RS66295B1 - Metod konjugacije cys-mab - Google Patents

Metod konjugacije cys-mab

Info

Publication number
RS66295B1
RS66295B1 RS20241377A RSP20241377A RS66295B1 RS 66295 B1 RS66295 B1 RS 66295B1 RS 20241377 A RS20241377 A RS 20241377A RS P20241377 A RSP20241377 A RS P20241377A RS 66295 B1 RS66295 B1 RS 66295B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
antigen
protein
antibody fragment
mixture
Prior art date
Application number
RS20241377A
Other languages
English (en)
Inventor
Michal Achmatowicz
Dante ROMANINI
James R Falsey
Bradley J Herberich
Oliver R Thiel
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=63371775&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS66295(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of RS66295B1 publication Critical patent/RS66295B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovo obelodanjivanje se odnosi na metodu kapiranja, redukcije i oksidacije cys-mAb kako bi se obezbedio homogeni materijal za naknadne reakcije konjugacije.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Konjugovani biomolekuli su raznovrstan niz supstanci koje se sastoje od više molekula prekursora, od kojih je najmanje jedan izveden iz biološkog sistema. Najčešće se biološki izvedene komponente proizvode tehnikama rekombinantne DNK. U farmaceutskoj industriji, konjugovani biomolekuli su istraživani kao tretmani za različita medicinska stanja. U ovim slučajevima, konjugat može pružiti niz terapijskih koristi kombinovanjem korisnih svojstava dva ili više molekula prekursora u jedan entitet.
[0003] Jedna posebno uspešna klasa farmaceutskih biokonjugata su konjugati antitela, koji se nazivaju i konjugati antitela i leka. Ovi molekuli se sastoje od antitela, tipično izvedenog iz kulture ćelija sisara, i sintetičkog molekula sa biološkom ili farmakološkom aktivnošću. Nekoliko konjugata antitela i lekova odobreno je kao terapija za karcinom, a mnogi drugi su u kliničkom i pretkliničkom razvoju. Svi konjugati antitela i leka koji su do sada odobreni proizvedeni su korišćenjem nespecifične hemije koja proizvodi smešu konjugovanih molekula.
[0004] Farmaceutski proizvodi zasnovani na konjugatima antitela specifičnim za mesto, gde je sintetički molekul vezan na definisanim mestima u molekulu antitela, mogu pružiti terapijske koristi, kao i poboljšanu kontrolu kvaliteta i/ili rok trajanja. Stoga su preduzeti brojni napori da se razviju metode za proizvodnju konjugata antitela specifičnih za mesto. Uobičajeni pristup konjugaciji specifičnoj za mesto je upotreba cisteinskog mutantnog antitela (Cys-mAb ili Tiomab), u kojem se nova cisteinska aminokiselina uvodi u primarnu strukturu antitela. Ovaj projektovani cistein se može koristiti kao mesto konjugacije sintetičkog molekula.
Jagath R Junutula et al., "Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index", Nature Biotechnology, Vol.26, No.8 (2008) se odnosi na inženjering supstitucija cisteina na pozicijama lakih i teških lanaca antitela koja obezbeđuju reaktivne tiolne grupe i ne ometaju savijanje i sastavljanje imunoglobulina, niti menjaju vezivanje antigena.
Christopher R Behrens et al., "Methods for site-specific drug conjugation to antibodies", MABS, Vol.6, No.1 (2014) se odnosi na metode za konjugaciju lekova specifičnih za mesto sa antitelima i upoređuje rezultate in vivo sa njihovim nespecifično konjugovanim odgovarajućim entitetima.
WO 2016/067013 A1 se odnosi na metodu čvrste faze sinteze biomolekul-lek-konjugata.
WO 2009/012256 A1 se odnosi na humanizovana i konjugovana antitela protiv CD79b korisna za lečenje hematopoetskog tumora kod sisara.
WO 2005/084390 A2 se odnosi na konjugate proteina i leka i metode pravljenja konjugata proteina i leka ili konjugata proteina sa označivačem, kao i proteine koji imaju tačke konjugacije za prijem leka ili označivača.
WO 2018/136440 A1 se odnosi na metode lečenja metaboličkih bolesti i poremećaja korišćenjem sastava koji se sastoji od proteina za vezivanje antigena specifičnog za GIPR polipeptid konjugovan sa agonistom GLP-1 receptora.
WO 2017/137628 A1 se odnosi na proces selektivne redukcije antitela modifikovanih cisteinom. WO 2015/086853 A1 se odnosi na metode za dobijanje proteinskog konjugata pri čemu cisteinski ostatak proteina služi kao tačka vezivanja za hemijski deo konjugovan sa proteinom.
WO 2017/055582 A1 se odnosi na proteinske konjugate, a posebno na konjugate više od dva proteina ili polipeptida.
[0005] Konjugacija specifična za mesto sa proteinom Cys-mAb zahteva projektovani bočni lanac cisteina u redukovanom tiolnom obliku. Međutim, kada se antitela izoluju iz ćelijske kulture sisara, projektovani cistein je generalno „kapiran“ kao mešoviti disulfid sa citoplazmatskim tiolom kao što je glutation. Tako direktno dodavanje reaktivnog sintetičkog molekula neće proizvesti konjugat jer bočni lanac projektovanog cisteina nije dostupan za reakciju.
[0006] Selektivna redukcija u jednom koraku za uklanjanje kape bila bi veoma poželjna, ali trenutno nije izvodljiva zbog hemijske sličnosti između mešovitog disulfida i strukturnih disulfida u antitelima. Kada se redukcioni agens doda u Cys-mAb da bi se uklonile kape, neki deo drugih disulfida u antitelu će takođe biti redukovana, a rezultujući tioli mogu reagovati da formiraju konjugate na neželjenim mestima.
[0007] Shodno tome, i dalje postoji potreba za efikasnim, robusnim načinima proizvodnje konjugata cistein-proizvedenih antitela koji nude visok prinos i dosledan kvalitet proizvoda.
SAŽETAK PRONALASKA
[0008] Pronalazak je definisan u priloženim patentnim zahtevima.
[0009] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje pruža metodu za pripremu konjugata antitela ili konjugata fragmenta antitela, metoda koja se sastoji od koraka: a) dobijanja sastava koji se sastoji od antitela ili fragmenta antitela; b) izlaganja antitela ili fragmenta antitela agensu za blokiranje cisteina, pri čemu je agens za blokiranje cisteina cisteamin, i agens za blokiranje cisteina formira stabilan mešoviti disulfid sa najmanje jednim cisteinskim ostatkom antitela ili fragmenta antitela; c) dodavanja redukcionog agensa u sastav da bi se formirala redukciona smeša i omogućila reakcija redukcije tako da redukciona smeša sadrži redukovano antitelo ili redukovani fragment antitela, pri čemu je redukcioni agens trifenilfosfin-3, 3', 3''-trisulfonat
[0010] („TPPTS”); d) dodavanja oksidacionog agensa u redukcionu smešu kako bi se formirala oksidovana smeša i omogućila oksidaciona reakcija tako da oksidaciona smeša sadrži oksidovano antitelo ili fragment oksidovanog antitela; i e) dodavanja aktiviranog hemijskog dela u oksidovanu smešu kako bi se formirala konjugaciona smeša i omogućila reakcija konjugacije tako da se formira konjugat antitela ili konjugat fragmenta antitela.
[0011] U jednom aspektu, nakon koraka b) i pre koraka c) vrši se hromatografija sa izmenjivanjem katjona kako bi se uklonio višak agensa za blokiranje cisteina. U jednom aspektu, nakon koraka c) i pre koraka d) vrši se korak razmene pufera kako bi se uklonio redukcioni agens. U jednom otelotvorenju, korak razmene pufera je ultrafiltracija/dijafiltracija. U jednom aspektu, nakon koraka e), vrši se korak prečišćavanja kako bi se uklonio aktivirani hemijski deo. U jednom otelotvorenju, korak prečišćavanja uključuje hidrofobnu interakcionu hromatografiju ultrafiltraciju/dijafiltraciju ili hidrofobnu interakcionu hromatografiju praćenu ultrafiltracijom/dijafiltracijom.
[0012] U drugom aspektu, ovo obelodanjivanje pruža metodu za pripremu konjugata antitela ili konjugata fragmenta antitela, metoda koja se sastoji od koraka: a) dobijanja sastava koji se sastoji od mešovitog disulfida koji se sastoji od antitela ili fragmenta antitela sa kapiranim slobodnim cisteinom koji se sastoji od cisteaminske kape; b) dodavanja redukcionog agensa u sastav kako bi se formirala redukciona smeša i omogućila reakcija redukcije tako da redukciona smeša sadrži redukovano antitelo ili redukovani fragment antitela, pri čemu je redukcioni agens trifenilfosfin-3, 3', 3 "-trisulfonat („TPPTS“); c) dodavanja oksidacionog agensa u redukcionu smešu kako bi se formirala oksidaciona smeša i omogućila reakcija oksidacije tako da se formira oksidaciona smeša koja se sastoji od oksidiranog antitela ili fragmenta antitela; i d) dodavanja aktiviranog hemijskog dela u oksidovanu smešu kako bi se formirala konjugaciona smeša i omogućila reakcija konjugacije tako da se formira konjugat antitela ili konjugat fragmenta antitela.
[0013] U jednom aspektu, nakon koraka a) i pre koraka b) vrši se hromatografija sa izmenjivanjem katjona kako bi se uklonio višak agensa za blokiranje cisteina. U jednom aspektu, nakon koraka b) i pre koraka c) vrši se korak razmene pufera kako bi se uklonio redukcioni agens. U jednom otelotvorenju, korak razmene pufera je ultrafiltracija/dijafiltracija. U jednom aspektu, nakon koraka d), vrši se korak prečišćavanja kako bi se uklonio aktivirani hemijski deo. U jednom otelotvorenju, korak prečišćavanja uključuje hidrofobnu interakcionu hromatografiju („HIC“), ultrafiltraciju/dijafiltraciju ili hidrofobnu interakcionu hromatografiju praćenu ultrafiltracijom/dijafiltracijom.
[0014] U drugom aspektu, ovo obelodanjivanje pruža metodu za pripremu konjugata antitela ili konjugata fragmenta antitela, metoda koja se sastoji od koraka: a) dobijanja sastava koji se sastoji od mešovitog disulfida koji se sastoji od antitela ili fragmenta antitela sa kapiranim slobodnim cisteinom koji se sastoji od cisteaminske kape; b) dodavanja redukcionog agensa u sastav kako bi se formirala redukciona smeša i omogućila reakcija redukcije tako da redukciona smeša sadrži redukovano antitelo ili redukovani fragment antitela, pri čemu je redukcioni agens trifenilfosfin-3, 3', 3 "-trisulfonat („TPPTS“); c) dodavanja oksidacionog agensa u redukcionu smešu kako bi se formirala oksidaciona smeša i omogućila reakcija oksidacije tako da se formira oksidaciona smeša koja se sastoji od oksidiranog antitela ili fragmenta antitela; i d) dodavanja aktiviranog hemijskog dela u oksidovanu smešu kako bi se formirala konjugaciona smeša i omogućila reakcija konjugacije tako da se formira konjugat antitela ili konjugat fragmenta antitela.
[0015] U jednom aspektu, nakon koraka a) i pre koraka b) vrši se korak razmene pufera kako bi se uklonio redukcioni agens. U jednom aspektu, nakon koraka c), vrši se korak prečišćavanja kako bi se uklonio aktivirani hemijski deo. U jednom otelotvorenju, korak razmene pufera je ultrafiltracija/dijafiltracija. U jednom otelotvorenju, korak prečišćavanja uključuje hidrofobnu interakcionu hromatografiju ultrafiltraciju/dijafiltraciju ili hidrofobnu interakcionu hromatografiju praćenu ultrafiltracijom/dijafiltracijom.
[0016] U jednom otelotvorenju, mešoviti disulfid je antitelo ili fragment antitela sa kapiranim slobodnim cisteinom. U metodi pronalaska, antitelo ili fragment antitela sa kapiranim slobodnim cisteinom sastoji se od kape, pri čemu je kapa cisteamin. U metodi pronalaska, redukcioni agens je trifenilfosfin-3,3 ',3"-trisulfonat („TPPTS“). U jednom otelotvorenju, odnos redukcionog agensa i antitela ili fragmenta antitela je 2 do 4:1 (mol/mol)). U jednom otelotvorenju, oksidacioni agens je dehidroaskorbinska kiselina („DHAA“). U jednom otelotvorenju, odnos oksidacionog agensa i antitela ili fragmenta antitela je 3 do 6: 1 (mol/mol)). U jednom otelotvorenju, aktivirani hemijski deo je peptid koji se sastoji od halogena, pri čemu je halogen izabran iz grupe koja se sastoji od Br, I i Cl). U jednom otelotvorenju, odnos aktiviranog hemijskog dela i antitela ili fragmenta antitela je 2 do 3:1 (mol/mol).
[0017] U jednom otelotvorenju, antitelo ili fragment antitela obuhvata ostatak cisteina na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od D70 lakog lanca antitela u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO: 7; E276 teškog lanca antitela u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO: 8; i T363 teškog lanca antitela u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO: 8.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0018]
Slika 1. Tipični Cys mAb (IgG1) koji se sastoji od četiri polipeptidna lanca (dva laka lanca, dva teška lanca) koji se drže zajedno sa 16 nativnih disulfidnih veza (prikazanih zelenom bojom). Dodatni cisteini ugrađeni u antitelo nose dva dodatna disulfida (prikazana narandžastom bojom). Selektivna redukcija projektovanih disulfida u prisustvu ostalih 16 nativnih disulfida bila bi veoma poželjna, ali nije izvodljiva (u jednom koraku).
Slika 2. Neto selektivna redukcija može se izvršiti u dva koraka. (1) Korak redukcije obezbeđuje potpuno „dekapiranje“ projektovanih disulfida - neke prirodne disulfidne veze su takođe rascepljene. (2) Korak oksidacije vraća nativnu strukturu IgG1. Klirens UF/DF tiola oslobođenog u koraku redukcije (R-SH) je potreban pre oksidacije kako bi se sprečilo „ponovno kapiranje“.
Slika 3. „Dekapirano“ Cys mAb lako podnosi konjugaciju specifičnu za mesto sa alkilirajućim agensima (npr. peptidnim derivatima bromoacetamida).
Slika 4. Direktno poređenje performansi redukcije usklađenog para (CA TCEP) i neusklađenog para (mes TCEP).
Slika 5. Formiranje „dekapiranog“ Cys mAb tokom vremena. Uslovi reakcije: 10 g/l cisteaminom kapiranog Cys mAb u specifičnom puferu pri pH 5,0, 3,5 ekvivalentnih količina fosfina (TPPTS, TPPDS ili TCEP), sobna temperatura. Reakciona smeša je praćena hromatografijom sa izmenjivanjem katjona i kvantifikovana na 280 nm. Samo „dekapirano“ Cys mAb je prikazano na ovoj slici.
Slika 6. Proces konjugacije na bazi cisteamina omogućava skoro stehiometrijske količine reagenasa za redukciju, oksidaciju i alkilaciju kako bi se dobio mAb-peptidni konjugat sa uniformnim sadržajem PAR2 (npr. ≥95%).
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0019] Ovo obelodanjivanje pruža metodu kapiranja, redukcije i oksidacije cys-mAb kako bi se obezbedio homogeni materijal za naknadne reakcije konjugacije. Ova metoda pokazuje robusne načine proizvodnje konjugata antitela modifikovanih cisteinom koji nude visok prinos i dosledan kvalitet proizvoda.
[0020] Utvrđeno je da su „slobodni cisteini“ pogodne tačke vezivanja za konjugacije različitih grupa koje modifikuju svojstva. Slobodni cistein se ovde odnosi na cisteinski ostatak koji nije uključen u uobičajenu disulfidnu vezu između dva cisteina jednog ili dva polipeptida. Obično će slobodni cistein biti cistein koji je uveden u polipeptidnu sekvencu od interesa mutagenezom usmerenom na mesto, ali neki proteini mogu alternativno sadržavati cistein na odgovarajućoj poziciji. Kao što je opisano u pozadini, dodati cistein može biti pogodna tačka vezivanja za grupu koja modifikuje svojstvo proteina. Uvođenjem cisteinskog ostatka obično se dobija slobodni cistein, jer u proteinu nije prisutan partner za formiranje disulfidne veze.
[0021] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje pruža metodu za pripremu konjugata antitela ili konjugata fragmenta antitela, metoda koja se sastoji od koraka: a) dobijanja sastava koji se sastoji od antitela ili fragmenta antitela; b) izlaganja antitela ili fragmenta antitela agensu za blokiranje cisteina, pri čemu je agens za blokiranje cisteina cisteamin, i agens za blokiranje cisteina formira stabilan mešoviti disulfid sa najmanje jednim cisteinskim ostatkom antitela ili fragmenta antitela; c) dodavanja redukcionog agensa u sastav da bi se formirala redukciona smeša i omogućavanje reakcije redukcije tako da redukciona smeša sadrži redukovano antitelo ili redukovani fragment antitela, pri čemu je redukcioni agens trifenilfosfin-3, 3',3"-trisulfonat („TPPTS“); d) dodavanja oksidacionog agensa u redukcionu smešu da bi se formirala oksidovana smeša i omogućila oksidaciona reakcija tako da oksidaciona smeša sadrži oksidovano antitelo ili fragment oksidovanog antitela; i e) dodavanja aktiviranog hemijskog dela u oksidovanu smešu kako bi se formirala konjugaciona smeša i omogućila reakcija konjugacije tako da se formira konjugat antitela ili konjugat fragmenta antitela.
[0022] U jednom aspektu, nakon koraka b) i pre koraka c) vrši se hromatografija sa izmenjivanjem katjona kako bi se poboljšala homogenost antitela i uklonio višak agensa za blokiranje cisteina. U jednom aspektu, nakon koraka c) i pre koraka d) sprovodi se korak zamene pufera radi uklanjanja oslobođenih kapa (tiola) i uklanjanja redukcionog agensa. U jednom otelotvorenju, korak razmene pufera je ultrafiltracija/dijafiltracija. U jednom aspektu, nakon koraka e), vrši se korak prečišćavanja kako bi se uklonio sav višak aktiviranog hemijskog dela i poboljšala čistoća antitela ili konjugata fragmenta antitela. U jednom otelotvorenju, korak prečišćavanja uključuje hidrofobnu interakcionu hromatografiju ultrafiltraciju/dijafiltraciju ili hidrofobnu interakcionu hromatografiju praćenu ultrafiltracijom/dijafiltracijom.
[0023] U drugom aspektu, ovo obelodanjivanje pruža metodu za pripremu konjugata antitela ili konjugata fragmenta antitela, metoda koja se sastoji od koraka: a) dobijanja sastava koji se sastoji od mešovitog disulfida koji se sastoji od antitela ili fragmenta antitela sa kapiranim slobodnim cisteinom koji se sastoji od cisteaminske kape; b) dodavanja redukcionog agensa u sastav kako bi se formirala redukciona smeša i omogućila reakcija redukcije tako da redukciona smeša sadrži redukovano antitelo ili redukovani fragment antitela, pri čemu je redukcioni agens trifenilfosfin-3, 3', 3 "-trisulfonat („TPPTS“); c) dodavanja oksidacionog agensa u redukcionu smešu kako bi se formirala oksidaciona smeša i omogućila reakcija oksidacije tako da se formira oksidaciona smeša koja se sastoji od oksidiranog antitela ili fragmenta antitela; i d) dodavanja aktiviranog hemijskog dela u oksidovanu smešu kako bi se formirala konjugaciona smeša i omogućila reakcija konjugacije tako da se formira konjugat antitela ili konjugat fragmenta antitela.
[0024] U jednom aspektu, nakon koraka a) i pre koraka b) vrši se hromatografija sa izmenjivanjem katjona kako bi se uklonio višak agensa za blokiranje cisteina. U jednom aspektu, nakon koraka b) i pre koraka c) vrši se hromatografija sa izmenjivanjem katjona kako bi se uklonile kape i višak agensa za blokiranje cisteina. U jednom otelotvorenju, korak razmene pufera je ultrafiltracija/dijafiltracija. U jednom aspektu, nakon koraka d), vrši se korak prečišćavanja kako bi se uklonio aktivirani hemijski deo. U jednom otelotvorenju, korak prečišćavanja uključuje hidrofobnu interakcionu hromatografiju
ultrafiltraciju/dijafiltraciju ili hidrofobnu interakcionu hromatografiju praćenu ultrafiltracijom/dijafiltracijom.
[0025] U drugom aspektu, ovo obelodanjivanje pruža metodu za pripremu konjugata antitela ili konjugata fragmenta antitela, metoda koja se sastoji od koraka: a) dobijanja sastava koji se sastoji od mešovitog disulfida koji se sastoji od antitela ili fragmenta antitela sa kapiranim slobodnim cisteinom koji se sastoji od cisteaminske kape; b) dodavanja redukcionog agensa u sastav kako bi se formirala redukciona smeša i omogućila reakcija redukcije tako da redukciona smeša sadrži redukovano antitelo ili redukovani fragment antitela, pri čemu je redukcioni agens trifenilfosfin-3, 3', 3"-trisulfonat („TPPTS“); c) dodavanja oksidacionog agensa u redukcionu smešu kako bi se formirala oksidaciona smeša i omogućila reakcija oksidacije tako da se formira oksidaciona smeša koja se sastoji od oksidiranog antitela ili fragmenta antitela; i d) dodavanja aktiviranog hemijskog dela u oksidovanu smešu kako bi se formirala konjugaciona smeša i omogućila reakcija konjugacije tako da se formira konjugat antitela ili konjugat fragmenta antitela.
[0026] U jednom aspektu, nakon koraka a) i pre koraka b) vrši se korak razmene pufera kako bi se uklonio redukcioni agens. U jednom aspektu, nakon koraka c), vrši se korak prečišćavanja kako bi se uklonio aktivirani hemijski deo. U jednom otelotvorenju, korak razmene pufera je ultrafiltracija/dijafiltracija. U jednom otelotvorenju, korak prečišćavanja uključuje hidrofobnu interakcionu hromatografiju ultrafiltraciju/dijafiltraciju ili hidrofobnu interakcionu hromatografiju praćenu ultrafiltracijom/dijafiltracijom.
[0027] U jednom otelotvorenju, mešoviti disulfid je antitelo ili fragment antitela sa kapiranim slobodnim cisteinom. U metodi pronalaska, antitelo ili fragment antitela sa kapiranim slobodnim cisteinom sastoji se od kape, pri čemu je kapa cisteamin. U metodi pronalaska, redukcioni agens je trifenilfosfin-3,3 ',3"-trisulfonat („TPPTS“). U jednom otelotvorenju, odnos redukcionog agensa i antitela ili fragmenta antitela je 2 do 4:1 (mol/mol)). U jednom otelotvorenju, oksidacioni agens je dehidroaskorbinska kiselina („DHAA“). U jednom otelotvorenju, odnos oksidacionog agensa i antitela ili fragmenta antitela je 3 do 6:1 (mol/mol)). U jednom otelotvorenju, aktivirani hemijski deo je peptid koji se sastoji od halogena, pri čemu je halogen izabran iz grupe koja se sastoji od Br, I i Cl). U jednom otelotvorenju, odnos aktiviranog hemijskog dela i antitela ili fragmenta antitela je 2 do 3:1 (mol/mol).
[0028] U jednom otelotvorenju, antitelo ili fragment antitela obuhvata ostatak cisteina na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od D70 lakog lanca antitela u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO: 7; E276 teškog lanca antitela u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO: 8; i T363 teškog lanca antitela u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO: 8.
[0029] Mesto konjugacije koje je „podložno konjugaciji“ znači da će bočni lanac aminokiselinskog ostatka na izabranom mestu konjugacije reagovati sa dodatnim funkcionalnim delom od interesa (ili sa linkerom kovalentno vezanim za dodatni funkcionalni deo), pod definisanim hemijskim uslovima, što će rezultirati kovalentnim vezivanjem dodatnog funkcionalnog dela (direktno ili preko linkera) za bočni lanac kao glavni proizvod reakcije.
1
[0030] Disulfidi su kovalentna vezivanja dva atoma sumpora koja mogu biti prisutna u različitim (ili istim) molekulima. U proteinima, ostaci cisteina mogu biti povezani disulfidnom vezom koja se naziva i cistin.
[0031] Da bi bio efikasan cilj reakcije konjugacije, slobodni cistein mora biti u redukovanom obliku. Protein sa slobodnim cisteinom, iz istog razloga, može biti teško proizvesti, i stoga se često dobija kao mešoviti disulfid, uključujući mali organski deo. Mešoviti disulfidi su molekuli uključujući disulfid, sličan disulfidnoj vezi između dva cisteinska aminokiselinska ostatka, od kojih je svaki deo sekvence polipeptida (koji mogu biti isti ili različiti). Mala organska grupa u ovom kontekstu naziva se kapa (Cap), pa se mešoviti disulfid označava kao molekul protein-S-S-Cap. U ovoj primeni termin „mešani disulfidi“ se koristi za molekule koji obuhvataju disulfidnu vezu koja povezuje dva različita entiteta koji nisu oba polipeptida, iako molekuli mogu dodatno uključivati „obične“ disulfidne veze pored mešovitog disulfida.
[0032] U jednom otelotvorenju, metoda pronalaska uključuje korak redukcije molekula protein-S-S-Cap jer se protein koji je predmet konjugacije dobija u obliku sastava molekula protein-S-S-Cap.
[0033] Kao što je gore opisano, kapa se obično izvodi iz malog organskog dela, uključujući najmanje jedan atom sumpora koji je deo disulfidne veze mešovitog disulfida. Takvi organski delovi mogu postojati kao monomeri u redukovanom obliku ili kao dimeri u oksidovanom obliku. U mešovitom disulfidu, -S-Cap je stoga oksidovani oblik monomera ili pola dimera. -S-Cap je izveden iz cisteamina/cistamina (koji predstavlja dekarboksilovani oblik cistina), a mešoviti disulfid je stoga Protein-S-S-cyst, gde se cyst odnosi na polovinu cistamina. Kapa u molekulu protein-S-S-Cap potiče od cisteamina.
[0034] Kapa je
[0035] Kao što je gore opisano, cilj redukcije je dobijanje molekula sa slobodnim redukovanim cisteinom (-SH) koji je reaktivan u reakciji konjugacije.
[0036] U jednom otelotvorenju, mešoviti disulfid je molekul proteina-S-S-Cap pri čemu je protein-S izveden iz proteina koji se sastoji od slobodnog cisteina.
[0037] Da bi se dobio protein sa reaktivnim atomom sumpora, u mešoviti disulfidni sastav se dodaje redukcioni agens, a smeša se inkubira kako bi se omogućila redukcija da bi se dobio protein sa reaktivnim atomom sumpora, npr. redukovani protein formata: protein-S- H. Opisani koraci su a) dobijanje sastava mešovitog disulfida koji se sastoji od proteina, b) dodavanje redukcionog agensa u navedeni proteinski sastav, c) omogućavanje redukcije i dobijanje rastvora koji se sastoji od redukovanog proteina (P-SH).
[0038] U jednom otelotvorenju, redukcioni agens je trinatrijum-trifenilfosfin-3,3',3"-trisulfonat (TPPTS).
[0039] Kada se mešoviti disulfid redukuje, dobijen je rastvor koji se sastoji od redukovanog proteina (P-SH). Pre naknadne konjugacije može biti korisno ukloniti redukcioni agens i/ili oslobođeni molekul kape. U jednom otelotvorenju, može biti uključen opcioni korak uklanjanja malih molekula, kao što su molekuli sa molekulskom masom ispod 10 kDa iz rastvora koji se sastoji od redukovanog proteina (P-SH). U jednom otelotvorenju molekuli sa molekulskom masom ispod 10 kDa uklanjaju se iz rastvora koji se sastoji od redukovanog proteina dijafiltracijom.
[0040] U reakciji konjugacije, hemijski deo se kovalentno vezuje za atom sumpora slobodnog cisteina redukovanog proteina (protein-SH). Hemijski deo može biti bilo koji deo pogodan za konjugaciju sa proteinom, kao što je deo koji modifikuje svojstva. Deo koji modifikuje svojstva može biti hemijski deo koji može da promeni jednu od više karakteristika proteina od interesa. U jednom otelotvorenju, hemijski deo je grupa koja modifikuje svojstva, kao što je hemijski deo sposoban da stabilizuje protein, povećavajući poluvreme eliminacije cirkulacije ili povećavajući potenciju. U jednom otelotvorenju, hemijski deo je agens za produženje delovanja. Da bi se konjugacija efikasno odvijala, hemijski deo se može koristiti u aktiviranom obliku. U metodi u skladu sa pronalaskom kao što je gore opisano, aktivirani hemijski deo se dodaje rastvoru koji sadrži redukovani protein, pri čemu konjugacija hemijskog dela sa redukovanim proteinom rezultira pripremom konjugovanog proteina. Dakle, metoda prema pronalasku uključuje dalje korake: dodavanje aktiviranog hemijskog dela rastvoru koji sadrži redukovani protein, omogućavajući reakciju konjugacije i dobijanje preparata navedenog konjugovanog proteina.
[0041] Hemijski deo može biti bilo koji deo pogodan za konjugaciju sa proteinom, kao što je deo koji modifikuje svojstva. Deo koji modifikuje svojstva može biti hemijski deo koji može da promeni jednu od više karakteristika proteina od interesa. U jednom otelotvorenju, hemijski deo je peptid i/ili ligand sa ili bez sekvence linkera. U jednom otelotvorenju, hemijski deo je grupa koja modifikuje svojstva, kao što je hemijski deo sposoban da stabilizuje protein, povećavajući poluvreme eliminacije cirkulacije ili povećavajući potenciju. U jednom otelotvorenju, hemijski deo je vezivo albumina. Da bi se konjugacija efikasno odvijala, hemijski deo se može koristiti u aktiviranom obliku. U metodi u skladu sa pronalaskom kao što je gore opisano, aktivirani hemijski deo se kombinuje sa redukovanim proteinom, pri čemu konjugacija hemijskog dela sa redukovanim proteinom rezultira pripremom konjugovanog proteina preko atoma sumpora.
[0042] Hemijski deo je poželjno aktivirani hemijski deo, što znači deo koji je sposoban da reaguje sa proteinom-SH formirajući molekul protein-S-hemijski deo. Takvi aktivirani hemijski delovi mogu uključivati meke elektrofilne alkilacione reagense, uključujući maleimidne ili haloacetilne grupe, koje su poznate u struci.
[0043] U jednom otelotvorenju, aktivirani hemijski deo je halogenizovani hemijski deo, kao što je halogenizovani peptidni ligand. Halogenizovani hemijski deo može uključivati Br, I ili CI.
[0044] U jednom otelotvorenju, aktivirani hemijski deo je halogenizovano vezivo albumina (AB-halo).
[0045] Da bi se postigla efikasna redukcija mešovitog disulfida, obično se primenjuje višak redukcionog agensa u molarnim koncentracijama. Dodavanjem redukcionog agensa u sastav mešovitog disulfida dobija se redukciona smeša. Količina redukcionog agensa može biti izražena u ekvivalentima količine mešovitog disulfida, tako da, u slučaju kada je količina
1
redukcionog agensa 1 ekvivalent količine mešovitog disulfida, molarne koncentracije mešovitog disulfida i redukcionog agensa u smeši su jednake.
[0046] U jednom otelotvorenju, količina redukcionog agensa dodata sa oko 2 molarna ekvivalenta na oko 4 molarna ekvivalenta molarne količine mešovitog disulfida.
[0047] Da bi se redukovala količina prekomerne redukcije antitela ili fragmenta antitela, korisno je redukovati potrebnu količinu, što je, kao što je ovde opisano, moguće ako se optimizuju koraci procesa. Efikasna reakcija redukcije korišćenjem manjih količina redukcionog agensa zahteva da se preostali reakcioni uslovi pažljivo odaberu kao što je predviđeno ovim pronalaskom.
[0048] Redukcija mešovitog disulfida može, u zavisnosti od uslova, trajati nekoliko minuta ili sati. Kvalifikovana osoba zna da različiti uslovi rezultiraju različitom efikasnošću i stoga su vreme i uslovi potrebni za postizanje potpune ili gotovo potpune redukcije mešovitog disulfida detaljnije opisani u sledećim primerima.
[0049] Redukcioni agens se može dodati kao koncentrat ili jednostavno dodavanjem agensa kao čvrstog praha u mešoviti disulfidni sastav. Redukcioni agens se pomeša sa mešovitim disulfidnim sastavom da bi se inicirala redukcija. Smeša može biti nazvana redukciona smeša.
[0050] Da bi proces bio dovoljno efikasan, redukcija treba da dovede do redukcije od najmanje 80%, kao što je redukcija od najmanje 90% ukupne količine mešovitog disulfida. U takvim slučajevima redukcija se smatra zadovoljavajućom kada je količina mešovitog disulfida najviše 20%, kao što je najviše 10% količine mešovitog disulfida u redukcionoj smeši. U poželjnim otelotvorenjima može se dobiti redukcija od oko 95% mešovitog disulfida, ostavljajući oko 5% neredukovanog mešovitog disulfida u rastvoru koji se sastoji od redukovanog proteina. U daljem otelotvorenju, efikasan proces ostavlja najviše 2% mešovitog disulfida u odgovarajućem vremenskom periodu.
[0051] Do redukcije može doći tokom perioda od najmanje 15 minuta, kao što je najmanje 30 minuta ili kao što je najmanje 1 sat. U jednom otelotvorenju, redukciona smeša se ostavlja 2-10 sati, kao što je 3-6 sati ili oko 3-4 sata nakon dodavanja redukcionog agensa.
[0052] U jednom otelotvorenju, redukcija se vrši do 24 sata, kao što je do 12 sati, kao što je do 8 sati, kao što je do 6 sati, kao što je do 4 sata.
[0053] Redukcija se može u jednom otelotvorenju odvijati na 1 -50°C, kao što je na sobnoj temperaturi, kao što je na 18-25°C. U alternativnim otelotvorenjima, redukcija se može izvršiti na hladnijoj temperaturi, kao što je ispod 10 °C, kao što je oko 4-6 °C.
[0054] Pre nastavka koraka konjugacije, redukovani protein se može odvojiti od redukcione smeše, kao što je od viška redukcionog agensa i/ili malog organskog molekula mešovitog disulfida, npr. H-S-Cap proteina sa kapiranim slobodnim cisteinom. Ovaj opcioni korak može biti korak uklanjanja molekula sa niskom molekulskom masom, kao što su molekuli sa molekulskom masom ispod 10 kDa.
[0055] Kvalifikovana osoba zna za različite metode za uklanjanje jedinjenja male molekulske mase, kao što je filtracija pomoću odgovarajuće membrane. U jednom otelotvorenju, metoda se sastoji od koraka razmene pufera (ultrafiltracija/dijafiltracija).
[0056] Efikasnost koraka dijafiltracije, npr. količina malih molekula i ekscipijenasa koji se uklanjaju, povezana je sa generisanom zapreminom filtrata, u odnosu na zapreminu retentata. Takođe se napominje da reč „ukloniti“ u ovom kontekstu treba shvatiti kao „redukovanje koncentracije“ jer će rezidualne količine molekula i ekscipijenasa niske molekulske mase obično biti prisutne nakon koraka dijafiltracije (ili alternativnih koraka procesa) „uklanjanja“ molekula sa niskom molekulskom masom.
[0057] Pre nastavka koraka konjugacije, redukovani protein se oksidira kako bi se smanjila količina prekomerno redukovanog antitela ili fragmenta antitela.
[0058] Da bi se postigla efikasna oksidacija prekomerno redukovanog antitela ili fragmenta antitela, obično se primenjuje višak oksidacionog agensa u molarnim koncentracijama. Dodavanjem oksidacionog agensa u sastav prekomerno redukovanog antitela ili fragmenta antitela dobija se oksidovana smeša. Količina oksidacionog agensa može biti izražena u ekvivalentima količine prekomerno redukovanog antitela ili fragmenta antitela, tako da, u slučaju kada je količina oksidacionog agensa 1 ekvivalent količine mešovitog disulfida, molarne koncentracije mešovitog disulfida i redukcionog agensa u smeši su jednake.
1
[0059] U jednom otelotvorenju, količina oksidacionog agensa koji se dodaje je oko 3 molarna ekvivalenta do oko 6 molarnih ekvivalenata u odnosu na molarnu količinu prekomerno redukovanog antitela ili fragmenta antitela.
[0060] Oksidacija prekomerno redukovanog antitela ili fragmenta antitela može, u zavisnosti od uslova, trajati nekoliko minuta ili sati. Kvalifikovana osoba zna da različiti uslovi rezultiraju različitom efikasnošću i stoga su vreme i uslovi potrebni za dobijanje potpune ili gotovo potpune oksidacije prekomerno redukovanog antitela ili fragmenta antitela detaljnije opisani u primerima u nastavku.
[0061] Oksidacioni agens se može dodati kao koncentrat ili jednostavno dodavanjem agensa kao čvrstog praha prekomerno redukovanom sastavu antitela ili fragmenta antitela. Oksidacioni agens se pomeša sa prekomerno redukovanim sastavom antitela ili fragmenta antitela da bi se pokrenula oksidacija. Smeša može da se nazove oksidaciona smeša.
[0062] Da bi proces bio dovoljno efikasan, oksidacija treba da dovede do najmanje 80% oksidacije, kao što je najmanje 90% oksidacije ukupne količine prekomerno redukovanog antitela ili fragmenta antitela. U takvim slučajevima, oksidacija se smatra zadovoljavajućom kada je količina prekomerno redukovanog antitela ili fragmenta antitela najviše 20%, kao što je najviše 10% količine prekomerno redukovanog antitela ili fragmenta antitela u oksidacionoj smeši. U poželjnim otelotvorenjima može se dobiti oksidacija oko 95% prekomerno redukovanog antitela ili fragmenta antitela, ostavljajući oko 5% prekomerno redukovanog antitela ili fragmenta antitela u rastvoru koji se sastoji od oksidovanog proteina. U daljem otelotvorenju, efikasan proces ostavlja najviše 2% prekomerno redukovanog antitela ili fragmenta antitela u odgovarajućem vremenu.
[0063] Do oskidacije može doći tokom perioda od najmanje 15 minuta, kao što je najmanje 30 minuta ili kao što je najmanje 1 sat. U jednom otelotvorenju, oksidaciona smeša se ostavlja 2-10 sati, kao što je 3-6 sati ili oko 3-4 sata nakon dodavanja oksidacionog agensa.
[0064] U jednom otelotvorenju, oksidacija se vrši do 24 sata, kao što je do 12 sati, kao što je do 8 sati, kao što je do 6 sati ili kao što je do 4 sata.
1
[0065] Oksidacija se može u jednom otelotvorenju odvijati na 1 -50°C, kao na sobnoj temperaturi, kao na 18-25°C. U alternativnim otelotvorenjima, redukcija se može izvršiti na hladnijoj temperaturi, kao što je ispod 10 °C, kao što je oko 2-8 °C. U jednom otelotvorenju, oksidacioni agens je dehidroaskorbinska kiselina.
[0066] Kao što je gore opisano, konjugacija se vrši u skladu sa metodom koja se vrši dodavanjem aktiviranog hemijskog dela rastvoru koji se sastoji od redukovanog proteina.
[0067] Ako prethodna redukcija nije potpuna, odnos redukovanog proteina i mešovitog disulfida može sprečiti reakciju konjugacije visokog prinosa. Pored toga, prisustvo viška redukcionog agensa i oslobođenih molekula kape može ometati reakciju konjugacije.
[0068] Opet, relativni odnos reaktanata, npr. redukovanog proteina i aktiviranog hemijskog dela, utiče na efikasnost reakcije.
[0069] U jednom otelotvorenju, molarna koncentracija aktiviranog hemijskog dela je najmanje jednaka ili možda dvostruko veća od molarne koncentracije proteina koji se konjuguje. Ovo se takođe može izraziti u ekvivalentima, npr. može se koristiti najmanje 10, kao što je 8, kao što je 6, kao što je 4, kao što je 2 ili kao što je najmanje jedan (1) ekvivalent aktiviranog hemijskog dela u odnosu na protein koji će se konjugovati. Pošto aktivirani hemijski deo može biti skup resurs, korisno je smanjiti potrebnu količinu, što je, kao što je ovde opisano, moguće ako se optimizuju prethodni koraci. Efikasna reakcija konjugacije korišćenjem redukovanih količina aktiviranog hemijskog dela zahteva da se preostali reakcioni uslovi pažljivo izaberu kao što je predviđeno ovim pronalaskom. U jednom otelotvorenju, količina aktiviranog hemijskog dela je najviše 8 ekvivalenata proteina, kao što je najviše 6, kao što je najviše 4, kao što je najviše 3, kao što je najviše 2,5, kao što je najviše 2, kao što je najviše 1,5 ekvivalenata proteina koji se konjuguje.
[0070] Konjugacija oksidovanog proteina sa hemijskim delom može, u zavisnosti od uslova, trajati nekoliko minuta ili sati. Kvalifikovana osoba zna da različiti uslovi rezultiraju različitom efikasnošću i stoga će vreme potrebno za dobijanje potpune ili gotovo potpune konjugacije varirati u zavisnosti od uslova koji su detaljnije opisani u nastavku. Prema ovoj metodi, reakcija konjugacije se smatra zadovoljavajućom kada količina početnog materijala npr. redukovani protein dostigne 10%, kao što je 5% ili po mogućnosti 2% ili manje.
1
[0071] Aktivirani hemijski deo se može dodati kao koncentrat ili jednostavno dodavanjem agensa kao čvrstog praha rastvoru koji se sastoji od oksidovanog proteina. U jednom otelotvorenju, aktivirani hemijski deo se rastvara u odgovarajućem rastvoru pre dodavanja aktiviranog hemijskog dela rastvoru koji se sastoji od oksidovanog proteina. Takođe može biti da se hemijski deo aktivira u rastvoru pre reakcije konjugacije.
[0072] Termin „deo koji produžava poluvreme eliminacije“ odnosi se na farmaceutski prihvatljiv deo, domen ili „nosač“ kovalentno povezan ili konjugovan sa Fc domenom i/ili farmaceutski aktivnim delom, koji sprečava ili ublažava in vivo proteolitičku degradaciju ili drugu hemijsku modifikaciju koja umanjuje aktivnost farmaceutski aktivnog dela, povećava poluvreme eliminacije ili druga farmakokinetička svojstva kao što su, ali ne ograničavajući se na povećanje brzine apsorpcije, smanjuje toksičnost, poboljšanje rastvorljivosti, povećanje biološke aktivnosti i/ili ciljne selektivnosti farmaceutski aktivnog dela u odnosu na cilj od interesa, povećava mogućnost proizvodnje i/ili smanjuje imunogenost farmaceutski aktivnog dela (npr. peptidnog ili nepeptidnog dela), u poređenju sa nekonjugovanim oblikom farmaceutski aktivnog dela. Polietilen glikol (PEG) je primer korisnog dela koji produžava poluvreme eliminacije. Drugi primeri dela koji produžava poluvreme eliminacije, u skladu sa pronalaskom, uključuju kopolimer etilen-glikola, kopolimer propilen-glikola, karboksimetilcelulozu, polivinilpirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen-malein-anhidrida, poliamino-kiselinu (npr. polilizin), dekstran n-vinilpirolidon, poli nvinilpirolidon, homopolimer propilen-glikola, polimer propilen-oksida, polimer etilen-oksida, polioksi-etilovani poliol, polivinil-alkohol, linearan ili razgranat glikozilovani lanac, poliacetal, dugolančanu masnu kiselinu, dugolančanu hidrofobnu alifatičnu grupu, Fcdomen imunoglobulina (videti npr. Feige et al., Modified peptides as therapeutic agents, američki patent br.6,660,843), albumin (npr. humani serumski albumin; videti npr. Rosen et al., Albumin fusion proteins, američki patent br.6,926,898 i US 2005/0054051; Bridon et al., Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components, US 6,887,470), transtiretin (TTR; videti npr. Walker et al., Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins, US 2003/0195154 A1; 2003/0191056 A1) ili globulin koji vezuje tiroksin (TBG).
1
[0073] Ostala otelotvorenja korisnog dela koji produžava poluvreme eliminacije, u skladu sa pronalaskom, uključuju peptidne ligande ili male (nepeptidne organske) ligande molekula koji imaju afinitet vezivanja za proteine seruma dugog poluvremena eliminacije pod fiziološkim uslovima temperature, pH i jonske jačine. Primeri uključuju peptid koji se vezuje za albumin ili ligand malog molekula, peptid koji se vezuje za transtiretin ili ligand malog molekula, peptid koji se vezuje za globulin koji se vezuje za tiroksin ili ligand malog molekula, peptid koji se vezuje za antitela ili ligand malog molekula ili drugi peptid ili mali molekul koji ima afinitet za serumski protein dugog poluvremena eliminacije. (Videti npr. Blaney et al., Method and compositions for increasing the serum half-life of pharmacologically active agents by binding to transthyretin-selective ligands, američki patent br. 5,714,142; Sato et al., Serum albumin binding moieties, US 2003/0069395 A1; Jones et al., Pharmaceutical active conjugates, US Patent No.6,342,225). „Serumski protein dugog poluvremena eliminacije“ je jedan od stotina različitih proteina rastvorenih u krvnoj plazmi sisara, uključujući takozvane „noseće proteine“ (kao što su albumin, transferin i haptoglobin), fibrinogen i druge faktore zgrušavanja krvi, komponente komplementa, imunoglobuline, inhibitore enzima, prekursore supstanci kao što su angiotenzin i bradikinin i mnoge druge vrste proteina. Pronalazak obuhvata upotrebu bilo koje pojedinačne vrste farmaceutski prihvatljivog dela poluvremena eliminacije koji se produžava, kao što su, ali ne ograničavajući se na one opisane u ovom dokumentu, ili upotrebu kombinacije dva ili više različitih delova poluvremena eliminacije koji se produžavaju.
[0074] Metode rekombinantnog polipeptida i nukleinske kiseline koje se ovde koriste, uključujući primere, su generalno one navedene u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) or Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994).
[0075] Naslovi odeljaka koji se ovde koriste samo su u organizacione svrhe i ne treba ih tumačiti kao ograničavajuće za opisanu temu.
[0076] Ukoliko ovde nije drugačije definisano, naučni i tehnički termini koji se koriste u vezi sa ovom primenom imaju značenja koja obično razumeju stručnjaci u predmetnoj oblasti. Dalje, osim ako nije drugačije propisano kontekstom, pojmovi u jednini uključuju množinu, a pojmovi u množini uključuju jedninu.
1
[0077] Generalno, nomenklature koje se koriste u vezi sa ćelijskom i tkivnom kulturom, molekularnom biologijom, imunologijom, mikrobiologijom, genetikom i hemijom i hibridizacijom proteina i nukleinskih kiselina opisanim u ovom dokumentu su one koje su dobro poznate i uobičajeno korišćene u stručnoj praksi. Metode i tehnike ove primene se generalno izvode u skladu sa konvencionalnim metodama dobro poznatim u struci i kao što je opisano u različitim opštim i specifičnijim referencama koje se navode i razmatraju u celoj ovoj specifikaciji, osim ako nije drugačije naznačeno. Videti npr. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) i Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja izvode se u skladu sa specifikacijama proizvođača, kao što se obično ostvaruje u struci ili kao što je ovde opisano. Terminologija koja se koristi u vezi sa analitičkom hemijom, sintetičkom organskom hemijom i medicinskom i farmaceutskom hemijom koja je ovde opisana, kao i laboratorijske procedure i tehnike opisane u ovom dokumentu, dobro su poznate i uobičajeno korišćene u stručnoj praksi. Standardne tehnike se mogu koristiti za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutsku pripremu, formulaciju i isporuku i lečenje pacijenata.
[0078] Osim u operativnim primerima, ili gde je drugačije naznačeno, sve brojeve koji izražavaju količine sastojaka ili reakcione uslove koji se ovde koriste treba razumeti kao modifikovane u svim slučajevima izrazom „oko“. Termin „oko“ kada se koristi u vezi sa procentima može značiti ±1%.
[0079] U skladu sa konvencijom, kako se ovde koristi „jedan“ i „jedna“ znači „jedan ili više“, osim ako nije posebno naznačeno drugačije.
[0080] Kao što se ovde koristi, termini „aminokiselina“ i „ostatak“ su zamenljivi i, kada se koriste u kontekstu peptida ili polipeptida, odnose se i na prirodne i na sintetičke aminokiseline, kao i na analoge aminokiselina, mimetike aminokiselina i aminokiseline koje se ne pojavljuju prirodno, a koje su hemijski slične prirodnim aminokiselinama.
[0081] „Prirodno prisutna aminokiselina“ je aminokiselina koja je kodirana genetskim kodom, kao i one aminokiseline koje su kodirane genetskim kodom, ali su modifikovane nakon sinteze, npr. hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat i O-fosfoserin. Analog aminokiselina je jedinjenje koje
2
ima istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodna aminokiselina, tj. α ugljenik koji je vezan za vodonik, karboksilnu grupu, amino grupu i R grupu, npr. homoserin, norleucin, metionin sulfoksid, metionin metil sulfonijum. Takvi analozi mogu imati modifikovane R grupe (npr. norleucin) ili modifikovane peptidne okosnice, ali će zadržati istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodna aminokiselina.
[0082] „Mimetik aminokiseline“ je hemijsko jedinjenje koje ima strukturu koja se razlikuje od opšte hemijske strukture aminokiseline, ali funkcioniše na način sličan prirodnoj aminokiselini. Primeri uključuju metakriloil ili akriloil derivat amidnih, β-, γ-, δ-imino kiselina (kao što je piperidin-4-karboksilna kiselina) i slično.
[0083] „Neprirodno prisutna aminokiselina“ je jedinjenje koje ima osnovnu hemijsku strukturu sličnu prirodno prisutnoj aminokiselini, ali nije ugrađeno u rastući polipeptidni lanac tokom translacionog procesa. „Neprirodno prisutna aminokiselina“ takođe uključuje aminokiseline koje nastaju modifikacijom (npr. posttranslacionim modifikacijama) prirodno kodiranih aminokiselina (uključujući 20 standardnih aminokiselina), ali same po sebi nisu prirodno inkorporisane u polipeptidni lanac tokom translacije. Neograničavajuće liste primera neprirodno prisutnih aminokiselina, a koje se mogu ubaciti u polipeptidnu sekvencu ili supstituisati ostatkom divljeg tipa u polipeptidnoj sekvenci uključuju β-aminokiseline, homoamino kiseline, ciklične aminokiseline i aminokiseline sa derivatizovanim bočnim lancima. Primeri uključuju (u L- ili D-obliku; skraćeno u zagradama): citrulin (Cit), homocitrulin (hCit), Nα-metilcitrulin (NMeCit), Nα-metilhomocitrulin (Nα-MeHoCit), ornitin (Orn), Nα-metilornitin (Nα-MeOrn ili NMeOrn), sarkozin (Sar), homolizin (hLys ili hK), homoarginin (hArg ili hR), homoglutamin (hQ), Nα-metilarginin (NMeR), Nα-metilleucin (Nα-MeL ili NMeL), N-metilhomolizin (NMeHoK), Nα-metilglutamin (NMeQ), norleucin (Nle), norvalin (Nva), 1,2,3,4-tetrahidroizohinolin (Tic), oktahidroindol-2-karboksilna kiselina (Oic), 3-(1-naftil)alanin (1-Nal), 3-(2-naftil)alanin (2-Nal), 1,2,3,4-tetrahidroizohinolin (Tic), 2-indanilglicin (IgI), para-jodofenilalanin (pI-Phe), para-aminofenilalanin (4AmP ili 4-amino-Phe), 4-guanidino-fenilalanin (Guf), glicilizin (skraćeno „K(Nε-glicil)“ ili „K(glicil)“ ili „K(gly)“), nitrofenilalanin (nitroPhe), aminofenilalanin (aminoPhe ili Amino-Phe), benzilfenilalanin (benzilPhe), γ-karboksiglutaminska kiselina (γ-karboksiglu), hidroksiprolin (hidroksiPro), p-karboksifenilalanin (Cpa), α-aminoadipinska kiselina (Aad), Nα-metilvalin (NMeVal), Nα-metilleucin (NMeLeu), Nα-metilnorleucin (NMeNle), ciklopentilglicin (Cpg), cikloheksilglicin (Chg), acetilarginin (acetilArg), α, β-diaminopropionska kiselina (Dpr), α, γdiaminobutirična kiselina (Dab), diaminopropionska kiselina (Dap), cikloheksilalanin (Cha), 4-metilfenilalanin (MePhe), β, β-difenilalanin (BiPhA), aminobutirična kiselina (Abu), 4-fenilfenilalanin (ili bifenilalanin; 4Bip), α-aminoisobutirična kiselina (Aib), beta-alanin, betaaminopropionska kiselina, piperidinska kiselina, aminokapronska kiselina, aminoheptanska kiselina, aminopimelinska kiselina, dezmozin, diaminopimelinska kiselina, N-etilglicin, N-etilasparagin, hidroksilizin, alo-hidroksilizin, izodezmozin, alo-izoleucin, N-metilglicin, N-metilizoleucin, N-metilvalin, 4-hidroksiprolin (Hyp), γ-karboksiglutamat, ε-N,N,N-trimetillizin, ε-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, ω-metilarginin, 4-amino-O-ftalna kiselina (4APA), i druge slične aminokiseline, kao i derivatizovani oblici bilo koje od posebno navedenih.
[0084] Termin „izolovani molekul nukleinske kiseline“ odnosi se na jednolančani ili dvolančani polimer deoksiribonukleotida ili ribonukleotidnih baza očitanih sa 5' do 3' kraja, ili njegov analog, koji je odvojen od najmanje oko 50 procenata polipeptida, peptida, lipida, ugljenih hidrata, polinukleotida ili drugih materijala sa kojima se nukleinska kiselina prirodno nalazi kada je ukupna nukleinska kiselina izolovana iz izvornih ćelija. Poželjno je da izolovani molekul nukleinske kiseline u suštini ne sadrži bilo koje druge kontaminirajuće molekule nukleinske kiseline ili druge molekule koji se nalaze u prirodnom okruženju nukleinske kiseline koji bi ometali njenu upotrebu u proizvodnji polipeptida ili njenu terapijsku, dijagnostičku, profilaktičku ili istraživačku upotrebu.
[0085] Termin „izolovani polipeptid“ se odnosi na polipeptid koji je odvojen od najmanje oko 50 procenata polipeptida, peptida, lipida, ugljenih hidrata, polinukleotida ili drugih materijala sa kojima se polipeptid prirodno nalazi kada je izolovan iz izvorne ćelije. Poželjno je da izolovani polipeptid u suštini ne sadrži bilo koje druge kontaminirajuće polipeptide ili druge kontaminante koji se nalaze u njegovom prirodnom okruženju koji bi ometali njegovu terapijsku, dijagnostičku, profilaktičku ili istraživačku upotrebu.
[0086] Sastav prema ovom pronalasku, koji uključuje lek ili peptid povezan, pričvršćen ili vezan, bilo direktno ili indirektno putem veznog dela, za drugo antitelo ili fragment antitela je „konjugat“ ili „konjugovani“ molekul.
[0087] Termin „kodiranje“ se odnosi na polinukleotidnu sekvencu koja kodira jednu ili više aminokiselina. Termin ne zahteva početni ili završni kodon.
[0088] Termini „identičan“ i procentualni „identitet“, u kontekstu dve ili više nukleinskih kiselina ili polipeptidnih sekvenci, odnose se na dve ili više sekvenci ili perioda koji su isti. „Procentualni identitet“ označava procenat identičnih ostataka između aminokiselina ili nukleotida u upoređenim molekulima i izračunava se na osnovu veličine najmanjeg molekula koji se upoređuje. Za ove proračune, razmaci u poravnanju (ako postoje) mogu se obraditi određenim matematičkim modelom ili računarskim programom (tj. „algoritmom“). Metode koje se mogu koristiti za izračunavanje identiteta poravnatih nukleinskih kiselina ili polipeptida uključuju one opisane u Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), (1988) New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., (1987) Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; i Carillo et al., (1988) SIAM J. Applied Math.48:1073.
[0089] U izračunavanju procentualnog identiteta, sekvence koje se upoređuju poravnavaju se na način koji daje najveće podudaranje između sekvenci. Računarski program koji se koristi za određivanje procentualnog identiteta je programski paket GCG, koji uključuje GAP (Devereux et al., (1984) Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). Računarski algoritam GAP se koristi za poravnanje dva polipeptida ili polinukleotida za koje treba odrediti identitet procentualne sekvence. Sekvence su poravnate za optimalno podudaranje njihovih odgovarajućih aminokiselina ili nukleotida („usklađeni raspon“, kako je određeno algoritmom). Kazna za otvaranje razmaka (koja se izračunava kao 3 puta prosečna dijagonala, pri čemu je „prosečna dijagonala” prosečna vrednost dijagonale matrice poređenja koja se koristi; „dijagonala” predstavlja rezultat ili broj dodeljen svakom savršenom podudaranju aminokiselina u određenoj matrici poređenja) i kazna za produžavanje razmaka (koja obično iznosi 1/10 kazne za otvaranje razmaka), kao i matrica poređenja poput PAM 250 ili BLOSUM 62, koriste se u kombinaciji sa algoritmom. U određenim otelotvorenjima, standardna matrica za poređenje (videti Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 za PAM 250 matricu za poređenje; Henikoff et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 za BLOSUM 62 matricu za poređenje) takođe se koristi u okviru algoritma.
2
[0090] Preporučeni parametri za određivanje procentualnog identiteta polipeptida ili nukleotidnih sekvenci korišćenjem GAP programa su sledeći:
Algoritam: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol.48:443-453;
Matrica poređenja: BLOSUM 62 prema Henikoff et al., 1992, supra;
Kazna za razmak: 12 (ali bez kazne za razmake na krajevima)
Kazna za dužinu razmaka: 4
Prag sličnosti: 0
[0091] Određene šeme poravnanja za poravnanje dve sekvence aminokiselina mogu rezultirati podudaranjem samo kratke regije dve sekvence, a ova mala poravnata regija može imati veoma visok identitet sekvence iako ne postoji značajna veza između dve sekvence pune dužine. Shodno tome, izabrana metoda poravnanja (npr. program GAP) može se podesiti ako se to želi kako bi se postiglo poravnanje koje obuhvata najmanje 50 susednih aminokiselina ciljnog polipeptida.
[0092] „Protein koji vezuje antigen“ kako se ovde koristi označava bilo koji protein koji se specifično vezuje za određeni ciljni antigen. Termin obuhvata intaktna antitela koja obuhvataju najmanje dva teška lanca pune dužine i dva laka lanca pune dužine, kao i njihove derivate, varijante, fragmente i mutacije. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2i Fv fragmente. Protein koji vezuje antigen takođe uključuje domenska antitela kao što su nanotela i scFv kao što je opisano u daljem tekstu.
[0093] Generalno, kaže se da se protein koji vezuje antigen „specifično vezuje“ za svoj ciljni antigen kada protein koji vezuje antigen u suštini pokazuje pozadinsko vezivanje za neciljane molekule. Protein koji vezuje antigen koji se specifično vezuje za cilj može, međutim, unakrsno reagovati sa ciljnim antigenima različitih vrsta. Obično se protein koji vezuje antigen specifično vezuje za cilj kada je konstanta disocijacije (KD) ≤10<-7>M, mereno tehnikom rezonance površinskih plazmona (npr. BIACore, GE-Healthcare Uppsala, Švedska) ili testom kinetičke isključenosti (KinExA, Sapidyne, Boise, Idaho). Protein koji vezuje antigen specifično se vezuje za cilj sa „visokim afinitetom“ kada je KD ≤5× 10<-9>M, i sa „veoma visokim afinitetom“ kada je KD ≤5× 10<-10>M, kako je izmereno korišćenjem opisanih metoda.
[0094] „Regija vezivanja antigena“ označava protein ili deo proteina koji se specifično vezuje za određeni antigen. Na primer, onaj deo proteina koji vezuje antigen koji sadrži aminokiselinske ostatke koji stupaju u interakciju sa antigenom i daju proteinu koji vezuje antigen njegovu specifičnost i afinitet za antigen naziva se „regija vezivanja antigena“. Regija vezivanja antigena obično uključuje jednu ili više „komplementarnih regija vezivanja“ („CDR“) imunoglobulina, jednolančanog imunoglobulina ili kamelidnog antitela. Određene regije vezivanja antigena takođe uključuju jednu ili više „okvirnih“ regija. „CDR“ je sekvenca aminokiselina koja doprinosi specifičnosti i afinitetu vezivanja antigena. „Okvirne“ regije mogu pomoći u održavanju pravilne konformacije CDR kako bi se promovisalo vezivanje između regija koje vezuje antigen i antigena.
[0095] „Rekombinantni protein“ je protein proizveden primenom rekombinantnih tehnika, tj. ekspresijom rekombinantne nukleinske kiseline kako je ovde opisano. Metode i tehnike za proizvodnju rekombinantnih proteina su dobro poznate u struci.
[0096] Termin „antitelo“ odnosi se na intaktan imunoglobulin bilo kog izotipa ili na njegov fragment koji može konkurisati intaktnom antitelu u specifičnom vezivanju za ciljni antigen, i uključuje, na primer, himerna, humanizovana, potpuno humana i bispecifična antitela. „Antitelo“ kao takvo je vrsta proteina koji vezuje antigen. Intaktno antitelo će se generalno sastojati od najmanje dva teška lanca pune dužine i dva laka lanca pune dužine. Antitela mogu biti izvedena isključivo iz jednog izvora, ili mogu biti „himerna“, odnosno različiti delovi antitela mogu biti izvedeni iz dva različita antitela kao što je opisano u nastavku. Proteini, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu se proizvesti u hibridomima, tehnikama rekombinantne DNK ili enzimskim ili hemijskim cepanjem intaktnih antitela.
[0097] Termin „laki lanac“ kako se koristi u odnosu na antitelo ili njegove fragmente uključuje laki lanac pune dužine i njegove fragmente koji imaju dovoljnu sekvencu varijabilne regije da omoguće specifičnost vezivanja. Laki lanac pune dužine uključuje domen varijabilne regije, VL, i domen konstantne regije, CL. Domen varijabilne regije lakog lanca je na aminoterminusu polipeptida. Laki lanci uključuju kapa lance i lambda lance.
[0098] Termin „teški lanac“ kako se koristi u odnosu na antitelo ili njegove fragmente uključuje teški lanac pune dužine i njegove fragmente koji imaju dovoljnu sekvencu varijabilne regije da omoguće specifičnost vezivanja. Teški lanac pune dužine uključuje domen varijabilne regije, VH i tri domena konstantne regije, CH1, CH2 i CH3. VH domen je na amino-terminusu polipeptida, a CH domeni su na karboksil-terminusu, pri čemu je CH3 najbliži karboksi-
2
terminusu polipeptida. Teški lanci mogu pripadati bilo kom izotipu, uključujući IgG (uključujući podtipove IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4), IgA (uključujući podtipove IgA1 i IgA2), IgM i IgE.
[0099] Termin „imunološki funkcionalni fragment“ (ili jednostavno „fragment“) antitela ili imunoglobulinskog lanca (teškog ili lakog lanca), kako se ovde koristi, je protein koji vezuje antigen i koji se sastoji od dela (bez obzira na to kako se taj deo dobija ili sintetiše) antitela kojem nedostaje barem neka od aminokiselina prisutnih u lancu pune dužine, ali koji je sposoban da se specifično veže za antigen. Takvi fragmenti su biološki aktivni po tome što se specifično vezuju za ciljni antigen i mogu konkurisati drugim proteinima koji vezuju antigene, uključujući intaktna antitela, za specifično vezivanje za dati epitop.
[0100] Ovi biološki aktivni fragmenti mogu biti proizvedeni tehnikama rekombinantne DNK ili mogu biti proizvedeni enzimskim ili hemijskim cepanjem proteina koji vezuju antigen, uključujući intaktna antitela. Imunološki funkcionalni fragmenti imunoglobulina uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab'i F(ab')2fragmente.
[0101] U drugom otelotvorenju, Fvs, antitela domena i scFv, i mogu biti izvedeni iz antitela ovog pronalaska.
[0102] Dalje se razmatra da bi funkcionalni deo proteina koji vezuju antigen koji su ovde obelodanjeni, na primer, jedan ili više CDR, mogao biti kovalentno vezan za drugi protein ili za mali molekul kako bi se stvorio terapeutski agens usmeren na određenni cilj u telu, koji poseduje bifunkcionalna terapeutska svojstva ili ima produženo poluvreme eliminacije seruma.
[0103] „Fab fragment“ se sastoji od jednog lakog lanca i CH1 i varijabilnih regija jednog teškog lanca. Teški lanac Fab molekula ne može da formira disulfidnu vezu sa drugim molekulom teškog lanca.
[0104] Regija „Fc“ sadrži dva fragmenta teškog lanca koji se sastoje od domena CH2 i CH3 antitela. Dva fragmenta teškog lanca drže zajedno dve ili više disulfidnih veza i hidrofobne interakcije CH3 domena.
2
[0105] „Fab' fragment“ sadrži jedan laki lanac i deo jednog teškog lanca koji sadrži VH domen i CH1 domen, kao i regiju između CH1 i CH2 domena, tako da se može formirati međulančana disulfidna veza između dva teška lanca dva Fab' fragmenta da bi se formirao molekul F(ab')2.
[0106] Fragment „F(ab')2“ sadrži dva laka lanca i dva teška lanca koji sadrže deo konstantne regije između domena CH1 i CH2, tako da se između dva teška lanca formira međulančana disulfidna veza. F(ab')2 fragment se stoga sastoji od dva Fab' fragmenta koji se drže zajedno disulfidnom vezom između dva teška lanca.
[0107] „Fv regija“ obuhvata varijabilne regije i iz teških i iz lakih lanaca, ali joj nedostaju konstantne regije.
[0108] „Jednolančana antitela“ ili „scFv“ su Fv molekuli u kojima su varijabilne regije teškog i lakog lanca povezane fleksibilnim linkerom kako bi se formirao jedan polipeptidni lanac, koji formira regiju vezivanja antigena. scFv se detaljno razmatraju u publikaciji Međunarodne patentne prijave br. WO 88/01649, kao i u američkim patentima br.4,946,778 i br.5,260,203.
[0109] „Domensko antitelo“ ili „jednolančani imunoglobulin“ je imunološki funkcionalan fragment imunoglobulina koji sadrži samo varijabilnu regiju teškog lanca ili varijabilnu regiju lakog lanca. Primeri domenskih antitela uključuju Nanobodies<®>. U nekim slučajevima, dve ili više VH regija se kovalentno spajaju sa peptidnim linkerom da bi se stvorilo bivalentno antitelo domena. Dve VH regije bivalentnog domenskog antitela mogu ciljati iste ili različite antigene.
[0110] „Bivalentni protein koji vezuje antigen“ ili „bivalentno antitelo“ sastoji se od dve regije vezivanja antigena. U nekim slučajevima, dve regije vezivanja imaju iste specifičnosti antigena. Bivalentni proteini koji vezuju antigen i bivalentna antitela mogu biti bispecifični, videti, infra.
[0111] „Multispecifični protein koji vezuje antigen“ ili „multispecifično antitelo“ je ono koje cilja više od jednog antigena ili epitopa.
[0112] „Bispecifični“, „dvostruko specifični“ ili „bifunkcionalni“ protein ili antitelo za vezivanje antigena je hibridni protein ili antitelo za vezivanje antigena, respektivno, koje ima dva različita mesta vezivanja antigena. Bispecifični proteini koj vezuju antigen i antitela su
2
vrsta multispecifičnog proteina koji vezuje antigen ili multispecifičnog antitela i mogu se proizvesti različitim metodama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, fuziju hibrida ili povezivanje Fab' fragmenata. Videti npr. Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol.148:1547-1553. Dva mesta vezivanja bispecifičnog proteina koji vezuje antigen ili antitela će se vezati za dva različita epitopa, koji se mogu nalaziti na istim ili različitim proteinskim ciljevima.
[0113] Termin „konkurisati“ u kontekstu proteina koji vezuju antigen (npr. antitela) označava situaciju u kojoj se kompeticija između proteina koji vezuju antigen određuje testom u kojem ispitivani protein (npr. antitelo ili imunološki funkcionalan fragment istog) sprečava ili inhibira specifično vezivanje referentnog proteina koji vezuje antigen za zajednički antigen. Mogu se koristiti brojne vrste testova kompetitivnog vezivanja, na primer: radioimunološki test (RIA) sa čvrstom fazom, direktni ili indirektni, enzimski imunološki test (EIA) sa čvrstom fazom, direktni ili indirektni, kompetitivni test u sendvič formatu (videti npr. Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); EIA sa čvrstom fazom, direktni biotin-avidin (videti npr. Kirkland et al., 1986, J. Immunol.137:3614-3619) test sa čvrstom fazom, direktni sa oznakom, sendvič test sa čvrstom fazom, direktni sa oznakom (videti npr. Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA sa čvrstom fazom, direktni, uz korišćenje oznake I-125 (videti npr. Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); EIA sa čvrstom fazom, direktni biotin-avidin; (videti npr. Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); direktni RIA sa oznakom (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). Tipično, takav test uključuje upotrebu prečišćenog antigena vezanog za čvrstu površinu ili ćelija koje ga sadrže, neoznačenog test proteina koji vezuje antigen i označenog referentnog proteina koji vezuje antigen. Kompetitivna inhibicija se meri određivanjem količine oznake vezane za čvrstu površinu ili ćelije u prisustvu proteina koji vezuje test antigen. Obično je test protein koji veuje antigen prisutan u višku. Dodatni detalji u vezi sa metodama za određivanje kompetitivnog vezivanja dati su u primerima u ovom dokumentu. Obično, kada je konkurentski protein koji vezuje antigen prisutan u višku, on će inhibirati specifično vezivanje referentnog proteina koji vezuje antigen za zajednički antigen za najmanje 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ili 75%. U nekim slučajevima, vezivanje inhibira najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 97% ili više.
[0114] Termin „antigen“ se odnosi na molekul ili deo molekula koji se može vezati selektivnim vezivnim agensom, kao što je protein koji vezuje antigen (uključujući, npr. antitelo), i koji se dodatno može koristiti kod životinje za proizvodnju antitela koja se mogu vezati za taj antigen.
2
Antigen može posedovati jedan ili više epitopa koji su sposobni za interakciju sa različitim proteinima koji vezuju antigen, npr. antitela.
[0115] Termin „epitop“ je deo molekula koji je vezan proteinom koji vezuje antigen (na primer, antitelo). Termin uključuje bilo koju determinantu koja se može specifično vezati za protein koji vezuje antigen, kao što je antitelo. Epitop može biti susedni ili nesusedni (diskontinuirani) (npr. u polipeptidu, aminokiselinski ostaci koji nisu susedni jedni drugima u polipeptidnoj sekvenci, ali koji su u kontekstu molekula vezani proteinom koji vezuje antigen). Konformacioni epitop je epitop koji postoji u konformaciji aktivnog proteina, ali nije prisutan u denaturisanom proteinu. U određenim otelotvorenjima, epitopi mogu biti mimetični po tome što sadrže trodimenzionalnu strukturu koja je slična epitopu koji se koristi za generisanje proteina koji vezuje antigen, ali ne sadrže nijedan ili samo neke od aminokiselinskih ostataka pronađenih u tom epitopu koji se koristi za generisanje proteina koji vezuje antigen. Najčešće se epitopi nalaze na proteinima, ali u nekim slučajevima mogu se nalaziti i na drugim vrstama molekula, kao što su nukleinske kiseline. Determinante epitopa mogu uključivati hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil ili sulfonil grupe i mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Generalno, proteini koji vezuju antigen specifični za određeni ciljni antigen će preferencijalno prepoznati epitop na ciljnom antigenu u složenoj smeši proteina i/ili makromolekula.
[0116] Kao što se ovde koristi, „suštinski čista“ znači da je opisana vrsta molekula dominantna prisutna vrsta, odnosno da je na molarnoj osnovi zastupljenija od bilo koje druge pojedinačne vrste u istoj smeši. U određenim otelotvorenjima, suštinski čist molekul je sastav u kojem predmetna vrsta obuhvata najmanje 50% (na molarnoj osnovi) svih prisutnih makromolekularnih vrsta. U drugim otelotvorenjima, suštinski čist sastav će činiti najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% svih makromolekularnih vrsta prisutnih u sastavu. U drugim otelotvorenjima, predmetna vrsta se prečišćava do esencijalne homogenosti pri čemu se kontaminirajuće vrste ne mogu otkriti u sastavu konvencionalnim metodama detekcije i stoga se sastav sastoji od jedne detektabilne makromolekularne vrste.
[0117] Termin „polinukleotid“ ili „nukleinska kiselina“ uključuje i jednolančane i dvolančane nukleotidne polimere. Nukleotidi koji se sastoje od polinukleotida mogu biti ribonukleotidi ili deoksiribonukleotidi ili modifikovani oblik bilo kog tipa nukleotida. Modifikacije uključuju
2
modifikacije baze kao što su bromouridin i derivati inozina, modifikacije riboze kao što su 2',3' -dideoksiriboza i modifikacije internukleotidne veze kao što su fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselenoat, fosforodiselenoat, fosforanilotioat, fosforaniladat i fosforoamidat.
[0118] Termin „oligonukleotid“ označava polinukleotid koji se sastoji od 200 ili manje nukleotida. U nekim otelotvorenjima, oligonukleotidi su dužine 10 do 60 baza. U drugim otelotvorenjima, oligonukleotidi su dužine 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 do 40 nukleotida. Oligonukleotidi mogu biti jednolančani ili dvolančani, npr. za upotrebu u izgradnji mutiranog gena. Oligonukleotidi mogu biti sens ili antisens oligonukleotidi. Oligonukleotid može uključivati oznaku, uključujući radioaktivnu oznaku, fluorescentnu oznaku, hapten ili antigensku oznaku, za testove detekcije. Oligonukleotidi se mogu koristiti, na primer, kao PCR prajmeri, prajmeri za kloniranje ili sonde za hibridizaciju.
[0119] „Izolovani molekul nukleinske kiseline“ označava DNK ili RNK genomskog, iRNK, cDNK ili sintetičkog porekla ili neku njihovu kombinaciju koja nije povezana sa celim ili delom polinukleotida u kojem se izolovani polinukleotid nalazi u prirodi ili je povezan sa polinukleotidom sa kojim nije povezan u prirodi. Za potrebe ovog obelodanjivanja, treba shvatiti da „molekul nukleinske kiseline“ koji sadrži određenu nukleotidnu sekvencu ne obuhvata netaknute hromozome. Izolovani molekuli nukleinske kiseline „koji se sastoje“ od određenih sekvenci nukleinske kiseline mogu uključivati, pored navedenih sekvenci, sekvence kodiranja za do deset ili čak do dvadeset drugih proteina ili njihovih delova, ili mogu uključivati operativno povezane regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju regije kodiranja recitovanih sekvenci nukleinske kiseline, i/ili mogu uključivati vektorske sekvence.
[0120] Osim ako nije drugačije navedeno, levi kraj bilo koje jednolančane polinukleotidne sekvence navedene ovde predstavlja 5' kraj; levi smer dvolančanih polinukleotidnih sekvenci označava se kao 5' smer. Smer od 5' ka 3' u kojem se dodaju novonastali RNK transkripti naziva se smer transkripcije; sekvence na DNK lancu koje imaju istu sekvencu kao RNK transkript i nalaze se 5' od 5' kraja RNK transkripta nazivaju se „uzvodne sekvence“; sekvence na DNK lancu koje imaju istu sekvencu kao RNK transkript i nalaze se 3' od 3' kraja RNK transkripta nazivaju se „nizvodne sekvence“.
[0121] Termin „kontrolna sekvenca“ se odnosi na polinukleotidnu sekvencu koja može uticati na ekspresiju i obradu sekvenci kodiranja na koje je ligirana. Priroda takvih kontrolnih sekvenci može zavisiti od organizma domaćina. U određenim otelotvorenjima, kontrolne sekvence za prokariote mogu uključivati promotor, mesto vezivanja ribozoma i sekvencu završetka transkripcije. Na primer, kontrolne sekvence za eukariote mogu uključivati promotore koji se sastoje od jednog ili više mesta prepoznavanja za transkripcione faktore, sekvence pojačivača transkripcije i sekvence prekida transkripcije. „Kontrolne sekvence“ mogu uključivati sekvence lidera i/ili sekvence partnera za fuziju.
[0122] Termin „vektor“ označava bilo koji molekul ili entitet (npr. nukleinsku kiselinu, plazmid, bakteriofag ili virus) koji se koristi za prenos informacija o kodiranju proteina u ćeliju domaćina.
[0123] Termin „vektor ekspresije“ ili „konstrukt ekspresije“ odnosi se na vektor koji je pogodan za transformaciju ćelije domaćina i sadrži sekvence nukleinskih kiselina koje usmeravaju i/ili kontrolišu (u vezi sa ćelijom domaćinom) ekspresiju jedne ili više heterolognih regija kodiranja operativno povezanih sa njima. Konstrukt ekspresije može uključivati, ali nije ograničen na, sekvence koje utiču na ili kontrolišu transkripciju, translaciju i, ako su prisutni introni, utiču na spajanje RNK regije kodiranja koja je operativno povezana sa njim.
[0124] Kao što se ovde koristi, „operativno povezano“ znači da su komponente na koje se termin primenjuje u odnosu koji im omogućava da obavljaju svoje inherentne funkcije pod odgovarajućim uslovima. Na primer, kontrolna sekvenca u vektoru koja je „operativno povezana“ sa sekvencom kodiranja proteina je ligirana sa njom tako da se ekspresija sekvence kodiranja proteina postiže pod uslovima kompatibilnim sa transkripcionom aktivnošću kontrolnih sekvenci.
[0125] Termin „ćelija domaćin“ označava ćeliju koja je transformisana sekvencom nukleinske kiseline i time eksprimuje gen od interesa. Termin uključuje potomstvo roditeljske ćelije, bez obzira da li je potomstvo identično u morfologiji ili u genetskom sastavu sa originalnom roditeljskom ćelijom, sve dok je prisutan gen od interesa.
[0126] Termini „polipeptid“ ili „protein“ se ovde koriste naizmenično za polimer aminokiselinskih ostataka. Termini se takođe odnose na aminokiselinske polimere u kojima je jedan ili više aminokiselinskih ostataka analog ili mimetik odgovarajuće prirodne aminokiseline, kao i na prirodne aminokiselinske polimere. Termini takođe mogu obuhvatiti
1
polimere aminokiselina koji su modifikovani, npr. dodavanjem ostataka ugljenih hidrata za formiranje glikoproteina, ili fosforilacijom. Polipeptidi i proteini mogu biti proizvedeni prirodnom i nerekombinantnom ćelijom; ili ih proizvodi genetski projektovana ili rekombinantna ćelija, i obuhvataju molekule koji imaju aminokiselinsku sekvencu nativnog proteina, ili molekule koji imaju delecije, dodatke i/ili supstitucije jedne ili više aminokiselina nativne sekvence. Termini „polipeptid“ i „protein“ specifično obuhvataju proteine koji vezuju antigen, antitela ili sekvence koje imaju delecije, adicije i/ili supstitucije jedne ili više aminokiselina proteina koji vezuje antigen. Termin „polipeptidni fragment“ se odnosi na polipeptid koji ima amino-terminalnu deleciju, karboksil-terminalnu deleciju i/ili internu deleciju u poređenju sa proteinom pune dužine. Takvi fragmenti takođe mogu sadržati modifikovane aminokiseline u poređenju sa proteinima pune dužine. U određenim otelotvorenjima, fragmenti su dugi oko pet do 500 aminokiselina. Na primer, fragmenti mogu biti dugi najmanje 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ili 450 aminokiselina. Korisni fragmenti polipeptida uključuju imunološki funkcionalne fragmente antitela, uključujući domene vezivanja.
[0127] Termin „izolovani protein“ označava da je određeni protein: (1) oslobođen najmanje nekih drugih proteina sa kojima se normalno nalazi, (2) suštinski oslobođen drugih proteina iz istog izvora, npr. iz iste vrste, (3) eksprimiran ćelijom iz druge vrste, (4) odvojen od najmanje oko 50 procenata polinukleotida, lipida, ugljenih hidrata ili drugih materijala s kojima je u prirodi povezan, (5) funkcionalno povezan (putem kovalentne ili nekovalentne interakcije) sa polipeptidom s kojim nije povezan u prirodi, ili (6) da se ne javlja u prirodi. Tipično, „izolovani protein“ čini najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, ili najmanje oko 50% datog uzorka. Genomska DNK, cDNK, mRNK ili druga RNK, sintetičkog porekla, ili bilo koja njihova kombinacija može da kodira takav izolovani protein. Po mogućnosti, izolovani protein je u suštini bez proteina ili polipeptida ili drugih kontaminanata koji se nalaze u njegovom prirodnom okruženju koji bi ometali njegovu terapijsku, dijagnostičku, profilaktičku, istraživačku ili drugu upotrebu.
[0128] „Varijanta“ polipeptida (npr. proteina koji vezuje antigen, kao što je antitelo) obuhvata sekvencu aminokiselina u kojoj je jedan ili više ostataka aminokiselina ubačeno,izbrisano i/ili supstituisano u odnosu na drugu sekvencu polipeptida. Varijante uključuju fuzione proteine.
2
[0129] „Derivat“ polipeptida je polipeptid (npr. protein koji vezuje antigen, kao što je antitelo) koji je hemijski modifikovan na način koji se razlikuje od varijanti nastalih insercijom, delecijom ili supstitucijom, na primer, konjugacijom sa drugom hemijskom grupom.
[0130] Termin „prirodno prisutan“, koji se koristi u specifikaciji u vezi sa biološkim materijalima kao što su polipeptidi, nukleinske kiseline, ćelije domaćini i slično, odnosi se na materijale koji se nalaze u prirodi.
[0131] „Ispitanik“ ili „pacijent“ kakp se ovde koristi, može biti bilo koji sisar. U tipičnom otelotvorenju, ispitanik ili pacijent je čovek.
[0132] „Konzervativna supstitucija aminokiselina“ može uključivati supstituciju nativnog aminokiselinskog ostatka (tj. ostatka koji se nalazi u datoj poziciji polipeptidne sekvence divljeg tipa) sa ne-nativnim ostatkom (tj. ostatkom koji se ne nalazi u datoj poziciji polipeptidne sekvence divljeg tipa) tako da postoji mali ili nikakav uticaj na polaritet ili naboj aminokiselinskog ostatka na toj poziciji. Konzervativne supstitucije aminokiselina takođe obuhvataju aminokiselinske ostatke koji se ne javljaju prirodno i koji se obično inkorporiraju hemijskom sintezom peptida, a ne sintezom u biološkim sistemima. To uključuje peptidomimetike i druge obrnute ili obrnute oblike aminokiselinskih delova.
[0133] Prirodno prisutni ostaci mogu se podeliti u klase na osnovu zajedničkih svojstava bočnih lanaca:
(1) hidrofobni: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutralni hidrofilni: Cys, Ser, Thr;
(3) kiseli: Asp, Glu;
(4) bazni: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro; i
(6) aromatični: Trp, Tyr, Phe.
[0134] Dodatne grupe aminokiselina se takođe mogu formulisati korišćenjem principa opisanih u npr. Creighton (1984) PROTEINS: STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES (2d Ed. 1993), W.H. Freeman and Company. U nekim slučajevima može biti korisno dodatno okarakterisati supstitucije zasnovane na dve ili više takvih karakteristika (npr.
supstitucija sa „malim polarnim“ ostatkom, kao što je THR ostatak, može predstavljati visoko konzervativnu supstituciju u odgovarajućem kontekstu).
[0135] Konzervativne supstitucije mogu uključivati supstituciju člana jedne od ovih klasa za drugog člana iste klase. Nekonzervativne supstitucije mogu uključivati supstituciju člana jedne od ovih klasa za člana iz druge klase.
[0136] Sintetički, retki ili modifikovani aminokiselinski ostaci sa poznatim fiziohemijskim svojstvima sličnim onima iz gore opisane grupe mogu se koristiti kao „konzervativna“ supstitucija za određeni aminokiselinski ostatak u sekvenci. Na primer, D-Arg ostatak može poslužiti kao supstitucija za tipičan L-Arg ostatak. Takođe može biti slučaj da se određena supstitucija može opisati u smislu dve ili više gore opisanih klasa (npr. supstitucija sa malim i hidrofobnim ostatkom znači supstituciju jedne aminokiseline ostatkom koji se nalazi u obe gore opisane klase ili drugim sintetičkim, retkim ili modifikovanim ostacima za koje se u struci zna da imaju slična fiziohemijska svojstva takvim ostacima koji ispunjavaju obe definicije).
[0137] „Vektor“ se odnosi na vehikulum za dostavu koji: (a) omogućava ekspresiju nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid; (b) omogućava proizvodnju polipeptida iz te sekvence; (c) omogućava transfekciju/transformaciju ciljnih ćelija pomoću te sekvence; (d) omogućava replikaciju nukleotidne sekvence; (e) povećava stabilnost nukleotidne sekvence; (f) omogućava detekciju nukleotidne sekvence i/ili transformisanih/transfektovanih ćelija; i/ili (g) na drugi način obezbeđuje povoljne biološke i/ili fizičkohemijske funkcije nukleotidnoj sekvenci koja kodira polipeptid. Vektor može biti bilo koji pogodan vektor, uključujući hromozomske, nehromozomske i sintetičke vektore nukleinske kiseline (sekvenca nukleinske kiseline koja se sastoji od odgovarajućeg skupa elemenata za kontrolu ekspresije). Primeri takvih vektora uključuju derivate SV40, bakterijske plazmide, fagovsku DNK, bakulovirus, plazmide kvasca, vektore izvedene iz kombinacija plazmida i fagovske DNK i vektore virusne nukleinske kiseline (RNK ili DNK)
[0138] Rekombinantni vektor ekspresije može biti dizajniran za ekspresiju proteina u prokariotskim (npr. E. coli) ili eukariotskim ćelijama (npr. ćelije insekata, koristeći vektore ekspresije bakulovirusa, ćelije kvasca ili ćelije sisara). U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin je ćelija sisara koja nije ljudskog porekla. Reprezentativne ćelije domaćini uključuju one
4
domaćine koji se obično koriste za kloniranje i ekspresiju, uključujući sojeve Escherichia coli TOP10F', TOP10, DH10B, DH5a, HB101, W3110, BL21(DE3) i BL21 (DE3) pLysS, BLUESCRIPT (Stratagene), ćelijske linije sisara CHO, CHO-K1, HEK293, 293-EBNA PIN vektore (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem.264: 5503-5509 (1989); pET vektore (Novagen, Madison Wis.). Alternativno, rekombinantni vektor ekspresije se može transkribovati i prevesti in vitro, na primer korišćenjem regulatornih sekvenci T7 promotora i T7 polimeraze i in vitro translacionog sistema. Po mogućnosti, vektor sadrži promotor uzvodno od mesta kloniranja koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid. Primeri promotora koji se mogu uključiti i isključiti uključuju lak promotor, T7 promotor, trc promotor, tac promotor i trp promotor.
[0139] U različitim otelotvorenjima, vektori se sastoje od operativno povezane nukleotidne sekvence koja reguliše ekspresiju ciljnog polipeptida. Vektor se može sastojati ili biti povezan sa bilo kojim odgovarajućim promotorom, pojačivačem i drugim elementima koji olakšavaju ekspresiju. Primeri takvih elemenata uključuju snažne promotore ekspresije (npr. ljudski CMV IE promotor/pojačivač, RSV promotor, SV40 promotor, SL3-3 promotor, MMTV promotor ili HIV LTR promotor, EF1alpha promotor, CAG promotor), efikasne poli (A) završne sekvence, poreklo replikacije plazmidnog proizvoda u E. coli, gen za otpornost na antibiotike kao selektivni marker i/ili pogodno mesto kloniranja (npr. polilinker). Vektori takođe mogu da obuhvataju inducibilni promotor za razliku od konstitutivnog promotora kao što je CMV IE. U jednom aspektu, obezbeđena je nukleinska kiselina koja se sastoji od sekvence koja kodira ciljni polipeptid koji je operativno povezan sa promotorom specifičnim za tkivo koji promoviše ekspresiju sekvence u metabolički relevantnom tkivu, kao što je tkivo jetre ili pankreasa.
[0140] U drugom aspektu ovog obelodanjivanja, obezbeđene su ćelije domaćini koje se sastoje od nukleinskih kiselina i vektora koji su ovde obelodanjeni. U različitim otelotvorenjima, vektor ili nukleinska kiselina je integrisana u genom ćelije domaćina, koji je u drugim otelotvorenjima vektor ili nukleinska kiselina ekstra-hromozomska.
[0141] Obezbeđene su rekombinantne ćelije, kao što su kvasac, bakterijske (npr. E. coli) i ćelije sisara (npr. imortalizovane ćelije sisara) koje sadrže takvu nukleinsku kiselinu, vektor ili kombinacije jednog ili oba. U različitim otelotvorenjima obezbeđene su ćelije koje se sastoje od neintegrisane nukleinske kiseline, kao što su plazmidni, kosmidni, fagemidni ili linearni ekspresijski element, koji se sastoji od sekvence koja kodira za ekspresiju ciljnog polipeptida.
[0142] Vektor koji se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira ciljni polipeptid predviđen ovim dokumentom može se uvesti u ćeliju domaćina transformacijom ili transfekcijom. Metode transformacije ćelije sa vektorom ekspresije su dobro poznate.
[0143] Nukleinska kiselina koja kodira metu može se pozicionirati i/ili dostaviti u ćeliju domaćina ili životinju domaćina putem virusnog vektora. U ovom svojstvu može se koristiti bilo koji odgovarajući virusni vektor. Virusni vektor može da sadrži bilo koji broj virusnih polinukleotida, sam ili u kombinaciji sa jednim ili više virusnih proteina, koji olakšavaju isporuku, replikaciju i/ili ekspresiju nukleinske kiseline pronalaska u željenoj ćeliji domaćinu. Virusni vektor može biti polinukleotid koji se sastoji od celog ili dela virusnog genoma, konjugata virusnog proteina/nukleinske kiseline, čestice slične virusu (VlP) ili netaknute virusne čestice koja se sastoji od virusnih nukleinskih kiselina i nukleinske kiseline koja kodira polipeptid. Virusni vektor virusnih čestica može se sastojati od divljeg tipa virusne čestice ili modifikovane virusne čestice. Virusni vektor može biti vektor koji zahteva prisustvo drugog vektora ili virusa divljeg tipa za replikaciju i/ili ekspresiju (npr. virusni vektor može biti virus zavisan od pomagača), kao što je adenovirusni vektorski amplikon. Tipično, takvi virusni vektori se sastoje od virusne čestice divljeg tipa ili virusne čestice modifikovane u svom sadržaju proteina i/ili nukleinske kiseline radi povećanja transgenskog kapaciteta ili pomoći u transfekciji i/ili ekspresiji nukleinske kiseline (primeri takvih vektora uključuju amplikone herpes virusa/AAV). Tipično, virusni vektor je sličan i/ili izveden iz virusa koji obično inficira ljude. Pogodne virusne vektorske čestice u tom pogledu uključuju, na primer, adenovirusne vektorske čestice (uključujući bilo koji virus ili dobijen od virusa adenoviridae), adenopovezane virusne vektorske čestice (AAV vektorske čestice) ili druge parvoviruse i parvovirusne vektorske čestice, papilomavirusne vektorske čestice, flaviralne vektore, alfavirusne vektore, herpes virusne vektore, vektore virusa boginja, retrovirusne vektore, uključujući lentivirusne vektore.
[0144] Ciljni polipeptid eksprimovan kao što je ovde opisano može se izolovati korišćenjem standardnih metoda prečišćavanja proteina. Ciljni polipeptid se može izolovati iz ćelije u kojoj je prirodno eksprimovan ili se može izolovati iz ćelije koja je projektovana da eksprimuje ciljni polipeptid, na primer ćelija koja prirodno ne eksprimira ciljni polipeptid.
[0145] Metode prečišćavanja proteina koje se mogu koristiti za izolaciju ciljnog polipeptida, kao i povezani materijali i reagensi, poznati su u struci. Dodatne metode prečišćavanja koje mogu biti korisne za izolaciju ciljnog polipeptida mogu se naći u referencama kao što su Bootcov MR, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11514-9, Fairlie WD, 2000, Gene 254: 67-76.
[0146] Proteini koji vezuju antigen koji su obezbeđeni su polipeptidi u koje su ugrađene i/ili povezane jedna ili više regija koje određuju komplementarnost (CDR), kako je opisano u ovom dokumentu. Kod nekih proteina koji vezuju antigen, CDR su ugrađeni u „okvirnu“ regiju, koja usmerava CDR tako da se postignu odgovarajuća svojstva vezanja antigena CDR. Određeni ovde opisani proteini koji vezuju antigen su antitela ili su izvedeni iz antitela. U drugim proteinima koji vezuju antigen, CDR sekvence su ugrađene u drugi tip proteinske skele.
[0147] Generalno, obezbeđeni proteini koji vezuju antigen obično obuhvataju jedan ili više CDR kao što je ovde opisano (npr.1, 2, 3, 4, 5 ili 6). U nekim slučajevima, protein koji vezuje antigen obuhvata (a) polipeptidnu strukturu i (b) jedan ili više CDR koji se ubacuju u polipeptidnu strukturu i/ili spajaju sa njom. Polipeptidna struktura može imati različite oblike. Na primer, može biti, ili obuhvatiti, okvir prirodno prisutnog antitela, ili njegovog fragmenta ili varijante, ili može biti potpuno sintetičke prirode. Primeri različitih polipeptidnih struktura su dalje opisani u nastavku.
[0148] U određenim otelotvorenjima, polipeptidna struktura proteina koji vezuju antigen je antitelo ili je izvedena iz antitela. Shodno tome, primeri određenih proteina koji vezuju antigen koji su obezbeđeni uključuju, ali nisu ograničeni na, monoklonska antitela, bispecifična antitela, minitela, domenska antitela kao što su Nanobodies<®>, sintetička antitela (koja se ovde ponekad nazivaju „mimetici antitela“), himerna antitela, humanizovana antitela, ljudska antitela, fuzije antitela i delovi ili fragmenti svakog od njih, respektivno. U nekim slučajevima, protein koji vezuje antigen je imunološki fragment kompletnog antitela (npr. Fab, Fab', F(ab')2). U drugim slučajevima, protein koji vezuje antigen je scFv koji koristi CDR iz antitela ovog pronalaska.
[0149] U drugom aspektu, protein koji vezuje antigen ima poluvreme eliminacije od najmanje jednog dana in vitro ili in vivo (npr. kada se daje ljudskom ispitaniku). U jednom otelotvorenju, protein koji vezuje antigen ima poluvreme eliminacije od najmanje tri dana. U različitim drugim otelotvorenjima, protein koji vezuje antigen ima poluvreme eliminacije od 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ili 60 dana ili više. U drugom otelotvorenju, protein koji vezuje antigen je derivatizovan ili modifikovan tako da ima duže poluvreme eliminacije u poređenju sa nederivatizovanim ili nemodifikovanim antitelima. U drugom otelotvorenju, protein koji vezuje antigen sadrži tačkaste mutacije za povećanje poluvremena eliminacije seruma. Dalji detalji u vezi sa takvim mutantskim i derivatizovanim oblicima dati su u nastavku.
[0150] Neki od proteina koji vezuju antigen koji su obezbeđeni imaju strukturu koja je tipično povezana sa prirodno prisutnim antitelima. Strukturne jedinice ovih antitela obično se sastoje od jednog ili više tetramera, od kojih se svaki sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, iako neke vrste sisara takođe proizvode antitela koja imaju samo jedan teški lanac. Kod tipičnog antitela, svaki par ili parna jedinica uključuje jedan „laki“ lanac pune dužine (u određenim otelotvorenjima, oko 25 kDa) i jedan „teški“ lanac pune dužine (u određenim otelotvorenjima, oko 50-70 kDa). Svaki pojedinačni lanac imunoglobulina sastoji se od nekoliko „domena imunoglobulina“, od kojih se svaki sastoji od otprilike 90 do 110 aminokiselina i izražava karakterističan obrazac savijanja. Ovi domeni su osnovne jedinice od kojih se sastoje polipeptidi antitela. Amino-terminalni deo svakog lanca obično uključuje varijabilni domen koji je odgovoran za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo je evolucijski konzerviraniji od drugog kraja lanca i naziva se „konstantna regija“ ili „C regija“. Ljudski laki lanci se generalno klasifikuju kao kapa i lambda laki lanci, a svaki od njih sadrži jedan varijabilni domen i jedan konstantni domen. Teški lanci se obično klasifikuju kao mu, delta, gama, alfa ili epsilon lanci, a oni definišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA i IgE, respektivno. IgG ima nekoliko podtipova, uključujući, ali ne ograničavajući se na, IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. IgM podtipovi uključuju IgM i IgM2. IgA podtipovi uključuju IgA1 i IgA2. Kod ljudi, IgA i IgD izotipovi sadrže četiri teška lanca i četiri laka lanca; IgG i IgE izotipovi sadrže dva teška lanca i dva laka lanca; a IgM izotip sadrži pet teških lanaca i pet lakih lanaca. C regija teškog lanca obično obuhvata jedan ili više domena koji mogu biti odgovorni za efektorsku funkciju. Broj domena konstantne regije teškog lanca zavisiće od izotipa. IgG teški lanci, na primer, svaki sadrži tri domena C regije poznata kao CH1, CH2 i CH3. Obezbeđena antitela mogu imati bilo koji od ovih izotipova i podtipova. U određenim otelotvorenjima, antitelo je podtipa IgG1, IgG2 ili IgG4.
[0151] U lakim i teškim lancima pune dužine, varijabilnim i konstantnim regijama pridružuje se regija „J“ od oko dvanaest ili više aminokiselina, pri čemu teški lanac takođe uključuje regiju „D“ od oko deset aminokiselina više. Videti npr. Fundamental Immunology, 2nd ed., Ch. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press. Varijabilne regije svakog para lakih/teških lanaca obično formiraju mesto vezivanja antigena.
[0152] Za ovde navedena antitela, varijabilne regije imunoglobulinskih lanaca generalno pokazuju istu ukupnu strukturu, koja se sastoji od relativno konzerviranih okvirnih regija (FR) spojenih sa tri hipervarijabilne regija, koje se češće nazivaju „regije koje određuju komplementarnost“ ili CDR. CDR iz dva lanca svakog gore pomenutog para teških lanaca/lakih lanaca obično se poravnavaju okvirnim regijama kako bi se formirala struktura koja se specifično vezuje za određeni epitop na antigenu. Od N-terminala do C-terminala, prirodno prisutne varijabilne regije lakog i teškog lanca su obično u skladu sa sledećim redosledom ovih elemenata: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Osmišljen je sistem numerisanja za dodeljivanje brojeva aminokiselinama koje zauzimaju pozicije u svakom od ovih domena. Ovaj sistem numeracije je definisan u Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 and 1991, NIH, Bethesda, Md.), ili Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol.196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883.
[0153] Ovaj pronalazak se odnosi na sastav koji se sastoji od proteina koji vezuje antigen i ima najmanje jedno unutrašnje mesto konjugacije. Mesto konjugacije mora biti podložno konjugaciji dodatnog funkcionalnog dela (npr. leka, liganda ili peptida) definisanom hemijom konjugacije kroz bočni lanac aminokiselinskog ostatka na mestu konjugacije. Postizanje visokoselektivne, lokacijski specifične konjugacije na protein koji vezuje antigen, u skladu sa ovim pronalaskom, zahteva razmatranje različitih kriterijuma dizajna. Prvo, poželjna hemija konjugacije ili spajanja mora biti definisana ili unapred određena. Funkcionalni delovi se mogu konjugovati ili spojiti sa izabranim mestom konjugacije proteina koji vezuje antigen putem asortimana različitih konjugacionih hemikalija poznatih u struci. Na primer, konjugacioni partner aktiviran maleimidom koji cilja pristupačan cistein tiol na proteinu za vezivanje antigena je jedno otelotvorenje, ali se mogu koristiti brojne hemikalije za konjugaciju ili spajanje koje ciljaju bočne lance bilo kanonskih ili nekanonskih, npr. neprirodne aminokiseline u sekvenci proteina za vezivanje antigena, u skladu sa ovim pronalaskom.
[0154] Hemije za hemoselektivnu konjugaciju uključuju: bakrov(I)-katalizovane azid-alkin [3+2] dipolarske cikloaddicije, Staudinger ligaciju, druge procese acil transfera (S→N; X→N), oksimacije, formiranje hidrazonskih veza i druge odgovarajuće reakcije organske hemije kao što su ukrštanja koristeći paladijumske katalizatore rastvorljive u vodi. (Npr. Bong et al., Chemoselective Pd(0)-catalyzed peptide coupling in water, Organic Letters 3(16):2509-11 (2001); Dibowski et al., Bioconjugation of peptides by palladium-catalyzed C-C crosscoupling in water, Angew. Chem. Int. Ed. 37(4):476-78 (1998); DeVasher et al., Aqueousphase, palladium-catalyzed cross-coupling of aryl bromides under mild conditions, using water-soluble, sterically demanding alkylphosphines, J. Org. Chem. 69:7919-27 (2004); Shaugnessy et al., J.Org. Chem, 2003, 68, 6767-6774; Prescher, JA and Bertozzi CR, Chemistry in living system, Nature Chemical Biology 1(1); 13-21 (2005)).
[0155] Kao što je gore pomenuto, konjugacija (ili kovalentno vezivanje) za protein koji vezuje antigen odvija se kroz bočni lanac aminokiselinskog ostatka na mestu konjugacije, na primer, ali ne ograničavajući se na cisteinilni ostatak. Aminokiselinski ostatak, na primer, cisteinil ostatak, na internom mestu konjugacije koji je izabran može biti onaj koji zauzima istu poziciju aminokiselinskog ostatka u sekvenci nativnog Fc domena, ili se aminokiselinski ostatak može projektovati u sekvencu Fc domena supstitucijom ili insercijom.
[0156] Izbor mesta konjugacije u ukupnom proteinu koji vezuje antigen je još jedan važan aspekt izbora mesta interne konjugacije u skladu sa ovim pronalaskom. Bilo koji od izloženih aminokiselinskih ostataka na proteinu koji vezuje antigen može biti potencijalno korisno mesto konjugacije i može biti mutiran u cistein ili neku drugu reaktivnu aminokiselinu za selektivno spajanje mesta, ako već nije prisutan na izabranom mestu konjugacije sekvence proteina koji vezuje antigen. Međutim, ovaj pristup ne uzima u obzir potencijalna sterička ograničenja koja mogu poremetiti aktivnost konjugovanog partnera ili ograničiti reaktivnost modifikovane mutacije.
[0157] U jednom otelotvorenju, protein koji vezuje antigen je antitelo ili njegov funkcionalni fragment. U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov funkcionalni fragment se sastoji od cisteinske ili nekanonske aminokiselinske supstitucije na jednom ili više mesta konjugacije izabranih iz grupe koja se sastoji od D70 lakog lanca antitela u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO: 7; E276 teškog lanca antitela u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO: 8; i T363 teškog lanca antitela u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO: 8. Radi jasnoće, „D70 lakog lanca antitela u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO: 7“ je isto mesto supstitucije kao AHo pozicija D88 lakog lanca antitela 5G12.006 i Kabat pozicija D70 lakog lanca antitela 5G12.006; „E276 teškog lanca antitela u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO:
4
[0158] 8“ je isto mesto supstitucije kao AHo pozicija E384 teškog lanca antitela 5G12.006 i Kabat pozicija E285 teškog lanca antitela 5G12.006; i „T363 teškog lanca antitela u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO: 8“ je isto mesto supstitucije kao AHo pozicija T487 teškog lanca antitela 5G12.006 i Kabat pozicija T382 teškog lanca antitela 5G12.006.
�
�
[0159] Regije koje određuju komplementarnost (CDR) i okvirne regije (FR) datog antitela mogu se identifikovati korišćenjem sistema koji su opisali Kabat et al. u Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no.91-3242, 1991. Određena antitela koja su ovde obelodanjena obuhvataju jednu ili više sekvenci aminokiselina koje su identične ili imaju značajan identitet sekvence aminokiselina jedne ili više CDR predstavljenih u TABELAMA 4A i 4B. Ovi CDR koriste sistem koji su opisali Kabat et al. kao što je gore navedeno.
[0160] Opisana je struktura i svojstva CDR u okviru prirodno prisutnog antitela, supra. Ukratko, u tradicionalnom antitelima, CDR su ugrađeni u okvir u varijabilnoj regiji teškog i lakog lanca gde čine regije odgovorne za vezivanje i prepoznavanje antigena. Varijabilna regija se sastoji od najmanje tri CDR teškog ili lakog lanca, videti supra (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD; see also Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol.196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883), u okviru okvirne regije (određene okvirne regije 1-4, FR1, FR2, FR3 i FR4, Kabat et al., 1991, supra; videti takođe Chothia i Lesk, 1987, supra). Međutim, CDR navedeni u ovom dokumentu ne samo da se mogu koristiti za definisanje domena vezivanja antigena tradicionalne strukture antitela, već mogu biti ugrađeni u različite druge polipeptidne strukture, kao što je ovde opisano.
4
[0161] Proteini koji vezuju antigen koji su obezbeđeni uključuju monoklonska antitela. Monoklonska antitela se mogu proizvesti korišćenjem bilo koje tehnike poznate u struci, imortalizovanjem ćelija slezine sakupljenih od transgene životinje nakon završetka rasporeda imunizacije. Ćelije slezine mogu se imortalizovati korišćenjem bilo koje tehnike poznate u struci, npr. fuzijom sa ćelijama mijeloma za proizvodnju hibrida. Ćelije mijeloma za upotrebu u postupcima fuzije koji proizvode hibridome po mogućnosti ne proizvode antitela, imaju visoku efikasnost fuzije i nedostatke enzima koji ih čine nesposobnim za rast u određenim selektivnim medijima koji podržavaju rast samo željenih fuzionisanih ćelija (hibridomi). Primeri odgovarajućih ćelijskih linija za upotrebu u fuzijama sa miševima uključuju Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 41, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 i S194/5XXO Bul; primeri ćelijskih linija koje se koriste u fuzijama sa pacovima uključuju R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F i 4B210. Ostale ćelijske linije korisne za ćelijske fuzije su U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 i UC729-6.
[0162] U nekim slučajevima, ćelijska linija hibridoma se proizvodi imunizacijom životinje (npr. transgene životinje koja ima humane imunoglobulinske sekvence) imunogenom; sakupljanjem ćelija slezine iz imunizovane životinje; spajanjem prikupljenih ćelija slezine sa ćelijskom linijom mijeloma, čime se generišu ćelije hibridoma; uspostavljanjem ćelijskih linija hibridoma iz ćelija hibridoma i identifikovanjem ćelijske linije hibridoma koja proizvodi antitelo koje vezuje ciljni polipeptid. Takve ćelijske linije hibridoma i monoklonska antitela koja oni proizvode su aspekti ove primene.
[0163] Monoklonska antitela koja izlučuje ćelijska linija hibridoma mogu se prečistiti bilo kojom tehnikom poznatom u struci. Hibridomi ili mAb se mogu dalje pregledati kako bi se identifikovali mAb sa određenim svojstvima.
[0164] Obezbeđena su i himerna i humanizovana antitela na osnovu gorenavedenih sekvenci. Monoklonska antitela za upotrebu kao terapijski agensi mogu se modifikovati na različite načine pre upotrebe. Jedan primer je himerno antitelo, koje je antitelo sastavljeno od proteinskih segmenata iz različitih antitela koji su kovalentno spojeni da proizvode funkcionalne imunoglobulinske lake ili teške lance ili njihove imunološki funkcionalne delove. Generalno, deo teškog lanca i/ili lakog lanca je identičan ili homologan odgovarajućoj sekvenci u antitelima dobijenim od određene vrste ili pripada određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca identičan ili homologan odgovarajućoj sekvenci u antitelima dobijenim od
4
druge vrste ili pripada drugoj klasi ili podklasi antitela. Za metode koje se odnose na himerna antitela, videti na primer američki patent br. 4,816,567; i Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855. CDR grafting je opisan, na primer, u američkom patentu br.
6,180,370, br.5,693,762, No.5,693,761, br.5,585,089 i br.5,530,101.
[0165] Generalno, cilj pravljenja himernog antitela je stvaranje himere u kojoj se maksimizira broj aminokiselina iz predviđene vrste pacijenta. Jedan primer je „CDR-graftovano“ antitelo, u kojem antitelo obuhvata jednu ili više regija koje određuju komplementarnost (CDR) iz određene vrste ili pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca antitela identičan ili homologan odgovarajućoj sekvenci u antitelima dobijenim od druge vrste ili pripada drugoj klasi ili podklasi antitela. Za upotrebu kod ljudi, varijabilna regija ili odabrani CDR iz antitela glodara često se graftuju u ljudsko antitelo, zamenjujući prirodno prisutne varijabilne regije ili CDR ljudskog antitela.
[0166] Jedan koristan tip himernog antitela je „humanizovano“ antitelo. Generalno, humanizovano antitelo se proizvodi od monoklonskog antitela koje je prvobitno nastalo kod životinje koja nije čovek. Određeni aminokiselinski ostaci u ovom monoklonskom antitelu, obično iz delova antitela koji ne prepoznaju antigen, modifikovani su tako da budu homologni odgovarajućim ostacima u ljudskom antitelu odgovarajućeg izotipa. Humanizacija se može izvršiti, na primer, korišćenjem različitih metoda supstitucijom najmanje dela varijabilne regije glodara odgovarajućim regijama ljudskog antitela (videti npr. američki patent br. 5,585,089 i br. 5,693,762; Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536).
[0167] U jednom aspektu, CDR varijabilnih regija lakog i teškog lanca antitela koja su ovde data graftuju se na okvirne regije (FR) iz antitela iste ili različite filogenetske vrste. Na primer, CDR varijabilnih regija teškog i lakog lanca VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12 i/ili VL1, i VL2 mogu se graftovati na konsenzus ljudskih FR. Da bi se stvorio konsenzus ljudskih FR, FR iz nekoliko sekvenci aminokiselina ljudskog teškog lanca ili lakog lanca mogu se uskladiti kako bi se identifikovala konsenzusna sekvenca aminokiselina. U drugim otelotvorenjima, FR teškog lanca ili lakog lanca koji su ovde obelodanjeni zamenjuju se FR iz drugog teškog lanca ili lakog lanca. U jednom aspektu, retke aminokiseline u FR teških i lakih lanaca antitela se ne zamenjuju, dok se ostatak FR aminokiselina zamenjuje. „Retka aminokiselina“ je specifična aminokiselina koja je na poziciji
4
na kojoj se ova određena aminokiselina obično ne nalazi u FR. Alternativno, graftovane varijabilne regije iz jednog teškog ili lakog lanca mogu se koristiti sa konstantnom regijom koja se razlikuje od konstantne regije tog određenog teškog ili lakog lanca kao što je ovde obelodanjeno. U drugim otelotvorenjima, graftovane varijabilne regije su deo jednolančanog Fv antitela.
[0168] U određenim otelotvorenjima, konstantne regije iz vrsta koje nisu ljudi mogu se koristiti zajedno sa ljudskim varijabilnim regijama za proizvodnju hibridnih antitela.
[0169] Obezbeđena su i potpuno ljudska antitela. Dostupne su metode za pravljenje potpuno ljudskih antitela specifičnih za dati antigen bez izlaganja ljudskih bića antigenu („potpuno ljudska antitela“). Jedan specifičan način predviđen za sprovođenje proizvodnje potpuno ljudskih antitela je „humanizacija“ mišjeg humoralnog imunog sistema. Uvođenje lokusa ljudskog imunoglobulina (Ig) u miševe kod kojih su endogeni Ig geni inaktivirani je jedno od načina za proizvodnju potpuno ljudskih monoklonskih antitela (mAbs) kod miševa, životinje koja se može imunizovati bilo kojim poželjnim antigenom. Upotreba potpuno ljudskih antitela može minimizirati imunogene i alergijske odgovore koji ponekad mogu biti uzrokovani primenom mišjih mAb i onih izvedenih od miševa kao terapijskih agenasa na ljudima.
[0170] Potpuno ljudska antitela mogu se proizvesti imunizacijom transgenih životinja (obično miševa) koje su sposobne da proizvedu repertoar ljudskih antitela u odsustvu proizvodnje endogenih imunoglobulina. Antigeni za ovu svrhu obično imaju šest ili više susednih aminokiselina, a opciono su konjugovani sa nosačem, kao što je hapten. Videti npr. Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; and Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol.7:33. U jednom primeru takve metode, transgene životinje se proizvode onesposobljavanjem endogenih lokusa imunoglobulina miša koji kodiraju mišje teške i lake lance imunoglobulina u njima i insercijom u genom miša velikih fragmenata DNK ljudskog genoma koji sadrže lokuse koji kodiraju ljudske proteine teškog i lakog lanca. Delimično modifikovane životinje, koje imaju manje od punog komplementa lokusa ljudskog imunoglobulina, zatim se ukrštaju kako bi se dobila životinja koja ima sve željene modifikacije imunog sistema. Kada se primenjuje imunogen, ove transgene životinje proizvode antitela koja su imunospecifična za imunogen, ali imaju humane, a ne mišje sekvence aminokiselina, uključujući varijabilne regije. Za više detalja o takvim metodama, videti na primer WO96/33735 i WO94/02602. Dodatne metode koje se odnose na transgene
4
miševe za pravljenje ljudskih antitela opisane su u američkom patentu br. 5,545,807; br.
6,713,610; br. 6,673,986; br. 6,162,963; br. 5,545,807; br. 6,300,129; No. 6,255,458; br.
5,877,397; br.5,874,299 i br.5,545,806; u PCT publikacijama WO91/10741, WO90/04036, i u EP 546073B1 i EP 546073A1.
[0171] Gore opisani transgeni miševi, koji se ovde nazivaju „HuMab“ miševi, sadrže minilokus gena humanog imunoglobulina koji kodira nepreuređene teške ljudske ([mu] i
[gama]) i [kapa] sekvence imunoglobulina lakog lanca, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju lokuse endogenog [mu] i [kapa] lanca (Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859). Shodno tome, miševi pokazuju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ili [kapa] i kao odgovor na imunizaciju, a uvedeni transgeni ljudskog teškog i lakog lanca prolaze kroz promenu klase i somatsku mutaciju kako bi generisali monoklonska antitela visokog afiniteta ljudskog IgG [kapa] (Lonberg et al., supra.; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci.764:536-546). Priprema HuMab miševa detaljno je opisana u Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al., 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol.
152:2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci.764:536-546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14:845-851. Videti dalje američki patent br. 5,545,806; br. 5,569,825; br. 5,625,126; br. 5,633,425; br. 5,789,650; br.
5,877,397; br.5,661,016; No.5,814,318; br.5,874,299; i br.5,770,429; ka i američki patent br.
5,545,807; međunarodne publikacije br. WO 93/1227; WO 92/22646; i WO 92/03918. Tehnologije koje se koriste za proizvodnju ljudskih antitela kod ovih transgenih miševa obelodanjene su i u WO 98/24893 i Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15: 146-156. Na primer, transgeni sojevi HCo7 i HCo12 miševa mogu se koristiti za generisanje ljudskih monoklonskih antitela protiv ciljnog antigena. Dalji detalji u vezi sa proizvodnjom ljudskih antitela pomoću transgenih miševa dati su u nastavku.
[0172] Koristeći tehnologiju hibridoma, ljudski mAb specifični za antigen sa željenom specifičnošću mogu se proizvesti i izabrati između transgenih miševa, poput onih opisanih gore. Takva antitela se mogu klonirati i eksprimovati pomoću odgovarajućeg vektora i ćelije domaćina, ili se antitela mogu sakupiti iz kultivisanih ćelija hibridoma.
[0173] Potpuno ljudska antitela se takođe mogu izvesti iz biblioteka prikaza faga (kao što je obelodanjeno u Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol.227:381; i Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581). Tehnike prikaza faga oponašaju imunološku selekciju kroz prikaz repertoara antitela na površini filamentnog bakteriofaga, a naknadnu selekciju faga njihovim vezivanjem za antigen po izboru. Jedna takva tehnika je opisana u PCT publikaciji br. WO 99/10494.
[0174] Derivati proteina koji vezuju antigen koji su ovde opisani su takođe obezbeđeni. Derivatizovani proteini koji vezuju antigen mogu da sadrže bilo koji molekul ili supstancu koja daje željeno svojstvo antitelima ili fragmentima, kao što je povećano poluvreme eliminacije u određenoj upotrebi. Derivatizovani protein koji vezuje antigen može se sastojati, na primer, od detektabilnog (ili označavajućeg) dela (npr. radioaktivnog, kolorimetrijskog, antigenog ili enzimskog molekula, detektabilnog dela (kao što je magnetno ili elektrodenzno (npr. zlatno) zrno) ili molekula koji se vezuje za drugi molekul (npr. biotin ili streptavidin)), terapijskog ili dijagnostičkog dela (npr. radioaktivnog, citotoksičnog ili farmaceutski aktivnog dela) ili molekula koji povećava pogodnost proteina koji vezuje antigen za određenu upotrebu (npr. primena na ispitaniku, kao što je ljudski ispitanik, ili druge upotrebe in vivo ili in vitro). Primeri molekula koji se mogu koristiti za derivatizaciju proteina koji vezuje antigen uključuju albumin (npr.ljudski serumski albumin) i polietilen glikol (PEG). Albuminom vezani i PEGilirani derivati proteina koji vezuju antigen mogu se pripremiti tehnikama dobro poznatim u struci. Određeni proteini koji vezuju antigen uključuju pegilirani jednolančani polipeptid kao što je ovde opisano. U jednom otelotvorenju, protein koji vezuje antigen je konjugovan ili na drugi način povezan sa transtiretinom (TTR) ili TTR varijantom. Varijanta TTR ili TTR može biti hemijski modifikovana, na primer, hemikalijom izabranom iz grupe koja se sastoji od dekstrana, poli(n-vinil pirolidona), polietilen glikola, homopolimera propropilen glikola, kopolimera polipropilen oksida/etilen oksida, polioksietiliranih poliola i polivinil alkohola.
[0175] Ostali derivati uključuju kovalentne ili agregativne konjugate proteina koji vezuju antigen sa drugim proteinima ili polipeptidima, kao što je ekspresija rekombinantnih fuzionih proteina koji se sastoje od heterolognih polipeptida fuzionisanih sa N-terminusom ili C-terminusom proteina koji vezuje antigen. Na primer, konjugovani peptid može biti heterologni signal (ili lider) polipeptida, npr. lider alfa-faktora kvasca, ili peptid kao što je oznaka epitopa. Fuzioni proteini koji sadrže proteine koji vezuju antigen mogu se sastojati od peptida koji se dodaju kako bi se olakšalo prečišćavanje ili identifikacija proteina koji vezuje antigen (npr. poli-His). Protein koji vezuje antigen takođe se može povezati sa peptidom FLAG kao što je
1
opisano u Hopp et al., 1988, Bio/Technology 6: 1204; i američkom patentu br. 5,011,912. Peptid FLAG je visoko antigen i obezbeđuje epitop reverzibilno vezan specifičnim monoklonskim antitelima (mAb), omogućavajući brzo testiranje i lako prečišćavanje eksprimovanog rekombinantnog proteina. Komercijalno su dostupni reagensi korisni za pripremu fuzionih proteina u kojima je peptid FLAG fuzionisan sa datim polipeptidom (Sigma, St. Louis, MO).
[0176] U nekim otelotvorenjima, protein koji vezuje antigen obuhvata jednu ili više oznaka. Termin „označavajuća grupa“ ili „oznaka“ označava bilo koju detektabilnu oznaku. Primeri pogodnih označavajućih grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: radioizotope ili radionuklide (npr.<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I), fluorescentne grupe (npr. FITC, rodamin, lantanidni fosfori), enzimatske grupe (npr. peroksidaza rena, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminiscentne grupe, biotinilne grupe ili unapred određene polipeptidne epitopske sekvence koje prepoznaje sekundarni reporter (npr. sekvence parova leucinskih zatvarača, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni za vezivanje metala, epitopske oznake). U nekim otelotvorenjima, označavajuća grupa je povezana sa proteinom koji vezuje antigen putem distancera različitih dužina kako bi se smanjila potencijalna sterička prepreka. Različite metode za označavanje proteina su poznate u struci i mogu se koristiti kako se smatra prikladnim.
[0177] Termin „efektorska grupa“ označava bilo koju grupu vezanu za protein koji vezuje antigen i koji deluje kao citotoksični agens. Primeri za odgovarajuće efektorske grupe su radioizotopi ili radionuklidi (npr.<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I). Druge pogodne grupe uključuju toksine, terapijske grupe ili hemoterapijske grupe. Primeri pogodnih grupa uključuju kaliheamicin, auristatine, geldanamicin i majtanzin. U nekim otelotvorenjima, efektorska grupa je povezana sa proteinom koji vezuje antigen preko odstojnika različitih dužina kako bi se smanjila potencijalna sterilna prepreka.
[0178] Generalno, oznake spadaju u različite klase, u zavisnosti od testa u kojem će biti otkrivene: a) izotopske oznake, koje mogu biti radioaktivni ili teški izotopi; b) magnetne oznake (npr. magnetne čestice); c) redoks aktivni delovi; d) optičke boje; enzimske grupe (npr. peroksidaza rena, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza (npr. sekvence parova leucinskih zatvarača, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni za vezivanje metala, epitopske oznake, itd.). U nekim otelotvorenjima, označavajuća grupa je povezana sa
2
proteinom koji vezuje antigen putem distancera različitih dužina kako bi se smanjila potencijalna sterička prepreka. U struci su poznate različite metode za označavanje proteina.
[0179] Specifične oznake uključuju optičke boje, uključujući, ali ne ograničavajući se na, hromofore, fosfore i fluorofore, pri čemu su potonje specifične u mnogim slučajevima. Fluorofori mogu biti fluori „malih molekula“ ili proteinski fluori.
[0180] Pod „fluorescentnom oznakom“ se podrazumeva svaki molekul koji se može detektovati na osnovu njegovih inherentnih fluorescentnih svojstava. Odgovarajuće fluorescentne oznake uključuju, bez ograničenja, fluorescein, rodamin, tetrametilrodamin, eozin, eritrozin, kumarin, metil-kumarini, piren, Malacit Green, stilben, Lucifer Yellow, Cascade BlueJ, Texas Red, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, Oregon Green, Alexa-Fluor boje (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow i R-phycoerythrin (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, Rhodamine i Texas Red (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Odgovarajuće optičke boje, uključujući fluorofore, opisane su u Molecular Probes Handbook, autor Richard P. Haugland.
[0181] Pogodne proteinske fluorescentne oznake takođe uključuju, ali nisu ograničene na, zeleni fluorescentni protein, uključujući vrste Renilla, Ptilosarcus ili Aequorea GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Labs., Inc., Genbank pristupni broj U55762), plavi fluorescentni protein (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc., Quebec, Kanada; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6: 178-182), pojačani žuti fluorescentni protein (EYFP, Clontech Labs., Inc.), luciferaza (Ichiki et al., 1993, J. Immunol.
150:5408-5417), β galaktozidaza (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) i Renilla (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, američki patentni br. 5292658, br. 5418155, No. 5683888, br. 5741668, br. 5777079, br.
5804387, br.5874304, br.5876995, br.5925558).
[0182] Obezbeđene su i nukleinske kiseline koje kodiraju ovde opisane proteine koji vezuju antigen, ili njihove delove, uključujući nukleinske kiseline koje kodiraju jedan ili oba lanca antitela, ili fragment, derivat, mutein, ili njihovu varijantu, polinukleotide koji kodiraju varijabilne regije teškog lanca ili samo CDR, polinukleotide dovoljne za upotrebu kao sonde za hibridizaciju, PCR prajmere ili prajmere za sekvenciranje za identifikaciju, analizu, mutiranje ili pojačavanje polinukleotida koji kodiraju polipeptid, anticensne nukleinske kiseline za inhibiciju ekspresije polinukleotida i komplementarne sekvence gore navedenog. Nukleinske kiseline mogu biti bilo koje dužine. One mogu biti, na primer, dužine 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1.000, 1.500, 3.000, 5.000 ili više nukleotida i/ili mogu da sadrže jednu ili više dodatnih sekvenci, na primer, regulatorne sekvence i/ili da budu deo veće nukleinske kiseline, na primer, vektora. Nukleinske kiseline mogu biti jednolančane ili dvolančane i mogu sadržati RNK i/ili DNK nukleotide i njihove veštačke varijante (npr. peptidne nukleinske kiseline). Bilo koja varijabilna regija navedena u ovom dokumentu može biti pričvršćena za ove konstantne regije kako bi se formirale kompletne sekvence teškog i lakog lanca. Međutim, treba shvatiti da su ove sekvence konstantnih regija date samo kao specifični primeri. U nekim otelotvorenjima, sekvence varijabilne regije su povezane sa drugim sekvencama konstantne regije koje su poznate u struci.
[0183] Nukleinske kiseline koje kodiraju određene proteine koji vezuju antigen ili njihove delove (npr. antitelo pune dužine, teški ili laki lanac, varijabilni domen ili CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 ili CDRL3) mogu se izolovati iz B-ćelija miševa koji su imunizovani antigenom. Nukleinska kiselina se može izolovati konvencionalnim procedurama kao što je lančana reakcija polimeraze (PCR). Prikaz faga je još jedan primer poznate tehnike u kojoj se mogu pripremiti derivati antitela i drugi proteini koji vezuju antigen. U jednom pristupu, polipeptidi koji su komponente proteina od interesa koji vezuje antigen eksprimuju se u bilo kom odgovarajućem rekombinantnom ekspresijskom sistemu, a eksprimovanim polipeptidima je dozvoljeno da se sastave kako bi formirali proteine koji vezuju antigen.
[0184] Jedan aspekt dalje obezbeđuje nukleinske kiseline koje se hibridizuju sa drugim nukleinskim kiselinama pod određenim uslovima hibridizacije. Metode za hibridizaciju nukleinskih kiselina su dobro poznate u struci. Videti npr. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Kao što je ovde definisano, umereno strogi uslov hibridizacije koristi rastvor za predispiranje koji sadrži 5x natrijum hlorid/natrijum citrat (SSC), 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0), hibridizacioni pufer od oko 50% formamida, 6x SSC i temperaturu hibridizacije od 55°C (ili druge slične rastvore za hibridizaciju, kao što je onaj koji sadrži oko 50% formamida, sa temperaturom hibridizacije od 42°C), i uslove pranja od 60°C, u 0,5x SSC, 0,1% SDS. Strogi uslov hibridizacije podrazumeva hibridizaciju u 6x SSC na 45°C, nakon čega sledi jedno ili više pranja u 0,1x SSC, 0,2% SDS na 68°C. Štaviše,
4
stručnjak u predmetnoj oblasti može manipulisati uslovima hibridizacije i/ili pranja kako bi se povećala ili smanjila strogost hibridizacije tako da nukleinske kiseline koje se sastoje od nukleotidnih sekvenci koje su najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ili 99% identične jedna drugoj obično ostaju međusobno hibridizovane.
[0185] Osnovne parametre koji utiču na izbor uslova hibridizacije i smernice za osmišljavanje odgovarajućih uslova utvrđuju, na primer, Sambrook, Fritsch i Maniatis (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., supra; and Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4), i mogu ih lako odrediti stručnjaci u predmetnoj oblasti na osnovu, npr, dužine i/ili baznog sastava nukleinske kiseline.
[0186] Promene se mogu uvesti mutacijom u nukleinsku kiselinu, što dovodi do promena u sekvenci aminokiselina polipeptida (npr. antitela ili derivata antitela) koje kodira. Mutacije se mogu uvesti korišćenjem bilo koje tehnike poznate u struci. U jednom otelotvorenju, jedan ili više određenih aminokiselinskih ostataka se menjaju korišćenjem, na primer, protokola mutageneze usmerenog na mesto. U drugom otelotvorenju, jedan ili više nasumično izabranih ostataka se menjaju korišćenjem, na primer, protokola nasumične mutageneze. Kako god da je napravljen, mutantni polipeptid može biti ekspresovan i podvrgnut skriningu za željeno svojstvo.
[0187] Mutacije se mogu uneti u nukleinsku kiselinu bez značajne promene biološke aktivnosti polipeptida koji kodira. Na primer, mogu se napraviti nukleotidne supstitucije koje dovode do supstitucija aminokiselina na neesencijalnim aminokiselinskim ostacima. Alternativno, jedna ili više mutacija mogu se uvesti u nukleinsku kiselinu koja selektivno menja biološku aktivnost polipeptida koji kodira. Na primer, mutacija može kvantitativno ili kvalitativno da promeni biološku aktivnost. Primeri kvantitativnih promena uključuju povećanje, smanjenje ili eliminisanje aktivnosti. Primeri kvalitativnih promena uključuju promenu specifičnosti antigena antitela. U jednom otelotvorenju, nukleinska kiselina koja kodira bilo koji ovde opisani protein koji vezuje antigen može biti mutirana da promeni sekvencu aminokiselina koristeći tehnike molekularne biologije koje su dobro uspostavljene u struci.
[0188] Drugi aspekt pruža molekule nukleinske kiseline koji su pogodni za upotrebu kao prajmeri ili hibridizacione sonde za detekciju sekvenci nukleinske kiseline. Molekul nukleinske kiseline može da sadrži samo deo sekvence nukleinske kiseline koja kodira polipeptid pune dužine, na primer, fragment koji se može koristiti kao sonda ili prajmer ili fragment koji kodira aktivni deo polipeptida.
[0189] Sonde zasnovane na sekvenci nukleinske kiseline mogu se koristiti za detekciju nukleinske kiseline ili sličnih nukleinskih kiselina, na primer, transkripata koji kodiraju polipeptid. Sonda može da se sastoji od grupe za označavanje, npr. radioizotopa, fluorescentnog jedinjenja, enzima ili kofaktora enzima. Takve sonde se mogu koristiti za identifikaciju ćelije koja eksprimira polipeptid.
[0190] Drugi aspekt obezbeđuje vektore koji se sastoje od nukleinske kiseline koja kodira polipeptid ili njegov deo (npr. fragment koji sadrži jedan ili više CDR ili jedan ili više domena varijabilnih regija). Primeri vektora uključuju, ali nisu ograničeni na, plazmide, virusne vektore, neepizomalne vektore sisara i vektore ekspresije, na primer, rekombinantne vektore ekspresije. Vektori rekombinantne ekspresije mogu da sadrže nukleinsku kiselinu u obliku pogodnom za ekspresiju nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu. Vektori rekombinantne ekspresije uključuju jednu ili više regulatornih sekvenci, izabranih na osnovu ćelija domaćina koje će se koristiti za ekspresiju, koje su operativno povezane sa sekvencom nukleinske kiseline koju treba eksprimirati. Regulatorne sekvence uključuju one koje usmeravaju konstitutivnu ekspresiju nukleotidne sekvence u mnogim tipovima ćelija domaćina (npr. rani pojačivač gena SV40, promotor virusa Rous sarcoma i promotor citomegalovirusa), one koje usmeravaju ekspresiju nukleotidne sekvence samo u određenim ćelijama domaćinima (npr. regulatorne sekvence specifične za tkivo, videti Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci.11:287, Maniatis et al., 1987, Science 236: 1237), i one koje usmeravaju inducibilnu ekspresiju nukleotidne sekvence kao odgovor na određeni tretman ili uslov (npr. promotor metalotionina u ćelijama sisara i promotor koji reaguje na tet-reaktivnost i/ili streptomicin u prokariotskim i eukariotskim sistemima (videti id.). Stručnajci u predmetnoj oblasti će razumeti da dizajn vektora ekspresije može zavisiti od faktora kao što su izbor ćelije domaćina koju treba transformisati, nivo ekspresije željenog proteina itd. Vektori ekspresije se mogu uvesti u ćelije domaćina kako bi se time proizveli proteini ili peptidi, uključujući fuzione proteine ili peptide, kodirane nukleinskim kiselinama kao što je ovde opisano.
[0191] Drugi aspekt obezbeđuje ćelije domaćine u koje je uveden rekombinantni vektor ekspresije. Ćelija domaćin može biti bilo koja prokariotska ćelija (na primer E. coli) eukariotska ćelija (na primer, ćelije kvasca, insekta ili sisara (npr. CHO ćelije)). Vektorska DNK se može uvesti u prokariotske ili eukariotske ćelije konvencionalnim tehnikama transformacije ili transfekcije. Za stabilnu transfekciju ćelija sisara, poznato je da, u zavisnosti od korišćenog vektora ekspresije i tehnike transfekcije, samo mali deo ćelija može integrisati stranu DNK u svoj genom. Da bi se identifikovali i izabrali ovi integranti, gen koji kodira selektivni marker (npr. za otpornost na antibiotike) se generalno uvodi u ćelije domaćine zajedno sa genom od interesa. Preferirani selektivni markeri uključuju one koji daju rezistenciju na lekove, kao što su G418, higromicin i metotreksat. Ćelije stabilno transficirane uvedenom nukleinskom kiselinom mogu se identifikovati selekcijom leka (npr. ćelije koje su ugradile selektivni marker gen će preživeti, dok će druge ćelije umreti), između ostalih metoda.
[0192] Ovde su takođe dati sistemi i konstrukti ekspresije u obliku plazmida, vektora ekspresije, transkripcije ili kaseta ekspresije koje sadrže najmanje jedan polinukleotid kao što je gore opisano, kao i ćelije domaćine koje se sastoje od takvih sistema ili konstrukata ekspresije.
[0193] Ovde navedeni proteini koji vezuju antigen mogu se pripremiti bilo kojom od brojnih konvencionalnih tehnika. Na primer, proteini koji vezuju antigen mogu se proizvesti rekombinantnim ekspresijskim sistemima, koristeći bilo koju tehniku poznatu u struci. Videti npr. Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.) Plenum Press, New York (1980); i Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).
[0194] Proteini koji vezuju antigen mogu biti eksprimovani u ćelijskim linijama hibridoma (npr. posebno antitela mogu biti eksprimovana u hibridomima) ili u ćelijskim linijama koje nisu hibridomi. Konstrukti ekspresije koji kodiraju antitela mogu se koristiti za transformaciju ćelije domaćina sisara, insekata ili mikroba. Transformacija se može izvršiti korišćenjem bilo koje poznate metode za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina, uključujući, na primer, pakovanje polinukleotida u virus ili bakteriofag i transdukciju ćelije domaćina sa konstruktom procedurama transfekcije poznatim u struci, kao što je prikazano u američkom patentu br.
4,399,216; br. 4,912,040; br. 4,740,461; br. 4,959,455. Optimalna procedura transformacije koja se koristi zavisiće od toga koji tip ćelije domaćina se transformiše. Metode za uvođenje heterolognih polinukleotida u ćelije sisara su dobro poznate u struci i uključuju, ali nisu ograničene na, transfekciju posredovanu dekstranom, precipitaciju kalcijum fosfata, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, inkapsulaciju polinukleotida u lipozomima, mešanje nukleinske kiseline sa pozitivno naelektrisanim lipidima i direktnu mikroinjekciju DNK u jezgra.
[0195] Konstrukti rekombinantne ekspresije obično se sastoje od molekula nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji se sastoji od jednog ili više sledećih elemenata: jednog ili više CDR predviđenih ovde; konstantne regije lakog lanca; varijabilne regije lakog lanca; konstantne regije teškog lanca (npr. CH1, CH2 i/ili CH3); i/ili drugog dela skele proteina koji vezuje antigen. Ove sekvence nukleinskih kiselina se ubacuju u odgovarajući vektor ekspresije koristeći standardne tehnike ligacije. U jednom otelotvorenju, konstantna regija teškog ili lakog lanca je dodata C-terminusu varijabilne regije teškog ili lakog lanca i ligirana je u vektor ekspresije. Vektor se obično bira da bude funkcionalan u određenoj ćeliji domaćinu (tj. vektor je kompatibilan sa mašinerijom ćelije domaćina, što omogućava pojačavanje i/ili ekspresiju gena). U nekim otelotvorenjima, koriste se vektori koji koriste testove komplementacije proteina i fragmenta korišćenjem proteinskih reportera, kao što je dihidrofolat reduktaza (videti na primer američki patent br.6,270,964). Odgovarajući vektori ekspresije mogu se kupiti, na primer, od Invitrogen Life Technologies ili BD Biosciences (ranije „Clontech“). Ostali korisni vektori za kloniranje i ekspresiju antitela i fragmenata uključuju one opisane u Bianchi and McGrew, 2003, Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84:439-44. Dodatni pogodni vektori ekspresije su razmatrani, na primer, u Methods Enzymol., vol.185 (D. V. Goeddel, ed.), 1990, New York: Academic Press.
[0196] Tipično, vektori ekspresije koji se koriste u bilo kojoj od ćelija domaćina će sadržati sekvence za održavanje plazmida i za kloniranje i ekspresiju egzogenih nukleotidnih sekvenci. Takve sekvence, kolektivno nazvane „bočne sekvence“ u određenim otelotvorenjima, obično će uključivati jednu ili više sledećih nukleotidnih sekvenci: promotor, jednu ili više sekvenci pojačivača, poreklo replikacije, sekvencu transkripcionog završetka, kompletnu intronsku sekvencu koja sadrži mesto spajanja donora i akceptora, sekvencu koja kodira vodeću sekvencu za sekreciju polipeptida, mesto vezivanja ribozoma, sekvencu poliadenilacije, regiju polilinkera za umetanje nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji treba eksprimovati i selektivni marker element. Svaka od ovih sekvenci je razmotrena u nastavku.
[0197] Opciono, vektor može da sadrži sekvencu koja kodira „oznaku“ , tj. molekul oligonukleotida koji se nalazi na 5' ili 3' kraju sekvence koja kodira protein koji vezuje antigen; sekvenca oligonukleotida kodira poliHis (kao što je heksaHis), ili drugu „oznaku“ kao što je FLAG<®>, HA (virus hemaglutinin influence) ili MIC, za koju postoje komercijalno dostupna antitela. Ova oznaka se obično spaja sa polipeptidom nakon ekspresije polipeptida i može poslužiti kao sredstvo za prečišćavanje afiniteta ili detekciju proteina koji vezuje antigen iz ćelije domaćina. Prečišćavanje afiniteta se može postići, na primer, kolonskom hromatografijom korišćenjem antitela protiv oznake kao matrice afiniteta. Opciono, oznaka se može naknadno ukloniti iz prečišćenog proteina vezivanja antigena na različite načine, kao što je korišćenje određenih peptidaza za cepanje.
[0198] Bočne sekvence mogu biti homologne (tj. iz iste vrste i/ili soja kao ćelija domaćin), heterologne (tj. iz vrste koja nije vrsta ili soj ćelije domaćina), hibridne (tj. kombinacija bočnih sekvenci iz više od jednog izvora), sintetičke ili nativne. Kao takav, izvor bočne sekvence može biti bilo koji prokariotski ili eukariotski organizam, bilo koji organizam kičmenjaka ili beskičmenjaka, ili bilo koja biljka, pod uslovom da je bočna sekvenca funkcionalna i da se može aktivirati mašinerijom ćelije domaćina.
[0199] Bočne sekvence korisne u vektorima mogu se dobiti bilo kojom od nekoliko metoda dobro poznatih u struci. Tipično, bočne sekvence korisne ovde će prethodno biti identifikovane mapiranjem i/ili restrikcionom digestijom endonukleaze i stoga se mogu izolovati od odgovarajućeg izvora tkiva korišćenjem odgovarajućih restrikcionih endonukleaza. U nekim slučajevima, puna nukleotidna sekvenca bočne sekvence može biti poznata. Ovde se bočna sekvenca može sintetizovati korišćenjem ovde opisanih metoda za sintezu ili kloniranje nukleinskih kiselina.
[0200] Bilo da je poznata cela ili samo deo bočne sekvence, ona se može dobiti korišćenjem lančane reakcije polimeraze (PCR) i/ili skriningom genomske biblioteke odgovarajućom sondom kao što je oligonukleotid i/ili fragment bočne sekvence iz iste ili druge vrste. Kada bočna sekvenca nije poznata, fragment DNK koji sadrži bočnu sekvencu može biti izolovan iz većeg dela DNK koji može sadržati, na primer, sekvencu kodiranja ili čak drugi gen ili gene. Izolacija se može postići restrikcionom digestijom endonukleaze kako bi se proizveo odgovarajući fragment DNK, nakon čega sledi izolacija korišćenjem prečišćavanja agaroznim gelom, Qiagen<®>kolonskom hromatografijom (Chatsworth, CA), ili drugim metodama poznatim kvalifikovanoj osobi. Izbor odgovarajućih enzima za postizanje ove svrhe biće lako očigledan stručnjaku u predmetnoj oblasti.
[0201] Poreklo replikacije je obično deo onih komercijalno kupljenih vektora prokariotske ekspresije, a poreklo pomaže u pojačavanju vektora u ćeliji domaćinu. Ako izabrani vektor ne sadrži poreklo mesta replikacije, može se hemijski sintetizovati na osnovu poznate sekvence i ligirati u vektor. Na primer, poreklo replikacije iz plazmida pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) pogodno je za većinu gram-negativnih bakterija, a različita virusna porekla (npr. SV40, poliom, adenovirus, vezikularni stomatitus virus (VSV) ili papiloma virusi kao što su HPV ili BPV) korisna su za kloniranje vektora u ćelijama sisara. Generalno, poreklo komponente replikacije nije potrebno za vektore ekspresije kod sisara (na primer, poreklo SV40 se često koristi samo zato što takođe sadrži rani promotor virusa).
[0202] Sekvenca završetka transkripcije se obično nalazi 3' do kraja polipeptidnog regiona kodiranja i služi za završetak transkripcije. Obično je sekvenca završetka transkripcije u prokariotskim ćelijama fragment bogat sa GC, nakon čega sledi poli-T sekvenca. Iako se sekvenca lako klonira iz biblioteke ili čak kupuje komercijalno kao deo vektora, takođe se može lako sintetizovati korišćenjem metoda za sintezu nukleinskih kiselina kao što su one opisane u ovom dokumentu.
[0203] Selektivni marker gen kodira protein neophodan za opstanak i rast ćelije domaćina koja se uzgaja u selektivnom medijumu kulture. Tipični selekcioni marker geni kodiraju proteine koji (a) daju otpornost na antibiotike ili druge toksine , npr. ampicilin, tetraciklin ili kanamicin za prokariotske ćelije domaćina; (b) dopunjuju auksotrofne nedostatke ćelije; ili (c) snabdevaju kritične hranljive materije koje nisu dostupne iz složenih ili definisanih medija. Specifični selektivni markeri su gen za rezistenciju na kanamicin, gen za rezistenciju na ampicilin i gen za rezistenciju na tetraciklin. Prednost je u tome što se gen za rezistenciju na neomicin može koristiti za selekciju kako u prokariotskim, tako i u eukariotskim ćelijama domaćinima.
[0204] Drugi selektivni geni mogu se koristiti za pojačavanje gena koji će biti eksprimovan. Amplifikacija je proces u kojem se geni koji su potrebni za proizvodnju proteina kritičnog za rast ili preživljavanje ćelija ponavljaju u tandemu unutar hromozoma uzastopnih generacija rekombinantnih ćelija. Primeri odgovarajućih selektivnih markera za ćelije sisara uključuju dihidrofolat reduktazu (DHFR) i gene timidin kinaze bez promotora. Transformanti ćelija sisara se stavljaju pod selekciono opterećenje pri čemu su samo transformanti jedinstveno prilagođeni da prežive na osnovu selektivnog gena prisutnog u vektoru. Selekciono opterećenje se primenjuje kultivisanjem transformisanih ćelija pod uslovima u kojima se koncentracija selekcionog agensa u medijumu postepeno povećava, čime se dovodi do amplifikacije kako selekcionog gena, tako i DNK koja kodira drugi gen, poput gena za polipeptid koji se veže za ciljni polipeptid, kao što je protein koji vezuje antigen. Kao rezultat, iz amplifikovane DNK se sintetišu povećane količine polipeptida kao što je protein koji vezuje antigen.
[0205] Mesto vezivanja ribozoma je obično neophodno za inicijaciju translacije mRNK i karakteriše ga Shine-Dalgarno sekvenca (prokariote) ili Kozak sekvenca (eukariote). Element se obično nalazi 3' od promotora i 5' od kodirajuće sekvence polipeptida koji treba da bude eksprimovan.
[0206] U nekim slučajevima, kao što je slučaj kada je glikozilacija poželjna u sistemu ekspresije eukariotskih ćelija domaćina, može se manipulisati različitim pre- ili prosekvencama kako bi se poboljšala glikozilacija ili prinos. Na primer, može se promeniti mesto cepanja peptidaze određenog signalnog peptida ili dodati pro-sekvence, koje takođe mogu uticati na glikozilaciju. Konačni proteinski proizvod može imati, na poziciji -1 (u odnosu na prvu aminokiselinu zrelog proteina), jednu ili više dodatnih aminokiselina do ekspresije, koje možda nisu u potpunosti uklonjene. Na primer, konačni proteinski proizvod može imati jedan ili dva aminokiselinska ostatka koja se nalaze na mestu cepanja peptidaze, pričvršćena za amino-terminus. Alternativno, upotreba nekih enzimskih mesta cepanja može rezultirati blago skraćenim oblikom željenog polipeptida, ako se enzim preseče na takvom području unutar zrelog polipeptida.
[0207] Ekspresija i kloniranje će obično sadržati promotor koji je prepoznat od strane organizma domaćina i operativno povezan sa molekulom koji kodira protein koji vezuje antigen. Promotori su neprepisane sekvence koje se nalaze uzvodno (tj .5') od startnog kodona strukturnog gena (obično unutar 100 do 1000 bp) i kontrolišu transkripciju strukturnog gena. Promotori su konvencionalno grupisani u jednu od dve klase: inducibilni promotori i konstitutivni promotori. Inducibilni promotori iniciraju povećane nivoe transkripcije iz DNK pod njihovom kontrolom kao odgovor na neku promenu uslova kulture, kao što je prisustvo ili odsustvo hranljive materije ili promena temperature. Konstitutivni promotori, s druge strane, ravnomerno transkribuju gen sa kojim su operativno povezani, odnosno sa malo ili nimalo kontrole nad ekspresijom gena. Poznat je veliki broj promotora, koje prepoznaju različite potencijalne ćelije domaćini. Pogodan promotor je operativno povezan sa DNK koja kodira
1
teški lanac ili laki lanac koji se sastoji od proteina koji vezuje antigen uklanjanjem promotora iz DNK izvora restrikcijom varenja enzima i umetanjem željene sekvence promotora u vektor.
[0208] Pogodni promotori za upotrebu sa domaćinima kvasca su takođe dobro poznati u struci. Pojačivači kvasca se povoljno koriste sa promotorima kvasca. Pogodni promotori za upotrebu sa ćelijama domaćinima sisara su dobro poznati i uključuju, ali nisu ograničeni na, one dobijene iz genoma virusa kao što su polioma virus, virus boginja peradi, adenovirus (kao što je adenovirus 2), virus papiloma goveda, virus sarkoma ptica, citomegalovirus, retrovirusi, virus hepatitisa B i virus Simian 40 (SV40). Drugi pogodni promotori sisara uključuju heterologne promotore sisara, na primer, promotore toplotnog šoka i promotore aktina.
[0209] Sekvenca pojačivača se može ubaciti u vektor kako bi se povećala transkripcija DNK koja kodira laki lanac ili teški lanac koji se sastoji od proteina koji vezuje antigen od strane viših eukariota. Pojačivači su elementi DNK koji deluju na cis, obično dužine oko 10-300 bp, koji deluju na promotor da poveća transkripciju. Pojačivači su relativno orijentisani i nezavisni od položaja, pošto su pronađeni na pozicijama i 5' i 3' u odnosu na jedinicu za transkripciju. Poznato je nekoliko sekvenci pojačivača dostupnih iz gena sisara (npr. globin, elastaza, albumin, alfa-feto-protein i insulin). Tipično, međutim, koristi se pojačivač virusa. SV40 pojačivač, citomegalovirusni rani promotorski pojačivač, poliomski pojačivač i adenovirusni pojačivači poznati u struci su primerni pojačavajući elementi za aktivaciju eukariotskih promotora. Dok se pojačivač može postaviti u vektor ili 5' ili 3' od sekvence kodiranja, obično se nalazi na mestu 5' od promotora. Sekvenca koja kodira odgovarajuću nativnu ili heterolognu sekvencu signala (sekvenca lidera ili signalni peptid) može se inkorporirati u vektor ekspresije, kako bi se promovisala ekstracelularna sekrecija antitela. Izbor signalnog peptida ili lidera zavisi od tipa ćelija domaćina u kojima će se antitelo proizvoditi, a heterologna signalna sekvenca može zameniti nativnu signalnu sekvencu. Primeri signalnih peptida koji su funkcionalni u ćelijama domaćinima sisara uključuju sledeće: signalnu sekvencu za interleukin-7 (IL-7) opisanu u američkom patentu br.4,965,195; signalnu sekvencu za receptor interleukina-2 opisanu u Cosman et al., 1984, Nature 312:768; signalni peptid receptora interleukina-4 opisan u EP patentu br.0367566; signalni peptid receptora interleukina-1 tipa I opisan u američkom patentu br. 4,968,607; signalni peptid receptora interleukina-1 tipa II opisan u EP patentu br.0460 846.
2
[0210] U jednom otelotvorenju, sekvenca lidera se sastoji od SEQ ID NO: 21 (MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RC) koja je kodirana sa SEQ ID NO: 22 (atggacatga gagtgcctgc acagctgctg ggcctgctgc tgctgtggct gagaggcgcc agatgc). U drugom otelotvorenju, sekvenca lidera se sastoji od SEQ ID NO: 23 (MAWALLLLTL LTQGTGSWA) koja je kodirana sa SEQ ID NO: 24 (atggcctggg ctctgctgct cctcaccctc ctcactcagg gcacagggtc ctgggcc).
[0211] Vektori ekspresije koji su obezbeđeni mogu biti konstruisani od početnog vektora kao što je komercijalno dostupan vektor. Takvi vektori mogu ili ne moraju da sadrže sve željene bočne sekvence. Ako jedna ili više bočnih sekvenci opisanih u ovom dokumentu već nisu prisutne u vektoru, one se mogu pojedinačno dobiti i ligirati u vektor. Metode koje se koriste za dobijanje svake od bočnih sekvenci dobro su poznate stručnjaku u predmetnoj oblasti.
[0212] Nakon što je vektor konstruisan i molekul nukleinske kiseline koji kodira laki lanac, teški lanac ili laki lanac i teški lanac koji se sastoji od sekvence vezivanja antigena je ubačen u odgovarajuće mesto vektora, završeni vektor se može ubaciti u odgovarajuću ćeliju domaćina za pojačavanje i/ili polipeptidnu ekspresiju. Transformacija ekspresijskog vektora za protein koji vezuje antigen u izabranu ćeliju domaćina može se postići poznatim metodama koje uključuju transfekciju, infekciju, koprecipitaciju kalcijum fosfata, elektroporaciju, mikroinjekciju, lipofekciju, DEAE-dekstran posredovanu transfekciju ili druge poznate tehnike. Izabrana metoda će delimično biti funkcija tipa ćelije domaćina koja će se koristiti. Ove metode i druge pogodne metode su dobro poznate stručnjaku, i izložene su, na primer, u Sambrook et al., 2001, supra.
[0213] Ćelija domaćin, kada se uzgaja pod odgovarajućim uslovima, sintetiše protein koji vezuje antigen koji se kasnije može sakupiti iz medija za kulturu (ako ga ćelija domaćin izlučuje u medijum) ili direktno iz ćelije domaćina koja ga proizvodi (ako se ne izlučuje). Izbor odgovarajuće ćelije domaćina zavisiće od različitih faktora, kao što su željeni nivoi ekspresije, modifikacije polipeptida koje su poželjne ili neophodne za aktivnost (kao što su glikozilacija ili fosforilacija) i lakoća savijanja u biološki aktivni molekul.
[0214] Ćelijske linije sisara dostupne kao domaćini za ekspresiju dobro su poznate u struci i uključuju, ali nisu ograničene na, imortalizovane ćelijske linije dostupne iz Američke kolekcije kultura sojeva (ATCC), uključujući, ali ne ograničavajući se na ćelije jajnika kineskog hrčka (Cho), HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (Cos), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr. Hep G2) i niz drugih ćelijskih linija. U drugom otelotvorenju, može se odabrati ćelijska linija iz B ćelijskog porekla koja ne proizvodi sopstvena antitela, ali ima sposobnost da proizvodi i luči heterologna antitela.
[0215] „Linker deo“ koji se ovde koristi odnosi se na biološki prihvatljivu peptidilnu ili nepeptidilnu organsku grupu koja je kovalentno vezana za aminokiselinski ostatak toksinskog peptidnog analoga ili drugog polipeptidnog lanca (npr. imunoglobulinski HC ili LC ili imunoglobulinski Fc domen) sadržanu u sastavu pronalaska, koji linker deo kovalentno spaja ili konjugira toksinski peptidni analog ili drugi polipeptidni lanac sa drugim peptidnim ili polipeptidnim lancem u sastavu, ili na deo koji produžava poluvreme eliminacije. U nekim otelotvorenjima sastava, deo koji produžava poluvreme eliminacije, kao što je ovde opisano, je konjugovan, tj. kovalentno vezan direktno za aminokiselinski ostatak samog analoga toksin peptida, ili opciono, za peptidilni ili nepeptidilni linker deo (uključujući, ali ne ograničavajući se na aromatične ili arilne linkere) koji je kovalentno vezan za aminokiselinski ostatak analoga toksin peptida. Prisustvo bilo kog dela linkera je opciono. Kada je prisutan, njegova hemijska struktura nije kritična, jer služi prvenstveno kao odstojnik za pozicioniranje, spajanje, povezivanje ili optimizaciju prezentacije ili pozicije jednog funkcionalnog dela u odnosu na jedan ili više drugih funkcionalnih delova molekula sastava pronalaska. Prisustvo linker dela može biti korisno u optimizaciji farmakološke aktivnosti nekih otelotvorenja sastava pronalaska. Linker, ako postoji, može se sastojati od aminokiselina povezanih peptidnim vezama. Linker deo, ako postoji, može biti nezavisno isti ili drugačiji od bilo kog drugog linkera, ili više linkera, koji mogu biti prisutni u sastavu pronalaska. U nekim otelotvorenjima, linker može biti multivalentni linker koji olakšava multivalentni prikaz analoga toksinskih peptida ovog pronalaska; multivalentni prikaz takvih biološki aktivnih jedinjenja može povećati afinitet i/ili potenciju vezivanja kroz aviditet. In vivo svojstva terapijskog agensa mogu se promeniti (tj. specifično ciljanje, produženje poluvremena eliminacije, profil distribucije, itd.) putem konjugacije sa polimerom ili proteinom.
[0216] Peptidilni linkeri. Kao što je gore navedeno, deo linkera, ako je prisutan (bilo u okviru primarne aminokiselinske sekvence analoga toksin peptida, ili kao linker za pričvršćivanje dela koji produžava poluvreme eliminacije na analog toksin peptida), može biti „peptidil“ u prirodi (tj. sastavljen od aminokiselina povezanih zajedno peptidnim vezama) i sačinjen po dužini, po mogućnosti, od 1 do oko 40 aminokiselinskih ostataka, poželjnije, od 1 do oko 20 aminokiselinskih ostataka, a najpoželjnije od 1 do oko 10 aminokiselinskih ostataka. Poželjno,
4
ali ne nužno, aminokiselinski ostaci u linkeru su među dvadeset kanonskih aminokiselina, poželjnije cistein, glicin, alanin, prolin, asparagin, glutamin i /ili serin. Još poželjnije, peptidilni linker se sastoji od većine aminokiselina koje nisu sterički ometene, kao što su glicin, serin i alanin povezani peptidnom vezom. Takođe je poželjno da se, ako je prisutan, izabere peptidilni linker koji izbegava brzu proteolitičku razgradnju u cirkulaciji in vivo. Neke od ovih aminokiselina mogu biti glikozilirane, kao što dobro razumeju stručnjaci. Na primer, korisna sekvenca linkera koja čini mesto sijalizacije je X1X2NX4X5G (SEQ ID NO: 25), pri čemu su X1, X2,X4i X5svaki nezavisno bilo koji aminokiselinski ostatak.
[0217] U drugim otelotvorenjima, 1 do 40 aminokiselina dela peptidil linkera se biraju između glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina i lizina. Pođeljno, linker se sastoji od većine aminokiselina koje nisu sterički ometene, kao što su glicin i alanin. Stoga, poželjni linkeri uključuju poliglicine, poliserine i polialanine, ili kombinacije bilo kog od njih. Neki primeri peptidilnih linkera su poli(Gly)1-8, posebno (Gly)3, (Gly)4(SEQ ID NO:26), (Gly)5(SEQ ID NO:27) i (Gly)7(SEQ ID NO:28), kao i GlySer i poli(Gly)4Ser, kao što su „L15“ (GGGGSGGGGSGGGGS; SEQ ID NO:29), poly(Gly-Ala)2-4i poli(Ala)1-8. Drugi specifični primeri peptidilnih linkera uključuju (Gly)sLys (SEQ ID NO:30) i (Gly)sLysArg (SEQ ID NO:31). Drugi primeri korisnih peptidilnih linkera su: Drugi primeri korisnih peptidilnih linkera su:
(Gly)3Lys(Gly)4(SEQ ID NO:32);
(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQ ID NO:33);
(Gly)3Cys(Gly)4(SEQ ID NO:34); i
GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO:35).
[0218] Da bi se objasnila gornja nomenklatura, na primer, (Gly)3Lys(Gly)4znači Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:36). Korisne su i druge kombinacije Gly i Ala.
[0219] Ostali poželjni linkeri su oni koji su ovde identifikovani kao „L5“ (GGGGS; ili „G4S“; SEQ ID NO:37), „L10“ (GGGGSGGGGS; SEQ ID NO:38); „L20“ (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS; SEQ ID NO:39) ; „L25“ (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS; SEQ ID NO:40) i svi linkeri koji se koriste u radnim primerima u daljem tekstu.
[0220] U nekim otelotvorenjima sastava ovog pronalaska, koji se sastoje od dela peptidnog linkera, kiseli ostaci, na primer, ostaci glutamata ili aspartata, stavljaju se u aminokiselinsku sekvencu linker dela. Primeri uključuju sledeće sekvence peptidnih linkera:
GGEGGG (SEQ ID NO:41);
GGEEEGGG (SEQ ID NO:42);
GEEEG (SEQ ID NO:43);
GEEE (SEQ ID NO:44);
GGDGGG (SEQ ID NO:45);
GGDDDGG (SEQ ID NO:46);
GDDDG (SEQ ID NO:47);
GDDD (SEQ ID NO:48);
GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS (SEQ ID NO:49);
WEWEW (SEQ ID NO:50);
FEFEF (SEQ ID NO:51);
EEEWWW (SEQ ID NO:52);
EEEFFF (SEQ ID NO:53);
WWEEEWW (SEQ ID NO:54); ili
FFEEEFF (SEQ ID NO:55).
[0221] U drugim otelotvorenjima, linker predstavlja mesto fosforilacije, npr. X1X2YX4X5G (SEQ ID NO:56), pri čemu su X1, X2, X4i X5svaki nezavisno bilo koji aminokiselinski ostatak; X1X2SX4X5G (SEQ ID NO:57), pri čemu su X1, X2,X4i X5svaki nezavisno bilo koji aminokiselinski ostatak; ili X1X2TX4X5G (SEQ ID NO:58), pri čemu su X1, X2, X4i X5svaki nezavisno bilo koji aminokiselinski ostatak.
[0222] Ovde prikazani linkeri su dati kao primeri; peptidilni linkeri u okviru ovog pronalaska mogu biti mnogo duži i mogu uključivati druge ostatke. Peptidilni linker može da sadrži, npr. cistein, drugi tiol ili nukleofil za konjugaciju sa delom koji produžava poluvreme eliminacije. U drugom otelotvorenju, linker sadrži ostatak cisteina ili homocisteina, ili drugi 2-aminoetanetiolni ili 3-amino-propanetiolni deo za konjugaciju sa maleimidom, jodoacetaamidom ili tioesterom, funkcionalizovanim delom koji produžava poluvreme eliminacije.
[0223] Još jedan koristan peptidilni linker je veliki, fleksibilni linker koji se sastoji od nasumične Gly/Ser/Thr sekvence, na primer: GSGSATGGSGSTASSGSGSATH (SEQ ID NO:59) ili HGSGSATGGSGSTASSGSGSAT (SEQ ID NO:60), za koji se procenjuje da je veličine oko 1 kDa PEG molekula. Alternativno, korisni peptidilni linker može se sastojati od aminokiselinskih sekvenci za koje se u struci zna da formiraju rigidne spiralne strukture (npr. rigidni linker: -AEAAAKEAAAKEAAAKAGG-// SEQ ID NO:61). Pored toga, peptidilni linker takođe može da sadrži nepeptidilni segment kao što je alifatski molekul od 6 ugljenika formule -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-. Peptidilni linkeri se mogu izmeniti tako da formiraju derivate kao što je ovde opisano.
[0224] Nepeptidilni linkeri. Opciono, nepeptidilni linker deo je takođe koristan za konjugaciju dela koji produžava poluvreme eliminacije sa peptidnim delom konjugovanog analoga toksinskog peptida koji produžava poluvreme eliminacije. Na primer, mogu se koristiti alkilni linkeri kao što je -NH-(CH2)s-C(O)-, pri čemu je s = 2-20. Ovi alkilni linkeri mogu biti dalje supstituisani bilo kojom grupom koja nema steričko ometanje, kao što su niži alkil (npr. C1-C6), niži acil, halogen (npr. Cl, Br), CN, NH2, fenil itd. Primeri nepeptidnih linkera uključuju PEG linkere (npr. prikazani ispod):
pri čemu je n takav da linker ima molekulsku masu od oko 100 do oko 5000 Daltona (Da), poželjno oko 100 do oko 500 Da.
[0225] U jednom otelotvorenju, nepeptidilni linker je aril. Linkeri se mogu izmeniti tako da formiraju derivate na isti način kao što je ovde opisano. „Aril“ je fenil ili fenil vicinalno fuzionisan sa zasićenim, delimično zasićenim ili nezasićenim 3-, 4- ili 5-članim ugljeničnim mostom, pri čemu je fenil ili most supstituisan sa 0, 1, 2 ili 3 supstituenta izabranih između C1-8 alkila,C1-4 haloalkila ili halo. „Heteroaril“ je nezasićeni 5, 6 ili 7-člani monociklični ili delimično zasićeni ili nezasićeni 6-, 7-, 8-, 9-, 10- ili 11-člani biciklični prsten, u kojem je barem jedan prsten nesasićen, pri čemu monociklični i biciklični prstenovi sadrže 1, 2, 3 ili 4 atoma izabrana između N, O i S, pri čemu je prsten supstituisan sa 0, 1, 2 ili 3 supstituenta izabrana između C1-8 alkila, C1-4 haloalkila i halo.
[0226] Nepeptidni delovi sastava predmetnog pronalaska, kao što su nepeptidni linkeri ili nepeptidni delovi koji produžavaju poluvreme eliminacije, mogu se sintetizovati konvencionalnim organskim hemijskim reakcijama.
[0227] Ostala otelotvorenja multivalentnog linkera obuhvataju rigidno poliheterocikličko jezgro kontrolisane dužine. Linkeri su hemijski diferencirani na bilo kom kraju kako bi se prilagodili ortogonalnim hemijskim spojevima (tj. azidni „klik“, amidni spoj, formiranje tioetra alkilacijom sa maleimidom ili haloacetamidom, formiranje oksima, reduktivna aminacija, itd.).
[0228] Gorenavedeno je samo ilustrativan, a ne iscrpan tretman vrsta linkera koji se mogu opciono koristiti u skladu sa ovim pronalaskom.
Primer 1
Generisanje anti-GIPR/GLP-1 peptidnih konjugata
[0229] Anti-GIPR antitelo 2G10_LC1.003 je projektovano da ima mutaciju E70C u SEQ ID NO: 151 (laki lanac) ili da ima mutaciju E275C u SEQ ID NO: 152 (teški lanac). Bis-cisteaminkapirano Anti-GIPR Cys mAb (3-12 mg/ml IgG1 u 20 mM natrijum acetata, pH 5,0) je delimično redukovano korišćenjem 2-4 ekvivalenta trifenilfosfina-3,3 ',3"-trisulfonata na sobnoj temperaturi. Hromatografija sa izmenjivanjem katjona (CEX) je korišćena za praćenje progresije reakcije (obično završena za 1-2 sata). Oslobođeni cisteamin je očišćen iz delimično redukovanog IgG1 razmenom pufera u 20 mM natrijum acetata, pH 5,0. Rezultirajuće delimično redukovano Cys mAb bez cisteamina (3-12 mg/ml) je reoksidovano dodavanjem 4-7 ekvivalenta 4 mM dehidroaskorbinske kiseline, 0,5 M aq. Na2HPO4do pH 7,0-7,5 nakon čega sledi inkubacija na 2-8 °C. Napredak reoksidacije praćen je pomoću HPLC sa reverznom fazom. Čim je IgG1 potpuno reformisan (obično 1-3 sata), dodato je 2-3 ekvivalenta peptida bromoacetil-GLP-1 (SEQ ID NO: 129) sa C-terminalnim linkerom (SEQ ID NO: 29) i reakciona smeša je dalje inkubirana na 2-8°C. Napredak reakcije alkilacije praćen je pomoću LC/MS i/ili CEX dok se nije dobio ciljni profil odnosa peptida i antitela (PAR) (npr. ≥95% PART, <5% PAR0+PAR1). Reakciona smeša je ugašena podešavanjem pH na 5,0 pomoću sirćetne kiseline. Željeni PART anti-GIPR/GLP-1 konjugat je prečišćen korišćenjem hromatografije zasnovane na hidrofobnoj interakciji (HIC), nakon čega je obavljen UF/DF postupak za formulaciju u 10% natrijum-acetatu, 9% sukroze, pH 5,2.
�
�
[0230] „Agonist GLP-1 receptora“ ili „peptid GLP-1“ odnosi se na jedinjenja koja imaju aktivnost GLP-1 receptora. Takva primerna jedinjenja uključuju eksendine, analoge eksendina, agoniste eksendina, GLP-1(7-37), analoge GLP-1(7-37), agoniste GLP-1(7-37) i slično. Jedinjenja agonista GLP-1 receptora mogu se opciono amidirati. Termini „agonist GLP-1 receptora“ i „jedinjenje agonista GLP-1 receptora“ imaju isto značenje.
Tabela 1. Primeri sekvenci agonista GLP-1 receptora
4
Rezultati i diskusija
[0231] Uspešna specifična konjugacija sa Cys mAb proteinom (IgG1) ključna je i zavisi od mogućnosti selektivnog redukovanja („dekapiranja“) cisteinskih ostataka koji su ugrađeni u skelu IgG1 povezanu disulfidnim mostovima. Ovaj praktično izazovan proces ima za cilj da smanji samo disulfidne veze
dva projektovana cisteina u prisustvu najmanje šesnaest nativnih disulfidnih veza koje drže zajedno IgG1 tetramer. Selektivna redukcija u jednom koraku bila bi veoma poželjna, ali trenutno nije izvodljiva (slika 1). Umesto toga razvijena je neto selektivna redukcija u dva koraka (slika 2):
[0232] Korak redukcije: Cys mAb se omogućava da reaguje sa redukcionim sredstvom (obično fosfinom) kako bi se postiglo potpuno redukovanje („dekapiranje“) ugrađenih cisteinskih ostataka. Neke nativne disulfidne veze su takođe redukovane. Stepen ove neželjene sporedne reakcije u velikoj meri zavisi od reakcionih parametara, uključujući posttranslacione modifikacije (npr. identitet „kapa“) i reakcionih uslova (npr. temperatura, vrsta i količina redukcionog agensa, reakcioni pufer). Rezultat je „dekapirano“ i prekomerno redukovano Cys mAb.
[0233] Korak oksidacije: Tiolne „kape“ oslobođene u koraku redukcije moraju se očistiti pre nego što se nastavi kako bi se sprečilo neželjeno „ponovno kapiranje“ Cys mAb. Nativne disulfidne veze se zatim obnavljaju u prisustvu oksidansa (obično dehidroaskorbinske kiseline).
[0234] Ovaj protokol u dva koraka generiše „dekapirani“ Cys mAb protein spreman za konjugaciju specifičnu za mesto putem S-alkilacione reakcije (slika 3).
[0235] Da bi se postigao praktično homogen Cys mAb konjugat (PART; odnos peptida i antitela 2), neophodno je zadržati prekomernu redukciju na minimum, jer obnavljanje nativnih disulfidnih veza oksidacijom nije savršeno. S druge strane, nedovoljna redukcija je podjednako nepoželjna jer dovodi do nedovoljno alkilisanih nečistoća (PAR1, PAR0). Optimalni redukcioni profil koji se sastoji od potpunog dekapiranja sa minimalnom prekomernom redukcijom zahteva pravilnu kombinaciju nekoliko parametara:
Pozitivno naelektrisana cisteinska „kapa“ (npr. cisteamin, CA) mora biti uparena sa negativno naelektrisanim reducentom. Utvrđeno je da je trifenilfosfin-3,3 ',3"-trisulfonat (TPPTS) posebno efikasan. Ostali anjonski fosfini, npr. TCEP, TPPDS su bili funkcionalni, ali su njihove performanse bile inferiorne u odnosu na TPPTS (slika ). Neusklađeni parovi npr. merkaptoetansulfonat (MES, negativno naelektrisana „kapa“) i tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP, negativno naelektrisani redukcioni agens) doveli su do sporih, neselektivnih i/ili nepotpunih reakcija (slika 4).
[0236] Reakcioni puferi moraju biti niske jonske čvrstoće (npr.20 mM natrijum acetata) kako bi se maksimizirale atraktivne Coulombic interakcije između suprotno naelektrisanih reakcionih partnera (npr. pozitivno naelektrisani cisteamin-kapirani IgG1 i negativno naelektrisani TPPTS). Povećanje jonske čvrstoće reakcionog medija čini redukciju sporom i neselektivnom (slika ).
[0237] Reakciona pH vrednost mora biti dovoljno niska (npr. pH 5) da oslobođeni tioli („kape“) ne prolaze kroz sekundarne sporedne reakcije, npr. razmena disulfida sa nativnim disulfidima IgG1.
[0238] Pravilna kombinacija gorenavedenih varijabli omogućava potpuno dekapiranje koristeći samo mali višak redukcionog agensa (npr. 1,5 ekvivalenta viška, ukupno 3,5 ekvivalenata po Cys mAb), što dovodi do minimalno prekomerne redukcije. Takav minimalni stepen prekomerne redukcije se lako koriguje u sledećem koraku oksidacije koristeći dehidroaskorbinsku kiselinu (DHAA, npr.4-6 ekvivalenata) kao blagi oksidans. Rezultirajući praktično homogeni „dekapirani“ Cys-mAb se može čisto alkilisati koristeći samo mali višak (npr. 0,2 ekvivalenta viška, ukupno 2,2 ekvivalenta po Cys-mAb) bromoacetamida (npr. derivati bromoacetamida sintetičkih peptida) da bi se priuštio ≥95% konjugata PAR2 (slika ).

Claims (24)

Patentni zahtevi
1. Metoda za pripremu konjugata antitela ili konjugata fragmenta antitela, koja obuhvata korake:
a) dobijanja sastava koji se sastoji od antitela ili fragmenta antitela;
b) izlaganja antitela ili fragmenta antitela agensu za blokiranje cisteina, pri čemu je agens za blokiranje cisteina cisteamin, i agens za blokiranje cisteina formira stabilan mešoviti disulfid sa najmanje jednim cisteinskim ostatkom antitela ili fragmenta antitela;
c) dodavanja redukcionog agensa u sastav da bi se formirala redukciona smeša i omogućila reakcija redukcije tako da redukciona smeša sadrži redukovano antitelo ili redukovani fragment antitela, pri čemu je redukcioni agens trifenilfosfin-3,3 ',3"-trisulfonat („TPPTS“);
d) dodavanja oksidacionog agensa u redukcionu smešu kako bi se formirala oksidovana smeša i omogućila oksidaciona reakcija tako da oksidaciona smeša sadrži oksidovano antitelo ili fragment oksidovanog antitela; i
e) dodavanja aktiviranog hemijskog dela u oksidovanu smešu kako bi se formirala konjugaciona smeša i omogućila reakcija konjugacije tako da se formira konjugat antitela ili konjugat fragmenta antitela.
2. Metoda prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je mešoviti disulfid antitelo ili fragment antitela sa kapiranim slobodnim cisteinom.
3. Metoda prema patentnom zahtevu 1, pri čemu se nakon koraka b) i pre koraka c) vrši hromatografija sa izmenjivanjem katjona kako bi se uklonio višak agensa za blokiranje cisteina.
4. Metoda prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je odnos redukujućeg agensa i antitela ili fragmenta antitela 2 do 4:1 (mol/mol).
5. Metoda prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, pri čemu se nakon koraka c) i pre koraka d) vrši korak razmene pufera kako bi se uklonio redukujući agens.
6. Metoda prema patentnom zahtevu 5, pri čemu je korak razmene pufera ultrafiltracija/dijafiltracija.
7. Metoda prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, pri čemu je oksidacioni agens dehidroaskorbinska kiselina („DHAA“).
8. Metoda prema patentnom zahtevu 7, pri čemu je odnos oksidacionog agensa i antitela ili fragmenta antitela 3 prema 6:1 (mol/mol).
9. Metoda prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, pri čemu je aktivirani hemijski deo peptid koji se sastoji od halogena, pri čemu se halogen bira iz grupe koja se sastoji od Br, I i Cl.
10. Metoda prema patentnom zahtevu 9, pri čemu je odnos aktiviranog hemijskog dela i antitela ili fragmenta antitela 2 do 3:1 (mol/mol).
11. Metoda prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, pri čemu se nakon koraka e) vrši korak prečišćavanja kako bi se uklonio aktivirani hemijski deo.
12. Metoda prema patentnom zahtevu 11, pri čemu korak prečišćavanja uključuje hidrofobnu interakcionu hromatografiju
ultrafiltraciju/dijafiltraciju ili hidrofobnu interakcionu hromatografiju
praćenu ultrafiltracijom/dijafiltracijom.
13. Metoda za pripremu konjugata antitela ili konjugata fragmenta antitela, koja obuhvata korake:
a) dobijanja sastava koji se sastoji od mešovitog disulfida koji se sastoji od antitela ili fragmenta antitela sa kapiranim slobodnim cisteinom koji se sastoji od cisteaminske kape;
b) dodavanja redukcionog agensa u sastav da bi se formirala redukciona smeša i omogućila reakcija redukcije tako da redukciona smeša sadrži redukovano antitelo ili redukovani fragment antitela, pri čemu je redukcioni agens trifenilfosfin-3, 3', 3''-trisulfonat („TPPTS“);
c) dodavanja oksidacionog agensa u redukcionu smešu kako bi se formirala oksidovana smeša i omogućila oksidaciona reakcija tako da oksidaciona smeša sadrži oksidovano antitelo ili fragment oksidovanog antitela; i
d) dodavanja aktiviranog hemijskog dela u oksidovanu smešu kako bi se formirala konjugaciona smeša i omogućila reakcija konjugacije tako da se formira konjugat antitela ili konjugat fragmenta antitela.
14. Metoda prema patentnom zahtevu 13, pri čemu se nakon koraka a) i pre koraka b) vrši hromatografija sa izmenjivanjem katjona kako bi se uklonio višak agensa za blokiranje cisteina.
15. Metoda prema patentnom zahtevu 13, pri čemu je odnos redukujućeg agensa i antitela ili fragmenta antitela 2 do 4:1 (mol/mol).
16. Metoda prema bilo kom od patentnih zahteva 13-15, pri čemu se nakon koraka b) i pre koraka c) vrši korak razmene pufera kako bi se uklonio redukujući agens.
17. Metoda prema patentnom zahtevu 16, pri čemu je korak razmene pufera ultrafiltracija/dijafiltracija.
18. Metoda prema bilo kom od patentnih zahteva 13-17, pri čemu je oksidacioni agens dehidroaskorbinska kiselina („DHAA“).
19. Metoda prema patentnom zahtevu 18, pri čemu je odnos oksidacionog agensa i antitela ili fragmenta antitela 3 prema 6:1 (mol/mol).
20. Metoda prema bilo kom od patentnih zahteva 13-19, pri čemu je aktivirani hemijski deo peptid koji se sastoji od halogena, pri čemu se halogen bira iz grupe koja se sastoji od Br, I i Cl.
21. Metoda prema patentnom zahtevu 20, pri čemu je odnos aktiviranog hemijskog dela i antitela ili fragmenta antitela 2 do 3:1 (mol/mol).
22. Metoda prema bilo kom od patentnih zahteva 13-21, pri čemu se nakon koraka d) vrši korak prečišćavanja kako bi se uklonio aktivirani hemijski deo.
23. Metoda prema patentnom zahtevu 22, pri čemu korak prečišćavanja uključuje hidrofobnu interakcionu hromatografiju
ultrafiltraciju/dijafiltraciju ili hidrofobnu interakcionu hromatografiju
praćenu ultrafiltracijom/dijafiltracijom.
24. Metoda prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, pri čemu antitelo ili fragment antitela sadrži cisteinski ostatak na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od D70 lakog lanca antitela u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO: 7; E276 teškog lanca antitela u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO: 8; i T363 teškog lanca antitela u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO: 8.
RS20241377A 2017-08-04 2018-08-03 Metod konjugacije cys-mab RS66295B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762541522P 2017-08-04 2017-08-04
PCT/US2018/045212 WO2019028382A1 (en) 2017-08-04 2018-08-03 CYS-MABS CONJUGATION METHOD
EP18759787.7A EP3661562B1 (en) 2017-08-04 2018-08-03 Method of conjugation of cys-mabs

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66295B1 true RS66295B1 (sr) 2025-01-31

Family

ID=63371775

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20241377A RS66295B1 (sr) 2017-08-04 2018-08-03 Metod konjugacije cys-mab

Country Status (19)

Country Link
US (2) US12594342B2 (sr)
EP (2) EP3661562B1 (sr)
JP (2) JP7504025B2 (sr)
AU (1) AU2018309090B2 (sr)
CA (1) CA3071852A1 (sr)
DK (1) DK3661562T3 (sr)
ES (1) ES2997332T3 (sr)
FI (1) FI3661562T3 (sr)
HR (1) HRP20241422T1 (sr)
HU (1) HUE069142T2 (sr)
LT (1) LT3661562T (sr)
MA (1) MA68842B1 (sr)
MX (2) MX2020001327A (sr)
PL (1) PL3661562T3 (sr)
PT (1) PT3661562T (sr)
RS (1) RS66295B1 (sr)
SI (1) SI3661562T1 (sr)
SM (1) SMT202400503T1 (sr)
WO (1) WO2019028382A1 (sr)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA127495C2 (uk) * 2015-12-23 2023-09-13 Амджен Інк. Виділений антигензв'язуючий білок, який специфічно зв'язується з поліпептидом рецептора шлункового інгібіторного пептиду (gipr) людини, та фармацевтична композиція, яка його містить
IL313587A (en) 2017-01-17 2024-08-01 Amgen Inc Method of treating or ameliorating metabolic disorders using glp-1 receptor agonists conjugated to antagonists for gastric inhibitory peptide receptor (gipr)
LT3661562T (lt) 2017-08-04 2024-10-25 Amgen Inc. Cys-mab konjugavimo būdas
EP4577552A4 (en) * 2022-08-22 2026-02-25 Suzhou Bioreinno Biotechnology Ltd Company NEW THIOL REDUCER, PROCESS AND ITS USE
WO2025038435A1 (en) * 2023-08-11 2025-02-20 Amgen Inc. Methods of solid phase antibody conjugation
WO2025092705A1 (zh) * 2023-10-31 2025-05-08 山东博安生物技术股份有限公司 Gipr阻断型抗体及其抗体偶联物
WO2025167838A1 (en) * 2024-02-08 2025-08-14 Suzhou Bioreinno Biotechnology Limited Company Antibodies, antibody-drug conjugates, and producing methods thereof
WO2025184315A1 (en) * 2024-02-29 2025-09-04 Amgen Inc. Glucagon receptor agonists, conjugated to glucose-dependent insulinotropic polypeptide antibodies

Family Cites Families (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
EP0281604B1 (en) 1986-09-02 1993-03-31 Enzon Labs Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5011912A (en) 1986-12-19 1991-04-30 Immunex Corporation Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system
US4965195A (en) 1987-10-26 1990-10-23 Immunex Corp. Interleukin-7
US4968607A (en) 1987-11-25 1990-11-06 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
AU643427B2 (en) 1988-10-31 1993-11-18 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5683888A (en) 1989-07-22 1997-11-04 University Of Wales College Of Medicine Modified bioluminescent proteins and their use
US5292658A (en) 1989-12-29 1994-03-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center Cloning and expressions of Renilla luciferase
WO1996033735A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6713610B1 (en) 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
WO1991018982A1 (en) 1990-06-05 1991-12-12 Immunex Corporation Type ii interleukin-1 receptors
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
ES2142801T3 (es) 1991-03-11 2000-05-01 Univ Georgia Res Found Clonacion y expresion de luciferasa de renilla.
EP0590076A4 (en) 1991-06-14 1997-02-12 Dnx Corp Production of human hemoglobin in transgenic pigs
CA2113113A1 (en) 1991-07-08 1993-01-21 Simon W. Kantor Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
US6342225B1 (en) 1993-08-13 2002-01-29 Deutshces Wollforschungsinstitut Pharmaceutical active conjugates
EP0759170B1 (en) 1993-09-10 2008-07-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green fluorescent protein
WO1995021191A1 (en) 1994-02-04 1995-08-10 William Ward Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein
JPH09509428A (ja) 1994-02-23 1997-09-22 カイロン コーポレイション 薬理学的に活性な薬剤の血清半減期を増加させるための方法および組成物
US5777079A (en) 1994-11-10 1998-07-07 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US5804387A (en) 1996-02-01 1998-09-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP)
US5876995A (en) 1996-02-06 1999-03-02 Bryan; Bruce Bioluminescent novelty items
US5925558A (en) 1996-07-16 1999-07-20 The Regents Of The University Of California Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates
US5976796A (en) 1996-10-04 1999-11-02 Loma Linda University Construction and expression of renilla luciferase and green fluorescent protein fusion genes
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
IL129767A0 (en) 1996-12-12 2000-02-29 Prolume Ltd Apparatus and method for detecting and identifying infectious agents
CA2196496A1 (en) 1997-01-31 1998-07-31 Stephen William Watson Michnick Protein fragment complementation assay for the detection of protein-protein interactions
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
JP2002507410A (ja) 1998-03-27 2002-03-12 プロルーム・リミテッド ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質をコードする核酸および、診断、高処理スクリーニングおよび新規アイテムにおけるその使用
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6887470B1 (en) 1999-09-10 2005-05-03 Conjuchem, Inc. Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components
EP2213743A1 (en) 2000-04-12 2010-08-04 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
AU2002335930B2 (en) 2001-03-09 2005-07-28 Morphosys Ag Serum albumin binding moieties
US20050054051A1 (en) 2001-04-12 2005-03-10 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
JP4942643B2 (ja) * 2004-03-02 2012-05-30 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 部分的に付加された抗体およびそれらの結合体化方法
US20090041744A1 (en) 2005-06-17 2009-02-12 Novo Nordisk Healthcare A/G Dimeric and Multimeric FVIIa Compounds
ES2553160T3 (es) 2005-06-17 2015-12-04 Novo Nordisk Health Care Ag Reducción y derivatización selectivas de proteínas Factor VII transformadas por ingeniería que comprenden al menos una cisteína no nativa
CL2008001334A1 (es) 2007-05-08 2008-09-22 Genentech Inc Anticuerpo anti-muc16 disenado con cisteina; conjugado que lo comprende; metodo de produccion; formulacion farmaceutica que lo comprende; y su uso para tratar el cancer.
EP2176295B1 (en) * 2007-07-16 2014-11-19 Genentech, Inc. Humanized anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
EP2711018A1 (en) * 2009-06-22 2014-03-26 MedImmune, LLC Engineered Fc regions for site-specific conjugation
EP2595661A1 (en) 2010-07-22 2013-05-29 Novo Nordisk Health Care AG Growth hormone conjugates
EP3079722B1 (en) * 2013-12-13 2021-03-24 Novo Nordisk Health Care AG Method for thioether conjugation of proteins
KR20230088389A (ko) * 2014-02-11 2023-06-19 씨젠 인크. 단백질의 선택적 환원
SG11201701128YA (en) * 2014-09-12 2017-03-30 Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates
GB201419185D0 (en) 2014-10-28 2014-12-10 Adc Biotechnology Ltd Method of synthesising ADCs using affinity resin
AR103172A1 (es) 2014-12-22 2017-04-19 Novartis Ag Reducción selectiva de residuos de cisteina en anticuerpos il-17
RU2021101009A (ru) 2015-08-12 2021-02-20 Пфайзер Инк. Кэпированные и некэпированные цистеины антитела, и их применение в конъюгации антитело - лекарственное средство
EP3355931B1 (en) * 2015-10-01 2024-06-26 Novo Nordisk A/S Protein conjugates
UA127495C2 (uk) * 2015-12-23 2023-09-13 Амджен Інк. Виділений антигензв'язуючий білок, який специфічно зв'язується з поліпептидом рецептора шлункового інгібіторного пептиду (gipr) людини, та фармацевтична композиція, яка його містить
CA3026139C (en) 2016-02-12 2023-09-12 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Selective reduction of cysteine-engineered antibodies
UY37376A (es) * 2016-08-26 2018-03-23 Amgen Inc Construcciones de arni para inhibir expresión de asgr1 y métodos para su uso
IL313587A (en) * 2017-01-17 2024-08-01 Amgen Inc Method of treating or ameliorating metabolic disorders using glp-1 receptor agonists conjugated to antagonists for gastric inhibitory peptide receptor (gipr)
LT3661562T (lt) 2017-08-04 2024-10-25 Amgen Inc. Cys-mab konjugavimo būdas

Also Published As

Publication number Publication date
EP3661562A1 (en) 2020-06-10
MA68842B1 (fr) 2025-01-31
HUE069142T2 (hu) 2025-02-28
WO2019028382A1 (en) 2019-02-07
US12594342B2 (en) 2026-04-07
PT3661562T (pt) 2024-12-13
DK3661562T3 (da) 2024-12-16
CA3071852A1 (en) 2019-02-07
JP2020529986A (ja) 2020-10-15
ES2997332T3 (en) 2025-02-17
SI3661562T1 (sl) 2025-01-31
US20260034235A1 (en) 2026-02-05
AU2018309090B2 (en) 2023-03-30
SMT202400503T1 (it) 2025-01-14
HRP20241422T1 (hr) 2025-01-03
JP2024095687A (ja) 2024-07-10
MX2020001327A (es) 2020-03-20
PL3661562T3 (pl) 2025-02-24
EP3661562B1 (en) 2024-10-02
EP4464719A2 (en) 2024-11-20
FI3661562T3 (fi) 2024-12-09
AU2018309090A1 (en) 2020-02-20
US20210346513A1 (en) 2021-11-11
EP4464719A3 (en) 2025-03-05
JP7504025B2 (ja) 2024-06-21
LT3661562T (lt) 2024-10-25
MX2025000220A (es) 2025-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7504025B2 (ja) Ｃｙｓ－ｍａｂのコンジュゲーション方法
CN109476736B (zh) 结合间皮素和cd3的双特异性抗体构建体
CA2956000C (en) An anti-ctla4 monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, a pharmaceutical composition and use
TWI886677B (zh) 雙特異性抗體產品之連續製造製程
CN110582297B (zh) 包含T细胞接合抗体构建体的低pH药物组合物
CA3082297A1 (en) Molecules that bind to cd137 and psma
JP7250706B2 (ja) 胃抑制ペプチド受容体（ｇｉｐｒ）に対するアンタゴニスト結合タンパク質／ｇｌｐ－１受容体アゴニスト融合タンパク質を使用した代謝障害の治療又は寛解方法
CN105829343A (zh) Gitr抗原结合蛋白
WO2024046239A1 (zh) 靶向人gprc5d的重组人源化单克隆抗体及其应用
JP2003284577A (ja) 癌マーカー用生物合成結合蛋白質
JP2014518640A (ja) β−クロトおよびＦＧＦ受容体を含む複合体に結合するヒト抗原結合タンパク質
JP2013523184A (ja) ヒトＦＧＦ受容体およびβ−ＫＬＯＴＨＯ結合性タンパク質
CN109641037A (zh) 抗psma抗体及其用途
US20250197518A1 (en) Bispecific antibodies with cleavable c-terminal charge-paired tags
KR20250166188A (ko) Tnfr2 결합 폴리펩타이드 및 이의 용도의 방법
US20250108121A1 (en) Method for producing an antibody peptide conjugate
CN120399078B (zh) 靶向cd117的纳米抗体及其应用
CN120399079B (zh) 靶向cd90的纳米抗体及其应用
JP7691977B2 (ja) 抗ｔｉｒｃ７抗原結合タンパク質
TW202421650A (zh) 雙特異性分子穩定組成物