RS66193B1

RS66193B1 - Anti-pd-1 antitela

Info

Publication number: RS66193B1
Application number: RS20241278A
Authority: RS
Inventors: David A Blair; Nicole K Garaffa; Pankaj Gupta; Priyanka Gupta; Fei Han; Aaron Timothy Karlak; Dongmei Liu; Ivo Lorenz; Mouhamadou Lamine Mbow; Miguel E Moreno-Garcia; Joseph A Mozdzierz; Kerry L M Ralph; Abdulsalam Shaaban; Della M White; Helen Haixia Wu; Guangwei Yang
Original assignee: Boehringer Ingelheim Int
Priority date: 2020-05-26
Filing date: 2021-05-24
Publication date: 2024-12-31
Also published as: MA59827B1; US12312405B2; DK4157876T3; ECSP22092185A; TW202216765A; LT4157876T; MX2022014974A; EP4464383A3; TWI859446B; CA3181776A1; CN121717905A; IL298431A; SI4157876T1; CR20220596A; CN121930345A; EP4464383A2; US20260070984A1; JP7777632B2; HRP20241488T1; CN115956087A

Description

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se uopšteno odnosi na anti-PD-1 (Programirana ćelijska smrt 1) antitela za terapeutsku i dijagnostičku upotrebu. Preciznije, otkrivena su anti-PD-1 antitela i postupci za upotrebu za lečenje različitih bolesti ili poremećaja koje karakterišu ćelije koje eksprimiraju PD-1. Farmaceutske kompozicije i kompleti koji sadrže anti-PD-1 antitela su takođe otkrivene.

STANJE TEHNIKE

[0002] Programirana ćelijska smrt 1, takođe poznata kao PD-1 i CD279 (klaster diferencijacije 279), je protein receptora ćelijske površine koji se prvenstveno eksprimira na T-ćelijama, ali i na drugim imunim ćelijama. PD-1 put je ključni regulator u indukciji i održavanju imunološke tolerancije. Protein funkcioniše kao inhibitor "kontrolne tačke imuniteta", odnosno deluje tako da moduliše aktivnost ćelija u imunološkom sistemu kako bi regulisao i ograničio autoimune bolesti. PD-1 ima dva liganda, PD-L1 i PD-L2, koji stupaju u interakciju sa receptorom površine ćelije. Nakon vezivanja, PD-1 indukuje intracelularni signal, koji negativno reguliše odgovore T-ćelija. Na površini aktiviranih T ćelija, ekspresija PD-1 se pojačava nakon što T ćelije prepoznaju periferne antigene; naknadno, povišeno vezivanje PD-1 za PD-L1 i PD-L2 postaje ključni korak za nizvodno inhibitorno signaliziranje. PD-1 je takođe povezan sa povećanom proliferacijom Treg ćelija i poboljšanom imunosupresivnom funkcijom.

[0003] Nedavno je shva ćeno da se mnogi kanceri mogu zaštititi od imunog sistema modifikovanjem inhibitora "imunološke kontrolne tačke" i tako izbeći otkrivanje. PD-1 inhibitori, nova klasa lekova koji blokiraju PD-1, aktiviraju imuni sistem da napadne tumore i koriste se za lečenje određenih vrsta raka.

[0004] Nasuprot tome, defektne PD-1 inhibitorne funkcije su takođe povezane sa patofiziologijom imunološki posredovanih bolesti, a ekspresija PD-1 ili njegovih liganda može biti disregulisana ili nije u potpunosti uključena u određene autoimune indikacije. Indukcija aktivacije PD-1 i upotreba PD-1 / PD-L1 i/ili PD-L2 sistema stoga predstavlja alternativni pristup za suzbijanje imunološkog odgovora i obezbeđivanje lečenja za različite imunološke i inflamatorne poremećaje. WO 2011/110621 A1 opisuje humanizovana anti-PD-1 antitela.

[0005] Stoga postoji potreba za terapijama, koje indukuju PD-1 put, poboljšavaju supresivnu funkciju i obezbeđuju lečenja za imunološke i inflamatorne poremećaje koje kontroliše PD-1/PD-L1 i/ili PD-L2 sistem. Posebno, postoji potreba za biološkim terapeuticima, kao što su antitela, koja moduliraju interakciju između PD-1 i PD-L1 ili PD-L2 bez blokiranja takve interakcije.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0006] Predmetni pronalazak je opisan u zahtevima. Otkriće obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za humani PD-1. U jednom aspektu pronalaska, antitela predmetnog pronalaska ne blokiraju interakciju između PD-1 i PD-L1. U jednom aspektu pronalaska, antitela predmetnog pronalaska pojačavaju interakciju između PD-1 i PD-L1. U jednom aspektu pronalaska, antitela predmetnog pronalaska aktiviraju PD-1 signalni put. U jednom aspektu pronalaska, antitela predmetnog pronalaska su anti-PD-1 agonista antitela. Antitela pronalaska su korisna, na primer, za lečenje i/ili prevenciju bolesti ili poremećaja koji se mogu ublažiti modulacijom interakcije između PD-1 i PD-L1, posebno aktiviranjem PD-1 puta.

[0007] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo, posebno monoklonsko anti-PD-1 antitelo, na primer humanizovano monoklonsko anti-PD-1 antitelo, koje ima jedno ili više opisanih svojstava ovde u nastavku. U jednom aspektu, anti-PD-1 antitelo predmetnog pronalaska se vezuje za prečišćeni rekombinantni humani PD-1 sa visokim afinitetom, na primer 20 nM ili manje, na primer 10 nM ili manje, na primer 5 nM manje. U jednom aspektu, anti-PD-1 antitelo predmetnog pronalaska se vezuje za prečišćeni rekombinantni cinomologus PD-1 sa afinitetom od 50 nM ili manje. U jednom aspektu, anti-PD-1 antitelo predmetnog pronalaska selektivno se vezuje za PD-1, posebno za humani PD-1. U jednom aspektu, antitelo predmetnog pronalaska se ne vezuje za PD-1 miša, pacova ili zeca. U jednom aspektu, anti-PD-1 antitelo predmetnog pronalaska ne blokira vezivanje PD-L1 za PD-1. U jednom aspektu, anti-PD-1 antitelo predmetnog pronalaska pojačava vezivanje PD-L1 za PD-1. U jednom aspektu, anti-PD-1 antitelo predmetnog pronalaska slabi aktivnost T ćelija u testu funkcionalnih ćelija, na primer inhibicijom proizvodnje IFNi, inhibicijom proizvodnje IL-17A ili inhibicijom proizvodnje IL-21. U jednom aspektu, anti-PD-1 antitelo predmetnog pronalaska inhibira akumulaciju ljudskih ćelija u modelu miša i smanjuje nivoe humanih inflamatornih citokina u modelu miša. U jednom aspektu, anti-PD-1 antitelo predmetnog pronalaska ima povoljna farmakokinetička svojstva. U jednom aspektu, anti-PD-1 antitelo predmetnog pronalaska ima povoljna biofizička svojstva, na primer prinos, kvalitet, stabilnost ili rastvorljivost. U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje fragmente antitela koji se vezuju za antigen iz predmetnog pronalaska.

[0008] Pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koje sadrži:

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43 (H-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 (H-CDR3), i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 (L-CDR3),

ili

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43 (H-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 45 (H-CDR3), i

ili

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 47 (H-CDR1); aminokiselinska sekvenca SEK ID NO: 48 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 49 (H-CDR3), i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6 (L-CDR3),

ili

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50 (H-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 52 (H-CDR3), i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 (L-CDR3),

ili

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53 (H-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 54 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55 (H-CDR3), i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12 (L-CDR3),

ili

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 56 (H-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 57 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 58 (H-CDR3), i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 (L-CDR3),

ili

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59 (H-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 60 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 61 (H-CDR3), i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 (L-CDR3),

ili

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62 (H-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 63 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64 (H-CDR3), i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21 (L-CDR3),

ili

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 65 (H-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 67 (H-CDR3), i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24 (L-CDR3),

ili

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68 (H-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 69 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 70 (H-CDR3), i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 25 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 (L-CDR3),

ili

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71 (H-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 72 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 58 (H-CDR3), i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29 (L-CDR3),

ili

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73 (H-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 74 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 75 (H-CDR3), i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32 (L-CDR3),

ili

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73 (H-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77 (H-CDR3), i

ili

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73 (H-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77 (H-CDR3), i

ili

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73 (H-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 79 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77 (H-CDR3), i

ili

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 164 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32 (L-CDR3),

ili

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 166 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32 (L-CDR3),

ili

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 167 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32 (L-CDR3),

ili

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80 (H-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 81 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82 (H-CDR3), i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34 (L-CDR3),

ili

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 83 (H-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 84 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85 (H-CDR3), i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36 (L-CDR3),

ili

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86 (H-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88 (H-CDR3), i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 37 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39 (L-CDR3),

ili

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 89 (H-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 90 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 91 (H-CDR3), i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 41 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 42 (L-CDR3).

[0009] Pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen koji sadrži:

ili

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 167 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32 (L-CDR3).

1

[0010] Pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen koji sadrži:

varijabilni region teškog lanca koji sadrži bilo koji od:

aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 73 (H-CDR1); aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 74 (H-CDR2); i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 75 (H-CDR3),

aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 73 (H-CDR1); aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 76 (H-CDR2); i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 77 (H-CDR3),

aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 73 (H-CDR1); aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 78 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77 (H-CDR3), ili

aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 73 (H-CDR1); aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 79 (H-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77 (H-CDR3);

i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži bilo koji od:

aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 30 (L-CDR1); aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 31 (L-CDR2); i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 32 (L-CDR3),

aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 164 (L-CDR1); aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 31 (L-CDR2); i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 32 (L-CDR3),

aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 165 (L-CDR1); aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 166 (L-CDR2); i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 32 (L-CDR3),

aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 165 (L-CDR1); aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 167 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32 (L-CDR3).

[0011] U jednom izvođenju, CDRs anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen su definisani prema numerisanju grupe za hemijsko računarstvo (CCG).

[0012] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen kao što je gore navedeno, pri čemu je antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen humanizovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen.

[0013] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen kao što je gore navedeno, pri čemu je antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen izabran iz grupe koju čine monoklonsko antitelo, Fab, F(ab')2, Fv i scFv.

[0014] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 108 i SEQ ID NO: 92, respektivno; SEQ ID NO: 109 i SEQ ID NO: 93, respektivno; SEQ ID NO: 110 i SEQ ID NO: 94, respektivno; SEQ ID NO: 111 i SEQ ID NO: 95, respektivno; SEQ ID NO: 112 i SEQ ID NO: 96, respektivno; SEQ ID NO: 113 i SEQ ID NO: 97, respektivno; SEQ ID NO: 114 i SEQ ID NO: 98, respektivno; SEQ ID NO: 115 i SEQ ID NO: 99, respektivno; SEQ ID NO: 116 i SEQ ID NO: 100, respektivno; SEQ ID NO: 117 i SEQ ID NO: 101, respektivno; SEQ ID NO: 118 i SEQ ID NO: 102, respektivno; SEQ ID NO: 119 i SEQ ID NO: 103, respektivno; SEQ ID NO: 120 i SEQ ID NO: 104, respektivno; SEQ ID NO: 121 i SEQ ID NO: 105, respektivno; SEQ ID NO: 122 i SEQ ID NO: 106, respektivno; SEQ ID NO: 123 i SEQ ID NO: 107, respektivno.

[0015] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ NO: 131, SEQ NO: 133, SEQ NO: 135, SEQ NO: 137 ili SEQ NO: 139 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ NO: 125, SEQ NO: 127 ili SEQ NO: 129.

[0016] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 131 i SEQ ID NO: 125, respektivno.

[0017] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 133 i SEQ ID NO: 127, odnosno.

[0018] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 135 i SEQ ID NO: 127, respektivno.

[0019] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 137 i SEQ ID NO: 129, respektivno.

[0020] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 139 i SEQ ID NO: 129, respektivno.

[0021] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 131 i SEQ ID NO: 125, respektivno.

[0022] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 133 i SEQ ID NO: 127, respektivno.

[0023] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 135 i SEQ ID NO: 127, respektivno.

[0024] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 137 i SEQ ID NO: 129, respektivno.

[0025] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 139 i SEQ ID NO: 129, respektivno.

[0026] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen kao što je gore opisano, pri čemu antitelo sadrži

1

konstantni region teškog lanca izabran između grupe koja se sastoji od lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM , IgA i IgE konstantnih regiona, na primer humani lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA ili IgE.

[0027] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo kao što je gore opisano, pri čemu je konstantni region teškog lanca konstantni region teškog lanca lgG4 sa Ser228Pro mutacijom.

[0028] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo kao što je gore opisano, pri čemu je konstantni region teškog lanca konstantni region teškog lanca IgGl

[0029] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo kao što je gore opisano, pri čemu je konstantni region teškog lanca konstantni region teškog lanca lgG1 sa Leu234Ala i Leu235Ala mutacijama.

[0030] U jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen kao što je gore opisano pri čemu antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži konstantni region lakog lanca izabran iz grupe koju čine kapa i lambda.

[0031] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo, pri čemu antitelo sadrži teški lanac i laki lanac koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 143 i SEQ ID NO: 141, respektivno.

[0032] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo, pri čemu antitelo sadrži teški lanac i laki lanac koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 147 i SEQ ID NO: 145, respektivno.

[0033] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo, pri čemu antitelo sadrži teški lanac i laki lanac koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 149 i SEQ ID NO: 145, respektivno.

[0034] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo, pri čemu antitelo sadrži teški lanac i laki lanac koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 153 i SEQ ID NO: 151, respektivno.

[0035] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo, pri čemu antitelo sadrži teški lanac i laki lanac koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 155 i SEQ ID NO: 151, respektivno.

[0036] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo, pri čemu antitelo sadrži teški lanac i laki lanac, pri čemu se aminokiselina sekvenca navedenog teškog lanca sastoji od aminokiselina SEQ ID NO: 143 i aminokiselinska sekvenca navedenog lakog lanca sastoji se od aminokiselina SEQ ID NO: 141.

[0037] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo, pri čemu antitelo sadrži teški lanac i laki lanac, pri čemu se aminokiselinska sekvenca navedenog teškog lanca sastoji od aminokiselina SEQ ID NO: 147 i aminokiselinska sekvenca navedenog lakog lanca se sastoji od aminokiselina SEQ ID NO : 145.

[0038] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo, gde antitelo sadrži teški lanac i laki lanac, pri čemu se aminokiselinska sekvenca navedenog teškog lanca sastoji od aminokiselina SEQ ID NO: 149 i aminokiselinska sekvenca navedenog lakog lanca sastoji se od aminokiselina SEQ ID NO: 145.

[0039] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo, pri čemu antitelo sadrži teški lanac i laki lanac, pri čemu se aminokiselinska sekvenca navedenog teškog lanca sastoji od aminokiselina SEQ ID NO: 153 i aminokiselinska sekvenca navedenog lakog lanca se sastoji od aminokiselina SEQ ID NO: 151.

[0040] Pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo, pri čemu antitelo sadrži teški lanac i laki lanac, pri čemu se aminokiselinska sekvenca navedenog teškog lanca sastoji od aminokiselina SEQ ID NO: 155 i aminokiselinska sekvenca navedenog lakog lanca se sastoji od aminokiselina SEQ ID NO: 151.

[0041] U jednom izvođenju, anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen kao što je gore opisano je monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen.

[0042] U jednom izvođenju, anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen kao što je gore opisano je humanizovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen.

[0043] U jednom izvođenju, anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen kao što je gore opisano je agonističko anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen.

1

[0044] U jednom izvođenju, anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, kao što je gore opisano, vezuje se za humani PD-1 sa visokim afinitetom, na primer manje od 20 nM, na primer 10 nM ili manje, na primer manje od 5 nM.

[0045] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji se takmiči za vezivanje za PD-1 sa anti-PD-1 antitelom ili njegovim fragmentom koji se vezuje za antigen kao što je gore opisano. U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji se takmiči za vezivanje za PD-1 sa antitelom A, antitelom B, antitelom C, antitelom D ili antitelom E.

[0046] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen kao što je gore opisano, i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0047] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen kao što je gore opisano za upotrebu kao lek.

[0048] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu u postupku lečenja poremećaja PD-1 puta koji obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno farmaceutski efikasne količine anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen kao što je gore opisano. U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen kao što je gore opisano za upotrebu u lečenju poremećaja PD-1 puta. U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen kao što je gore opisano u proizvodnji leka za lečenje poremećaja PD-1 puta.

[0049] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu u postupku modulacije interakcije između PD-1 i PD-L1 kod humanog pacijenta koji se sastoji od davanja humanom pacijentu kompozicije koja sadrži anti-PD-1 antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen kao što je gore opisano u količini dovoljnoj da aktivira PD-1 put kod humanog pacijenta. U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen kao što je gore opisano za upotrebu u modulaciji interakcije između PD-1 i PD-L1 kod humanog pacijenta. U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu

1

anti-PD-1 antitela ili fragmenta koji se vezuje za antigen kao što je gore opisano u proizvodnji leka za modulaciju interakcije između PD-1 i PD-L1 kod humanog pacijenta.

[0050] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu u postupku slabljenja aktivnosti T ćelija koje eksprimiraju PD-1 kod humanog pacijenta koji se sastoji od davanja kompozicije humanom pacijentu koja sadrži anti-PD-1 antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen kao što je gore opisano u količini dovoljnoj da smanji imuni odgovor kod humanog pacijenta. U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen kao što je gore opisano za upotrebu u slabljenju aktivnosti T ćelija koje eksprimiraju PD-1 kod humanog pacijenta. U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu anti-PD-1 antitela ili fragmenta koji se vezuje za antigen kao što je gore opisano u proizvodnji leka za smanjenje aktivnosti T ćelija koje eksprimiraju PD-1 kod humanog pacijenta.

[0051] U jednom izvođenju, u gore navedenom postupku, u anti-PD-1 antitelu ili njegovom fragmentu koji se vezuje za antigen za upotrebu iznad, ili u upotrebi anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen iznad, bolest je izabrana iz grupe koju čine sistemska skleroza (SSc), sistemski eritematozni lupus, polimiozitis, arteritis gigantskih ćelija, psorijaza, psorijatični artritis, ankilozantni spondilitis i inflamatorna bolest creva.

[0052] U jednom izvođenju, u prethodnom postupku, u anti-PD-1 antitelu ili njegovom fragmentu koji se vezuje za antigen za upotrebu iznad, ili u upotrebi anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen iznad, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen se primenjuje parenteralnim putem, intravenskim putem ili subkutanim putem.

[0053] U jednom izvođenju, pronalazak obezbeđuje izolovani polinukleotid koji kodira amino varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca kao što je gore opisano.

[0054] U jednom izvođenju, pronalazak obezbeđuje izolovani polinukleotid koji kodira teški lanac i/ili laki lanac kao što je gore opisano.

[0055] U jednom izvođenju, pronalazak obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid kao što je gore opisano.

1

[0056] U jednom izvođenju, pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži ekspresioni vektor kao što je gore opisano. U jednom izvođenju, ćelija domaćin je ćelija sisara.

[0057] U jednom izvođenju, pronalazak obezbeđuje postupak proizvodnje antitela koji se sastoji od koraka:

- kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži ekspresioni vektor koji sadrži izolovani polinukleotid koji kodira varijabilni region teškog lanca kao što je gore opisano i ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira varijabilni region lakog lanca kao što je gore opisano pod uslovima koji omogućavaju formiranje antitela, i

- obnavljanje navedenog antitela.

[0058] U jednom izvođenju, pronalazak obezbeđuje postupak proizvodnje antitela koji se sastoji od koraka:

- kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži ekspresioni vektor koji sadrži izolovani polinukleotid koji kodira teški lanac kao što je gore opisano i ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira laki lanac kao što je gore opisano pod uslovima koji omogućavaju formiranje antitela; i

- obnavljanje navedenog antitela.

[0059] U jednom izvođenju, gore navedeni postupak dalje obuhvata korak prečišćavanja antitela. U jednom izvođenju, gore navedeni postupak dalje obuhvata korak formulisanja antitela u farmaceutsku kompoziciju.

[0060] Pronalazak obezbeđuje multispecifično antitelo koje sadrži prvo mesto vezivanja antigena anti-PD-1 agoniste i drugo mesto vezivanja antigena.

[0061] U jednom izvođenju, drugo mesto vezivanja antigena je mesto vezivanja anti-CD48, mesto vezivanja anti-CD-2, mesto vezivanja anti-CD11a ili mesto vezivanja anti-CD3.

[0062] U jednom izvođenju, prvo mesto vezivanja antigena anti-PD-1 agoniste sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca kao što je gore opisano.

[0063] U jednom izvođenju, multi-specifično antitelo je bi-specifično antitelo.

1

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0064] Slika 1: Selektivnost anti-PD-1 antitela na humani PD-1 protein u testu zasnovanom na ćelijama procenjenom protočnom citometrijom. MFI je skraćenica za "srednji intenzitet fluorescencije".

[0065] Slika 2: Test vezivanja za takmičenje humanog PD-1-Fc vezivanja za humani PD-L1-Fc. Senzorgram koji prikazuje krivu vezivanja 25 nM PD-1 -Fc za PD-L1 -Fc amin spojen na površini GLM čipa (Slika 2A). Senzorgrami Antitela C, MK-3475 i PD1AB-6-4P (500 nM) prethodno pomešanih sa 25 nM PD-1 -Fc vezivanja za PD-L1 -Fc amin spojen sa površinom GLM čipa (Slika 2B).

[0066] Slika 3: Poboljšano vezivanje PD-L1 za PD-1 u prisustvu anti-PD-1 agonista antitela. PD-1 biotin: test interakcije PD-L1 (slika 3A). CHO PD-1 - PD-L1 Delphia-Eu TRF test (Slike ZV i 3D). SNO PD-1: Test vezivanja biotina PD-L1 (Slika 3C). Na Slici 3D, pojedinačne tačke podataka su prikazane samo za Antitelo C; pojedinačne tačke podataka za druga antitela nisu prikazane na Slici 3D zbog njihove neposredne blizine jedna drugoj. POC je skraćenica za "procenat kontrole".

[0067] Slika 4: Funkcionalna aktivnost T ćelija u prisustvu anti-PD-1 agoniste antitela ili F(ab')2 fragmenata izvedenih iz roditeljskog 723C2 agonista antitela (Slika 4A) ili roditeljskog agonističkog antitela 820C3 (Slika 4B). POC je skraćenica za "procenat kontrole".

[0068] Slika 5: Indukcija aktivacije PD-1 od strane MAb protiv CD48 nakon umrežavanja.

[0069] Slika 6: Obeležavanje humane pan-T ćelije sa CellTrace-Violet, aktivacija sa CD3 MAbs, i analiza ćelijske proliferacije razblaženjem CellTrace-a.

[0070] Slika 7: Bispecifični konstrukti (Slika 7A). Vezivanje svake ruke za PD-1 ili CD48 demonstrirano protočnom citometrijom na Jurkat ćelijama koje prekomerno eksprimiraju PD-1 (Slika 7B). Stimulacija CD4+ T (PD1<+>) ćelija humane memorije anti-CD3e vezanim za ploču u prisustvu PD-1/CD48 BsAbs vezanih za ploču ili kontrolnih antitela (Slika 7C). MFI je skraćenica za "srednji intenzitet fluorescencije".

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0071] Predmetni pronalazak se bavi potrebom za lečenjem imunoloških i inflamatornih poremećaja, posebno imunoloških i inflamatornih poremećaja kontrolisanih PD-1/PD-L1 i/ili PD-L2 sistema. Da bi se odgovorilo na ovu potrebu, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitela kako je opisano u zahtevima, koja ne blokiraju interakciju između PD-1 i PD-L1. U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela, koja pojačavaju

1

interakciju između PD-1 i PD-L1. U jednom izvođenju pronalaska, antitela predmetnog pronalaska aktiviraju PD-1 signalni put. U jednom izvođenju, antitela predmetnog pronalaska su anti-PD-1 agonista antitela. PD-1 agonizam uspostavlja imunološku ravnotežu inhibiranjem ekspanzije i efektorske funkcije autoreaktivnih T ćelija kod ljudskih bolesti gde je PD-1 eksprimiran, ali možda nije uključen, ili optimalno angažovan od strane njegovih liganda. U jednom izvođenju, antitela predmetnog pronalaska su korisna u lečenju imunih i inflamatornih poremećaja i odbacivanja transplantata. Na primer, antitela predmetnog pronalaska su korisna za lečenje i/ili prevenciju bolesti ili poremećaja koji se mogu ublažiti modulacijom interakcije između PD-1 i PD-L1, posebno aktiviranjem PD-1 puta. U jednom izvođenju, antitela predmetnog pronalaska su korisna u lečenju i/ili prevenciji sistemske skleroze (SSc), sistemskog eritematoznog lupusa, polimiozitisa, arteritisa džinovskih ćelija, psorijaze, psorijatičnog artritisa, ankilozirajućeg spondilitisa ili inflamatorne bolesti creva.

[0072] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo, posebno monoklonsko anti-PD-1 antitelo, na primer humanizovano monoklonsko anti-PD-1 antitelo, koje ima jedno ili više opisanih svojstava ovde ispod. U jednom izvođenju, anti-PD-1 antitelo predmetnog pronalaska se vezuje za prečišćeni rekombinantni humani PD-1 sa visokim afinitetom, na primer 20 nM ili manje, na primer 10 nM ili manje, na primer 5 nM manje. U jednom izvođenju, anti-PD-1 antitelo predmetnog pronalaska se vezuje za prečišćeni rekombinantni cinomologus PD-1 sa afinitetom od 50 nM ili manje. U jednom izvođenju, anti-PD-1 antitelo predmetnog pronalaska selektivno se vezuje za PD-1, posebno za humani PD-1. U jednom izvođenju, antitelo predmetnog pronalaska se ne vezuje za PD-1 miša, pacova ili zeca. U jednom izvođenju, anti-PD-1 antitelo predmetnog pronalaska ne blokira vezivanje PD-L1 za PD-1. U jednom izvođenju, anti-PD-1 antitelo predmetnog pronalaska poboljšava vezivanje PD-L1 za PD-1. U jednom izvođenju, anti-PD-1 antitelo predmetnog pronalaska slabi aktivnost T ćelija u nekoliko testova funkcionalnih ćelija kao što je prikazano u nastavku, na primer inhibicijom proizvodnje IFNȖ, inhibicijom proizvodnje IL-17A ili inhibicijom proizvodnje IL-21. U jednom izvođenju, anti-PD-1 antitelo predmetnog pronalaska inhibira akumulaciju ljudskih ćelija u modelu miša i smanjuje nivoe humanih inflamatornih citokina u modelu miša. U jednom izvođenju, anti-PD-1 antitelo predmetnog pronalaska ima povoljna farmakokinetička svojstva. U jednom izvođenju, anti-PD-1 antitelo predmetnog pronalaska ima povoljna biofizička svojstva, na primer prinos, kvalitet, stabilnost ili rastvorljivost. Ova svojstva su na primer prikazana u Primerima u nastavku.

[0073] Generalizovana struktura antitela ili imunoglobulina je dobro poznata stručnjacima u ovoj oblasti, ovi molekuli su heterotetramerni glikoproteini, tipično od oko 150.000 daltona, sastavljena od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanci. Svaki laki lanac je

2

kovalentno vezan za teški lanac jednom disulfidnom vezom kako bi se formirao heterodimer, a heterotrimerni molekul se formira preko kovalentne disulfidne veze između dva identična teška lanca heterodimera. Iako su laki i teški lanci međusobno povezani jednom disulfidnom vezom, broj disulfidnih veza između dva teška lanca varira u zavisnosti od izotipa imunoglobulina. Svaki teški i laki lanac takođe ima redovno raspoređene unutarlančane disulfidne mostove. Svaki teški lanac ima na amino-kraju varijabilni domen (VH= varijabilni teški lanac), a zatim slede tri ili četiri konstantna domena (CH1, CH2, CH3i CH4), kao i zglobni region između CH1i CH2. Svaki laki lanac ima dva domena, amino-krajnji varijabilni domen (VL= varijabilni laki lanac) i karboksi-krajnji konstantni domen (CL). VLdomen se nekovalentno povezuje sa VHdomenom, dok je CLdomen obično kovalentno vezan za CH1domen preko disulfidne veze. Veruje se da određeni ostaci aminokiselina formiraju interfejs između varijabilnih domena lakog i teškog lanca (Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol.186:651-663, Vargas-Madrazo E, Paz-Garcfa E. J Mol Recognit 2003; 16(3): 113-120. Promenljivi domeni se ovde takođe pominju kao varijabilni regioni, a konstantni domeni kao konstantni regioni.

[0074] Određeni domeni unutar varijabilnih domena se u velikoj meri razlikuju između različitih antitela, odn. "hipervarijabilni". Ovi hipervarijabilni domeni sadrže ostatke koji su direktno uključeni u vezivanje i specifičnost svakog određenog antitela za njegovu specifičnu antigenu determinantu. Hipervarijabilnost, i u varijabilnim domenima lakog i teškog lanca, koncentrisana je u tri segmenta poznata kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR) ili hipervarijabilne petlje (HVL). CDRs su definisani poređenjem sekvenci u Kabat et al., 1991, u: Sekvence proteina od imunološkog značaja, 5. izdanje. Služba javnog zdravlja, Nacionalni institut za zdravlje, Bethesda, Md., dok su HVL-ovi strukturno definisani prema trodimenzionalnoj strukturi varijabilnog domena, kao što su opisali Chothia i Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917. Tamo gde ove dve metode dovode do neznatno drugačijih identifikacija CDRs, poželjna je strukturna definicija. Kako je definisao Kabat, CDR-L1 je pozicioniran na oko ostataka 24-34, CDR-L2, na oko ostataka 50-56, i CDR-L3, na oko ostataka 89-97 u varijabilnom domenu lakog lanca; CDR-H1 je pozicioniran na oko ostataka 31-35, CDR-H2 na oko ostataka 50-65, a CDR-H3 na oko ostataka 95-102 u varijabilnom domenu teškog lanca. Alternativna definicija CDRs je prema numerisanju grupe za hemijsko računarstvo (CCG) (Almagro et al., Proteins 2011; 79:3050-3066 i Maier et al, Proteins 2014; 82:1599-1610). CDR1, CDR2, CDR3 teških i lakih lanaca stoga definišu jedinstvena i funkcionalna svojstva specifična za dato antitelo.

[0075] Tri CDRs unutar svakog od teškog i lakog lanca su razdvojeni okvirnim regionima (FR), koji sadrže sekvence koje imaju tendenciju da budu manje varijabilne. Od amino kraja do karboksi kraja varijabilnih domena teškog i lakog lanca, FR i CDR su raspoređeni po redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Konfiguracija FRs uglavnom ȕlistova dovodi CDRs unutar svakog od lanaca u neposrednu blizinu jedan drugom, kao i CDRs iz drugog lanca. Dobijena konformacija doprinosi mestu vezivanja antigena (videti Kabat ital., 1991, NIH Publ. br. 91-3242, Vol. I, strane 647-669), iako nisu svi CDR ostaci nužno direktno uključeni u vezivanje antigena.

[0076] FR ostaci i Ig konstantni domeni uopšteno nisu direktno uključeni u vezivanje antigena, ali doprinose vezivanju antigena i/ili posreduju efektorskoj funkciji antitela. Smatra se da neki FR ostaci imaju značajan uticaj na vezivanje antigena na najmanje tri načina: nekovalentnim vezivanjem direktno za epitop, interakcijom sa jednim ili više CDR ostataka i uticajem na interfejs između teškog i lakog lanca. Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antigena, ali posreduju u različitim efektorskim funkcijama Ig, kao što je učešće antitela u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC), citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC) i ćelijskoj fagocitozi zavisnoj od antitela (ADCP).

[0077] Laki lanci imunoglobulina kičmenjaka se pripisuju jednoj od dve jasno različite klase, kapa (ț) i lambda (Ȝ), na osnovu aminokiselineske sekvence konstantnog domena. Poređenja radi, teški lanci imunoglobulina sisara su dodeljeni jednoj od pet glavnih klasa, prema redosledu konstantnih domena: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. IgG i IgA se dalje dele na podklase (izotipove), na primer, IgGi, lgG2, lgG3, lgG4, IgAi i lgA2, respektivno. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina nazivaju se Į, ȕ, İ, Ȗ, i µ, respektivno. Strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije klasa nativnih imunoglobulina su dobro poznate.

[0078] Izrazi "antitelo", "anti-PD-1 antitelo", "humanizovano anti-PD-1 antitelo" i "varijanta humanizovanog anti-PD-1 antitela" se ovde koriste u najširem smislu i posebno obuhvataju monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela pune dužine), multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela), antitela sa manjim modifikacijama kao što su skraćenja N- ili C-terminala i fragmenti antitela kao što su varijabilni domeni i drugi delovi antitela koji pokazuju željenu biološku aktivnost , npr., PD-1 vezivanje.

[0079] Izraz "monoklonsko antitelo" (mAb) se odnosi na antitelo iz populacije suštinski homogenih antitela; to jest, pojedinačna antitela u toj populaciji su identična osim za prirodne mutacije ili moguće dobro poznate promene kao što je uklanjanje C-krajnjeg lizina iz teškog lanca antitela ili post-translacione modifikacije kao što su izomerizacija ili deamidacija aminokiselina, oksidacija metionina ili deamidacija asparagina ili glutamina koja može biti prisutna u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična, usmerena su protiv jedne antigenske determinante, „epitopa“. Prema tome, modifikator "monoklonalni" ukazuje na suštinski homogenu populaciju antitela usmerenih na identičan epitop i ne treba da se tumači kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim posebnim metodama. Trebalo bi razumeti da se monoklonska antitela mogu napraviti bilo kojom tehnikom ili metodologijom poznatoj u tehnici; uključujući, na primer, metod hibridoma (Kohler et al., 1975, Nature 256:495), ili metode rekombinantne DNK poznate u tehnici (videti, npr., US patent br.

4,816,567), ili metode izolacije monoklonalnih rekombinantnih proizvedenih korsiteći antitela faga iz biblioteke, koristeći tehnike opisane u Clackson et al., 1991, Nature 352: 624-628, i Marks et al., 1991, J. Mol. Biol.222: 581-597.

[0080] Himerična antitela se sastoje od varijabilnih regiona teškog i lakog lanca antitela jedne vrste (npr. sisar koji nije čovek kao što je miš) i konstantnih regiona teškog i lakog lanca antitela druge vrste (npr., čoveka) i može se dobiti povezivanjem DNK sekvenci koje kodiraju varijabilne regione antitela od prve vrste (npr. miša) sa DNK sekvencama za konstantne regione antitela iz druge (npr. ljudske) vrste i transformisanje domaćina ekspresionim vektorom koji sadrži povezane sekvence kako bi se omogućilo da se proizvede himerno antitelo. Alternativno, himerno antitelo takođe može biti ono u kome je jedan ili više regiona ili domena teškog i/ili lakog lanca identičan, homologan ili varijanta odgovarajuće sekvence u monoklonskom antitelu iz druge klase ili izotipa imunoglobulina, ili iz konsenzusa ili sekvence zametne linije. Himerična antitela mogu uključivati fragmente takvih antitela, pod uslovom da fragment antitela pokazuje željenu biološku aktivnost svog matičnog antitela, na primer vezivanje za isti epitop (videti, npr., US patent br. 4,816,567; i Morrison et al., 1984. , Natl.6851-6855).

[0081] Izrazi "fragment antitela", "fragment koji se vezuje za antigen", "fragment anti-PD-1 antitela", "humanizovani fragment anti-PD-1 antitela", "varijantni humanizovani fragment anti-PD-1 antitela" odnose se na deo anti-PD-1 antitela pune dužine, u kome se zadržava varijabilni region ili funkcionalna sposobnost, na primer, specifično vezivanje epitopa PD-1. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, scFv i scFv-Fc fragment, dijatelo, linearno antitelo, jednolančano antitelo, minitelo, dijatelo formirano od fragmenata antitela, i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.

[0082] Fragmenti antitela se mogu dobiti na primer tretiranjem antitela pune dužine tretiranih enzimima kao što su papain ili pepsin kako bi se stvorili korisni fragmenti antitela. Varenje papaina se koristi za proizvodnju dva identična fragmenta antitela koja se vezuju za antigen pod nazivom "Fab" fragmenti, svaki sa jednim mestom za vezivanje antigena, i rezidualnim

2

"Fc" fragmentom. Fab fragment takođe sadrži konstantni domen lakog lanca i CH1domen teškog lanca. Lečenje pepsinom daje F(ab')2 fragment koji ima dva mesta za vezivanje antigena i još uvek je sposoban da umreži antigen.

[0083] Drugi primer fragmenata antitela prema pronalasku su Fab' fragmenti. Fab' fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po prisustvu dodatnih ostataka uključujući jedan ili više cisteina iz zglobnog regiona antitela na C-kraju CH1domena. F(ab')2 fragmenti antitela su parovi Fab' fragmenata povezanih cisteinskim ostacima u zglobnom regionu. Poznata su i druga hemijska spajanja fragmenata antitela.

[0084] "Fv" fragment sadrži kompletno mesto za prepoznavanje i vezivanje antigena koje se sastoji od dimera jednog varijabilnog domena teškog i jednog lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj vezi. U ovoj konfiguraciji, tri CDRs svakog varijabilnog domena interaguju kako bi definisali mesto vezivanja antigena na površini VH-VLdimera. Zajedno, šest CDRs daju antitelu specifičnost vezivanja antigena.

[0085] Fragmenti antitela mogu takođe uključivati "jednolančane Fv" ili "scFv" fragmente. Fragment "jednolančanog Fv" ili "scFv" antitela je jednolančana varijanta Fv koja sadrži VHi VLdomene antitela gde su domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Jednolančani Fv je sposoban da prepozna i veže antigen. ScFv polipeptid može opciono da sadrži i polipeptidni linker pozicioniran između VHi VLdomena kako bi se olakšalo formiranje željene trodimenzionalne strukture za vezivanje antigena uz pomoć scFv (videti, npr., Pluckthun, 1994, u The Pharmacologi of monoclonal Antibodies , Vol 113, izd. Rosenburg i Moore, Springer-Verlag, Njujork, str.269-315).

[0086] Fragmenti antitela mogu takođe da formiraju tandem Fd segmente, koji sadrže par tandem Fd segmenata (VH-CH1-VH-CH1) kako bi formirali par regiona za vezivanje antigena. Ova "linearna antitela" mogu biti bispecifična ili monospecifična kao što je opisano u, na primer, Zapata etal.1995, Protein Eng.8(10): 1057-1062.

[0087] U jednom aspektu, anti-PD-1 antitelo pronalaska je humanizovano antitelo ili fragment antitela. Humanizovano antitelo ili fragment humanizovanog antitela je specifičan tip himernog antitela koji uključuje varijantu imunoglobulinske aminokiselinske sekvence, ili njen fragment, koji je sposoban da se veže za unapred određeni antigen i koji sadrži jedan ili više FR koji u suštini imaju aminokiselinu sekvenca humanog imunoglobulina i jedan ili više CDRs koji imaju suštinski aminokiselinsku sekvencu ne-humanog imunoglobulina. Ova nehumana aminokiselinska sekvenca koja se često naziva "uvozna" sekvenca se obično uzima iz domena "uvoznog" antitela, posebno varijabilnog domena. Uopšteno, humanizovano antitelo uključuje najmanje CDRs ili HVLs ne-humanog antitela, umetnute između FRs varijabilnog domena teškog ili lakog lanca čoveka. Postupci humanizacije antitela su na primer opisali Almagro et al., (2008) Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633, ili u WO 12092374 A2.

[0088] Predmetni pronalazak opisuje specifična humanizovana anti-PD-1 antitela koja sadrže CDRs izvedene iz mišjeg vodećeg 723C2 umetnut između FR varijabilnih domena teškog i lakog lanca sekvence humane zametne linije. Pored toga, cistein u CDR3 teškog lanca mišjeg vodećeg 723C2 zamenjen je tirozinom u humanizovanim anti-PD-1 antitelima izvedenim iz mišjeg vodećeg 723C2 (’’DC“ do ’’DY“).

[0089] U jednom aspektu, humanizovano anti-PD-1 antitelo sadrži u suštini sve od najmanje jednog, a tipično dva, varijabilna domena (kao što su sadržani, na primer, u Fab, Fab', F(ab')2, Fabc i Fv fragmenti) u kojima svi, ili uglavnom svi, CDRs odgovaraju onima nehumanog imunoglobulina, a posebno ovde, CDRs su mišje sekvence izvedenog 723C2 miša, a FRs su sekvence humanog imunoglobulina ili sekvence zametne linije. U drugom aspektu, humanizovano anti-PD-1 antitelo takođe uključuje najmanje deo Fc regiona imunoglobulina, obično onaj humanog imunoglobulina. Obično, antitelo će sadržati i laki lanac kao i najmanje varijabilni domen teškog lanca. Antitelo takođe može uključivati jedan ili više CH1, zglobnih, CH2, CH3i/ili CH4regiona teškog lanca, prema potrebi.

[0090] Humanizovano anti-PD-1 antitelo prema pronalasku može da se izabere iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo koji izotip, uključujući IgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA1i lgA2. Na primer, konstantni domen može biti konstantni domen za fiksiranje komplementa gde je poželjno da humanizovano antitelo ispoljava citotoksičnu aktivnost, a izotip je tipično IgG1. Tamo gde takva citotoksična aktivnost nije poželjna, konstantni domen može biti drugog izotipa, npr. lgG2. Alternativno humanizovano anti-PD-1 antitelo može da sadrži sekvence iz više od jedne imunoglobulinske klase ili izotipa, a izbor određenih konstantnih domena za optimizaciju željenih efektorskih funkcija je u okviru stručnjaka u ovoj oblasti.

[0091] U jednom aspektu, konstantni domen antitela predmetnog pronalaska je lgG4Pro, koji ima jednu zamensku mutaciju (Ser228Pro) koja sprečava razmenu Fab-ruka. Ova Serto Pro mutacija je u zglobnom regionu kičme lgG4 i obično je poznata kao Ser228Pro, iako njena pozicija u teškom lancu može varirati za nekoliko aminokiselina, na primer u zavisnosti od dužine varijabilnog regiona i/ili razlike između dužina zgloba između lgG1 i lgG4. Ser u Pro

2

mutacija u zglobnom regionu (Cys-Pro-Ser-Cys-Pro) se ovde pominje kao "Ser228Pro", nezavisno od njenog položaja u teškom lancu. U drugom aspektu, konstantni domen antitela predmetnog pronalaska je lgG1 KO, koji ima dve mutacije u zglobnom regionu, Leu234Ala i Leu235Ala, za smanjenje efektorske funkcije (ADCC).

[0092] FRs i CDRs, ili HVLs, humanizovanog anti-PD-1 antitela ne moraju tačno da odgovaraju roditeljskim sekvencama. Na primer, jedan ili više ostataka u uvoznom CDR, ili HVL, ili konsenzus ili germline FR sekvenci mogu biti izmenjeni (npr., mutagenizovani) supstitucijom, umetanjem ili brisanjem tako da rezultujući aminokiselinski ostatak nije više identičan originalnom ostatku na odgovarajućoj poziciji u bilo kojoj roditeljskoj sekvenci, ali antitelo ipak zadržava funkciju vezivanja za PD-1. Takve izmene obično neće biti opsežne i biće konzervativne izmene. Obično će najmanje 75% ostataka humanizovanih antitela odgovarati onima iz roditeljskog konsenzusa ili FR sekvenci zametne linije i uvoznih CDR sekvenci, češće najmanje 90%, a najčešće veće od 95%, ili veće od 98% ili veće od 99%.

[0093] Ostaci imunoglobulina koji utiču na interfejs između varijabilnih regiona teškog i lakog lanca („interfejs VL-VH“) su oni koji utiču na blizinu ili orijentaciju dva lanca jedan u odnosu na drugi. Određeni ostaci koji mogu biti uključeni u međulančane interakcije uključuju VLostatke 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96 i 98 i VHostatke 35, 37, 39, 45, 47, 91, 593 , 100, i 103 (koristeći sistem numerisanja koji je naveden u Kabat et al., Sekuences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)). U.S. Pat.

6,407,213 takođe razmatra da ostaci kao što su VLostaci 43 i 85, i VHostaci 43 i 60 takođe mogu biti uključeni u ovu interakciju. Iako su ovi ostaci indikovani samo za humani IgG, oni su primenljivi na sve vrste. Važni ostaci antitela za koje se razumno očekuje da budu uključeni u međulančane interakcije se biraju za supstituciju u konsenzus sekvenci.

[0094] Izrazi "konsenzus sekvenca" i "konsenzus antitelo" odnose se na aminokiselinsku sekvencu koja sadrži aminokiselinski ostatak koji se najčešće pojavljuje na svakoj lokaciji u svim imunoglobulinima bilo koje određene klase, izotipa ili strukture podjedinice, npr. varijabilni domen imunoglobulina. Konsenzus sekvenca može biti zasnovana na imunoglobulinima određene vrste ili mnogih vrsta. Razume se da „konsenzus“ sekvenca, struktura ili antitelo obuhvata konsenzus humanu sekvencu kako je opisano u određenim izvođenjima i da se odnosi na aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ostatke aminokiselina koje se najčešće javljaju na svakoj lokaciji u svim ljudskim imunoglobulinima bilo koje klase, izotipa ili strukturne podjedinice. Dakle, konsenzus sekvenca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja na svakoj poziciji ima aminokiselinu koja je prisutna u jednom ili više poznatih imunoglobulina, ali koja možda neće tačno duplirati celu aminokiselinsku sekvencu bilo kog

2

pojedinačnog imunoglobulina. Konsenzusna sekvenca varijabilnog regiona nije dobijena ni od jednog prirodno proizvedenog antitela ili imunoglobulina. Kabat etal., 1991, Sekvence proteina od imunološkog značaja, 5. izdanje. Služba javnog zdravlja, Nacionalni instituti za zdravlje, Bethesda, Md., i njihove varijante. FR konsenzus sekvenci teškog i lakog lanca, i njihove varijante, obezbeđuju korisne sekvence za pripremu humanizovanih anti-PD-1 antitela. Videti, na primer, U.S. Pat. br.6,037,454 i 6,054,297.

[0095] Sekvence humane zametne linije se prirodno nalaze u ljudskoj populaciji. Kombinacija ovih gena zametne linije stvara raznolikost antitela. Sekvence antitela zametne linije za laki lanac antitela potiču od konzerviranih humanih kapa ili lambda v-gena i j-gena. Slično, sekvence teškog lanca potiču od v-, d- i j-gena zametne linije (LeFranc, M-P, i LeFranc, G, "The Immunoglobulin Facts Book" Academic Press, 2001).

[0096] "Izolovano" antitelo je ono koje je identifikovano i izdvojeno i/ili izvučeno iz komponente svog prirodnog okruženja. Zagađujuće komponente prirodnog okruženja antitela su oni materijali koji mogu da ometaju dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu antitela, a mogu biti enzimi, hormoni ili druge proteinske ili neproteinske rastvorene supstance. U jednom aspektu, antitelo će biti prečišćeno do najmanje veće od 95% masene izolacije antitela, na primer prečišćeno do najmanje veće od 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%.

[0097] Izolovano antitelo uključuje antitelo in situ unutar rekombinantnih ćelija u kojima se proizvodi, pošto najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Obično, međutim, izolovano antitelo će biti pripremljeno najmanje jednim korakom prečišćavanja u kome se uklanja rekombinantni ćelijski materijal.

[0098] Izraz "performanse antitela" kako se koristi prema pronalasku odnosi se na faktore/osobine koje doprinose prepoznavanju antitela antigena ili efikasnosti antitela in vivo. Promene u aminokiselinskoj sekvenci antitela mogu uticati na svojstva antitela kao što je savijanje i mogu uticati na fizičke faktore kao što su početna brzina vezivanja antitela za antigen (ka), konstanta disocijacije antitela od antigena (kd), konstanta afiniteta antitelo za antigen (Kd), konformacija antitela, stabilnost proteina i poluživot antitela.

[0099] Izraz "agonističko antitelo" ili "agonističko antitelo" kako se koristi prema pronalasku odnosi se na antitelo, koje nakon vezivanja za PD-1, indukuje najmanje jednu biološku aktivnost koju indukuje PD-1 ligand PD-L1. U jednom aspektu, indukcija je statistički značajna u poređenju sa indukcijom u odsustvu agonističkog antitela. U jednom aspektu, antitelo je agonističko antitelo kada je najmanje jedna biološka aktivnost indukovana sa

2

najmanje oko 20%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% više nego u odsustvu agonističkog antitela, na primer kada se meri kao u jednom od Primeri opisani u nastavku. U nekim izvođenjima, "agonističko antitelo" pojačava interakciju između PD-1 i PD-L1. Primeri testova za detekciju osobina PD-1 agonista su ovde opisani ili su poznati u tehnici.

[00100] "Multispecifičan" se odnosi na protein, kao što je antitelo, koji specifično vezuje dva ili više različitih antigena ili dva ili više različitih epitopa unutar istog antigena.

[00101] "Bispecifičan" se odnosi na protein, kao što je antitelo, koji specifično vezuje dva različita antigena ili dva različita epitopa unutar istog antigena.

[00102] U nekim izvođenjimaa, antitelo koje specifično vezuje PD-1 ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema pronalasku je bispecifično antitelo. U nekim izvođenjima, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema pronalasku je multispecifično antitelo. Monospecifična antitela koja specifično vezuju PD-1 ovde navedena mogu biti konstruisana u bispecifična antitela.

[00103] Bispecifična antitela pune dužine mogu da se generišu na primer korišćenjem razmene Fab krajeva (npr. razmena polumolekula, razmena jednog para teški lanac-laki lanac) između dva monospecifična bivalentna antitela uvođenjem supstitucija na interfejsu teškog lanca CH3 u svakom polu molekulu da favorizuje formiranje heterodimera od dva polumolekula antitela koji imaju izrazitu specifičnost bilo in vitro u okruženju bez ćelija ili korišćenjem koekspresije. Fab reakcija razmene krajeva je rezultat disulfidne veze.

[00104] Bispecifična antitela se takođe mogu generisati korišćenjem dizajna kao što su Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech), Knob-in-Hole (Genentech), CrossMAbs (Roche) i elektrostatički izazvanu interakciju CH3 (Chugai, Amgen, NovoNordisk, Oncomed), LUZ-Y (Genentech), telo domena projektovanog za razmenu Strand tela (SEEDtelo) (EMD Serono), Biclonic (Merus) i kao DuoBody® proizvodi (Genmab A/S).

[00105] Na primer, bispecifično PD-1/CD2, bispecifično PD-1/CD48, bispecifično PD-1/CD11a ili PD-1/CD3 antitelo može da se generiše korišćenjem VH/VL domena PD-1 antitela koji je ovde opisan ili bilo koji VH/VL region objavljenih anti-PD-1 agonističkih antitela i bilo koji VH/VL region objavljenih anti-CD2, anti-CD48, anti-CD11a ili anti-CD3 antitela, respektivno.

2

[00106] Bispecifično antitelo može da sadrži prvi domen koji vezuje PD-1 i drugi domen koji vezuje CD2, CD48, CD11a ili CD3.

[00107] Kao što je ovde korišćeno, izrazi "identičan" ili "procenat identiteta", u kontekstu dve ili više nukleinskih kiselina ili polipeptidnih sekvenci, odnose se na dve ili više sekvenci ili podsekvencija koje su iste ili imaju određeni procenat nukleotida ili aminokiselinske ostatke koji su isti, kada se uporede i poravnaju za maksimalnu korespondenciju. Da bi se odredio procenat identiteta, sekvence su poređane radi optimalnog poređenja (npr. praznine se mogu uvesti u sekvencu prve aminokiselinske sekvence ili sekvence nukleinske kiseline za optimalno poravnanje sa drugom aminokiselinskom sekvencom ili sekvencom nukleinske kiseline). Zatim se porede aminokiselinski ostaci ili nukleotidi na odgovarajućim pozicijama amino kiselina ili nukleotidnih pozicija. Kada je položaj u prvoj sekvenci zauzet istim aminokiselinskim ostatkom ili nukleotidom kao odgovarajući položaj u drugoj sekvenci, onda su molekuli identični na toj poziciji. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje dele sekvence (tj. % identiteta = # identičnih pozicija/ukupan broj pozicija (npr. preklapajućih pozicija) x 100). U nekim izvođenjima, dve sekvence koje se porede su iste dužine nakon što su praznine uvedene unutar sekvenci, prema potrebi (npr., isključujući dodatnu sekvencu koja se proteže izvan sekvenci koje se porede). Na primer, kada se porede sekvence varijabilnog regiona, sekvence lidera i/ili konstantnog domena se ne uzimaju u obzir. Za poređenje sekvenci između dve sekvence, "odgovarajući" CDR se odnosi na CDR na istoj lokaciji u obe sekvence (npr. CDR-H1 svake sekvence).

[00108] Određivanje procenta identičnosti ili procenta sličnosti između dve sekvence može se postići korišćenjem matematičkog algoritma. Poželjan, neograničavajući primer matematičkog algoritma koji se koristi za poređenje dve sekvence je algoritam Karlin i Altschul, 1990, Proc. Natl. Akad. Sci. USA 87:2264-2268, modifikovano kao u Karlin i Altschul, 1993, Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 90:5873-5877. Takav algoritam je ugrađen u NBLAST i XBLAST programe Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410. BLAST pretrage nukleotida se mogu izvršiti pomoću programa NBLAST, rezultat = 100, dužina reči = 12, kako bi se dobile nukleotidne sekvence homologne nukleinskoj kiselini koja kodira protein od interesa. BLAST pretrage proteina se mogu izvršiti pomoću programa XBLAST, rezultat = 50, dužina reči = 3, kako bi se dobile aminokiselinske sekvence homologne proteinu od interesa. Kako bi se dobilo poravnanja na osnovu praznina u svrhu poređenja, Gapped BLAST se može koristiti kao što je opisano u Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativno, PSI-Blast se može koristiti za obavljanje iterirane pretrage koja detektuje udaljene odnose između molekula (Id.). Kada se koriste programi BLAST, Gapped BLAST i PSI-Blast, mogu se koristiti podrazumevani parametri odgovarajućih

2

programa (npr. XBLAST i NBLAST). Drugi poželjni, neograničavajući primer matematičkog algoritma koji se koristi za poređenje sekvenci je algoritam Miersa i Millera, CABIOS (1989). Takav algoritam je ugrađen u program ALIGN (verzija 2.0) koji je deo softverskog paketa za poravnanje sekvenci GCG. Kada se koristi program ALIGN za upoređivanje sekvenci aminokiselina, može se koristiti tabela ostatka težine PAM120, kazna za dužinu razmaka od 12 i kazna za prazninu od 4. Dodatni algoritmi za analizu sekvenci su poznati u tehnici i uključuju ADVANCE i ADAM kao što je opisano u Torellis i Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5; i FASTA opisani u Pearson i Lipman, 1988, Proc. Natl. Akad. Sci. USA 85:2444-8. U okviru FASTA, ktup je kontrolna opcija koja postavlja osetljivost i brzinu pretrage. Ako je ktup = 2, slični regioni u dve sekvence koje se porede nalaze se posmatranjem parova poređanih ostataka; ako je ktup = 1, ispituju se aminokiseline sa jednim poravnanjem, ktup se može podesiti na 2 ili 1 za sekvence proteina, ili od 1 do 6 za sekvence DNK. Podrazumevano ako ktup nije naveden onda je 2 za proteine i 6 za DNK. Alternativno, poravnanje proteinske sekvence može da se izvede korišćenjem CLUSTAL W algoritma, kao što su opisali Higgins et al., 1996, Methods Enzimol.266:383-402.

[00109] Sekvenca nukleinske kiseline je "operativno povezana" kada je stavljena u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, presekvencija nukleinske kiseline ili sekretorni lider je operativno vezan za nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid ako je eksprimiran kao preprotein koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promoter ili pojačivač je operativno vezan za kodirajuću sekvencu ako utiče na transkripciju sekvence; ili je mesto vezivanja ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je postavljeno tako da olakša translaciju. Uopšteno, "operativno povezana" znači da su sekvence DNK koje se povezuju susedne i, u slučaju sekretornog vođe, susedne i u okviru čitanja. Međutim, pojačivači su opciono susedni. Povezivanje se može postići ligacijom na pogodnim restrikcijskim mestima. Ako takva mesta ne postoje, mogu se koristiti sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri.

[00110] Kao što je ovde korišćeno, izrazi "ćelija", "ćelijska linija" i "ćelijska kultura" se koriste naizmenično i sve takve oznake uključuju njihovo potomstvo. Dakle, "transformanti" i "transformisane ćelije" obuhvataju primarnu ćeliju subjekta i kulture izvedene iz njih bez obzira na broj transfera, koji su na primer mogli biti transfektovani sa jednim ili više ekspresionih vektora koji kodiraju jednu ili više sekvenci amino kiselina antitela ili njegov fragment koji vezuje antigen predmetnog pronalaska.

[00111] Izraz "sisar" za svrhe lečenja prema pronalasku odnosi se na bilo koju životinju klasifikovanu kao sisara, uključujući ljude, pripitomljene i domaće životinje, i zoološki vrt, sportske ili kućne ljubimce, kao što su psi, konji, mačke, krave i sl. Poželjno je da je sisar čovek.

[00112] "Poremećaj", kao što je ovde korišćen, je svako stanje koje bi imalo koristi od lečenja ovde opisanim anti-PD-1 antitelom, posebno humanizovanim anti-PD-1 antitelom opisanim ovde. Ovo uključuje hronične i akutne poremećaje ili bolesti uključujući ona patološka stanja koja predisponiraju sisara za dotični poremećaj.

[00113] Kao što je ovde korišćeno, termin "poremećaj PD-1 puta" ili "bolest PD-1 puta " odnosi se na stanje koje se može ublažiti modulacijom interakcije između PD-1 i PD-L1, posebno aktiviranjem PD-1 put. „Poremećaj PD-1 puta“ ili „bolest PD-1 puta“ uključuje bolesti povezane sa T-ćelijama gde je izražen PD-1, „poremećaj PD-1 puta“ ili „bolest PD-1 puta“ takođe uključuje stanja koja karakterišu aktivirane auto-reaktivne T ćelije koje eksprimiraju PD-1 i pokretači su hronične upale i autoimune bolesti i kod kojih dolazi do slabljenja PD-1 koji izražava aktivnost T ćelija i/ili smanjenja modulacije poželjan je imuni odgovor. Primeri poremećaja na putu PD-1 uključuju bolesti ili poremećaje kao što su sistemska skleroza (SSc), sistemski eritematozni lupus, polimiozitis, arteritis džinovskih ćelija, psorijaza, psorijatični artritis, ankilozantni spondilitis i inflamatorna bolest creva.

[00114] Izraz "specifično se vezuje", ili slično, znači da anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen formira kompleks sa antigenom koji je relativno stabilan u fiziološkim uslovima. Metode za određivanje da li se dva molekula specifično vezuju su ovde opisane ili su poznate u tehnici i uključuju, na primer, ravnotežnu dijalizu, površinsku plazmonsku rezonancu i slično. U jednom izvođenju, specifično vezivanje je okarakterisano sa KDod oko 1 x 10<-7>M (100 nM) ili manje u skladu sa metodom afinitetnog vezivanja opisanom u odeljku Primeri ovde. U drugom izvođenju, specifično vezivanje je okarakterisano sa KD od oko 5 x 10<-8>M (50 nM) ili manje u skladu sa metodom afinitetnog vezivanja opisanom u odeljku Primeri ovde. U drugom izvođenju, specifično vezivanje je okarakterisano sa KDod oko 1 x 10<-8>M (10 nM) ili manje u skladu sa metodom afinitetnog vezivanja opisanom u odeljku Primeri ovde. U drugom izvođenju, specifično vezivanje je okarakterisano sa KDod oko 5 x 10<-9>M (5 nM) ili manje u skladu sa metodom afinitetnog vezivanja opisanom u odeljku Primeri ovde. Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani PD-1 može, međutim, da ima unakrsnu reaktivnost na druge antigene, kao što su PD-1 molekuli drugih vrsta. Štaviše, izolovano antitelo može biti u suštini bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.

1

[00115] Izraz "subkutana primena" se odnosi na uvođenje leka, na primer anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen prema pronalasku, pod kožu životinje ili čoveka, poželjno unutar džepa između kožu i osnovnog tkiva, relativno sporom, kontinuiranom isporukom iz posude za lek. Stiskanje ili povlačenje kože prema gore i dalje od osnovnog tkiva može stvoriti džep.

[00116] Izraz "subkutana infuzija" odnosi se na uvođenje leka, na primer anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen prema pronalasku, pod kožu životinje ili čoveka, poželjno u džep između kožu i osnovnog tkiva, relativno sporom, kontinuiranom isporukom iz posude za lek tokom vremenskog perioda uključujući, ali ne ograničavajući se na, 30 minuta ili manje, ili 90 minuta ili manje. Opciono, infuzija se može napraviti subkutanom implantacijom pumpe za isporuku leka implantirane pod kožu životinje ili čoveka, pri čemu pumpa isporučuje unapred određenu količinu leka u unapred određenom vremenskom periodu, kao što je 30 minuta, 90 minuta, ili vremenski period koji obuhvata dužinu režima lečenja.

[00117] Izraz "subkutani bolus" se odnosi na primenu leka ispod kože životinje ili čoveka, gde je bolusna primena leka kraća od približno 15 minuta; u drugom izvođenju, manje od 5 minuta, a u još jednom izvođenju, manje od 60 sekundi. U još jednom izvođenju, primena je unutar džepa između kože i ispod tkiva, gde džep može da se stvori štipanjem ili povlačenjem kože nagore i dalje od tkiva ispod. Na primer, "subkutani bolus" se odnosi na davanje anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen prema pronalasku ljudskom pacijentu za manje od približno 15 minuta; u drugom izvođenju, manje od 5 minuta, a u još jednom izvođenju, manje od 60 sekundi

[00118] Izraz "terapeutski efikasna količina" se koristi kako bi se odnosilo na količinu anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen koji ublažava ili olakšava jedan ili više simptoma poremećaja koji se leči. Pri tome, ta količina ima povoljan ishod za pacijenta. Efikasnost se može meriti na konvencionalne načine, u zavisnosti od stanja koje se leči.

[00119] Izrazi "lečenje" i "terapija" i slično, kao što je ovde korišćeno, podrazumevaju terapeutske, kao i profilaktičke ili supresivne mere za bolest ili poremećaj koji dovode do bilo kakvog klinički poželjnog ili blagotvornog efekta, uključujući, ali ne ograničeno na ublažavanje ili ublažavanje jednog ili više simptoma, regresiju, usporavanje ili prestanak progresije bolesti ili poremećaja. Tako, na primer, izraz lečenje uključuje davanje anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen pre ili posle pojave simptoma bolesti

2

ili poremećaja, čime se sprečava ili uklanja jedan ili više znakova bolesti ili poremećaj. Kao drugi primer, izraz uključuje primenu anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen nakon kliničke manifestacije bolesti radi suzbijanja simptoma bolesti. Dalje, primena anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen nakon pojave i nakon razvoja kliničkih simptoma gde primena utiče na kliničke parametre bolesti ili poremećaja, kao što je stepen povrede tkiva ili količina ili obim metastaza, bez obzira da li lečenje dovodi do poboljšanja bolesti ili ne, obuhvata "lečenje" ili "terapiju" kao što se ovde koristi. Štaviše, sve dok kompozicije pronalaska, same ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensom, ublažavaju ili ublažavaju najmanje jedan simptom poremećaja koji se leči u poređenju sa tim simptomom u odsustvu upotrebe kompozicije anti-PD-1 antitela ili njegov antigen-vezujući fragment, rezultat treba smatrati efikasnim lečenjem osnovnog poremećaja bez obzira da li su svi simptomi poremećaja ublaženi ili ne.

[00120] Izraz "umetak u pakovanju" se koristi kako bi se odnosio na uputstva koja su uobičajeno uključena u komercijalna pakovanja terapeutskih proizvoda, koja sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, primeni, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapeutskih proizvoda.

[00121] Antitela

[00122] Ovde su opisana i otkrivena anti-PD-1 antitela, posebno humanizovana anti-PD-1 antitela, kao i kompozicije i proizvodi koji sadrže anti-PD-1 antitela prema predmetnom pronalasku. Takođe su opisani fragmenti anti-PD-1 antitela koji se vezuju za antigen. Anti-PD-1 antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen mogu se koristiti u lečenju raznih bolesti ili poremećaja, posebno bolesti ili poremećaja koje karakterišu aktivirane autoreaktivne T ćelije koje eksprimiraju PD-1 i pokretači su hronične upale i autoimune bolesti. Svako anti-PD-1 antitelo i njegov fragment koji se vezuje za antigen uključuje najmanje deo koji specifično prepoznaje PD-1 epitop. U jednom aspektu, anti-PD-1 antitela predmetnog pronalaska i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen su agonisti anti-PD-1 antitela i njegovog fragment koji se vezuje za antigen.

[00123] Stvaranje anti-PD-1 antitela prema pronalasku i njihova karakterizacija je opisana u Primerima. U početnoj karakterizaciji, anti-PD-1 himerno vođenog 723C2 je odabrano na osnovu njegovog superiornog učinka antitela, kao što je na primer opisano u Primerima ispod. Biblioteka varijanti je generisana postavljanjem CDRs himernog vođenja u FRs humanog konsenzus teškog i lakog lanca varijabilnih domena i dalje inženjeringom FRs sa različitim izmenama. Pored toga, cistein u CDR3 teškog lanca mišjeg vođenog 723C2 zamenjen je tirozinom u humanizovanim anti-PD-1 antitelima izvedenim iz mišjeg vođenog 723C2 („DC“ do „DY“). Promena sa "DC" na "DY" nije imala uticaja na farmakološka svojstva antitela. Proces za proizvodnju humanizovanih antitela je opisan u Primerima.

[00124] Aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona reprezentativnih mišjih vođenja su prikazane u Tabelama 1 i 2. CDR regioni ovih mišjih vođenig i CDR regioni projektovanih varijanti vođenih 723C2 prikazani su u Tabelama 3 i 4.

Tabela 1: Anti-PD-1 Mišje Vođene – VK Sekvence

4

Tabela 2: Anti-PD-1 Mišje Vodeće – VH Sekvence

[00125] Mišji lakogi lanac i teški lanac CDRs različitih mišjih antitela su prikazani u Tabeli 3 i Tabeli 4, respektivno. Tabele 3 i 4 takođe pokazuju tri laka lanca CDRs i tri teška lanca CDRs koji su izvedeni iz mišjeg antitela 723C2 kroz proces humanizacije.

Tabela 3: Sekvence LAKOG LANCA CDR

Tabela 4: Sekvence TEŠKOG LANCA CDR

[00126] CDRs navedeni gore u Tabelama 3 i 4 su definisani korišćenjem numeracije Chemical Computing Group (CCG) su podvučeni (Almagro et al., Proteins 2011; 79:3050-3066 i Maieretal, Proteins 2014; 82:1599 ).

[00127] Reprezentativni broj varijabilnih regiona humanizovanog lakog lanca i teškog lanca izvedenih iz mišjeg antitela 723C2 je dat i prikazan u Tabelama 5 i 6.

Tabela 5: Humanizovane 723C2-VK Sekvence

Tabela 6: Humanizovana 723C2-VH Sekvenca

[00128] Odabrana kombinacija varijabilnih regiona humanizovanog lakog lanca i teškog lanca izvedeni iz mišjeg antitela 723C2 rezultirali su Antitelima A, B, C, D i E:

Antitelo A: 723C2-lgG4Pro-463-60 sa lgK-463-60 (varijabilni region teškog lanca 723C2VH-463-60 i varijabilni region lakog lanca 723C2VK-463-60);

Antitelo B: 723C2-lgG4Pro-461-41 sa lgK-462-07 (varijabilni region teškog lanca 723C2VH-461-41 i varijabilni region lakog lanca 723C2VK-462-07);

Antitelo C: 723C2-lgG4Pro-461-47 sa lgK-462-07 (varijabilni region teškog lanca 723C2VH-461-47 i varijabilni region lakog lanca 723C2VK-462-07);

Antitelo D: 723C2-lgG4Pro-461-44 sa lgK-462-08 (varijabilni region teškog lanca 723C2VH-461-44 i varijabilni region lakog lanca 723C2VK-462-08).

Antitelo E: 723C2-lgG4Pro-461-40 sa lgK-462-08 (varijabilni region teškog lanca 723C2VH-461-40 i varijabilni region lakog lanca 723C2VK-462-08).

[00129] Antitela A, B, C, D i E imaju sekvence teškog i lakog lanca prikazane u Tabeli 7.

Tabela 7: DNK Teškog i Lakog Lanca i Aminokiselinske Sekvence za Antitela A, B, C, D i E

4

[00130] Laki lanci i varijabilni regioni teškog lanca Antitela A, B, C, D i E su podvučeni u Tabeli 7. Zglobni region u konstantnim regionima teškog lanca je prikazan podebljanim slovima sa mutacijom Ser228Pro uokviren.

4

[00131] Mišji vođeni 723C2 je takođe konvertovan u humane IgGIVT, IgGIKO i lgG4Pro formate. lgG4Pro ima jednu mutaciju u zglobnom regionu, Ser228Pro, koja sprečava razmenu Fab-ruka. IgGIKO ima dve mutacije u zglobnom regionu, Leu234Ala i Leu235Ala, za smanjenje efektorske funkcije (ADCC).

[00132] Himerni 723C2 u humanim IgGIVT, IgGIKO i lgG4Pro formatima prikazani su u Tabeli 8.

Tabela 8. DNK Teškog i Lakog Lanca i Aminokiselinska Sekvenca za himerni 723C2 u humanim IgGIWT, IgGIKO i lgG4Pro

4

1

Aminokiseline koje odgovaraju promeni od DC do DY u H-CDR3 su podvučene u aminokiselinskim sekvencama u Tabeli 8.

2

[00133] Humanizacija i Varijante aminokiselinskih sekvenci

[00134] Druge varijante anti-PD-1 antitela i fragmenata antitela se mogu konstruisati na osnovu skupa CDRs prikazanih u Tabelama 3 i 4. Treba razumeti da u varijantama anti-PD-1 antitela i fragmenata antitela aminokiselinska sekvenca CDRs ostaje nepromenjena, ali okolni regioni, npr., FR regioni mogu biti projektovani. Varijante aminokiselinske sekvence anti-PD-1 antitela mogu se pripremiti uvođenjem odgovarajućih nukleotidnih promena u DNK anti-PD-1 antitela, ili sintezom peptida. Takve varijante uključuju, na primer, brisanje iz, i/ili umaetanje u i/ili supstitucije, ostataka unutar aminokiselinskih sekvenci anti-PD-1 antitela iz primera ovde. Bilo koja kombinacija brisanja, umetanja i supstitucija se pravi kako bi se došlo do konačnog konstrukta, pod uslovom da konačni konstrukt poseduje željene karakteristike. Promene aminokiselina takođe mogu da promene posttranslacione procese humanizovanog ili varijantnog anti-PD-1 antitela, kao što je promena broja ili položaja mesta glikozilacije.

[00135] Ovaj pronalazak uključuje anti-PD-1-antitela ili njihove fragmente antitela koji imaju varijabilni teški lanac i varijabilni laki lanac, pri čemu su aminokiselinska sekvenca varijabilnog teškog lanca i aminokiselinska sekvenca varijabilnog lakog lanca najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 92.5%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identične aminokiselinske sekvence otkrivene u Tabelama 1, 2, 5 i 6.

[00136] Pronalazak uključuje anti-PD-1-antitela ili njihove fragmente antitela koji imaju varijabilni teški lanac i varijabilni laki lanac, pri čemu su aminokiselinska sekvenca varijabilnog teškog lanca i aminokiselinska sekvenca varijabilnog lakog lanca najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 92.5%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identične aminokiselinske sekvence SEQ ID NO.131, 133, 135, 137 ili 139 i SEQ ID NOs.125, 127 ili 129, respektivno.

[00137] Predmetni pronalazak uključuje anti-PD-1 antitela koja imaju teški lanac i laki lanac, pri čemu aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca čine najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identične aminokiselinske sekvence koje su otkrivene u Tabelama 7 i 8.

[00138] Drugi tip arijante aminokiseline antitela uključuje promenu originalnog šablona glikozilacije antitela. Izraz "promena" u ovom kontekstu znači brisanje jednog ili više ugljenih hidrata koji se nalaze u antitelu, i/ili dodavanje jednog ili više mesta glikozilacije koja ranije nisu bila prisutna u antitelu. Na primer, antitelo može da sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 297 teškog lanca humanog lgG1 kako bi se poništila glikozilacija posredovana kompleksom enzima oligosahariltransferaze zamenom asparagina 297 (npr. N297A, N297G).

[00139] U nekim aspektima, predmetni pronalazak uključuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju varijante aminokiselinske sekvence ovde opisanih anti-PD-1 antitela. Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju varijante aminokiselinske sekvence anti-PD-1 antitela se pripremaju različitim metodama poznatim u tehnici. Ove metode uključuju, ali nisu ograničene na, izolaciju iz prirodnog izvora (u slučaju prirodnih varijanti aminokiselinskih sekvenci) ili pripremu mutagenezom posredovanom oligonukleotidom (ili usmerenom na mesto), PCR mutagenezom i mutagenezom kasete ranije pripremlje varijantne ili nevarijantne verzije anti-PD-1 antitela. Na primer, molekuli nukleinske kiseline prema pronalasku takođe obuhvataju molekule nukleinske kiseline koji se hibridizuju pod strogim uslovima sa molekulima nukleinske kiseline kao što je ovde otkriveno, pri čemu izraz "strogi uslovi" može uključivati, npr., hibridizaciju u puferu koji sadrži 50% forme SSC i 1% SDS na 42°C, ili hibridizacija u puferu koji sadrži 5 x SSC i 1% SDS na 65°C, oba sa ispiranjem od 0.2 x SSC i 0.1% SDS na 65°C. Primerni strogi uslovi hibridizacije takođe mogu uključiti hibridizaciju u puferu od 40% formamida, 1 M NaCl i 1% SDS na 37°C, i ispiranje u 1 x SSC na 45°C.

[00140] U određenim izvođenjima, anti-PD-1 antitelo je fragment antitela. Postoje tehnike koje su razvijene za proizvodnju fragmenata antitela. Fragmenti se mogu dobiti proteolitičkom varenjem intaktnih antitela (videti, na primer, Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical and Biophisical Methods 24:107-117; i Brennan et al., 1985, Science 229:81). Alternativno, fragmenti se mogu proizvesti direktno u rekombinantnim ćelijama domaćinima. Na primer, Fab'-SH fragmenti se mogu direktno izdvojiti iz E. coli i hemijski spojiti kako bi se formirali F(ab')2 fragmenti (videti, npr., Carter et al., 1992, Bio/Technologi 10:163-167). Drugim pristupom, F(ab')2 fragmenti mogu biti izolovani direktno iz rekombinantne kulture ćelije domaćina. Druge tehnike za proizvodnju fragmenata antitela biće očigledne stručnom stručnjaku.

[00141] U jednom aspektu, anti-PD-1 antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen mogu uključivati modifikacije, kao što je glikozilacija ili deamidacija.

[00142] U određenim izvođenjima, može biti poželjno koristiti fragment anti-PD-1 antitela, umesto intaktnog antitela. Može biti poželjno modifikovati fragment antitela kako bi se povećao njegov poluživot u serumu. Ovo se može postići, na primer, ugradnjom epitopa koji

4

se vezuje za spaseni receptor u fragment antitela. U jednoj metodi, odgovarajući region fragmenta antitela može biti izmenjen (npr. mutiran), ili epitop može da se ugradi u peptidnu oznaku koja se zatim spaja sa fragmentom antitela na bilo kom kraju ili u sredini, na primer, pomoću DNK ili sinteza peptida. Videti, npr., WO 96/32478. Na primer, fragmenti antitela se takođe mogu spojiti sa albuminom humanog seruma kako bi se produžio poluživot u serumu, ako je upotreba lgG1 osnove pune dužine nepoželjna. Takvi fuzioni proteini fragmenta antitela sa albuminom humanog seruma mogu biti korisni u situacijama u kojima dva različita fragmenta antitela treba da se spoje kako bi se povećala avidnost, ili kako bi se stvorio bispecifični vezujući protein sa produženim poluživotom u serumu (videti npr. WO 05077042 A2).

[00143] U drugom izvođenju, predmetni pronalazak uključuje kovalentne modifikacije anti-PD-1 antitela. Kovalentne modifikacije uključuju modifikaciju cisteinilnih ostataka, histidilnih ostataka, lizinilnih i amino-krajnjih ostataka, arginilnih ostataka, tirozilnih ostataka, karboksilnih bočnih grupa (aspartil ili glutamil), glutaminilnih i asparaginilnih ostataka, ili seril, ili treonil ostataka. Druga vrsta kovalentne modifikacije uključuje hemijsko ili enzimsko spajanje glikozida sa antitelom. Takve modifikacije mogu biti napravljene hemijskom sintezom ili enzimskim ili hemijskim cepanjem antitela, ako je primenljivo. Druge vrste kovalentnih modifikacija antitela mogu se uvesti u molekul reagovanjem ciljanih aminokiselinskih ostataka antitela sa organskim derivatizujućim agensom koji je sposoban da reaguje sa odabranim bočnim lancima ili amino- ili karboksi-krajnjim ostacima.

[00144] Uklanjanje bilo kojih grupa ugljenih hidrata prisutnih na antitelu se može postići hemijski ili enzimski. Hemijska deglikozilacija je opisana od strane Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophis.259:52 i Edge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131. Enzimsko cepanje ugljenih hidrata na antitelima se može postići upotrebom raznih endo- i egzoglikozidaza kao što je opisano od strane Thotakura et al., 1987, Meth. Enzimol 138:350.

[00145] Drugi tip korisne kovalentne modifikacije obuhvata povezivanje antitela sa jednim od raznih neproteinskih polimera, npr., polietilen glikola, polipropilen glikola ili polioksialkilena, na način dat u jednoj ili više U.S. Pat. Br.4,640,835, U.S. Pat. Br.4,496,689, U.S. Pat. Br.

4,301,144, U.S. Pat. br.4,670,417, U.S. Pat. Br.4,791,192 i U.S. Pat. Br.4,179,337.

[00146] Vezivanje epitopa

[00147] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji prepoznaje specifični "PD-1 antigen epitop" i "PD-1 epitop".

[00148] Kao što je korišćeno ovde, izrazi "epitop PD-1 antigena" i "PD-1 epitop" se odnose na molekul (npr., peptid) ili fragment molekula koji je sposoban da se veže za anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen. Ovi izrazi dalje uključuju, na primer, PD-1 antigenu determinantu koja je prepoznata od srtane bilo kog antitela ili fragmenta antitela predmetnog pronalaska.

[00149] Epitopi PD-1 antigena mogu biti uključeni u proteine, proteinske fragmente, peptide ili slično. Epitopi su najčešće proteini, kratki oligopeptidi, mimici oligopeptida (odn. organska jedinjenja koja oponašaju svojstva vezivanja antitela PD-1 antigena) ili njihove kombinacije.

[00150] U jednom aspektu, anti-PD-1 antitelo predmetnog pronalaska ili njegov fragment koji se vezuje za antigen vezuje se specifično za PD-1 epitop na način koji oponaša vezivanje fiziološkog liganda što dovodi do agonizma posredovanog antitelom.

[00151] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji se takmiči za vezivanje za PD-1 sa anti-PD-1 antitelom u skladu sa predmetnim pronalaskom. Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo na PD-1 ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji se takmiči za vezivanje za PD-1 sa bilo kojim od Antitela A, Antitela B, Antitela C, Antitela D ili Antitela E opisanog ovde. Testovi konkurencije se mogu sprovesti na primer kao što je opisano u PLoS One.2014; 9(3): e92451 korišćenjem biosenzora, ili PLoS One 2020. Mart 5;15(3):e0229206, ili metodom koja je ovde otkrivena.

[00152] Terapeutske Upotrebe

[00153] U jednom izvođenju, anti-PD-1 antitela pronalaska ili njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen su korisni za lečenje ili prevenciju poremećaja PD-1 puta.

[00154] U drugom izvođenju, anti-PD-1 antitela pronalaska ili njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen su korisni kao lek.

[00155] Shodno tome, u jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju za upotrebu u metodi modulacije interakcije između PD-1 i PD-L1 kod humanog pacijenta koji se sastoji od davanja navedenom humanom pacijentu kompozicije koja sadrži anti-PD- 1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen u skladu sa predmetnim pronalaskom u količini dovoljnoj da aktivira PD-1 put kod navedenog humanog pacijenta. U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u modulaciji interakcije između PD-1 i PD-L1 kod humanog pacijenta. U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen u skladu sa predmetnim pronalaskom u proizvodnji leka za modulaciju interakcije između PD-1 i PD-L1 kod humanog pacijenta.

[00156] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu u postupku slabljenja aktivnosti T ćelija koje eksprimiraju PD-1 kod humanog pacijenta koji se sastoji od davanja kompozicije navedenom humanom pacijentu koji sadrži anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen u skladu sa predmetnim pronalaskom u količini dovoljnoj da smanji imuni odgovor u navedenom humanom pacijentu. U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u smanjenju aktivnosti T ćelija koje eksprimiraju PD-1 kod humanog pacijenta. Predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen u skladu sa predmetnim pronalaskom u proizvodnji leka za smanjenje aktivnosti T ćelija koje eksprimiraju PD-1 kod humanog pacijenta.

[00157] U jednom izvođenju, bolest ili poremećaj PD-1 puta je sistemska skleroza (SSc), sistemski eritematozni lupus, polimiozitis, arteritis gigantskih ćelija, psorijaza, psorijatični artritis, ankilozantni spondilitis ili inflamatorna bolest creva. Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak lečenja ili prevencije sistemske skleroze (SSc), sistemskog eritematoznog lupusa, polimiozitisa, arteritisa gigantskih ćelija, psorijaze, psorijatičnog artritisa, ankilozirajućeg spondilitisa ili inflamatorne bolesti creva kod humanog pacijenta koji se sastoji od davanja navedenom humanom pacijentu kompozicije koja sadrži anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen u skladu sa predmetnim pronalaskom. U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u lečenju ili prevenciji sistemske skleroze (SSc), sistemskog eritematoznog lupusa, polimiozitisa, arteritisa gigantskih ćelija, psorijaze, psorijatični artritis, ankilozantni spondilitis ili inflamatorna bolest creva kod humanog pacijenta. U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen u skladu sa predmetnim pronalaskom u proizvodnji leka za lečenje ili prevenciju sistemske skleroze (SSc), sistemskog eritematoznog lupusa, polimiozitisa , arteritis gigantskih ćelija, psorijaza, psorijatični artritis, ankilozni spondilitis ili inflamatorna bolest creva kod humanog pacijenta.

[00158] U jednom izvođenjuu, bolest ili poremećaj PD-1 puta je hronična ili akutna, kao što je hronična inflamatorna bolest ili akutna inflamatorna bolest. U jednom izvođenju, bolest ili poremećaj PD-1 puta je artritis, reumatoidni artritis, astma, COPD, karlična inflamatorna bolest, Alchajmerova bolest, inflamatorna bolest creva, Kronova bolest, ulcerozni kolitis, Pejronijeva bolest, gastronomska bolest, bolest celijakije, bolest žučne kese, pilonidalna bolest, peritonitis, psorijaza, psorijatični artritis, vaskulitis, hirurške adhezije, moždani udar, dijabetes tipa I, Lajmska bolest, meningoencefalitis, autoimuni uveitis, multipla skleroza, lupus (kao što je sistemski eritematozni lupus), Guillain-Barov sindrom, atopijski dermatitis, autoimuni hepatitis, fibrozni alveolitis, Graveova bolest, IgA nefropatija, idiopatska trombocitopenična purpura, Menijerova bolest, pemfigus, primarna bilijarna ciroza, sarkoidoza, skleroderma, Wegenerova granulomatoza, drugi autoimuni poremećaji, pankreatitis, traume (operacija), uključujući transplantaciju, transplantaciju bolesti kao što je bolest kao miokarda infarkt kao i ateroskleroza, intravaskularna koagulacija, resorpcija kostiju, osteoporoza, osteoartritis, parodontitis i hipohlorhidija, neplodnost u vezi sa nedostatkom fetalno-materinske tolerancije, Sjogrenov sindrom, vitiligo, mijastenija gravis ili sistemska skleroza.

[00159] Shodno tome, u jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije jedne od gore navedenih bolesti ili poremećaja kod humanog pacijenta koji obuhvata davanje navedenom humanom pacijentu kompoziciju koja sadrži anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen u skladu sa predmetnim pronalaskom. U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u lečenju ili prevenciji jedne od gore navedenih bolesti ili poremećaja kod humanog pacijenta. U jednom izvođenju, predmetni ptonalazak obezbeđuje upotrebu anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen u skladu sa predmetnim pronalaskom u proizvodnji leka za lečenje ili prevenciju jedne od gore navedenih bolesti ili poremećaja kod humanog pacijenta.

[00160] U jednom aspektu, PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu ili u upotrebi kao što je gore opisano ili u postupku kao što je gore opisano je agonističko anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen.

[00161] Ne-terapeutske Upotrebe

[00162] Ovde opisana antitela su korisna kao agensi za prečišćavanje afiniteta. U ovom procesu, antitela se imobilišu na čvrstoj fazi kao što je Protein A smola, korišćenjem postupaka dobro poznatih u tehnici. Imobilizovano antitelo se dovodi u kontakt sa uzorkom koji sadrži protein PD-1 (ili njegov fragment) koji treba da se prečisti, a zatim se podloga ispira sa odgovarajućim rastvaračem koji će ukloniti uglavnom sav materijal u uzorku osim proteina PD-1, koji je vezan za imobilisano antitelo. Konačno, nosač je ispran sa drugim pogodnim rastvaračem koji će osloboditi PD-1 protein iz antitela.

[00163] Anti-PD-1 antitela i njihovi fragmenti kao što su ovde otkriveni su takođe korisni u dijagnostičkim testovima za detekciju i/ili kvantifikaciju PD-1 proteina, na primer, otkrivanje ekspresije PD-1 u specifičnim ćelijama, tkivima, ili serumu.

[00164] Biće korisno u nekim izvođenjima, na primer, u dijagnostičke svrhe da se obeleži antitelo detektabilnim ostatkom. Dostupne su brojne detektabilne oznake, uključujući radioizotope, fluorescentne oznake, oznake supstrata enzima, kvantne tačke i slično.

Oznaka može biti indirektno konjugovana sa antitelom korišćenjem različitih poznatih tehnika. Na primer, antitelo se može konjugovati sa biotinom i bilo koja od tri široke kategorije oznaka koje su gore navedene može biti konjugovana sa avidinom, ili obrnuto. Biotin se selektivno vezuje za avidin i tako se oznaka može konjugovati sa antitelom na ovaj indirektan način. Alternativno, kako bi se postigla indirektna konjugacija oznake sa antitelom, antitelo se može konjugovati sa malim haptenom (kao što je digoksin) i jedan od različitih tipova oznaka navedenih gore je konjugovan sa anti-hapten antitelom (npr., anti-digoksin antitelo). Stoga, se tako može postići indirektna konjugacija oznake sa antitelom.

[00165] Primeri radioizotopnih oznaka uključuju<35>S,<14>C,<125>l,<3>H i<131>I. Antitelo se može obeležiti radioizotopom, korišćenjem tehnika opisanih u, na primer, Current Protocols in Immunologi, Volumes 1 i 2, Coligen et al., 1991. al., Ed. Vilei-lnterscience, Njujork, Njujork, Pubs. Radioaktivnost se može izmeriti, na primer, scintilacionim brojanjem.

[00166] Primeri fluorescentnih oznaka obuhvataju oznake izvedene iz retkih zemljanih helata (europijum helati) ili fluoresceina i njegovih derivata, rodamina i njegovi derivata, dansil, lisamin, fikoeritrin i Texas Red su dostupne, ili npr. bilo koja od sledećih fluorescentnih oznaka: dialkilaminokumarin, rodamin izotiocijanat, Alexa 350, Alexa 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 6, Alexa Fluor 6, Alexa Fluor 680, AMCA, aminoakridin, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, BODIPY-FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODY 530/550, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665), Karboksirodamin 6G, Karboksi-X-rodamin (ROX), Kaskadna Plava, Kaskadna Žuta, Koumarin 343, Cijanin boje (Cy3, Cy5, Cy3.5, Cy5.5), Dansil, Dapoksil, Dialkilaminokumarin,.DM-NERF, Eosin, Erithrosin, Fluorescein, FA, Hidroksikumarin, IRBoje (IRD40, IRD 700, IRD 800), JOE, Lisamin rodamin B, Marina Blue, Metoksi kumarin, Nafto fluorescein, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, PyMPO, 5-karboksi-4',5,-dihloro-2',7'-dimetoksi fluorescein, 5-karboksi-2',4',5,7'-tetrahlorofluorescein, 5-karboksifluorescein, 5-karboksirodamin, 6-karboksirodamin, 6-karboksitetrametil amino, Cascade Blue, Cy2, Cy3, Cy5,6-FAM, dansil hlorid, fluorescein, HEX, 6-JOE, NBD (7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol), Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, ftalna kiselina, tereftalna kiselina, izoftalna kiselina, krezil ljubičasta, krezil plava ljubičasta, brilijant krezil plava, para- aminobenzojeva kiselina, eritrozin, ftalocijanini, azometini, cijanini, ksantini, sukcinilfluoresceini, retkih zemljani kriptati metala, europijum trisbipiridin diamin, europijum kriptat ili helat, diamin, dicianini, lajodijan plava boja, aUopikocijanin, alokocianin B, fikocijanin C, fikocijanin R, tiamin, fikoeritrocijanin, fikoeritrin R, REG, rodamin zeleni, rodamin izotiocijanat, rodamin crvena, TAMRA, TET, TRIT (tetrametil rodamin izotiol, Tetrametilrhodolamin, ili Teksak Crvena. Fluorescentne oznake se mogu konjugovati sa antitelom pomoću poznatih tehnika, kao što su one otkrivene u Current Protocols in Immunologi, supra, na primer. Fluorescencija se može kvantifikovati pomoću fluorimetra.

[00167] Postoje različite dobro okarakterisane oznake enzim-supstrat poznati u struci (videti, npr., US Patent Bbr.4,275,149 za pregled). Enzim uopšteno katalizuje hemijsku promenu hromogenog supstrata koja se može meriti različitim tehnikama. Na primer, promena može biti promena boje u supstratu koja se može meriti spektrofotometrijski. Alternativno, enzim može da promeni fluorescenciju ili hemiluminiscenciju supstrata. Tehnike za kvantifikaciju promene fluorescencije su opisane gore. Hemiluminiscentna supstrat postaje elektronski pobuđena hemijskom reakcijom i onda može emitovati svetlost koja se može meriti, korišćenjem hemiluminometra, na primer, ili donirati energiju fluorescentnom akceptoru.

[00168] Primeri enzimskih oznaka uključuju luciferaze kao što su luciferaza svitaca i bakterijska luciferaza (US Patent Br.4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, malat dehidrogenaza, ureaza, peroksidaza kao što je ren peroksidaza (HRPO), alkalin fosfataza, ȕ-galaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze (kao što su glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza), heterocidne oksidaze (kao što su urikaza i ksantin oksidaza), laktoperoksidaza, mikroperoksidaze, i slične. Tehnike za konjugaciju enzima na antitela su opisane, na primer, u O'Sullivan et al., 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, ur.), Academic press, N.Y., 73: 147-166.

[00169] Primeri kombinacija enzim-supstrat uključuju, na primer: Ren peroksidazu (HRPO) sa vodonik peroksidazom kao supstratom, pri čemu vodonik peroksidaza oksidiše prekursor boje kao što je ortofenilen diamin (OPD) ili 3,3',5,5 '-tetrametil benzidin hidrohlorid (TMB); alkalna fosfataza (AP) sa para-nitrofenil fosfatom kao hromogenim supstratom; i ȕ-D-galaktozidaza (ȕ-D-Gal) sa hromogenim supstratom kao što je p-nitrofenil-ȕ-D-galaktozidaza ili fluorogeni supstrat 4-metilumbeliferil-ȕ-D-galaktozidaza.

[00170] Brojne druge kombinacije enzim-supstrat su dostupne stručnjacima iz ove oblasti. Za opšti pregled ovih, pogledati U.S. Pat. Br.4,275,149 i U.S. Pat. Br.4,318,980.

[00171] U drugom izvođenju, anti-PD-1 antitelo ili fragment antitela iz pronalaska se koristi neobeležen i detektuje se obeleženim antitelom koje vezuje anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment. Na primer, obeležena anti-humana Fc, ili anti-humana Fab antitela mogu da se koriste za detekciju neobeleženog anti-PD-1 antitela ili fragmenta. Upotreba neobeleženog anti-PD-1 antitela ili njegovih fragmenata u skladu sa pronalaskom može biti korisna za postizanje bolje penetracije u tkivo, pošto će fluorescentna oznaka povećati molekulsku težinu i/ili povećati hidrofobnost antitela ili fragmenta antitela ukoliko je spojen da bi dovelo do smanjenog prodiranje u tkivo.

[00172] Antitela opisana ovde mogu da se koriste u bilo kojoj poznatoj metodi ispitivanja, kao što su testovi kompetitivnog vezivanja, direktni i indirektni sendvič testovi i testovi imunoprecipitacije. Videti, na primer, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, str.147-158 (CRC Press, Inc.1987). Dijagnostički kompleti.

[00173] Humanizovano anti-PD-1 antitelo pronalaska može da se koristi u dijagnostičkom kompletu, odn., upakovanoj kombinaciji reagensa u unapred određenim količinama sa uputstvima za izvođenje dijagnostičkog testa. Tamo gde je antitelo obeleženo enzimom, komplet može da sadrži supstrate i kofaktore potrebne za enzim, kao što je prekursor supstrata koji obezbeđuje detektabilni hromofor ili fluorofor. Pored toga, mogu biti uključeni i drugi aditivi kao što su stabilizatori, puferi (na primer blok pufer ili pufer za lizu), i slično. Relativne količine različitih reagenasa mogu da variraju u velikoj meri kako bi se obezbedile koncentracije u rastvoru reagenasa koje značajno optimizuju osetljivost testa. Reagensi se mogu obezbediti kao suvi prahovi, obično liofilizovani, uključujući ekscipijense koji će pri rastvaranju obezbediti rastvor reagensa odgovarajuće koncentracije.

1

[00174] Dijagnostički kompleti

[00175] Anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment se može koristiti u dijagnostičkom kompletu, odn., upakovanoj kombinaciji reagensa u unapred određenim količinama sa uputstvima za izvođenje dijagnostičkog testa. Tamo gde je antitelo obeleženo enzimom, komplet može da sadrži supstrate i kofaktore potrebne za enzim, kao što je prekursor supstrata koji obezbeđuje hromofor ili fluorofor koji se može detektovati. Pored toga, mogu biti uključeni i drugi aditivi kao što su stabilizatori, puferi (na primer blok pufer ili pufer za lizu) i slično. Relativne količine različitih reagenasa mogu da variraju u velikoj meri kako bi se obezbedile koncentracije u rastvoru reagenasa koje značajno optimizuju osetljivost testa. Reagensi se mogu obezbediti kao suvi prahovi, obično liofilizovani, uključujući ekscipijente koji će pri rastvaranju obezbediti rastvor reagensa odgovarajuće koncentracije.

[00176] Kompozicije i njihova primena

[00177] Kompozicija koja sadrži anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen u skladu sa pronalaskom može se davati subjektu koji ima ili je izložen riziku od bolesti ili poremećaja PD-1 puta opisanih ovde. Pronalazak dalje obezbeđuje upotrebu anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen u proizvodnji leka za prevenciju ili lečenje bolesti ili poremećaja PD-1 puta. Izraz "subjekat" kao što je ovde korišćen označava svakog pacijenta sisara na kome se može primeniti anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, uključujući, na primer, ljude i određene sisare koji nisu ljudi, kao što su primati i psi . Subjekti koji su posebno namenjeni za lečenje korišćenjem metoda opisanih ovde uključuju ljude. Anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, prema pronalasku, može da se primeni ili samostalno ili u kombinaciji sa drugim kompozicijama.

[00178] U jednom aspektu, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen predmetnog pronalaska.

[00179] Poznati su različiti sistemi isporuke i mogu se koristiti za primenu anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen. Metode uvođenja uključuju, ali nisu ograničene na, intravitrealne, kapi za oči, intradermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intravenske, subkutane, intranazalne, epiduralne i oralne puteve. Anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen se može primeniti, na primer, infuzijom, bolusom ili injekcijom, i može se primeniti zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima. Davanje može

2

biti sistemsko ili lokalno. Formulacije za takve injekcije se mogu pripremiti u, na primer, napunjenim špricevima.

[00180] Anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen se može davati kao farmaceutske kompozicije koje sadrže terapeutski efikasnu količinu anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen i jedan ili više farmaceutski kompatibilnih sastojaka.

[00181] U tipičnim izvođenjima, farmaceutska kompozicija je formulisana u skladu sa rutinskim procedurama kao farmaceutska kompozicija prilagođena za intravensku ili subkutanu primenu kod ljudi. Obično, kompozicije za primenu injekcijom su rastvori u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Tamo gde je potrebno, lek takođe može da sadrži agens za rastvaranje i lokalni anestetik kao što je lignokain kako bi se ublažio bol na mestu injekcije. Uopšteno, sastojci se isporučuju ili odvojeno ili pomešani zajedno u jediničnom doznom obliku, na primer, kao suvi liofilizovani prah ili koncentrat bez vode u hermetički zatvorenoj posudi kao što je ampula ili kesica na kojoj je naznačena količina aktivnog agensa. Tamo gde se lek primenjuje putem infuzije, može se izdati bocom za infuziju koja sadrži sterilnu vodu ili fiziološki rastvor farmaceutskog kvaliteta. Tamo gde se lek primenjuje injekcijom, može se obezbediti ampula sterilne vode za injekcije ili fiziološki rastvor tako da se sastojci mogu mešati pre primene.

[00182] Dalje, farmaceutska kompozicija se može obezbediti kao farmaceutski komplet koji sadrži (a) posudu koja sadrži anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen u liofilizovanom obliku i (b) drugu posudu koja sadrži farmaceutski prihvatljivi razblaživač (npr., sterilna voda) za injekcije. Farmaceutski prihvatljiv razblaživač se može koristiti za rekonstituciju ili razblaživanje liofilizovanog anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen. Opciono povezano sa takvom posudom(ama) može biti obaveštenje u u obliku koji je propisala vladina agencija koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih ili bioloških proizvoda, a koje obaveštenje odražava odobrenje agencije za proizvodnju, upotrebu ili prodaju za ljudsku primenu.

[00183] Količina anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen koji je efikasan u lečenju ili prevenciji bolesti ili poremećaja PD-1 puta može se odrediti standardnim kliničkim tehnikama. Pored toga, in vitro testovi mogu opciono da se koriste kako bi pomogli u identifikaciji optimalnih opsega doziranja. Precizna doza koja će se koristiti u formulaciji takođe će zavisiti od načina primene, i stadijuma poremećaja, i treba je odlučiti prema proceni lekara i okolnostima svakog pacijenta. Efikasne doze se mogu ekstrapolirati iz krivulja doza-odgovor izvedenih iz in vitro test sistema ili na životinjskim modelima.

[00184] Na primer, toksičnost i terapeutska efikasnost anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen mogu se odrediti u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama standardnim farmaceutskim procedurama za određivanje ED50(doza koja je terapeutski efikasna u 50% stanovništvo). Poželjno je anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji pokazuje veliki terapeutski indeks.

[00185] Podaci dobijeni iz testova ćelijske kulture i studija na životinjama se mogu koristiti u formulisanju opsega doza za upotrebu kod ljudi. Doziranje anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen obično leži u opsegu cirkulišućih koncentracija koje uključuju ED50sa malo ili bez toksičnosti. Doziranje može da varira unutar ovog opsega u zavisnosti od oblika doze koji se koristi i načina primene. Za bilo koje anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji se koristi u metodi, terapeutski efikasna doza se može inicijalno proceniti iz testova ćelijske kulture. Doza se može formulisati u životinjskim modelima kako bi se postigao opseg koncentracije u cirkulišućoj plazmi koji uključuje IC50(odn., koncentraciju test jedinjenja koja postiže polumaksimalnu inhibiciju simptoma) kao što je određeno u ćelijskoj kulturi. Takve informacije se mogu koristiti za preciznije određivanje korisnih doza kod ljudi. Nivoi u plazmi se mogu meriti, na primer, tečnom hromatografijom visokih performansi, ELISA i slično.

[00186] U jednom izvođenju, anti-PD-1-antitelo se primenjuje u redovnim intervalima.

[00187] U nekim izvođenjima, antitela predmetnog pronalasku mogu biti formulisana u dozama, koje uključuju na primer od 1 mg/ml do 250 mg/ml, na primer od 20 mg/ml do 200 mg/ml.

[00188] U nekim izvođenjima, farmaceutske kompozicije koje sadrže anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen mogu dalje da sadrže terapeutski agens, bilo konjugovano ili nekonjugovano sa vezivnim agensom.

[00189] Takva primena kombinovane terapije može imati aditivni ili sinergistički efekat na parametre bolesti (npr., ozbiljnost simptoma, broj simptoma ili učestalost relapsa).

[00190] Što se tiče terapeutskih režima za kombinatornu primenu, u specifičnom izvođenju, anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen se primenjuje istovremeno sa

4

terapeutskim agensom. U drugom specifičnom izvođenju, terapeutski agens se primenjuje pre ili posle primene anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen.

[00191] Polinukleotidi, Vektori, ûelije Domaćini, i Rekombinantne Metode

[00192] Predmetni pronalzak se odnosi na izolovane polinukleotide koji sadrže sekvencu koja kodira anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, vektore i ćelije domaćina koje sadrže polinukleotide, i rekombinantne tehnike za proizvodnju antitela.

Izolovani polinukleotidi mogu kodirati bilo koji željeni oblik anti-PD-1 antitela uključujući, na primer, monoklonska antitela pune dužine, Fab, Fab', F(ab')2i Fv fragmente, dijatela, linearna antitela, jednolančane molekule antitela, i multispecifična antitela formirana iz fragmenata antitela.

[00193] Polinukleotid(i) koji sadrži sekvencu koja kodira anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment ili lanac može biti spojen za jedan ili više regulatornih ili kontrolnih sekvenci, kao što je poznato u tehnici, i mogu se nalaziti u pogodnim ekspresionim vektorima ili ćelijama domaćina kao što je poznato u tehnici. Svaki od polinukleotidnih molekula koji kodiraju varijabilne domene teškog ili lakog lanca mogu biti nezavisno spojeni za polinukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni domen, kao što je humani konstantni domen, omogućavajući proizvodnju intaktnih antitela. Alternativno, polinukleotidi, ili njihovi delovi, mogu biti spojeni zajedno, obezbeđujući šablon za proizvodnju jednolančanog antitela.

[00194] Za rekombinantnu proizvodnju, polinukleotid koji kodira antitelo se ubacuje u vektor koji se može replicirati za kloniranje (amplifikacija DNK) ili za ekspresiju. Dostupni su mnogi pogodni vektori za ekspresiju rekombinantnog antitela. Komponente vektora uopšteno uključuju, ali nisu ograničene na, jedno ili više od sledećeg: signalnu sekvencu, poreklo replikacije, jedan ili više gena markera, pojačivač, promoter i sekvencu za završetak transkripcije.

[00195] Anti-PD-1 antitela se takođe mogu proizvesti kao fuzioni polipeptidi, u kojima je antitelo spojeno sa heterolognim polipeptidom, kao što je signalna sekvenca ili drugi polipeptid koji ima specifično mesto cepanja na amino kraju zrelog proteina ili polipeptid. Odabrana heterologna signalna sekvenca je obično ona koju prepoznaje i obrađuje (odn., odcepljena od strane signalne peptidaze) od strane ćelije domaćina. Za prokariotske ćelije domaćina koje ne prepoznaju i ne obrađuju signalnu sekvencu anti-PD-1 antitela, signalna sekvenca može biti supstituisana prokariotskom signalnom sekvencom. Signalna sekvenca može biti, na primer, alkalna fosfataza, penicilinaza, lipoprotein, toplotno stabilni lideri enterotoksina II i slično. Za sekreciju kvasca, nativna signalna sekvenca može biti zamenjena, na primer, vodećom sekvencom dobijenom od alfa faktora invertaze kvasca (uključujući lidere Į-faktora Saccharomices i Kluyveromices), kisele fosfataze, C. albicans glukoamilaze ili signala opisanog u WO 90/13646. U ćelijama sisara se mogu koristiti signalne sekvence sisara kao i virusne sekretorne vođe, na primer, herpes simpleks gD signal. DNK za takav region prekursora je vezan u okviru čitanja za DNK koja kodira humanizovano anti-PD-1 antitelo.

[00196] Ekspresioni i klonirani vektori sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava da se vektor replicira u jednoj ili više odabranih ćelija domaćina. Uopšteno, u vektorima za kloniranje ova sekvenca je ona koja omogućava vektoru da se replicira nezavisno od hromozomske DNK domaćina i uključuje poreklo replikacije ili sekvence koje se autonomno repliciraju. Takve sekvence su dobro poznate po raznim bakterijama, kvascima i virusima. Poreklo replikacije iz plazmida pBR322 je pogodno za većinu Gram-negativnih bakterija, 2-ȣ. plazmidno poreklo je pogodno za kvasac, a različito virusno poreklo (SV40, polioma, adenovirus, VSV i BPV) je korisno za kloniranje vektora u ćelijama sisara. Uopšteno, poreklo komponente replikacije nije potrebno za vektore ekspresije sisara (originalni SV40 se obično može koristiti samo zato što sadrži rani promoter).

[00197] Ekspresioni i klonirani vektori mogu da sadrže gen koji kodira selektabilni marker kako bi se olakšala identifikacija ekspresije. Obični selektivni markerski geni kodiraju proteine koji daju otpornost na antibiotike ili druge toksine, na primer, ampicilin, neomicin, metotreksat ili tetraciklin, ili alternativno, predstavljaju komplementarne auksotrofne nedostatke, ili u drugim alternativama snabdevaju specifične hranljive materije koje nisu prisutne u složenim medijima, npr., gen koji kodira D-alanin racemazu za Bacilli.

[00198] Jedan primer šeme selekcije koristi lek za zaustavljanje rasta ćelije domaćina. One ćelije koje su uspešno transformisane heterolognim genom proizvode protein koji daje rezistenciju na lekove i tako preživljavaju režim selekcije. Primeri takve dominantne selekcije koriste lekove neomicin, mikofenolnu kiselinu i higromicin. Uobičajeni selektivni markeri za ćelije sisara su oni koji omogućavaju identifikaciju ćelija kompetentnih da preuzmu nukleinsku kiselinu koja kodira humanizovano anti-PD-1 antitelo, kao što je DHFR (dihidrofolat reduktaza), timidin kinaza, metalotionein-l i -II (kao što su geni metalotionein primata), adenozin deaminazu, ornitin dekarboksilazu i kao. ûelije transformisane genom za selekciju DHFR se prvo identifikuju kultivisanjem svih transformanata u medijumu kulture koji sadrži metotreksat (Mtx), kompetitivni antagonist DHFR. Odgovarajuća ćelija domaćina kada se koristi DHFR divljeg tipa je ćelijska linija jajnika kineskog hrčka (CHO) sa nedostatkom DHFR aktivnosti (npr. DG44).

[00199] Alternativno, ćelije domaćina (posebno domaćini divljeg tipa koji sadrže endogeni DHFR) su transformisane ili ko-transformisane sa DNK sekvencama koje kodiraju anti-PD-1 antitelo, divlji tip DHFR proteina i drugim selektivnim markerom kao što je aminoglikozid 3'-fosfotransferaza (APH), može se odabrati rastom ćelije u medijumu koji sadrži selekcioni agens za selektivni marker kao što je aminoglikozidni antibiotik, npr. kanamicin, neomicin ili G418. Videti, npr., U.S. Pat. Br.4,965,199.

[00200] Tamo gde se rekombinantna proizvodnja vrši u ćeliji kvasca kao ćeliji domaćina, gen TRP1 prisutan u plazmidu kvasca YRp7 (Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39) može se koristiti kao selektivni marker. Gen TRP1 obezbeđuje selekcioni marker za mutantni soj kvasca kome nedostaje sposobnost da raste u triptofanu, na primer, ATCC br.44076 ili PEP4-1 (Jones, 1977, Genetics 85:12). Prisustvo trp1 lezije u genomu ćelije domaćina kvasca potom pruža efikasno okruženje za otkrivanje transformacije rastom u odsustvu triptofana. Slično, sojevi kvasca sa nedostatkom Leu2p, kao što su ATCC 20,622 i 38,626, su dopunjeni poznatim plazmidima koji nose LEU2 gen.

[00201] Pored toga, vektori izvedeni iz kružnog plazmida pKD1 od 1.6 µm se mogu koristiti za transformaciju Kluyveromices kvasca. Alternativno, za K. lactis je prijavljen sistem ekspresije za proizvodnju velikog obima rekombinantnog telećeg himozina (Van den Berg, 1990, Bio/Technologi 8:135). Takođe su otkriveni stabilni ekspresioni vektori sa više kopija za sekreciju zrelog rekombinantnog humanog serumskog albumina od strane industrijskih sojeva Kluyveromices (Fleer et al., 1991, Bio/Technologi 9:968-975).

[00202] Ekspresioni i klonirani vektori obično sadrže promoter koji prepoznaje organizam domaćin i koji je operativno vezan za molekul nukleinske kiseline koji kodira anti-PD-1 antitelo ili njegov polipeptidni lanac. Promoteri pogodni za upotrebu sa prokariotskim domaćinima uključuju phoA promoter, p-laktamazu i sisteme promotera laktoze, alkalnu fosfatazu, sistem promotera triptofana (trp) i hibridne promotere kao što je tac promoter. Drugi poznati bakterijski promoteri su takođe pogodni. Promoteri za upotrebu u bakterijskim sistemima će takođe sadržati Shine-Dalgamo (SD) sekvencu koja je operativno povezana sa DNK koja kodira humanizovano anti-PD-1 antitelo.

[00203] Poznate su mnoge eukariotske promoterske sekvence. Praktično svi eukariotski geni imaju region bogat AT koji se nalazi otprilike 25 do 30 baza uzvodno od mesta gde je transkripcija pokrenuta. Druga sekvenca pronađena 70 do 80 baza uzvodno od početka transkripcije mnogih gena je CNCAAT region gde N može biti bilo koji nukleotid. Na 3' kraju većine eukariotskih gena nalazi se AATAAA sekvenca koja može biti signal za dodavanje poli A repa na 3' kraju kodirajuće sekvence. Sve ove sekvence su na odgovarajući način umetnute u eukariotske ekspresione vektore.

[00204] Primeri pogodnih promotivnih sekvenci za upotrebu sa domaćinima kvasca obuhvataju promotere za 3-fosfoglicerat kinazu ili druge glikolitičke enzime, kao što su enolaza, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilazaospofoksilaza-glukozofa-6 izomeraza, 3-fosfoglicerat mutaza, piruvat kinaza, triosefosfat izomeraza, fosfoglukoza izomeraza i glukokinaza.

[00205] Inducibilni promoteri imaju dodatnu prednost transkripcije kontrolisane uslovima rasta. Ovo uključuje regione promotera kvasca za alkohol dehidrogenazu 2, izocitohrom C, kiselu fosfatazu, derivate enzima povezanih sa metabolizmom azota, metalotionein, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu i enzime odgovorne za korišćenje maltoze i galaktoze. Pogodni vektori i promoteri za upotrebu u ekspresiji kvasca su dalje opisani u EP 73,657 ili Baghban et al. Molekularna biotehnologija (2019) 61:365-384. Pojačivači kvasca se takođe povoljno koriste sa promoterima kvasca.

[00206] Transkripcija anti-PD-1 antitela iz vektora u ćelijama domaćina sisara je kontrolisana, na primer, promoterima dobijenim iz genoma virusa kao što su virus polioma, virus boginja ptica, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), goveđi papiloma virus, virus sarkoma ptica, citomegalovirus, retrovirus, virus hepatitisa B i Simian virus 40 (SV40), od heterolognih promotora sisara, na primer, promotera aktina ili promotera imunoglobulina, ili od promotera toplotnog šoka, pod uslovom da su takvi promoteri kompatibilni sa sistemima ćelija domaćina.

[00207] Rani i kasni promoteri virusa SV40 se prikladno dobijaju kao SV40 restrikcioni fragment koji takođe sadrži SV40 virusno poreklo replikacije. Neposredni rani promoter humanog citomegalovirusa se prikladno dobija kao restrikcioni fragment HindIII E. Sistem za ekspresiju DNK kod sisara domaćina koristeći goveđi papiloma virus kao vektor je otkriven u U.S. Pat. Br.4,419,446. Modifikacija ovog sistema je opisana u U.S. Pat. Br.4,601,978. Videti takođe Reies et al., 1982, Nature 297:598-601, koji otkriva ekspresiju cDNK humanog p-interferona u ćelijama miša pod kontrolom promotora timidin kinaze iz virusa herpes simpleksa. Alternativno, dugo terminalno ponavljanje virusa Rous sarkoma može se koristiti kao promoter.

[00208] Još jedan koristan element koji se može koristiti u rekombinantnom ekspresionom vektoru jeste pojačivačka sekvenca, koja se koristi za povećanje transkripcije DNK koja kodira anti-PD-1 antitelo od strane viših eukariota. Mnoge pojačivačkr sekvence su sada poznate iz gena sisara (npr., globin, elastaza, albumin, a-fetoprotein i insulin). Obično, međutim, koristi se pojačivač virusa eukariotske ćelije. Primeri uključuju pojačivač SV40 na kasnoj strani porekla replikacije (bp 100-270), pojačivač ranog promotera citomegalovirusa, pojačivač polioma na kasnoj strani porekla replikacije i pojačivače adenovirusa. Videti takođe Yaniv, 1982, Nature 297:17-18 za opis pojačivača elemenata za aktivaciju eukariotskih promotera. Pojačivač se može ugraditi u vektor na poziciji 5' ili 3' u sekvenci koja kodira anti-PD-1 antitelo, ali je poželjno lociran na mestu 5' od promotera.

[00209] Ekspresioni vektori koji se koriste u eukariotskim ćelijama domaćina (kvasac, gljive, insekti, biljke, životinje, ljudske, ili ćelije sa jezgrom iz drugih višećelijskih organizama) takođe mogu da sadrže sekvence neophodne za završetak transkripcije i za stabilizaciju mRNK. Takve sekvence su obično dostupne iz 5' i, povremeno 3', neprevedenih regiona eukariotske ili virusne DNK ili cDNK. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente transkriptovane kao poliadenilovani fragmenti u neprevedenom delu mRNK koja kodira anti-PD-1 antitelo. Jedna korisna komponenta za kraj transkripcije je region poliadenilacije goveđeg hormona rasta. Videti WO 94/11026 i ekspresioni vektor koji je u njemu otkriven. U nekim izvođenjima, anti-ANGPT2 antitela mogu da se eksprimiraju korišćenjem CHEF sistema. (Vidi, npr., U.S. Pat. Br.5,888,809.)

[00210] Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju DNK u vektorima ovde su ćelije prokariota, kvasca ili više eukariotske ćelije opisane gore. Pogodni prokarioti za ovu svrhu uključuju eubakterije, kao što su Gram-negativni ili Gram-pozitivni organizmi, na primer, Enterobacteriaceae kao što je Escherichia, npr., E. coli, Enterobacter, Ervinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, npr., Salmonella, Seratium, npr., Serratia marcescans, i Shigella, kao i Bacilli kao što su B. subtilis i B. licheniformis (npr., B. licheniformis 41 P otkriven u DD 266,710 objavljen 12. aprila 1989), Pseudomonas kao što su P. aeruginoza, i Streptomyces. Jedan preferirani domaćin za kloniranje E. coli je E. coli 294 (ATCC 31,446), iako su pogodni i drugi sojevi kao što su E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537) i E. coli W3110 (ATCC 27,325). Ovi primeri su više ilustrativni nego ograničavajući.

[00211] Pored prokariota, eukariotski mikrobi kao što su filamentozne gljive ili kvasac su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju anti-PD-1 antitelo.

Saccharomices cerevisiae, ili obični pekarski kvasac, najčešće se koristi među mikroorganizmima domaćinima nižih eukariota. Međutim, izvestan broj drugih rodova, vrsta i sojeva su uobičajeno dostupni i korisni ovde, kao što je Schizosaccharomices pombe;

Kluiveromices domaćini kao što su, na primer, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. vwickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum /ATCC 36,906), K. thermotolerans i K. markianus; hajdučka trava (EP 402,226); Pichia pastors (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234);

Neurospora crassa; Schvanniomices kao što je Schvanniomices occidentalis; i filamentozne gljive kao što su, na primer, Neurospora, Penicillium, Tolipocladium, i domaćini Aspergillus kao što su A. nidulans i A. niger.

[00212] Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog anti-PD-1 antitela su izvedene iz višećelijskih organizama. Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata, uključujući, na primer, brojne bakulovirusne sojeve i varijante i odgovarajuće permisivne ćelije domaćina insekata iz domaćina kao što su Spodoptera frugiperda (gusenica), Aedes aegipti (komarac), Aedes albopictus (komarac), Drosophila voćna mušica) i Bombik mori (svilena buba). Različiti sojevi virusa za transfekciju su javno dostupni, na primer, L-1 varijanta Autographa californica NPV i Bm-5 soj Bombyx mori NPV, i takvi virusi se mogu koristiti, posebno za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.

[00213] Kulture biljnih ćelija pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza i duvana takođe se mogu koristiti kao domaćini.

[00214] Anti-PD-1 antitela ili njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen se takođe mogu ugraditi u virusne vektore, odn., polinukleotid koji kodira za anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen se uvodi u virusni vektor, a zatim ekspresovan u telu pacijenta nakon infekcije sa virusom.

[00215] U drugom aspektu, ekspresija anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen se sprovodi u ćelijama kičmenjaka. Propagacija ćelija kičmenjaka u kulturi (kultura tkiva) postala je rutinska procedura i tehnike su široko dostupne. Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), humana embrionalna linija bubrega (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi suspenzije, (Graham et al., 1977, Gen Virol 36: 59), ćelije bubrega bebe hrčka (BHK, ATCC CCL 10), ćelije jajnika kineskog hrčka/-DHFR1 (CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216, npr., DG44), mišje Sertolijeve ćelije (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod.23:243-251), ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-; 1587), ćelije humanog karcinoma grlića materice (HELA, ATCC CCL 2), ćelije psećeg bubrega (MDCK, ATCC CCL 34), ćelije jetre bivolja pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442), ćelije ljudskih pluća (V138, ATCC CCL 75), ćelije ljudske jetre (Hep G2, HB 8065), tumor dojke miša (MMT 060562, ATCC CCL51), TR1 ćelije (Mather et al., 1982, Annals N.I. Acad. Sci.383: 44¬68), MRC 5 ćelije, FS4 ćelije i humana linija hepatoma (Hep G2).

[00216] ûelije domaćini se transformišu sa goreopisanim ekspresionim ili klonirajućim vektorima za proizvodnju antitela ili fragmentima koji se vezuju za antitela i kultivišu se u konvencionalnim hranljivim medijumima modifikovanim na odgovarajući način za indukciju promotera, selekciju transformanata ili amplifikaciju gena koji kodiraju željene sekvence.

[00217] ûelije domaćina korišćene za proizvodnju antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen opisane ovde mogu se kultivisati u različitim medijumima. Komercijalno dostupni mediji kao što su Ham's F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.) i Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma-Aldrich Co.) su pogodni za kultivisanje ćelija domaćina, bilo koji od medijuma opisanih u jednom ili više od Ham et al., 1979, Meth. Enz.58: 44, Barnes et al., 1980, Anal. Biochem.102: 255, U.S. Pat. Br.4,767,704, U.S. Pat. Br.

4,657,866, U.S. Pat. Br.4,927,762, U.S. Pat. Br.4,560,655, U.S. Pat. Br.5,122,469, WO 90/103430, i WO 87/00195 se mogu koristiti kao medijumi za kulturu ćelija domaćina. Bilo koji od ovih medijuma se može po potrebi dopuniti hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što su insulin, transferin ili epidermalni faktor rasta), solima (kao što su natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum i fosfat), puferima (kao što je HEPES ), nukleotidima (kao što su adenozin i timidin), antibioticima (kao što je gentamicin), elementima u tragovima (definisani kao neorganski jedinjenja koja su obično prisutna u konačnim koncentracijama u mikromolarnom opsegu) i glukoze ili ekvivalentnog izvora energije. Drugi dodaci se takođe mogu uključiti u odgovarajućim koncentracijama koje bi bile poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Uslovi kulture, kao što su temperatura, pH i slično, su oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom domaćinom odabranom za ekspresiju, i biće očigledni običnom stručnjaku.

[00218] Kada se koriste rekombinantne tehnike, antitelo se može proizvesti intracelularno, u periplazmatskom prostoru, ili direktno izlučeno u medijum. Ako se antitelo proizvodi intracelularno, ćelije mogu biti poremećene kako bi se oslobodio protein kao prvi korak. Ostaci čestica, bilo ćelije domaćini ili lizirani fragmenti, mogu se ukloniti, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Carter et al., 1992, Bio/Technologi 10:163-167 opisuje proceduru za izolovanje antitela koja se luče u periplazmatski prostor E. coli. Ukratko, ćelijska pasta se odmrzava u prisustvu natrijum acetata (pH 3.5), EDTA i

1

fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) tokom oko 30 minuta. Ostaci ćelija mogu se ukloniti centrifugiranjem. Tamo gde se antitelo izlučuje u medijum, supernatanti iz takvih ekspresionih sistema se uopšteno prvo koncentrišu korišćenjem komercijalno dostupnog filtera koncentracije proteina, na primer, Amicon ili Millipore Pellicon ultrafiltracione jedinice. Inhibitor proteaze kao što je PMSF može biti uključen u bilo koji od prethodnih koraka za inhibiciju proteolize, a antibiotici mogu biti uključeni kako bi se sprečio rast slučajnih kontaminanata. Za izolovanje antitela iz ćelije domaćina mogu se koristiti različite metode.

[00219] Kompozicija antitela pripremljena od ćelija se može prečistiti korišćenjem, na primer, hidroksilapatit hromatografije, gel elektroforeze, dijalize i afinitetne hromatografije, pri čemu je afinitetna hromatografija tipična tehnika prečišćavanja. Pogodnost proteina A kao afinitetnog liganda zavisi od vrste i izotipa bilo kog Fc domena imunoglobulina koji je prisutan u antitelu. Protein A se može koristiti za prečišćavanje antitela koja su zasnovana na teškim lancima gama1, gama2, ili gama4 (videti, npr. Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth.62:1-13). Protein G se preporučuje za sve izotipove miša i za humani gama3 (videti, npr., Guss et al., 1986 EMBO J.5:1567-1575). Matrica za koju je vezan afinitetni ligand najčešće je agaroza, ali su dostupne i druge matrice. Mehanički stabilne matrice kao što su staklo sa kontrolisanim porama ili poli(stirendivinil)benzen omogućavaju brži protok i kraće vreme obrade nego što se može postići sa agarozom. Tamo gde antitelo sadrži CH3domen, Bakerbond ABX™ smola (J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.) je korisna za prečišćavanje. Druge tehnike za prečišćavanje proteina kao što su frakcionisanje na koloni sa jonoizmenjivačkim izmenama, taloženje etanolom, HPLC reverzne faze, hromatografija na silicijum dioksidu, hromatografija na heparinu SEPHAROSE™ hromatografija na smoli za razmenu anjona ili katjona (kao što je kolona poliasparaginske kiseline), hromatofokusiranje, SDS-PAGE i taloženje amonijum sulfatom su takođe dostupni u zavisnosti od antitela koje treba da se dobije.

[00220] Nakon bilo kog(ih) preliminarnog(ih) koraka(a) prečišćavanja, smeša koja se sastoji od antitela od interesa i zagađivača može biti podvrgnuta hromatografiji hidrofobne interakcije sa niskim pH korišćenjem pufera za eluiranje na pH između oko 2.5-4.5, koji se obično izvodi pri niskim koncentracijama soli ( npr. od oko 0-0.25 M soli).

[00221] Takođe su uključene nukleinske kiseline koje se hibridizuju pod uslovima niske, umerene i visoke strogosti, posebno pod uslovima visoke strogosti, kao što je ovde definisano, sa celom ili delom (npr., delom koji kodira varijabilni region) nukleotidne sekvence predstavljen izolovanim polinukleotidnim sekvencama koje kodiraju anti-PD-1 antitelo ili fragment antitela. Hibridizujući deo hibridizirajuće nukleinske kiseline je obično

2

dugačak najmanje 15 (npr.20, 25, 30 ili 50) nukleotida. Hibridizujući deo hibridizujuće nukleinske kiseline je najmanje 80 %, npr., najmanje 90 %, najmanje 95 %, ili najmanje 98 %, identičan je sekvenci dela ili cele nukleinske kiseline koja kodira anti-PD-1 polipeptid (npr. varijabilni region teškog ili lakog lanca), ili njegov komplement. Hibridizirajuće nukleinske kiseline tipa opisanog ovde mogu se koristiti, na primer, kao sonda za kloniranje, prajmer, npr., PCR prajmer ili dijagnostička sonda. U jednom aspektu, "uslovi visoke strogosti" znači za sonde dužine najmanje 100 nukleotida, prehibridizaciju i hibridizaciju na 42°C u 5 x SSPE, 0.3 % SDS, 200 mikrograma/ml strižene i denaturisane DNK sperme lososa, i 50 % formamida, prateći standardne Southern blotting procedure za 12 do 24 sata. Materijal nosača je na kraju ispran tri puta po 15 minuta korišćenjem 0.2 x SSC, 0.2 % SDS na 65°C.

[00222] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 108 do 123.

[00223] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 92 do 107.

[00224] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od SEQ NO: 131, SEQ NO: 133, SEQ NO: 135, SEQ NO: 137 ili SEK BR: 139.

[00225] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu bilo koje od SEQ NO: 130, SEK BR: 132, SEK BR: 134, SEQ NO: 136 ili SEQ NO: 138.

[00226] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ NO: 125, SEQ NO: 127 ili SEQ NO: 129.

[00227] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu bilo koje od SEQ NO: 124, SEQ NO: 126 ili SEQ NO: 128.

[00228] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ NO: 143, SEQ NO: 147, SEQ NO: 149, SEQ NO: 153 ili SEQ NO: 155.

[00229] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu bilo koje od SEQ NO: 142, SEQ NO: 146, SEQ NO: 148, SEQ NO: 152 ili SEQ NO: 154.

[00230] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ NO: 141, SEQ NO: 145 ili SEQ NO: 151.

[00231] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu bilo koje od SEQ NO: 140, SEQ NO: 144 ili SEQ NO: 150.

[00232] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ NO: 159, SEQ NO: 161 ili SEQ NO: 163.

[00233] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu bilo koje od SEQ NO: 158, SEQ NO: 160 ili SEQ NO: 162.

[00234] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ NO: 157.

[00235] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ NO: 156.

[00236] Proizvodni Predmet

[00237] U drugom aspektu, uključen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje gore opisanih poremećaja. Proizvodni predmet se sastoji od posude i etikete. Odgovarajuća posuda uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve i epruvete. Posude mogu biti formirane od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Posuda sadrži kompoziciju koja je efikasna za lečenje stanja i može imati sterilni pristupni otvor. Na primer, posuda može biti kesica za intravenski rastvor ili bočica koja ima čep koji se može probiti iglom za hipodermičku injekciju. Aktivni agens u kompoziciji je anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen. Oznaka na ili povezana sa posudom označava da se kompozicija koristi za lečenje stanja po izboru. Proizvodni predmet može dalje da sadrži drugu posudu koja sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Dalje može uključivati druge materijale poželjne sa

4

komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle, špriceve i umetke za pakovanja sa uputstvima za upotrebu.

[00238] Pronalazak je dalje opisan u sledećim primerima.

[00239] PRIMERI

[00240] Primer 1: Generisanje antitela (imunizacija)

Miševi soja MHC tipa A, C, D, E, H, G su imunizovani rekombinantnim monomernim humanim PD-1 ili humanim PD-1 -humanFc-His proteinom. Simbol gena za ovaj rekombinantni protein je PDCD1, a GenelD je 5133. Serologija je zatim procenjena protočnom citometrijom korišćenjem CHO-humanih PD-1 ćelija, eksprimirajući humani PD-1 antigen za vezivanje. Odabrani serološki pozitivni miševi dobili su poslednji podsticaj pre izolacije B-ćelija. Svi odabrani miševi su pokazali pozitivne titre antitela u serumu. Na pozitivnoj serologiji, splenociti su sakupljeni za oporavak B-ćelija specifičnih za antigen. Sve procedure su sprovedene u skladu sa protokolom koji je odobrio IACUC (Institucionalni komitet za negu i upotrebu životinja).

[00241] Primer 2: Proizvodnja Humanizovanih Anti-PD-1 Antitela

Mišje označeno antitelo 723C2 je konvertovano u himerna antitela koja se sastoje od varijabilnog domena miša 723C2 i humanog konstantnog IgG1WT, IgG1KO ili lgG4Pro domena. Sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (Vț) antitela 723C2 miša i varijabilnog regiona teškog lanca (VH) prikazane su u Tabelama 1 i 2 iznad. lgG4Pro ima jednu zamensku mutaciju (Ser228Pro) koja sprečava razmenu Fab-ruka. IgG1KO ima dve mutacije u predelu šarke, Leu234Ala i Leu235Ala, za smanjenje efektorske funkcije (ADCC). Himerna antitela se stvaraju kako bi se potvrdila funkcija antitela i kako bi se obezbedila tačna sekvenca. Sekvence himernog 723C2 u humanim IgG1WT, lgG1KO i lgG4Pro formatima prikazane su u Tabeli 8. Himerni 723C2 u humanim IgG1WT i lgG4Pro sadrži mutaciju u H-CDR3, DC do DY. Međutim, himerni 723C2 u ljudskom IgG1KO nema mutaciju. Mutacija na ovom mestu je istaknuta u Tabeli 8. Varijabilni region antitela se zatim humanizuje kroz proces dizajna i skrininga. Napravljena je biblioteka u kojoj su humani i mišji ostaci varirali na takav način da u bilo kojoj poziciji može biti ili humani ili mišji ostatak. Takva biblioteka je napravljena za one aminokiseline koje su se razlikovale između humanih zametnih linija i mišjih antitela. Odabrani su samo klonovi koji zadržavaju funkciju roditeljskog mišjeg antitela. Reprezentativni humanizovani varijabilni regioni za antitelo 723C2 su prikazani u Tabelama 5 i 6.

Na ovaj način, Antitelo A, Antitelo B, Antitelo C, Antitelo D i Antitelo E su humanizovana antitela izvedena iz mišjeg antitela 723C2 (klonirana u humani lgG4Pro/kapa osnova). Antitela A, B, C, D i E su prikazana u Tabeli 7.

[00242] Primer 3: Vezivanje antitela za rekombinantni PD-1 protein

A) Kinetika i afinitet himernih anti-PD-1 antitela u vezivanju za osnovu humanog lgG4Pro za rekombinantni humani PD-1 prikazani su u nastavku (Tabela 9). Kinetika i afiniteti vezivanja su izmereni korišćenjem ProteOn XPR36 (Biorad, Hercules, CA) korišćenjem materijala dobijenog prolaznom transfekcijom nakon prečišćavanja u jednoj koloni.

Tabela 9

B) Afiniteti su izmereni za humanizovana anti-PD-1 antitela izvedena iz mišjeg antitela 723C2. Podaci o kinetičkom vezivanju, mereni korišćenjem ProteOn XPR36 (Biorad, Hercules, CA) i globalno prilagođeni modelu vezivanja 1:1, pokazali su da su interakcije sa rekombinantnim humanim PD-1 u opsegu od 1 nM ~ 10 nM (Tabela 10 ). Antitelo PD1AB-6-4P (antitelo u osnovi lgG4Pro otkriveni u WO 2017/058859 za Celgene) je takođe testirano.

Tabela 10

C) Afinitet i kinetički podaci za anti-PD-1 antitela koja se vezuju za cinomologni PD-1 su izmereni na ProteOn XPR36 i globalno prilagođeni modelu vezivanja 1:1 (Tabela 11).

Antitelo, PD1AB-6-4P je takođe testirano.

Tabela 11

D) Molekularna selektivnost za humani PD-1

Selektivnost anti-PD-1 antitela za humani PD-1 protein u testu zasnovanom na ćelijama procenjena je protočnom citometrijom. Roditeljske Jurkat ćelije koje ne eksprimiraju humani PD-1 protein ili Jurkat ćelije koje eksprimiraju humani PD-1 protein su inkubirane sa anti-PD-1 antitelom obeleženim sa AlexaFluor 647 u koncentracijama navedenim u nastavku. Kao kontrola, roditeljske i PD-1 eksprimirajuće Jurkat ćelije su inkubirane sa anti-TNP izotip kontrolnim antitelima. Posle inkubacije, ćelije su isprane kako bi se uklonilo nevezano antitelo, fiksirano u PFA, a zatim isprano u puferu za bojenje. Vezivanje antitela za ćelije Jurkat je procenjeno protočnom citometrijom. Neobojene ćelije su takođe procenjene protočnom citometrijom kao negativna kontrola. Anti-PD-1 antitelo se selektivno vezuje za humani PD-1 do najmanje 1 mikromolar, na šta ukazuje dozno-zavisno vezivanje antitela za Jurkat ćelije koje eksprimiraju humani PD-1 protein i nedostatak vezivanja AlexaFluor 647 obeleženih anti-PD-1 antitela na roditeljske Jurkat ćelije kojima nedostaje ekspresija PD-1. Rezultati reprezentativnog eksperimenta korišćenjem Antitela C (Ab C) su prikazani na Slici 1.

Primer 4: Konkurentni Test vezivanja humanog PD-1-Fc za humani PD-L1-Fc Humani PD-L1-Fc je amin spojen na kanale 1-3 GLM čipa na BioRad ProteOn XPR36 instrumentu u koncentraciji od 60 µg/mL; tri test antitela, Antitelo C, MK-3475 (pembrolizumab) i PD1AB-6-4P su amini spojeni na kanale 4, 5 i 6, respektivno, pri 30 µg/mL. Humani PD1-Fc je ubrizgan preko kanala 1-6 na površini čipa u koncentraciji od 25 nM. Senzorgram ukazuje na specifično vezivanje između PD-L1 i PD-1 receptora (Slika 2A).

500 nM Antitela C, MK-3475 i PD1AB-6-4P su prethodno pomešani sa 25 nM PD1-Fc i ubrizgani kao analit kroz sve kanale na čipu kako bi se procenilo da li pojedina antitela inhibiraju vezivanje PD-L1 za PD- 1. I Antitelo C i PD1AB-6-4P nisu konkurentni PD-L1 za vezivanje za PD-1 antigen kao što je pokazano senzorgramima. MK-3475 i PD-L1 su potencijalni blokatori vezivanja jedan drugog sa PD-1 na osnovu nevezujućih senzorgrama uočenih u testu konkurencije (Slika 2B).

Primer 5. Pojačano vezivanje PD-L1 za PD-1 u prisustvu anti-PD-1 agonista antitela Interakcije PD-1/PD-L1 su ispitivane u prisustvu PD-1 agonističkog antitela 723C2 u humanoj osnovi lgG4Pro bez mutacije DC do DYu H-CDR3. Višestruki testovi su korišćeni kako bi se pokazalo da antitelo 723C2 pojačava vezivanje PD-L1 za PD-1. Biohemijski test zasnovan na ELISA testu je korišćen za procenu vezivanja PD-1 za PD-L1 vezan za ploču (BPS Bioscience). Bele mikroploče sa 96 bunarčLća su obložene sa 50 µl PD-L1 pri 2 µg/ml u PBS preko noći na 4°C. Supernatanti su uklonjeni i ploče su isprane tri puta sa 1X imunopuferom koji je obezbedio proizvođDč BPS Bioscience (Cat# 72005), nakon čega je usledilo blokiranje puferom za blokiranje tokom jednog sata na sobnoj temperaturi (RT). Dodata su antitela, zajedno sa relevantnim kontrolama, a zatim PD-1 biotin u količini od 0.5 ng/ml (10 ng) tokom dva sata na sobnoj temperaturi. Ploče su blokirane puferom za blokiranje tokom 10 minuta. Sekundarno antitelo na streptavidin peroksidazu rena je dodato u isprane ploče tokom jednog sata, nakon čega je usledilo ispiranje puferom za ispitivanje PD-1. Ploče su bile blokirane 10 minuta. Hemiluminiscentna mešavina supstrata je dodata na ploču neposredno pre čitanja. Hemiluminiscentni signal je očitan na luminometru (Envision) ili na mikrotitarskoj ploči koja je sposobna da očita hemiluminiscenciju.

Uočene su pojačane interakcije PD-1 sa PD-L1 u prisustvu antitela 723C2, na šta ukazuje povećan signal hemiluminiscencije u poređenju sa uzorcima tretiranim kontrolnom izotipom (Slika 3A). Antitelo 723C2 je označeno kao 723C2-4P na Slici 3A. Ovo je u suprotnosti sa MK3475, poznatim anti-PD-1 antagonističkim antitelom, koje je blokiralo interakciju PD-L1 -PD-1. Antitelo PD1AB-6-4P pokazalo je ograničeno poboljšanje PD-1 - PD-L1 u ovom testu (Slika 3A).

Ispitivanje zasnovano na ćelijama je korišćeno da se potvrdi rezultati zasnovani na ELISA testu koji pokazuju poboljšanje interakcija PD-1/PD-L1 u prisustvu antitela 723C2. Ovde je interakcija PD-1/PD-L1 procenjena merenjem vezivanja rastvorljivog PD-1 za CHO ćelije koje prekomerno eksprimiraju PD-1 sa DELFIA (imunoesej fluorescencije lantanida sa pojačanom disocijacijom) testom vezivanja receptor-ligand (Perkin Elmer).

10.000 ćelija je postavljeno na pločice i inkubirano preko noći na 37°C 5% CO2 inkubator (vlažni inkubator). Biotinom obeležen PD-L1 EC 10 (130 nM) i 10 µl PD-1 antitela su dodati u svaki bunarčLć i inkubirani na sobnoj temperaturi 1 sat. Ploče su dva puta isprane sa 50 µl 1X TRF pufera za ispiranje.20 µL reagensa Eu-Streptavidin je dodato na ploču za ispitivanje i inkubirano na sobnoj temperaturi jedan sat. Dodat je rastvor za poboljšanje i inkubiran 30 minuta na RT. Ploče su očitane na čitaču fluorescentnih ploča (Ekscitacija: 320 ili 340 nm, emisija: 615 nm). U ovom testu, i kao potvrda ELISA testa, prisustvo antitela 723C2 u ovom testu zasnovanom na ćelijama pojačalo je interakcije PD-1/PD-L1 (Slika 3B). Antitelo 723C2 je označeno kao 723C2-4P na Slici 3B.

Drugi test zasnovan na ćelijama gde je PD-1 eksprimiran na CHO ćelijama je takođe korišćen za procenu interakcija PD-1/PD-L1. U ovom testu, vezivanje PD-L1-multimera za CHO ćelije koje eksprimiraju PD-1 mereno je protočnom citometrijom.50 µl 2 x 106 ćelija/ml je dodato u svaki bunarčLć (100,000 ćelija/bunarčLć). ûelije su centrifugirane i ponovo suspendovane u 50 µl naznačenih koncentracija antitela i inkubirane 60 minuta na ledu. PDL1-biotin i Streptavidin-APC su kombinovani u puferu za bojenje (1 µg/ml PDL1-biotin 0.25 µg/ml Streptavidin-APC). Dodato 50 µl 2X PDL1-biotin/streptavidin-APC smeše u ćelije i inkubirajte na ledu 60 minuta. ûelije su isprane i resuspendovane u 180 µl pufera za bojenje 20 µ PFA i podaci su dobijeni na BD LSR II. Kao što je prikazano na Slici 3C, ovaj test zasnovan na ćelijama je takođe pokazao pojačano vezivanje PD-L1 za PD-1 u prisustvu antitela 723C2. Antitelo PD1AB-6-4P nije imalo uticaja na vezivanje PD-L1, dok je antitelo antagonista MK3475 inhibirala vezivanje PD-L1 za PD-1 (Slika 3C). Antitelo 723C2 je označeno kao 723C2-4P na Slici 3C.

CHO PD-1 - PD-L1 Delphia-Eu TRF test kao što je gore opisano je takođe izveden sa Antitelom C, antitelom PD1AB-6-4P, Antitelom 1-4Pro, antitelom PD1B1090-4Pro, antitelom PD1B1094-4Pro i antitelom ANB-030 -4Pro. Antitelo 1-4Pro obuhvata varijabilne regione teškog i lakog lanca antitela 1 opisanog u WO 2019/168745 za Eli Lilly, u lgG4-Pro osnovi. Antitelo PD1B1090-4Pro i antitelo PD1B1094-4Pro obuhvataju varijabilne regione teškog i lakog lanca PD1B1090 i PD1B1094, respektivno, opisane u WO 2018/226580 za Janssen Biotech, u osnovi lgG4-Pro. Antitelo ANB-030-4Pro obuhvata varijabilne regione teškog i lakog lanca antitela ANB-030, opisanih pod CAS brojem CAS 2412764-40-8 u osnovi lgG4-Pro (takođe odgovara varijabilnim regionima teškog lanca i lakog lanca APE12537, opisan u WO 2020/247648 za Anaptisbio). Uključeno je i anti-TNP antitelo u osnovi lgG4-Pro.

Antitelo C je pokazalo konzistentno (N=3) poboljšanje vezivanja PD-1\PDL-1 na način koji zavisi od koncentracije (Slika 3D). Svi drugi agonisti anti-PD-1 dosledno nisu pokazivali poboljšanje vezivanja PD-1\PDL-1 (Slika 3D).

Primer 6: Testovi funkcionalnih ćelija, inhibicija aktivacije NFAT u testu reportera agonista THP-1/Jurkat-PD-1

Razvijen je THP-1/Jurkat PD1 NFAT test ko-kulture kako bi se procenila agonistička aktivnost anti-PD1 antitela generisanih iz više kampanja. ûelijska linija THP-1 je dobijena od ATCC. Jurkat reporterska ćelijska linija je generisana interno. Jurkat reporterske ćelije prekomerno eksprimiraju humani PD-1 (hPD-1) na površini ćelije i takođe eksprimiraju reporter luciferaze vođen NFAT za merenje statusa aktivacije ćelija kao odgovor na stimulaciju. Jurkat PD1 NFAT ćelije se aktiviraju sa CD3xCD33 BiTE u prisustvu THP-1 ćelija. Anti-CD33 krak BiTE vezuje CD33 eksprimiran na THP-1 ćelijama, dok anti-CD3 krak vezuje CD3 molekul na Jurkat ćelijama. BiTE služi da angažuje THP-1 i Jurkat ćelije što dovodi do formiranja imunske sinapse između dve ćelije dok aktivira Jurkat ćelije. Aktivacija Jurkat PD-1 NFAT ćelija se meri pomoću reportera luciferaze koji pokreće NFAT. Ovaj test je sproveden u prisustvu anti-PD1 antitela da bi se identifikovala agonistička antitela.

Molekuli koji su pokazali smanjenje aktivacije od 20% ili više, na šta ukazuje gubitak signala luciferaze, klasifikovani su kao agonistička antitela (Tabela 12). Anti-PD-1 antitela 306E6 do 820C3 u Tabeli 12 bila su na lgG1 osnovii miša. Nekoliko od ovih antitela je odabrano za dodatno profilisanje na osnovi humanog lgG4Pro (označeno kao himerna antitela u Tabeli 12).

Tabela 12

Primer 7: Funkcionalni ćelijski testovi - Inhibicija proizvodnje IFNȖ iz humanih PD-1 knockin splenocita

Primarni test ćelija koji je korišćen za odabir najboljih anti-PD1 antitela bio je hPD1 knock-in test mišjih splenocita. Slezine su sakupljene od C57BL/6 miševa koji eksprimiraju humani PD1 umesto mišjeg PD1. Splenociti su izolovani iz slezine i aktivirani anti-CD3 (klon 2C11) u koncentraciji od 0.1 µg/ml. Aktivacija T ćelija je merena nakon 48 sati kvantitacijom nivoa mlFNȖ MSD analizom (Meso Scale Discoveri). Test je sproveden u prisustvu anti-PD1 antitela odabranih iz THP-1/Jurkat PD1 NFAT testa skrininga. Najveći molekuli identifikovani iz ovog testa su odabrani na osnovu % inhibicije mlFNȖ (50 % ili više) i klade sekvence. Vrednosti inhibicije i IC50 prikazane su u Tabeli 13.

Tabela 13

1

Primer 8: Testovi funkcionalnih ćelija, inhibicija proizvodnje IFNȖ iz humanog PBMC testa

Anti-PD-1 agonistična antitela su dalje okarakterisana po njihovoj sposobnosti da modulišu funkcionalnu aktivnost T ćelija, mereno proizvodnjom IFNȖ, u testu humanih primarnih ćelija. PBMC su izolovani iz ljudske pune krvi i aktivirani sa 1.5 pM anti-CD3 (klon OKT3, BioLegend). Aktivacija i funkcija T ćelija je procenjena nakon 72 sata kvantifikacijom nivoa hlFNȖ MSD analizom. Identifikovana anti-PD-1 agonist antitela su bila u stanju da smanje sekreciju IFNȖ u poređenju sa ćelijama tretiranim kontrolnim izotipom (Tabela 14A).

Tabela 14A

Antitelo C, antitelo 1-4Pro, antitelo PD1B1090-4Pro, antitelo PD1B1094-4Pro, antitelo ANB-030-4Pro i abatacept su takođe testirani u ovom testu. Rezultati su prikazani u Tabeli 14B. Antitelo C, varijabilni regioni antitela 1-4Pro, antitela PD1B1090-4Pro, antitela PD1B1094-4Pro i antitela ANB-030-4Pro u osnovi divljeg tipa lgG1 i u osnovi lgG1 KO, i abatacept su takođe testirani u ovom testu . Rezultati su prikazani u Tabeli 14C koja je sažeta u nastavku. U svakom eksperimentu testirano je pet donora.

2

Tabela 14B

Tabela 14C

Inhibicija IFNȖ za varijabilne regione antitela 1-4Pro, antitela PD1B1090-4Pro, antitela PD1B1094-4Pro i antitela ANB-030-4Pro u osnovi lgG1 KO bila je manja od 40 % sa vrednostima IC50iznad 30 nM.

Primer 9: Funkcionalni testovi ćelija, inhibicija proizvodnje IL-17A iz Th17-monocitnog testa istoimene kulture

Anti-PD-1 agonista antitela su testirana na funkcionalnu inhibiciju sekrecije IL-17 pomoću Th17 diferenciranih T ćelija. Razvijen je primarni test istoimenih kultura ćelija kako bi se procenila modulacija IL-17 pomoću PD-1. Humane primarne T ćelije izolovane iz PBMC su Th17-diferencirane pod sledećim iskrivljenim uslovima: CD4 T ćelije su stimulisane sa 0.5 µg/ml anti-CD3 vezanim za ploču (klon UCHT1) tokom 4 dana u Th17 iskrivljenom medijumu (medij X-VIV015 IL-1ȕ (10 ng/mL), IL-23 (10 ng/mL), IL-6 (10 ng/mL), IL-2 (2 ng/mL), TGFȕ (0.5 ng/mL), 5 µg/mL anti-IL4, 5 µg/mL anti-IFNȖ). Posle 4 dana, ćelije su uklonjene sa ploča obloženih anti-CD3 i prebačene u boce koje sadrže Th17 iskrivljeni medijum. Posle diferencijacije, Th17 ćelije su mirovane najmanje 3 dana, zatim su kultivisane sa autolognim monocitima i ponovo stimulisane sa 40 fM anti-CD3 (klon OKT3) u prisustvu PD-1 antitela.

Sistem istoimene kulture je bio neophodan zbog Fc zahteva neophodnih da anti-PD-1 antitela pokažu agonističku aktivnost. U ovom testu primećena je inhibicija IL-17 u prisustvu anti-PD-1 agonističkih antitela. IC50antitela i maksimalna inhibicija IL-17 odgovora su prikazani u tabeli ispod (Tabela 15). Maksimalna inhibicija je upoređena u odnosu na kontrolno antitelo izotipa.

Tabela 15

Primer 10: Funkcionalni testovi ćelija, inhibicija proizvodnje IL-21 iz testa istoimene kulture Tfh-monocita

Razvijen je test za procenu sposobnosti anti-PD-1 agonističkih antitela da inhibiraju aktivnost T folikularnih pomoćnih (Tfh) ćelija in vitro. CD4 T ćelije i autologni monociti su dobijeni iz ALLCELLS. T ćelije su iskrivljene prema Tfh liniji aktiviranjem ćelija sa Dinabeads humanim T-aktivatorom CD3/CD28 (Gibco) u prisustvu IL-23 (25 ng/ml) i TGFp (5 ng/ml) tokom 5 dana, a zatim u kombinaciji sa autolognim monocitima u prisustvu 4.5 pM anti-CD3 (klon OKT3, BioLegend) i anti-PD-1 agonista antitela nakon što su ćelije isprane i aktivacione kuglice uklonjene.24 sata kasnije, supernatanti su sakupljeni i ispitani na prisustvo IL-21 (Meso Scale Discoveri, MSD V-Plex Human IL-21 Kit). Proizvodnja IL-21 restimulisanih Tfhdiferenciranih ćelija je inhibirana sa anti-PD-1 agonist antitelima. Reprezentativne vrednosti IC50 i Emax inhibicije su prikazane u Tabeli 16.

Tabela 16

4

Primer 11: Uloga FcgR interakcija na aktivnost agonista PD-1

Uloga interakcija Fc-Fcg receptora na funkcionalnu aktivnost agonističkih antitela je okarakterisana korišćenjem kandidatskih anti PD-1 agonističkih antitela na različitim formatima osnove (lgG1 divlji tip, lgG1 KO ili lgG4 Pro) ili fragmenata dvovalentnih antitela (F(ab') 2 fragmenta). Funkcionalna aktivnost varijanti antitela je procenjena sposobnošću modulacije proizvodnje IFNȖ iz aktiviranih T ćelija u humanom PBMC testu opisanom iznad. Aktivnost funkcionalnog agoniste, merena smanjenjem proizvodnje IFNȖ, gubi se sa dvovalentnim F(ab')2 fragmentima roditeljskih 723C2 i 820C3 antitela (Slike 4A i 4B).

Nasuprot tome, antitelo pune dužine u humanoj lgG4Pro osnovi inhibira proizvodnju IFNȖ na način zavisan od doze (Slike 4A i 4B, označene kao 723C2-4P i 820C3-4P, respektivno). U ovim testovima, humani PBMC su izolovani iz pune krvi i aktivirani sa 1.5 pM anti-CD3 klona OKT3 u prisustvu anti-PD-1 antitela ili F(ab')2 fragmenta naznačenog anti-PD-1 antitelo. Posle 72 sata, nivoi humanog IFN gama citokina u supernatantu su mereni MSD analizom.

Kako ovo sugeriše da su Fc interakcije potrebne za funkcionalnu agonističku aktivnost anti-PD-1 antitela, 723C2 antitelo je generisano na IgG1WT, IgG1KO i lgG4Pro okosnicama kako bi se dalje karakterisale ove interakcije (723-lgG1 WT, 723-lgG1 KO i 723-lgG4Pro, respektivno, u Tabeli 17 ispod). I lgG1 WT i lgG4 Pro se vezuju za humane Fc receptore u različitom stepenu, dok osnova lgG1 KO ima znatno smanjeno vezivanje za Fc receptore. Anti-PD-1 agonističko antitelo na lgG4 Pro pokazalo je najveći stepen inhibicije IFNȖ u humanom PBMC testu, dok je antitelo na lgG1 KO pokazalo značajno smanjenu aktivnost (Tabela 17). Zajedno, ovi podaci ukazuju na to da funkcionalni agonizam anti-PD-1 antitela zavisi od Fc interakcija.

Tabela 17

Primer 12: In vivo model - ksenogeni CD4<+>T ćelija GvHD modela

In vivo ksenogeni CD4<+>T ćelijski GvHD model miša je korišćen za testiranje efikasnosti antitela agonista PD-1. Osam NSG miševa po grupi (NOD.Cg-Prkdc<scid>ll2rg<tmwjl>/SzJ, The Jackson Laboratory) je ubrizgano IV sa 5 x 10<6>CD4<+>T ćelija (prečišćenih negativnom selekcijom) iz leukopaka zdravih donora. Miševi su dozirani dva puta nedeljno po 0.625 mg/kg IP prema sledećem; Grupa 1: 723 (lgG4-Pro), Grupa 2: PD1AB-6-4P (lgG4-Pro), Grupa 3: anti-TNP izotip (lgG4-Pro), Grupa 4: Avelumab (hlgG1-LALAPG), Grupa 5: anti-TNP izotip (hlgG1-LALAPG), grupa 6: CTLA4-lg (hlgG1-LALA). TNP je trinitrofenol. LALA predstavlja mutacije Leu234Ala/Leu235Ala koje se obično koriste za ometanje efektorske funkcije antitela. PG predstavlja mutaciju Pro329Gli, koja eliminiše efektorsku funkciju sprečavanjem vezivanja za Fc gama receptore.

Izvedena su tri eksperimentalna ponavljanja, svaka sa jedinstvenim donatorom. Do četvrte nedelje, primećena je značajna inhibicija akumulacije humanih ćelija u grupama 1, 2 i 6 u poređenju sa njihovim kontrolama koje se podudaraju sa izotipovima za sve testirane donore (Tabela 18). Kvantifikacija inflamatornih citokina u četvrtoj nedelji pokazala je značajno smanjenje nivoa humanog IFNȖ, TNFĮ i IL-10 kod svih donatora (Tabela 19). Humani IL-1ȕ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12p70 i IL-13 su takođe testirani, ali su svi bili ispod granice detekcije za test.

TABELA 18: AKUMULACIJA HUMANIH CD45<+>ûELIJA

TABELA 19: PROIZVODNJA HUMANOG PLAZMA CITOKINA

Primer 13: Farmakokinetičke studije kod Cinomolgus majmuna

Farmakokinetika (PK) antitela C je procenjena kod mužjaka cinomolgus majmuna kineskog porekla nakon jedne intravenske (IV) bolus doze od 0,1, 0,3 i 1,5 mg/kg ili subkutane (SC) doze od 1,5 mg/kg (n=3 po grupa). Koncentracije antitela C u serumu određivane su korišÉenjem dva različita formata MSD imunoeseja: (1) „totalni” generički test za hvatanje i detekciju leka i (2) test „besplatnog” leka sa hvatanjem antigena (PD1-ECD) i anti - otkrivanje ljudi. PK profili oba eseja su se preklapali, što sugeriše da endogeni sPD-1 nije ometao merenje antitela C i da je imao mali ili nikakav uticaj na TMDD. Antitelo C je pokazalo CL zavisan od doze (koristeÉi i slobodne i "totalne" analize), između 0,1 i 0,3 mg/kg što ukazuje na doprinos ciljanoj dispoziciji leka (TMDD) ukupnom klirensu. Rezime farmakokinetičkih parametara NCA za svaku od odgovarajuÉih doza je prikazan u Tabeli 20 ispod.

Tabela 20

Primer 14: Transfekcija i proizvodnja u CHO Éelijama i biofizički podaci

Transfekcija i proizvodnja u CHO Éelijama:

CHO-E Éelije su transfektovane pri ~ 2 x 10E6 Éelija/mL u Irvine BalanCD Transfectori CHO 4mM L-glutamin (ili Glutamax). Potrebne količine za transfekciju od 1L su 0.15 mg HC DNK plus 0.3 mg LC DNK i 1.05 mg DNK punila (sperma haringe) i 0.15 mg XBP1 DNK. DNK je razblažena u 100 ml OptiPro SFM i sterilno filtrirana kroz filter od 0.2 µm filtera. 0.75 mL Mirus TransIT Pro reagensa za transfekciju je dodato u razblaženu DNK smešu i DNK kompleks je odmah dodat pripremljenim CHOE Éelijama, a boca za muÉkanje je vraÉena u šejker na 37°C, 5 % CO2 na 140 o/min.24 sata nakon transfekcije, temperatura je pomerena na 32°C, 2 ml Gibco agensa protiv zgrušavanja i 100ml Irvine Transfectori Supplementa je dodato u transfektovane Éelije. Pet dana posle transfekcije temperatura šejkera se pomera na 30°C.200 mL Irvine Transfectori Supplementa je dodato između 5. ili 7. dana, u zavisnosti od toga kada nivo glukoze padne između 2 g/L - 1g/L. Transficirane kulture su držane 10 dana. Žetva se vrši centrifugiranjem Éelija, nakon čega sledi sterilna filtracija kroz 0.2 µm PES filter (Thermo Scientific). Nakon žetve, bistreni supernatanti Éelijske kulture su uzorkovani za titar pomoÉu ForteBio/Pall Octet Red 96 instrumenta sa biosenzorima za protein A, kako sledi.

Titri za Antitelo A, Antitelo C i Antitelo E bili su između 18-38 mg/L, sa oko 80 % oporavka od prečišÉavanja proteina, i više od 98 % monomera nakon SEC prečišÉavanja. Proteini su zamenjeni puferom u konačnom puferu koji sadrži 10 mM histidin-HCl, pH 6.0 i stabilni su na 4°C najmanje 4 meseca i sa rastvorljivošÉu do 180 mg/ml u ovom puferu.

Tabela 21

Tabela 22

AUC: analitičko ultracentrifugiranje mereno metodom brzine sedimentacije pri koncentracijama od 0.5 -1 mg/ml; SEC: hromatografija isključenja veličine; % M: procenat monomera.

Primer 15: Bi-specifična antitela

Materijali i metode

Mišja antitela i reagensi. anti-hPD1 (EH12.2H7) (Biolegend, 329912); Anti-hCD48 (Biogems, 10511-25-500); lgG1 (cat#16-4714-85), anti-hCD3 (OKT3) (16-0037-85), anti-hCD3 (UCHT1) (16-0038-85) i anti-CD11a (140011982) iz eBiosciences; anti-hCD71 (Southern Biotech, 9670-14). aCD3/aCD28 humani aktivator T-ćelija Dinabeads (Gibco, 11131D) Imagestream. Jurkat PD-1 ćelije su inkubirane u medijumu XVIVO 15 (Lonza) na ledu 10 minuta sa AF-488 toksinom kolere (Life Technologies, V-34403) i antitelom za umrežavanje (Jackson ImmunoResearch) i APC aCD3 (Biolegend, 317), PV786 aPD-1 (Biolegend, 329930) ili APC aCD48 (Sigma, SAB4700193). ûelije su aktivirane transferom u prethodno zagrejanom X-VIVO 15 i ostavljene da se inkubiraju dodatnih 12 minuta. Aktivacija ćelija je zaustavljena dodavanjem hladnog PBS-2% PFA (približno 1:10 odnos, ćelije:PFA), a ćelije su inkubirane u rastvoru za fiksiranje 20 minuta na ledu. ûelije su isprane i resuspendovane u XVIVO i analizirane na formiranje kapice i perimetarski prag korišćenjem softvera Imagestream.

Protoþna citometrija.1 x 10<5>Jurkat, Jurkat-PD-1 ili aCD3/aCD28 stimulisane primarne humane T ćelije su inkubirane 1 sat na 4°C sa 1 mg/ml primarnih MAbs, ili gde su testirani bispecifični molekuli, generisane su krive vezivanja u 8 tačaka iz početnu koncentraciju od 6.25 mg/ml i serijski razblažen 1:4. ûelije su isprane i obojene 1 sat na 4°C sa 1:100 razblaženjem PE-anti-mišjeg Ig (Life Technologies, P852), ili 1:800 razblaženjem PE-kozjeg anti-humanog F(ab')2 ( Invitrogen AHI1707), respektivno. Uzorci su oprani, fiksirani u 1x puferu za fiksiranje/lizu (eBioscience, 00-5333-57) i analizirani na LSR2 (BD)

PD-1 komplementarni test.2 x 10<4>Jurkat T ćelije koje prekomerno eksprimiraju PD-1-PK pune dužine i intracelularne SHP1-EA fuzione proteine pune dužine kupljene su od DiscoverX (DRX-BI-080515A) i kultivisane prema opisu proizvođDča. ûelije su resuspendovane u medijumu za oblaganje ćelija (DiscoverX, 93-0563R4B) i prethodno inkubirane sa primarnim mišjim ili humanim antitelima na 4°C tokom 30 minuta. U zavisnosti od eksperimenta, ćelije su dodatno prethodno inkubirane sa 10 mM inhibitora pan-Src kinaze PP2 (Abeam, ab120308) ili neaktivnog analoga PP3 (Abeam, ab120617). ûelije su isprane i tretirane sa ili bez umreženih sekundarnih kozjih anti-mišjih IgG (Thermo Scientific, 31170). ûelije su prebačene na 384-bele Opti-Plates (PerkinElmer), primljen je reagens za detekciju fleša (DiscoverX, 93-0247) i očitane u EnVision čitaču ploča (Perkin Elmer).

Primarna aktivacija huT üelija. Primarne humane Pan-T ćelije (AHCells, PB009-1F) su obeležene sa 500 nM ljubičaste ćelije u tragovima (Life technologi, cat#c34557). Epoksidinabeads M450 (Invitrogen, 14011) su kovalentno obložene sa 2.5 mg mišjih Abs/10<7>kuglica prema uputstvima proizvođDča. ûelije su ostavljene nestimulisane ili su stimulisane anti-CD3 (UCHT1) vezanim na ploči (250 i 500 ng/mL) u prisustvu epoksidnih perli obloženih Ab. ûelije su sakupljene nakon 96 h, obojene sa BV510 anti-CD4 (BD, 562970) i PeCi7 anti-CD8 (BD, 335787) Abs, a proliferacija ćelija je analizirana razblaženjem Cell Trace Violet u LSR2 (BD). CD4<+>/CD45RO<+>T ćelije primarne memorije (AHCells, PB009-7F) su stimulisane sa 1 mg/bunarčLću anti-CD3 vezanog na ploči (UCHT1) u prisustvu 1 mg/bunariću kontrolnog izotipa vezanog na ploči (ISO) ili BsAbs, respektivno. Supernanti kulture su sakupljeni 72h i analizirani za IL-2 i IL-10 sekreciju (MSD).

Dizajn BsAbs generacije i konstrukcije. Bi-specifična antitela (BsAbs) su generisana iz objavljenih anti-CD48 (US2012/0076790) i anti-PD1 (WO 2011/110621AI) sekvenci koje su korišćene kao gradivni blokovi. Bispecifični konstrukti su dizajnirani sa tehnologijom kvačica u rupu kako bi se olakšala heterodimerizacija dva različita ciljna varijabilna regiona (lgG1-KO) za generisanje BsAbs koji sadrže anti-PD-1 i anti-CD48 (PD-1/CD48) ili anti-PD -1 i anti-TNP kao kontrola (PD-1/ISO) (Slika 7A). Sekvence varijabilnog regiona dobijene za odgovarajuće mete su klonirane u pTT-5 (licenciran od Nacionalnog istraživačkog saveta Kanade) ekspresione vektore koji sadrže humane konstantne regione. Ukratko, aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona su optimizovane kodonima za ekspresiju sisara. Laki i teški lanci ciljanog V-gena su klonirani u isti ekspresioni vektor koji sadrži spojni vezni segment. Vektor je linearizovan digestijom restrikcionih enzima korišćenjem EcoRI i Nhel mesta za prepoznavanje. DNK sekvence za varijabilne regione naručene su kao G-blokovi (dsDNK) od Integrated DNK Technologies (IDTDNA) sa preklapajućim homolognim krajevima vektoru i susednim linker segmentom. G-blokovi su zatim spojeni Gibsonovom metodom sklapanja (NEBuilder HiFi kit, Nev England Biolabs, cat#E5510S) prema protokolu proizvođDča. Tradicionalno kloniranje je zatim završeno transformisanjem mešavine za sklapanje u kompetentne ćelije (NEB 5-alpha C2987, Nev England Biolabs) i zatim uzgajano preko noći na 37C na LB agar pločama sa 100 µg/ml karbenicilina (Teknova). Pojedinačne kolonije su sakupljene i uzgajane na 37C preko noći u LB medijumu sa karbenicilinom.

Pozitivni klonovi za insert su potvrđeni analizom sekvence korišćenjem softverskog paketa Lasergene (DNAstar). DNK plazmida potvrđena sekvencom je uvećana u 0.5L kulturama i zatim prečišćena preko Plasmid Plus megaprep kita (Kiagen, kat. br.12981) u skladu sa protokolom proizvođDča.

CHO-E Transient Transfection. CHO-E ćelije su transfektovane pri 2e6 ćelija/mL u FS-CHO sa dodatkom 2 mM glutamina. Za zapreminu transfekcije mAb od 1L, 1 mg DNK plazmida lakog lanca (LC) i 0.5mg DNK plazmida teškog lanca (HC) se razblaže u 100 mL OptiPro SFM (Gibco) i sterilno filtriraju kroz filter od 0.2 µ filtera (Millipore). Dodato je 1.5 mL transfekcionog reagensa TransIT Pro (Mirus Bio LLC) i ostavljeno da se inkubira 15-30 minuta na sobnoj temperaturi. Kompleks je zatim dodat u pripremljene CHO-E ćelije, a boca za mućkanje je vraćena na šejker.24 sata nakon transfekcije, 10 mL agensa protiv nakupljanja i 150 mL CHO CD Efficient Feed B (oboje iz Gibco) je dodato u transfektovane ćelije i temperatura je pomera na 32°C. Transfektovana kultura su održavane 6-12 dana i rutinski su praćene tokom cele kulture radi rasta ćelija, održivosti i potrošnje hranljivih materija. Sakupljanje kulture je završeno centrifugiranjem na 4700 obrtaja u minuti na 4°C, nakon čega je sledila sterilna filtracija.

BsAbs Preþišüavanje. Ubacite sakupljeni supernatant kulture na 1 ml HiTrap MabSelect SuRe kolone iz GE (Cat#11003493) prethodno ekvilibrisanu puferom A (DPBS, pH 7.2) pri 1.0 ml/min. Isperite kolone sa po 10 ml pufera A, pufera B (DPBS plus 1.0 M NaCI) i pufera A ponovo pri 1 ml/min. Zatim eluirati vezane proteine sa 30 mM natrijum acetata, pH 3.5. Neutralizovati frakciju od 5 ml sa 1% zapremine prema zapremini 3M natrijum acetata, pH~9. Konačni pufer je 60 mM NaOAc, pH~5 nakon eluiranja proteina A. Procenat monomera je bio 71% za PD1/ISO i 63% za PD1/CD48 prema aSEC. MabSelect Sure prečišćeni materijali su dodatno polirani kako bi se uklonili agregati katjonom. Poros GoPure HS Pre-pakovana kolona kompanije Thermo Fisher (Cat#4481316) je korišćena za jonsku razmenu. Ubacite uzorak proteina A u kolonu Poros HS od 1 ml prethodno ekvilibrisanu puferom A (60 mM NaOAc. pH 5.0) i isperite kolonu sa 10 zapremina kolone pufera A. Zatim eluirajte vezane proteine sa gradijentom od 0 % do 40 % pufera B (60 mM NaOA, 1 M NaCl, pH 5.0) u zapremini od 20 kolona pri 0.5 ml/min. Sakupite frakcije oko vrha i podesite koncentraciju soli na 100 mM NaCl. Sterilno filtrirajte uzorke pomoću jedinica za filtraciju. Izmerite koncentraciju proteina, odredite nivo endotoksina i pokrenite SDS-PAGE kao i aSEC.

NFAT Luciferazni test. Jurkat PD-1 NFAT reportercell linija je generisana u kompaniji.

Humani PD-1 iz GeneCopoeia (EX-B0169-M02) je kloniran u vektor koji je transfektovan u Jurkat ćelije (ATCC) putem elektroporacije. NFAT luciferazni reporter (Promega E8481) je zatim transfektovan u klonove koji eksprimiraju PD-1 putem elektroporacije. ûelijska linija THP-1 je kupljena ATCC (TIB-202) i kultivisana prema uputstvima proizvođDča.

Jurkat PD-1 i NFAT reporterske ćelije su ponovo suspendovane u medijumu za ispitivanje (RPMI, 2 % Hl-FBS), a 3 x 10<4>ćelije/stanje su prethodno inkubirane sa dozama BsAbs (početna koncentracija od 100 nM i 1:3 razblaženja) tokom 15 minuta u 384 Opti ploča sa ravnim dnom. Dodate su THP-1 ćelije (3 x 10<4>ćelije/stanje) i ćelije su stimulisane sa 10 nM rastvorom aCD3xaCD33 aktivatora tokom 6 h na 37°C. NFAT reporter je analiziran dodavanjem Steadi-Glo® Luciferase Assai reagensa u obliku 15 min (Promega, E2520) i Rčitan u EnVision Plate Reader.

Rezultati

CD48 i PD-1 unakrsno vezivanje pojaþava PD-1 fosforilaciju. CD48 je dobro utvrđen protein rezidentnog lipidnog nosača i IS u mišjim i humanim limfocitima (Elishmereni i Levi-Schaffer, 2011). Kako bismo bolje kvalifikovali prisustvo i obilje CD48 u lipidnim nosačima u

1

odnosu na PD-1 i CD3, izveden je eksperiment Imagestream kako bi kvantifikovali na nivou jedne ćelije ko-lokalizaciju ovih receptora sa lipidinim nosačima izazvanim toksinom kolere (CT) koalescencije (capping) u Jurkat ćelijama koje prekomerno eksprimiraju PD-1. Analiza ko-lokalizacije CD48, CD3 i PD-1 unutar kapica lipidnog nosača indukovane CT je sprovedena korišćenjem MAb-a obeleženih fluoroforom. Ova analiza je pokazala da se, za razliku od PD-1, CD3 i CD48 lako primećuju unutar zatvaranja indukovanog CT.

Kvantifikacija perimetra, u kojoj manje vrednosti perimetra koreliraju sa zatvaranjem, otkrila je da je nakon aktivacije zatvaranje CD48 bilo očigledno, ali nešto manje u izobilju od CD3. Nasuprot tome, PD-1 se obično nije kolokalizovao sa CT, što je u skladu sa hipotezom da PD-1 zahteva aktivan proces (npr. interakcija sa PDL-1) kakoa bi se regrutovao u IS obogaćen lipidnim nosačem (Yokosuka et al., 2012).

Prisustvo CD48 u lipidnim nosačima i konstitutivna povezanost sa Src kinazama (Lck u T ćelijama), omogućilo nam je da pretpostavimo da će, slično za CD3, aproksimacija CD48 sa PD-1 indukovati aktivaciju/fosforilaciju PD-1, kao kanonski mehanizam za aktivacija PD-1 potrebne Lck posredovane fosforilacije intracelularnih ITSM i ITIM domena PD-1 (Chemnitz et al., 2004; Parry et al., 2005; Sheppard et al., 2004). Kako bi se testirala ova hipoteza, generisana je prilagođena ćelijska linija Jurkat da ekspresuje humani PD-1 fuzioni protein sa jednom polovinom b-galaktozidaze (PK) i citosolnim SHP1 fuzionim proteinom pune dužine sa komplementarnom polovinom b-galaktozidaze (EA ). Aktivacija PD-1 je tako merena kao funkcija komplementacije PK/EA usled regrutovanja SHP1 u fosforilisani PD1, koji proizvodi funkcionalnu b-galaktozidazu. Nakon potvrđivanja ekspresije PD-1, CD48 i CD3 u ovim ćelijama, postavljeni su eksperimenti za procenu potencijala MAb protiv CD48 da izazove aktivaciju PD-1 nakon unakrsnog povezivanja (Slika 5). Aktivacija PD-1 nije indukovana u odsustvu PD-1 MAb ili Fc-specifičnog sekundarnog F(ab')2 antitela. Unakrsno povezivanje sa sekundarnim antitelom indukovalo je PD-1 aktivaciju za ~3 puta; međutim, u prisustvu CD48 ili CD3 Mab, aktivacija PD-1 je povećana za ~9 puta, što ukazuje da bliska povezanost CD48 ili CD3 sa PD-1 može povećati aktivaciju PD-1. Nizak nivo aktivacije PD-1 izazvan samo-unakrsnim povezivanjem nije bio iznenađujući jer su studije pokazale da je mali deo Lck konstitutivno povezan sa PD-1 u T ćelijama (Sheppard et al., 2004).

CD48-zavisna aktivacija PD-1 zahteva aktivnost Src-kinaze. Kako bi se utvrdilo da li poboljšanje aktivacije/fosforilacije PD-1 pomoću CD48 zavisi od aktivnosti Src kinaze, eksperimenti unakrsnog povezivanja su sprovedeni u prisustvu inhibitora pan-Src kinaze PP2, ili neaktivnog analoga PP3. Inhibicija Src-kinaze poništila je aktivaciju PD-1 nakon samo-unakrsnog povezivanja ili istovremenog unakrsnog povezivanja sa CD48, što ukazuje da je Lck aktivnost potrebna za aktivaciju PD-1. Kako bi se ovaj koncept dodatno potvrdio, aktivacija PD-1 je procenjena uankrsnim povezivanjem PD-1 sa suboptimalnim količinama anti-PD-1 u prisustvu antitela agonista CD71, receptora koji ne migrira u lipidne nosače niti

2

se povezuje sa Src-kinazama (Schatzlmaier et al., 2015). Unakrsno povezivanje PD-1 sa CD71 nije rezultiralo aktivacijom PD-1, podržavajući pronađeno da translokacija PD-1 u okruženje bogato aktiviranim Src kinazama omogućava fosforilaciju i aktivaciju PD-1.

CD48 zavisna PD-1 aktivacija otupljuje AR-indukovanu proliferaciju primarnih humanih T üelija. Kako bi se funkcionalno procenila sposobnost aktivacije PD-1 zavisne od CD48 da modulira funkcije T ćelija, magnetne perle su kovalentno obložene sa CD48, PD-1 MAbs i kontrolnim izotipoma i testirane na primarnim humanim T ćelijama (CD4<+>i CD8<+>) stimulisan anti-CD3 vezanim na ploči. Prvo smo potvrdili ekspresiju CD48 i PD-1 u preaktiviranim humanim CD4<+>i CD8+ T limfocitima. Kako bi se procenio efekat obloženih kuglica na aktivaciju ćelija, humane pan-T ćelije su obeležene sa CellTrace-Violet, zatim aktivirane sa CD3 MAbs, a proliferacija ćelija je analizirana razblaženjem CellTrace (Slika 6). Kao što je prikazano na Slici 6, perle obložene i sa CD48 i PD-1 MAb su bile u stanju da značajno smanje proliferaciju T ćelija u odnosu na ćelije tretirane perlama obloženim samo CD48 ili PD-1 MAb, a inhibitorni efekat je bio značajniji na CD4<+>nego CD8<+>ćelije. Kao dodatnu kontrolu, testirali smo i perle obložene sa PD-1 i CD11a Mabs; potonji je izabrao na osnovu premise da CD11a nije konstitutivni protein rezidentan u lipidnom nosaču. Kao što se očekivalo, PD-1 nije imao inhibitornu funkciju pri ko-retruimentaciji sa CD11a. Ovi rezultati dalje podržavaju hipotezu da aktivacija PD-1 sa rezidentnim molekulima lipidnog nosača (odn. CD48) može efikasno aktivirati PD-1 da inhibira ekspanziju T ćelija.

Bispecifiþno antitelo protiv PD-1 i CD48 indukuje aktivaciju PD-1 kakoa bi modulisalo sekreciju citokina i aktivaciju NFAT u humanim T üelijama stimulisanim AR. Rezultati dobijeni korišćenjem odvojenih perli obloženih monoklonskim antitelom, podstakli su nas da generišemo bispecifična antitela (BsAbs) kako bismo testirali hipotezu da bi molekularna lokalizacija PD-1 sa CD48 obezbedila inhibitorni signal na aktiviranim humanim T ćelijama (Slika 7). Objavljena antitela su generisana (agonističko anti-PD-1 antitelo iz patentne prijave WO 2011/110621 Al), i anti-CD48 Ab iz US2012/0076790), a BsAbs su konstruisani kao jednostruki konstrukti teškog/lakog lanca sa dugmetom ili rupicom za generisanje BsAbs koji sadrže anti-PD-1 i anti-CD48 (PD-1/CD48), ili anti-PD-1 i anti-TNP kao kontrolu (PD-1/ISO) (Slika 7A). Vezivanje svake račve za PD-1 ili CD48 je demonstrirano protočnom citometrijom na Jurkat ćelijama koje prekomerno eksprimiraju PD-1 kako bi se otkrilo vezivanje i PD-1 i CD48, ili nedostatak ekspresije PD-1, da bi se otkrilo samo vezivanje CD48 (Slika 7B ).

Koristeći sistem Jurkat PD-1 komplementacije opisan gore, pokazali smo da je PD-1/CD48 BsAb bio ~3 puta snažniji indukujući PD-1 aktivaciju od PD-1/ISO kontrole, potvrđujući da kolokalizacija PD-1/CD48 korišćenjem ovog BsAb formata takođe dovodi do poboljšane fosforilacije PD-1 (Slika 6). Da bi se procenio funkcionalni efekat PD-1/CD48 BsAb, CD4<+>T (PD1<+>) ćelije humane memorije su stimulisane anti-CD3e vezanim za ploču u prisustvu PD-1/CD48 BsAb ili kontrolnih antitela vezanih za ploču i analizirane na lučenje citokina (Slika 7C). Ova analiza je otkrila imunomodulatorni efekat PD-1/CD48 BsAb jer je značajno smanjio lučenje proinflamatornog citokina IL2, ali je pojačao proizvodnju antiinflamatornog citokina IL-10. Pošto lučenje IL-2 zahteva transkripcionu aktivaciju NFAT (Chov et al., 1999), efekat PD-1/CD48 BsAb na aktivaciju NFAT je procenjen u Jurkat T ćelijama koje eksprimiraju i PD-1 i NFAT-Luciferaze reporter, i aktiviran sa anti-CD3e u prisustvu THP-1 ćelija za kostimulaciju. Ova analiza je pokazala da je PD-1/CD48 BsAb bio u stanju da smanji NFAT reporter >10-30% u odnosu na kontrolna antitela, i ukazuje da CD48 zavisna aktivacija PD-1 takođe inhibira ključni događaj transkripcije efektora T ćelija koji dovodi do proizvodnje IL-1.

4

Claims

Patentni zahtevi

1. Anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji sadrži:

varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 166 (L-CDR2); i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32 (L-CDR3).

2. Anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema zahtevu 1, pri čemu je navedeno antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen izabran iz grupe koju čine: humanizovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, monoklonsko antitelo, Fab , F(ab')2, Fv i scFv.

3. Anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu navedeno antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90 % identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ NO. : 135, i varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90 % identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ NO: 127.

4. Anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu navedeno antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135 i SEQ ID NO: 127, respektivno.

5. Anti-PD1 antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu navedeno antitelo sadrži: konstantni region teškog lanca izabran iz grupe koju čine: lgG4, lgG1, lgG2, lgG3, IgM, IgA i IgE konstantni regioni, poželjno pri čemu je konstantni region teškog lanca konstantni region teškog lanca lgG4 sa Ser228Pro mutacijom ili pri čemu je konstantni region teškog lanca konstantni region teškog lanca lgG1 sa Leu234Ala i Leu235Ala mutacijama.

6. Anti-PD1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži konstantni region lakog lanca izabran iz grupe koju čine kapa i lambda.

7. Anti-PD-1 antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu navedeno antitelo sadrži teški lanac i laki lanac koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 149 i SEQ ID NO: 145, respektivno.

8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od zahteva 1 do 7, i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

9. Anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od zahteva 1 do 8 za upotrebu kao lek, poželjno za upotrebu u lečenju poremećaja PD-1 puta.

10. Anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema zahtevu 9, pri čemu poremećaj PD-1 puta je hronična inflamatorna bolest ili akutna inflamatorna bolest.

11. Anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema zahtevu 9 ili 10, pri čemu poremećaj PD-1 puta je odabran između grupe koja se sastoji od: artritis, reumatoidni artritis, astma, COBP, inflamatorna bolest karlice, Alchajmerova bolest, inflamatorna bolest creva, Kronova bolest, ulcerozni kolitis, Pejronijeva bolest, celijakija, bolest žučne kese, pilonidalna bolest, peritonitis, psorijaza, psorijatični artritis, vaskulitis, hirurške adhezije, Lajmska bolest, dijalitička bolest kod muškaraca, autoimuni uveitis, multipla skleroza, lupus, sistemski eritematozni lupus, Guillain-Barreov sindrom, atopijski dermatitis, autoimuni hepatitis, fibrozirajući alveolitis, Grave-ova bolest, IgA nefropatija, idiopatska trombocitopenična purpura, Menierova bolest, pemfigus, primarna bilijarna ciroza, sarkoidoza, skleroderma, Vegenerova granulomatoza, drugi autoimuni poremećaji, pankreatitis, traume, operacije, bolest transplantata protiv domaćina, odbacivanje transplantata, bolesti srca uključujući ishemijske bolesti kao što je infarkt miokarda, kao i ateroskleroza, intravaskularna koagulacija, resorpcija kostiju, osteoporoza, osteoartritis i hipohloritis, parodontitis neplodnost povezana sa nedostatkom fetalno-materinske tolerancije, Sjogrenov sindrom, vitiligo, mijastenija gravis i sistemska skleroza; i/ili

pri čemu poremećaj PD-1 puta je odabran između grupe koja se sastoji od: sistemska skleroza, sistemski eritematozni lupus, polimiozitis, arteritis gigantskih ćelija, psorijaza, psorijatični artritis, ankilozni spondilitis i inflamatorna bolest creva.

12. Anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema bilo kom od zahteva 9 do 11, pri čemu navedeno antitelo ili njegov fragment koji vezuje za antigen se daje parenteralnim putem, intravenskim putem ili subkutanim putem.

13. Izolovani polinukleotid koji kodira anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od zahteva 1 do 7.

14. Ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid prema zahtevu 13.

15. ûelija domaćin koja sadrži ekspresioni vektor prema zahtevu 14, poželjno gde ćelija je ćelija sisara.

16. Postupak za proizvodnju antitela koji sadrži korake:

- kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira varijabilni region teškog lanca prema bilo kom od zahteva 1 do 4 i ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira odgovarajući varijabilni region lakog lanca prema bilo kom od zahteva 1 do 4, poželjno ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira teški lanac prema bilo kom od zahteva 5 do 7 i ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira laki lanac prema bilo kom od zahteva 5 do 7, pod uslovima koji dozvoljavaju formiranje antitela; i

- obnavljanje navedenog antitela;

opciono pri čemu postupak dalje obuhvata korak prečišćavanja navedenog antitela i/ili korak formulisanja navedenog antitela u farmaceutsku kompoziciju.

17. Multispecifično antitelo koje sadrži prvo mesto za vezivanje anti-PD-1 agonista i drugo mesto za vezivanje antigena, pri čemu navedeno prvo mesto za vezivanje anti-PD-1 agonista sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca prema bilo kom od zahteva 1 do 4.

18. Multispecifično antitelo prema zahtevu 17, pri čemu je navedeno drugo mesto vezivanja antigena anti-CD48 vezujuće mesto, anti-CD2 vezujuće mesto, anti-CD11 vezujuće mesto ili anti-CD3 vezujuće mesto i/ili pri čemu je navedeno antitelo bi-specifično antitelo.