RS66284B1

RS66284B1 - Formulacije humanih anti-rankl antitela i metode njihove upotrebe

Info

Publication number: RS66284B1
Application number: RS20241343A
Authority: RS
Inventors: Stephen Robert Brych; Lyanne M Wong; Jaymille Fallon; Monica Michelle Goss; Jian Hua Gu; Pavan K Ghattyvenkatakrishna
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2017-04-28
Filing date: 2018-04-27
Publication date: 2025-01-31
Also published as: MA48462A; TN2021000055A1; FI4190355T3; TWI903512B; PH12019502444A1; IL293127B2; UY37707A; SMT202400095T1; US11192952B2; CL2019003032A1; EP4477667A3; DK3615066T3; KR20190140464A; TW201841654A; EP4477667A2; PE20251534A1; JOP20240115B1; AU2018260750A1; CL2020002012A1; LT3615066T

Description

Opis

POZADINA

Oblast obelodanjivanja

[0001] Pronalazak se odnosi na humana anti-RANKL monoklonska antitela, uključujući visokokoncentrisane vodene formulacije denosumaba i njegovih biološki sličnih lekova.

Kratak opis stanja tehnike

[0002] Denosumab je komercijalno dostupan u obliku rastvora koncentracije 60 mg/ml i 70 mg/ml.

[0003] Povećanje koncentracija proteinskih formulacija može izazvati probleme sa stabilnošću, na primer agregacijom koja dovodi do stvaranja vrsta visoke molekulske mase (HMWS). HMWS, posebno one koje čuvaju većinu nativne konfiguracije monomernog pandana, mogu biti posebno zabrinjavajuće u nekim proteinskim formulacijama. Agregacija takođe može potencijalno uticati na supkutanu bioraspoloživost i farmakokinetiku terapijskog proteina.

[0004] Operacije punjenja i završne obrade, kao i primena, mogu uključivati korake proticanja proteinskih rastvora kroz klipne pumpe, peristaltičke pumpe ili igle za injekcije. Takvi procesi mogu izazvati smicajna i mehanička naprezanja, što može izazvati denaturaciju proteina i rezultirati agregacijom. Ovaj fenomen se može pogoršati sa povećavanjem koncentracije proteinskih rastvora.

[0005] Patent US 2011/0060290 se odnosi na stabilizovane sastave specifičnih vezivnih agenasa za RANKL, specifičnih vezivnih agenasa za TNF i/ili specifičnih vezivnih agenasa za IL-1R1 u kontejnerima.

SAŽETAK

[0006] U skladu sa predmetnim pronalaskom obezbeđeno je obelodanjivanje koje po prvi put pokazuje da dodavanje inhibitora agregacije aminokiselina u vodeni rastvor koji se sastoji od visoke koncentracije anti-RANKL antitela dovodi do smanjene količine agregata antitela formiranih tokom vremena, kao i do sporije brzine formiranja takvih agregata. Predmetno obelodanjivanje takođe predviđa efekat pH na formiranje agregata u koncentrovanim vodenim rastvorima anti-RANKL antitela, pri čemu je zapaženo smanjeno formiranje agregata kada je pH vodenih rastvora u opsegu od oko 5,0 do manje od 5,2. Dalje se sugeriše ovde predstavljenim obelodanjivanjem da se stabilizacija anti-RANKL antitela odvija kroz interakcije između inhibitora agregacije aminokiselina i antitela. Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, smatra se da hidrofobne interakcije, kao i druge vrste intermolekularnih interakcija, između inhibitora agregacije aminokiselina i anti-RANKL antitela imaju stabilizujući efekat na koncentrovane rastvore antitela. Shodno tome, obelodanjivanje predmetnog pronalaska odnosi se na stabilne vodene farmaceutske formulacije koje sadrže visoke koncentracije anti-RANKL antitela čije formulacije sadrže niske količine (npr. manje od oko 2%) agregata.

[0007] U prvom otelotvorenju, pronalazak pruža vodenu farmaceutsku formulaciju koja sadrži:

- anti-RANKL antitelo u koncentraciji u opsegu od 100 do 140 mg/ml; i

- 5 mM do 180 mM L-fenilalanin ili L-triptofan;

pri čemu vodena farmaceutska formulacija ima pH u opsegu od 5,0 do 5,4; i

pri čemu anti-RANKL antitelo obuhvata teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 14 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 13.

[0008] U drugom otelotvorenju, pronalazak pruža vodenu farmaceutsku formulaciju pronalaska za primenu u (a) lečenju ili prevenciji događaja povezanih sa skeletom (SRE) kod ispitanika sa koštanim metastazama solidnih tumora, (b) lečenju ili prevenciji SRE kod ispitanika koji je odrasla osoba ili skeletno zreli adolescent sa gigantocelularnim tumorom kosti koji je neoperabilan ili gde je verovatno da će hirurška resekcija rezultirati teškim morbiditetom, (c) lečenju hiperkalcemije maligniteta refraktornog na bisfonatnu terapiju kod ispitanika, (d) lečenju ili prevenciji SRE kod ispitanika sa multiplim mijelomom ili sa koštanim metastazama iz solidnog tumora, (e) lečenju osteoporoze žena u postmenopauzi sa visokim rizikom od preloma, (f) lečenju za povećanje koštane mase kod žena sa visokim rizikom od preloma koje primaju adjuvantnu terapiju inhibitorom aromataze za rak dojke, (g) lečenju za povećanje koštane mase kod muškaraca sa visokim rizikom od preloma koji primaju terapiju deprivacije androgena za nemetastatski rak prostate, (h) lečenju za povećanje koštane mase kod muškaraca sa osteoporozom sa visokim rizikom od preloma, (i) terapiji kalcijumom ili vitaminom D, (j) lečenju gigantocelularnog tumora kosti kod pacijenta kome je to potrebno, (k) lečenju hiperkalcemije maligne bolesti kod pacijenta kome je to potrebno, (l) lečenju osteoporoze kod pacijenta kome je to potrebno, ili (m) povećanju koštane mase kod pacijenta kome je to potrebno.

DALJE OBELODANJIVANJE

[0009] Vodena farmaceutska formulacija može da sadrži humani antihumani receptorski aktivator za nuklearni faktor kapa-B ligand (anti-RANKL) monoklonsko antitelo ili njegov deo koji se vezuje za antigen u koncentraciji većoj od 70 mg/ml i ima pH u opsegu od oko 5,0 do manje od 5,2.

[0010] Vodena farmaceutska formulacija može da sadrži smešu humanog antihumanog receptorskog aktivatora za nuklearni faktor kapa-B ligand (anti-RANKL) monoklonskog antitela ili njegovog dela koji se vezuje za antigen i inhibitora agregacije aminokiselina. Inhibitor agregacije aminokiselina može se sastojati od aminokiseline koja se sastoji od naelektrisanog bočnog lanca, aromatične aminokiseline ili hidrofobne aminokiseline.

Aminokiselina koja se sastoji od naelektrisanog bočnog lanca može biti aminokiselina koja se sastoji od pozitivno naelektrisanog bočnog lanca, kao što su, na primer, arginin i lizin.

Aromatična aminokiselina može da sadrži fenil ili indol. Opciono, aromatična aminokiselina dalje sadrži C1-C6alkil lanac između alfa ugljenika i fenila ili indola. Aminokiseline, uključujući, na primer, fenilalanin i triptofan, su primerni inhibitori agregacije aminokiselina. Inhibitor agregacije aminokiselina može biti hidrofobna aminokiselina koja ima rezultat veći od oko 2,5 na Kajt-Dulitl (Kyte and Doolittle) skali hidrofobnosti. Opciono, hidrofobna aminokiselina je valin, leucin ili izoleucin. Razmatraju se dodatni inhibitori agregacije aminokiselina kako je ovde opisano.

[0011] Vodena farmaceutska formulacija može dalje da sadrži modifikator toničnosti, surfaktant (površinski aktivno sredstvo), pufer ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0012] Opisana je prezentacija formulacije za skladištenje ili upotrebu, npr. u bočici za jednokratnu upotrebu, špricu za jednokratnu upotrebu ili staklenoj, staklom obloženoj ili staklom premazanoj primarnoj posudi. Posuda, opciono, ampula, napunjeni špric (PFS) ili staklena posuda mogu da sadrže bilo koju od ovde opisanih vodenih farmaceutskih formulacija. Posuda može sadržati oko 1 ml ili manje (npr. oko 0,5 ml) vodene farmaceutske formulacije.

[0013] Postupci pravljenja stabilne, vodene farmaceutske formulacije koja se sastoji od humanog antihumanog receptorskog aktivatora nuklearnog faktora kapa-B liganda (anti-RANKL) monoklonskog antitela, ili njegovog dela koji se vezuje za antigen, mogu se sastojati od kombinovanja anti-RANKL monoklonskog antitela, ili njegovog dela koji se vezuje za antigen, u koncentraciji većoj od 70 mg/ml sa inhibitorom agregacije aminokiselina, puferom, surfaktantom i opciono modifikatorom toničnosti. Opisana je stabilna, vodena farmaceutska formulacija napravljena prema bilo kom od postupaka izrade stabilne, vodene farmaceutske formulacije opisane u ovom dokumentu.

[0014] Opisani su postupci upotrebe formulacije kao što je ovde opisano za sprečavanje ili lečenje bolesti koja reaguje na humano anti-RANKL monoklonsko antitelo ili njegov deo koji se vezuje za antigen. Upotreba može obuhvatiti terapijsko lečenje ispitanika koje obuhvata lečenje ili prevenciju događaja povezanog sa skeletom (SRE), lečenje ili prevenciju gigantocelularnog tumora kosti, lečenje ili prevenciju hiperkalcemije maligniteta, lečenje ili prevenciju osteoporoze ili povećanja koštane mase kod ispitanika. Na primer, terapijski tretman obuhvata (a) lečenje ili prevenciju SRE kod ispitanika sa koštanim metastazama od solidnih tumora, (b) lečenje ili prevenciju SRE kod ispitanika koji je odrasla osoba ili skeletno zreli adolescent sa gigantocelularnim tumorom kosti koji je neoperabilan ili gde je verovatno da će hirurška resekcija rezultirati teškim morbiditetom, (c) lečenje hiperkalcemije maligniteta refraktornog na bisfonsfonatnu terapiju kod ispitanika, (d) lečenje ili prevenciju SRE kod ispitanika sa multiplim mijelomom ili sa koštanim metastazama od solidnog tumora, (e) lečenje osteoporoze žena u postmenopauzi sa visokim rizikom za prelom, (f) lečenje za povećanje koštane mase kod žena sa visokim rizikom za prelom koje primaju adjuvantnu terapiju inhibitorom aromataze za rak dojke, (g) lečenje za povećanje koštane mase kod muškaraca sa visokim rizikom za prelom koji primaju terapiju deprivacije androgena za nemetastatski rak prostate, (h) lečenje za povećanje koštane mase kod muškaraca sa osteoporozom sa visokim rizikom za prelom, (i) lečenje kalcijumom ili vitaminom D.

[0015] Opisani su postupak sprečavanja događaja povezanog sa skeletom (SRE) kod pacijenta kome je to potrebno, postupak lečenja gigantocelularnog tumora kostiju kod pacijenta kome je to potrebno, postupak lečenja hiperkalcemije maligniteta kod pacijenta kome je to potrebno, postupak lečenja osteoporoze kod pacijenta kome je to potrebno i postupak povećanja koštane mase kod pacijenta kome je to potrebno. Postupci obuhvataju davanje pacijentu efikasne količine bilo koje od formulacija opisanih u ovom dokumentu. Formulacija se može supkutano dostaviti pacijentu.

[0016] Opisana je upotreba denosumaba, ili drugog humanog anti-RANKL monoklonskog antitela ili njegovog dela koji se vezuje za antigen, u proizvodnji leka kako je ovde opisano za lečenje pacijenta kome je potrebno humano anti-RANKL monoklonsko antitelo.

[0017] Komplet može uključivati sastav ili član opisan u ovom dokumentu zajedno sa uputstvom za pakovanje, etiketom pakovanja, uputstvima ili drugim oznakama koje usmeravaju ili obelodanjuju bilo koji od postupaka ili obelodanjivanja koji su ovde obelodanjeni.

[0018] Opisan je postupak poboljšanja stabilnosti vodene farmaceutske formulacije uključujući humani antihumani receptorski aktivator nuklearnog faktora kapa-B liganda (anti-RANKL) monoklonsko antitelo ili njegov deo koji se vezuje za antigen, u koncentraciji većoj od 70 mg/ml, uključujući korak pripreme vodene farmaceutske formulacije uključujući humani antihumani receptorski aktivator nuklearnog faktora kapa-B liganda (anti-RANKL) monoklonsko antitelo ili njegov deo koji se vezuje za antigen pri pH vrednosti u opsegu od oko 5,0 do manje od 5,2, pri čemu vodena farmaceutska formulacija pokazuje poboljšanu stabilnost pri pH vrednosti u opsegu od oko 5,0 do manje od 5,2 u poređenju sa ekvivalentnom vodenom farmaceutskom formulacijom koja nije pri pH vrednosti u opsegu od oko 5,0 do manje od 5,2.

[0019] Opisan je postupak poboljšanja stabilnosti vodene farmaceutske formulacije uključujući humani antihumani receptorski aktivator nuklearnog faktora kapa-B liganda (anti-RANKL) monoklonskog antitela ili njegovog dela koji se vezuje za antigen, uključujući korak pripreme vodene farmaceutske formulacije koja se sastoji od humanog antihumanog receptorskog aktivatora nuklearnog faktora kapa-B liganda (anti-RANKL) monoklonskog antitela ili njegovog dela koji se vezuje za antigen u mešavini sa inhibitorom agregacije aminokiselina, pri čemu vodena farmaceutska formulacija pokazuje poboljšanu stabilnost sa inhibitorom agregacije aminokiselina u poređenju sa ekvivalentnom vodenom farmaceutskom formulacijom bez inhibitora agregacije aminokiselina.

[0020] Opisan je postupak smanjenja nivoa agregata HMWS u rastvoru denosumaba ili drugog humanog anti-RANKL monoklonskog antitela.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0021]

Na Slikama 1, 2 i 8 prikazan je procenat HMWS praćen putem SE-UHPLC u funkciji formulacije i vremena na 37°C za različite formulacije denosumaba visoke koncentracije. Legenda na Slici 1 je u skladu sa formulacijom koja ima skraćenicu prikazanu u tabeli 1. Legenda na slici 8 odgovara slovu prikazanom u Tabeli 5.

Na Slici 3 prikazani su hromatogrami isključivanja po veličini za različite formulacije denosumaba visoke koncentracije nakon skladištenja na 37°C tokom 1 meseca.

Legenda na Slici 3 je u skladu sa formulacijom koja ima skraćenicu prikazanu u Tabeli 2.

Slika 4 je grafikon % HMWS praćenog putem SE-UHPLC kao funkcija vremena za svaku formulaciju koja ima odgovarajući F# prikazan u Tabeli 3A.

Slika 5 je par hromatograma isključivanja po veličini za formulacije navedene u Tabeli 3A. Legenda na Slici 5 odgovara nazivu formulacije navedenom u Tabeli 3B.

Slika 6 je grafikon % HMWS praćenog putem SE-UHPLC kao funkcija vremena skladištenja na 37°C za svaku formulaciju koja ima odgovarajući F# prikazan u Tabeli 4A.

Na Slici 7A prikazani su hromatogrami isključivanja po veličini za formulacije pri pH 4,8 sa koncentracijom denosumaba navedenom u Tabeli 4A.

Na Slici 7B prikazani su hromatogrami isključivanja po veličini za formulacije pri pH 5,1 koje imaju koncentraciju denosumaba navedenu u Tabeli 4A.

Slika 9 je grafikon % HMWS praćenog putem SE-UHPLC kao funkcija vremena skladištenja na 37°C za svaku formulaciju koja ima odgovarajući F# prikazan u Tabeli 6B.

Na Slici 10 prikazani su hromatogrami isključivanja po veličini kao funkcija formulacije nakon skladištenja na 37°C tokom 1 meseca za formulacije čiji je naziv naveden u Tabeli 6B.

Slika 11A je grafikon procenta HMWS praćenog putem SE-UHPLC kao funkcija vremena na 37°C za formulaciju koja ima slovo navedeno u Tabeli 7B.

Slika 11B je grafikon procenta HMWS praćenog putem SE-UHPLC kao funkcija vremena na 40°C za formulaciju koja ima slovo navedeno u Tabeli 7C.

Slika 12A prikazuje hromatograme isključivanja po veličini za formulacije iz Tabele 7B.

Na Slici 12B prikazani su hromatogrami isključivanja po veličini za formulacije iz Tabele 7C.

Slike 13, 14 i 15 su grafikoni procenta HMWS praćenog putem SE-UHPLC kao funkcija vremena skladištenja na 37°C za svaku formulaciju koja ima odgovarajuće slovo formulacije prikazano u Tabeli 8A. Slike 16, 17 i 18 su hromatografska preklapanja formulacija navedenih u Tabeli 8A nakon skladištenja na 37°C tokom 1 meseca. Slike 13 i 16 se odnose na formulacije koje sadrže aromatične aminokiseline, slike 14 i 17 se odnose na formulacije koje sadrže polarne/naelektrisane aminokiseline, a slike 15 i 18 se odnose na formulacije koje sadrže hidrofobne aminokiseline.

Slike 19-24 su grafikoni % inkorporacije deuterijuma na 4°C u funkciji vremena (log (sec)) za aminokiseline lakog lanca 28-33 (Slika 19), aminokiseline lakog lanca 108-116 (Slika 20), aminokiseline lakog lanca 125-132 (Slika 21), aminokiseline teškog lanca 47-59 (Slika 22), aminokiseline teškog lanca 243-253 (Slika 23) i aminokiseline teškog lanca 392-399 (Slika 24) za svaku od formulacija 35-38.

Slike 25-30 su grafikoni % inkorporacije deuterijuma na 37°C u funkciji vremena (log (sec)) za aminokiseline lakog lanca 28-33 (Slika 25), aminokiseline lakog lanca 108-117 (Slika 26), aminokiseline lakog lanca 124-131 (Slika 27), aminokiseline teškog lanca 47-59 (Slika 28), aminokiseline teškog lanca 242-253 (Slika 29) i aminokiseline teškog lanca 392-399 (Slika 30) za svaku od formulacija 35-38.

Slika 31 je grafikon procenta HMWS praćenog putem SE-UHPLC u funkciji formulacije i vremena na 37°C sa nazivom formulacije navedenim u Tabeli 10.

Slika 32 je grafikon procenta LMWS praćenog putem SE-UHPLC u funkciji formulacije i vremena na 37°C sa nazivom formulacije naznačenim u Tabeli 11.

Slika 33 je grafikon procenta HMWS praćenog putem SE-UHPLC u funkciji formulacije i vremena na 37°C sa nazivom formulacije navedenim u Tabeli 12.

Slika 34 je grafikon procenta LMWS praćenog putem SE-UHPLC u funkciji formulacije i vremena na 37°C sa nazivom formulacije naznačenim u Tabeli 13.

Slika 35 je grafikon procenta HMWS praćenog putem SE-UHPLC u funkciji formulacije i vremena na 37°C sa nazivom formulacije navedenim u Tabeli 14.

Slika 36 je grafikon procenta LMWS praćenog putem SE-UHPLC u funkciji formulacije i vremena na 37°C sa nazivom formulacije naznačenim u Tabeli 15.

Slika 37 su preklapanja hromatograma isključivanja po veličini za svaku formulaciju koja ima naziv formulacije naveden u Tabeli 10.

Slika 38 su preklapanja hromatograma isključivanja po veličini za svaku formulaciju koja ima naziv formulacije naveden u Tabeli 12.

Slika 39 su preklapanja hromatograma isključivanja po veličini za svaku formulaciju koja ima naziv formulacije naveden u Tabeli 14.

Slike 40A i 40B su grafikoni koji sadrže krive izotermne hemijske denaturacije denosumaba u odsustvu arginina, pri pH 4,5, 4,8 i 5,0. Slika 40A je grafikon frakcije denaturisanog denosumaba u funkciji koncentracije denaturanta. Slika 40B je grafikon koji prikazuje dF/d[denaturant] kao funkciju koncentracije denaturanta.

Slike 41A i 41B su grafikoni koji sadrže krive izotermne hemijske denaturacije denosumaba u prisustvu 75mM arginin HCl pri pH 4,5, 4,8. i 5,2. Slika 41A je grafikon frakcije denaturisanog denosumaba u funkciji koncentracije denaturanta. Slika 41B je grafikon koji prikazuje dF/d[denaturant] kao funkciju koncentracije denaturanta.

Slike 42 i 43 su grafikoni procenta HMWS praćenog putem SE-UHPLC kao funkcija vremena na 25°C tokom 3 meseca, odnosno 37°C tokom 2 meseca, za formulaciju koja ima naziv Formulacija u Tabeli 17.

DETALJAN OPIS

[0022] Bilo bi poželjno obezbediti koncentrovaniji vodeni rastvor denosumaba i drugih humanih anti-RANKL antitela i njihovih delova koji se vezuju za antigen, koji su jednako stabilni kao, ili stabilniji od razblaženih rastvora. Koncentrisaniji rastvor bi mogao da obezbedi pogodnost za pacijenta, na primer dozvoljavanjem primene manje zapremine, kao što je 1 ml injekcije, za isporuku 120 mg aktivnog rastvora, kao što je denosumab, umesto 1,7 ml ili 2 ml injekcije razblaženije aktivne formulacije. Još dalje, to bi omogućilo još manjoj zapremini rastvora za injekciju da isporuči nižu dozu aktivne supstance, npr.0,5 ml koncentracije denosumaba od 120 mg/ml za isporuku doze od 60 mg. Takođe bi bilo poželjno obezbediti vodeni rastvor denosumaba i drugih humanih anti-RANKL antitela i njihovih delova koji se vezuju za antigen, koji su stabilniji od prethodno poznatih rastvora. Stabilna, koncentrovana formulacija će imati i druge prednosti, kao što je omogućavanje rukovanja i otpreme manjih količina proizvoda i omogućavanje dužeg roka trajanja proizvoda.

1

[0023] Agregati u biološkim proizvodima mogu se razlikovati po poreklu, veličini i tipu. Agregati koji mogu uticati na efikasnost ili bezbednost biološkog proizvoda su posebno zabrinjavajući, npr. agregati koji mogu poboljšati imunološke odgovore i izazvati štetne kliničke efekte. Agregati visoke molekulske mase, poznati i kao vrste visoke molekulske mase (HMWS), posebno oni koji konzerviraju većinu nativne konfiguracije monomernog ekvivalenta, mogu biti od posebnog značaja. Agregacija takođe može potencijalno uticati na supkutanu bioraspoloživost i farmakokinetiku terapijskog proteina.

[0024] Formiranje agregata može imati različite uzroke. Generalno, agregacija proteina je rezultat konformacione nestabilnosti, koja je rezultat strukturnih promena proteina, i koloidne nestabilnosti, u kojoj dominiraju intermolekularne sile. U slučaju kada je potreban događaj kritične nukleacije da bi se izazvala precipitacija, kinetika agregacije proteina može se okarakterisati uključivanjem faze vremenskog zaostajanja.

[0025] Agregacija zbog konformacione nestabilnosti uključuje korake odvijanja i asocijacije. Odvijanje molekula proteina izlaže ostatke hidrofobnih aminokiselina. Hidrofobni ostaci odvijenih molekula mogu se zatim podvrgnuti asocijaciji, što dovodi do agregacije (npr. kao dimeri, trimeri, ostali multimeri i agregati višeg reda). Takve asocijacije zavise od koncentracije. Povećanje koncentracije proteina u vodenom rastvaraču generalno povećava brzinu i obim agregacije, uključujući termički indukovanu agregaciju. Dakle, aditivi koji utiču na slobodnu energiju odvijanja proteina u rastvoru mogu uticati na konformacionu stabilnost.

[0026] Koloidna nestabilnost rezultira agregatima putem sila intramolekularne asocijacije protein-protein. Na takve sile može uticati jedan ili više faktora, uključujući jonsku jačinu, pH rastvora i vrste pufera.

[0027] Denosumab je komercijalno dostupan u obliku rastvora koncentracije 60 mg/ml i 70 mg/ml. Pokušaji da se formulišu rastvori denosumaba sa višom koncentracijom korišćenjem istih pomoćnih supstanci pokazali su da je viša koncentracija uticala na stabilnost proizvoda, putem istovremenog i proporcionalnog povećanja HMWS. Na primer, koncentracija od 120 mg/ml denosumaba ima koncentraciju više od 70% veću od 70 mg/ml denosumaba i dvostruko je veća od koncentracije od 60 mg/ml.

[0028] Shodno tome, stabilizovana vodena formulacija prema predmetnom obelodanjivanju će se odupreti formiranju agregata u većoj meri od prethodno poznatih formulacija. Opisana je stabilizovana vodena formulacija koju karakteriše pH od 5,0 do manje od 5,2. Još jedno neekskluzivno obelodanjivanje je stabilizovana vodena formulacija koja uključuje inhibitor agregacije aminokiselina. Takođe su opisani srodni oblici doziranja, npr. kao ampule za jednokratnu upotrebu, špricevi i staklene posude, i srodni postupci lečenja. Dodatno su opisani postupci izrade stabilnih, vodenih farmaceutskih formulacija.

[0029] Kao što je opisano u nastavku, pH i inhibitor agregacije aminokiselina (npr. arginin, arginin-arginin dipeptid, arginin-fenilalanin dipeptid) su dve poluge za koje je pokazano da smanjuju nivo HMWS i brzinu formiranja HMWS denosumaba pri 120 mg/ml. HMWS se mogu opisati kao intermolekularne proteinske interakcije koje su ili ireverzibilne (npr. kovalentne) ili reverzibilne (npr. nekovalentne samo-asocirane interakcije). Postoje četiri dobro prihvaćena uzroka reakcija samo-asocijacije proteina koji mogu dovesti do povećanja viskoziteta i HMWS; hidrofobne, naelektrisane, polarne i dipolne interakcije. I pH formulacije i arginin (visoko naelektrisana bazna aminokiselina pri neutralnim do kiselim pH vrednostima) mogu ometati intermolekularne sile naelektrisanih proteina. Bez namere da bude vezano bilo kojom određenom teorijom, zamislivo je da se formiranje HMWS denosumaba pri 120 mg/ml zasniva na naelektrisanju proteina, a ove promene formulacije ometaju sile naelektrisanja uključene u mehanizam formiranja HMWS. Dalje, bez namere da bude vezano bilo kojom određenom teorijom, moguće je da postoje i interakcije samoasocijacije hidrofobnih proteina u formiranju HMWS, jer arginin sadrži kratak alifatski lanac ugljovodonika u bočnom lancu. Ovaj alifatski lanac može poremetiti hidrofobne interakcije između proteina. Ova ideja je dodatno podržana uključivanjem fenilalanina u formulaciju kako bi se dodatno smanjili nivoi HMWS. Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, arginin stabilizuje anti-RANKL antitelo na način različit od fenilalanina, tako da, ako arginin stupa u interakciju sa antitelima putem hidrofobnih interakcija, arginin može stupiti u interakciju sa antitelima na jedan ili više drugih načina.

[0030] Druge pomoćne supstance koje mogu imati potencijalno pozitivan uticaj na smanjenje nivoa i brzine formiranja HMWS mogu imati sličnu pozitivno naelektrisanu grupu na neutralnim do kiselim pH vrednostima u poređenju sa argininom, i/ili mogu biti hidrofobne prirode slične fenilalaninu. Primeri ovih pomoćnih supstanci mogu uključivati lizin, N-acetil arginin, N-acetil lizin, tirozin, triptofan i leucin.

[0031] Smatra se da formulacije, oblici doziranja i postupci uključuju bilo koju kombinaciju jednog ili više dodatnih opcionih elemenata, karakteristika i koraka koji su dalje opisani u nastavku (uključujući one prikazane na slikama), osim ako nije drugačije navedeno.

[0032] U jurisdikcijama koje zabranjuju patentiranje postupaka koje se primenjuju na ljudskom telu, značenje „primene“ sastava na humanom ispitaniku ograničava se na propisivanje kontrolisane supstance koju će humani ispitanik samostalno primenjivati bilo kojom tehnikom (npr. oralno, inhalacijom, lokalnom primenom, injekcijom, umetanjem, itd.). Predviđeno je najšire razumno tumačenje koje je u skladu sa zakonima ili propisima koji definišu predmet patentiranja. U jurisdikcijama koje ne zabranjuju patentiranje postupaka koji se praktikuju na ljudskom telu, "primena" sastava uključuje i postupke koji se praktikuju na ljudskom telu, kao i gore navedene aktivnosti.

[0033] Kao što se ovde koristi, termin „koji sadrži“ označava potencijalno uključivanje drugih agenasa, elemenata, koraka ili karakteristika, pored onih navedenih.

[0034] Treba razumeti da svako maksimalno numeričko ograničenje dato u ovoj specifikaciji uključuje kao alternativne aspekte opsege formirane sa svakim odgovarajućim donjim numeričkim ograničenjem, kao da su takvi opsezi izričito napisani. Svako minimalno numeričko ograničenje dato u ovoj specifikaciji uključiće kao alternativne aspekte opsege formirane sa svakim višim numeričkim ograničenjem, kao da su takvi opsezi izričito napisani. Svaki numerički opseg dat u ovoj specifikaciji će uključivati svaki uži numerički opseg koji spada u takav širi numerički opseg, kao da su svi takvi uži numerički opsezi ovde izričito napisani. Dimenzije i vrednosti koje su ovde obelodanjene treba shvatiti tako da uključuju obelodanjivanje i nabrojane vrednosti i odgovarajuće tačne numeričke vrednosti, npr. vrednost opisanu kao „oko 10 mM“ treba shvatiti tako da uključuje, kao alternativno obelodanjivanje, "10 mM".

[0035] Termini „terapeutski efikasna količina“, kao što se ovde koristi, odnose se na količinu jedinjenja dovoljnu za lečenje, ublažavanje ili sprečavanje identifikovane bolesti ili stanja, ili za pokazivanje detektabilnog terapeutskog, profilaktičkog ili inhibitornog efekta. Efekat se

1

može detektovati, na primer, poboljšanjem kliničkog stanja ili smanjenjem simptoma.

Precizna efikasna količina za ispitanika zavisiće od telesne težine, veličine i zdravlja ispitanika; prirode i obima stanja; i terapije izabrane za primenu. Kada je lek odobren od strane američke Uprave za hranu i lekove (U.S. Food and Drug Administration - FDA), „terapeutski efikasna količina“ se odnosi na dozu koju je odobrila FDA ili njena partnerska strana agencija za lečenje identifikovane bolesti ili stanja.

[0036] Predmetno obelodanjivanje pruža stabilizovane (ili stabilne) vodene farmaceutske formulacije kao što je pokazano smanjenim količinama agregata i/ili smanjenim brzinama formiranja agregata nakon skladištenja. Kao što je ovde opisano, stabilnost takvih formulacija pokazuje smanjena količina HMWS i/ili smanjene brzine formiranja HMWS nakon skladištenja u različitim vremenskim periodima i na različitim temperaturama. Generalno, formulacije veće stabilnosti povezane su sa nižim količinama HMWS, nižim brzinama formiranja HMWS i/ili višim glavnim pikovima antitela na višim temperaturama skladištenja, u odnosu na niže temperature. Kao što se ovde koristi, termin „vrste visoke molekulske mase“ ili „HMWS“ odnosi se na agregate višeg reda antitela formulacija, kao i agregate nižeg reda antitela formulacija. Agregati nižeg reda, uključuju, na primer, dimerne vrste. Agregatne količine i brzine formiranja mogu se meriti ili pratiti tehnikama, kao što je, npr. SE-UHPLC. SE-UHPLC hromatogrami antitela, u nekim slučajevima, pokazuju pik oko 5,8 minuta koji predstavlja količinu HMWS vodene farmaceutske formulacije, pik oko 6,7 minuta koji predstavlja vrste dimera i pik oko 8,0 minuta koji odražava količinu netaknutih, neagregiranih oblika antitela. U odnosu na skladištenje na 4°C, skladištenje na 37°C omogućava ubrzanje testa stabilnosti tako da se stabilnost određene formulacije može odrediti u kraćem vremenskom periodu, u odnosu na vremenski period skladištenja na 4°C. Na primer, skladištenje na 37 °C tokom 1, 2 ili 3 meseca može biti indikativno ili prediktivno skladištenje na 4 °C tokom 36 meseci.

[0037] Stabilizovana formulacija kao što je ovde opisano može pokazati smanjeni obim i brzinu formiranja HMWS nakon 3 meseca skladištenja na 37°C, u poređenju sa kontrolnom formulacijom ekvivalentne koncentracije koja se sastoji od 10 mM acetata, 5% (m./vol.) sorbitola, 0,01% (m./vol.) polisorbata 20 kao pomoćnih supstanci i ima pH rastvora od 5,2.

[0038] Stabilizovana formulacija kao što je ovde opisano i koja uključuje inhibitor agregacije aminokiselina može pokazati smanjeni obim formiranja HWMS nakon 1 meseca skladištenja na 37°C, u poređenju sa ekvivalentnom kontrolnom formulacijom bez inhibitora agregacije aminokiselina. Na primer, obim formiranja se može smanjiti tako da je % količina HMWS putem SE-UPHLC manja za najmanje oko 0,1%, ili oko 0,2%, ili oko 0,3%, ili oko 0,4%, ili oko 0,5%, ili oko 0,6%, ili oko 0,7%, na primer, u opsegu od oko 0,1% do oko 2%, ili oko 0,1% do oko 1%, u poređenju sa kontrolnom formulacijom nakon 1 meseca skladištenja na 37°C.

[0039] Stabilizovana formulacija kao što je ovde opisano može imati nisku količinu HMWS nakon jednomesečnog skladištenja na 37°C, pomoću SE-UHPLC. Na primer, količina HMWS može biti ne više od 2%, ili manje od 2%, ili ne više od 1,9%, ili manje od 1,9%, ili ne više od 1,8%, ili manje od 1,8%, ili ne više od 1,7%, ili manje od 1,7%, ili ne više od 1,6%, ili manje od 1,6%, ili ne više od 1,5%, ili manje od 1,5%, ili ne više od 1,4%, ili manje od 1,4%, ili ne više od 1,3%, ili manje od 1,3%, ili ne više od 1,2%, ili manje od 1,2%, na primer u rasponu od oko 0,01% do oko 2%, ili oko 0,01% do oko 1,9%, ili oko 0,01% do oko 1,8%, ili oko 0,01% do oko 1,7%, ili oko 0,01% do oko 1,6%, ili oko 0,01% do oko 1,5%, ili oko 0,01% do oko 1,4%, ili oko 0,01% do oko 1,3% ili oko 0,01% do oko 1,2%. Količina HMWS nakon jednomesečnog skladištenja na 37°C, pomoću SE-UHPLC može biti veća od 2%, npr. veća od 2% i do 3%, dok smanjena brzina agregacije koju pruža inhibitor agregacije aminokiselina može omogućiti odgovarajući rok trajanja proizvoda, npr. do tri godine ili do dve godine.

[0040] Stabilizovana formulacija kao što je ovde opisano može imati nisku količinu HMWS nakon tromesečnog skladištenja na 37°C, pomoću SE-UHPLC. Na primer, količina HMWS može biti ne više od 2%, ili manje od 2%, ili ne više od 1,9%, ili manje od 1,9%, ili ne više od 1,8%, ili manje od 1,8%, ili ne više od 1,7%, ili manje od 1,7%, ili ne više od 1,6%, ili manje od 1,6%, ili ne više od 1,5%, ili manje od 1,5%, ili ne više od 1,4%, ili manje od 1,4%, ili ne više od 1,3%, ili manje od 1,3%, ili ne više od 1,2%, ili manje od 1,2%, na primer u rasponu od oko 0,01% do oko 2%, ili oko 0,01% do oko 1,9%, ili oko 0,01% do oko 1,8%, ili oko 0,01% do oko 1,7%, ili oko 0,01% do oko 1,6%, ili oko 0,01% do oko 1,5%, ili oko 0,01% do oko 1,4%, ili oko 0,01% do oko 1,3%, ili oko 0,01% do oko 1,2%.

[0041] Stabilizovana formulacija kao što je ovde opisano može imati nisku količinu HMWS nakon 36 meseci skladištenja na 4 °C, pomoću SE-UHPLC. Na primer, količina HMWS može biti ne više od 2%, ili manje od 2%, ili ne više od 1,9%, ili manje od 1,9%, ili ne više

1

od 1,8%, ili manje od 1,8%, ili ne više od 1,7%, ili manje od 1,7%, ili ne više od 1,6%, ili manje od 1,6%, ili ne više od 1,5%, ili manje od 1,5%, ili ne više od 1,4%, ili manje od 1,4%, ili ne više od 1,3%, ili manje od 1,3%, ili ne više od 1,2%, ili manje od 1,2%, na primer u rasponu od oko 0,01% do oko 2%, ili oko 0,01% do oko 1,9%, ili oko 0,01% do oko 1,8%, ili oko 0,01% do oko 1,7%, ili oko 0,01% do oko 1,6%, ili oko 0,01% do oko 1,5%, ili oko 0,01% do oko 1,4%, ili oko 0,01% do oko 1,3%, ili oko 0,01% do oko 1,2%.

[0042] Stabilizovana formulacija kao što je ovde opisano može imati visoki iznos glavnog pika denosumaba ili drugog antitela (ili njegovog dela koji se vezuje za antigen) nakon jednomesečnog skladištenja na 37°C, pomoću SE-UHPLC. Na primer, iznos glavnog pika može biti najmanje 95%, ili veći od 95%, ili najmanje 96%, ili veći od 96%, ili najmanje 97%, ili veći od 97%, ili najmanje 97,5%, ili veći od 97,5%, ili najmanje 98%, ili veći od 98%, ili najmanje 98,1%, ili veći od 98,1%, ili najmanje 98,2%, ili veći od 98,2%, ili najmanje 98,3%, ili veći od 98,3%, ili najmanje 98,4%, ili veći od 98,4%, ili najmanje 98,5%, ili veći od 98,5%, ili najmanje 98,6%, ili veći od 98,6%, na primer u rasponu od oko 95% do oko 99,9%, ili oko 96% do oko 99,9%, ili oko 97% do oko 99,9%, ili oko 97,5% do oko 99,9%, ili oko 98% do oko 99,9%, ili oko 98,1% do oko 99,9%, ili oko 98,2% do oko 99,9%, ili oko 98,3% do oko 99,9%, ili oko 98,4% do oko 99,9%, ili oko 98,5% do oko 99,9%, ili oko 98,6% do oko 99,9%.

[0043] Stabilizovana formulacija kao što je ovde opisano može imati visoki iznos glavnog pika denosumaba ili drugog antitela (ili njegovog dela koji se vezuje za antigen) nakon 3 meseca skladištenja na 37°C, pomoću SE-UHPLC. Na primer, iznos glavnog pika može biti najmanje 95%, ili veći od 95%, ili najmanje 96%, ili veći od 96%, ili najmanje 97%, ili veći od 97%, ili najmanje 97,5%, ili veći od 97,5%, ili najmanje 98%, ili veći od 98%, ili najmanje 98,1%, ili veći od 98,1%, ili najmanje 98,2%, ili veći od 98,2%, ili najmanje 98,3%, ili veći od 98,3%, ili najmanje 98,4%, ili veći od 98,4%, ili najmanje 98,5%, ili veći od 98,5%, ili najmanje 98,6%, ili veći od 98,6%, na primer u rasponu od oko 95% do oko 99,9%, ili oko 96% do oko 99,9%, ili oko 97% do oko 99,9%, ili oko 97,5% do oko 99,9%, ili oko 98% do oko 99,9%, ili oko 98,1% do oko 99,9%, ili oko 98,2% do oko 99,9%, ili oko 98,3% do oko 99,9%, ili oko 98,4% do oko 99,9%, ili oko 98,5% do oko 99,9%, ili oko 98,6% do oko 99,9% .

1

[0044] Stabilizovana formulacija kao što je ovde opisano može imati visoki iznos glavnog pika denosumaba ili drugog antitela (ili njegovog dela koji se vezuje za antigen) nakon 36 meseci skladištenja na 37°C, pomoću SE-UHPLC. Na primer, iznos glavnog pika može biti najmanje 95%, ili veći od 95%, ili najmanje 96%, ili veći od 96%, ili najmanje 97%, ili veći od 97%, ili najmanje 97,5%, ili veći od 97,5%, ili najmanje 98%, ili veći od 98%, ili najmanje 98,1%, ili veći od 98,1%, ili najmanje 98,2%, ili veći od 98,2%, ili najmanje 98,3%, ili veći od 98,3%, ili najmanje 98,4%, ili veći od 98,4%, ili najmanje 98,5%, ili veći od 98,5%, ili najmanje 98,6%, ili veći od 98,6%, na primer u rasponu od oko 95% do oko 99,9%, ili oko 96% do oko 99,9%, ili oko 97% do oko 99,9%, ili oko 97,5% do oko 99,9%, ili oko 98% do oko 99,9%, ili oko 98,1% do oko 99,9%, ili oko 98,2% do oko 99,9%, ili oko 98,3% do oko 99,9%, ili oko 98,4% do oko 99,9%, ili oko 98,5% do oko 99,9%, ili oko 98,6% do oko 99,9% .

[0045] Smatra se da stabilizovana formulacija može imati i malu količinu HMWS i veliki iznos glavnog pika, u skladu sa gore opisanom specifikacijom, nakon skladištenja.

[0046] Vodene farmaceutske formulacije mogu sadržati najviše oko 4% vrsta visoke molekulske mase (HMWS) i/ili mogu sadržati više od oko 96% glavnog pika antitela, mereno pomoću SE-UHPLC, nakon skladištenja. Vodene farmaceutske formulacije mogu sadržati ne više od oko 3% vrsta visoke molekulske mase (HMWS) i/ili mogu sadržati više od oko 97% glavnog pika antitela, mereno pomoću SE-UHPLC, nakon skladištenja. Vodene farmaceutske formulacije mogu sadržati manje od oko 2% HMWS i/ili više od oko 98% glavnog pika antitela, mereno pomoću SE-UHPLC, nakon skladištenja. Skladištenje može biti na temperaturi od oko 2 °C do oko 8 °C (npr. oko 2°C, oko 3°C, oko 4°C, oko 5°C, oko 6°C, oko 7°C, oko 8°C) najmanje 12 meseci, 24 meseca ili 36 meseci (npr., najmanje ili oko 12 meseci, najmanje ili oko 16 meseci, najmanje ili oko 20 meseci, najmanje ili oko 24 meseca, najmanje ili oko 28 meseci, najmanje ili oko 32 meseca, najmanje ili oko 36 meseci, opciono, duže). Skladištenje može biti na oko 20 °C do oko 30 °C (npr. oko 21 °C do oko 30 °C, oko 22 °C do oko 30 °C, oko 23 °C do oko 30 °C, oko 24 °C do oko 30 °C, oko 25 °C do oko 30 °C, oko 26 °C do oko 30 °C, oko 27 °C do oko 30 °C, oko 28 °C do oko 30 °C, oko 28 °C do oko 30 °C, oko 20 °C do oko 29 °C, oko 20 °C do oko 28 °C, oko 20 °C do oko 27 °C, oko 20 °C do oko 26 °C, oko 20 °C do oko 25 °C, oko 20 °C do oko 24 °C, oko 20 °C do oko 23 °C, oko 20 °C do oko 22 °C) tokom oko 1 meseca (npr. oko 26 dana, oko 27 dana, oko 28 dana, oko 29 dana, oko 30 dana, oko 31 dana, oko 32 dana, oko 33 dana, oko 34 dana, oko 35

1

dana, oko 36 dana). Skladištenje se može sastojati od prvog skladištenja nakon kojeg sledi drugo skladištenje, pri čemu je prvo skladištenje na oko 2 °C do oko 8 °C najmanje 12 meseci, 24 meseca ili 36 meseci, a drugo skladištenje je na oko 20 °C do oko 30 °C u toku oko 1 meseca. Vodene farmaceutske formulacije mogu sadržati ne više od 2% HMWS, ili manje od 2% HMWS, ili ne više od 1,9% HMWS, ili manje od 1,9% HMWS, ili ne više od 1,8% HMWS, ili manje od 1,8% HMWS, ili ne više od 1,7% HMWS, ili manje od 1,7% HMWS, ili ne više od 1,6% HMWS, ili manje od 1,6% HMWS, ili ne više od 1,5% HMWS, ili manje od 1,5% HMWS, ili ne više od 1,4% HMWS, ili manje od 1,4% HMWS, ili ne više od 1,3% HMWS, ili manje od 1,3% HMWS, ili ne više od 1,2% HMWS, ili manje od 1,2% HMWS, na primer u rasponu od oko 0,01% do oko 2% HMWS, ili oko 0,01% do oko 1,9% HMWS, ili oko 0,01% do oko 1,8% HMWS, ili oko 0,01% do oko 1,7% HMWS, ili oko 0,01% do oko 1,6% HMWS, ili oko 0,01% do oko 1,5% HMWS, ili oko 0,01% do oko 1,4% HMWS, ili oko 0,01% do oko 1,3% HMWS, ili oko 0,01% do oko 1,2% HMWS, opciono, mereno pomoću SE-UHPLC. Vodene farmaceutske formulacije mogu da sadrže više od 98% glavnog pika antitela, ili najmanje 95% glavnog pika antitela, ili više od 95% glavnog pika antitela, ili najmanje 96% glavnog pika antitela, ili više od 96% glavnog pika antitela, ili najmanje 97% glavnog pika antitela, ili više od 97% glavnog pika antitela, ili najmanje 97,5% glavnog pika antitela, ili više od 97,5% glavnog pika antitela, ili najmanje 98% glavnog pika antitela, ili više od 98% glavnog pika antitela, ili najmanje 98,1% glavnog pika antitela, ili više od 98,1% glavnog pika antitela, ili najmanje 98,2% glavnog pika antitela, ili više od 98,2% glavnog pika antitela, ili najmanje 98,3% glavnog pika antitela, ili više od 98,3% glavnog pika antitela, ili najmanje 98,4% glavnog pika antitela, ili više od 98,4% glavnog pika antitela, ili najmanje 98,5% glavnog pika antitela, ili više od 98,5% glavnog pika antitela, ili najmanje 98,6% glavnog pika antitela, ili više od 98,6% glavnog pika antitela, na primer u opsegu od oko 95% do oko 99,9% glavnog pika antitela, ili oko 96% do oko 99,9% glavnog pika antitela, ili oko 97% do oko 99,9% glavnog pika antitela, ili oko 97,5% do oko 99,9% glavnog pika antitela, ili oko 98% do oko 99,9% glavnog pika antitela, ili oko 98,1% do oko 99,9% glavnog pika antitela, ili oko 98,2% do oko 99,9% glavnog pika antitela, ili oko 98,3% do oko 99,9% glavnog pika antitela, ili oko 98,4% do oko 99,9% glavnog pika antitela, ili oko 98,5% do oko 99,9% glavnog pika antitela, ili oko 98,6% do oko 99,9% glavnog pika antitela, opciono, mereno pomoću SE-UHPLC.

[0047] Kao što se ovde koristi, termin „antitelo“ se odnosi na protein koji ima konvencionalni format imunoglobulina, koji se sastoji od teških i lakih lanaca i koji sadrži varijabilne i

1

konstantne regione. Na primer, antitelo može biti IgG koji je strukture "u obliku slova Y" dva identična para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan "laki" (obično ima molekulsku masu od oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac (obično ima molekulsku masu od oko 50-70 kDa). Antitelo ima varijabilni region i konstantni region. U IgG formatima, varijabilni region je generalno sa oko 100-110 ili više aminokiselina, sastoji se od tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR) – hipervarijabilna regiona, prvenstveno je odgovoran za prepoznavanje antigena i značajno varira između drugih antitela koja se vezuju za različite antigene. Vidi, npr. Janeway et al., "Structure of the Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes", Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th ed. Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, (1999).

[0048] Ukratko, u skeletu antitela, CDR su ugrađeni u okvir u varijabilnom regionu teškog i lakog lanca gde čine regione koji su u velikoj meri odgovorni za vezivanje i prepoznavanje antigena. Varijabilni region se sastoji od najmanje tri CDR teškog lanca ili tri CDR lakog lanca (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, Md.; vidi takođe Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol.196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883), unutar regiona okvira (označeni regioni okvira 1-4, FR1, FR2, FR3, i FR4, od Kabat et al., 1991; vidi takođe Chothia and Lesk, 1987, supra).

[0049] Humani laki lanci su klasifikovani kao kapa i lambda laki lanci. Teški lanci se klasifikuju kao mi, delta, gama, alfa ili epsilon i definišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA, odnosno IgE. IgG ima nekoliko podklasa, uključujući, ali ne ograničavajući se na IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. IgM ima podklase uključujući, ali ne ograničavajući se na IgM1 i IgM2. Ovde opisana obelodanjivanja uključuju sve takve klase ili izotipove antitela. Konstantni region lakog lanca može biti, na primer, konstantni region lakog lanca tipa kapa ili lambda, npr. konstantni region lakog lanca humanog tipa kapa ili lambda. Konstantni region teškog lanca može biti, na primer, konstantni region teškog lanca alfa-, delta-, epsilon, gama- ili mu tipa, npr. region konstante teškog lanca ljudskog alfa-, delta-, epsilon, gama- ili mu tipa. Shodno tome, antitelo može biti antitelo izotipa IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM, uključujući bilo koji od IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. Anti-RANKL antitelo može biti IgG1, IgG2 ili IgG4 antitelo.

1

[0050] Antitelo može biti monoklonsko antitelo ili poliklonsko antitelo. Antitelo može da sadrži sekvencu koja je suštinski slična prirodnom antitelu koje proizvodi sisar, npr. miš, pacov, zec, koza, konj, kokoš, hrčak, svinja ili čovek. U tom smislu, antitelo se može smatrati kao sisarsko antitelo, npr. antitelo miša, antitelo pacova, antitelo zeca, antitelo koze, antitelo konja, antitelo kokoši, antitelo hrčka, antitelo svinje ili ljudsko antitelo. Anti-RANKL antitelo može biti monoklonsko ljudsko antitelo. Rekombinantni protein može biti himerno antitelo ili humanizovano antitelo. Termin „himerno antitelo“ se ovde koristi za označavanje antitela koje sadrži konstantne domene iz jedne vrste i varijabilne domene iz druge, ili uopštenije, koji sadrže delove aminokiselinske sekvence iz najmanje dve vrste. Termin „humanizovan“ kada se koristi u vezi sa antitelima odnosi se na antitela koja imaju najmanje CDR regione iz ne-humanog izvora koji su projektovani tako da imaju strukturu i imunološku funkciju sličniju pravim ljudskim antitelima od originalnih izvornih antitela. Na primer, humanizacija može uključivati presađivanje CDR iz ne-humanog antitela, kao što je antitelo miša, u ljudsko antitelo. Humanizacija takođe može uključivati odabrane aminokiselinske supstitucije kako bi ne-humana sekvenca izgledala više kao humana sekvenca.

[0051] Antitelo može biti rascepljeno na fragmente enzimima, kao što su npr. papain i pepsin. Papain cepa antitelo da bi proizveo dva Fab fragmenta i jedan Fc fragment. Pepsin cepa antitelo da bi proizveo F(ab')2fragment i pFc' fragment. Vodena farmaceutska formulacija može da sadrži fragment antitela, npr. Fab, Fc, F(ab')2ili pFc', koji zadržava najmanje jedno mesto vezivanja za antigen (RANKL). Što se tiče vodenih farmaceutskih formulacija i postupaka predmetnog obelodanjivanja, antitelu mogu nedostajati određeni delovi antitela i može biti fragment antitela koji se vezuje za RANKL. Fragment antitela može biti antigenvezujući deo anti-RANKL antitela.

[0052] Proteinski proizvodi antitela mogu biti format vezivanja antigena zasnovan na fragmentima antitela, npr. scFvs, Fabs i VHH/VH, koji zadržavaju puni kapacitet vezivanja antigena. Najmanji antigen-vezujući fragment koji zadržava svoje kompletno antigenvezujuće mesto je Fv fragment, koji se u potpunosti sastoji od varijabilnih (V) regiona.

Rastvorljivi, fleksibilni aminokiselinski peptidni linker se koristi za povezivanje V regiona sa scFv (jednolančani varijabilni fragment) fragmentom za stabilizaciju molekula, ili se konstantni (C) domeni dodaju V regionima da bi se generisao Fab fragment [fragment, antigen-vezujući). I scFv i Fab su fragmenti u širokoj upotrebi koji se lako mogu proizvesti kod domaćina, npr. prokariotskih domaćina. Ostali proteinski proizvodi antitela uključuju

2

disulfidnom vezom stabilizovani scFv (ds-scFv), jednolančani Fab (scFab), kao i di- i multimerne formate antitela kao što su dia-, tria- i tetra-tela ili minitela (miniAbs) koja se sastoje od različitih formata koji sadrže scFv povezane sa oligomerizacionim domenima. Najmanji fragmenti su VHH/VH kamelidnog teškog lanca Abs kao i jednodomenskog Abs (sdAb). Gradivni blok koji se najčešće koristi za kreiranje novih formata antitela je jednolančani varijabilni (V)-domenski fragment antitela (scFv), koji se sastoji od V domena iz teškog i lakog lanca (VH i VL domen) povezanih peptidnim linkerom od ~15 aminokiselinskih ostataka. Peptidno telo ili peptidna-Fc fuzija je još jedan proteinski proizvod antitela. Struktura peptidnog tela sastoji se od biološki aktivnog peptida presađenog na Fc domen. Peptidna tela su dobro opisana u struci. Vidi, npr. Shimamoto et al., mAbs 4(5): 586-591 (2012).

[0053] Ostali proteinski proizvodi antitela uključuju, npr. jednolančano antitelo (SCA); diatelo; triatelo; tetratelo; i bispecifična ili trispecifična antitela. Bispecifična antitela se mogu podeliti u pet glavnih klasa: BsIgG, dodati IgG, BsAb fragmenti, bispecifični fuzioni proteini i BsAb konjugati. Vidi, npr. Spiess et al., Molecular Immunology 67(2) Part A: 97-106 (2015).

[0054] Anti-RANKL antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, može se sastojati, u suštini se sastoji od, ili se sastoji od bilo kog od ovih proteinskih proizvoda antitela (npr. scFv, Fab VHH/VH, Fv fragment, ds-scFv, scFab, dimerno antitelo, multimerno antitelo (npr. diatelo, triatelo, tetratelo), miniAb, peptitelo VHH/VH kamelidnog teškog lanca antitela, sdAb, diatelo; triatelo; A tetratelo; bispecifično ili trispecifično antitelo, BsIgG, dodato IgG, BsAb fragment, bispecifični fuzioni protein i BsAb konjugat).

[0055] Anti-RANKL antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, može se sastojati, u suštini se sastoji ili se sastoji od proteinskog proizvoda antitela u monomernom ili polimernom, oligomernom ili multimernom obliku. U određenim obelodanjivanjima u kojima antitelo sadrži dva ili više različitih fragmenata regiona vezivanja antigena, antitelo se smatra bispecifičnim, trispecifičnim ili multi-specifičnim, ili dvovalentnim, trovalentnim ili multivalentnim, u zavisnosti od broja različitih epitopa koji su prepoznati i vezani antitelima.

[0056] Ljudski antihumani receptorski aktivator nuklearnog faktora kapa-B liganda (anti-RANKL) antitela ili njegov antigen-vezujući deo za upotrebu u formulaciji je antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji specifično vezuje humani RANKL protein ili humani osteoprotegrin (OPGL) protein njegovog fragmenta i inhibira ili neutrališe aktivnost RANKL ili OPGL proteina i/ili inhibira RANK/RANKL signalni put, i ovde se naziva humano anti-RANKL monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući deo. Na primer, formulacije opisane ovde mogu se sastojati od humanog anti-RANKL monoklonskog antitela koje se specifično vezuje za aminokiselinsku sekvencu humanog RANKL (SEQ ID NO: 12) ili njegovog dela. Humani RANKL protein je transmembranski ili rastvorljivi protein koji je kodiran polinukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 11, za koju je poznato da je od suštinskog značaja za formiranje, funkciju i preživljavanje osteoklasta. Na primer, humana anti-RANKL antitela inhibiraju interakciju RANKL sa njegovim receptorom RANK.

[0057] Primer humanog anti-RANKL monoklonskog antitela je denosumab, koji se prodaje u komercijalnom obliku kao Xgeva<®>i Prolia<®>. Xgeva<®>je formulacija denosumaba u dozi od 120 mg u 1,7 ml rastvora (70 mg/ml) u ampuli za jednokratnu upotrebu, koja sadrži 120 mg denosumaba, acetata (18 mM), sorbitola (4,6%), vode za injekcije (USP) i natrijum hidroksida do pH vrednosti od 5,2. Prolia<®>je dostupna kao formulacija denosumaba u dozi od 60 mg u 1 ml rastvora (60 mg/ml). Jedan napunjeni špric za jednokratnu upotrebu od 1 ml Prolia<®>sadrži 60 mg denosumaba (rastvor 60 mg/ml), 4,7% sorbitola, 17 mM acetata, 0,01% polisorbata 20, vode za injekcije (USP) i natrijum hidroksida do pH vrednosti od 5,2.

Posebno se razmatraju formulacije opisane u ovom dokumentu, uključujući denosumab ili njegov deo. Denosumab je potpuno humano IgG2 monoklonsko antitelo koje se vezuje za humani RANKL. Denosumab ima približnu molekulsku masu od 147 kDa i eksprimiran je u ćelijskoj liniji jajnika kineskog hrčka (CHO). Aminokiselinske sekvence varijabilnog lakog lanca (LC) denosumaba i varijabilnog teškog lanca (HC) navedene su kod SEQ ID NO: 1 i 2, respektivno, a LC i HC pune dužine su navedene kao SEQ ID NO: 3 i 4; respektivno.

Nukleinska kiselina koja se sastoji od nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 (denosumab varijabilni LC) je, opciono, nukleinska kiselina SEQ ID NO: 19. Nukleinska kiselina koja se sastoji od nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 (varijabilni HC denosumaba) je, opciono, nukleinska kiselina SEQ ID NO: 20. Nukleinska kiselina koja se sastoji od nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 (LC pune dužine denosumaba) je, opciono, nukleinska kiselina SEQ ID NO: 21. Nukleinska kiselina koja se sastoji od nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 (HC pune dužine denosumaba) je, opciono, nukleinska kiselina SEQ ID NO: 23. Zreli oblik LC, koji je predstavljen kao aminokiseline 21-235 pune dužine LC, naveden je kao SEQ ID NO: 13, dok je zreli oblik HC, koji je predstavljen kao aminokiseline 20-467 pune dužine HC, naveden kao SEQ ID NO: 14. Nukleinska kiselina koja se sastoji od nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13 (zreli oblik LC) je, opciono, nukleinska kiselina SEQ ID NO: 22. Nukleinska kiselina koja se sastoji od nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 (zreli oblik HC) je, opciono, nukleinska kiselina SEQ ID NO: 24. Pored toga, denosumab LC CDR su navedeni kao SEQ ID NO: 5 (LC CDR1), SEQ ID NO: 6 (LC CDR2) i SEQ ID NO: 7 (LC CDR3). Denosumab HC CDR-i su navedeni kao SEQ ID NO: 8 (HC CDR1), SEQ ID NO: 9 (HC CDR2) i SEQ ID NO: 10 (HC CDR3). Denosumab je opisan i patentiran u Međunarodnoj prijavi patenta br. WO 03/002713 i US Patent br.7,364,736.

[0058] Kao što se ovde koristi, termin „denosumab“ uključuje biološki slične lekove denosumaba. Kako se ovde koristi, „biološki sličan“ (odobreni referentni proizvod/biološki lek, kao što je proteinski terapeutik, antitelo itd.) odnosi se na biološki proizvod koji je sličan referentnom proizvodu na osnovu podataka izvedenih iz (a) analitičkih studija koje pokazuju da je biološki proizvod veoma sličan referentnom proizvodu bez obzira na manje razlike u klinički neaktivnim komponentama; (b) studija na životinjama (uključujući procenu toksičnosti); i/ili (c) kliničkih studija ili studija (uključujući procenu imunogenosti i farmakokinetike ili farmakodinamike) koje su dovoljne da pokažu bezbednost, čistoću i potenciju u jednom ili više odgovarajućih uslova upotrebe za koje je referentni proizvod licenciran i namenjen za upotrebu i za koje se traži izdavanje dozvole za biološki proizvod. Biološki sličan biološki proizvod i referentni proizvod mogu koristiti isti mehanizam ili mehanizme delovanja za uslov ili uslove upotrebe koji su propisani, preporučeni ili predloženi u predloženom obeležavanju, ali samo u meri u kojoj su mehanizam ili mehanizmi delovanja poznati za referentni proizvod. Uslov ili uslovi upotrebe propisani, preporučeni ili predloženi na etiketi predloženoj za biološki proizvod možda su prethodno odobreni za referentni proizvod. Put primene, oblik doziranja i/ili jačina biološkog proizvoda mogu biti isti kao kod referentnog proizvoda. Objekat u kojem se biološki proizvod proizvodi, prerađuje, pakuje ili drži može ispunjavati standarde dizajnirane da osiguraju da biološki proizvod i dalje bude bezbedan, čist i potentan. Referentni proizvod može biti odobren bar u jednom od sledećeg: SAD, Evropa ili Japan. Biološki sličan lek može biti, na primer, antitelo koje ima istu primarnu aminokiselinsku sekvencu kao antitelo na tržištu, ali može biti

2

proizvedeno u različitim tipovima ćelija ili različitim postupcima proizvodnje, prečišćavanja ili formulacije.

[0059] Formulacije mogu da se sastoje od humanog anti-RANKL antitela koje se sastoji od najmanje jedne od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 1-4, 13, 14 ili njihovog dela. Formulacije mogu da sadrže humano anti-RANKL antitelo koje se sastoji od najmanje jedne od CDR aminokiselinskih sekvenci navedenih kao SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ili SEQ ID NO: 10, ili najmanje dve od CDR aminokiselinskih sekvenci navedenih kao SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ili SEQ ID NO: 10, ili najmanje tri CDR aminokiselinske sekvence navedene kao SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ili SEQ ID NO: 10, ili najmanje četiri CDR aminokiselinske sekvence navedene kao SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ili SEQ ID NO: 10, ili najmanje pet CDR aminokiselinskih sekvenci navedenih kao SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ili SEQ ID NO: 10, ili najmanje šest CDR aminokiselinskih sekvenci navedenih kao SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ili SEQ ID NO: 10.

[0060] Formulacije mogu da sadrže humano anti-RANKL antitelo koje se sastoji od najmanje jedne aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-4, 13 i 14 i inhibira interakciju između RANKL i njegovog receptora, RANK, ili humano anti-RANKL antitelo koje se sastoji od najmanje jedne aminokiselinske sekvence koja je najmanje 85% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-4, 13 i 14 i inhibira interakciju između RANKL i njegovog receptora, RANK, ili humano anti-RANKL antitelo koje se sastoji od najmanje jedne aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-4, 13 i 14 i inhibira interakciju između RANKL i njegovog receptora, RANK ili humano anti-RANKL antitelo koje se sastoji od najmanje jedne aminokiselinske sekvence koja je najmanje 91% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-4, 13 i 14 i inhibira interakciju između RANKL i njegovog receptora, RANK, ili humano anti-RANKL antitelo koje se sastoji od najmanje jedne aminokiselinske sekvence koja je najmanje 92% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-4, 13 i 14 i inhibira interakciju između RANKL i njegovog receptora, RANK, ili humano anti-RANKL antitelo koje sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 93% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-4, 13 i 14 i inhibira interakciju između RANKL i njegovog receptora, RANK, ili humano anti-RANKL antitelo koje sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 94% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-4, 13 i 14 i inhibira interakciju između RANKL i njegovog receptora, RANK, ili humano anti-RANKL antitelo koje se sastoji od najmanje jedne aminokiselinske sekvence koja je najmanje 95% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-4, 13 i 14 i inhibira interakciju između RANKL i njegovog receptora, RANK, ili humano anti-RANKL antitelo koje se sastoji od najmanje jedne aminokiselinske sekvence koja je najmanje 96% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-4 ,13 i 14 i inhibira interakciju između RANKL i njegovog receptora, RANK, ili humano anti-RANKL antitelo koje se sastoji od najmanje jedne aminokiselinske sekvence koja je najmanje 97% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-4, 13 i 14 i inhibira interakciju između RANKL i njegovog receptora, RANK, ili humano anti-RANKL antitelo koje se sastoji od najmanje jedne aminokiselinske sekvence koja je najmanje 98% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-4, 13 i 14 i inhibira interakciju između RANKL i njegovog receptora, RANK, ili humano anti-RANKL antitelo koje se sastoji od najmanje jedne aminokiselinske sekvence koja je najmanje 99% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-4, 13 i 14 i inhibira interakciju između RANKL i njegovog receptora, RANK.

[0061] Vodena farmaceutska formulacija može da sadrži anti-RANKL antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, uključujući proteinski proizvod antitela, kao što je ovde opisano. Anti-RANKL antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, sastoji se od varijabilnog domena lakog lanca koji se sastoji od CDR1 sekvence lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 5. Anti-RANKL antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, može se sastojati od varijabilnog domena lakog lanca koji se sastoji od CDR2 sekvence lakog lanca koja se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 6. Anti-RANKL antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, može se sastojati od varijabilnog domena teškog lanca koji se sastoji od CDR3 sekvence teškog lanca koja se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 10. Anti-RANKL antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, može da sadrži SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 10. Anti-RANKL antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, može da sadrži (i) varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence CDR3 lakog lanca koja se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:7; (ii) varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence CDR1 teškog lanca koja se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 8, opciono, SEQ ID NO: 27; (iii) varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence CDR2 teškog lanca koja se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 9, ili (iv) bilo koja njihova kombinacija. Anti-RANKL antitelo, ili

2

njegov deo koji vezuje antigen, može sadržati (A) varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od CDR1 lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 5, varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od CDR2 lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 6, i varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od CDR3 lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7; i (B) varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od CDR1 teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 8 (opciono, SEQ ID NO: 27), varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od CDR2 teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9, i varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od CDR3 teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 10. Anti-RANKL antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, može sadržati: (A) varijabilni domen lakog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od: (i) varijabilnog domena lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80% (npr. najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%) identična sa SEQ ID NO: 1; (ii) varijabilnog domena lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kodirane polinukleotidnom sekvencom koja se sastoji od SEQ ID NO: 19; i (iii) varijabilnog domena lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kodirane polinukleotidom koji hibridizuje pod strogim uslovima sa komplementom polinukleotida koji se sastoji od SEQ ID NO: 19; ili (B) varijabilni domen teškog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od: (i) varijabilnog domena teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80% (npr., najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%) identična sa SEQ ID NO: 2; (ii) varijabilnog domena teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kodirane polinukleotidnom sekvencom koja se sastoji od SEQ ID NO: 20, i (iii) varijabilnog domena teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kodirane polinukleotidom koji se pod strogim uslovima hibridizuje sa komplementom polinukleotida koji se sastoji od SEQ ID NO: 20; ili (C) varijabilni domen lakog lanca od (A) i varijabilni domen teškog lanca od (B). Anti-RANKL antitelo može biti potpuno humano antitelo, humanizovano antitelo ili himerno antitelo. Deo koji se vezuje za antigen može biti Fab, Fab', F(ab')2 ili jednolančani Fv. Anti-RANKL antitelo može biti IgG1, IgG2ili IgG4antitelo, opciono, pri čemu anti-RANKL antitelo sadrži sekvencu SEQ ID NO: 15. Anti-RANKL antitelo može da sadrži sekvencu SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 ili SEQ ID NO: 18. Anti-RANKL antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, može se sastojati od: (A) lakog lanca izabranog iz grupe koja se sastoji od: (i) lakog

2

lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80% (npr. najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%) identična sa SEQ ID NO: 3 ili SEQ ID NO: 13; (ii) lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kodirane polinukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 21 ili 23; i (iii) lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kodirane polinukleotidom koji se hibridizuje pod strogim uslovima do komplementa polinukleotida koji se sastoji od SEQ ID NO: 21 ili 23; ili (B) teškog lanca izabranog iz grupe koja se sastoji od: (i) teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80% (npr., najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%) identična sa SEQ ID NO: 4 ili SEQ ID NO: 14; (ii) teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kodirane polinukleotidnom sekvencom koja se sastoji od SEQ ID NO: 22 ili 24, i (iii) teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kodirane polinukleotidom koji se pod strogim uslovima hibridizuje sa komplementom polinukleotida koji se sastoji od SEQ ID NO: 22 ili 24; ili (C) varijabilnog domena lakog lanca od (A) i varijabilnog domena teškog lanca od (B).

[0062] Koncentracija denosumaba ili drugog humanog anti-RANKL antitela, ili njegovog dela koji se vezuje za antigen, u vodenoj formulaciji može generalno biti u bilo kom korisnom opsegu, npr. oko 0,1 do oko 200 mg/ml. Kako se koncentracija povećava, dolazi do povećanja viskoziteta, što može ometati preradu formulacije u izvođenje sterilne doze za farmaceutsku upotrebu.

[0063] Poboljšana stabilnost formulacije inhibitorom agregacije aminokiselina može postojati u bilo kojoj koncentraciji denosumaba ili drugog humanog anti-RANKL antitela, ili njegovog dela koji se vezuje za antigen, uključujući oko 10 mg/ml do oko 200 mg/ml, ili oko 15 mg/ml do oko 150 mg/ml, ili oko 30 mg/ml do oko 200 mg/ml, ili oko 60 mg/ml do oko 200 mg/ml, ili oko 60 mg/ml do oko 180 mg/ml, ili oko 60 mg/ml do oko 160 mg/ml, ili oko 60 mg/ml do oko 150 mg/ml, ili oko 60 mg/ml do oko 140 mg/ml, ili oko 60 mg/ml do oko 130 mg/ml, ili oko 60 mg/ml do oko 120 mg/ml, ili oko 60 mg/ml do oko 110 mg/ml, ili oko 60 mg/ml do oko 100 mg/ml, ili oko 60 mg/ml do oko 90 mg/ml, ili oko 60 mg/ml do oko 80 mg/ml, ili oko 60 mg/mL do oko 70 mg/mL, ili oko 70 mg/mL do oko 200 mg/mL, ili oko 70 mg/mL do oko 180 mg/mL, ili oko 70 mg/mL do oko 160 mg/mL, ili oko 70 mg/mL do oko 150 mg/mL, ili oko 70 mg/mL do oko 140 mg/mL, ili oko 70 mg/mL do oko 130 mg/mL, ili oko

2

70 mg/mL do oko 120 mg/mL, ili oko 70 mg/mL do oko 110 mg/mL, ili oko 70 mg/mL do oko 100 mg/mL, ili oko 70 mg/mL do oko 90 mg/mL, ili oko 70 mg/mL do oko 80 mg/mL, na primer 120 mg/mL.

[0064] Koncentracija denosumaba ili drugog humanog anti-RANKL antitela, ili njegovog dela koji se vezuje za antigen, za formulacije koje imaju pH od oko 5,0 do manje od 5,2 može se razmotriti da obuhvati opsege veće od 70 mg/ml, ili najmanje 71 mg/ml, ili najmanje oko 75 mg/ml, ili najmanje oko 80 mg/ml, ili najmanje oko 85 mg/ml, ili najmanje oko 90 mg/ml, ili najmanje oko 95 mg/ml, ili najmanje oko 100 mg/ml, ili najmanje oko 105 mg/ml, ili najmanje oko 110 mg/ml, ili najmanje oko 115 mg/ml, ili najmanje oko 120 mg/ml, i do oko 200 mg/ml. Na primer, predviđeni opsezi uključuju, 71 mg/ml do oko 200 mg/ml, ili oko 75 mg/ml do oko 200 mg/ml, ili oko 75 mg/ml do oko 180 mg/ml, ili oko 75 mg/ml do oko 160 mg/ml, ili oko 75 mg/ml do oko 150 mg/ml, ili oko 75 mg/ml do oko 140 mg/ml, ili oko 75 mg/ml do oko 130 mg/ml, ili oko 75 mg/ml do oko 120 mg/ml, ili oko 75 mg/ml do oko 110 mg/ml, ili oko 75 mg/ml do oko 100 mg/ml, ili oko 75 mg/ml do oko 90 mg/ml, ili oko 120 mg/ml do oko 200 mg/ml, ili oko 120 mg/ml do oko 180 mg/ml, ili oko 120 mg/ml do oko 160 mg/ml, ili oko 120 mg/ml do oko 140 mg/ml, na primer 120 mg/ml.

[0065] Vodena farmaceutska formulacija može da sadrži antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, u koncentraciji većoj od 70 mg/ml, npr. većoj od 80 mg/ml, većoj od 90 mg/ml, većoj od 100 mg/ml, većoj od 125 mg/ml, većoj od 150 mg/ml, većoj od 175 mg/ml, većoj od 200 mg/ml, većoj od 225 mg/ml, većoj od 250 mg/ml, većoj od 275 mg/ml. Vodena farmaceutska formulacija može da sadrži antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, u koncentraciji manjoj od oko 300 mg/ml, npr. manjoj od oko 275 mg/ml, manjoj od oko 250 mg/ml, manjoj od oko 225 mg/ml, manjoj od oko 200 mg/ml, manjoj od oko 175 mg/ml, ili manjoj od oko 150 mg/ml. Koncentracija antitela, ili njegovog dela koji se vezuje za antigen, u formulaciji je u opsegu od oko 10 mg/ml do oko 300 mg/ml, npr. oko 25 mg/ml do oko 300 mg/ml, oko 50 mg/ml do oko 300 mg/ml, oko 75 mg/ml do oko 300 mg/ml, oko 125 mg/ml do oko 300 mg/ml, oko 150 mg/ml do oko 300 mg/ml, oko 175 mg/ml do oko 300 mg/ml, oko 200 mg/ml do oko 300 mg/ml, oko 225 mg/ml do oko 300 mg/ml, oko 250 mg/ml do oko 300 mg/ml, oko 275 mg/ml do oko 300 mg/ml, oko 10 mg/ml do oko 275 mg/ml, oko 10 mg/ml do oko 250 mg/ml, oko 10 mg/ml do oko 225 mg/ml, oko 10 mg/ml do oko 200 mg/ml, oko 10 mg/ml do oko 175 mg/ml, oko 10 mg/ml do oko 150 mg/ml, oko 10 mg/ml do oko 125 mg/ml, oko 10 mg/ml do oko 100 mg/ml, oko 10 mg/ml do oko 75 mg/ml, oko 10

2

mg/ml do oko 50 mg/ml, ili oko 10 mg/ml do oko 25 mg/ml. Vodena farmaceutska formulacija može da sadrži koncentraciju antitela ili njegovog dela koji se vezuje za antigen, u opsegu većem od 70 mg/ml do oko 300 mg/ml, npr. većem od 80 mg/ml do oko 300 mg/ml, većem od 90 mg/ml do oko 300 mg/ml, većem od 100 mg/ml do oko 300 mg/ml, većem od 125 mg/ml do oko 300 mg/ml, većem od 150 mg/ml do oko 300 mg/ml, većem od 175 mg/ml do oko 300 mg/ml, većem od 200 mg/ml do oko 300 mg/ml, većem od 70 mg/ml do oko 275 mg/ml, većem od oko 70 mg/ml do oko 250 mg/ml, većem od oko 70 mg/ml do oko 225 mg/ml, većem od oko 70 mg/ml do oko 200 mg/ml, većem od oko 70 mg/ml do oko 175 mg/ml, većem od oko 70 mg/ml do oko 150 mg/ml, većem od oko 70 mg/ml do oko 125 mg/mL, većem od oko 70 mg/mL do oko 100 mg/mL. Vodena farmaceutska formulacija može da sadrži koncentraciju antitela ili njegovog dela koji se vezuje za antigen u opsegu od oko 100 do oko 140 mg/ml, npr. oko 110 mg/ml, oko 120 mg/ml, oko 130 mg/ml. Vodena farmaceutska formulacija može da sadrži koncentraciju antitela ili njegovog dela koji se vezuje za antigen, koja je oko 120 mg/ml ± 12 mg/ml, npr. oko 108 mg/ml do oko 132 mg/ml, oko 115 mg/ml do oko 125 mg/ml, oko 116 mg/ml, oko 117 mg/ml, oko 118 mg/ml, oko 119 mg/ml, oko 120 mg/ml, oko 121 mg/ml, oko 122 mg/ml, oko 123 mg/ml, oko 124 mg/ml.

[0066] Denosumab i druga humana anti-RANKL monoklonska antitela i njihovi delovi koji vezuju antigen mogu se pripremiti u skladu sa opisom datim u međunarodnoj patentnoj publikaciji WO 2003002713 A2.

[0067] Studije formulacije rastvora denosumaba visoke koncentracije (npr.120 mg/ml), opisane u nastavku, pokazale su veliko povećanje formiranja HMWS (brzina i obim) ispod pH 5, a posebno pri nižoj pH vrednosti (npr. pH 4,5). Pokazalo se da sa povećavanjem pH, dolazi do povećanja formiranja dimernih vrsta. Uravnotežavanjem ova dva efekta, smatra se da će ovde opisana formulacija imati pH u opsegu od oko 5,0 do manje od 5,2, ili oko 5,0 do oko 5,19, ili oko 5,0 do oko 5,15, ili oko 5,0 do oko 5,10, na primer oko 5,0, oko 5,05, oko 5,1 ili oko 5,15.

[0068] Ovde opisane studije su takođe pokazale nezavisan efekat stabilizacije i smanjenja agregacije koji je omogućen uključivanjem inhibitora agregacije aminokiselina. Shodno tome, razmatra se da kada je uključen inhibitor agregacije aminokiselina, pH formulacije može biti u opsegu od oko 4,9 do oko 5,4, ili oko 5,0 do oko 5,4, ili oko 5,0 do oko 5,2, ili

2

oko 5,0 do manje od 5,2, ili oko 5,0 do 5,19, ili oko 5,0 do oko 5,15, ili oko 5,0 do oko 5,10, na primer oko 5,0, oko 5,05, oko 5,1, ili oko 5,15, ili oko 5,2.

[0069] Vodena formulacija se može puferisati. Kada se koristi, pufer može biti organski pufer. Puferski sistem se može centrirati na 25 °C oko pH 4 do 5,5, ili 4,5 do 5,5, ili 4,5 do 5, na primer. Na primer, puferski sistem može imati pKa u okviru jedne pH jedinice od pH 5,0-5,2 na 25 °C. Jedan takav puferski sistem je sirćetna kiselina /acetat, sa pKa od oko 4,75 na 25°C. Drugi takav puferski sistem je glutaminska kiselina / glutamat, koji ima pKa od oko 4,27 na 25 °C. Drugi alternativni puferski sistemi koji se razmatraju uključuju sisteme zasnovane na jonima uključujući sukcinat (pKa od 4,21 na 25 °C), propionat (pKa od 4,87 na 25 °C), malat (pKa od 5,13 na 25 °C), piridin (pKa od 5,23 na 25 °C) i piperazin (pKa od 5,33 na 25 °C). Smatra se da se pufer može obezbediti kao natrijum so (ili dinatrijum so, po potrebi), ili kao alternativa kao kalijum, magnezijum ili amonijum so. Puferi se mogu zasnivati na acetatu, citratu, sukcinatu, fosfatu i hidroksimetilaminometanu (Tris), na primer. Posebno se razmatraju puferi na bazi acetata, glutamata i sukcinata, npr. acetat ili glutamat.

[0070] Poređenje formiranja HMWS pomoću tečne hromatografije isključivanja po veličini ultra visokih performansi (SE-UHPLC) u formulacijama denosumaba od 120 mg/ml koje imaju acetatne ili glutamatne pufere, ali inače ekvivalentne, pokazalo je da nema razlike između tipa pufera kada se ocenjuje tokom četiri nedelje skladištenja na 37°C.

[0071] Kada se koristi, pufer će biti uključen u dovoljnoj količini da održi izabrani pH formulacije pri uslovima skladištenja za rok trajanja proizvoda, npr.3 godine na 4°C, ili 1 mesec na 25°C, ili 2 nedelje na 25°C, ili 7 dana na 25°C. Koncentracija pufera može biti u opsegu od oko 2 mM do oko 40 mM, ili oko 5 mM do oko 20 mM, ili oko 10 mM do oko 25 mM, ili oko 15 mM do oko 25 mM, na primer 10 mM, ili 15 mM, ili 18 mM, ili 25 mM. Na primer, acetatni pufer koji se koristi sa anti-RANKL monoklonskim antitelima (npr. denosumab) i fenilalaninom može biti u opsegu od oko 2 mM do oko 30 mM, ili oko 16 mM do oko 41 mM, ili oko 25 mM do oko 39 mM, ili oko 30 mM do oko 34 mM. Drugim rečima, pufer za dijafiltraciju koji se koristi za koncentrisanje antitela do koncentracije veće od 70 mg/ml (npr. 120 mg/ml) može biti u opsegu od 5 mM do oko 30 mM, ili oko 15 mM do oko 25 mM, ili oko 20 mM. Takođe se razmatra obezbeđivanje formulacije stabilizovane aminokiselinom koja je samo-puferovana. Pufer može biti uključen u dovoljnoj količini da održi izabrani pH formulacije pri uslovima skladištenja za rok trajanja proizvoda, npr.36 meseci na oko 2°C do oko 8°C, opciono, nakon čega sledi oko 1 mesec na oko 20°C do oko 30°C.

[0072] Vodena farmaceutska formulacija može da sadrži pufer, a opciono, pufer je centriran, na 25°C, u opsegu od oko pH 4,0 do oko pH 5,5. Pufer može imati pKa u okviru jedne pH jedinice od pH 5,0-5,2 na 25 °C. Vodena farmaceutska formulacija može da sadrži oko 5 mM do oko 60 mM pufera, oko 5 mM do oko 50 mM pufera, ili oko 9 mM do oko 45 mM pufera (npr. oko 15 mM do oko 30 mM pufera, npr. oko 20 mM, oko 25 mM pufera). Pufer može biti acetat ili glutamat.

[0073] Formulacija takođe može uključivati jedan ili više stabilizatora protiv agregacije proteina i druge pomoćne supstance formulacije. Smatra se da takvi stabilizatori i pomoćne supstance – ekscipijensi, uključuju, ali nisu ograničeni na, inhibitore agregacije aminokiselina, modifikatore toničnosti, surfaktante – površinski aktivna sredstva, agense solubilizacije (npr. N-metil-2-pirolidon), PEG konjugaciju i ciklodekstrine (npr. Captisol<®>).

[0074] Termin „inhibitor agregacije aminokiselina“ odnosi se na aminokiselinu ili kombinaciju aminokiselina (npr. smeše, ili dipeptide, ili oligopeptide koji imaju 2 do 10 ostataka), pri čemu je bilo koja data aminokiselina prisutna ili u slobodnom baznom obliku ili u obliku soli (npr. arginin HCl), ili u analogu aminokiseline, i koji smanjuje HMWS ili inhibira stvaranje HMWS. Razmatraju se soli, uključujući natrijumove soli, kalijumove soli i hidrohlorid soli. Pored toga, razmatraju se argininske soli sa hidrohloridom, glutamatom, butiratom i glikolatom. Kada se koristi kombinacija aminokiselina, sve aminokiseline mogu biti prisutne u svojim oblicima slobodne baze, sve mogu biti prisutne u svojim oblicima soli, ili neke mogu biti prisutne u svojim oblicima slobodne baze, dok su druge prisutne u svojim oblicima soli. Pored toga ili kao alternativa dipeptidima i oligopeptidima, mogu se koristiti smeše jedne ili više aminokiselina, npr. smeša arginina i fenilalanina. U vodenoj farmaceutskoj formulaciji može biti prisutan samo jedan tip inhibitora agregacije aminokiselina. Može biti prisutna samo jedna aminokiselina, npr. u formulaciji može biti prisutan samo L-arginin ili samo L-fenilalanin.

[0075] Razmatra se upotreba jedne ili više aminokiselina koje nose naelektrisani bočni lanac, na primer jednog ili više arginina, lizina, histidina, aspartata i glutamata. Aminokiseline se mogu izabrati između baznih aminokiselina, npr. arginina, lizina, histidina ili njihove

1

kombinacije. Posebno se razmatra arginin. Bilo koji stereoizomer (tj. L, D ili DL izomer) određene aminokiseline, ili kombinacije ovih stereoizomera, može se koristiti u predmetnom postupku ili formulaciji sve dok je određena aminokiselina prisutna u svom slobodnom baznom obliku ili obliku soli. Posebno se razmatra L-stereoizomer, npr. L-arginin. Opciono, aminokiselina je ona koja ima pozitivno naelektrisan bočni lanac, npr. arginin.

[0076] Opciono, razmatra se upotreba jedne ili više aminokiselina koje imaju aromatične prstenove u svojim bočnim lancima, npr. fenilalanin, tirozin, triptofan ili njihova kombinacija. Posebno se razmatra fenilalanin.

[0077] Opciono, razmatra se upotreba jedne ili više hidrofobnih aminokiselina, na primer alanin, izoleucin, leucin, fenilalanin, valin, prolin ili glicin.

[0078] Opciono, razmatra se upotreba jedne ili više alifatskih, hidrofobnih aminokiselina, na primer, alanina, izoleucina, leucina ili valina. Posebno se razmatra leucin.

[0079] Analozi aminokiselina koji pokazuju efekte smanjenja ili inhibicije agregacije takođe bi se mogli koristiti u ovoj metodi ili formulaciji. Termin „analog aminokiseline“ se odnosi na derivat prirodne aminokiseline. Razmatrani analozi uključuju, na primer, amino- i N-monoetil-, i n-acetil-derivate. Ostali razmatrani analozi uključuju dipeptide ili oligopeptide koji imaju 2 do 10 ostataka, npr. arginin-arginin i fenilalanin-arginin. Opciono, razmatra se da se n-acetil arginin i n-acetil lizin neće koristiti sami, već se mogu koristiti u kombinaciji sa drugim inhibitorom agregacije aminokiselina. Kao i kod aminokiselina, analozi aminokiselina se koriste u ovoj metodi ili formulaciji u slobodnom baznom obliku ili u obliku soli.

[0080] Inhibitori agregacije aminokiselina koji se koriste u ovoj metodi ili formulaciji štite terapijski aktivni protein od različitih stresova, čime se povećava ili/i održava stabilnost proteina ili formulacije koja sadrži protein tokom životnog veka proteina (pre i tokom skladištenja, pre upotrebe). Ovde, termin "stres" uključuje, ali nije ograničen na toplotu, zamrzavanje, pH, svetlost, mešanje, oksidaciju, dehidraciju, površine, smicanje, zamrzavanje/odmrzavanje, pritisak, teške metale, fenolna jedinjenja, denaturante, itd., iz bilo kog izvora, npr. transportovanja. Posebno se razmatra toplotni stres. Termin stres obuhvata svaki faktor koji modulira (tj. smanjuje, održava ili povećava) stabilnost proteina ili

2

formulacije koja sadrži protein. Povećana i/ili održavana stabilnost uz dodatak inhibitora agregacije aminokiselina javlja se na način zavisan od koncentracije. To jest, povećanje koncentracija inhibitora agregacije aminokiselina dovodi do povećane i/ili održane stabilnosti proteina ili formulacije koja sadrži protein iz predmetnog obelodanjivanja kada taj protein ili formulacija koja sadrži taj protein obično pokazuje formiranje agregata u odsustvu inhibitora agregacije aminokiselina. Kao što je prikazano u sledećim primerima, uključivanje inhibitora agregacije aminokiselina u formulaciju takođe može smanjiti količinu već formirane HMWS. Na primer, takvi inhibitori agregacije aminokiselina uključuju arginin i arginin-fenilalanin dipeptid. Određivanje količine određenog inhibitora agregacije aminokiselina koji će se koristiti u predmetnom postupku ili formulaciji za smanjenje formiranja agregata, čime se povećava stabilnost proteina, a time i stabilnost formulacije tokom celog životnog veka proteina, može se lako odrediti za denosumab ili bilo koje određeno humano anti-RANKL monoklonsko antitelo od interesa s obzirom na obelodanjivanje u ovom dokumentu.

[0081] Pokazalo se da prisustvo inhibitora agregacije aminokiselina u formulaciji smanjuje količinu dimernih vrsta i njihovu kinetičku brzinu formiranja. Na primer, uključivanje arginina u koncentraciji od 75 mM u formulaciji denosumaba koja ima pH od 5,2 rezultiralo je smanjenjem od približno 0,3% i 25% količina dimernih vrsta i njihove kinetičke brzine formiranja, respektivno, nakon 1 meseca na 37°C u poređenju sa sličnom formulacijom bez arginina pri pH od 5,2. Nasuprot tome, utvrđeno je da monoklonsko antitelo koje nije humano anti-RANKL monoklonsko antitelo nije stabilizovano uključivanjem arginina, već je rezultiralo povećanim HMWS. Shodno tome, drugi postupak obelodanjivanja je postupak smanjenja HMWS u formulaciji denosumaba ili drugog humanog anti-RANKL monoklonskog antitela dodavanjem inhibitora agregacije aminokiselina, npr. arginina ili fenilalanina.

[0082] Shodno tome, vodena farmaceutska formulacija može da sadrži inhibitor agregacije aminokiselina, koji je opciono aminokiselina. Aminokiselina može biti L-stereoizomerna aminokiselina (L-aminokiselina), iako se razmatraju D-stereoizomerne aminokiseline (D-aminokiseline). Inhibitor agregacije aminokiselina može da sadrži aminokiselinu koja se sastoji od naelektrisanog bočnog lanca, koji se ovde takođe naziva "naelektrisana aminokiselina". Termin „naelektrisana aminokiselina“ se odnosi na aminokiselinu koja sadrži bočni lanac koji je negativno naelektrisan (tj. deprotoniran) ili pozitivno naelektrisan (tj. protoniran) u vodenom rastvoru pri fiziološkom pH. Na primer, negativno naelektrisane aminokiseline uključuju, na primer, asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu, dok pozitivno naelektrisane aminokiseline uključuju, na primer, arginin, lizin i histidin.

Naelektrisane aminokiseline uključuju naelektrisane aminokiseline među 20 kodiranih aminokiselina, kao i atipične ili u prirodi neprisutne ili nekodirane aminokiseline. Shodno tome, inhibitor agregacije aminokiselina može biti aminokiselina koja se sastoji od bočnog lanca sa pozitivnim naelektrisanjem. Aminokiselina koja se sastoji od bočnog lanca sa pozitivnim naelektrisanjem može sadržati strukturu bočnog lanca formule I ili formule II:

pri čemu je n 1 do 7, pri čemu je svaki od R1i R2nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C18alkil, (C1-C18alkil)OH, (C1-C18alkil)NH2, NH, NH2(C1-C18alkil)SH, (C0-C4alkil)(C3-C6)cikloalkil, (C0-C4alkil)(C2-C5heterociklik), (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7, i (C1-C4alkil)(C3-C9heteroaril), pri čemu je R7H ili OH, pri čemu je opciono jedan od R1i R2slobodna amino grupa (-NH3<+>),

pri čemu je m 1 do 7, pri čemu je svaki od R3i R4nezavisno izabran iz grupe A koja se sastoji od: H, C1-C18alkil, (C1-C18alkil)OH, (C1-C18alkil)NH2, (C1-C18alkil)SH, (C0-C4alkil)(C3-C6)cikloalkil, (C0-C4alkil)(C2-C5heterociklik), (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R8, i (C1-C4

4

alkil)(C3-C9heteroaril), pri čemu R8je H ili OH, pri čemu je R5opciono prisutan, i, kada je prisutan, izabran je iz grupe A, opciono, pri čemu svaki od R3i R4i R5je H.

[0083] Aminokiselina koja se sastoji od bočnog lanca sa pozitivnim naelektrisanjem može sadržati strukturu bočnog lanca formule I i, n je u opsegu od 2 do 4. R1može biti NH ili NH2. R2može biti NH2ili NH3<+>. Aminokiselina koja se sastoji od bočnog lanca sa pozitivnim naelektrisanjem može biti arginin. Aminokiselina koja se sastoji od pozitivno naelektrisanog bočnog lanca može sadržati strukturu bočnog lanca formule II i, m je u opsegu od 3 do 5. Svaki od R3i R4može biti H. R5može biti prisutan, a opciono je H. Aminokiselina koja se sastoji od pozitivno naelektrisanog bočnog lanca može biti lizin. Aminokiselina koja se sastoji od pozitivno naelektrisanog bočnog lanca prisutna je u formulaciji kao so, opciono, hidrohlorid (HCl) so. Shodno tome, vodeni farmaceutski sastav može da sadrži L-arginin HCl ili L-lizin HCl.

[0084] Inhibitor agregacije aminokiselina može biti aromatična aminokiselina. Aromatična aminokiselina može da sadrži fenil ili indol. Aromatična aminokiselina može da sadrži C1-C6alkil lanac (npr. C1-C3alkil lanac ) između alfa ugljenika i fenila ili indola. Aromatična aminokiselina može biti L-fenilalanin. Aromatična aminokiselina može biti L-triptofan.

[0085] Inhibitor agregacije aminokiselina može biti hidrofobna aminokiselina. Hidrofobnost se može meriti ili bodovati prema bilo kojoj od skala hidrofobnosti poznatih u struci.

Generalno, što je rezultat pozitivniji, to je aminokiselina hidrofobnija. Hidrofobnost se može oceniti na skali hidrofobnosti Kajta i Dulitla (Kyte J, Doolittle RF (maj 1982). "A simple method for displaying the hydropathic character of a protein". J. Mol. Biol.157 (1): 105-32.) Hidrofobna aminokiselina može imati rezultat veći od oko 2,5 na skali hidrofobnosti Kajta i Dulitla. Hidrofobna aminokiselina može da sadrži bočni lanac koji sadrži C2do C12alkil, razgranati ili pravolančani, ili C4do C8cikloalkil, C4do C8heterocikl koji sadrži heteroatom azota, opciono, pri čemu je heterocikl imidazol, pirol ili indol. Za potrebe ovog dokumenta, termin „cikloalkil“ obuhvata bilo koji ugljenični ciklik, uključujući ugljenične biciklike ili triciklike.

[0086] Hidrofobna aminokiselina može da sadrži C3do C8alkil, opciono, hidrofobna aminokiselina se sastoji od razgranatog C3alkila ili razgranatog C4alkila. Hidrofobna aminokiselina može biti L-valin, L-leucin ili L-izoleucin.

[0087] Inhibitor agregacije aminokiselina se koristi u količini koja je efikasna za obezbeđivanje povećane stabilnosti i može se koristiti u koncentraciji u opsegu od oko 10 mM do oko 200 mM, na primer u opsegu od oko 30 mM do oko 120 mM, ili oko 38 mM do oko 150 mM, ili oko 38 mM do oko 113 mM, ili oko 38 mM do oko 75 mM, na primer oko 10 mM, oko 38 mM, oko 75 mM, oko 113 mM, ili oko 150 mM. Vodena farmaceutska formulacija može da sadrži oko 5 mM do oko 300 mM inhibitora agregacije aminokiselina, opciono, oko 25 mM do oko 90 mM inhibitora agregacije aminokiselina. Vodena farmaceutska formulacija može da sadrži oko 5 mM do oko 150 mM (npr. oko 10 mM do oko 150 mM, oko 15 mM do oko 150 mM, oko 20 mM do oko 150 mM, oko 25 mM do oko 150 mM, oko 5 mM do oko 140 mM, oko 5 mM do oko 130 mM, oko 5 mM do oko 120 mM, oko 5 mM do oko 110 mM, oko 5 mM do oko 100 mM, oko 5 mM do oko 90 mM) inhibitora agregacije aminokiselina, kada je inhibitor agregacije aminokiselina aminokiselina koja sadrži bočni lanac sa pozitivnim naelektrisanjem, opciono, L-arginin. Vodena farmaceutska formulacija može da sadrži oko 30 mM do oko 80 mM (npr. oko 35 mM, oko 40 mM, oko 45 mM, oko 50 mM, oko 55 mM, oko 60 mM, oko 65 mM, oko 70 mM, oko 75 mM) inhibitora agregacije aminokiselina, kada je inhibitor agregacije aminokiselina aminokiselina koja se sastoji od bočnog lanca sa pozitivnim naelektrisanjem, opciono, L-arginin.

[0088] Vodena farmaceutska formulacija može da sadrži oko 5 mM do oko 180 mM (npr. oko 10 mM do oko 180 mM, oko 15 mM do oko 180 mM, oko 20 mM do oko 180 mM, oko 25 mM do oko 180 mM, oko 5 mM do oko 170 mM, oko 5 mM do oko 170 mM, oko 5 mM do oko 160 mM, oko 5 mM do oko 150 mM, oko 5 mM do oko 140 mM, oko 5 mM do oko 130 mM, oko 5 mM do oko 120 mM, oko 5 mM do oko 110 mM) inhibitora agregacije aminokiselina, kada je inhibitor agregacije aminokiselina aromatska aminokiselina, opciono, L-fenilalanin. Vodena farmaceutska formulacija može da sadrži oko 5 mM do oko 100 mM (npr. oko 10 mM, oko 15 mM, oko 20 mM, oko 25 mM, oko 30 mM, oko 35 mM, oko 40 mM, oko 45 mM, oko 50 mM, oko 55 mM, oko 60 mM, oko 65 mM, oko 70 mM, oko 75 mM, oko 80 mM, oko 85 mM, oko 90 mM, oko 95 mM) inhibitora agregacije aminokiselina, opciono, oko 20 mM do oko 50 mM inhibitora agregacije aminokiselina, kada je inhibitor agregacije aminokiselina aromatična aminokiselina, opciono, L-fenilalanin.

[0089] Opciono, vodena farmaceutska formulacija se sastoji od oko 5 mM do oko 300 mM inhibitora agregacije aminokiselina, kada je inhibitor agregacije aminokiselina hidrofobna aminokiselina, opciono, L-valin, L-izoleucin ili L-leucin. Opciono, vodena farmaceutska formulacija sadrži oko 5 mM do oko 200 mM (npr. oko 10 mM do oko 200 mM, oko 20 mM do oko 200 mM, oko 30 mM do oko 200 mM, oko 40 mM do oko 200 mM, oko 50 mM do oko 200 mM, oko 60 mM do oko 200 mM, oko 70 mM do oko 200 mM, oko 80 mM do oko 200 mM, oko 90 mM do oko 200 mM, oko 100 mM do oko 200 mM, oko 5 mM do oko 290 mM, oko 5 mM do oko 280 mM, oko 5 mM do oko 270 mM, oko 5 mM do oko 260 mM, oko 5 mM do oko 250 mM, oko 5 mM do oko 240 mM, oko 5 mM do oko 230 mM, oko 5 mM do oko 220 mM, oko 5 mM do oko 210 mM) inhibitora agregacije aminokiselina, opciono, oko 20 mM do oko 50 mM inhibitora agregacije aminokiselina, kada je inhibitor agregacije aminokiselina hidrofobna aminokiselina, opciono, L-valin, L-izoleucin ili L-leucin. Vodeni farmaceutski sastav može da sadrži: oko 30 mM do oko 80 mM L-arginin hidrohlorida; oko 20 mM do oko 50 mM L-fenilalanina; oko 20 mM do oko 50 mM L-triptofana; oko 30 mM do oko 80 mM L-lizin hidrohlorida; oko 20 mM do oko 50 mM L-leucina; oko 20 mM do oko 50 mM L-izoleucina; oko 20 mM do oko 50 mM L-valina; ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0090] Koncentracija inhibitora agregacije aminokiselina može biti u molarnom odnosu sa antitelom. Molarni odnos inhibitora agregacije aminokiselina i anti-RANKL antitela može biti oko 10 do oko 200 (npr. oko 25 do oko 150, oko 50 do oko 100), kada je inhibitor agregacije aminokiselina aromatična aminokiselina, opciono, L-fenilalanin. Opciono, molarni odnos je oko 20 do oko 90. Molarni odnos inhibitora agregacije aminokiselina i anti-RANKL antitela može biti oko 20 do 300, kada je inhibitor agregacije aminokiselina aminokiselina koja se sastoji od pozitivno naelektrisanog bočnog lanca, opciono, L-arginina. Opciono, molarni odnos je oko 45 do oko 180.

[0091] Surfaktanti su površinski aktivni agensi koji su amfipatični (imaju polarnu glavu i hidrofobni rep). Površinski aktivne supstance se prvenstveno akumuliraju na razdelnim površinama, što rezultira smanjenom međufaznom napetošću. Surfaktant se može opciono uključiti u formulaciju. Upotreba površinski aktivne supstance takođe može pomoći u ublažavanju stvaranja velikih proteinskih čestica.

[0092] Surfaktant može biti nejonski surfaktant. Primeri uključuju estre polioksietilen sorbitan masnih kiselina (npr. polisorbat 20, polisorbat 80), alkilaril polietre, npr. oksietilirani alkil fenol (npr. Triton<™>X-100) i poloksamere (npr. Pluronics<®>, npr. Pluronic<®>F68) i kombinacije bilo kog od gore navedenih, bilo u okviru klase površinski aktivnih supstanci ili među klasama površinski aktivnih supstanci. Posebno se razmatraju polisorbat 20 i polisorbat 80.

[0093] Pogodna je koncentracija surfaktanta u opsegu od oko 0,004% (m/v) do oko 0,1% (m/v) (npr. za polisorbat 20 ili polisorbat 80), na primer oko 0,004% do oko 0,05%, ili oko 0,004% do oko 0,02%, ili oko 0,01%. Formulacija može da sadrži najmanje oko 0,004 (m/v) % surfaktanta, a opciono manje od oko 0,15 (m/v)%. Oko 0,005 (m/v)% do oko 0,015 (m/v)% surfaktanta može biti prisutno u formulaciji, opciono, oko 0,005 (m/v)%, oko 0,006 (m/v)%, oko 0,007 (m/v)%, oko 0,008 (m/v)%, oko 0,009 (m/v)%, oko 0,010 (m/v)%, oko 0,011 (m/v)%, oko 0,012 (m/v)%, oko 0,013 (m/v)%, ili oko 0,014 (m/v)%.

[0094] Stabilizovana vodena formulacija može biti pogodna za primenu bilo kojim prihvatljivim putem, uključujući parenteralni, a posebno supkutani. Na primer, supkutana primena može biti na nadlaktici, natkolenici ili abdomenu. Drugi putevi uključuju intravenske, intradermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intranodalne i intrasplenske, na primer. Preferira se supkutani put.

[0095] Ako je rastvor u obliku namenjenom za primenu na ispitaniku, može se učiniti izotoničnim sa predviđenim mestom primene. Na primer, osmolalnost može biti u opsegu od oko 270 do oko 350 mOsm/kg, ili oko 285 do oko 345 mOsm/kg, ili oko 300 do oko 315 mOsm/kg. Na primer, ako je rastvor u obliku namenjenom za parenteralnu primenu, može biti izotoničan sa krvlju (osmolalnost oko 300 mOsm/kg). Vodena farmaceutska formulacija može imati osmolalnost u opsegu od oko 200 mOsm/kg do oko 500 mOsm/kg, ili oko 225 mOsm/kg do oko 400 mOsm/kg, ili oko 250 mOsm/kg do oko 350 mOsm/kg.

[0096] Vodena farmaceutska formulacija može imati provodljivost u opsegu od oko 500 µS/cm do oko 5500 µS/cm, opciono, pri čemu je provodljivost u opsegu od oko 2500 µS/cm do oko 5500 µS/cm, kada formulacija sadrži aminokiselinu koja se sastoji od pozitivno naelektrisanog bočnog lanca, ili u opsegu od oko 500 µS/cm do oko 2000 µS/cm, kada formulacija sadrži aromatičnu aminokiselinu ili joj nedostaje inhibitor agregacije aminokiselina. Vodena farmaceutska formulacija može imati viskozitet koji nije veći od oko 6 cP na 5°C, opciono, pri čemu je viskozitet oko 4,5 cP do oko 5,5 cP. Vodena farmaceutska formulacija može imati viskozitet koji je manji od oko 13 cP na 25°C, opciono, oko 2,0 cP do oko 10 cP, opciono, oko 2,5 cP do oko 4 cP.

[0097] Modifikatori toničnosti ili sredstva za podešavanje toničnosti su poznati u struci i uključuju jedinjenja kao što su soli (npr. natrijum hlorid, kalijum hlorid, kalcijum hlorid, natrijum fosfat, kalijum fosfat, natrijum bikarbonat, kalcijum karbonat, natrijum laktat), šećeri (npr. dekstran, dekstroza, laktoza, trehaloza) i šećerni alkoholi (npr. manitol, sorbitol, ksilitol, glicerol, propilen glikol). Modifikator toničnosti se može izabrati iz grupe koju čine: sorbitol, manitol, saharoza, trehaloza, glicerol i njihove kombinacije. Modifikator toničnosti može biti sorbitol. Sorbitol se može koristiti, npr. u koncentraciji u opsegu od 0,1% (m/v) do 5% (m/v), ili 1,2% (m/v) do 5% (m/v), na primer 3,6% (m/v), 4,6% (m/v) ili 4,7% (m/v). Opciono, formulacija se sastoji od oko 1,0 (m/m)% do oko 5,0 (m/m)% modifikatora toničnosti. Na primer, formulacija se sastoji od oko 2,0 (m/m) % do oko 5,0 (m/m) % sorbitola, ili oko 3,5 (m/m) % do oko 5,0 (m/m) % sorbitola, ili oko 4,0% (m/m) do oko 5,0 (m/m) % sorbitola. Opciono, formulacija ne sadrži sorbitol ili je bez sorbitola. Opciono, formulacija ne sadrži modifikator toničnosti.

[0098] Druge pomoćne supstance poznate u struci mogu se koristiti u formulaciji, sve dok ne utiču negativno na stabilnost. Šećeri i polioli se mogu koristiti za zaštitu proteina od agregacije, uključujući obezbeđivanje stabilnosti pri zamrzavanju/odmrzavanju. Takva jedinjenja uključuju sorbitol, manitol, glicerol, eritritol, kaprilat, triptofanat, sarkozid i glicin. Mogu se koristiti i stabilizatori za pripremu liofilizovanih preparata, na primer stabilizujući šećeri, npr. disaharidi kao što su trehaloza i saharoza. Liofilizovani preparat može uključivati i sredstvo za povećanje zapremine - punioci, kao što je poznato u struci. Ostale pomoćne supstance poznate u struci za stabilizaciju proteina uključuju agense solubilizacije (npr. N-metil-2-pirolidon), polietilen glikol (PEG) i ciklodekstrine (npr. Captisol<®>). Farmaceutski prihvatljive kiseline i baze mogu se koristiti za podešavanje pH rastvora, npr. natrijum hidroksid.

[0099] Za parenteralnu primenu, formulacija može biti u obliku parenteralno prihvatljivog sterilnog vodenog rastvora bez pirogena koji se sastoji od denosumaba ili drugog ljudskog anti-RANKL monoklonskog antitela, sa ili bez dodatnih terapijskih sredstava, u farmaceutski prihvatljivom vehikulumu. Nosilac za parenteralnu injekciju može biti sterilna destilovana voda u kojoj je denosumab ili drugo ljudsko anti-RANKL monoklonsko antitelo, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapijskog sredstva, formulisano kao sterilni, izotonični rastvor. Formulacija će sadržati farmaceutski prihvatljive pomoćne supstance, npr. ekscipijense kvaliteta USP (United States Pharmacopeia – SAD Farmakopeja).

[0100] „Konzervans“ je jedinjenje koje se može uključiti u farmaceutsku formulaciju kako bi se smanjilo bakterijsko delovanje u njoj, na primer, čime se olakšava proizvodnja formulacije za višestruku upotrebu. Primeri konzervansa uključuju oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, heksametonijum hlorid, benzalkonijum hlorid (smeša alkilbenzildimetilamonijum hlorida u kojoj su alkil grupe jedinjenja dugog lanca) i benzetonijum hlorid. Druge vrste konzervansa uključuju aromatične alkohole, uključujući fenol, butil i benzil alkohol, alkil parabene, uključujući metil i propil paraben, katehol, rezorcinol, cikloheksanol, 3-pentanol i m-krezol. Alternativno, formulacija može biti bez konzervansa. Na primer, kada je formulacija predstavljena u obliku doziranja za jednokratnu upotrebu, ona može biti bez konzervansa.

[0101] Iako je formulacija ovde opisana u svom vodenom obliku, stabilizovana formulacija se takođe može naknadno liofilizovati za pripremu liofilizata. Shodno tome, osim ako kontekst ne nalaže drugačije, razmatra se mogućnost da reference na formulaciju i njen način upotrebe uključuju liofilizat koji nastaje iz stabilizovanog vodenog rastvora.

[0102] Farmaceutska formulacija koja se koristi za primenu in vivo je obično sterilna. To se može postići filtriranjem kroz sterilne filtracione membrane. Parenteralni sastavi generalno se mogu staviti u kontejner koji ima sterilni pristupni otvor, na primer, vrećicu za intravenski rastvor, ili ampulu sa čepom koji se može probiti iglom za hipodermičku injekciju, ili prethodno napunjen špric. Takve formulacije se mogu čuvati ili u obliku spremnom za upotrebu ili u obliku (npr. liofilizovanom) koji se rekonstituiše ili razblažuje pre primene.

[0103] Ovde su opisani kompleti za proizvodnju jedinice za primenu jedne doze. Svaki komplet može sadržati i prvi kontejner sa osušenim preparatom denosumaba ili drugog humanog anti-RANKL monoklonskog antitela napravljenog od formulacije rastvora opisane u ovom dokumentu i drugi kontejner sa sterilnom vodom ili vodenim rastvorom. Kompleti mogu da sadrže jednokomorne i višekomorne napunjene špriceve (npr. tečne špriceve i liošpriceve).

4

[0104] Ovde opisana stabilizovana formulacija može se koristiti zajedno sa jednim ili više dodatnih terapijskih sredstava, npr. kalcijumom i jedinjenjem vitamina D. Stabilizovana formulacija opisana u ovom dokumentu može se primeniti kod pacijenta koji prima terapiju sa dodatnim terapijskim agensom, ili se stabilizovana formulacija opisana u ovom dokumentu može primeniti istovremeno sa dodatnim terapijskim agensom.

[0105] Stabilizovana formulacija se može koristiti za sprečavanje ili lečenje bilo koje bolesti koja reaguje na denosumab ili drugo humano anti-RANKL monoklonsko antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen. Takve upotrebe i srodne metode uključuju, ali nisu ograničene na, obelodanjivanja opisana u nastavku.

[0106] Formulacija se može koristiti za sprečavanje događaja povezanog sa skeletom (SRE) kod pacijenta kome je to potrebno, uključujući primenu efikasne količine stabilizovane formulacije opisane u ovom dokumentu. SRE se može izabrati iz grupe koju čine patološki prelom, terapija zračenjem kostiju, operacija kostiju i kompresija kičmene moždine, na primer. Pacijent može biti onaj koji ima koštanu metastazu iz solidnog tumora. Solidni tumor može biti jedan ili više od karcinoma dojke, karcinoma prostate, karcinoma pluća, nemikrocelularnog karcinoma pluća i karcinoma bubrežnih ćelija, na primer. Količina formulacije može biti efikasna za smanjenje markera koštanog prometa urinarnog N-terminalnog telopeptida korigovanog za kreatinin (uNTx/Cr), opciono za najmanje 80%. Pacijent može biti pacijent sa multiplim mijelomom.

[0107] Formulacija se može koristiti za lečenje pacijenta sa gigantocelularnim tumorom kosti, uključujući primenu efikasne količine stabilizovane formulacije opisane u ovom dokumentu. Pacijent može imati gigantocelularni tumor kosti koji je rekurentan, neoperabilan ili za koji je verovatno da će hirurška resekcija rezultirati teškim morbiditetom. Pacijent može biti odrasla osoba ili adolescent sa skeletom, na primer.

[0108] Formulacija se može koristiti za lečenje pacijenta sa hiperkalcemijom maligne kosti, uključujući primenu efikasne količine stabilizovane formulacije opisane u ovom dokumentu. Malignitet može biti refraktoran na bisfosfonatnu terapiju. Postupak ili upotreba može uključivati primenu količine formulacije koja je efikasna za smanjenje ili održavanje serumskog kalcijuma pacijenta na nivou manjem ili jednakom oko 11,5 mg/dl.

[0109] Formulacija se može koristiti za lečenje osteoporoze kod pacijenta kome je to potrebno, uključujući primenu efikasne količine stabilizovane formulacije opisane u ovom dokumentu. Na primer, pacijentkinja može biti žena u postmenopauzi sa visokim rizikom od preloma. Pacijent može biti muškarac sa visokim rizikom od preloma.

[0110] Formulacija se može koristiti za povećanje koštane mase kod pacijenta kome je to potrebno, uključujući primenu efikasne količine stabilizovane formulacije opisane u ovom dokumentu. Na primer, količina primenjene formulacije može biti količina efikasna za smanjenje učestalosti novih vertebralnih preloma i/ili nevertebralnih preloma. Količina primenjene formulacije može biti količina efikasna za smanjenje resorpcije kostiju. Količina formulacije može biti količina koja je efikasna za povećanje gustine kostiju kod pacijenta u najmanje jednom području izabranom između lumbalne kičme, ukupnog kuka i vrata butne kosti. Količina formulacije može biti količina efikasna za povećanje koštane mase u kortikalnoj kosti pacijenta i/ili trabekularnoj kosti. Količina formulacije može biti količina efikasna za smanjenje serumskog markera resorpcije kostiju tipa 1 C-telopetida (CTX). Pacijent kome je to potrebno može opciono imati osteoporozu. Pacijent kome je to potrebno može biti žena sa visokim rizikom od preloma koja prima adjuvantnu terapiju inhibitorom aromataze za rak dojke. Pacijent kome je to potrebno može biti muškarac sa visokim rizikom od preloma koji prima terapiju deprivacije androgena za nemetastatski rak prostate. Pacijent kome je to potrebno može biti čovek sa osteoporozom sa visokim rizikom od preloma.

[0111] Formulacija se može koristiti kao adjuvantno lečenje za žene u postmenopauzi sa karcinomom dojke u ranoj fazi sa visokim rizikom od recidiva bolesti, koje primaju adjuvantnu/neoadjuvantnu terapiju karcinoma.

[0112] Formulacija se može koristiti kao prva linija lečenja pacijenata sa metastatskim nemikrocelularnim karcinomom pluća u kombinaciji sa hemoterapijom na bazi platine.

[0113] Formulacija se može koristiti za lečenje idiopatske subglotične stenoze (ISS).

[0114] Formulacija se može koristiti za prevenciju raka dojke i raka jajnika kod zdravih žena sa mutiranim BRCA-1.

[0115] Opciono, formulacija se može koristiti u kombinaciji sa inhibitorom imunološke kontrolne tačke. Opciono, inhibitor imunološke kontrolne tačke je specifičan za protein koji funkcioniše na putu imunološke kontrolne tačke, npr., CTLA4, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7H4, BTLA, SLAM, 2B4, CD160, KLRG-1 ili TIM3. Opciono, inhibitor imunološke kontrolne tačke je antitelo, njegov fragment koji se vezuje za antigen, ili proteinski proizvod antitela specifičan za CTLA4, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7H4, BTLA, SLAM, 2B4, CD160, KLRG-1 ili TIM3. Takvi inhibitori imunološke kontrolne tačke uključuju, ali nisu ograničeni na: atezolizumab, avelumab, ipilimumab, tremelimumab, BMS-936558, MK3475, CT-011, AM-224, MDX-1105, IMP321, MGA271. Inhibitori PD-1 uključuju, na primer, pembrolizumab i nivolumab. Inhibitori PD-L1 uključuju, na primer, atezolizumab, avelumab i durvalumab. Inhibitori CTLA4 uključuju, npr., ipilimumab. Formulacija se može koristiti za lečenje pacijenata sa melanomom sa koštanim metastazama, opciono u kombinaciji sa PD-1 antitelima (npr. nivolumab, pembrolizumab). Formulacija se može koristiti za lečenje pacijentkinja sa rakom dojke, opciono, u kombinaciji sa CTLA4 inhibitorom, kao što je ipilimumab.

[0116] Formulacija se može koristiti za lečenje tumora bogatih gigantoćelijama, npr. kod hiperparatireoidizma ili sa sekundarnom aneurizmalnom cistom kostiju.

[0117] Formulacija se može koristiti za lečenje progresivnog metastatskog raka prostate rezistentnog na kastraciju (mCRPC). Formulacija se može koristiti za lečenje karcinoma prostate senzitivnog na kastraciju. Formulacija se može koristiti za lečenje raka prostate rezistentnog na hormone.

[0118] Formulacija se može koristiti za lečenje metastatskog raka dojke (mBC). Formulacija se može koristiti za lečenje preoperativnog raka dojke. Formulacija se može koristiti za lečenje ranog raka dojke. Formulacija se može koristiti za lečenje primarnog karcinoma dojke negativnog na hormonske receptore, RANK-pozitivnog ili RANK-negativnog. Formulacija se može koristiti za lečenje postmenopauzalnog HER2 negativnog raka dojke.

[0119] Formulacija se može koristiti za lečenje mijelodisplastičnog sindroma, npr. kod starijeg pacijenta.

4

[0120] Formulacija se može koristiti za lečenje gubitka kostiju izazvanog lečenjem raka (CTIBL).

[0121] Formulacija se može koristiti za lečenje tumora grlića materice.

[0122] Formulacija se može koristiti za indukovanje imunomodulatornih efekata kod pacijenata sa imunoterapijom ili bez nje.

[0123] Formulacija se može koristiti za sprečavanje ili lečenje gubitka kostiju povezanog sa osteoporozom, Pagetovom bolešću, osteomijelitisom, hiperkalcemijom, osteopenijom, osteonekrozom i reumatoidnim artritisom. Formulacija se može koristiti za sprečavanje ili lečenje inflamatornih stanja sa gubitkom kostiju. Formulacija se može koristiti za sprečavanje ili lečenje autoimunih stanja sa gubitkom kostiju. Formulacija se može koristiti za sprečavanje ili lečenje gubitka kostiju povezanog sa rakom, uključujući rak dojke, prostate, štitne žlezde, bubrega, pluća, jednjaka, rektuma, bešike, grlića materice, jajnika, jetre i gastrointestinalni karcinom, multipli mijelom, limfom i Hodžkinovu bolest.

[0124] Formulacija se može primeniti u bilo kom odgovarajućem vremenskom rasporedu. Raspored primene može biti jednom u četiri nedelje. Opciono, primena može uključivati primenu 8. i 15. dana prvog meseca terapije. Primena može biti na rasporedu jednom u šest meseci. Za upotrebu kod osteoporoze i povećanja koštane mase, na primer, razmatra se raspored jednom u šest meseci. Ostale predviđene doze održavanja su svake 3 nedelje, svaka 3 meseca i svakih 6 nedelja.

[0125] Vodena farmaceutska formulacija može se koristiti za lečenje pacijenta sa multiplim mijelomom ili koštanim metastazama iz solidnog tumora. Formulacija se može davati u dozi od oko 120 mg svake 4 nedelje kao supkutana injekcija u nadlakticu, natkolenicu ili abdomen.

[0126] Vodena farmaceutska formulacija se može koristiti za lečenje pacijenta sa gigantocelularnim tumorom kosti. Formulacija se može davati u dozi od oko 120 mg svake 4 nedelje sa dodatnim dozama od 120 mg 8. i 15. dana prvog meseca terapije. Formulacija se može primeniti supkutano u nadlakticu, natkolenicu ili abdomen pacijenta. Pacijentu se mogu davati kalcijum i vitamin D za lečenje ili sprečavanje hipokalcemije.

[0127] Vodena farmaceutska formulacija može se koristiti za lečenje pacijenta sa hiperkalcemijom maligniteta. Formulacija se može davati u dozi od oko 120 mg svake 4 nedelje sa dodatnim dozama od 120 mg 8. i 15. dana prvog meseca terapije. Formulacija se može primeniti supkutano u nadlakticu, natkolenicu ili abdomen pacijenta.

[0128] Vodena farmaceutska formulacija može se koristiti za lečenje žena u postmenopauzi sa osteoporozom sa visokim rizikom od preloma ili za povećanje koštane mase kod muškaraca sa visokim rizikom od preloma koji primaju terapiju deprivacije androgena za nemetastatski rak prostate ili kod žena sa visokim rizikom od preloma koje primaju adjuvantnu terapiju inhibitorom aromataze za rak dojke. Vodenu farmaceutsku formulaciju može primeniti zdravstveni radnik i u dozi od 60 mg svakih 6 meseci kao supkutanu injekciju u nadlakticu, natkolenicu ili abdomen. Pacijent se takođe može uputiti da uzima kalcijum 1000 mg dnevno i najmanje 400 ill vitamina D dnevno.

[0129] Jedna vrsta formulacije prema obelodanjivanju će sadržati denosumab, acetat i arginin. Arginin je opciono L-arginin. Arginin je opciono L-arginin hidrohlorid. Formulacija može opciono da sadrži sorbitol. Formulacija može opciono da sadrži polisorbat. Polisorbat može opciono biti polisorbat 20. pH može opciono biti oko 5,0 do oko 5,2, ili manji od 5,2.

[0130] Druga vrsta formulacije prema obelodanjivanju će sadržati denosumab, acetat i fenilalanin. Formulacija može opciono da sadrži sorbitol. Formulacija može opciono da sadrži polisorbat. Polisorbat može opciono biti polisorbat 20. pH može opciono biti oko 5,0 do oko 5,2, ili manji od 5,2. Na primer, formulacija može uključivati denosumab u koncentraciji od oko 108 mg/ml do oko 132 mg/ml, oko 28,8 mM do oko 35,2 mM acetata, 33,3 mM do oko 40,7 mM fenilalanina, 3,51% (m/v) do oko 4,29% (m/v) sorbitola i oko 0,009% (m/v) do oko 0,011% (m/v) polisorbata 20, pri pH 5,1, i opciono može biti sadržana u PFS, opciono sadrži oko 1 ml ili manje od oko 1 ml (npr. oko 0,5 ml) formulacije. Na primer, formulacija može uključivati denosumab u koncentraciji od 120 mg/ml, 32 mM acetata, 37 mM fenilalanina, 3,9% (m/v) sorbitola i 0,01% (m/v) polisorbata 20, pri pH 5,1, i opciono može biti sadržana u PFS, opciono sadrži oko 1 ml ili manje od oko 1 ml (npr. oko 0,5 ml) formulacije. Formulacija se može napraviti koncentrovanjem denosumaba pomoću pufera za dijafiltraciju koji sadrži 20 mM acetata, 4,2% (m/v) sorbitola i 40 mM fenilalanina, pri pH 4,7.

4

[0131] Druga vrsta formulacije prema obelodanjivanju će sadržati denosumab, glutamat i arginin. Arginin je opciono L-arginin. Arginin je opciono L-arginin hidrohlorid. Formulacija može opciono da sadrži sorbitol. Formulacija može opciono da sadrži polisorbat. Polisorbat može opciono biti polisorbat 20. PH može opciono biti oko 5,0 do oko 5,2, ili manji od 5,2.

[0132] Druga vrsta formulacije prema obelodanjivanju će sadržati denosumab, acetat i fenilalanin. Formulacija može opciono da sadrži sorbitol. Formulacija može opciono da sadrži polisorbat. Polisorbat može opciono biti polisorbat 20. pH može opciono biti oko 5,0 do oko 5,2, ili manji od 5,2.

[0133] Druga vrsta formulacije prema obelodanjivanju će sadržati denosumab, glutamat, arginin i fenilalanin. Arginin je opciono L-arginin. Arginin je opciono L-arginin hidrohlorid. Formulacija može opciono da sadrži sorbitol. Formulacija može opciono da sadrži polisorbat. Polisorbat može opciono biti polisorbat 20. pH može opciono biti oko 5,0 do oko 5,2, ili manje od 5,2.

[0134] Formulacije prema obelodanjivanju mogu se napraviti bilo kojim odgovarajućim postupkom. U jednoj vrsti postupka, rastvor koji sadrži anti-RANKL monoklonsko antitelo (npr. denosumab) može se pripremiti u koncentraciji manjoj od 70 mg/ml, odgovarajuća količina ovde opisanog inhibitora agregacije aminokiselina može se dodati rastvoru, a zatim se rastvor može koncentrisati do količine veće od 70 mg/ml opisane u ovom dokumentu, npr.

120 mg/ml. Opciono, rastvor može prvo biti prekomerno koncentrisan, tj. u koncentraciji anti-RANKL monoklonskog antitela (npr. denosumab) većoj od konačne ciljne koncentracije, a zatim se pre-koncentrisani rastvor može razblažiti, npr. sa puferskim rastvorom za podešavanje pH, do konačne ciljne koncentracije i pH. Na primer, prekomerna koncentracija može dovesti do količine anti-RANKL monoklonskog antitela (npr. denosumab) u opsegu od 130 mg/ml do 300 mg/ml ili 180 mg/ml do 300 mg/ml. Početna koncentracija denosumaba pre koncentrisanja nije posebno ograničena i može biti, na primer, oko 1 mg/ml, ili oko 2 mg/ml, ili oko 5 mg/ml, ili oko 8 mg/ml, ili oko 10 mg/ml, ili oko 20 mg/ml, ili oko 30 mg/ml, ili oko 40 mg/ml, ili oko 50 mg/ml, ili oko 60 mg/ml, ili oko 70 mg/ml, ili u opsegu unutar bilo koje takve koncentracije, npr. oko 1 mg/ml do oko 70 mg/ml, ili oko 1 mg/ml do oko 10 mg/ml.

4

[0135] Koncentrisanje formulacije može se izvršiti bilo kojim odgovarajućim postupkom. Proces koncentrisanja može uključivati centrifugiranje. Proces koncentrisanja može uključivati ultrafiltraciju.

[0136] Uvođenje inhibitora agregacije aminokiselina u formulaciju može se obaviti bilo kojim odgovarajućim procesom. Na primer, inhibitor agregacije aminokiselina se može uvesti u formulaciju jednostavnim dodavanjem (spajkovanjem) u formulaciju, npr. kao što je opisano u primerima u nastavku. U drugom postupku, inhibitor agregacije aminokiselina se može uvesti u formulaciju dijafiltracijom uz puferski rastvor koji sadrži inhibitor agregacije aminokiselina, npr. kao što je opisano u primerima u nastavku. Inhibitor agregacije aminokiselina se može uvesti u formulaciju pre ili nakon koncentrisanja anti-RANKL monoklonskog antitela preko 70 mg/ml. Kao što je prikazano u primerima u nastavku, postoji korist od dodavanja inhibitora agregacije aminokiselina u rastvor pre koncentrisanja, jer inhibira agregaciju tokom procesa koncentrisanja.

[0137] Shodno tome, obelodanjivanje pruža postupke za izradu stabilne, vodene farmaceutske formulacije koja se sastoji od humanog anti-humanog receptorskog aktivatora za nuklearni faktor kapa-B ligand (anti-RANKL) monoklonskog antitela, ili njegovog dela koji se vezuje za antigen. Postupak može da obuhvata kombinovanje anti-RANKL monoklonskog antitela, ili njegovog dela koji se vezuje za antigen, u koncentraciji većoj od 70 mg/ml sa inhibitorom agregacije aminokiselina, puferom, surfaktantom i opciono modifikatorom toničnosti. Antitelo ili deo koji se vezuje za antigen može biti bilo koji od ovde opisanih, a koncentracija antitela ili njegovog dela koji se vezuje za antigen može biti u skladu sa ovde navedenim poukama. Inhibitor agregacije aminokiselina može biti bilo koji od ovde opisanih. Na primer, inhibitor agregacije aminokiselina može biti pozitivno naelektrisana aminokiselina, aromatična aminokiselina ili hidrofobna aminokiselina. Inhibitor agregacije aminokiselina može biti u molarnom odnosu sa antitelima kao što je ovde opisano. Količina i izbor inhibitora agregacije, surfaktanta, modifikatora toničnosti i pufera je kao što je gore opisano. Obelodanjivanje takođe pruža formulacije napravljene postupcima izrade, opisanim u ovom dokumentu.

[0138] Formulacija u skladu sa ovim obelodanjivanjem može uključivati podešavanje pH vrednosti rastvora visoke koncentracije anti-RANKL monoklonskog antitela (npr. denosumaba) opisanog u ovom dokumentu, npr. onog koji ima koncentraciju veću od 70

4

mg/ml ili 120 mg/ml. Formulacija se može pripremiti podešavanjem pH rastvora niske koncentracije anti-RANKL monoklonskog antitela (npr. denosumab), a zatim koncentrisanjem rastvora do željene, više konačne koncentracije. U struci su poznata odgovarajuća sredstva za podešavanje pH.

PRIMERI

[0139] Sledeći primeri su dati za ilustraciju i nemaju za cilj da ograniče obim pronalaska. U ovde predstavljenim primerima koriste se sledeće skraćenice: DF, dijafiltracija; PS20, polisorbat 20, HCl, hidrohlorid, UF/DF, ultrafiltracija/dijafiltracija; F#, broj formulacije; HMWS, vrste visoke molekulske mase; SE-UHPLC, tečna hromatografija isključenja po veličini ultra visokih performansi. Pored toga, u ovim primerima, dat je sastav DF pufera ili pufera za dijalizu koji se koristi za izradu konačne formulacije koja sadrži denosumab, kao i procenjene koncentracije komponenti konačne formulacije. Konačne koncentracije određenih komponenti konačnih formulacija koje se čuvaju i naknadno analiziraju radi stabilnosti mogu se razlikovati od koncentracija DF ili pufera za dijalizu u zavisnosti od prisustva ili odsustva protivjona (npr. HCl). Bez protivjona, formulacije imaju nisku jonsku jačinu. U takvim slučajevima, acetat se ko-koncentriše sa denosumabom, tako da konačne formulacije sadrže veću koncentraciju acetata, u odnosu na koncentraciju DF ili pufera za dijalizu. Na primer, upotreba DF pufera koji sadrži 10 mM acetat dovodi do ~23 mM acetata u konačnoj formulaciji denosumaba (120 mg/ml) (pH 5,1), kada ni DF pufer ni konačna formulacija ne sadrže protivjon (npr. HCl) i stoga je niske jonske jačine. Slično tome, DF pufer koji sadrži 20 mM acetat dovodi do ~32 mM acetata u konačnoj formulaciji denosumaba (120 mg/ml), pri pH 5,1, bez protivjona (npr. HCl). Kada je prisutan protivjon (npr. HCl u arginin HCl), acetat se ne koncentriše zajedno sa denosumabom, pa su stoga koncentracija acetata DF pufera i koncentracija acetata konačnog sastava generalno ekvivalentne. Pored toga, pomoćne supstance mogu biti volumetrijski isključene ili na njih mogu uticati nespecifične interakcije. Na primer, u formulaciji denosumaba od 120 mg/ml, koncentracije fenilalanina i sorbitola su približno 7-10% niže od onoga što je naznačeno u DF puferu, a koncentracija arginina je približno 10-15% niža. S obzirom na gore navedeno, u sledećim primerima su date koncentracije komponenti konačnih formulacija, uzimajući u obzir gore opisane efekte isključenja pomoćnih supstanci i ko-koncentracije acetata.

4

REFRENTNI PRIMER 1

[0140] Izvršena je inicijalna procena dvanaest formulacija za njihov efekat minimiziranja količine (%) HMWS u tečnoj formulaciji denosumaba visoke koncentracije (120 mg/ml) i njihovo formiranje tokom vremena. Alternative formulaciji uključivale su promene tipa pufera, stabilizatora i pH rastvora. Testirane formulacije, A-L, opisane su u Tabeli 1 u nastavku. Sve navedene vrednosti pufera odnose se na koncentraciju pufera prema kojoj je antitelo dijafiltrirano. Svaka pomoćna supstanca i površinski aktivna supstanca je dodata u rastvor nakon razmene pufera do nivoa navedenog u tabeli. Iako koncentracije acetata u predmetnim formulacijama nisu izmerene, formulacije denosumaba od 120 mg/ml sa sorbitolom dijafiltriranim uz 10 mM acetat imale su približne konačne vrednosti acetata između 25 mM i 35 mM acetata.

[0141] Denosumab pri 70 mg/ml u acetatu, pH 5,2 je bio UF/DF uz 10 mM acetat, pH 5,2 i koncentrisan na 160 mg/ml. Osnovni rastvori su pripremljeni u 10 mM acetatu pri pH 5,2 koji sadrži:

35 % sorbitol

1 % polisorbat 20

1 % polisorbat 80

30% Pluronic<®>F-68

3% Triton<™>X-100

250 mM L-Arginin HCl

250 mM N-acetil arginin (NAR)

250 mM N-acetil lizin (NAK)

250 mM Prolin

250 mM polietilen glikol (PEG) 3350

250 mM Captisol<®>ciklodekstrin

[0142] Da bi se postigle formulacije od A do J, materijal od 160 mg/ml pripremljen sa 10 mM acetatom, pH 5,2 je razblažen do 120 mg/ml korišćenjem 10 mM acetata pri pH od 5,2, nakon čega je usledio dodatak odgovarajućih osnovnih rastvora sorbitola, ekscipijensa i/ili surfaktanta do ciljne konačne koncentracije navedene u Tabeli 1. Da bi se postigle formulacije K i L, samo-puferovane, odnosno formulacije glutamata, dva odvojena alikvota iz materijala od 160 mg/ml podvrgnuta su dodatnoj razmeni pufera centrifugiranjem.

Materijal za formulacije K i L je zatim razblažen do 120 mg/ml korišćenjem odgovarajućeg

4

pufera, nakon čega je usledio dodatak odgovarajućih osnovnih rastvora sorbitola i polisorbata 20 do ciljne konačne koncentracije navedene u tabeli formulacije u Tabeli 1.

TABELA 1

[0143] Na Slici 1 prikazan je procenat HMWS praćen putem SE-UHPLC u funkciji formulacije i vremena na 37°C. Formulacija L, koja se sastoji od približno 10 mM glutamat pufera, 10 mM L-arginin HCl, 2,4% (m/v) sorbitola kao modifikatora toničnosti, 0,01% (m/v) polisorbata 20 kao surfaktanta i pri pH vrednosti od 5,0 pokazala je i smanjene početne količine HMWS, što ukazuje na određeno smanjenje već formiranih agregata i smanjenu kinetiku za formiranje HMWS na 37°C.

REFERENTNI PRIMER 2

[0144] Procena formulacija ekscipijenasa od 10 mM acetata, 75 mM L-arginina, 2,4% (m/v) sorbitola, 0,01% (m/v) polisorbata 20 i formulacija ekscipijenasa od10 mM acetata, 5% (m/v) sorbitola, 0,01% (m/v) polisorbata 20, svaka sa visokom koncentracijom (120 mg/ml) denosumaba, na temperaturi od 37°C do 1 meseca otkrila je efekte pH i inhibitora agregacije aminokiselina na brzinu i obim formiranja HMWS. Testirane formulacije su opisane u Tabeli 2 u nastavku. Sve navedene vrednosti pufera i pomoćnih supstanci odnose se na koncentracije pufera i pomoćnih supstanci prema kojima je antitelo dijafiltrirano.

[0145] Da bi se pripremili ispitni uzorci M-Q, alikvot denosumaba od 3 ml pri 70 mg/ml u acetatu, pH 5,2, je dijaliziran uz 500 ml DF pufera opisanog u nastavku, sa ukupno 3 promene pufera da bi se postiglo razblaženje prethodne formulacije od 1 milion puta kako bi se osigurala potpuna razmena pufera. Materijal je zatim prekomerno koncentrisan pomoću centrifuge-koncentratora, nakon čega je usledilo razblaživanje do 120 mg/ml i dodavanje polisorbata 20 do konačne koncentracije od 0,01%.

TABELA 2

1

[0146] Na SLICI 2 prikazan je procenat HMWS praćen putem SE-UHPLC u funkciji formulacije i vremena na 37°C. Na SLICI 3 prikazani su hromatogrami isključivanja po veličini kao funkcija formulacije nakon skladištenja na 37°C tokom 1 meseca.

[0147] Kako se pH rastvora smanjivao, došlo je do povećanja formiranja velikih agregata. Pri pH ispod 4,8, a posebno 4,5, veliki agregati su bile dominantne HWMS, sa dramatičnim povećanjem za test formulaciju pri pH 4,5. Kao što je prikazano na SLICI 3, formulacije P i Q imale su najnižu količinu HWMS višeg reda (retenciono vreme oko 6 minuta), nakon čega su usledile komparativne formulacije O, N i M sa opadajućim pH vrednostima.

[0148] Međutim, sa povećavanjem pH, generalno je došlo do povećanja dimernih vrsta. Kao što je prikazano na SLICI 3, formulacija N imala je najnižu količinu dimernih vrsta (retenciono vreme oko 6,8 minuta), nakon čega su usledile formulacije M, O, P i Q.

[0149] Prisustvo arginina u formulaciji O pri koncentraciji od 75 mM rezultiralo je smanjenjem od približno 0,3% i 25% količina dimernih vrsta i njihove kinetičke brzine formiranja, respektivno, nakon 1 meseca na 37°C u poređenju sa formulacijom P koja ima isti pH, ali bez arginina.

REFERENTNI PRIMER 3

[0150] Ovaj primer pokazuje efekat pH na formulacije denosumaba visoke koncentracije.

[0151] Denosumab (u koncentraciji od 120 mg/ml) je formulisan sa acetatom, sorbitolom i polisorbatom 20 (PS20) sa ili bez inhibitora agregacije aminokiselina pri tri različite pH

2

vrednosti: 4,8, 5,1 i 5,4. U ovoj studiji, inhibitor agregacije aminokiselina je bio L-arginin HCl. Sve formulacije su napravljene razmenom pufera početnog rastvora koji sadrži nižu koncentraciju denosumaba, nakon čega sledi prekomerno koncentrisanje materijala denosumaba, a zatim razblaživanje materijala denosumaba sa željenim količinama pufera, pomoćnih supstanci i površinski aktivnih supstanci. Ukratko, alikvot denosumaba u dozi od 70 mg/ml u acetatu, pH 5,2 (početni materijal) je dijaliziran uz DF pufer, kao što je opisano u TABELI 3A, sa ukupno 3 promene pufera da bi se postiglo razblaženje početnog materijala od 1 milion puta kako bi se osigurala potpuna razmena pufera. Materijal denosumaba izmenjen puferom je zatim koncentrisan pomoću centrifuge-koncentratora do koncentracije denosumaba veće od 120 mg/ml, a koncentrisani materijal je naknadno razblažen da bi se postigla koncentracija od 120 mg/ml denosumaba. PS20 je dodat do konačne koncentracije od 0,01%.

[0152] Smatralo se da protein u visokoj koncentraciji doprinosi pH rastvora na osnovu njegovog stanja naelektrisanja. Koncentracija acetata u formulaciji 1 je povećana da bi se postigao ciljani konačni pH, a koncentracije acetata u formulacijama 2 i 3 su usklađene sa koncentracijom u formulaciji 1. Koncentracije acetata u formulacijama 4-6 zahtevale su još veću količinu acetata kako bi se uskladile sa konačnim koncentracijama acetata u formulacijama 1-3, zbog toga što se acetat ne ko-koncentriše u prisustvu soli HCl.

Formulacija 7 je služila kao kontrola kako bi se osiguralo da povećana koncentracija acetata u formulacijama 4-6 ne ometa stabilnost proteina u formulacijama arginin hidrohlorida.

[0153] Različite formulacije denosumaba napravljene i testirane u ovoj studiji opisane su u TABELI 3A.

TABELA 3A

[0154] Uzorak svake formulacije je stavljen u posudu sa zapreminom punjenja od 1 ml i čuvan na temperaturi od 37°C do 4 nedelje. Inhibicija agregacije i stabilnost protiv inhibicije agregacije tokom vremena, na osnovu formiranja HMWS i dimernih vrsta, procenjena je korišćenjem SE-UHPLC. Profili inhibicije agregacije ovih formulacija upoređeni su u početnim uslovima i tokom i nakon perioda skladištenja.

[0155] Procenat HMWS praćen je putem SE-UHPLC kao funkcije formulacije i vremena na 37°C. SLIKA 4 predstavlja grafikon procenta HMWS kao funkcije vremena za formulacije 1-7, a TABELA 3B daje tačke podataka grafikona.

TABELA 3B

4

[0156] NA SLICI 5 prikazani su hromatogrami isključivanja po veličini za svaku formulaciju nakon skladištenja na 37°C tokom 1 meseca. Formulacije bez arginina prikazane su na levom panelu, dok su formulacije sa argininom prikazane na desnom panelu.

[0157] Kao što je prikazano na SLICI 4, formulacije koje sadrže arginin imale su bolje performanse od kontrolnih formulacija bez arginin hidrohlorida, a formulacije sa pH 5,1 imale su bolje performanse od uporedivih formulacija sa pH 4,8 i pH 5,4. Za formulacije 1-3 bez arginin hidrohlorida, dimer vrste su se povećavale kako se pH rastvora povećao na 5,4 (SLIKA 5A). Za formulacije 4-6 koje sadrže arginin hidrohlorid, kako je pH rastvora smanjen na 4,8, došlo je do povećanja formiranja većih agregata, kao i do povećanja dimer vrsta pošto je pH rastvora povećan na 5,4 (SLIKA 5B). Pri pH vrednosti rastvora od 5,1, formulacija 6 sa prisustvom arginin hidrohlorida, imala je najnižu količinu ukupne HMWS u poređenju sa formulacijom 2 bez prisustva arginin hidrohlorida. Pored toga, ponašanje formulacije 7 pokazalo je da je povećanje koncentracije acetatnog pufera sa 10 mM na 40 mM imalo relativno manji uticaj na formiranje HMWS.

REFERENTNI PRIMER 4

[0158] Ovaj primer pokazuje vezu između pH i formiranja HMWS za različite formulacije denosumaba koje sadrže različite koncentracije denosumaba.

[0159] Koncentracije proteina denosumaba od 15 mg/ml do 150 mg/ml ocenjivane su radi procene pH osetljivosti formiranja HMWS pri različitim koncentracijama proteina i pri koncentracijama od 75 mM arginin hidrohlorida. Dve pH vrednosti, odnosno pH 4,8 i 5,1, procenjene su pri svakoj od ispitivanih koncentracija proteina: 15, 60, 120 i 150 mg/mL.

[0160] Ukupno 8 formulacija (formulacije 8-15; opisane u TABELI 4A) je procenjeno u ovoj studiji. Da bi se pripremile ove formulacije, dva alikvota denosumaba od 70 mg/ml u acetatu pri pH 5,2 dijalizirana su uz odgovarajući DF pufer opisan u TABELI 4A. Obe postavke dijalize br.1 i br.2 prošle su kroz ukupno 3 promene pufera kako bi se postiglo razblaženje prethodne formulacije od 1 milion puta kako bi se osigurala potpuna razmena pufera. Nakon dijalize, alikvoti svake postavke za dijalizu #1 i #2 opisani u TABELI 4A su uklonjeni da bi se pripremio korak razblaživanja za formulacije 8, 9, 12 i 13. Preostali materijal je zatim prekomerno koncentrisan pomoću centrifuge-koncentratora, nakon čega je usledilo razblaživanje do odgovarajućih koncentracija denosumaba navedenih u TABELI 4A i dodavanje PS20 do konačne koncentracije od 0,01%.

TABELA 4A

[0161] Formulacije su stavljene u posude sa zapreminom punjenja od 1 ml i čuvane na temperaturi od 37°C do 1 meseca. Inhibicija agregacije i stabilnost protiv inhibicije agregacije tokom vremena, na osnovu formiranja HMWS i dimernih vrsta, procenjena je korišćenjem SE-UHPLC. Profili inhibicije agregacije ovih formulacija upoređeni su u početnim uslovima i tokom i nakon perioda skladištenja.

[0162] SLIKA 6 predstavlja grafikon procenta HMWS praćen putem SE-UHPLC u funkciji vremena skladištenja na 37°C za svaku formulaciju, a TABELA 4B daje tačke podataka za grafikon.

TABELA 4B

[0163] Na slikama 7A i 7B prikazani su hromatogrami isključivanja po veličini kao funkcija formulacije nakon skladištenja na 37°C tokom 1 meseca. Kao što je prikazano na Slici 6, % HMWS se povećao sa povećanjem koncentracije proteina. Formulacije 8-11 pri pH 4,8 dosledno su imale veće nivoe HMWS u poređenju sa odgovarajućim formulacijama pri pH 5,1 (formulacije 12-15). Povećanje % HMWS pri pH 4,8 je posledica velikog pika agregata prikazanog na Slici 7A (gore) na oko 5,75 minuta. Dok je % HMWS pri pH rastvora 5,1 imao rastuće dimer vrste kako sa povećanjem koncentracije proteina, ukupna HMWS je bila niža od odgovarajućih koncentracija proteina pri pH rastvora 4,8 (slika 7B (dole)).

[0164] Razlika u nivoima HMWS pri pH 5,1 naspram pH 4,8 postala je veća kako se koncentracija denosumaba povećavala, pri čemu je razlika bila veća pri višim koncentracijama denosumaba.

PRIMER 5

[0165] Formulacije sa različitim koncentracijama arginina, NAR i dva dipeptida koji se sastoje od arginin-arginina (Arg-Arg) i arginin-fenilalanina (Arg-Phe) procenjeni su na stabilizujuće efekte na rastvorima koji imaju koncentraciju denosumaba od 120 mg/ml.

[0166] Testirane formulacije su opisane u TABELI 5 u nastavku. Sve navedene vrednosti acetata i pomoćnih supstanci (osim dipeptida) odnose se na koncentracije pufera i pomoćnih supstanci prema kojima je antitelo dijafiltrirano. Svaki dipeptid je dodat u rastvor postpuferske razmene do nivoa navedenog u tabeli. Formulacije od R do X su postignute pomoću UF/DF uz DF pufer naveden u nastavku. Formulacije Y i Z su postignute pomoću LTF/DF, zajedno u jednom skupu, uz DF pufer koji sadrži 10 mM acetat, 3,6% sorbitola, pH 4,0. Nakon LTF/DF, skup za formulacije Y i Z je podeljen na 2, a Arg-Arg ili Arg-Phe dipeptidi su zatim spajkovani unutra iz 1 M osnovnog rastvora koji sadrži 3,6% sorbitola pri pH 5,1. Polisorbat 20 je dodat u svaku formulaciju u konačnoj ciljnoj koncentraciji od 0,01%. Acetat je ko-koncentrisan bez arginina, što dovodi do konačne koncentracije acetata od oko 25 mM u formulacijama S do X. Sorbitol je poželjno isključen u procesu koncentrisanja, što dovodi do smanjenja od oko 7 do 8% (m/v) od početne koncentracije.

[0167] Formulacije su stavljene u posude sa zapreminom punjenja od 1,0 ml. Formulacije su čuvane na temperaturama od 2°C do 8°C do 12 meseci i 25°C, 30°C i 37°C do 3 meseca. Stabilnost na osnovu formiranja HMWS procenjena je korišćenjem SE-UHPLC. Stabilnost ovih dipeptidnih formulacija nakon jednog meseca na 37°C upoređena je sa formulacijama arginin hidrohlorida na 37°C kao što je prikazano na Slici 8.

TABELA 5

[0168] Na Slici 8 prikazan je procenat HMWS praćen pomoću SE-UHPLC u funkciji formulacije i vremena na 37°C. Rezultati pokazuju da inhibitori agregacije aminokiselina inhibiraju stvaranje HMWS. Arginin-fenilalanin dipeptid, na primer, pokazao je značajno poboljšanje, što je rezultiralo sa oko 0,3% manje HMWS u poređenju sa drugim formulacijama. Redosled rangiranja od najniže do najviše HMWS bio je Z < < V < Y ≈ T ≈ W ≈ X ≈ U < S < R. Kao što se može videti na slici, i formulacije koje sadrže arginin-arginin (Arg-Arg) (formulacija Y) i arginin-fenilalanin (Arg-Phe) (formulacija Z) koje sadrže dipeptide smanjile su formiranje HMWS u poređenju sa kontrolnom formulacijom kojoj nedostaje arginin i nedostaju dipeptidi koji sadrže arginin (formulacija R). Formulacija Z je sadržala najmanju količinu HMWS, superiorna u odnosu na formulaciju Y.

PRIMER 6

[0169] Ovaj primer pokazuje inhibiciju agregacije i stabilnost denosumaba u funkciji različitih koncentracija arginina i fenilalanina, i uporednih smeša arginina i fenilalanina.

[0170] Kao što je prethodno opisano, identifikovani su arginin hidrohlorid (HCl) i arginin HCl-fenilalanin dipeptidi da smanjuju početni nivo i brzinu formiranja HMWS denosumaba. U ovoj studiji, formulacije koje sadrže koncentracije arginin HCl, koncentracije fenilalanina i kombinaciju arginin HCl i fenilalanina procenjene su na stabilizujuće efekte na rastvore koji sadrže denosumab pri 120 mg/ml.

[0171] Testirane formulacije (formulacije 16-20) opisane su u TABELI 6A u nastavku. Da bi se pripremile ove formulacije, alikvot denosumaba od 70 mg/ml u acetatu, pH 5,2 je dijaliziran uz DF pufer koji je opisan u TABELI 6A, sa ukupno 3 promene pufera da bi se postiglo 1 milion puta razblaživanje prethodne formulacije kako bi se osigurala potpuna razmena pufera. Materijal je zatim prekomerno koncentrisan pomoću centrifugekoncentratora, nakon čega je usledilo razblaživanje do 120 mg/ml i dodavanje polisorbata 20 do konačne koncentracije od 0,01%. Formulacija 16 je bila kontrolna formulacija.

TABELA 6A

[0172] Formulacije su stavljene u posude sa zapreminom punjenja od 1,0 ml. Formulacije su čuvane na temperaturi od 37°C do 1 meseca. Inhibicija agregacije i stabilnost na inhibiciju agregacije tokom vremena, na osnovu formiranja HMWS i dimernih vrsta, procenjena je korišćenjem SE-UHPLC. Profili inhibicije agregacije ovih formulacija upoređeni su u početnim uslovima i tokom i nakon perioda skladištenja.

[0173] Na Slici 9 prikazan je procenat HMWS praćen pomoću SE-UHPLC u funkciji formulacije i vremena na 37°C. Na Slici 10 prikazani su hromatogrami isključivanja po veličini kao funkcija formulacije nakon skladištenja na 37°C tokom 1 meseca. TABELA 6B

1

u nastavku prikazuje procenat HMWS praćen pomoću SE-UHPLC u funkciji formulacije i vremena na 37°C.

TABELA 6B

[0174] Sve formulacije koje sadrže inhibitor agregacije aminokiselina, arginin ili fenilalanin (formulacije 17-20), bile su superiorne u odnosu na sorbitol kontrolnu formulaciju kojoj nedostaje bilo koji inhibitor agregacije aminokiselina (formulacija 16). Sve formulacije koje sadrže fenilalanin (formulacije 18, 19 i 20) slično su sadržale niske nivoe HMWS, u poređenju i sa kontrolnom i arginin HCl formulacijom (formulacije 16, odnosno 17) (Slika 9). Brzina formiranja HMWS bila je slična u svim formulacijama koje sadrže arginin HCl i fenilalanin (formulacije 17-19), kao što je prikazano na Slici 9. Kombinovana formulacija koja sadrži i 38 mM arginin i 38 mM fenilalanin (ukupno 76 nM, formulacija 20) pokazala je stabilnost bolju od formulacije 75 mM arginin (formulacija 17) (slika 9), ali ne i bolju od formulacije 75 mM fenilalanin (formulacija 19) (Slika 9).

PRIMER 7

[0175] Ovaj primer pokazuje inhibiciju agregacije i stabilnost denosumaba u funkciji različitih koncentracija fenilalanina.

[0176] U prethodnim studijama, arginin hidrohlorid i arginin hidrohlorid-fenilalanin dipeptidi identifikovani su da minimiziraju početni startni nivo i brzinu formiranja HMWS denosumaba. Formulacije koje sadrže arginin hidrohlorid, različite koncentracije fenilalanina

2

i kombinaciju arginin hidrohlorida i fenilalanina procenjene su na stabilizujuće efekte na rastvore koji sadrže denosumab pri 120 mg/ml.

[0177] Testirane formulacije su opisane u Tabeli 7A u nastavku. Da bi se pripremili ispitni uzorci A-E, alikvot denosumaba od 70 mg/ml u acetatu, pH 5,2 je dijaliziran uz DF pufere opisane u nastavku, sa ukupno 3 promene pufera da bi se postiglo 1 milion puta razblaženje prethodne formulacije kako bi se osigurala potpuna razmena pufera. Materijal je zatim prekomerno koncentrisan pomoću centrifuge-koncentratora do približno 130 mg/ml do 150 mg/ml, nakon čega je usledilo razblaživanje do 120 mg/ml i dodavanje polisorbata 20 do konačne koncentracije od 0,01%. Formulacija A je bila kontrolna formulacija.

[0178] Formulacije su stavljene u posude sa zapreminom punjenja od 1,0 ml. Formulacije su čuvane na temperaturi od 37°C do 1 meseca. Stabilnost na bazi formiranja HMWS procenjena je korišćenjem SE-UHPLC. Profili stabilnosti ovih formulacija upoređeni su nakon mesec dana na 37°C sa formulacijama sorbitola i arginin hidrohlorida/sorbitola na 37°C kao što je prikazano na slici 11A.

[0179] Da bi se pripremili ispitni uzorci F - K, alikvot denosumaba pri 70 mg/ml u acetatu, pH 5,2 je ultrafiltriran/dijafiltriran (UF/DF) uz DF pufere opisane u nastavku za ukupno 12 dija-zapremina kako bi se osigurala potpuna razmena pufera. Materijal je zatim prekomerno koncentrisan do približno 200 mg/ml korišćenjem ultrafiltracije, nakon čega je usledilo razblaživanje do 120 mg/ml i dodavanje polisorbata 20 do konačne koncentracije od 0,01%. Koncentracija acetata je bila 20 mM u ovim formulacijama. Formulacija F je smatrana kontrolnom formulacijom. Sve navedene vrednosti acetata i pomoćnih supstanci su za koncentracije pufera i pomoćnih supstanci uz koje se antitelo dijalizira.

[0180] Formulacije su stavljene u posude sa zapreminom punjenja od 1,0 ml. Formulacije su čuvane na temperaturi od 40°C do 1 meseca. Stabilnost na bazi formiranja HMWS procenjena je korišćenjem SE-UHPLC. Profili stabilnosti ovih formulacija upoređeni su nakon mesec dana na 40°C sa formulacijama sorbitola i arginin hidrohlorida/sorbitola na 40°C kao što je prikazano na slici 11B.

TABELA 7A

4

[0181] Na slici 11A i u Tabeli 7B prikazan je procenat HMWS praćen pomoću SE-UHPLC u funkciji formulacije i vremena na 37°C. Na slici 11B i Tabeli 7C prikazan je procenat HMWS praćen pomoću SE-UHPLC u funkciji formulacije i vremena na 40°C. Na slikama 12A i 12B prikazani su hromatogrami isključivanja po veličini kao funkcija formulacije nakon skladištenja na 37°C i 40°C tokom 1 meseca.

TABELA 7B

TABELA 7C

[0182] Sve formulacije fenilalanina (formulacije C, D, E, G - K) sadržale su niže nivoe HMWS u poređenju sa formulacijama sorbitola i arginin hidrohlorida/sorbitola (formulacije A, odnosno B). Formulacija kombinacije arginin hidrohlorida i fenilalanina imala je sličnu stabilnost u poređenju sa formulacijom arginin/sorbitol (formulacija B). Sve formulacije su bile superiorne u odnosu na kontrolnu formulaciju sorbitola (formulacije A i F).

PRIMER 8

[0183] Ovaj primer pokazuje procenu različitih inhibitora agregacije aminokiselina.

[0184] Procena različitih inhibitora agregacije aminokiselina sprovedena je pripremom osam formulacija sa hidrofobnom, aromatičnom ili polarnom/naelektrisanom aminokiselinom kako bi se utvrdio njihov efekat na minimiziranje količine (%) HMWS u tečnoj formulaciji denosumaba visoke koncentracije (120 mg/ml) i formiranje HMWS tokom vremena.

Formulacija je uključivala jednu od osam L-amino kiselina i smanjenu količinu sorbitola, u odnosu na kontrolnu formulaciju koja ne sadrži nijedan inhibitor agregacije aminokiselina i veću količinu sorbitola radi izotoničnosti (Formulacija 26).

[0185] Testirani inhibitori agregacije aminokiselina grupisani su u jednu od tri grupe (grupe I-III) i sadržali su količinu inhibitora agregacije aminokiselina, kako sledi:

I. Aromatične aminokiseline:

(a) 38 mM fenilalanin (formulacija 27);

(b) 38 mM triptofan (formulacija 28);

II. Polarne/naelektrisane aminokiseline:

(a) 75 mM arginin HCl (Formulacija 29);

(b) 75 mM lizin (formulacija 30);

(c) 75 mM histidin (formulacija 31);

III. Hidrofobne aminokiseline:

(a) 38 mM leucin (formulacija 32);

(b) 38 mM izoleucin (formulacija 33);

(c) 38 mM valin (formulacija 34).

[0186] Da bi se pripremile formulacije 26-34, alikvot denosumaba od 70 mg/ml u acetatu, pH 5,2 je dijaliziran uz DF pufer opisan u TABELI 8A, sa ukupno 3 promene pufera da bi se postiglo 1 milion puta razblaženje prethodne formulacije kako bi se osigurala potpuna razmena pufera. Dijaliza formulacije histidina F koristila je pufer sa početnom pH vrednošću od 4,0 i predviđeno je da će se pH vrednost pomeriti na ciljnu pH vrednost od 5,1 nakon koncentracije proteina zbog Donanovog efekta i ko-centracije acetata. Međutim, pH se nije pomerio na ciljni pH od 5,1 nakon što je protein koncentrisan na 120 mg/ml, ali je ostao na pH 4,0. Da bi se pH formulacije histidina doveo do pH 5,1, bila je potrebna titracija sa razblaženim (0,1N) NaOH. Preostale formulacije su prekoncentrisane korišćenjem centrifuge-koncentratora, nakon čega sledi razblaživanje do 124-128 mg/ml i dodavanje polisorbata 20 do konačne koncentracije od 0,01% (m/v).

TABELA 8A

[0187] Formulacije su stavljene u posude sa zapreminom punjenja od 1,0 ml. Formulacije su čuvane na temperaturi od 37°C do 4 nedelje. Inhibicija agregacije i stabilnost u odnosu na inhibiciju agregacije tokom vremena, na bazi formiranja HMWS i dimernih vrsta, procenjena je korišćenjem SE-UHPLC. Profili inhibicije agregacije ovih formulacija upoređeni su u početnim uslovima i tokom i nakon perioda skladištenja.

[0188] Slike 13-15 predstavljaju grafikone procenta HMWS praćenog pomoću SE-UHPLC u funkciji vremena skladištenja na 37°C za svaku formulaciju, a Tabela 8B daje podatke za grafikone. Na Slici 16-18 prikazani su hromatografski slojevi formulacija navedenih u Tabeli 8A nakon skladištenja na 37°C tokom 1 meseca. Slike 13 i 16 se odnose na formulacije koje sadrže aromatične aminokiseline, Slike 14 i 17 se odnose na formulacije koje sadrže polarne/naelektrisane aminokiseline, a Slike 15 i 18 se odnose na formulacije koje sadrže hidrofobne aminokiseline.

TABELA 8B

[0189] Kao što je prikazano na Slikama 13-15, sve formulacije koje sadrže inhibitor agregacije aminokiselina (formulacije 27-34) pokazale su određeno poboljšanje stabilnosti, u odnosu na formulaciju acetat/sorbitol (formulacija 26). Formulacije koje sadrže aromatičnu aminokiselinu (formulacije 27 i 28) pokazale su najveće smanjenje %HMWS. Formulacija koja sadrži fenilalanin (formulacija 27) je takođe pokazala veliko smanjenje HMWS, a formulacija koja sadrži triptofan je pokazala najveće smanjenje, u odnosu na kontrolu (formulacija 26). Od formulacija denosumaba koje sadrže polarne/naelektrisane aminokiseline (formulacije 29-31) generalno su pokazale veće količine agregata većeg reda (slika 17) u poređenju sa drugim formulacijama koje imaju stabilizatore aminokiselina (slike 16 i 18), a ova specifična formulacija histidina pokazala je veće količine ukupne HWMS u poređenju sa formulacijom acetata/sorbitola (formulacija 26) (Slika 14). Rezultati formulacije histidina mogu biti sa odstupanjem od procesa dijalize, dužeg trajanja provedenog na pH 4,0 i titracije formulacije sa razblaženim NaOH. Formulacije koje sadrže hidrofobnu aminokiselinu (formulacije 32-34) pokazale su dosledno poboljšanje u formiranju HMWS.

PRIMER 9

[0190] Ovaj primer pokazuje mogući mehanizam delovanja arginina i fenilalanina u stabilizaciji denosumaba. Masena spektrometrija razmene vodonika/deuterijuma (HDX-MS) je osetljiva i robusna tehnologija za karakterizaciju interakcije protein-protein/ligand/ ekscipijens. Postupak detektuje promene u vodoničnoj vezi okosnice amida usled interakcije sa pomoćnom supstancom.

[0191] Masena spektrometrija razmene vodonika i deuterijuma (HDX-MS) sprovedena je sa denosumabom (u koncentraciji od 3 mg/ml) u 10 mM acetatnom puferu (pH 5,2) ("A52") u prisustvu L-arginina (formulacija 35), L-fenilalanina (formulacija 36) ili L-glicina (formulacija 37) i upoređena sa formulacijom denosumaba kojoj nedostaju inhibitori agregacije aminokiselina (formulacija 38). Eksperimenti su sprovedeni na 4°C (sa koncentracijom 75 mM L-arginina, L-fenilalanina ili L-glicina) i 37°C (sa koncentracijom 150 mM L-arginina, L-fenilalanina ili L-glicina). Nakon analize više od 530 peptida, identifikovan je mali broj regiona sa značajnom konformacionom promenom. Nekoliko reprezentativnih peptida iz ovih regiona je zahvaćeno na Slikama 19-30.

[0192] Slike 19-24 su grafikoni % inkorporacije deuterijuma na 4°C u funkciji vremena (log (sec)) za aminokiseline lakog lanca 28-33 (slika 19), aminokiseline lakog lanca 108-116 (slika 20), aminokiseline lakog lanca 125-132 (slika 21), aminokiseline teškog lanca 47-59 (slika 22), aminokiseline teškog lanca 243-253 (slika 23) i aminokiseline teškog lanca 392-399 (slika 24) za svaku od formulacija 35-38.

[0193] Slike 25-30 su grafikoni % inkorporacije deuterijuma na 37°C u funkciji vremena (log (sec)) za aminokiseline lakog lanca 28-33 (slika 25), aminokiseline lakog lanca 108-117 (slika 26), aminokiseline lakog lanca 124-131 (slika 27), aminokiseline teškog lanca 47-59 (slika 28), aminokiseline teškog lanca 242-253 (slika 29) i aminokiseline teškog lanca 392-399 (slika 30) za svaku od formulacija 35-38.

[0194] Ovi podaci podržavaju da Arg i Gly imaju sličan efekat interakcije na denosumab, iako je Arg imao nešto jači HDX otisak (konformacione promene) na denosumab: jaka stabilizacija u Fab LC 28-33 regionu; suptilna stabilizacija u Fab LC 108-132 i HC 47-59, Fc CH3 HC 392-399 regionima; i suptilna destabilizacija u Fc CH2243-253 regionu. Bez namere da bude vezan bilo kojom određenom teorijom, zamišljeno je da je efekat arginin hidrohlorida posledica kombinovanog preferencijalnog isključivanja sa površine denosumaba i slabih površinskih interakcija, dok glicin deluje preferencijalnim isključivanjem.

[0195] Međutim, fenilalanin nije pokazao značajnu strukturnu perturbaciju na denosumabu. Bez namere da bude vezan bilo kojom određenom teorijom, zamišljeno je da bi efekat stabilizacije fenilalanina mogao biti putem jednog ili više sledećih mehanizama: interakcije bočnog lanca jer nema uticaja na okosnicu peptida (nema HDX otiska); i/ili interakcija katjona-pi sa bočnim lancima arginina/lizina bez uticaja na mrežu vodonične veze okosnice.

PRIMER 10

[0196] Ovaj primer pokazuje mogući mehanizam delovanja fenilalanina u stabilizaciji denosumaba.

1

[0197] Da bi se proučio specifični efekat Phe na denosumab, izvršena je simulacija molekularne dinamike. Konkretno, Fab domen denosumaba je solvatiziran u simulacionoj kutiji sa viškom Phe i sprovedene su dve simulacije 10 ns. Zajedno, ostaci Phe vezani za Fab više od 90% vremena su izabrani za dalju analizu. Identifikovano je devet takvih slučajeva. U 5 od 9 posmatranja dugotrajnog boravka, ostatak Phe je bio vezan za graničnu površinu VH/VL (varijabilni teški/varijabilni laki) i CH/CL (konstantni teški/konstantni laki) regiona. U jednom primeru, verovalo se da bočni lanac Phe interaguje sa bočnim lancima hidrofobnih ostataka (npr. V93, Y95 i W112 teškog lanca i A44 i P45 lakog lanca), na graničnoj površini VH/VL. U drugom primeru, verovalo se da prsten bočnog lanca Phe interaguje sa NH3+ i COO(-) grupama ostataka (npr. T 165 lakog lanca i G171, V172 i T174 teškog lanca) na graničnoj površini CH1 i CL. Bez namere da bude vezano bilo kojom određenom teorijom, ovo zapažanje je dovelo do ideje da je specifičan efekat Phe u ublažavanju agregacije denosumaba posledica interakcije fenil grupe sa hidrofobnim ostacima (npr. R30, G31, R32 i Y33 CDR1 lakog lanca, A52 CDR2 lakog lanca i M106 CDR3 teškog lanca) koji formiraju graničnu površinu teških konstantnih 1 (Hc) i lakih konstantnih (Lc) lanaca. Pretpostavlja se da će ova interakcija zameniti prethodno hidrofobnu površinu relativno naelektrisanijom (shodno tome hidrofilnijom) površinom iz grupa NH3(+) i COO(-) iz pomoćne supstance Phe.

PRIMER 11

[0198] Sprovedena je procena stabilnosti višestrukih konstrukata anti-RANKL antitela (izotipova IgG1, IgG2 i IgG4). Kao što je gore opisano, i arginin HCl i fenilalanin minimiziraju početne HMWS i nivoe HWMS tokom vremena, u poređenju sa kontrolnom formulacijom acetat/sorbitol denosumaba (koji je IgG2 imunoglobulin). Ova procena je izvedena kako bi se uporedio potencijal Arg-HCl i Phe za smanjenje HMWS u formulacijama koje sadrže različite konstrukte anti-RANKL antitela. Konstrukti IgG1 i IgG4 testirani u ovoj studiji sadržali su iste hipervarijabilne regione (koji određuju komplementarnost) (CDR) u poređenju sa denosumabom, ali su sadržali različite konstrukcije sa konstantnim domenom. Različiti konstrukt IgG2 testiran u ovoj studiji imao je različite CDR u odnosu na denosumab, ali je sadržao istu konstrukciju konstantnog domena.

[0199] Svaki testirani konstrukt antitela je prečišćen i koncentrisan od 8 mg/ml do 70 mg/ml korišćenjem koncentrisanja centrifugom. Svaka koncentrisana zapremina je podeljena na tri alikvota i zatim dijalizirana uz acetatni pufer formulisan sa sorbitolom, sorbitol/fenilalaninom

2

i sorbitol/arginin hidrohloridom za pripremu formulacija 39-47, kao što je opisano u TABELI 9. Uzorci nakon dijalize su bili pre-koncentrisani na više od 120 mg/ml sa koncentrisanjem centrifugom. Protein antitela je razblažen do 120 mg/ml sa odgovarajućim puferom.

TABELA 9

[0200] Formulacije su stavljene u staklene posude sa zapreminom punjenja od 1,0 ml.

Formulacije su čuvane na temperaturi od 37°C do 1 meseca. Inhibicija agregacije i stabilnost protiv inhibicije agregacije tokom vremena, na bazi formiranja HMWS, procenjena je korišćenjem SE-UHPLC. Profili inhibicije agregacije ovih formulacija upoređeni su u početnim uslovima i nakon perioda skladištenja. Stabilnost ovih formulacija nakon skladištenja upoređena je u okviru klase imunoglobulina.

[0201] Na slikama 31, 33 i 35 (i povezanim TABELAMA 10, 12 i 14 u nastavku) prikazan je procenat HMWS praćen pomoću SE-UHPLC u funkciji formulacije i vremena na 37°C sa imunoglobulinima G (IgG1, IgG2, odnosno IgG4). Na Slikama 32, 34 i 36 (i povezanim TABELAMA 11, 13 i 15 u nastavku) prikazan je procenat vrsta niske molekulske mase (LMWS, npr. fragmentacija proteina) koje prati SE-UHPLC kao funkcija formulacije i vremena na 37°C sa imunoglobulinima G (IgG1, IgG2, odnosno IgG4). Na Slikama 37, 38 i 39 prikazana su preklapanja hromatograma isključivanja po veličini kao funkcija formulacije nakon skladištenja na 37C za t=4 nedelje.

TABELA 10: Poređenje % HMW, IgG1 (A, B, C) na 37C tokom 4 nedelje

TABELA 11: Poređenje % LMWS, IgG1 (A, B, C) na 37C tokom 4 nedelje

4

TABELA 12: Poređenje % HMW, IgG2 (D, E, F) na 37C tokom 4 nedelje

TABELA 13: Poređenje % HMW, IgG2 (D, E, F) na 37C tokom 4 nedelje

TABELA 14: Poređenje % HMW, IgG4 (G, H, I) na 37C tokom 4 nedelje

TABELA 15: Poređenje % LMWS, IgG4 (G, H, I) na 37C tokom 4 nedelje

[0202] Kao što je prikazano na Slikama 31 i 32, molekul IgG1, koji ima sličan CDR region kao i prethodni uzorci denosumaba, pokazao je smanjenje od približno 0,2% u HMWS sa dodatkom fenilalanina u poređenju sa kontrolnom formulacijom acetat/sorbitol. Uzorci IgG2 koji imaju različit CDR i prikazani su na Slikama 33 i 34 pokazali su povećanje HMWS u formulaciji acetat/fenilalanin/sorbitol u poređenju sa kontrolnom formulacijom acetat/sorbitol. Formulacije acetat/sorbitol i acetat/fenilalanin/sorbitol imale su sličnu stabilnost za tip uzorka IgG4 sa acetat/sorbitol/arginin koji ima veću formaciju HMWS kao što je prikazano na Slikama 35 i 36. U svim slučajevima sa tipovima uzoraka IgG1, IgG2 i IgG4, formulacija koja sadrži acetat/sorbitol/arginin pokazala je povećanu razgradnju HMWS u poređenju sa formulacijama acetat/sorbitol (kontrola) i acetat/fenilalanin/sorbitol.

[0203] Zbog velikog povećanja fragmentacije proteina u formulaciji acetat/arginin/sorbitol kao što je prikazano na Slikama 37 i 38, odnos između fragmentacije i izoforme antitela prikazan je na Slikama 32, 34 i 36. U literaturi je pokazano da agregacija posredovana fragmentacijom monoklonskih antitela može rezultirati antitelima uskladištenim na 37°C [Perico N. et al., J.Pharm.Sci. (2009) 98, pgs.3031 - 3042]. Ovaj mehanizam je moguć u ovoj proceni jer je fragmentacija najveća u formulacijama acetat/arginin/sorbitol. Fragmentacija je minimizirana u formulaciji acetat/fenilalanin/sorbitol koja potencijalno dovodi do manjeg broja HMWS vrsta. Tip uzorka IgG4 nema ubrzanu fragmentaciju ili agregaciju.

[0204] Iz podataka prikupljenih u ovoj studiji, kao i iz prethodnih podataka o molekularnom modeliranju podataka prikupljenih sa denosumabom, može se utvrditi snažna korelacija između aminokiselinske sekvence CDR i relativnog efekta smanjenja HMWS sa fenilalaninom. Uočeno je smanjenje HMW vrsta u denosumabu (IgG2) i IgG1 varijanti koje su imale identične CDR aminokiseline, ali nije uočeno smanjenje HMWS u IgG2 varijanti sa različitim CDR domenima. Čini se da su aminokiselinske sekvence sadržane u CDR domenima podložne interakciji sa fenilalaninom i naknadnoj inhibiciji agregacije. Molekul IgG4 je takođe imao identične CDR regione u poređenju sa denosumabom, ali je tokom studije otkrivena minimalna promena agregacije. Molekul IgG4 se razlikuje od verzije IgG1 i IgG2 prvenstveno dužinom aminokiselina šarke i njenom funkcionalno aktivnom strukturom. Kako izoforme IgG1 i IgG2 antitela imaju proširenu strukturu koja se obično opisuje kao "Y" oblik, domen IgG4 Fab CH1 stupa u interakciju sa domenom CH2 formirajući kompaktniju strukturu [Aalberse R.C. et al., Immunology (2002), 105, pgs.9-19] Ova kompaktna struktura mogla bi da inhibira reakcije fragmentacije i agregacije koje se obično vide sa IgG1 i IgG2 modalitetima.

PRIMER 12

[0205] Sprovedena je studija za praćenje stabilnosti denosumaba formulisanog kako je opisano u nastavku i u vezi sa Tabelom 16 (Formulacije 51-55). Puferi za dijafiltraciju se razlikuju po koncentraciji acetata i početnoj pH vrednosti da bi se proizvele konačne formulacije sa pH 5,1 pri koncentraciji denosumaba od 120 mg/ml. Pored toga, nivo sorbitola je podešen kako bi se održala izotoničnost konačnog proizvoda (-300 mOsm/kg). Denosumab u dozi od 70 mg/ml je dijafiltriran prema svakom puferu za više od 7 dijazapremina, zatim je ultrafiltriran do oko 180 gm/ml i razblažen sa puferom za dijafiltraciju i polisorbatom do koncentracije od 120 mg/ml denosumaba i 0,01% polisorbata 20. Stabilnost je procenjena korišćenjem SE-UHPLC nakon skladištenja na 37°C i pokazuje da je stabilnost denosumaba u ovim formulacijama veoma slična. Početne vrste HMW se blago smanjuju kako se početne koncentracije acetata povećavaju. Nasuprot tome, brzine agregacije se neznatno poboljšavaju u formulacijama sa nižim nivoima acetata.

TABELA 16

REFERENTNI PRIMER 13

[0206] Sledeći primer izveštava o rezultatima studija o uticaju arginina na hemijsku stabilnost denaturacije denosumaba pri tri različite pH vrednosti: 4,5, 4,8 i 5 (ili 5,2).

[0207] Svi eksperimenti hemijske denaturacije sprovedeni su pomoću instrumenta Unchained Labs - HUNK sa fluorescentnim detektorom. Talasna dužina ekscitacije bila je 280 nm, a snimci emisije snimljeni su između 300 i 500 nm. Za svaki eksperiment denaturacije, protein, pufer i denaturant (gvanidinijum HCl) su raspodeljeni u 36 bunara sa linearnim povećanjem koncentracije denaturanta, što je rezultiralo krivom od 36 tačaka za svako stanje. Softver za fitovanje krive koji je obezbedio proizvođač instrumenta (Unchained Labs) korišćen je za fitovanje tačaka podataka. Korišćen je model sa dva stanja, jer su postojali dokazi o samo jednoj tranziciji (nativni ↔ denaturisani). Eksperimenti su sprovedeni korišćenjem 0 - 6 M uree u 10mM acetatu 5,0% m/v sorbitola i titrirani do zahtevane pH vrednosti od 4,5, 4,8 ili 5 (5,2). Koncentracija proteina denosumaba bila je 7 mg/ml u svim eksperimentima.

[0208] Na slici 40 prikazane su krive izotermne hemijske denaturacije denosumaba u odsustvu arginina, pri pH 4,5, 4,8 i 5,0. U odsustvu arginina, C1/2hemijskog denaturanta potrebnog za 50%-no odvijanje je sličan u tri ispitivana uslova pH.

[0209] Na Slici 41 prikazane su krive izotermne hemijske denaturacije denosumaba u prisustvu 75mM arginin HCl pri pH 4,5, 4,8. i 5,2. Došlo je do značajnog povećanja stabilnosti hemijske denaturacije pri pH 5,2 u poređenju sa pH 4,8 i 4,5. C1/2se povećava za 1M denaturanta gvanidinijum HCl pri pH 5,2 u odnosu na niži pH. Dakle, zaštitna priroda arginina je iznenađujuća i veoma zavisi od pH.

PRIMER 14

[0210] Sledeći primer daje rezultate studija o uticaju arginina i fenilalanina na stabilnost formulacija denosumaba visoke koncentracije u špricevima tokom vremena.

[0211] U prethodnim studijama, arginin hidrohlorid i fenilalanin su identifikovani da smanjuju početni nivo i brzinu stvaranja HMWS denosumaba. U ovoj studiji, formulacije koje sadrže arginin-hidrohlorid, fenilalanin i kombinaciju arginin hidrohlorida i fenilalanina procenjene su na stabilizujuće efekte na rastvore koji sadrže denosumab pri 120 mg/ml i čuvaju se u špricevima do tri meseca i na dve različite temperature.

[0212] Testirane formulacije su opisane u TABELI 17 u nastavku. Da bi se pripremile formulacije 56-59, denosumab u dozi od 70 mg/ml u acetatu, pH 5,2 je dijafiltiran uz pufere za dijafiltraciju (DF) opisane u nastavku, za 8 dija-zapremina kako bi se osigurala potpuna razmena pufera. Materijal je zatim ultrafiltriran do više od 180 mg/ml, nakon čega je usledilo razblaživanje do 120 mg/ml i dodavanje polisorbata 20 do konačne koncentracije od 0,01%. Formulacija 56 je bila kontrolna formulacija. Vrednosti acetata, arginin HCl i fenilalanina navedene su za DF pufer i dati su procenjeni nivoi u konačnom sastavu od 120 mg/ml denosumaba, uzimajući u obzir isključenje pomoćnih supstanci i ko-koncentrisanje acetata kada nije prisutan nijedan drugi protivjon. Viskozitet na 5°C i 25°C izmeren je pomoću Paarovog modularnog kompaktnog reometra pri brzinama smicanja do 1000 s<-1>(inverzne sekunde). Formulacije su stavljene u staklene prethodno napunjene špriceve (PFS) sa zapreminom punjenja od 1,0 ml. Paralelni kompleti špriceva su čuvani na temperaturi od 25 °C tokom 3 meseca, odnosno na 37 °C tokom 2 meseca. Stabilnost na bazi formiranja HMWS procenjena je korišćenjem SE-UHPLC.

TABELA 17

[0213] Na Slikama 42 i 43 prikazan je procenat HMWS praćen pomoću SE-UHPLC u funkciji formulacije i vremena na 25°C tokom 3 meseca, odnosno 37°C tokom 2 meseca.

[0214] U TABELAMA 18-21 prikazani su isti podaci u tabelarnom obliku, kao i povećanje HMWS u odnosu na početne nivoe HMWS.

TABELA 18: nivo % HMWS na 25 °C tokom 12 nedelja

TABELA 19: Povećanje HMWS na 25 °C tokom 12 nedelja

TABELA 20: Nivo % HMWS na 37 °C tokom 8 nedelja

1

TABELA 21: Povećanje HMWS na 37 °C tokom 8 nedelja

[0215] Ovaj primer pokazuje da dodavanje arginina, fenilalanina i njihovih kombinacija smanjuje nivo početne HMWS (t=0) u formulacijama denosumaba visoke koncentracije. Na 25°C, povećanje HMWS je smanjeno u formulaciji fenilalanina 59, u poređenju sa kontrolnom formulacijom 56. Na 37 °C, formulacije 57 i 59 imaju smanjeno formiranje HMWS u poređenju sa kontrolnom formulacijom sorbitola 56. Formulacija koja sadrži i arginin HCl i fenilalanin formirala je HMWS većom brzinom na 37°C u odnosu na druge formulacije, što ukazuje na to da kombinacija ovih pomoćnih supstanci destabilizuje denosumab na tako višim temperaturama u ovoj formulaciji.

[0216] U celoj ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koji slede, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč "sadržati" i varijacije kao što su "sadrži" i "koji sadrži" podrazumevaće uključivanje navedenog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka, ali ne i isključivanje bilo kog drugog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka.

[0217] U celoj specifikaciji, gde su sastavi opisani kao oni koji uključuju komponente ili materijale, smatra se da sastavi takođe mogu sadržati u suštini, ili da sadrže, bilo koju kombinaciju nabrojanih komponenti ili materijala, osim ako nije drugačije opisano. Isto tako, tamo gde su postupci opisani kao oni koje uključuju određene korake, razmatra se da postupci takođe mogu obuhvatiti, ili da obuhvataju, bilo koju kombinaciju nabrojanih koraka, osim ako nije drugačije opisano. Ovde opisano obelodanjivanje na odgovarajući način može se primeniti u odsustvu bilo kog elementa ili koraka koji ovde nije posebno obelodanjen.

2

Claims

Patentni zahtevi

1. Vodena farmaceutska formulacija koja sadrži:

- anti-RANKL antitelo u koncentraciji u opsegu od 100 do 140 mg/mL; i

- 5 mM do 180 mM L-fenilalanin ili L-triptofan;

pri čemu vodena farmaceutska formulacija ima pH u opsegu od 5,0 do 5,4; i

pri čemu anti-RANKL antitelo sadrži teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 14 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 13.

2. Vodena farmaceutska formulacija prema zahtevu 1, pri čemu anti-RANKL antitelo je denosumab.

3. Vodena farmaceutska formulacija prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu koncentracija anti-RANKL antitela iznosi 120 mg/ml ± 12 mg/ml.

4. Vodena farmaceutska formulacija prema bilo kom od prethodnih zahteva, koja sadrži:

(i) L-fenilalanin; ili

(ii) 20 mM ili 50 mM L-fenilalanin ili L-triptofan, opciono 40 mM L-fenilalanin.

5. Vodena farmaceutska formulacija prema bilo kom od prethodnih zahteva, koja dalje sadrži modifikator toničnosti, opciono izabran iz grupe koju čine: sorbitol, manitol, saharoza, trehaloza, glicerol i njihove kombinacije, koje dalje opciono sadrže 1,0 (m/m) % do 5,0 (m/m) % modifikatora toničnosti.

6. Vodena farmaceutska formulacija prema zahtevu 5, pri čemu modifikator toničnosti sadrži sorbitol, opciono koji sadrži 2,0 (m/m) % do 5,0 (m/m) % sorbitola, ili 3,5 (m/m) % do 5,0 (m/m) % sorbitola, ili 4,0 % (m/m) do 5,0 (m/m) % sorbitola.

7. Vodena farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 1 do 4, koja ne sadrži sorbitol i/ili ne sadrži bilo koji modifikator toničnosti.

8. Vodena farmaceutska formulacija prema bilo kom od prethodnih zahteva, koja dalje sadrži surfaktant, opciono pri čemu je surfaktant izabran iz grupe koju čine: polioksietilen sorbitan estri masnih kiselina, alkilaril polietri, poloksameri i njihove kombinacije, dalje opciono pri čemu je surfaktant polisorbat 20.

9. Vodena farmaceutska formulacija prema zahtevu 8, koja sadrži najmanje oko 0,004 (m/v) % surfaktanta, opciono sadrži manje od 0,15 (m/v) % surfaktanta, dalje opciono sadrži 0,005 (m/v) % do 0,015 (m/v) % surfaktanta

10. Vodena farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 1 do 9, koja sadrži 5 mM do 60 mM pufer, opciono

(i) koji sadrži 5 mM do 50 mM pufer, opciono 9 mM do 45 mM pufer; i/ili

(ii) pri čemu je pufer acetat, citrat, sukcinat, fosfat ili hidroksimetilaminometan (Tris).

11. Vodena farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 1 do 9, koja je samopuferisana.

12. Vodena farmaceutska formulacija prema bilo kom od prethodnih zahteva, koja ima pH od 5,0 do 5,2, opciono 5,1.

13. Vodena farmaceutska formulacija prema bilo kom od prethodnih zahteva:

(a) koja ima (i) viskozitet koji nije veći od 6 cP na 5°C, (ii) provodljivost u opsegu od 500 µS/cm do 2000 µS/cm, (iii) osmolalnost od 200 mOsm/kg do 500 mOsm/kg, (iv) manje od 2% vrsta visoke molekulske mase (HMWS) i/ili više od 98% glavnog pika antitela, mereno putem SE-UHPLC, nakon skladištenja na 2°C do 8°C tokom najmanje 12 meseci; i/ili

(b) koja sadrži manje od 2% vrsta visoke molekulske mase (HMWS) i/ili više od 98% glavnog pika antitela, mereno putem SE-UHPLC, nakon skladištenja na 2°C do 8°C tokom najmanje 36 meseci; i/ili

(c) koja sadrži manje od 2% vrsta visoke molekulske mase (HMWS) i/ili više od 98% glavnog pika antitela, mereno pomoću SE-UHPLC, nakon prvog skladištenja na 2°C do 8°C tokom najmanje 36 meseci, nakon čega sledi drugo skladištenje na 20°C do 30°C tokom 1 meseca.

14. Vodena farmaceutska formulacija prema bilo kom od prethodnih zahteva, za primenu u (a) lečenju ili prevenciji događaja povezanog sa skeletom (SRE) kod ispitanika sa koštanim metastazama iz solidnih tumora, (b) lečenju ili prevenciji SRE kod

4

ispitanika koji je odrasla osoba ili skeletno zreli adolescent sa gigantocelularnim tumorom kosti koji je neoperabilan ili gde je verovatno da će hirurška resekcija rezultirati teškim morbiditetom, (c) lečenju hiperkalcemije maligniteta refraktornog na bisfonsfonatnu terapiju kod ispitanika, (d) lečenju ili prevenciji SRE kod ispitanika sa multiplim mijelomom ili sa koštanim metastazama iz solidnog tumora, (e) lečenju osteoporoze žena u postmenopauzi sa visokim rizikom od preloma, (f) lečenju za povećanje koštane mase kod žena sa visokim rizikom od preloma, koje primaju adjuvantnu terapiju inhibitorom aromataze za rak dojke, (g) lečenju za povećanje koštane mase kod muškaraca sa visokim rizikom od preloma, koji primaju terapiju deprivacije androgena za nemetastatski rak prostate, (h) lečenju za povećanje koštane mase kod muškaraca sa osteoporozom sa visokim rizikom od preloma, (i) terapiji kalcijumom ili vitaminom D, (j) lečenju gigantocelularnog tumora kostiju kod pacijenta kome je to potrebno, (k) lečenju hiperkalcemije maligniteta kod pacijenta kome je to potrebno, (1) lečenju osteoporoze kod pacijenta kome je to potrebno, ili (m) povećanju koštane mase kod pacijenta kome je to potrebno.