RS66465B1

RS66465B1 - Inhibitorna monoklonska antitela protiv faktora xii/xiia i njihove upotrebe

Info

Publication number: RS66465B1
Application number: RS20250129A
Authority: RS
Inventors: Con Panousis; Veronika Rayzman; Andrew Nash; Michael Wilson; Stefan Schmidbauer; Marc Nolte
Original assignee: Csl Behring Gmbh; Csl Ltd
Priority date: 2011-07-22
Filing date: 2012-07-20
Publication date: 2025-02-28
Also published as: JP6253578B2; AU2012289001B2; SMT202500041T1; CA2841185A1; KR20140054112A; PT2734552T; EP2734552A1; BR112014001104A2; US9856326B2; CA2841185C; HUE070002T2; WO2013014092A1; US9518127B2; FR25C1026I1; HK1198334A1; MX347454B; EP2734552B1; US20140199361A1; CN103687878A; FI2734552T3

Description

Opis

[0001] Pronalazak se odnosi na inhibitorna antitela protiv faktora XII/FXIIa i postupke njihove upotrebe.

[0002] Faktor XII (Hageman faktor) je serumski glikoprotein sa molekulskom težinom od oko 80 kDa. Pored autoaktivacije izlaganjem negativno naelektrisanim površinama, faktor XII se dodatno aktivira kalikreinom proteolitičkim cepanjem da bi se formirao alfa-faktor XIIa, koji se zatim dalje pretvara, na primer tripsinom, u beta-faktor XIIa (XIIa-β). Alfa-faktor XIIa je sastavljen od N-terminalnog teškog lanca od oko 50 kDa, koji sadrži kontaktni vezujući domen, i C-terminalnog lakog lanca od oko 28 kDa, koji sadrži katalitički centar. Teški i laki lanci su povezani disulfidnom vezom. FXIIa-β je aktivni oblik FXII od oko 30 kDa, koji se sastoji od kompletnog lakog lanca i 2000 Da fragmenta teškog lanca povezanog disulfidnom vezom.

[0003] Povreda zida krvnih sudova izaziva iznenadnu adheziju i agregaciju krvnih pločica, što je praćeno aktivacijom sistema koagulacije plazme i stvaranjem tromba koji sadrži fibrin, koji začepljuje mesto povrede. Ovi događaji su ključni za ograničavanje posttraumatskog gubitka krvi, ali takođe mogu začepiti obolele sudove što dovodi do ishemije i infarkta vitalnih organa. U modelu vodopada, koagulacija krvi se odvija nizom reakcija koje uključuju aktivaciju zimogena ograničenom proteolizom koja kulminira stvaranjem trombina, koji pretvara fibrinogen plazme u fibrin i aktivira trombocite. Zauzvrat, trombociti adherentni na kolagen ili fibrin olakšavaju stvaranje trombina za nekoliko redova veličine izlaganjem prokoagulantnih fosfolipida (uglavnom fosfatidil serina) na njihovoj spoljašnjoj površini, koji širi sklapanje i aktivaciju kompleksa koagulacionih proteaza i direktnom interakcijom između receptora trombocita i faktora koagulacije.

[0004] Postoje dva konvergentna puta za koagulaciju koja su pokrenuta ili ekstrinzičnim (zid krvnih sudova) ili intrinzičnim (krvlju) komponentama vaskularnog sistema. „Spoljašnji“ put je iniciran kompleksom faktora plazme VII (FVII) sa integralnim membranskim proteinskim faktorom tkiva (TF), esencijalnim koagulacionim kofaktorom koji je odsutan na luminalnoj površini, ali je snažno eksprimiran u subendotelnim slojevima suda i koji je dostupan ili oslobođen povredom tkiva. TF eksprimiran u cirkulirajućim mikrovezikulama takođe može doprineti širenju tromba održavanjem stvaranja trombina na površini aktiviranih trombocita.

„Intrinzični“ ili kontaktni aktivacioni put se pokreće kada faktor XII (FXII, Hagemanov faktor) dođe u kontakt sa negativno naelektrisanim površinama u reakciji koja uključuje kininogen visoke molekularne težine i kalikrein u plazmi. FXII se može aktivirati makromolekularnim sastojcima subendotelnog matriksa kao što su glikozaminoglikani i kolageni, sulfatidi, nukleotidi, polifosfati i drugi rastvorljivi polianjoni ili nefiziološki materijali kao što su staklo ili polimeri. Jedan od najmoćnijih aktivatora kontakta je kaolin i ova reakcija služi kao mehanička osnova za glavni klinički test zgrušavanja, aktivirano parcijalno tromboplastinsko vreme (aPTT), koje meri kapacitet koagulacije preko „intrinzičnog” puta. U reakcijama koje se razmnožavaju trombocitima, aktivirani FXII zatim aktivira FXI u FXIa i nakon toga FXIa aktivira faktor IX. Kompleks FVIIIa, koji je FVIIIa prethodno aktiviran tragovima FXa i/ili trombina, i FIXa (tenazni kompleks) naknadno aktivira FX.

[0005] Uprkos njegovoj visokoj moći da indukuje zgrušavanje krvi in vitro, (pato-)fiziološki značaj intrinzičnog puta koagulacije izazvanog FXII doveden je u pitanje činjenicom da nasledni nedostaci FXII, kao i kininogena visoke molekularne težine i kalikreina u plazmi nisu povezani sa komplikacijama krvarenja. Zajedno sa zapažanjem da ljudi i miševi kojima nedostaju sastojci ekstrinzičnog puta kao što su TF i FVII pate od teškog krvarenja, ovo je dovelo do trenutne hipoteze da je za prestanak krvarenja in vivo potrebna isključivo ekstrinzična kaskada (Mackman, N.2004. Role of tissue factor in hemostasis, thrombosis, and vascular development. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.24, 1015-1 022).

[0006] U patološkim stanjima, kaskada koagulacije može se aktivirati neadekvatno, što onda dovodi do stvaranja hemostatskih čepova unutar krvnih sudova. Na taj način se mogu začepiti sudovi i ograničiti dotok krvi u distalne organe. Ovaj proces je poznat kao tromboza, a ako se tromb emboliše, kao tromboembolija koja je povezana sa visokim mortalitetom. Pored toga, upotreba protetičkih uređaja koji dolaze u kontakt sa krvlju je ozbiljno ograničena zbog aktivacije kaskade unutrašnje koagulacije. Odgovarajući premaz površine proteze može izbeći pomenuti problem u nekim slučajevima, ali može ugroziti njenu funkciju u drugim. Primeri takvih protetskih uređaja su hemodijalizatori, kardiopulmonalni bajpas krugovi, srčani zalisci, vaskularni stentovi i stalni kateteri. U slučajevima kada se koriste takvi uređaji, primenjuju se antikoagulansi, kao što je heparin, da bi se sprečilo stvaranje fibrina na površini. Međutim, neki pacijenti ne podnose heparin, što može izazvati heparinom indukovanu trombocitopeniju (HIT) koja rezultira agregacijom trombocita i trombozom opasnom po život. Pored toga, inherentni nedostatak svih antikoagulansa koji se koriste u klinikama je povećan rizik od ozbiljnih događaja krvarenja. Stoga postoji jaka potreba za novim tipovima antikoagulansa, koji nisu povezani sa ovakvim komplikacijama i koji se mogu koristiti kod obolelih pacijenata ili kao bolji koncept profilakse/terapije koji sprečava trombozu bez povećanog rizika od krvarenja.

[0007] Više od pet decenija poznato je da nedostatak faktora koagulacije XII nije povezan sa povećanim spontanim komplikacijama krvarenja ili povredama (Ratnoff OD & Colopy JE 1955. A familial hemorrhagic trait associated with a deficiency of a clot-promoting fraction of plasma. J Clin Invest 34:602-613). Zaista, iako se lako detektuju patološkom vrednošću merenom u aPTT (klinički test zgrušavanja koji se bavi intrinzičnim putem koagulacije), ljudi koji imaju manjak FXII ne pate od abnormalnog krvarenja čak ni tokom velikih hirurških zahvata (Colman RW. Hemostasis and Thrombosis. Basic principles & clinical practice (eds. Colman RW, Hirsch J, Mader VJ, Clowes AW, & George J) 103-122 (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2001)). Nasuprot tome, nedostatak FXII je bio povezan sa povećanim rizikom od venske tromboze (Kuhli C et al.2004. Factor XII deficiency: a thrombophilic risk factor for retinal vein occlusion. Am. J. Ophthalmol.137:459-464; Halbmayer WM et al.1993. Factor XII (Hageman factor) deficiency: a risk factor for development of thromboembolism. Incidence of FXII deficiency in patients after recurrent venous or arterial thromboembolism and myocardial infarction. Wien. Med. Wochenschr. 143:43-50). Studije i izveštaji o slučajevima koji podržavaju ovu ideju odnose se na indeksni slučaj nedostatka FXII, gospodina Džona Hagemana, koji je umro od plućne embolije. Hipoteza da je nedostatak FXII povezan sa povećanim protrombotičkim rizikom osporava se nedavnom ponovnom procenom nekoliko izveštaja o slučajevima čiji su originalni izveštaji povezivali nedostatak FXII sa trombozom (Girolami A et al. 2004. The occasional venous thromboses seen in patients with severe (homozygous) FXII deficiency are probably due to associated risk factors: A study of prevalence in 21 patients and review of the literature. J. Thromb. Thrombolysis 17:139-143). U većini slučajeva autori su identifikovali istovremene urođene ili stečene protrombotičke faktore rizika u kombinaciji sa nedostatkom faktora FXII koji bi mogli biti odgovorni za trombotički događaj nezavisno od FXII. Najveće epidemiološke studije koje su koristile dobro okarakterisane pacijente (Koster T et al. 1994. John Hageman's factor and deep-vein thrombosis: Leiden thrombophilia Study. Br. J. Haematol. 87:422-424) and FXII-deficient families (Zeerleder S et al. 1999. Reevaluation of the incidence of thromboembolic complications in congenital factor XII deficiency - a study on 73 subjects from 14 Swiss families. Thromb. Haemost.82:1240-1246) ukazuju da ne postoji korelacija između nedostatka FXII i bilo kakvog pro- ili antitrombotičkog rizika.

[0008] Iznenađujuće i suprotno uobičajenom verovanju stručnjaka u ovoj oblasti, otkriveno je da je intrinzični put koagulacije vođen faktorom XII uključen u formiranje arterijskog tromba in vivo, ali nije neophodan za normalnu hemostazu specifičnu za tkivo (Renne T et al. 2005. Defective thrombus formation in mice lacking factor XII. J. Exp. Med. 202:271-281; Kleinschnitz C et al. 2006. Targeting coagulation factor XII provides protection from pathological thrombosis in cerebral ischemia without interfering with hemostasis. J. Exp. Med.

203, 513-518; WO2006066878). Neočekivano, ovi rezultati postavljaju faktor XII u centralnu poziciju u procesu formiranja patološkog tromba. Stoga supstance koje mogu da ometaju i blokiraju aktivaciju FXII ili aktivnost FXII mogu biti prikladne da blokiraju stvaranje patogenog arterijskog tromba i njegove kliničke posledice.

[0009] U WO2006066878 predlaže se upotreba antitela protiv FXII/FXIIa ili upotreba inhibitora FXII/FXIIa. Kao potencijalni inhibitori predloženi su antitrombin III (AT III), inhibitor angiotenzin konvertujućeg enzima, inhibitor C1, aprotinin, inhibitor alfa-I proteaze, antipain ([(S)-I-karboksi-2-feniletil]-karbamoil-L-Arg-L-Val-Arginal), Z-Pro-Proaldehiddimetil acetat, DX88 (Dyax Inc., 300 Technology Square, Cambridge, MA 02139, USA; citirano u: Williams A and Baird LG.2003. DX-88 and HAE: a developmental perspective. Transfus Apheresis Sci. 29:255-258), leupeptin, inhibitori prolil oligopeptidaze kao što je Fmoc-Ala-Pir-CN, inhibitor kukuruznog tripsina, mutanti inhibitora goveđeg pankreasnog tripsina, ekotin, jedini antikoagulantni protein žutoperke, Cucurbita maxima inhibitor tripsina-V uključujući Curcurbita maxima izoinhibitore i Hamandarin (kako je otkriveno od Isawa H et al. 2002. A mosquito salivary protein inhibits activation of the plasma contact system by binding to factor XII and high molecular weight kininogen. J. Biol. Chem.277:27651-27658).

[0010] Idealan inhibitor FXII/FXIIa kao terapeutsko sredstvo - dok ispoljava visoku inhibitornu aktivnost prema FXII/FXIIa - neće povećati rizik od krvarenja, biti neimunogen i mora se primenjivati što je štedljivije moguće - idealno samo jednom. Inhibitori malih molekula kao što je Z-Pro-Pro-aldehid-dimetil acetat će imati samo veoma kratak polu-život nakon primene, što zahteva višestruke injekcije, ili će se morati razviti u oralno dostupne oblike sa sporim oslobađanjem, a zatim će se davati stalno tokom dugog period. Proteini ljudske plazme kao što je inhibitor C1 bi na prvi pogled ispunili sve zahteve, imaju relativno visoku inhibitornu aktivnost prema FXII/FXIIa, a da pritom ne povećavaju rizik od krvarenja, nisu imunogeni kao humani protein i takođe imaju znatno dugi poluživot u plazmi. Sada je iznenađujuće otkriveno da u in vivo modelu inhibitora tromboze C1 kao glavnog kandidata za inhibitor humanog FXII/FXIIa ne može biti uspešno korišćen za sprečavanje okluzije. Drugi predloženi inhibitor FXII/FXIIa iz humane plazme, odnosno inhibitor AT III, barem ne bi ispunio drugi zahtev jer bi se rizik od krvarenja povećao (Warren BL et al. 2001. Caring for the critically ill patient.

High-dose antithrombin III in severe sepsis: a randomized controlled trial. JAMA 286:1869-1878).

[0011] U WO2008098720A1 predlaže se upotreba inhibitora serinske proteaze Kazal tipa Infestina ili njegovih domena ili modifikovanih inhibitora serinske proteaze Kazal tipa na osnovu Infestin homologa kao inhibitora FXII/FXIIa. Odabran iz ove podgrupe, razvijen je rekombinantni Infestin-4 fuzionisan sa humanim albuminom za produženje poluživota (rHA-Infestin-4) koji pokazuje visoku inhibitornu aktivnost prema FXII/FXIIa. Pored toga, ova supstanca je pokazala antitrombotičku efikasnost bez narušavanja (fiziološke) hemostaze dok je demonstrirala korisni poluživot nakon fuzije sa humanim albuminom (Hagedorn et al.2010. Factor XIIa Inhibitor Recombinant Human Albumin Infestin-4 Abolishes Occlusive Arterial Thrombus Formation Without Affecting Bleeding. Circulation.121:1510-1517). Međutim, iako je imunogenost smanjena tokom razvoja, i dalje postoji rizik od imunogenih odgovora kod čoveka. Pored toga, još duži poluživot bi imao dodatne korisne efekte. Otuda je očigledno da još uvek postoji potreba za poboljšanim lekovima za lečenje i/ili profilaksu tromboze i sličnih poremećaja. Stoga je cilj ovog pronalaska da zadovolji takvu potrebu. Kandidat za takav poboljšani lek je poboljšano anti-FXII/FXIIa antitelo sa inhibitornom aktivnošću.

[0012] Otkrivena su antitela na faktor XII. Pixley et al ((J Biol Chem (1987) 262, 10140-10145) disclosed monoclonal antibody B7C9 to human Factor XII. This antibody blocked surfacemediated coagulant activity, but not amidolytic activity of Factor XIIa. Small et al (Blood (1985), 65, 202-210) otkrili su monoklonsko antitelo na ljudski faktor XII, koje je sprečilo aktivaciju faktora XII, ali ne i koagulans ili amidolitičku aktivnost aktiviranog FXII (FXIIa). Nuijens et al (J. Biol. Chem. (1989) 264, 12941-12949) otkrili su monoklonska antitela F1 i F3, koja inhibiraju koagulacionu aktivnost, ali ne i amidolitičku aktivnost FXII. WO8911865 obezbeđuje monoklonska antitela proizvedena protiv lakog lanca FXII (B6F5, C6B7, D2E10). Ova antitela inhibiraju koagulacionu aktivnost, ali pokazuju samo delimičnu inhibiciju amidolitičke aktivnosti FXIIa. WO9008835 opisuje proizvodnju monoklonskog antitela koje selektivno vezuje FXIIa-β u odnosu na FXII, i razvoj imunološkog testa koji specifično detektuje FXIIa-β u krvi. Iz primera 7 u WO9008835, jasno je da antitelo ne inhibira amidolitičku aktivnost FXIIa. WO9117258 opisuje lečenje sepse anti-FXII antitelom OT-2, koje se vezuje za nativni FXII u plazmi, i inhibira aktivaciju kontaktnog sistema u plazmi, kao i amidolitičku aktivnost FXIIa.

[0013] Dors et al, Thromb Haemost 1992; 67(06): 644-648 opisuje novi osetljivi test za funkcionalni faktor XII zasnovan na stvaranju kompleksa kalikrein-C1-inhibitora u plazmi sa nedostatkom faktora XII pomoću faktora XII vezanog za staklo. WO 90/08835 opisuje monoklonsko antitelo faktora koagulacije krvi XIIa β i imunotest. US 2006/024745 opisuje varijante faktora XIIa. WO 2007/122371 odnosi se na postupke prevencije arterijskih tromboza i na srodne proizvode, dijagnostičke postupke, postupke snimanja i postupke ciljnog delovanja lekova. Esnouf et al, Thromb Haemost 2000; 83(06): 874-881 opisuje monoklonsko antitelo uzgojeno protiv humanog β-faktora XIIa koje takođe prepoznaje α-faktor XIIa, ali ne i faktor XII ili komplekse faktora XIIa sa inhibitorom C1 esteraze.

[0014] Cilj ovog pronalaska je bio razvoj poboljšanog antitela koje - dok pokazuje visoku inhibitornu aktivnost prema FXIIa - neće povećati rizik od krvarenja, biti neimunogeno i imati dug polu-život. Pošto FXII ima višedomensku strukturu uključujući tip fibronektina i domene slične EGF (prikaz od Stavrou and Schmaier (2010) Thromb. Res., 125:210-215), verovalo se da FXII treba da ima dodatne važne fiziološke funkcije pored svoje uloge kao FXIIa, odnosno kao enzima nakon aktivacije. Nove studije su sada pokazale da FXII doprinosi proliferaciji i rastu ćelija što dovodi do angiogeneze (prikaz od SchmaierandLaRusch (2010) Thromb. Haemost., 104:915-918). Stoga, da ne bi ometale ove (a možda i druge do sada nepoznate) funkcije FXII, poželjno je da terapeutsko antitelo protiv FXII/FXIIa ima jasno veći afinitet prema FXIIa, na primer prema FXIIa-β, u poređenju sa FXII.

[0015] Sve reference u opisu na postupke lečenja odnose se na antitela, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom.

Rezime pronalaska

[0016] Pronalazak obezbeđuje monoklonsko antitelo protiv faktora XII/XIIa-beta ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji sadrži:

(i) varijabilni region teškog lanca (vH) sa sekvencom SEQ ID NOs: 73, 74 ili 76, i (ii) varijabilni region lakog lanca (vL) koji sadrži CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 11, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 12 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 13, pri čemu je vL region više od 85% identičan sekvenci SEQ ID NO: 5.

[0017] U nekim primerima izvođenja, vH region ima sekvencu SEQ ID NO: 73.

[0018] U nekim primerima izvođenja, vH region ima sekvencu SEQ ID NO: 74.

[0019] U nekim primerima izvođenja, vH region ima sekvencu SEQ ID NO: 76.

[0020] U nekim primerima izvođenja, antitelo je humani IgG ili njegova varijanta.

[0021] U nekim primerima izvođenja, IgG je IgG4.

[0022] U nekim primerima izvođenja, vL region je više od 94% identičan sa SEQ ID NO: 5.

[0023] U nekim primerima izvođenja, vL region je više od 96% identičan sa SEQ ID NO: 5.

[0024] Sledeći aspekt pronalaska je nukleinska kiselina koja kodira antitelo, ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, prema pronalasku.

[0025] Još jedan aspekt pronalaska je vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, iz pronalaska, operativno vezan za odgovarajuću sekvencu promotora.

[0026] Dodatni aspekt pronalaska je ćelijska linija ili ćelija kvasca koja sadrži vektor pronalaska.

[0027] Sledeći aspekt pronalaska je postupak za proizvodnju antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen prema pronalasku, koji sadrži kultivisanje ćelijske linije ili ćelije kvasca prema pronalasku pod odgovarajućim uslovima da bi se eksprimiralo antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, i prečišćavanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta iz supernatanta kulture.

[0028] Još jedan aspekt pronalaska je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema pronalasku za upotrebu u medicini.

[0029] Sledeći aspekt pronalaska je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju poremećaja izabranog iz grupe koja se sastoji od formiranja venskog, arterijskog ili kapilarnog tromba, formiranja tromba u srcu, formiranja tromba tokom i/ili nakon kontakta krvi čoveka ili životinje sa veštačkim površinama, tromboembolije, sprečavanjem formiranja i/ili stabilizacije trombova i time trodimenzionalnog rasta intraluminalnog tromba, ili sprečavanjem i/ili lečenjem intraluminalnih trombova.

[0030] Poželjno, formiranje venskog ili arterijskog tromba je moždani udar, infarkt miokarda, tromboza dubokih vena, tromboza portalne vene, tromboza bubrežne vene, tromboza jugularne vene, tromboza cerebralnog venskog sinusa, Budd-Chiari sindrom ili Paget-Schroetter-ova bolest.

[0031] Poželjno, do formiranja tromba dolazi tokom i/ili nakon kontakta krvi čoveka ili životinje sa veštačkim površinama tokom i/ili posle medicinske procedure koja je izvedena na pomenutom ljudskom ili životinjskom subjektu i navedeno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen se primenjuju pre i/ili tokom i/ili posle navedenog medicinske procedure i dodatno

(i) veštačka površina je izložena najmanje 80% zapremine krvi subjekta i veštačka površina je najmanje 0.2 m<2>ili

(ii) veštačka površina je kontejner za sakupljanje krvi izvan tela subjekta ili

(iii) veštačka površina je stent, zalistak, intraluminalni kateter ili sistem za unutrašnje potpomognuto pumpanje krvi.

[0032] Pronalazak dalje obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema pronalasku za upotrebu u prevenciji ili lečenju naslednog angioedema.

[0033] Još jedan aspekt pronalaska je medicinski uređaj obložen antitelom ili njegovim antigenvezujućim fragmentom iz pronalaska, pri čemu je uređaj kardiopulmonalna bajpas mašina, ekstrakorporalni membranski sistem oksigenacije za oksigenaciju krvi, uređaj za potpomognuto pumpanje krvi, uređaj za dijalizu krvi, uređaj za ekstrakorporalnu filtraciju krvi, spremište za korišćenje u prikupljanju krvi, intraluminalni kateter, stent, veštački srčani zalistak i/ili pribor za bilo koji od navedenih uređaja uključujući cevi, kanile, centrifugalnu pumpu, zalistak, port i/ili diverter.

[0034] Sledeći aspekt pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema pronalasku.

Kratak opis slika

[0035]

Slika 1: Anti-FXIIa ELISA kompeticija faga upotrebom FXIIa amidolitičkog inhibitora infestin4. Koncentracije kompetitora (rHA-Inf4) su prikazane na X-osi. Fiksne koncentracije fag-eksprimiranog Fab antitela ili infestin4 (pTaclnf4) korišćenih u testu određene su upotrebom ELISA titracije faga.

Slika 2: Inhibicija amidolitičke aktivnosti humanog FXIIa zavisna od koncentracije monoklonskim antitelom 3F7 kao potpuno humanim IgG4. Monoklonsko antitelo C1.2 na antihumani GCSF receptor (potpuno humani IgG4) je korišćeno kao negativna kontrola i rHA-Infestin kao pozitivna kontrola za test.

Slika 3: stop šabloni teškog lanca 3F7 koji se koriste za sazrevanje afiniteta. CDR regioni su osenčeni sivo, a pozicije aminokiselina u svakoj biblioteci koje su nasumično raspoređene su označene kao "x".

Slika 4: stop šabloni lakog lanca 3F7 koji se koriste za sazrevanje afiniteta. CDR regioni su osenčeni sivo, a pozicije aminokiselina u svakoj biblioteci koje su nasumično raspoređene su označene kao "x".

Slika 5: Inhibicija amidolitičke aktivnosti humanog FXIIa zavisna od koncentracije monoklonskim antitelima 3F7 i OT-2.

Slika 6: A: Poravnanje katalitičkih domena FXII miša, pacova i čoveka, i identifikacija ostataka koji formiraju katalitičku trijadu (*) i mutacije uvedene (!) da bi se identifikovao potencijalni epitop antitela 3F7. B: Western Blot koji pokazuje vezivanje 3F7 za različite mutante.

Slika 7: Stopa okluzije u FeCl3-indukovanoj trombozi nakon tretmana sa MAb 3F7 (n=5-25/grupi)

Slika 8: Efekat MAb 3F7 na aPTT (n=5-25/grupa; srednja vrednost±SD)

Slika 9: Efekat MAb 3F7 na PT (n=5-25/grupa; srednja vrednost±SD)

Slika 10: Efekat MAb 3F7 na FXIIa-aktivnost (n=5-25/grupi; srednja vrednost±SD)

Slika 11: Efekat MAb 3F7 na vreme do hemostaze. Podaci su predstavljeni kao srednje vrednosti (+SD). Statistika: p>0.05 (Kruskal-Wallis test). N=10/grupi.

Slika 12: Efekat MAb 3F7 na ukupan gubitak krvi. Podaci su predstavljeni kao srednje vrednosti (+SD). Statistika: p>0.05 (Kruskal-Wallis test). N=10/grupi.

Slika 13: Efekat MAb 3F7 na vreme do hemostaze. Horizontalne linije predstavljaju srednje vrednosti. Statistika: p>0.05 (Kruskal-Wallis test). N=10/grupi.

Slika 14: Efekat MAb 3F7 na ukupan gubitak krvi. Horizontalne linije predstavljaju srednje vrednosti. Statistika: p>0.05 (Kruskal-Wallis test). N=10/grupi.

Slika 15: Poređenje aPTT-a OT-2, MAb 3F7 i verzije MAb 3F7 sa zrelim afinitetima.

Slika 16: Poređenje inhibicije humanog faktora XIIa-alfa različitim antitelima

Spisak sekvenci

[0036]

SEQ ID NO: 1: Humana FXII sekvenca

SEQ ID NO: 2: Mišja FXII sekvenca

SEQ ID NO: 3: Pacovska FXII sekvenca

SEQ ID NO: 4: 3F7 vH sekvenca

SEQ ID NO: 5: 3F7 vL sekvenca

SEQ ID NO: 6: CDR1 teškog lanca 3F7 (HCDR1)

SEQ ID NO: 7: CDR2 teškog lanca 3F7 (HCDR2)

SEQ ID NO: 8: CDR2 teškog lanca 3F7 sa varijacijama

SEQ ID NO: 9: CDR3 teškog lanca 3F7 (HCDR3)

SEQ ID NO: 10: CDR3 teškog lanca 3F7 sa varijacijama

SEQ ID NO: 11: CDR1 lakog lanca 3F7 (LCDR1)

SEQ ID NO: 12: CDR2 lakog lanca 3F7 (LCDR2)

SEQ ID NO: 13: CDR3 lakog lanca 3F7 (LCDR3)

SEQ ID NO: 14: CDR3 lakog lanca 3F7 sa varijacijama

SEQ ID NO: 15: stop šablon H1 teškog lanca 3F7

SEQ ID NO: 16: Oligonukleotidna mutagena trimer mešavina 3F7 H1 SEQ ID NO: 17: stop šablon H2 teškog lanca 3F7

SEQ ID NO: 18: Oligonukleotidna mutagena trimer mešavina 3F7 H2 SEQ ID NO: 19: stop šablon H3.1 teškog lanca 3F7

SEQ ID NO: 20: Oligonukleotidna mutagena trimer mešavina 3F7 H3.1 SEQ ID NO: 21: stop šablon H3.2 teškog lanca 3F7

SEQ ID NO: 22: Oligonukleotidna mutagena trimer mešavina 3F7 H3.2 SEQ ID NO: 23: stop šablon L1 lakog lanca 3F7

SEQ ID NO: 24: Oligonukleotidna mutagena trimer mešavina 3F7 L1 SEQ ID NO: 25: stop šablon L3.1 lakog lanca 3F7

SEQ ID NO: 26: Oligonukleotidna mutagena trimer mešavina 3F7 L3.1 SEQ ID NO: 27: stop šablon L3.2 lakog lanca 3F7

SEQ ID NO: 28: Oligonukleotidna mutagena trimer mešavina 3F7 L3.2 SEQ ID NO: 29: CDR2 teškog lanca VR119 SEQ ID NO: 30: CDR2 teškog lanca VR112 SEQ ID NO: 31: CDR2 teškog lanca VR115 SEQ ID NO: 32: CDR2 teškog lanca VR110 SEQ ID NO: 33: CDR2 teškog lanca VR107 SEQ ID NO: 34: CDR2 teškog lanca VR108 SEQ ID NO: 35: CDR2 teškog lanca VR103 SEQ ID NO: 36: CDR2 teškog lanca VR101 SEQ ID NO: 37: CDR2 teškog lanca VR109 SEQ ID NO: 38: CDR2 teškog lanca VR99 SEQ ID NO: 39: CDR3 teškog lanca VR149 SEQ ID NO: 40: CDR3 teškog lanca VR167 SEQ ID NO: 41: CDR3 teškog lanca VR148 SEQ ID NO: 42: CDR3 teškog lanca VR159 SEQ ID NO: 43: CDR3 teškog lanca VR160 SEQ ID NO: 44: CDR1 lakog lanca VR24 SEQ ID NO: 45: CDR1 lakog lanca VR06 SEQ ID NO: 46: CDR1 lakog lanca VR16 SEQ ID NO: 47: CDR1 lakog lanca VR05 SEQ ID NO: 48: CDR1 lakog lanca VR12 SEQ ID NO: 49: CDR1 lakog lanca VR10 SEQ ID NO: 50: CDR1 lakog lanca VR14 SEQ ID NO: 51: CDR1 lakog lanca VR17 SEQ ID NO: 52: CDR3 lakog lanca VR31 SEQ ID NO: 53: CDR3 lakog lanca VR29 SEQ ID NO: 54: CDR3 lakog lanca VR27 SEQ ID NO: 55: CDR3 lakog lanca VR39 SEQ ID NO: 56: CDR3 lakog lanca VR46 SEQ ID NO: 57: CDR3 lakog lanca VR41 SEQ ID NO: 58: CDR3 lakog lanca VR38 SEQ ID NO: 59: CDR3 lakog lanca VR58 SEQ ID NO: 60: CDR3 lakog lanca VR62 SEQ ID NO: 61: CDR3 lakog lanca VR53 SEQ ID NO: 62: CDR3 lakog lanca VR52 SEQ ID NO: 63: CDR3 lakog lanca VR63

SEQ ID NO: 64: Prajmer za sekvenciranje CH1 Rev

SEQ ID NO: 65: Prajmer za sekvenciranje pLacPCRfw

SEQ ID NO: 66: Prajmer za sekvenciranje wt GIII stump rev

SEQ ID NO: 67: Prajmer za sekvenciranje KpaCLfwd

SEQ ID NO: 68: Prajmer za sekvenciranje LdaCLfwd

SEQ ID NO: 69: Prajmer za sekvenciranje PUCrev

SEQ ID NO: 70: Prajmer za sekvenciranje 3254

SEQ ID NO: 71: Prajmer za sekvenciranje Seq CL lambda

SEQ ID NO: 72: Prajmer za sekvenciranje Seq CH1

SEQ ID NO: 73: vH sekvenca VR115

SEQ ID NO: 74: vH sekvenca VR112

SEQ ID NO: 75: vL sekvenca VR24

SEQ ID NO: 76: vH sekvenca VR110

SEQ ID NO: 77: vH sekvenca VR119

Detaljan opis pronalaska

[0037] Cilj ovog pronalaska je bio razvoj poboljšanog antitela koje - dok pokazuje visoku inhibitornu aktivnost prema FXIIa - neće povećati rizik od krvarenja, biti neimunogeno i imati dug polu-život.

[0038] Jedan aspekt pronalaska je stoga monoklonsko antitelo protiv faktora XII/FXIIa ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema patentnim zahtevima koje ima više od 2 puta veći afinitet vezivanja za humani faktor XIIa, poželjno za humani faktor XIIa-beta, nego na humani faktor XII i koji je sposoban da potpuno inhibira amidolitičku aktivnost humanog faktora XIIa.

[0039] Drugi aspekt pronalaska je antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema patentnim zahtevima koji ima više od 2 puta veći afinitet vezivanja za humani faktor XIIa, poželjno za humani faktor XIIa-beta, nego za humani faktor XII i koji je sposoban za potpuno inhibirajuću amidolitičku aktivnost humanog faktora XIIa i koji je u kompeticiji sa antitelom koje sadrži sekvence SEQ ID NO: 4 i 75 eksprimirane kao IgG4 za vezivanje za FXII/FXIIa.

[0040] Poželjno je da antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ima više od 3 puta, poželjnije više od 4 puta, još poželjnije više od 5 puta, više od 6 puta, više od 8 puta, više od 10 puta, više od 12 puta, više od 14 puta, više od 16 puta, najpoželjnije više od 18 puta veći afinitet vezivanja za humani faktor XIIa, poželjno za humani faktor XIIa-beta, nego za humani faktor XII. Poželjno, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen potpuno inhibira amidolitičku aktivnost FXIIa pri koncentraciji manjoj od 100 nM, poželjnije manjoj od 50 nM, još poželjnije manjoj od 40 nM, ili čak manjoj od 30 nM. Poželjno, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen potpuno inhibira u koncentraciji između 1 pM i 100 nM, poželjnije u koncentraciji između 5 pM i 50 nM. Poželjno je da se analiza amidolitičke aktivnosti FXIIa izvodi kao što je opisano u Primeru 1(5).

[0041] Sledeći aspekt pronalaska je monoklonsko antitelo protiv faktora XII/FXIIa ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema patentnim zahtevima koji inhibira faktor XIIa-alfa, poželjno humani faktor XIIa-alfa, za više od 40%, poželjno više od 50%, još poželjnije više od 60%, kada se koristi pri molarnom odnosu FXIIa-alfa prema antitelu od 1:0.2. Alternativno, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen inhibira faktor XIIa-alfa, poželjno humani faktor XIIa-alfa, za više od 80%, poželjno više od 85%, poželjnije više od 90%, pri molarnom odnosu FXIIa-alfa prema antitelu od 1:0.5; najpoželjnije, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen postiže potpunu inhibiciju FXIIa-alfa u molarnom odnosu od 1:0.5. Poželjno, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ima afinitet prema humanom FXIIa koji je najmanje uporediv sa antitelom 3F7 koje je ovde otkriveno.

[0042] Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen može da veže mišji FXII/FXIIa. Nivo vezivanja antitela za polipeptid koji sadrži SEQ ID NO: 2 ili njegov relevantni fragment u kome (a) asparaginski ostatak na poziciji 398 SEQ ID NO: 2 je supstituisan za lizin; ili (b) izoleucinski ostatak na poziciji 438 SEQ ID NO: 2 je supstituisan za alanin, može biti niži od nivoa vezivanja proteina za odgovarajući polipeptid koji sadrži SEQ ID NO: 2 ili njegov relevantni fragment bez navedene supstitucije. Relevantni fragment polipeptida SEQ ID NO: 2 sadrži katalitički centar; primeri su laki lanac, FXIIa-beta, FXIIa-alfa ili kompletan FXII.

[0043] U pronalasku, antitela ili njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen sadrže varijabilni region teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 73, 74 ili 76.

[0044] Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema pronalasku sadrži varijabilni region lakog lanca (vL) koji je više od 85% identičan sekvenci SEQ ID NO: 5. Poželjno je varijabilni region lakog lanca (vL) više od 88%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, još poželjnije 98%, ili čak 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 5. Poželjni primeri izvođenja pronalaska su antitela ili njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen koji sadrže varijabilni region lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 5.

[0045] Kombinacije CDR regiona teškog lanca (HCDR) i CDR regiona lakog lanca (LCDR) prikazane u tabeli 1, pri čemu su brojevi u kolonama ispod HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 odgovarajuće SEQ ID NO:

[0046] Poželjno, antitelo ili njegovi fragmenti koji se vezuju za antigen prema pronalasku vezuju humani faktor XIIa-beta sa KDboljom od 3×10<-9>M, najpoželjnije 10<-9>M ili čak 5×10<-10>M.

[0047] Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen može biti bilo koji izotip, uključujući IgG, IgM, IgE, IgD ili IgA, i bilo koji njihov podtip. Poželjno, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku je humani IgG ili njegova varijanta, poželjno humani IgG4 ili njegova varijanta. Postupci za promenu tipa antitela su dobro poznati u tehnici. Molekul nukleinske kiseline koji kodira vHili vLregion je izolovan i operativno povezan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira različiti cHili cL, respektivno, iz konstantnog regiona različite klase molekula imunoglobulina.

[0048] Ovo otkriće obuhvata proteine i/ili antitela koja su ovde opisana i sadrže konstantni region antitela. Ovo uključuje fragmente antitela koji se vezuju za antigen fuzionisan sa Fc.

[0049] Sekvence konstantnih regiona korisnih za proizvodnju proteina prema ovom pronalasku mogu se dobiti iz više različitih izvora. U nekim primerima, konstantni region ili njegov deo proteina je izveden iz humanog antitela. Konstantni region ili njegov deo može biti izveden iz bilo koje klase antitela, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo koji izotip antitela, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U jednom primeru, konstantni region je humani izotip IgG4 ili stabilizovani IgG4 konstantni region.

[0050] U jednom primeru, Fc region konstantnog regiona ima smanjenu sposobnost indukovanja efektorske funkcije, npr., u poređenju sa nativnim ili divljim tipom humanog IgG1 ili IgG3 Fc regiona. U jednom primeru, efektorska funkcija je citotoksičnost posredovana od antitela (ADCC) i/ili ćelijski posredovana fagocitoza (ADCP) zavisna od antitela i/ili citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC). Postupci za procenu nivoa efektorske funkcije proteina koji sadrži Fc region su dobro poznati u tehnici.

[0051] U jednom primeru, Fc region je IgG4 Fc region (tj., iz IgG4 konstantnog regiona), npr. humani IgG4 Fc region. Sekvence odgovarajućih IgG4 Fc regiona će biti očigledne stručnjaku i/ili dostupne u javno dostupnim bazama podataka (npr. dostupne u Nacionalnom centru za informacije o biotehnologiji).

[0052] U jednom primeru, konstantni region je stabilizovani IgG4 konstantni region. Pod terminom "stabilizovani IgG4 konstantni region" podrazumevaće se IgG4 konstantni region koji je modifikovan da smanji razmenu Fab kraka ili sklonost da se podvrgne razmeni Fab kraka ili formiranju poluantitela ili sklonosti formiranju poluantitela. "Razmena Fab kraka" se odnosi na tip modifikacije proteina za humani IgG4, u kome se IgG4 teški lanac i vezani laki lanac (polumolekul) zamenjuju za par teškog lakog lanca iz drugog IgG4 molekula. Dakle, IgG4 molekuli mogu da steknu dva različita Fab kraka koji prepoznaju dva različita antigena (što rezultira bispecifičnim molekulima). Razmena Fab kraka se dešava prirodno in vivo i može se indukovati in vitro prečišćenim krvnim ćelijama ili redukcionim sredstvima kao što je redukovani glutation. "Poluantitelo" se formira kada se IgG4 antitelo disocira i formira dva molekula od kojih svaki sadrži jedan teški lanac i jedan laki lanac.

[0053] U jednom primeru, stabilizovani IgG4 konstantni region sadrži prolin na poziciji 241 zglobnog regiona prema sistemu Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 and/or 1991). Ova pozicija odgovara poziciji 228 zglobnog regiona prema sistemu numeracije EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 2001 and Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 63, 78-85, 1969). U humanom IgG4, ovaj ostatak je generalno serin. Nakon zamene serina za prolin, IgG4 zglobni region sadrži sekvencu CPPC. S tim u vezi, stručnjak će biti svestan da je "zglobni region" deo konstantnog regiona teškog lanca antitela koji je bogat prolinom koji povezuje Fc i Fab regione koji daje mobilnost na dva Fab kraka antitela. Zglobni region uključuje cisteinske ostatke koji su uključeni u disulfidne veze između teških lanaca. Uopšteno se definiše kao niz od Glu226 do Pro243 humanog IgG1 prema sistemu numeracije Kabat. Zglobni regioni drugih izotipova IgG mogu se poravnati sa sekvencom IgG1 postavljanjem prvog i poslednjeg cisteinskih ostataka koji formiraju disulfidne veze između teškog lanca (S-S) na istim pozicijama (videti npr. WO2010/080538).

[0054] Dodatni primeri stabilizovanih IgG4 antitela su antitela u kojima je arginin na poziciji 409 u konstantnom regionu teškog lanca humanog IgG4 (prema sistemu numeracije EU) zamenjen lizinom, treoninom, metioninom ili leucinom (npr., kako je opisano u WO2006/033386). Fc region konstantnog regiona može dodatno ili alternativno da sadrži ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: alanina, valina, glicina, izoleucina i leucina na poziciji koja odgovara 405 (prema sistemu numeracije EU). Izborno, zglobni region sadrži prolin na poziciji 241 (tj. CPPC sekvencu) (kao što je gore opisano).

[0055] U sledećem primeru, Fc region je region modifikovan da ima smanjenu efektorsku funkciju, tj., "neimunostimulatorni Fc region". Na primer, Fc region je IgG1 Fc region koji sadrži supstituciju na jednoj ili više pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od 268, 309, 330 i 331. U sledećem primeru, Fc region je IgG1 Fc region koji sadrži jednu ili više od sledećih promena E233P, L234V, L235A i deleciju G236 i/ili jednu ili više od sledećih promena A327G, A330S i P331S (Armour et al., Eur J Immunol.29:2613-2624, 1999; Shields et al., J Biol Chem.

276(9):6591-604, 2001). Dodatni primeri neimunostimulatornih Fc regiona su opisani, na primer, u in Dall'Acqua et al., J Immunol. 177: 1129-1138, 2006; i/ili Hezareh J Virol ;75: 12161-12168, 2001).

[0056] U sledećem primeru, Fc region je himerni Fc region, na primer, koji sadrži najmanje jedan CH2 domen iz IgG4 antitela i najmanje jedan CH3 domen iz IgG1 antitela, gde Fc region sadrži supstituciju na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od 240, 262, 264, 266, 297, 299, 307, 309, 323, 399, 409 i 427 (EU numeracija) (npr., kako je opisano u WO2010/085682). Primeri supstitucija uključuju 240F, 262L, 264T, 266F, 297Q, 299A, 299K, 307P, 309K, 309M, 309P, 323F, 399S i 427F.

[0057] Ovo otkriće takođe razmatra dodatne modifikacije antitela.

[0058] Na primer, antitelo sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina koje produžavaju poluživot proteina. Na primer, antitelo sadrži Fc region koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje povećavaju afinitet Fc regiona za neonatalni Fc region (FcRn). Na primer, Fc region ima povećan afinitet za FcRn pri nižem pH, npr., oko pH 6.0, da bi se olakšalo vezivanje Fc/FcRn u endozomu. U jednom primeru, Fc region ima povećan afinitet za FcRn na oko pH 6 u poređenju sa njegovim afinitetom na oko pH 7.4, koji olakšava ponovno oslobađanje Fc (a samim tim i molekula koji sadrže Fc region) u krv nakon ćelijske reciklaže. Ove aminokiselinske supstitucije su korisne za produženje poluživota proteina, smanjenjem klirensa iz krvi.

[0059] Primeri aminokiselinskih supstitucija uključuju T250Q i/ili M428L ili T252A, T254S i T266F ili M252Y, S254T i T256E ili H433K i N434F prema EU sistemu numerisanja. Dodatne ili alternativne aminokiselinske supstitucije su opisane, na primer, u US20070135620 ili US7083784.

[0060] Još poželjnije, antitelo pronalaska je humani IgG1 ili humani IgG4, konstruisan za pojačano vezivanje za humani neonatalni Fc receptor FcRn na nižoj pH, npr. pH 6, što dovodi do produženog poluživota antitela u humanom serumu. Opisani su postupci za skrining za optimalne varijante Fc za optimizaciju vezivanja FcRn (npr. Zalevsky et al (2010) Nature Biotech 28, 157-159).

[0061] Druga poželjna antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti prema pronalasku sadrže konstantne regione imunoglobulina sisara, kao što su konstantni regioni izotipova sisara kao što su IgG, IgM, IgE, IgD ili IgA, i bilo koji njihov podtip.

[0062] Poželjno, antitelo je IgG sisara, uključujući IgG miša, IgG svinja, IgG krava, IgG konja, IgG mačaka, IgG pasa i IgG primata ili njihove varijante. Ova antitela mogu biti himerna antitela, gde su humani varijabilni regioni pronalaska kombinovani sa konstantnim regionom imunoglobulina izabrane vrste. Alternativno, antitelo ili njegovi fragmenti koji se vezuju za antigen mogu biti proizvedeni presađivanjem humanih CDR regiona koji su ovde opisani u okvirne ostatke iz imunoglobulina izabrane vrste.

[0063] Poželjno je da su antitela ili njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen prema pronalasku u svom zrelom obliku, tj. bez signalnog peptida; međutim, antitela ili njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen uključujući signalne peptide su takođe uključeni u pronalazak.

[0064] Fragment koji se vezuje za antigen može biti bilo koji fragment antitela prema pronalasku koji održava sposobnost vezivanja FXIIa. Poželjni fragmenti koji se vezuju za antigen su Fab fragment, Fab' fragment, F(ab')2fragment, Fv fragment, jednolančano antitelo, jednolančani Fv fragment, Fv protein stabilizovan disulfidom ili dimer jednolančanog Fv fragmenta. Antitela takođe uključena u pronalazak su himerno antitelo, humanizovano antitelo, murinizovano antitelo ili bispecifično antitelo. Postupci za proizvodnju ovih fragmenata i antitela su dobro poznati u tehnici (videti npr. Harlow & Lane: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

[0065] U pronalazak je takođe uključen fuzioni protein ili čestica faga koja sadrži fragment antitela iz pronalaska koji se vezuje za antigen. Fragment koji se vezuje za antigen može, na primer, biti fuzionisan sa humanim serumskim albuminom ili njegovom varijantom. Stručnjak će biti dobro svestan drugih proteina koji se mogu koristiti kao fuzioni partneri za fragmente koji se vezuju za antigen. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen takođe može biti fuzionisan sa obeleživačem, kao što je heksa-histidinska oznaka. Oznaka može biti snabdevena vezujućim peptidom koji se može odcepiti, tako da se može ukloniti iz antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen kada je to potrebno.

[0066] Sledeći aspekt pronalaska je nukleinska kiselina koja kodira antitelo, ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, prema pronalasku. Poželjno, nukleinska kiselina takođe sadrži region koji kodira signalni peptid, poželjno nukleinska kiselina sadrži region koji kodira signalni peptid za teški lanac i region koji kodira signalni peptid za laki lanac.

[0067] Molekule nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide obezbeđene pronalaskom može lako da proizvede stručnjak, koristeći date aminokiselinske sekvence, genetski kod i sekvence dostupne u javnim bazama podataka. Pored toga, razne funkcionalno ekvivalentne nukleinske kiseline mogu se lako proizvesti i stoga su takođe uključene u ovaj pronalazak. Molekuli nukleinske kiseline se mogu pripremiti bilo kojim pogodnim postupkom, na primer direktnom hemijskom sintezom. Postupci za pripremu DNK su dobro poznati u tehnici.

[0068] Još jedan aspekt pronalaska je vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, iz pronalaska, operativno vezan za odgovarajuću sekvencu promotora ili ugrađen u odgovarajuću ekspresionu kasetu, koja može uključivati dodatne regulatorne elemente kao što su kao pojačivački elementi za povećanje nivoa ekspresije. Poželjno je da se koristi jak promotor. Za ekspresiju u E. coli, može se koristiti promotor kao što su T7, lac, trp ili lambda promotori, poželjno u sprezi sa mestom vezivanja ribozoma i signalom za završetak transkripcije. Za ćelije sisara, SV40, CMV ili promotori imunoglobulina se mogu koristiti za obezbeđivanje visokog nivoa ekspresije. Poželjno, vektor je vektor ekspresije ćelija sisara, poželjnije vektor izabran iz Lonza GS System<™>ili Selexis Genetic Elements<™>sistema. Poželjno, vektor takođe sadrži selektivnu markersku sekvencu kao što su gpt, neo, amp ili hyg geni, i sistem za amplifikaciju gena kao što je glutamin sintetaza ili DHFR. Drugi poželjni vektor je vektor ekspresije kvasca, npr. ekspresioni vektor optimizovan za Pichia pastoris. Vektor takođe može biti virusni vektor, npr. vektor zasnovan na virusu vakcinije, adenovirusu ili retrovirusu. Vektor takođe može biti bakulovirus za ekspresiju u ćelijama insekata.

[0069] Dodatni aspekt pronalaska je ćelijska linija ili ćelija kvasca koja sadrži vektor pronalaska. Poželjno, ćelijska linija je ćelijska linija sisara, kao što je CHO, HEK293, MDCK, COS, HeLa, ili ćelijske linije mijeloma kao što je NS0. Sledeći primer izvođenja je ćelijska linija insekata za upotrebu sa bakulovirusom, kao što su SF9 ćelije, SF21 ćelije ili HighFive<™>ćelije. Još jedna ćelija je ćelija kvasca, kao što je Saccharomyces, npr. S. cerevisiae, ili Pichia pistoris. Moguće su i bakterijske ćelije domaćini kao što je E. coli. Postupci za uvođenje DNK u odgovarajuće ćelije domaćina su dobro poznati u tehnici. Na primer, kada je ćelija domaćin linija ćelija sisara, mogu se koristiti tehnike kao što su lipofekcija ili elektroporacija.

[0070] Sledeći aspekt pronalaska je postupak za proizvodnju antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen prema pronalasku, koji sadrži kultivisanje ćelijske linije ili ćelije kvasca prema pronalasku pod odgovarajućim uslovima da bi se eksprimiralo antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen. Antitelo njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen se zatim prečišćava iz supernatanta kulture. Poželjno, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen izlučuje ćelija domaćin, a zatim se lako može prečistiti iz supernatanta kulture. Tehnike za prečišćavanje antitela su dobro poznate u tehnici, i uključuju tehnike kao što su precipitacija amonijum sulfatom, hromatografija isključivanja veličine, afinitetna hromatografija, hromatografija izmene jona i druge.

[0071] Kada se eksprimiraju u E. coli, antitela ili njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen mogu se proizvesti u inkluzijskim telima. Postupci za izolovanje inkluzionih tela i ponovno savijanje eksprimiranog proteina su dobro poznati u tehnici.

[0072] Još jedan aspekt pronalaska je antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema pronalasku za upotrebu u medicini.

[0073] Sledeći aspekt pronalaska je antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu u prevenciji formiranja i/ili stabilizacije tromba kod čoveka ili životinje. Trodimenzionalni intraluminalni rast tromba je smanjen ili čak sprečen. Dakle, ovaj aspekt pronalaska se odnosi na antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu u lečenju ili prevenciji poremećaja izabranog iz grupe koja se sastoji od formiranja venskog, arterijskog ili kapilarnog tromba, formiranja tromba u srcu, formiranja tromba tokom i/ili nakon kontakta krvi čoveka ili životinje sa veštačkim površinama i tromboembolije sprečavanjem i/ili lečenjem formiranja i/ili stabilizacije tromba i time trodimenzionalnog intraluminalnog rasta tromba. Još jedan aspekt pronalaska je antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu u lečenju intraluminalnih trombova kod ljudi ili životinja povezanih sa poremećajem izabranim iz grupe koja se sastoji od formiranja venskog, arterijskog ili kapilarnog tromba, formiranja tromba u srcu, formiranja tromba tokom i/ili nakon kontakta krvi čoveka ili životinje sa veštačkim površinama ili tromboembolije. Poželjno, formiranje venskog ili arterijskog tromba je moždani udar, infarkt miokarda, tromboza dubokih vena, tromboza portalne vene, tromboembolija, tromboza bubrežnih vena, tromboza jugularne vene, tromboza cerebralnog venskog sinusa, Budd-Chiari-ev sindrom ili Paget-Schroetter bolest.

[0074] Koristan efekat antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen u različitim uslovima može se potvrditi, na primer, upotrebom odgovarajućeg životinjskog modela, na primer mišjeg modela. Poređenjem životinja tretiranih antitelom ili njegovim antigenvezujućim fragmentom i kontrolnom grupom, može se pokazati povoljan efekat tretmana odgovarajuće bolesti antitelom. Alternativno, uzorci plazme pacijenata mogu se testirati na relevantne parametre. Na primer, koristan efekat u lečenju ili prevenciji simptoma povezanih sa bolešću kod pacijenata sa naslednim angioedemom može se testirati korišćenjem modela miša, na primer kako je opisano u Han et al (2002) J. Clin. Invest. 109:1057-1063. Takođe se može predvideti in vitro test, korišćenjem uzoraka plazme pacijenata; uzorci plazme tretiranih i netretiranih pacijenata mogu se uporediti za nivoe bradikinina i/ili kininogena visoke molekularne težine. Antitelo treba da smanji stvaranje bradikinina i/ili spreči smanjenje nivoa kininogena visoke molekularne težine.

[0075] Poželjno, do formiranja tromba dolazi tokom i/ili nakon kontakta krvi čoveka ili životinje sa veštačkim površinama tokom i/ili posle medicinskog postupka koji je izveden na pomenutom ljudskom ili životinjskom subjektu i navedeno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment se primenjuju pre i/ili ili tokom i/ili posle pomenutog medicinskog postupka, i dodatno pri čemu

[0076] Poželjno, rizik od krvarenja kod navedenog čoveka ili životinje

(i) nije povećan; i/ili

(ii) je utvrđen

a) preko vremena krvarenja iz uha ili vrha prsta prema Duke-u i pri čemu navedeno vreme krvarenja iz uha ili vrha prsta nije duže od 10 minuta ili

b) po metodi Ivy-a i pri čemu vreme krvarenja nije duže od 10 minuta ili

v) po metodi Marx-a i vreme krvarenja nije duže od 4 minuta.

[0077] Medicinski postupak može biti

i) bilo koji postupak koji zahteva kardiopulmonalni bajpas ili

ii) oksigenaciju krvi putem ekstrakorporalne membranske oksigenacije ili

iii) unutrašnje potpomognuto pumpanje krvi ili

iv) dijaliza krvi ili

v) ekstrakorporealna filtracija krvi ili

vi) prikupljanje krvi u bilo kom spremištu za kasniju upotrebu kod životinja ili ljudi ili vii) upotreba intraluminalnog(ih) katetera ili

viii) upotreba stenta(ova) ili

ik) upotreba veštačkih srčanih zalistaka.

[0078] Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema pronalasku može se primeniti pre, posle i/ili tokom medicinskog postupka koji zahteva kardiopulmonalni bajpas, ili medicinskog postupka koji sadrži sakupljanje krvi u bilo kom spremištu za kasniju upotrebu kod životinja ili ljudi. Može se primeniti i nanošenjem na veštačku površinu. Kada medicinski postupak uključuje doniranje krvi, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen mogu biti:

i) primenjivani na davaoca krvi pre i/ili tokom postupka donacije krvi ili

ii) pomešani sa krvlju u skladištu za prikupljanje ili

iii) primenjeni na primaoca krvi pre, tokom i/ili nakon što je krv primenjena na čoveka ili životinju.

[0079] Poželjno je da se količina heparina ili njegovih derivata i/ili hirudina ili njegovih derivata koja se dodaje pored antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen pre i/ili tokom i/ili posle medicinskog postupka smanji ili čak potpuno izostavi u poređenju sa količinom heparina ili njegovih derivata i/ili hirudina ili njegovih derivata koja se normalno primenjuje pre i/ili tokom pomenutog medicinskog postupka kada se ne primenjuje anti-FXII/FXIIa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen.

[0080] Poželjno, protrombotički rizik nakon postoperativnog antagonizma heparina ili njegovih derivata i/ili postoperativnog antagonizma hirudina ili njegovih derivata je sprečen ili smanjen; rizik od protromboze takođe može biti uzrokovan primenom protamina.

[0081] Sledeći aspekt pronalaska je antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema pronalasku za prevenciju ili lečenje sindroma glave pumpe.

[0082] Još jedan aspekt pronalaska je medicinski uređaj obložen antitelom ili njegovim fragmentom koji se vezuje za antigen prema pronalasku, pri čemu je uređaj kardiopulmonalna bajpas mašina, ekstrakorporealni membranski sistem oksigenacije za oksigenaciju krvi, uređaj za potpomognuto pumpanje krvi, uređaj za dijalizu krvi, uređaj za ekstrakorporealnu filtraciju krvi, spremište za upotrebu u prikupljanju krvi, intraluminalni kateter, stent, veštački srčani zalistak i/ili pribor za bilo koji od navedenih uređaja uključujući cevi, kanile, centrifugalnu pumpu, zalistak, port i/ili diverter.

[0083] Drugi aspekt pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema pronalasku. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment se može formulisati prema poznatim postupcima za pripremu farmaceutske kompozicije. Na primer, može se mešati sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenasa. Na primer, može se koristiti sterilna voda ili fiziološki rastvor. Druge supstance, kao što su pH puferski rastvori, sredstva za smanjenje viskoziteta, ili stabilizatori takođe mogu biti uključeni.

[0084] Veliki izbor farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa i nosača je poznat u tehnici. Takvi farmaceutski nosači i ekscipijensi, kao i pogodne farmaceutske formulacije su opširno opisani u raznim publikacijama (videti na primer "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) ili "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000) A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; i Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc). Konkretno, farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo pronalaska može biti formulisana u liofilizovanom ili stabilnom rastvorljivom obliku. Polipeptid može biti liofilizovan različitim postupcima poznatim u tehnici. Liofilizovane formulacije se rekonstituišu pre upotrebe dodavanjem jednog ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača kao što je sterilna voda za injekcije ili sterilni fiziološki rastvor soli.

[0085] Farmaceutska kompozicija pronalaska se može primeniti u dozama i tehnikama dobro poznatim u tehnici. Količinu i vreme primene će odrediti nadležni lekar ili veterinar kako bi se postigli željeni ciljevi. Put primene može biti bilo kojim putem koji isporučuje bezbednu i terapeutski efikasnu dozu u krv subjekta koji se leči. Mogući putevi primene uključuju sistemske, lokalne, enteralne i parenteralne puteve, kao što su intravenski, intraarterijski, subkutani, intradermalni, intraperitonealni, oralni, transmukozni, epiduralni ili intratekalni. Poželjni putevi su intravenski ili subkutani.

[0086] Efikasna doza i način primene određuju se faktorima kao što su starost i težina subjekta, kao i prirodom i terapeutskim opsegom antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen. Određivanje doze se određuje poznatim postupcima, nije zahtevano nepotrebno eksperimentisanje.

[0087] Terapeutski efikasna doza je doza antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen prema pronalasku koja dovodi do pozitivnog terapeutskog efekta kod pacijenta ili subjekta kome je potrebno lečenje. Terapeutski efikasna doza je u opsegu od oko 0.01 do 50 mg/kg, od oko 0.01 do 30 mg/kg, od oko 0.1 do 30 mg/kg, od oko 0.1 do 10 mg/kg, od oko 0.1 do 5 mg /kg, od oko 1 do 5 mg/kg, od oko 0.1 do 2 mg/kg ili od oko 0.1 do 1 mg/kg. Tretman može da sadrži davanje jedne doze ili višestrukih doza. Ako je potrebno više doza, one se mogu primenjivati dnevno, svaki drugi dan, nedeljno, dvonedeljno, mesečno ili dvaput mesečno ili po potrebi. Takođe se može koristiti depo koji polako i kontinuirano oslobađa antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen. Terapeutski efikasna doza može biti doza koja inhibira FXIIa kod subjekta za najmanje 50%, poželjno za najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, poželjnije za najmanje 95%, 99% ili čak 100%.

Definicije

[0088] Osim ako nije drugačije navedeno, svi termini se koriste u skladu sa uobičajenom upotrebom.

[0089] "Antitelo" u svom najširem smislu je polipeptid koji sadrži varijabilni region imunoglobulina koji specifično prepoznaje epitop na antigenu. Antitela se obično sastoje od dva identična teška lanca i dva identična laka lanca, od kojih svaki ima varijabilni region na svom N-terminusu (vHi vLregion). Obično će se vH i vL region kombinovati da bi formirali mesto vezivanja antigena. Međutim, opisana su i jednodomenska antitela, gde je prisutan samo jedan varijabilni region i vezuje se za antigen.

[0090] Tipično, antitelo sadrži dva teška i dva laka lanca, povezana disulfidnim vezama. Postoji 5 glavnih izotipova antitela (IgG, IgM, IgE, IgA, IgD), od kojih se neki javljaju kao multimeri osnovne strukture antitela. Izotip je određen konstantnim regionom teških lanaca. Postoje dve vrste lakih lanaca, lambda i kapa.

[0091] Termin "antitelo" kako se ovde koristi uključuje intaktna antitela, kao i njihove varijante i delove koji zadržavaju vezivanje antigena. Ovo uključuje fragmente antitela kao što su Fab fragmenti, F(ab')2fragmenti, Fab' fragmenti, jednolančani Fv fragmenti ili Fv fragmenti stabilizovani disulfidom. Prema tome, termin "antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen" u ovom dokumentu je samo iz predostrožnosti, sam termin "antitelo" je već namenjen da pokrije antitelo i njegove fragmente koji se vezuju za antigen.

[0092] Svaki teški i laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona i konstantnog regiona. Varijabilni regioni sadrže okvirne ostatke i hipervarijabilne regione, koji se takođe nazivaju regioni koji određuju komplementarnost ili CDR. Obim okvirnih ostataka i CDR regiona se određuje prema Kabatu; Kabat baza podataka je dostupna na internetu (Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C (1991) Sequences of proteins of immunological interest, 5th edn. U.S. Department of Health and Human services, NIH, Bethesda, MD). CDR regioni su važni u vezivanju za epitop i stoga određuju specifičnost antitela.

[0093] „Monoklonsko antitelo“ je antitelo koje proizvodi jedan klon B limfocita, ili ćelijska linija konstruisana da eksprimira jedno antitelo.

[0094] "Himerno antitelo" je antitelo sa varijabilnim regionima jedne vrste presađenim na konstantne regione druge vrste. "Humanizovano" antitelo je antitelo gde CDR regioni iz različitih vrsta, npr. mišje monoklonsko antitelo, presađeni su u okvir humanog antitela. Analogno tome, "murinizovano" antitelo je antitelo gde su CDR regioni iz različitih vrsta, npr. humano monoklonsko antitelo, presađeni su u okvir mišjeg antitela. Humano antitelo je antitelo koje je u potpunosti izvedeno iz čoveka, tj. humanih CDR regiona u humanom okviru i bilo kog konstantnog regiona pogodnog za primenu na čoveka.

[0095] Antitelo „klicine linije“ je antitelo gde se somatske mutacije koje su unele promene u ostatke okvira preokrenu u originalnu sekvencu prisutnu u genomu.

[0096] "Fragment koji se vezuje za antigen" se odnosi na bilo koji fragment antitela koji zadržava sposobnost da specifično veže epitop antigena za koji se antitelo vezuje. Ovo uključuje, ali nije ograničeno na Fab, F(ab')2, ili jednolančane Fv fragmente.

[0097] "Afinitet vezivanja" se odnosi na afinitet antitela prema njegovom antigenu. Može se meriti raznim tehnikama, npr. tehnologiji zasnovanoj na površinskoj plazmonskoj rezonanci (BiaCore).

[0098] "Epitop" je antigenska determinanta, definisana je ostacima ili određenim hemijskim strukturama sa kojima antitelo dolazi u kontakt na antigenu.

[0099] "Identičnost sekvence" se odnosi na sličnost aminokiselinskih sekvenci. Pripremljeno je najbolje moguće poravnanje dve sekvence, a identičnost sekvence je određena procentom identičnih ostataka. Dostupni su standardni postupci za poravnanje sekvenci, npr. algoritmi za Needleman and Wunsch (J Mol Biol (1970) 48, 443), Smith and Waterman (Adv Appl Math (1981) 2, 482), Pearson and Lipman (Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85, 2444) i drugi. Odgovarajući softver je komercijalno dostupan, npr. GCG paket softvera (Devereux et al (1984), Nucl Acids Res 12, 387), gde se poravnanja mogu proizvesti korišćenjem, na primer, GAP ili BESTFIT sa podrazumevanim parametrima ili njihovim naslednicima. Algoritam Blast, koji je prvobitno opisan od strane Altschul et al (J. Mol. Biol. (1990) 215, 403), ali dodatno preciziran tako da uključuje poravnanja sa prazninama (Blast 2), dostupan iz različitih izvora kao što su EBI, NCBI, takođe će proizvesti poravnanja i izračunati % identičnosti između dve sekvence.

[0100] "Specifično vezivanje" se odnosi na vezivanje za suštinski samo jedan antigen.

[0101] "FXII/FXIIa" se odnosi na jedan ili oba faktora XII i aktivirani faktor XII (FXIIa). Tako "inhibitor FXII/FXIIa" uključuje inhibitore jednog ili oba od FXII i FXIIa. Dalje, anti-FXII/FXIIa antitela obuhvataju antitela koja se vezuju i inhibiraju jedan ili oba FXII i FXIIa.

[0102] "Infestini" su klasa inhibitora serin proteaze dobijenih iz srednjeg creva hematofagnog insekta, Triatoma infestans, glavnog vektora parazita Trypanosoma cruzi za koga se zna da izaziva Chagas-ovu bolest (Campos ITN et al. 32 Insect Biochem. Mol. Bio. 991-997, 2002; Campos ITN et al.577 FEBS Lett. 512-516, 2004). Ovaj insekt koristi ove inhibitore da spreči koagulaciju progutane krvi. Infestin gen kodira 4 domena koji rezultiraju proteinima koji mogu inhibirati različite faktore u putu koagulacije. Posebno, domen 4 kodira protein (Infestin-4) koji je jak inhibitor FXIIa. Infestin-4 je primenjivan na miševe bez komplikacija krvarenja (WO 2008/098720). Infestin-4 je spojen sa humanim serumskim albuminom (rHA-Infestin-4).

[0103] "Potpuna inhibicija amidolitičke aktivnosti FXIIa" označava inhibiciju od 80% ili više, poželjno od 90% ili više, poželjnije od 95% ili više, aktivnosti uočene u kontrolnom eksperimentu bez prisutnog inhibitora. „Aktivnost faktora XIIa“ obuhvata aktivnost svih oblika faktora XIIa, kao što su FXIIa-alfa i FXIIa-beta.

[0104] Termini "tretman" ili "lečenje" ili "terapija" treba da se tumače široko; biće uključeno poboljšanje bilo kog simptoma u vezi sa bolešću kod subjekta ili pacijenta ili u nivou relevantnog biomarkera.

Primeri

[0105] Sledeći primeri ilustruju određene primere izvođenja pronalaska, ali nemaju za cilj da ograniče pronalazak na primere izvođenja koji su prikazani kao primer. Korišćene tehnike su zasnovane na standardnim laboratorijskim postupcima koji su dobro poznati stručnjaku i opisani u standardnim laboratorijskim priručnicima.

Cilj

[0106] Da se izoluju potpuno humana antitela iz DYAX Fab-bazirane biblioteke prikaza faga koja su u stanju da efikasno inhibiraju amidolitičku aktivnost humanog FXIIa.

Materijali

[0107] rHA-Infestin-4 (inhibitor amidolitičke aktivnosti FXIIa) je snabdeven od Dr. Thomas Weimer, Holger Lind, i Stefan Schmidbauer (CSL Behring). Humani FXII, FXIIa i FXIIa beta su kupljeni od Enzyme Research Laboratories (snabdeven od Banksia Scientific, Qld, Australia). Hromogeni supstrat S-2303 je iz Chromogenix (isporučio Abacus ALS). Sulfo-NHS-SS-biotin i rastvor supstrata TMB su iz Pierce. Enzimi i M13-KO7 pomoćni fag su iz New England Biolabs. Maxisorp imunoploče su iz Nunc. Dynabeads M-280 Streptavidin su iz Invitrogen Corp. Twin tec PCR ploče sa 96 bunarčića su bile iz Eppendorf. Taq DNK polimeraza je iz Scientifix. ExoSAP-je snabdeven od GE Healthcare. Komplet za sekvenciranje BigDye Terminator bio je iz Applied Biosystems. Anti-humano FXII antitelo (OT-2) je iz Sanquin (Amsterdam, Netherlands).

Primer 1. Izbor fagnog prikaza

1) Postupak paninga faga

[0108] Humana Fab-bazirana biblioteka za prikaz faga (Dyax Corp. Cambridge, MA) je korišćena za skrining protiv biotinilovanog FXIIa beta. Pre započinjanja svakog kruga selekcije, biblioteka antitela je prethodno inkubirana sa 500 µL 4% mleka u PBS tokom 1 sata na sobnoj temperaturi (RT). Alikvoti od 100 µL kuglica M280 streptavidina su obloženi sa 3 µg biotinilovanog FXIIa beta preko noći na 4°C, nakon čega je usledilo ispiranje 3 puta u PBS/0.05% Tween 20 (PBST) i jednom u PBS upotrebom KingFisher magnetne čestice (The Fisher Scientific). Kuglice su sakupljene korišćenjem Dynal magnetnog separatora čestica (MPS) (Invitrogen Corp.), resuspendovane u 1 mL 2% mleka u PBS i stavljene na sobnu temperaturu 1 sat. Blokirane kuglice su sakupljene pomoću MPS, a prvi krug je izveden inkubacijom 5.5 × 10<12>jedinica koje formiraju kolonije (cfu) faga sa imobilisanim FXIIa beta u ukupnoj zapremini od 1 mL na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta. Nakon inkubacije, kuglice su sakupljene i isprane 10 puta sa PBST koristeći Kingfisher, nakon čega su usledila 2 ručna ispiranja u PBS. Na kraju, kuglice su resuspendovane u 500 µL PBS i označene kao izlaz 1. kruga (približno 0.5 × 10<8>cfu ukupno). Izlazni fag 1. kruga je zatim amplifikovan inficiranjem 6 ml TG1 kulture sa jednom polovinom (250 µL) kuglica na 37°C tokom 30 minuta, uz mućkanje na 250 rpm. Jedan mL inficirane kulture je uklonjen i čuvan na 4°C i 2.5 × 10<10>pfu pomoćnog faga M13KO7 dodato je u preostalih 5 mL kulture, nakon čega je usledila dodatna inkubacija na 37°C bez mućkanja. Amplifikacija je završena dodavanjem 30 mL 2xIT medijuma (koji sadrži 100 µg/mL ampicilina i 50 µg/mL Kanamicina) i inkubacijom preko noći na 30°C. Nakon amplifikacije, bakterijske pelete su sakupljene centrifugiranjem 30 minuta na 4000 rpm, a fag je istaložen iz rezultujućeg medijuma nakon dodavanja 1:5 zapreminskog rastvora NaCl-PEG (20% PEG 8000, 2.5 M NaCl) i inkubacije na ledu 60 min. Talog je resuspendovan u 1 mL PBS, bakterijski ostaci su uklonjeni centrifugiranjem na 8000 rpm korišćenjem stočne centrifuge tokom 10 minuta i fag se ponovo istaloži kao što je gore opisano. Konačne pelete faga su resuspendovane u ukupnoj zapremini od 1 mL u PBS i titrirane da bi se koristile kao ulaz za sledeći krug selekcije. Krug 2 i 3 su izvedeni kao što je opisano za krug 1. Nakon kruga 3, ELISA je urađena na pilot skali selekcije klonova i preliminarne analize za vezivanje za FXIIa beta.

2) Pilot skala selekcije i ELISA analiza klonova iz kruga 3 selekcije prikaza faga

[0109] Preliminarni skrining izlaznih klonova 3. kruga je izveden pomoću Fab-fag ELISA. Kolonije su sakupljene i inokulisane u 120 µL 2xYT medijuma, koji sadrži 2% glukoze i 100 µg/mL ampicilina. Oni su mućkani preko noći na 37°C, 250 rpm (Infors Supershaker) i označeni kao "masterplate". Ove kulture su korišćene za inokulaciju 100 µL 2xYT/100 µg/mL ampicilina u pločama sa dubokim bunarčićima, a ploče su inkubirane na 37°C, 700 rpm do OD600 od približno 0.5. Zatim je dodato 100 µL pomoćnog faga do konačne koncentracije od 0.5 × 10<10>pfu, i ploče su inkubirane bez mućkanja 30 min na 37°C.2xYT medijum (koji sadrži 100 µg/mL ampicilina i 100 µg/mL kanamicina) je dodat spašenim kulturama da bi se dobila konačna koncentracija od 25 µg/mL kanamicina, nakon čega je usledila inkubacija preko noći na 30°C uz mućkanje (650 rpm). Dobijene kulture su centrifugirane na 600 g tokom 30 minuta, a supernatanti su korišćeni za fagnu ELISA.

[0110] Za Fab-fagnu ELISA, Nunc imunoploče su obložene preko noći na 4°C sa 100 µL/bunariću 1 µg/mL FXIIa u PBS. Uključeni su i negativni kontrolni bunarčići obloženi samo sa PBS. Bunarčići su zatim blokirani 2 sata na 37°C sa 200 µL 5% obranog mleka/PBS, i isprani 3x u PBST. U svaki bunarčić dodato je 50 µL 1% obranog mleka/PBST i 50 µL supernatanta kulture faga, a ploče su inkubirane uz mućkanje na sobnoj temperaturi 2 sata. Ploče su zatim ručno isprane 5 puta sa PBST, i 100 µL anti-M13 mAb razblaženog 1/5000 u 1% mleka/PBST je dodato u svaki bunarčić, nakon čega je usledila inkubacija od 30 minuta na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Ploče su zatim isprane kao i ranije, i 100 µL TMB supstrata je dodato u svaki bunarčić i ploče su zatim inkubirane 10 minuta na sobnoj temperaturi uz mućkanje.

Reakcija je zaustavljena dodavanjem 50 µL 2M fosforne kiseline, a apsorbanca je očitana na 450 nm u čitaču mikroploča (Wallac Victor). Dvanaest klonova se pokazalo pozitivnim u ELISA testu sa jednim bunarčićem i dalje su testirani u kompetitivnoj ELISA.

3) Analiza klonova iz 3. kruga selekcije: Kompetitivna fagna ELISA

[0111] Dvanaest klonova za koje je utvrđeno da su reaktivni na FXIIa u Fab-fag ELISA sa jednim bunarčićem su dalje testirani na reaktivnost na FXIIa u kompetitivnoj ELISA. Ukratko, titri faga iz supernatanata kulture (videti prethodni odeljak) su prvo određeni upotrebom titracione ELISA. Za titracionu ELISA, Nunc imunoploče su obložene preko noći na 4°C sa 100 µL/bunariću 1 µg/mL FXIIa u PBS. Uključeni su i negativni kontrolni bunarčići obloženi samo sa PBS. Bunarčići su zatim blokirani 2 sata na 37°C sa 200 µL 5% obranog mleka/PBS, i isprani 3x u PBS/0.05% Tween 20 (PBST). Pedeset µL supernatanata faga je 4 puta serijski razblaženo u 1% obranog mleka/PBST, i 100 µL svakog razblaženja je dodato na blokiranu ploču. Posle 1.5 h inkubacije na sobnoj temperaturi uz mućkanje, ploče su ručno isprane 5 puta u PBST, a ostatak ELISA protokola je praćen u suštini kao što je opisano u prethodnom odeljku. Podaci su ucrtani korišćenjem softvera KaleidaGraph sa aproksimacijom sigmoidalne krive i zabeležena je vrednost EC50.

[0112] Za kompetitivnu ELISA, Nunc imunoploče sa 96 bunarčića su obložene i blokirane kao što je gore navedeno. Koncentracije faga su fiksirane na nivou utvrđenom titracionim ELISA testom, a kompetitivni protein (rHA-Infestin-4) je serijski razblažen. Ukratko, 4-struka serijska razblaženja kompetitivnog proteina su napravljena sa 100 µL 2 puta kompetitivnog proteina u početnom bunarčiću (tj. 200 nM za željenu koncentraciju od 100 nM) sa 75 µL pufera za razblaživanje (1% obranog mleka/PBST) u preostalim bunarčićima, i serijskim razblaživanjem 25 µL kompetitora niz ploču. 75 µL 2x fagnog stoka (razblaživanje određeno titracionom ELISA) je dodato u svaki bunarčić, i 100 µL iz svakog bubarčića je prebačeno u obloženu i blokiranu ploču, a ostatak ELISA protokola je praćen kao što je gore opisan. Fag koji eksprimira Infestin domen 4 (Inf4) kao fuziju gena-III korišćen je kao pozitivna kontrola u kompetitivnom ELISA testu. Klonovi faga označeni kao 3F7 i 3H4 pokazali su kompeticiju sa EC50vrednostima ekvivalentnim kontrolnom Inf4-fagu, i izabrani su za dalju analizu (Slika 1). Rezultati kompetitivne ELISA pokazuju da je rHA-Infestin-4 u stanju da je u kompeticiji sa 3F7 i 3H4 Fab-fagom i najverovatnije se vezuje za slične regione na FXIIa. Svi ostali klonovi faga, iako su bili sposobni da se vežu za FXIIa, nisu bili u kompeticiji sa rHA-infestinom-4 (kao što je predstavljeno klonom 3G5 na Slici 1) i stoga je malo verovatno da će se vezati za slične regione unutar katalitičkog domena FXIIa.

4) Analiza klona 3F7: Analiza sekvenci

[0113] Da bi se odredile sekvence aminokiselina za Fab klonove 3F7 i 3H4, 5 mL prekonoćnih kultura su započete korišćenjem 5 µL "masterplate" kultura, a plazmidi su izolovani korišćenjem Qiagen miniprep kompleta. DNK Fab kasete je sekvencionisana korišćenjem CH1Rev i pLacPCRfw prajmera (Tabela 2). Reakcije sekvenciranja i elektroforeza su sprovedene u postrojenju za sekvenciranje DNK na Odeljenju za patologiju Univerziteta u Melburnu. Sekvence su analizirane korišćenjem SeqMan (Lasergene) i utvrđeno je da su 100% identične, pa je jedno antitelo (3F7) sa sposobnošću da je u kompeticiji sa infestinom-4 za vezivanje za FXIIa dobijeno paningom.

Tabela 2: Prajmeri za sekvenciranje korišćeni za karakterizaciju klonova faga

Tabela 3: Sekvence varijabilnih regiona i CDR regiona 3F7. CDR definisani prema KABAT sistemu numerisanja (Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C (1991) Sequences of proteins of immunological interest, 5<th>edn. U.S. Department of Health and Human services, NIH, Bethesda, MD)

5) Analiza klona 3F7: inhibicija FXIIa pomoću 3F7 mAb

[0114] Da bi se procenilo da li 3F7 mAb inhibira amidolitičku aktivnost FXIIa u in vitro testu, 3F7 Fab-fag je ponovo formatiran u humano IgG4/lambda antitelo pune dužine i prečišćen upotrebom protokola opisanih u Primeru 3. Ukratko, 1 µg FXIIa je inkubirano u Nunc imunopločama u prisustvu ili odsustvu rHA-Infestin-4, 3F7 mAb ili kontrolnog mAb (antihumanog GCSFR antitela C1.2) u zapremini od 160 µL tokom 5 min na 37°C. Dodato je 40 µL supstrata (4mM S-2302) i ploča je dalje inkubirana na 37°C tokom 15 min. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 40 µL 20% sirćetne kiseline, a promena boje je otkrivena na 405 nm u čitaču ploča. Podaci su ucrtani korišćenjem softvera KaleidaGraph sa aproksimacijom sigmoidalne krive i zabeležena je EC50vrednost. Kao što je prikazano na slici 2, otkriveno je da antitelo 3F7 efikasno inhibira FXIIa amidolitičku aktivnost.

Primer 2. Sazrevanje afiniteta 3F7 antitela

[0115] Cilj sazrevanja afiniteta 3F7 bio je da se identifikuju i karakterišu varijante mAb 3F7 sposobne da se vežu za humani FXIIa sa većim afinitetom od roditeljskog antitela. Varijante većeg afiniteta imaju potencijal da pokažu poboljšanu inhibiciju amidolitičke aktivnosti FXIIa. Postupak za generisanje biblioteka sazrevanja afiniteta Fab-faga (videti Konstrukciju biblioteke ispod) zavisi od degenerisanih oligonukleotida koji se spajaju sa ssDNK šablonom koji se zatim produžava da bi se napravio dvolančani oblik za transformaciju. Veličina biblioteke zavisi od efikasnosti transformacije i degeneracije korišćenih prajmera. Korišćeni prajmeri (videti dole) pokrivali su kombinaciju od 19 aminokiselina (bez cisteina). Dizajnirane su biblioteke koje ciljaju 6 aminokiselinskih ostataka u isto vreme. Teorijska raznolikost upotrebe trimer oligonukleotida za 6 ostataka je 19<6>= 4.7 × 10<7>.

1) Dizajn biblioteka sazrevanja afiniteta

[0116] Za svaki fagemid, kreiran je stop šablon klicine linije zamenom 18 kodona (6 aminokiselinskih ostataka) u svim CDR regionima, osim CDR-L2, sa TAA stop kodonima. Linearni dizajn za konstrukcije je sledeći: Ncol-VL-CL-linker-VH-Sall. Bočna mesta Ncol i Sall su uključena za kloniranje u pTac vektor za prikaz faga, koji sadrži preostale elemente za prikaz faga. Verzije stop šablona pod nazivom 3F7 H1, 3F7 H2, 3F7 H3.1 i 3F7 H3.2 (varijabilni region teškog lanca) i 3F7 L1, 3F7 L3.1, 3F7 L3.2 (varijabilni region lakog lanca) su proizveli GeneArt i prikazani su na slikama 3 i 4 respektivno.

2) Konstrukcija biblioteke

[0117] Biblioteke su konstruisane upotrebom postupaka opisanih od Sidhu et al. (Phage display for selection of novel binding peptides. Methods in Enzymology, 2000, vol.238, p.333-336) sa verzijama "stop šablona" pTac-3F7 Fab. Svaki stop šablon je korišćen kao šablon za Kunkelov metod mutageneze (Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Methods in Enzymology, 1987, vol. 154, p. 367-382) sa mutagenim oligonukleoteidima (Tabela 4) dizajniranim da istovremeno popravljaju stop kodone i uvode mutacije na dizajniranim mestima. Reakcije mutageneze su uvedene u E. coli SS320 elektroporacijom, a proizvodnja faga je započeta dodatkom M13-KO7 pomoćnog faga. Posle rasta preko noći na 30°C, fagi su sakupljeni precipitacijom sa PEG/NaCl. Efikasnost mutageneze je procenjena sekvenciranjem od 12 klonova nasumično odabranih iz svake biblioteke, i kretala se od 50 do 100%. Svaka biblioteka je sadržala 0.75 – 3.75 × 10<9>pojedinačnih klonova. Prajmer 3254 (Tabela 2) je korišćen za sekvenciranje klonova iz biblioteka L1, L3.1 i L3.2, a prajmer Seq CL lambda (Tabela 2) je korišćen za sekvenciranje klonova iz biblioteka H1, H2, H3.1 i H3.2.

Tabela 4: 3F7 mutageni trimer oligonukleotidi koji se koriste za sazrevanje afiniteta, gde svaki "Nnn" označava triplet koji kodira jednu od 19 aminokiselina bez cisteina koje proizvodi i isporučuje Ella Biotech, Germany).

3) Paning biblioteke

[0118] Biblioteke su propuštene kroz pet krugova selekcije sa opadajućom koncentracijom biotinilovanog FXIIa beta. Ciljna koncentracija je smanjena 10 puta sa svakim krugom, od 40 nM u krugu 1 do 4 pM u krugu 5. Paning je izveden u rastvoru sa biotinilovanim FXIIa beta. Uzorci faga su inkubirani sa antigenom razblaženim u 4% mleka u PBST (ili samo 4% mleka/PBST da bi se napravili blanko uzorci bez ciljnog mesta) uz rotaciju na sobnoj temperaturi 1 sat. Magnetne kuglice streptavidina Dynal M-280 su blokirane u 5% obranog mleka/PBS tokom 30 minuta na 37 °C uz horizontalno mućkanje. Kuglice su sakupljene upotrebom MPS i dodata je smeša faga/antigena tokom 30 minuta. Kuglice su zatim oprane 10 puta u PBST (KingFisher Long Wash), nakon čega je usledilo ručno pranje u PBS. Kuglice su konačno resuspendovane u 500 µL 50 mM DTT i inkubirane na 37°C tokom 30 minuta uz horizontalno mućkanje. Eluirani fag je sakupljen i dodat u 170 µL pufera za neutralizaciju (0.351 g L-cisteina 5 mg BSA do 5 mL sa 1 M Tris pH 8).330 µL eluiranog faga je korišćeno kao ulaz za sledeću rundu. Obogaćivanje za svaki krug selekcije je izračunato kao odnos eluiranog faga odabranog na ciljnom mestu prema slepim uzorcima.

4) Analiza klonova iz sazrevanja afiniteta 3F7

[0119] Po završetku paninga, određeni broj klonova faga je odabran iz svake obogaćene biblioteke i sekvencioniran upotrebom prajmera opisanih iznad (konstrukcija biblioteke). Jedinstveni klonovi iz svake biblioteke su zatim odabrani na osnovu sekvence i ponovo formatirani u potpuno humana IgG4/lambda antitela za analizu vezivanja. Afinitetno zrele varijante su inicijalno pregledane upotrebom Biacore kao neprečišćenog supernatanta ćelijske kulture da bi se procenili afiniteti vezivanja u poređenju sa roditeljskim 3F7 (kao što je opisano u Primeru 4(1)). Tabela 5 navodi antitela za koja je utvrđeno da imaju veći afinitet vezivanja za FXIIa beta od 3F7. Klonovi sa najvećim afinitetom su imali tendenciju da potiču iz CDR2 regiona teškog lanca i CDR 1 regiona lakog lanca.

Tabela 5. Procenjeni vezujući afiniteti 3F7 i afinitetno zrele varijante na bazi kinetike vezivanja na jednoj koncentraciji FXIIa beta. Sva antitela su testirana kao neprečišćeni IgG4 molekuli u supernatantima ćelijske kulture na Biocore A100 instrumentu. Prikazane su samo varijante sa boljim afinitetom za FXIIA nego 3F7. Videti slike 3 i 4 za lokacije biblioteke.

Na osnovu rezultata procenjenog skrininga afiniteta vezivanja, najboljih 5 mab je zatim prečišćeno i podvrgnuto detaljnoj analizi afiniteta vezivanja (kao što je opisano u primeru 4(2)). Kao što je prikazano u tabeli 6, ovi klonovi su pokazali 24 do 57 puta poboljšanje afiniteta vezivanja u poređenju sa roditeljskim 3F7.

Tabela 6: Detaljna Biacore analiza afiniteta vezivanja prečišćenog 3F7 i gornjih 5 afinitetnih zrelih varijanti za FXIIa beta iz tabele 5. Sva antitela su testirana kao potpuno humani IgG4 molekuli.

Primer 3. Proizvodnja IgG i prečišćavanje antitela poreklom iz faga prema pronalasku

1) Konstrukcija ekspresionog vektora sisara

[0120] Ekspresioni vektori sisara su konstruisani upotrebom standardnih tehnika molekularne biologije kloniranjem celog lakog lanca (varijabilnih i konstantnih domena) i varijabilnog domena teškog lanca iz odabranih Fab konstrukata izvedenih iz faga u pRhG4 vektor kao što je prethodno opisano (Jostock et al 2004. Rapid generation of functional human IgG antibodies derived from Fab-on-phage display libraries. J Immunol Methods, 289; 65-80).

2) Ćelijska kultura

[0121] 293-T ćelije prilagođene suspenziji bez seruma su dobijene od Genechoice Inc. Ćelije su kultivisane u Freestyle<™>ekspresionom medijumu (Invitrogen) dopunjenim penicilinom/streptomicinom/fungizon reagensom (Invitrogen). Pre transfekcije ćelije su održavane na 37°C u vlažnim inkubatorima sa atmosferom od 8% CO2.

3) Prolazna transfekcija

[0122] Prolazna transfekcija ekspresionog vektora sisara upotrebom 293-T ćelija je izvedena upotrebom reagensa za transfekciju 293fektinom (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. Ekspresioni vektori lakog i teškog lanca su kombinovani i ko-transfektovani sa 293-T ćelijama. Ćelije (1000 ml) su transfektovane u konačnoj koncentraciji od 1 × 10<6>vijabilnih ćelija/ml i inkubirane u Cellbag 2L (Wave Biotech/GE Healthcare) tokom 5 dana na 37°C u atmosferi od 8% CO2na 2/10 Wave Bioreactor sistemu 2/10 ili 20/50 (Wave Biotech/GE Healthcare). Uslovi kulture su bili 35 ljuljanja u minuti sa uglom od 8°. Pluronic<®>F-68 (Invitrogen), do konačne koncentracije od 0.1% v/v, dodat je 4 sata nakon transfekcije.24 sata nakon transfekcije ćelijske kulture su dopunjene Triptonom N1 (Organotechnie, France) do konačne koncentracije od 0.5 % v/v. Supernatanti ćelijske kulture su sakupljeni centrifugiranjem na 2500 rpm i zatim su propušteni kroz 0.45 µM filter (Nalgene) pre prečišćavanja.

4) Analiza ekspresije proteina

[0123] Posle 5 dana, 20 µl supernatanta kulture je podvrgnuto elektroforezi na 4-20% Tris-Glicin SDS poliakrilamidnom gelu i antitelo je vizuelizovano bojenjem sa Coomassie Blue reagensom.

5) Prečišćavanje antitela

[0124] Monoklonska antitela su prečišćena upotrebom tandemske afinitetne hromatografije za protein A i hromatografije na koloni sa odsoljavanjem. Hromatografija pomoću Hitrap MabSelect sure (1 ml, GE Healthcare, UK) i Desalting (HiPrep 26/10, GE Healthcare, UK) smola je razvijena upotrebom AKTA express (GE Healthcare, UK) prema postupku preporučenom od proizvođača. Ukratko, ekvilibracija afinitetne kolone Proteina A izvedena je u 1 X MT-PBS puferu. Filtrirani kondicionirani medijum ćelijske kulture (500 ml) je primenjen na kolonu brzinom od 1 ml/min i ispran uzastopno sa 1 X MT-PBS (10 ml) i 10 mM Tris, 0.5 M arginina, 150 mM NaCl pH 7.2 (80 ml). Vezano antitelo je zatim eluirano sa 0.1 M Na acetatom pH 3.0 (8 ml) i odmah primenjeno na kolonu za odsoljavanje. Koncentracija antitela je određena hromatografski upoređivanjem sa standardima kontrolnih antitela. Proteinske frakcije su sakupljene i koncentrovane upotrebom Amicon UltraCel 50K centrifugalnog uređaja (Millipore) pre sterilne filtracije upotrebom filtera od 0.22 um.

[0125] Čistoća antitela je analizirana pomoću SDS-PAGE, gde je 2 µg proteina u redukcionom puferu za uzorke (Invitrogen, CA) stavljeno na Novex NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen, CA) i konstantan napon od 200V je primenjen 40 minuta u XCell SureLock Mini-Cell (Invitrogen, CA) sa reakcionim puferom NuPAGE MES SDS pre nego što se vizuelizuje upotrebom Coomassie boje, prema uputstvima proizvođača.

Primer 4. Određivanje afiniteta antitela - Biacore analiza

1) Procenjeni afiniteti vezivanja iz neprečišćenih supernatanata antitela

[0126] Anti-humani (kozji anti-humani IgG (gama) mišji adsorbovani, Invitrogen, kat. br. H10500) je hemijski imobilisan na površini CM-5 senzora upotrebom hemije spajanja amina. Supernatanti kulture su razblaženi 1/60 sa tekućim puferom pre hvatanja. Antitela su uhvaćena tokom 180 sekundi, što predstavlja prosečno hvatanje od 800 jedinica odgovora (RU). FXIIa beta je zatim ubrizgan na nuli i 100 nM tokom 180 sekundi, i disociran na 180 sekundi. Svi testovi su sprovedeni na Biacore A100 instrumentu na 37 stepeni Celzijusa i podaci su prilagođeni kinetičkom modelu 1:1.

2) Detaljna analiza afiniteta vezivanja

[0127] Anti-humano (kozji anti-humani IgG (gama) mišji adsorbovani, Invitrogen, Kat. br. H10500) ili anti-mišje Fc specifično antitelo (Jackson Immuno Research Labs inc. Kat. br.515-005-071) je hemijski imobilizovano na površini CM-5 senzora upotrebom hemije spajanja amina. Imobilizovana antitela su zatim korišćena za hvatanje anti-FXII/FXIIa mAb iz rastvora.

[0128] Humani FXII ili FXIIa beta je zatim ubrizgan preko uhvaćenog antitela u različitim koncentracijama radi detaljne kinetike vezivanja. Odgovori iz referentne protočne ćelije (u kojoj mAb nije uhvaćeno, ali je inače tretirano identično) su oduzeti. Odgovori sa prazne injekcije su zatim oduzeti od rezultujućih senzorgrama.

[0129] Konačni ispravljeni odgovori su prilagođeni upotrebom nelinearne regresije na model koji opisuje kinetiku 1:1, uključujući termin za ograničenje transporta mase. Vrednost Rmax je podešena lokalno, da bi se uzela u obzir mala odstupanja u nivou uhvaćenog mAb. Određena je brzina asocijacije (ka), brzina disocijacije (kd) i ravnotežna konstanta disocijacije (KD).

[0130] Za detaljnu kinetiku vezivanja, FXII je injektiran pri 0, 15.1, 31.25, 62.5, 125, 250 i 500 nM, u duplikatu, a FXIIa beta je injektiran pri 0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 i 40nM, sa 10 nM u duplikatu.

[0131] Za antitelo 3F7, regeneracija je izvršena nakon svakog ciklusa sa 90 sekundi injekcije od 100 mM H3PO4. Za mab OT-2, regeneracija je izvršena nakon svakog ciklusa sa 60 sekundi injekcije 25 mM glicina, pH 1.7, nakon čega je usledila 30 sekundi injekcija 25 mM glicina, pH 8.6. Svi testovi su sprovedeni na 25°C.

Primer 5. Poređenje 3F7 sa drugim inhibitorima antitela amidolitičke aktivnosti FXIIa.

[0132] Pregledom relevantne naučne literature otkriveno je da iako je opisan niz antitela koja mogu da moduliraju aktivnost FXII, većina njih je ili usmerena na teški lanac i sprečava početnu kontaktnu aktivaciju FXII ili je usmerena na laki lanac i izgleda da samo delimično inhibira amidolitičku aktivnost FXII. Cilj ovog rada bio je da se uporedi 3F7 sa antitelom OT-2 za koje se tvrdi da potpuno blokira amidolitičku aktivnost FXIIa (Dors et al., A novel sensitive assay for functional FXII based on the generation of kallikrein-C1-inhibitor complexes in FXII deficient plasma by glass-bound Factor XII. Thrombosis and Haemostasis, 1992, vol. 67, p.

644-648; Citarella et al., Structure/function analysis of human factor XII using recombinant deletion mutants. European Journal of Biochemistry, 1996, vol.238, p.240-249).

1) Inhibicija amidolitičke aktivnosti FXIIa sa 3F7 i OT-2 antitelima

[0133] Aktivnost 3F7 i OT-2 antitela je upoređena u in vitro testu amidolitičke aktivnosti FXIIa, u suštini kao što je opisano u Primeru 1(5). Oba antitela su bila u stanju da potpuno blokiraju amidolitičku aktivnost FXIIa (Slika 5).

2) Biacore analiza vezivanja 3F7 i OT-2 mAb za FXII i aktivirani FXIIa beta

[0134] Dok se pokazalo da i 3F7 i OT-2 potpuno blokiraju amidolitičku aktivnost FXIIa, 3F7 je pokazao malu, ali ponovljivu ~2 puta veću potenciju u ovom testu. Da bismo utvrdili da li 3F7 i OT-2 dele sličan epitop na FXIIa, prvobitno smo izvršili kompetitivni ELISA test sa ovim antitelima i pokazali da su u stanju da su u efikasnoj kompeticiji jedni sa drugima za vezivanje za FXIIa (podaci nisu prikazani).

[0135] Da bismo dalje okarakterisali uporedno vezivanje ovih antitela za FXII, izveli smo Biacore eksperimente sa oba antitela protiv neaktiviranog FXII i katalitički aktivnog FXIIa beta. Rezultati ovog eksperimenta su prikazani u tabeli 7 i pokazuju da dok OT-2 pokazuje ekvivalentan afinitet vezivanja za FXII ili aktivirani FXIIa beta, 3F7 pokazuje jasnu prednost vezivanja za aktivirani oblik FXII (FXIIa). Ovi rezultati pokazuju da, iako se čini da se oba antitela vezuju za slične regione na lakom lancu FXII, izgleda da ne dele identičan epitop. Sposobnost 3F7 da se prvenstveno vezuje za aktivirani FXII može dati farmokinetičku i/ili farmakodinamičku prednost.

Tabela 7: Detaljna Biacore analiza afiniteta vezivanja prečišćenih IgG monoklonskih antitela 3F7 i OT-2 za FXIIa beta.

Primer 6: Identifikacija ključnih FXIIa ostataka uključenih u vezivanje 3F7

[0136] Nakon što smo pregledali 3F7 zbog njegove sposobnosti da inhibira aktivnost FXIIa kod brojnih vrsta (podaci nisu prikazani), utvrdili smo da je 3F7 veoma potentan protiv mišjeg i humanog FXIIa, ali ne i pacovskog FXIIa. Koristeći ove informacije, istražili smo koji ključni ostaci unutar FXIIa lakog lanca mogu biti uključeni u epitop 3F7 generisanjem rekombinantnog mišjeg FXII (koji 3F7 prepoznaje pomoću Western analize) i mutiranjem različitih ostataka koji su se razlikovali od aminokiselina pacova (vidi sliku 6). Kao što rezultat pokazuje, mutiranje pozicije 398 ili 438 ukida vezivanje 3F7.

1. Konstrukcija i ekspresija divljeg tipa i mutantnog mišjeg faktora XII (Mu-FXII)

[0137] cDNK koja kodira ceo protein Mu-FXII (GenBank pristupni broj NM_021489) dobijena je od GeneART AG (Regensberg, Germany). Ova cDNK je korišćena kao šablon za pravljenje sledećih odvojenih promena ostataka standardnim PCR tehnikama: a) N376D, b) A385D, c) N398K, d) W420R, e) R427H, f) I438A, g) Q450R, h) delE451, i) S452G, j) K453R, T454K, k) G472S, l) N516S, m) T538A i n) A589D. Sa izuzetkom f) I438A, ove promene ostataka su odgovarale prelasku sa ostatka miša na njegov ortolog pacova (GenBank pristupni br. NM_001014006) (videti sliku 6A). U slučaju h), ovo je uključivalo deleciju Glu451. Generisan je još jedan mutant (o), višestruki mutant koji uključuje promene aminokiselina od miša do pacova E552D, T555V i A556T. Svi konstrukti su modifikovani na 3' kraju da kodiraju C-terminalni 8xHis-obeleživač, kloniran u ekspresioni vektor sisara pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, USA) i sekvenca je potvrđena analizom DNK sekvence.

[0138] Freestyle<™>293 suspenzione ćelije (Invitrogen) su gajene do 1.1 × 10<6>ćelija/ml u 5ml Freestyle ekspresionom medijumu (Invitrogen). 7 µL 293Fektin (Invitrogen) reagensa za transfekciju je prethodno inkubirano 5 minuta sa 167 µL Opti-MEM I medijuma (Invitrogen), zatim je dodato u 5 µg plazmidne DNK koja kodira divlji tip ili mutant Mu-FXII i smeša je inkubirana dodatnih 20 minuta. Kompleks DNK-293Fektin je dodat ćelijama koje su kultivisane 6 dana na 37 °C, 8% CO2u inkubatoru za mućkanje na 250 rpm. Supernatanti kulture su sakupljeni centrifugiranjem na 2000 rpm tokom 5 minuta i čuvani na 4 °C za analizu.

2. Western bloting

[0139] Supernatanti koji sadrže rekombinantni divlji tip ili mutantni mu-FXII su dodati u jednake zapremine 2× neredukcionog pufera za uzorke, inkubirani na 80°C tokom 10 minuta i zatim stavljeni na prethodno izlivene 4-12% Bis-Tris gelove (Invitrogen) i podvrgnuti elektroforezi 1 sat na 200V. Proteini su zatim elektroforetski prebačeni na nitrocelulozne filtere i blokirani 1 sat u 5% mleka u prahu u Tris-puferisanom fiziološkom rastvoru sa 0.05% Tween-20 (TTBS). Filteri su zatim inkubirani 1 sat sa 3F7 mAb ili anti-His mAb 3H3 (oba 1 mg/mL u TTBS sa 5% mleka u prahu), temeljno isprani sa TTBS, a zatim inkubirani još sat vremena sa anti-humanim IgG -FITC ili anti-mišjim IgG-FITC, respektivno (Millipore, SAD; oba na 0.25 mg/ml u TTBS sa 5% mleka u prahu). Nakon daljeg ispiranja membrana u TTBS, proteini vezani za Ab-FITC su vizuelizovani korišćenjem analizatora promenljivog režima Typhoon (GE Healthcare, USA). Rezultati su prikazani na slici 6B. Vezivanje 3F7 se ukida kada su ostaci 398 i 438 mišje sekvence mutirani, što ukazuje da ova dva ostatka mogu biti deo epitopa mAb 3F7.

Primer 7: Prevencija FeCl3-indukovane arterijske tromboze kod miševa sa intravenskim tretmanom monoklonskim antitelom 3F7

[0140] Prethodne studije (npr. otkrivene u WO2006066878) su pokazale da je inhibicija FXIIa sprečila FeCl3-indukovanu arterijsku trombozu kod miševa. Cilj ove studije bio je da se istraži da li su miševi zaštićeni i od arterijske tromboze tretmanom specifičnim monoklonskim antitelom usmerenim protiv faktora koagulacije XIIa (MAb 3F7).

Metode

[0141] Grupe za tretman su bile kao što su prikazane u tabeli 8:

Tabela 8: Grupe tretmana

[0142] Miševi soja NMRI, dobijeni iz Charles River Laboratories, ženke, starosti 6-8 nedelja, težine između 25 i 39 g, primili su jednu i.v. injekciju rastvora za tretman kao što je navedeno u tabeli 8 na t=-15 min u dubokoj anesteziji. Nakon toga, kvantitativno su određeni efekti tretmana na stopu trombotičke okluzije. Osnovni protok krvi određen je postavljanjem ultrazvučne sonde oko izložene arterije karotis. Za pokretanje tromboze, 0.5 mm<2>(0.5×1.0 mm) deo filter papira zasićen sa 10% rastvorom gvožđe hlorida stavljen je na arteriju carotis nishodno od sonde za protok na t=0 min. Posle 3 minuta filter papir je uklonjen i protok krvi je praćen 60 minuta da bi se utvrdila pojava trombotičnih okluzija.

[0143] Nakon perioda posmatranja od 60 minuta, uzorci krvi su uzeti od ispitivanih životinja (antikoagulant: 10% citrat). Nakon toga, plazma je pripremljena prema standardnim metodama i duboko zamrznuta (-80 °C ± 10 °C) do određivanja aPTT (aktivirano parcijalno tromboplastinsko vreme), PT (protrombinsko vreme) i FXIIa-aktivnosti.

Određivanje aPTT:

[0144] APTT je određen dodavanjem 50 µL ispitivanih uzoraka plazme (vidi gore) u 50 µL Patromtin SL (Siemens HealthCare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany), nakon čega je usledila faza inkubacije od 120 sekundi na 37 °C. Zatim je dodato 50 µL rastvora kalcijum hlorida (25 mM, Siemens HealthCare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany) da bi se započela reakcija.

Određivanje PT:

[0145] PT je određen dodavanjem 50 µL ispitivanih uzoraka plazme (vidi gore) u 100 µL aktivacionog reagensa Thromborel S (Siemens HealthCare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany) nakon 15 sekundi vremena inkubacije na 37°C.

Određivanje FXIIa-aktivnosti:

[0146] FXIIa-aktivnost je određena upotrebom testa zasnovanog na aPTT i upoređena sa referentnom krivom dobijenom sa razblaženjima standardne humane plazme i plazme sa deficijencijom FXII (Siemens HealthCare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany).

50 µL ispitivanih uzoraka plazme (vidi gore), koji su prethodno razblaženi 1:5 sa imidazol puferskim rastvorom (Siemens HealthCare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany), dodato je u 50 µL plazme sa deficijencijom FXII. Posle vremena inkubacije od 30 sekundi na 37 °C, dodato je 50 µL Patromtina SL (Siemens HealthCare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany) i rastvor je nakon toga inkubiran 120 sekundi na 37 °C. Zatim je dodato 50 µL rastvora kalcijum hlorida (25 mM, Siemens HealthCare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany) da bi se započela reakcija.

[0147] Sve tri analize su obavljene u BCT (Behring Coagulation Timer; Siemens HealthCare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany) u skladu sa uslovima koje je predložio dobavljač odgovarajućih reagenasa za analizu (Siemens HealthCare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany).

Rezultati:

[0148] Intravenska injekcija od 30 mg/kg, 20 mg/kg, 10 mg/kg i 5 mg/kg MAb 3F7 je rezultirala potpunom zaštitom od FeCl3-indukovane okluzije arterije karotis miševa (Tabela 9, Slika 7). Pri opadajućim dozama (tj.2.5 – 0.5 mg/kg), stope okluzije su se povećavale dok se vreme do okluzije smanjivalo u zavisnosti od doze (Tabela 9, Slika 7). U poređenju sa kontrolama, PT je bio nepromenjen (Tabela 10, Slika 9) dok je aPTT bio produžen oko četiri puta pri visokim dozama (Tabela 10, Slika 8). FXIIa-aktivnost je bila skoro potpuno inhibirana pri dozi od 10 mg/kg i više, a i dalje je prepolovljena pri dozi od 0.5 mg/kg (Tabela 10, Slika 10). Pored toga, aPTT se smanjio dok se aktivnost FXIIa povećavala u zavisnosti od doze pri opadajućim dozama MAb 3F7 (tabela 10, slike 8 i 10). Kontrolni MAb nije pokazao zaštitu od FeCl3-indukovane okluzije arterije karotis i vrednosti aPTT, PT i FXIIa-aktivnosti su nepromenjene (tabele 9, 10, slike 7 do 10).

Tabela 9: Stope okluzije

Tabela 10: PT, aPTT i FXIIa-aktivnost (srednja vrednost±SD)

Diskusija:

[0149] Ova studija je pokazala da su miševi bili potpuno zaštićeni od arterijske tromboze nakon intravenskog tretmana sa MAb 3F7 u dozi od 5 mg/kg ili više. Sa smanjenjem doza, stope okluzije su se povećavale, dok se vreme do okluzije smanjivalo u zavisnosti od doze. U poređenju sa kontrolama, PT je bio nepromenjen dok su aPTT i FXIIa-aktivnost bile doznozavisno produžene i smanjene, respektivno. Ukratko, MAb 3F7 je pokazao izuzetan profil efikasnosti i poželjan odnos doza-odgovor.

Primer 8: Efekti anti-FXIIa monoklonskog antitela 3F7 na hemostazu u modelu subakvatičnog krvarenja kod miševa

[0150] Primer 7 je pokazao da MAb 3F7 u potpunosti sprečava FeCl3-indukovanu arterijsku trombozu kod miševa u dozama od 30 - 5 mg/kg. Pored ovog efekta, FXIIa-aktivnost je bila skoro potpuno inhibirana i aPTT je produžen do četiri puta pri ovim zaštitnim dozama. Da bi se razjasnilo pitanje da li takvi efekti mogu uticati na fiziološku hemostazu, cilj ove studije je da se ispita MAb 3F7 u pogledu njegovog uticaja na hemostazu u modelu krvarenja mišjeg repa pri najnižoj potpuno zaštitnoj dozi (tj.5 mg/kg) kao i 5 puta iznad ove doze (tj.25 mg/kg).

Metode

[0151]

Tabela 11: Grupe tretmana

[0152] Ženke NMRI miševa su dobijene iz Charles River Laboratories (Kisslegg). Imale su 6 do 8 nedelja i težile su od 25 do 32 g.

[0153] Hemostaza je određena u subakvatičnom modelu. Ukratko, parametri krvarenja iz vrha repa određeni su kvantitativnim određivanjem vremena do hemostaze i gubitka krvi. Zapremina ukupnog gubitka krvi izračunata je merenjem hemoglobina prisutnog u fiziološkom rastvoru koji se koristi za potapanje vrha repa. Shodno tome, uzet je u obzir hemoglobin životinja. Sečenje vrha repa je obavljeno skalpelom u dubokoj anesteziji (Narcoren), pri čemu je uklonjeno oko 3 mm vrha repa. Odmah nakon lezije, vrh repa je potopljen u fiziološki rastvor, koji je održavan na fiziološkoj temperaturi tela miševa korišćenjem vodenog kupatila. Period posmatranja za praćenje krvarenja bio je 30 min. Svi test artikli su primenjivani i.v. na 5 min. pre početka perioda posmatranja (rezanje repa).

Rezultati:

[0154] Nezavisno od grupe, sve životinje su pokazale hemostazu u periodu posmatranja (Tabela 12). Vreme do hemostaze i ukupni gubitak krvi nisu se razlikovali između grupa (tabele 12 i 13, slike 11 do 14; Kruskal-Wallis test: p>0.05).

Tabela 12: Učestalost i vreme do hemostaze u roku od 30 minuta nakon tretmana sa MAb 3F7

(n=10/grupi)

Tabela 13: Ukupan gubitak krvi nakon tretmana sa MAb 3F7 (n=10/grupa)

Diskusija:

[0155] Iz rezultata ove studije može se zaključiti da dve primenjene doze MAb 3F7 (5 i 25 mg/kg), snažno sprečavaju FeCl3-indukovanu arterijsku trombozu kod miševa, nisu imale efekte na fiziološku hemostazu korišćenjem modela krvarenja mišjeg repa.

Primer 9: Poređenje aPTT 3F7 i afinitetno-sazrelih verzija

[0156] Aktivirano parcijalno tromboplastinsko vreme (aPTT) je određeno u standardnoj humanoj plazmi (SHP, Dade Behring), gde su različite količine odgovarajućeg inhibitora dodavane u fiziološki rastvor do ukupne zapremine od 200 µL. 50 µL ovog rastvora je dodato u 50 µL Patromtina SL (Dade Behring) i inkubirano 120 sekundi na 37°C. Zatim je dodato 50 µL rastvora kalcijum hlorida (25 mM) da bi se započela reakcija.

[0157] Postupak je izveden u BCS XP (Behring Coagulation System) prema uslovima koje je predložio proizvođač.

[0158] Upoređivan je aPTT OT-2, MAb 3F7 i afinitetno zrelih verzija MAb 3F7. Rezultati su prikazani na slici 15. Afinitetno zrele verzije MAb 3F7 su značajno bile aktivnije od OT-2 i originalnog MAb 3F7.

Primer 10: Poređenje inhibicije faktora XIIa-alfa pomoću različitih antitela

[0159] Izveden je test inhibicije, u suštini kao što je opisan u Primeru 1(5) gore. U ovom slučaju, 3F7, afinitetno sazreli 3F7 derivati i OT-2 su upoređivani u različitim molarnim odnosima sa humanim faktorom XIIa-alfa, u rasponu od 1:0.1 do 1:10. Podaci su prikazani u tabeli 14 ispod i na slici 16.3F7 i afinitetno sazreli derivati su pokazali bolju inhibiciju od OT-2, a veća količina OT-2 je bila potrebna da bi se postigla maksimalna inhibicija nego 3F7 i njegovih derivata.

Tabela 14:

Claims

Patentni zahtevi

1. Anti-Faktor XII/XIIa-beta monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži:

2. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što vH region ima sekvencu SEQ ID NO: 73.

3. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što vH region ima sekvencu SEQ ID NO: 74.

4. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što vH region ima sekvencu SEQ ID NO: 76.

5. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačeno time što antitelo je humani IgG ili njegova varijanta.

6. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 5, naznačeno time što IgG je IgG4.

7. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačeno time što je vL region više od 94% identičan sa SEQ ID NO: 5.

8. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačeno time što je vL region više od 96% identičan sa SEQ ID NO: 5.

9. Nukleinska kiselina koja kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu.

10. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 9, operativno vezan sa odgovarajućom sekvencom promotora.

11. Ćelijska linija ili ćelija kvasca koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 10.

12. Postupak za proizvodnju antitela ili njegovog fragmenta prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, koji sadrži kultivisanje ćelijske linije ili ćelije kvasca prema patentnom zahtevu 11 pod odgovarajućim uslovima za ekspresiju antitela i prečišćavanje antitela iz supernatanta kulture.

13. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 za upotrebu u medicini.

14. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju poremećaja izabranog iz grupe koja se sastoji od formiranja venskog, arterijskog ili kapilarnog tromba, formiranja tromba u srcu, tromboembolije, formiranja tromba tokom i/ili nakon kontakta krvi čoveka ili životinje sa veštačkim površinama, sprečavanjem formiranja i/ili stabilizacije tromba i na taj način trodimenzionalnog rasta intraluminalnog tromba, ili sprečavanjem i/ili lečenjem intraluminalnog tromba.

15. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, naznačeno time što formiranje venskog ili arterijskog tromba je moždani udar, infarkt miokarda, duboka venska tromboza, tromboza portalne vene, tromboembolija, tromboza bubrežne vene, tromboza jugularne vene, cerebralna venska sinusna tromboza, Budd-Chiari sindrom ili Paget-Schroetter-ova bolest.

16. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, za upotrebu u prevenciji ili lečenju naslednog angioedema.

17. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, naznačeno time što se formiranje tromba tokom i/ili posle kontakta krvi sa veštačkim površinama dešava tokom i/ili posle medicinske procedure sprovedene na pomenutom ljudskom ili životinjskom subjektu i, pri čemu se navedeno antitelo primenjuje pre i/ili tokom i/ili posle pomenute medicinske procedure, i dalje pri čemu

18. Medicinski uređaj obložen antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačen time što uređaj je kardiopulmonalna bajpas mašina, ekstrakorporealni membranski sistem oksigenacije za oksigenaciju krvi, uređaj za potpomognuto pumpanje krvi, uređaj za dijalizu krvi, uređaj za ekstrakorporealnu filtraciju krvi, spremište za upotrebu u prikupljanju krvi, intraluminalni kateter, stent, veštački srčani zalistak i/ili pribor za bilo koji od navedenih uređaja uključujući cevi, kanile, centrifugalnu pumpu, zalistak, port i/ili diverter.

19. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8.