RS65978B1 - Trispecifični proteini i postupci primene - Google Patents

Description

Napomene: Kompletan dokument, uključujući referentnu tabelu(e) i listu(e) sekvenci, može se preuzeti sa Web stranice EPO.

Opis

UPUĆIVANJE NA REFERENCU

[0001] Ova patentna prijava zahteva benefit od SAD privremene prijave br. 62/572,381 podnete 13. oktobra 2017. godine.

LISTA SEKVNCI

[0002] Trenutna prijava sadrži listu sekvenci koja je dostavljena elektronski u ASCII formatu i ovim je u celini inkorporirana kao referenca. Navedena ASCII kopija, kreirana 11. oktobra 2018, nosi naziv 47517-723_601_SL.txt i veličine je 752,020 bajtova.

STANJE TEHNIKE

[0003] Kancer je drugi vodeći uzrok ljudske smrti pored koronarne bolesti. Širom sveta, milioni ljudi umiru od kancera svake godine. Samo u SAD, kancer uzrokuje smrt preko pola miliona ljudi svake godine, sa oko 1,4 miliona novih slučajeva dijagnostikovanih godišnje. Dok se broj smrtnih slučajeva od srčanih bolesti značajno smanjuje, broj smrtnih slučajeva koji su rezultat kancera generalno su u porastu. Početkom sledećeg veka, predviđa se da će kancer postati vodeći uzrok smrti.

[0004] Štaviše, čak i za one pacijente sa kancerom koji u početku prežive svoj primarni kancer, uobičajeno iskustvo je pokazalo da su njihovi životi dramatično promenjeni. Mnogi pacijenti sa karcinomom doživljavaju jaku anksioznost vođeni svešću o mogućnosti ponovnog pojavljivanja ili neuspeha lečenja. Mnogi pacijenti sa kancerom doživljavaju značajne fizičke slabosti posle lečenja.

[0005] Uopšteno govoreći, osnovni problem u lečenju najsmrtonosnijih karcinoma je nedostatak efikasnih i netoksičnih sistemskih terapija. Kancer je složena bolest koju karakterišu genetske mutacije koje dovode do nekontrolisanog rasta ćelija. Ćelije kancera prisutne su u svim organizmima i, pod normalnim okolnostima, njihov prekomerni rast je strogo regulisan raznim fiziološkim faktorima.

SUŠTINA PRONALSKA

[0006] Selektivno uništavanje pojedinačne ćelije ili specifičnog tipa ćelije je često poželjno u različitim kliničkim uslovima. Na primer, primarni cilj terapije kancera je da se specifično unište ćelije tumora, dok zdrave ćelije i tkiva ostaju netaknuti i neoštećeni. Jedan takav postupak je izazivanje imunološkog odgovora protiv tumora, kako bi imune efektorske ćelije kao što su prirodne ćelije ubice (NK) ili citotoksični T limfociti (CTL) napale i uništile tumorske ćelije. Predmetni pronalazak se fokusira na terapiju ciljanjem sredstva za sazrevanje B ćelija (BCMA). Korisni dokumenti za razumevanje stanja tehnike su WO 2017/031104, WO 2017/025038, WO 2016/187594.

[0007] Shodno tome, u jednom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje trispecifične proteine koji se vezuju za sredstvo za sazrevanje B ćelija (BCMA) koje sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 520 (prevod SEK ID BR: 520). U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje protein za primenu u lečenju kancera B ćelijske linije. U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polinukleotid kao što je definisano u patentnim zahtevima. U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje vektor kao što je definisano u patentnim zahtevima. U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina kao što je definisano u patentnim zahtevima. U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži 1) protein za koji se traži patentna zaštita, vektor za koji se traži patentna zaštita ili ćeliju domaćina za koju se traži patenta zaštita, i 2) farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0008] Ovde je obezbeđen, trispecifični protein koji se vezuje za sredstvo za sazrevanje B ćelija (BCMA) koji sadrži: (a) prvi domen (A) koji se specifično vezuje za humani CD3; (b) drugi domen (B) koji je domen produžetka poluživota; i (c) treći domen (C) koji se specifično vezuje za BCMA, pri čemu su domeni povezani redosledom H2N-(A)-(C)-(B)-COOH, H2N-(B)-(A)-(C)-COOH, H2N-(C)-(B)-(A)-COOH, H2N-(C)-(A)-(B)-COOH, H2N-(A)-(B)-(C)-COOH, ili H2N-(B)-(C)-(A)-COOH, pri čemu su domeni povezani linkerima L1 i L2.

[0009] U skladu sa patentnim pronalaskom, treći domen trispecifičnog proteina koji se vezuje za BCMA sadrži VHH domen u skladu sa SEQ ID NO: 383. VHH domen sadrži sledeću formulu: F1-CDR1-F2-CDR2-F3-CDR3-F4, pri čemu region koji određuje komplementarnost CDR1 je SEQ ID NO: 76, CDR2 je SEQ ID NO: 190, i CDR3 je SEQ ID NO: 304, i okvirni region F1 je SEQ ID NO: 461, F2 je SEQ ID NO: 463, F3 je SEQ ID NO: 464, i F4 je SEQ ID NO: 460.

[0010] Trispecifični protein koji se vezuje za BCMA, u nekim slučajevima, ima poluvreme eliminacije od najmanje 12 sati, najmanje 20 sati, najmanje 25 sati, najmanje 30 sati, najmanje 35 sati, najmanje 40 sati, najmanje 45 sati. sati, najmanje 50 sati, ili najmanje 100 sati.

[0011] Ovde je obezbeđen trispecifični protein koji se vezuje za BCMA, gde se treći domen vezuje za humani BCMA protein koji sadrži sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 468. U nekim slučajevima, treći domen se vezuje za epitop BCMA, pri čemu navedeni epitop sadrži ekstracelularni domen BCMA. U nekim slučajevima, treći domen se vezuje za epitop BCMA, pri čemu navedeni epitop sadrži aminokiselinske ostatke 5-51 SEQ ID NO: 468.

[0012] U nekim slučajevima, trispecifični protein koji se vezuje za BCMA je manji od oko 80 kDa. U drugim slučajevima, trispecifični protein koji se vezuje za BCMA može biti oko 50 do oko 75 kDa. U drugim slučajevima, trispecifični protein koji se vezuje za BCMA je manji od oko 60 kDa.

[0013] Trispecifični protein koji se vezuje za BCMA koji je ovde opisan, u nekim slučajevima, ima poluvreme eliminacije od najmanje oko 50 sati, oko 100 sati ili više.

[0014] Trispecifični protein koji se vezuje za BCMA, u nekim slučajevima, pokazuje povećanu penetraciju u tkivo u poređenju sa IgG za isti BCMA.

[0015] Ovde je takođe obezbeđen, koristan za razumevanje pronalaska, ali nije eksplicitno zaštićen patentnim zahtevima, proces za proizvodnju trispecifičnog proteina koji se vezuje za BCMA koji je ovde opisan, pri čemu navedeni proces obuhvata kultivisanje domaćina transformisanog ili transfektovanog vektorom koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira trispecifični protein koji se vezuje za BCMA pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju trispecifičnog proteina koji se vezuje za BCMA i obnavljanje i prečišćavanje proizvedenog proteina iz kulture.

[0016] Subjekat koji se leči postupcima koji su navedeni u patentnim zahtevima, u nekim slučajevima je čovek.

[0017] U nekim slučajevima, postupci dalje obuhvataju administraciju jednog ili više sredstava u kombinaciji sa trispecifičnim proteinom koji se vezuje za BCMA.

[0018] Ovde opisani postupci su korisni za lečenje ili poboljšanje tumorske bolesti, pri čemu se trispecifični protein koji se vezuje za BCMA selektivno vezuje za tumorske ćelije koje eksprimuju BCMA.

[0019] Tumorska bolest koja se leči opisanim postupcima obuhvata primarni kancer ili njegovu metastazu. U jednom slučaju, tumorska bolest obuhvata kancer B ćelijske linije.

[0020] Karcinom B ćelijske linije koji se leči navedenim postupcima uključuje, ali nije ograničen na multipli mijelom, leukemiju, limfom ili njihove metastaze. Reference za postupke lečenja terapijom ili operacijom ili in vivo dijagnostičke metode u ovom opisu treba da se tumače kao reference za jedinjenja i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska za primenu u tim postupcima.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0021] Nove karakteristike pronalaska su posebno izložene u priloženim patentnim zahtevima. Jedan trispecifični protein koji se vezuje za BCMA prema predmetnom pronalasku je ovde označen identifikatorom "02B05". Ostali trispecifični proteini koji se vezuje za BCMA i koji su ovde opisani, a na koje se pozivaju drugi identifikatori, nisu eksplicitno deo patentnih zahteva pronalaska.

Bolje razumevanje karakteristika i prednosti ovog pronalaska biće dobijeno pozivanjem na sledeći detaljan opis koji postavlja ilustrativna tehnička rešenja, u kojima su korišćeni principi pronalaska, i prateće crteže:

Sl. 1 je šematski prikaz primernog trispecifičnog proteina koji se vezuje za ciljani antigen BCMA koji ima konstantni element jezgra koji sadrži anti-CD3ε jednolančani varijabilni fragment (scFv) i anti-ALB varijabilni region teškog lanca; i anti-BCMA vezujući domen koji može biti VHH, VH, scFv, ne-Ig vezivo, ili ligand.

Sl. 2 ilustruje efekat primernog molekula koji cilja BCMA (01H08, 01F07, 02F02, i BH253), koji sadrži protein koji vezuje anti-BCMA u skladu sa predmetnim obelodanjenjem, u ubijanju prečišćenih humanih T ćelija koje eksprimuju BCMA u poređenju sa negativnom kontrolom.

Sl. 3 je slika SDS-PAGE reprezentativnih prečišćenih BCMA trispecifičnih molekula. Traka 1: 01F07-M34Y TriTAC nesmanjeni; Traka 2:01F07-M34G-TriTAC nesmanjeni; Traka 3: 02B05 TriTAC nesmanjeni; Traka 4: 02G02-M34Y TriTAC nesmanjeni; Traka 5: 02G02 M34G TriTAC nesmanjeni; Traka 6: SDS-PAGE standard širokog dometa (Bio-Rad #1610317); Traka 7: 01F07-M34Y TriTAC nesmanjeni; Traka 8:01F07-M34GTriTAC nesmanjeni; Traka 9: 02B05 TriTAC nesmanjeni; Traka 10: 02G02-M34Y TriTAC nesmanjeni; Traka 11: 02G02 M34G TriTAC nesmanjeni; Traka 12: SDS-PAGE standard širokog dometa (Bio-Rad #1610317)

Sl. 4A-4I ilustruju efekat primernog trispecifičnih molekula koji ciljaju BCMA, koji sadrže anti-BCMA vezujući protein prema predmetnom pronalasku, u ubijanju ćelija Jeko1, MOLP-8 ili OPM-2 ćelija koje eksprimuju BCMA u poređenju sa negativnom kontrolom.

Sl. 5A-5D ilustruju vezivanje primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA za prečišćene T ćelije od četiri različita humana donora, donor 02 (Sl.5A), donor 35 (Sl.

5B), donor 81 (Sl.5C), donor 86 (Sl.5D).

Sl. 6A-6F ilustruju vezivanje primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA za ćelije koje eksprimuju BCMA, NCI-H929 (Sl.6A), EJM (Sl. 6B), OPM2 (Sl.6D), RPMI8226 (Sl. 6E); ili ćelijske linije kojima nedostaje ekspresija BCMA, NCI-H510A (Sl. 6C) i DMS-153 (Sl.6F).

Sl. 7 ilustruje rezultate TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA i BCMA koje eksprimuje EJM ćelije, u prisustvu ili odsustvu humanog serumskog albumina (HSA).

Sl. 8 ilustruje rezultate TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA i EJM ćelija koje eksprimuju BCMA, koristeći promenljiv odnos efektorskih ćelija prema ciljanim ćelijama.

Sl. 9 ilustruje rezultate TDCC testa primenom primernog BCMA ciljanog trispecifičnog proteina (02B05) i OPM2 ćelija koje eksprimuju BCMA, koristeći promenljiv odnos efektorskih ćelija prema ciljnim ćelijama.

Sl. 10 ilustruje rezultate TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA i BCMA ćelija koje eksprimuju NCI-H929, koristeći različite vremenske tačke i odnos efektorskih ćelija prema ciljnim ćelijama.

Sl. 11 ilustruje rezultate TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA, BCMA koje eksprimuju EJM ćelije, i T ćelija od četiri različita donora, u prisustvu humanog serumskog albumina (HSA).

Sl. 12 ilustruje rezultate TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA, BCMA ćelija koje eksprimuju NCI-H929, i T ćelija od četiri različita donora, u prisustvu humanog serumskog albumina (HSA).

Sl. 13 ilustruje rezultate TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA, OPM2 ćelija koje eksprimuju BCMA i T ćelija od četiri različita donora, u prisustvu humanog serumskog albumina (HSA).

Sl. 14 ilustruje rezultate TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA, BCMA ćelija koje eksprimuju RPMI8226 i T ćelija od četiri različita donora, u prisustvu humanog serumskog albumina (HSA).

Sl. 15 ilustruje rezultate TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA, BCMA neeksprimovanih OVCAR8 ćelija i T ćelija od četiri različita donora, u prisustvu humanog serumskog albumina (HSA).

Sl. 16 ilustruje rezultate TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA, NCI-H510A ćelija koje ne eksprimuju BCMA i T ćelija od četiri različita donora, u prisustvu humanog serumskog albumina (HSA).

Sl. 17 ilustruje rezultate TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA, BCMA ćelija koje eksprimuju NCI-H929 i mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) od dva različita donora cinomolgusa, u prisustvu humanog serumskog albumina (HSA).

Sl. 18 ilustruje rezultate TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA, BCMA ćelija koje eksprimuju RPMI8226 i mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) od dva različita donora cinomolgusa, u prisustvu humanog serumskog albumina (HSA).

Sl. 19 ilustruje nivo ekspresije biomarkera aktivacije T ćelija CD69, nakon TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA i BCMA ćelija koje eksprimuju EJM.

Sl. 20 ilustruje nivo ekspresije biomarkera aktivacije T ćelija CD25, nakon TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA i BCMA ćelija koje eksprimuju EJM.

Sl. 21 ilustruje nivo ekspresije biomarkera aktivacije T ćelija CD69, nakon TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA i BCMA ćelija koje eksprimuju OPM2.

Sl. 22 ilustruje nivo ekspresije biomarkera aktivacije T ćelija CD25, nakon TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA i BCMA ćelija koje eksprimuju OPM2.

Sl. 23 ilustruje nivo ekspresije biomarkera aktivacije T ćelija CD69, nakon TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA i BCMA ćelija koje eksprimuju RPMI8226.

Sl. 24 ilustruje nivo ekspresije biomarkera aktivacije T ćelija CD25, nakon TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA i BCMA ćelija koje eksprimuju RPMI8226.

Sl. 25 ilustruje nivo ekspresije biomarkera aktivacije T ćelija CD69, nakon TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA i BCMA ćelija koje ne eksprimuju OVCAR8.

Sl. 26 ilustruje nivo ekspresije biomarkera aktivacije T ćelija CD25, nakon TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA i BCMA ćelija koje ne eksprimuju OVCAR8.

Sl. 27 ilustruje nivo ekspresije biomarkera aktivacije T ćelija CD69, nakon TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA i BCMA ćelija koje ne eksprimuju NCI-H510A.

Sl. 28 ilustruje nivo ekspresije biomarkera aktivacije T ćelija CD25, nakon TDCC testa primenom primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA i BCMA ćelija koje ne eksprimuju NCI-H510A.

Sl. 29 ilustruje nivo ekspresije citokina, TNF-α, u ko-kulturama T ćelija i ciljanih ćelija koje eksprimuju BCMA (EJM ćelije) tretiranih povećanjem koncentracija primernog trispecifičnog proteina koji cilja BCMA ili sa GFP trispecifičnim proteinom negativne kontrole.

Sl. 30 ilustruje smanjenje rasta tumora u modelu RPMI8226 ksenografta, koji je tretiran sa primernim trispecifičnim proteinom koji cilja BCMA, u različitim koncentracijama, ili sa kontrolnim vehikulumom.

Sl. 31 ilustruje smanjenje rasta tumora u modelu Jeko1 ksenografta, koji je tretiran sa primernim trispecifičnim proteinom koji cilja BCMA, u različitim koncentracijama, ili sa kontrolnim vehikulumom.

Sl. 32 ilustruje koncentraciju trispecifičnog proteina koji cilja BCMA u uzorcima seruma cinomolgus majmuna doziranih sa različitim koncentracijama primernog trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA.

Sl. 33 rezultati TDCC testa primenom trispecifičnog proteina koji cilja BCMA dobijenog iz uzoraka seruma cinomolgus majmuna sakupljenih 168 sati nakon doziranja sa različitim koncentracijama primernog trispecifičnog proteina koji cilja BCMA, BCMA koje eksprimuju EJM ćelije, i prečišćene humane T ćelije u prisustvu seruma majmuna cinomolgus koji nisu bili izloženi trispecifičnom proteinu koji cilja BCMA.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0022] Tehničko obelodanjenje dato u nastavku može u nekim aspektima prevazići obim patentnih zahteva. Elementi obelodanjenja koji ne spadaju u obim patentnih zahteva su dati radi informisanosti.

[0023] Ovde su opisani trispecifični proteini koji ciljaju antigen sazrevanja B ćelija (BCMA), njihove farmaceutske kompozicije (koji se ovde pominju kao trispecifični proteini koji se vezuju za BCMA, trispecifični protein koji cilja BCMA, ili trispecifični protein koji se vezuje za antigen BCMA) kao i nukleinske kiseline, rekombinantne ekspresione vektore i ćelije domaćina za pravljenje takvih proteina. Takođe su obezbeđeni postupci za primenu obelodanjenih trispecifičnih proteina koji ciljaju BCMA u prevenciji i/ili lečenju bolesti, stanja i poremećaja. Trispecifični proteini koji ciljaju BCMA su sposobni da se specifično vežu za BCMA kao i za CD3 i imaju domen produženja poluživota, kao što je domen koji se vezuje za humani albumin (ALB). Sl.1 prikazuje neograničavajući primer trispecifičnog proteina koji se vezuje za BCMA.

[0024] "Antitelo" se tipično odnosi na tetramerni protein u obliku slova Y koji sadrži dva teška (H) i dva laka (L) polipeptidna lanca koji se drže zajedno kovalentnim disulfidnim vezama i nekovalentnim interakcijama. Humani laki lanci sadrže varijabilni domen (VL) i konstantni domen (CL) pri čemu se konstantni domen može lako klasifikovati kao kapa ili lambda na osnovu sekvence aminokiselina i lokusa gena. Svaki teški lanac sadrži jedan varijabilni domen (VH) i konstantni region, koji u slučaju IgG, IgA, i IgD, sadrži tri domena nazvana CH1, CH2, i CH3 (IgM i IgE imaju četvrti domen, CH4). U klasama IgG, IgA i IgD, CH1 i CH2 domeni su razdvojeni fleksibilnim zglobnim regionom, koji je segment bogat prolinom i cisteinom promenljive dužine (uglavnom od oko 10 do oko 60 amino kiselina u IgG). Varijabilni domeni u lakim i teškim lancima su povezani sa konstantnim domenima pomoću "J" regiona od oko 12 ili više aminokiselina, a teški lanac takođe ima "D od oko 10 dodatnih amino kiselina. Svaka klasa antitela dalje sadrži međulančane i unutarlančane disulfidne veze formirane uparenim cisteinskim ostacima. Postoje dve vrste nativnih disulfidnih mostova ili veza u molekulima imunoglobulina: međulančane i unutarlančane disulfidne veze. Lokacija i broj međulančanih disulfidnih veza variraju u zavisnosti od klase i vrste imunoglobulina. Međulančane disulfidne veze nalaze se na površini imunoglobulina, dostupne su rastvaraču i obično se relativno lako redukuju. U humanom IgG1 izotipu postoje četiri međulančane disulfidne veze, jedna od svakog teškog lanca do lakog lanca i dve između teških lanaca. Međulančane disulfidne veze nisu potrebne za povezivanje lanca. Kao što je dobro poznato, zglobni region teškog lanca bogat cisteinom IgG1 se generalno smatra da se sastoji od tri dela: gornjeg zgloba, zgloba jezgra i donjeg zgloba. Stručnjaci iz date oblasti tehnike će prepoznati da IgG1 zglobni region sadrži cisteine u teškom lancu koji sadrže međulančane disulfidne veze (dve teške/teške, dve teške/lake), koje obezbeđuju strukturnu fleksibilnost koja olakšava Fab pokrete. Međulančane disulfidne veze između lakog i teškog lanca IgG1 formiraju se između C214 kapa ili lambda lakog lanca i C220 u gornjem zglobnom regionu teškog lanca. Međulančane disulfidne veze između teških lanaca su na pozicijama C226 i C229 (sve numerisane prema EU indeksu prema Kabat, i sar., infra.).

[0025] Kako se ovde koristi, termin "antitelo" uključuje poliklonska antitela, multiklonalna antitela, monoklonalna antitela, himerna antitela, humanizovana i primatizovana antitela, CDR presađena antitela, humana antitela, rekombinantno proizvedena antitela, intratela, multispecifična antitela, bispecifična antitela, monovalentna antitela, multivalentna antitela, antiidiotipska antitela, sintetička antitela, uključujući muteine i njihove varijante, imunospecifične fragmente antitela kao što su Fd, Fab, F(ab')2, F(ab') fragmenti, jednolančani fragmenti (npr., ScFv i ScFvFc), disulfid -vezani Fvs (sdFv), Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena, linearna antitela, jednodomenska antitela kao što je sdAb (VH, VL, ili VHH domeni); i njihovi derivati uključujući Fc fuzije i druge modifikacije, i bilo koji drugi imunoreaktivni molekul sve dok sadrži domen koji ima vezujuće mesto za preferencijalno povezivanje ili vezivanje sa BCMA proteinom. Štaviše, osim ako kontekstualna ograničenja ne diktiraju drugačije, termin dalje obuhvata sve klase antitela (tj. IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM) i sve podklase (tj., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2). Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama antitela se obično označavaju odgovarajućim malim grčkim slovom alfa, delta, epsilon, gama, odnosno mu. Laki lanci antitela bilo koje vrste kičmenjaka mogu se dodeliti jednom od dva jasno različita tipa, nazvana kapa (kapa) i lambda (lambda), na osnovu sekvenci aminokiselina njihovih konstantnih domena.

[0026] BCMA vezujući domen trispecifičnih proteina koji ciljaju BCMA ovog obelodanjenja sadrži VHH domen. Termin "VHH," kako se ovde koristi, odnosi se na jednolančani domen vezivanja antitela bez lakog lanca. U nekim slučajevima, VHH je izveden iz antitela tipa koji se može naći u kamelidima ili hrskavičnim ribama koje su prirodno lišene lakih lanaca ili od sintetičkog i neimunizovanog VHH koji se može konstruisati u skladu sa tim. Svaki teški lanac sadrži varijabilni region kodiran V-, D- i J egzonima. VHH, u nekim slučajevima, je prirodni VHH, kao što je VHH dobijen od kamelida, ili rekombinantni protein koji sadrži varijabilni domen teškog lanca. U nekim tehničkim rešenjima, VHH je izdvojen iz vrste izabrane iz grupe koju čine kamile, lame, vikunje, gvanakoe, i hrskavične ribe (kao što su, ali bez ograničenja ajkule). U nekim tehničkim rešenjima, VHH je izdvojen iz alpake (kao što je, ali nije ograničena na Huacaya alpaka ili Suri alpaka).

[0027] Kako se ovde koristi, "varijabilni region" ili "varijabilni domen" se odnosi na činjenicu da se određeni delovi varijabilnih domena ekstenzivno razlikuju u sekvenci među antitelima i da se koriste u vezivanju i specifičnosti svakog posebnog antitela za njegov određeni antigen. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena kroz varijabilne domene antitela. Koncentrisan je u tri segmenta koji se nazivaju regioni koji određuju komplementarnost (CDR) ili hipervarijabilni regioni iu varijabilnim domenima lakog lanca (VL) i teškog lanca (VH). Više očuvani delovi varijabilnih domena nazivaju se okvirom (FR). Svaki varijabilni domen nativnih teških i lakih lanaca sastoji se od četiri FR regiona, koji u velikoj meri usvajaju konfiguraciju β-listova, povezanih sa tri CDR, koji formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima i čine deo strukture β lista. CDR-ovi u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini FR regiona i, sa CDR-ovima iz drugog lanca, doprinose formiranju antigen-vezujućeg mesta antitela (videti Kabat i sar., Sekvences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela za antigen, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj toksičnosti zavisnoj od antitela. Fragmenti ScFv (ili varijabla jednolančanog fragmenta), koji su u nekim slučajevima dobijeni genetskim inženjeringom, povezuju se u jedan polipeptidni lanac, VH i VL region antitela, razdvojeni peptidnim linkerom.

[0028] BCMA vezujući domen BCMA ciljanih trispecifičnih sadrži samo antitela za teški lanac, koja su VHH domeni, i sadrže tri CDR. Takva antitela samo za teški lanac, u nekim tehničkim rešenjima, vezuju BCMA kao monomer bez zavisnosti od dimerizacije sa VL (promenljivim delom lakog lanca) regionom radi optimalnog afiniteta vezivanja.

[0029] Dodeljivanje aminokiselina svakom domenu, okvirnom regionu i CDR je, u nekim realizacijama, u skladu sa jednom od šema numerisanja koje su dali Kabat i sar. (1991) Sekvences of Proteins of Immunological Interest (5th Ed.), US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242; Chothia i sar., 1987, PMID: 3681981; Chothia i sar., 1989, PMID: 2687698; MacCallum i sar., 1996, PMID: 8876650; ili Dubel, Ed. (2007) Handbook of Therapeutic Antibodies, 3rd Ed., Wily-VCH Verlag GmbH i Co ili AbM (Oxford Molecular/MSI Pharmacopia) osim ako nije drugačije naznačeno. Nije predviđeno da CDR-ovi ovog obelodanjenja nužno odgovaraju Kabat konvenciji o numerisanju.

[0030] Termin "okvir" ili "FR" ostaci (ili regioni) se odnose na ostatke varijabilnog domena koji nisu CDR ili ostaci hipervarijabilnog regiona kao što je ovde definisano. "Okvir humanog konsenzusa" je okvir koji predstavlja najčešći aminokiselinski ostatak u selekciji sekvenci VL ili VH okvira humanog imunoglobulina.

[0031] Kako se ovde koristi, termin "procenat (%) identiteta aminokiselinske sekvence" u odnosu na sekvencu je definisan kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidata koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u specifičnoj sekvenci, nakon poravnanja sekvence i uvođenje praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, i ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Usklađivanje u svrhu određivanja procenta identiteta aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su u okviru stanja tehnike, na primer, korišćenjem javno dostupnog računarskog softvera kao što je EMBOSS MATCHER, EMBOSS WATER, EMBOSS STRETCHER, EMBOSS NEEDLE, EMBOSS LALIGN, BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući sve algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja preko cele dužine sekvenci koje se porede.

[0032] Kako se ovde koristi, "poluvreme eliminacije" se koristi u svom uobičajenom smislu, kao što je opisano u Goodman i Gillman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics 21-25 (Alfred Goodman Gilman, Louis S. Goodman, and Alfred Gilman, eds., 6th ed. 1980). Ukratko, termin treba da obuhvati kvantitativnu meru vremenskog toka eliminacije leka. Eliminacija većine lekova je eksponencijalna (tj. prati kinetiku prvog reda), pošto se koncentracije leka obično ne približavaju onima koje su potrebne za zasićenje procesa eliminacije. Brzina eksponencijalnog procesa može se izraziti njegovom konstantom brzine, k, koja izražava frakcionu promenu u jedinici vremena, ili njegovim poluvremenom, t1/2 vreme potrebno za 50% završetka procesa. Jedinice ove dve konstante su vreme-1 i vreme, respektivno. Konstanta brzine prvog reda i poluvreme reakcije su jednostavno povezani (k×t1/2=0.693) i mogu se u skladu sa tim zameniti. Pošto kinetika eliminacije prvog reda diktira da se konstantna frakcija leka gubi u jedinici vremena, dijagram log koncentracije leka u odnosu na vreme je linearan u svakom trenutku nakon početne faze distribucije (tj. nakon što su apsorpcija i distribucija leka završene). Poluvreme za eliminaciju leka može se tačno odrediti iz takvog grafikona.

[0033] Kako se ovde koristi, termin "afinitet vezivanja" se odnosi na afinitet proteina opisanih u otkriću prema njihovim ciljevima vezivanja, i izražava se numerički korišćenjem vrednosti "Kd". Ako je naznačeno da dva ili više proteina imaju uporedive afinitete vezivanja prema njihovim ciljevima vezivanja, onda su vrednosti Kd za vezivanje odgovarajućih proteina za njihove ciljeve vezivanja unutar ±2 puta jedna od druge. Ako je naznačeno da dva ili više proteina imaju uporedive afinitete vezivanja prema jednom cilju vezivanja, onda su vrednosti Kd za vezivanje odgovarajućih proteina za pomenutu metu pojedinačnog vezivanja, unutar ±2 puta jedna od druge. Ako je indikovano da protein vezuje dve ili više meta sa uporedivim afinitetima vezivanja, onda su Kd vrednosti za vezivanje pomenutog proteina za dve ili više mete unutar ±2 puta jedna od druge. Uopšteno, veća vrednost Kd odgovara slabijem vezivanju. U nekim tehničkim rešenjima, "Kd" se meri testom vezivanja radioaktivno obeleženog antigena (RIA) ili testovima površinske plazmonske rezonance primenom BIAcore<™>-2000 ili BIAcore<™>-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.). U određenim tehničkim rešenjima, takođe se određuju "brzina uključenja" ili "brzina pridruživanja" ili "pridružujuća brzina" ili "kon" i "brzina isključenja" ili "brzina disocijacije" ili "disocijaciona brzina" ili "koff" se takođe određuju tehnikom površinske plazmonske rezonance primenom BIAcore<™>-2000 ili BIAcore<™>-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.). U dodatnim tehničkim rešenjima, "Kd", "kon", i "koff" se mere primenom OCTET<®>sistema (Pall Life Sciences). U primernoj metodi za merenje afiniteta vezivanja primenom OCTET<®>sistema, ligand, npr., biotinilovani humani ili cinomolgus BCMA, se imobiliše na površini vrha kapilarnog senzora OCTET<®>streptavidina, čiji vrhovi streptavidina se zatim aktiviraju u skladu sa uputstvima proizvođača 20-50 µg/ml humanog ili cinomolgusovog BCMA proteina Rastvor PBS/kazeina se takođe uvodi kao sredstvo za blokiranje. Za kinetička merenja asocijacije, varijante proteina koji se vezuje za BCMA se uvode u koncentraciji u rasponu od oko 10 ng/mL do oko 100 µg/mL, oko 50 ng/mL do oko 5 µg/mL, ili oko 2 ng/mL do oko 20 µg /mL. U nekim realizacijama, BCMA vezujući jednodomenski proteini se koriste u koncentraciji u rasponu od oko 2 ng/mL do oko 20 µg/mL. Potpuna disocijacija je primećena u slučaju negativne kontrole, pufera za ispitivanje bez vezujućih proteina. Kinetički parametri reakcija vezivanja se zatim određuju korišćenjem odgovarajućeg alata, npr., ForteBio softvera.

[0034] Termin "oko" ili "približno" podrazumeva u okviru prihvatljivog opsega greške za određenu vrednost kako je to odredio stručnjak u ovoj oblasti tehnike, što će delimično zavisiti od toga kako se vrednost meri ili određuje, npr., ograničenja mernog sistema. Na primer, "oko" može da znači u okviru 1 ili više od 1 standardne devijacije, prema praksi u datoj vrednosti. Tamo gde su određene vrednosti opisane u prijavi i zahtevima, osim ako nije drugačije navedeno, treba pretpostaviti da termin "oko" znači prihvatljiv opseg greške za određenu vrednost.

[0035] Termini "pojedinac," "pacijent," ili "subjekat" se koriste naizmenično. Nijedan od termina ne zahteva niti je ograničen na situacije koje karakteriše nadzor (npr. stalni ili povremeni) zdravstvenog radnika (npr. lekara, registrovane medicinske sestre, medicinske sestre, pomoćnika lekara, bolničara, ili radnika u bolnici).

[0036] Terminologija koja se ovde koristi je samo u svrhu opisa određenih slučajeva i nema nameru da bude ograničavajuća. Kako se ovde koristi, oblici jednine imaju za cilj da uključuju i oblike množine, osim ako kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Štaviše, u meri u kojoj se termini "uključujući", "uključuje", "koji ima", "ima", "sa", ili njihove varijante koriste u detaljnom opisu i/ili patentnim zahtevima, takvi termini su namenjeni da budu inkluzivni na način sličan terminu "sadrži."

[0037] U jednom aspektu pronalaska, trispecifični proteini koji ciljaju BCMA, koji su definisani u patentnim zahtevima, sadrže domen (A) koji se specifično vezuje za CD3, domen (B) koji se specifično vezuje za humani albumin (ALB) i domen (C) koji se specifično vezuje za BCMA. Takođe su obelodanjeni, iako nisu svi u okviru patentnih zahteva, opštije konstruisani, pri čemu su tri domena u BCMA ciljanim trispecifičnim proteinima raspoređena bilo kojim redosledom. Zbog toga, smatra se da je redosled domena trispecifičnih proteina koji ciljaju BCMA:

H2N-(A)-(B)-(C)-COOH,

H2N-(A)-(C)-(B)-COOH,

H2N-(B)-(A)-(C)-COOH,

H2N-(B)-(C)-(A)-COOH,

H2N-(C)-(B)-(A)-COOH, ili

H2N-(C)-(A)-(B)-COOH.

[0038] Trispecifični proteini koji ciljaju BCMA prema pronalasku imaju HSA vezujući domen kao srednji domen, tako da je redosled domena H2N-(C)-(B)-(A)-COOH. Pretpostavlja se da imajući ALB vezujući domen kao srednji domen CD3 i BCMA vezujući domeni dobijaju dodatnu fleksibilnost da se vežu za svoje odgovarajuće mete.

[0039] Trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani su dizajnirani da omoguće specifično ciljanje ćelija koje eksprimuju BCMA regrutovanjem citotoksičnih T ćelija. Ovo poboljšava efikasnost u poređenju sa ADCC (citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela), koja koristi antitela pune dužine usmerena na jedini antigen i nije sposobna da direktno regrutuje citotoksične T ćelije. Nasuprot tome, angažovanjem CD3 molekula eksprimovanih specifično na ovim ćelijama, trispecifični proteini koji ciljaju BCMA mogu umrežiti citotoksične T ćelije sa ćelijama koje eksprimuju BCMA na visoko specifičan način, usmeravajući na taj način citotoksični potencijal T ćelije ka ciljanoj ćeliji. Trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani angažuju citotoksične T ćelije preko vezivanja za površinski eksprimovane CD3 proteine, koji čine deo TCR. Simultano vezivanje nekoliko BCMA trispecifičnih antigenvezujućih proteina za CD3 i za BCMA eksprimovan na površini određenih ćelija izaziva aktivaciju T ćelija i posreduje u kasnijoj lizi određene ćelije koja eksprimuje BCMA. Zbog toga, trispecifični proteini koji ciljaju BCMA pokazuje snažno, specifično i efikasno ubijanje ciljanih ćelija.

Trispecifični proteini koji ciljaju BCMA

koji su ovde opisani mogu stimulisati ubijanje ciljanih ćelija od strane citotoksičnih T ćelija da bi se eliminisale patogene ćelije (npr., tumorske ćelije koje eksprimuju BCMA). U nekim takvim slučajevima, ćelije se eliminišu selektivno, čime se smanjuje mogućnost toksičnih neželjenih dejstava.

[0040] Trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani daju dalje terapijske prednosti u odnosu na tradicionalna monoklonska antitela i druge manje bispecifične molekule. Uopšteno, efikasnost rekombinantnih proteinskih lekova u velikoj meri zavisi od intrinzične farmakokinetike samog proteina. Jedna takva prednost ovde je da trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani imaju produženo farmakokinetičko poluvreme eliminacije zbog domena produženja poluživota kao što je domen specifičan za HSA. U tom pogledu, ovde opisani trispecifični proteini koji ciljaju BCMA imaju produženo poluvreme eliminacije iz seruma od oko dva, tri, oko pet, oko sedam, oko 10, oko 12 ili oko 14 dana u nekim tehničkim rešenjima. Ovo je u suprotnosti sa drugim vezujućim proteinima kao što su BiTE ili DART molekuli koji imaju relativno kraća poluvremena eliminacije. Na primer, BiTE CD19×CD3 bispecifični scFv-scFv fuzioni molekul zahteva kontinuiranu intravensku infuziju (i.v.) isporuku leka zbog kratkog poluvremena eliminacije. Duža intrinzična poluvremena trispecifičnhi proteina koji ciljaju BCMA rešavaju ovaj problem i na taj način omogućavaju povećan terapijski potencijal kao što su farmaceutske formulacije niskih doza, smanjena periodična primena i/ili nove farmaceutske kompozicije.

[0041] Trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani takođe imaju optimalnu veličinu za poboljšanu penetraciju u tkivo i distribuciju u tkivu. Veće veličine ograničavaju ili sprečavaju prodiranje ili distribuciju proteina u ciljanim tkivima. Trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani izbegavaju ovo tako što imaju malu veličinu koja omogućava poboljšanu penetraciju i distribuciju u tkiva. Shodno tome, trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani, u nekim slučajevima imaju veličinu od oko 50 kD do oko 80 kD, od oko 50 kD do oko 75 kD, od oko 50 kD do oko 70 kD, ili od oko 50 kD do oko 65 kD. Prema tome, veličina BCMA ciljanih trispecifičnih proteina ima prednost u odnosu na IgG antitela koja imaju oko 150 kD i molekule BiTE i DART dijatela koji su oko 55 kD, ali nisu produženi poluživot i zato se brzo uklanjaju kroz bubrege.

[0042] Trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani mogu biti dizajnirani tako da imaju optimalnu veličinu za poboljšanu penetraciju i distribuciju u tkiva. U takvim slučajevima, Trispecifični proteini koji ciljaju BCMA je konstruisan tako da bude što manji, uz zadržavanje specifičnosti prema svojim metama. Shodno tome, trispecifični proteini koji ciljaju BCMA i koji su ovde opisani mogu imati veličinu od oko 20 kD do oko 40 kD ili od oko 25 kD do oko 35 kD do oko 40 kD, do oko 45 kD, do oko 50 kD, do oko 55 kD, do oko 60 kD, do oko 65 kD. U nekim slučajevima, BCMA ciljani trispecifični proteini koji su ovde opisani imaju veličinu od oko 50 kD, 49, kD, 48 kD, 47 kD, 46 kD, 45 kD, 44 kD, 43 kD, 42 kD, 41 kD, 40 kD, oko 39 kD, oko 38 kD, oko 37 kD, oko 36 kD, oko 35 kD, oko 34 kD, oko 33 kD, oko 32 kD, oko 31 kD, oko 30 kD, oko 29 kD, oko 28 kD, oko 27 kD , oko 26 kD, oko 25 kD, oko 24 kD, oko 23 kD, oko 22 kD, oko 21 kD, ili oko 20 kD. Primer pristupa maloj veličini je korišćenje fragmenata antitela sa jednim domenom (sdAb) za svaki od domena. Na primer, određeni trispecifični protein koji se vezuje za antigen BCMA ima anti-CD3 sdAb, anti-ALB sdAb i sdAb za BCMA. Ovo smanjuje veličinu primera trispecifičnih proteina koji se vezuju za antigen BCMA na ispod 40 kD. Dakle, domeni trispecifičnih proteina koji ciljaju BCMA mogu biti svi fragmenti antitela sa jednim domenom (sdAb). U drugim slučajevima, trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani sadrže veziva malih molekula (SME) za ALB i/ili BCMA. SME veziva su mali molekuli veličine u proseku od oko 500 do 2000 Da i vezani su za trispecifične proteine koji ciljaju BCMA poznatim postupcima, kao što je sortazna ligacija ili konjugacija. U ovim slučajevima, jedan od domena trispecifičnog proteina koji se vezuje za antigen BCMA je sekvenca za prepoznavanje sortaze, npr., LPETG (SEQ ID NO: 482). Za vezivanje SME veziva na trispecifični protein koji se veže za antigen BCMA sa sekvencom za prepoznavanje sortaze, protein se inkubira sa sortazom i SME vezivom pri čemu sortaza vezuje SME vezivo za sekvencu prepoznavanja. Poznata SME veziva uključuju MIP-1072 i MIP-1095 koji se vezuju za BCMA.

[0043] U još drugim slučajevima, domen koji se vezuje za trispecifični protein koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani može da sadrži čvorni peptid za vezivanje BCMA. Čvorovi su peptidi stabilizovani disulfidom sa skelom cisteinskog čvora i imaju prosečnu veličinu oko 3,5 kD. Predviđeno je da se čvorovi vezuju za određene tumorske molekule kao što je BCMA. Domen koji se vezuje za trispecifične proteine koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani može takođe da sadrži prirodni BCMA ligand.

[0044] Još jedna karakteristika trispecifičnih proteina koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani je da su oni jednopolipeptidnog dizajna sa fleksibilnim vezama njihovih domena. Ovo omogućava laku proizvodnju i izradu trispecifičnih proteina koji ciljaju BCMA jer oni mogu biti kodirani jednim molekulom cDNK da bi se lako ugradili u vektor. Dalje, pošto su trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani monomerni pojedinačni polipeptidni lanac, ne postoje problemi uparivanja lanaca ili zahtevi za dimerizacijom. Smatra se da trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani imaju smanjenu tendenciju agregacije za razliku od drugih prijavljenih molekula kao što su bispecifični proteini sa Fc- gama imunoglobulinskim domenima.

[0045] U trispecifičnim proteinima koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani, domeni su povezani unutrašnjim linkerima L1 i L2, gde L1 povezuje prvi i drugi domen trispecifičnih proteina koji ciljaju BCMA, i L2 povezuje drugi i treći domen BCMA ciljanih trispecifičnih proteina. Linkeri L1 i L2 imaju optimizovanu dužinu i/ili sastav aminokiselina. Što se tiče sastava aminokiselina unutrašnjih linkera L1 i L2, peptidi su odabrani sa svojstvima koja daju fleksibilnost trispecifičnim proteinima koji ciljaju BCMA, ne ometaju vezujuće domene, kao i otporne na cepanje od proteaza. Na primer, ostaci glicina i serina generalno obezbeđuju otpornost na proteazu. Uopšteno govoreći, primeri unutrašnjih linkera pogodnih za povezivanje domena u trispecifičnim proteinima koji ciljaju BCMA uključuju ali nisu ograničeni na (GS)n (SEQ ID NO: 472), (GGS)n (SEQ ID NO: 473), (GGGS)n (SEQ ID NO: 474), (GGSG)n (SEQ ID NO: 475), (GGSGG)n (SEQ ID NO: 476), (GGGGS)n (SEQ ID NO: 477), (GGGGG)n (SEQ ID NO: 478), ili (GGG)n (SEQ ID NO: 479), pri čemu n je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10. U jednom tehničkom rešenju, interni linker L1 i/ili L2 je (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 480) ili (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 481).

Domen koji se vezuje za CD3

[0046] Specifičnost odgovora T ćelija je posredovana prepoznavanjem antigena (prikazanog u kontekstu glavnog kompleksa histokompatibilnosti, MHC) od strane TCR. Kao deo TCR, CD3 je proteinski kompleks koji uključuje CD3γ (gama) lanac, CD3δ (delta) lanac i dva CD3ε (epsilon) lanca koji su prisutni na površini ćelije. CD3 se povezuje sa α (alfa) i β (beta) lancima TCR, kao i CD3ζ (zeta) zajedno da bi sačinjavao kompletan TCR. Grupisanje CD3 na T ćelijama, kao što je imobilizovana anti-CD3 antitela, dovodi do aktivacije T ćelija sličnog angažovanju T ćelijskog receptora, ali nezavisno od njegove specifičnosti tipične za klon.

[0047] Trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani sadrže domen koji se specifično vezuje za CD3. U jednom aspektu, ovde opisani trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji sadrže domen koji se specifično vezuje za humani CD3. BCMA ciljani trispecifični proteini koji su ovde opisani mogu da sadrže domen koji se specifično vezuje za CD3γ. Alternativno, trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani mogu da sadrže domen koji se specifično vezuje za CD3δ. Alternativno, trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani mogu da sadrže domen koji se specifično vezuje za CD3ε.

[0048] Dalje, trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani mogu da sadrže domen koji se specifično vezuje za TCR. U određenim slučajevima, trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani sadrže domen koji specifično vezuje α lanac TCR. U određenim slučajevima, trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani sadrže domen koji specifično vezuje β lanac TCR.

[0049] U nekim slučajevima, CD3 vezujući domen trispecifičnog proteina koji se vezuje za antigen BCMA ima afinitet prema CD3 na ćelijama koje eksprimuju CD3 sa KDod 1000 nM ili manje, 500 nM ili manje, 200 nM ili manje, 100 nM ili manje, 80 nM ili manje, 50 nM ili manje, 20 nM ili manje, 10 nM ili manje, 5 nM ili manje, 1 nM ili manje, ili 0,5 nM ili manje. U nekim specifičnijim slučajevima, CD3 vezujući domen trispecifičnog proteina koji se vezuje za antigen BCMA ima afinitet prema CD3ε, γ ili δ sa KDod 1000 nM ili manje, 500 nM ili manje, 200 nM ili manje, 100 nM ili manje, 80 nM ili manje, 50 nM ili manje, 20 nM ili manje, 10 nM ili manje, 5 nM ili manje, 1 nM ili manje, ili 0,5 nM ili manje. U daljim slučajevima, CD3 vezujući domen trispecifičnog proteina koji se vezuje za antigen BCMA ima nizak afinitet prema CD3, tj., oko 100 nM ili veći.

[0050] Afinitet vezivanja za CD3 se može odrediti, na primer, sposobnošću samog trispecifičnog proteina koji se vezuje za antigen BCMA ili njegovog CD3 vezujućeg domena da se veže za CD3 obložen na ploči za analizu; prikazan na površini mikrobne ćelije; u rastvoru; itd. Aktivnost vezivanja samog trispecifičnog proteina koji se vezuje za antigen BCMA ili njegovog CD3 vezujućeg domena predmetnog obelodanjenja za CD3 može se analizirati imobilizacijom liganda (npr., CD3) ili samog trispecifičnog proteina koji se vezuje za antigen BCMA ili njegovog CD3 vezujućeg domena, na perlu, supstrat, ćeliju, itd. Sredstva se mogu dodati u odgovarajući pufer i partneri za vezivanje inkubirati tokom određenog vremenskog perioda na datoj temperaturi. Nakon ispiranja da bi se uklonio nevezani materijal, vezani protein se može osloboditi sa, na primer, SDS, puferima sa visokim pH i sličnim i analizirati, na primer, pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR).

Domen produženog poluživota

[0051] Ovde se razmatraju domeni koji produžavaju poluživot domena koji se vezuje za antigen. Predviđeno je da takvi domeni uključuju, ali nisu ograničeni na domene za vezivanje albumina, Fc domene, male molekule i druge domene produženog poluživota koji su poznati u stanju tehnike.

[0052] Humani albumin (ALB) (molekulska masa od oko 67 kDa) je najzastupljeniji protein u plazmi, prisutan u količini od oko 50 mg/ml (600 µM), i ima poluživot od oko 20 dana kod ljudi. ALB služi za održavanje pH plazme, doprinosi koloidnom krvnom pritisku, funkcioniše kao nosilac mnogih metabolita i masnih kiselina i služi kao glavni protein za transport lekova u plazmi.

[0053] Nekovalentna povezanost sa albuminom produžava poluvreme eliminacije kratkoživih proteina. Na primer, rekombinantna fuzija domena za vezivanje albumina sa Fab fragmentom rezultirala je klirensom in vivo od 25 i 58 puta i produženjem poluživota od 26 i 37 puta kada se administrira intravenozno miševima i zečevima kao u poređenju sa administracijom samog Fab fragmenta. U drugom primeru, kada se insulin aciluje sa masnim kiselinama da bi se promovisala povezanost sa albuminom, primećen je produženi efekat kada se ubrizgava subkutano kod zečeva ili svinja. Zajedno, ove studije pokazuju vezu između vezivanja albumina i produženog delovanja.

[0054] BCMA ciljanog trispecifičnog ovog pronalaska sadrži domen produžetka poluživota [0055] Domen produženja poluživota trispecifičnog proteina koji se vezuje za antigen BCMA obezbeđuje izmenjenu farmakodinamiku i farmakokinetiku samog trispecifičnog proteina koji se vezuje za antigen BCMA. Kao što je gore navedeno, domen produženja poluživota produžava poluvreme eliminacije. Domen produženja poluživota takođe menja farmakodinamička svojstva uključujući promenu distribucije tkiva, penetraciju i difuziju trispecifičnog proteina koji vezuje antigen. U nekim tehničkim rešenjima, domen produžetka poluživota obezbeđuje poboljšano ciljanje tkiva (uključujući tumor), distribuciju tkiva, penetraciju u tkivo, difuziju unutar tkiva i poboljšanu efikasnost u poređenju sa proteinom bez domena produženja poluživota. U jednom tehničkom rešenju, terapijski postupci efektivno i efikasno koriste smanjenu količinu trispecifičnog proteina koji vezuje antigen, što rezultira smanjenim sporednim efektima, kao što je smanjena citotoksičnost netumorskih ćelija.

[0056] Dalje, afinitet vezivanja domena produženja poluživota može biti izabran tako da cilja specifično poluvreme eliminacije u određenom trispecifičnom proteinu koji vezuje antigen. Prema tome, domen produžetka poluživota može imati visok afinitet vezivanja ili srednji afinitet vezivanja; ili nizak ili marginalni afinitet vezivanja. Primeri afiniteta vezivanja uključuju koncentracije KD na 10 nM ili manje (visoke), između 10 nM i 100 nM (srednje) i veće od 100 nM (niske). Kao što je gore navedeno, afiniteti vezivanja za ALB se određuju poznatim metodama kao što je površinska plazmonska rezonanca (SPR).

[0057] U nekim slučajevima, ALB vezujući domeni opisani ovde sadrže jednodomensko antitelo.

Domen koji se vezuje za antigen sazrevanja B ćelija (BCMA)

[0058] Antigen sazrevanja B ćelija (BCMA, TNFRSF17, CD269) je transmembranski protein koji pripada super familiji receptora porodice tumorske nekroze (TNFR) koji je primarno eksprimovan na terminalno diferenciranim B ćelijama. Ekspresija BCMA je ograničena na B ćelijsku liniju i uglavnom je prisutna na plazma ćelijama i plazmablastima i donekle na memorijskim B ćelijama, ali je praktično odsutna na perifernim i naivnim B ćelijama. BCMA se takođe eksprimuje ćelijama multiplog mijeloma (MM), na ćelijama leukemije i ćelijama limfoma.

[0059] BCMA je identifikovan molekularnom analizom t(4;16)(q26;p13) translokacije pronađene u humanom intestinalnom T ćelijskom limfomu i sekvenca unutar okvira je mapirana u traku hromozoma 16p13.1.

[0060] Humana BCMA cDNK ima otvoreni okvir čitanja od 552 bp koji kodira polipeptid od 184 amino kiseline. BCMA gen je organizovan u tri egzona koji su odvojeni sa dva introna, od kojih je svaki okružen konsenzusnim mestima za spajanje GT donora i AG akceptora, i kodira transkript od 1,2 kb. Struktura BCMA proteina uključuje integralni transmembranski protein zasnovan na centralnom hidrofobnom regionu od 24 aminokiseline u strukturi alfa-spirale.

[0061] Mišiji BCMA gen je lociran na hromozomu 16 sinteničnom za humani 16p13 region, i takođe uključuje tri egzona koja su odvojena sa dva introna. Gen kodira protein od 185 aminokiselina. Mišija BCMA mRNK se izražava kao transkript od 404 bp na najvišim nivoima u ćelijama plazmacitoma (J558) i na skromnim nivoima u A20 B ćelijskoj liniji limfoma. Mišiji BCMA mRNK transkripti su takođe detektovani na niskim nivoima u linijama limfoma T ćelija (EL4, BW5147) i dendritskih ćelija (CB1D6, D2SC1), za razliku od humanih ćelijskih linija T ćelija i dendritskih ćelija. Mišija BCMA cDNK sekvenca ima 69,3% nukleotidnog identiteta sa sekvencom humane BCMA cDNK i nešto veći identitet (73,7%) kada se uporede kodirajući regioni između ove dve sekvence cDNK. Mišiji BCMA protein je 62% identičan humanom BCMA proteinu i, kao i humani BCMA, sadrži jedan hidrofobni region, koji može biti unutrašnji transmembranski segment. N-terminalni domen od 40 aminokiselina i mišijeg i humanog BCMA proteina ima šest konzerviranih cisteinskih ostataka, u skladu sa formiranjem motiva ponavljanja cisteina koji se nalazi u ekstracelularnom domenu TNFR. Slično članovima TNFR superfamilije, BCMA protein sadrži konzervirani aromatični ostatak od četiri do šest ostataka C-terminala iz prvog cisteina.

[0062] BCMA se ne eksprimuje na površini ćelije, već se nalazi na Golgijevom aparatu. Količina ekspresije BCMA je proporcionalna stadijumu ćelijske diferencijacije (najviša u plazma ćelijama).

[0063] Uključen je u razvoj B ćelija i homeostazu zbog njegove interakcije sa svojim ligandima BAFF (faktor aktiviranja B ćelija, takođe označen kao TALL-1 ili TNFSF13B) i APRIL (ligand koji indukuje proliferaciju).

[0064] BCMA reguliše različite aspekte humoralnog imuniteta, razvoja B ćelija i homeostaze zajedno sa svojim članovima familije TACI (transmembranski aktivator i interaktor ciklofilinskog liganda) i BAFF-R (receptor faktora aktivacije B ćelija, takođe poznat kao član superporodice receptora faktora tumorske nekroze 13C). Ekspresija BCMA se javlja prilično kasno u diferencijaciji B ćelija i doprinosi dugoročnom preživljavanju plazmablasta i plazma ćelija u koštanoj srži. BCMA takođe podržava rast i preživljavanje ćelija multiplog mijeloma (MM).

[0065] BCMA je uglavnom poznat po svojoj funkcionalnoj aktivnosti u posredovanju u preživljavanju plazma ćelija koje održavaju dugotrajni humoralni imunitet.

[0066] Postoji potreba za mogućnostima lečenja solidnih tumorskih bolesti povezanih sa prekomernom ekspresijom BCMA, kao što su kancerogeni multipli mijelom, leukemije i limfomi. Predmetno obelodanjenje obezbeđuje proteine sa jednim domenom koji se specifično vezuju za BCMA na površini ciljnih ćelija tumora.

[0067] Dizajn trispecifičnih proteina koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani omogućava da domen koji se vezuje za BCMA bude fleksibilan u smislu da domen koji se vezuje za BCMA može biti bilo koji tip vezujućeg domena, uključujući ali ne ograničavajući se na domene iz monoklonskog antitela, poliklonskog antitela, rekombinantnog antitela, humanog antitela, humanizovanog antitela.

[0068] Tipično, BCMA vezujući domen se vezuje za protein koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 469, 470 ili 471. U nekim slučajevima, može se vezati za protein koji sadrži skraćenu verziju SEQ ID NO: 469, 470 ili 471.

[0069] BCMA vezujući domen je anti-BCMA antitelo ili varijanta antitela. Kako se ovde koristi, termin "varijanta antitela" se odnosi na varijante i derivate antitela opisanih ovde. Razmatrane su varijante sekvence aminokiselina ovde opisanih anti-BCMA antitela. Na primer, određene varijante aminokiselinske sekvence anti-BCMA antitela opisane ovde su predviđene da poboljšaju afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Primeri postupaka za pripremu varijanti amino kiselina uključuju, ali nisu ograničeni na, uvođenje odgovarajućih modifikacija u nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo, ili sintezom peptida. Takve modifikacije obuhvataju, na primer, delecije iz, i/ili insercije u i/ili supstitucije ostataka unutar aminokiselinskih sekvenci antitela.

[0070] Bilo koja kombinacija delecije, umetanja i supstitucije može da se napravi da bi se došlo do konačne konstrukcije, pod uslovom da konačna konstrukcija poseduje željene karakteristike, npr., vezivanje antigena. Date su varijante antitela koje imaju jednu ili više supstitucija amino kiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju CDR i okvirne regione. Primeri takvih supstitucija su opisani u nastavku. Supstitucije aminokiselina mogu biti uvedene u antitelo od interesa i proizvodi se testiraju na željenu aktivnost, npr., zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost ili poboljšana citotoksičnost posredovana T-ćelijama (TDCC). Razmatrane su obe supstitucije aminokiselina konzervativne i nekonzervativne za pripremu varijanti antitela.

[0071] U drugom primeru supstitucije za stvaranje varijantnog anti-BCMA antitela, jedan ili više ostataka hipervarijabilnog regiona roditeljskog antitela su supstituisani. Uopšteno, varijante se zatim biraju na osnovu poboljšanja željenih svojstava u poređenju sa roditeljskim antitelom, na primer, povećan afinitet, smanjen afinitet, smanjena imunogenost, povećana pH zavisnost vezivanja.

[0072] BCMA vezujući domen trispecifičnog proteina koji cilja BCMA je jednodomensko antitelo koje je varijabilni domen (VHH).

[0073] Uopšteno, treba napomenuti da termin jednodomensko antitelo kako se ovde koristi u svom najširem smislu nije ograničen na specifičan biološki izvor ili na specifičan postupak pripreme. Antitela sa jednim domenom su antitela čiji su komplementarni određujući regioni deo polipeptida sa jednim domenom. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, antitela teškog lanca, antitela koja su prirodno lišena lakih lanaca, jednodomenska antitela izvedena iz konvencionalnih 4-lančanih antitela, projektovana antitela i jednodomenske skele osim onih dobijenih od antitela. Antitela sa jednim domenom mogu biti bilo koja iz stanja tehnike, ili bilo koja buduća jednodomenska antitela. Antitela sa jednim domenom mogu biti izvedena iz bilo koje vrste uključujući, ali bez ograničenja na, miša, čoveka, kamilu, lamu, kozu, zeca, goveče. Na primer, jednodomenska antitela prema pronalasku mogu se dobiti: (1) izolovanjem VHH domena prirodnog antitela teškog lanca; (2) ekspresijom nukleotidne sekvence koja kodira VHH domen koji se javlja u prirodi; (3) "humanizacijom" VHH domena koji se pojavljuje u prirodi ili ekspresijom nukleinske kiseline koja kodira takav humanizovani VHH domen; (4) "kamelizacijom" VH domena koji se javlja u prirodi od bilo koje životinjske vrste, a posebno od vrste sisara, kao što je ljudsko biće, ili ekspresijom nukleinske kiseline koja kodira takav kamelizovani VH domen; (5) "kamelizacijom" "domenskog antitela" ili "Dab", ili ekspresijom nukleinske kiseline koja kodira takav kamelizovani VH domen; (6) korišćenjem sintetičkih ili polusintetičkih tehnika za pripremu proteina, polipeptida ili drugih sekvenci amino kiselina; (7) pripremanjem nukleinske kiseline koja kodira jednodomensko antitelo korišćenjem tehnika za sintezu nukleinske kiseline poznate u ovoj oblasti, nakon čega sledi ekspresija tako dobijene nukleinske kiseline; i/ili (8) bilo kojom kombinacijom jednog ili više od prethodnog.

[0074] Antitelo sa jednim domenom može odgovarati VHH domenima prirodno prisutnih antitela teškog lanca usmerenih protiv BCMA. Kao što je dalje opisano ovde, takve VHH sekvence se generalno mogu generisati ili dobiti odgovarajućom imunizacijom vrste lame sa BCMA, (tj., tako da se podigne imuni odgovor i/ili antitela teškog lanca usmerena protiv BCMA), dobijanjem odgovarajućeg biološkog uzorak iz pomenute lame (kao što je uzorak krvi, uzorak seruma ili uzorak B-ćelija), i generisanjem VHH sekvenci usmerenih protiv BCMA, počevši od navedenog uzorka, korišćenjem bilo koje pogodne tehnike poznate u ovoj oblasti.

[0075] Alternativno, takvi VHH domeni koji se javljaju u prirodi protiv BCMA, dobijaju se iz naivnih biblioteka Camelid VHH sekvenci, na primer skriningom takve biblioteke primenom BCMA, ili najmanje jednog dela, fragmenta, antigenske determinante ili epitopa koristeći jedan ili više tehnika skrininga poznatih u ovoj oblasti. Takve biblioteke i tehnike su na primer opisane u WO 99/37681, WO 01/90190, WO 03/025020 i WO 03/035694. Alternativno, koriste se poboljšane sintetičke ili polusintetičke biblioteke izvedene iz naivnih VHH biblioteka, kao što su VHH biblioteke dobijene iz naivnih VHH biblioteka tehnikama kao što su nasumična mutageneza i/ili CDR mešanje, kao što je na primer opisano u WO 00/43507.

[0076] Još jedna tehnika za dobijanje VHH sekvenci usmerenih protiv BCMA, uključuje odgovarajuću imunizaciju transgenog sisara koji je sposoban da ekspresuje antitela teškog lanca (tj., tako da se podigne imuni odgovor i/ili antitela teškog lanca usmerena protiv BCMA), dobijanje odgovarajući biološki uzorak navedenog transgenog sisara (kao što je uzorak krvi, uzorak seruma ili uzorak B-ćelija), a zatim generisanje VHH sekvenci usmerenih protiv BCMA, počevši od navedenog uzorka, korišćenjem bilo koje pogodne tehnike poznate u ovoj oblasti. Na primer, za ovu svrhu, mogu se koristiti pacovi ili miševi koji eksprimuju teški lanac antitela i dalje postupke i tehnike opisane u WO 02/085945 i WO 04/049794.

[0077] U nekim slučajevima, anti-BCMA jednodomensko antitelo trispecifičnog proteina koji cilja BCMA sadrži jednodomensko antitelo sa sekvencom aminokiselina koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci prirodnog VHH domena, ali koja je "humanizovana", tj., jedan ili više aminokiselinskih ostataka u aminokiselinskoj sekvenci pomenute VHH sekvence koja se javlja u prirodi (a posebno u okvirnim sekvencama) pomoću jednog ili više aminokiselinskih ostataka koji se javljaju na odgovarajućim pozicijama u VH domenu iz konvencionalno 4-lančano antitelo od ljudskog bića (npr., kao što je gore navedeno). Ovo se može izvesti na način poznat u ovoj oblasti, koji će biti jasan stručnjaku iy date oblasti tehnike, na primer na osnovu daljeg opisa ovde. Opet, treba napomenuti da se takva humanizovana anti-BCMA jednodomenska antitela iz ovog obelodanjenja dobijaju na bilo koji pogodan način poznat sam po sebi (tj., kao što je naznačeno u tačkama (1)-(8) iznad) i zbog toga nisu striktno ograničene na polipeptide koji su dobijeni primenom polipeptida koji sadrži VHH domen koji se prirodno pojavljuje kao polazni materijal. Alternativno, jednodomensko anti-BCMA antitelo, kao što je ovde opisano, sadrži jednodomensko antitelo sa aminokiselinskom sekvencom koja odgovara amino kiselinskoj sekvenci prirodnog VH domena, ali koja je "kamelizovana", tj. jedan ili više aminokiselinskih ostataka u amino kiselinskoj sekvenci prirodnog VH domena iz konvencionalnog 4-lančanog antitela sa jednim ili više aminokiselinskih ostataka koji se javljaju na odgovarajućim pozicijama u VHH domenu teškog lanca antitelo. Takve "kamelizovane" supstitucije se poželjno ubacuju na pozicije aminokiselina koje formiraju i/ili su prisutne na VH-VL interfejsu, i/ili na takozvanim ostacima obeležja Camelidae (videti na primer WO 94/04678 i Davies i Riechmann (1994 i 1996)). Poželjno, VH sekvenca koja se koristi kao polazni materijal ili početna tačka za generisanje ili dizajniranje kamelizovanog pojedinačnog domena je poželjno VH sekvenca od sisara, poželjnije VH sekvenca ljudskog bića, kao što je VH3 sekvenca. Međutim, treba napomenuti da se takva kamelizovana jednodomenska antitela anti-BCMA iz ovog obelodanjenja mogu dobiti na bilo koji pogodan način poznat u ovoj oblasti (tj., kao što je naznačeno u tačkama (1)-(8) iznad) i zbog toga nisu strogo ograničeno na polipeptide koji su dobijeni primenom polipeptida koji sadrži VH domen koji se javlja u prirodi kao polazni materijal. Na primer, kao što je dalje opisano ovde, i "humanizacija" i "kamelizacija" se izvode obezbeđivanjem nukleotidne sekvence koja kodira prirodni VHH domen ili VH domen, respektivno, a zatim menjanjem jednog ili više kodona u navedenoj nukleotidnoj sekvenci u takvoj način na koji nova nukleotidna sekvenca kodira "humanizovano" ili "kamelizovano" jednodomensko antitelo, respektivno. Ova nukleinska kiselina se zatim može eksprimovati, tako da se dobije željeno jednodomensko antitelo anti-BCMA prema pronalasku. Alternativno, na osnovu aminokiselinske sekvence prirodnog VHH domena ili VH domena, respektivno, aminokiselinska sekvenca željenog humanizovanog ili kamelizovanog anti-BCMA jednodomenskog antitela iz predmetnog obelodanjenja, respektivno, može biti dizajnirana i potom sintetizovana de novo primenom poznatih tehnika za sintezu peptida. U nekim slučajevima, na osnovu aminokiselinske sekvence ili nukleotidne sekvence prirodnog VHH domena ili VH domena, respektivno, nukleotidna sekvenca koja kodira željeno humanizovano ili kamelizovano anti-BCMA jednodomensko antitelo iz predmetnog obelodanjenja, respektivno, može biti dizajnirano i zatim sintetisan de novo primenom poznatih tehnika za sintezu nukleinske kiseline, nakon čega se tako dobijena nukleinska kiselina ekspresuje primenom poznatih tehnika ekspresije, tako da se dobije željeno anti-BCMA jednodomensko antitelo prema pronalasku.

[0078] Drugi pogodni postupci i tehnike za dobijanje jednodomenskog antitela anti-BCMA prema pronalasku i/ili nukleinskih kiselina koje kodiraju isto, počevši od VH sekvenci ili VHH sekvenci koje se pojavljuju u prirodi, na primer, obuhvataju kombinovanje jednog ili više delova jednog ili više prirodnih VH sekvence (kao što su jedna ili više okvirnih (FR) sekvenci i/ili sekvenci regiona koji određuju komplementarnost (CDR)), jedan ili više delova jedne ili više VHH sekvenci koje se pojavljuju u prirodi (kao što je jedna ili više FR sekvenci ili CDR sekvenci) i/ili jednu ili više sintetičkih ili polusintetičkih sekvenci, na pogodan način, tako da se obezbedi jednodomensko antitelo anti-BCMA prema pronalasku ili nukleotidna sekvenca ili nukleinska kiselina koja ih kodira.

U skladu sa patentnim pronalaskom, treći domen trispecifičnog proteina koji se vezuje za BCMA sadrži VHH domen prema SEQ ID NO: 383. VHH domen sadrži sledeću formulu: F1-CDR1-F2-CDR2-F3-CDR3-F4, pri čemu je region za određivanje komplementarnosti CDR1 je SEQ ID NO: 76, CDR2 je SEQ ID NO: 190, i CDR3 je SEQ ID NO: 304, i okvirni region F1 je SEQ ID NO: 461, F2 je SEQ ID NO: 463, F3 je SEQ ID NO: 464, i F4 je SEQ ID NO: 460.

[0079] Protein koji se vezuje za BCMA koji je ovde opisan može se vezati za humani BCMA sa hKd u opsegu od oko 0,1 nM do oko 500 nM, ili do oko 400 nM, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90 nM.

Alternativno, hKd može da se kreće od oko 0,1 nM do oko 450 nM, 0,2 nM do oko 80 nM; ili od oko 0,3 nM do oko 70 nM; ili od oko 0,4 nM do oko 50 nM; ili od oko 0,5 nM do oko 30 nM; ili od oko 0,6 nM do oko 10 nM; ili od oko 0,7 nM do oko 8 nM, ili od oko 0,8 nM do oko 6 nM; ili od oko 0,9 nM do oko 4 nM; ili od oko 1 nM do oko 2 nM.

[0080] Bilo koji od prethodnih BCMA vezujućih domena može biti obeležen afinitetnim peptidom radi lakšeg prečišćavanja. Na primer, afinitetna peptidna oznaka može biti šest uzastopnih histidinskih ostataka, koji se takođe nazivaju His tag ili 6X-his (His-His-His-His-His-His; SEQ ID NO: 471).

[0081] Domeni koji se vezuju za BCMA predmetnog obelodanjenja prvenstveno vezuju BCMA vezanu za membranu u odnosu na rastvorljivi BCMA. BCMA vezan za membranu odnosi se na prisustvo BCMA u ili na površini ćelijske membrane ćelije koja eksprimuje BCMA. Rastvorljivi BCMA se odnosi na BCMA koji više nije na ili na površini ćelijske membrane ćelije koja eksprimuje ili eksprimuje BCMA. U određenim slučajevima, rastvorljivi BCMA je prisutan u krvi i/ili limfnoj cirkulaciji kod subjekta. BCMA vezujući domeni mogu poželjno da vežu BCMA vezan za membranu najmanje 5 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 25 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 100 puta, 500 puta ili 1000 puta više od rastvorljivog BCMA. Trispecifični proteini koji se vezuju za ciljani antigen BCMA predmetnog obelodanjenja mogli bi da prvenstveno vežu BCMA koji je vezan za membranu 30 puta više od rastvorljivog BCMA. Određivanje preferencijalnog vezivanja proteina koji vezuje antigen za BCMA koji je vezan za membranu u odnosu na rastvorljivi BCMA može se lako odrediti primenom testova koji su dobro poznati u stanju tehnike.

Polinukleotidi koji kodiraju trispecifične proteine koji ciljaju BCMA

[0082] Takođe su obezbeđeni polinukleotidni molekuli koji kodiraju trispecifični protein koji se vezuje za anti-BCMA koji je ovde opisan. Oni mogu biti obezbeđeni kao DNK konstrukt ili kao transkript RNK za prenos.

[0083] Molekuli polinukleotida se konstruišu poznatim postupcima kao što je kombinovanje gena koji kodiraju tri vezujuća domena ili odvojena peptidnim linkerima ili, u drugim tehničkim rešenjima, direktno povezani peptidnom vezom, u jednu genetsku konstrukciju koja je operativno povezana sa odgovarajućim promoterom, i opciono pogodan terminator transkripcije, i ekspresija u bakterijama ili drugom odgovarajućem ekspresionom sistemu kao što su, na primer, CHO ćelije.

U tehničkim rešenjima gde je domen koji se vezuje za BCMA mali molekul, polinukleotidi sadrže gene koji kodiraju CD3 vezujući domen i domen produžetka poluživota. U tehničkim rešenjima gde je domen produženja poluživota mali molekul, polinukleotidi sadrže gene koji kodiraju domene koji se vezuju za CD3 i BCMA. U zavisnosti od korišćenog vektorskog sistema i domaćina, može se koristiti bilo koji broj odgovarajućih elemenata za transkripciju i translaciju, uključujući konstitutivne i inducibilne promotere. Promoter je odabran tako da pokreće ekspresiju polinukleotida u odgovarajućoj ćeliji domaćinu.

[0084] Polinukleotid se može umetnuti u vektor, poželjno ekspresioni vektor. Ovaj rekombinantni vektor se može konstruisati prema poznatim postupcima. Vektori od posebnog interesa uključuju plazmide, fagemide, derivate faga, viri (npr. retroviruse, adenoviruse, viruse povezane sa adeno, viruse herpesa, lentiviruse i slično), i kozmide.

[0085] Različiti ekspresioni vektor/domaćin sistemi mogu da se koriste da sadrže i ekspresuju polinukleotid koji kodira polipeptid opisanog trispecifičnog proteina za vezivanje antigena. Primeri ekspresionih vektora za ekspresiju u E. coli su pSKK (Le Gall i sar., J Immunol Methods. (2004) 285(1):111-27) ili pcDNA5 (Invitrogen) za ekspresiju u ćelijama sisara.

[0086] Prema tome, trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani, mogu se proizvesti uvođenjem vektora koji kodira protein kao što je gore opisano u ćeliju domaćina i kultivisanje navedene ćelije domaćina pod uslovima u kojima su proteinski domeni eksprimovani, mogu se izolovati i, opciono, dalje prečišćavati.

Integracija u himerne antigenske receptore (CAR)

[0087] Trispecifični proteini koji se vezuju za ciljani antigen BCMA prema predmetnom obelodanjenju mogu biti ugrađeni u himerni antigenski receptor (CAR). Konstruisana imunološka efektorska ćelija, npr., T ćelija ili NK ćelija, može da se koristi za ekspresiju CAR koji uključuje trispecifični protein za ciljani anti-BCMA koji sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo kao što je ovde opisano. U jednom tehničkom rešenju, CAR uključujući trispecifični protein za ciljani anti-BCMA kao što je ovde opisano je povezan sa transmembranskim domenom preko zglobnog regiona, i dalje kostimulatorskim domenom, npr. funkcionalnim signalnim domenom dobijenim od OX40, CD27, CD28, CD5, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), ili 4-1BB.The CAR može dalje da sadrži sekvencu koja kodira intracelularni signalni domen, kao što je 4-1BB i/ili CD3 zeta.

Modifikacije BCMA trispecifičnog proteina

[0088] Trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani obuhvataju derivate ili analoge u kojima (i) je aminokiselina supstituisana aminokiselinskim ostatkom koji nije kodiran genetskim kodom, (ii) zreli polipeptid je fuzionisan sa drugim jedinjenjem kao što je polietilen glikol, ili (iii) dodatne amino kiseline su fuzionisane sa proteinom, kao što je vodeća ili sekretorna sekvenca ili sekvenca za prečišćavanje proteina.

[0089] Tipične modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na acetilaciju, acilaciju, ADP-ribozilaciju, amidaciju, kovalentno vezivanje flavina, kovalentno vezivanje hem ostatka, kovalentno vezivanje nukleotida ili derivata nukleotida, kovalentno vezivanje lipida ili lipidnog derivata, kovalentno vezivanje fosfatidilinozitola, unakrsno povezivanje, ciklizacija, formiranje disulfidne veze, demetilacija, formiranje kovalentnih unakrsnih veza, formiranje cistina, formiranje piroglutamata, formilacija, gama karboksilacija, glikozilacija, formiranje GPI sidra, hidroksilacija, jodiranje, metilacija, miristoilacija, oksidacija, proteolitička obrada, fosforilacija, prenilacija, racemizacija, selenoilacija, sulfatizacija, dodavanje amino kiselina proteinima posredovano transferom RNK kao što je arginilacija, i ubikvitinacija.

[0090] Modifikacije se vrše bilo gde u trispecifičnim proteinima koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani, uključujući peptidnu kičmu, bočne lance amino kiselina i amino ili karboksilne krajeve. Određene uobičajene peptidne modifikacije koje su korisne za modifikaciju trispecifičnih proteina koji ciljaju BCMA uključuju glikozilaciju, vezivanje lipida, sulfatizaciju, gama-karboksilaciju ostataka glutaminske kiseline, hidroksilaciju, blokadu amino ili karboksilne grupe u polipeptidu, ili oboje, kovalentnom modifikacijom, i ADP-ribozilacija.

Farmaceutske komopzicije

[0091] Takođe su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže trispecifični vezujući protein koji se vezuje za anti-BCMA koji je opisan ovde, vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid trispecifičnih proteina koji ciljaju BCMA ili ćeliju domaćina transformisanu ovim vektorom i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač. Termin "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje, ali nije ograničen na bilo koji nosač koji ne ometa efikasnost biološke aktivnosti sastojaka i koji nije toksičan za pacijenta kome se administrira. Primeri pogodnih farmaceutskih nosača su dobro poznati u stanju tehnike i uključuju fosfatno puferisane slane rastvore, vodu, emulzije, kao što su emulzije ulje/voda, različite vrste sredstava za vlaženje, sterilni rastvori itd. Takvi nosači se mogu formulisati konvencionalnim postupcima i mogu se administrirati subjektu u odgovarajućoj dozi. Poželjno je da su kompozicije sterilne. Ove kompozicije mogu takođe da sadrže pomoćne supstance kao što su konzervansi, emulgatori i disperziona sredstva. Sprečavanje delovanja mikroorganizama može se obezbediti uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih sredstava. Sledeće tehničko rešenje obezbeđuje jedan ili više od gore opisanih trispecifičnih proteina koji ciljaju BCMA upakovanih u liofilizovani oblik, ili upakovanih u vodenom medijumu.

[0092] U farmaceutskim kompozicijama, trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani mogu biti inkapsulirani u nanočestice. Takve nanočestice mogu biti fulereni, tečni kristali, lipozomi, kvantne tačke, superparamagnetne nanočestice, dendrimeri, ili nanošipci. U nekim slučajevima, trispecifični protein koji se vezuje za antigen BCMA je vezan za lipozome. U nekim slučajevima, trispecifični proteini koji se vezuju za antigen BCMA su konjugovani na površinu lipozoma. U nekim slučajevima, trispecifični proteini koji se vezuju za antigen BCMA su inkapsulirani unutar ljuske lipozoma. U nekim slučajevima, lipozom je katjonski lipozom.

[0093] Trispecifični proteini koji ciljaju BCMA koji su ovde opisani su predviđeni da se primenjuju kao lek. Administracija se vrši na različite načine, npr. intravenskom, intraperitonealnom, subkutanom, intramuskularnom, topikalnom ili intradermalnom administracijom. Način administracije zavisi od vrste terapije i vrste jedinjenja sadržanog u farmaceutskoj kompoziciji. Režim doziranja će odrediti prisutni lekar i drugi klinički faktori. Doze za svakog pacijenta zavise od mnogih faktora, uključujući veličinu pacijenta, površinu tela, starost, pol, određeno jedinjenje koje se administrira, vreme i način administracije, vrstu terapije, opšte zdravlje i druge lekove koji se istovremeno primenjuju. "Efektivna doza" se odnosi na količine aktivnog sastojka koje su dovoljne da utiču na tok i težinu bolesti, što dovodi do smanjenja ili remisije takve patologije i može se odrediti primenom poznatih postupaka.

[0094] U nekim slučajevima, trispecifični proteini koji ciljaju BCMA predmetnog obelodanjenja se administriraju u dozama do 10 mg/kg sa učestalošću od jednom nedeljno. U nekim slučajevima, dozni režim se kreće od oko 1 ng/kg do oko 10 mg/kg. U nekim slučajevima, doza je od oko 1 ng/kg do oko 10 ng/kg, oko 5 ng/kg do oko 15 ng/kg, oko 12 ng/kg do oko 20 ng/kg, oko 18 ng/kg do oko 30 ng/kg, oko 25 ng/kg do oko 50 ng/kg, oko 35 ng/kg do oko 60 ng/kg, oko 45 ng/kg do oko 70 ng/kg, oko 65 ng/kg do oko 85 ng/kg, oko 80 ng/kg do oko 1 µg/kg, oko 0,5 µg/kg do oko 5 µg/kg, oko 2 µg/kg do oko 10 µg/kg, oko 7 µg/kg do oko 15 µg/ kg, oko 12 µg/kg do oko 25 µg/kg, oko 20 µg/kg do oko 50 µg/kg, oko 35 µg/kg do oko 70 µg/kg, oko 45 µg/kg do oko 80 µg/kg, oko 65 µg/kg do oko 90 µg/kg, oko 85 µg/kg do oko 0,1 mg/kg, oko 0,095 mg/kg do oko 10 mg/kg. U nekim slučajevima, doza je oko 0,1 mg/kg do oko 0,2 mg/kg; oko 0,25 mg/kg do oko 0,5 mg/kg, oko 0,45 mg/kg do oko 1 mg/kg, oko 0,75 mg/kg do oko 3 mg/kg, oko 2,5 mg/kg do oko 4 mg/kg, oko 3,5 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 4,5 mg/kg do oko 6 mg/kg, oko 5,5 mg/kg do oko 7 mg/kg, oko 6,5 mg/kg do oko 8 mg/kg, oko 7,5 mg/ kg do oko 9 mg/kg, ili oko 8,5 mg/kg do oko 10 mg/kg. Učestalost administracije može biti manje od dnevno, svaki drugi dan, manje od jednom dnevno, dva puta nedeljno, nedeljno, jednom u 7 dana, jednom u dve nedelje, jednom u dve nedelje, jednom u tri nedelje, jednom u četiri nedeljama ili jednom mesečno. U nekim slučajevima, učestalost administracije je nedeljno. U nekim slučajevima, učestalost administracije je nedeljno, a doza je do 10 mg/kg. U nekim slučajevima, trajanje administracije je od oko 1 dana do oko 4 nedelje ili duže.

Postupci lečenja

[0095] Reference za postupke lečenja terapijom ili operacijom ili in vivo dijagnostičke metode u ovom opisu, treba da se tumače kao reference za jedinjenja i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska za primenu u tim postupcima.

Trispecifični proteini koji ciljaju BCMA ovog obelodanjenja poželjno bi trebalo da smanje rast tumorskih ćelija in vivo kada se administriraju subjektu koji ima tumorske ćelije koje eksprimuju BCMA. Merenje smanjenja rasta tumorskih ćelija može se odrediti pomoću više različitih metodologija dobro poznatih u stanju tehnike. Neograničavajući primeri uključuju direktno merenje dimenzije tumora, merenje izrezane tumorske mase i poređenje sa kontrolnim subjektima, merenje pomoću tehnika snimanja (npr., CT ili MRI) koje mogu ili ne moraju koristiti izotope ili luminiscentne molekule (npr., luciferaza) za poboljšanje analiza i sl. U specifičnim slučajevima, primena trispecifičnih proteina prema obelodanjenju može dovesti do smanjenja in vivo rasta tumorskih ćelija u poređenju sa kontrolnim sredstvom za vezivanje antigena za najmanje oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%, sa smanjenjem rasta tumora za oko 100%, što ukazuje na potpun odgovor i nestanak tumora. Takođe, primena trispecifičnih proteina prema pronalasku bi poželjno trebalo da dovede do smanjenja in vivo rasta tumorskih ćelija u poređenju sa kontrolnim sredstvom za vezivanje antigena za oko 50-100%, oko 75-100% ili oko 90-100%, kao što je za oko 50-60%, oko 60-70%, oko 70-80%, oko 80-90%, ili oko 90-100%.

[0096] Ovde su takođe obezbeđeni postupci i primene stimulaciju imunog sistema pojedinca kome je to potrebno, koji obuhvataju administriranje trispecifičnog proteina za ciljanje anti-BCMA. U nekim slučajevima, administriranje trispecifičnog proteina koji cilja anti-BCMA koji je ovde opisan indukuje i/ili održava citotoksičnost prema ćeliji koja eksprimuje ciljni antigen.

[0097] Ovde su takođe obezbeđeni postupci i primene stimulaciju imunog sistema pojedinca kome je to potrebno, koji obuhvataju administriranje proteina koji se vezuje za BCMA kao što je ovde opisano. U nekim slučajevima, administriranje proteina koji se vezuje za BCMA kao što je ovde opisano indukuje i/ili održava citotoksičnost prema ćeliji koja eksprimuje ciljni antigen. U nekim slučajevima, ćelija koja eksprimuje ciljni antigen je terminalno diferencirana B ćelija koja je ćelija kancera ili tumora, ili metastatska ćelija kancera ili tumorska ćelija.

[0098] Ovde su takođe obezbeđeni postupci i primene za lečenje bolesti, poremećaja ili stanja povezanih sa BCMA koji obuhvataju administriranje pojedincu kome je to potrebno proteina koji se vezuje za BCMA ili multispecifičnog vezujućeg proteina koji sadrži protein koji se vezuuje za BCMA koji je ovde opisan.

[0099] Bolesti, poremećaji ili uslovi koji su povezani sa BCMA uključuju, ali nisu ograničeni na kancer ili metastaze koje su B ćelijske linije.

[0100] Kanceri se mogu lečiti, sprečiti, ili upravljati proteinima koji se vezuju za BCMA ovog obelodanjenja, i postupci za njihovu prmenu, uključuju ali bez ogrraničenja primarni kancer ili metastatski kancer.

[0101] Primeri takvih leukemija uključuju, ali nisu ograničeni na,: akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL), akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL) i hroničnu mijeloidnu leukemiju (CML), kao i brojne manje uobičajeni tipovi kao što su, na primer, leukemija dlakavih ćelija (HCL), T-ćelijska prolimfocitna leukemija (T-PLL), velika granularna limfocitna leukemija i T-ćelijska leukemija odraslih, itd. Podtipovi akutne limfoblastne leukemije (ALL) koji se leče uključuju, ali nisu ograničeni na, prekursor B akutnu limfoblastnu leukemiju, prekursor T akutnu limfoblastnu leukemiju, Burkitovu leukemiju i akutnu bifenotipsku leukemiju. Podtipovi hronične limfocitne leukemije (CLL) koji se leče uključuju, ali nisu ograničeni na, prolimfocitnu leukemiju B-ćelija. Podtipovi akutne mijelogene leukemije (AML) koji se leče uključuju, ali nisu ograničeni na, akutnu promijelocitnu leukemiju, akutnu mijeloblastnu leukemiju i akutnu megakarioblastnu leukemiju. Podtipovi hronične mijelogene leukemije (CML) koji se leče uključuju, ali nisu ograničeni na, hroničnu mijelomonocitnu leukemiju.

[0102] Primeri limfoma koji se leči predmetnim postupcima uključuju, ali ne ograničavaju se na Hodžkinovu bolest, ne-Hodgkinovu bolest ili bilo koji podtip limfoma.

[0103] Primeri takvih multiplih mijeloma uključuju, ali nisu ograničeni na, multipli mijelom kosti ili drugih tkiva uključujući, na primer, tinjajući multipli mijelom, nesekretorni mijelom, osteosklerotični mijelom, itd.

[0104] Za pregled takvih poremećaja, videti Fishman i sar., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia i Murphy i sar., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America).

[0105] Kako se ovde koristi, u nekim tehničkim rešenjima, "tretman" ili "lečenje" ili "tretirati" se odnosi na terapijski tretman gde je cilj da se uspori (smanji) neželjeno fiziološko stanje, poremećaj ili bolest, ili da se dobiju blagotvorni ili željeni klinički rezultati. Za svrhe koje su ovde opisane, blagotvorni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na ublažavanje simptoma; smanjenje obima stanja, poremećaja ili bolesti; stabilizacija (tj. ne pogoršanje) stanja, poremećaja ili bolesti; odlaganje početka ili usporavanje progresije stanja, poremećaja ili bolesti; poboljšanje stanja, poremećaja ili bolesnog stanja; i remisija (bilo delimična ili potpuna), bez obzira da li se može detektovati ili se ne može detektovati, ili povoćanje ili poboljšanje stanja, poremećaja ili bolesti. Tretman uključuje izazivanje klinički značajnog odgovora bez preteranog nivoa neželjenih efekata. Tretman takođe uključuje produženje preživljavanja u poređenju sa očekivanim preživljavanjem ako se ne leči. U drugim tehničkim rešenjima, "tretman" ili "lečenje" ili "tretirati" se odnosi na profilaktičke mere, gde je cilj da se odloži početak ili smanji ozbiljnost neželjenog fiziološkog stanja, poremećaja ili bolesti, kao što je, na primer, osoba koja je predisponiran za bolest (npr. pojedinac koji nosi genetski marker za bolest kao što je kancer dojke.

[0106] Trispecifični proteini koji ciljaju BCMA kao što je ovde opisano mogu se administrirati u kombinaciji sa sredstvom za lečenje određene bolesti, poremećaja ili stanja. Sredstva uključuju, ali nisu ograničena na terapije koje uključuju antitela, male molekule (npr., hemoterapeutike), hormone (steroidne, peptidne i slično), radioterapije (y-zrake, X-zrake, i/ili usmerenu isporuku radioizotopa, mikrotalasne peću, UV zračenje i slično), genske terapije (npr. antisens, retrovirusna terapija i slično) i druge imunoterapije. Trispecifični protein koji cilja anti-BCMA kao što je ovde opisano može se administrirati u kombinaciji sa sredstvima protiv dijareje, antiemetskim sredstvima, analgeticima, opioidima i/ili nesteroidnim antiinflamatornim sredstvima. Trispecifični protein koji cilja anti-BCMA koji je ovde opisan može biti administriran u kombinaciji sa sredstvom protiv kancera.

[0107] Neograničavajući primeri sredstava protiv kancera koji se mogu koristiti u različitim tehničkim rešenjima pronalaska, uključujući farmaceutske kompozicije i dozne oblike i komplete predmetnog obelodanjenja, uključuju: acivicin; aklarubicin; akodazol hidrohlorid; akronin; adozelesin; aldesleukin; altretamin; ambomicin; ametantron acetat; aminoglutetimid; amsacrine; anastrozol; antramicin; asparaginaza; asperlin; azacitidin; azetepa; azotomicin; batimastat; benzodepa; bikalutamid; bisantren hidrohlorid; bisnafid dimezilat; bizelesin; bleomicin sulfat; brekvinar natrijum; bropirimin; busulfan; cactinomicin; kalusteron; karacemid; carbetimer; karboplatin; karmustin; karubicin hidrohlorid; carzelesin; cedefingol; hlorambucil; cirolemicin; cisplatin; kladribin; krisnatol mezilat; ciklofosfamid; citarabin; dakarbazin; daktinomicin; daunorubicin hidrohlorid; decitabin; deksormaplatin; dezaguanin; dezaguanin mezilat; diazikuone; docetaksel; doksorubicin; doksorubicin hidrohlorid; drolokifene; drolokifene citrate; dromostanolon propionat; duazomicin; edatreksat; eflomitin hidrohlorid; elsamitrucin; enloplatin; enpromate; epipropidin; epirubicin hidrohlorid; erbulozol; esorubicin hidrohlorid; estramustin; estramustin fosfat natrijum; etanidazol; etopozid; etopozid fosfat; etoprin; fadrozol hidrohlorid; fazarabine; fenretinid; floksuridin; fludarabin fosfat; fluorouracil; flurocitabin; foskvidon; fostriecin natrijum; gemcitabin; gemcitabin hidrohlorid; hidroksiurea; idarubicin hidrohlorid; ifosfamid; ilmofosine; interleukin II (uključujući rekombinantni interleukin II, ili rIL2), interferon alfa-2a; interferon alfa-2b; interferon alfa-n1 interferon alfa-n3; interferon beta-I a; interferon gama-I b; iproplatin; irinotekan hidrohlorid; lanreotid acetat; letrozol; leuprolid acetat; liarozol hidrohlorid; lometreksol natrijum; lomustin; losoksantron hidrohlorid; masoprokol; maitansine; mehloretamin hidrohlorid; megestrol acetat; melengestrol acetat; melphalan; menogaril; merkaptopurin; metotreksat; metotreksat natrijum; metoprin; meturedepa; mitindomid; mitokarcin; mitokromin; mitogilin; mitomalcin; mitomicin; mitosper; mitotan; mitoksantron hidrohlorid; mikofenolna kiselina; nocodazole; nogalamicin; ormaplatin; okisuran; paklitaksel; pegaspargaza; peliomicin; pentamustin; peplomicin sulfat; perfosfamid; pipobroman; piposulfan; piroksantron hidrohlorid; plikamicin; plomestane; porfimer natrijum; porfiromicin; prednimustin; prokarbazin hidrohlorid; puromicin; puromicin hidrohlorid; pirazofurin; riboprin; rogletimid; safingol; safingol hidrohlorid; semustin; simtrazen; sparfosat natrijum; sparsomicin; spirogermanijum hidrohlorid; spiromustin; spiroplatin; streptonigrin; streptozocin; sulofenur; talisomicin; tekogalan natrijum; tegafur; teloksantron hidrohlorid; temoporfin; tenipozid; teroksiron; testolakton; tiamiprin; tioguanin; tiotepa; tiazofurin; tirapazamine; toremifen citrat; trestolon acetat; triciribin fosfat; trimetreksat; trimetreksat glukuronat; triptorelin; tubulozol hidrohlorid; uracil mustard; uredepa; vapreotid; verteporfin; vinblastin sulfat; vinkristin sulfat; vindesine; vindezin sulfat; vinepidin sulfat; vinglicinat sulfat; vinleurozin sulfat; vinorelbin tartarat; vinzolidin sulfat; vinzolidin sulfat; vorozol; zeniplatin; zinostatin; zorubicin hidrohlorid. Drugi primeri lekova protiv kancera uključuju, ali nisu ograničeni na: 20-epi-1,25 dihidroksivitamin D3; 5-etiniluracil; abirateron; aklarubicin; acilfulven; adecipenol; adozelesin; aldesleukin; ALL-TK antagoniste; altretamin; ambamustin; amidoks; amifostin; aminolevulinsku kiselinu; amrubicin; amsacrin; anagrelid; anastrozol; andrografolid; inhibitore angiogeneze; antagonist D; antagonist G; antareliks; anti-dorsalizirajući morfogenetski protein-1; antiandrogen karcinoma prostate; antiestrogen; antineoplaston; antisens oligonukleotide; afidikolin glicinat; modulatore gena apoptoze; regulatore apoptoze; apurinsku kiselinu; ara-CDP-DL-PTBA; arginin deaminazu; asulacrin; atamestan; atrimustin; aksinastatin 1; aksinastatin 2; aksinastatin 3; azasetron; azatoksin; azatirozin; derivate bakatina III; balanol; batimastat; BCR/ABL antagoniste; benzohlorine; benzoilstaurosporin; derivate beta laktama; beta-aletin; betaklamicin B; betulinsku kiselinu; bFGF inhibitor; bikalutamid; bisantren; bisaziridinilspermin; bisnafid; bistraten A; bizelesin; breflat; bropirimin; budotitan; butionin sulfoksimin; kalcipotriol; kalfostin C; derivate kamptotecina; kanarinske boginje IL-2; kapecitabin; karboksamid-amino-triazol; karboksiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inhibitor dobijen iz hrskavice; carzelesin; inhibitore kazein kinaze (ICOS); kastanospermin; cekropin V; cetroreliks; hlorine; hlorohinoksalin sulfonamid; cikaprost; cis-porfirin; kladribin; analoge klomifena; klotrimazol; kolimicin A; kolimicin B; kombretastatin A4; analog kombretastatina; konagenin; krambescidin 816; krisnatol; kriptoficin 8; derivate kriptoficina A; kuracin A; ciklopentantrakinone; cikloplatam; cipemicin; citarabin okfosfat; citolitički faktor; citostatin; dakliksimab; decitabin; dehidrodidemnin B; deslorelin; deksametazon; deksifosfamid; deksrazoksan; dekverapamil; diazikuen; didemnin B; didoks; dietilnorspermin; dihidro-5-azacitidin; dihidrotaksol, 9-; dioksamicin; difenil spiromustin; docetaksel; dokozanol; dolasetron; doksifluridin; droloksifen; dronabinol; duokarmicin SA; ebselen; ekomustin; edelfosin; edrekolomab; eflomitin; elemen; emitefur; epirubicin; epristerid; analog estramustina; agoniste estrogena; antagoniste estrogena; etanidazol; etopozid fosfat; eksemestan; fadrozol; fazarabin; fenretinid; filgrastim; finasterid; flavopiridol; flezelastin; fluasteron; fludarabin; fluorodaunorunicin hidrohlorid; forfenimeks; formestan; fostriecin; fotemustin; gadolinijum teksafirin; galijum nitrat; galocitabin; ganireliks; inhibitore želatinaze; gemcitabin; inhibitore glutationa; hepsulfam; heregulin; heksametilen bisacetamid; hipericin; ibandronsku kiselinu; idarubicin; idoksifen; idramanton; ilmofozin; ilomastat; imidazoakridon; imikvimod; peptide imunostimulansa; inhibitor receptora faktora rasta-I sličnog insulinu; agoniste interferona; interferone; interleukine; iobenguane; jododoksorubicin; ipomeanol, 4-; iroplakt; irsogladin; izobengazol; izohomohalikondrin B; itasetron; jasplakinolid; kahalalid F; lamelarin-N triacetat; lanreotid; leinamicin; lenograstim; lentinan sulfat; leptolstatin; letrozol; faktor inhibicije leukemije; leukocitni alfa interferon; leuprolid+estrogen+progesteron; leuprorelin; levamisol; liarozol; linearni analog poliamina; lipofilni disaharidni peptid; lipofilna jedinjenja platine; lisoklinamid 7; lobaplatin; lombricin; lometreksol; lonidamin; lozoksantron; inhibitor HMG-CoA reduktaze (kao što je, ali bez ograničenja lovastatin, pravastatin, fluvastatin, statin, simvastatin i atorvastatin); loksoribin; lurtotekan; lutecijum teksafirin; lizofilin; litičke peptide; maitansin; manostatin A; marimastat; masoprokol; maspin; inhibitore matrilizina; inhibitore matriks metaloproteinaze; menogaril; merbaron; meterelin; metioninaza; metoklopramid; MIF inhibitor; mifepriston; miltefosin; mirimostim; neusklađena dvolančana RNK; mitoguazon; mitolaktol; analoge mitomicina; mitonafid; mitotoksin faktor rasta fibroblasta-saporin; mitoksantron; mofaroten; molgramostim; monoklonsko antitelo, humani horionski gonadotropin; monofosforil lipid A+ćelijski zid miobakterije sk; mopidamol; inhibitor gena za višestruku rezistenciju na lekove; terapiju zasnovanu na višestrukom supresoru tumora 1; mustard antikancerogeno sredstvo; mikaperoksid B; ekstrakt mikobakterijskog ćelijskog zida; miriaporon; N-acetildinalin; N-supstituisane benzamide; nafarelin; nagrestip; nalokson+pentazocin; napavin; nafterpin; nartograstim; nedaplatin; nemorubicin; neridronsku kiselinu; neutralnu endopeptidazu; nilutamid; nisamicin; modulatore azotnog oksida; nitroksid antioksidans; nitrulin; O6-benzilgvanin; oktreotid; okicenon; oligonukleotide; onapriston; ondansetron; ondansetron; oracin; oralni induktor citokina; ormaplatin; osateron; oksaliplatin; oksaunomicin; paklitaksel; analoge paklitaksela; derivate paklitaksela; palauamin; palmitoilrizoksin; pamidronsku kiselinu; panaksitriol; panomifen; parabaktin; pazeliptin; pegaspargazu; peldesin; pentozan polisulfat natrijum; pentostatin; pentrozol; perflubron; perfosfamid; perilil alkohol; fenazinomicin; fenilacetat; inhibitore fosfataze; picibanil; pilokarpin hidrohlorid; pirarubicin; piritreksim; placetin A; placetin B; inhibitor aktivatora plazminogena; kompleks platine; jedinjenja platine; platinatriamin kompleks; porfimer natrijum; porfiromicin; prednizon; propil bis-akridon; prostaglandin J2; inhibitore proteasoma; imunomodulator na bazi proteina A; inhibitor protein kinaze C; inhibitore protein kinaze C, mikroalgal; inhibitore protein tirozin fosfataze; inhibitore purin nukleozid fosforilaze; purpurine; pirazoloakridin; piridoksilovani hemoglobin polioksietilen konjugat; raf antagoniste; raltitreksed; ramosetron; inhibitore ras farnezil protein transferazu; ras inhibitore; ras-GAP inhibitor; reteliptin demetiliran; renijum Re 186 etidronat; rizoksin; ribozime; RII retinamid; rogletimid; rohitukin; romurtid; rokvinimeks; rubiginon B1; ruboksil; safingol; saintopin; SarCNU; sarkofitol A; sargramostim; Sdi 1 mimetike; semustin; inhibitor 1 izveden iz starenja; sesne oligonukleotide; inhibitore transdukcije signala; modulatore za transdukciju signala; jednolančani protein koji se vezuje za antigen; sizofiran; sobuzoksan; natrijum borokaptat; natrijum fenilacetat; solverol; protein koji vezuje somatomedin; sonermin; sparfosičnu kiselinu; spikamicin D; spiromustin; splenopentin; spongistatin 1; skvalamin; inhibitor matičnih ćelija; inhibitori deobe matičnih ćelija; stipiamid; inhibitore stromelizina; sulfinozin; superaktivni vazoaktivni antagonist intestinalnog peptida; suradista; suramin; svainsonin; sintetičke glikozaminoglikane; talimustin; tamoksifen metiodid; tauromustin; tazaroten; tekogalan natrijum; tegafur; telurapirilijum; inhibitore telomeraze; temoporfin; temozolomid; tenipozid; tetrahlorodekaoksid; tetrazomin; taliblastin; tiokoralin; trombopoetin; trombopoetin mimetik; timalfasin; agonist receptora timopoetina; timotrinan; hormon koji stimuliše štitastu žlezdu; kalaj etil etiopurpurin; tirapazamin; titanocen bihlorid; topsentin; toremifen; totipotentni faktor matičnih ćelija; inhibitore translacije; tretinoin; triacetiluridin; triciribin; trimetreksat; triptorelin; tropisetron; turosterid; inhibitore tirozin kinaze; tirpostine; UBC inhibitore; ubenimeks; faktor inhibitora rasta koji potiče od urogenitalnog sinusa; antagoniste receptora urokinaze; vapreotid; variolin B; vektorski sistem, gensku terapiju eritrocita; velaresol; veramin; verdine; verteporfin; vinorelbin; vinksaltin; VITAXIN<®>; vorozol; zanoteron; zeniplatin; zilaskorb; i zinostatin stimalamer. Dodatni antikancerogeni lekovi su 5-fluorouracil i leukovorin. Ova dva sredstva su posebno korisna kada se primenjuju u postupcima koje koriste talidomid i inhibitor topoizomeraze. U nekim tehničkim rešenjima, trispecifični protein koji cilja anti-BCMA iz predmetnog obeodanjenja se primenjuje u kombinaciji sa gemcitabinom.

[0108] Takođe, trispecifični protein koji cilja anti-BCMA kao što je ovde opisano može da se administrira pre, tokom ili posle operacije.

[0109] Dalje, antikancerogeno sredstvo može se konjugovati na bilo koji pogodan način sa trispecifičnim proteinom.

Metode detekcije ekspresije BCMA i dijagnoze kancera koji su povezani sa BCMA

[0110] Iako nije eksplicitno navedeno, obezbeđeni su kompleti za detekciju ekspresije BCMA in vitro i/ili in vivo. Kompleti uključuju prethodne trispecifične proteine koji ciljaju BCMA (npr., trispecifični protein koji sadrži obeleženo jednodomensko antitelo anti-BCMA ili njegove fragmente koji se vezuju za antigen), i jedno ili više jedinjenja za detekciju obeležija. Obeležije može biti izabrano iz grupe koja se sastoji od fluorescentnog obeležija, enzimskog obeležija, radioaktivnog obeležija, aktivnog obeležija nuklearne magnetne rezonance, luminiscentnog obeležija i hromoforskog obeležija.

[0111] U nekim slučajevima, ekspresija BCMA se detektuje u biološkom uzorku. Uzorak može biti bilo koji uzorak, uključujući, ali ne ograničavajući se na tkivo sa biopsija, obdukcija i patoloških uzoraka. Biološki uzorci takođe uključuju delove tkiva, na primer, zamrznute delove uzeti za histološke svrhe. Biološki uzorci dalje uključuju telesne tečnosti, kao što su krv, serum, plazma, sputum, kičmena tečnost ili urin. Biološki uzorak se obično dobija od sisara, kao što je čovek ili primata koji nije čovek.

[0112] Uzorci koji se dobijaju za primenu u ovde opisanom testu uključuju tkiva i telesne tečnosti koji se mogu obraditi korišćenjem konvencionalnih sredstava u stanju tehnike (npr. homogenizacija, izolacija seruma, itd.). Shodno tome, uzorak dobijen od pacijenta se transformiše pre upotrebe u ovde opisanom testu. BCMA, ako je prisutan u uzorku, dalje se transformiše ovde opisanim postupcima na osnovu vezivanja za, na primer, antitelo.

[0113] U jednom tehničkom rešenju koje nije eksplicitno traženo, obezbeđen je metod za detekciju da li subjekat ima kancer kontaktom uzorka subjekta sa jednodomenskim antitelom anti-BCMA kao što je ovde obelodanjeno; i detektovanje vezivanja jednodomenskog antitela za uzorak. Povećanje vezivanja antitela za uzorak u poređenju sa vezivanjem antitela za kontrolni uzorak identifikuje kao da subjekat ima kancer.

[0114] Takođe je obezbeđen, ali nije zatražen, metod za potvrđivanje dijagnoze kancera kod subjekta kontaktom uzorka subjekta kome je dijagnostikovan kancer sa jednodomenskim antitelom anti-BCMA kao što je ovde obelodanjeno; i detektovanje vezivanja antitela za uzorak. Povećanje vezivanja antitela za uzorak u poređenju sa vezivanjem antitela za kontrolni uzorak potvrđuje dijagnozu kancera kod subjekta.

[0115] U nekim primerima obelodanjenih metoda, jednodomensko antitelo BCMA trispecifičnog proteina je direktno obeleženo.

[0116] U nekim primerima, metode dalje uključuju dovođenje u kontakt sa drugim antitelom koje specifično vezuje jednodomensko antitelo anti-BCMA sa uzorkom; i detektovanje vezivanja drugog antitela. Povećanje vezivanja drugog antitela za uzorak u poređenju sa vezivanjem drugog antitela za kontrolni uzorak detektuje kancer kod subjekta ili potvrđuje dijagnozu kancera kod subjekta.

[0117] U nekim slučajevima, kancer je leukemija, limfom, multipli mijelom ili bilo koji drugi tip kancera koji eksprimuje BCMA.

[0118] U nekim primerima, kontrolni uzorak je uzorak subjekta bez kancera. U posebnim primerima, uzorak je uzorak krvi ili tkiva.

[0119] U nekim slučajevima, antitelo koje vezuje (na primer, specifično vezuje) BCMA je direktno obeleženo oznakom koja se može detektovati. Antitelo koje vezuje (na primer, specifično vezuje) BCMA (prvo antitelo) može biti neobeleženo, dok je drugo antitelo ili drugi molekul koji može da veže antitelo koje specifično vezuje BCMA obeleženo. Drugo antitelo se bira tako da je u stanju da specifično veže specifičnu vrstu i klasu prvog antitela. Na primer, ako je prvo antitelo lama IgG, onda sekundarno antitelo može biti anti-lama-IgG. Ostali molekuli koji se mogu vezati za antitela uključuju, bez ograničenja, protein A i protein G, koji su oba komercijalno dostupni. Pogodna obeležija za antitelo ili sekundarno antitelo su gore opisana i uključuju različite enzime, prostetičke grupe, fluorescentne materijale, luminiscentne materijale, magnetna sredstva i radioaktivne materijale. Neograničavajući primeri pogodnih enzima uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, beta-galaktozidazu ili acetilholinesterazu. Neograničavajući primeri pogodnih kompleksa protetičke grupe uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin. Neograničavajući primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin. Neograničavajući primerni luminiscentni materijal je luminol; neograničavajući primer magnetnog sredstva je gadolinijum, a neograničavajući primeri radioaktivnih obeležija uključuju 125I, 1311, 35S ili 3H.

[0120] Alternativno, BCMA se može testirati u biološkom uzorku kompetitivnim imunološkim testom koji koristi BCMA standarde obeležene detektabilnom supstancom i neobeleženim antitelom koje specifično vezuje BCMA. U ovom testu, biološki uzorak, obeleženi BCMA standardi i antitelo koje specifično vezuju BCMA se kombinuju i određuje se količina obeleženog BCMA standarda vezanog za neobeleženo antitelo. Količina BCMA u biološkom uzorku je obrnuto proporcionalna količini obeleženog BCMA standarda vezanog za antitelo koje specifično vezuje BCMA.

[0121] Imunološki testovi i metod koji su ovde obelodanjeni mogu se primeniti u brojne svrhe. Antitelo koje specifično vezuje BCMA može se primeniti za detektovanje proizvodnje BCMA u ćelijama u ćelijskoj kulturi. Alternativno, antitelo se može primeniti za detekciju količine BCMA u biološkom uzorku, kao što je uzorak tkiva, ili uzorak krvi ili seruma. U nekim primerima, BCMA je BCMA ćelijska površina. U drugim primerima, BCMA je rastvorljiv BCMA (npr. BCMA u supernatantu ćelijske kulture ili rastvorljiv BCMA u uzorku telesne tečnosti, kao što je uzorak krvi ili seruma).

[0122] Takođe je obezbeđen, ali nije zahtevan, komplet za detekciju BCMA u biološkom uzorku, kao što je uzorak krvi ili uzorak tkiva. Na primer, da bi se potvrdila dijagnoza kancera kod subjekta, može se izvršiti biopsija da bi se dobio uzorak tkiva za histološki pregled. Alternativno, može se uzeti uzorak krvi da bi se detektovalo prisustvo rastvorljivog BCMA proteina ili fragmenta. Kompleti za detekciju polipeptida će tipično sadržati jedno domensko antitelo, u skladu sa ovim obelodanjenjem, koje specifično vezuje BCMA. Fragment antitela, kao što je scFv fragment, VH domen ili Fab može biti uključen u komplet. Antitelo može biti obeleženo (na primer, fluorescentnim, radioaktivnim ili enzimskim obeležijem).

[0123] Takav komplet može da sadrži instrukcijske materijale koji obelodanjuju načine primene antitela koje vezuje BCMA. Instrukcijiski materijali mogu biti napisani, u elektronskom obliku (kao što je računarska disketa ili kompakt disk) ili mogu biti vizuelni (kao što su video datoteke), ili obezbeđeni putem elektronske mreže, na primer, preko interneta, World Wide Web-a, intraneta ili druge mreže. Kompleti takođe mogu uključivati dodatne komponente da bi se olakšala određena primena za koju je komplet dizajniran. Tako, na primer, komplet može dodatno da sadrži sredstva za detekciju oznake (kao što su enzimski supstrati za enzimske oznake, setovi filtera za detekciju fluorescentnih oznaka, odgovarajuće sekundarne obeležija kao što je sekundarno antitelo, ili slično). Kompleti mogu dodatno uključivati pufere i druge reagense koji se rutinski koriste u praksi određenih metoda. Takvi kompleti i odgovarajući sadržaji su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti tehnike.

[0124] Takav dijagnostički komplet može da sadrži imunološki test. Iako detalji imunotestiranja mogu da variraju u zavisnosti od određenog formata koji se koristi, metoda detekcije BCMA u biološkom uzorku generalno uključuje korake dovođenja u kontakt biološkog uzorka sa antitelom koje specifično reaguje, pod imunološki reaktivnim uslovima, na BCMA polipeptid. Antitelu je dozvoljeno da se specifično veže pod imunološki reaktivnim uslovima kako bi se formirao imuni kompleks, a prisustvo imunog kompleksa (vezano antitelo) se detektuje direktno ili indirektno.

[0125] Metode detektovanja prisustva ili odsustva markera ćelijske površine su dobro poznate u stanju tehnike. Na primer, antitela se mogu konjugovati sa drugim jedinjenjima uključujući, ali bez ograničenja na, enzime, magnetne perle, koloidne magnetne perle, haptene, fluorohrome, metalna jedinjenja, radioaktivna jedinjenja ili lekove. Antitela se takođe mogu koristiti u imunotestovima kao što su, ali ne ograničavajući se na, radioimuno testovi (RIA), ELISA ili imunohistohemijski testovi. Antitela se takođe mogu koristiti za sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom (FACS). FACS koristi mnoštvo kanala u boji, kanala za detekciju niskog ugla i tupog rasipanja svetlosti i kanala impedansa, između ostalih sofisticiranijih nivoa detekcije, za razdvajanje ili sortiranje ćelija (videti SAD patent br. 5, 061,620). Bilo koje od jednodomenskih antitela koje vezuju BCMA, kao što je ovde obelodanjeno, može se koristiti u ovim testovima. Prema tome, antitela se mogu primeniti u konvencionalnom imunotestu, uključujući, bez ograničenja, ELISA, RIA, FACS, imunohistohemiju tkiva, Western blot ili imunoprecipitaciju.

PRIMERI

[0126] Sledeći primeri obezbeđuju ilustracije opštih tehnika obezbeđenih ovde, ali ne ograničavaju obim patentnih zahteva. Jedan trispecifični protein koji se vezuje za BCMA prema traženom pronalasku je u primerima označen identifikatorom "02B05". Drugi trispecifični proteini koji se vezuju za BCMA opisani u primerima, na koje se pozivaju drugi identifikatori, nisu deo pronalaska za koji se traži zaštita.

Primer 1

Proizvodnja proteina

[0127] Sekvence trispecifičnih molekula koje ciljaju BCMA, koje sadrže protein koji se vezuje za BCMA u skladu sa predmetnim obelodanjenjem, klonirane su u vektor ekspresije sisara pcDNK 3.4 (Invitrogen) kome je prethodila vodeća sekvenca i praćena 6x histidinskom oznakom (SEQ ID NO: 471). Expi293 ćelije (Life Technologies A14527) su održavane u suspenziji u bocama za optimalni rast (Thomson) između 0.2 to 8 × 1e6 ćelija/mL u Expi293 medijumu. Prečišćena plazmidna DNK je transfektovana u Expi293 ćelije u skladu sa protokolima sistema kompleta za ekspresiju Expi293 (Life Technologies, A14635), i održavana 4-6 dana nakon transfekcije. Količina primernih trispecifičnih proteina koja se testira, u kondicioniranom medijumu, iz transfektovanih Expi293 ćelija je kvantitifikovana korišćenjem Octet instrumenta sa vrhovima Protein A i korišćenjem kontrolnog trispecifičnog proteina za standardnu krivu.

Testovi ćelijske citotoksičnosti zavisne od T ćelija

[0128] Titracije kondicioniranog medijuma su dodate TDCC testovima (testovi ćelijske citotoksičnosti zavisne od T ćelija) da bi se procenilo da li je jednodomensko antitelo anti-BCMA sposobno da formira sinapsu između T ćelija i ćelijske linije koja eksprimuje BCMA i usmerava T ćelije da ubiju ćelijsku liniju koja eksprimuje BCMA. U ovom testu (Nazarian i sar., 2015. J. Biomol. Screen., 20:519-27), T ćelije i ciljane ćelije ćelijske linije kancera su pomešane zajedno u odnosu 10:1 u ploči sa 384 bunarčića, i dodavane su različite količine trispecifičnih proteina koji se testiraju. Tumorske ćelijske linije su konstruisane da eksprimuju protein luciferaze. Posle 48 sati, korišćen je STEADY-GLO<®>Luminescentni test (Promega) da se kvantifikuju preostale vijabilne tumorske ćelije.

[0129] U ovom primeru su korišćene EJM ćelije, što je ćelijska linija koja služi kao in vitro model za multipli mijelom i leukemiju plazma ćelija. Vijabilnost EJM ćelija se meri nakon 48 sati. Videlo se da su trispecifični proteini posredovali ubijanju T ćelija. Sl. 2 prikazuje primer testa ćelijske vijabilnosti sa test proteinima 01H08, 01F07, 02F02 i BH253 u poređenju sa negativnom kontrolom. EC50za TDCC aktivnost nekoliko drugih test trispecifičnih proteina je naveden ispod u Tabeli 1.

Afinitet vezivanja

[0130] U trenutnoj studiji, određen je afinitet vezivanja za humani BCMA protein trispecifičnih proteina koji ciljaju BCMA koji sadrže protein koji se vezuje za BCMA u skladu sa predmetnim obelodanjenjem. Izmereni afiniteti su navedeni u Tabeli 1.

Tabela 1: Afinitet vezivanja i TDCC aktivnost nekoliko trispecifičnih proteina koji ciljaju

BCMA.

ND: Nije utvrđeno.

[0131] Molekuli 01H08, 01F07, 01H06, 02G02, 02B05, 01C01, 02F02, 02E05, 01E08, 02C01, 02E06, 02B06, 02F04, 01G08, 02C06, 01H09, 01F04, 01D02, 02D11, 01A07, 02C03, 02F07, 01E04, 02H09, 01E03, 02F05, 01B05, 01C05, 02F12, 01H11, 02G06, 01E06, 01G11, 02A05, 01A08, 02G05, 01B09, 01G01, 01B06, 01F10, 01E05, 02G01, 01A06, 02B04, 01D06, 02B07, 02B11, 01H04, 01D03, 01A05, 02F11, 01D04, 01B04, 02C05, 02E03, 01D05, 01C04, 01E07, 01G06, 02F06, 01B01, 01D07, 02A08, 01A02, 02G11, 01G04, 02F03, 01C06, 01A01 imaju najmanje dva puta povećanje TDCC potencije i takođe pokazuju povećanje afinitet u poređenju sa molekulom sa roditeljskim CDR-ovima, 253BH10.

[0132] Molekuli 01H08, 01F07, 01H06, 02G02, 02B05, 01C01, 02F02, 02E05, 01E08, 02C01, 02E06, 02B06, 02F04, 01G08, 02C06, 01H09, 01F04, 01D02, 02D11, 01A07, 02C03, 02F07, 01E04, 02H09, 01E03, 02F05, 01B05, 01C05, 02F12, 01H11, 02G06, 01E06, 01G11, 02A05, 01A08, 02G05, 01B09 imaju najmanje desetostruko povećanje TDCC potencije i takođe pokazuju povećani afinitet u poređenju sa molekulom sa roditeljskim CDR-ovima, 253BH10.

[0133] Anti-GFP trispecifični molekul, uključen u ove testove kao negativna kontrola, nije imao detektabilno vezivanje BCMA i nije imao uticaj na vijabilnost ćelija u TDCC testu (podaci nisu prikazani).

Primer 2

Metode za procenu vezivanja i citotoksičnih aktivnosti primernih trispecifičnih proteina koji ciljaju BCMA u skladu sa predmetnim obelodanjenjem protiv ćelija Jeko1, MOLP8 i OPM2

Proizvodnja proteina

[0134] Sekvence trispecifičnih molekula koje ciljaju BCMA, koje sadrže protein koji se vezuje za BCMA u skladu sa predmetnim obelodanjenjem, kojoj prethodi vodeća sekvenca i praćena 6x histidinskom oznakom (SEQ ID NO: 471), eksprimovane su primenom vektora i postupaka koji su prethodno opisani (Running Deer and Allison, 2004. Biotechnol Prog.20:880-9) osim reagensa na bazi lipida i nelinearizovane plazmidne DNK korišćeni su za transfekciju ćelija. Rekombinantni trispecifični proteini su prečišćeni primenom afinitetne hromatografije, jonske razmene i/ili hromatografije isključivanja veličine. Prečišćeni protein je kvantifikovan primenom teoretskih koeficijenata ekstinkcije i apsorpcione spektroskopije. Slika Coomassie obojenja SDS-PAGE pokazuje čistoću proteina (Sl.3).

Testovi citotoksičnosti

[0135] Testiranje ćelijske citotoksičnosti zavisne od T-ćelija (TDCC) kod ljudi je korišćeno za merenje sposobnosti učesnika T ćelija, uključujući trispecifične molekule, da usmere T ćelije da ubiju ćelije tumora (Nazarian i sar., 2015. J. Biomol. Screen., 20:519-27). U ovom testu, T ćelije i ćelije ciljane ćelijske linije kancera se mešaju zajedno u odnosu 10:1 u ploči sa 384 bunarčića i dodaju se različite količine trispecifičnih proteina koji se testiraju. Linije tumorskih ćelija su projektovane da eksprimuju protein luciferaze. Posle 48 sati, da se kvantifikuju preostale vitalne tumorske ćelije, korišćen je Steady-Glo<®>luminescentni test (Promega).

[0136] U trenutnoj studiji, titracije prečišćenog proteina su dodate TDCC testovima (testovi ćelijske citotoksičnosti zavisne od T ćelija) da bi se procenilo da li je jednodomensko antitelo anti-BCMA sposobno da formira sinapsu između T ćelija i Jeko1 koji eksprimuju Jeko1, MOLP8 i OPM2 ćelijske linije kancera. Jeko1 je ćelijska linija B ćelijskog limfoma. MOLP-8 je ćelijska linija mijeloma. OPM-2 je ćelijska linija humanog mijeloma.

[0137] Vijabilnost ćelija je merena nakon 48 sati. Videlo se da su trispecifični proteini posredovali ubijanju T ćelija. Sl.4 prikazuje primer testa vijabilnosti ćelije sa testom proteina u poređenju sa negativnom kontrolom. EC50za TDCC aktivnost nekoliko drugih test trispecifičnih proteina je naveden ispod u Tabeli 2. Anti-GFP trispecifični molekul, uključen u ove testove kao negativna kontrola, nije imao uticaja na vijabilnost ćelije (podaci nisu prikazani).

Tabela 2: TDCC EC50vrednosti za 3 ćelijske linije za odabrane trispecifične proteine koji ciljaju BCMA u TriTAC formatu (anti-ciljni (BCMA):anti-albumin:anti-CD3 vezujući domeni).

Afinitet vezivanja

[0138] U trenutnoj studiji, određen je afinitet vezivanja za humani BCMA protein trispecifičnih proteina koji ciljaju BCMA koji sadrže protein koji se vezuje za BCMA u skladu sa predmetnim obelodanjenjem.

Tabela 3: Afinitet vezivanja prečišćenih ciljanih trispecifičnih proteina koji sadrže BCMA vezujući protein u skladu sa predmetnim obelodanjenjem

[0139] Podaci na Sl. 3, Sl. 4, u Tabeli 2 i Table 3 pokazuju da trispecifični proteini koji ciljaju BCMA mogu biti eksprimovani i prečišćeni do čistoće veće od 90%. Prečišćeni proteini pokazuju oko 13 puta do 213 puta snažniju TDCC aktivnost u poređenju sa trispecifičnim proteinom sa roditeljskom BCMA ciljanom sekvencom. Prečišćeni trispecifični proteini se vezuju za BCMA sa afinitetom od oko 3 do 7nM.

Primer 3

Model tumora ksenografta

[0140] Primer trispecifičnog proteina koji cilja BCMA je procenjen u modelu ksenografta.

[0141] Na dan 0, NCG miševi su subkutano inokulisani sa RPMI-8226 ćelijama, i takođe intraperitonealno implantirani sa normalnim mononuklearnim ćelijama ljudske periferne krvi (PBMC). Tretman sa primerom trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA (SEQ ID NO: 520) je takođe započet dana 0 (qdx10) (jednom dnevno tokom 10 dana). Doza za administraciju je bila 5 µg/kg, 50 µg/kg, ili 500 µg/kg trispecifičnog proteina 02B05 koji cilja BCMA, ili kontrolnog vehikuluma. Zapremine tumora određivane su tokom 25 dana. Kao što je prikazano na Sl. 30, srednja zapremina tumora bila je značajno niža kod miševa tretiranih primerom trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA (pri 50 µg/kg, ili 500 µg/kg), u poređenju sa miševima tretiranim vehikulumom ili nižom dozom trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA (pri 5 µg/kg).

[0142] Na dan 0, NCG miševi su subkutano inokulisani sa Jeko 1 ćelijama, i takođe intraperitonealno implantirani sa normalnim mononuklearnim ćelijama ljudske periferne krvi (PBMC). Tretman sa primerom trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA (02B05) (SEQ ID NO: 520) je započet dana 3 (qdx10) (jednom dnevno tokom 10 dana). Doza za administraciju je bila 5 µg/kg, 50 µg/kg, ili 500 µg/kg trispecifičnog proteina 02B05 koji cilja BCMA, ili kontrolnog vehikuluma. Zapremine tumora određivane su tokom 25 dana. Kao što je prikazano na Sl. 31, srednja zapremina tumora bila je značajno niža kod miševa tretiranih primerom trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA (pri 500 µg/kg), u poređenju sa miševima tretiranim vehikulumom ili nižom dozom trispecifičnog proteina (02B05) koji cilja BCMA (pri 5 µg/kg ili 50 µg/kg).

Primer 4

Protokol kliničkog ispitivanja dokaza o konceptu za administriranje trispecifičnog proteina koji se vezuje za antigen BCMA iz ovog obelodanjenja za pacijente sa multiplim mijelomom

[0143] Ovo je faza I/II kliničkih studija za proučavanje trispecifičnog proteina koji se vezuje za antigen BCMA iz Primera 1 za lečenje multiplog mijeloma.

Rezultati studija:

[0144]

Primarno: Maksimalna tolerisana doza trispecifičnih proteina koji ciljaju BCMA iz prethodnih primera

Sekondarno: Da bi se utvrdilo da li su in vitro odgovori trispecifičnih proteina koji ciljaju BCMA iz prethodnih primera povezani sa kliničkim odgovorom

Faza I

[0145] Maksimalna tolerantna doza (MTD) biće određena u delu faze I studije.

[0146] 1.1 Maksimalna tolerantna doza (MTD) biće određena u delu faze I studije.

[0147] 1.2 Pacijenti koji ispunjavaju kriterijume podobnosti biće uključeni u studiju za BCMA ciljane trispecifične proteine iz prethodnih primera.

[0148] 1.3 Cilj je da se identifikuje najveća doza trispecifičnih proteina koji ciljaju BCMA iz prethodnih primera koja se može bezbedno administrirati bez ozbiljnih ili nekontrolisanih neželjenih dejstava kod učesnika. Doza koja se daje zavisiće od broja učesnika koji su prethodno bili uključeni u studiju i koliko se doza dobro podnosila. Neće svi učesnici dobiti istu dozu.

Faza II

[0149] 2.1 Sledeći odeljak faze II će biti tretiran u MTD sa ciljem da se utvrdi da li terapija sa trispecifičnim proteinima koji ciljaju BCMA iz prethodnih primera rezultira u stopi odgovora od najmanje 20%.

[0150] Primarni rezultat za fazu II --- Da bi se utvrdilo da li terapija trispecifičnim proteinima koji ciljaju BCMA iz prethodnih primera dovodi do toga da najmanje 20% pacijenata postigne klinički odgovor (blast odgovor, manji odgovor, delimični odgovor, ili potpuni odgovor)

Podobnost

[0151] Kriterijumi podobnosti za uključivanje u studije su sledeći:

Prethodno nelečeni pacijenti sa multiplim mijelomom i bez ozbiljnih ili neposrednih komplikacija (npr. predstojeći patološki prelom, hiperkalcemija, bubrežna insuficijencija). Svi asimptomatski pacijenti sa malom ili srednjom masom tumora će se kvalifikovati.

[0152] Pacijenti sa velikom masom tumora, simptomatskim ili predstojećim prelomima, hiperkalcemijom (korigovani kalcijum >11.5 mg%), anemijom (Hgb <8.5 gm/dl), zatajenjem bubrega (kreatinin >2.0 mg/dl), visokom serumskom laktat dehidrogenazom (>300 U/L) ili leukemija plazma ćelija (>1000/ul) nisu prihvatljivi.

[0153] Otvorene infekcije ili neobjašnjiva groznica treba da se povuku pre lečenja. Potrebna je adekvatna funkcija jetre (uključujući SGPT, bilirubin i LDH).

[0154] Pacijenti moraju imati Zubrod učinak od 1 ili manje.

[0155] Pacijenti moraju dati pismeni informisani pristanak koji pokazuje da su svesni istraživačke prirode ove studije.

[0156] Očekivani životni vek bi trebalo da prelazi 1 godinu.

[0157] Pacijenti sa idiopatskom monoklonskom gamopatijom i nesekretornim multiplim mijelomom nisu podobni. Pacijenti čija je jedina prethodna terapija bila lokalna radioterapija, alfa-IFN, ili ATRA are eligible. su kvalifikovani. Pacijenti koji su prethodno bili izloženi visokim dozama glukokortikoida ili alkilirajućih sredstva nisu kvalifikovani.

Primer 5

Merenja afiniteta za humani i cinomolgus BCMA, CD3ε, i albumin, primenom primernog trispecifičnog proteina koji cilja BCMA ovog obelodanjenja

[0158] Cilj ove studije je bio da se proceni afinitet primernog trispecifičnog proteina koji cilja BCMA ovog obelodanjenja (02B05) (SEQ ID NO: 520), prema humanom BCMA, cinomolgus BCMA, humanom CD3ε, cinomolgus CD3ε, humanom albuminu, albuminu cinomolgusa i mišijim albuminom. Afiniteti su mereni pomoću oktet instrumenta. Za ova merenja, vrhovi streptavidina su prvo napunjeni sa 2,5 nM humanog BCMA-Fc, 2,5 nM cinomolgus BCMA-Fc, 2,5 nM humanog CD3ε-Fc, 2,5 nM cinomolgus CD3ε-Fc, 50 nM humanog serumskog albumina (HSA), 50 nM cinomolgus serumskog albumina, ili 50 nM mišijeg seruma albumina. Nakon toga, primerni trispecifični protein 02B05 koji cilja BCMA je inkubiran sa vrhovima, a nakon perioda asocijacije, vrhovi su premešteni u puferski rastvor da bi se omogućilo da se primerni trispecifični protein (02B05) koji cilja BCMA odvojio. Afiniteti za vezivanje za humani i cinomolgus BCMA i CD3ε mereni su u prisustvu 15 mg/ml humanog serumskog albumina. Prosečne izračunate KDvrednosti iz ovih studija date su u Tabeli 4 (n označava broj nezavisnih merenja, n/d označava da nije otkriveno vezivanje u testiranim uslovima). Detektovano je vezivanje za humani BCMA, humani CD3ε, ciynomolgus CD3ε, humani serum albumina, cinomolgus serum albumina, i mišiji serum albumina. U testiranim uslovima, nije otkriveno vezivanje za cinomolgus BCMA.

Tabela 4. Izmerene KDvrednosti za primernog trispecifičnog proteina 02B05 koji cilja BCMA na proteinske ligande.

Primer 6

Sposobnost vezivanja humanih T ćelija primernog trispecifičnog proteina koji cilja BCMA ovog obelodanjenja

[0159] Primerni trispecifični protein koji cilja BCMA 02B05 (SEQ ID NO: 520) je testiran na njegovu sposobnost da se veže za prečišćene T ćelije. Ukratko, BCMA trispecifični protein ili fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom (PBS) su inkubirani sa prečišćenim T ćelijama od 4 različita anonimna humana donora. Nakon ispiranja nevezanog proteina, T ćelije su zatim inkubirane sa Alexa Fluor 647 konjugovanim antitelom koje prepoznaje anti-albuminski domen u trispecifičnom proteinu 02B05 koji se vezuje za antigen BCMA. T ćelije su zatim analizirane protočnom citometrijom. Primećeno je da su humane T ćelije inkubirane sa trispecifičnim proteinom 02B05 koji se vezuje za antigen BCMA imale značajne promene povezane sa Alexa Fluor 647 bojenjem u poređenju sa ćelijama koje su inkubirane sa PBS. Rezultati su prikazani na Sl. 5A, 5B, 5C, i 5D. U zaključku, ova studija je pokazala da je primer trispecifičnog proteina koji cilja BCMA bio u stanju da veže ljudske T ćelije.

Primer 7

Sposobnost primernog trispecifičnog proteina koji cilja BCMA ovog obelodanjenja da veže ćelije koje eksprimuju BCMA

[0160] Primerni trispecifični protein koji cilja BCMA 02B05 (SEQ ID NO: 520) je testiran na njegovu sposobnost da se veže za ćelije koje eksprimuju BCMA. Ukratko trispecifični protein 02B05 koji se vezuje za antigen BCMA je inkubiran sa ćelijskim linijama koje eksprimuju BCMA (NCI-H929; EJM; RPMI-8226; OPM2) ili bez BCMA (NCI-H510A; DMS-153). Ekspresija BCMA RNK u ovim ćelijama je naznačena vrednostima FPKM (fragmenata po milionu kilobaze) navedenim na Sl.6A-F: vrednosti RNA FPKM su iz Enciklopedije ćelijske linije kancera (Broad Institute, Cambridge, MA USA). Nakon ispiranja nevezanog proteina, ćelije su zatim inkubirane sa Alexa Fluor 647 konjugovanim antitelom koje prepoznaje domen anti-albumina u trispecifičnom proteinu 02B05 koji se vezuje za antigen BCMA. Ćelije su zatim analizirane protočnom citometrijom. Kao negativna kontrola, ćelije su inkubirane sa trispecifičnim proteinom koji cilja na GFP. Ćelije koje eksprimuju BCMA RNK i inkubirane sa BCMA trispecifičnim proteinom imale su značajne promene povezane sa bojenjem Alexa Fluor 647 u poređenju sa ćelijama koje su inkubirane sa GFP trispecifičnim proteinom (kao na Sl.6A, 6B, 6D, i 6E). Dok su ćelije koje nemaju BCMA RNK proizvele ekvivalentno Alexa Fluor 647 bojenje sa BCMA trispecifičnim proteinom i GFP trispecifičnim proteinom (kao što se vidi na Sl.6C, i 6F). Dakle, ova studija je pokazala da je primer trispecifičnog proteina koji vezuje antigen BCMA bio u stanju da se selektivno veže za ćelije koje eksprimuju BCMA.

Primer 8

Sposobnost primernog trispecifičnog proteina koji cilja BCMA da posreduje u ubijanju T ćelija ćelija kancera koje eksprimuje BCMA

[0161] Primerni trispecifični protein BCMA 02B05 (SEQ ID NO: 520) je testiran na njegovu sposobnost da usmeri T ćelije da ubijaju ćelije koje eksprimuju BCMA u prisustvu i odsustvu humanog serumskog albumina (HSA) primenom standardnog TDCC testa kao što je opisano u Primeru 1. Zbog toga što primerni BCMA trispecifični protein sadrži anti-albuminski domen, ovaj eksperiment je izveden da bi se potvrdilo da vezivanje za albumin ne bi sprečilo trispecifični protein koji se vezuje za antigen BCMA da usmeri T ćelije da ubiju ćelije koje eksprimuju BCMA. Testirano je pet ćelijskih linija koje eksprimuju BCMA: EJM, Jeko, OPM2, MOLP8, i NCI-H929. Reprezentativni podaci za eksperiment sa EJM ćelijama prikazani su na Sl.7. Primećeno je da se vijabilnost EJM ćelija smanjuje sa povećanjem količine primernog 02B05 Sa svih pet ćelijskih linija, primer u prisustvu ili odsustvu humanog seruma albumina (HSA), dok kontrolni GFP koji cilja na trispecifični protein nije uticao na vijabilnost ćelije. U prisustvu albumina, bile su potrebne veće koncentracije BCMA trispecifičnog proteina da bi se smanjila vijabilnost EJM ćelija. EC50vrednosti za ubijanje ćelija pomoću BCMA trispecifičnog proteina za EJM ćelije kao i ćelije Jeko, OPM2, MOL8, i NCI-H929 u odsustvu ili prisustvu HSA date su u Tabeli 5. Sa svih pet ćelijskih linija, primer 02B05 trispecifičnog proteina koji se vezuje za antigen BCMA usmeravao je T ćelije da ubijaju ciljne ćelije u prisustvu HSA.

Tabela 5 TDCC EC50vrednosti za primerni trispecifični protein koji cilja BCMA u prisustvu ili odsustvu humanog seruma albumina sa pet različitih ćelijskih linija koje eksprimuju BCMA

Primer 9

Sposobnost primernog trispecifičnog proteina koji cilja BCMA da posreduje u ubijanju T ćelija ćelije kancera koje eksprimuju BCMA, primenom manjeg odnosa ciljane ćelije i efektorske ćelije

[0162] U standardnom TDCC testu (kao što je opisano u Primeru 1), odnos 1 ciljane ćelija (EJM ćelija ili OPM2 ćelija) na 10 efektorskih ćelija (T ćelija) se koristi u testu od 48 sati. U ovom eksperimentu, testirana je sposobnost primera trispecifičnog proteina BCMA 02B05 (SEQ ID NO: 520) da usmeri T ćelije da ubiju ciljane ćelije sa manjim odnosom ciljane ćelije prema efektoru. Očekivalo se da će se manje ubijanja primetiti kada se koristi manje efektorskih ćelija. Testirane su dve ćelijske linije koje eksprimuju BCMA, EJM i OPM2, primenom odnosa ciljane i efektorske ćelije od 1:1, 1:3 i 1:10, a eksperiment je izveden u prisustvu 15 mg/ml HSA. Kao negativna kontrola korišćen je GFP koji cilja na trispecifični protein. Podaci iz ovog eksperimenta prikazani su na Sl. 8 (TDCC test sa EJM ćelijama) i Sl. 9 (TDCC test sa OPM2 ćelijama). Kao što se očekivalo, primećeno je skoro potpuno ubijanje ciljanih ćelija sa odnosom ciljane i efektorske ćelije od 1:10. Količina ubijanja je smanjena sa smanjenjem efektorskih ćelija. EC50vrednosti za ubijanje ćelija sa svakim odnosom su navedene u Tabeli 6 (n/d označava da je uočeno nedovoljno ubijanje da bi se izračunala vrednost EC50). EC50vrednosti su porasle kada je bilo prisutno manje efektorskih ćelija. Stoga, kao što se očekivalo, smanjenje broja efektorskih ćelija do ciljnih ćelija smanjilo je TDCC aktivnost BCMA trispecifičnog proteina.

Tabela 6 TDCC EC50vrednosti za primernog trispecifičnog proteina koji cilja BCMA (02B05) sa različitim odnosom ciljane ćelije (EJM ćelije) i efektorske ćelije (T ćelije) (testirano u prisustvu 15 mg/ml HSA)

Primer 10

Sposobnost primernog trispecifičnog proteina koji cilja BCMA da posreduje u ubijanju T ćelija ćelije kancera koje eksprimuju BCMA, u studiji vremenskog toka, primenom manjeg odnosa ciljane ćelije i efektorske ćelije

[0163] U standardnom TDCC testu (Primer 1), odnos 1 ciljana ćelija na 10 efektorskih ćelija (T ćelija) se koristi u testu od 48 sati. U ovom eksperimentu, vremenski tok je izveden primenom odnosa ciljanih ćelija (EJM ćelije) od 1 prema 1 prema efektorskim ćelijama (T ćelije). Očekivalo se da će sa produženim vremenom, odnos 1 prema 1 dovesti do ubijanja ciljanih ćelija. Eksperiment je izveden u prisustvu 15 mg/ml HSA. Kao negativna kontrola korišćen je trispecifični protein koji cilja GFP. Vijabilnost ciljane ćelije je merena 1, 2, 3 i 4 dana nakon inkubacije ciljanih ćelija i efektorskih ćelija, u odnosu 1:1, u prisustvu primera 02B05 trispecifičnog proteina koji se vezuje za antigen BCMA i 15 mg/ml HSA ili trispecifičnog proteina koji cilja GFP i 15 mg/ml HSA. Iako nije primećeno ubijanje ciljanih ćelija prvog dana, ubijanje je primećeno u svim drugim vremenskim tačkama u prisustvu trispecifičnog proteina koji se vezuje za antigen BCMA, pri čemu se količina ubijanja povećava sa vremenom (Sl.10). Ubijanje sa nije primećeno kod trispecifičnog proteina koji cilja GFP. Vrednosti EC50izračunate za ubijanje ćelija svakog dana date su u Tabeli 7 (n/d označava nedovoljno ubijanje da bi se odredila vrednost EC50). Iz ove studije je zaključeno da je primerni 02B05 BCMA trispecifični protein bio u stanju da usmeri ubijanje T ćelija sa manjim brojem efektorskih ćelija, ali je bilo potrebno više vremena da se postigne potpunije ubijanje.

Tabela 7 TDCC EC50vrednosti za primerni trispecifični protein koji cilja BCMA (02B05) sa odnosom ciljane ćelije (EJM ćelije) i efektorske ćelije (T ćelije) 1 prema 1 (testirano u prisustvu 15 mg/ml HSA), u različito vreme

Primer 11

Sposobnost primernog trispecifičnog proteina koji cilja BCMA da usmeri humane T ćelije da ubiju ćelije koje eksprimuju BCMA

[0164] Primerni BCMA trispecifični protein 02B05 (SEQ ID NO: 520) je testiran na njegovu sposobnost da usmeri T ćelije od četiri različita anonimna humana donora da ubiju četiri različite ćelije koje eksprimuju BCMA u prisustvu 15 mg/ml humanog seruma albumina (HSA) primenom standardnog TDCC testa kao što je opisano u Primeru 1. Ćelijske linije koje eksprimuju BCMA su EJM, NCI-H929, OPM2, i RPMI8226. Kao negativne kontrole, dve ćelijske linije koje nemaju ekpresiju BCMA, OVCAR8 i NCI-H510A, takođe su testirane u TDCC testovima. Kontrolni trispecfični protein koji cilja GFP je takođe korišćen kao negativna kontrola. Sa četiri ćelijske linije koje eksprimuju BCMA i sva četiri donatora T ćelija, vijabilnost ćelija se smanjivala sa povećanjem količine BCMA trispecifičnog proteina, ali ne i sa GFP trispecifičnim proteinom (Sl.

11, 12, 13, i 14). Vrednosti EC50za ubijanje ćelija date su u Tabeli 8. Primerni 02B05 trispecifični protein koji se vezuje za antigen BCMA nije direktno ubijao ćelijske linije kojima nedostaje ekspresija BCMA (Sl.15 i 16). Dakle, zaključeno je da je primerni 02B05 trispecifični protein koji se vezuje za antigen BCMA bio u stanju da usmeri T ćelije od više donatora da ubiju spektar ćelijskih linija koje eksprimuju BCMA.

Tabela 8 EC50vrednosti primernog BCMA trispecifičnog proteina 02B05 iz TDCC testova sa četiri ćelijske linije koje eksprimuju BCMA i četiri donora T ćelija u prisustvu 15 mg/ml HSA

Primer 12

Sposobnost primernog trispecifičnog proteina koji cilja BCMA da usmeri cinomolgus T ćelije da ubiju ćelije koje eksprimuju BCMA

[0165] Primerni BCMA trispecifični protein 02B05 (SEQ ID NO: 520) je testiran na njegovu sposobnost da usmeri T ćelije od majmuna cinomolgus da ubiju ćelije koje eksprimuju BCMA u prisustvu 15 mg/ml humanog seruma albumina (HSA). Eksperimentalni uslovi su bili isti kao što je opisano u Primeru 1 osim što su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) cinomolgus majmuna korišćene kao izvor T ćelija. Testirane su dve ćelijske linije koje eksprimuju BCMA, RPMI8226 i NCI-H929. Kao što je prikazano na Sl.17 i 18, BCMA trispecifični protein je bio u stanju da usmeri T ćelije prisutne u cinomolgus PBMC da ubiju dve ćelijske linije koje eksprimuju BCMA. EC50vrednosti za ubijanje ćelija su navedene u Tabeli 9. GFP trispecifični protein nije uticao na vijabilnost ćelija koje eksprimuju BCMA. Thus, trispecifični protein koji eksprimuje BCMA, koji može da veže cinomolgus CD3ε (kao što je prikazano u Primeru 5), može usmeriti cinomolgus T ćelije da ubiju ćelije koje eksprimuju humani BCMA.

Tabela 9 EC50vrednosti primernog BCMA trispecifičnog proteina iz TDCC testova sa dve ćelijske linije i two cinomolgusi PMBC donora u prisustvu 15 mg/ml HSA

Primer 13

Primerni trispecifični protein koji se vezuje za antigen BCMA i indukcija aktivacije T ćelija posredovane ciljanim ćelijama tumora

[0166] Primerni trispecifični protein koji cilja BCMA 02B05 (SEQ ID NO: 520) je testiran na njegovu sposobnost da aktivira T ćelije u prisustvu ćelija koje ekprimuju BCMA. Ćelijske linije koje eksprimuju BCMA su EJM, OPM2, i RPMI8226. Kao negativne kontrole, uključene su i dve ćelijske linije koje nemaju ekspresiju BCMA, OVCAR8 i NCI-H510A. T ćelije su dobijene od četiri različita anonimna humana donora. Testovi su postavljeni korišćenjem uslova standardnog TDCC testa kao što je opisano u Primeru 1 osim što je test prilagođen formatu sa 96 bunarčića i test je izveden u prisustvu 15 mg/ml HSA. Posle 48-časovnog testa, aktivacija T ćelija je procenjena korišćenjem protočne citometrije za merenje ekspresije biomarkera aktivacije T ćelija CD25 i CD69 na površini T ćelija. Sa povećanjem koncentracija primernog 02B05 trispecifičnog proteina koji se vezuje za antigen BCMA primećena je povećana ekspresija CD69 i CD25 na T ćelijama kada su zajedno kultivisane sa ćelijama koje eksprimuju BCMA (kao što je prikazano na Sl. 19-24). Dakle, uočena povećana ekspresija zavisila je od interakcije BCMA vezujuće sekvence unutar primernog 02B05 trispecifičnog proteina koji se vezuje za antigen BCMA, pošto je primećeno malo ili nimalo aktivacije kod kontrolnog GFP trispecifičnog proteina (kao što je prikazano na slikama Sl.19-24) ili sa ciljanim ćelijama bez ekspresije BCMA (kao što je prikazano na Sl.25-28). Zbog toga je primerni 02B05 trispecifični protein koji se vezuje za antigen BCMA aktivirao T ćelije u ko-kulturama koje sadrže ćelije koje eksprimuju BCMA. Ovaj zaključak potkrepljuju dodatni podaci. Na primer, ekspresija citokina, TNFα, merena je u medijumu sakupljenom iz ko-kulture T ćelija i ciljanih ćelija koje eksprimuju BCMA tretirane povećanjem koncentracija primernog 02B05 trispecifičnog proteina koji se vezuje za antigen BCMA ili sa negativnom kontrolom GFP trispecifičnog proteina. Ko-kulture su postavljene korišćenjem uslova standardnog TDCC testa (kao što je opisano u Primeru 1) sa dodatkom 15 mg/ml HSA. TNFα je meren korišćenjem elektrohemiluminiscentnog testa (Meso Scale Discovery). Robusna indukcija ekspresije TNFα je primećena sa 02B05 primernim trispecifičnim proteinom koji cilja BCMA, a ne sa GFP trispecifičnim proteinom (Sl.29). Ovaj rezultat dalje potvrđuje da je 02B05 primerni trispecifični protein koji cilja BCMA aktivirao T ćelije u ko-kulturama koje sadrže ćelije koje ekprimuju BCMA.

Primer 14

Farmakokinetika primernog trispecifičnog proteina koji cilja BCMA iz ovog obelodanjenja

[0167] Cinomolgus majmunima su administrirane pojedinačne intravenske doze primernog trispecifičnog proteina koji cilja BCMA (02B05) (SEQ ID NO: 520), pri 0.01 mg/kg, 0.1 mg/kg, ili 1 mg/kg. Dve životinje su uključene po grupi doziranja. Nakon administracije, uzorci seruma su sakupljeni i analizirani pomoću dva različita elektrohemiluminiscentna testa. Jedan test je koristio biotinilovani CD3ε kao reagens za hvatanje i detektovan sa sulfo označenim BCMA (nazvan funkcionalnim testom). Drugi test je korišćen kao reagens za hvatanje biotinilovanog antitela koje prepoznaje domen anti-albumina u primernom trispecifičnom proteinu koji cilja BCMA i korišćen kao reagens za detekciju sulfo obeleženog antitela koje prepoznaje domen za vezivanje anti-CD3 u primernom trispecifičnom proteinu koji cilja BCMA (tj., anti-idiotipskom antitelu). Rezultati elektrohemiluminiscentnih testova su ucrtani na Sl.32. Kao što se vidi na Sl.

32, primerni trispecifični protein koji cilja BCMA je detektovan u uzorcima seruma cinomolgusa, čak i nakon 504 sata nakon administracije. Primerni trispecifični protein koji cilja BCMA identifikovan je korišćenjem i sulfo-označenog BCMA (linije označene terminom "funktionalno" na Sl.32) i anti-idiotipskim antitelom (linije označene terminom "anti-idiotip" na Sl.32).

[0168] Da bi se potvrdilo da je primerni trispecifični protein koji cilja BCMA zadržao sposobnost da usmeri T ćelije da ubiju EJM ćelije koje eksprimuju BCMA, nakon in vivo administracije, uzorci seruma iz vremenske tačke od 168 sati su testirani u TDCC testu (kao što je opisano u Primeru 1) u prisustvu 16.7% seruma od cinomolgus majmuna koji nije bio izložen trispecifičnom proteinu koji cilja BCMA, titriranjem primernog trispecifičnog proteina koji cilja BCMA primenom koncentracija proteina koje su utvrđene korišćenjem elektrohemiluminiscentnih testova (prikazano na Sl. 33). Sveže razblaženi primerni 02B05 BCMA trispecifični protein je upoređen sa BCMA trispecifičnim proteinom sakupljenim od test majmuna cinomolgus u 168 h.

GFP trispecifični protein je uključen kao negativna kontrola. Ova studija je pokazala da je primerni trispecifični protein koji cilja BCMA sakupljen iz seruma testiranog cinomolgus majmuna imao identičnu aktivnost kao sveže razblažen protein, i da je protein u uzorcima seruma zadržao sposobnost da usmerava T ćelije da ubiju ciljane ćelije koje eksprimuju BCMA.

Tabela sekvenci

Claims (7)

Patentni zahtevi

1. Trispecifični protein koji se vezuje za sredstvo za sazrevanje B ćelija (BCMA) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 520.

2. Trispecifični protein koji se vezuje za BCMA prema patentnom zahtevu 1, za primenu za lečenje karcinoma B ćelijske linije.

3. Trispecifični protein koji se vezuje za BCMA za primenu prema patentnom zahtevu 2, pri čemu kancer B ćelijske linije sadrži multipli mijelom, leukemiju, limfom, ili njihove metastaze.

4. Polinukleotid koji kodira trispecifični protein koji se vezuje za BCMA prema patentnom zahtevu 1.

5. Vektor koji sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 4.

6. Ćelija domaćina koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 5.

7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži

1) trispecifični protein koji se vezuje za BCMA prema patentnom zahtevu 1, vektor prema patentnom zahtevu 5, ili ćeliju domaćina prema patentnom zahtevu 6; i

2) farmaceutski prihvatljiv nosač.