RS66646B1 - Formulacije suvog praška vezujućih antitela za timusni stromalni limfopoetin (tslp) i postupci njihove upotrebe - Google Patents

Description

Opis

OBLAST OBELODANJIVANJA

[0001] Predmetna tehnika se uopšteno odnosi na fragmente koji se vezuju za antigen anti-TSLP antitela, formulacije fragmenata suvog praška koji se vezuju za antigen izvedenih iz antitela specifičnih za timusni stromalni limfoprotein (TSLP), kao i na postupke lečenja astme, uključujući blagu, umerenu i tešku astmu, eozinofilne astme i ne/blage eozinofilne astme, koristeći suvi prašak putem plućne isporuke. Formulacije suvog praha uključuju mešavinu leucina i trileucina koje rezultiraju formulacijom koja je posebno pogodna za isporuku fragmenata koji se vezuju za antigen koji su izvedeni iz anti-TSLP antitela putem inhalacije. POZADINA

[0002] Procenjuje se da astma pogađa oko 300 miliona ljudi širom sveta, uključujući sve starosne grupe, i predstavlja ozbiljan teret za zdravstveni sistem i društvo zbog gubitka produktivnosti na radnom mestu i poremećaja u porodici. ("Pocket Guide for Asthma Management and Prevention," Global Initiative for Asthma; 2019). Astma izaziva simptome kao što su piskanje, kratak dah, stezanje u grudima i kašalj koji se vremenom razlikuju u zavisnosti od pojave, učestalosti i intenziteta. Simptomi su često povezani sa bronhokonstrikcijom, zadebljanjem zida disajnih puteva i povećanom proizvodnjom sluzi. Astma može imati različite stepene simptoma i biti dobro kontrolisana, ili slabo kontrolisana, u zavisnosti od broja napada i ozbiljnosti.

[0003] Timusni stromalni limfoprotein (TSLP), citokin dobijen iz epitelnih ćelija proizveden kao odgovor na stimulanse iz okoline i proinflamatorne stimulacije, dovodi do aktivacije višestrukih inflamatornih ćelija i nizvodnih puteva. TSLP je povećan u disajnim putevima pacijenata sa astmom i u vezi je sa ekspresijom Th2 citokina i hemokina. i sa ozbiljnosti bolesti. Iako je TSLP centralni za regulaciju Th2 imuniteta, on takođe može igrati ključnu ulogu u drugim putevima upale i stoga biti relevantan za više fenotipova astme.

[0004] Isporuka antitela na TSLP pacijentu, posebno putem inhalacije, obezbedila bi poboljšani postupak lečenja za astmatične pacijente, uključujući i one sa blagom astmom kojima može biti potrebna dnevna primena malih doza.

[0005] WO 2009/035577 obelodanjuje proteine koji vezuju antigen sposobne da vežu limfoprotein strome timusa. WO 01/32144 se odnosi na sastave suvog praška koje imaju poboljšanu disperzivnost. US 2018/327489 obelodanjuje molekule koji se vezuju za timusni stromalni limfoprotein (TSLP) i postupke korišćenja navedenih molekula. WO 2017/042696 obelodanjuje ciljanu isporuku formulacija osušenih raspršivanjem u pluća. WO 2016/142426 se odnosi na TSLP vezujuće proteine.

KRATAK REZIME OBELODANJIVANJA

[0006] U prvom aspektu pronalaska, obezbeđen je fragment koji se vezuje za antigen anti-TSLP antitela koji sadrži teški lanac koji ima sekvencu datu u SEQ ID NO:28 i laki lanac koji ima sekvencu datu u SEQ ID NO:29.

[0007] U drugom aspektu pronalaska, obezbeđena je formulacija suvog praška koja sadrži više mikročestica, pri čemu mikročestice sadrže: a) 8% do 11% leucina po masi; b) 2% do 4% trileucina po masi; i c) Fab antitela timusnog stromalnog limfoproteina (TSLP) prema prvom aspektu.

[0008] U nekim otelotvorenjima, formulacija suvog praška ima komprimovanu nasipnu gustinu od 0,4-1,0 g/cm<3>.

[0009] U nekim otelotvorenjima, formulacija suvog praška dalje sadrži sredstvo za stabilizaciju stakla, pri čemu je sredstvo za stabilizaciju stakla amorfni saharid i/ili pufer.

[0010] U nekim otelotvorenjima, amorfni saharid se bira iz grupe koju čine trehaloza, saharoza, rafinoza, inulin, dekstran, manitol i ciklodekstrin. U nekim otelotvorenjima, amorfni saharid je trehaloza.

[0011] U nekim otelotvorenjima, formulacija suvog praška sadrži 10,5% leucina po masi i 2% trileucina po masi.

[0012] U nekim otelotvorenjima, formulacija suvog praška dalje sadrži surfaktant, pri čemu se surfaktant opciono bira između polisorbata-20 (PS-20), polisorbata-40 (PS-40), polisorbata-60 (PS-60), polisorbata-80 (PS-80) i poloksamer-188. U nekim otelotvorenjima, surfaktant je PS-80 prisutan u koncentraciji u opsegu od 0,27 masenih % do 2,7 masenih %. U nekim otelotvorenjima, PS-80 je prisutan u koncentraciji od 1,1% po masi.

[0013] U nekim otelotvorenjima, formulacija suvog praha sadrži više mikročestica, pri čemu mikročestice sadrže: a) 10,5% leucina po masi; b) 2% trileucina po masi; c) Fab koji se sastoji od teškog lanca koji ima sekvencu datu u SEQ ID NO:28 i lakog lanca koji ima sekvencu datu u SEQ ID NO:29; d) pufer; i e) trehalozu.

[0014] U trećem aspektu, formulacija suvog praška u skladu sa je za upotrebu u postupku lečenja, pri čemu formulacija treba da se primenjuje inhalacijom.

[0015] U nekim otelotvorenjima, formulacija suvog praška je za upotrebu u postupku lečenja astme, kao što je blaga astma, umerena astma, teška astma, eozinofilna astma ili neeozinofilna astma, ili niskoeozinofilna astma.

KRATAK OPIS SLIKA

[0016] Prethodne i druge karakteristike i aspekti ove tehnologije mogu se bolje razumeti iz sledećeg opisa otelotvorenja i kao što je ilustrovano u pratećim slikama. Prateće slike, koje su ovde inkorporirane i čine deo specifikacije, dodatno služe da ilustruju principe ove tehnologije. Slike nisu nužno u razmeri.

SL.1 pokazuje vezivanje Fab1za hu TSLP kao što je izmereno pomoću KinExA.

SL.2 pokazuje vezivanje Fab1za cino TSLP mereno pomoću KinExA.

SL.3 prikazuje kompetetivno vezivanje Fab1za hu TSLP kao meru korišćenjem HTRF testa.

SL.4 pokazuje da Fab1inhibira oslobađanje CCL17 iz PBMC-a izazvanih TSLP-om.

SL.5 pokazuje da Fab1, Fab2i Fab3inhibiraju oslobađanje CCL17 izazvano TSLP-om iz PBMC. SL.6A-6C prikazuju Fab1serum, BAL i ELF PK profile nakon inhalacije pojedinačne (Grupa 1 i 2) i ponovljene eskalacije doze (Grupa 3).

SL.7 prikazuje mikročestice iz formulacije suvog praška u skladu sa ovim otelotvorenjima.

SL.8A prikazuje rezultate komprimovane zapreminske gustine kao funkcije leucina i trileucina u formulacijama suvog praška.

SL.8B prikazuje punjenje kapsula formulacijama suvog praška koje su ovde opisane.

SL.9 prikazuje rezultate specifične površine merene korišćenjem BET-a, u m<2>/g, za mikročestice formulacija suvog praška u skladu sa ovim otelotvorenjima.

SL.10 pokazuje indirektnu korelaciju sadržaja vlage sa koncentracijom leucina.

SL.11A-11D pokazuju površinsku hrapavost mikročestica kako je detektovan SEM.

SL.12 prikazuje korelaciju između srednjeg masenog aerodinamičkog prečnika (MMAD) i vrednosti mas.% leucina i trileucina.

SL.13 prikazuje korelaciju između taloženja uređaja i vrednosti mas.% leucina i trileucina.

SL.14 prikazuje korelaciju između frakcije finih čestica (FPF) i vrednosti leucina i trileucina mas.%. SL.15A prikazuje broj sub-vidljivih čestica nakon rekonstitucije formulacije koja sadrži 40% (w/w) Fab1i različite koncentracije polisorbata-80 (PS-80) do koncentracije rastvora Fab1od 30 mg/ml (na Slici "≥" obuhvata gornju granicu veličine od 200 µm)

SL.15B prikazuje broj sub-vidljivih čestica nakon rekonstitucije formulacije koja sadrži 40% (w/w) Fab1i različite koncentracije PS-80 do koncentracije rastvora Fab1 od 2,5 mg/ml (na Slici "≥" obuhvata gornju granicu veličine od 200 µm)

SL.16A prikazuje broj sub-vidljivih čestica nakon rekonstitucije formulacije koja sadrži 40% (w/w) Fab1i različite koncentracije poloksamera-188 do koncentracije rastvora Fab1od 30 mg/ml (na Slici "≥" obuhvata gornju granicu veličine od 200 µm)

SL.16B prikazuje broj sub-vidljivih čestica nakon rekonstitucije formulacije koja sadrži 40% (w/w) Fab1i različite koncentracije poloksamera-188 do koncentracije Fab1u rastvoru od 2,5 mg/ml (na Slici "≥" obuhvata gornju granicu veličine od 200 µm)

SL.17A prikazuje procenat vlage u formulaciji koja sadrži 40% (w/w) Fab1i 1,1% PS-80 nakon skladištenja od 1 ili 3 meseca na 40°C i 75% relativnoj vlažnosti (40/75) i 3 meseca na 25°C i 60% relativne vlažnosti (25/60)

SL.17B prikazuje raspodelu veličine čestica (PSD) formulacije koja sadrži 40% (w/w) Fab1i 1,1% PS-80 nakon skladištenja 1 ili 3 meseca na 40°C i 75% relativnoj vlažnosti (40/75) i 3 meseca na 25°C i 60% relativne vlažnosti (25/60)

SL.17C prikazuje morfologiju čestica formulacije koja sadrži 40% (w/w) Fab1i 1,1% PS-80 nakon skladištenja 1 ili 3 meseca na 40°C i 75% relativnoj vlažnosti (40/75) i 3 meseca na 25°C i 60% relativne vlažnosti (25/60)

SL.18A prikazuje procenat vlage u formulaciji koja sadrži 1% (w/w) Fab1i 1,1% PS-80 nakon skladištenja od 1 ili 3 meseca na 40°C i 75% relativnoj vlažnosti (40/75) i 3 meseca na 25°C i 60% relativne vlažnosti (25/60)

SL.18B prikazuje raspodelu veličine čestica (PSD) formulacije koja sadrži 1% (w/w) Fab1i 1,1% PS-80 nakon skladištenja 1 ili 3 meseca na 40°C i 75% relativnoj vlažnosti (40/75) i 3 meseca na 25°C i 60% relativne vlažnosti (25/60)

SL.18C prikazuje morfologiju čestica formulacije koja sadrži 1% (w/w) Fab1i 1,1% PS-80 nakon skladištenja 1 ili 3 meseca na 40°C i 75% relativnoj vlažnosti (40/75) i 3 meseca na 25°C i 60% relativne vlažnosti (25/60)

SL.19A prikazuje broj sub-vidljivih čestica nakon rekonstitucije formulacije koja sadrži 40% Fab1 i 1,1% PS-80 (w/w) u koncentraciju Fab1od 30 mg/ml, nakon skladištenja na 40/75 tokom 1 ili 3 meseca i 25/60 tokom 3 meseca

SL.19B prikazuje broj sub-vidljivih čestica nakon rekonstitucije formulacije koja sadrži 1% Fab1 i 1,1% PS-80 (w/w) do koncentracije rastvora Fab1 od 0,75 mg/ml, nakon skladištenja na 40/75 tokom 1 ili 3 meseca i 25/60 tokom 3 meseca

DETALJAN OPIS

[0017] Ovde opisana formulacija suvog praška rešava neispunjenu potrebu tako što omogućava upotrebu fragmenata koji vezuju anti-TSLP antitela za lečenje astme u okruženju primarne zdravstvene zaštite.

Ispitanici koji pate od astme tipično upravljaju simptomima astme tako što sami isporučuju farmaceutske sastave, kao što su dugodelujući beta agonisti i/ili glukokortikoidi, putem inhalacije.

[0018] Dok postojeći biološki lekovi, bilo odobreni ili klinički ispitani, nude novu paradigmu lečenja pacijenata sa astmom, oni se generalno ne mogu isporučiti ispitanicima poznatim plućnim putem.

Tezepelumab, biološki lek sledeće generacije, je monoklonsko antitelo (mAb) humanog imunoglobulina G2 (lgG2) koje se vezuje za TSLP, sprečavajući njegovu interakciju sa kompleksom TSLP receptora. U nedavnoj fazi 2, nasumičnom, dvostruko slepom, placebom kontrolisanom ispitivanju, ispitanici sa astmom koji su primili potkožne injekcije tezepelumaba imali su niže stope klinički značajnih egzacerbacija astme od onih koji su primali placebo (Corren et al (2017) NEJM 377:936-946).

[0019] Ovde opisani pronalazak kombinuje terapeutske prednosti bioloških lekova sledeće generacije, kao što je tezepelumab, sa načinom davanja koji je poznatiji osobama koje pate od astme. Dakle, pronalazak omogućava da se takve terapije sledeće generacije primenjuju u okruženju primarne zdravstvene zaštite, čime se proširuje dostupnost ovih lekova na ispitanike van domašaja specijalističke nege.

[0020] Pored toga, formulacije opisane ovde mogu biti posebno korisne za lečenje pacijenata sa manje teškom astmom koji bi se normalno lečili u okruženju primarne zdravstvene zaštite. Na primer, pacijenti sa skalom Globalne inicijative za astmu (GINA) od 3 ili manje, prikladno GINA skalom od 2 ili 3, mogu biti posebno podložni lečenju ovde opisanom formulacijom. U određenim otelotvorenjima, pacijenti sa GINA skorom od 3 su podložni lečenju ovde opisanom formulacijom. U određenim otelotvorenjima, pacijenti sa GINA skorom od 2 su podložni lečenju ovde opisanom formulacijom. Štaviše, isporukom bioloških lekova direktno u pluća, neželjeni efekti povezani sa sistemskom primenom (kao što je upala na mestu injekcije) se smanjuju.

[0021] Pored toga, formulacije pružaju mogućnost lečenja pacijenata sa umereno teškom astmom koji se mogu lečiti u okruženju primarne zdravstvene zaštite, ili za lečenje pacijenata sa umereno teškom astmom sa lošim pristupom lečenju putem specijalističke nege. Na primer, formulacije mogu biti korisne za lečenje pacijenata sa umerenom i teškom astmom sa skalom Globalne inicijative za astmu (GINA) od 4-5. Pogodno, formulacije pružaju mogućnost lečenja umereno-teške astme koja je nekontrolisana. Pogodno, formulacije obezbeđuju mogućnost lečenja umereno-teške astme koja je nekontrolisana na srednjoj dozi do visoke doze ICS:LABA sa jednim ili više egzacerbacija i čestim simptomima.

[0022] Termin „oko“ se ovde koristi da znači približno, u okviru, otprilike ili oko. Kada se termin „oko“ koristi u kombinaciji sa numeričkim opsegom, on modifikuje taj opseg tako što proširuje granice iznad i ispod navedenih numeričkih vrednosti. Generalno, termin "oko" se ovde koristi za modifikovanje numeričke vrednosti iznad i ispod navedene vrednosti za varijansu od 10%.

[0023] Kao što je ovde opisano, formulacije suvog praška su obezbeđene za stabilizaciju i isporuku farmaceutski aktivnih sredstava. Pogodno, formulacije suvog praška su formulisane za isporuku u pluća, uključujući inhalaciju preko inhalatora suvog praška (DPI).

[0024] Kako se ovde koristi, „formulacija suvog praška“ odnosi se na formulaciju koja uključuje više čvrstih mikročestica u prašku koji pogodno sadrži manje od oko 20% vlage, pogodnije manje od 10% vlage, manje od oko 5-6% vlage ili manje od oko 3% vlage. Kao što je ovde opisano, formulacije suvog praška se mogu koristiti za isporuku pacijentu putem inhalacije. U drugim otelotvorenjima, formulacije suvog praška mogu da se rekonstituišu i daju u tečnom obliku, bilo oralno, intravenozno, parenteralno, itd. Kao što je ovde opisano, prednost datih formulacija suvog praška je povećana propusnost za poboljšanu proizvodnju. Dalja prednost je u tome što ovde opisana platforma za formulaciju obezbeđuje visoku komprimovanu nasipnu gustinu. To znači da se po jedinici isporuke može upakovati veća masa praška (npr. unutar kapsule). To znači da se visoka doza aktivnog sredstva može isporučiti ispitaniku po jedinici isporuke. Ova iznenađujuća prednost može poboljšati usaglašenost pacijenata smanjenjem broja jediničnih doza koje su potrebne za uzimanje. Pored toga, visoka komprimovana zapreminska gustina može omogućiti isporuku veće doze aktivnog sredstva, povećavajući gornji kraj opsega primenjenih doza. Ovo može omogućiti isporuku aktivnih sredstava u terapeutski efikasnim dozama gde to ranije nije bilo moguće.

[0025] „Mikročestica“ kako se ovde koristi odnosi se na čvrstu česticu čija je srednji prečnik mase (MMD) manji od 20 µm. Srednji prečnik mase je mera srednje veličine čestica mikročestica, merena korišćenjem odgovarajuće postupke, uključujući na primer centrifugalnu sedimentaciju, elektronsku mikroskopiju, rasejanje svetlosti, lasersku difrakciju itd.

[0026] Ovde opisane formulacije suvog praška prikladno sadrže više mikročestica. Kako se ovde koristi, "množina" se odnosi na 2 ili više predmeta, i prikladno se odnosi na 5 ili više, 10 ili više, 50 ili više, 100 ili više, 500 ili više, 1000 ili više, itd.

[0027] Kao što je ovde navedeno, formulacije suvog praška uključuju više mikročestica, mikročestice sadrže 8% do 11% leucina; 2% do 4% trileucina po masi; i Fab fragmenta koji se vezuje za anti-TSLP antitelo definisan ovde. Osim ako nije drugačije navedeno, "aktivno sredstvo" se odnosi na fragment koji se vezuje za antigen izveden iz anti-TSLP antitela, kako je ovde definisano.

[0028] SL.7 prikazuje skenirajući elektronski mikrograf mikročestica primerne formulacije suvog praška date ovde. U daljim obelodanjivanjima, formulacije suvog praška uključujući mnoštvo ili mikročestice pogodno sadrže oko 1% do oko 25% leucina; oko 1% do oko 10% trileucina; i aktivno sredstvo.

[0029] Kako se ovde koristi „leucin“, bez obzira da li je prisutan kao pojedinačna aminokiselina ili kao aminokiselinska komponenta peptida, odnosi se na aminokiselinu leucin (C6H13NO2), koja može biti racemska smeša ili u svom D- ili L-obliku, kao i na modifikovane oblike leucina gde je jedan ili više atoma leucina bio zamenjen sa jednim ili više atoma leucina (tj. funkcionalna grupa). Hemijska struktura leucina je data u nastavku:

[0030] „Trileucin“ kako se ovde koristi odnosi se na hemijsko jedinjenje u kome su tri molekula leucina povezana zajedno u peptid, kao leucin-leucin-leucin (Leu-Leu-Leu), C18H35N3O4. Hemijska struktura trileucina je data u nastavku:

[0031] Količine leucina i trileucina date ovde, osim ako nije drugačije navedeno, date su kao maseni procenti (mas.%) formulacija. Pošto formulacije suvog praška sadrže u suštini malo vode, ako uopšte i ima, masene komponente formulacija suvog praška su stoga procenti suve mase finalnih formulacija.

[0032] U otelotvorenjima formulacije koje sadrže leucin; trileucin; i fragment koji se vezuje za antigen, leucin i trileucin se drže u željenom opsegu odnosa koji obezbeđuje poboljšane karakteristike komprimovane zapreminske gustine opisane ovde, kao i obezbeđivanje željenih karakteristika mikročestica koje omogućavaju poboljšano skladištenje i isporuku.

[0033] Osim ako nije drugačije navedeno, odnosi opisani ovde su izraženi kao odnosi po težini (w/w - takođe se naziva "maseni odnos"), to jest, masa leucina: masa trileucina u formulacijama koje su ovde opisane. Odnosi se postižu obezbeđivanjem željene koncentracije leucina i trileucina u mg/mL u sirovini, a zatim sušenjem da bi se uklonio rastvarač sirovine što rezultira atomizovanom mikročesticom gde se početni odnos koncentracije (izražen u mg/mL) održava kao konačni odnos leucin:trileucin po masi.

[0034] Primeri masenih procenata za leucin i trileucin koji se mogu koristiti u formulacijama suvog praška za postizanje ovih odnosa su opisani ovde. Formulacije suvog praška sadrže 8% do 11% leucina i 2% do 4% trileucina, a u otelotvorenjima, formulacije suvog praška sadrže oko 10,5% leucina i oko 2% trileucina.

[0035] Formulacije suvog praška sadrže 2% do 4% trileucina po masi. U nekim otelotvorenjima, formulacija suvog praška sadrži oko 2%, oko 2,5%, oko 3%, oko 3,5%, oko 4%, trileucin, po masi.

[0036] Formulacije suvog praška sadrže 8% do 11% leucina po masi. U nekim otelotvorenjima, formulacije suvog praška sadrže oko 8%, oko 8,5%, oko 9%, oko 10%, oko 10,5% ili oko 11% leucina po masi.

[0037] Formulacije suvog praška sadrže oko 8% do oko 11% leucina i oko 2% do oko 4% trileucina po masi, pogodnije oko 9% do oko 11% leucina i oko 2% do oko 3% trileucina po masi. U primernim otelotvorenjima, formulacije suvog praška sadrže oko 10,5% leucina i oko 2% trileucina po masi.

[0038] Kao što je ovde opisano, iznenađujuće je pronađeno da upotreba kombinacije leucina i trileucina u formulaciji suvog praha omogućava smanjenje ukupne količine leucina i trileucina koja je potrebna za pripremu mikročestica, u poređenju sa formulacijama suvog praška koje sadrže samo jednu od ovih komponenti, dok i dalje obezbeđuje željenu stabilnost. U određenim otelotvorenjima, formulacije predmetnog pronalaska imaju povećanu komprimovanu zapreminsku gustinu u poređenju sa formulacijama u struci, što može omogućiti isporuku veće koncentracije aktivnog sredstva u pluća pacijenta nakon inhalacije. Čini se da su ove poboljšane karakteristike povezane sa ugradnjom leucina i trileucina u mikročestice.

[0039] Primer procesa pripreme formulacije suvog praha, u skladu sa ovim otelotvorenjima, može se odvijati na sledeći način. Tečna sirovina koja sadrži željene krajnje komponente formulacije suvog praška se atomizuje pomoću raspršivača do fine magle. Magla se zatim osuši kako je ovde opisano. Raspršene kapljice sadrže rastvorene komponente, u početku kao tečne kapljice. Kako se kapljica suši, različite komponente formulacije počinju da se zasićuju i talože različitim brzinama. Kao što je ovde opisano, omotač počinje da se formira oko spoljne površine mikročestica formulacija suvog praška. Ova ljuska prikladno uključuje komponente leucina i trileucina na spoljnoj površini ljuske. Treba napomenuti da se leucin i trileucin prvenstveno nalaze na spoljnoj površini mikročestica, dok se manje količine leucina i trileucina takođe mogu naći u mikročesticama. U otelotvorenjima, veća koncentracija leucina i trileucina se prikladno nalaze na ili blizu površine mikročestica, umesto blizu centra mikročestica. U otelotvorenjima, centar mikročestica sadrži značajnu količinu aktivnog sredstva, zajedno sa drugim komponentama ekscipijensa kao što je ovde opisano, pogodno u amorfnom obliku. Kako se ovde koristi, "znatna količina" aktivnog agensa znači da je najmanje oko 60% aktivnog sredstva (tj. ukupnog aktivnog sredstva u formulaciji) locirano na ili blizu centra mikročestica, pogodnije najmanje oko 70%, a pogodnije najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95% i u nekim otelotvorenjima 95-100% aktivnog agensa se nalazi u ili blizu centra mikročestica.

[0040] U daljim otelotvorenjima, mikročestice sadrže leucin i trileucin koji se nalaze u suštini kroz mikročestice, ali sa većim količinama na ili blizu površine mikročestica. Kao što se ovde koristi, „uglavnom kroz mikročestice“ znači da se leucin i/ili trileucin nalaze u gradijentu od spoljašnje površine mikročestica prema centru mikročestica, ali prikladno sa opadajućim količinama leucina i/ili trileucina kako se krećete prema centru, a u centru trileucina se ne nalaze trileucini aktivno sredstvo se nalazi. U drugim otelotvorenjima, količine leucina i trileucina mogu biti u suštini ujednačene u celom poprečnom preseku mikročestica.

[0041] U otelotvorenjima, suštinski svaka od mikročestica formulacija suvog praška sadrži leucin i trileucin. To jest, pogodno je da najmanje oko 60% mikročestica sadrži leucin i trileucin, ili najmanje oko 70%, a još pogodnije najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, a u otelotvorenjima oko 95%-100% mikrodelova i trileucina. U otelotvorenjima svaka od mikročestica formulacija suvog praška sadrži leucin i trileucin.

[0042] U dodatnim otelotvorenjima, leucin i/ili trileucin se mogu naći u formulacijama suvog praha, ali se ne nalaze u mikročestici formulacije ili nisu povezani sa njima. Tako, u otelotvorenjima, slobodni leucin i/ili trileucin koji nije povezan sa mikročesticama može se naći u formulacijama suvog praška. Međutim, generalno, količina slobodnog leucina i/ili trileucina (tj. nije povezana sa mikročesticama) je reda manje od oko 10%, manje od oko 5%, manje od oko 1%, a pogodnije manje od oko 0,1% ukupne količine leucina i/ili trileucina u formulacijama.

[0043] U određenim otelotvorenjima, formulacije suvog praška opisane ovde imaju komprimovanu nasipnu gustinu koja omogućava isporuku velike količine aktivnog sredstva. "Kompresovana zapreminska gustina" se odnosi na masu po jedinici zapremine (odgovarajuće g/cm<3>) praha kada se meri pod sledećim uslovima. Pogodan test za merenje komprimovane zapreminske gustine (cBD) je opisan u primerima (videti, npr., Primer 6). Pogodno je da se komprimovana zapreminska gustina (CBD) prahova meri pomoću analizatora gustine, kao što je GeoPyc® Model 1360 analizator gustine (Micromeritics, Norcross, GA). Uzorci praška se na odgovarajući način pripremaju u okruženju niske vlažnosti (< 5% RV), pre prenošenja u komoru za uzorke analizatora gustine koja je pročišćena gasovitim azotom. Neto masa uzorka praha se beleži, a zatim se sila kompresije od 10-14 N, pogodno 12 N, primenjuje na uzorak pomoću klipa, brzinom od 250-350 koraka konsolidacije u sekundi, pogodno 300 koraka konsolidacije u sekundi. Linearna udaljenost koju pređe klip za svaki korak konsolidacije se prevodi u zapreminsko pomeranje uzorka praha. Prosek merenja iz svakog koraka konsolidacije se zatim transformiše u izračunatu vrednost zapreminske gustine za formulaciju suvog praška, izraženu u g/cm<3>.

[0044] Pogodno, kompresovana nasipna gustina formulacije suvog praha koja je ovde opisana je najmanje 0,4 g/cm<3>, a pogodno između oko 0,4 g/cm<3>do oko 1,0 g/cm<3>, a još pogodnije oko 0,4-0,9 gm/cm<3>, oko 0,4-0,8 g/cm<3>, oko 0,4-0,8 g/cm<3>, 0,5-0,8 gm/cm<3>, ili oko 0,4 gm/cm<3>, oko 0,5 gm/cm<3>, oko 0,6 gm/cm<3>, oko 0,7 gm/cm<3>, ili oko 0,8 gm/cm<3>. U određenim otelotvorenjima, komprimovana zapreminska gustina formulacije suvog praška koja je ovde opisana je od oko 0,4 gm/cm<3>do oko 0,9 gm/cm<3>. U određenim otelotvorenjima, komprimovana zapreminska gustina formulacije suvog praška koja je ovde opisana je od oko 0,5 gm/cm<3>do oko 0,8 gm/cm<3>.

[0045] SL.8A prikazuje rezultate komprimovane zapreminske gustine kao funkcije leucina i trileucina u formulacijama suvog praška opisanim ovde. Svaka od kolona predstavlja količinu trileucina u formulacijama. Unutar svake kolone, količina leucina je povećana sa oko 1% na oko 20%. Kao što je prikazano, povećanje količine trileucina rezultira manjom komprimovanom zapreminskom gustinom, a povećanje leucina unutar svake grupe takođe smanjuje komprimovanu nasipnu gustinu. Da bi se postigla komprimovana zapreminska gustina od oko 0,5 g/cm<3>do oko 0,8 g/cm<3>, količinu trileucina treba održavati ispod 4% po masi.

[0046] Formulacije koje su ovde opisane sadrže fragment koji se vezuje za antigen antitela na limfopoetin strome timusa (anti-TSLP). Povoljno, pronalazači su otkrili da ovde opisane formulacije omogućavaju isporuku fragmenta koji se vezuje za antigen putem inhalacije direktno u pluća. Isporuka terapeutski aktivnog antigen-vezujućeg fragmenta anti-TSLP antitela putem inhalacije povoljno omogućava upotrebu bioloških lekova za lečenje astme u okruženju primarne zdravstvene zaštite.

[0047] Sekvenca TSLP polipeptida je data u nastavku:

[0048] Termin "antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na protein koji sadrži najmanje dva teška lanca i dva laka lanca povezana disulfidnim vezama. Termin "antitelo" obuhvata prirodna antitela kao i sve rekombinantne oblike antitela, npr. humanizovana antitela, potpuno humana antitela i himerna antitela. Svaki teški lanac se obično sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i konstantnog regiona teškog lanca (CH). Svaki laki lanac se obično sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (VL) i konstantnog regiona lakog lanca (CL). Termin "antitelo", međutim, takođe uključuje druge tipove antitela kao što su jednodomenska antitela, antitela teškog lanca, tj. antitela sastavljena samo od jednog ili više, posebno dva teška lanca, i nanotela, tj. antitela sastavljena samo od jednog monomernog varijabilnog domena.

[0049] Fragmenti za vezivanje antitela uključuju (i) Fab fragmente, monovalentne fragmente koji se sastoje od varijabilnog regiona i prvog konstantnog domena svakog teškog i lakog lanca; (ii) F(ab)2 fragmenti, bivalentni fragmenti koji sadrže dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; U određenim otelotvorenjima, fragment koji se vezuje za antitelo je Fab. U nekim otelotvorenjima, anti-TSLP antitelo iz kojeg je izveden fragment koji se vezuje za antigen je IgG1.

[0050] Sekvence primera Fab pronalaska (u daljem tekstu nazvanih Fab1) uključuju:

HCDR1 FAB1

Thr Tyr Gly Met His (SEQ ID NO: 1)

HCDR2 FAB1

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly (SEQ ID NO: 2)

HCDR3 FAB 1

Ala Pro Gln Trp Glu Leu Val His Glu Ala Phe Asp Ile (SEQ ID NO: 3)

HEAVY CHAIN VH FAB 1

LCDR1 FAB1

Gly Gly Asn Asn Leu Gly Ser Lys Ser Val His (SEQ ID NO: 5)

LCDR2 FAB 1

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser (SEQ ID NO: 6)

LCDR3 FAB1

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val (SEQ ID NO: 7)

LAKI LANAC VL FAB 1

FAB1 VARIJABILNI TEŠKI LANAC VH (nukleinska kiselina)

FAB1 VARIJABILNI LAKI LANAC VL (nukleinska kiselina)

FAB1 TEŠKI LANAC (polipeptid)

FAB1 LAKI LANAC (polipeptid)

FAB1 TEŠKI LANAC (nukleinska kiselina)

FAB1 LAKI LANAC (nukelinska kiselina)

[0051] Formulacije suvog praška prema pronalasku sadrže više mikročestica, pri čemu mikročestice sadrže: 8% do 11% leucina po masi; 2% do 4% trileucina po masi; i Fab antitela na stromalni limfoprotein timusa (TSLP) prema pronalasku.

[0052] Fragment koji se vezuje za antigen unutar formulacije suvog praška sadrži teški lanac koji ima sekvencu datu u SEQ ID NO:28 i laki lanac koji ima sekvencu datu u SEQ ID NO:29. U ovom fragmentu za vezivanje antitela:

a. varijabilni domen teškog lanca obuhvata:

CDR1 sekvenca teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 1, CDR2 sekvenca teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:2, i CDR3 sekvencu teškog lanca koja sadrži sekvencu aminokiselina datu u SEQ ID NO:3, i

b. Varijabilni domen lakog lanca obuhvata:

CDR1 sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:5, sekvencu CDR2 lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:6, i sekvencu CDR3 lakog lanca koja sadrži sekvencu aminokiselina datu u SEQ ID NO:7.

[0053] Prema tome, fragment koji se vezuje za antigen u formulaciji suvog praha prema predmetnom pronalasku sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži CDR1 sekvencu lakog lanca koja ima sekvencu aminokiselina koja je navedena u SEQ ID NO:1, CDR2 sekvencu teškog lanca koja ima sekvencu aminokiselina datu u SEQ ID NO:2, i CDR3 sekvencu teškog lanca koja ima sekvencu lakog lanca koja ima sekvencu aminokiselinskog lanca SEQ ID NO:3 i CDR1 sekvencu lakog lanca koja ima aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:5, sekvencu CDR2 lakog lanca koja ima sekvencu aminokiselina datu u SEQ ID NO:6, i CDR3 sekvencu lakog lanca koja ima sekvencu aminokiselina datu u SEQ ID NO:7.

[0054] Fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu u formulacijama suvog praška sadrži teški lanac koji ima sekvencu datu u SEQ ID NO:28; i laki lanac koji ima sekvencu datu u SEQ ID NO:29. U ovom fragmentu koji se vezuje za antigen za upotrebu u formulacijama suvog praška, varijabilni domen teškog lanca obuhvata SEQ ID NO:4; i varijabilni domen lakog lanca obuhvata SEQ ID NO:8.

[0055] U dodatnim otelotvorenjima, fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu u formulacijama suvog praška sadrži (a) varijabilni domen teškog lanca koji je kodiran polinukleotidnom sekvencom koja sadrži SEQ ID NO: 30, (b) varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od polinukleotidne sekvence koja sadrži SEQ ID NO: 31; ili varijabilni domen teškog lanca (a) i varijabilni domen lakog lanca (b).

[0056] Dalje sekvence CDR lakog lanca (LCDR), varijabilnog domena lakog lanca (VL), CDR teškog lanca (HCDR) i varijabilnog domena teškog lanca (VH) fragmenata koji se vezuju za antigen koji su ovde obelodanjeni uključuju:

LCDR1 FAB2

Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His (SEQ ID NO:11)

LAKI LANAC VL FAB2

LCDR1 FAB3

Gly Gly Asn Asn Val Gly Ser Lys Ser Val His (SEQ ID NO:13)

LAKI LANAC VL FAB3

HCDR2 FAB4

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly (SEQ ID NO:15) TEŠKI LANAC VH FAB4

HCDR2 FAB5

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Ala (SEQ ID NO:17) TEŠKI LANAC VH FAB5

LCDR1 FAB6

Gly Gly Gln Asn Leu Gly Ser Lys Ser Val His (SEQ ID NO:19)

LAKI LANAC VL FAB6

LCDR1 FAB7

Gly Gly Asn Gln Leu Gly Ser Lys Ser Val His (SEQ ID NO:21)

LAKI LANAC VL FAB7

LCDR3 FAB8

Gln Val Trp Asp Thr Ser Ser Asp His Val Val (SEQ ID NO:23)

LAKI LANAC VL FAB8

LCDR3 FAB9

Gln Val Trp Asp Ser Thr Ser Asp His Val Val (SEQ ID NO: 25)

LAKI LANAC VL FAB9

[0057] Domeni teškog varijabilnog lanca i lakog varijabilnog lanca fragmenta koji se vezuje za antigen pronalaska obuhvata kombinaciju CDR sekvenci datih u sledećoj tabeli:

[0058] Formulacija koja je ovde obelodanjena može se primeniti u kombinaciji sa dodatnim aktivnim sredstvom za upotrebu u lečenju astme. Primeri aktivnih sredstava koji se mogu primeniti u kombinaciji sa formulacijom suvog praška koja je ovde opisana uključuju, ali nisu ograničeni na, inhalacione kortikosteroide (ICS), bronhodilatatore (uključujući dugodelujuće beta agoniste (LABA), dugodelujuće antimuskarinske agoniste (LAMA), kratkodelujuće beta agoniste (SABA), i muskarinske b2-agoniste (MABA)), antihistaminike, antileukotriene, PDE-4 inhibitore, inhibitore janus kinaze i inhibitore fosfoinozitid 3-kinaze. U određenim otelotvorenjima, dodatno aktivno sredstvo je kombinovan u formulaciji pronalaska zajedno sa fragmentom koji se vezuje za anti-TSLP antitelo koji je ovde obelodanjen.

[0059] U pogodnim otelotvorenjima, formulacije suvog parška opisane ovde dalje sadrže sredstvo za stabilizaciju stakla koji pomaže u stabilizaciji formulacije, a posebno u stabilizaciji aktivnog sredstva.

„Sredstvo za stabilizaciju stakla“ se odnosi na ekscipijens koji stabilizuje aktivno sredstvo (pogodno polipeptid) u formulaciji suvog praška, pogodno zamenom vode na površini aktivnog sredstva tokom sušenja, ili na drugi način ometa proces degradacije, i formira amorfnu čvrstu supstancu koja uključuje aktivno sredstvo. Primeri sredstava za stabilizaciju stakla uključuju amorfne saharide, polimerne šećere, pufere, soli ili sintetičke polimere (npr., poli-L-glikolnu kiselinu), kao i smeše takvih komponenti. U pogodnim otelotvorenjima, sredstvo za stabilizaciju stakla je amorfni saharid. U dodatnim otelotvorenjima, sredstvo za stabilizaciju stakla je pufer. U daljim otelotvorenjima, ovde opisane formulacije mogu uključivati i amorfni saharid i pufer, koji zajedno ili odvojeno mogu delovati kao sredstvo za stabilizaciju stakla.

Primeri amorfnih saharida za upotrebu u ovde opisanim formulacijama uključuju, ali nisu ograničeni na, trehalozu, saharozu, rafinozu, inulin, dekstran, manitol i ciklodekstrin. U nekim otelotvorenjima, amorfni saharid za upotrebu u formulaciji pronalaska je trehaloza. Pogodno, amorfni saharid je prisutan u oko 30% do oko 70% (maseni procenat) formulacije suvog praška. U daljim otelotvorenjima, amorfni saharid je prisutan na oko 30% do oko 65%, oko 35% do oko 65%, oko 35% do oko 60%, oko 40% do oko 60%, oko 30% do oko 50%, ili oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%. Pogodno, amorfni saharid je trehaloza, i prisutan je u formulacijama u količini od oko 30% -60%, pogodnije oko 35% -55%, ili oko 35%, oko 40%, oko 45% ili oko 50% mase formulacije suvog praška.

Primeri pufera koji se mogu uključiti u formulacije suvog praha, pogodno kao sredstva za stabilizaciju stakla, uključuju različite citratne pufere (kao što je natrijum citrat), fosfatni pufer, histidinski pufer, glicinski pufer, acetatni pufer i tartaratne pufere kao što su puferi kao i kombinacije pufera. Količine pufera koje se mogu uključiti u formulacije suvog praška mogu se kretati od oko 0,1% do oko 20%, pogodnije oko 0,5% do oko 15%, oko 1% do oko 10%, oko 2% do oko 8%, oko 3% do oko 7%, ili oko 1%, oko 2%, oko 3%, oko 4%, oko 5%, oko 6%, oko 7%, oko 8%, oko 9%, oko 10%.

[0062] Puferi takođe obezbeđuju kontrolu pH vrednosti formulacija suvog praška, prikladno održavajući pH između oko pH 5 i oko pH 8, na primer, pH između oko pH 5 do oko pH 6, ili oko pH 5,5 do oko pH 6,5, ili oko pH 6 do oko pH 7, ili oko pH od oko 6,5 do oko pH 7,5, ili od oko pH 7 do oko pH 8.

[0063] Formulacije suvog praška opisane ovde sadrže oko 30%-50% trehaloze, oko 10%-11% leucina, oko 1%-3% trileucina, oko 8%-9% citratnog pufera i aktivnog sredstva, pogodnije oko 39% trehaloze, oko 10,5% leucina, oko 2% trileucina, oko 8,5% citratnog pufera i aktivno sredstvo.

[0064] Ovde su opisane formulacije suvog praška koje se u suštini sastoje od oko 30% -50% amorfnog saharida, leucina, oko 1% do oko 10% trileucina, oko 1% do oko 10% pufera i aktivnog sredstva. U dodatnim otelotvorenjima, obezbeđene su formulacije suvog praška koje se u suštini sastoje od oko 30% -50% amorfnog saharida, oko 8% do oko 11% leucina, oko 2% do oko 4% trileucina, oko 1% do oko 10% pufera i aktivnog sredstva prema patentnim zahtevima. Obezbeđene su dodatne formulacije suvog praška koje se u suštini sastoje od oko 35% -45% trehaloze, oko 9% do oko 11% leucina, oko 2% do oko 3% trileucina, oko 2% do oko 85% citratnog pufera i aktivnog sredstva prema patentnim zahtevima. U daljim otelotvorenjima, formulacije suvog praška se u suštini sastoje od oko 39% trehaloze, oko 10,5% leucina, oko 2% trileucina, oko 8,5% citratnog pufera i aktivnog sredstva prema patentnim zahtevima.

[0065] U sastavima i formulacijama koje se „u suštini sastoje“ od navedenih sastojaka, takve kompozicije i formulacije sadrže navedene komponente i one koje ne utiču materijalno na osnovne i nove karakteristike formulacija za koje se traži. Komponente koje ne utiču materijalno na osnovne i nove karakteristike formulacija za koje se traži zahtev su one koje ne ograničavaju sposobnost leucina i trileucina da stabilizuju formulacije suvog praška. Pogodno, sastavi i formulacije koje se u suštini sastoje od navedenih sastojaka posebno isključuju druge aminokiseline ili tripeptidne aminokiseline, ali mogu uključivati dodatne šećere, pufere, itd.

[0066] U nekim otelotvorenjima, formulacija suvog praška sadrži oko 39% trehaloze, oko 10,5% leucina, oko 2% trileucina, oko 8,5% citratnog pufera i oko 40% fragmenta anti-TSLP antitela kako je definisano u patentnim zahtevima.

[0067] Mikročestice koje čine formulacije suvog praška opisane ovde na odgovarajući način imaju specificirani srednji aerodinamički prečnik mase (MMAD) kada se daju u obliku aerosola. Mikročestice mogu takođe imati specificirani ekvivalentni srednji prečnik optičke zapremine (oVMD). oVMD se takođe može nazvati distribucijom veličine čestica (PSD ili pPSD).

[0068] Kako se ovde koristi, „srednji aerodinamički prečnik mase“ ili „MMAD“ je mera aerodinamičke veličine dispergovane mikročestice. Aerodinamički prečnik se koristi za opisivanje aerosolizovanog praška u smislu njegovog ponašanja taloženja i predstavlja prečnik sfere jedinične gustine koja ima istu brzinu taloženja, u vazduhu, kao i mikročestica. Aerodinamički prečnik obuhvata oblik čestice, gustinu i fizičku veličinu mikročestice. Kako se ovde koristi, MMAD se odnosi na srednju tačku ili medijanu aerodinamičke raspodele veličine čestica aerosolizovanog praška određene kaskadnim udarcem, osim ako nije drugačije naznačeno. Pogodno, mikročestice formulacija suvog praška koje su ovde date imaju srednji aerodinamički prečnik mase (MMAD) od oko 1 µm do oko 10 µm, pogodnije oko 2 µm do oko 8 µm, oko 2 µm do oko 7 µm, oko 2 µm do oko 6 µm, oko 6 µm, oko 6 µm 2 µm do oko 4 µm, oko 3 µm do oko 7 µm, oko 4 µm do oko 7 µm, oko 3 µm do oko 7 µm, oko 4 µm do oko 7 µm, oko 3 µm do oko 6 µm, ili oko 2 µm, oko 3 µm, oko 4 µm, oko 5 µm, oko 6 µm, ili oko 7 µm.

[0069] Prikladno, frakcija finih čestica (frakcija čestica koje se emituju iz uređaja za inhalaciju koji ima aerodinamički prečnik čestica manji od 5 µm formulacija suvog praška opisanih ovde je ≥ 50%, što je pogodnije ≥ 60%. Ova frakcija finih čestica (FPF) može doprineti niskom zadržavanju u uređaju formulacija suvog praška od manje od 20%, prikladno manje od 15%, manje od 10% ili manje od 5%, koje ostaju u uređaju nakon isporuke pacijentu.

[0070] U dodatnim otelotvorenjima, mikročestice prikladno imaju srednji prečnik optičke zapremine (oVMD) od oko 0,5 µm do oko 7 µm. Ekvivalentni srednji prečnik optičke zapremine (oVMD) se odnosi na srednji prečnik sfere koji najbolje aproksimira specifičnu optičku interakciju mikročestice sa svetlošću, pri čemu je polovina mikročestica najbolje aproksimirana ekvivalentnom sferom manjom, a polovina mikročestica je najbolje aproksimirana ekvivalentnom srednjom optičkom sferom kada je merena veća od odgovarajuće srednje sfere. U primernim otelotvorenjima, mikročestice imaju ekvivalentni srednji prečnik optičkog volumena (oVMD) od oko 0,5 µm do oko 6 µm, ili oko 1 µm do oko 5 µm, ili oko 1 µm do oko 4 µm, ili oko 2 µm do oko 2 µm do oko 2 µm do oko 5 µm.4 µm, ili oko 2 µm do oko 4 µm, ili oko 2 µm do oko 3 µm, ili oko 2 µm do oko 3,5 µm, ili oko 1 µm, oko 1,5 µm, oko 2 µm, oko 2,5 µm, oko 3 µm, oko 3,5 µm, oko 4 µm, oko 4,5 µm, ili oko5 µm.

[0071] Kao što je ovde opisano, visoka komprimovana zapreminska gustina omogućava isporuku veće količine aktivnog sredstva, koristeći istu zapreminu isporuke. Određeni biološki agensi mogu zahtevati isporuku od čak 50 mg/dozi, ili više, za efikasan tretman. Kao što je ilustrativno prikazano na Sl.8B, kombinacija leucina i trileucina može rezultirati formulacijom suvog praška koja ima veću nasipnu gustinu i stoga za istu količinu mase punjenja zauzima znatno manji volumen.

[0072] Primerne formulacije platforme prikazane na Sl.8B su date u nastavku. LTC označava formulaciju bez trileucina (TLeu), ali sadrži leucin, trehalozu i citratni pufer; TTC označava formulaciju bez leucina (Leu), ali koja sadrži trileucin, trehalozu i citratni pufer; TLTC ukazuje na uključivanje i leucina i trileucina, kao i trehaloze i citratnog pufera. Cit se odnosi na citratni pufer. Tre se odnosi na trehalozu.

Tabela 1: Primeri formulacija platforme

[0073] Kapsule (kapsule veličine 3) svake formulacije su prikazane sa odgovarajućim masama punjenja na Sl. 8B. Kao što je ilustrovano, za TLTC formulaciju, kombinacija trileucina i leucina omogućava punjenje kapsule sa 100 mg formulacije suvog praška, uz zadržavanje preostalog prostora u kapsuli. Druge formulacije se ne mogu puniti iznad oko 70-80 mg mase punjenja. Ovo predstavlja dramatično poboljšanje postignuto upotrebom leucina i trileucina u kombinaciji za pripremu formulacije sa visokom kompresovanom nasipnom gustinom, omogućavajući veliku masu punjenja.

[0074] Kao što je ovde opisano, upotreba leucina i trileucina u formulacijama suvog praška takođe dovodi do toga da mikročestice imaju željene veličine (MMAD), kao i poželjnu specifičnu površinu (SSA) i hrapavost, što rezultira mikročesticama koje mogu da teče na odgovarajući način i da se isporuče u pluća pomoću različitih platformi za inhalaciju.

[0075] Specifična površina (SSA) mikročestica se definiše kao ukupna površina mikročestica po jedinici mase (pogodno sa jedinicama od m<2>/g). Postupci merenja SSA su poznate u tehnici i uključuju, na primer, merenja Brunauer-Emmett-Teller-a (BET) korišćenjem procene specifične površine materijala adsorpcijom azota merenom kao funkcija relativnog pritiska. Površina se određuje izračunavanjem količine adsorbatnog gasa koja odgovara monomolekulskom sloju na površini mikročestica. Tehnika meri spoljašnju površinu i sve procene površine pora da bi se odredila ukupna specifična površina. Instrumenti za merenje BET su poznati u tehnici.

[0076] U otelotvorenjima, specifična površina (SSA) mikročestica formulacija suvog praška je oko 3 m<2>/g do oko 8 m<2>/g. U pogodnim otelotvorenjima, SSA većeg broja mikročestica je oko 3,5 m<2>/g-7,5 m<2>/g, ili oko 4 m<2>/g-7 m<2>/g, ili oko 4,5 m<2>/g-7 m<2>/g, ili oko 5 m<2>/g-7 m<2>/g, ili oko 4,5 m<2>/g-6 m<2>/g, ili oko 5 m<2>/g-6 m<2>/g, ili oko 4 m<2>/g, oko 4,5 m<2>/g, oko 5 m<2>/g, oko 5,5 m<2>/g, oko 6 m<2>/g, oko 6,5 m<2>/g, ili oko 7 m<2>/g.

[0077] SL.9 prikazani su rezultati specifične površine merene korišćenjem BET-a, u m<2>/g. Svaka kolona na SL.9 predstavlja različitu količinu trileucina u formulacijama. Unutar svake kolone, količina leucina se povećava sa oko 1% na oko 20%. Umetnuti mikrogrami pokazuju fizički izgled mikročestica pri niskom SSA (dole levo) i višem SSA (gore desno). Kao što je prikazano, pri nižim mas.% trileucina, SSA ostaje ispod približno 5 m<2>/g, ali se povećava sa povećanjem leucina. Iznad oko 2% trileucina, SSA se povećava na više od 3,0 m<2>/g, a takođe raste sa povećanjem procenta leucina. Vrednosti SSA iznad 5,5 m<2>/g, a približavaju se 7,0 m<2>/g, postižu se sa količinama trileucina iznad oko 4%. Poželjni opseg specifične površine od oko 4-7 m<2>/g može se lako postići korišćenjem između oko 1-6% trileucina, a količine leucina između oko 1-20%. Kao što je prikazano, korišćenjem količine trileucina ispod oko 6%, količina leucina se može održavati ispod 10%, čak i ispod 5%, i dalje održavati željeni SSA i mikročestice sa hrapavostom površine. Mikrograf u gornjem levom uglu pokazuje oblik mikročestica ovde opisanih formulacija suvog praška, koji pokazuju željenu veličinu, specifičnu površinu i hrapavost površine.

[0078] U određenim otelotvorenjima, formulacija suvog praška ima komprimovanu nasipnu gustinu od oko 0,4-1,0 g/cm<3>. Pogodno, komprimovana nasipna gustina formulacije suvog praška je oko 0,5-0,8 g/cm<3>. U otelotvorenjima, komprimovana zapreminska gustina formulacije suvog praška koja je ovde opisana je oko 0,4-0,9 gm/cm<3>, oko 0,4-0,8 gm/cm<3>, oko 0,5-0,8 gm/cm<3>, oko 0,6-0,8 gm/cm<3>, ili oko 0,4 gm/cm<3>, oko 0,5 gm/cm<3>, oko 0,6 gm/cm<3>, oko 0,7 gm/cm<3>, ili oko 0,8 gm/cm<3>. U određenim otelotvorenjima, komprimovana zapreminska gustina formulacije suvog praška koja je ovde opisana je od oko 0,4 gm/cm<3>do oko 0,9 gm/cm<3>. U određenim otelotvorenjima, komprimovana zapreminska gustina formulacije suvog praška koja je ovde opisana je od oko 0,5 gm/cm<3>do oko 0,8 gm/cm<3>.

[0079] Formulacije suvog praška pogodno uključuju sredstvo za stabilizaciju stakla kao što je ovde opisano, uključujući amorfni saharid ili pufer, ili upotrebu i amorfnog saharida i pufera. Primeri amorfnih saharida uključuju one opisane ovde, uključujući trehalozu, saharozu, rafinozu, inulin, dekstran i ciklodekstrin.

Pogodno, amorfni saharid je prisutan na oko 30% do oko 70%, a u otelotvorenjima je trehaloza, pogodno prisutan na oko 35%-60, ili 35%-55%.

[0080] Ovde su opisani primeri pufera za upotrebu u formulacijama suvog praška i uključuju citratni pufer, fosfatni pufer i tartratni pufer. Pogodno, pufer je prisutan u količini od oko 1% do oko 10%, a u otelotvorenjima je citratni pufer. U određenim otelotvorenjima , pH citratnog pufera je od oko pH 5,5 do oko pH 6,5, kao što je oko pH 5,5, oko pH 5,6, oko pH 5,7, oko pH 5,8, oko pH 5,9, oko pH 6,0, oko pH 6,1, oko pH 6,2, oko 6,3 pH, oko pH 6,4, oko pH 6,5. U određenim otelotvorenjima, pH citratnog pufera je oko pH 6,4.

[0081] U određenim otelotvorenjima formulacije suvog praška opisane ovde sadrže surfaktant. Kao što je ovde definisano, "surfaktant" se odnosi na molekul ili jedinjenje koje smanjuje aglomeraciju čestica, adheziju čestica na površinu kapsule, zidove ambalaže ili komponente ventila uređaja za inhalaciju. Takođe je pronađeno da surfaktant smanjuje formiranje sub-vidljivih čestica (SVP) nakon rekonstitucije formulacije. Uklanjanje ili smanjenje formiranja SVP-a pojednostavljuje analitičku karakterizaciju formulacije, jer uklanja teret praćenja formiranja SVP-a tokom proizvodnje. Analitička karakterizacija SVP-a može uključivati razvoj ortogonalnih tehnika za identifikaciju i kvantifikaciju SVP-a u svrhu kontrole kvaliteta. Stoga, uklanjanje SVP-a ili njihovo smanjenje na prihvatljive nivoe uklanja neophodnost ovog koraka karakterizacije iz procesa proizvodnje, pojednostavljujući proizvodnju. Uklanjanje SVP-a takođe može učiniti raspon doza predvidljivijim, pošto je kinetika oslobađanja leka iz SVP-a nepoznata. Štaviše, uklanjanje SVP-a će verovatno povećati količinu aktivnog sredstva koji je dostupan za uključenje u farmakološke aktivnosti nakon rekonstitucije, što može značiti ne samo da se može postići veća isporučena doza, već se može izračunati i preciznije predviđanje isporučene doze. Veća isporučena doza takođe može imati koristi za pacijenta, na primer, potencijalnim smanjenjem broja ili učestalosti doza koje se moraju primeniti za dobijanje farmakološke koristi.

[0082] „Sub-vidljiva čestica“ („SVP“) je čestica koja nije vidljiva golim okom od oko 1 µm do oko 200 µm. Prisustvo sub-vidljivih čestica može se utvrditi rekonstituisanjem formulacije suvog praška i tečnosti zamućenog kvaliteta. Stvarno određivanje prisustva SVP-a može se potvrditi upotrebom tehnike kao što je snimanje mikrotoka. Snimanje mikrotoka (ili MFI) kombinuje mikrofluidnu protočnu mikroskopiju i analizu čestica slike visoke rezolucije kako bi se kvantifikovao SVP broj. MFI može da objedini ove brojeve u opsegu veličine čestica, na primer, spajanjem broja čestica u opsegu veličine od oko 1 do oko 200 µm, oko 2 µm do oko 200 µm, oko 5 µm do oko 200 µm, oko 10 µm do oko 200 µm i oko 25 µm do oko 200 µm. Primeri pokazuju da uključivanje surfaktanta u formulaciju suvog praška smanjuje prisustvo SVP u svakom opsegu veličine čestica u poređenju sa kontrolnom formulacijom u kojoj nema surfaktanta (npr. Sl.15A). Stoga, u određenim otelotvorenjima, formulacija suvog praška koja je ovde obelodanjena sadrži surfaktant, pri čemu se nakon rekonstitucije smanjuje broj sub-vidljivih čestica u formulaciji. U nekim otelotvorenjima, broj sub-vidljivih čestica je smanjen u poređenju sa ekvivalentnom formulacijom koja nema surfaktant.

[0083] U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 25 µm do oko 200 µm se smanjuje na ispod 30000 čestica po ml, kao što je 25000 čestica po ml, 20000 čestica po ml, 15000 čestica po ml, 10000 čestica po ml ili 5000 čestica po ml. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 25 µm do oko 200 µm je smanjen na ispod 1000 čestica po ml. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 25 µm do oko 200 µm je smanjen na ispod 1000 čestica po ml. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 25 µm do oko 200 µm je smanjen na ispod 100 čestica po ml.

[0084] U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 10 µm do oko 200 µm se smanjuje na ispod 100000 čestica po ml, kao što je 90000 čestica po ml, 80000 čestica po ml, 70000 čestica po ml, 60.000 čestica po ml, 50000 čestica po ml, 40000 čestica po ml ili 30000 čestica po ml. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 10 µm do oko 200 µm je smanjen na ispod 10000 čestica po ml. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 10 µm do oko 200 µm je smanjen na ispod 1000 čestica po ml. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 10 µm do oko 200 µm je smanjen na ispod 100 čestica po ml.

[0085] U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 5 µm do oko 200 µm se smanjuje na ispod 200000 čestica po ml, kao što je 180000 čestica po ml, 170000 čestica po ml, 160000 čestica po ml, 150000 čestica po ml ili 140000 čestica po ml. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 5 µm do oko 200 µm je smanjen na ispod 50000 čestica po ml. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 5 µm do oko 200 µm je smanjen na ispod 10000 čestica po ml. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 5 µm do oko 200 µm je smanjen na ispod 2000 čestica po ml.

[0086] U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 2 µm do oko 200 µm smanjen je na ispod 1×10<6>čestica po ml, kao što su 0,8×10<6>čestica po ml, 0,7×10<6>čestica po ml, 0,6×10<6>čestica po ml ili 0,5×10<6>čestica po ml. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 2 µm do oko 200 µm je smanjen na ispod 100000 čestica po ml. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 2 µm do oko 200 µm je smanjen na ispod 50000 čestica po ml. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 2 µm do oko 200 µm je smanjen na ispod 10000 čestica po ml.

[0087] U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 1 µm do oko 200 µm smanjen je na ispod 2×10<6>čestica po ml, kao što su 1,8×10<6>čestica po ml, 1,7×10<6>čestica po ml, 1,6×10<6>čestica po ml ili 1,5×10<6>čestica po ml. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 1 µm do oko 200 µm je smanjen na ispod 200000 čestica po ml. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 1 µm do oko 200 µm je smanjen na ispod 150000 čestica po ml.

[0088] U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 25 µm do oko 200 µm je smanjen više od 2 puta, kao što je više od 3 puta, više od 4 puta, više od 5 puta, više od 6 puta, više od 7 puta, više od 8 puta, više od 9 puta, u poređenju sa referencom ponovnog konstituisanja. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 25 µm do oko 200 µm je smanjen više od 10 puta nakon rekonstitucije u poređenju sa referentnom kontrolom.

[0089] U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 10 µm do oko 200 µm je smanjen više od 2 puta, kao što je više od 3 puta, više od 4 puta, više od 5 puta, više od 6 puta, više od 7 puta, više od 8 puta, više od 9 puta, u poređenju sa referencom ponovnog konstituisanja. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 10 µm do oko 200 µm je smanjen više od 10 puta nakon rekonstitucije u poređenju sa referentnom kontrolom.

[0090] U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 5 µm do oko 200 µm je smanjen više od 2 puta, kao što je više od 3 puta, više od 4 puta, više od 5 puta, više od 6 puta, više od 7 puta, više od 8 puta, više od 9 puta, u poređenju sa referencom ponovnog konstituisanja. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 5 µm do oko 200 µm je smanjen više od 10 puta nakon rekonstitucije u poređenju sa referentnom kontrolom.

[0091] U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 2 µm do oko 200 µm je smanjen više od 2 puta, kao što je više od 3 puta, više od 4 puta, više od 5 puta, više od 6 puta, više od 7 puta, više od 8 puta, više od 9 puta, u poređenju sa referencom ponovnog konstituisanja. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 2 µm do oko 200 µm je smanjen više od 10 puta nakon rekonstitucije u poređenju sa referentnom kontrolom. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 2 µm do oko 200 µm je smanjen više od 100 puta nakon rekonstitucije u poređenju sa referentnom kontrolom.

[0092] U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 1 µm do oko 200 µm je smanjen više od 2 puta, kao što je više od 3 puta, više od 4 puta, više od 5 puta, više od 6 puta, više od 7 puta, više od 8 puta, više od 9 puta, u poređenju sa referencom ponovnog konstituisanja. U određenim otelotvorenjima, broj SVP veličine od oko 1 µm do oko 200 µm je smanjen više od 10 puta nakon rekonstitucije u poređenju sa referentnom kontrolom.

[0093] U određenim otelotvorenjima referentna kontrola je ekvivalentna formulacija kojoj nedostaje surfaktant. U nekim otelotvorenjima, formulacija se rekonstituiše u vodi. U nekim otelotvorenjima, formulacija se rekonstituiše do koncentracije aktivnog sredstva od 30 mg/ml. U nekim otelotvorenjima, formulacija se rekonstituiše do koncentracije aktivnog sredstva od 2,5 mg/ml. U nekim otelotvorenjima, broj SVP-a je određen mikroprotočnim imidžingom (MFI). U određenim otelotvorenjima, broj SVP-a je određen mikroprotočnim snimanjem (MFI) korišćenjem metode kao što je definisano u primerima.

[0094] Primerni surfaktanti pogodni za upotrebu u formulacijama suvog praška opisanim ovde uključuju, ali nisu ograničeni na, polisorbat-20 (PS-20), polisorbat-40 (PS-40), polisorbat-60 (PS-60), polisorbat-80 (PS-80) i poloksamer-188. U određenim otelotvorenjima, formulacije koje su ovde opisane sadrže PS-80, pogodno u koncentraciji u opsegu od oko 0,27% po masi do oko 2,7% po masi, pogodno od oko 0,27% po masi do oko 1,33% po masi, pogodno od oko 0,67% po masi do oko 1,33% po masi, pogodno od oko 0,67% po masi do oko 1,33% po masi. U određenim otelotvorenjima, formulacija sadrži PS-80 u koncentraciji u opsegu od oko 0,3% po masi do oko 3% po masi. U određenim otelotvorenjima, formulacija sadrži PS-80 u koncentraciji u opsegu od oko 0,3% po masi do oko 2,5% po masi. U određenim otelotvorenjima, formulacija sadrži PS-80 u koncentraciji u opsegu od oko 0,5% po masi do oko 2,5% po masi. U određenim otelotvorenjima, formulacija sadrži PS-80 u koncentraciji u opsegu od oko 0,5% po masi do oko 2% po masi. U određenim otelotvorenjima, formulacija sadrži PS-80 u koncentraciji u opsegu od oko 0,5% po masi do oko 1,5% po masi.

[0095] U primernim otelotvorenjima, formulacija sadrži PS-80 u koncentraciji u opsegu od oko 0,67% do oko 1,33%.

[0096] U primernim otelotvorenjima, formulacija sadrži PS-80 u koncentraciji od oko 0,7% (w/w), oko 0,8% (w/w), oko 0,9% (w/w), oko 1,0% (w/w), oko 1,1% (w/w), oko 1,2% (w/w), ili oko 1,2% (w/w) (w/w). U nekim otelotvorenjima, formulacija sadrži PS-80 u koncentraciji od oko 1,1% (w/w).

[0097] U primernim otelotvorenjima, sastav sadrži PS-80 u koncentraciji od 0,7% ± 0,35 (w/w), oko 0,8% ± 0,4 (w/w), oko 0,9% ± 0,45 (w/w), oko 1,0% ± 0,5 (w/w), oko 1,1% ± 0,55 (w/w), oko 1,2% ± 0,6 (w/w), oko 1,3% ± 0,65 (w/w), oko 1,4% ± 0,7 (w/w), oko 1,5% ± 0,75 (w/w), oko 1,6% ± 0,8 (w/w) ili oko 1,7% ± 0,75 (w/w). U nekim otelotvorenjima, formulacija sadrži PS-80 u koncentraciji od 1,1% ± 0,55 (w/w).

[0098] U određenim otelotvorenjima, formulacije koje su ovde opisane sadrže poloksamer-188, pogodno u koncentraciji u opsegu od oko 1% po masi do oko 10% po masi. U primernim otelotvorenjima, formulacija sadrži poloksamer-188 (P188) u koncentraciji u opsegu od oko 0,67% do oko 2,67%. U određenim otelotvorenjima, formulacija sadrži P188 u koncentraciji u opsegu od oko 0,3% po masi do oko 3% po masi. U određenim otelotvorenjima, formulacija sadrži P188 u koncentraciji u opsegu od oko 0,3% po masi do oko 2,5% po masi. U određenim otelotvorenjima, formulacija sadrži P188 u koncentraciji u opsegu od oko 0,5% po masi do oko 2,5% po masi. U određenim otelotvorenjima, formulacija sadrži P188 u koncentraciji u opsegu od oko 0,5% po masi do oko 2% po masi. U određenim otelotvorenjima, formulacija sadrži P188 u koncentraciji u opsegu od oko 0,5% po masi do oko 1,5% po masi.

[0099] U primernim otelotvorenjima, formulacija sadrži P188 u koncentraciji u opsegu od oko 0,67% do oko 1,67%.

[0100] U primernim otelotvorenjima, formulacija sadrži P188 u koncentraciji od oko 0,7% (w/w), oko 0,8% (w/w), oko 0,9% (w/w), oko 1,0% (w/w), oko 1,1% (w/w), oko 1,2% (w/w), oko 1,3% (w/w), oko 1,4% (w/w), oko 1,5% (w/w), oko 1,6% (w/w) ili oko 1,7% (w/w).

[0101] U primernim otelotvorenjima, formulacija suvog praška sadrži oko 39% trehaloze, oko 10,5% leucina, oko 2% trileucina, oko 8,5% citratnog pufera i aktivnog sredstva.

[0102] Ovde su opisane odgovarajuće veličine za mikročestice formulacija suvog praha, a u otelotvorenjima, mnoštvo mikročestica ima srednji aerodinamički prečnik mase (MMAD) od oko 2 µm do oko 4 µm kada se daju u obliku aerosola. Pogodne specifične površine (SSA) mikročestica su ovde opisane i uključuju, na primer, specifičnu površinu od oko 4-7 m<2>/g. Pogodno, mikročestice imaju ekvivalentni srednji prečnik optičkog volumena (oVMD) od oko 1 µm do oko 5 µm.

[0103] Ovde je obelodanjen postupak za pripremu formulacije suvog praška. Postupak pogodno obuhvata pripremu tečne sirovine, koja sadrži leucin, oko 0,1 mg/mL do oko 6 mg/mL trileucina, aktivnog sredstva, i pogodno dalje sadrži agens za stabilizaciju stakla. Sredstvo za stabilizaciju stakla kao što je ovde opisano može biti izostavljeno iz formulacija suvog praška ako se želi. Tečna sirovina takođe može da sadrži surfaktant. Tečna sirovina se priprema kombinovanjem ovih komponenti u tečnom rastvaraču, da bi se stvorila sirovina u kojoj je svaka od komponenti rastvorena. Zagrevanje se može dodati po želji ili je potrebno da bi se povećala rastvorljivost različitih komponenti za formiranje tečne sirovine. Primeri tečnih rastvarača uključuju vodu, uključujući dejonizovanu vodu, kao i razblažene rastvore alkohola sa vodom. Aktivno sredstvo se prikladno dodaje u tečnu sirovinu nakon dodavanja i rastvaranja preostalih komponenti sirovine.

[0104] U pogodnim postupcima pripreme koji su ovde obelodanjeni, leucin i trileucin su prisutni u koncentracijskom odnosu leucin:trileucin od oko 0,1:1 do oko 30:1 u tečnoj sirovini. Kao što je ovde opisano, kada se priprema tečna sirovina, leucin i trileucin se daju kao količine mg/mL. Dakle, odnos koncentracija leucin:trileucin od oko 0,1:1 do oko 30:1 u podešenoj zapremini tečne sirovine odgovara odnosu leucin:trileucin po masi u tečnoj sirovini. Kao što je ovde obelodanjeno, leucin i trileucin su prisutni u koncentracijskom odnosu leucin:trileucin od oko 0,1:1 do oko 25:1, oko 0,5: 1 do oko 20:1, oko 1:1 do oko 20:1, oko 1:1 do oko 15:1, oko 1:1 do oko 12: 1, oko 1:1 do oko 10:1, oko 1:1 do oko 7:1, oko 1:1 do oko 6:1, ili oko 1:1:, oko 2:1, oko 3:1, oko 4:1, oko 5:1, oko 5:1:1:, oko 5,2:1 oko 5,25:1, oko 5,3:1.5,4:1, oko 5,5:1, oko 5,75:1 ili oko 6:1, u tečnoj sirovini.

[0105] Potom se tečna sirovina može raspršiti. U određenim obelodanjivanjima, tečna sirovina se filtrira pre atomizacije. U određenim obelodanjivanjima, tečna sirovina se filtrira kroz filter od 0,22 mikrona. U određenim obelodanjivanjima, tečna sirovina koja sadrži leucin i trileucin se filtrira pre dodavanja aktivnog sredstva. U određenim obelodanjivanjima, tečna sirovina se filtrira nakon dodavanja aktivnog sredstva pre atomizacije. Atomizacija se odnosi na pretvaranje tečne sirovine u fine kapljice, pogodno korišćenjem gasa pod pritiskom (kao što je CO2ili inertni gas). Primeri uređaja za proizvodnju atomizovane tečne sirovine su poznati u tehnici i uključuju upotrebu različitih mlaznica za raspršivanje koje imaju željene veličine i karakteristike protoka. Primeri parametara za atomizaciju uključujući izlaznu temperaturu od oko 50°C-90°C, pogodno oko 60°C-80°C, ili oko 70°C; brzina unosa sirovine od oko 8-15 ml/min, pogodno oko 9-14 ml/min, oko 10-13 ml/min, ili oko 12 ml/min; brzina protoka gasa raspršivača od oko 9-15 kg/sat (sat ili h), pogodno oko 10-14 kg/h, oko 12-14 kg/h, ili oko 13 kg/h; i protok gasa za sušenje od oko 60-100 kg/h, pogodno oko 60-90 kg/h, oko 70-90 kg/h, ili oko 80 kg/h.

[0106] Raspršena tečna sirovina se zatim može osušiti, pogodno pod toplotom iu kombinaciji sa protokom vazduha da bi se pomoglo u sušenju. Rezultat sušenja daje mnoštvo mikročestica. Temperature sušenja se obično kreću od oko 50°-100°C, ili oko 60°-100°C, ili oko 70°-90°C; protok vazduha može biti reda veličine oko 10-40 m<3>/sat.

[0107] Ovde su opisani primeri agensa za stabilizaciju stakla, uključujući amorfne saharide i pufere, kao i odgovarajuće količine sredstava za stabilizaciju stakla. Odgovarajuće količine leucina i trileucina su takođe obezbeđene. Kako konačna formulacija suvog praška treba da sadrži navedene količine leucina i trileucina (i drugih komponenti), takve količine se takođe koriste u tečnoj sirovini. Rezultat procesa sušenja nakon atomizacije je da se uklanja bilo koji tečni rastvarač, i tako puna količina originalne suve mase komponenti odgovara konačnoj suvoj masi jedinjenja u formulaciji suvog praška. Primeri aktivnih sredstava su takođe opisani ovde.

Posstupci za pripremu formulacija suvog praška koje su ovde opisane pogodno obezbeđuju mikročestice koje imaju navedene željene fizičke karakteristike, uključujući željenu komprimovanu nasipnu gustinu, specifičnu površinu i veličine. Ovde su opisane primerne veličine, kao i primeri SSA, uključujući specifičnu površinu manju od oko 10 m<2>/g, pogodno oko 4-7 m<2>/g. Pogodno, postupci obezbeđuju mnoštvo mikročestica koje imaju ekvivalentni srednji prečnik optičke zapremine (oVMD) od oko 1 µm do oko 5 µm, kao što je ovde opisano; srednji aerodinamički prečnik mase (MMAD) od oko 2 µm do oko 4 µm kada se daje u obliku aerosola; komprimovana zapreminska gustina od oko 0,4 g/cm<3>-0,8 g/cm<3>.

[0109] Prednost postupka za pripremu formulacija suvog praška opisanih ovde se odnosi na visoku propusnu prirodu procesa. Na primer, ako je brzina protoka atomizacije podešena na 20 ml/min, određen je sledeći protok u gramima/sat.

Tabela 2: Im likaci e koncentraci e na ro usnost

[0110] Kao što je navedeno, korišćenjem samo trileucina u sirovini, sa maksimalnom koncentracijom trileucina od 5 mg/mL, postignuto je maksimalno opterećenje čvrstih materija od 25 mg/mL (vezano za maksimalnu rastvorljivost). Ovo dovodi do 30 g/sat. Sa samo leucinom od 60%, sa maksimalnom koncentracijom leucina od 20 mg/mL, postignuto je maksimalno opterećenje čvrstim materijama od 33 mg/mL i protok od 40 g/sat. Prikazani su i dodatni rezultati za upotrebu samo leucina i trileucina. Nasuprot tome, za tri ispitivane sirovine koje su sadržavale i leucin i trileucin, maksimalno opterećenje čvrstim materijama od 250 mg/mL i protok od 300 g/sat je postignut korišćenjem samo 8% leucina i 2% trileucina. Ovo je bilo iznenađujuće i neočekivano otkriće prednosti postupaka i formulacija koje su ovde obelodanjene, u tome što se disperzibilna čestica može obezbediti korišćenjem relativno malih količina leucina i trileucina, ali takođe omogućavajući veliku količinu protoka. Ovako velika propusnost u velikoj meri utiče na sposobnost da se poveća proizvodnja formulacija suvog praška opisanih ovde gde su potrebne velike količine formulacija.

[0111] Ovde opisani postupci i formulacije omogućavaju proizvodnju kapsula, blister pakovanja itd. i drugih odgovarajućih ambalaža za formulacije suvog praška. Takve ambalaže se mogu proizvesti sa 10-200 mg suvog praška, pogodno 10-100 mg, ili 25-75 mg ili 50 mg ili formulacijom suvog praška. Takve ambalaže mogu prikladno da isporuče 0,1-10 mg formulacije suvog praška u pluća pacijenta.

Upotreba ovde opisanih postupaka obezbeđuje formulacije suvog praška koje mogu smanjiti ukupan broj kapsula potrebnih za upotrebu u uređaju za inhalaciju. Na primer, zapremina potrebna za isporuku 50-100 mg aktivnog sredstva može se smanjiti sa dve veće 00 kapsule na jednu kapsulu veličine 3.

[0113] Ovde opisani postupci takođe obezbeđuju mehanizam za povećanje komprimovane zapreminske gustine i specifične površine formulacije suvog praška koja se sastoji od više mikročestica. Kao što je opisano u celom tekstu, ugrađivanjem leucina i trileucina u formulaciju suvog praška, može se lako postići komprimovana zapreminska gustina od oko 0,4-1,0 g/cm<3>(pogodno oko 0,5-0,8 g/cm<3>). Pored toga, može se postići i specifična površina od oko 5-10 m<2>/g (pogodno oko 5 m<2>/g do oko 7 m<2>/g). Veličine mikročestica se mogu formirati u opsegu koji je ovde opisan, uključujući mikročestice sa srednjim aerodinamičkim prečnikom mase (MMAD) od oko 2 µm do oko 4 µm kada se daju u obliku aerosola.

[0114] Postupci za proizvodnju aerosolnog oblika formulacije suvog praška su poznati u tehnici i uključuju, na primer, upotrebu inhalatora kao što je inhalator suvog praška (DPI) (npr., Monodose RS01 DPI od PLASTIAPE (Osnago, Italija). Formulacije suvog praška koje su ovde opisane mogu se dozirati u gasnu struju bilo pomoću pasivnog ili aktivnog uređaja za inhalaciju, i ostati suspendovane u gasu onoliko vremena koliko je dovoljno da pacijent udahne najmanje deo mikročestica, tako da deo mikročestica stigne do pluća.

[0115] Ovde su takođe obezbeđeni postupci lečenja medicinskog stanja kod pacijenata sisara, koje uključuju davanje pacijentu inhalacijom (uključujući inhalator sa suvim prahom) formulacija suvog praška kao što je ovde opisano.

[0116] Medicinska stanja koja se mogu lečiti korišćenjem postupaka opisanih ovde uključuju ona koja utiču na nervni sistem, endokrini sistem, mišićni sistem, kardiovaskularni sistem, digestivni sistem, respiratorni sistem (i posebno pluća), hormonske sisteme, imuni sistem, reproduktivni sistem itd.

[0117] U otelotvorenjima, ovde je obezbeđen postupak lečenja inflamatornog stanja povezanog sa TSLP kod pacijenta. Inflamatorna stanja povezana sa TSLP-om mogu biti izazvana alergijskim reakcijama ili iritansima iz okoline ili stimulansima. U nekim otelotvorenjima, inflamatorno stanje povezano sa TSLP može biti astma, hronična opstruktivna bolest pluća, alergijski rinitis, alergijski rinosinusitis, alergijski konjunktivitis, atopijski dermatitis ili eozinofilni ezofagitis.

[0118] U nekim otelotvorenjima, inflamatorno stanje povezano sa TSLP-om je astma, a pomenuti postupak lečenja obuhvata davanje pacijentu inhalacijom formulacije suvog praška koja sadrži terapeutski efikasnu količinu anti-TSLP antitela ili fragmenta antitela. U određenim otelotvorenjima, pacijent je odrasla osoba. U određenim otelotvorenjima, pacijent je dete ili adolescent.

Kao što je ovde opisano, pogodna formulacija suvog praška uključuje mnoštvo mikročestica, pri čemu mikročestice sadrže: leucin; oko 1% do oko 10% trileucina po masi; i antitelo stromalnog limfoproteina (anti-TSLP) ili varijanta antitela, pri čemu su leucin i trileucin prisutni u koncentracijskom odnosu leucin:trileucin od oko 0,1:1 do oko 30:1. Formulacija suvog praška može sadržati komprimovanu masu od 3-1.0 cm den. Primeri komponenti za uključivanje u formulaciju i njihove količine su opisani u celom delu.

[0120] Kao što je ovde opisano, sposobnost isporučivanja antitela na stromalni limfoprotein protiv timusa (anti-TSLP) ili varijante antitela putem inhalacije obezbeđuje mehanizam isporuke koji je pogodniji za upotrebu u okruženju primarne zdravstvene zaštite.

[0121] U otelotvorenjima postupak za lečenje astme, formulacija suvog praška se primenjuje često i u nižim dozama nego sistemski primenjeni anti-TSLP lek. U nekim otelotvorenjima, formulacija se može davati svakodnevno. Takva otelotvorenja mogu biti pogodnije za ispitanika ili pacijenta. Štaviše, takva otelotvorenja mogu smanjiti neželjene efekte koji se mogu javiti putem sistemskog davanja.

[0122] Fragment antitela koji se vezuje za antigen za upotrebu u postupcima lečenja sadrži teški lanac koji ima sekvencu datu u SEQ ID NO:28 i laki lanac koji ima sekvencu datu u SEQ ID NO:29. U ovom fragmentu koji se vezuje za antitelo, varijabilni domen teškog lanca obuhvata:

CDR1 sekvencu teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:1;

CDR2 sekvencu teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:2;

CDR3 sekvencu teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:3; i varijabilni domen lakog lanca obuhvata:

CDR1 sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:5;

CDR2 sekvenca lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 6, i CDR3 sekvenca lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:7.

[0123] U ovom fragmentu koji se vezuje za antigen, varijabilni domen teškog lanca obuhvata SEQ ID NO:4; i varijabilni domen lakog lanca obuhvata SEQ ID NO:8.

[0124] U nekim otelotvorenjima, oblici astme koji se mogu lečiti formulacijom pronalaska uključuju blagu astmu, umerenu astmu, tešku astmu, neeozinofilnu astmu, nisko eozinofilnu astmu i visoko eozinofilnu astmu. U određenim otelotvorenjima, formulacije pronalaska mogu biti za upotrebu u lečenju blage astme. U određenim otelotvorenjima, formulacije pronalaska mogu biti za upotrebu u lečenju umerene astme. U određenim otelotvorenjima, formulacije pronalaska mogu biti za upotrebu u lečenju teške astme. U određenim otelotvorenjima, formulacije pronalaska mogu biti za upotrebu u lečenju neeozinofilne astme. U određenim otelotvorenjima, formulacije pronalaska mogu biti za upotrebu u lečenju nisko eozinofilne astme. U određenim otelotvorenjima, formulacije pronalaska mogu biti za upotrebu u lečenju visoko eozinofilne astme.

[0125] Termini "blaga astma" i "umerena astma" kako se ovde koriste odnose se na astmu koja ima skalu Globalne inicijative za astmu (GINA) od 3 ili manje, prikladno GINA skalu od 2 ili 3. GINA skala meri ozbiljnost astme, na osnovu sledećih kriterijuma (vidite "Pocket Guide for Asthma Management and Prevention," Global Initiative for Asthma; 2019).

[0126] Termin „teška astma“ kako se ovde koristi odnosi se na astmu koja zahteva tretman visokog intenziteta (npr., GINA korak 4 i korak 5) da bi se održala dobra kontrola, ili gde dobra kontrola nije postignuta uprkos tretmanu visokog intenzitet (GINA, Global Strategy for Asthma Management and Prevention. Global Initiative for Asthma (GINA) December 2012). Termin "teška astma" takođe obuhvata umereno-tešku astmu. Umereno-teški astmatičari pogodni za lečenje ovde opisanim formulacijama mogu biti oni koji se ne kontrolišu na srednjoj dozi do visoke doze ICS:LABA sa jednim ili više egzacerbacija i čestim simptomima. U određenim otelotvorenjima, teška astma je dalje definisana kao teška astma sa upalom tipa 2 koju karakterišu povišeni eozinofili u krvi (tj. broj eozinofila u krvi od ≥ 150 ćelija/µL) i/ili povišen FeNO. (tj. FeNO ≥ 20 ppb).

[0127] Termin „FENO“ se odnosi na frakcioni izdahnuti azotni oksid, koji je biomarker za upalu bronhija ili disajnih puteva. FENO proizvode epitelne ćelije disajnih puteva kao odgovor na inflamatorne citokine, kao što su TSLP, IL-4 i IL-13. Nivoi FENO kod zdravih odraslih osoba kreću se od 2 do 30 delova na milijardu (ppb). Primer za merenje FENO-a obuhvata ispitanike koji udišu do ukupnog kapaciteta pluća preko NIOX MINO<®>monitora zapaljenja disajnih puteva, a zatim izdišu 10 sekundi brzinom od 50 ml/sek (potpomognuto vizuelnim i slušnim signalima).

[0128] Termin "visoko eozinofilna astma" kako se ovde koristi odnosi se na pacijenta sa astmom koji ima skrining eozinofila u krvi od ≥ 250 ćelija/µL.

[0129] Naročito, formulacije pružaju mogućnost lečenja pacijenata sa manje teškom astmom koji bi se normalno lečili u okruženju primarne zdravstvene zaštite. Na primer, pacijenti sa skalom Globalne inicijative za astmu (GINA) od 3 ili manje, prikladno GINA skalom od 2 ili 3. GINA skala meri težinu astme, na osnovu sledećih kriterijuma (vidite ("Pocket Guide for Asthma Management and Prevention," Global Initiative for Asthma; 2019):

simptomi astme tokom dana više od dva puta nedeljno;

noćno buđenje zbog astme;

upotreba leka za ublažavanje astme više od dva puta nedeljno; i

ograničenje aktivnosti zbog astme.

Rezultat od nula ovih kriterijuma se smatra „dobro kontrolisanim“. Rezultat od 1-2 od ovih kriterijuma se smatra „delimično kontrolisanim“. Rezultat od 3-4 od ovih kriterijuma se smatra „nekontrolisanim“.

[0130] U nekim otelotvorenjima, formulacije obezbeđuju mogućnost lečenja pacijenata sa umereno teškom astmom koji bi mogli da se leče u okruženju primarne zdravstvene zaštite, ili za lečenje pacijenata sa umereno teškom astmom sa lošim pristupom lečenju putem specijalističke nege. Na primer, formulacije mogu biti korisne za lečenje pacijenata sa umerenom i teškom astmom sa skalom Globalne inicijative za astmu (GINA) od 4-5. Pogodno, formulacije pružaju mogućnost lečenja umereno-teške astme koja je nekontrolisana. Pogodno, formulacije obezbeđuju mogućnost lečenja umereno-teške astme koja je nekontrolisana na srednjoj dozi do visoke doze ICS:LABA sa jednim ili više egzacerbacija i čestim simptomima.

PRIMERI PRIMER 1 - GENERACIJA ANTI-TSLP FABS

[0131] Serija fragmenata za vezivanje antitela (Fab) izvedenih iz anti-TSLP monoklonskog antitela „A5“ obelodanjenog u WO 2009/035577, generisana je korišćenjem standardne molekularne biologije i tehnika kloniranja. Ukratko, CDR sekvence A5 su klonirane u IgG1 Fab skelu, što je rezultiralo Fab fragmentom koji se ovde naziva Fab1ili Fab1. VH i VL sekvence Fab1 su obelodanjene kao SEQ ID NO:4 i 8, respektivno.

[0132] Varijante Fab2-9su takođe generisane od Fab1koje sadrže mutacije u CDR regionima. Kombinacija VH i VL CDR-a za svaki od Fabs1-9 prikazana je u tabeli 3.

Tabela 3 CDR sekvenca anti-TSLP Fabs1-9

[0133] Analizirana je čistoća, stabilnost i sklonost agregaciji Fab1. Ukratko, 50 mg/mL Fab1je formulisano u 30 mM natrijum citratu, 105 mM trehaloze, pH 6,0. Uzorci su smešteni u komore za stabilnost na 40°C i 5°C u različitim vremenskim periodima. U različitim vremenskim tačkama, uzorci su testirani relevantnim analitičkim tehnikama, kao što je ekskluziona hromatografija visokih performansi (HP-SEC). Korišćen je Agilent HPLC sistem sa temperaturom kontrolisanim autosamplerom, DAD ili VWD i softverom Agilent ChemStation/OpenLAB ECM CDS kompanije Agilent Technologies (Santa Klara, Kalifornija, SAD).

Korišćena je i zaštitna kolona, TSKgel kolona (7,9 mm ID, Kataloški br.08543) i TSK-Gel G3000SWxl kolona (5 µm, 250 A i 7,8 × 300 mm, Kataloški br.08541) iz Tosoh Bioscience (Griesheim, Nemačka) Korišćena je mobilna faza 0,1 M dvobazni anhidrovani natrijum fosfat, 0,1 M natrijum sulfat, pH 6,8.

Rezultati analize stabilnosti i agregacije prikazani su u Tabeli 4.

Tabela 4 Stabilnost i a re aci a Fab1

[0134] Stabilnost Fab1je takođe testirana diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC). Za testiranje je korišćen MicroCal Capillari VP DSC kompanije Malvern Panalitical (Malvern, UK), a za analizu podataka korišćen je softver Origin 7.0 (Northampton, MA, SAD). Fab1uzorak je razblažen do 5 mg/mL sa puferom za formulaciju (30 mM natrijum citrat, 105 mM trehaloze, pH 6,0). Za svaki pojedinačni ciklus, 500 µL razblaženog Fab1uzorka i referentnog (pufera za formulaciju) je ubrizgano u DSC uzorak i referentne ćelije pomoću autosamplera. Rastvori su zagrevani od 25°C do 100°C pri brzini skeniranja od 95°C/sat. Skeniranje pufera (popunjeno iu uzorku i u referentnim ćelijama) je takođe dobijeno kao blanko za korekciju osnovne linije uzorka.

[0135] Profil punjenja Fab1je takođe određen izoelektričnim fokusiranjem slike (IEF) korišćenjem iCE3 analizatora. ICE3 kapilarni IEF analizator, PrinCE MicroInjector autosampler, MicroInjection obložena transferna kapilara su svi kupljeni i isporučeni od strane Protein Simple-a. Uzorci su analizirani korišćenjem FC kertridža sa kapilarom obloženom fluorougljenikom i ugrađenim rezervoarima za elektrolit (Deo # 101701, Protein Simple). Autosampler je održavan na 4°C tokom cele analize. Utvrđeno je da je pI opseg Fab1od 8,35 do 8,80.

PRIMER 2 – FAB1SE VEZUJE ZA HU I CINO TSLP SA PM AFINITETOM

BIAcore određuje afinitet Fab1vezivanja za TSLP

[0136] Specifičnost i afinitet Fab1za humani i cino TSLP eksprimiran u rekombinantnim ćelijama sisara su određeni korišćenjem Biacore 8K SPR instrumenta (GE Healthcare, Little Chalfont, Bucks, UK).

[0137] Čipovi biosenzora S serije C1, kompleti za spajanje amina, puferi na bazi fiziološkog rastvora sa hepes puferom i puferi za regeneraciju su nabavljeni od GE Healthcare i korišćeni u skladu sa uputstvima proizvođača. Površine streptavidina su pripremljene korišćenjem liofilizovanog streptavidina koji je rekonstituisan sa D-PBS. Ukratko, streptavidin je razblažen do 4 µg mL-1 u 10 mM natrijum acetatu pH 4,5 i kovalentno imobilizovan na tri površine protočne ćelije biosenzorskog čipa S serije C1 standardnim postupcima spajanja amina. Postignuta je konačna površina streptavidina od 170 jedinica odgovora (RU). Reagensi za spajanje amina su takođe korišćeni za pripremu kontrolne prazne površine, bez imobilizovanog streptavidina, koja bi služila kao referentna površina unutar svake protočne ćelije. N-terminalno označeni biotinilovani TSLP (human i cino) su zatim titrirani na svaku površinu streptavidina da bi se omogućilo <100 RU vezivanja Fab1pri zasićenju (Rmax). Nizak nivo vezivanja analita je obezbedio da su artefakti izazvani transportom mase svedeni na minimum, posebno kada se kombinuju sa relativno brzim protokom od 50 µL min-1 testa koji se koristi tokom koraka merenja kinetike. Razblaženja (Multi-Cycle Kinetics) monomerizovanog Fab1 (2-struka razblaženja u HBS-EP+ puferu u rasponu između 1,25 i 20 nM) su ubrizgana, pri brzini testa od 50 µL min-1, tokom 2 minuta povezivanja i 10 minuta disocijacije. Višestruke injekcije samo pufera su napravljene pod istim uslovima tokom eksperimenta kako bi se omogućila dvostruka referentna obrada konačnih setova senzorgrama.

[0138] Površina čipa je potpuno regenerisana protokom dva impulsa od 30 sekundi 10 mM glicina pH 1,7. Afinitet vezivanja i kinetika su određeni korišćenjem 1:1 Langmuir modela.

[0139] Rezultati prikazani u tabeli 5 pokazuju da se Fab1vezuje za imobilisani hu i cino TSLP sa sličnim afinitetima (unutar 2 puta; 46 pM i 88 pM, respektivno).

Afinitet vezivanja određen kinetičkim testom isključenja (KinExA).

[0140] Afinitet vezivanja faze rastvora (KD) Fab1za humani i cino TSLP je takođe određen korišćenjem instrumenta KinExA 3200 (Sapidine Instruments, Boise, Idaho, SAD) i dobijeni podaci su obrađeni korišćenjem softvera KinExA Pro verzije 4.1.11. Recenzirana je KinExA metodologija (Darling i Brault, 2004).

[0141] Fab1je prethodno pomešan sa različitim koncentracijama svakog od hu i cino TSLP dok se ne postigne ravnoteža (najmanje 12 koncentracija svakog hu i cino TSLP je pripremljeno korišćenjem 2-struke metode serijskog razblaživanja). Količina slobodnog Fab1je zatim izmerena korišćenjem KinExA instrumenta hvatanjem slobodnog Fab pomoću perli obloženih hu TSLP-om, ispiranjem nevezanog materijala i detekcijom vezanog Fab1fluorometrijski korišćenjem komercijalnog, specifičnog za vrstu antitela (Alexa Fluor 647 obeleženo mišje anti-Human Heavy i Light chain Immunson antitelo (Jackson Immunoresearch 209-605-088)). KDFab1za hu TSLP je ekstrahovan globalnim 1:1 uklapanjem u tri skupa podataka, izvedena iz hu TSLP titracija u 1000 pM (punjeni dijamanti), 500 pM (obrnuti popunjeni trouglovi) ili 40 pM (otvoreni kvadrati) rastvore fiksne koncentracije Fab1(Sl.1). KDFab1za cino TSLP je ekstrahovan globalnim 1:1 uklapanjem u dva skupa podataka, izvedena iz cino TSLP titracija u rastvore fiksne koncentracije Fab1od 1000 pM (punjeni dijamanti) ili 40 pM (otvoreni kvadrati) (Sl.2).

[0142] Količina slobodnog Fab1obelodanjena na svakoj koncentraciji hu i cino TSLP je ucrtana u odnosu na titriranu koncentraciju TSLP (Sl.1 i 2, respektivno). Za izračunavanje konstante ravnoteže disocijacije (KD) korišćen je softver KinExA. Rezultati prikazani u Tabeli 6 pokazuju da se Fab1vezuje za humani TSLP sa 1,7 puta većim afinitetom nego što se vezuje za cino TSLP u slobodnom rastvoru.

Tabela 6 Afinitet rastvorljive faze Fab1za hu i cino TSLP korišćenjem KinExA

PRIMER 3 – FAB1I TEZEPELUMAB VEZUJU SE ZA TSLP SA SLIČNIM KARAKTERISTIKAMA VEZIVANJA

[0143] Karakteristike vezivanja Fab1za hu TSLP su direktno upoređene sa tezepelumabom. Tezepelumab je monoklonsko antitelo (mAb) humanog imunoglobulina G2 (lgG2) koje se vezuje za TSLP, sprečavajući njegovu interakciju sa kompleksom TSLP receptora. Studija dokaza o konceptu kod pacijenata sa blagom, atopijskom astmom, pokazala je da tezepelumab inhibira rani i kasni astmatični odgovor i potiskuje biomarkere Th2 inflamacije nakon izazivanja inhalacionog alergena. Tezepelumab se trenutno istražuje na klinici kao specijalistički tretman za lečenje teške astme.

[0144] Potencija vezivanja Fab1in vitro je određena korišćenjem TSLP-a zasnovanog na homogenom fluorescentnom rezonantnom prenosu energije (FRET) Homogene Time-Resolved Fluorescence (HTRF<®>, Cisbio International): test vezivanja mAb. Streptavidin kriptat je korišćen za detekciju biotinilovanog TSLP-a. Ukratko, uzorci neobeleženog Fab1 titrirani su u HTRF test da bi se takmičili sa tezepelumabom obeleženim DiLight-om za vezivanje za biotinilovani His-Avi hu TSLP. Takođe je izveden test takmičenja korišćenjem neobeleženog tezepelumaba i tezepelumaba obeleženog DiLight-om kao pozitivne kontrole.

[0145] Rezultati pokazuju da se Fab1takmiči za vezivanje za huTSLP sa tezepelumabom i vezuje se za hu TSLP sa sličnom snagom kao tezepelumab (IC50: Fab1- 0,38nM; tezepelumab - 0,23 nM - SL.3). HTRF test je takođe izveden korišćenjem Fabs2-9, što pokazuje da se svaki od ovih Fab takođe takmiči za vezivanje za hu TSLP sa tezepelumabom i vezivanje za hu TSLP sa sličnom snagom kao tezepelumab (Tabela 7).

Tabela 7 IC50Fabs2-9kako je određeno HTRF testom

Primer 4 - Fab1neutrališe aktivnost TSLP u testu mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC)

[0146] Sledeće je utvrđeno da li vezivanje Fab1za TSLP ima aktivnost funkcionalnog blokiranja u primarnom ćelijskom testu merenjem TSLP-indukovanog oslobađanja CCL17 iz PBMC nakon tretmana sa Fab1.

[0147] Krv je dobijena od zdravih davalaca u okviru programa davalaca krvi uspostavljenog u MedImmune, Cambridge, UK. Mononuklearne ćelije periferne krvi su izolovane standardnom procedurom korišćenjem gradijenta fikol. Ukratko, 20 ml krvi razblažene sa PBS (10 ml krvi:30 ml PBS) naneseno je na 15 ml fikola. Epruvete su centrifugirane na 400 g tokom 40 minuta na sobnoj temperaturi bez kočnice. PBMC slojevi su sakupljeni i ćelije su isprane dva puta sa 50 ml PBS. PBMC su izbrojani korišćenjem hemocitometra i tripan plavog da bi se isključile mrtve ćelije i resuspendovani u medijumu za kulturu (RPMI sa 10% fetalnog telećeg seruma i 1% penicilina/streptomicina) pre postavljanja u ploču sa 96 udubljenja. Ćelije su stimulisane sa TSLP (0,5 ng/ml) u prisustvu fragmenta antitela koji se vezuje za TSLP Fab1, tokom 48 h. Testovi su takođe izvedeni korišćenjem TSLP-vezujućeg antitela tezepelumab, kao pozitivne kontrole. Posle 48 sati, supernatanti su uklonjeni i testirani na proizvodnju CCL17 korišćenjem R&D duoset ELISA, u skladu sa protokolom proizvođača. Eksperimenti su izvedeni sa šest donora u tri nezavisna eksperimenta.

[0148] Rezultati pokazuju da je Fab1 inhibirao proizvodnju CCL17 iz PBMC sa IC50od 1,39 nM (Sl.4). Test je ponovljen korišćenjem pored Fab1, Fab2i Fab3(koji sadrže sekvence varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca kao što je navedeno u Tabeli 3) i dobijeni su slični rezultati (Sl.5).

PRIMER 5 – ODREĐIVANJE MAKSIMALNE TOLERISANE DOZE I FARMAKOKINETIKE POSLE UDISANJA FAB1 KOD CINOMOLGUS MAJMUNA

[0149] Cilj ispitivanje je bio da se odredi maksimalna tolerisana doza (MTD) ili maksimalna izvodljiva doza (MFD) i farmakokinetika (PK) aerosolizovanog Fab1nakon izlaganja inhalacijom preko maske za lice kod Cinomolgus makakija.

[0150] Ženke cinomolgus majmuna primile su jednu inhalaciju Fab1u trajanju od 8 minuta i 20 minuta (grupe 1 i 2, tri životinje po grupi). Doze isporučene u pluća za Grupu 1 i 2 bile su 1 i 2 mg/kg na osnovu 25% taloženja u plućima. Grupa 3 je bila ponovljena eskalacija doze. Jedna ženka i jedan mužjak cinomolgus majmuna tretirani su na sledeći način: 8 minuta inhalacije dnevno prva 2 dana, 20 minuta inhalacije dnevno tokom 2 dana, 60 minuta inhalacije dnevno tokom 3 dana. Sakupljeni su serijski uzorci krvi za Fab1serumsku PK i koncentraciju uree. Uzorci bronhoalveolarnog ispiranja (BAL) su sakupljeni za Fab1PK i koncentraciju uree. Tečnost epitelne obloge (ELF) je izračunata iz BAL koristeći koncentraciju uree kao markera razblaženja. Hibridni imunoafinitetna LC-MS/MS postupak je korišćena za određivanje koncentracije Fab1u matricama uzoraka seruma i BAL. Donja granica kvantifikacije bila je 4 ng/mL u serumu i 10 ng/mL u BAL-u. Nekompartmentalna (NCA) analiza je izvedena na pojedinačnim PK podataka u plazmi korišćenjem Phoeniix WinNonlin (verzija 7.0, Certara, L.P., St Louis, MO).

[0151] Posle inhalacije Fab1, koncentracija PK, BAL i ELF u serumu se povećava sa dozom, a postojala je velika varijabilnost u koncentraciji Fab1(Sl.6A-6C). Prosečno terminalno poluvreme Fab1u serumu kreće se između 9,75 do 13,6 h. Cmaxu serumu je postignut na srednjem Tmaxod 2 do 4 sata nakon inhalacije.

Koncentracija ELF-a je bila mnogo viša od seruma nakon inhalacije (>2000 puta veća) što sugeriše da je distribucija Fab1u serumu bila niska nakon inhalacione doze.

Primer 6: PROCENA FIZIČKIH KARAKTERISTIKA FORMULACIJA OSUŠENIH PRSKANJEM KOJE SADRŽE LEUCIN I TRILEUCIN

[0152] Sledeći postupci procenjuju uticaj odnosa koncentracija trileucina i leucina na svojstva čestica.

[0153] Ukupno, 24 praha različitog mas.% trileucina, leucina i trehaloze (TLT) su osušeni raspršivanjem na pilot sušači raspršivanjem koristeći identične parametre procesa pri ukupnoj koncentraciji čvrste sirovine od 10%. Pošto su sirovine pripremljene sa ukupnom koncentracijom čvrstih materija od 10% (100 mg/mL), sve vrednosti mas.% u ovom ispitivanju su takođe identične vrednostima koncentracije (mg/mL). Opseg vrednosti koncentracije za svaku česticu ekscipijensa prikazan je u tabeli 8.

Tabela 8: Opsezi sastava komponenti čestica

[0154] Svaka sirovina (Tabela 9) je pripremljena rastvaranjem ekscipijenasa u vodi. Kada su svi ekscipijensi potpuno rastvoreni, sirovine su osušene raspršivanjem, korišćenjem sledećih parametara procesa: izlazna temperatura, 70°C; brzina unosa sirovine, 12 ml/min; protok gasa raspršivača, 13 kg/h; i protok gasa za sušenje, 80 kg/h. Parametri su odabrani da bi se postigla ciljana svojstva čestica i aerosola za formulaciju suvog praška namenjenu inhalaciji. Svaka od 24 formulacije proizvedena je u količini od 18 g da bi se obezbedilo dovoljno praška za karakterizaciju i procenu performansi proizvoda. Serije su randomizirane i proizvedene tokom dva dana.

[0155] Sledeće fizičke karakteristike praška su testirane za sve formulacije

Tabela 10: Analizirani parametri čestica

[0156] Kompresovana zapreminska gustina (CBD) praškova je merena korišćenjem GeoPyc® Model 1360 analizatora gustine (Micromeritics, Norcross, GA). Uzorci praška su pripremljeni u okruženju niske vlažnosti (< 5% RV), pre prenošenja u komoru za uzorke analizatora gustine koja je pročišćena gasovitim azotom. Zabeležena je neto masa uzorka praha, a zatim je na uzorak primenjena sila kompresije od 12N pomoću klipa, brzinom od 300 koraka konsolidacije u sekundi. Linearna udaljenost koju je klip prešao za svaki korak konsolidacije preveden je u zapreminsko pomeranje uzorka praška. Prosek merenja iz svakog koraka konsolidacije je zatim transformisan u izračunatu vrednost zapreminske gustine, izražene u g/cm<3>.

[0157] Rezultati pokazuju da je utvrđeno da sadržaj leucina i trileucina ima značajan uticaj na svojstva čestica. Trileucin je identifikovan kao primarni faktor sa najvećim uticajem, dok je leucin identifikovan kao sekundarni faktor sa takođe značajnim uticajem. Rezultati su sumirani u tabeli 11.

Tabela 11: Rezultati karakterizacije čestica

Sila kompresije od 300000 N/m , ili 38N ako se koristi komora za uzorke od 12,7 mm.

PRIMER 7 - KARAKTERISTIKE PERFORMANSE AEROSOLNIH FORMULACIJA LEUCINA/TRILEUCINA

[0158] Sledeći primer procenjuje učinak aerosola formulacija koje sadrže leucin i trileucin u uređaju za inhalaciju suvog praška. Izlazne performanse aerosola navedene u tabeli 7 su testirane na 20 od 24 formulacije navedene u tabeli 4. Sva karakterizacija performansi proizvoda je završena korišćenjem Monodose RS01 uređaja, sa kapsulama veličine 3. Analiza Next Generation Impactor (NGI) je izvedena pri brzini protoka od 60L/min.

[0159] Kaskadno ispitivanje udara je obavljeno prema USP <601> da bi se izmerio učinak aerosola formulacija osušenih raspršivanjem kada se isporučuju iz uređaja za inhalaciju suvog praška. Korišćeni kaskadni udarni aparat bio je Next Generation Impactor (NGI; USP41, Poglavlje <601>). Za merenja aerosola napravljena u ovim primerima, jedna HPMC kapsula veličine 3 koja sadrži formulaciju praška osušenog raspršivanjem je dispergovana iz uređaja za inhalaciju suvog praška i isporučena u NGI pod vakuumom povučenom pri 60 L/min prema USP metodologiji. Uzorci iz svake faze NGI su dobijeni i ispitani na sadržaj proteina UV apsorpcijom na 280 nm. Glavni parametri performansi aerosola izračunati na osnovu ovih merenja su: a) Frakcija finih čestica < 5µm (FPF<5µm), definisana kao frakcija praška emitovanog iz uređaja za koju se meri da je < 5 µm u aerodinamičkom prečniku čestica; i b) srednji maseni aerodinamički prečnik MMAD.

Tabela 12: Karakterizacija aerosola

[0160] Rezultati analize aerosola su rezimirani u tabeli 13.

Tabela 13: Rezultati karakterizacije aerosola

Primer 8 - Stvaranje formulacija leucina/trileucina za inhalaciju koje sadrže fragment koji se vezuje za anti-TSLP antitelo (Fab)

[0161] Testirane su karakteristike druge formulacije koja sadrži drugačiji Fab. Korišćen je anti-TSLP Fab, izveden iz humanog IgG 1 monoklonskog antitela koje specifično vezuje TSLP (limfoprotein strome timusa) (pogledajte sekvence navedene u SEQ ID NOS: 1-8 ovde). Dobijene su različite formulacije koje sadrže masene koncentracije navedene u Tabeli 14.

Tabela 14: Sastav s re om sušenih formulaci a ko e sadrže anti-TSLP Fab

[0162] Anti-TSLP Fab je prvobitno primljen u tečnom puferu koji sadrži 105 mM trehaloze, 30 mM citrata, pH 6,0. Leucin, trileucin, trehaloza i citrat su rastvoreni u odvojenom vodenom rastvoru, koji je zatim dodat u anti-TSLP Fab rastvor da bi se stvorili rasuti rastvori tečne sirovine za sušenje raspršivanjem. Tabela 15 sumira sastave sirovina koje su pripremljene da bi se postigle ciljne kompozicije praškaste formulacije. Rastvori tečne sirovine su zatim osušeni raspršivanjem, koristeći procesne parametre navedene u tabeli 16. Parametri su odabrani da bi se postigla ciljana svojstva čestica i aerosola za formulaciju suvog praška namenjenu inhalaciji.

Tabela 15 Sastav tečnih sirovina za sušenje raspršivanjem

Tabela 16: Ključni parametri procesa sušenja raspršivanjem

[0163] Rezultati karakterizacije performansi praška i aerosola formulacija osušenih raspršivanjem su sumirani u tabeli 17. Za merenja performansi aerosola, sve tri formulacije su testirane sa 20 mg praha osušenog raspršivanjem napunjenog u HPMC kapsulu veličine 3 i dispergovane iz uređaja za inhalaciju suvog praška.

Tabela 17 Svojstva praška i aerosola formulacija koje sadrže anti-TSLP Fab koje su sprejom osušene

[0164] Od posebnog značaja je uspeh u punjenju 50 mg Formulacije #3 u jednu HPMC kapsulu veličine 3, što se može pripisati velikoj zapreminskoj gustini praška. Visoka nasipna gustina (cBD) je omogućila isporuku veoma velikog tereta iz jedne kapsule (FPM <5 µm od oko 14 mg, FPF od 82%, MMAD od 2,4 pm).

[0165] Pored toga, formulacija #3, pokazuje sličan cBD (0,58 g/cm3) i SSA (4,6 m2/g) kao i formulacija anti-IL-4 Fab #2 (cBD = 0,59 g/cm3, SSA = 4,5 m2/g), što sugeriše da se svojstva praška prenose između farmaceutskih formulacija koje sadrže različite aktivne sastojke.

PRIMER 9 – SVOJSTVA PRAŠKA I AEROZOLA ANTI-TSLP FORMULACIJA OSUŠENIH RASPRŠIVANJEM U TRI SERIJE RAZLIČITE VELIČINE

[0166] Ovaj primer pruža analizu svojstava praška i aerosola formulacija anti-TSLP Fab leucina/trileucina koristeći veće veličine serija da bi se omogućila ispitivanja inhalacione toksikologije koje nisu GLP i GLP. Povećanje zahteva korišćenje alternativne opreme za sušenje raspršivanjem i prilagođavanja parametara procesa sušenja raspršivanjem, kako bi se uračunao povećan protok toplote i mase kroz sistem i potreba za produženim ciklusima obrade.

[0167] Proizvedene su tri serije raspršivanjem sušenih anti-TSLP Fab formulacija u rastućim serijama. Serije su sadržavale: anti-TSLP Fab 40% w/w, trehalozu 39% w/w, leucin 10,5% w/w, trileucin 2% w/w i citrat pH 6,08,5% w/w. Parametri procesa odabrani za svaku seriju prikazani su u tabeli 18.

Tabela 18 Parametri procesa sušenja raspršivanjem za tri serije anti-TSLP Fab formulacije sa povećanjem veličine serije

[0168] Testiranje performansi aerosola serije #1 je izvršeno sa masom punjenja praška od 50 mg u HPMC kapsuli veličine 3, dok su serije #2 i #3 testirane sa masom punjenja od 20 mg. Iako postoji blagi porast oVMD kako se veličina serije povećava sa veličine serije od 8,5 g na 1,2 kg, postignuta je gustina komprimovanog praška (cBD) između 0,45 i 0,85 g/cm<3>. Performanse aerosola praškova su takođe održavane nezavisno od veličine serije, sa velikom isporukom anti-TSLP Fab-a iz inhalatora zasnovanog na kapsulama. Ovo pokazuje skalabilnost formulacije uz minimalna prilagođavanja procesa sušara raspršivanjem. Potpuni rezultati karakterizacije praška i ispitivanja performansi aerosola su sažeti u tabeli 19.

Tabela 19 Svojstva praška i performanse aerosola za tri anti-TSLP Fab serije sve veće veličine serije

Primer 10 Dalja karakterizacija leucin/trileucin formulacija koje sadrže surfaktant.

[0169] Stvorene su dodatne serije formulacija trileucina/leucina koje sadrže različite količine PS-80. Sastav formulacije i parametri procesa za proizvodnju svake serije prikazani su u tabeli 20. Inače, stvaranje formulacije je bilo kao što je opisano u primeru 6.

Tabela 20: Sastavi formulacije i parametri procesa sušenja raspršivanjem za formulaciju koja sadrži sve veće količine PS-80

[0170] Svojstva aerosola formulacija u Tabeli 20 su analizirana korišćenjem postupaka obelodanjenih u Primeru 7. Rezultati analize prikazani su u tabeli 21.

Tabela 21: performanse aerosola formulacija koje sadrže PS-80

[0171] Sadržaj agregata, oVMD, sadržaj preostale vlage, Tg, cBD i SSA su takođe mereni korišćenjem postupaka opisanih u prethodnim primerima. Rezultati analize svojstava praška su prikazani u tabeli 22. Tabela 22: Svojstva praška formulacija suvog praška koje sadrže FAB1i različite (w/w) količine PS-80.

[0172] Analiza pokazuje da su svojstva praška u velikoj meri ekvivalentna kontrolnoj formulaciji bez obzira na % (w/w) količinu PS-80.

[0173] Formulacije opisane u Tabeli 22 su zatim analizirane na sadržaj sub-vidljivih čestica (SVP). Broj subvidljivih čestica (SVP) meren je korišćenjem tehnologije mikro-protoka slike (MFI). MFI kombinuje mikrofluidnu protočnu mikroskopiju i analizu čestica slike visoke rezolucije kako bi kvantifikovao SVP broj i objedinio ove brojeve u rasponu veličine čestica. Pre testiranja, uzorci praška su rastvoreni u vodi i lagano mešani da bi se obezbedila ujednačena distribucija čestica, a zatim su stavljeni na Protein Simple MFI 5200 (Kalifornija, SAD). Rezultati su prikazani kao zbirovi za različite veličine čestica (≤1 µm, ≤2 µm, ≤5 µm, ≤10 µm i ≤25 µm) po ml. Sl.14A pokazuje da uključivanje 0,27% (w/w/) PS-80 u formulaciju suvog praška smanjuje apsolutni broj SVP po ml pri rekonstituciji. Smanjenje broja SVP opada sa povećanjem koncentracije PS-80. Značajno smanjenje SVP uočeno je dodavanjem 0,67% (w/w) PS-80, sa zanemarljivom količinom SVP sa prečnikom čestica većim od 5 µm. Trend je primećen kada je formulacija rekonstituisana do koncentracije od 30 mg/ml FAB1 ili 2,5 mg/ml FAB1(Sl.14B).

[0174] Karakterizacija formulacije i analiza SVP-a su sprovedene kao što je iznad opisano za drugu formulaciju koja sadrži ekscipijens. U ovom ispitivanju, poloksamer 188, za razliku od PS-80, korišćen je kao ekscipijens.

[0175] Ispitivani su višestruki % w/w količine poloksamera 188. Sastavi formulacije i parametri procesa za proizvodnju svake šarže formulacije su opisani u tabeli 20 za formulacije koje sadrže PS-80. Količina trehaloze je modifikovana da bi se kompenzovala promenljiva količina poloksamera 188.

[0176] Sadržaj agregata, oVMD, sadržaj preostale vlage, Tg, cBD i SSA su takođe mereni korišćenjem postupaka opisanih u prethodnim primerima. Rezultati analize svojstava praška su prikazani u tabeli 23.

Tabela 23: Svojstva praha formulacija suvog praška koje sadrže FAB1 i različite (w/w) količine Poloksamera-188.

[0177] Svojstva aerosola formulacija Poloksamera-188 su takođe analizirana korišćenjem postupaka obelodanjenih u Primeru 7. Rezultati su prikazani u tabeli 24.

Tabela 24: performanse aerosola form lacija koje sadrže Poloksamer 188 (P188)

Formulacije P188 su analizirane na sadržaj SVP koristeći postupke opisane iznad. Slika 15A pokazuje da uključivanje 0,67% (w/w) P188 u formulaciju suvog praška smanjuje apsolutni broj SVP po ml pri rekonstituciji. Trend je primećen kada je formulacija rekonstituisana do koncentracije od 30 mg/ml FAB1(Sl.

15A) ili 2,5 mg/ml FAB1(SL.15B).

Primer 11 Karakterizacija leucin/trileucin formulacija koje sadrže 1,1% (w/w) PS-80.

[0179] U ovom primeru su analizirana svojstva praška formulacije suvog praška koji sadrži ili 1% ili 40% (m/v) Fab1i 1,1% (w/w) PS-80. Kompletni sastavi formulacije su prikazane u tabeli 25. Formulacije su proizvedene kako je opisano u Primeru 6.

Tabela 25: Masene količine ekscipijenasa u formulacijama suvog praška koje sadrže 1,1% (w/w) PS-80 i ili 40% (w/w) ili 1% (w/w) Fab1

[0180] Stabilnost formulacija je analizirana nakon skladištenja tokom jednog ili tri meseca na 40°C i 75% relativnoj vlažnosti (40/75) ili 25°C i 60% relativnoj vlažnosti (25/60). Ispitivani su distribucija veličine čestica, sadržaj vlage i hrapavost površine. Slike 16A i B pokazuju da su sadržaj vlage i raspodela veličine čestica ostali stabilni tokom vremena za formulacije koje sadrže 40% (w/w) Fab1. Slika C pokazuje da morfologija čestica ostaje konzistentna tokom vremena. Slike 17A i 17B pokazuju da su sadržaj vlage i raspodela veličine čestica ostali stabilni tokom vremena za formulacije koje sadrže 1% (w/w) Fab1. Slika 17C pokazuje da morfologija čestica ostaje konzistentna tokom vremena.

[0181] Analizirano je formiranje SVP-a pri rekonstituciji nakon skladištenja na 40/75 tokom 1 ili 3 meseca, ili 25/60 tokom 3 meseca. Analiza je sprovedena kao što je opisano u Primeru 8. Slika 18A pokazuje da, nakon rekonstitucije 40% (w/w) Fab1formulacije do Fab1koncentracije od 30 mg.ml, količina SVP-a koja se formira pod svakim uslovom ostaje nepromenjena. Slika 18B pokazuje da, nakon rekonstitucije 1% (w/w) Fab1formulacije do Fab1koncentracije od 0,75 mg/ml, količina SVP-a koji se formira pod svakim uslovom ostaje nepromenjena.

[0182] Karakteristike aerosola su takođe testirane nakon skladištenja. Rezultati su prikazani u tabelama 26 i 27.

Tabela 26: Performanse aerosola formulacija koje sadrže 40% (w/w) Fab1i 1,1% (w/w) PS-80 neposredno nakon proizvodnje i nakon skladištenja 1 ili 3 meseca na 40/75 ili 3 meseca na 25/60.

Tabela 27: Performanse aerosola formulacija koje sadrže 1% (w/w) Fab1i 1,1% (w/w) PS-80 neposredno nakon proizvodnje i nakon skladištenja 1 ili 3 meseca na 40/75 ili 3 meseca na 25/60.

[0183] Procenat isporučene doze (DD) je takođe karakterisan nakon skladištenja svake formulacije pod svakim uslovima. Rezultati su prikazani u tabelama 26 i 27.

[0184] Potencija Fab1u svakoj od formulacija opisanih u Tabeli 25 je takođe testirana nakon skladištenja na 40/75 tokom 1 ili 3 meseca, ili 25/60 tokom 3 meseca.

[0185] Potencija je određena korišćenjem homogene vremenski razrešene fluorescencije (HTRF). HTRF kombinuje tehnologiju prenosa energije fluorescentne rezonance (FRET) sa merenjima sa vremenskim razrešenjem (TR). Kada su dva fluorofora, donor i akceptor, u neposrednoj blizini jedan drugom, ekscitacija donora podstiče prenos energije na akceptor, stvarajući tako FRET signal. U ovom testu, Streptavidin-Europium Cryptate, vezan za biotinilovani humani TSLP, je donor, a d2 obeleženo anti-TSLP mAb je akceptor. FAB1se vezuje za humani TSLP i sprečava vezivanje obeleženog mAb. Ovo zauzvrat povećava rastojanje između fluorofora donora i akceptora i rezultira smanjenjem FRET signala.

[0186] Nakon procene paralelizma između referentnog standarda i kontrole testa ili između referentnog standarda i uzoraka testa, vrši se prilagođavanje logističke krive sa četiri parametra (4PL), a relativne snage FAB1kontrolnih i uzoraka testa se izračunavaju deljenjem IC50 vrednosti referentnog standarda ili svaki uzorak testa i množenjem sa 100%.

[0187] Nivoi potentnosti Fab1bili su između 85 do 110% snage Fab1odmah rekonstituisanog (tj. t=0) iz ekvivalentne formulacije.

Reference:

[0188]

Darling RJ, Brault PA. Assay and Drug Development Technologies.2004;2:647-657

Gauvreau GM, O'Byrne PM, Boulet LP, et al. N Engl J Med 2014;370:2102-10

Tepper, JS, et al Int J Toxicol 2016;35: 376-92

Rennard, SI, et al J Appl Physiol 1986;60:532-538

Claims (18)

Patentni zahtevi

1. Fragment koji se vezuje za antigen antitela protiv stromalnog limfoproteina timusa (TSLP) koji sadrži teški lanac koji ima sekvencu datu u SEQ ID NO:28 i laki lanac koji ima sekvencu datu u SEQ ID NO:29.

2. Fragment koji se vezuje za antigen anti-TSLP antitela prema patentnom zahtevu 1, gde je fragment Fab.

3. Formulacija suvog praška koja sadrži više mikročestica, mikročestice sadrže:

a.8% do 11% leucina po masi;

b.2% do 4% trileucina po masi; i

c.2. Fab antitela na stromalni limfoprotein timusa (TSLP) prema patentnom zahtevu 2.

4. Formulacija suvog praška prema patentnom zahtevu 3, gde formulacija suvog praška ima komprimovanu nasipnu gustinu od 0,4-1,0 g/cm<3>.

5. Formulacija suvog praška prema patentnom zahtevu 3 ili zahtevu 4, koja dalje sadrži sredstvo za stabilizaciju stakla.

6. Formulacija suvog praška prema patentnom zahtevu 5, gde je sredstvo za stabilizaciju stakla amorfni saharid i/ili pufer.

7. Formulacija suvog praška prema patentnom zahtevu 6, gde formulacija suvog praška sadrži amorfni saharid, i gde je amorfni saharid izabran iz grupe koju čine trehaloza, saharoza, rafinoza, inulin, dekstran, manitol i ciklodekstrin.

8. Formulacija suvog praška prema patentnom zahtevu 6, gde formulacija suvog praška sadrži pufer, i gde je pufer izabran iz grupe koju čine citratni pufer, fosfatni pufer, histidinski pufer, glicinski pufer, acetatni pufer i tartratni pufer.

9. Formulacija suvog praška prema bilo kom od patentnih zahteva 6-8, gde je amorfni saharid trehaloza.

10. Formulacija suvog praška prema bilo kom od patentnih zahteva 3-9, koja sadrži 10,5% leucina po masi i 2% trileucina po masi.

11. Formulacija suvog praška prema bilo kom od patentnih zahteva 3-10, koja dalje sadrži surfaktant.

12. Formulacija suvog praška prema patentnom zahtevu 11, gde je surfaktant izabran između polisorbata-20 (PS-20), polisorbata-40 (PS-40), polisorbata-60 (PS-60), polisorbata-80 (PS-80) i poloksamera-188.

13. Formulacija suvog praška prema patentnom zahtevu 12, gde je surfaktant PS-80 prisutan u koncentraciji u opsegu od 0,27 masenih % do 2,7 masenih %.

14. Formulacija suvog praška prema patentnom zahtevu 13, naznačena time što je PS-80 prisutan u koncentraciji od 1,1 masenih %.

15. Formulacija suvog praška prema bilo kom od patentnih zahteva 3-14, pri čemu navedena formulacija sadrži više mikročestica, pri čemu mikročestice sadrže:

a.10,5% leucina po masi;

b.2% trileucina po masi;

c. Fab koji se sastoji od teškog lanca koji ima sekvencu datu u SEQ ID NO:28 i lakog lanca koji ima sekvencu datu u SEQ ID NO:29;

d. pufer ; i

e. trehalozu.

16. Formulacija suvog praška prema bilo kom od patentnih zahteva 3-15 za upotrebu u postupku lečenja, gde formulacija treba da se primenjuje inhalacijom.

17. Formulacija suvog praška za upotrebu prema patentnom zahtevu 16, u postupku lečenja astme.

18. Formulacija suvog praška za upotrebu prema patentnom zahtevu 17, gde je astma blaga astma, umerena astma, teška astma, eozinofilna astma ili neeozinofilna astma, ili niskoeozinofilna astma.