovanom proteinu kao mera broja kovalentnih veza između polisaharida i proteinskog nosača
[0117] WatersAccQ-Tag analiza aminokiselina (AAA) se koristi za merenje stepena konjugacije u uzorcima konjugata. Uzorci se hidrolizuju korišćenjem kiselinske hidrolize u parnoj fazi na Eldex radnoj stanici, da bi se proteini nosači razbili na njihove sastavne aminokiseline. Slobodne aminokiseline su derivatizovane korišćenjem 6-aminohinolil-N-hidroksisukcinimidil karbamata (AQC). Derivatizovani uzorci se zatim analiziraju korišćenjem UPLC sa UV detekcijom na C18 koloni. Prosečna koncentracija proteina se dobija korišćenjem reprezentativnih aminokiselina osim lizina. Potrošnja lizina tokom konjugacije (tj., gubitak lizina) određena je iz razlike između prosečne izmerene količine lizina u konjugatu i očekivane količine lizina u početnom proteinu.
Testiranje slobodnog polisaharida
[0118] Slobodni polisaharid (tj., polisaharid koji nije konjugovan sa CRM197) u uzorku konjugata se meri prvo taloženjem slobodnog proteina i konjugata sa dioksiholatom (DOC) i hlorovodoničnom kiselinom. Precipitati se zatim filtriraju i filtrati se analiziraju u odnosu na koncentraciju slobodnog polisaharida pomoću HPSEC/UV/MALS/RI. Slobodni polisaharid se izračunava kao procenat ukupnog polisaharida merenog pomoću HPSEC/UV/MALS/RI.
Testiranje slobodnog proteina
[0119] Slobodni polisaharid, konjugat polisaharid-CRM197 i slobodni CRM197 u uzorcima konjugata se razdvajaju kapilarnom elektroforezom u režimu micelarne elektrokinetičke hromatografije (MEKC). Ukratko, uzorci se mešaju sa MEKC radnim puferom koji sadrži 25 mM borata, 100 mM SDS, pH 9.3, i razdvoje se u prethodno kondicioniranoj “bare-fused” kapilari silicijum dioksida. Razdvajanje se prati na 200 nm i slobodni CRM197 se kvantifikuje CRM197 standardnom krivom. Rezultati slobodnog proteina se prikazuju kao procenat ukupnog sadržaja proteina određen HPSEC/UV/MALS/RI procedurom.
[0120] Sledeći primeri ilustruju ali ne ograničavaju predmetni pronalazak.
PRIMERI
PRIMER 1: Dobijanje kapsularnih polisaharida S. pneumoniae
[0121] Postupci kultivacije pneumokoka su dobro poznati u oblasti. Videti, npr., Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52. Postupci dobijanja pneumokoknih kapsularnih polisaharida su takođe dobro poznati u oblasti. Videti, npr., evropski patent sa brojem EP 0497524 B 1. Dole opisani proces generalno sledi postupak koji je opisan u evropskom patentu sa brojem EP 0497 524 B1 i generalno je primenljiv na sve pneumokokne serotipove, osim na one gde je posebno modifikovan.
[0122] Izolati pneumokoknog podtipa 24F dobijeni su iz Merck kolekcije kultura. Gde je potrebno, podtipovi se mogu razlikovati na osnovu Quelling reakcije korišćenjem specifičnih antiseruma. Videti, npr., američki patent sa brojem 5,847,112. Dobijeni izolati su dalje klonski izolovani serijskim nanošenjem u dve faze na agar ploče koje se sastoje od medijuma bez životinjskih komponenti koji sadrži sojin pepton, ekstrakt kvasca i glukozu bez hemina. Klonski izolati za svaki serotip su dalje prošireni u tečnoj kulturi koristeći medijum bez životinjskih komponenti koji sadrži sojin pepton, ekstrakt kvasca, HEPES, natrijum hlorid, natrijum bikarbonat, kalijum fosfat, glukozu i glicerol da bi se pripremile banke pre master ćelija.
[0123] Dobijanje svakog serotipa pneumokoknog polisaharida sastojalo se od ekspanzije ćelije i fermentacije za proizvodnju serije praćene hemijskom inaktivacijom pre daljeg prečišćavanja. Bočica sa odmrznutim ćelijskim bankama iz svakog serotipa je proširena korišćenjem levka za mućkanje ili boce za kulturu koja sadrži prethodno sterilisani medijum za rast bez životinjskih komponenti koji sadrži sojin pepton ili ultrafiltrat sojinog peptona, ekstrakt kvasca ili ultrafiltrat ekstrakta kvasca, HEPES, natrijum hlorid, natrijum bikarbonat, kalijum fosfat i glukozu. Kultura ćelijske ekspanzije je uzgajana u zatvorenom levku ili boci za mućkanje da bi se minimizirala razmena gasa uz kontrolu temperature i mešanja. Nakon postizanja određene gustine kulture, merene optičkom gustinom na 600 nm, deo ćelijske ekspanzione kulture je prebačen u proizvodni fermentor koji sadrži prethodno sterilisanu podlogu za rast bez životinjskih komponenti koja sadrži sojin pepton ili ultrafiltrat sojinog peptona, ekstrakt kvasca ili ultrafiltrat ekstrakta kvasca, natrijum hlorid, kalijum fosfat i glukozu. Kontrolisani su temperatura, pH, pritisak i mešanje. Protok vazduha za prekrivanje je takođe kontrolisan jer nije korišćeno prskanje.
[0124] Serijska fermentacija je prekinuta dodavanjem hemijskog inaktivirajućeg agensa, fenola, kada je glukoza bila skoro potrošena. Čist fenol je dodat do konačne koncentracije od 0.8 - 1.2% da bi se ćelije inaktivirale i oslobodio kapsularni polisaharid iz ćelijskog zida. Primarna inaktivacija se dešava u određenom vremenu u fermentoru gde temperatura i mešanje nastavljaju da se kontrolišu. Nakon primarne inaktivacije, serija je prebačena u drugu posudu gde je dodatno držana određeno vreme na kontrolisanoj temperaturi i mešanju do konačne inaktivacije. Ovo je potvrđeno ili tehnikama zasejavanja mikroba ili verifikacijom koncentracije fenola i određenog vremena. Inaktivirani bujon je zatim prečišćen.
Prečišćavanje Ps
[0125] Prečišćavanje pneumokoknog polisaharida sastojalo se od nekoliko koraka centrifugiranja, dubinske filtracije, operacija koncentrovanja/dijafiltracije i precipitacije. Sve procedure su izvedne na sobnoj temperaturi osim ako nije drugačije naznačeno.
[0126] Inaktivirani bujon iz fermentorskih kultura S. pneumoniae je flokulisan sa katjonskim polimerom (kao što je BPA-1000, petrolit "Tretolite" i "Spektar 8160" i poli(etilenimin), "Millipore pDADMAC"). Katjonski polimeri su se vezali za proteinske nečistoće, nukleinske kiseline i ćelijske ostatke. Nakon koraka flokulacije i perioda sazrevanja, flokulisane čvrste materije su uklonjene centrifugiranjem i višestrukim koracima dubinske filtracije. Prečišćeni bujon je koncentrovan i dijafiltriran korišćenjem filtera od 100 kDa do 500 kDa MWCO (isključivanje po molekulskoj masi). Dijafiltracija je obavljena korišćenjem Tris, MgCl2pufera i natrijum fosfatnog pufera. Diafiltracijom su uklonjeni zaostala nukleinska kiselina i protein.
[0127] Dalje uklanjanje nešistoća je postignuto reprecipitacijom polisaharida u natrijum acetatu i fenolu sa denaturisanim alkoholom i/ili izopropanolom. Tokom koraka taloženja fenola, natrijum acetat u natrijum fosfatnom slanom rastvoru i fenol (tečni fenoli ili čvrsti fenoli) su stavljeni u dijafiltrirani ostatak. Alkoholno frakcionisanje polisaharida je zatim sprovedeno u dve faze. U prvoj fazi, preparatu je dodat alkohol sa niskim procentom da se istalože ćelijski ostaci i druge neželjene nečistoće, dok je sirovi polisaharid ostao u rastvoru. Nečistoće su uklonjene centrifugiranjem nakon čega je usledio korak dubinske filtracije. Polisaharid je zatim izvučen iz rastvora dodavanjem u seriju dodatnog izopropanola ili denaturisanog alkohola. Precipitirani polisaharidni pelet je sakupljen centrifugiranjem, trituriran i osušen kao prah i čuvan zamrznut na -70°C.
PRIMER 2: NMR strukturne analize polisaharida
[0128] Strategija za određivanje strukture polisaharida uključivala je proces u više koraka koji je izveden u suštini kao što je opisano u Abeygunawardana i sarad., Determination of the Chemical Structure of Complex Polysaccharides by Heteronuclear NMR Spectroscopy in Advances in Biophysical Chemistry 1993, tom 3, strane 199-249, JAI Press Inc. Prečišćeni polisaharidi su ispitivani korišćenjem standardnih 1D i 2D NMR tehnika. Konačno, polisaharidi su ispitani na prisustvo fosfata korišćenjem<31>P NMR.
[0129] Označavanje ostataka monosaharida je izvršeno putem<1>H-<1>H COSY, dvostruko kvantno filtriranog homonuklearnog COSY i ukupne korelacione spektroskopije (TOCSY).<13>C hemijska pomeranja su dodeljena heteronuklearnom jednostrukom kvantnom koherentnom spektroskopijom (HSQC) i kombinacijom HSQC-TOCSY. Višestruko uređen HSQC je korišćen da se razlikuje metilen od metinskih grupa. Međurezidualne veze su određene kombinacijom HMBC i NOESY spektroskopije. Anomerna konfiguracija ostataka je određena iz anomernih protonskih i ugljenikovih hemijskih pomeranja, vrednosti<3>JH1,H2i<1>JH1,C1. Anomernu konfiguraciju furanoznih prstena je teško proceniti na osnovu vrednosti<3>JH1,H2and<1>JH1,C1, stoga je za ovo određivanje korišćena dugotrajna sprega protona prstena iz anomernog ugljenika.
[0130] 1D fosforna NMR spektroskopija je pokazala da polisaharidi serotipa 24F sadrže fosfor u strukturi. Određivanje mesta veza fosfora je obavljeno putem<1>H-<31>P HMBC spektroskopije na prečišćenom (sl. 5A) i perjodatom oksidovanom (sl.5B) polisaharidu.
[0131] Na osnovu NMR podataka na sl. 2-5, struktura polisaharida serotipa 24F S. pneumoniae utvrđeno je sledeće:
pri čemu n predstavlja broj ponavljajućih jedinica koje čine polisaharid. Videti takođe sl.1A.
[0132] Ostaci šećera uključuju ramnozu (Rha), ribozu (Rib), glukozu (Glc) i arabinitol. Jedan od ostataka glukoze je N-acetilovan. Riboza je u obliku furanoze.
[0133] Kurzivna slova (p i f) odnose se na piranozu (zatvoreni prsten koji se sastoji od šest atoma) i furanozu (zatvorni i prsten koji se sastoji od pet atoma).
[0134] α i β se odnosi na konfiguraciju protona vezanog za anomerni ugljenik jedinice šećera. Anomerni ugljenik je uvek broj 1 kada se označava atom ugljenika u jedinici šećera (obično od 1 do 6). α znači da je anomerni proton u ekvatorijalnoj poziciji u 3D strukturi. β znači da je anomerni proton u aksijalnoj poziciji.
[0135] Brojevi povezani sa strelicama odnose se na to kako su pojedinačne jedinice šećera međusobno povezane. Na primer, nomenklatura α-Rhap-(1→3)-α-Glcp- znači da je ugljenik broj 1 ramnoze povezan sa ugljenikom broj 3 glukoze (p znači da su oba piranozni prstenovi).
Identifikacija glavnog aktivnog mesta na polisaharidu serotipa 24F S. pneumoniae
[0136] Utvrđeno je da je glavno aktivno mesto na serotipu 24F S. pneumoniae na drugom ugljeniku bočnog lanca arabinitola.
[0137] Oksidovani polisaharid serotipa 24F je liofilizovan a zatim ponovo rastvoren sa deuterijum oksidom za NMR analizu. NMR experimenti su izvedeni na 600 MHz na temperaturi sonde od 37°C korišćenjem kriogenski hlađene sonde. Jednodimenzionalni (1D) protonski spektar je dobijen korišćenjem impulsa od 90 stepeni sa 16 tranzijenta i kašnjenjem od 10 sekundi između pulseva (uključujući 3 sekunde vremena prikupljanja). Gradijent COSY i TOCSY podaci su dobijeni sa 4 odnosno 16 tranzijenta (redom) u prvoj dimenziji i 512 inkremenata u drugoj dimenziji. 1D TOCSY, usresređen na triplet na 5.19 ppm, dobijen je sa 1024 tranzijenta sa vremenom recikliranje od 10 sekundi (uključujući 3 sekunde vremena prikupljanja) i vremenom mešanja od 90 ms. Dobijen je višestruko uređen gHSQCAD sa 64 tranzijenta i 512 inkremenata.
[0138] U poređenju sa neaktiviranim polisaharidom, 1D protonski spektar je pokazao dodatni signal (triplet) u anomernom regionu na 5.19 ppm. Podaci gCOSY i TOCSY pokazali su unakrsni pik od signala na 5.19 ppm do signala na 3.86 ppm. 1D TOCSY se selektivnom trakom centriranom na 5.19 ppm pokazao je samo jednu korelaciju sa tripletom na 3.86 ppm (slika 6). Podaci gHSQCAD dali su hemijska pomeranja ugljenika na 91.13 ppm (signal na 5.19 ppm) i 70.79 ppm (signal na 3.86 ppm). Hemijsko pomeranje ugljenika na 91.13 ppm je blago naviše od mesta gde se obično primećuju anomerni signali koji ukazuju na to da je to hidratisani aldehid. Drugi signal na 70.69 ppm identifikovan je kao metilen (metilenski ugljenici imaju suprotnu fazu metina i metil ugljenika u višestruko uređenom gHSQCAD eksperimentu; Slika 7). Ovi podaci pokazuju da je proton na 5.19 ppm (od hidratisnog aldehida) u blizini metilenske grupe (3.86 ppm protona i 70.69 ppm ugljenika). Jedino mesto gde bi se ovo moglo dogoditi, na osnovu strukture 24F polisaharida, je bočni lanac arabinitola na ugljeniku 2.
[0139] Formiranje aldehida pretežno na drugom ugljeniku bilo je iznenađujuće po tome što zahteva selektivno cepanje 2,3-ugljenika sa vicinalnim diolima ili poželjne kontinuirane serije oksidacije na ugljenicima sa višim brojevima sa vicinalnim diolima (ili aldehidom) do konačne oksidacije na 2. ugljeniku arabinitol šećera.
PRIMER 3: Konjugacija polisaharida serotipa 24F S. pneumoniae sa CRM197 korišćenjem reduktivne aminacije u dimetilsulfoksidu
[0140] Polisaharid je rastvoren, dimenzionisan do ciljne molekulske mase, hemijski aktiviran i puferom zamenjen ultrafiltracijom. Aktivirani polisaharid i prečišćeni CRM197 su pojedinačno liofilizovani i ponovo rastvoreni u dimetil sulfoksidu (DMSO). Rastvori ponovo rastvorenog polisaharida i CRM197 su zatim kombinovani i konjugovani kako je opisano u nastavku. Dobijeni konjugat je prečišćen ultrafiltracijom pre konačne filtracije pri 0.2-mikrona. Nekoliko parametara procesa u svakom koraku, kao što su pH, temperatura, koncentracija i vreme, kontrolisano je da bi se dobili konjugati sa željenim atributima.
Smanjenje veličine i oksidacija polisaharida
[0141] Prečišćeni pneumokokni kapsularni Ps prah je rastvoren u vodi i filtriran na filteru od 0.45-mikrona. Veličina rastvorenog polisaharida je smanjena kiselom hidrolizom dodavanjem sirćetne kiseline do 200 mM, inkubacijom na 92°C tokom 50 minuta, zatim neurtralizovanjem dodavanjem hladnog pufera kalijum fosfata pH 7 do 400 mM.
[0142] Polisaharid smanjene veličine je koncentrovan i dijafiltriran u odnosu na vodu korišćenjem membrane za ultrafiltraciju sa tangencijalnim protokom od 5 NMWCO.
[0143] Rastvor polisaharida je zatim podešen na 22°C i pH 5 sa natrijum acetatnim puferom da bi se minimalizovalo smanjenje veličine polisaharida usled aktivacije. Aktivacija polisaharida je započeta dodatkom 100 mM rastvora natrijum metaperjodata. Dodati natrijum metaperjodat je bio 0.18-0.21 mola natrijum metaperjodata po molu ponavljajuće jedinice polisaharida da bi se postigao ciljani nivo aktivacije polisaharida (molovi aldehida po molu ponavljajuće jedinice polisaharida). Reakcija oksidacije je trajala 2 sata na 22°C.
[0144] Aktivirani proizvod je dijafiltriran u odnosu na 10 mM kalijum fosfat, pH 6.4 a zatim je usledila dijafiltracija u odnosu na vodu korišćenjem membrane za ultrafiltraciju sa tangencijalnim protokom od 5 kDa NMWCO. Ultrafiltracija je sprovedena na 2-8°C.
Konjugacija polisaharida sa CRM197
[0145] Prečišćen CRM197, dobijen ekspresijom u Pseudomonas fluorescens kao što je prethodno opisano (WO 2012/173876 A1), je dijafiltriran n u odnosu na 2 mM fosfatni puffer pH 7.0, korišćenjem membrane za ultrafiltraciju sa tangencijalnim protokom 5 kDa NMWCO.
[0146] Aktivirani polisaharidi su formulisani za liofilizaciju pri 2 mg Ps/mL sa koncentracijom saharoze od 10% m/v. CRM197 je formulisan za liofilizaciju pri 6 mg Pr/mL sa koncentracijom saharoze od 1% m/v.
[0147] Formulisani rastvori Ps i CRM197 su pojedinačno liofilizovani. Liofilizovani Ps i CRM197 materijali su ponovo rastvoreni pojedinačno u jednakim zapreminama DMSO. Rastvor polisaharida je napunjen sa natrijum hloridom do konačne koncentracije od 20-50 mM. Rastvori polisaharida i CRM197 su pomešani da bi se postigla koncentracija polisaharida od 1.4-1.5 g Ps/L (grami polisaharida/litru) i maseni odnos polisaharida u odnosu na CRM197 od 1.5. Maseni odnos je odabran da kontroliše odnos polisaharida u odnosu na CRM197 u rezultujućem konjugatu. Dodat je natrijum cijanoborohidrid (1 mol po molu ponavljajuće jedinice polisaharida) i konjugacija je nastavljena 2 sata na 22°C.
Redukcija sa natrijum borohidridom
[0148] Natrijum borohidrid (2 mola po molu ponavljajuće jedinice polisaharida) je dodat nakon reakcije konjugacije i inkubiran 1 sat na 22°C. Serija je razblažena u 150 mM natrijum hlorida, sa približno 0.025% (m/v) polisorbata 20, na približno 4°C. Zatim je dodat kalijum fosfatni pufer da se dobijene neutralna pH vrednost. Za neke serije, serija je koncentrovana i dijafiltrirana na približno 4°C naspram 150 mM natrijum hlorida, 25 mM kalijum fosfata pH 7, korišćenjem membrane za ultrafiltraciju sa tangencijalnim protokom 30 kD NMWCO.
Završno filtriranje i skladištenje proizvoda
[0149] Serija je zatim koncentrovana i dijafiltrirana u odnosu na 10 mM histidina u 150 mM natrijum hlorida, pH 7.0, sa 0.015% (m/v) polisorbata 20, na 4°C korišćenjem 300 kDa NMWCO tangencijalnog protoka ultrafiltracione membrane.
[0150] Serija ostataka je filtrirana pri 0.2 mikrona a zatim razblažena sa dodatnih 10 mM histidina u 150 mM natrijum hlorida, pH 7.0 sa 0.015% (m/v) polisorbata 20, raspoređena u alikvote i zamrznuta na ≤ -60°C.
[0151] Tabela 1 prikazuje osobine za polisaharidni konjugat serotipa 24F S. pneumoniae pripremljen u DMSO-u.
Tabela 1. Osobine polisaharidnog konjugata serotipa 24F S. pneumoniae iz DMSO konjugacije
PRIMER 4: Formulacija monovalentnih konjugata
[0152] Konjugati pneumokoknog polisaharid-CRM197 su dobijeni kao što je opisano u primeru 3. Potrebna zapremina konjugata u masi koja je potrebna da bi se dobila ciljna koncentracija pojedinačnih serotipova izračunata je na osnovu zapremine serije i koncentracije pojedinačnih koncentracija polisaharida u masi. Serija konjugata serotip 24F S. pneumoniae je kombinovana sa ekscipijensima, sterilno filtriranim i dodatim u APA pod uslovima mešanja. Konačna koncentracija monovalentne konjugatne vakcine serotipa 24F S. pneumoniae bila je 4 µg/mL (m/v PnPs) sa 20 mM histidina, 150 mM NaCl, 0.2% (w/v) PS-20 i 0.250 mg/mL (m/v Al) u obliku APA.
PRIMER 5: Studija imunogenosti monovalentnog konjugata kod novozelandskog belog zeca
[0153] Imunogenost monovalentnih konjugata je procenjena na modelu novozelandskog belog zeca (NZWR - New Zealand White Rabbit). Odrasli novozelandski beli zečevi (NZWR, n=3/grupa) su intramuskularno (IM) imunizovani sa 0.25 ml odgovarajuće monovalentne konjugovane vakcine 0. dana i 14. dana (naizmenične strane). Monovalentna pneumokokna vakcina je dozirana sa 1 µg PnPs (polisaharid serotipa 24F S. pneumoniae konjugovan sa CRM197) sa 62.5 µg aluminijum fosfatnog adjuvansa (APA) po imunizaciji. Serumi su sakupljeni pre početka studije (pre-imuni) i 14. dana (posle doze 1, PD1) i 28. (posle doze 2, PD2). NZWR su posmatrani najmanje dnevno od strane obučenog osoblja za brigu o životinjama zbog bilo kakvih znakova bolesti ili iscrpljenosti. Formulacije vakcine u NZWR su smatrane bezbednim i dobro se tolerišu. Svi eksperimenti na životinjama izvedeni su u strogom skladu sa preporukama u Vodiču za negu i upotrebu laboratorijskih životinja Nacionalnog institute za zdravlje. Eksperimentalni protokol NZWR-a odobrili su Institucionalni komiteti za negu i upotrbu životinja u kompanijama Merck & Co., Inc (Kenilworth, NJ) i Covance (Denver, PA).
[0154] NZWR serumi su testirani u ELISA testovima da bi se procenila imunogenost IgG korišćenjem odgovarajuće koncentracije PnPs omotača od 1-2 mg/ml. Funkcionalno antitelo je određeno testovima opsonofagocitoze (OPA) na osnovu prethodno opisanih protokola. Videti, npr., Caro-Aguilar i sarad., 2017, Vaccine 35:865-72 i Burton i sarad., 2006, Clin Vaccine Immunol 13(9): 1004-9.
[0155] Utvrđeno je da su monovalentne pneumokokne konjugatne vakcine iz serotipa 24F S. pneumoniae imunogene kod zečeva (slika 8) i stvaraju funkcionalno antitelo koje je ubilo odgovarajući bakterijski soj (slika 9).
PRIMER 6: Studija izazivanja monovalentnog konjugata kod miša
[0156] Da bi se potvrdila imunogenost glikokonjugata S. pneumoniae serotip 24, oni su testirani na modelu izazivanja miša. Mladi miševi (stari 6-8 nedelja) su imunizovan sa 0.1 ml 24F-CRM197 monovalentne konjugatne vakcine 0, 14. i 28. dana (n=10/grupa). C57BL/6 miševi Swiss Webster miševi su intraperitonealno (IP) imunizovani sa 0.1 ml injektovanih na jednom mestu. CD-1 miševi su intramuskularno (IM) imunizovani sa 0.05 ml injektovanih na dva mesta. Monovalentna pneumokokna vakcina je dozirana na 0.4 µg PnPs (24F polisaharid konjugovan sa CRM197) sa 25 µg aluminijum fosfatnog adjuvansa (APA) po imunizaciji. Obučeno osoblje za brigu o životinjama posmatralo je miševe najmanje svaki dan zbog bilo kakvih znakova bolesti ili iscrpljenosti. Smatralo se da su formulacije vakcine kod miševa bezbedne i da se dobro tolerišu.
[0157] 52. dana, miševi su intratrahealno izazvani sa serotipom 24F S. pneumoniae. Kulture eksponencijalne faze S. pneumoniae su centrifugirane, isprane i suspendovane u sterilnom PBS-u. Miševi su anestezirani izofluranom pre izazivanja.10<6>cfu S. pneumoniae u 0.1ml PBS-a stavljeno je u grlo miševa obešenih uspravno za sekutiće. Aspiracija bakterija je izazvana blagim povlačenjem jezika ka spolja i pokrivanjem nozdrva. Miševi su svakodnevno mereni i eutanazirani ako je gubitak težine premašio 20% početne težine. Krv je sakupljana na 24 sata, 48 sati i 72 sata da bi se procenila bakterijemija. Miševe je posmatralo obučeno osoblje za brigu o životinjama najmanje dva puta dnevno zbog bilo kakvih znakova bolesti ili iscrpljenosti. Svi eksperimenti na životinjama izvedeni su u strogom skladu sa preporukama u Vodiču za negu i upotrebu laboratorijskih životinja Nacionalnog institute za zdravlje. Eksperimentalni protokol za miševe odobrio je Komitet za institucionalnu negu i upotrebu životinja u kompaniji Merck & Co., Inc.
[0158] Utvrđeno je da 24F-CRM197 monovalentna pneumokoknna konjugovana vakcina obezbeđuje zaštitu kod sva tri soja miševa nakon izazivanja sa 24F S. pneumoniae. Videti slike 10-12.
PRIMER 7: Formulacija pneumokoknih konjugovanih vakcina za polivalentnu studiju zečeva
[0159] Multivalentna pneumokokna konjugovana vakcina koja se sastoji od različite konjugovane smeše preparata u masi (uključujući serotipove 16F, 23A, 23B, 24F i 31 iz S. pneumoniae) koja je dobijena korišćenjem pneumokoknih konjugata polisaharid-CRM197 i formulisana je u 20 mM histidina pH 5.8 i 150 mM natrijum hlorida i 0.1% m/v Polisorbata-20 (PS-20) na 4 µg/mL svakog serotipa za ukupnu koncentraciju polisaharida od 84 µg/mL. Konjugati su dobijeni individualnom konjugacijom proteina CRM197 sa tipovima pneumokoknog polisaharida (PnPs) (uključujući serotipove 16F, 23A, 23B, 24F i 31 iz S. pneumoniae). Potrebna zapremina mase konjugata potrebna za dobijanje ciljne koncentracije pojedinačnih serotipova izračunata je na osnovu serije zapremine i koncentracije pojedinačnih koncentracija u masi polisaharida. Pojedinačni konjugati su dodati u rastvor histidina, natrijum hlorida i Polisorbata-20 (PS-20) da bi se stvorila smeša konjugata. Posuda za formulaciju koja sadrži smešu konjugata je mešana korišćenjem magnetne mešalice, i sterilno filtrirana u drugu posudu. Formulacije su zatim punjene u plastične špriceve, staklene špriceve ili bočice i čuvane na 2-8°C.
PRIMER 8: Imunogenost multivalentne pneumokokne konjugovane vakcine kod novozelandskih belih zečeva
[0160] Odrasli novozelandski beli zečevi (NZWR, n=5/grupa) su intramuskularno (IM) imunizovani sa 0.5 ml 21-valentne pneumokokne konjugovane vakcine opisane u primeru 7, 0. i 14. dana (naizmenične strane). PCV21 pneumokokna vakcina je dozirana sa 2 µg svakog konjugovanog PnPs po imunizaciji. Serumi su prikupljeni pre početka studije (pre-imuni) i 14. dana (posle doze 1, PD1) i 28. (posle doze 2, PD2). Obučeno osoblje za brigu o životinjama je posmatralo NZWs najmanje dnevno zbog bilo kakvih znakova bolesti ili iscrpljenosti. Formulacije vakcine u NZWR-a su smatrane bezbednim i dobro se tolerišu. Svi eksperimenti na životinjama izvedeni su u strogom skladu sa preporukama u Vodiču za negu i upotrebu laboratorijskih životinja Nacionalnog institute za zdravlje. Eksperimentalni protokol NZWR odobrili su Institucionalni komiteti za negu i upotrebu životinja u kompanijama Merck & Co., Inc i Covance (Denver, PA).
[0161] NZWR serumi su procenjeni na IgG imunogenost korišćenjem multipleksnog testa elektrohemiluminescencije (ECL). Ovaj test je razvijen za primenu sa zečjim serumom na osnovu humanog testa koji su opisali Marchese i sarad. (Optimization and validation of a multiplex, electrochemiluminescence-based detection assay for the quantitation of immunoglobulin G serotype-specific antipneumococcal antibodies in human serum. Clin Vaccine Immunol. 16(3): 387-96 (2009)) korišćenjem tehnologije koji je razvio MesoScale Discovery (odeljenje MesoScale Diagnostics, LLC, Gaithersburg, MD) koji koristi SULFO-TAG<™>oznaku koja emituje svetlost nakon elektrohemijske stimulacije. SULFO-TAG<™>-obeleženi anti-zečji IgG koriščen je kao sekundarno antitelo za testiranje NZWR uzoraka seruma. Funkcionalno antitelo je određeno višestrukim opsonofagocitnim testovima (MOPA) na bazi prethodno opisanih protokola dostupnih onlajn u Referentnoj laboratoriji za bakterijske respiratorne patogene na Univerzitetu Alabama u Birmingemu korišćenjem Opsotiter<®>3 softvera (UAB Research Foundation, Caro-Aguilar I sarad, 2017, supra, Burton i sarad., 2006, supra).
[0162] Utvrđeno je da su konjugati polisaharida i proteina dobijeni iz serotipova 16F, 23A, 23B, 24F i 31 iz S. pneumoniae u multivalentnoj pneumokoknoj konjugovanoj vakcini imunogeni i za dozu 1 (PD1) i za post dozu 2 (PD2) kod zečeva (slika 13). Takođe su generisali funkcionalno antitelo koje je ubijalo vakcinske tipove sojeva bakterija (Slika 14). Zečevi imunizovani multivalentnom pneumokoknom konjugovanom vakcinom u dozi od 2 µg imali su značajno veće titre PD1 MOPA za četiri serotipa u poređenju sa prethodno imunizovanim zečjim serumima (slika 14). Zečevi imunizovani sa PCV21 u dozi od 2 µg imali su značajno veće titre PD2 MOPA za svih pet serotipova u poređenju sa prethodno imunizovanim zečjim serumima (slika 14). Log transformisani podaci su analizirani jednosmernom ANOVA sa Danetovim testom da bi se odredila značajnost.

Claims (6)

  1. Patentni zahtevi 1. Konjugat polisaharid-proteinski nosač sa polisaharidom koji ima ponavljajuću jedinicu sledeće strukture:
    konjugovan sa proteinom nosačem.
  2. 2. Konjugat polisaharid-proteinski nosač prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je proteinski nosač CRM197, fragment B toksina difterije (DTFB), DTFB C8, toksoid difterije (DT), toksoid tetanusa (TT), fragment C od TT, toksoid pertusisa, toksoid kolere, LT E. coli, ST E. coli ili egzotoksin A iz Pseudomonas aeruginosa.
  3. 3. Konjugat polisaharid-proteinski nosač prema patentnom zahtevu 2, pri čemu je proteinski nosač CRM197.
  4. 4. Konjugat polisaharid-proteinski nosač prema patentnom zahtevu 3, pri čemu konjugat polisaharid-proteinski nosač ima molekulsku masu od 1000 kDa do 10,000 kDa.
  5. 5. Konjugat polisaharid-proteinski nosač prema patentnom zahtevu 3, pri čemu konjugat polisaharid-proteinski nosač ima odnos polisaharida prema proteinskom nosaču od 0.4 do 2.0.
  6. 6. Konjugat polisaharid-proteinski nosač prema patentnom zahtevu 5, pri čemu je protenski nosač konjugovan sa polisaharidom preko 2. ugljenikovog atoma arabinitol šećera.
RS20240956A 2017-09-07 2018-09-04 Pneumokokni polisaharidi i njihova primena u imunogenim konjugatima polisaharid-proteinski nosač RS65893B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762555461P 2017-09-07 2017-09-07
US201862645252P 2018-03-20 2018-03-20
EP18853342.6A EP3678654B1 (en) 2017-09-07 2018-09-04 Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates
PCT/US2018/049308 WO2019050815A1 (en) 2017-09-07 2018-09-04 ANTI-PNEUMOCOCCAL POLYSACCHARIDES AND THEIR USE IN IMMUNOGENIC CONJUGATES POLYSACCHARIDE-PROTEIN CARRIER

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65893B1 true RS65893B1 (sr) 2024-09-30

Family

ID=65634964

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240956A RS65893B1 (sr) 2017-09-07 2018-09-04 Pneumokokni polisaharidi i njihova primena u imunogenim konjugatima polisaharid-proteinski nosač

Country Status (19)

Country Link
EP (2) EP3678654B1 (sr)
JP (2) JP7438102B2 (sr)
KR (1) KR102736850B1 (sr)
CN (2) CN111093650B (sr)
AU (2) AU2018328037B2 (sr)
BR (1) BR112020004509A8 (sr)
CA (1) CA3074708A1 (sr)
DK (1) DK3678654T3 (sr)
ES (1) ES2994040T3 (sr)
FI (1) FI3678654T3 (sr)
HR (1) HRP20241185T1 (sr)
HU (1) HUE068482T2 (sr)
LT (1) LT3678654T (sr)
MX (1) MX2020002555A (sr)
PL (1) PL3678654T3 (sr)
PT (1) PT3678654T (sr)
RS (1) RS65893B1 (sr)
SI (1) SI3678654T1 (sr)
WO (1) WO2019050815A1 (sr)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
CN110366428B (zh) 2016-12-30 2024-05-17 Vaxcyte公司 具有非天然氨基酸的多肽-抗原缀合物
EP4656208A3 (en) 2017-01-31 2026-03-04 Merck Sharp & Dohme LLC Methods for making polysaccharide-protein conjugates
US11400162B2 (en) 2017-02-24 2022-08-02 Merck Sharp & Dohme Llc Processes for the formulation of pneumococcal polysaccharides for conjugation to a carrier protein
JP7680185B2 (ja) * 2017-02-24 2025-05-20 メルク・シャープ・アンド・ドーム・エルエルシー 肺炎連鎖球菌多糖－タンパク質コンジュゲートの免疫原性の増強
WO2019050814A1 (en) 2017-09-07 2019-03-14 Merck Sharp & Dohme Corp. ANTI-PNEUMOCOCCAL POLYSACCHARIDES AND THEIR USE IN IMMUNOGENIC CONJUGATES POLYSACCHARIDE-PROTEIN CARRIER
MX2020002558A (es) 2017-09-07 2020-07-13 Merck Sharp & Dohme Procesos para la formulacion de polisacaridos neumococicos para la conjugacion a una proteina transportadora.
MX394768B (es) 2017-09-07 2025-03-21 Merck Sharp & Dohme Llc Polisacaridos neumococicos y su uso en conjugados de polisacarido inmunogenico con proteina.
MX394767B (es) 2017-09-07 2025-03-24 Merck Sharp & Dohme Llc Polisacaridos neumococicos y su uso en conjugados de polisacarido inmunogenico con proteina transportadora.
US11524076B2 (en) 2017-09-07 2022-12-13 Merck Sharp & Dohme Llc Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates
ES3058336T3 (es) 2017-12-06 2026-03-10 Merck Sharp & Dohme Llc Composiciones que comprenden conjugados polisacárido-proteína de Streptococcus pneumoniae y métodos de uso de los mismos
EP3749357A4 (en) 2018-02-05 2022-04-20 Sanofi Pasteur, Inc. POLYVALENT PNEUMOCOCCAL POLYSACCHARIDE PROTEIN CONJUGATE COMPOSITION
US11951162B2 (en) 2018-04-18 2024-04-09 Sk Bioscience Co., Ltd. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and immunogenic conjugate thereof
EP3788143B1 (en) 2018-04-30 2023-06-28 Merck Sharp & Dohme LLC Methods for providing a homogenous solution of lyophilized mutant diptheria toxin in dimethylsulfoxide
US12144855B2 (en) 2018-04-30 2024-11-19 Merck Sharp & Dohme Llc Methods for producing streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide carrier protein conjugates from lyospheres
EP3787673A4 (en) 2018-04-30 2022-04-27 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for producing streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide carrier protein conjugates
MX2021003358A (es) 2018-09-23 2021-05-27 Biological E Ltd Polisacaridos capsulares purificados de streptococcus pneumoniae.
CR20210333A (es) 2018-12-19 2021-08-18 Merck Sharp & Dohme Composiciones que comprenden conjugados de polisacárido de streptococcus pneumoniae con proteína y sus métodos de uso
WO2022035816A1 (en) * 2020-08-10 2022-02-17 Inventprise, Llc Multivalent pneumococcal glycoconjugate vaccines containing emerging serotype 24f
EP4622665A2 (en) 2022-11-22 2025-10-01 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
AU2023403045A1 (en) 2022-12-01 2025-06-12 Pfizer Inc. Pneumococcal conjugate vaccine formulations
TW202527906A (zh) 2023-09-14 2025-07-16 美商輝瑞股份有限公司 包含經結合之肺炎鏈球菌莢膜醣抗原之佐劑化致免疫性組成物及其用途
WO2025219908A2 (en) 2024-04-19 2025-10-23 Pfizer Inc. Media and fermentation methods for polysaccharide production in bacterial cell culture

Family Cites Families (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0027888B1 (en) 1979-09-21 1986-04-16 Hitachi, Ltd. Semiconductor switch
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US4902506A (en) 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4709017A (en) 1985-06-07 1987-11-24 President And Fellows Of Harvard College Modified toxic vaccines
US4950740A (en) 1987-03-17 1990-08-21 Cetus Corporation Recombinant diphtheria vaccines
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
CA2006700A1 (en) 1989-01-17 1990-07-17 Antonello Pessi Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
CA2017507C (en) 1989-05-25 1996-11-12 Gary Van Nest Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
KR920703114A (ko) 1989-07-14 1992-12-17 원본미기재 접합체 백신을 위한 시토킨 및 호르몬 운반체
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
ATE128628T1 (de) 1990-08-13 1995-10-15 American Cyanamid Co Faser-hemagglutinin von bordetella pertussis als träger für konjugierten impfstoff.
NZ239643A (en) 1990-09-17 1996-05-28 North American Vaccine Inc Vaccine containing bacterial polysaccharide protein conjugate and adjuvant (c-nd-che-a-co-b-r) with a long chain alkyl group.
CA2059692C (en) 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
CA2059693C (en) * 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
ES2204900T3 (es) 1992-02-11 2004-05-01 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Estructura inmuinogena de doble vector.
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
CA2135052A1 (en) 1992-05-06 1993-11-11 R. John Collier Diphtheria toxin receptor-binding region
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
ATE280235T1 (de) 1993-03-05 2004-11-15 Wyeth Corp Plasmid zur herstellung von crm-protein und diphtherie-toxin
WO1995008348A1 (en) 1993-09-22 1995-03-30 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Method of activating soluble carbohydrate using novel cyanylating reagents for the production of immunogenic constructs
US5866135A (en) 1994-04-21 1999-02-02 North American Vaccine, Inc. Group A streptococcal polysaccharide immunogenic compositions and methods
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain
US6455673B1 (en) 1994-06-08 2002-09-24 President And Fellows Of Harvard College Multi-mutant diphtheria toxin vaccines
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
WO1996034609A1 (en) 1994-12-05 1996-11-07 The Biomembrane Institute Myeloglycan
NZ304715A (en) 1995-03-22 1999-07-29 Jackson H M Found Military Med Production of immunogenic constructs using organic cyanylating reagents to activate carbohydrates and then coupling the carbohydrate to a protein, peptide or hapten
KR19980067137A (ko) 1997-01-31 1998-10-15 박원훈 알긴산염 초미세과립구를 이용한 폐렴구균 감연중에 대한 백신
US6299881B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
GB9713156D0 (en) 1997-06-20 1997-08-27 Microbiological Res Authority Vaccines
KR100757630B1 (ko) 1997-12-23 2007-09-10 박스터 헬쓰케어 에스.에이. 신규한 추출 및 단리 방법으로 수득되는 세균성 캡슐형 다당류
US6146902A (en) 1998-12-29 2000-11-14 Aventis Pasteur, Inc. Purification of polysaccharide-protein conjugate vaccines by ultrafiltration with ammonium sulfate solutions
JP2002541808A (ja) 1999-04-09 2002-12-10 テクラブ， インコーポレイテッド ポリサッカリド結合体ワクチンのための組換えトキシンａタンパク質キャリア
GB0007432D0 (en) 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
CA2413450C (en) 2000-06-20 2014-02-18 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
WO2002053761A2 (en) 2000-12-28 2002-07-11 Wyeth Recombinant protective protein from $i(streptococcus pneumoniae)
EP2277897A1 (en) 2001-04-16 2011-01-26 Wyeth Holdings Corporation Streptococcus pneumoniae open reading frames encoding polypeptide antigens and uses thereof
WO2002091998A2 (en) 2001-05-11 2002-11-21 Aventis Pasteur, Inc. Novel meningitis conjugate vaccine
EP1456231A2 (en) 2001-12-20 2004-09-15 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
AU2003291365B2 (en) 2002-11-07 2009-06-11 Synergy America, Inc. Compositions and methods for treating or preventing pneumococcal infection
RU2340627C2 (ru) 2003-03-13 2008-12-10 ГлаксоСмитКлайн Байолоджикалз с.а. Способ очистки бактериального цитолизина
US20060251675A1 (en) 2003-03-17 2006-11-09 Michael Hagen Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
US7905122B2 (en) 2003-04-28 2011-03-15 Nidec Motor Corporation Method and system for determining a washing machine load unbalance
US7709001B2 (en) 2005-04-08 2010-05-04 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EP3311836A1 (en) 2005-04-08 2018-04-25 Wyeth LLC Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7955605B2 (en) 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US20070184072A1 (en) 2005-04-08 2007-08-09 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
KR101515078B1 (ko) 2005-12-22 2015-04-24 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신
CN101663327B (zh) 2007-03-23 2014-05-07 惠氏公司 产生肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)荚膜多糖的缩短的纯化方法
AU2008287286B2 (en) 2007-04-13 2013-10-10 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Mutants of cholesterol-dependent cytolysins and uses thereof
TW201136603A (en) * 2010-02-09 2011-11-01 Merck Sharp & Amp Dohme Corp 15-valent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine composition
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
KR20140038517A (ko) 2011-06-13 2014-03-28 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 천연 또는 돌연변이 형태의 디프테리아 독소의 정제 방법
JP6502262B2 (ja) 2012-12-20 2019-04-17 ファイザー・インク 糖複合化方法
US11576958B2 (en) 2013-02-07 2023-02-14 Children's Medical Center Corporation Protein antigens that provide protection against pneumococcal colonization and/or disease
EP2829612A1 (en) * 2013-07-25 2015-01-28 Technische Universität München Method for producing exopolysaccharides, products and uses thereof
CN110859957B (zh) 2014-01-21 2024-04-12 辉瑞公司 包含缀合荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其用途
BR112016015835B1 (pt) * 2014-01-21 2023-12-26 Pfizer Inc Processo de preparação de conjugados compreendendo polissacarídeos capsulares de streptococcus pneumoniae
ES2701169T3 (es) 2014-02-14 2019-02-21 Pfizer Conjugados glucoproteicos inmunogénicos
CN107001528A (zh) * 2014-07-09 2017-08-01 米德瑞（美国）有限公司 低聚糖组合物及其制备方法
WO2016020499A2 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Glycovaxyn Ag Modified host cells for use in bioconjugate production
KR102225282B1 (ko) * 2015-07-21 2021-03-10 화이자 인코포레이티드 접합된 캡슐형 사카라이드 항원을 포함하는 면역원성 조성물, 그를 포함하는 키트 및 그의 용도
WO2017035412A1 (en) * 2015-08-25 2017-03-02 Kaleido Biosciences, Inc. Glycan compositions and uses thereof
WO2017083520A1 (en) * 2015-11-13 2017-05-18 Cadena Bio, Inc. Animal therapeutic and feed compositions and methods of use
GB201603029D0 (en) 2016-02-22 2016-04-06 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP3436061A4 (en) * 2016-03-31 2019-12-04 Liffey Biotech Limited Saccharide-polypeptide-conjugate compositions and methods of use thereof
NZ752348A (en) 2016-09-30 2022-11-25 Biological E Ltd Multivalent pneumococcal vaccine compositions comprising polysaccharide-protein conjugates
MX394768B (es) * 2017-09-07 2025-03-21 Merck Sharp & Dohme Llc Polisacaridos neumococicos y su uso en conjugados de polisacarido inmunogenico con proteina.
MX2020002558A (es) * 2017-09-07 2020-07-13 Merck Sharp & Dohme Procesos para la formulacion de polisacaridos neumococicos para la conjugacion a una proteina transportadora.
WO2019050814A1 (en) * 2017-09-07 2019-03-14 Merck Sharp & Dohme Corp. ANTI-PNEUMOCOCCAL POLYSACCHARIDES AND THEIR USE IN IMMUNOGENIC CONJUGATES POLYSACCHARIDE-PROTEIN CARRIER
MX394767B (es) * 2017-09-07 2025-03-24 Merck Sharp & Dohme Llc Polisacaridos neumococicos y su uso en conjugados de polisacarido inmunogenico con proteina transportadora.
ES3058336T3 (es) * 2017-12-06 2026-03-10 Merck Sharp & Dohme Llc Composiciones que comprenden conjugados polisacárido-proteína de Streptococcus pneumoniae y métodos de uso de los mismos
CN108159408A (zh) 2017-12-29 2018-06-15 云南沃森生物技术股份有限公司 一种多价肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN118063638A (zh) 2024-05-24
ES2994040T3 (en) 2025-01-16
CN111093650B (zh) 2024-03-01
SI3678654T1 (sl) 2024-10-30
LT3678654T (lt) 2024-08-26
BR112020004509A8 (pt) 2023-01-31
CA3074708A1 (en) 2019-03-14
JP7438102B2 (ja) 2024-02-26
KR20200051004A (ko) 2020-05-12
JP2020533439A (ja) 2020-11-19
KR102736850B1 (ko) 2024-11-29
PL3678654T3 (pl) 2024-12-16
EP3678654A4 (en) 2021-04-21
HUE068482T2 (hu) 2025-01-28
AU2024201518B2 (en) 2025-12-18
AU2018328037B2 (en) 2024-03-07
CN111093650A (zh) 2020-05-01
MX2020002555A (es) 2020-09-25
AU2024201518A1 (en) 2024-03-28
JP7659672B2 (ja) 2025-04-09
RU2020112308A3 (sr) 2022-03-24
EP4520325A1 (en) 2025-03-12
EP3678654B1 (en) 2024-06-26
BR112020004509A2 (pt) 2020-09-15
PT3678654T (pt) 2024-08-05
HRP20241185T1 (hr) 2024-11-22
JP2024056835A (ja) 2024-04-23
WO2019050815A1 (en) 2019-03-14
DK3678654T3 (da) 2024-09-02
EP3678654A1 (en) 2020-07-15
RU2020112308A (ru) 2021-10-07
AU2018328037A1 (en) 2020-03-19
FI3678654T3 (fi) 2024-09-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2024201518B2 (en) Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates
AU2024201517B2 (en) Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates
AU2024201470B2 (en) Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates
KR102783492B1 (ko) 폐렴구균 폴리사카라이드 및 면역원성 폴리사카라이드-담체 단백질 접합체에서의 그의 용도
US11524076B2 (en) Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates
RU2784449C2 (ru) Пневмококковые полисахариды и их применение в иммуногенных конъюгатах полисахарид-белок-носитель
RU2801304C2 (ru) Пневмококковые полисахариды и их применение в иммуногенных конъюгатах полисахарид-белок-носитель
RU2785429C2 (ru) Пневмококковые полисахариды и их применение в иммуногенных конъюгатах полисахарид-белок-носитель