ES2993335T3 - Monoclonal antibodies against c-met - Google Patents

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ES2993335T3 ES21171029T ES21171029T ES2993335T3 ES 2993335 T3 ES2993335 T3 ES 2993335T3 ES 21171029 T ES21171029 T ES 21171029T ES 21171029 T ES21171029 T ES 21171029T ES 2993335 T3 ES2993335 T3 ES 2993335T3
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Goeij Bart De
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Aran Labrijn
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Janine Schuurman
Paul Parren
De Winkel Jan Van
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Abstract

Se describen anticuerpos monoclonales aislados que se unen a c-Met humano, el receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, y composiciones y moléculas basadas en anticuerpos relacionadas. También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos y métodos terapéuticos y de diagnóstico para utilizar los anticuerpos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos monoclonales contra c-Met
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales dirigidos a c-Met humano, el receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, y a los usos de dichos anticuerpos, en particular a su uso en el tratamiento del cáncer.
Antecedentes de la invención
c-Met es una proteína tirosina cinasa receptora que atraviesa la membrana. El precursor principalmente de cadena única se escinde postraduccionalmente para producir la forma madura del heterodímero c-Met que consiste en una cadena a extracelular (50 kDa) y una cadena p transmembrana más larga (145 kDa), que están unidas por disulfuro (Birchmeieret al.2003. Nat Rev Mol Cell Biol 4:915). La parte extracelular de c-Met está compuesta por tres tipos de dominios. El dominio SEMA N-terminal está formado por toda la subunidad a y parte de la subunidad p, y abarca la homología con las proteínas semaforinas. Al dominio SEMA le sigue un dominio rico en cisteína y además cuatro dominios similares a inmunoglobulina (Ig). La parte citoplasmática contiene un dominio cinasa yuxtamembrana y una cola carboxiterminal que es esencial para la señalización posterior. El único ligando conocido de alta afinidad para c-Met, el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF, por sus siglas en inglés), se expresa principalmente por fibroblastos en condiciones normales (Li y Tseng 1995. J Cell Physiol 163:61) y por células tumorales (Ferraciniet al.1995. Oncogene 10:739). El HGF (también llamado factor de dispersión: SF, por sus siglas en inglés) se sintetiza como un precursor que se convierte proteolíticamente en un heterodímero a/p activo. Basándose en la estructura cristalina del fragmento de unión al receptor, se cree que el HGF se une a c-Met como un dímero (Chirgadzeet al.1999. Nat Struct Biol 6:72). La cadena HGF-a se une con alta afinidad al dominio similar a Ig en c-Met, mientras que la cadena HGF-p se une con baja afinidad al dominio SEMA c-Met (Basilicoet al.2008. J Biol Chem 283:21267). La última interacción es responsable de la dimerización de c-Met y la activación de la tirosina cinasa del receptor tras la unión del heterodímero HGF activo. La autofosforilación del receptor da como resultado un sitio de acoplamiento único para el reclutamiento de efectores, de los cuales la unión de Gab1 (ligando 1 asociado a la proteína 2 unida al receptor del factor de crecimiento [Grb2]) es esencial para las principales vías de señalización posterior de c-Met (Comoglioet al.
2008. Nat Rev Drug Discov 7:504):
• Vía Ras-ERK1/2: proliferación.
• Vía Ras-Rac: invasión, motilidad, transición epitelial a mesenquimatosa.
• Vía PI3K-Akt: supervivencia.
c-Met se expresa en la superficie de las células epiteliales y endoteliales de muchos órganos durante la embriogénesis y en la edad adulta, incluido el hígado, el páncreas, la próstata, el riñón, el músculo y la médula ósea. La activación de c-Met desempeña un papel esencial en el llamado programa de "crecimiento invasivo" que consiste en una serie de procesos, incluida la proliferación, motilidad, angiogénesis y protección contra la apoptosis (Boccaccio y Comoglio 2006. Nat Rev Cancer 6:637). Estos procesos regulados por c-Met ocurren en condiciones fisiológicas normales durante el desarrollo embrionario, reparación de lesiones hepáticas y cardíacas, y patológicamente durante la oncogénesis (Ederet al.2009. Clin Cancer Res 15:2207).
La señalización inadecuada de c-Met ocurre en prácticamente todos los tipos de tumores sólidos, tales como cánceres de la vejiga, mama, cervicouterino, colorrectal, gástrico, cabeza y cuello, hígado, pulmón, ovario, pancreático, próstata, renal y de tiroides, así como en diferentes sarcomas, neoplasias malignas hematopoyéticas y melanoma (Birchmeieret al.2003. Nat Rev Mol Cell Biol 4:915; Comoglioet al.2008. Nat Rev Drug Discov 7:504; Peruzzi y Bottaro 2006. Clin Cancer Res 12:3657). Los mecanismos subyacentes de la tumorigenicidad de c-Met se logran normalmente de tres maneras diferentes:
• bucles autocrinos de HGF/c-Met,
• sobreexpresión de c-Met o HGF,
• mutaciones activadoras de cinasas en la secuencia codificante del receptor c-Met.
Más notablemente, se han identificado mutaciones activadoras de c-Met en pacientes con cáncer renal papilar hereditario (Schmidtet al.1997. Nat Genet 16:68). La activación constitutiva de c-Met contribuye a una o una combinación de fenotipos de cáncer proliferativos, invasivos, de supervivencia o angiogénicos. Se ha demostrado que el silenciamiento génico de c-Met expresado endógenamente en células tumorales da como resultado la falta de proliferación y crecimiento tumoral y la regresión de la metástasis establecida, así como una menor generación de nuevas metástasis (Corsoet al.2008. Oncogene 27:684).
Como c-Met contribuye a múltiples estadios del desarrollo del cáncer, desde la iniciación hasta el avance y la metástasis, c-Met y su ligando h Gf se han convertido en candidatos principales para terapias dirigidas contra el cáncer (Comoglioet al.2008. Nat Rev Drug Discov 7:504; Knudsen y Vande Woude 2008. Curr Opin Genet Dev 18:87). Se están explorando varias estrategias para alcanzar este objetivo:
• Receptores señuelo: las subregiones de HGF o c-Met o análogos moleculares pueden actuar de forma antagónica como competidores estequiométricos al bloquear la unión del ligando o la dimerización del receptor. Un ejemplo de tal subregión antagónica de HGF es NK4 (Kringle Pharma).
• Inhibidores de la tirosina cinasa (TKI, por sus siglas en inglés) de molécula pequeña: Tres TKI específicos de c-Met en diferentes estadios de evaluación clínica son ARQ197 (ArQule), JNJ 38877605 (Johnson & Johnson) y PF-04217903 (Pfizer).
• Anticuerpos monoclonales anti-HGF, tales como AMG102, rilotumumab (Amgen), HuL2G7 (Takeda) y AV-299 (Schering).
• Se han descrito anticuerpos monoclonales anti-c-Met en los documentos WO2005016382, WO2006015371, WO2007090807, WO2007126799 WO2009007427, WO2009142738 y van der Horstet al.(van der Horstet al.
2009. Neoplasoa 11:355). MetMAb (Genentech) es un anticuerpo OA-5D5 monovalente humanizado (de un solo brazo) que se une al dominio extracelular de c-Met, evitando de este modo la unión del HGF y la posterior activación del receptor (Jinet al.2008. Cancer Res 68:4360). En modelos de xenoinjerto de ratón, se descubrió que el tratamiento con MetMAb inhibe el crecimiento tumoral del glioblastoma ortotópico impulsado por HGF y de los tumores pancreáticos subcutáneos (Jinet al.2008. Cancer Res 68:4360; Martenset al.2006. Clin Cancer Res 12:6144). h224G11 (Pierre Fabre) (Corvaia y Boute 2009. Resumen 835 (100.a Reunión Anual de la AACR) es un anticuerpo IgG1 anti-c-Met bivalente humanizado. Se han observado efectos antitumorales de este anticuerpo en ratones. (Goetschet al.2009. Resumen 2792 (100.a Reunión Anual de la AACR). CE-355621 (Pfizer) es una IgG2 humana que bloquea la unión del ligando al unirse al dominio extracelular de c-Met e inhibe el crecimiento dependiente de HGF en modelos de xenoinjerto tumoral (Tsenget al.2008. J Nucl Med 49:129). El documento WO2009111691 divulga un anticuerpo biespecífico contra c-Met y EGFR.
En conclusión, se están investigando varios productos anti-c-Met, pero hasta el momento no se ha aprobado ningún producto anti-c-Met para uso terapéutico. Sigue existiendo la necesidad de productos eficaces y seguros para el tratamiento de enfermedades graves relacionadas con c-Met, tales como cáncer.
Sumario de la invención
Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar nuevos anticuerpos anti-c-Met biespecíficos altamente específicos y efectivos para uso médico, en donde los anticuerpos biespecíficos tienen un segundo sitio de unión a antígeno específico para el receptor del factor de crecimiento epidérmico. Los anticuerpos biespecíficos de la invención exhiben características de unión a c-Met que difieren de los anticuerpos descritos en la técnica. Los anticuerpos biespecíficos de la invención tienen una alta afinidad hacia c-Met humano, son antagónicos y tienen un perfil farmacocinético favorable para su uso en pacientes humanos. En consecuencia, en el aspecto principal, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-c-Met y un segundo sitio de unión a antígeno específico del receptor del factor de crecimiento epidérmico, en donde el primer sitio de unión a antígeno comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 98, 99 y 100 y una región VL que comprende las secuencias CDR1,2 y 3 de SEQ ID NO: 102, 103 y 104. La invención se refiere además a secuencias de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo. En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la invención. La invención también se refiere al anticuerpo de la invención para su uso como medicamento que puede usarse en el tratamiento del cáncer.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1:Alineación de las secuencias de la región variable de la cadena pesada de los HuMab. Sobre la base de estas secuencias, se puede definir una secuencia de consenso para algunas de las secuencias CDR. Estas secuencias de consenso se dan en la Tabla 4.
Figura 2:Alineación de las secuencias de la región variable de la cadena ligera de los HuMab. Sobre la base de estas secuencias, se puede definir una secuencia de consenso para algunas de las secuencias CDR. Estas secuencias de consenso se dan en la Tabla 4.
Figura 3:Curvas de unión de formas monovalentes y bivalentes de anticuerpos anti-c-Met a células A431 que expresan c-Met. Los datos mostrados son la MFI(mean fluorescence intensity,intensidad de fluorescencia media) de un experimento representativo. Debido a que IgG1-024 y Uni-068 no mostraron una unión saturada a las células A431, no fue posible calcular un valor preciso de CE50.
Figura 4:Unión de anticuerpos a c-Met expresados en células epiteliales de mono Rhesus. Los datos mostrados son la MFI de un experimento.
Figura 5:Inhibición inducida por anticuerpos anti-c-Met de la unión de HGF al dominio extracelular del receptor c-Met. Los datos mostrados son un experimento representativo.
Figura 6:Curvas de inhibición de la unión de HGF de los varios anticuerpos anti-c-Met para la unión a cMetSEMA_567His8 sometidos a ensayo con TR-FRET. Los datos mostrados son la media de la MFI ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
Figura 7:Porcentaje de inhibición de células KP4 viables tras el tratamiento con anticuerpos anti-c-Met en comparación con células no tratadas (0 %). Los datos mostrados son porcentajes de inhibición de células viables de dos experimentos independientes ± la desviación estándar. IgG1-1016-022 sólo fue positivo en un experimento.
Figura 8:Eficacia de los anticuerpos anti-c-Met para inhibir el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto KP4 en ratones SCID. Los ratones se trataron con 400 |jg de anticuerpo en el día 9, seguido semanalmente de una dosis de mantenimiento de 200 jg . Se muestra la mediana de los tamaños tumorales por grupo de tratamiento.
Figura 9:Eficacia de los anticuerpos anti-c-Met para inhibir el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto KP4 en ratones SCID. Los ratones se trataron con 400 jg de anticuerpo en el día 9, seguido semanalmente de una dosis de mantenimiento de 200 jg . Efecto del tratamiento sobre la incidencia de tumores a lo largo del tiempo. Se muestra el porcentaje de ratones exentos de tumores (tamaños tumorales <500 mm3). La formación de tumores se retrasa en ratones tratados con anticuerpos antagonistas en comparación con los anticuerpos de control.
Figura 10:Eficacia de los anticuerpos anti-c-Met para inhibir el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto MKN45 en ratones SCID. Los ratones se trataron con 40 mg/kg de anticuerpo el día 7 y 20 mg/kg de anticuerpo los días 14, 21 y 28. Se muestran los tamaños tumorales medios hasta que el 50 % de los ratones alcanzaron el punto final de 700 mm3, por grupo de tratamiento.
Figura 11:Eficacia de los anticuerpos anti-c-Met para inhibir el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto MKN45 en ratones SCID. Los ratones se trataron con 40 mg/kg de anticuerpo el día 7 y 20 mg/kg de anticuerpo los días 14, 21 y 28. Se muestra el porcentaje de ratones con tamaños tumorales inferiores a 700 mm3 en un diagrama de Kaplan Meier. La formación de tumores se retrasa en ratones tratados con anticuerpos anti-c-Met en comparación con el anticuerpo de control de isotipo.
Figura 12:Ensayo de viabilidad de KP4 para determinar el efecto de la flexibilidad del anticuerpo sobre la actividad agonista. El formato IgA2m(1) no indujo proliferación, a diferencia de los formatos IgA1 e IgG1 del mismo anticuerpo. En este experimento se utilizaron variantes del anticuerpo anti-c-Met 5D5 (véase el documento US6468529 y Ejemplo 2).
Figura 13:Análisis SDS-PAGE no reducido de los mutantes de flexibilidad de(069).No se observaron multímeros ni productos de degradación anómalos, mientras que el emparejamiento de la cadena ligera fue visible como una banda de 50 kD ((LC)2) en los mutantes C220S, IgG1-bisagra IgG3 y AC220.
Figura 14:ELISA de unión a antígeno para medir la unión de c-Met de mutantes de bisagra de anticuerpos c-Met. Todos los mutantes se unen con una afinidad comparable a c-Met como se muestra en ELISA.
Figura 15:Fosforilación de c-Met como lectura de la actividad agonista de los anticuerpos contra c-Met. La figura 15 muestra los resultados de la transferencia Western de los lisados A549; membranas teñidas con anticuerpos contra c-met fosforilado, c-Met total o p-actina.
Figura 16:Ensayo de proliferación con células NCI-H441. La masa celular se determinó tras 7 días de incubación en presencia de anticuerpos o controles y se representó gráficamente como porcentaje de muestras no tratadas (establecido como 100 %).
Figura 17:Ensayo de viabilidad de KP4. Se sometió a ensayo el efecto de los anticuerpos contra c-Met sobre la viabilidad general de las células KP4. La capacidad de IgG1-1016-069 para reducir la viabilidad de KP4 se mantuvo y/o mejoró al introducir mutaciones que disminuyen la flexibilidad de los anticuerpos.
Figura 18:Modulación negativa medida como niveles totales de c-Met en lisados A549 usando ELISA. Todas las variantes del anticuerpo(069)mantuvieron la capacidad de modulación negativa.
Figura 19:Ensayo ADCC para comparar versiones con alto y bajo contenido de fucosa del anticuerpo IgG1-1016-069.
Figura 20:Falta de unión de los anticuerpos c-Met a las células en sangre completa en el ensayo de unión FACS. Se muestran los resultados para los linfocitos B; monocitos y granulocitos.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
La expresión "c-Met", cuando se usa en el presente documento, se refiere al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (número de acceso Genbank NM 000245) e incluye cualquier variante, isoforma y homólogo de especies de c-Met humano que se expresan de forma natural en células o se expresan en células transfectadas con el gen de c-Met.
La expresión "inmunoglobulina" se refiere a una clase de glicoproteínas estructuralmente relacionadas que consisten en dos pares de cadenas polipeptídicas, un par de cadenas ligeras (L) de bajo peso molecular y un par de cadenas pesadas (H), las cuatro interconectadas por enlaces disulfuro. La estructura de las inmunoglobulinas se ha caracterizado bien. Véase, por ejemplo,Fundamental ImmunologyCapítulo 7 (Paul, W., ed., 2.a edición, Raven Press, N.Y. (1989)). Brevemente, cada cadena pesada comprende normalmente una región variable de la cadena pesada (abreviada en el presente documento como V<h>o VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de cadena pesada normalmente comprende tres dominios, C<h>1, C<h>2 y C<h>3. Cada cadena ligera comprende normalmente una región variable de la cadena ligera (abreviada en el presente documento como V<l>o VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de cadena ligera normalmente comprende un dominio, C<l>. Las regiones V<h>y V<l>pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad (o regiones hipervariables, que pueden ser hipervariables en secuencia y/o en forma de bucles definidos estructuralmente), también denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR, por sus siglas en inglés). Cada V<h>y V<l>está normalmente compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (véase también Chothia y LeskJ. Mol.Biol. 196, 901-917 (1987)). Normalmente, la numeración de los residuos de aminoácidos en esta región se realiza mediante el método descrito en Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md . (1991) (expresiones tales como numeración de residuos de dominio variable como en Kabat o según Kabat en el presente documento se refieren a este sistema de numeración para dominios variables de la cadena pesada o dominios variables de la cadena ligera). Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real de un péptido puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento de, o inserción en, una FR o una CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir un único inserto de aminoácido (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de CDR2 V<h>y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc. según Kabat) después del residuo 82 de FR de la cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos puede determinarse para un anticuerpo dado mediante alineación en las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "convencional".
La expresión "anticuerpo" (Ab, por sus siglas en inglés) en el contexto de la presente invención se refiere a una molécula de inmunoglobulina, un fragmento de una molécula de inmunoglobulina o un derivado de cualquiera de los mismos, que tiene la capacidad para unirse específicamente a un antígeno en condiciones fisiológicas normales con una semivida de períodos de tiempo significativos, tal como al menos aproximadamente 30 minutos, al menos aproximadamente 45 minutos, al menos aproximadamente una hora, al menos aproximadamente dos horas, al menos aproximadamente cuatro horas, al menos aproximadamente 8 horas, al menos aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas o más, aproximadamente 48 horas o más, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7 o más días, etc., o cualquier otro período relevante funcionalmente definido (tal como un tiempo suficiente para inducir, promover, potenciar y/o modular una respuesta fisiológica asociada a la unión del anticuerpo al antígeno y/o tiempo suficiente para que el anticuerpo reclute una actividad efectora). Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de la molécula de inmunoglobulina contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos (Ab) pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedador, incluidas diversas células del sistema inmunitario (tales como las células efectoras) y componentes del sistema del complemento tales como C1q, el primer componente de la vía clásica de activación del complemento. Un anticuerpo anti-c-Met también puede ser un anticuerpo biespecífico, diacuerpo, o molécula similar (véase por ejemplo el documento PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993) para una descripción de los diacuerpos). De hecho, los anticuerpos biespecíficos, diacuerpos y similares, proporcionados no presente documento pueden unirse a cualquier diana adecuada además de a una porción de c-Met. Como se ha descrito anteriormente, el anticuerpo biespecífico de la invención se une a c-Met y EGFR. Como se ha indicado anteriormente, la expresión anticuerpo en el presente documento, salvo que se especifique lo contrario o que el contexto lo contradiga claramente, incluye fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad para unirse específicamente al antígeno. Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro de la expresión "anticuerpo" incluyen (i) un fragmento Fab' o Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios V<l>, V<h>, C<l>y C<h>1, o un anticuerpo monovalente como se describe en el documento WO2007059782 (Genmab); (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste esencialmente en los dominios V<h>y C<h>1; (iv) un fragmento Fv que consiste esencialmente en los dominios V<l>y V<h>de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Wardet al.,Nature 341, 544-546 (1989)), que consiste esencialmente en un dominio V<h>y también denominado anticuerpos de dominio (Holtet al.;Trends Biotechnol. nov de 2003;21(11):484-90); (vi) de camélido o nanocuerpos (Revetset al.;Expert Opin Biol Ther. enero de 2005;5(1):111-24) y (vii) una región determinante de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) aislada. Por otra parte, aunque los dos dominios del fragmento Fv, V<l>y V<h>, estén codificados por genes distintos, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite formarse como una única cadena de proteína en la cual las regiones V<l>y V<h>se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como anticuerpos monocatenarios o Fv monocatenarios (scFv), véanse, por ejemplo, Birdet al.,Science 242, 423-426 (1988) e Hustonet al.,PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Dichos anticuerpos monocatenarios están incluidos dentro de la expresión anticuerpo salvo que se indique lo contrario o se indique claramente por el contexto. Aunque tales fragmentos se incluyen generalmente dentro del significado de anticuerpo, colectivamente y cada uno de forma independiente son características únicas de la presente invención, exhibiendo diferentes propiedades biológicas y utilidad. Estos y otros fragmentos de anticuerpos útiles en el contexto de la presente invención se analizan más detalladamente en el presente documento. También debe entenderse que la expresión anticuerpo, salvo que se indique lo contrario, también incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAb), polipéptidos similares a anticuerpos, tales como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados, y fragmentos de anticuerpos que conservan la capacidad de unirse específicamente al antígeno (fragmentos de unión a antígeno) proporcionados por cualquier técnica conocida, tal como escisión enzimática, síntesis peptídica y técnicas de expresión recombinante. Un anticuerpo generado puede poseer cualquier isotipo.
Como se utiliza en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE o IgM) que está codificada por los genes de la región constante de la cadena pesada.
La expresión "anticuerpo monovalente" significa en el contexto de la presente invención que una molécula de anticuerpo es capaz de unirse a una sola molécula del antígeno y, por lo tanto, no es capaz de realizar la reticulación del antígeno.
Un "anticuerpo deficiente en función efectora" o un "anticuerpo con función efectora deficiente" se refiere a un anticuerpo que tiene una capacidad significativamente reducida o nula para activar uno o más mecanismos efectores, tales como la activación del complemento o la unión del receptor Fc. Por lo tanto, los anticuerpos con función efectora deficiente tienen una capacidad significativamente reducida o nula para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Un ejemplo de tal anticuerpo es IgG4.
Un "anticuerpo anti-c-MET" es un anticuerpo como se ha descrito anteriormente, que se une específicamente al antígeno c-Met.
La expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de estirpe germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica de sitioin vitroo mediante mutación somáticain vivo).Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias CDR derivadas de la estirpe germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.
Como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo humano es "derivado de" una secuencia particular de la estirpe germinal si el anticuerpo se obtiene de un sistema que usa secuencias de inmunoglobulina humana, por ejemplo, inmunizando a un ratón transgénico portador de genes de inmunoglobulina humana o seleccionando una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana, y en donde el anticuerpo humano seleccionado es al menos el 90 %, tal como al menos el 95 %, por ejemplo al menos el 96 %, tal como al menos el 97 %, por ejemplo, al menos el 98 %, o al menos el 99 % idéntico en secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la estirpe germinal. Normalmente, fuera de la CDR3 de la cadena pesada, un anticuerpo humano derivado de una secuencia particular de la estirpe germinal humana no mostrará más de 20 diferencias de aminoácidos, p.ej. no más de 10 diferencias de aminoácidos, tal como no más de 9, 8, 7, 6 o 5, por ejemplo, no más de 4, 3, 2 o 1 diferencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la estirpe germinal.
En una realización preferida, el anticuerpo de la invención está aislado. Un "anticuerpo aislado", como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a c-Met está sustancialmente exento de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de c-Met). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de c-Met humano puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (tales como los homólogos de especies de c-Met). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente exento de otro material celular y/o productos químicos.
Cuando se utiliza en el presente documento en el contexto de dos o más anticuerpos, la expresión "compite con" o "compite de forma cruzada con" indica que dos o más anticuerpos compiten por unirse a c-Met, p. ej. compiten por la unión de c-Met en el ensayo descrito en los Ejemplos incluidos en el presente documento. Para algunos pares de anticuerpos, la competición en el ensayo de los Ejemplos solo se observa cuando un anticuerpo se recubre sobre la placa y el otro se usa para competir, y no viceversa. La expresión "compite con" cuando se usa en el presente documento también pretende cubrir dichas combinaciones de anticuerpos.
La expresión "epítopo" significa una proteína determinante capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. Los epítopos por lo general consisten en agrupaciones de moléculas de superficie tales como cadenas laterales de aminoácidos o azúcares y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen por que la unión a los primeros, pero no a los segundos, se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. El epítopo puede comprender residuos de aminoácidos directamente implicados en la unión (también denominados componente inmunodominante del epítopo) y otros residuos de aminoácidos, que no están directamente implicados en la unión, tales como residuos de aminoácidos que son bloqueados eficazmente por el péptido de unión a antígeno específicamente (en otras palabras, el residuo de aminoácido está dentro de la huella del péptido de unión a antígeno específicamente).
La expresión "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en el presente documento se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una especificidad de unión única y afinidad por un epítopo particular. En consecuencia, la expresión "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que presentan una única especificidad de unión que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse mediante un hibridoma que incluye un linfocito B obtenido de un animal no humano transgénico o transcromosómico, tal como un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada y un transgén de cadena ligera humanos, fusionado a una célula inmortalizada.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "unión" en el contexto de la unión de un anticuerpo a un antígeno predeterminado normalmente es una unión con una afinidad correspondiente a una K<d>de aproximadamente 10<- 7>M o menos, tal como aproximadamente 10<- 8>M o menos, tal como aproximadamente 10<- 9>M o menos, aproximadamente 10<-10>M o menos, o aproximadamente 10<-11>M o incluso menos cuando se determina mediante, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmón de superficie (SPR, por sus siglas en inglés) en un instrumento BIAcore 3000 que usa el antígeno como el ligando y el anticuerpo como el analito, y se une al antígeno predeterminado con una afinidad correspondiente a una K<d>que es al menos diez veces menor, tal como al menos 100 veces inferior, por ejemplo, al menos 1.000 veces inferior, tal como al menos 10.000 veces inferior, por ejemplo, al menos 100.000 veces inferior que su afinidad por la unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) distinto del antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado. La cantidad con la que la afinidad es inferior depende de la K<d>del anticuerpo, de manera que, cuando la K<d>del anticuerpo es muy baja (es decir, el anticuerpo es altamente específico), la cantidad con la que la afinidad por el antígeno es inferior a la afinidad por un antígeno no específico puede ser de al menos 10.000 veces.
La expresión "kd" (s<-1>), como se utiliza en el presente documento, se refiere a la constante de tasa de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Dicho valor también se denomina el valor koff.
La expresión "ka" (M<-1>* s<-1>), como se utiliza en el presente documento, se refiere a la constante de tasa de disociación de una interacción antígeno-anticuerpo particular.
La expresión "K<d>" (M), como se utiliza en el presente documento, se refiere a la constante de disociación en el equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno particular.
La expresión "K<a>" (M<-1>), como se utiliza en el presente documento, se refiere a la constante de asociación en el equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno particular y se obtiene dividiendo ka por el kd.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "inhibe el crecimiento" (p. ej., refiriéndose a células, tales como células tumorales) pretende incluir cualquier disminución mensurable en el crecimiento celular cuando entra en contacto con un anticuerpo anti-c-Met en comparación con el crecimiento de las mismas células que no están en contacto con un anticuerpo anti-c-Met, p. ej., la inhibición del crecimiento de un cultivo celular en al menos aproximadamente el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 99 % o el 100 %. Esta disminución del crecimiento celular puede ocurrir por diversos mecanismos, p. ej., fagocitosis de células efectoras, ADCC, CDC y/o apoptosis.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos que comprenden variantes funcionales de la región V<l>., región V<h>, o una o más CDR de los anticuerpos de los ejemplos. Una variante funcional de una V<l>, V<h>o CDR utilizada en el contexto de un anticuerpo anti-c-Met todavía permite que el anticuerpo conserve al menos una proporción sustancial (al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más) de la afinidad/avidez y/o la especificidad/selectividad del anticuerpo original y, en algunos casos, dicho anticuerpo anti-c-Met puede estar asociado con una mayor afinidad, selectividad y/o especificidad que el anticuerpo original.
Estas variantes funcionales normalmente conservan una identidad de secuencia significativa con respecto al anticuerpo original. El porcentaje de identidad entre dos secuencias depende del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = n.° de posiciones idénticas/n.° total de posiciones * 100), teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos se puede determinar, p. ej., usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970).
La secuencia de las variantes de CDR puede diferir de la secuencia de las CDR de las secuencias de anticuerpos originales mediante sustituciones en su mayoría conservativas; por ejemplo, al menos 10, tal como al menos 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 de las sustituciones en la variante son reemplazos conservativos de residuos de aminoácidos.
En el contexto de la presente divulgación, las sustituciones conservativas pueden definirse mediante sustituciones dentro de las clases de aminoácidos reflejadas en la siguiente tabla:
Clases de residuos de aminoácidos para sustituciones conservativas
La expresión "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula hospedadora"), como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión, p. ej., un vector de expresión que codifica un anticuerpo de la invención. Las células hospedadoras recombinantes incluyen, por ejemplo, transfectomas, tales como células CHO, células HEK293, células NS/0 y células linfocíticas.
La expresión "animal no humano transgénico" se refiere a un animal no humano que tiene un genoma que comprende uno o más transgenes o transcromosomas humanos de la cadena pesada y/o ligera (integrados o no integrados en el ADN genómico natural del animal) y que es capaz de expresar anticuerpos totalmente humanos. Por ejemplo, un ratón transgénico puede tener un transgén humano de la cadena ligera y un transgén humano de la cadena pesada o un transcromosoma humano de la cadena pesada, de manera que el ratón produce anticuerpos humanos anti-c-Met cuando se inmuniza con el antígeno c-Met y/o células que expresan c-Met. El transgén humano de la cadena pesada puede integrarse en el ADN cromosómico del ratón, como es el caso de los ratones transgénicos, por ejemplo, ratones HuMAb, tales como los ratones HCo7 o HCo12, o el transgén humano de la cadena pesada puede mantenerse extracromosómicamente, como es el caso de los ratones KM transcromosómicos como se describe en el documento WO02/43478. Ratones similares, que tienen un repertorio de genes Ab humanos más grande, incluyen HCo7 y HCo20 (véase, p. ej., el documento WO2009097006). Estos ratones transgénicos y transcromosómicos (denominados colectivamente en el presente documento "ratones transgénicos") son capaces de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para un antígeno determinado (tales como IgG, IgA, IgM, IgD y/o IgE) al someterse a recombinación V-D-J y cambio de isotipo. También se pueden utilizar animales no humanos transgénicos para la producción de anticuerpos contra un antígeno específico introduciendo genes que codifican dicho anticuerpo específico, por ejemplo, uniendo operativamente los genes a un gen que se expresa en la leche del animal.
"Tratamiento" se refiere a la administración de una cantidad eficaz de un compuesto terapéuticamente activo de la presente invención con el fin de aliviar, mejorar, detener o erradicar (curar) síntomas o cuadros clínicos.
Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-c-Met puede variar de acuerdo con factores tales como la patología, la edad, el sexo y el peso del individuo y de la capacidad del anticuerpo anti-c-Met para generar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en que los efectos tóxicos o adversos del anticuerpo o de la porción de anticuerpo se ven superados por los efectos terapéuticamente beneficiosos.
Un "anticuerpo antiidiotípico" es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos generalmente asociados con el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo.
Aspectos y realizaciones adicionales de la invención
Como se ha descrito anteriormente, en un primer aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-c-Met y un segundo sitio de unión a antígeno específico del receptor del factor de crecimiento epidérmico, en donde el primer sitio de unión a antígeno comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1,2 y 3 de SEQ ID NO: 98, 99 y 100 y una región VL que comprende las secuencias CDR1,2 y 3 de SEQ ID NO: 102, 103 y 104 (069).
Los anticuerpos monoclonales de la presente divulgación pueden producirse, p. ej., mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohleret al.,Nature 256, 495 (1975), o pueden producirse mediante métodos de ADN recombinante. Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse a partir de fagotecas de anticuerpos usando las técnicas descritas en, por ejemplo, Clacksonet al.,Nature 352, 624-628 (1991) y Markset al.,J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991). Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse de cualquier fuente adecuada. Por lo tanto, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse a partir de hibridomas preparados a partir de linfocitos B esplénicos de murino obtenidos de ratones inmunizados con un antígeno de interés, por ejemplo, en forma de células que expresan el antígeno en la superficie, o un ácido nucleico que codifica un antígeno de interés. Los anticuerpos monoclonales también pueden obtenerse a partir de hibridomas derivados de células que expresan anticuerpos de seres humanos o mamíferos no humanos inmunizados tales como ratas, perros, primates, etc.
En una realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo humano. Los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra c-Met pueden generarse usando partes que transportan ratones transgénicos o transcromosómicos del sistema inmunitario humano más bien que del sistema del ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen los ratones denominados en el presente documento como ratones HuMAb y ratones k M, respectivamente, y se denominan colectivamente en este documento "ratones transgénicos".
El ratón HuMAb contiene un minilocus de genes de inmunoglobulina humana que codifica las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (|j y<y>) y cadena ligera<k>humanas no reordenadas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci endógenos de cadena j y<k>(Lonberg, N.et al.,Nature 368, 856-859 (1994)). En consecuencia, los ratones presentan una expresión reducida de IgM o k de ratón y, en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humanos introducidos, experimentan un cambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales humanos de alta afinidad IgG,K (Lonberg, N.et al.(1994), citado anteriormente; revisado en Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. y Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 1365-93 (1995) y Harding, F. y Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764536-546 (1995)). La preparación de los ratones HuMAb se describe con detalle en Taylor, L.et al.,Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J.et al.,International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillonet al., J. Immunol.152, 2912-2920 (1994), Taylor, L.et al.,International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D.et al.,Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Véanse también los documentos US 5.545.806, US 5569825, US 5625126, US 5633425, US 5789650, US 5877397, US 5661016, US 5814318, US 5874299, US 5770429, US 5545807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 y WO 01/09187.
Los ratones HCo7 tienen una alteración de la JKD en sus genes de la cadena ligera (kappa) endógena (como se describe en Chenet al.,EMBO J. 12, 821-830 (1993)), una alteración CMD en sus genes de la cadena pesada endógena (como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/14424), un transgén humano de la cadena ligera kappa Kco5 (como se describe en Fishwildet al.,Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)) y un transgén humano de la cadena pesada Hco7 (como se describe en el documento US 5.770.429).
Los ratones Hco12 tienen una alteración de la JKD en sus genes de la cadena ligera (kappa) endógena (como se describe en Chenet al.,EMBO J. 12, 821-830 (1993)), una alteración CMD en sus genes de la cadena pesada endógena (como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/14424), un transgén humano de la cadena ligera kappa Kco5 (como se describe en Fishwildet al.,Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)) y un transgén humano de la cadena pesada Hco12 (como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 01/14424).
En la cepa de ratones KM, el gen de la cadena ligera kappa endógena de ratón se ha alterado homocigóticamente como se describe en Chenet al.,EMBO J. 12, 811-820 (1993) y el gen de la cadena pesada endógeno de ratón se ha alterado homocigóticamente como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/09187. Esta cepa de ratón lleva un transgén de cadena ligera kappa humana, Kco5, como se describe en Fishwildet al.,Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Esta cepa de ratón también lleva un transcromosoma de la cadena pesada humana compuesto por el fragmento hCF del cromosoma 14 (SC20), como se describe en el documento WO 02/43478.
Los esplenocitos de estos ratones transgénicos pueden usarse para generar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales humanos de acuerdo con técnicas bien conocidas.
Asimismo, los anticuerpos humanos de la presente invención o los anticuerpos de la presente invención de otras especies pueden identificarse a través de tecnologías de tipo presentación, incluyendo, sin limitación, presentación en fagos, presentación en retrovirus, expresión en ribosomas y otras técnicas, usando técnicas bien conocidas en la materia, y las moléculas resultantes se pueden someter a maduración adicional, tal como maduración por afinidad, ya que estas técnicas son bien conocidas en la materia (véase, por ejemplo, Hoogenboomet al.,J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (expresión en fago), Vaughanet al.,Nature Biotech 14, 309 (1996) (expresión en fago), Hanes y Plucthau, PNAS UsA 94, 4937-4942 (1997) (expresión en ribosoma), Parmley y Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (expresión en fago), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirlaet al.,PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russelet al.,Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboomet al.,Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell y McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992) y documento US 5.733.743). Si se utilizan tecnologías de expresión para producir anticuerpos que no son humanos, dichos anticuerpos pueden estar humanizados.
En una realización, el anticuerpo de la invención es de isotipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE o IgM.
En un aspecto principal de la invención, el anticuerpo comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 98, 99 y 100 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 102, 103 y 104,(069).
En otra realización, el anticuerpo comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 97 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 101(069).
También se divulga en el presente documento un anticuerpo que compite por la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo inmovilizado, en donde dicho anticuerpo inmovilizado comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 37(024),preferentemente en donde el anticuerpo compite por más del 50 %, tal como más del 75 % con dicho anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17.
En una divulgación adicional, el anticuerpo no compite por la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo inmovilizado que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5(005)
b) un anticuerpo inmovilizado que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 17 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 21(008)
c) un anticuerpo inmovilizado que comprende la región VH y la región VL del anticuerpo5D5,y
d) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 49 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 53(045),
preferentemente en donde el anticuerpo compite por menos del 25 %, tal como menos del 20 % con dicho anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17.
En una divulgación adicional, el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 37(024)
b) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 65 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 69(061)
c) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 73 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 77(062)
d) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 81 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 85(064)
e) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 89 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 93(068)
f) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 97 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 101(069)
g) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 113 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 117(098)
h) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 121 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 125(101)y
i) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 129 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 133(181).
En una divulgación adicional, el anticuerpo comprende una región CDR3 de VH que tiene la secuencia que se establece en
a) SEQ ID NO: 36(024)
b) SEQ ID NO: 193, tal como una región CDR3 de VH como se establece en SEQ ID NO: 68, 76, 84 o 92(061, 062, 064, 068)
c) SEQ ID NO: 196, tal como una región CDR3 de VH como se establece en SEQ ID NO: 100 o 132(069, 181)d) SEQ ID NO: 116(098),o
e) SEQ ID NO: 201, tal como una región CDR3 de VH como se establece en SEQ ID NO: 124(101).
En una divulgación adicional, el anticuerpo comprende:
a) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 34, 185 y 36 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 38, 39 y 206, tal como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1,2 y 3 de SEQ ID NO: 34, 35 y 36 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 38, 39 y 40,(024)
b) una región VH que comprende las secuencias<c>DR1 ,2 y 3 de SEQ ID NO: 191, 192 y 193 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 78, 79 y 208, tal como un anticuerpo que comprende
a. una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 66, 67 y 68 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 70, 71 y 72(061)
b. una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 74, 75 y 76 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 78, 79 y 80,(062)
c. una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 82, 83 y 84 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 86, 87 y 88,(064),o
d. una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 90, 91 y 92 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 94, 95 y 96,(068)
c) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 194, 195 y 196 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO:209, 210 y 104, tal como un anticuerpo que comprende
a. una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 130, 131 y 132 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 134, 135 y 136,(181)
d) una región VH que comprende las secuencias CDR1,2 y 3 de SEQ ID NO: 197, 198 y 116 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO:118, 119 y 211, tal como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 114, 115 y 116 y una región Vl que comprende las secuencias CDR1,2 y 3 de SEQ ID NO: 118, 119 y 120(098),o
e) una región VH que comprende las secuencias CDR1,2 y 3 de SEQ iD NO: 199, 200 y 201 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO:126, 212 y 128, tal como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 122, 123 y 124 y una región V<l>que comprende las secuencias CDR1,2 y 3 de SEQ ID NO: 126, 127 y 128(101).
Se divulgan además anticuerpos que comprenden:
a) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 33 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 37(024)
b) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 61 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de S<e>Q ID NO: 69(061)
c) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 73 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 77(062)
d) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 81 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 85(064)
e) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 89 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 93(068)
f) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 113 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 117(098)
g) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 121 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de Se Q ID NO: 125(101)
h) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 129 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de S<e>Q ID NO: 133(181)
i) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 159 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 160(078)
j) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 161 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 162(084)
k) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 163 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 164(063)
l) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 165 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 166(087)
m) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 137 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de S<e>Q ID NO: 138(066)
n) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 139 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de Se Q ID NO: 140(065)
o) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 141 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de S<e>Q ID NO: 142(082)
p) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 143 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 144(089),o
q) una variante de cualquiera de dichos anticuerpos, en donde dicha variante tiene preferentemente como máximo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más preferentemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservativas de aminoácidos en dichas secuencias.
También se divulga un anticuerpo:
- que compite por la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo inmovilizado, en donde dicho anticuerpo inmovilizado comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 13(006),tal como cuando el anticuerpo compite por más del 50 %, tal como más del 75 % con dicho anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17, y
- el anticuerpo no compite en la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo inmovilizado que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 49 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 53(045),tal como en donde el anticuerpo compite menos del 50 %, p. ej. menos del 25 %, tal como menos del 20 % con dicho anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17 y
- el anticuerpo se une al dominio SEMA de c-Met, tal como en donde el anticuerpo es capaz de inhibir la unión de HGF al dominio SEMA con una CI50 de menos de 10 pg/ml, tal como menos de 2 pg/ml como se describe en el Ejemplo 9.
Se divulga además un anticuerpo que no compite por la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo inmovilizado que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 37(024),tal como en donde el anticuerpo compite por menos del 25 %, tal como menos del 20 % con dicho anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17.
Se divulga además un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5(005)
b) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 13(006)
c) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 25 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 29(022)y
d) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 57 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 61(058).
En una divulgación adicional, el anticuerpo comprende una región CDR3 de VH que tiene la secuencia que se establece en
a) SEQ ID NO: 181, tal como una región CDR3 de VH como se establece en SEQ ID NO: 4 o 12(005, 006)b) SEQ ID NO: 28(022),o
c) SEQ ID NO: 60(058).
Se divulgan además anticuerpos que comprenden:
a) una región VH que comprende las secuencias CDR1,2 y 3 de SEQ ID NO: 179, 180 y 181 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 6, 7 y 202, tal como un anticuerpo que comprende
a. una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 2, 3 y 4 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 6, 7 y 8,(005),o
b. una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 14, 15 y 16,(006)
b) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 26, 184 y 28 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 30, 31 y 205, tal como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1,2 y 3 de SEQ ID NO: 26, 27 y 28 y una región VL que comprende las secuencias C<d>R1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 30, 31 y 32(022),o
c) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 189, 190 y 60 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 62, 63 y 207, tal como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1,2 y 3 de SEQ ID NO: 58, 59 y 60 y una región VL que comprende las secuencias Cd R1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 62, 63 y 64(058)
También se divulgan anticuerpos que comprenden:
a) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5(005)
b) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de s Eq ID NO: 13(006)
c) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 25 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 29(022)
d) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 57 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 61(058)
e) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 145 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de Se Q ID NO: 146(031)
f) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 147 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 148(007)
g) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 149 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 150(011)
h) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 151 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de Se Q ID NO: 152(017)
i) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 153 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 154(025),o
j) una variante de cualquiera de dichos anticuerpos, en donde dicha variante tiene preferentemente como máximo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más preferentemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservativas de aminoácidos en dichas secuencias.
Se divulga además en el presente documento:
- un anticuerpo que compite por la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo inmovilizado, en donde dicho anticuerpo inmovilizado comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 49 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 53(045),tal como cuando el anticuerpo compite por más del 50 %, tal como más del 75 % con dicho anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17, y
- el anticuerpo no compite por la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo inmovilizado, en donde dicho inmovilizado comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 13(006),tal como cuando el anticuerpo compite por menos del 25 %, tal como menos del 20 % con dicho anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17.
En el presente documento se divulga además un anticuerpo que no compite por la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 17 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 21(008)y
b) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 37(024),
tal como en donde el anticuerpo compite por menos del 25 %, tal como menos del 20 % con dicho anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17.
En el presente documento se divulga además un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 49 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 53(045).
En el presente documento se divulga además un anticuerpo que comprende una región CDR3 de VH que tiene la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 188, tal como una región CDR3 de VH como se establece en SEQ ID NO: 52(045).
En el presente documento se divulga además un anticuerpo que comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 186, 187 y 188 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 54, 55 y 56, tal como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 50, 51 y 52 y una región V<l>que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 54, 55 y 56(045).
En el presente documento se divulga además un anticuerpo que comprende:
a) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 49 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 53(045)
b) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 155 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de S<e>Q ID NO: 156(040)
c) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 157 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 158 (039), o
d) una variante de cualquiera de dichos anticuerpos, en donde dicha variante tiene preferentemente como máximo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más, tales como sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservativas de aminoácidos en dichas secuencias.
En el presente documento se divulga además un anticuerpo que se une al dominio SEMA de c-Met, tal como en donde el anticuerpo es capaz de inhibir la unión de HGF al dominio SEMA con una CI50 de menos de 10 |jg/ml, tal como menos de 2 jg/m l como se describe en el Ejemplo 9.
En el presente documento se divulgan además anticuerpos que se unen al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 17 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 21(008)o se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de s Eq ID NO: 41 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 45(035)o se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 105 y una región V<l>que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 109(096).
En el presente documento se divulgan además anticuerpos que comprenden una región CDR3 de VH que tiene la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 183, tal como una región CDR3 de VH como se establece en SEQ ID NO: 20, 44 o 108(008, 035, 096).
En el presente documento se divulgan además anticuerpos que comprenden una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 18, 182 y 183 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 22, 203 y 204, tal como un anticuerpo que comprende
a) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 18, 19 y 20 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 22, 23 y 24,(008),o
b) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 42, 43 y 44 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 46, 47 y 48,(035),o
c) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 106, 107 y 108 y una región VL que comprende las secuencias CDR1,2 y 3 de SEQ ID NO: 110, 111 y 112(096).
En el presente documento se divulgan además anticuerpos que comprenden:
a) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 17 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 21(008)
b) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 41 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 45(035)
c) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 105 y, preferentemente, una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 109(096)
o
d) una variante de cualquiera de dichos anticuerpos, en donde dicha variante tiene preferentemente como máximo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más preferentemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservativas de aminoácidos en dichas secuencias.
En otra realización, el anticuerpo se une a las células A431 con una CE50 de 10 nM o menos, tal como una CE50 de 2 nM o menos, preferentemente como se determina de acuerdo con el Ejemplo 13.
Incluso en otra realización, el anticuerpo se une a c-Met con una constante de afinidad (K<d>) de 20 nM o menos, tal como una afinidad de 5 nM o menos, preferentemente como se determina de acuerdo con el Ejemplo 14.
Incluso en otra realización, el anticuerpo se une a Rhesus c-Met, preferiblemente en donde la señal de unión del anticuerpo a Rhesus c-Met es al menos 5 veces la de un anticuerpo de control negativo, como se determina de acuerdo con el Ejemplo 15.
Incluso en otra realización, el anticuerpo inhibe la unión de HGF al dominio extracelular de c-Met, preferiblemente en donde el anticuerpo inhibe la unión en más del 40 %, tal como más del 50 %, como se determina de acuerdo con el Ejemplo 16.
Incluso en otra realización, el anticuerpo es capaz de inhibir la viabilidad de las células KP4, preferiblemente en donde el anticuerpo es capaz de inhibir la viabilidad en más del 10%, tal como más del 25%, p. ej., más del 40%, preferiblemente como se describe en el Ejemplo 19.
Formatos de anticuerpos
La presente invención proporciona anticuerpos anti-c-Met antagónicos y también se divulgan en el presente documento anticuerpos anti-c-Met no antagónicos. Mientras que algunos anticuerpos actúan de forma antagónica sobre las células diana independientemente de si son monovalentes o bivalentes, para otros anticuerpos, el efecto funcional depende de la valencia. Como se muestra en el Ejemplo 19 del presente documento, los anticuerpos 024, 062, 064, 068, 069, 098, 101, 181, por ejemplo, (que están todos en el mismo grupo de bloqueo cruzado, véase el Ejemplo 17) tienen propiedades antagónicas en un ensayo de viabilidad de KP4 independientemente del formato. Los anticuerpos 022 y 058, por otro lado, se comportan de forma antagónica en este ensayo en un formato monovalente, pero de forma agonista (o al menos no antagónica) en un formato bivalente. Por lo tanto, dependiendo de las propiedades funcionales deseadas para un uso particular, se pueden seleccionar anticuerpos particulares del conjunto de anticuerpos divulgados en el presente documento. Como se ha mencionado anteriormente, el anticuerpo de la invención (069) tiene propiedades antagónicas en un ensayo de viabilidad de KP4 independientemente de si está en forma monovalente o bivalente.
Por otra parte, el anticuerpo de la invención puede ser de cualquier isotipo. La elección del isotipo normalmente estará guiada por las funciones efectoras deseadas, tales como la inducción de ADCC. Los isotipos ilustrativos son IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4. Puede usarse cualquiera de las regiones constantes de la cadena ligera humana, kappa o lambda. Si se desea, la clase de un anticuerpo anti-c-Met de la presente invención se puede cambiar mediante métodos conocidos. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente invención que originalmente era IgM puede cambiarse de clase a un anticuerpo IgG de la presente invención. Asimismo, se pueden utilizar técnicas de cambio de clase para convertir una subclase de IgG en otra, por ejemplo, de IgG1 a IgG2. Por lo tanto, la función efectora de los anticuerpos de la presente invención puede modificarse mediante el cambio de isotipo a, p. ej., un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE o IgM para diferentes usos terapéuticos. En una realización, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo IgG1, por ejemplo, una IgG1,K.
La modulación negativa de c-Met inducida por anticuerpos antagonistas representa un mecanismo de acción de los anticuerpos terapéuticos c-Met. En consecuencia, en un aspecto de la invención, los anticuerpos con propiedades agonistas reducidas, pero que mantengan la capacidad de inducir la modulación negativa de c-Met son deseables.
Se ha descubierto que, al reducir la flexibilidad conformacional de los anticuerpos, se minimiza la posible actividad agonista residual de los anticuerpos IgG1 bivalentes.
En consecuencia, el anticuerpo de la invención puede modificarse para hacerlo menos flexible, tal como mediante mutaciones en la región de bisagra.
Los mayores cambios conformacionales son el resultado de la flexibilidad de la bisagra, que permite un amplio intervalo de ángulos Fab-Fc (Ollmann Saphire, E., R.L. Stanfield, M.D.M. Crispin, P.W.H.I. Parren, P.M. Rudd, R.A. Dwek, D.R. Burton e I.A. Wilson. 2002. Las estructuras de IgG contrastantes revelan asimetría y flexibilidad extremas. J. Mol. Biol.
319: 9-18). Una forma de reducir la flexibilidad del brazo Fab en las inmunoglobulinas es prevenir la formación de enlaces disulfuro entre la cadena ligera y la pesada a través de modificación genética. En un anticuerpo IgG1 natural, la cadena ligera está conectada covalentemente con la cadena pesada a través de un puente disulfuro, conectando la cisteína C-terminal de la cadena ligera a la cisteína en la posición 220 (numeración e U C220) en la bisagra del Fc de la cadena pesada. Ya sea mutando el aminoácido C220 a serina o cualquier otro aminoácido natural, al eliminar C220, eliminando la bisagra completa o reemplazando la bisagra IgG1 por una bisagra IgG3, se forma una molécula en la que las cadenas ligeras están conectadas a través de sus cisteínas C-terminales, análoga a la situación encontrada en el isotipo humano IgA2m(1). Esto da como resultado una flexibilidad reducida de los Fabs en relación con el Fc y, en consecuencia, una capacidad de reticulación reducida, como se muestra en los Ejemplos.
Otra estrategia para reducir la flexibilidad de una molécula de IgG1 es reemplazar la bisagra de IgG1 por la bisagra IgG2 o una bisagra similar a IgG2. (Danglet al.EMBO J. 1988;7:1989-94). Esta región de bisagra tiene dos propiedades distintas de las de IgG1, que se considera que hacen que las moléculas sean menos flexibles. En primer lugar, en comparación con la bisagra IgG1, la bisagra IgG2 es 3 aminoácidos más corta. En segundo lugar, la bisagra IgG2 contiene una cisteína adicional, por lo tanto, se formarán tres puentes disulfuro entre cadenas pesadas en lugar de dos. Como alternativa, se puede introducir una variante de la bisagra IgG1 que se parezca a la bisagra IgG2. Este mutante (TH7A6-9) (documento WO2010063746) contiene la mutación T223C y dos supresiones (K222 y T225) para crear una bisagra más corta con una cisteína adicional.
Se divulga además un anticuerpo del subtipo IgG1, en donde la región de bisagra se ha modificado por:
(i) supresión de la región de bisagra de la secuencia EPKSCDKTHTCPPCP y sustituyéndola por la región de bisagra IgG2 de la secuencia: ERKCCVECPPCP (Bisagra IgG1-IgG2);
(ii) supresión de la posición 220 para que la región de bisagra modificada tenga la secuencia de EPKSDKTHTCPPCP (IgG1 AC220);
(iii) sustitución de la cisteína en la posición 220 por cualquier otro aminoácido natural (X) de modo que la región de bisagra modificada tenga la secuencia de EPk Sx DKTHTCPPCP (IgG1 C220X);
(iv) supresión de la región de bisagra de la secuencia EPKSCDKTHTCPPCP (UniBody IgG1);
(v) supresión de la región de bisagra de la secuencia EPKSCDKTHTCPPCP sustituyéndola por la región de bisagra IgG3 de la secuencia ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP (Bisagra IgG1-IgG3); o
(vi) sustitución de la treonina en la posición 223 por cisteína, eliminando la lisina en la posición 222 y la treonina en la posición 225, de modo que la región de bisagra modificada tenga la secuencia de EPKSCDCHCPPCP (IgG1 TH7A6-9).
También se divulga que se puede modificar la región de bisagra del anticuerpo del subtipo IgG1 suprimiendo la posición 220 de modo que la región de bisagra modificada tenga la secuencia de EPKSDKTHTCPPCP (IgG1 AC220) o sustituyendo la cisteína en la posición 220 con cualquier otro aminoácido natural (X) de modo que la región de bisagra modificada tenga la secuencia de EPKSXDKTh Tc PPCP (IgG1 C220X).
Se divulga además que se puede modificar la región de bisagra del anticuerpo del subtipo IgG1 sustituyendo la cisteína en la posición 220 con serina de modo que la región de bisagra modificada tenga la secuencia de EPKSSDKTHTCPPCP (IgG1 C220S).
En otra realización, el anticuerpo de la invención es del subtipo IgG2.
En otra realización, el anticuerpo de la invención está modificado con glicosilación para reducir la fucosa y, por lo tanto, mejorar la ADCC, p. ej., mediante la adición de compuestos a los medios de cultivo durante la producción de anticuerpos como se describe en el documento US2009317869 o como se describe en van Berkelet al.(2010) Biotechnol. Bioeng. 105:350 o mediante el uso de células con inactivación de FUT8, p. ej., como se describe en Yamane-Ohnukiet al.(2004) Biotechnol. Bioeng 87:614. La ADCC puede optimizarse como alternativa usando el método descrito por Umañaet al.(1999) Nature Biotech 17:176.
Varias publicaciones han demostrado la correlación entre la fucosilación del núcleo reducida y la actividad ADCC potenciadain vitro(Shields RL. 2002 JBC; 277:26733-26740, Shinkawa T. 2003 JBC; 278(5):3466-3473, Umaña P. Nat Biotechnol. feb de 1999;17(2):176-80).
En otra realización, el anticuerpo de la invención se ha modificado para reducir la fucosilación del núcleo por debajo del 10 %, tal como por ejemplo por debajo del 5 %, como se determina mediante cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento acoplada con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD). Esto puede lograrse mediante métodos bien conocidos en la técnica anterior, p. ej., tratamiento o producción de kifunensina en células FUT8 negativas.
En otra realización, el anticuerpo de la invención se ha modificado para potenciar la activación del complemento, p. ej., como se describe en Natsumeet al.(2009) Cancer Sci. 100:2411.
En una realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo de longitud completa, preferiblemente un anticuerpo IgG1, en particular un anticuerpo IgG1,K. En otra realización, el anticuerpo de la invención es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo monocatenario.
Los fragmentos de anticuerpos pueden, por ejemplo, obtenerse mediante fragmentación usando técnicas convencionales, y los fragmentos pueden examinarse para determinar su utilidad como se describe en el presente documento para los anticuerpos completos. Por ejemplo, se pueden generar fragmentos F(ab')2 tratando el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab')2 resultante puede tratarse para reducir los puentes disulfuro y producir fragmentos Fab'. Los fragmentos Fab pueden obtenerse tratando un anticuerpo IgG con papaína; los fragmentos Fab' pueden obtenerse con digestión con pepsina del anticuerpo IgG. Un fragmento F(ab') también puede producirse mediante la unión de Fab', como se describe a continuación, a través de un enlace tioéter o un enlace disulfuro. Un fragmento Fab' es un fragmento de anticuerpo que se obtiene cortando un enlace disulfuro de la región de bisagra del F(ab')2. Se puede obtener un fragmento Fab' tratando un fragmento F(ab')2 con un agente reductor, tal como ditiotreitol. El fragmento de anticuerpo también puede generarse mediante la expresión de ácidos nucleicos que codifican dichos fragmentos en células recombinantes (véase, por ejemplo, Evanset al., J. Immunol.Meth. 184, 123-38 (1995)). Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una porción de un fragmento F(ab')2 podría incluir secuencias de ADN que codifican el dominio C<h>1 y la región de bisagra de la cadena H, seguido de un codón de terminación de la traducción para producir dicha molécula de fragmento de anticuerpo truncado.
Como se ha explicado anteriormente, en una realización, el anticuerpo anti-c-Met de la invención es un anticuerpo bivalente.
En otra realización, el anticuerpo anti-c-Met de la invención es un anticuerpo monovalente.
También se divulgan en el presente documento fragmentos Fab o anticuerpos de un solo brazo, tal como se describe en el documento US20080063641 (Genentech) u otro anticuerpo monovalente, p. ej., tal como se describe en el documento WO2007048037 (Amgen).
También se divulga un anticuerpo monovalente que tiene una estructura como se describe en el documento WO2007059782 (Genmab) que tiene una supresión de la región de bisagra. Este anticuerpo monovalente anti-c-Met, se construye mediante un método que comprende:
i) proporcionar una construcción de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo monovalente, comprendiendo dicha construcción una secuencia de nucleótidos que codifica la región VL de un anticuerpo antic-Met específico de antígeno seleccionado y una secuencia de nucleótidos que codifica la región CL constante de una Ig, en donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica la región VL de un anticuerpo específico de antígeno seleccionado y dicha secuencia de nucleótidos que codifica la región CL de una Ig están unidas operativamente entre sí, y en donde, en caso de un subtipo IgG1, la secuencia de nucleótidos que codifica la región CL se ha modificado de modo que la región CL no contiene ningún aminoácido capaz de formar enlaces disulfuro o enlaces covalentes con otros péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos idéntica a la región CL en presencia de IgG humana policlonal o cuando se administra a un animal o ser humano;
ii) proporcionar una construcción de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo monovalente, comprendiendo dicha construcción una secuencia de nucleótidos que codifica la región VH de un anticuerpo específico de antígeno seleccionado y una secuencia de nucleótidos que codifica una región CH constante de una Ig humana, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la región CH se ha modificado de modo que la región correspondiente a la región de bisagra y, según lo requiera el subtipo de Ig, otras regiones de la región CH, tales como la región CH3, no comprende ningún residuo de aminoácido que participe en la formación de enlaces disulfuro o enlaces intercadenas pesadas covalentes o no covalentes estables con otros péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos idéntica de la región CH de la Ig humana en presencia de IgG humana policlonal o cuando se administra a un animal o ser humano, en donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica la región VH de un anticuerpo específico de antígeno seleccionado y dicha secuencia de nucleótidos que codifica la región CH de dicha Ig están unidas operativamente entre sí;
iii) proporcionar un sistema de expresión celular para producir dicho anticuerpo monovalente;
iv) producir dicho anticuerpo monovalente mediante la coexpresión de las construcciones de ácidos nucleicos de (i) y (ii) en células del sistema de expresión celular de (iii).
De manera similar, en una realización, el anticuerpo anti-c-Met es un anticuerpo monovalente, que comprende:
(i) una región variable de un anticuerpo de la invención como se describe en este documento o una parte de unión a antígeno de dicha región, y
(ii) una región C<h>de una inmunoglobulina o un fragmento de la misma que comprende las regiones C<h>2 y C<h>3, en donde la región C<h>o fragmento de la misma se ha modificado de modo que la región correspondiente a la región de bisagra y, si la inmunoglobulina no es un subtipo IgG4, otras regiones de la región C<h>, tales como la región C<h>3, no comprenden residuos de aminoácidos, que son capaces de formar enlaces disulfuro con una región C<h>idéntica u otros enlaces intercadenas pesadas covalentes o no covalentes estables con una región C<h>idéntica en presencia de IgG humana policlonal.
También se divulga que la cadena pesada del anticuerpo anti-c-Met monovalente puede modificarse de modo que se suprima toda la bisagra.
En otra realización adicional, dicho anticuerpo monovalente es del subtipo IgG4, pero se ha modificado la región C<h>3 de modo que se han realizado una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos:
Numeración de mutaciones CH3
KABAT* Indice EU G4* Mutaciones
E378 E357 E357A o E357T o E357V o E357I
S387 S364 S364R o S364K
T389 T366 T366A o T366R o T366K o T366N
L391 L368 L368A o L368V o L368E o L368G o L368S o L368T
D427 D399 D399A o D399To D399S
F436 F405 F405A o F405L o F405T o F405D o F405R o F405Q o F405K o F405Y Y438 Y407 Y407A o Y407E o Y407Q o Y407K o Y407F
F436 y Y438 F405 y Y407 (F405T y Y407E) o (F405D y Y407E)
D427 y Y438 D399 y Y407 (D399S y Y407Q) o (D399S y Y407K) o (D399S y Y407E)
*KABAT indica la numeración de aminoácidos según Kabat(Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991,).El índice EU indica la numeración de aminoácidos según el índice EU como se describe enKabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).
En otra realización adicional, la secuencia de dicho anticuerpo monovalente se ha modificado de modo que no comprende ningún sitio aceptor para la glicosilación ligada a N.
También se divulgan en el presente documento anticuerpos anti-c-Met monocatenarios. Los anticuerpos monocatenarios son péptidos en los que las regiones Fv de cadena pesada y ligera están conectadas. Dicha divulgación incluye un Fv monocatenario (scFv) en donde las cadenas pesada y ligera en el Fv de un anticuerpo antic-Met de la presente invención están unidas con un enlazador peptídico flexible (normalmente de aproximadamente 10, 12, 15 o más residuos de aminoácidos) en una sola cadena peptídica. Los métodos para producir estos anticuerpos se describen, por ejemplo, en el documento 4.946.778, Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994), Birdet al.,Science 242, 423 426 (1988), Hustonet al.,PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) y McCaffertyet al.,Nature 348, 552-554 (1990). El anticuerpo monocatenario puede ser monovalente, si solo se utilizan una única Vh y Vl, bivalente, si se utilizan dos Vh y Vl, o polivalente, si se utilizan más de dos Vh y Vl.
En una realización, el anticuerpo anti-c-Met de la invención es un anticuerpo deficiente en la función efectora. También se divulga en el presente documento un anticuerpo anti-c-Met deficiente en función efectora que es un anticuerpo IgG4 estabilizado, que se ha modificado para evitar el intercambio del brazo Fab (van der Neut Kolfschotenet al.(2007) Science 317(5844):1554-7). Ejemplos de tales anticuerpos IgG4 estabilizados son los anticuerpos, en donde la arginina en la posición 409 en una región constante de cadena pesada de IgG4 humana, la cual se indica en el índice EU como en Kabatet al.,se sustituye por lisina, treonina, metionina o leucina, preferiblemente lisina (descrita en el documento WO2006033386 (Kirin)) y/o en donde la región de bisagra se ha modificado para comprender una secuencia Cys-Pro-Pro-Cys.
Se divulga además un anticuerpo anti-c-Met IgG4 estabilizado que es un anticuerpo IgG4 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde dicha cadena pesada comprende una región constante de IgG4 humana que tiene un residuo seleccionado del grupo que consiste en: Lys, Ala, Thr, Met y Leu en la posición correspondiente a 409 y/o un residuo seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Val, Gly, Ile y Leu en la posición correspondiente a 405, y en donde dicho anticuerpo comprende opcionalmente una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones adicionales, pero no comprende una secuencia Cys-Pro-Pro-Cys en la región de bisagra. Este anticuerpo puede comprender un residuo de Lys o Ala en la posición correspondiente a 409 o la región CH3 del anticuerpo ha sido reemplazada por la región CH3 de la IgG1 humana, de la IgG2 humana o de la IgG3 humana. Véase también el documento WO2008145142 (Genmab).
En una divulgación aún adicional, un anticuerpo anti-c-Met IgG4 estabilizado es un anticuerpo IgG4 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde dicha cadena pesada comprende una región constante de IgG4 humana que tiene un residuo seleccionado del grupo que consiste en: Lys, Ala, Thr, Met y Leu en la posición correspondiente a 409 y/o un residuo seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Val, Gly, Ile y Leu en la posición correspondiente a 405, y en donde dicho anticuerpo comprende opcionalmente una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones adicionales, y en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia Cys-Pro-Pro-Cys en la región de bisagra. Preferentemente, dicho anticuerpo comprende un residuo de Lys o Ala en la posición correspondiente a 409 o la región CH3 del anticuerpo ha sido reemplazada por la región CH3 de la IgG1 humana, de la IgG2 humana o de la IgG3 humana.
En otra realización, el anticuerpo anti-c-Met deficiente en función efectora es un anticuerpo de tipo no IgG4, p. ej., IgG1, IgG2 o IgG3 que se ha mutado de modo que la capacidad de mediar funciones efectoras, tales como ADCC, se ha reducido o incluso eliminado. Estas mutaciones se han descrito, p. ej., en Dall'Acqua WFet al.,J Immunol.
177(2):1129-1138 (2006) y Hezareh M, J Virol. ;75(24):12161-12168 (2001).
Conjugados
En otra realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-c-Met conjugado con un resto terapéutico, tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunosupresor o un radioisótopo. Estos conjugados se denominan en el presente documento "inmunoconjugados". Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se denominan "inmunotoxinas".
Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células (por ejemplo, las destruya). Los agentes terapéuticos adecuados para formar los inmunoconjugados de la presente invención incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidro-testosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, antimetabolitos (tales como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, gemcitabina, cladribina), agentes alquilantes (tales como mecloretamina, tiotepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbacina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatino y otros derivados del platino, tales como carboplatino), antibióticos (tales como dactinomicina (antes actinomicina)), bleomicina, daunorrubicina (antes daunomicina), doxorrubicina, idarrubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC)), toxina diftérica y moléculas relacionadas (tales como la cadena A diftérica y fragmentos activos de la misma y moléculas híbridas), toxina de ricina (como la ricina A o una toxina de cadena de ricina A desglicosilada), toxina colérica, una toxina similar a Shiga (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), toxina LT, toxina C3, toxina Shiga, toxina pertúsica, toxina tetánica, inhibidor de la proteasa Bowman-Birk de la soja, exotoxina dePseudomonas,alorina, saporina, modeccina, gelanina, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas deAleurites fordii,proteínas de diantina, proteínas dePhytolaca americana(PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor deMomordica charantia,curcina, crotina, inhibidor deSaponaria officinalis,gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina y toxinas de enomicina. Otras moléculas conjugadas adecuadas incluyen ribonucleasa (RNasa), DNasa I, enterotoxina A estafilocócica, proteína antivírica de fitolaca, toxina diftérica y endotoxina dePseudomonas.Véase, por ejemplo, Pastanet al.,Cell 47, 641 (1986) y Goldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994). Los agentes terapéuticos, que pueden administrarse en combinación con un anticuerpo anti-c-Met de la presente invención como se describe en otra parte del presente documento, pueden también ser candidatos a restos terapéuticos útiles para conjugación con un anticuerpo de la presente invención.
En otra realización, un anticuerpo anti-c-Met de la invención comprende un ácido nucleico conjugado o una molécula asociada a un ácido nucleico. En una de dichas facetas de la presente invención, el ácido nucleico conjugado es una ribonucleasa citotóxica, un ácido nucleico antisentido, una molécula de ARN inhibidora (por ejemplo, una molécula de ARNip) o un ácido nucleico inmunoestimulador (por ejemplo, una molécula de ADN que contiene un motivo CpG inmunoestimulador). En otra realización, un anticuerpo anti-c-Met de la invención está conjugado con un aptámero o una ribozima.
En una realización, se proporcionan anticuerpos anti-c-Met que comprenden uno o más aminoácidos radiomarcados. Un anticuerpo anti-c-Met radiomarcado puede utilizarse con fines tanto diagnósticos como terapéuticos (la conjugación con moléculas radiomarcadas es otra característica posible). Los ejemplos de etiquetas no limitativos para polipéptidos incluyen 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc y 125I, 131I y 186Re.
Los anticuerpos anti-c-Met también pueden estar químicamente modificados por conjugación covalente con un polímero para, por ejemplo, aumentar su semivida en circulación. Los ejemplos de polímeros, y los métodos para unirlos a péptidos, se ilustran, por ejemplo, en los documentos US 4.766.106, US 4179337, US 4495285 y US 4609546. Los polímeros adicionales incluyen los polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG) (por ejemplo, un PEG con un peso molecular entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 40.000), tal como entre aproximadamente 2000 y aproximadamente 20.000).
Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo anti-c-Met con la(s) molécula(s) conjugada(s), tales como los descritos anteriormente, incluidos los métodos descritos en Hunteret al.,Nature 144, 945 (1962), Davidet al.,Biochemistry 13, 1014 (1974), Painet al., J. Immunol.Meth. 40, 219 (1981) y Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982). Estos anticuerpos se pueden producir conjugando químicamente la otra fracción al lado N-terminal o al lado C-terminal del anticuerpo anti-c-Met o fragmento del mismo (por ejemplo, una cadena H o L del anticuerpo anti-c-Met) (véase, por ejemplo, Antibody Engineering Handbook, editado por Osamu Kanemitsu, publicado por Chijin Shokan (1994)). Dichos derivados de anticuerpos conjugados también pueden generarse mediante conjugación en residuos o azúcares internos, cuando corresponda. Los agentes pueden acoplarse directa o indirectamente a un anticuerpo anti-c-Met de la presente invención. Un ejemplo de acoplamiento indirecto de un segundo agente es el acoplamiento mediante un resto espaciador. En una realización, el anticuerpo anti-c-Met de la presente invención está unido a un enlazador quelante, p. ej. tiuxetán, lo que permite conjugar el anticuerpo con un radioisótopo.
Anticuerpos biespecíficos
En un aspecto principal, la invención se refiere a una molécula biespecífica que comprende un primer sitio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-c-Met de la invención como se ha descrito anteriormente en el presente documento y un segundo sitio de unión a antígeno específico del receptor del factor de crecimiento epidérmico.
También se divulgan moléculas biespecíficas que comprenden un primer sitio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-c-Met de la invención como se ha descrito anteriormente en el presente documento y un segundo sitio de unión a antígeno con una especificidad de unión diferente, tal como una especificidad de unión para una célula efectora humana, un receptor Fc humano, un receptor de linfocitos T, un receptor de linfocitos B o una especificidad de unión para un epítopo no solapante de c-Met, es decir, un anticuerpo biespecífico en donde el primer y el segundo sitios de unión del antígeno no compiten por la unión a c-Met, p. ej., cuando se somete a ensayo como se describe en el Ejemplo 17.
Los ejemplos de moléculas de anticuerpos biespecíficos de la invención comprenden (i) dos anticuerpos, uno con especificidad para c-Met y otro para una segunda diana, que están conjugados entre sí, (ii) un anticuerpo único que tiene una cadena o brazo específico para c-Met y una segunda cadena o brazo específico para una segunda molécula, y (iii) un anticuerpo monocatenario que tiene especificidad para c-Met y una segunda molécula. En el aspecto principal de la invención, la segunda molécula es el receptor del factor de crecimiento epidérmico, también conocido como HER1. También se divulga, pero no forma parte de la invención reivindicada, un antígeno de cáncer/antígeno asociado a tumores, tal como el antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno prostático específico (PSA), RAGE (antígeno renal), a-fetoproteína, CAMEL (antígeno reconocido por CTL en melanoma), antígenos CT (tales como MAGE-B5, -B6, -C2, -C3, y D; Mage-12; CT10; NY-ESO-1, SSX-2, GAGE, BAGE, MAGE y SAGE), antígenos de mucina (p. ej., MUC1, mucina-CA125, etc.), antígenos gangliósidos, tirosinasa, gp75, C-myc, Mart1, MelanA, MUM-1, MUM-2, Mu M-3, HLA-B7, Ep-CAM o una integrina asociada al cáncer, tal como la integrina a5p3. Las segundas moléculas además divulgadas son: un factor angiogénico u otro factor de crecimiento asociado al cáncer, tal como un factor de crecimiento endotelial vascular, un factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico, angiogenina o un receptor de cualquiera de estos, particularmente receptores asociados al avance del cáncer (por ejemplo, uno de los receptores HER1-HER4). Como se ha mencionado anteriormente, la segunda molécula para la cual es específico el anticuerpo de la invención es el receptor del factor de crecimiento epidérmico (HER1). En una realización, un anticuerpo biespecífico de la presente invención es un diacuerpo.
Secuencias de ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras
En un aspecto adicional, la invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos, tales como secuencias de ADN, que codifican cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo de la invención. En una realización, la secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 y/o SEQ ID NO: 101. En otra realización particular, la secuencia de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos VH de SEQ ID NO: 97. En otra realización particular, la secuencia de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos VL de SEQ ID NO: 101.
Se divulgan además secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21,25, 29, 33, 37, 41,45, 49, 53, 57, 61,65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177 y 178.
Se divulgan además secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos VH seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105, 113, 121, 129, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175 e 177.
Se divulgan además secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos VL seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 5, 13, 21,29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109, 117, 125, 133, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176 e 178.
Incluso en un aspecto adicional, la invención se refiere a un vector de expresión, o a un conjunto de vectores de expresión, que codifica un anticuerpo de la invención. La cadena pesada y ligera del anticuerpo pueden estar codificadas por el mismo vector o por vectores diferentes.
Estos vectores de expresión pueden utilizarse para la producción recombinante de anticuerpos de la invención.
En una realización, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o ambas de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 97 y 101. En otra realización particular, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica las secuencias de aminoácidos VH de SEQ ID NO: 97. Aún en otra realización, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica las secuencias de aminoácidos VL de SEQ ID NO: 101.
En otra divulgación, el vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177 y 178.
En otra divulgación, el vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de las secuencias de aminoácidos VH seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105, 113, 121, 129, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175 e 177.
En otra divulgación, el vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de las secuencias de aminoácidos VL seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109, 117, 125, 133, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176 e 178.
En otra realización, el vector de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de una cadena ligera, una cadena pesada o las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo, p.ej. un anticuerpo humano.
Un vector de expresión en el contexto de la presente invención puede ser cualquier vector adecuado, incluidos vectores cromosómicos, no cromosómicos y de ácido nucleico sintético (una secuencia de ácido nucleico que comprende un conjunto adecuado de elementos de control de la expresión). Los ejemplos de estos vectores incluyen derivados de SV40, plásmidos bacterianos, ADN de fago, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, y vectores de ácido nucleico viral (ARN o ADN). En una realización, un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-c-Met está comprendido en un vector de ADN o ARN no marcado, incluyendo, por ejemplo, un elemento de expresión lineal (como se describe, por ejemplo, en Sykes y Johnston, Nat Biotech 17, 355 59 (1997)), un vector de ácido nucleico compactado (como se describe, por ejemplo, en los documentos US 6.077.835 y/o WO 00/70087), un vector plasmídico tal como pBR322, pUC 19/18 o pUC 118/119, un vector de ácido nucleico de tamaño mínimo "mosquito" (como se describe, por ejemplo, en Schakowskietal.,Mol Ther 3, 793-800 (2001)), o como una construcción de vector de ácido nucleico precipitado, tal como una construcción precipitada con CaP04 (como se describe, por ejemplo, en el documento WO 00/46147, Benvenisty y Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigleret al.,Cell 14, 725 (1978), y Coraro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)). Dichos vectores de ácido nucleico y el uso de los mismos son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, los documentos US 5.589.466 y US 5.973.972).
En una realización, el vector es adecuado para la expresión del anticuerpo anti-c-Met en una célula bacteriana. Ejemplos de dichos vectores incluyen vectores de expresión tales como BlueScript (Stratagene), vectores pIN (Van Heeke y Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989), vectores pET (Novagen, Madison WI) y similares).
Un vector de expresión puede también, o como alternativa, ser un vector adecuado para la expresión en un sistema de levadura. Se puede emplear cualquier vector adecuado para la expresión en un sistema de levadura. Los vectores adecuados incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden promotores constitutivos o inducibles tales como el factor alfa, alcohol oxidasa y PGH (revisado en: F. Ausubelet al.,ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley InterScience Nueva York (1987), y Grantet al.,Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)).
Un vector de expresión puede también, o como alternativa, ser un vector adecuado para la expresión en células de mamíferos, p. ej., un vector que comprende glutamina sintetasa como marcador seleccionable, tales como los vectores descritos en (Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10:169-175).
Un ácido nucleico y/o vector también puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de secreción/localización, que puede dirigirse a un polipéptido, tal como una cadena polipeptídica naciente, al espacio periplásmico o al medio de cultivo celular. Estas secuencias son conocidas en la técnica e incluyen péptidos señal o líderes de secreción.
En un vector de expresión de la invención, los ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-c-Met pueden comprender o estar asociados con cualquier promotor, potenciador y otros elementos facilitadores de la expresión adecuados. Los ejemplos de dichos elementos incluyen promotores de expresión fuertes (por ejemplo, el promotor/potenciador IE de CMV humano, así como RSV, SV40, SL3-3, MMTV y promotores LTR del VIH), secuencias de terminación de poli (A) eficaces, un origen de replicación para el producto plasmídico enE. coli,un gen de resistencia a antibióticos como marcador seleccionable y/o un sitio de clonación conveniente (por ejemplo, un polienlazador). Los ácidos nucleicos también pueden comprender un promotor inducible a diferencia de un promotor constitutivo tal como CMV IE.
En una realización, el vector de expresión que codifica el anticuerpo anti-c-Met puede posicionarse y/o administrarse a la célula hospedadora o al animal hospedador a través de un vector viral.
Incluso en un aspecto adicional, la invención se refiere a una célula hospedadora eucariota o procariota recombinante, tal como un transfectoma, que produce un anticuerpo de la invención como se define en el presente documento. Los ejemplos de células hospedadoras incluyen células de levadura, bacterianas y de mamíferos, tales como células CHO o HEK. Por ejemplo, en una realización, la presente invención proporciona una célula que comprende un ácido nucleico integrado de forma estable en el genoma celular que comprende una secuencia que codifica la expresión de un anticuerpo anti-c-Met de la presente invención. En otra realización, la presente invención proporciona una célula que comprende un ácido nucleico no integrado, tal como un plásmido, cósmido, fagémido, o elemento de expresión lineal, que comprende una secuencia que codifica la expresión de un anticuerpo anti-c-Met de la invención.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un hibridoma que produce un anticuerpo de la invención como se define en el presente documento. Incluso en un aspecto adicional, la invención se refiere a un animal o planta no humano transgénico que comprende ácidos nucleicos que codifican una cadena pesada humana y una cadena ligera humana, en donde el animal o planta produce un anticuerpo de la invención de la invención.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para producir un anticuerpo anti-c-Met de la invención, comprendiendo dicho método las etapas de
a) cultivar un hibridoma o una célula hospedadora de la invención como se ha descrito anteriormente en el presente documento, y
b) purificar el anticuerpo de la invención del medio de cultivo.
Composiciones
En un aspecto principal adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende:
- un anticuerpo anti-c-Met como se define en el presente documento, y
- un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La composición farmacéutica de la presente invención puede contener un anticuerpo de la presente invención.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de acuerdo con técnicas convencionales tales como las divulgadas en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19.a edición, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Una composición farmacéutica de la presente invención puede incluir, p. ej., diluyentes, cargas, sales, tampones, detergentes (por ejemplo, un detergente no iónico, tal como Tween-20 o Tween-80), estabilizadores (por ejemplo, azúcares o aminoácidos exentos de proteínas), conservantes, fijadores de tejidos, solubilizantes y/u otros materiales adecuados para su inclusión en una composición farmacéutica.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de isotonicidad, antioxidantes y agentes retardantes de la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles con un compuesto de la presente invención. Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, etanol, dextrosa, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, soluciones coloidales de carboximetilcelulosa, goma tragacanto y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo y/o diferentes tampones. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Puede mantenerse una fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden comprender antioxidantes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo (1) antioxidantes hidrosolubles, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, lecitina, galato de propilo, alfatocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosforoso y similares.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden comprender agentes de isotonicidad, tales como azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, glicerol o cloruro de sodio en las composiciones.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden contener uno o más adyuvantes apropiados para la vía de administración elegida tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de dispersión, conservantes o tampones, que pueden potenciar la vida útil o la eficacia de la composición farmacéutica. Los compuestos de la presente invención pueden prepararse con vehículos que protegerán el compuesto contra una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Dichos vehículos pueden incluir gelatina, monoestearato de glicerilo, diestearato de glicerilo, polímeros biodegradables y biocompatibles tales como acetato de etilvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico solo o con una cera, u otros materiales bien conocidos en la técnica. Generalmente, los expertos en la materia conocen métodos para la preparación de dichas formulaciones.
Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes, p. ej., enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de microfiltración esterilizante. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos, p. ej., de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, ejemplos de métodos de preparación son el secado al vacío y el secado por congelación (liofilización), que proporcionan un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución de los mismos previamente esterilizada por filtración.
Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas pueden variarse para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin ser tóxicos para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o la amida de las mismas, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la afección, la salud general y los antecedentes médicos anteriores del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
La composición farmacéutica puede ser para la administración por cualquier vía y modo adecuados. En una realización, una composición farmacéutica de la presente invención es para la administración parenteral. "Administración por vía parenteral", como se utiliza en el presente documento, significa modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, normalmente por inyección, e incluyen inyección e infusión epidérmica, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, intratendinosa, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intracraneal, intratorácica, epidural e intraesternal.
En una realización, esa composición farmacéutica es para la administración mediante inyección o infusión intravenosa o subcutánea.
Usos
Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere al anticuerpo, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano mediante terapia.
En un aspecto principal adicional, la invención se refiere a un anticuerpo anti-c-Met de la invención para su uso como medicamento.
Los anticuerpos anti-c-Met de la invención pueden usarse para una serie de fines. En particular, los anticuerpos de la invención pueden usarse en el tratamiento de diferentes formas de cáncer, incluyendo el cáncer metastásico y el cáncer refractario. Este cáncer puede ser dependiente o independiente del HGF.
En una realización, los anticuerpos anti-c-Met de la invención son para su uso en el tratamiento de una forma de cáncer seleccionada del grupo que consiste en: cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervicouterino, colangiocarcinoma, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (tal como el cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC)), cáncer nasofaríngeo, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de vesícula biliar, cáncer de próstata y cáncer de tiroides.
En otra realización, los anticuerpos anti-c-Met de la invención son para su uso en el tratamiento de una forma de cáncer seleccionada del grupo que consiste en: osteosarcoma, rabdomiosarcoma y sarcoma sinovial.
En otra realización, los anticuerpos anti-c-Met de la invención son para su uso en el tratamiento de una forma de cáncer seleccionada del grupo que consiste en: sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma, histiocitoma fibroso maligno y fibrosarcoma.
En otra realización, los anticuerpos anti-c-Met de la invención son para su uso en el tratamiento de neoplasias malignas hematopoyéticas, tales como una neoplasia maligna seleccionada del grupo que consiste en: leucemia mielógena aguda, leucemia de linfocitos T en adultos, leucemia mieloide crónica, linfoma y mieloma múltiple.
En otra realización, los anticuerpos anti-c-Met de la invención son para su uso en el tratamiento de una neoplasia seleccionada del grupo que consiste en: glioblastoma, astrocitoma, melanoma, mesotelioma y tumor de Wilms.
En otra realización, los anticuerpos anti-c-Met de la invención son para su uso en el tratamiento de tumores MiT, incluido el sarcoma de células claras (CCS), sarcoma de partes blandas alveolares (ASPS) y carcinoma de células renales asociado a translocación.
En otra realización, los anticuerpos anti-c-Met agonistas de la invención son para su uso en la regulación de la producción de citocinas y la inducción de la movilización de células progenitoras endoteliales, p. ej., en pacientes con enfermedad cardíaca coronaria (Yanget al.(2009) Clin Exp Pharmacol Physiol. 36:790).
También se divulgan anticuerpos anti-c-Met agonistas para su uso en la inhibición o mejora de la insuficiencia renal crónica (Mizunoet al.(2008) Front Biosci. 13:7072).
La invención se refiere a un método para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de una célula tumoral que expresa c-Met, que comprende la administración, a un individuo que lo necesite, de una cantidad eficaz de un anticuerpo de la invención.
En una realización, dicha célula tumoral está involucrada en una forma de cáncer seleccionada del grupo que consiste en: cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervicouterino, colangiocarcinoma, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer nasofaríngeo, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de vesícula biliar, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, osteosarcoma, rabdomiosarcoma, sarcoma sinovial, sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, fibrosarcoma, leucemia mielógena aguda, leucemia de linfocitos T en adultos, leucemia mieloide crónica, linfoma, mieloma múltiple, glioblastoma, astrocitoma, melanoma, mesotelioma y tumor de Wilms.
Además, la divulgación se refiere al uso de un anticuerpo monoclonal que se une a c-Met humano para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, tal como una de las indicaciones específicas de cáncer mencionadas anteriormente.
En una realización, la selección de pacientes que se tratarán con un anticuerpo anti-c-Met se basa en el nivel de (sobre)expresión de c-Met y/o HGF en las células tumorales relevantes de dichos pacientes.
En otra realización de los métodos de tratamiento de la presente invención, durante la terapia se controla la eficacia del tratamiento, p. ej., en puntos predefinidos en el tiempo, determinando los niveles de expresión de c-Met en las células tumorales relevantes.
Las pautas posológicas en los métodos de tratamiento y usos anteriores se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse una única dosis en embolada, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo, o se puede reducir o aumentar proporcionalmente la dosis según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Las composiciones parenterales pueden formularse en forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosis.
Las dosificaciones eficientes y las posologías para los anticuerpos anti-c-Met dependen de la enfermedad o afección que se ha de tratar y pueden ser determinadas por los expertos en la materia. Un intervalo de ejemplo, no limitante, para una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención es de aproximadamente 0,1-100mg/kg, tal como aproximadamente 0,1-50 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 0,1-20 mg/kg, tal como aproximadamente 0,1-10 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 0,5, aproximadamente tal como 0,3, aproximadamente 1, aproximadamente 3, aproximadamente 5 o aproximadamente 8 mg/kg.
Un médico o veterinario que tenga experiencia habitual en la materia puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría comenzar las dosis del anticuerpo anti-c-Met empleado en la composición farmacéutica a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una composición de la presente invención será aquella cantidad del compuesto que sea la dosis más baja eficaz para producir un efecto terapéutico. La administración puede ser, p. ej., parenteral, tal como intravenosa, intramuscular o subcutánea. En una realización, los anticuerpos anti-c-Met pueden ser para la administración por infusión en una dosis semanal desde 10 hasta 500 mg/m2, tal como desde 200 hasta 400 mg/m2. Esta administración podrá repetirse, p. ej., de 1 a 8 veces, tal como de 3 a 5 veces. La administración puede realizarse mediante infusión continua durante un período desde 2 hasta 24 horas, tal como por ejemplo desde 2 hasta 12 horas. En una realización, los anticuerpos anti-c-Met pueden administrarse mediante infusión lenta y continua durante un largo período, tal como más de 24 horas, para reducir las reacciones adversas tóxicas.
En una realización, los anticuerpos anti-c-Met pueden ser para la administración en una dosis semanal desde 250 mg hasta 2000 mg, tal como, por ejemplo, 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg o 2000 mg, hasta 8 veces, tal como de 4 a 6 veces. Esta pauta terapéutica podrá repetirse una o más veces según sea necesario, por ejemplo, después de 6 meses o 12 meses. La dosis se puede determinar o ajustar midiendo la cantidad de compuesto de la presente invención en la sangre tras la administración, por ejemplo, extrayendo una muestra biológica y usando anticuerpos antiidiotípicos que se dirigen a la región de unión al antígeno de los anticuerpos anti-c-Met de la presente invención.
En una realización, los anticuerpos anti-c-Met pueden ser para la administración mediante terapia de mantenimiento, tal como, p. ej., una vez por semana durante un período de 6 meses o más.
Un anticuerpo anti-c-Met también puede ser para la administración de forma profiláctica para reducir el riesgo de desarrollar cáncer, retrasar el inicio de la aparición de un evento en el avance del cáncer y/o reducir el riesgo de reaparición cuando un cáncer está en remisión.
Los anticuerpos anti-c-Met también pueden ser para la administración en terapia de combinación, es decir, combinados con otros agentes terapéuticos de interés para la enfermedad o afección que se ha de tratar. En consecuencia, en una realización, el medicamento que contiene anticuerpos es para su combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, tal como un agente citotóxico, quimioterápico o antiangiogénico.
Esta administración combinada puede ser simultánea, por separado o secuencial. Para la administración simultánea, los agentes pueden administrarse como una composición o como composiciones separadas, según corresponda. La presente divulgación también proporciona, por lo tanto, métodos para tratar un trastorno que involucra células que expresan c-Met como se ha descrito anteriormente, cuyos métodos comprenden la administración de un anticuerpo anti-c-Met descrito en el presente documento combinado con uno o más agentes terapéuticos adicionales como se describe a continuación.
La presente divulgación también describe un método para tratar un trastorno que involucra células que expresan c-Met en un sujeto, cuyo método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-c-Met descrito en este documento y al menos un agente terapéutico adicional a un sujeto que lo necesite.
La presente divulgación también describe un método para tratar o prevenir el cáncer, cuyo método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-c-Met descrito en este documento y al menos un agente terapéutico adicional a un sujeto que lo necesite.
En una realización, tal terapéutico adicional puede seleccionarse de un antimetabolito, tal como el metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, gemcitabina o cladribina.
En otra realización, tal agente terapéutico adicional puede seleccionarse de un agente alquilante, tal como mecloretamina, tiotepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbacina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatino y otros derivados del platino, tales como carboplatino.
En otra realización, tal agente terapéutico adicional puede seleccionarse de un agente antimitótico, tal como taxanos, por ejemplo, docetaxel, paclitaxel y alcaloides de la vinca, por ejemplo, vindesina, vincristina, vinblastina y vinorelbina.
En otra realización, tal agente terapéutico adicional puede seleccionarse de un inhibidor de la topoisomerasa, tal como topotecán o irinotecán, o un fármaco citostático, tal como etopósido y tenipósido.
En otra realización, tal agente terapéutico adicional puede seleccionarse de un inhibidor del factor de crecimiento, tal como un inhibidor de ErbB1 (EGFR) (tal como un anticuerpo anti-EGFR, p.ej. zalutumumab, cetuximab, panitumumab o nimotuzumab u otros inhibidores del EGFR, tal como gefitinib o erlotinib), un inhibidor de ErbB2 (Her2/neu) (tal como un anticuerpo anti-HER2, p.ej. trastuzumab, trastuzumab-DM1 o pertuzumab) o un inhibidor tanto de EGFR como de HER2, tal como lapatinib).
En otra realización, tal agente terapéutico adicional puede seleccionarse de un inhibidor de la tirosina cinasa, tal como imatinib (Glivec, Gleevec STI571) o lapatinib, PTK787/ZK222584.
La presente divulgación también describe un método para tratar un trastorno que involucra células que expresan c-Met en un sujeto, cuyo método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-c-Met de la presente divulgación y al menos un inhibidor de la angiogénesis, neovascularización y/u otra vascularización a un sujeto que lo necesite.
Ejemplos de tales inhibidores de la angiogénesis son los inhibidores de la urocinasa, inhibidores de la metaloproteasa de matriz (tales como marimastat, neovastat, BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 y agentes similares), inhibidores de la migración y proliferación de células endoteliales (tales como TNP-470, escualamina, 2-metoxiestradiol, combretastatinas, endostatina, angiostatina, penicilamina, SCH66336 (Schering-Plough Corp, Madison, NJ), R115777 (Janssen Pharmaceutica, Inc, Titusville, NJ) y agentes similares), antagonistas de factores de crecimiento angiogénicos (tales como ZD6474, SU6668, anticuerpos contra agentes angiogénicos y/o sus receptores (tales como VEGF (p. ej. bevacizumab), bFGF y angiopoyetina-1), talidomida, análogos de la talidomida (tales como CC-5013), Sugen 5416, SU5402, ribozima antiangiogénica (tal como la angiozima), interferón a (tal como interferón a2a), suramina y agentes similares), inhibidores de la VEGF-R cinasa y otros inhibidores de la tirosina cinasa antiangiogénica (tales como SU011248), inhibidores de la señalización de supervivencia/integrina específica del endotelio (tales como vitaxina y agentes similares), antagonistas/quelantes del cobre (tales como tetratiomolibdato, captopril y agentes similares), carboxiamido-triazol (CAI), ABT-627, CM101, interleucina-12 (IL-12), IM862, PNU145156E así como moléculas de nucleótidos que inhiben la angiogénesis (tales como el ADNc antisentido del VEGF, ADNc que codifica la angiostatina, ADNc que codifica p53 y ADNc que codifica el receptor VEGF-2 deficiente).
Otros ejemplos de tales inhibidores de la angiogénesis, neovascularización y/u otra vascularización son derivados de heparina antiangiogénicos (p. ej., eparinasa III), temolozomida, NK4, factor inhibidor de la migración de macrófagos, inhibidores de ciclooxigenasa-2, inhibidores del factor 1 inducible por hipoxia, isoflavonas de soja antiangiogénicas, oltipraz, fumagilina y análogos de la misma, análogos de la somatostatina, polisulfato de pentosano, tecogalan de sodio, dalteparina, tumstatina, tromboespondina, NM-3, combrestatina, canstatina, avastatina, anticuerpos contra otras dianas, tales como los anticuerpos anti-integrina alfa-v/beta-3 y anti-kininostatina.
En una realización, un agente terapéutico para su uso en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastornos como se ha descrito anteriormente puede ser un inmunógeno anticancerígeno, tal como un antígeno de cáncer/antígeno asociado a un tumor (por ejemplo, molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM/TACSTDI), mucina 1 (MUC1), antígeno carcinoembrionario (CEA), glucoproteína 72 asociada a tumor (TAG-72), gp100, Melan-A, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7, vacunas virales asociadas al cáncer (por ejemplo, vacunas contra el virus del papiloma humano) o proteínas de choque térmico derivadas de tumores,
En una realización, un agente terapéutico para su uso en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastornos como se ha descrito anteriormente puede ser una citocina anticancerígena, quimiocina, o combinación de las mismas. Los ejemplos de citocinas y factores de crecimiento adecuados incluyen IFNy, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNa (p. ej., INFa2b), IFNp, GM-CSF, CD40L, ligando Flt3, factor citoblástico, ancestim y TNFa. Las quimiocinas adecuadas pueden incluir quimiocinas negativas para Glu-Leu-Arg (ELR) tales como IP-10, MCP-3, MIG y SDF-1a de las familias de quimiocinas humanas CXC y C C. Las citocinas adecuadas incluyen derivados de citocinas, variantes de citocinas, fragmentos de citocinas y proteínas de fusión de citocinas.
En una realización, un agente terapéutico para su uso en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastornos como se ha descrito anteriormente puede ser un regulador de control del ciclo celular/apoptosis (o "agente regulador"). Un regulador de control del ciclo celular/apoptosis puede incluir moléculas que se dirigen y modulan a los reguladores de control del ciclo celular/apoptosis, tales como (i) cdc-25 (tal como NSC 663284), (ii) cinasas dependientes de ciclina que sobreestimulan el ciclo celular (tales como flavopiridol (L868275, HMR1275), 7-hidroxiestaurosporina (UCN-01, KW-2401) y roscovitina (R-roscovitina, CYC202)), y (iii) moduladores de la telomerasa (tales como BIBR1532, SOT-095, GRN163 y composiciones descritas, por ejemplo, en los documentos US 6.440.735 y US 6.713.055). Los ejemplos no limitantes de moléculas que interfieren con las vías apoptóticas incluyen el ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL)/ligando de apoptosis-2 (Apo-2L), anticuerpos que activan los receptores TRAIL, IFN,^ y Bcl-2 antisentido.
En una realización, un agente terapéutico para su uso en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastornos como se ha descrito anteriormente puede ser un agente regulador hormonal, tales como agentes útiles para la terapia con antiandrógenos y antiestrógenos. Ejemplos de tales agentes reguladores hormonales son el tamoxifeno, idoxifeno, fulvestrant, droloxifeno, toremifeno, raloxifeno, dietilestilbestrol, etinilestradiol/estinilo, un antiandrógeno (tal como flutamina/eulexina), una progestina (tal como caproato de hidroxiprogesterona, medroxiprogesterona/provera, acepato de megestrol/megace), un adrenocorticosteroide (tal como hidrocortisona, prednisona), hormona liberadora de hormona luteinizante (y análogos de la misma y otros agonistas de LHRH tales como buserelina y goserelina), un inhibidor de la aromatasa (tal como anastrazol/arimidex, aminoglutetimida/citraden, exemestano) o un inhibidor hormonal (tal como octreotida/sandostatina).
En una realización, un agente terapéutico para su uso en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastornos como se ha descrito anteriormente puede ser un agente antianérgico, tales como compuestos que bloquean la actividad de CTLA-4, p. ej., ipilimumab.
En una realización, un agente terapéutico para usar en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastornos como se ha descrito anteriormente puede ser un ácido nucleico anticancerígeno o una molécula de ARN inhibidora anticancerígena.
Ejemplos de otros agentes anticancerígenos, que pueden ser relevantes como agentes terapéuticos para su uso en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastornos como se ha descrito anteriormente son agentes inductores de diferenciación, análogos del ácido retinoico (tales como el ácido retinoico todo trans, el ácido retinoico 13-cis y agentes similares), análogos de la vitamina D (tales como el seocalcitol y agentes similares), inhibidores de ErbB3, ErbB4, IGF-IR, receptor de insulina, PDGFRa, PDGFRbeta, Flk2, Flt4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, TRKA, TRKC, RON (tal como un anticuerpo anti-RON), Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, Alk, LTK, PTK7 y agentes similares.
Ejemplos de otros agentes anticancerígenos, que pueden ser relevantes como agentes terapéuticos para su uso en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastornos como se ha descrito anteriormente son la estramustina y la epirrubicina.
Ejemplos de otros agentes anticancerígenos, que pueden ser relevantes como agentes terapéuticos para su uso en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastornos como se ha descrito anteriormente son un inhibidor de HSP90 como 17-alil amino geld-anamicina, anticuerpos dirigidos contra un antígeno tumoral tal como el PSA, CA125, KSA, integrinas, p. ej., integrina p1, o inhibidores de VCAM.
Ejemplos de otros agentes anticancerígenos, que pueden ser relevantes como agentes terapéuticos para su uso en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastornos como se ha descrito anteriormente son los inhibidores de la calcineurina (tales como valspodar, PSC 833 y otros inhibidores de MDR-1 o de la p-glicoproteína), inhibidores de TOR (tales como sirólimus, everolimus y rapamicina), inhibidores de los mecanismos de "alojamiento de los linfocitos" (tales como FTY720) y agentes con efectos sobre la señalización celular, tales como inhibidores de moléculas de adhesión (por ejemplo, anti-LFA).
En una realización, el anticuerpo anti-c-Met de la invención es para su uso en combinación con uno o más anticuerpos terapéuticos adicionales, tales como ofatumumab, zanolimumab, daratumumab, ranibizumab, Zenapax, Simulect, Remicade, Humira, Tysabri, Xolair, raptiva y/o rituximab.
Otros anticuerpos terapéuticos que pueden usarse en combinación con el anticuerpo de la presente invención son anticuerpos anti-c-Met que se unen a otras regiones de c-Met, tales como los anticuerpos descritos en los documentos WO2005016382, WO2006015371, WO2007090807, WO2007126799 o WO2009007427.
Se divulga además que se pueden utilizar dos o más anticuerpos diferentes descritos en el presente documento en combinación para el tratamiento de la enfermedad. Combinaciones especialmente interesantes incluyen dos o más anticuerpos no competidores. Esta terapia de combinación puede conducir a la unión de un mayor número de moléculas de anticuerpos por célula, que puede dar una mayor eficacia, p. ej., a través de la activación de la lisis mediada por el complemento.
Además de lo anterior, otros ejemplos de terapias de combinación de la divulgación incluyen los siguientes:
• Para el tratamiento del cáncer de pulmón no microcítico, un anticuerpo anti-c-Met en combinación con inhibidores de EGFR, tal como un anticuerpo anti-EGFR, p.ej. zalutumumab, cetuximab, panitumumab o nimotuzumab u otros inhibidores del EGFR, tal como gefitinib o erlotinib), o en combinación con un inhibidor de ErbB2 (Her2/neu) (tal como un anticuerpo anti-HER2, p.ej. trastuzumab, trastuzumab-DM1 o pertuzumab) o en combinación con un inhibidor tanto de EGFR como de h ER2, tal como lapatinib, o en combinación con un inhibidor de HER3.
• Para el tratamiento del glioma, un anticuerpo anti-c-Met en combinación con temozolomida o un inhibidor de la angiogénesis, tal como bevacizumab.
• Para el tratamiento del cáncer colorrectal, un anticuerpo anti-c-Met en combinación con uno o más compuestos seleccionados entre: gemcitabina, bevacizumab, FOLFOX, FOLFIRI, XELOX, IFL, oxaliplatino, irinotecán, 5-FU/LV, capecitabina, UFT, agentes dirigidos al EGFR, tales como cetuximab, panitumumab, zalutumumab; inhibidores del VEGF o inhibidores de la tirosina cinasa tales como sunitinib.
• Para el tratamiento del cáncer de próstata, un anticuerpo anti-c-Met en combinación con uno o más compuestos seleccionados entre: terapias hormonales/antihormonales; tales como los antiandrógenos, agonistas de la hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH) y agentes quimioterapéuticos tales como los taxanos, mitoxantrona, estramustina, 5FU, vinblastina, ixabepilona,
Radioterapia - cirugía
En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-c-Met de la presente invención para su uso en un método de tratamiento de un trastorno que involucra células que expresan c-Met en un sujeto, cuyo método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-c-Met y radioterapia a un sujeto que lo necesite.
En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-c-Met de la presente invención para su uso en un método de tratamiento o prevención del cáncer, cuyo método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-c-Met y radioterapia a un sujeto que lo necesite.
En una realización, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-c-Met, tal como un anticuerpo antic-Met de la presente invención, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer que se administrará en combinación con radioterapia.
La radioterapia puede comprender radiación, o se proporciona la administración asociada de radiofármacos a un paciente. La fuente de radiación puede ser externa o interna al paciente que se está tratando (el tratamiento con radiación puede, por ejemplo, estar en forma de radioterapia de haz externo (EBRT) o braquiterapia (BT)). Los elementos radiactivos que pueden utilizarse en la práctica de dichos métodos incluyen, p. ej., radio, cesio-137, iridio-192, americio-241, oro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnecio-99, yoduro-123, yoduro-131 e indio-111.
En otra realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-c-Met de la presente invención para su uso en un método de tratamiento o prevención del cáncer, cuyo método comprende la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-c-Met, en combinación con cirugía.
Usos de diagnóstico
Los anticuerpos anti-c-Met de la invención también pueden usarse con fines diagnósticos. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición de diagnóstico que comprende un anticuerpo anti-c-Met como se define en el presente documento.
En una realización, los anticuerpos anti-c-Met de la presente invención pueden usarsein vitropara diagnosticar enfermedades en donde las células activadas que expresan c-Met desempeñan un papel activo en la patogénesis, detectando los niveles de c-Met, o los niveles de células que contienen c-Met en la superficie de su membrana. Esto se puede lograr, por ejemplo, al poner en contacto una muestra a ser sometida a ensayo, opcionalmente junto con una muestra de control, con el anticuerpo anti-c-Met en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y c-Met. En otra realización, los anticuerpos anti-c-Met de la presente invención pueden usarse en métodos de diagnósticoin vivo.
Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invención se refiere a un métodoin vitropara detectar la presencia del antígeno c-Met, o de una célula que expresa c-Met, en una muestra que comprende:
- poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-c-Met de la invención en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y c-Met; y
- analizar si se ha formado un complejo.
Más específicamente, la presente invención proporciona métodosin vitropara la identificación y el diagnóstico de células y tejidos invasivos y otras células a las que se dirigen los anticuerpos anti-c-Met de la presente invención, y para el seguimiento del progreso de los tratamientos terapéuticos, estado después del tratamiento, riesgo de desarrollar cáncer, progresión del cáncer y similares.
Las etiquetas adecuadas para el anticuerpo anti-c-Met y/o los anticuerpos secundarios utilizados en dichas técnicas son bien conocidos en la técnica.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un kit para detectar la presencia del antígeno c-Met, o de una célula que expresa c-Met, en una muestra que comprende:
- una molécula biespecífica anti-c-Met de la invención; y
- instrucciones de uso del kit.
En una realización, la presente invención proporciona un kit para el diagnóstico de cáncer que comprende un recipiente que comprende un anticuerpo anti-c-Met y uno o más reactivos para detectar la unión del anticuerpo anti-c-Met a c-Met. Los reactivos pueden incluir, por ejemplo, etiquetas fluorescentes, etiquetas enzimáticas u otras etiquetas detectables. Los reactivos también pueden incluir anticuerpos secundarios o terciarios o reactivos para reacciones enzimáticas, en donde las reacciones enzimáticas producen un producto que puede visualizarse.
Anticuerpos antiidiotípicos
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un anticuerpo antiidiotípico que se une a un anticuerpo anti-c-Met de la invención como se describe en el presente documento.
Un anticuerpo antiidiotípico (Id) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos generalmente asociados con el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo Id se puede preparar inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético que la fuente de un mAb anti-c-Met con el mAb para el cual se está preparando un anti-Id. El animal inmunizado puede normalmente reconocer y responder a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante produciendo un anticuerpo para estos determinantes idiotípicos (el anticuerpo anti-Id).
Un anticuerpo anti-Id puede utilizarse también como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmunitaria en otro animal adicional, produciendo un anticuerpo denominado anti-anti-Id. Un anti-anti-Id puede ser epitópicamente idéntico al mAb original, que indujo el anti-Id. Por lo tanto, mediante el uso de anticuerpos contra los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de especificidad idéntica.
La presente invención se ilustra además por medio de los siguientes ejemplos, que no deberán considerarse como una limitación adicional.
Ejemplos
Ejemplo 1: Construcciones de expresión para c-Met
Se generaron construcciones con codones optimizados para la expresión de c-Met, el dominio extracelular (ECD) (aa 1-932 y una etiqueta His6 C-terminal o el dominio SEMA de c-Met (aa 1-567 y una etiqueta His9 C-terminal), en células HEK o CHO. Las proteínas codificadas por estas construcciones son idénticas al número de acceso Genbank NM 000245 para c-Met. Las construcciones contenían sitios de restricción adecuados para la clonación y una secuencia Kozak óptima (Kozaket al.(1999) Gen 234: 187-208). Las construcciones se clonaron en el vector de expresión de mamíferos pEE13.4 (Lonza Biologics) (Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10:169-175), obteniendo pEE13.4cMet, pEE13.4cMetECDHis y pEE13.4cMetSEMA-567His8.
Ejemplo 2: Construcciones de expresión para 5D5v1, 5D5 y G11-HZ
Se generaron construcciones con codones optimizados para la expresión de la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) de los anticuerpos IgG1 5D5v1, 5D5 y G11-HZ en células HEK. Las proteínas codificadas por estas construcciones son idénticas a las descritas en la patente estadounidense 6468529 (números de secuencia 3 y 4) para la cadena pesada y la cadena ligera de 5D5v1, documento WO 2006/015371 A2 (fig. 13) para la cadena pesada y la cadena ligera de 5D5 y documento WO 2009/007427 A2 (la secuencia se extrajo de múltiples figuras) para la cadena pesada y la cadena ligera de 224G11. En el presente documento, 224G11 también se denomina G11-HZ.
Ejemplo 3: Expresión transitoria en células HEK-293F
Se obtuvieron células Freestyle™ 293-F (un subclón de HEK-293 adaptado al crecimiento en suspensión y en medio Freestyle químicamente definido, HEK-293F)) de Invitrogen y se transfectaron con el ADN plasmídico apropiado, usando 293fectin (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La expresión de c-Met se sometió a ensayo a través de análisis FACS como se describe a continuación. En el caso de la expresión de anticuerpos, se coexpresaron los vectores de expresión de la cadena pesada y cadena ligera apropiados.
Ejemplo 4: Expresión transitoria en células CHO
pEE13.4cMet se transfectó transitoriamente en la línea celular Freestyle™ CHO-S (Invitrogen) usando el reactivo de transfección Freestyle MAX (Invitrogen). La expresión de c-Met se sometió a ensayo a través de análisis FACS como se describe a continuación.
Ejemplo 5: Clonación y expresión de anticuerpos monovalentes (moléculas UniBody®)
Para la expresión de anticuerpos monovalentes en células de mamíferos, la región constante HC de IgG4, sin la región de bisagra (Ch) (aminoácidos E99-P110) y que contiene las 2 mutaciones F405T e Y407E en la región CH3, se sintetizó como una construcción con codones optimizados en el vector de expresión de mamíferos pcDNA3.3 (Invitrogen) y se denominó pUniTE. Se construyó un vector separado insertando la región constante con codones optimizados de la región de la cadena ligera kappa humana en pcDNA3.3 y se denominó pKappa.
Las regiones VH y VL relevantes se insertaron respectivamente en pUniTE y pKappa, dando como resultado vectores para la expresión de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos específicos. La cotransfección de los vectores de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo específico en células HEK-293F (Invitrogen), da como resultado la producción transitoria de anticuerpos monovalentes con las especificidades deseadas. La purificación se realizó usando cromatografía en columna de afinidad de proteína A (como se describe en el Ejemplo 11).
Ejemplo 6: Purificación de c-Met marcado con His
cMetECDHis y cMetSEMAHis se expresaron en células HEK-293F. La etiqueta His en cMetECDHis y cMetSEMAHis permite la purificación con cromatografía de afinidad de metales inmovilizados. En este proceso, un quelante fijado sobre la resina cromatográfica se carga con cationes Co2+. Los sobrenadantes que contenían cMetECDHis y cMetSEMAHis se incubaron con la resina en modo discontinuo (es decir, solución). La proteína marcada con His se une fuertemente a las perlas de resina, mientras que otras proteínas presentes en el sobrenadante del cultivo no se unen fuertemente. Tras la incubación, las perlas se recuperan del sobrenadante y se empaquetan en una columna. La columna se lava para eliminar las proteínas unidas débilmente. Las proteínas cMetECDHis y cMetSEMAHis fuertemente unidas se eluyen a continuación con un tampón que contiene imidazol, que compite con la unión de His a Co2+. El eluyente se elimina de la proteína mediante intercambio de tampón en una columna de desalinización.
Ejemplo 7: Procedimiento de inmunización de ratones transgénicos
Los anticuerpos 005, 006, 007, 008, 011, 012, 016, 017, 022, 024, 025, 028, 031, 035, 039, 040, 045, 093, 095, 096, 101 y 104 se derivaron de las siguientes inmunizaciones: un ratón HCo20 (1 hembra, cepa GG2713), un ratón HCo17 (hembra, cepa GG2714) y dos ratones HCo12-Balb/C (2 hembras, cepa GG2811) (Medarex, San José, CA, EE. UU.; para referencias, véase el párrafo anterior sobre el ratón HuMab, documentos WO2009097006 y US2005191293) se inmunizaron cada quince días alternando con 5*10® células tumorales NCI-H441 por vía intraperitoneal (IP) y 20 |jg de proteína cMetECDHis acoplada al hapteno Hemocianina de Lapa Californiana (KLH) por vía subcutánea (SC).
Los anticuerpos 058, 061, 062, 063, 064, 065, 066, 068, 069, 078, 082, 084, 087, 089, 098 y 181 se derivaron de las siguientes inmunizaciones: dos ratones HCo20 (1 macho y 1 hembra, cepa GG2713) y un ratón HCo12-Balb/C (1 macho, cepa GG2811) (Medarex, San José, CA, EE. UU.; (para referencias, véase el párrafo anterior sobre el ratón HuMab) fueron inmunizados cada quince días alternando con 5*106 células CHO-K1SV transfectadas transitoriamente con cMetECD por vía intraperitoneal (IP) y 20 jg de proteína cMetECDHis acoplada al hapteno Hemocianina de Lapa Californiana (KLH) por vía subcutánea (SC).
Se realizaron un máximo de ocho inmunizaciones por ratón, cuatro inmunizaciones IP y cuatro SC en la base de la cola. La primera inmunización con células se realizó en adyuvante completo de Freund (CFA; Difco Laboratories, Detroit, M<i>, EE. UU.). Para todas las demás inmunizaciones, las células se inyectaron IP en PBS y el cMetECD acoplado a KLH se inyectó SC usando adyuvante incompleto de Freund (IFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, EE. UU.). Se fusionaron los ratones con al menos dos títulos secuenciales de anticuerpos específicos de c-Met de 200 (diluciones de suero de 1/200) o superiores, detectados en el ensayo de detección específica de antígeno FMAT como se describe en el Ejemplo 8.
Ejemplo 8: Ensayo de detección homogéneo de antígenos específicos
La presencia de anticuerpos anti-c-Met en sueros de ratones inmunizados o sobrenadante de cultivo de hibridoma o transfectoma HuMab (anticuerpo monoclonal humano) se determinó mediante ensayos de detección específicos de antígeno homogéneo (cuatro cuadrantes) usando tecnología de ensayo de microvolumen fluorométrico (FMAT; Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). Para esto, se utilizó una combinación de 3 ensayos basados en células y un ensayo basado en perlas. En los ensayos basados en células, se determinó la unión a TH1016-cMet (células HEK-293F que expresan transitoriamente el dominio extracelular del receptor c-Met; producidas como se ha descrito anteriormente) y HT29 (que expresan c-Met en la superficie celular), así como células HEK293 de tipo salvaje (control negativo que no expresa c-Met). Para el ensayo basado en perlas, se determinó la unión a SB1016-cMet (cMetECDH se obtiene a partir de células HEK-293F transfectadas transitoriamente como se ha descrito anteriormente, biotiniladas y acopladas a perlas recubiertas con estreptavidina). Se agregaron muestras a las células/perlas para permitir la unión a c-Met. Posteriormente, la unión de HuMab se detectó usando un conjugado fluorescente (anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con Cy5; Jackson ImmunoResearch). El anticuerpo quimérico específico c-Met 5D5v1 (producido en células HEK-293F) se utilizó como control positivo y el suero agrupado de ratón HuMab y HuMab-KLH se utilizaron como controles negativos. Las muestras se exploraron usando un sistema de detección celular Applied Biosystems 8200 (8200 CDS) y se usaron 'recuentos * fluorescencia' como lectura. Las muestras se declararon positivas cuando los recuentos fueron superiores a 50 y los recuentos * fluorescencia fueron al menos tres veces superiores al control negativo HuMab-KLH.
Ejemplo 9: Generación de hibridomas HuMab
Los ratones HuMab con suficiente desarrollo de título específico de antígeno (definido como se ha descrito anteriormente) fueron sacrificados y se recolectaron el bazo y los ganglios linfáticos que flanqueaban la aorta abdominal y la vena cava. La fusión de esplenocitos y células de ganglios linfáticos con una línea celular de mieloma de ratón se realizó mediante electrofusión usando un sistema de electrofusión CEEF 50 (Cyto Pulse Sciences, Glen Burnie, MD, EE. UU.), esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las placas de fusión se examinaron con el ensayo de unión específica de antígeno como se ha descrito anteriormente y los resultados positivos de este ensayo se sometieron a ensayo en un ensayo Alphascreen® SureFire® de fosforilación de ERK y ensayo Octet clasificación de afinidad como se describe a continuación. Los anticuerpos 031, 035, 087 y 089 se expandieron y cultivaron con base en protocolos estándar (p. ej., como se describe en Coligan J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. y Strober, W., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006).
Paralelamente se clonaron los anticuerpos 005, 006, 007, 008, 011, 012, 016, 017, 022, 024, 025, 028, 035, 039, 040, 045, 058, 061, 062, 063, 064, 065, 066, 068, 069, 078, 082, 084, 093, 095, 096, 098, 101, 104 y 181 usando el sistema ClonePix (Genetix, Hampshire, RU). Se sembraron hibridomas de pocillos primarios específicos en un medio semisólido hecho de un 40 % de CloneMedia (Genetix, Hampshire, Reino Unido) y 60 % de medios completos HyQ 2x (Hyclone, Waltham, EE. UU.) y se seleccionaron aproximadamente 100 subclones de cada pocillo primario. Los subclones se volvieron a someter a ensayo en el ensayo de unión específica de antígeno como se ha descrito anteriormente y se midieron los niveles de IgG usando Octet para seleccionar el clon más específico y productor por pocillo primario para una expansión adicional. Se realizó una expansión y un cultivo adicionales de los hibridomas HuMab resultantes con base en protocolos estándar (p. ej., como se describe en Coligan J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. y Strober, W., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006).
Ejemplo 10: Espectrometría de masas de anticuerpos purificados
Se purificaron pequeñas alícuotas de 0,8 ml de sobrenadante de hibridoma que contenía anticuerpos procedentes del estadio de 6 pocillos o recipientes Hyperflask, usando columnas de PhyTip que contenían resina de proteína G (PhyNexus Inc., San José, EE. UU.) en una estación de trabajo Sciclone ALH 3000 (Caliper Lifesciences, Hopkinton, EE. UU.). Las columnas de PhyTip se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero los tampones se reemplazaron con: Tampón de unión PBS (B. Braun, Medical B.V., Oss, Países Bajos) y Tampón de elución de glicina 0,1 M-HCl pH 2,7 (Fluka Riedel-de Haen, Buchs, Alemania). Tras la purificación, las muestras se neutralizaron con Tris-HCl 2 M pH 9,0 (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Países Bajos). Como alternativa, en algunos casos se purificaron volúmenes mayores de sobrenadante de cultivo usando cromatografía en columna de afinidad de proteína A.
Tras la purificación, las muestras se colocaron en una placa de 384 pocillos (Waters, placa de pocillos cuadrados de 100 ul, n.° de pieza 186002631). Las muestras se desglicosilaron durante la noche a 37 °C con N-glicosidasa F. Se añadió DTT (15 mg/ml) (1 pl/pocillo) y se incubó durante 1 h a 37 °C. Las muestras (5 o 6 ul) se desalinizaron en un Acquity UPlC™ (Waters, Milford, e E. UU.) con una columna BEH300 C18, 1,7 pm, columna de 2,1 x 50 mm a 60 °C. Se utilizaron agua MQ y acetonitrilo de grado LC-MS (Biosolve, n.° de cat. 01204101, Valkenswaard, Países Bajos), ambos con ácido fórmico al 0,1 % (Fluka, n.° de cat. 56302, Buchs, Alemania), como eluyentes A y B, respectivamente. Los espectros de masas de ionización por electronebulización de tiempo de vuelo se registraron en línea en un espectrómetro de masas microOTOF™ (Bruker, Bremen, Alemania) funcionando en modo de iones positivos. Antes del análisis, se calibró una escala de 900-3000 m/z con una mezcla de ajuste de EN (Agilent Technologies, Santa Clara, EE. UU.). Los espectros de masas se deconvolucionaron con DataAnalysis™ software v. 3.4 (Bruker) que utiliza el algoritmo de Máxima Entropía buscando pesos moleculares entre 5 y 80 kDa.
Tras la desconvolución, se compararon las masas de las cadenas pesadas y ligeras resultantes de todas las muestras para encontrar anticuerpos duplicados. En la comparación de las cadenas pesadas se tuvo en cuenta la posible presencia de variantes de lisina C-terminal. Esto dio como resultado una lista de anticuerpos únicos, donde único se define como una combinación única de cadenas pesadas y ligeras. En caso de que se encontrasen anticuerpos

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-c-Met y un segundo sitio de unión a antígeno específico del receptor del factor de crecimiento epidérmico, en donde el primer sitio de unión a antígeno comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 98, 99 y 100 y una región VL que comprende las secuencias C<d>R<i>, 2 y 3 de SEQ ID NO: 102, 103 y 104.
2. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, en donde el primer sitio de unión a antígeno comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 97 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 101.
3. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.
4. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, por ejemplo, una IgG1,K.
5. Secuencias de ácidos nucleicos que codifican cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Un vector de expresión, o un conjunto de vectores de expresión, que codifican el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Una célula hospedadora eucariota o procariota recombinante que produce un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
8. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
9. La composición farmacéutica de la reivindicación 8, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico es de 0,1-50 mg/kg o de 5-20 mg/kg.
10. La composición farmacéutica de la reivindicación 8 o 9, en donde la composición farmacéutica es para la administración mediante inyección o infusión intravenosa o subcutánea.
11. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso como medicamento.
12. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en el tratamiento del cáncer, tal como un cáncer dependiente de HGF o un cáncer independiente de HGF.
13. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde el cáncer es cáncer de pulmón, tal como el cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC); cáncer colorrectal; cáncer esofágico; o cáncer gástrico.
14. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde el tratamiento comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo y al menos un agente terapéutico adicional a un sujeto que lo necesite.
15. El anticuerpo biespecífico para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor del factor de crecimiento o un inhibidor de la tirosina cinasa.
16. El anticuerpo biespecífico para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el inhibidor del factor de crecimiento o el inhibidor de la tirosina cinasa es gefitinib, erlotinib o lapatinib.
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