RS66008B1 - Monoklonska antitela protiv c-met - Google Patents

Monoklonska antitela protiv c-met

Info

Publication number
RS66008B1
RS66008B1 RS20241085A RSP20241085A RS66008B1 RS 66008 B1 RS66008 B1 RS 66008B1 RS 20241085 A RS20241085 A RS 20241085A RS P20241085 A RSP20241085 A RS P20241085A RS 66008 B1 RS66008 B1 RS 66008B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
ser
gly
antibody
thr
ala
Prior art date
Application number
RS20241085A
Other languages
English (en)
Inventor
Joost J Neijssen
Goeij Bart De
Den Brink Edward Van
Aran F Labrijn
Rene M A Hoet
Janine Schuurman
Paul Parren
De Winkel Jan Van
Original Assignee
Genmab As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genmab As filed Critical Genmab As
Publication of RS66008B1 publication Critical patent/RS66008B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncogenic proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
OPIS PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na monoklonska antitela usmerena na humani c-Met, receptor faktora rasta hepatocita, i na upotrebe antitela, posebno na njihovu upotrebu u lečenju kancera.
STANJE TEHNIKE
[0002] c-Met je receptor tirozin kinazni protein koji prolazi kroz membranu. Primarni jednolančani prekursor je posttranslaciono cepa da se proizvede zero oblik heterodimera c-Met koji se sastoji iz vanćelijskog α-lanca (50 kDa) i dužeg transmembranskog β-lanca (145 kDa), koji su vezani disulfidnom vezom (Birchmeier et al. 2003. Nat Rev Mol Cell Biol 4:915). Vanćelijski deo c-Met se sastoji iz tipa domena. N-terminalni SEMA domen formira se od cele α-podjedinice i dela β-podjedinice, i obuhvata homologiju sa proteinima semaforina. Nakon SEMA domena sledi domen bogat cisteinom i dalje četiri domena slična imunoglobulinu-(Ig). Citoplazmatski deo sadrži domen jukstamembranske kinaze i karboksi-terminalni rep koji je neophodan za nishodnu signalizaciju. Jedini poznati ligand visokog afiniteta za c-Met, faktor rasta hepatocita (HGF), uglavnom se eksprimira fibroblastima u normalnim uslovima (Li and Tseng 1995. J Cell Physiol 163:61) i ćelijama tumora (Ferracini et al.1995.). Oncogene 10:739). HGF (takođe nazvan “scatter” faktor: SF) se sintetiše kao prekursor koji se proteolitički pretvara u aktivni α/β heterodimer. Na osnovu kristalne strukture fragmenta koji vezuje receptor, smatra se da HGF vezuje c-Met kao dimer (Chirgadze et al.1999. Nat Struct Biol 6:72). HGF-a lanac se vezuje sa visokim afinitetom za domen sličan Ig u c-Met, dok se lanac HGF-β vezuje sa niskim afinitetom za c-Met SEMA domen (Basilico et al.2008. J Biol Chem 283:21267). Poslednja interakcija je odgovorna za c-Met dimerizaciju i aktivaciju receptorske tirozin kinaze nakon vezivanja aktivnog HGF heterodimera. Autofosforilacija receptora rezultira jedinstvenim mestom spajanja za regrutovanje efektora, od kojih je Gab1 (faktor rasta vezan za protein 2 [Grb2]-vezani vezivni 1) vezivanje ključno za glavne c-Met nishodne signalne puteve (Comoglio et al.2008 Nat Rev Drug Discov 7:504):
● Ras-ERK1/2 put: proliferacija.
● Ras-Rac put: invazija, kretanje, epitelno-mezenhimalni prelaz.
● PI3K-Akt put: preživljavanje.
[0003] c-Met je eksprimovan na površini epitelijelnih i endotelnih ćelija mogih organa tokom embriogeneze i u odraslom dobu, uključujući jetru, pankreas, prostatu, bubreg, mišić, i kostnu srž. c-Met aktivacija igra esencijalnu ulogu u takozvanom programu "invazivnog rasta" koji se sastoji iz serije procesa, uključujući proliferaciju, kretanje, angiogenezu i zaštitu od apoptoze (Boccaccio and Comoglio 2006. Nat Rev Cancer 6:637). Ovi c-Met-regulisani procesi pojavljuju se pod normalnim fiziološkim uslovima tokom embrionalnog razvoja, saniranja povreda jetre i srca, i patološki tokom onkogeneze (Eder et al.2009. Clin Cancer Res 15:2207).
[0004] Neodgovarajuća c-Met signalizacija se javlja u gotovo svim vrstama solidnih tumora, kao što su tumori bešike, dojke, grlića materice, kolorektalni, želudca, glave i vrata, jetre, pluća, jajnika, pankreasa, prostate, bubrega, i kancera tiroidee, kao i u različitim sarkomima, hematopojetsim malignitetima, i melanomu (Birchmeier et al.2003. Nat Rev Mol Cell Biol 4:915; Comoglio et al.2008. Nat Rev Drug Discov 7:504; Peruzzi and Bottaro 2006. Clin Cancer Res 12:3657). Osnovni mehanizmi tumorigenosti c-Met se obično postižu na tri različita načina:
• autokrinim HGF/c-Met petljama,
• prekomernom ekspresijom c-Met ili HGF,
• mutacijama koje aktiviraju kinazu u kodirajućoj sekvenci receptora c-Met.
[0005] Najznačajnije, aktivirajuće c-Met mutacije su identifikovane kod pacijenata sa papilarnim kancerom bubrežnih ćelija (Schmidt et al. 1997. Nat Genet 16:68). Konstitutivna aktivacija c-Met doprinosi jednoj ili više kombinacija proliferativih, invazivnih, preživelih, ili angiogenih tipova kancera. Gensko utišavanje endogeno eksprimiranog c-Met u tumorskim ćelijama je pokazano da dovodi do odsustva proliferacije i tumorskog rasta i regresiju uspostavljenih metastaza, kao i smanjeno stvaranje novih metastaza (Corso et al.2008. Oncogene 27:684).
[0006] Kao c-Met ima doprinos u višestrukim stadijumima razvoja kancera, od inicijacije do progresije do metastaze, c-Met i njegovi ligandi HGF su postali vodeći kandidati za ciljane terapije protiv kancera (Comoglio et al.2008. Nat Rev Drug Discov 7:504; Knudsen and Vande Woude 2008. Curr Opin Genet Dev 18:87). Istražuje se nekoliko strategija za postizanje ovog cilja:
• Receptori mamci (eng. decoy): podregioni HGF ili c-Met ili molekularnih analoga mogu delovati antagonistički kao stehiometrijski kompetitori blokiranjem vezivanja liganda ili dimerizacijom receptora. Jedan primer takvog antagonističkog podregiona HGF je NK4 (Kringle Pharma).
• Mali molekuli tirozin kinazni inhibitori (TKIs): Tri c-Met-specifična TKI-a u različitim stadijumima kliničke procene su ARQ197 (ArQule), JNJ 38877605 (Johnson & Johnson) i PF-04217903 (Pfizer).
• Anti-HGF monoklonska antitela, kao što su AMG102, rilotumumab (Amgen), HuL2G7 (Takeda), i AV-299 (Schering).
• Anti-c-Met monoklonska antitela su opisana u WO2005016382, WO2006015371, WO2007090807, WO2007126799 WO2009007427, WO2009142738 i van der Horst et al. (van der Horst et al. 2009. Neoplasoa 11:355). MetMAt (Genentech) je humanizovano monovalentno (jednakokrako) OA-5D5 antitelo koje se vezuje za vanćelijski domen c-Met, time sprečavajući vezivanje HGF i naknadnu aktivaciju receptora (Jin et al.2008. Cancer Res 68:4360). U modelima ksenotranspantata miša, pronađeno je da tretman sa MetMAt inhibira rast tumora izazvanog HGF-om ortotopski glioblastom i subkutanozni tumori pankreasa (Jin et al. 2008. Cancer Res 68:4360; Martens et al. 2006. Clin Cancer Res 12:6144). h224G11 (Pierre Fabre) (Corvaia and Boute 2009. Abstract 835 AACR 100th Annual Meeting) je humanizovano bivalentno anti-c-Met IgG1 antitelo. Anti-tumorski efekti ovog antitela su uočeni kod miševa (Goetsch et al. 2009. Abstract 2792 AACR 100th Annual Meeting). CE-355621 (Pfizer) je humani IgG2 koji blokira vezivanje liganda vezivanjem za vanćelijski domen c-Met I inhibira rast zavisan od HGF u modelima ksenotranspantata tumora (Tseng et al.2008. J Nucl Med 49:129). WO2009111691 prikazuje bispecifično antitelo protiv c-Met i EGFR.
[0007] U zaključku, ispituje se nekoliko proizvoda anti-c-Met, ali do sada nijedan anti-c-Met proizvod nije dobio odobrenje za terapijsku upotrebu. Ostaje potreba za efikasnim i bezbednim proizvodima za lečenje ozbiljnih bolesti povezanih sa c-Met, kao što je kancer.
SUŠTINA PRONALASKA
[0008] Cilj predmetnog pronalaska je da se obezbede nova i visoko specifična i efikasna bispecifična anti-c-Met antitela za medicinsku upotrebu pri čemu bispecifična antitela imaju drugo antigen vezujuće mesto specifično za receptor epidermalnog faktora rasta. Bispecifična antitela iz pronalaska ispoljavaju karakteristike vezivanja c-Met koje se razlikuju od antitela opisanih u oblasti tehnike. Bispecifična antitela iz pronalaska imaju visoki afinitet prema humanom c-Met, antagonistička su i imaju povoljan farmakokinetički profil za upotrebu na humanim pacijentima. Prema tome, u glavnom aspektu pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo koji sadrži prvo mesto za vezivanje antigena iz anti-c-Met antitela i drugo mesto za vezivanje antigena specifično za receptor epidermalnog faktora rasta, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO: 98, 99 i 100 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO: 102, 103 i 104. Pronalazak se dalje odnosi na sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju teške i lake lance antitela. U daljem aspektu pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo iz pronalaska. Pronalazak se takođe odnosi na antitelo iz pronalaska za upotrebu kao lek koji se može koristiti u lečenju kancera.
KRATAK OPIS SLIKA
[0009]
Slika 1: Poravnanje sekvenci varijabilnog regina teškog lanca HuMabs. Na osnovu ovih sekvenci, može se definisati konsenzusna sekvenca za neke od sekvenci CDR. Ove konsenzusne sekvence su prikazane u Tabeli 4.
Slika 2: Poravnanje sekvenci varijabilnog regina lakog lanca HuMabs. Na osnovu ovih sekvenci, može se definisati konsenzusna sekvenca za neke od sekvenci CDR. Ove konsenzusne sekvence su prikazane u Tabeli 4.
Slika 3: Krive vezivanja monovalentnih i bivalentnih oblika anti-c-Met antitela za A431 ćelije koje eksprimuju c-Met. Prikazani podaci su MFI jednog reprezetativnog eksperimenta. Zbog toga što IgG1-024 i Uni-068 nisu pokazali zasićeno vezivanje za A431 ćelije nije bilo moguće izračunati tačnu vrednost EC50.
Slika 4: Vezivanje antitela za c-Met eksprimovan na epitelnim ćelijama Rezus majmuna. Prikazani podaci su MFI jednog eksperimenta.
Slika 5: Anti-c-Met antitelom indukovana inhibicija vezivanja HGF za vanćelijski domen c-Met receptora. Prikazani podaci su jedan reprezentativni eksperiment.
Slika 6: Krive vezivanja HGF različitih anti-c-Met antitela za vezivanje sa cMetSEMA_567His8 testiranog sa TR-FRET. Prikazani podaci su srednja vrednost MFI ± standardna devijacija tri nezavisna eksperimenta.
Slika 7: Procenat inibicije vijabilnih KP4 ćelija nakon tretmana anti-c-Met antitelom u poređenju sa netretiranim ćelijama (0%). Prikazani podaci su procenat inhibicije vijabilnih ćelija dva nezavisna eksperimenta ± standardna devijacija. IgG1-1016-022 je bio pozitivan u samo jednom eksperimentu.
Slika 8: Efikasnost anti-c-Met antitela da inhibiraju tumorski rast u modelu KP4 ksenotranspantata u SCID miševima. Miševi su tretirani sa 400 µg antitela u danu 9 praćeno nedeljno sa dozom održavanja od 200 µg. Prikazane su srednje vrednosti veličine tumora po grupi tretmana.
Slika 9: Efikasnost anti-c-Met antitela da inhibira tumorski rast u modelu KP4 ksenotranspantata kod SCID miševa. Miševi su tretirani sa 400 µg antitela u danu 9 praćeno nedeljno sa dozom održavanja od 200 µg. Efekat tretmana na pojavu tumora u vremenu. Prikazan je procenat miševa bez tumora (veličine tumora <500 mm<3>). Nastanak tumora je odložen kod miševa koji su tretirani antagonističkim antitelima u poređenju sa kontrolnim antitelima.
Slika 10: Efikasnost anti-c-Met antitela da inhibiraju tumorski rast u modelu MKN45 ksenotranspantata u SCID miševima. Miševi su tretirani sa 40 mg/kg antitela u danu 7 i 20 mg/kg antitela u danima 14, 21 i 28. Srednje veličine tumora do 50% miševa dostigne su krajnju tačku od 700 mm<3>, po grupi koja je primila tretman kao što je prikazano.
Slika 11: Efikasnost anti-c-Met antitela da inhibiraju tumorski rast u modelu MKN45 ksenotranspantata u SCID miševima. Miševi su tretirani sa 40 mg/kg antitela u danu 7 i 20 mg/kg antitela u danima 14, 21 i 28. Procenat miševa sa veličinama tumora manjim od 700 mm<3>je prikazan u Kaplan Meier grafikonu. Obrazovanje tumora je odloženo kod miševa koji su tretirani sa anti-c-Met antitelima u poređenju sa izotopskom kontrolom antitela.
Slika 12: KP4 test vijabilnosti da bi se odredio efekat fleksibilnosti antitela na agonističku aktivnost. Format IgA2m(1) nije indukovao proliferaciju, suprotno sa formatima IgA1 i IgG1 istog antitela. Varijante 5D5 anti-c-Met antitela (videti US6468529 i Primer 2) su korišćeni u ovom eksperimentu.
Slika 13: Neredukujuća SDS-PAGE analiza fleksibilnosti mutanata (069). Nisu uočeni aberantni multimeri ili proizvodi degradacije dok je uparivanje lakih lanaca bilo vidljivo kao traka od 50 kD ((LC)2) u C220S, ΔC220 i IgG1-zglob IgG3 mutantima.
Slika 14: Antigen vezujuća ELISA test za merenje vezivanja c-Met mutanata u zglobu c-Met antitela. Svi mutant se vezuju sa uporedivim afinitetom za c-Met kao što je prikazano u ELISA.
Slika 15: Fosforilacija c-Met kao očitavanje agonističke aktivnosti antitela protiv c-Met. Slika 15 prikazuje rezultate Vestern blota za lizate A549; membrane obojene antitelima protiv fosforilovanog c-met, ukupnog c-Met ili β-aktina.
Slika 16: Test proliferacije sa NCI-H441 ćelijama. Ćelijska masa je određena nakon 7 dana inkubacije u prisustvu antitela ili kontrola i prikazana na grafiku kao procenat netretiranih uzoraka (postavljeno kao 100%).
Slika 17: Test vijabilnosti KP4. Efekat antitela protiv c-Met na sveukupnu vijabilnost KP4 ćelija je ispitan. Sposobnost IgG1-1016-069 da smanje vijabilnost KP4 je zadržana i/ili unapređena uvođenjem mutacija koje smanjuju fleksibilnost antitela.
Slika 18: Smanjena modulacija kao što je mereno ukupnim nivoima c-Met u lizatima A549 korišćenjem ELISA. Sve varijante antitela (069) zadržale su kapacitet smanjene modulacije.
Slika 19: ADCC test za poređenje visokih i niskih verzija fukoze antitela IgG1-1016-069.
Slika 20: Odsustvo vezivanja c-Met antitela za ćelije u punoj krvi u FACS testu vezivanja. Rezultati su prikazani za B ćelije; monocite i granulocite.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Definicije
[0010] Termin "c-Met", kada se ovde koristi, odnosi se na receptor faktora rasta hepatocita (Genbank pristupni broj NM 000245) i obuhvata bilo koje varijante, izooblike i homologe vrsta humanog c-Met koji su prirodno eksprimovani od ćelija ili su eksprimovani na ćelijama koje su transfekovane genom c-Met.
[0011] Termin "imunoglobulin" se odnosi na klasu strukturalno bliskih glikoproteina koji se sastoje iz dva para polipeptidnih lanaca, jednog para lakih lanaca (L) niske molekulske težine i jednog para teških lanaca (H), sva četiri međusobno vezana disulfidnim vezama. Struktura imunoglobulina je dobro okarakterisana. Videti na primer Fundamental Immunology Ch.7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Ukratko, svaki težak lanaca se obično sastoji iz varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno VHili VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca obično se sastoji iz tri domena, CH1, CH2, i CH3. Svaki lanac obično se sastoji iz varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno kao VLili VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca obično se sastoji iz jednog domena, CL. Regioni VHi VLse mogu dalje podeliti u regione hipervarijabilnosti (ili hipervarijabilne regione koji mogu biti hipervarijabilni u sekvenci i/ili obliku struktruralno definisanih petlji), takođe nazvani regioni koji određuju komplementarnost (CDRs), rasuti među regionima koji su konzervisaniji, nazvani regionima okvira (FRs). Svaki VHi VLse obično sastoji iz tri CDRs i četiri FRs, koji su uređeni od amino-kraja prema karboksi-kraju u sledećem redu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (videti takođe Chothia i Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)). Obično, numeracija aminokiselinskih ostataka u ovom regionu se izvodi postupkom koji se opisuje u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) (izrazi kako što su obeležavanje ostatka u varijabilnom domenu kao u Kabat ili prema Kabat ovde se odnosi na ovaj sistem obeležavanja za varijabilne domene teškog lanca ili varijabilne domene lakog lanca). Korišćenjem ovog sistema obeležavanja, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca peptida može sadržati nekoliko ili dodatne aminokiseline koje odgovaraju skraćenju, ili inserciji u, FR ili CDR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može uključiti umetanje pojedinačne aminokiseline (ostatak 52a prema Kabat) nakon ostatka 52 VHCDR2 i umetnutih ostataka (na primer ostaci 82a, 82b, i 82c, itd. prema Kabat) nakon FR ostatka 82 u teškom lancu. Obeležavanje ostataka po Kabat-u može se odrediti za dato antitelo poravnanjem u regionima homologije sekvence antitela sa "standardnim" sekvencom obeleženom po Kabat-u.
[0012] Termin "antitelo" (At) u kontekstu predmetnog pronalaska se odnosi na molekul imunoglobulina, fragment molekula imunoglobulina, ili derivat bilo kojeg od njih, koji ima sposobnost da se specifičnog veže za antigen pod uobičajenim fiziološkim uslovima sa polu životom značajnih vremenskih perioda, kao što je bar oko 30 minuta, bar oko 45 minuta, bar oko jednog sata, bar oko dva sata, bar oko četiri sata, bar oko 8 sati, bar oko 12 sati, oko 24 sata ili više, oko 48 sati ili više, oko 3, 4, 5, 6, 7 ili više dana, itd., ili bilo koji drugi relevantni funkcionalno definisani period (kao što je vreme koje je dovoljno da se indukuje, promoviše, pojača, i/ili modulira fiziološki odgovor povezan sa vezivanjem antitela za antigen i/ili vreme dovoljno antitelu za regrutovanje efektorske akivnosti). Varijabilni regioni teških i lakih lanaca molekula imunoglobulina sadrže vezujuće domene koji interaguju sa antigenom. Konstantni regioni antitela (At-a) mogu posredovati vezivanju imunoglobulina za tkiva domaćina ili faktore, uključujući različite ćelije imunog sistema (kao što su efektorske ćelije) i komponente sistema komplementa kao što je C1q, prva komponenta u klasičnom putu aktivacije komplementa. Anti-c-Met antitelo može takođe biti bispecifično antitelo, diatelo, ili sličan molekul (videti na primer PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993) za opis diatela). Zaista, bispecifična antitela, diatela, i slično, koja su ovde obezbeđena mogu se vezati za bilo koji pogodan cilj pored dela c-Met. Kao što je gore opisano, bispecifično antitelo iz pronalaska vezuje c-Met i EGFR. Kao što je gore ozačeno, ovde navedeni termin antitelo, osim ako nije drugačije naznačeno ili je jasno u suprotnosti sa kontekstom, obuhvata fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen. Pokazano je da funkcija vezivanja antigena antitela može da se izvede fragmentima pune dužine antitela. Primeri vezujućih fragmenata koji su obuhvaćeni terminom "antitelo" uključuju (i) Fab’ ili Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji iz VL, VH, CLi CH1 domena, ili monovalentno antitelo kao što je opisano u WO2007059782 (Genmab); (ii) F(ab’)2fragmenata, bivalentnih fragmenata koji sadrže dva Fab fragmenta spojena disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragmenta koji se u suštini sastoji iz VHi CH1 domena; (iv) Fv fragmenta koji se u suštini sastoji iz VLi VHdomena pojedinačnog kraka antitela, (v) dAb fragmenta (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), koji se u suštini sastoji iz VHdomena i takođe se nazivaju domenska antitela (Holt et al; Trends Biotechnol.2003 Nov;21(11):484-90); (vi) kamilja ili nanotela (Revets et al; Expert Opin Biol Ther.2005 Jan;5(1):111-24) i (vii) i izolovani regioni za određivanje komplementarnosti (CDR). Dalje, iako dva domena fragmenta Fv, VLi VH, se kodiraju odvojenim genima, oni se mogu spojiti, korišćenjem rekombinantnih postupaka, sintetičkim linkerom koji im omogućava da se dobiju kao jedan proteinski lanac u kome su parovi VLi VHregiona da se obrazuju monovalentni molekuli (poznati kao jednolančana antitela ili jednolančani Fv (scFv), videti na primer Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) i Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Takva jednolančana antitela su obuhvaćena izrazom antitelo osim ukoliko nije drugačije naznačeno ili jasno definisano kontekstom. Iako su takvi fragmenti generalno uključeni u značenju antitela, oni su kolektivno i svaki zasebno jedinstvene karakteristike predmetnog pronalaska, ispoljavaju različite biološke osobine i korisnost. Ovi i drugi korisni fragmenti antitela u kontekstu predmetnog pronalaska su ovde dalje razmatrani. Takođe treba razumeti da termin antitelo, osim ukoliko nije drugačije naznačeno, takođe obuhvata poliklonalna antitela, monoklonska antitela (mAt-a), polipeptide slične antitelima, kao što su himerna antitela i humanizovana antitela, i fragmenti antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen (antigen vezujući fragmenti) obezbeđeni bilo kojom poznatom tehnikom, kao što je enzimsko cepanje, sinteza peptida, i rekombinantne tehnike. Antitelo dobijeno na taj način može imati bilo koji izotip.
[0013] Kao što se ovde koristi, "izotip" se odnosi na imunoglobulinsku klasu (na primer IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ili IgM) koja je kodirana genima za konstantni region teškog lanca.
[0014] Termin "monovalentno antitelo" označava u kontekstu predmetnog pronalaska da je molekul antitela sposoban da se veže za pojedinačni molekul antigena, i stoga nije u stanju da unakrsno veže antigen.
[0015] "Antitelo sa nedostatkom efektorske funkcije" ili "antitelo sa nedostatkom efektorske funkcije" odnosi se na antitelo koje ima značajno smanjenu ili nikakvu sposobnost da aktivira jedan ili više efektorskih mehanizama, kao što je aktivacija komplementa ili vezivanje Fc receptora. Dakle, antitela sa nedostatkom efektorske funkcije imaju značajno smanjenu ili nikakvu sposobnost da posreduju u ćelijski posredovanoj citotoksičnosti (ADCC) i/ili citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC). Primer takvog antitela je IgG4.
[0016] "anti-c-Met antitelo" je antitelo kao što je gore opisano, koje se specifično vezuje za antigen c-Met.
[0017] Termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, treba da obuhvati antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz sekvenci humanog imunoglobulina germinativne linije. Humana antitela prema pronalasku mogu da obuhvataju aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama humanog imunoglobulina germinativne linije (npr. mutacije uvedene slučajnom ili specifičnom za mesto mutageneze in vitro ili somatskom mutacijom in vivo). Međutim, termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, nije namenjen da uključi antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativne linije druge vrste sisara, kao što je miš, kalemljene na sekvence ljudskog okvira.
[0018] Kako se ovde koristi, humano antitelo je "izvedeno iz" određene sekvence germinativne linije ako je antitelo dobijeno iz sistema koji koristi sekvence humanog imunoglobulina, na primer imunizacijom transgenog miša koji nosi gene humanog imunoglobulina ili skriningom biblioteke gena humanog imunoglobulina, i pri čemu je izabrano humano antitelo najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, na primer najmanje 96%, kao što je najmanje 97%, na primer najmanje 98%, ili kao što je najmanje 99% identično u aminokiselinama sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koju kodira gen imunoglobulina germinativne linije. Tipično, van CDR3 teškog lanca, humano antitelo izvedeno iz određene sekvence humane germinativne linije neće pokazati više od 20 razlika aminokiselina, npr. ne više od 10 razlika aminokiselina, kao što je ne više od 9, 8, 7, 6 ili 5, na primer ne više od 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinsku razliku u odnosu na aminokiselinsku sekvencu koju kodira gen imunoglobulina germinativne linije.
[0019] U poželjnom izvođenju, antitelo pronalaska je izolovano. „Izolovano antitelo“, kako se ovde koristi, ima za cilj da se odnosi na antitelo koje je u suštini bez drugih antitela koja imaju različite antigene specifičnosti (na primer, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za c-Met je u suštini bez antitela koja specifično vezuju antigene osim c-Met). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop, izooblik ili varijantu humanog c-Met može, međutim, imati unakrsnu reaktivnost na druge srodne antigene, na primer iz drugih vrsta (kao što su homolozi c-Met vrsta). Štaviše, izolovano antitelo može biti u suštini bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.
[0020] Kada se ovde koristi u kontekstu dva ili više antitela, termin "u kompeticiji sa" ili "unakrsno u kompeticiji" označava da se dva ili više antitela takmiče za vezivanje za c-Met, npr. u kompeticiji za c-Met vezivanje u testu opisanom u Primerima ovde. Za neke parove antitela, konkurencija u testu Primera se primećuje samo kada je jedno antitelo obloženo na ploči, a drugo se koristi za kompeticijiu, a ne obrnuto. Termin "u kompeticiji sa" kada se ovde koristi takođe ima za cilj da pokrije takve kombinacije antitela.
[0021] Termin "epitop" označava proteinsku determinantu sposobnu da se specifično veže za antitelo. Epitopi se obično sastoje od površinskih grupa molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i nekoformacioni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje za prvi, ali ne i za drugi, gubi u prisustvu denaturirajućih rastvarača. Epitop može sadržati aminokiselinske ostatke koji su direktno uključeni u vezivanje (koji se takođe naziva imunodominantna komponenta epitopa) i druge aminokiselinske ostatke, koji nisu direktno uključeni u vezivanje, kao što su aminokiselinski ostaci koji su efikasno blokirani specifičnim vezivanjem antigena peptid (drugim rečima, aminokiselinski ostatak je unutar otiska peptida koji se specifično vezuje za antigen).
[0022] Izrazi "monoklonsko antitelo" kako se ovde koriste odnose se na pripremu molekula antitela sa jednom molekularnom kompozicijom. Kompozicija monoklonskog antitela pokazuje jedinstvenu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop. Shodno tome, termin "humano monoklonsko antitelo" se odnosi na antitela koja pokazuju jednu specifičnost vezivanja koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz sekvenci humanog imunoglobulina zametne linije. Humana monoklonska antitela mogu da se generišu pomoću hibridoma koji uključuje B ćeliju dobijenu od transgene ili transhromozomske nehumane životinje, kao što je transgeni miš, koji ima genom koji sadrži transgen humanog teškog lanca i transgen lakog lanca, fuzionisan za besmrtnu ćeliju.
[0023] Kako se ovde koristi, termin "vezivanje" u kontekstu vezivanja antitela za unapred određeni antigen tipično je vezivanje sa afinitetom koji odgovara KDod oko 10<-7>M ili manje, kao što je oko 10<-8>M ili manje, kao što je oko 10<-9>M ili manje, oko 10<-10>M ili manje, ili oko 10<-11>M ili čak manje kada se odredi na primer tehnologijom površinske plazmonske rezonance (SPR) u BIAcore 3000 instrumentu koji koristi antigen kao ligand i antitelo kao analit, i vezuje se za unapred određeni antigen sa afinitetom koji odgovara KDkoji je najmanje deset puta niži, kao što je najmanje 100 puta niži, na primer najmanje 1000 puta niži, kao što je na najmanje 10,000 puta niže, na primer najmanje 100,000 puta niže od njegovog afiniteta za vezivanje za nespecifičan antigen (npr. BSA, kazein) koji nije unapred određen antigen ili blisko srodni antigen. Količina sa kojom je afinitet manji zavisi od KDantitela, tako da kada je KDantitela veoma nizak (to jest, antitelo je visoko specifično), onda je količina sa kojom je afinitet za antigen niži od afiniteta za nespecifični antigen može biti najmanje 10,000 puta.
[0024] Termin "kd" (sec<-1>), kao što se ovde koristi, se odnosi na konstantu ravnoteže disocijacije određene interakcije antitela sa antigenom. Pomenuta vrednost je ovde označena sa koffvrednost.
[0025] Termin "ka" (M<-1>3 sec<-1>), kao što se ovde koristi, se odnosi na konstantu ravnoteže vezivanja određene interakcije antitela sa antigenom.
[0026] Termin "KD" (M), kao što se ovde koristi, se odnosi na konstantu ravnoteže disocijacije određene interakcije antitela sa antigenom.
[0027] Termin "KA" (M<-1>), kao što se ovde koristi, se odnosi na konstantu ravnoteže vezivanja određene interakcije antitela sa antigenom i dobija se deljenjem kasa kd.
[0028] Kao što se ovde koristi, termin "inhibira rast" (npr. odnosi se na ćelije, kao što su tumorske ćelije) je namenjen da uključi bilo kakvo merljivo smanjenje ćelijskog rasta kada se dovede u kontakt sa anti-c-Met antitelom u poređenju sa rastom istih ćelija koje nisu u kontaktu sa anti-c-Met antitelom, npr., inhibicija rasta ćelijske kulture za bar oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%, ili 100%. Takvo smanjenje u ćelijskom rastu može nastati različitim mehanizmima, npr., fagocitozom efektorske ćelije, ADCC, CDC, i/ili apoptozom.
[0029] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitela koja sadrže funkcionalne varijante VLregiona, VHregiona, ili jedan ili više CDRs antitela iz primera. Funkcionalna varijanta VL, VH, ili CDR korišćena u kontekstu anti-c-Met antitela i dalje dozvoljava antitelu da zadrži bar suštinski deo (najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili više) afiniteta/aviditeta i/ili specifičnosti/selektivnosti roditeljskog antitela i u nekim slučajevima takvo anti-c-Met antitelo može biti povezano sa većim afinitetom, selektivnošću i/ili specifičnošću u odnosu na roditeljsko antitelo.
[0030] Takve funkcionalne varijante obično zadržavaju značajan identitet u sekvenci sa roditeljskim antitelom. Procenat identiteta između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje dele sekvence (tj., % homologije = # identičnih pozicija/ukupni # pozicija 3100), uzimajući u obzir broj praznih mesta (eng. gaps), i dužinu svakog “gap”, koju je potrebno uvesti za optimalno poravnanje dve sekvence. Procenat identiteta između dve nukleotidne ili aminokiselinske sekvence se može npr. odrediti korišćenjem algoritma E. Meyers i W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988) koji je uključen u ALIGN program (verzija 2.0), korišćenjem PAM120 tabele ostatka težine, kazne 12 dužine praznog mesta i kazne 4 praznog mesta. Dodatno, procenat identiteta između dve aminokiselinske sekvence može se odrediti korišćenjem Needleman i Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970) algoritma.
[0031] Sekvenca varijanti CDR može se razlikovati od sekvence CDR sekvenci roditeljskih antitela uglavnom kroz konzervativne supstitucije; na primer, bar 10, kao što je bar 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 supstitucija varijante su konzervativne zamene aminokiselinskih ostataka.
[0032] U kontekstu predmetnog prikaza, konzervativne supstitucije se mogu definisati zamenama unutar aminokiselinskih klasa koje su prikazane u sledećoj tabeli:
Klase aminokiselinskih ostataka za konzervativne supstitucije
[0033]
[0034] Termin "rekombinantna ćelija domaćin" (ili jednostavno "ćelija domaćin"), kao što se ovde koristi, je namenjen da se odnosi na ćeliju u koju je uveden ekspresioni vektor, npr. ekspresioni vektor koji kodira antitelo iz pronalaska. Rekombinantne ćelije domaćini uključuju, na primer, transfektome, kao što su CHO ćelije, HEK293 ćelije, NS/0 ćelije, i ćelije limfociti.
[0035] Termin "transgena nehumana životinja" se odnosi na nehumanu životinju koja ima genom koji se sastoji iz jednog ili više transgena ili transhromozoma humanog teškog i/ili lakog lanca (bilo integrisanih ili neintegrisanih u prirodnu genomsku DNK životinja) i koja je sposobna da eksprimuje potpuno humana antitela. Na primer, transgeni miš može sadržati transgen humanog lakog lanca i ili transgen humanog teškog lanca ili transhromozom humanog teškog lanca, tako da miš proizvodi humana anti-c-Met antitela kada se imunizuje c-Met antigenom i/ili ćelijama koje eksprimuju c-Met. Transgen humanog teškog lanca može biti integrisan u hromozomalnu DNK miša, kao i u slučaju transgenih miševa, na primer HuMAb miševi, kao što su HCo7 ili HCo12 miševi, ili transgen humanog teškog lanca se može održavati ekstrahromozomalno, kao u slučaju transhromozomalnih KM miševa kao što je opisano u WO02/43478. Slični miševi, koji imaju veći genski repertoar humanog At, uključuju HCo7 i HCo20 (videti npr. WO2009097006). Takvi transgeni i transhromozomalni miševi (ovde kolektivno označeni sa "transgeni miševi") su sposobni da proizvode višestruke izotipove humanih monoklonskih antitela na dati antigen (kao što je IgG, IgA, IgM, IgD i/ili IgE) podvrgavanjem V-D-J rekombinaciji i izotipskom prekopčavanju. Transgene, nehumane životinje mogu se takođe koristiti za dobijanje antitela protiv specifičnog antigena uvođenjem gena koji kodiraju takvo specifično antitelo, na primer operativnim vezivanjem gena za gen koji se eksprimuje u mleku životinja.
[0036] "Tretman" se odnosi na davanje efikasne količine terapeutski aktivnog jedinjenja predmetnog ponalaska sa ciljem da se olakšaju, ublaže, zaustave ili ukinu (izleče) simptomi ili stanja bolesti.
[0037] "Efikasna količina" se odnosi na količinu efikasnog, u doziranjima i neophodnom vremenskom periodu, da bi se postigao željeni terapeutski rezultat. Terapeutski efikasna količina anti-c-Met antitela se može razlikovati u zavisnosti od faktora kao što su stanje bolesti, starosna dob, pol, i težina pojedinca, i sposobnost anti-c-Met antitela da izazove željeni odgovor kod individue. Terapeutski efikasna količina je takođe ona u kojoj bilo koji toksični ili oštećujući efekti antitela ili dela antitela su prevaziđeni od strane terapeutski korisne efekte.
[0038] "Anti-idiotipsko" antitelo je antitelo koje prepoznaje jedinstvene determinante generalno povezane sa mestom za vezivanj antigena antitela.
Dalji aspekti i izvođenja pronalaska
[0039] Kao što je gore opisano, u prvom aspektu, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo koji sadrži prvo mesto za vezivanje antigena iz anti-c-Met antitela i drugo mesto za vezivanje antigena specifično za receptor epidermalnog faktora rasta, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO: 98, 99 i 100 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO: 102, 103 i 104 (069).
[0040] Monoklonska antitela iz predmetnog prikaza mogu npr. se proizvesti postupkom hibridoma prvi put opisanog od strane Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), ili se mogu proizvesti postupcima rekombinantne DNK. Monoklonska antitela se mogu takođe izolovati iz fagnih biblioteka antitela korišćenjem postupaka opisanih u, na primer, Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol.222, 581-597 (1991). Monoklonska antitela mogu se dobiti iz bilo kog pogodnog izvora. Stoga, na primer, monoklonska antitela mogu se dobiti iz hibridoma koji se dobijaju iz B ćelija slezine miša dobijenih od miševa imunizovanih antigenom od interesa, na primer u obliku ćelija koje eksprimuju antigen na površini, ili nukleinskom kiselinom koja kodira antigen od interesa. Monoklonska antitela se takođe mogu dobiti iz hybridoma koji su dobijeni od ćelija koje eksprimuju antitela imunizovanih ljudi ili nehumanih životinja kao što su pacovi, psi, primati, itd.
[0041] U jednom izvođenju, antitelo iz pronalaska je humano antitelo. Humana monoklonskla antitela koja su usmerena protiv c-Met mogu se dobiti korišćenjem transgenim ili transhromozomalnim miševima koji nose delove humanog imunog sistema a ne mišjeg sistema. Takvi transgeni i transhromozomalni miševi uključuju miševe koji su ovde označeni sa HuMAb miševima i KM miševima, redom, i ovde se zajednički nazivaju "transgeni miševi".
[0042] HuMAb miš sadrži mini lokuse gena humanih imunoglobulina koji kodira nearanžirane imunoglobulinske sekvence humanog teškog (µ i γ) i κ lakog lanca, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktivišu endogene lokuse µ i κ lanca (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). Prema tome, miševi su ispoljili smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ili κ i u odgovoru na imunizaciju, uvedeni transgeni humanog teškog i lakog lanca, prolaze kroz promenu klase i somatsku mutaciju da se dobiju visoko afinitetna IgG,κ monoklonska antitela (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revijski u Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994) , Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol.1365-93 (1995) i Harding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764536-546 (1995)). Dobijanje HuMAb miševa je detaljno opisano u Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol.152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Videti takođe US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 i WO 01/09187.
[0043] HCo7 miševi imaju JKD poremećaj u njihovim endogenim genima lakog lanca (kapa) (kao što je opisano u Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), CMD poremećaj u njihovim endogenim genima teškog lanca (kao što je opisano u Primeru 1 WO 01/14424), Kco5 transgen humanog kapa lakog lanca (kao što je opisano u Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), i Hco7 transgena humanog teškog lanca (kao što je opisano u US 5,770,429).
[0044] Hco12 miševi imaju JKD poremećaj u njihovim endogenim genima lakog lanca (kapa) (kao što je opisano u Chen et al., EMBO J.12, 821-830 (1993)), CMD poremećaj u njihovim endogenim genima teškog lanca (kao što je opisano u Primeru 1 WO 01/14424), Kco5 transgen humanog kapa lakog lanca (kao što je opisano u Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), i Hco12 transgena humanog teškog lanca (kao što je opisano u Primeru 2 WO 01/14424).
[0045] U mišjem soju KM, the endogeni gen mišjeg kapa lakog lanca je homozigotno poremećen kao što je opisano u Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993) i endogeni gen mišjeg teškog lanca je homozigotno poremećen kao što je opisano u Primeru 1 WO 01/09187. Ovaj mišji soj nosi transgen humanog kapa lakog lanca, Kco5, kao što je opisano u Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Ovaj mišji soj takođe nosi transhromozom humanog teškog lanca koji se sastoji iz fragmenta hCF hromozoma 14 (SC20) kao što je opisano u WO 02/43478.
[0046] Splenociti iz ovih transgenih miševa se mogu koristiti da se dobiju hibridomi koji luče humana monoklonska antitela u skladu sa dobro poznatim postupcima.
[0047] Dalje, humana antitela iz predmetnog pronalaska ili antitela iz predmetnog pronalaska iz drugih vrsta mogu se identifikovati kroz tehnologije displejnog tipa, uključujući, bez ograničenja, prikaz faga, retrovirusni prikaz, ribozomski prikaz i druge metode, koristeći metode dobro poznate u oblasti tehnike i rezultujući molekuli mogu biti podvrgnuti dodatnom sazrevanju, kao što je sazrevanje afiniteta, pošto su takve tehnike dobro poznate u oblasti tehnike (videti na primer Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (phage display), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (phage display), Hanes and Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (ribosomal display), Parmley and Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (phage display), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992), i US 5,733,743). Ako se tehnologije prikaza koriste za proizvodnju antitela koja nisu ljudska, takva antitela mogu biti humanizovana.
[0048] U jednom izvođenju, antitelo iz pronalaska je izotipa IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ili IgM.
[0049] U glavnom aspektu pronalaska antitelo sadrži VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:98, 99 i 100 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:102, 103 i 104, (069).
[0050] U daljem izvođenju antitelo sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:97 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:101 (069).
[0051] Takođe ovde je prikazano antitelo koje je u kompeticiji za vezivanje sa rastvorljivim cMetECDHis sa imobilizovanim antitelom, gde pomenuto imobilizovano antitelo sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:33 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:37 (024), poželjno gde je antitelo u kompeticiji za više od 50%, kao što je više od 75% sa pomenutim imobilizovanim antitelom, kada se odredi kao što je opisano u Primeru 17.
[0052] U daljem prikazu, antitelo nije u kompeticiji za vezivanje za rastvorljivi cMetECDHis sa antitelom koje je izabrano iz grupe koja sadrži:
a) imobilizovano antitelo koji sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:1 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:5 (005)
b) imobilizovano antitelo koji sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:17 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:21 (008)
c) imobilizovano antitelo koji sadrži VH region i VL region antitela 5D5, i
d) imobilizovano antitelo koji sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:49 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:53 (045),
poželjno gde je antitelo u kompeticiji za manje od 25%, kao što je manje od 20% sa pomenutim imobilizovanim antitelom, kada se odredi kao što je opisano u Primeru 17.
[0053] U daljem prikazu, antitelo se veže za isti epitop kao antitelo koje je izabrano iz grupe koja sadrži:
a) antitelo koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:33 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:37 (024)
b) antitelo koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:65 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:69 (061)
c) antitelo koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:73 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:77 (062)
d) antitelo koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:81 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:85 (064)
e) antitelo koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:89 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:93 (068)
f) antitelo koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:97 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:101 (069)
g) antitelo koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:113 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:117 (098)
h) antitelo koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:121 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:125 (101), i
i) antitelo koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:129 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:133 (181).
[0054] U daljem izvođenju, antitelo sadrži VH CDR3 region koji ima sekvencu koja je predstavljena u a) SEQ ID NO:36 (024)
b) SEQ ID NO:193, kao što je VH CDR3 region kao što je prikazano u SEQ ID NO:68, 76, 84 ili 92 (061, 062, 064, 068)
c) SEQ ID NO:196, kao što je VH CDR3 region kao što je prikazano u SEQ ID NO:100 ili 132 (069, 181) d) SEQ ID NO:116 (098), ili
e) SEQ ID NO:201, kao što je VH CDR3 region kao što je prikazano u SEQ ID NO:124 (101).
[0055] U daljem izvođenju, antitelo sadrži:
a) VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:34, 185 i 36 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:38, 39 i 206, kao što je antitelo koje sadrži VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:34, 35 i 36 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:38, 39 i 40, (024)
b) VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:191, 192 i 193 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:78, 79 i 208, kao što je antitelo koje sadrži
a. VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:66, 67 i 68 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:70, 71 i 72 (061)
b. VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:74, 75 and 76 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:78, 79 i 80, (062)
c. VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:82, 83 i 84 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:86, 87 i 88, (064), ili
d. VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:90, 91 i 92 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:94, 95 i 96, (068)
c) a VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:194, 195 i 196 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:209, 210 i 104, kao što je antitelo koje sadrži
a. VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:130, 131 i 132 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:134, 135 i 136, (181)
d) VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:197, 198 i 116 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:118, 119 i 211, kao što su antitelo koje sadrži VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:114, 115 i 116 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:118, 119 i 120 (098), ili
e) VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO: 199, 200 i 201 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO: 126, 212 i 128, kao što je antitelo koje sadrži VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:122, 123 i 124 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:126, 127 i 128 (101).
[0056] Dalje su prikazana antitela koja sadrže:
a) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:33 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:37 (024)
b) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:61 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:69 (061)
c) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:73 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:77 (062)
d) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:81 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:85 (064)
e) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:89 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:93 (068)
f) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:113 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:117 (098)
g) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:121 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:125 (101)
h) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:129 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:133 (181)
i) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:159 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:160 (078)
j) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:161 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:162 (084)
k) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:163 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:164 (063)
l) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:165 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:166 (087)
m) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:137 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:138 (066)
n) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:139 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:140 (065)
o) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:141 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:142 (082)
p) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:143 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:144 (089), ili
q) varijantu bilo kojeg od pomenutih antitela, gde pomenuta varijanta poželjno ima najviše 1, 2 ili 3 aminokiselinske modifikacije, poželjnije aminokiselinske supstitucije, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije u navedenim sekvencama.
[0057] Takođe je prikazano antitelo:
- koje je u kompeticiji za vezivanje za rastvorljivi cMetECDHis sa imobilizovanim antitelom, pri čemu pomenuto imobilizovano antitelo sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:9 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:13 (006), kao što gde je antitelo u kompeticiji za više od 50%, kao što je više od 75% sa pomenutim imobilizovanim antitelom, kada je određeno kao što je opisano u Primeru 17, i
- antitelo nije u kompeticiji za vezivanje za rastvorljivi cMetECDHis sa imobilizovanim antitelom koji sadrže VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:49 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:53 (045), kao što gde je antitelo u kompeticiji manjoj od 50%, npr. manjoj od 25%, kao što je manje od 20% sa pomenutim imobilizovanim antitelom, kada je određeno kao što je opisano u Primeru 17 i
- antitelo se veže za SEMA domen c-Met, tako da gde je antitelo sposobno da inhibira vezivanje HGF za domen SEMA sa IC50 manjom od 10 µg/mL, kao što je manjom od 2 µg/mL kao što je opisano u Primeru 9.
[0058] Dalje prikazano, je antitelo koje nije u kompeticiji za vezivanje za rastvorljivi cMetECDHis sa imobilizovanim antitelom koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:33 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:37 (024), kao što gde je antitelo u kompeticiji za manje od 25%, kao što je manje od 20% sa pomenutim imobilizovanim antitelom, kada je određeno kao što je opisano u Primeru 17.
[0059] Dalje prikazano, je antitelo koje se veže za isti epitop kao antitelo koje je izabrano iz grupe koja sadrži:
a) antitelo koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:1 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:5 (005)
b) antitelo koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:9 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:13 (006)
c) antitelo koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:25 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:29 (022), i
d) antitelo koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:57 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:61 (058).
[0060] U daljem izlaganju, antitelo sadrži VH CDR3 region koji ima sekvencu prikazanu u
a) SEQ ID NO:181, kao što je VH CDR3 region kao što je prikazano u SEQ ID NO:4 ili 12 (005, 006) b) SEQ ID NO:28 (022), ili
c) SEQ ID NO:60 (058).
[0061] Dalje su prikazana antitela koja sadrže:
a) VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:179, 180 i 181 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:6, 7 i 202, kao što je antitelo koje sadrži
a. VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:2, 3 i 4 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:6, 7 i 8, (005), ili
b. VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:10, 11 i 12 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:14, 15 i 16, (006)
b) VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:26, 184 i 28 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:30, 31 i 205, kao što je antitelo koje sadrži VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:26, 27 i 28 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:30, 31 i 32 (022), ili
c) VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO: 189, 190 i 60 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO: 62, 63 i 207, kao što je antitelo koje sadrži VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:58, 59 i 60 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:62, 63 i 64 (058)
[0062] Takođe su prikazana antitela koja sadrže:
a) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:1 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:5 (005)
b) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:9 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:13 (006)
c) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:25 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:29 (022)
d) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:57 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:61 (058)
e) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:145 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:146 (031)
f) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:147 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:148 (007)
g) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:149 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:150 (011)
h) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:151 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:152 (017)
i) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:153 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:154 (025), ili
j) varijantu bilo kojih od pomenutih antitela, pri čemu pomenuta varijanta poželjno ima najviše 1, 2 ili 3 aminokiselinske modifikacije, poželjnije aminokiselinske supstitucije, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije u pomenutim sekvencama.
[0063] Ovde je dalje prikazano:
- antitelo koje je u kompeticiji za vezivanje za rastvorljivi cMetECDHis sa imobilizovanim antitelom, pri čemu pomenuto imobilizovano antitelo sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:49 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:53 (045), kao što je gde je antitelo u kompeticiji za više od 50%, kao što je više od 75% sa pomenutim imobilizovanim antitelom, kada je određeno kao što je opisano u Primeru 17, i
- antitelo koje nije u kompeticiji za vezivanje za rastvorljivi cMetECDHis sa imobilizovanim antitelom, pri čemu pomenuto imobilizovano sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:9 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:13 (006), kao što je gde je antitelo u kompeticiji za manje od 25%, kao što je manje od 20% sa pomenutim imobilizovanim antitelom, kada je određeno kao što je opisano u Primeru 17.
[0064] Ovde je takođe prikazano isan antitelo koje nije u kompeticiji za vezivanje za rastvorljivi cMetECDHis sa antitelom koje je izabrano iz grupe koja sadrži:
a) imobilizovano antitelo koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:17 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:21 (008), i
b) imobilizovano antitelo koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:33 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:37 (024),
kao što je gde je antitelo u kompeticiji za manje od 25%, kao što je manje od 20% sa pomenutim imobilizovanim antitelom, kada je određeno kao što je opisano u Primeru 17.
[0065] Ovde je dalje prikazano antitelo koje se vezuje za isti epitop kao antitelo koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:49 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:53 (045).
[0066] Ovde je dalje prikazano antitelo koje sadrži VH CDR3 region koji ima sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO:188, kao što je VH CDR3 region koji je prikazan u SEQ ID NO:52 (045).
[0067] Ovde je dalje prikazano antitelo koje sadrži VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO: 186, 187 i 188 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO: 54, 55 i 56, tako da antitelo koje sadrži VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:50, 51 i 52 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:54, 55 i 56 (045).
[0068] Ovde je dalje prikazano antitelo koje sadrži:
a) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:49 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:53 (045)
b) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:155 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:156 (040)
c) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:157 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:158 (039), ili
d) varijantu bilo kojih od pomenutih antitela, pri čemu pomenuta varijanta poželjno ima najviše 1, 2 ili 3 aminokiselinske modifikacije, poželjnije aminokiselinske supstitucije, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije u pomenutim sekvencama.
[0069] Ovde je dalje prikazano antitelo koje se veže za domen SEMA c-Met, kao što gde je antitelo sposobno da inhibira vezivanje HGF za domen SEMA sa IC50 manjom od 10 µg/mL, kao što je manjom od 2 µg/mL kao što je opisano u Primeru 9.
[0070] Ovde su dalje prikazana antitela koja se vezuju za isti epitop kao antitelo koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:17 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:21 (008) ili se vezuje za isti epitop kao antitelo koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:41 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:45 (035) ili se vezuje za isti epitope kao antitelo koje sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:105 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:109 (096).
[0071] Ovde su dalje prikazana antitela koja sadrže VH CDR3 region koji ima sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO:183, kao što je VH CDR3 region kao što je prikazan u SEQ ID NO:20, 44 ili 108 (008, 035, 096).
[0072] Ovde su dalje prikazana antitela koja sadrže VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:18, 182 i 183 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:22, 203 i 204, kao što je antitelo koje sadrži
a) VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:18, 19 i 20 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:22, 23 i 24, (008), ili
b) VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:42, 43 i 44 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:46, 47 i 48, (035), ili
c) VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:106, 107 i 108 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO:110, 111 i 112 (096).
[0073] Ovde su dalje prikazana antitela koja sadrže:
a) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:17 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:21 (008)
b) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:41 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:45 (035)
c) VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:105 i, poželjno, VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:109 (096) ili
d) varijantu bilo kojih od pomenutih antitela, pri čemu pomenuta varijanta poželjno ima najviše 1, 2 ili 3 aminokiselinske modifikacije, poželjnije aminokiselinske supstitucije, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije u pomenutim sekvencama.
[0074] U daljem izvođenju, antitelo se veže za A431 ćelije sa EC50 od 10 nM ili manje, kao što je EC50 od 2 nM ili manje, poželjno kao što je određeno u skladu sa Primerom 13.
[0075] U još daljem izvođenju, antitelo se veže za c-Met sa konstantom afiniteta (KD) 20 nM ili manjom, kao što je afinitet 5 nM ili manje, poželjno kao što je određeno prema Primeru 14.
[0076] U još daljem izvođenju, antitelo se veže za Rezusni c-Met, poželjno gde je signal vezivanja antitela za Rezusni c-Met najmanje 5 puta u odnosu na negativno kontrolno antitelo, kao što je određeno u skladu sa Primerom 15.
[0077] U još daljem izvođenju, antitelo inhibira vezivanje HGF za vanćelijski domen c-Met, poželjno gde antitelo inhibira vezivanje više od 40%, kao što je više od 50%, kao što je određeno u skladu sa Primerom 16.
[0078] U još daljem izvođenju, antitelo je sposobno da inhibira vijabilnost KP4 ćelija, poželjno pri čemu je antitelo sposobno da inhibira vijabilnost za više od 10%, kao što je više od 25%, npr. više od 40%, poželjno kao što je opisano u Primeru 19.
Formati antitela
[0079] Predmetni pronalazak obezbeđuje antagonistička anti-c-Met antitela i takođe su ovde prikazana neantagonistička anti-c-Met antitela. Dok neka antitela deluju antagonistički na ciljne ćelije bez obzira da li su monovalentna ili bivalentna, za druga antitela, funkcionalni efekat zavisi od valencije. Kao što je prikazano u Primeru 19 ovde, antitela 024, 062, 064, 068, 069, 098, 101, 181, na primer, (koja su sva u istoj grupi za unakrsno blokiranje videti Primer 17) imaju antagonistička svojstva u testu vijabilnosti KP4 bez obzira na format. Antitela 022 i 058, s druge strane, ponašaju se antagonistički u ovom testu u monovalentnom formatu, ali agonistički (ili barem neantagonistički) u bivalentnom formatu. Prema tome, u zavisnosti od željenih funkcionalnih svojstava za određenu upotrebu, određena antitela se mogu izabrati iz skupa antitela koji su ovde otkriveni. Kao što je gore pomenuto, antitelo iz pronalaska (069) ima antagonistička svojstva u testu vijabilnosti KP4 bez obzira da li u monovalentnom je ili bivalentnom formatu.
[0080] Dalje, antitelo iz pronalaska može biti bilo kog izotipa. Izbor izotipa će obično biti vođen željenim efektorskim funkcijama, kao što je indukcija ADCC. Primeri izotipova su IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Može se koristiti bilo koji od konstantnih regiona ljudskog lakog lanca, kapa ili lambda. Po želji, klasa anti-c-Met antitela iz ovog pronalaska može se promeniti poznatim metodama. Na primer, antitelo iz ovog pronalaska koje je prvobitno bilo IgM može biti prebačeno na IgG antitelo iz ovog pronalaska. Dalje, tehnike promene klasa (prekopčavanja) mogu se koristiti za pretvaranje jedne podklase IgG u drugu, na primer iz IgG1 u IgG2. Prema tome, efektorska funkcija antitela iz ovog pronalaska može da se promeni prebacivanjem izotipa na, npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ili IgM antitela za različite terapijske upotrebe. U jednom izvođenju antitelo predmetnog pronalaska je IgG1 antitelo, na primer IgG1,κ.
[0081] Smanjena modulacija c-Met izazvana antagonističkim antitelima predstavlja mehanizam delovanja terapeutskih c-Met antitela. Shodno tome, u jednom aspektu pronalaska poželjna su antitela sa smanjenim agonističkim svojstvima, ali sa zadržanom sposobnošću da indukuju smanjenu modulaciju c-Met.
[0082] Otkriveno je da je smanjenjem konformacione fleksibilnosti antitela potencijalna rezidualna agonistička aktivnost bivalentnih IgG1 antitela svedena na minimum.
[0083] Shodno tome,, antitelo prema pronalasku može biti modifikovano da bi postalo manje fleksibilno, kao što su mutacije zglobnog regiona.
[0084] Najveće konformacione promene su rezultat fleksibilnosti zglobnog regiona, koja omogućava širok spektar Fab-Fc uglova (Ollmann Saphire, E., R.L. Stanfield, M.D.M. Crispin, P.W.H.I. Parren, P.M. Rudd, R.A. Dwek, D.R. Burton and I.A. Wilson. 2002. Contrasting IgG structures reveal extreme asymmetry and flexibility. J. Mol. Biol.319: 9-18). Jedan od načina da se smanji fleksibilnost Fab-kraka u imunoglobulinima je da se spreči stvaranje disulfidnih veza između lakog i teškog lanca pomoću genetičke modifikacije. U prirodnom IgG1 antitelu laki lanac je kovalentno povezan sa teškim lancem preko disulfidne veze, povezujući C-terminalni cistein lakog lanca sa cisteinom na poziciji 220 (C220 EU numeracija) u zglobu Fc teškog lanca. lanac. Mutacijom aminokiseline C220 u serin ili bilo koju drugu prirodnu aminokiselinu, uklanjanjem C220, uklanjanjem kompletnog zglobnog regiona ili zamenom zglobnog regiona IgG1 sa zglobnim regionom IgG3, formira se molekul u kome su laki lanci povezani preko svojih C -terminalnih cisteina, analogno situaciji koja se nalazi u humanom izotipu IgA2m(1). Ovo rezultira smanjenom fleksibilnošću Fabs u odnosu na Fc i posledično smanjenim kapacitetom unakrsnog povezivanja, kao što je prikazano u Primerima.
[0085] Druga strategija za smanjenje fleksibilnosti IgG1 molekula je zamena zglobnog regiona IgG1 sa zglobnim regionom IgG2 ili zglobnim regionom nalik IgG2. (Dangl et al. EMBO J.1988; 7:1989-94). Ovaj zglobni region ima dve osobine različite od IgG1, za koje se smatra da čine molekule manje fleksibilnim. Prvo, u poređenju sa zglobnim regionom IgG1, zglobni region IgG2 je kraći za 3 aminokiseline. Drugo, zglobni region IgG2 sadrži dodatni cistein, tako da će se formirati tri umesto dva međulančana disulfidna mosta teškog lanca. Alternativno, može se uvesti varijanta zglobnog regiona IgG1 koja podseća na zglobni region IgG2. Ovaj mutant (TH7Δ6-9) (WO2010063746) sadrži mutaciju T223C i dve delecije (K222 i T225) kako bi se stvorilo kraći zglobni region sa dodatnim cisteinom.
[0086] Dalje je prikazano antitelo podtipa IgG1, gde je zglobni region modifikovan:
(i) delecijom zglobnog regiona sekvence EPKSCDKTHTCPPCP i supstitucijom sa zglobnim regionom IgG2 sekvence: ERKCCVECPPCP (IgG1 Zglobni region-IgG2);
(ii) delecijom pozicije 220 tako da modifikovani zglobni region ima sekvencu EPKSDKTHTCPPCP (IgG1 ΔC220);
(iii) supstitucijom cisteina na poziciji 220 sa bilo kojom drugom prirodnom aminokiselinom (X) tako da modifikovani zglobni region ima sekvencu EPKSXDKTHTCPPCP (IgG1 C220X);
(iv) delecijom zglobnog regiona sekvence EPKSCDKTHTCPPCP (UniBody IgG1);
(v) delecijom zglobnog regiona sekvence EPKSCDKTHTCPPCP i supstitucijom sa zglobnim regionom IgG3 sekvence ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP (IgG1 Zglobni region-IgG3); ili
(vi) supstitucijom treonina na poziciji 223 sa cisteinom, i delecijom lizina na poziciji 222 i treoninom na poziciji 225, tako da modifikovani zglobni region ima sekvencu EPKSCDCHCPPCP (IgG1 TH7Δ6-9).
[0087] Takođe prikazano, antitelo podtipa IgG1, može imati zglobni region koji je modifikovan delecijom u poziciji 220 tako da modifikovani zglobni region ima sekvencu EPKSDKTHTCPPCP (IgG1 ΔC220) ili supstitucijom cisteina u poziciji 220 sa bilo kojom drugom prirodnom aminokiselinom (X) tako da modifikovani zglobni region ima sekvencu EPKSXDKTHTCPPCP (IgG1 C220X).
[0088] Dalje prikazano, antitelo podtipa IgG1, može imati zglobni region modifikovan supstitucijom cisteina u poziciji 220 sa serinom tako da modifikovani zglobni region ima sekvencu EPKSSDKTHTCPPCP (IgG1 C220S).
[0089] U daljem izvođenju, antitelo iz pronalaska je podtipa IgG2.
[0090] U drugom izvođenju, antitelo iz pronalaska je gliko-modifikovan da smanji fukozu i na taj način poveća ADCC, npr. dodavanjem jedinjenja u medijumu kulture tokom proizvodnje antitela kao što je opisano u US2009317869 ili kao što je opisano u van Berkel et al. (2010) Biotechnol. Bioeng.105:350 ili korišćenjem ćelija sa izbačenim (eng. knockout) FUT8, npr. kao što je opisano u Yamane-Ohnuki et al (2004) Biotechnol. Bioeng 87:614. ADCC može biti alternativno optimizovano korišćenjem postupka opisanog od Umaña et al. (1999) Nature Biotech 17:176.
[0091] Različite publikacije su pokazale korelaciju između smanjene fukozilacije centralnog dela jezgra i pojačane aktivnosti ADCC in vitro (Shields RL. 2002 JBC; 277:26733-26740, Shinkawa T. 2003 JBC; 278(5):3466-3473, Umaña P. Nat Biotechnol.1999 Feb;17(2):176-80).
[0092] U daljem izvođenju, antitelo pronalaska je modifikovano da smanji fukozilaciju centralnog dela jezgra ispod 10%, kao što je ispod 5%, što je određeno hromatografijom visoke performanse sa izmenom anjona u kombinaciji sa pulsnom amperometrijskom detekcijom (HPAEC-PAD). Ovo se može postići postupcimma dobro poznatim u prethodnom stanju tehnike, npr. tretman ili proizvodnja kifunenzina u FUT8 negativnim ćelijama.
[0093] U daljem izvođenju, antitelo iz pronalaska je modifikovano da pojača aktivaciju komplementa, npr., kao što je opisano u Natsume et al. (2009) Cancer Sci.100:2411.
[0094] U jednom izvođenju, antitelo iz pronalaska je antitelo pune dužine, poželjno IgG1 antitelo, posebno IgG1,κ antitelo. U drugom izvođenju, antitelo iz pronalaska je fragment antitela ili jednolančano antitelo.
[0095] Fragmenti antitela mogu se npr., dobiti fragmentacijom korišćenjem uobičajenih postupaka, i izvršen je skrining fragmenata za korisnost na isti način kao što je ovde opisano za puna antitela. Na primer, F(ab’)2fragmenti se mogu dobiti tretmanom antitela pepsionom. Dobijeni F(ab’)2fragment se može tretirati da se redukuju disulfidni mostovi da se proizvedu Fab’ fragmenti. Fab fragmenti se mogu dobiti tretiranjem IgG antitela sa papainom; Fab’ fragmenti se mogu dobiti digestijom pepsinom IgG antitela. Fragment F(ab’) se takođe može proizvesti vezivanjem Fab’ kao što je ispod opisano tioetarskom vezom ili disulfidnom vezom. Fragment Fab’ je fragment antitela koji je dobijen isecanjem disulfidne veze u zglobnom regionu F(ab’)2. Fragment Fab’ se može dobiti tretiranjem fragmenta F(ab’)2redukcionim agensom, kao što je ditiotreitol. Fragment antitela se može dobiti eksprimovanjem nukleinskih kiselina koje kodiraju takve fragmente u rekombinantnim ćelijama (videti na primer Evans et al., J. Immunol. Meth.184, 123-38 (1995)). Na primer, himerni gen koji kodira deo F(ab’)2fragmenta može da uključi sekvence DNK koje kodiraju CH1 domen i zglobni region H lanca, nakon čega sledi translacioni stop kodon da bi se dobio takav skraćeni molekul fragmenta antitela.
[0096] Kao što je gore objašnjeno, u jednom izvođenju, anti-c-Met antitelo iz pronalaska je bivalentno antitelo.
[0097] U drugom izvođenju, anti-c-Met antitelo iz pronalaska je monovalento antitelo.
[0098] Ovde su takođe prikazani fragmenti Fab ili jednakokraka antitela, kao što je opisano u US20080063641 (Genentech) ili drugo monovalentno antitelo, npr. kao što je opisano u WO2007048037 (Amgen).
[0099] Takođe je prikazano monovalentno antitelo koje ima strukturu kao što je opisana u WO2007059782 (Genmab) sa delecijom u zglobnom regionu. Takvo anti-c-Met monovalentno antitelo, je konstruisano postupkom koji sadrži:
i) obezbeđivanje konstrukta nukleinske kiseline koja kodira laki lanac pomenutog monovalentnog antitela, pomenuti konstrukt sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira VL region odabranog antigen specifičnog anti-c-Met antitela i nukleotidna sekvenca koja kodira konstrantni CL region Ig, gde pomenuta nukleotidna sekvenca kodira VL region odabranog antigen specifičnog antitela i pomenuta nukleotidna sekvenca kodira CL region Ig su operativno vezani zajedno, i gde, u slučaju izotipa IgG1, nukelotidna sekvenca koja kodira CL region je modifikovana tako da CL region ne sadrži bilo koje aminokiseline sposobne da formiraju disulfidne veze ili kovalentne veze sa drugim peptidima koji sadrže identičnu aminokiselinsku sekvencu CL regiona u prisustvu poliklonskog humanog IgG ili kada se daje životinji ili ljudskom biću;
ii) obezbeđivanje konstrukta nukleinske kiseline koja kodira težak lanac pomenutog monovalentnog antitela, pomenuti konstrukt sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira VH region odabranog antigen specifičnog antitela i nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni CH region humanog Ig, pri čemu nukleotidna sekvenca koja kodira CH region je modifikovana tako da region koji odgovara zglobnom regionu i, kao što je zahtevano podtipom Ig, drugim regionima CH regiona, kao što je CH3 region, ne sadrži bilo koje aminokiselinske ostatke koji učestvuju u nastajanju disulfidnih veza ili kovalentne ili stabilne nekovalentne veze među-teških lanaca sa drugim peptidima koji sadrže identičnu aminokiselinsku sekvencu CH regiona humanog Ig u prisustvu poliklonskog humanog IgG ili kada se daje životinji ljudskom biću, gde pomenuta nukleotidna sekvenca koja kodira VH region pomenutog antigen specifičnog antitela i pomenuta nukleotidna sekvenca kodira CH region pomenutog Ig su operativno povezani zajedno;
iii) obezbeđivanje sistema ćelijske ekspresije za proizvodnju pomenutog monovalentnog antitela;
iv) proizvodnju pomenutog monovalentnog antitela istovremenom ekspresijom konstrukta nukleinskih kiselina iz (i) i (ii) u ćelijama sistema ćelijske ekspresije iz (iii).
[0100] Slično, u jednom izvođenju, anti-c-Met antitelo je monovalentno antitelo, koji sadrži:
(i) varijabilni region antitela iz pronalaska kao što je ovde opisan ili dela za vezivanje antigena pomenutog regiona, i
(ii) CHregion imunoglobulina ili njegov fragment koji sadrži CH2 i CH3 regionima, gde CHregion ili njegov fragmen je modifikovan tako da region odgovara zglobnom regionu i, ukoliko imunoglobulin nije podtipa IgG4, drugi regioni CHregiona, kao što je CH3 region, ne sadrže bilo koje aminokiselinske ostatke, koji su sposobni da obrazuju disulfidne veze sa identičnim CHregionom ili druge kovalentne ili stabilne nekovalentne među veze teških lanaca sa identičnim CHregionom u prisustvu poliklonskog humanog IgG.
[0101] Takođe prikazani težak lanac monovalentnog anti-c-Met antitela se može modifikovati tako da je čitav zglobni region deletiran.
[0102] U drugom daljem izvođenju, pomenuto monovalentno antitelo je podtipa IgG4, ali je region CH3 modifikovan tako da je izvršena jedna ili više od sledećih supstitucija aminokiselina:
Numeracija mutacija u CH3
[0103]
*KABAT označava numeraciju aminokiselina prema Kabatu (Kabat et al., Sequences of Proteins of ;Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). EU indeks označava numeraciju aminokiselina prema EU indeksu kao što je označeno u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). ;;[0104] U drugom daljem izvođenju, sekvenca pomenutog monovalentnog antitela je modifikovana tako da ne sadrži bilo koja akceptorska mesta za N-vezanu glikozilaciju. ;[0105] Ovde su takođe prikazana jednolančana anti-c-Met antitela. Jednolančana antitela su peptidi u kojima su povezani težak i laki lanac Fv regiona. Takav prikaz uključuje jednolančani Fv (scFv) gde su teški i laki lanci u Fv anti-c-Met antitela iz predmetnog prikaza spojeni sa fleksibilnim peptidnim linkerom (obično oko 10, 12, 15 ili više aminokiselinskih ostataka) u jednom peptidnom lancu. Postupci za dobijanje takvih antitela su opisani u na primer US 4,946,778, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg i Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994), Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) i McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990). Jednolančana antitela mogu biti monovalentna, ako se koristi samo jedan VHi VL, bivalentni, ako se koriste dva VHi VL, ili polivalentni, ukoliko se koriste više od dva VHi VL. ;;[0106] U jednom izvođenju, anti-c-Met antitelo iz pronalaska je antitelo sa defektom u efektorskoj funkciji. Ovde je takođe prikazano anti-c-Met antitelo sa defektom u efektorskoj funkciji koje je stabilizovano IgG4 antitelo, koje je modifikovano da spreči izmenu Fab-kraka (van der Neut Kolfschoten et al. (2007) Science 317(5844):1554-7). Primeri takvih stabilizovanih IgG4 antitela su antitela, gde je arginin u poziciji 409 u konstantnom region teškog lanca humanog IgG4, koji je naznačen u EU indeksu kao u Kabat et al., je supstituisan lizinom, treoninom, metioninom, ili leucinom, poželjno lizinom (opisano u WO2006033386 (Kirin)) i/ili gde je zglobni region modifikovan da sadrži Cys-Pro-Pro-Cys sekvencu. ;;[0107] Dalje je prikazano stabilizovano IgG4 anti-c-Met antitelo koje je IgG4 antitelo koje sadrži težak lanac i laki lanac, pri čemu pomenuti težak lanac sadrži konstantni region humanog IgG4 koji ima ostatak koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz: Lys, Ala, Thr, Met i Leu na poziciji koja odgovara 409 i/ili ostatak koji je odabran iz grupe koja sadrži: Ala, Val, Gly, Ile i Leu na poziciji koja odgovara 405, i gde pomenuto antitelo opciono sadrži jednu ili više drugih supstitucija, delecija i/ili insercija, ali ne sadrži Cys-Pro-Pro-Cys sekvencu u zglobnom regionu. Takvo antitelo može da sadrži Lys ili Ala ostatak na poziciji koja odgovara 409 ili region CH3 region antitela je zamenjen sa CH3 regionom humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG3. Videti takođe i WO2008145142 (Genmab). ;;[0108] Dalje, u još jednom prikazu stabilizovano IgG4 anti-c-Met antitelo je IgG4 antitelo koje sadrži težak lanac i laki lanac, gde pomenuti težak lanac sadrži konstantni region humanog IgG4 koji ima ostatak koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz: Lys, Ala, Thr, Met i Leu na poziciji koja odgovara 409 i/ili ostatak koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz: Ala, Val, Gly, Ile i Leu na poziciji koja odgovara 405, i gde pomenuto antitelo opciono sadrži jednu ili više drugih supstitucija, delecija i/ili insercija i gde pomenuto antitelo sadrži Cys-Pro-Pro-Cys sekvencu u zglobnom regionu. Poželjno, pomenuto antitelo sadrži Lys ili Ala ostatak na poziciji koja odgovara 409 ili CH3 region antitela je zamenjen CH3 regionom humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG3. ;;[0109] U daljem izvođenju, anti-c-Met antitelo sa defektnom efektorskom funkcijom je antitelo ne-IgG4 tipa, npr. IgG1, IgG2 ili IgG3 koje je mutirano tako da sposobnost u posredovanju efektorskih funkcija, kao što je ADCC, je smanjena ili čak eliminisana. Takve mutacije su npr. opisane u Dall’Acqua WF et al., J Immunol.177(2):1129-1138 (2006) i Hezareh M, J Virol. ;75(24):12161-12168 (2001). ;Konjugati ;;[0110] U daljem izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-c-Met antitelo konjugovano za terapijski ostatak, kao što je citotoksin, hemoterapeutski lek, imunosupresant, ili radioizotop. Takvi konjugati su ovde označeni sa "imunokonjugati". Imunokonjugati koji uključuju jedan ili više citotoksina su ovde naznačeni kao "imunotoksini". ;[0111] Citotoksin ili citotoksični agens obuhvata bilo koji agens koji ima oštećujuće dejstvo (npr., ubija) ćelije. Pogodni terapeutski agensi za obrazovanje imunokonjugata iz predmetnog pronalaska uključuju taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidro-testosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, i puromicin, antimetabolite (kao što su metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tiogvanin, citarabin, fludarabin, 5-fluorouracil, dekarbazin, hidroksiureu, asparaginazu, gemcitabin, kladribin), alkilujuće agense (kao što su mehloretamin, tioepa, hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU), lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, dakarbazin (DTIC), prokarbazin, mitomicin C, cisplatin i drugi derivati platine, kao što je karboplatina), antibiotici (kao što su daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, daunorubicin (ranije daunomicin), doksorubicin, idarubicin, mitramicin, mitomicin, mitoksantron, plicamicin, antramicin (AMC)), toksin difterije i srodni molekuli (kao što je A lanac difterije i njegovi aktivni fragmenti i hibridni molekuli), toksin ricina (kao što je ricin A ili deglikozilovani A lanac toksina ricina), toksin kolere, Shiga-srodni toksin (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), LT toksin, C3 toksin, Shiga toksin, pertusis toksin, tetanus toksin, Bowman-Birk proteazni inhibitor sojinog zrna, Pseudomonas exotoxin, alorin, saporin, modecin, gelanin, abrin A lanac, modecin A lanac, alfasarcin, Aleurites fordii proteini, diantin proteini, Phytolacca americana proteini (PAPI, PAPII, i PAP-S), momordica charantia inhibitor, curcin, krotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, i enomicin toksini. Drugi pogodni konjugovani molekuli uključuju ribonukleazu (RNaza), DNaza I, Staphylococcal enterotoksin-A, antivirusni protein vinobojke (pokeweed), difterin toksin, i Pseudomonas endotoksin. Videti, na primer, Pastan et al., Cell 47, 641 (1986) i Goldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994). Terapeutski agensi, koji se mogu primeniti u kombinaciji sa anti-c-Met antitelom iz predmetnog pronalaska kao što je ovde na drugom mestu opisano, mogu takođe biti kandidati za terapijske ostatake koji su korisni za konjugaciju sa antitelom iz predmetnog pronalaska. ;;[0112] U drugom izvođenju, anti-c-Met antitelo iz pronalaska sadrži konjugovanu nukleinsku kiselinu ili molekul koji je povezan sa nukleinskom kiselinom. U jednom takvom aspektu predmetnog pronalaska, konjugovana nukleinska kiselina citotoksična ribonukleaza, antisensna nukleinska kiselina, inhibitorni molekul RNK (npr., siRNK molekul) ili imunostimulatorna nukleinska kiselina (npr., imunostimulatorni molekul DNK koji sadrži CpG motiv). U drugom izvođenju, anti-c-Met antitelo iz pronalaska je konjugovano za aptamer ili ribozim. ;;[0113] U jednom izvođenju, obezbeđena su anti-c-Met antitela sadrže jednu ili više radiobeleženih aminokiselina. Radiobeleženo anti-c-Met antitelo može se koristiti i za dijagnostičke i terapijske svrhe konjugacija za radioobeležene molekule je još jedna moguća karakteristika). Neograničavajući primeri obeleživača za polipeptide uključuju 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, and 125I, 131I, i 186Re. ;;[0114] Anti-c-Met antitela mogu se hemijski modifikovati kovalentnim konjugovanjem za polimer da bi se na primer povećao njihov poluživot u cirkulaciji. Primeri polimera, i postupaka njihovog vezivanja za peptide, su ilustrovani na primer u US 4,766,106, US 4,179,337, US 4,495,285 i US 4,609,546. Dodatni polimeri uključuju polioksietilovane poliole i polietilen glikol (PEG) (npr., PEG sa molekulskom težinom od između oko 1,000 i oko 40,000, kao što je između oko 2,000 i oko 20,000). ;;[0115] Bilo koji postupak koji je poznat u oblasti tehnike za konjugovanje anti-c-Met antitela sa konjugovanim molekulom(ima), kao što su oni koji su gore opisani, mogu se koristiti, uključujući postupke opisane od strane Hunter et al., Nature 144, 945 (1962), David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth.40, 219 (1981) and Nygren, J. Histochem. and Cytochem.30, 407 (1982). Takva antitela se mogu proizvesti hemijskim konjugovanjem drugog ostatka za N-terminalnu stranu ili C-terminalnu stranu anti-c-Met antitela ili njegovog fragmenta (npr., H ili L lanca anti-c-Met antitela) (videti, npr., Antibody Engineering Handbook, edited by Osamu Kanemitsu, published by Chijin Shokan (1994)). Takvi derivati konjugovanih antitela mogu se takođe dobiti konjugacijom na unutrašnjim ostacima ili šećerima, gde je odgovarajuće. Agensi se mogu kuplovati ili direktno ili indirektno za anti-c-Met antitelo iz predmetnog pronalaska. Jedan primer indirektnog kuplovanja drugog agensa je kuplovanje pomoću grupe za razdvajanje (eng. spacer). U jednom izvođenju, anti-c-Met antitelo iz predmetnog pronalaska je vezano za helator linker, npr. tiuksetan, koji dozvoljava antitelu da se konjuguje sa radioizotopom. ;;Bispecifična antitela ;;[0116] U glavnom aspektu, pronalazak se odnosi na bispecifičan molekul koji sadrži prvo mesto za vezivanje antigena iz anti-c-Met antitela iz pronalaska kao što je ovde gore opisano i drugo mesto za vezivanje antigena specifično za receptor epidermalnog faktora rasta. ;;[0117] Takođe su prikazani bispecifični molekuli koji sadrže prvo mesto za vezivanje antigena iz antic-Met antitela iz pronalaska kao što je ovde gore opisano i drugo mesto za vezivanje antigena sa različitom specifičnosti vezivanja, kao što je specifičnost vezivanja za humanu efektorsku ćeliju, humani Fc receptor, T ćelijski receptor, B ćelijski receptor ili specifičnost vezivanja za nepreklapajući epitop c-Met, tj. bispecifično antitelo u kome prvo i drugo mesto za vezivanje antigena nije u kompeticiji za vezivanje sa c-Met, npr. kada je ispitano kao što se opisuje u Primeru 17. ;;[0118] Primeri molekula bispecifičnih antitela iz pronalaska sadrže (i) dva antitela jedan sa specifičnosti za c-Met i drugi za drugu metu koju su konjugovani zajedno, (ii) jedno antitelo koje ima jedan lanac ili krak specifičan za c-Met i drugi lanac ili krak specifičan za drugi molekul, i (iii) jednolancano antitelo koje ima specifičnost za c-Met i drugi molekul. U glavnom aspektu pronalaska drugi molekul je receptor epidermalnog faktora rasta, takođe poznat kao HER1. Takođe prikazan ali nije deo zahtevanog pronalaska je antigen kancera/antigen povezan sa tumorom kao što je karcinoembrionski antigen (CEA), antigen specifičan za prostatu (PSA), RAGE (bubrežni antigen), αfetoprotein, CAMEL (CTL-prepoznati antigen na melanomu), CT antigeni (kao što su MAGE-B5, -B6, -C2, -C3, i D; Mage-12; CT10; NY-ESO-1, SSX-2, GAGE, BAGE, MAGE, i SAGE), antigeni mucina (npr., MUC1, mucin-CA125, itd.), gangliozidni antigeni, tirozinaza, gp75, C-myc, Mart1, MelanA, MUM-1, MUM-2, MUM-3, HLA-B7, Ep-CAM ili integrin povezan sa kancerom, kao što je α5β3 integrin. Dalje prikazani drugi molekuli su: angiogeni faktor ili drugi faktor rasta povezan sa kancerom, kao što je vaskularni endotelni faktor rasta, faktor rasta fibroblasta, epidermalni faktor rasta, angiogenin ili receptor bilo kojih od navedenih, posebno receptori koji su povezani sa napredovanjem kancera (na primer jedan od HER1-HER4 receptora). Kao što je gore pomenuto drugi molekul za koji je antitelo iz pronalaska specifično je receptor epidermalnog faktora rasta (HER1). U jednom izvođenju, bispecifično antitelo iz pronalaska je diatelo. ;;Sekvence nukleinskih kiselina, vektori i ćelije domaćina ;;[0119] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na sekvence nukleinskih kiselina, kao što su sekvence DNK, koje kodiraju teške i lake lance antitela iz pronalaska. U jednom izvođenju sekvenca nukleinske kiseline kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 97 i/ili SEQ ID NO: 101. U drugom određenom izvođenju, sekvenca nukleinske kiseline kodira VH aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 97. U drugom određenom izvođenju, sekvenca nukleinske kiseline kodira VL aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 101. ;;[0120] Dalje su otkrivene sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju aminokiselinsku sekvencu koja je odabrana iz grupe koja sadrži: SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177 i 178. ;[0121] Dalje su otkrivene sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju VH aminokiselinsku sekvencu koja je odabrana iz grupe koja sadrži: SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105, 113, 121, 129, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175 i 177. ;[0122] Dalje su otkrivene sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju VL aminokiselinsku sekvencu koja je odabrana iz grupe koja sadrži: SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109, 117, 125, 133, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176 i 178. ;[0123] U još daljem aspektu, pronalazak se odnosi na ekspresioni vektor, ili set ekspresionih vektora, koji kodiraju antitelo iz pronalaska. Težak i laki lanac antitela mogu se kodirati istim vektorom ili različitim vektorom. ;[0124] Takvi ekspresioni vektori se mogu koristiti za rekombinantnu proizvodnju antitela iz pronalaska. ;[0125] U jednom izvođenju, ekspresioni vektor iz pronalaska sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira jedan ili obe aminokiselinske sekvence SEQ ID NOs: 97 i 101. U drugom određenom izvođenju, ekspresioni vektor iz pronalaska sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira VH aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 97. U još drugom izvođenju, ekspresioni vektor iz pronalaska sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira VL aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 101. ;[0126] U drugom prikazu ekspresioni vektor sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira jednu ili više aminokiselinskih sekvenci koje su odabrane iz grupe koja sadrži: SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177 i 178. ;[0127] U drugom prikazu, ekspresioni vektor sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira jednu ili više aminokiselinskih sekvenci VH koje su odabrane iz grupe koja sadrži: SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105, 113, 121, 129, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175 i 177. ;[0128] U drugom prikazu, ekspresioni vektor sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira jednu ili više aminokiselinskih sekvenci VL koje su izabrane iz grupe koja sadrži: SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109, 117, 125, 133, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176 i 178. ;[0129] U daljem izvođenju, ekspresioni vektor dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni region lakog lanca, teškog lanca ili oba lakog i teškog lanca antitela, npr. humanog antitela. ;[0130] Ekspresioni vektor u kontektu predmetnog pronalaska može biti bilo koji pogodan vektor, uključujući hromozomske, nehromozomske, i vektore sintetičke nukleinske kiseline (sekvenca nukleinske kiseline koja sadrži odgovarajući set ekspresionih kontrolnih elemenata). Primeri takvih vektora obuhvataju derivate SV40, bakterijske plazmide, fagnu DNK, bakulovirus, kvaščeve plazmide, vektore dobijene iz kombinacija plazmida i fagne DNK, i vektore virusnih nukleinskih kiselina (RNK ili DNK). U jednom izvođenju, nukleinska kiselina koja kodira anti-c-Met antitelo se sastoji iz golog vektora DNK ili RNK, uključujući, na primer, linearni ekspresioni element (kao što je opisano na primer u Sykes i Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)), kompaktni vektor nukleinske kiseline (kao što je opisano na primer u US 6,077, 835 i/ili WO 00/70087), plazmidni vektor kao što je pBR322, pUC 19/18, ili pUC 118/119, "midge" vektor nukleinske kiseline minimalne veličine (kao što je na primer opisano u Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)), ili kao istaloženi konstrukt vektora nukleinske kiseline, kao što je CaP04-istaloženi konstrukt (kao što je opisano u na primer WO 00/46147, Benvenisty i Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978), i Coraro i Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)). Takvi vektori nukleinske kiseline i njihova upotreba su dobro poznati u oblasti tehnike (videti na primer US 5,589,466 i US 5,973,972). ;;[0131] U jednom izvođenju, vektor je pogodan za ekspresiju anti-c-Met antitela u bakterijskoj ćeliji. Primeri takvih vektora obuhvataju ekspresione vektore kao što su BlueScript (Stratagene), pIN vektori (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989), pET vektori (Novagen, Madison WI) i slično). ;;[0132] Ekspresioni vektor može takođe ili alternativno biti vektor koji je pogodan za ekspresiju u kvaščevom sistemu. Može se koristiti bilo koji vektor koji je pogodan za ekspresiju u kvaščevom sistemu. Pogodni vektori uključuju, na primer, vektore koji sadrže konstitutivne ili inducibilne promotore kao što je alfa faktor, alkoholna oksidaza i PGH (reviewed in: F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987), i Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)). ;;[0133] Ekspresioni vektor može takođe ili alternativno biti vektor koji je pogodan za ekspresiju u sisarskim ćelijama, npr. vektor koji sadrži glutamin sintetazu kao markere za selekciju, kao što su vektori opisani u (Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10:169-175). ;;[0134] Nukleinska kiselina i/ili vektor može takođe sadržati sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu za lučenje/lokalizaciju, koja može ciljati polipeptid, kao što je polipeptid u nastajanju, u periplazmin prostor ili u medijumu ćelijske kulture. Takve sekvence su poznate u oblasti tehnike i obuhvataju lučenje vodećih ili signalnih peptida. ;;[0135] U ekspresionom vektoru iz pronalaska, nukleinske kiseline koje kodiraju anti-c-Met antitelo mogu sadržati ili biti povezane sa bilo kojim pogodnim promotorom, pojačivačem, i drugim elementima koji olakšavaju ekspresiju. Primeri takvih elemenata obuhvataju jake ekspresione promotore (npr., humani CMV IE promotor/pojačivač kao RSV, SV40, SL3-3, MMTV, i HIV LTR promotore), efikasne poli (A) terminacione sekvence, početak replikacije za proizvod plazmida u E. coli, gen za rezistenciju na antibiotike kao marker za selekciju, i/ili odgovarajuće mesto za kloniranje (npr., polilinker). Nukleinske kiseline mogu takođe sadržati inducibilni promotor za razliku od konstitutivnog promotora kao što je CMV IE. ;;[0136] U jednom izvođenju, ekspresioni vektor koji kodira anti-c-Met-antitelo može se pozicionirati u i/ili isporučiti u ćeliju domaćina ili životinju domaćina pomoću virusnog vektora. ;;[0137] U još daljem aspektu, pronalazak se odnosi na rekombinantnu eukariotsku ili prokariotsku ćeliju ćeliju domaćina, kao što je transfektom, koji proizvodi antitelo iz pronalaska kao što je ovde definisano. Primeri ćelija domaćina uključuju kvaščeve, bakterijske, i sisarske ćelije, kao što su CHO ili HEK ćelije. Na primer, u jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju koja sadrži stabilno integrisanu nukleinsku kiselinu u ćelijski genom koji sadrži sekvencu koja kodira za ekspresiju anti-c-Met antitela iz predmetnog pronalaska. U drugom uzvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju koja sadrži neintegrisanu nukleinsku kiselinu, kao što je plazmid, kozmid, fagemid, ili linearni ekspresioni element, koji sadrži sekvencu koja kodira za ekspresiju anti-c-Met antitela iz pronalaska. ;[0138] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na hibridom koji proizvodi antitelo pronalaska kako je ovde definisano. U još daljem aspektu, pronalazak se odnosi na transgenu neljudsku životinju ili biljku koja sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju ljudski teški lanac i ljudski laki lanac, pri čemu životinja ili biljka proizvodi antitelo pronalaska prema pronalasku. ;[0139] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju anti-c-Met antitela pronalaska, pomenuti postupak koji sadrži korake ;a) kultivisanje hibridoma ili ćelije domaćina prema pronalasku kao što je gore opisano, i ;b) prečišćavanje antitela pronalaska iz medijuma kulture. ;Kompozicije ;[0140] U daljem glavnom aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: -anti-c-Met antitela kao što je ovde definisano, i ;-farmaceutski prihvatljiv nosač. ;[0141] Farmaceutska kompozicija iz predmetnog pronalaska može da sadrži jedno antitelo ovog pronalaska. ;[0142] Farmaceutske kompozicije se mogu formulisati u skladu sa konvencionalnim postupcima kao što su one otkrivene u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može npr. uključuju razblaživače, punila, soli, pufere, deterdžente (npr. nejonski deterdžent, kao što je Tween-20 ili Tween-80), stabilizatore (npr. šećere ili aminokiseline bez proteina), konzervanse, sredstva za fiksiranje tkiva, solubilizatore i/ ili druge materijale pogodne za uključivanje u farmaceutsku kompoziciju. ;[0143] Farmaceutski prihvatljivi nosači obuhvataju sve pogodne rastvarače, disperzione medije, obloge, antibakterijske i gljivične agense, agense za izotoničnost, antioksidante i agense za odlaganje apsorpcije i slično koji su fiziološki kompatibilni sa jedinjenjem iz ovog pronalaska. Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama ovog pronalaska uključuju vodu, fiziološki rastvor, fiziološki rastvor puferovan fosfatom, etanol, dekstrozu, poliole (kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slično), i njihove pogodne mešavine, biljna ulja, koloidni rastvori karboksimetil celuloze, tragakant guma i injekcioni organski estri, kao što je etil oleat, i/ili različiti puferi. Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne prahove za ekstemporanu pripremu sterilnih rastvora ili disperzija za injekcije. Odgovarajuća tečnost se može održavati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom surfaktanata. ;[0144] Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska mogu takođe da sadrže farmaceutski prihvatljive antioksidanse, na primer (1) antioksidanse rastvorljive u vodi, kao što su askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slično; (2) antioksidansi rastvorljivi u ulju, kao što su askorbil palmitat, butilovani hidroksianizol, butilovani hidroksitoluen, lecitin, propil galat, alfa-tokoferol i slično; i (3) agensi za helatiranje metala, kao što su limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina i slično. ;[0145] Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe sadržati agense za izotoničnost, kao što su šećeri, polialkoholi, kao što su manitol, sorbitol, glicerol ili natrijum hlorid u kompozicijama. ;[0146] Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska mogu takođe da sadrže jedan ili više pomoćnih sredstava odgovarajućih za izabrani put primene kao što su konzervansi, sredstva za vlaženje, emulgatori, disperzioni agensi, konzervansi ili puferi, koji mogu da produže rok trajanja ili efikasnost farmaceutske kompozicije. Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu biti pripremljena sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implantate, transdermalne flastere i mikrokapsulirane sisteme za oslobađanje. Takvi nosači mogu uključivati želatin, gliceril monostearat, gliceril distearat, biorazgradive, biokompatibilne polimere kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina same ili sa voskom dobro poznatim u struci ili drugim materijalima. Postupci za pripremu takvih formulacija su generalno poznati stručnjacima u ovoj oblasti. ;;[0147] Sterilni rastvori za injekcije se mogu pripremiti ugradnjom aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka, npr. kao što je gore nabrojano, prema potrebi, praćeno sterilizacijom mikrofiltracijom. Generalno, disperzije se pripremaju ugradnjom aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke, npr. od gore nabrojanih. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, primeri postupaka pripreme su sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) koje daju prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilno filtriranog rastvora. ;;[0148] Stvarni nivoi doze aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama mogu da variraju tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna za postizanje željenog terapijskog odgovora za određenog pacijenta, kompoziciju i način primene, a da nije toksična za pacijenta. Odabrani nivo doze zavisiće od različitih farmakokinetičkih faktora, uključujući aktivnost određenih kompozicija iz ovog pronalaska koje se koriste, ili njihovog amida, načina davanja, vremena primene, brzine izlučivanja određenog jedinjenja koje se koristi, trajanja tretmana, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijale koji se koriste u kombinaciji sa određenim kompozicijama koje se koriste, starosti, pola, težine, stanja, opšteg zdravlja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se leči, i sličnih faktora dobro poznatih u medicinskoj umetnosti. ;;[0149] Farmaceutska kompozicija može biti za davanje bilo kojim pogodnim putem i načinom davanja. U jednom aspektu, farmaceutska kompozicija ovog pronalaska je za parenteralnu primenu. "Primenjen parenteralno" kako se ovde koristi označava načine primene osim enteralne i lokalne primene, obično injekcijom, i uključuje epidermalni, intravenski, intramuskularni, intraarterijski, intratekalni, intrakapsularni, intraorbitalni, intrakardijalni, intradermalni, intraperitonealni, transhetendinalni, subkutana, subkutikularna, intraartikularna, subkapsularna, subarahnoidalna, intraspinalna, intrakranijalna, intratorakalna, epiduralna i intrasternalna injekcija i infuzija. ;;[0150] U jednom izvođenju gde farmaceutska kompozicija je za davanje intravenozno ili subkuanoznom injekcijom ili infuzijom. ;;Upotrebe ;;[0151] Sve reference u opisu na postupke lečenja odnose se na antitelo, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ljudskog tela terapijom. ;;[0152] U daljem glavnom aspektu, pronalazak se odnosi na anti-c-Met antitelo pronalaska za upotrebu kao lek. ;[0153] Anti-c-Met antitela pronalaska mogu biti za upotrebu u brojne svrhe. Konkretno, antitela pronalaska mogu biti za upotrebu u lečenju različitih oblika kancera, uključujući metastatski kancer i refraktorni kancer. Takav kancer može biti HGF zavisan ili HGF nezavisan. ;;[0154] U jednom izvođenju, anti-c-Met antitela iz pronalaska su za upotrebu u lečenju oblika kancera izabranog iz grupe koju čine: kancera mokraćne bešike, kancera dojke, kancer grlića materice, holangiokarcinom, kolorektalni kancer, kancer endometrijuma, kancer jednjaka. kancer, kancera želuca, kancer glave i vrata, kancer bubrega, kancer jetre, kancer pluća (kao što je kancer ne-malih ćelija pluća (NSCLC)), kancer nazofarinksa, kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer žučne kese, kancer prostate i kancer štitne žlezde. ;;[0155] U drugom izvođenju, anti-c-Met antitela iz pronalaska su za upotrebu u lečenju oblika kancera izabranog iz grupe koju čine: osteosarkom, rabdomiosarkom i sinovijalni sarkom. ;;[0156] U drugom aspektu, anti-c-Met antitela prema pronalasku su za upotrebu u lečenju oblika kancera izabranog iz grupe koju čine: Kapošijev sarkom, lejomiosarkom, maligni fibrozni histiocitom i fibrosarkom. ;;[0157] U drugom izvođenju, anti-c-Met antitela iz ovog pronalaska su za upotrebu u lečenju hematopoetskih maligniteta, kao što je malignitet izabran iz grupe koju čine: akutna mijelogena leukemija, T ćelijska leukemija odraslih, hronična mijeloidna leukemija, limfom i multipli mijelom. ;;[0158] U sledećem izvođenju, anti-c-Met antitela pronalaska su za upotrebu u lečenju neoplazme izabrane iz grupe koju čine: glioblastom, astrocitom, melanom, mezoteliom i Vilmov tumor. ;;[0159] U sledećoj varijanti, anti-c-Met antitela pronalaska su za upotrebu u lečenju MiT tumora, uključujući sarkom svetlih ćelija (CCS), alveolarni sarkom mekih delova (ASPS) i karcinom bubrežnih ćelija povezan sa translokacijom. ;;[0160] U drugom izvođenju, agonistička anti-c-Met antitela pronalaska su za upotrebu u regulaciji proizvodnje citokina i indukcije mobilizacije endotelnih progenitorskih ćelija, npr. kod pacijenata sa koronarnom bolešću srca (Yang et al. (2009) Clin Exp Pharmacol Physiol.36:790). ;;[0161] Takođe su prikazana antagonistička anti-c-Met antitela za upotrebu u inhibiciji ili poboljšanju hronične bubrežne insuficijencije (Mizuno et al. (2008) Front Biosci.13:7072). ;;[0162] Pronalazak se odnosi na postupak za inhibiciju rasta i/ili proliferacije tumorske ćelije koja eksprimira c-Met, koji obuhvata davanje, pojedincu kome je to potrebno, efikasne količine antitela prema pronalasku. ;;[0163] U jednom izvođenju, pomenuta tumorska ćelija je uključena u oblik kancera odabranog iz grupe koju čine: kancer mokraćne bešike, kancer dojke, kancer grlića materice, holangiokarcinom, kolorektalni kancer, kancer endometrijuma, kancer jednjaka, kancer želuca, kancer glave i vrata, kancer bubrega, kancer jetre, kancer pluća, kancer nazofarinksa, kancera jajnika, kancer pankreasa, kancer žučne kese, kancer prostate, kancer štitne žlezde, osteosarkom, rabdomiosarkom, sinovijalni sarkom, Kapošijev sarkom, lejomiosarkom, maligni fibrozni histiocitom, fibrosarkom, akutna mijelogena leukemija, leukemija T ćelija odraslih, hronična mijeloidna leukemija, limfom, multipli mijelom, glioblastom, astrocitom, melanom, mezoteliom i Vilmov tumor. ;;[0164] Takođe, pronalazak se odnosi na upotrebu monoklonskog antitela koje se vezuje za humani c-Met za pripremu leka za lečenje kancera, kao što je jedna od gore navedenih specifičnih indikacija kancera. ;[0165] U jednom izvođenju, izbor pacijenata koji se leče anti-c-Met antitelom zasniva se na nivou (prekomerne)ekspresije c-Met i/ili HGF na relevantnim tumorskim ćelijama navedenih pacijenata. ;;[0166] U sledećem izvođenju postupci za lečenje predmetnog pronalaska, efikasnost lečenja se prati tokom terapije, npr. u unapred definisanim tačkama u vremenu, određivanjem nivoa ekspresije c-Met na relevantnim tumorskim ćelijama. ;;[0167] Režimi doziranja u gornjim metodama lečenja i upotrebe su prilagođeni da obezbede optimalan željeni odgovor (npr. terapijski odgovor). Na primer, može se primeniti jedan bolus, može se primeniti nekoliko podeljenih doza tokom vremena, ili doza može biti proporcionalno smanjena ili povećana kao što je naznačeno zahtevima terapijske situacije. Parenteralne kompozicije mogu biti formulisane u obliku jedinične doze radi lakše primene i uniformnosti doziranja. ;;[0168] Efikasne doze i režimi doziranja za anti-c-Met antitela zavise od bolesti ili stanja koje treba lečiti i mogu ih odrediti stručnjaci iz ove oblasti. Primerni, neograničavajući opseg za terapeutski efikasnu količinu jedinjenja iz ovog pronalaska je oko 0,1-100 mg/kg, kao što je oko 0,1-50 mg/kg, na primer oko 0,1-20 mg/kg, kao npr. oko 0,1-10 mg/kg, na primer oko 0,5, oko 0,3, oko 1, oko 3, oko 5 ili oko 8 mg/kg. ;;[0169] Lekar ili veterinar koji ima uobičajene veštine u ovoj oblasti može lako da odredi i prepiše efikasnu količinu potrebne farmaceutske kompozicije. Na primer, lekar ili veterinar bi mogao da započne sa dozama anti-c-Met antitela koje se koristi u farmaceutskoj kompoziciji na nivoima nižim od onih potrebnih da bi se postigao željeni terapeutski efekat i postepeno povećavao dozu dok se ne postigne željeni efekat. Uopšteno govoreći, pogodna dnevna doza kompozicije iz ovog pronalaska biće ona količina jedinjenja koja je najniža doza efikasna da proizvede terapeutski efekat. Administracija može npr. biti parenteralna, kao što je intravenozno, intramuskularno ili subkutano davanje. U jednom aspektu, anti-c-Met antitela mogu biti za primenu infuzijom u nedeljnoj dozi od 10 do 500 mg/m<2>, kao što je od 200 do 400 mg/m<2>. Takva primena se može ponoviti, na primer, 1 do 8 puta, kao što je 3 do 5 puta. Primena se može izvršiti kontinuiranom infuzijom u periodu od 2 do 24 sata, kao što je od 2 do 12 sati. U jednom aspektu, anti-c-Met antitela mogu biti za primenu sporom kontinuiranom infuzijom tokom dužeg perioda, kao što je više od 24 sata, da bi se smanjili toksični sporedni efekti. ;;[0170] U jednom aspektu, anti-c-Met antitela mogu biti za primenu u nedeljnoj dozi od 250 mg do 2000 mg, kao što je na primer 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg ili 2000 mg, do do 8 puta, na primer od 4 do 6 puta. Takav režim se može ponoviti jednom ili više puta po potrebi, na primer, nakon 6 meseci ili 12 meseci. Doziranje se može odrediti ili prilagoditi merenjem količine jedinjenja ovog pronalaska u krvi nakon davanja, na primer, uzimanjem biološkog uzorka i korišćenjem antiidiotipskih antitela koja ciljaju region koji se vezuje za antigen anti-c-Met antitela ovog pronalaska. ;;[0171] U jednom aspektu, anti-c-Met antitela mogu biti za primenu terapijom održavanja, kao što je, npr., jednom nedeljno tokom perioda od 6 meseci ili više. ;;[0172] Anti-c-Met antitelo takođe može biti za profilaktičku primenu kako bi se smanjio rizik od razvoja kancera, odložio početak pojave događaja u progresiji kancera i/ili smanjio rizik od ponovnog pojavljivanja kada je kancer u remisiji. ;;[0173] Anti-c-Met antitela mogu takođe biti za primenu u kombinovanoj terapiji, tj., u kombinaciji sa drugim terapijskim agensima relevantnim za bolest ili stanje koje se leči. Shodno tome, u jednom aspektu, lek koji sadrži antitelo je za kombinaciju sa jednim ili više daljih terapijskih agenasa, kao što je citotoksični, hemoterapeutski ili antiangiogeni agens. ;[0174] Takva kombinovana primena može biti simultana, odvojena ili sekvencijalna. Za istovremenu primenu, agensi se mogu davati kao jedna kompozicija ili kao odvojene kompozicije, prema potrebi. Ovo otkriće prema tome takođe obezbeđuje metode za lečenje poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju c-Met kao što je gore opisano, a koji postupci obuhvataju davanje anti-c-Met antitela opisanog ovde u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapijskih agenasa kao što je opisano u nastavku. ;;[0175] Predmetni pronalazak takođe opisuje postupak za lečenje poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimuju c-Met kod subjekta, gde postupak obuhvata davanje terapijski efikasne količine anti-c-Met antitela opisanog ovde i najmanje jednog dodatnog terapijskog agensa subjektu kome je to potrebno. ;;[0176] Predmetni prikaz takođe opisuje postupak za lečenje ili prevenciju kancera, gde postupak obuhvata davanje terapijski efikasne količine anti-c-Met antitela opisanog ovde i najmanje jednog dodatnog terapijskog agensa subjektu kome je to potrebno. ;;[0177] U jednom aspektu, takav dodatni terapeutski agens može biti izabran između antimetabolita, kao što je metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, fludarabin, 5-fluorouracil, dekarbazin, hidroksiurea, asparaginaza, gemcitabin ili kladribin. ;;[0178] U drugom izvođenju, takav dodatni terapeutski agens može da se izabere od agensa za alkilovanje, kao što je mehloretamin, tioepa, hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU), lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, dakarbazin (DTIC), prokarbazin, mitomicin C, cisplatin i drugi derivati platine, kao što je karboplatin. ;;[0179] U drugom izvođenju, takav dodatni terapijski agens može biti odabran od anti-mitotičkog agensa, kao što su taksani, na primer docetaksel, i paklitaksel, i vinka alkaloidi, na primer vindesin, vinkristin, vinblastin, i vinorelbin. ;;[0180] U drugom izvođenju, takav dodatni terapijski agens može se odabrati od inhibitora topoizomeraze, kao što je topotekan ili irinotekan, ili citostatski lek, kao što je etopozid i tenipozid. ;;[0181] U drugom izvođenju, takav dodatni terapijski agens može se odabrati od inhibitora faktora rasta, kao što je ErbB1 (EGFR) (kao što je anti-EGFR antitelo, npr. zalutumumab, cetuksimab, panitumumab ili nimotuzumab ili drugi inhibitori EGFR, kao što su gefitinib ili erlotinib), inhibitor ErbB2 (Her2/neu) (kao što je anti-HER2 antitelo, npr. trastuzumab, trastuzumab-DM1 ili pertuzumab) ili inhibitor oba EGFR i HER2, kao što je lapatinib). ;;[0182] U drugom izvođenju, takav dodatni terapijski agens može biti odabran iz tirozin kinaznog inhibitora, kao što je imatinib (Glivec, Gleevec STI571) ili lapatinib, PTK787/ZK222584. ;;[0183] Predmetni prikaz takođe opisuje postupak za lečenje poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimuju c-Met u subjektu, gde postupak sadrži davanje terapijski efikasne količine anti-c-Met antitela iz predmetnog prikaza i najmanje jednog inhibitora angiogeneze, neovaskularizacije, i/ili druga vaskularizacija subjektu kome je to potrebno. ;;[0184] Primeri takvih inhibitora angiogeneze su inhibitori urokinaze, inhibitori matriksne metaloproteinaze (kao što je marimastat, neovastat, BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 i slični agensi), inhibitori migracije i proliferacije endotelnih ćelija (kao što su TNP-470, skvalamin, 2-metoksiestradiol, kombretastatini, endostatin, angiostatin, penicilamin, SCH66336 (Schering-Plough Corp, Madison, NJ), R115777 (Janssen Pharmaceutica, Inc, Titusville, NJ) i slični agensi), antagonisti angiogenih faktora rasta (kao što su kao što su ZD6474, SU6668, antitela protiv angiogenih agensa i/ili njihovi receptori (kao što su VEGF (npr. bevacizumab), bFGF, i angiopoietin-1), talidomid, analozi talidomida (kao što su CC-5013), Sugen 5416, SU5402, antiangiogeni ribozim (kao što je angiozim), interferon α (kao što je interferon a2a), suramin i slični agensi), VEGF-R kinazni inhibitori i drugi antiangiogeni tirozin kinazni inhibitori (kao što su SU011248), inhibitori endotelno-specifična signalizacija integrina/preživljavanja (kao što je vitaksin i slični agensi), antagonisti/helatori bakra (kao što su tetratiomolibdat, kaptopril i slični agensi), karboksiamido-triazol (CAI), ABT-627, CM101, interleukin-12 (IL-12), IM862, PNU145156E kao i nukleotidni molekuli koji inhibiraju angiogenezu (kao što je antisens-VEGF-cDNK, cDNK koja kodira angiostatin, cDNK koja kodira p53 i cDNK koja kodira deficijentni VEGF receptor-2). ;;[0185] Drugi primeri takvih inhibitora angiogeneze, neovaskularizacija, i/ili druge vaskularizacije su antiangiogeni derivati heparina (npr. eparinaza III), temozolomid, NK4, faktor inhibitora migracije makrofaga, inhibitori ciklooksigenaze-2, inhibitori faktora 1 induciranog hipoksijom, antiangiogeni sojini izoflavoni, oltipraz, fumagilin i njegovi analozi, analozi somatostatina, pentosan polisulfat, tekogalan natrijum, dalteparin, tumstatin, trombospondin, NM-3, kombrestatin, kanstatin, avastatin, antitela protiv drugih meta, kao što su anti-alfa-v/beta-3 integrin i anti-kininostatin antitela. ;;[0186] U jednom izvođenju, terapijski agens za upotrebu u kombinaciji sa anti-c-Met antitelom za lečenje poremećaja kao što je gore opisano može biti immunogen protiv kancera, kao što je antigen kancera/tumor-povezani antigen (npr., molekul adhezije epitelnih ćelija (EpCAM/TACSTD1), mucin 1 (MUC1), karcinoembrionalni antigen (CEA), tumor-povezani glikoprotein 72 (TAG-72), gp100, Melan-A, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7, virusne vakcine povezane sa kancerom (npr., vakcine protiv humanog papilomavirusa) ili proteini toplotnog šoka dobijeni od tumora, ;;[0187] U jednom izvođenju, terapijski agens za upotrebu u kombinaciji sa anti-c-Met antitelom za lečenje poremećaja kao što je gore opisano može biti citokin protiv kancera, hemokin, ili njihova kombinacija. Primeri pogodnih citokina i faktora rasta obuhvataju IFNγ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNα (e.g., INFa2b), IFNβ, GM-CSF, CD40L, Flt3 ligand, faktor matičnih ćelija, ancestim, i TNFα. Pogodni hemokini mogu sadržati Glu-Leu-Arg (ELR)-negativne hemokine kao što su IP-10, MCP-3, MIG, i SDF-1a od humanih familija hemokina CXC i C-C. Pogodni citokini sadrže derivate citokina, varijante citokina, fragmente citokina, i fuzione proteine citokina. ;;[0188] U jednom izvođenju, terapijski agens za upotrebu u kombinaciji sa anti-c-Met antitelom za lečenje poremećaja kao što je gore opisano može biti regulator kontrole ćelijskog ciklusa/apoptoze (ili "regulacioni agens"). Regulator kontrole ćelijskog ciklusa/apoptoze može uključiti molekule koji ciljaju i moduliraju regulatore kontrole ćelijskog ciklusa/apoptoze kao što su (i) cdc-25 (kao što je NSC 663284), (ii) ciklin-zavisne kinaze koje prekomerno stimulišu ćelijski ciklus (kao što je flavopiridol (L868275, HMR1275), 7-hidroksistaurosporin (UCN-01, KW-2401), i roskovitin (R-roskovitin, CYC202)), i (iii) modulatori telomeraze (kao što su BIBR1532, SOT-095, GRN163 i kompozicije koje su opisane na primer u US 6,440,735 i US 6,713,055). Neograničavajući primeri molekula koji interferiraju sa apoptotskim putevima uključuju TNF-srodni ligand za indukciju apoptoze (TRAIL)/apoptoza-2 ligand (Apo-2L), antitela koja aktiviraju receptore TRAIL, IFN, □ i anti-sens□ Bcl-2. ;;[0189] U jednom izvođenju, terapijski agens za upotrebu u kombinaciji sa anti-c-Met antitelom za lečenje poremećaja kao što je gore opisano može biti hormonski regulacioni agens, kao što su agensi korisni za terapiju protiv androgena i estrogena. Primeri takvih hormonskih regulacionih agenasa su tamoksifen, idoksifen, fulvestrant, droloksifen, toremifen, raloksifen, dietilstilbestrol, etinil estradiol/estinil, antiandrogen (kao što je flutamind/euleksin), progestin (kao što je progesteron hidroksiat kao što je npr. progesteron/provera, megestrol acepat/megace), adrenokortikosteroid (kao što je hidrokortizon, prednizon), hormon koji oslobađa luteinizirajući hormon (i njegovi nalogi i drugi LHRH agonisti kao što su buserelin i goserelin), inhibitor aromataze (kao što je anastrazol/ari). aminoglutetimid/citraden, eksemestan) ili inhibitor hormona (kao što je oktreotid/sandostatin). ;;[0190] U jednom izvođenju, terapijski agens za upotrebu u kombinaciji sa anti-c-Met antitelom za lečenje poremećaja kao što je ovde opisano može biti anti-anergični agens, kao što su jedinjenja koja blokiraju aktivnost CTLA-4, npr., ipilimumab. ;;[0191] U jednom izvođenju, terapijski agens za upotrebu u kombinaciji sa anti-c-Met antitelom za lečenje poremećaja kao što je gore opisano može biti nukleinska kiselina protiv kancera ili inhibitorni molekul RNK protiv kancera. ;;[0192] Primeri drugih agenasa protiv kancera, koji mogu biti relevantni kao terapijski agensi za upotrebu u kombinaciji sa anti-c-Met antitelom za lečenje poremećaja kao što su gore opisani su agensi za idukciju diferencijacije, analozi retinoinske kiseline (kao što je sve trans retinoinska kiselina, 13-cis retinoinska kiselina i slični agensi), analozi vitamina D (kao što je seokalcitol i slični agensi), inhibitori ErbB3, ErbB4, IGF-IR, insulinski receptor, PDGFRa, PDGFRbeta, Flk2, Flt4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, TRKA, TRKC, RON (kao što je anti-RON antitelo), Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, Alk, LTK, PTK7 i slični agensi. ;;[0193] Primeri drugih agenasa protiv kancera, koji mogu biti relevantni kao terapijski agensi za upotrebu u kombinaciji sa anti-c-Met antitelom za lečenje poremećaja kao što je gore opisano su estramustin i epirubicin. ;;[0194] Primeri drugih agenasa protiv kancera, koji mogu biti relevantni kao terapijski agensi za upotrebu u kombinaciji sa anti-c-Met antitelom za lečenje poremećaja kao što su gore opisani su HSP90 inhibitor sličan 17-alil amino geld-anamicin, antitela usmerena protiv tumorskog antigena kao što je PSA, CA125, KSA, integrini, npr., integrin β1, ili inhibitori VCAM. ;;[0195] Primeri drugih agenasa protiv kancera, koji mogu biti relevantni kao terapijski agensi za upotebu u kombinaciji sa anti-c-Met antitelom za lečenje poremećaja kao što je gore opisano su inhibitori kalcineurina (kao što je valspodar, PSC 833 i drugi MDR-1 ili inhibitori p-glikoproteina), inhibitori TOR-a (kao što su sirolimus, everolimus i rapamicin). i inhibitori mehanizama "usmeravanja limfocita" (kao što su FTY720), i agensi sa efektima na ćelijsku signalizaciju kao što su inhibitori molekula adhezije (na primer anti-LFA). ;;[0196] U jednom izvođenju, anti-c-Met antitelo iz pronalaska je za upotrebu u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapijskih antitela, kao što je ofatumumab, zanolimumab, daratumumab, ranibizumab, Zenapaks, Simulekt, Remikade, Humira, Tysabri, Xolair, raptiva i/ili rituksimab. ;;[0197] Druga terapijska antitela koja se mogu koristiti u kombinaciji sa antitelom iz predmetnog pronalaska su anti-c-Met antitela koja se vežu za druge regione c-Met, kao što su antitela opisana u WO2005016382, WO2006015371, WO2007090807, WO2007126799 ili WO2009007427. ;;[0198] Dalje prikazana, dva ili više ovde opisana različita antitela se mogu koristiti u kombinaciji za lečenje bolesti. Posebno zanimljive kombinacije uključuju dva ili više antitela koja nisu u kompeticiji. Takva kombinovana terapija može dovesti do vezivanja povećanog broja molekula antitela po ćeliji, koji mogu dati povećanu efikasnost, npr. pomoću aktivacije komplementom posredovane lize. ;;[0199] Pored gore navedenog, drugi primeri kombinovanih terapija iz prikaza uključuju sledeće: ;;● Za lečenje kancera pluća ne-malih ćelija, anti-c-Met antitelo u kombinaciji sa inhibitorima EGFR, kao što je anti-EGFR antitelo, npr. zalutumumab, cetuksimab, panitumumab ili nimotuzumab ili drugi EGFR inhibitori, kao što su gefitinib ili erlotinib), ili u kombinaciji sa inhibitorom ErbB2 (Her2/neu) (kao što je anti-HER2 antitelo, npr. trastuzumab, trastuzumab-DM1 ili pertuzumab) ili u kombinaciji sa inhibitorom oba EGFR i HER2, kao što je lapatinib, ili u kombinaciji sa inhibitorom HER3 inhibitorom. ;;● Za lečenje glioma, anti-c-Met antitelo u kombinaciji sa temozolomidom ili inhibitorom angiogeneze, kao što je bevacizumab. ;;● Za lečenje kolorektalnog karcinoma anti-c-Met antitelo u kombinaciji sa jednim ili više jedinjenja izabranih između: gemcitabin, bevacizumab, FOLFOX, FOLFIRI, XELOX, IFL, oksaliplatin, irinotekan, 5-FU/LV, kapecitabin, UFT, sredstva koja ciljaju EGFR, kao što je cetuksimab. panitumumab, zalutumumab; inhibitori VEGF ili inhibitori tirozin kinaze kao što je sunitinib. ;;● Za lečenje kancera prostate anti-c-Met antitelo u kombinaciji sa jednim ili više jedinjenja odabranih između: hormonske/antihormonske terapije; kao što su antiandrogeni, agonisti hormona oslobađanja luteinizirajućeg hormona (LHRH) i hemoterapeutici kao što su taksani, mitoksantron, estramustin, 5FU, vinblastin, iksabepilon, ;;Terapija zračenjem - operacija ;;[0200] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-c-Met antitelo iz predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju c-Met kod subjekta, gde postupak obuhvata davanje terapijski efikasne količine anti-c-Met antitela, i terapije zračenjem subjektu kome je potrebna. ;;[0201] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-c-Met antitelo ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije kancera, koji postupak obuhvata davanje terapeutski efikasne količine anti-c-Met antitela i terapiju zračenjem subjektu kome je to potrebno. ;;[0202] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu anti-c-Met antitela, kao što je anti-c-Met antitelo ovog pronalaska, za pripremu farmaceutske kompozicije za lečenje kancera koja se primenjuje u kombinaciji sa terapijom zračenjem. ;;[0203] Terapija zračenjem može uključivati zračenje ili je obezbeđeno povezano davanje radiofarmaceutika pacijentu. Izvor zračenja može biti spoljašnji ili unutrašnji za pacijenta koji se leči (tretman zračenjem može, na primer, biti u obliku terapije eksternim zračenjem (EBRT) ili brahiterapije (BT)). Radioaktivni elementi koji se mogu koristiti u praksi takvih postupaka uključuju, npr., radijum, cezijum-137, iridijum-192, americijum-241, zlato-198, kobalt-57, bakar-67, tehnecijum-99, jodid-123, jodid- 131 i indijum-111. ;;[0204] U daljem izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-c-Met antitelo ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije kancera, pri čemu postupak obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno terapeutski efikasne količine anti-c-Met antitela, u kombinaciji sa operacijom. ;Diagnostičke upotrebe ;;[0205] Anti-c-Met antitela pronalaska mogu takođe biti za upotrebu u dijagnostičke svrhe. Prema tome, u daljem aspektu, pronalazak se odnosi na dijagnostičku kompoziciju koja sadrži anti-c-Met antitelo kako je ovde definisano. ;;[0206] U jednom izvođenju, anti-c-Met antitela iz ovog pronalaska mogu se koristiti in vitro za dijagnostikovanje bolesti u kojima aktivirane ćelije koje eksprimiraju c-Met igraju aktivnu ulogu u patogenezi, otkrivanjem nivoa c-Met, ili nivoa ćelija koji sadrže c-Met na svojoj površini membrane. Ovo se može postići, na primer, kontaktiranjem uzorka koji treba da se testira, opciono zajedno sa kontrolnim uzorkom, sa anti-c-Met antitelom pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela i c-Met. U drugom izvođenju, anti-c-Met antitela iz ovog pronalaska mogu biti za upotrebu u in vivo dijagnostičkim postupcima. ;;[0207] Dakle, u daljem aspektu, pronalazak se odnosi na in vitro postupak za detekciju prisustva c-Met antigena, ili ćelije koja eksprimira c-Met, u uzorku koji sadrži: ;;-dovođenje u kontakt uzorka sa anti-c-Met antitelom pronalaska pod uslovima koji omogućavaju nastajanje kompleksa između antitela i c-Met; i ;;- analiziranje da li je formiran kompleks. ;;[0208] Određenije, ovaj pronalazak obezbeđuje in vitro postupke za identifikaciju i dijagnozu invazivnih ćelija i tkiva, i drugih ćelija ciljanih anti-c-Met antitelima iz ovog pronalaska, i za praćenje napretka terapijskih tretmana, statusa posle lečenja, rizika od razvoja kancera, progresije kancera i slično. ;;[0209] Pogodni obeleživači za anti-c-Met antitelo i/ili sekundarna antitela koja su korišćena u takvim tehnikama su dobro poznati u oblasti tehnike. ;;[0210] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na komplet za detekciju prisustva antigena c-Met, ili ćelije koja eksprimuje c-Met, u uzorku koji sadrži: ;;-anti-c-Met bispecifični molekul iz pronalaska; i ;;-uputstva za upotrebu kompleta. ;;[0211] U jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje komplet za dijagnozu kancera koji se sastoji od kontejnera koji sadrži anti-c-Met antitelo i jedan ili više reagensa za detekciju vezivanja anti-c-Met antitela za c-Met. Reagensi mogu uključivati, na primer, fluorescentne oznake, enzimske oznake ili druge oznake koje se mogu detektovati. Reagensi mogu takođe uključiti sekundarna ili tercijarna antitela ili reagense za enzimske reakcije, pri čemu enzimske reakcije proizvode proizvod koji se može vizuelizovati. ;;Anti-idiotipska antitela ;;[0212] U daljem aspektu, otkrivanje se odnosi na anti-idiotipsko antitelo koje se vezuje za anti-c-Met antitelo pronalaska kao što je ovde opisano. ;;[0213] Anti-idiotipsko (Id) antitelo je antitelo koje prepoznaje jedinstvene determinante generalno povezane sa mestom vezivanja antigena antitela. Id antitelo se može pripremiti imunizacijom životinje iste vrste i genetičkog tipa kao izvora anti-c-Met mAt sa mAt za koje se priprema anti-Id. Imunizovana životinja tipično može prepoznati i odgovoriti na idiotipske determinante imunizujućeg antitela tako što proizvodi antitelo na ove idiotipske determinante (anti-Id antitelo). ;;[0214] Anti-Id antitelo se takođe može koristiti kao "imunogen" da se izazove imuni odgovor kod još jedne životinje, proizvodeći takozvano anti-anti-Id antitelo. Anti-anti-Id može biti epitopski identičan originalnom mAt, koji je indukovao anti-Id. Dakle, korišćenjem antitela na idiotipske determinante mAt, moguće je identifikovati druge klonove koji eksprimiraju antitela identične specifičnosti. ;;[0215] Predmetni pronalazak je dalje ilustrovan sledećim primerima koji ne bi trebalo da se tumače kao dodatno ograničavajućim. ;PRIMERI ;;Primer 1: Ekspresioni konstrukti za c-Met ;;[0216] Generisani su kodon-optimizovani konstrukti za ekspresiju c-Met, ekstracelularnog domena (ECD) (aa 1-932 i C-terminalni His6 oznaka ili SEMA domen c-Met (aa 1-567 i C-terminalni His9 oznaka), u HEK ili CHO ćelijama. Proteini kodirani ovim konstruktima su identični Genbank pristupnom NM 000245 za c-Met. Konstrukti su sadržali pogodna restrikciona mesta za kloniranje i optimalnu Kozak sekvencu (Kozak et al. (1999) Gene 234: 187-208). Konstrukti su klonirani u vektoru ekspresije sisara pEE13.4 (Lonza Biologics) (Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10:169-175), dobijajući pEE13.4cMet, pEE13.4cMetECDHis i pEE13.4cMetSEMA-567His8. ;;Primer 2: Ekspresioni konstrukti za 5D5v1, 5D5 i G11-HZ ;;[0217] Generisani su kodon optimizovani konstrukti za ekspresiju teškog lanca (HC) i lakog lanca (LC) IgG1 antitela 5D5v1, 5D5 and G11-HZ u HEK ćelijama. Proteini kodirani ovim konstruktima su identični onima koji su opisani u US patentu 6468529 (brojevi sekvence 3 i 4) za 5D5v1 teški lanac i laki lanac, WO 2006/015371 A2 (slika 13) za 5D5 teški lanac i laki lanac i WO 2009/007427 A2 (sekvenca je izvučena iz više slika) za teški i laki 224G11 lanac.224G11 se takođe ovde naziva G11-HZ. ;;Primer 3: Prolazna ekspresija u HEK-293F ćelijama ;;[0218] Freestyle<™>293-F (HEK-293 subklon prilagođen rastu suspenzije i hemijski definisanom Freestyle medijumu, (HEK-293F)) ćelije su dobijene od Invitrogena i transfektovane odgovarajućom plazmidnom DNK, koristeći 293fectin (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. Ekspresija c-Met je testirana pomoću FACS analize kao što je opisano u nastavku. U slučaju ekspresije antitela, odgovarajući vektori ekspresije teškog i lakog lanca su zajedno eksprimirani. ;;Primer 4: Prolazna ekspresija u CHO ćelijama ;;[0219] pEE13.4cMet je prolazno transfektovan u Freestyle<™>CHO-S (Invitrogen) ćelijskoj liniji koristeći Freestyle MAX transfekcioni reagens (Invitrogen). Ekspresija c-Met je testirana pomoću FACS analize kao što je dole opisano. ;;Primer 5: Kloniranje i ekspresija monovalentnih antitela (UniBody<®>molekuli) ;;[0220] Za ekspresiju monovalentnih antitela u ćelijama sisara, HC konstantni region IgG4, kojem nedostaje zglobni region (Ch) (aminokiseline E99-P110) i koji sadrži 2 mutacije F405T i Y407E u CH3 regionu, sintetizovan je kao konstrukt optimizovan za kodon u vektoru ekspresije sisara pcDNA3.3 (Invitrogen) i nazvan pUniTE. Odvojeni vektor je konstruisan umetanjem kodonom optimizovanog konstantnog regiona humanog regiona kapa regiona lakog lanca u pcDNA3.3 i nazvan pKappa. ;;[0221] Relevantni VH i VL regioni su umetnuti redom u pUniTE i pKappa, što je rezultiralo vektorima za ekspresiju teških i lakih lanaca specifičnih antitela. Zajednička transfekcija vektora teškog i lakog lanca specifičnog antitela u ćelijama HEK-293F (Invitrogen), rezultirala je prolaznom proizvodnjom monovalentnih antitela sa željenim specifičnostima. Prečišćavanje je izvedeno korišćenjem hromatografije na koloni sa afinitetom za protein A. (kao što je opisano u Primeru 11). ;;Primer 6: Prečišćavanje His-označenog c-Met ;;[0222] cMetECDHis i cMetSEMAHis su eksprimirani u HEK-293F ćelijama. His-oznaka u cMetECDHis i cMet-SEMAHis omogućava prečišćavanje afinitetnom hromatografijom sa imobilisanim metalnim jonima. U ovom procesu, helator fiksiran na hromatografskoj smoli se puni sa Co<2+>katjonima. Supernatanti koji sadrže cMetECDHis i cMetSEMAHis su inkubirani sa smolom u šaržnom režimu (tj. ;rastvor). His-označeni protein se snažno vezuje za kuglice smole, dok se drugi proteini prisutni u supernatantu kulture ne vezuju snažno. Nakon inkubacije, kuglice se izvlače iz supernatanta i pakuju u kolonu. Kolona se ispere da bi se uklonili slabo vezani proteini. Snažno vezani cMetECDHis i cMetSEMAHis proteini se zatim eluiraju sa puferom koji sadrži imidazol, koji je u kompeticiji sa vezivanjem His-a za Co<2+.>Eluent se uklanja iz proteina razmenom pufera na koloni za odsoljavanje. ;;Primer 7: Postupak imunizacije na transgenim miševima ;;[0223] Antitela 005, 006, 007, 008, 011, 012, 016, 017, 022, 024, 035, 039, 040, 045, 093, 095, 096, 101, 095, 096, 101 i 104 izvedeni su iz sledećih imunizacija : jedan HCo20 miš (1 ženka, soj GG2713), jedan miš HCo17 (ženka, soj GG2714) i dva miša HCo12-Balb/C (2 ženke, soj GG2811) (Medarex, San José, Kalifornija, SAD; za reference vidi paragraf o HuMab mišu iznad, WO2009097006 i US2005191293) su imunizovani svake dve nedelje naizmenično sa 5x10<6>NCI-H441 tumorskih ćelija intraperitonealno (IP) i 20 µg cMetECDHis proteina spojenog na hapten Keyhole Limpet Hemocijanin (KLH) subkutanozno (SC). ;;[0224] Antitela 058, 061, 062, 063, 064, 065, 066, 068, 069, 078, 082, 084, 087, 089, 098 i 181 izvedena su iz sledećih imunizacija: dva HCo20 miša (1 mužjak i 1 ženka, soj GG2713) i jedan miš HCo12-Balb/C (1 mužjak, soj GG2811) (Medarek, San José, Kalifornija, SAD; za reference pogledajte odlomak o HuMab mišu iznad) imunizovani su svake dve nedelje naizmenično sa 5x10<6>CHO-K1SV ćelija prolazno transfektovanih sa cMetECD intraperitonealno (IP) i 20 µg cMetECDHis proteina spojenog na hapten Keyhole Limpet hemocijanin (KLH) subkutanozno (SC). ;;[0225] Urađeno je najviše osam imunizacija po mišu, četiri IP i četiri SC imunizacije na bazi repa. Prva imunizacija ćelijama urađena je u kompletnom Frojndovom adjuvansu (CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, SAD). Za sve ostale imunizacije, ćelije su ubrizgane IP u PBS, a cMetECD spojen sa KLH je ubrizgan SC koristeći nepotpuni Freundov adjuvans (IFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, SAD). Miševi sa najmanje dva uzastopna titra c-Met specifičnih antitela od 200 (razblaženja seruma od 1/200) ili više, detektovani u FMAT testu za skrining za antigen, kao što je opisano u Primeru 8, su spojeni. ;Primer 8: Homogeni test za skrining specifičnog antigena ;;[0226] Prisustvo anti-c-Met antitela u serumima imunizovanih miševa ili HuMab (humano monoklonsko antitelo) hibridoma ili supernatanta kulture transfektoma određeno je homogenim testovima skrininga specifičnim za antigen (četiri kvadranta) korišćenjem Fluorometric Micro volume Assay Technology (FMAT; Applied Biosistems,). Foster City, Kalifornija, SAD). Za ovo je korišćena kombinacija od 3 testa zasnovana na ćelijama i jednog testa zasnovanog na zrncima. U testovima zasnovanim na ćelijama, određeno je vezivanje za TH1016-cMet (HEK-293F ćelije koje prolazno eksprimiraju ekstracelularni domen c-Met receptora; proizvedeno kao što je gore opisano) i HT29 (koji eksprimiraju c-Met na površini ćelije) kao i HEK293 ćelije divljeg tipa (negativna kontrola koja ne eksprimuje c-Met). Za test zasnovan na zrncima, određeno je vezivanje za SB1016-cMet (cMetECDH je dobijen iz prolazno transfektovanih ćelija HEK-293F kao što je gore opisano, biotinilovanih i spojenih sa zrncima obloženim streptavidinom). Uzorci su dodati ćelijama/zrncima da bi se omogućilo vezivanje za c-Met. Nakon toga, vezivanje HuMab-a je detektovano korišćenjem fluorescentnog konjugata (Kozji anti-Humani IgG-Cy5; Jackson ImmunoResearch). Himerično c-Met specifično antitelo 5D5v1 (proizvedeno u ćelijama HEK-293F) je korišćeno kao pozitivna kontrola, a serum HuMab-miša i HuMab-KLH su korišćeni kao negativne kontrole. Uzorci su skenirani korišćenjem Applied Biosystems 8200 Cellular Detection Sistem (8200 CDS) i „broj x fluorescencija“ je korišćena kao očitavanje. Uzorci su konstatovani kao pozitivni kada je broj bio veći od 50, a broj x fluorescencija je bio najmanje tri puta veći od negativne kontrole HuMab-KLH. ;Primer 9: Dobijanje hibridoma HuMab ;;[0227] HuMab miševi sa dovoljnim razvojem titra specifičnog za antigen (definisan kao gore) su žrtvovani i sakupljeni su slezina i limfni čvorovi koji okružuju abdominalnu aortu i šuplju venu. Fuzija splenocita i ćelija limfnih čvorova na ćelijsku liniju mijeloma miša je urađena elektrofuzijom korišćenjem CEEF 50 elektrofuzionog sistema (Cyto Pulse Sciences, Glen Burnie, MD, SAD), u suštini prema uputstvima proizvođača. Fuzione ploče su pregledane testom specifičnog vezivanja za antigen kao što je gore opisano, a pozitivni rezultati ovog testa su testirani u ERK-fosforilacionom Alphascreen® SureFire® testu i oktet testu rangiranja afiniteta kao što je opisano u nastavku. Antitela 031, 035, 087 i 089 su proširena i kultivisana na osnovu standardnih protokola (npr. kako je opisano u Coligan J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. and Strober, W., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006). ;;[0228] Paralelno antitela 005, 006, 007, 008, 011, 012, 016, 017, 022, 024, 025, 028, 035, 039, 040, 045, 058, 026, 06, 06, 06, 068, 069, 078, 082, 084, 093, 095, 096, 098, 101, 104 i 181 su klonirana korišćenjem ClonePix sistema (Genetix, Hampshire, UK). Specifični hibridomi primarnih bunarića su zasejani u polučvrstu podlogu napravljenu od 40% CloneMedia (Genetix, Hampshire, UK) i 60% HyQ 2x kompletnog medija (Hyclone, Waltham, USA) i odabrano je približno 100 podklonova svakog primarnog bunarića. Podklonovi su ponovo testirani u testu specifičnog vezivanja za antigen kao što je prethodno opisano, a nivoi IgG su mereni korišćenjem Octet-a da bi se odabrao najbolji specifični i produkcijski klon po primarnom bunariću za dalju ekspanziju. Dalja ekspanzija i kultivisanje rezultujućih HuMab hibridoma je urađena na osnovu standardnih protokola (npr. kako je opisano u Coligan J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. and Strober, W., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006). ;;Primer 10: Masena spektrometrija prečišćenih antitela ;;[0229] Mali alikvoti antitela od 0,8 ml koji sadrže supernatant hibridoma iz stadijuma sa 6 bunarića ili Hyperflask prečišćeni su korišćenjem PhyTip kolona koje sadrže Protein G smolu (PhyNexus Inc., San Jose, SAD) na radnoj stanici Sciclone ALH 3000 (Caliper Lifesciences, SAD, Hopkin). PhyTip kolone su korišćene prema uputstvima proizvođača, ali su puferi zamenjeni: vezujući pufer PBS (B. Braun, Medical B.V., Oss, Holandija) i elucioni pufer 0,1 M glicin-HCl pH 2,7 (Fluka Riedel-de Haën, Buchs, Nemačka). Posle prečišćavanja, uzorci su neutralizovani sa 2M Tris-HCl pH 9,0 (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Holandija). Alternativno, u nekim slučajevima veće zapremine supernatanta kulture su prečišćene korišćenjem hromatografije na koloni sa afinitetom za protein A. ;;[0230] Nakon prečišćavanja, uzorci su stavljeni u ploču sa 384 bunarića (Waters, 100 ul ploča sa kvadratnim bunarićem, deo # 186002631). Uzorci su deglikozilovani preko noći na 37°C sa N-glikozidazom F. Dodan je DTT (15 mg/mL) (1 µl/bunariću) i inkubiran 1 h na 37°C. Uzorci (5 ili 6 ul) su odsoljeni na Acquity UPLC™ (Waters, Milford, SAD) sa BEH300 C18, 1,7 µm, 2,1 x 50 mm kolonom na 60 °C. MQ voda i acetonitril LC-MS kvaliteta (Biosolve, kat. br.01204101, Valkensward, Holandija) sa obe 0,1% mravlje kiseline (Fluka, kat. br.56302, Buchs, Nemačka), korišćeni su kao Eluens A i B, redom. “Time-of-flight” maseni spektri jonizacije elektrosprejom su snimljeni on-line na micrOTOF™ masenom spektrometru (Bruker, Bremen, Nemačka) koji radi u režimu pozitivnih jona. Pre analize, skala od 900-3000 m/z je kalibrisana ES mešavinom za podešavanje (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Maseni spektri su dekonvolucionisani pomoću softvera DataAnalysis<™>v. 3.4 (Bruker) korišćenjem algoritma maksimalne entropije tražeći molekularne težine između 5 i 80 kDa. ;;[0231] Posle dekonvolucije, dobijene mase teškog i lakog lanca za sve uzorke su upoređene da bi se pronašla duplirana antitela. U poređenju teških lanaca uzeto je u obzir moguće prisustvo C-terminalnih varijanti lizina. Ovo je rezultiralo spiskom jedinstvenih antitela, gde se jedinstveno definiše kao jedinstvena kombinacija teških i lakih lanaca. U slučaju da su pronađena duplicirana antitela, rezultati drugih testova su korišćeni da bi se odlučilo koje je antitelo najbolji materijal za nastavak eksperimenata. ;;Primer 11: Analiza sekvence varijabilnih domena anti-c-Met antitela i kloniranje u ekspresionim vektorima ;;[0232] Ukupna RNK anti-c-Met HuMabs-a je pripremljena od 5x10<6>hibridomskih ćelija, a 5'-RACE-komplementarna DNK (cDNK) je pripremljena od 100 ng ukupne RNK, koristeći SMART RACE cDNK kompleta za umnožavanje (Clontech), prema uputstvuma proizvođača. Kodirajući regioni VH (varijabilni region teškog lanca) i VL (varijabilni region lakog lanca) su amplifikovani pomoću PCR-a i u okviru klonirani u vektore konstantnog regiona pG1f (koji sadrže optimizovani kodon, potpuno sintetički, konstantni region teškog lanca čoveka IgG1 (alotip f) u vektoru ekspresije sisara pEE6.4 (Lonza Biologics, Slough, UK (Bebbington et al. (1992) Biotechnology 10:169-175)) i pKappa (sadrži optimizovan kodon, potpuno sintetički, konstantni region ljudski kapa laki lanac (alotip Km3) u vektoru ekspresije sisara pEE12.4 (Lonza Biologics, Slough, UK (Bebbington et al. (1992) Biotechnology 10:169-175)) koristeći strategiju kloniranja nezavisno od ligacije (Aslanidis et al. 1990 Nucleic Acids Res. ;18:6069-6074). Za svaki HuMab, sekvencirano je 12 VL klonova i 8 VH klonova i njihove teorijske mase su izračunate i upoređene sa dostupnim podacima masene spektrometrije antitela. Sekvence su date u listi sekvenci i u tabeli 1 ispod. CDR sekvence su definisane prema Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Tabela 2 i tabela 3 daju pregled informacija o sekvenci antitela i većini homolognih sekvenci germinativne linije. ;;Tabela 1: Varijabilni region teškog lanca (VH), varijabilni region lakog lanca (VL) i sekvence CDR HuMab-ova ;; ; ;; (nastavak) ; ; ;; (nastavak) ; ; ;; (nastavak) ; ; ;; (nastavak) ; ; ;; (nаstavak) ; ; ;; (nastavak) ; ; ;; (nastavak) ; ; ;; (nastavak) ; ; ;; (nastavak) ; ; ;; (nastavak) ; ; ;; (nastаvak) ; ; ;; (nastavak) ; ; ;; (nastavak) ; ; ;; Tabela 2: Homologije porekla miša i sekvenci teškog lanca ; ; ;; Tabela 3: Homologije porekla miša i sekvenci lakog lanca ;; ;; [0233] Slike 1 i 2 daju poravnanje HuMabs sekvenci. Na osnovu ovih sekvenci, konsenzusna sekvenca se može definisati za neke od CDR sekvenci. Ove konsenzusne sekvence su date u tabeli 4. ;Tabela 4: Konsenzusne sekvence ; ; ;; (nastavak) ; ; ;;; Prečišćavanje antitela ;;[0234] Supernatant kulture je filtriran preko 0,2 µm filtera sa slepim krajem i nanet na kolone MabSelect SuRe od 5 ml (GE Health Care) i eluiran sa 0,1 M natrijum citrat-NaOH, pH 3. Eluat je odmah neutralizovan sa 2M Tris-HCl, pH 9 i dijalizovan preko noći do 12,6 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7,4 (B.Braun). Alternativno, nakon prečišćavanja, eluat je stavljen na HiPrep kolonu za odsoljavanje i antitelo je zamenjeno u 12,6 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7,4 (B.Braun) pufer. Nakon dijalize ili zamene pufera uzorci su sterilno filtrirani preko 0,2 µm filtera sa slepim krajem. Čistoća je određena pomoću SDS-PAGE i koncentracija je merena nefelometrijom i apsorpcijom na 280 nm. Prečišćena antitela su čuvana na 4°C. Masena spektrometrija je izvedena da bi se identifikovala molekulska masa teških i lakih lanaca antitela eksprimiranih hibridomima kao što je opisano u Primeru 10. ;;Primer 13: Vezivanje anti-c-Met klonova za tumorske ćelije koje eksprimiraju c-Met vezan za membranu mereno pomoću FACS analize ;;[0235] Vezivanje anti-c-Met antitela i njihovih monovalentnih oblika (koji se ovde takođe nazivaju "UniBodi molekuli", videti Primer 5) za ćelije A431 koje eksprimiraju c-Met vezan za membranu (kupljeno u ATCC, CRL-1555) je testirano korišćenjem protočne citometrije (FACS Canto II, BD Biosciences). Qifi analiza (Dako, Glostrup, Danska) otkrila je da ćelije A431 eksprimiraju u proseku 30.000 kopija c-Met proteina po ćeliji. Vezivanje anti-c-Met antitela i UniBodi molekula je detektovano korišćenjem fikoeritrin konjugovanog kozjeg anti-humanog IgG antitela (Jackson). IgG1-5D5 je korišćen kao antitelo pozitivne kontrole, a HuMab-KLH je korišćen kao kontrolno antitelo izotipa. Vrednosti EC50su određene pomoću nelinearne regresije (sigmoidalni dozni odgovor sa promenljivim nagibom) korišćenjem softvera GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Softvare, San Dijego, Kalifornija, SAD). ;;[0236] Slika 3 pokazuje da su sva testirana anti-c-Met antitela i UniBody molekuli vezani za c-Met eksprimirani na A431 ćelijama na način koji zavisi od doze. Vrednosti EC50za vezivanje varirale su između 0,28-1,92 nM za IgG i 0,52-13,89 nM za molekule UniBody. Zanimljivo je da je antitelo IgG1-024 pokazalo visoke nivoe nezasićenog vezivanja za ćelije A431, što nije primećeno kada je testirano vezivanje za HT-29 ćelije (kupljene u ATCC, HTB-38™) (podaci nisu prikazani). Za antitela 022, 024, 062, 064, 069, 098, 101 i 181, nije primećeno ili manje od 2 puta smanjene vrednosti EC50 između IgG1 i UniBody molekula identičnih klonova. Takođe, maksimalni nivoi vezivanja su nepromenjeni između molekula IgG1 i UniBody. Za antitela 005, 006, 008, 035, 045 i 058, s druge strane, uočeno je više od 2 puta smanjenje vrednosti EC50, kao i smanjenje maksimalnog nivoa vezivanja kada se uporedi IgG1 sa njihovim UniBody parnjakom. Ovo je najverovatnije bilo zbog niže off-stope (Kd) ovih antitela (videti Primer 14). ;;Primer 14: Oktet test rangiranja antitela ;;[0237] Vezivanje antitela za cMetECDHis je analizirano pomoću tehnologije bio-slojne interferometrije (BLI) na sistemu Octet (Fortebio, Menlo Park, SAD). Biosenzori obloženi anti-humanim IgG (Fcspecifični) korišćeni su za hvatanje anti-c-Met antitela prema proceduri koju je preporučio proizvođač. cMetECDHis dobijen iz ćelija HEK293 je stavljen na vrh imobilizovanih anti-c-Met antitela stavljanjem napunjenog biosenzora u bunarić koji sadrži 10 µg/mL cMetECDHis razblaženog u 10 puta razblaženom kinetičkom puferu (Fortebio). Razlika u refleksiji svetlosti (Δλ, nm) površine biosenzora usled vezivanja cMetECDHis merena je u realnom vremenu tokom približno 10 minuta i korišćena je od strane Octet softvera (V4.0, Fortebio) za izračunavanje konstante asocijacije (ka[1/M 3s]). Zatim, napunjeni biosenzor je stavljen u bunar koji sadrži samo kinetički pufer (10 puta razblažen u PBS) da bi se odredila konstanta disocijacije (kd[1/s]). Kinetička analiza je izvršena da bi se odredio afinitet (KD[M]) korišćenjem modela 1:1 (langmuir). Kao pozitivna kontrola, korišćeno je 0,2 µg/mL 5D5 IgG1 proizvedenog u ćelijama HEK293. ;;[0238] Tabela 5 pokazuje da su sva anti-c-Met antitela vezana za cMetECDH sa nanomolarnim afinitetima u opsegu od 0,6-13,9 nM. ;;Tabela 5: Kinetičke konstante (ka, kdi KD) antitela za vezivanje za cMetECDHis ;;; ; ;;; (nastavak) ;;; ;;; [0239] Da bi se utvrdila unakrsna reaktivnost sa c-Met Rezus majmuna, vezivanje anti-c-Met antitela za c-Met pozitivne epitelne ćelije rezus majmuna (4MBr-5 kupljeno u ATCC) je testirano korišćenjem protočne citometrije (FACS Canto II, BD Biosciences). Kao sekundarni konjugat korišćeno je fikoeritrin konjugovano kozje-anti-humano IgG antitelo (Jackson) fikoeritrin. HuMab-KLH je korišćen kao kontrolno antitelo izotipa. ;;[0240] Slika 4 pokazuje da su sva testirana anti-c-Met antitela unakrsno reaktivna sa Rezus c-Met. U obe testirane koncentracije (0,5 µg/mL i 10 µg/mL) anti-c-Met antitela su bila u stanju da se specifično vežu za c-Met majmuna Rezus. Za sva antitela, signal je bio najmanje 5 puta veći nego za kontrolno antitelo izotipa HuMab-KLH. Zanimljivo je da je P1016-035 pokazao mnogo više nivoe gornje fluorescencije (MFI od ~200.000) u poređenju sa drugim c-Met specifičnim antitelima. Ova razlika nije primećena na ćelijskim linijama koje eksprimiraju humani c-Met receptor. ;;Primer 16: Blokiranje vezivanja HGF-a za ekstracelularni domen c-Met određen imunosorbentnim testom povezanim sa enzimom (ELISA) ;;[0241] ELISA je sprovedena da se analizira da li anti-c-Met antitela mogu da blokiraju vezivanje faktora rasta hepatocita (HGF) za c-Met receptor. Zbog toga je obloženi ekstracelularni domen c-Met inkubiran sa neobeleženim anti-c-Met antitelom i fluorescentno obeleženim HGF. Antitela koja ne blokiraju se ne takmiče sa obeleženim HGF za vezivanje c-Met, što rezultira maksimalnim fluorescentnim signalom. Blokirajuća antitela su u kompeticiji sa obeleženim HGF za vezivanje c-Met, što rezultira smanjenim fluorescentnim signalom. ;;[0242] HGF (ProSpec Tany, Rehovot, Izrael) je fluorescentno obeležen konjugacijom sa Evropijum<3+>(PerkinElmer, Turku, Finska). ELISA bunarići su obloženi preko noći na 4°C sa 0,5 µg/mL rekombinantnog humanog c-Met ekstracelularnog domena (R&D systems, Mineapolis, SAD) razblaženim u PBS. Zatim, ELISA bunarići su isprani sa PBST (PBS sa dodatkom 0,05% Tween-20 [Sigma-Aldrich, Zvijndrecht, Holandija]) i blokirani jedan sat na sobnoj temperaturi (ST) sa PBST dopunjenom sa 2% (v/v) pileći serum (Gibco, Paisley, Škotska). Nakon ispiranja sa PBST, ELISA bunarići su inkubirani jedan sat na sobnoj temperaturi zaštićeni od svetlosti sa mešavinom od 50 µL serijski razblaženog antic-Met antitela (0,128-10,000 ng/mL u 5-strukim razblaženjima) i 50 µL 0,44 µg/mL HGF konjugovanog Evropijum<3+>u PBST, zatim, nevezani HGF konjugovan sa Evropijum<3+>je ispran sa PBST i vezani HGF konjugovan sa Evropijum<3+>je inkubiran 30 minuta na sobnoj temperaturi u mraku sa Delfia Enhancement Rastvorom (PerkinElmer) da bi se povećao signal . Srednji intenzitet fluorescencije na 615 nm je meren korišćenjem EnVision 2101 Multilabel čitača (PerkinElmer) primenom sledećih podešavanja: Lance/Delfia dvostruko ogledalo, emisioni filter 615, filter ekscitacije 340 nm, vreme kašnjenja 400 µs, prozor bljesak 0, prozor 400 µs, 2000 po ciklusu i dvosmerno čitanje red po red. Da bi se odredile vrednosti IC50, krive vezivanja su analizirane nelinearnom regresijom (sigmoidalni dozni odgovor sa promenljivim nagibom, gornje vrednosti ograničene na zajedničku vrednost za sve skupove podataka) korišćenjem GraphPad Prism V4.03 softvera (GraphPad Softvare , San Dijego, Kalifornija, SAD). ;;[0243] Slika 5 prikazuje reprezentativne primere krive inhibicije HGF vezivanja anti-c-Met antitela za vezivanje za ekstracelularni domen rekombinantnog humanog c-Met. 5D5 je korišćen kao antitelo pozitivne kontrole. Sva anti-c-Met antitela u prikazanom eksperimentu bila su u stanju kompeticije sa HGF-om konjugovanim sa Evropijum<3+>za vezivanje za rekombinantni c-Met. IC50vrednosti su varirale između 0,0011-0,0794 µg/mL. Bez dodavanja Evropijum<3+>-konjugovanog HGF-a, otkriveno je otprilike ~600 relativnih fluorescentnih jedinica (RFU), što ukazuje na signal kada je postignuta maksimalna inhibicija. Kada vezivanje Evropijum<3+>-konjugovanog HGF nije inhibirano, otkriveno je približno ~66.000 RFU. Antitela 005, 006, 058, 101 i antitelo pozitivne kontrole 5D5 su bili u stanju da inhibiraju 84,5-92,1% HGF vezivanja za c-Met receptor. Sva druga antitela su bila u stanju da inhibiraju najmanje 55% HGF vezivanja za c-Met. Pošto HGF može da veže c-Met receptor i na SEMA domenu i na Ig regionu, neka antitela mogu inhibirati samo jednu od ovih interakcija. Da bi se utvrdilo koja interakcija je inhibirana, izveden je test inhibicije vremenski razrešenog fluorescentnog rezonantnog prenosa energije (TR-FRET) zasnovan na cMetSEMAHis-u. ;;Primer 17: Kompeticija anti-c-Met antitela za vezivanje za rastvorljivi cMetECDH merena je sendvič-ELISA-om ;;[0244] Prvo su određene optimalne koncentracije za oblaganje testiranih anti-c-Met antitela i optimalna koncentracija cMetECDHis. Prema tome, ELISA bunarići su obloženi preko noći na 4°C sa anti-c-Met HuMabs serijski razblaženim u PBS (8 µg/mL u 2-strukim razblaženjima). Zatim, ELISA bunarići su isprani sa PBST (PBS dopunjen sa 0,05% Tween-20 [Sigma-Aldrich, Zvijndrecht, Holandija]) i blokirani jedan sat na sobnoj temperaturi (ST) sa PBSTC (PBST dopunjen 2% [v/ v] pileći serum [Gibco, Paislei, Scotland]). Nakon toga, ELISA bunarići su isprani sa PBST i inkubirani jedan sat na sobnoj temperaturi sa biotinilovanim cMetECDH koji je serijski razblažen u PBSTC (1 µg/mL u 2-strukim razblaženjima). Nevezani biotinilovani cMetECDHis je ispran sa PBST, a vezani biotinilovani cMetECDHis je inkubiran jedan sat na sobnoj temperaturi sa 0,1 µg/mL Streptavidin-poli-HRP (Sanquin, Amsterdam, Holandija) razblaženim u PBST. Posle ispiranja, reakcija je vizuelizovana kroz 15 minuta inkubacije sa 2,2'-azino-bis (3-etilbenzo-tiazolin-6-sulfonskom kiselinom (ABTS: razblažiti jednu ABTS tabletu u 50 mL ABTS pufera [Roche Diagnostics, Almere, Holandija]) na sobnoj temperaturi zaštićeno od svetlosti. Kolorizacija je zaustavljena dodavanjem jednake zapremine oksalne kiseline (Sigma-Aldrich, Zvijndrecht, Holandija). Fluorescencija na 405 nm je merena na mikrotitarskoj ploči (Biotek Instruments, Winooski, USA). Uslovi koji su rezultirali suboptimalnim (približno 80%) vezivanjem svakog antitela su određeni i korišćeni za sledeće eksperimente sa unakrsnim blokom. ;;[0245] ELISA bunarići su obloženi anti-c-Met antitelom u suboptimalnoj dozi kao što je gore opisano. Nakon blokiranja ELISA bunarića, oni su inkubirani sa unapred određenom koncentracijom biotinilovanog cMetECDHis u prisustvu viška anti-c-Met antitela. Reakcija je razvijena kao što je gore opisano. Preostalo vezivanje je izraženo kao procenat u odnosu na vezivanje uočeno u odsustvu kompetitorskog antitela. ;[0246] Tabela 6: Kada se dodaju kao konkurent, sva anti-c-Met antitela su bila u stanju kompeticije za vezivanje sa svojim imobilisanim članovima.022, 058 i 5D5, kada se dodaju kao kompetitorska antitela, bili su u kompeticiji sa antitelima 005 i 006. Međutim, obrnuta reakcija je otkrila samo delimičnu kompeticiju antitela 005 i 006. Ove razlike se mogu objasniti nižim afinitetima antitela 005 i 006 za biotinilovani cMetECDHis. Antitelo 5D5, kada je dodato kao kompetitorsko antitelo, takođe je pokazalo delimičnu kompeticiju sa antitelima 008 i 045, dok je u obrnutoj reakciji primećena nikakva ili minimalna kompeticija. Pored toga, antitela 024, 062, 064, 068 i 181, kada su dodata kao kompetitorska antitela, pokazala su delimičnu kompeticiju sa antitelom 101, dok je reverzna reakcija pokazala potpunu inhibiciju vezivanja cMetECDHis. Vrednosti veće od 100% mogu se objasniti efektima aviditeta i formiranjem kompleksa antitelo-cMetECDHis koji sadrže dva antitela koja nisu u kompeticiji. ;;[0247] Antitela 024, 062, 064, 068, 069, 098, 101 i 181 su u kompeticiji jedno sa drugim za vezivanje za cMetECDHis. Smatralo se da antitela 005, 006, 022 i 058 pripadaju jednoj unakrsno-blok grupi, grupi koju karakteriše potpuna kompeticija sa 005, 006, 022, 058 i 5D5. Međutim, antitelo 5D5 je bilo jedino antitelo koje je takođe moglo da bude u kompeticiji za vezivanje sa antitelom 045. Druga grupa antitela koja je u kompeticiji za vezivanje za cMetECDHis je formirana od 008, 035 i G11-HZ. ;;Tabela 6: Kompeticija anti-c-Met antitela za vezivanje za biotinilovani cMetECDHis ;; ;;; (nastavak) ;; ; ; ;; (nastavak) ; ; ;;; [0248] Prikazani podaci su procenti inhibicije vezivanja 6 stdev. od 3 nezavisna eksperimenta. Za antitela 035, 5D5 i G11-HZ unakrsni blok ELISA izveden je samo dva puta. Pored toga, brojne reakcije kompeticije(*) su dovele do vrednosti optimalne gustine veće od 5.0, što je iznad granice detekcije ELISA čitača. Ovi rezultati su odbačeni iz analize što je rezultiralo duplikatima merenjima.
Primer 18: Blokiranje vezivanja HGF-a za cMetSEMA-567His8 utvrđeno pomoću vremenski rešenog fluorescentnog rezonantnog prenosa energije (TR-FRET)
[0249] HGF može da veže c-Met receptor i na SEMA domenu i na IgG-regionu. Međutim, utvrđeno je da je samo HGF vezan za SEMA domen ključan za aktivaciju receptora. Stoga je interakcija anti-c-Met antitela sa SEMA domenom c-Met receptora proučavana korišćenjem TR-FRET tehnologije. Da bi se izvršio ovaj homogeni test zasnovan na blizini, faktor rasta hepatocita (HGF, ProSpec Tany, Rehovot, Izrael) je konjugovan sa fluorescentnom akceptorskom bojom; AlexaFluor-647 (Invitrogen, Breda, Holandija). cMetSEMA-567His8 je obeležen fluorescentnim donorskim molekulom usmerenim protiv histidinske oznake (Anti-6xhis Evropijum<3+>, PerkinElmer, Turku, Finska). Vezivanje AlexaFluor-647-konjugovanog HGF-a za Evropijum<3+>-obeležen cMetSEMA-567His8 omogućava prenos energije donatorskog molekula (ekscitacija 340 nm) do molekula akceptora (emisija 665 nm). Srednji fluorescentni intenzitet na 665 nm je izmeren na EnVision 2101 Multilabel čitaču (PerkinElmer). Kompeticija neobeleženih anti-c-Met antitela sa HGF konjugovanim AlexaFluor-647 merena je smanjenjem TR-FRET signala na 665 nm, jer je u nevezanom stanju rastojanje između fluorofora donora i aceptora preveliko za da se dogodi prenos energije.
[0250] Sva razblaženja su napravljena u 0.5x puferu za detekciju Lance (PerkinElmer) sa dodatkom 2,67% rastvora stabilizatora (PerkinElmer) i 0,03% (v/v) Tween-20 (Riedel de Haen, Seelze, Nemačka).
25 µL cMetSEMA-567His8 je dodato u 25 µL AlexaFluor-647 konjugovanog HGF-a, 25 µL anti-6xhis Evropijum<3+>i 25 µL neobeleženog anti-c-Met antitela u opti-belu ploču sa 96 bunarića (PerkinEl ploča). Dobijena je konačna koncentracija od 2,93 µg/mL cMetSEMA-567His8, 0,96 µg/mL AlexaFluor-647-konjugovanog HGF i 0,4 µg/mL anti-6xhis Evropijum<3+>. Testirano je 4-struko serijsko razblaživanje neobeleženog anti-c-Met antitela u rasponu od 0,49-8000 ng/mL. Posle inkubacije preko noći na 4°C u mraku, meren je srednji intenzitet fluorescencije na 665 nm korišćenjem EnVision 2101 Multilabel čitača primenom sledećih podešavanja: Lance/Delfia dvostruko ogledalo, emisioni filter 615-665 nm, filter ekscitacije 320 nm, vreme kašnjenja 60 µs, prozor 100 µs, 100 bljesak, 2000 µs po ciklusu i dvosmerno čitanje red po red. Da bi se odredile vrednosti IC50, krive vezivanja su analizirane nelinearnom regresijom (sigmoidalni dozni odgovor sa promenljivim nagibom) korišćenjem softvera GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Softvare, San Dijego, Kalifornija, SAD).
[0251] Slika 6 prikazuje krive inhibicije vezivanja HGF različitih anti-c-Met antitela za vezivanje za cMetSEMA_567His8 testiranih sa TR-FRET. Osim antitela 008, 035 i 096, sva antitela su bila u stanju da budu u kompeticiji sa HGF konjugovanim AlexaFluor-647 za vezivanje za cMetSEMA-567His8. Antitelo 022 je bilo u stanju da inhibira ~ 80% vezivanja HGF-a, dok su antitela 005, 006, 024, 045, 058, 061, 062, 064, 068, 069, 098, 101, 181 bila pozitivna kontrola na 5D i 5. > 90% HGF vezivanja za cMetSEMA-567His8. Određene su vrednosti IC50u rasponu od 0,082-0,623 µg/mL.
Tabela 7: IC50 vrednosti (µg/mL) i procenat inhibicije liganda anti-c-Met antitela za vezivanje za cMetSEMA-567His8 određene sa TR-FRET
mAt IC50% inhibicije
005 0.16 92
006 0.16 92
008 ND 4
022 0.37 77
024 0.39 95
035 ND 19
045 0.17 92
058 0.15 99
061 0.49 96
062 0.58 97
064 0.07 97
068 0.26 96
069 0.54 97
096 ND 16
098 0.55 98
101 0.53 96
181 0.34 93
5D5 0.2 95
[0252] Prikazani podaci su srednji MFI tri nezavisna eksperimenta.
Primer 19: Test vijabilnosti KP4
[0253] C-Met antitela su testirana na njihovu sposobnost da inhibiraju vijabilnost KP4 ćelija (Riken BioResource Center Cell Bank, RCB1005). KP4 ćelije, koje eksprimiraju visoke nivoe i c-Met i HGF na autokrini način, zasejane su u ploču za kulturu tkiva sa 96 bunarića (Greiner bio-one, Frickenhausen, Nemačka) (10.000 ćelija/bunariću) u medijumu bez seruma (1 deo HAM-ovog F12K [Cambrek, East Rutherford, Nev Jersey] i 1 deo DMEM [Cambrex]). Razblaživanje anti-c-Met antitela od 66,7 nM je pripremljeno u medijumu bez seruma koji je dodat ćelijama. Posle 3 dana inkubacije, količina živih ćelija je kvantifikovana pomoću Alamarblue (BioSource International, San Francisko, SAD) prema uputstvima proizvođača. Fluorescencija je praćena korišćenjem EnVision 2101 Multilabel čitača (PerkinElmer, Turku, Finska) sa standardnim Alamarblue podešavanjima. Alamarblue signal ćelija tretiranih antitelima je prikazan kao procenat signala u poređenju sa netretiranim ćelijama.
[0254] Slika 7 prikazuje procenat inhibicije vijabilnih KP4 ćelija nakon tretmana anti-c-Met antitelom u poređenju sa netretiranim ćelijama (0%). Klonovi u kutiji su antitela koja su međusobno u kompeticiji kao što je opisano u Primeru 17. Zanimljivo je da su antitela 024, 062, 064, 068, 069, 098, 101 i 181, koja pripadaju istoj grupi unakrsnih blokova, bila u stanju da inhibiraju vijabilnost KP4 (18-46%), oba kao IgG1 i UniBody molekul. Takođe, IgG1 molekuli antitela 008, 061 i 096 su bili u stanju da inhibiraju vijabilnost KP4. Nasuprot tome, antitelo 045 nije inhibiralo vijabilnost KP4 kao IgG1 niti kao molekul UniBody. Za Uni-1016-045-TE ovo može biti zbog njegovog niskog očiglednog afiniteta za c-Met vezan za membranu, što je mereno FACS analizom (Primer 13). IgG1 antitela klonova 005, 006, 022 i 058 nisu značajno inhibirala održivost KP4, dok su Uni-1016-022-TE, Uni-1016-058-TE i IgG1-1016-058-wtFab inhibirali 54, 54, % vijabilnosti KP4, tim redom. Uni-1016-005 i Uni-1016-006 se takođe nalaze u ukrštenoj kompeticiji sa klonovima 022 i 058, ali nisu značajno inhibirali vijabilnost KP4. Ovo može biti zbog njihovih niskih očiglednih afiniteta izmerenih FACS analizom (Primer 13). Zanimljivo je i da je IgG4-1016-058 pokazao izvesnu inhibiciju vijabilnosti KP4. Ovo nije primećeno kod IgG4-5D5).
[0255] Sve u svemu, podaci ukazuju da je za neke grupe koje unakrsno blokiraju monovalentno vezivanje potrebno da inhibira vijabilnost KP4, dok za druge grupe koje unakrsno blokiraju i monovalentna i dvovalentna vezujuća antitela mogu inhibirati vitalnost KP4.
Primer 20: KP4 model tumora ksenotranspantata kod SCID miševa
[0256] KP4 model tumora ksenotransplantata kod SCID miševa je izveden da bi se odredila efikasnost anti-c-Met HuMabs da inhibiraju rast tumora in vivo. Ženke SCID miševa stare sedam do jedanaest nedelja, soj C.B-17/IcrPrkdc-scid/CRL, kupljene su od Charles River Laboratories Nederland (Mastriht, Holandija) i držane u sterilnim uslovima u kavezima sa vrhom filtera sa hranom i vodom ad libitum. Za identifikaciju miša postavljeni su mikročipovi (PLEXX BV, Elst, Holandija). Sve eksperimente je odobrio komitet za etiku životinja Univerziteta Utreht.
[0257] Dana 0, 10x10<6>KP4 ćelija je inokulisano subukutanozno u 200 µl PBS na desnom boku. Miševi su pregledani najmanje dva puta nedeljno na kliničke znake bolesti. Veličina tumora je određena najmanje jednom nedeljno. Zapremine (mm<3>) su izračunate iz merenja kaliperom (PLEXX) kao 0,52 X (dužina) X (širina)2, počevši od 16. dana. Devetog dana merene su prosečne veličine tumora i miševi su podeljeni u 8 grupa od po 7 miševa. Anti-c-Met antitela (008, 058, 069 i 098) su ubrizgana intraperitonealno. Antitelo G11-HZ je korišćeno kao antitelo pozitivne kontrole, dok su antitela 5D5 i izotip-kontrola korišćena kao negativna kontrolna antitela. Miševi su primali punu dozu od 400 µg/mišu, praćenu jednom nedeljno sa dozom održavanja od 200 µg/mišu, tokom 7 nedelja.
[0258] Pored toga, uzorci plazme, sakupljeni pre primene 1.3. i 5. doze održavanja i kada su miševi prekinuti, prisustvo humanog IgG je verifikovano korišćenjem lateks čestica na BNII nefelometru (Dade Behring, Atterbury, UK).
[0259] Slike 8 i 9 pokazuju da je rast tumora KP4 ćelija inhibiran HuMabs 008, 069, 098 i pozitivnom kontrolom G11-HZ. Inhibicija je upoređena sa tretmanom antitelom za kontrolu izotipa. Rast tumora KP4 ćelija je odložen, ali nije potpuno inhibiran kontrolnim antitelom G11-HZ. Klonovi 069 i 098 su pokazali snažniju inhibiciju u poređenju sa klonovima 008 i G11-HZ. Antitela 5D5 i 058 nisu inhibirala rast tumora. Ovo je bilo u skladu sa in vitro podacima kao što je opisano u Primeru 19. Uzeti zajedno, ovi podaci ukazuju da za neke grupe koje unakrsno blokiraju dvovalentna vezujuća antitela mogu inhibirati rast tumora KP4.
Primer 21: MKN45 model tumora ksenotranspantata
[0260] Model tumora ksenotransplantata MKN45 humanog adenokarcinoma želuca kod golih miševa je korišćen za određivanje efikasnosti anti-c-Met HuMabs za inhibiranje rasta tumora in vivo.
[0261] Humane MKN45 ćelije adenokarcinoma želuca su kultivisane na 37°C i 5% COz u medijumu RPMI-1640 koji sadrži 100 jedinica/mL natrijuma penicilina G, 100 µg/mL streptomicin sulfata, 25 µg/mL gentamicina, goveđi serum i 2 mM glutamina. Korišćene su ženke golih miševa stare sedam do osam nedelja (nu/nu, Harlan) (telesne težine u rasponu od 17,0 do 26,4 g na početku studije). Životinje su hranjene ad libitum vodom i hranom. Miševi su smešteni u uslovima koji su u skladu sa preporukama Vodiča za negu i upotrebu laboratorijskih životinja. Program nege i korišćenja životinja je akreditovan od strane AAALAC. Dana 0, 1310e7 MKN45 ćelije su inokulisane subkutanozno u 200 µl 50% matrigela u PBS u boku svakog miša. Sedmog dana životinje su razvrstane u pet grupa (n=10) sa prosečnom zapreminom tumora od 80 do 120 mm<3>i započeto je lečenje. Anti-c-Met antitela (008, 058, 069) su ubrizgana u repnu venu (iv). Antitelo G11-HZ je korišćeno kao antitelo pozitivne kontrole, a antitelo za kontrolu izotipa je korišćeno kao antitelo za negativnu kontrolu. Svi miševi su primili 40 mg/kg antitela 7. dana i 20 mg/kg antitela 14., 21. i 28. dana.
[0262] Tumori su mereni dva puta nedeljno korišćenjem kalibra do krajnje tačke zapremine tumora od 700 mm<3>ili do kraja studije (62. dan). Slike 10 i 11 pokazuju da je rast tumora MKN45 ćelija značajno odložen antitelima 008, 058, 069 i kontrolnim antitelom G11-HZ u poređenju sa tretmanom sa kontrolnim antitelom izotipa.
Primer 22: Smanjenje rezidualne agonističke aktivnosti IgG1 c-Met antitela smanjenjem konformacione fleksibilnosti
[0263] Prirodni ligand c-Met, HGF, je funkcionalni dimer koji indukuje dimerizaciju dva c-Met molekula. Naknadna intracelularna fosforilacija intracelularnog domena c-Met dovodi do aktivacije nekoliko signalnih puteva koji su uključeni u proliferaciju, invaziju i preživljavanje ćelija. Većina bivalentnih antitela podignutih protiv c-Met pokazuje uporedive efekte kao HGF na sudbinu ćelije, posebno kada se vezujući epitopi antitela nalaze blizu ili u SEMA domenu c-Met.
[0264] Da bi se minimizirala potencijalna rezidualna agonistička aktivnost bivalentnih IgG1 antitela, korišćena je strategija za smanjenje konformacione fleksibilnosti. U IgG1 postoji veliki stepen slobode za Fab krakove da se pomeraju u odnosu na Fc domen. Najveće konformacione promene su rezultat fleksibilnosti šarke, koja omogućava širok spektar Fab-Fc uglova (Ollmann Saphire, E., R.L. Stanfield, M.D.M. Crispin, P.W.H.I. Parren, P.M. Rudd, R.A. Dwek, D.R. Burton and I.A. Wilson.2002. Contrasting IgG structures reveal extreme asymmetry and flexibility. J. Mol. Biol.319: 9-18) Jedan od načina da se smanji fleksibilnost Fab-ruka u imunoglobulinima je da se spreči stvaranje disulfidnih veza između lakog i teškog lanca pomoću genetičke modifikacije. U prirodnom IgG1 antitelu laki lanac je kovalentno povezan sa teškim lancem preko disulfidne veze, povezujući C-terminalni cistein lakog lanca sa cisteinom na poziciji 220 (C220 EU numeracija) u zglobu Fc teškog lanca. lanac. Mutacijom amino kiseline C220 u serin ili bilo koju drugu prirodnu aminokiselinu, uklanjanjem C220, uklanjanjem kompletnog zglobnog regiona ili zamenom IgG1 zgloba sa IgG3 zglobom, formira se molekul u kome su laki lanci povezani preko svojih C -terminalnih cisteina, analogno situaciji koja se nalazi u ljudskom izotipu IgA2m(1). Ovo rezultira smanjenom fleksibilnošću Fabs u odnosu na Fc i posledično smanjenim kapacitetom unakrsnog povezivanja, kao što je pokazano u uporednim studijama sa IgA2m(1) i IgG1 formatima agonističkog c-Met antitela (5D5) u testu vijabilnosti KP4 ( Slika 12).
[0265] Druga strategija za smanjenje fleksibilnosti IgG1 molekula je zamena IgG1 zgloba sa IgG2 zglobom ili zglobnim regionom nalik IgG2. (Dangl et al. EMBO J.1988; 7:1989-94). Ovaj zglobni region ima dve osobine različite od IgG1, za koje se smatra da čine molekule manje fleksibilnim. Prvo, u poređenju sa zglobom IgG1, zglob IgG2 je kraća za 3 aminokiseline. Drugo, zglob IgG2 sadrži dodatni cistein, tako da će se formirati tri umesto dva među-teška lančana disulfidna mosta. Alternativno, može se uvesti varijanta zgloba IgG1 koja podseća na zglob IgG2. Ovaj mutant (TH7Δ6-9) (WO2010063746) sadrži mutaciju T223C i dve delecije (K222 i T225) kako bi se stvorio kraći zglob sa dodatnim cisteinom.
Primer 23: Dobijanje IgG1 molekula sa smanjenom fleksibilnosti (ukrućeni molekuli IgG1) Kloniranje i ekspresija
[0266] Mutirana IgG1 antitela su dizajnirana i klonirana korišćenjem using standardnih molekularno bioloških postupaka. Pregled sekvenci svih dobijenih mutacija u zglobnom regionu je prikazan ispod u Tabeli 8.
Tabela 8: Aminokiselinska sekvenca zgloba mutiranih IgG1 antitela. Delecije su označene sa ’-’, i mutacije su podvučene.
Biohemijska karakterizacija
Prolazna ekspresija
[0268] Svi mutanti su eksprimirani u dovoljnim nivoima i nisu pokazali aberantno obrazovanje multimera kao što je određeno MS (>99% čistoća) i SDS-PAGE.
[0269] Rezultati SDS-PAGE su prikazani na Slici 13. U C220 mutantima (C220S i ΔC220) i IgG1 varijante sa obrisanim zglobom (IgG1 varijante sa obrisanim zglobom su takođe označene UniBody-IgG1 ili Uni-IgG1) uparivanje lakog lanca, vidljivo kao proteinska traka oko 50 kD u neredukujućoj analizi SDS-PAGE, je uočeno. Varijanta sa IgG3 zglobom takođe je pokazala uparivanje lakog lanca, dok varijanta sa IgG2 zglobom i IgG1 TH7Δ6-9 mutant pokazuje normalno uparivanje lakog-teškog lanca.
Primer 24: svojstva vezivanja mutanata c-Met
[0270] C-Met svojstva vezivanja mutanata su testirana u ELISA testu. Udubljenja ELISA ploče su obložene preko noći na 4°C sa rhHGF R/Fc himerom (R&D Systems; Cat.358MT/CF) u PBS (1 µg/mL). Zatim, bunarići su isprani sa PBST (PBS sa dodatkom 0,05% Tween-20 [Sigma-Aldrich, Zvijndrecht, Holandija]) i blokirani jedan sat na sobnoj temperaturi (ST) sa PBSTC (PBST dopunjen 2% [v/v] pileći serum [Gibco, Paisley, Scotland]). Nakon toga, bunarići su isprani sa PBST i inkubirani jedan sat na sobnoj temperaturi sa anti-cMet antitelima i varijantama koje su serijski razblažene u PBSTC (10 µg/mL u 4-strukim razblaženjima). Nevezano antitelo je isprano sa PBST, a antitelo vezano za oblogu je detektovano inkubacijom tokom jednog sata na sobnoj temperaturi sa kozjim anti-humanim IgG F(ab')2-HRP razblaženim u PBST (Jackson kat. br. 109-035- 097). Nakon ispiranja, reakcija je vizualizovana inkubacijom od 15 minuta sa 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonskom kiselinom) (ABTS: razblažiti jednu ABTS tabletu u 50 mL ABTS pufera [Roche Diagnostics, Almere, Holandija]) na ST zaštićeno od svetlosti. Kolorizacija je zaustavljena dodavanjem jednake zapremine oksalne kiseline (Sigma-Aldrich, Zvijndrecht, Holandija). Fluorescencija na 405 nm je merena na čitaču mikrotitarskih ploča (Biotek Instruments, Winooski, SAD). Svi mutanti su se vezali sa uporedivim očiglednim afinitetom (EC50) za c-Met (Slika 14). Tabela 10 pokazuje EC50vrednosti mutanata dobijenih u ovom eksperimentu.
toes tSELI ne đerestiod no vred C50 :E9la be Ta
Primer 25: Smanjeni agonistički efekat ojačanih IgG1 c-Met antitela
Fosforilacija receptora
[0271] Da bi se odredila agonistička svojstva ukrućenih antitela izveden je efekat antitela na fosforilaciju cMet. Nakon dimerizacije dva susedna receptora za cMet ili prirodnim ligandom HGF ili većinom bivalentnih antitela, tri tirozinska ostatka (pozicije 1230, 1234 i 1235) u intracelularnom domenu c-Met su unakrsno fosforilisana, što je praćeno naknadnom fosforilacijom nekoliko drugih aminokiselina u intracelularnom domenu i aktivacijom brojnih signalnih kaskada. Aktivacija dimerizacije cMet-a se stoga može pratiti korišćenjem antitela specifičnih za fosforilisani receptor na ovim pozicijama, i na taj način koristiti kao očitavanje potencijalnog agonizma anti-c-Met antitela.
[0272] A549 ćelije, CCL-185 dobijene od ATCC, uzgajane su u serumu koji sadrži DMEM medijum do postizanja konfluentnosti od 70%. Posle tripsinizacije i ispiranja ćelija, one su postavljene u ploču za kulturu sa 6 otvora na 1x10e6 ćelija/bunariću u medijumu za kulturu koji sadrži serum. Posle inkubacije preko noći ćelije su tretirane ili sa HGF (R&D Systems; kat.294-HG) (50 ng/mL) ili sa panelom antitela (30 µg/mL) i inkubirane 15 minuta na 37°C. Ćelije su zatim dva puta isprane ledeno hladnim PBS-om i lizirane puferom za lizu (Cell Signaling; kat.9803) dopunjenim koktelom inhibitora proteaze (Roche; kat.11836170001) i uzorci su čuvani na -80°C. Aktivacija receptora je određena merenjem fosforilacije pomoću Vestern blota korišćenjem fosfo c-Met specifičnih antitela. Proteini u ćelijskom lizatu su odvojeni na 4-12% SDS-PAGE gelu i prebačeni na nitroceluloznu membranu koja je naknadno obojena antitelom specifičnim za fosforilovani c-Met (I1234/1235) (Cell Signaling, cat: 3129). Za kontrolu punjenja gela, korišćena su antitela protiv ukupnog c-Met i beta-aktina. Rezultati Vestern blotova prikazani su na slici 15.
[0273] Kontrole medijuma za kulturu tkiva i ćelije tretirane monovalentnim formatom UniBody antitela 5D5 nisu pokazale fosforilaciju receptora. Nasuprot tome, Vestern blot analiza ćelija tretiranih pozitivnom kontrolom HGF ili agonističkim antitelom IgG1-1016-058 pokazala je jasan deo očekivane visine. Antitelo IgG1-1016-069 pokazalo je nisku, ali detektabilnu fosforilaciju receptora, što ukazuje na to da dolazi do nekog unakrsnog povezivanja receptora. Međutim, varijante koje su dizajnirane da smanje fleksibilnost molekula antitela pokazale su minimalnu aktivaciju receptora, sve do nivoa koji je uporediv sa nivoima otkrivenim u ćelijama tretiranim monovalentnom kontrolom Uni-5D5-TE. (Slika 15).
Efekat c-Met antitela na proliferaciju NCI-H441 in vitro
[0274] Potencijalna proliferativna agonistička aktivnost cMet antitela je testirana korišćenjem ćelijske linije adenokarcinoma pluća NCI-H441 (ATCC, HTB-174™), koja eksprimira visoke nivoe c-Met, ali ne proizvodi svoj ligand HGF. Ćelije NCI-H441 su zasejane u ploču za kulturu tkiva sa 96 bunarića (Greiner bio-one, Frickenhausen, Nemačka) (5.000 ćelija/bunariću) u RPMI (Lonza) bez seruma. Razblaženja antitela na c-Met (66,7 nM) pripremljena su u RPMI bez dodavanja seruma u ćelije. Posle 7 dana inkubacije na 37°C/5% CO2, količina živih ćelija je kvantifikovana pomoću Alamarblue (BioSource International, San Francisko, SAD) prema uputstvima proizvođača. Fluorescencija je praćena korišćenjem EnVision 2101 Multilabel čitača (PerkinElmer, Turku, Finska) sa standardnim Alamarblue podešavanjima.
[0275] Kao što se vidi na slici 17, proliferacija NCI-H441 ćelija je bila snažno indukovana agonističkim kontrolnim mAt-a IgG1-058 i IgG1-5D5. Antitelo IgG1-1016-069 je takođe pokazalo neki agonistički efekat u poređenju sa ćelijama tretiranim kontrolom izotipa. Agonistička aktivnost IgG1-1016-069 mogla bi se potpuno ukloniti uvođenjem C220 mutanata C220S i -del, a delimično i varijanti sa IgG2 i TH7D6-9 zglobom ili IgG2 okosnicom. Kontrolni uzorci tretirani kontrolom izotipa i monovalentnom verzijom 5D5 (Uni-5D5-TE) nisu indukovali rast ćelija.
Test vijabilnosti KP4
[0276] Sposobnost inhibiranja ćelija zavisnih od HGF takođe je određena za mutante anti-c-Met antitela u testu vijabilnosti KP4 (videti Primer 19 za eksperimentalne procedure). Rezultati su prikazani na slici 17. Efikasnost mutanata zasnovanih na IgG1-1016-069 je u potpunosti zadržana ili malo bolja kod C220 mutanata. Zanimljivo, mutiranje C220 u agonističkom antitelu 5D5 je dovelo do značajnog smanjenja vijabilnosti KP4. Nije primećen agonistički efekat 058 i 5D5 antitela u IgG1 formatu zbog visoke ekspresije HGF od strane KP4 (autokrina HGF petlja).
Smanjena modulacija
[0277] Smanjena modulacija c-Met izazvana antagonističkim antitelima predstavlja mehanizam delovanja terapeutskih c-Met antitela. Shodno tome, u jednom aspektu su poželjna antitela sa smanjenim agonističkim svojstvima, ali sa zadržanom sposobnošću da indukuju smanjenu-modulaciju c-Met-a. Da bi se odredio potencijal antitela za smanjivanje modulacije, ćelije A549 (CCL-185 dobijen od ATCC) su zasejane u ploče za kulturu tkiva sa 6 bunarića (500000 ćelija/bunariću) u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži serum i kultivisane preko noći na 37°C. Sledećeg jutra, dodata su anti-c-Met antitela u konačnoj koncentraciji od 10 µg/mL i ploča je inkubirana još 2 dana na 37°C. Posle ispiranja sa PBS, ćelije su lizirane inkubacijom 30 min na sobnoj temperaturi sa 250 µL lizirajućeg pufera (Cell signaling, Danvers, SAD). Ukupni nivoi proteina su kvantifikovani korišćenjem reagensa za analizu proteina bicinhoninske kiseline (BCA) (Pierce) prema protokolu proizvođača. Nivoi c-Met proteina u ćelijskim lizatima su kvantifikovani korišćenjem c-Met-specifične sendvič ELISA. U tu svrhu, bunarići ELISA ploča su obloženi preko noći na 4°C sa kozjim anti-humanim c-Met antitelom usmerenim protiv ekstracelularnog domena c-Met (R&D Systems), razblaženim u PBS (1 µg/mL). Zatim, bunarići su isprani sa PBST (PBS dopunjen sa 0,05% Tween-20 [Sigma-Aldrich, Zvijndrecht, Holandija]) i blokirani na jedan sat na sobnoj temperaturi sa PBSTC (PBST dopunjen 2% [v/v] pilećeg seruma [ Gibco, Pejsli, Škotska]). Dodati su nerazblaženi ćelijski lizati (100 µL) i inkubirani jedan sat na ST. Posle ispiranja sa PBST, bunarići su inkubirani jedan sat na sobnoj temperaturi sa mišjim antitelom usmerenim protiv intracelularnog ostatka tirozina-1234 humanog-c-Met (ćelijska signalizacija), razblaženim 1:1000 u PBSC. Bunarići su ponovo isprani sa PBST i inkubirani jedan sat na sobnoj temperaturi sa kozjim antimišjim Fc-HRP antitelom (Jackson) razblaženim 1:5000 u PBSC. Nakon ispiranja sa PBST, reakcija je vizualizovana kroz 30 minuta inkubacije sa 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonskom kiselinom) (ABTS: razblažiti jednu ABTS tabletu u 50 mL ABTS pufera [Roche Diagnostics, Almere, Holandija]) na ST zaštićeno od svetlosti. Kolorizacija je zaustavljena dodavanjem jednake zapremine oksalne kiseline (Sigma-Aldrich, Zvijndrecht, Holandija). Fluorescencija na 405 nm je merena na čitaču mikrotitarskih ploča (Biotek Instruments, Winooski, SAD). Kao što se vidi na slici 18, svi mutanti antitela 069 su bili u stanju da indukuju smanjenu modulaciju
Primer 26: Ćelijski posredovana citotoksičnost (ADCC) zavisna od antitela
[0278] MKN45 ćelije (kupljene od RIKEN BioResource Center, Tsukuba, Japan, RCB1001) su sakupljene (5x10<6>ćelija), isprane (dva puta u PBS, 1500 oum, 5 min) i sakupljene u 1 mL RPMI 1640% medijuma sa dodatkom cosmic teleći serum (CCS) (HyClone, Logan, UT, SAD), kome je dodato 200 mCi 51Cr (Chromium-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, Holandija). Smeša je inkubirana u vodenom kupatilu koje se mućkalo 1,5 sata na 37°C. Posle ispiranja ćelija (dva puta u PBS-u, 1500 oum, 5 min), ćelije su resuspendovane u medijumu RPMI 1640 sa dodatkom 10% CCS, izbrojane pomoću isključenja tripan plavog i razblažene do koncentracije od 1x10<5>ćelija/mL.
[0279] U međuvremenu, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane iz svežih “buffy” slojeva leukocita (Sanquin, Amsterdam, Holandija) korišćenjem standardnog Ficoll centrifugiranja gustine prema uputstvima proizvođača (medij za odvajanje limfocita; Lonza, Verviers, Francuska). Posle resuspenzije ćelija u medijumu RPMI 1640 sa dodatkom 10% CCS, ćelije su izbrojane pomoću tripan plavog isključivanja i koncentrisane na 1x10<7>ćelija/mL.
[0280] Za svaki ADCC eksperiment, 50 µL<51>Cr-obeleženih MKN45 ćelija (5.000 ćelija) je prethodno inkubirano sa 15 µg/mL cMet antitela u ukupnoj zapremini od 100 µL RPMI medijuma sa dodatkom 10% CCS u mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarića. Posle 15 minuta na sobnoj temperaturi, dodato je 50 µL PBMC (500.000 ćelija), što je rezultiralo odnosom efektora prema ciljnoj ćeliji od 100:1. Maksimalna količina ćelijske lize je određena inkubacijom 50 µL<51>Cr-obeleženih MKN45 ćelija (5.000 ćelija) sa 100 µL 5% Triton-Ks100. Količina spontane lize određena je inkubacijom 5.000<51>Cr -obeleženih MKN45 ćelija u 150 µL medijuma, bez antitela ili efektorskih ćelija. Nivo lize ćelija nezavisne od antitela određen je inkubacijom 5.000 MKN45 ćelija sa 500.000 PBMC bez antitela. Nakon toga, ćelije su inkubirane 4 sata na 37°C, 5% CO2. Ćelije su centrifugirane (1200 oum, 3 min) i 75 µL supernatanta je prebačeno u mikronske epruvete, nakon čega je oslobođeni<51>Cr izbrojan pomoću gama brojača. Izmereni broj u minuti (cpm) korišćen je za izračunavanje procenta lize posredovane antitelima na sledeći način:
(cpm uzorak – cpm At-nezavisna liza)/(cpm maks. liza – cpm spontana liza)x 100%
[0281] Različite publikacije su pokazale korelaciju između smanjene fukozilacije jezgra i pojačane aktivnosti ADCC in vitro (Shields RL.2002 JBC; 277:26733-26740, Shinkawa T.2003 JBC; 278(5):3466-3473). Slika 19 pokazuje da antitelo 069 ne indukuje lizu MKN45 ćelija preko ADCC. Međutim, kada je fukozilacija jezgra smanjena zbog prisustva kifunenzina tokom proizvodnje mAt u HEK-ćelijama, antitelo 069 je bilo u stanju da indukuje preko 30% lize MKN45 ćelija. Štaviše, liza je već primećena pri koncentracijama antitela ispod 0,01 ug/mL. Prikazane vrednosti su srednji maksimalni procenti<51>Croslobađanja 6 stdev iz jednog reprezentativnog in vitro ADCC eksperimenta sa MKN45 ćelijama.069 sa niskim sadržajem fukoze proizveden je u ćelijama HEK 293 u prisustvu kifunenzina, što je rezultiralo ~99,5% fukozilacije koja nije jezgra (tj. odsustvo fukoze).069 visoka fukoza je proizvedena u ćelijama HEK 293 bez kifunensina, što je rezultiralo ~2,11% fukozilacije bez jezgra, što je određeno hromatografijom visoke performanse sa izmenom anjona u kombinaciji sa pulsnom amperometrijskom detekcijom (HPAEC-PAD) (podaci nisu prikazani).
Primer 27: Nedostatak vezivanja c-Met antitela za ćelije periferne krvi čoveka
[0282] Da bi se rešilo vezivanje klona 069 za tri tipa ćelija (B-ćelije, monociti i granulociti) prisutnih u perifernoj krvi, izveden je FACS test vezivanja. Fluorescentno obeležen klon 069 je korišćen da omogući direktno merenje na FACS bez upotrebe sekundarnih antitela za detekciju. Populacije ćelija u krvi su identifikovane u testu korišćenjem fluorescentno komercijalnih antitela protiv specifičnih markera na ćelijama od interesa.
[0283] Periferna krv zdravih dobrovoljaca (Univerzitetski medicinski centar Utreht) je razblažena deset puta u FACS puferu (PBS 0,4% BSA 0,02% NaN3) i inkubirana sa Alexa<488>-konjugovanim c-Met antitelima i FITC-konjugovanim anti-CD19 anti-CD19 -CD16 i -CD14 antitela (konačna koncentracija 10 µg/mL) i fikoeritrin (PE) obeležena anti-CD19, -CD16 i -CD14 antitela (BD Biosciences, San Jose CA) za identifikaciju ćelijske populacije (odnosno B ćelije, granulociti i monociti) u konačnoj zapremini od 100 µl. Posle 30 minuta na 4°C, uzorci su centrifugirani (300 g, 3 min), supernatant je uklonjen, eritrociti su lizirani inkubacijom (10 min, 4°C) sa 200 µl rastvora Eri-lize (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 Mm EDTA [pH 7,4]), a uzorci su dva puta isprani u FACS puferu. Uzorci su resuspendovani u 100 µL FACS pufera i analizirani korišćenjem FACS Canto II (BD Biosciences).
[0284] Slika 20 je reprezentativni FACS dijagram koji pokazuje da Alexa488-konjugovani-069 nije vezao populaciju B ćelija (CD19-PE+ ćelije unutar gejta limfocita). Vezivanje Alexa<488>-konjugovanog rituksimaba je korišćeno kao pozitivna kontrola. Vezanje za druge ćelijske populacije je analizirano na sličan način i reprezentativni rezultati za 1 od 3 donora su takođe prikazani na slici 21. Antitelo 069-Alexa<488>se nije vezivalo za B ćelije, monocite ili granulocite, dok su pozitivna kontrolna antitela pokazala specifično vezivanje.
<120> Monoclonal antibodies against c-Met
<130> P/59.WO
<160> 219
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Phe Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Met Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Val Gly Tyr Asp Trp Pro Asp Thr Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 5
<212> PRT 72
<213> homo sapiens
Ser Tyr Gly Phe Gly
1 5
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 3
Arg Ile Ser Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Met Phe Gln 1 5 10 15
Gly
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 4
Asp Val Gly Tyr Asp Trp Pro Asp Thr Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 73
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 6
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 7
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 8
Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Pro Thr
1 5
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 74 Pro Gly Ser 1 5 10 15
Gly Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Met Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Val Gly Tyr Asp Ser Ala Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 10
Ser Phe Gly Ile Gly
1 5
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 11
Arg Ile Phe Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Met Phe Gln 1 5 10 15
Gly
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 12
Asp Val Gly Tyr Asp Ser Ala Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 14
76
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 15
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 16
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr
1 5
<210> 17
<211> 118
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 77
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 18
Ser Tyr Trp Ile Gly
1 5
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 19
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15
Gly
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 20
Gln Glu Ile Thr Gly Glu Phe Asp Tyr
1 5
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 21
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 7 S8er Val Gly 1 5 10 15
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 22
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 23
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 24 79
<211> 123
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Leu Leu Trp Phe Gly Glu Leu Trp Gly Tyr Phe Asp Leu 100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 26
Ser Tyr Ala Met His
1 5
80
<210> 27
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 28
Glu Leu Leu Trp Phe Gly Glu Leu Trp Gly Tyr Phe Asp Leu 1 5 10
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Ala Ser Ser Phe Thr Trp 85 90 95 81
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 30
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 31
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 32
Gln Glu Ala Ser Ser Phe Thr Trp Thr
1 5
<210> 33
<211> 122
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 33
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 82 Glu Trp Val 35 40 45
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Lys Asp Leu Asp Arg Gly Trp Met Gly Tyr Phe Gly Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 34
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 35
<211> 18
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 35
Ala Ile Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val 1 5 10 15
Lys Gly
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 36 83
<211> 106
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 38
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens 84
<210> 40
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 40
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Thr
1 5
<210> 41
<211> 118
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gln Glu Ile Thr Gly Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 42
Ser Tyr Trp Ile Gly
1 5
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 43
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15
Gly
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 44
Gln Glu Ile Thr Gly Glu Phe Asp Tyr
1 5
<210> 45
<211> 108
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 45
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 86 Leu Leu Ile 35 40 45
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Met 85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 46
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 47
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 48
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Met Tyr Thr
1 5 10
<210> 49
<211> 117
<212> PRT 87
<213> homo sapiens
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Trp Gly Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 50
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 51
Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Se 88r Val Lys 1 5 10 15
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 52
Asp Arg Gly Trp Gly Ser Asp Tyr
1 5
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 53
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 54
<211> 11 89
<212> PRT
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 55
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 56
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Phe Thr
1 5
<210> 57
<211> 125
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Asp Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 90 Asn Leu Tyr 65 70 75 80
Ala Arg Glu Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Gln 100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 58
Asp Tyr Tyr Met Tyr
1 5
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 59
Thr Ile Ser Asp Asp Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 60
<211> 16
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 60
Glu Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Gln Asp Tyr 1 5 10 15
<210> 61
<211> 108
<212> PRT 91
<213> homo sapiens
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Leu Ser Ser Ala 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Thr Ser Tyr Pro Gln 85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 62
Arg Ala Ser Gln Gly Leu Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 63
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 64 92
<211> 10
Gln Gln Phe Thr Ser Tyr Pro Gln Ile Thr
1 5 10
<210> 65
<211> 118
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 65
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Gly His Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Xaa Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Asp Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ala Val Asp Arg Ser Lys Asn Gln Leu 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Phe Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Asp Phe Leu Thr Asp Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
93
<210> 66
Ser Gly Gly His Ser Trp Ser
1 5
<210> 67
<211> 16
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 67
Xaa Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Asp Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 68
Ser Ser Tyr Asp Phe Leu Thr Asp
1 5
<210> 69
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 69
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 9 L4eu Leu Ile 35 40 45
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Gly Phe Pro Ile 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 70
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 70
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 71
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 72
Gln Gln Ala Asn Gly Phe Pro Ile Thr
1 5
<210> 73
<211> 118
<212> PRT 95 <213> homo sapiens
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 73
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Gly His Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Xaa Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Asp Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ala Val Asp Arg Ser Lys Asn Gln Leu 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Phe Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 74
Ser Gly Gly His Ser Trp Ser
1 5
<210> 75
<211> 16 96 <212> PRT
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 75
Xaa Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Asp Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 76
Ser Ser Tyr Asp Ile Leu Thr Asp
1 5
<210> 77
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 77
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Gly Phe Pro Ile 85 90 95 97
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 78
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 79
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 80
Gln Gln Ala Asn Gly Phe Pro Ile Thr
1 5
<210> 81
<211> 118
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 81
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Gly His Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Xaa Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Asp Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 82
Ser Gly Gly His Ser Trp Ser
1 5
<210> 83
<211> 16
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 83
Xaa Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Asp Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 99
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 84
Ser Ser Tyr Asp Ile Leu Thr Asp
1 5
<210> 85
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 85
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Gly Phe Pro Ile 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 86
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 86
100
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 87
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 88
Gln Gln Ala Asn Gly Phe Pro Ile Thr
1 5
<210> 89
<211> 118
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 89
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Gly Tyr Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Xaa Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
101
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 90
Ser Gly Gly Tyr Ser Trp Ser
1 5
<210> 91
<211> 16
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 91
Xaa Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
<210> 92
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 92
Ser Ser Tyr Asp Ile Leu Thr Asp
1 5
102
<210> 93
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 94
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 94
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 95
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 96
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile Thr
1 5
<210> 97
<211> 119
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 97
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Gly Thr Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 98
<211> 5
<212> PRT 104
<213> homo sapiens
Ser Tyr Gly Ile Ser
1 5
<210> 99
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 99
Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln 1 5 10 15
Gly
<210> 100
<211> 10
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 100
Asp Leu Arg Gly Thr Asn Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 101
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 101
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 105
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 102
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 102
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 103
Ala Ala Ser Ser Leu Leu Ser
1 5
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 104
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile Thr
1 5
<210> 105
<211> 118
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 105
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 10 P6ro Gly Glu 1 5 10 15
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gln Glu Ile Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 106
<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 106
Ser Tyr Trp Ile Gly
1 5
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 107
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15
Gly
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 108
Gln Glu Ile Thr Gly Asp Phe Asp Tyr
1 5
<210> 109
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 109
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 110
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 110
108
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 111
Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 112
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 113
<211> 121
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 113
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe 20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Phe Asn Gly His Thr Asp Tyr Ser Gln Lys Val 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys 85 90 95 109
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 114
<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 114
Asn Phe Gly Ile Ser
1 5
<210> 115
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 115
Trp Ile Ser Ala Phe Asn Gly His Thr Asp Tyr Ser Gln Lys Val Gln 1 5 10 15
Gly
<210> 116
<211> 12
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 116
Ser His Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 117
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 117
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 11 S0er Val Gly 1 5 10 15
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Lys Ser Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 118
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 118
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 119
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 119
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 120 111 <211> 123
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 121
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg His 20 25 30
Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Asp Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Val Phe Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Leu Pro Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr
115 120
<210> 122
<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 122
Arg His Gly Ile Thr
1 5
112
<210> 123
Trp Ile Ser Ala Asp Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15
Asp
<210> 124
<211> 14
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 124
Val Phe Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Leu Pro Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10
<210> 125
<211> 108
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 125
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Gly Val Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 113
<211> 12
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 126
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 127
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 127
Gly Val Phe Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 128
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 129
<211> 119
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 129
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 1 G14lu Trp Met 35 40 45
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Gly Thr Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 130
<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 130
Ser Tyr Gly Ile Ser
1 5
<210> 131
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 131
Trp Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln 1 5 10 15
Gly
<210> 132
<211> 10
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 132 115
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 133
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 134
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 134
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 135
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens 116 <210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 136
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile Thr
1 5
<210> 137
<211> 119
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 137
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Gly Thr Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 138
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 139
<211> 119
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 139
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Gly Thr Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 140
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 140
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<213> homo sapiens
<400> 141
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Gly Thr Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 142
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 142
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30
120
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 143
<211> 119
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 143
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Gly Thr Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
121
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 144
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 145
<211> 121
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 145
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Phe Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 122 Glu Trp Met 35 40 45
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Val Gly Tyr Asp Trp Pro Asp Thr Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 146
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 146
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 123
100 105
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 147
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Met Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Ile Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Val Gly Tyr Asp Ser Ala Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 148
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 148
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 124
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 149
<211> 121
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 149
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg Val Phe Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Met Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Val Gly Tyr Asp Ser Ala Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 125
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 150
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 151
<211> 123
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 151
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Phe Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Leu Leu Trp Phe Gly Glu Leu Trp Gly Tyr Phe Asp Leu 100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 152
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 152
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Ala Asn Ser Phe Thr Trp 85 90 95
<211> 123
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 153
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Leu Leu Trp Phe Gly Glu Leu Trp Gly Tyr Phe Asp Leu 100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 154
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 154
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
128
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Ser Phe Thr Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 155
<211> 117
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 155
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
129
Ala Arg Asp Arg Gly Trp Gly Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 156
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 156
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 157
<211> 117
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 157
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr P 1h3e0 Asn Asn Tyr 20 25 30
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Glu 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Asp Arg Gly Trp Gly Ser Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 158
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 158
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser As 13n1 Trp Pro Phe 85 90 95
<210> 159
<211> 118
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 159
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Gly His Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Cys Leu Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Trp Gly Gln Gly Ile 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 160
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 160
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 132
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 161
<211> 118
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 161
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Gly Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Gly His Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Cys Leu Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 133
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 162
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 162
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 163
<211> 118
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 163
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Gly His Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Cys Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Asp Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ala Val Asp Arg Ser Lys Asn Gln Leu 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Phe Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 164
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 164
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 165
<211> 118
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 165
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Gly His Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Cys Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Asp Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 166
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 166
136
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Gly Phe Pro Ile 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 167
<211> 118
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 167
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
137
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Glu Val Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 168
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 168
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 169
<211> 118
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 169
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys 13 P8ro Gly Glu 1 5 10 15
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gln Glu Val Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 170
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 170
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Se 1r3 L9eu Gln Pro 65 70 75 80
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 171
<211> 118
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 171
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gln Glu Ile Thr Gly Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 172
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
140
<400> 172
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 173
<211> 118
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 173
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asn Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 141
Ala Arg Gln Glu Ile Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 174
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 174
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 175
<211> 118
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 175 142
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gln Glu Ile Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 176
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 176
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 177
<211> 118
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 177
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ser Tyr 20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gln Glu Ile Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 178
<211> 107
<212> PRT 144
<213> homo sapiens
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Val Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Ile 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 179
<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> X1=Y or F
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> X2=A or G
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> X3=F or I
<220>
<221> VARIANT 145 <222> (5)..(5)
Ser Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 180
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> X1=I or V
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> X2=I,S or F
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> X3=I or T
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> X4=A or T
<220>
<221> VARIANT
<222> (14)..(14)
<223> X5=K or M
<400> 180
Arg Xaa Xaa Pro Ile Leu Gly Xaa Xaa Asn Tyr Ala Gln Xaa Phe Gln 1 5 10 15
Gly
<210> 181
<211> 12
<212> PRT
<213> homo sapiens
<223> X1=W or S
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> X2=P or A
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> X3=T or A
<400> 181
Asp Val Gly Tyr Asp Xaa Xaa Asp Xaa Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 182
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> X1=D, E or N
<400> 182
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Xaa Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15
Gly
<210> 183
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> X1=V or I
<220> 147 <221> VARIANT
Gln Glu Xaa Thr Gly Xaa Phe Asp Tyr
1 5
<210> 184
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> X1=V or F
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> X2=N or S
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> X3=D or Y
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> X4=Y or F
<400> 184
Xaa Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Xaa Lys Xaa Xaa Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 185
<211> 18
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6) 148
<223> X1=S or no aa
<222> (13)..(13)
<223> X2=V or A
<400> 185
Ala Ile Ser Gly Ser Xaa Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Xaa Asp Ser Val 1 5 10 15
Lys Gly
<210> 186
<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> X1=S or N
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> X2=S or T
<400> 186
Xaa Tyr Ala Met Xaa
1 5
<210> 187
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> X1=A or V
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> X2=S or I
149
<220>
Xaa Ile Ser Gly Ser Gly Gly Xaa Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Xaa Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 188
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> X1=Y or C
<400> 188
Asp Arg Gly Trp Gly Ser Asp Xaa
1 5
<210> 189
<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> X1=Y or S
<400> 189
Asp Tyr Tyr Met Xaa
1 5
<210> 190
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
150
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> X2=D or S
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> X3= D or S
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> X4=G or S
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> X5=Y or N
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> X6=P or A
<400> 190
Xaa Ile Ser Xaa Xaa Xaa Ser Tyr Thr Xaa Tyr Xaa Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 191
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> X1=Y or H
<400> 191
Ser Gly Gly Xaa Ser Trp Ser
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> X1=any amino acid
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> X2=I or L
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> X3=S or N
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> X4=Y or D
<400> 192
Xaa Xaa Tyr His Ser Gly Xaa Thr Tyr Xaa Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
<210> 193
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> X1=F or I
<400> 193
Ser Ser Tyr Asp Xaa Leu Thr Asp
1 5
<210> 194
<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens 152
<222> (1)..(1)
<223> X1=S or N
<400> 194
Xaa Tyr Gly Ile Ser
1 5
<210> 195
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> X1=A or T
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> X2=N or Y
<400> 195
Trp Ile Ser Xaa Tyr Asn Gly Xaa Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln 1 5 10 15
Gly
<210> 196
<211> 10
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> X1=A or N
<400> 196
Asp Leu Arg Gly Thr Xaa Tyr Phe Asp Tyr
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> X1=N or S
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> X2=F or Y
<400> 197
Xaa Xaa Gly Ile Ser
1 5
<210> 198
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> X1=F or Y
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> X2=H or N
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> X3=D or N
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> X4=S or A
<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(15)
<223> X5=V or L
<400> 198 154 Gly
<210> 199
<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> X1=R or S
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> X2=H or Y
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> X3=T or S
<400> 199
Xaa Xaa Gly Ile Xaa
1 5
<210> 200
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> X1=D or Y
<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(15)
<223> X2=F or L
<220>
<221> VARIANT
<222> (17)..(17) 155 <223> X3=D or G
Trp Ile Ser Ala Xaa Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Xaa Gln 1 5 10 15
Xaa
<210> 201
<211> 14
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> X1=F or L
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> X2=P or no aa
<400> 201
Val Xaa Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Leu Xaa Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10
<210> 202
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> X1=Y or F
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> X2=P or W
<400> 202
Gln Gln Tyr Asn Ser Xaa Pro Xaa Thr
1 5
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> X1=D, V or A
<400> 203
Xaa Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 204
<211> 10
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> X1=R, I, L, W or MY
<400> 204
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Xaa Thr
1 5 10
<210> 205
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> X1=Q or E
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> X2=A or T
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> X3=N or S 157 <223> X4=P or T
<400> 205
Gln Xaa Xaa Xaa Ser Phe Xaa Trp Thr
1 5
<210> 206
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> X1=I or no aa
<400> 206
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Xaa Thr
1 5
<210> 207
<211> 10
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> X1=T or N
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> X2=Q or no aa
<400> 207
Gln Gln Phe Xaa Ser Tyr Pro Xaa Ile Thr
1 5 10
<210> 208
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens 158 <222> (5)..(5)
<223> X1=G or S
<400> 208
Gln Gln Ala Asn Xaa Phe Pro Ile Thr
1 5
<210> 209
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> X1=S or N
<400> 209
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Xaa Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 210
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> X1=Q or L
<400> 210
Ala Ala Ser Ser Leu Xaa Ser
1 5
<210> 211
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT 159 <222> (1)..(1)
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> X2=K or N
<400> 211
Xaa Gln Tyr Xaa Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 212
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> X1=V or A
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> X2=F or S
<400> 212
Gly Xaa Xaa Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 213
<211> 15
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 213
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15
<210> 214
<211> 12
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 214
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 160 1 5 10
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 215
Glu Pro Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 216
<211> 15
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 216
Glu Pro Lys Ser Xaa Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15
<210> 217
<211> 62
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 217
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 35 40 45
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 218 161
<211> 13
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10
<210> 219
<211> 15
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 219
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15

Claims (16)

Patentni zahtevi
1. Bispecifično antitelo koje sadrži prvo mesto za vezivanje antigena iz anti-c-Met antitela i drugo mesto za vezivanje antigena specifično za receptor epidermalnog faktora rasta, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži VH region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO: 98, 99 i 100 i VL region koji sadrži CDR1, 2 i 3 sekvence SEQ ID NO: 102, 103 i 104.
2. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 1, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži VH region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:97 i VL region koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:101.
3. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 1, gde antitelo je antitelo pune dužine.
4. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 1, gde antitelo je IgG1 antitelo, na primer IgG1,K.
5. Sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju teške i lake lance antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4.
6. Ekspresioni vektor, ili set ekspresionih vektora, koji kodiraju antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4.
7. Rekombinantna eukariotska ili prokariotska ćelija domaćin koja proizvodi antitelo kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4.
8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
9. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 8, pri čemu je terapeutski efikasna količina bispecifičnog antitela 0,1-50 mg/Kg ili 5-20 mg/Kg.
10. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 8 ili 9, pri čemu je farmaceutska kompozicija za primenu intravenskom ili subuktanoznom injekcijom ili infuzijom.
11. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 za upotrebu kao lek.
12. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 za upotrebu u lečenju kancera, kao što je kancer zavisan od HGF ili kancer nezavisan od HGF.
13. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 za upotrebu u lečenju kancera, pri čemu je kancer kancer pluća, kao što je kancer pluća ne-malih ćelija (NSCLC); kolorektalni kancer; kancer jednjaka; ili kancer želuca.
14. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 za upotrebu u lečenju kancera, pri čemu lečenje obuhvata davanje terapeutski efikasne količine antitela i najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa subjektu kome je to potrebno.
15. Bispecifično antitelo za upotrebu u lečenju kancera prema patentnom zahtevu 14, što je dodatni terapeutski agens inhibitor faktora rasta ili inhibitor tirozin kinaze.
16. Bispecifično antitelo za upotrebu u lečenju kancera prema patentnom zahtevu 15, što je inhibitor faktora rasta ili inhibitor tirozin kinaze gefitinib, erlotinib ili lapatinib.
RS20241085A 2010-03-10 2011-03-10 Monoklonska antitela protiv c-met RS66008B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31262210P 2010-03-10 2010-03-10
DKPA201000191 2010-03-10
DKPA201000862 2010-09-24
EP21171029.8A EP3904391B1 (en) 2010-03-10 2011-03-10 Monoclonal antibodies against c-met

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66008B1 true RS66008B1 (sr) 2024-10-31

Family

ID=44342987

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20241085A RS66008B1 (sr) 2010-03-10 2011-03-10 Monoklonska antitela protiv c-met

Country Status (26)

Country Link
US (6) US9068011B2 (sr)
EP (4) EP3511342B1 (sr)
JP (4) JP6055312B2 (sr)
KR (2) KR102059663B1 (sr)
CN (2) CN107739407B (sr)
AU (4) AU2011226103C1 (sr)
BR (1) BR112012022672B1 (sr)
CA (3) CA3254586A1 (sr)
DK (1) DK3904391T3 (sr)
EA (1) EA201201273A1 (sr)
ES (1) ES2993335T3 (sr)
FI (1) FI3904391T3 (sr)
HR (1) HRP20241246T1 (sr)
HU (1) HUE068433T2 (sr)
IL (1) IL221408B (sr)
LT (1) LT3904391T (sr)
MX (1) MX340295B (sr)
NZ (1) NZ602294A (sr)
PH (1) PH12012501793B1 (sr)
PL (1) PL3904391T3 (sr)
PT (1) PT3904391T (sr)
RS (1) RS66008B1 (sr)
SG (2) SG183190A1 (sr)
SI (1) SI3904391T1 (sr)
SM (1) SMT202400403T1 (sr)
WO (1) WO2011110642A2 (sr)

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3511342B1 (en) 2010-03-10 2024-01-17 Genmab A/S Monoclonal antibodies against c-met
EP2621953B1 (en) 2010-09-30 2017-04-05 Ablynx N.V. Biological materials related to c-met
US11644471B2 (en) 2010-09-30 2023-05-09 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
CN106046168A (zh) 2011-06-23 2016-10-26 埃博灵克斯股份有限公司 结合血清白蛋白的蛋白
DK2723769T4 (da) 2011-06-23 2022-09-05 Ablynx Nv Teknikker til at forudsige, påvise og reducere uspecifik proteininterferens i assays, som involverer variable immunglobulin-enkeltdomæner
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
CA2843771A1 (en) * 2011-09-20 2013-03-28 Eli Lilly And Company Anti-c-met antibodies
CN103889451B (zh) * 2011-09-30 2016-06-29 埃博灵克斯股份有限公司 与C-Met相关的生物物质
US9346884B2 (en) * 2011-09-30 2016-05-24 Ablynx N.V. Biological materials related to c-Met
KR20130037153A (ko) * 2011-10-05 2013-04-15 삼성전자주식회사 항 ｃ-Ｍｅｔ 항체 및 그의 용도
CA2854806A1 (en) * 2011-11-07 2013-05-16 Medimmune, Llc Multispecific and multivalent binding proteins and uses thereof
EP2782932A1 (en) 2011-11-21 2014-10-01 F.Hoffmann-La Roche Ag Purification of anti-c-met antibodies
WO2013079973A1 (en) * 2011-12-02 2013-06-06 Di Cara Danielle Marie Antibodies against hgf - receptor and uses
GB201121914D0 (en) 2011-12-20 2012-02-01 Ge Healthcare Ltd Method for patient selection
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US9708601B2 (en) 2012-04-26 2017-07-18 Vaccinex, Inc. Fusion proteins to facilitate selection of cells infected with specific immunoglobulin gene recombinant vaccinia virus
WO2013192594A2 (en) * 2012-06-21 2013-12-27 Sorrento Therapeutics Inc. Antigen binding proteins that bind c-met
BR112015000167B1 (pt) 2012-07-06 2021-11-23 Genmab B.V. Proteína dimérica, proteína, composição, kit de partes e seus usos, bem como método para aumentar a oligomerização em solução de uma proteína dimérica compreendendo um primeiro e segundo polipeptídeo, cada um compreendendo pelo menos as regiões ch2 e ch3 de uma cadeia pesada de igg1 humana e proteína dimérica variante
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
US9695228B2 (en) 2012-11-21 2017-07-04 Janssen Biotech, Inc. EGFR and c-Met fibronectin type III domain binding molecules
CN113201073A (zh) 2012-11-21 2021-08-03 詹森生物科技公司 双特异性EGFR/c-Met抗体
US20170275367A1 (en) 2012-11-21 2017-09-28 Janssen Biotech, Inc. Bispecific EGFR/C-Met Antibodies
KR20200024345A (ko) 2013-01-10 2020-03-06 젠맵 비. 브이 인간 IgG1 Fc 영역 변이체 및 그의 용도
JP2014157056A (ja) * 2013-02-15 2014-08-28 Fujirebio Inc ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅細胞の検出方法
TW201444872A (zh) 2013-03-06 2014-12-01 Merrimack Pharmaceuticals Inc 抗Ｃ－ＭＥＴ串聯Ｆｃ雙特異性抗體
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
EP2787008B1 (en) * 2013-04-02 2019-09-04 Samsung Electronics Co., Ltd. Anti-idiotype antibody against anti-C-met antibody
US10214593B2 (en) 2013-04-02 2019-02-26 Samsung Electronics Co., Ltd. Anti-idiotype antibody against anti-c-MET antibody
CN105899226B (zh) 2013-10-14 2020-05-12 詹森生物科技公司 半胱氨酸工程化iii型纤连蛋白域结合分子
EA039356B1 (ru) * 2013-10-18 2022-01-18 Янссен Байотек, Инк. БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ К EGFR/c-Met АНТИТЕЛА
US9717715B2 (en) 2013-11-15 2017-08-01 Samsung Electronics Co., Ltd. Method of combination therapy using an anti-C-Met antibody
KR102372245B1 (ko) 2013-11-21 2022-03-08 젠맵 에이/에스 항체-약물 접합체 동결건조 제제
CN105085680A (zh) * 2014-05-23 2015-11-25 复旦大学 人源化抗PD-1及c-MET双特异性抗体及其制备方法和应用
KR101615619B1 (ko) * 2014-08-07 2016-04-26 주식회사 파멥신 c-Met 특이적 인간 항체 및 그 제조방법
US10450376B2 (en) 2014-09-16 2019-10-22 Symphogen A/S Anti-MET antibodies and compositions
HK1243940A1 (zh) 2014-11-06 2018-07-27 Scholar Rock, Inc. 抗原肌肉生长抑制素/潜在肌肉生长抑制素的抗体及其用途
US11596652B2 (en) 2015-02-18 2023-03-07 Enlivex Therapeutics R&D Ltd Early apoptotic cells for use in treating sepsis
US11318163B2 (en) 2015-02-18 2022-05-03 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
WO2016170541A1 (en) 2015-04-21 2016-10-27 Enlivex Therapeutics Ltd. Therapeutic pooled blood apoptotic cell preparations and uses thereof
US11000548B2 (en) 2015-02-18 2021-05-11 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11304976B2 (en) 2015-02-18 2022-04-19 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11512289B2 (en) 2015-02-18 2022-11-29 Enlivex Therapeutics Rdo Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11497767B2 (en) 2015-02-18 2022-11-15 Enlivex Therapeutics R&D Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
JP2018527903A (ja) * 2015-07-22 2018-09-27 スカラー ロック インコーポレイテッドＳｃｈｏｌａｒ Ｒｏｃｋ，Ｉｎｃ． Ｇｄｆ１１結合タンパク質およびその使用
LT3350220T (lt) 2015-09-15 2021-09-27 Scholar Rock, Inc. Anti pro/latentinio miostatino antikūnai ir jų panaudojimas
CN108350078A (zh) * 2015-11-03 2018-07-31 默克专利股份公司 用于提高肿瘤选择性和抑制的双特异性抗体及其用途
CN115814077A (zh) 2016-01-08 2023-03-21 供石公司 抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其使用方法
CN109069539A (zh) 2016-02-18 2018-12-21 恩立夫克治疗有限责任公司 用于癌症治疗的联合免疫疗法和细胞因子控制疗法
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
AU2017283546C1 (en) 2016-06-13 2020-11-19 Scholar Rock, Inc. Use of myostatin inhibitors and combination therapies
JP2019527540A (ja) 2016-06-21 2019-10-03 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド システイン操作フィブロネクチンｉｉｉ型ドメイン結合分子
KR102449406B1 (ko) 2016-08-02 2022-09-29 백시넥스 인코포레이티드 백시니아 바이러스/진핵 세포에서 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 생산하기 위한 개선된 방법
JP6942179B2 (ja) * 2016-09-29 2021-09-29 田辺三菱製薬株式会社 ｃＭＥＴモノクローナル結合剤、その薬物複合体およびその使用
TWI782930B (zh) * 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
US10611823B2 (en) 2016-12-14 2020-04-07 Hanssen Biotech, Inc CD137 binding fibronectin type III domains
NZ754187A (en) 2016-12-14 2026-02-27 Janssen Biotech Inc Cd8a-binding fibronectin type iii domains
WO2018111976A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Janssen Biotech, Inc. Pd-l1 binding fibronectin type iii domains
WO2018129029A1 (en) * 2017-01-04 2018-07-12 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
ES2944357T3 (es) 2017-01-06 2023-06-20 Scholar Rock Inc Tratamiento de enfermedades metabólicas inhibiendo la activación de miostatina
CN106831995A (zh) * 2017-03-31 2017-06-13 北京百特美博生物科技有限公司 新型双特异性抗体及其用途
JP2020521452A (ja) 2017-05-24 2020-07-27 パンディオン・セラピューティクス・インコーポレイテッド 標的化免疫寛容
NZ758605A (en) * 2017-05-30 2022-07-29 Chong Kun Dang Pharmaceutical Corp A novel anti-c-met antibody and use thereof
WO2019075097A1 (en) * 2017-10-11 2019-04-18 Board Of Regents, The University Of Texas System PD-L1 HUMAN ANTIBODIES AND METHODS OF USE
US10174091B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
TWI841554B (zh) 2018-03-21 2024-05-11 丹麥商珍美寶股份有限公司 以鉑為主之劑與抗組織因子抗體－藥物共軛物的組合治療癌症之方法
EP3768726B1 (en) 2018-03-23 2024-10-30 Board of Regents, The University of Texas System Dual specificity antibodies to pd-l1 and pd-l2 and methods of use therefor
WO2019182867A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Dual specificity antibodies to human pd-l1 and pd-l2 and methods of use therefor
CN119101158A (zh) 2018-03-23 2024-12-10 得克萨斯州大学系统董事会 人pd-l2抗体及其使用方法
WO2019217455A1 (en) 2018-05-07 2019-11-14 Genmab A/S Methods of treating cancer with a combination of an anti-pd-1 antibody and an anti-tissue factor antibody-drug conjugate
EP3822355A4 (en) * 2018-07-10 2022-05-18 Genemedicine Co., Ltd. ANTITUMOR COMPOSITION
TWI844571B (zh) 2018-10-30 2024-06-11 丹麥商珍美寶股份有限公司 使用抗血管內皮生長因子（ｖｅｇｆ）抗體與抗組織因子（ｔｆ）抗體－藥物共軛體之組合以治療癌症之方法
KR102396194B1 (ko) * 2018-12-07 2022-05-10 서울대학교 산학협력단 항 c-Met 아고니스트 항체 및 이의 용도
KR102433184B1 (ko) * 2018-12-07 2022-08-17 서울대학교 산학협력단 항 c-Met 아고니스트 항체 및 이의 용도
WO2020236875A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 Pandion Therapeutics, Inc. Madcam targeted immunotolerance
WO2021013068A1 (en) * 2019-07-19 2021-01-28 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Polypeptide complex for conjugation and use thereof
CN120842421A (zh) 2019-07-30 2025-10-28 魁尔斯弗生物治疗股份有限公司 双特异性抗LRRC15和CD3ε抗体
US11896682B2 (en) 2019-09-16 2024-02-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled MET binding proteins for immuno-PET imaging and methods of use thereof
CN114786682B (zh) 2019-10-14 2024-07-16 Aro生物疗法公司 结合cd71的纤维粘连蛋白iii型结构域
WO2021076543A1 (en) 2019-10-14 2021-04-22 Aro Biotherapeutics Company Epcam binding fibronectin type iii domains
WO2021076574A2 (en) 2019-10-14 2021-04-22 Aro Biotherapeutics Company Fn3 domain-sirna conjugates and uses thereof
CN111171147B (zh) * 2020-02-11 2021-07-20 北京康普美特创新医药科技有限责任公司 一种抗补体c3分子的全人源单克隆抗体及应用
US11981715B2 (en) 2020-02-21 2024-05-14 Pandion Operations, Inc. Tissue targeted immunotolerance with a CD39 effector
CN111620944B (zh) * 2020-06-01 2023-03-21 长春师范大学 一种全人源化抗乙肝病毒单克隆抗体、制备方法及其应用
CN112521507B (zh) * 2020-08-10 2021-06-08 北京鼎成肽源生物技术有限公司 抗人c-Met人鼠嵌合单克隆抗体及其应用
IL300854A (en) 2020-08-25 2023-04-01 Janssen Biotech Inc Treatment of non-small cell lung cancer with EGFR mutations
CN118480117B (zh) * 2021-01-18 2025-03-04 上海药明合联生物技术有限公司 工程化抗体和包含工程化抗体的抗体-药物偶联物
BR112023021318A2 (pt) 2021-04-14 2023-12-19 Aro Biotherapeutics Company Conjugados de domínio fn3-sirna e usos dos mesmos
CA3214552A1 (en) 2021-04-14 2022-10-20 Russell C. Addis Cd71 binding fibronectin type iii domains
CA3221816A1 (en) * 2021-06-25 2022-12-29 Han-Chung Wu Combined cancer therapy with an epithelial cell adhesion molecule (epcam) inhibitor and a hepatocyte growth factor receptor (hgfr) inhibitor
CN113621058B (zh) * 2021-08-19 2023-05-23 中国科学院微生物研究所 黄热病毒抗体及其应用
CA3230934A1 (en) * 2021-09-03 2023-03-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cmet antibodies and their uses
CN116178530A (zh) * 2021-09-26 2023-05-30 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗体在治疗SARS-CoV-2感染的用途
CN116725960A (zh) * 2022-03-11 2023-09-12 上海君实生物医药科技股份有限公司 新型冠状病毒抗体药物组合物及其用途
AU2023247654A1 (en) 2022-04-02 2024-11-14 Biotheus Inc. Monoclonal antibody and bispecific antibody against c-met
CA3263050A1 (en) 2022-07-30 2024-02-08 Pinetree Therapeutics, Inc. Compositions for targeted lysosomal degradation and their methods of use
IL321628A (en) 2022-12-22 2025-08-01 Scholar Rock Inc Selective and potent inhibitory antibodies for myostatin activation
KR20250135302A (ko) * 2023-01-19 2025-09-12 비원 메디슨즈 아이 게엠베하 항-cmet 항체 및 사용 방법
KR20260005269A (ko) 2023-04-24 2026-01-09 치아타이 티안큉 파마수티컬 그룹 주식회사 c-Met를 표적으로 하는 다중 특이성 항체
PE20260306A1 (es) 2023-06-12 2026-02-11 Amgen Inc Proteinas de union a receptor de linfotoxina beta agonistas
WO2025180462A1 (zh) * 2024-03-01 2025-09-04 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 双功能融合蛋白

Family Cites Families (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US835A (en) 1838-07-12 X i i i x
US6077A (en) 1849-01-30 Improved hinged claw-wrench
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
EP0098110B1 (en) 1982-06-24 1989-10-18 NIHON CHEMICAL RESEARCH KABUSHIKI KAISHA also known as JAPAN CHEMICAL RESEARCH CO., LTD Long-acting composition
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5648273A (en) 1989-12-27 1997-07-15 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Hepatic growth factor receptor is the MET proto-oncogene
WO1991009974A1 (en) 1989-12-27 1991-07-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce Diagnostic probe for detecting human stomach cancer
US5362716A (en) 1989-12-27 1994-11-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods for stimulating hematopoietic progenitors using hepatocyte growth factor and lymphokines
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69133349T2 (de) 1990-09-14 2004-10-07 Us Health Ein nicht-mitogener kompetitiver hgf-antagonist
US6566098B1 (en) 1990-09-14 2003-05-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA encoding truncated hepatocyte growth factor variants
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
DE69224906T2 (de) 1991-07-08 1998-10-29 Univ Massachusetts Thermotropes flüssig-kristallines segment-blockcopolymer
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
AU4645293A (en) 1992-06-26 1994-01-24 United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The The met proto-oncogene and a method for predicting breast cancer progression
DE69334159D1 (de) 1992-09-18 2007-09-13 Us Gov Health & Human Serv Medizinische Verwendung eines Antikörpers oder eines Antikörperfragments gegen die extrazelluläre Domäne von Met zur Prevention von Metastasen
US5361922A (en) 1993-04-02 1994-11-08 Beckman Instruments, Inc. Centrifuge tubes with snap plugs
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
US6214344B1 (en) 1995-06-02 2001-04-10 Genetech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonists and uses thereof
US5646036A (en) 1995-06-02 1997-07-08 Genentech, Inc. Nucleic acids encoding hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies
US5686292A (en) 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
CA2347067C (en) 1998-03-31 2013-09-17 Geron Corporation Dendritic cell vaccine containing telomerase reverse transcriptase for the treatment of cancer
CA2361421A1 (en) 1999-02-03 2000-08-10 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
DE60037896D1 (de) 1999-07-29 2008-03-13 Medarex Inc Menschliche antikörper gegen her2/neu
IL148079A0 (en) 1999-08-24 2002-09-12 Medarex Inc Human ctla-4 antibodies and compositions containing the same
EP1355921A2 (en) 2000-06-29 2003-10-29 North Shore-Long Island Jewish Health System Modulators of cellular proliferation and angiogenesis, methods for use and identification thereof
WO2002042468A2 (en) 2000-11-27 2002-05-30 Geron Corporation Glycosyltransferase vectors for treating cancer
CN1487996B (zh) 2000-11-30 2010-06-16 米德列斯公司 用于生产人类抗体的转基因转染色体啮齿动物
AU2002329540A1 (en) 2001-06-20 2003-01-02 Morphosys Ag Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
AU2002351208A1 (en) 2001-12-03 2003-06-17 Abgenix, Inc. Antibodies against carbonic anhydrase IX (CA IX) tumor antigen
AU2002357388A1 (en) 2001-12-27 2003-07-24 The United States Of America, As Represented By The Department Of Veterans Affairs Monoclonal antibody imaging and therapy of tumors that express met and bind hepatocyte growth factor
AU2003216341A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Dyax Corporation Mhc-peptide complex binding ligands
WO2004072117A2 (en) 2003-02-13 2004-08-26 Pharmacia Corporation Antibodies to c-met for the treatment of cancers
ITMI20031127A1 (it) 2003-06-05 2004-12-06 Uni Degli Studi Del Piemont E Orientale Am Anticorpi anti-hgf-r e loro uso
MXPA05013181A (es) 2003-06-06 2006-06-23 Genentech Inc Metodos y composiciones para modular hgf/met.
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
KR100556660B1 (ko) 2003-11-11 2006-03-10 국립암센터 Ｈｇｆ의 중화가능 에피토프 및 이에 결합하는 중화 항체
RS53984B1 (sr) 2003-12-10 2015-10-30 E. R. Squibb & Sons L.L.C. Ip-10 antitela i njihove upotrebe
US20050233960A1 (en) 2003-12-11 2005-10-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for inhibiting c-met dimerization and activation
KR100956913B1 (ko) 2003-12-19 2010-05-11 제넨테크, 인크. 치료제로서 유용한 일가 항체 단편
CN1961002B (zh) 2004-05-27 2011-05-18 克鲁塞尔荷兰公司 能中和狂犬病病毒的结合分子及其应用
EP1773885B1 (en) 2004-08-05 2010-04-21 Genentech, Inc. Humanized anti-cmet antagonists
US8911726B2 (en) * 2004-09-22 2014-12-16 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Stabilized human Igg4 antibodies
WO2006104911A2 (en) 2005-03-25 2006-10-05 Genentech, Inc. Methods and compositions for modulating hyperstabilized c-met
KR20130114763A (ko) 2005-03-31 2013-10-18 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 Ｈｇｆ／ｈｇｆｒ 활성의 모니터링 및 조정
AR056142A1 (es) 2005-10-21 2007-09-19 Amgen Inc Metodos para generar el anticuerpo igg monovalente
US10155816B2 (en) 2005-11-28 2018-12-18 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
CA2638889C (en) 2006-02-06 2015-06-02 Metheresis Translational Research S.A. Anti-met monoclonal antibody, fragments and vectors thereof, for the treatment of tumors and corresponding products
EP2004693B1 (en) 2006-03-30 2012-06-06 Novartis AG Compositions and methods of use for antibodies of c-met
AR059922A1 (es) 2006-04-01 2008-05-07 Galaxy Biotech Llc Anticuerpos monoclonales humanizados para el factor de crecimiento de hepatocitos
US8519106B2 (en) * 2007-03-13 2013-08-27 University Of Zurich Monoclonal human tumor-specific antibody
US20080300108A1 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Eybergen William N Torque transfer device and system
CA2689895A1 (en) * 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Non-glycosylated recombinant monovalent antibodies
AU2008255352B2 (en) 2007-05-31 2014-05-22 Genmab A/S Stable IgG4 antibodies
EP2014681A1 (en) 2007-07-12 2009-01-14 Pierre Fabre Medicament Novel antibodies inhibiting c-met dimerization, and uses thereof
WO2009097006A2 (en) 2007-08-10 2009-08-06 Medarex, Inc. Hco32 and hco27 and related examples
WO2009083009A2 (en) * 2008-01-03 2009-07-09 Genmab A/S Monoclonal antibodies against cd32b
RU2601892C2 (ru) * 2008-03-06 2016-11-10 Дженентек, Инк. Комбинированная терапия антагонистами с-мет и egfr
US8163551B2 (en) 2008-05-02 2012-04-24 Seattle Genetics, Inc. Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation
US8455623B2 (en) 2008-05-21 2013-06-04 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
NZ591087A (en) 2008-10-01 2012-08-31 Micromet Ag Cross-species-specific pscaxcd3, cd19xcd3, c-metxcd3, endosialinxcd3, epcamxc d3, igf-1rxcd3 or fapalpha xcd3 bispecific single chain antibody
PA8849001A1 (es) 2008-11-21 2010-06-28 Lilly Co Eli Anticuerpos de c-met
AR074438A1 (es) 2008-12-02 2011-01-19 Pf Medicament Proceso para la modulacion de la actividad antagonista de un anticuerpo monoclonal
WO2010064089A1 (en) 2008-12-02 2010-06-10 Pierre Fabre Medicament Novel anti-cmet antibody
AR074439A1 (es) 2008-12-02 2011-01-19 Pf Medicament Anticuerpo anti-cmet (receptor c-met)
WO2010064090A1 (en) 2008-12-02 2010-06-10 Pierre Fabre Medicament Process for the modulation of the antagonistic activity of a monoclonal antibody
EP3511342B1 (en) 2010-03-10 2024-01-17 Genmab A/S Monoclonal antibodies against c-met
CN113201073A (zh) * 2012-11-21 2021-08-03 詹森生物科技公司 双特异性EGFR/c-Met抗体
US20170275367A1 (en) 2012-11-21 2017-09-28 Janssen Biotech, Inc. Bispecific EGFR/C-Met Antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017265061B2 (en) 2019-09-19
EP3511342A1 (en) 2019-07-17
KR102059663B1 (ko) 2019-12-26
KR20130012128A (ko) 2013-02-01
JP6697027B2 (ja) 2020-05-20
CA3254586A1 (en) 2025-11-29
MX340295B (es) 2016-07-05
EP3904391B1 (en) 2024-07-10
NZ602294A (en) 2015-04-24
EP2545077A2 (en) 2013-01-16
PH12012501793B1 (en) 2018-08-24
BR112012022672B1 (pt) 2020-04-14
AU2019283925A1 (en) 2020-01-16
HRP20241246T1 (hr) 2024-12-06
JP7034204B2 (ja) 2022-03-11
AU2016200093A1 (en) 2016-02-04
EP4483963A2 (en) 2025-01-01
IL221408A0 (en) 2012-10-31
EP3511342B1 (en) 2024-01-17
US20170320962A1 (en) 2017-11-09
SG183190A1 (en) 2012-09-27
US20200079872A1 (en) 2020-03-12
KR101814571B1 (ko) 2018-01-04
CA2791863A1 (en) 2011-09-15
US11512140B2 (en) 2022-11-29
EA201201273A1 (ru) 2013-02-28
US20130216548A1 (en) 2013-08-22
CN107739407A (zh) 2018-02-27
CN103003307A (zh) 2013-03-27
WO2011110642A3 (en) 2012-07-05
CA2791863C (en) 2022-06-21
JP2017008041A (ja) 2017-01-12
EP2545077B1 (en) 2018-10-31
US20150329642A1 (en) 2015-11-19
JP6055312B2 (ja) 2017-01-11
DK3904391T3 (en) 2024-10-14
AU2011226103A1 (en) 2012-09-27
AU2011226103C1 (en) 2016-04-28
CA3157780A1 (en) 2011-09-15
PH12012501793A1 (en) 2012-12-10
BR112012022672A2 (pt) 2017-02-14
JP2018174937A (ja) 2018-11-15
CA3157780C (en) 2026-01-13
EP3904391A1 (en) 2021-11-03
US9068011B2 (en) 2015-06-30
WO2011110642A2 (en) 2011-09-15
SI3904391T1 (sl) 2024-10-30
CN103003307B (zh) 2017-08-11
JP6348541B2 (ja) 2018-06-27
JP2013529059A (ja) 2013-07-18
AU2019283925B2 (en) 2021-12-02
IL221408B (en) 2020-09-30
JP2020198874A (ja) 2020-12-17
PT3904391T (pt) 2024-10-14
US20240084036A1 (en) 2024-03-14
SMT202400403T1 (it) 2024-11-15
AU2011226103B2 (en) 2016-01-28
CN107739407B (zh) 2021-07-06
US9657107B2 (en) 2017-05-23
LT3904391T (lt) 2024-10-10
US20170313782A1 (en) 2017-11-02
ES2993335T3 (en) 2024-12-27
AU2017265061A1 (en) 2017-12-14
HUE068433T2 (hu) 2024-12-28
PL3904391T3 (pl) 2024-11-12
KR20180004292A (ko) 2018-01-10
MX2012009987A (es) 2012-11-30
EP4483963A3 (en) 2025-09-24
FI3904391T3 (fi) 2024-10-02
SG10201501767VA (en) 2015-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240084036A1 (en) Monoclonal antibodies against c-met
HK40063966A (en) Monoclonal antibodies against c-met
HK40063966B (en) Monoclonal antibodies against c-met
DK2545077T3 (en) Monoclonal antibodies to c-Met
HK40011497A (en) Monoclonal antibodies against c-met
HK40011497B (en) Monoclonal antibodies against c-met
HK1180698A (en) Monoclonal antibodies against c-met
HK1180698B (en) Monoclonal antibodies against c-met
EA045516B1 (ru) Моноклональные антитела к с-мет