RS66648B1 - Proteini dvostruke funkcije i farmaceutska kompozicija koja sadrži iste - Google Patents

Description

Oblast Tehnike

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na protein sa dvostrukom funkcijom uključujući biološki aktivni protein i mutantni protein faktora rasta fibroblasta 21 (FGF21), i farmaceutsku kompoziciju koja sadrži iste.

Stanje tehnike

[0002] US 2013/0129724 A1 se odnosi na proteine sa dvostrukom funkcijom za lečenje metaboličkih poremećaja.

[0003] Glukagonu sličan peptid-1 (GLP-1) je inkretinski hormon koji se sastoji od 31 aminokiseline, koju luče L ćelije u crevnom traktu kada su stimulisane hranom, itd. Njegovi biološki efekti nastaju putem intracelularne signalizacije preko GLP-1 receptora, receptora spojenog sa G proteinom, koji se eksprimuje u ciljanim tkivima kao što su βćelije u pankreasu, mozgu, itd. GLP-1 izlučen u krv ima veoma kratak poluživot od manje od 2 minuta, što je uzrokovano gubitkom aktivnosti usled cepanja aminokiselina na N-terminusu sa enzimom dipeptidil peptidazom-4 (DPP-4). Pošto GLP-1 stimuliše lučenje insulina u βćelijama u pankreasu na osnovu nivoa glukoze u krvi, ima snažan efekat na snižavanje glukoze u krvi bez izazivanja hipoglikemije. Dalje, primena GLP-1 dovodi do gubitka telesne težine kod različitih životinjskih modela i ljudi, što je poznato da je uzrokovano smanjenim unosom hrane zbog njegovog efekta na supresiju apetita. GLP-1 indukuje proliferaciju βćelija i povećava vitalnost β ćelija inhibiranjem ćelijske smrti uzrokovane toksičnošću glikolipida preko GLP-1 receptora eksprimiranih u βćelijama u pankreasu. Prekomerno lučenje glukagona povećava glukozu u krvi, što je poznato kao jedan od uzroka hiperglikemije kod dijabetičara. Pored toga, poznato je da GLP-1 deluje na Įćelije u pankreasu da inhibira povišenje glukoze u krvi natašte tako što inhibira lučenje glukagona specifičnog za protein kinaze A (PKA).

[0004] Eksendin-4 je klinički važan agonist GLP-1 receptora. Eksendin-4 je polipeptid sa 39 aminokiselinskih ostataka i normalno se proizvodi u pljuvačnim žlezdama guštera Gila Monster. Poznato je da eksendin-4 ima homologiju aminokiselinske sekvence od 52 % sa GLP-1, i da je u interakciji sa GLP-1 receptorom kod sisara (Thorens et al. {1993) Diabetes 42:1678-1682). Pokazalo se da eksendin-4 stimuliše lučenje insulina sa ćelijama koje proizvode insulin in vitro, a indukcija oslobađanja insulina sa ćelijama koje proizvode insulin je jača od GLP-1 u ekvimolarnim uslovima. Dok eksendin-4 snažno stimuliše lučenje insulina za smanjenje nivoa glukoze u krvi i kod glodara i kod ljudi sa dužim trajanjem delovanja od GLP-1, eksendin-4 pokazuje antigenost kod sisara lišenih GLP-1 jer ima nepoznate epitope kod takvih životinja.

[0005] Sposobnost analoga GLP-1 i eksendina-4 (npr. liraglutid i bieta) da poboljšaju kontrolu glukoze kod ljudi je klinički potvrđena. Prijavljeno je da GLP-1 povećava βćelijsku masu putem inhibicije apoptoze i indukovane proliferacije. Štaviše, takođe je objavljeno da GLP-1 deluje kao crevni hormon koji inhibira lučenje želudačne kiseline i pražnjenje želuca, dok istovremeno pojačava signale sitosti, čime se smanjuje apetit. Takvi efekti GLP-1 mogu objasniti gubitak težine primećen kada se analozi GLP-1 daju pacijentima sa dijabetesom tipa 2. Pored toga, GLP-1 ispoljava kardioprotektivne efekte nakon ishemije kod glodara.

[0006] Učinjeni su različiti pokušaji da se razviju analozi GLP-1 dugog dejstva. Klinički potvrđeni analozi GLP-1 dugog dejstva uključuju dulaglutid (WO 2005/000892) i albiglutid (WO 2003/059934). Dulaglutid je analog GLP-1 spojen sa Fc, a albiglutid je analog GLP-1 fuzionisan sa albuminom, oba imaju farmakokinetičke profile koji omogućavaju davanje jednom nedeljno. Oba leka imaju odlične efekte na snižavanje glukoze u krvi i smanjenje telesne težine sa jednom nedeljnom primenom, a takođe pružaju znatno poboljšanu pogodnost u pogledu lečenja u poređenju sa bietom i liraglutidom.

[0007] U međuvremenu, faktor rasta fibroblasta 21 (FGF21), sintetizovan u jetri, je hormon za koji se zna da igra važnu ulogu u homeostazi glukoze i lipida. FGF21 ispoljava farmakološka dejstva u jetri, adipocitima, βćelijama pankreasa, hipotalamusu u mozgu i mišićnim tkivima, gde su eksprimirani i FGF21-specifični receptor, odnosno FGF receptor, i β-kloto kompleks. Prijavljeno je da u modelima različitih dijabetičkih i metaboličkih bolesti nehumanih primata i miša, FGF21 može sniziti nivo glukoze u krvi na insulin-nezavisan način, smanjiti telesnu težinu i smanjiti koncentraciju triglicerida i lipoproteina niske gustine (LDL) u krvi. Pored toga, zbog svog efekta poboljšanja osetljivosti na insulin, FGF21 ima potencijal za razvoj kao novi terapeutski agens za dijabetes i gojaznost (videti WO 2003/011213).

[0008] Shodno tome, u cilju razvoja novog antidijabetičkog leka zasnovanog na FGF21, Xčinjeni su pokušaji da se poboljša njegova biološka aktivnost i in vivo stabilnost konstruisanjem mutanata FGF21 zasnovanih na sekvenci divljeg tipa FGF21 putem supstitucije, umetanja i brisanja nekih aminokiselina (videti WO 2010/0654). Međutim, pošto FGF21 ima veoma kratak poluživot, pokazao se problematičnim ako se koristi direktno kao bioterapeutski agens (Kharitonenkov, A. etal. (2005) Journal ofClinical Investigation 115:1627-1635). Poluživot FGF21 in vivo je 1 do 2 sata kod miševa i 2.5 do 3 sata kod majmuna. Stoga, da bi se FGF21 koristio u svom trenutnom obliku kao terapeutski agens za dijabetes, potrebna je svakodnevna primena.

[0009] Prijavljeni su različiti pristupi u pokušaju da se poveća in vivo poluživot FGF21 rekombinantnih proteina. Jedan takav primer je povezivanje polietilen glikola (PEG), odn. polimernog materijala, sa FGF21 da bi se povećala njegova molekularna težina, čime se inhibira izlučivanje bubrega i povećava vreme zadržavanja in vivo (videti WO 2012/066075). Drugi pristup pokušava da poboljša poluživot spajanjem sa masnom kiselinom, koja se vezuje za humani albumin (videti WO 2012/010553). Dodatni primer pokušava da poveća vreme poluraspada uz održavanje farmakološke aktivnosti ekvivalentne onoj divljeg tipa FGF21 kroz stvaranje agonističkog antitela, koje se specifično vezuje za ljudski FGF receptor sam ili kao kompleks sa β-kloto (videti WO 2012/170438). U drugom primeru, poluživot je poboljšan pripremanjem dugodelujućih fuzionih proteina, u kojima se Fc region IgG vezuje za molekul FGF21 (videti WO 2013/188181).

[0010] Među različitim tehnologijama koje su dostupne za stvaranje dugodelujućih lekova, Fc fuziona tehnologija se široko koristi jer ima manje nedostataka koji se vide kod drugih pristupa, kao što je izazivanje imunološkog odgovora ili toksičnosti uz povećanje poluživota in vivo. Za razvoj Fc spojenog FGF21 proteina kao terapeutskog leka dugog dejstva, treba da budu ispunjeni sledeći uslovi.

[0011] Prvo, smanjenje in vitro aktivnosti izazvano sa fuzijom treba minimizirati. I N-terminus i C-terminus FGF21 su uključeni u aktivnost FGF21. S tim u vezi, poznato je da aktivnosti FGF21 fuzionih proteina u velikoj meri variraju u zavisnosti od lokacije fuzije. Shodno tome, aktivnosti Fc-spojenih FGF21 fuzionih proteina, u kojima se mutacije uvode u FGF21, mogu biti izmenjene u zavisnosti od prisustva/odsustva ili lokacije fuzije. Drugo, farmakokinetički profil koji omogućava primenu u intervalu od jednom nedeljno kod ljudi treba da se ostvari povećanjem in vivo poluživota sa fuzijom. Treće, s obzirom na to da se imunogenost može Rčekivati kod većine pacijenata nakon primene biofarmaceutika, rizik imunogenosti usled fuzionog linkera ili mutacije treba da bude minimiziran. Četvrto, ne bi trebalo biti problema sa stabilnošću koji proizilaze iz pozicije fuzije ili uvođenja mutacije. Peto, pošto se neželjeni imuni odgovori mogu javiti u zavisnosti od izotipova fuzionisanog imunoglobulina, neophodno je rešenje za sprečavanje takvih odgovora.

[0012] Već je prijavljen pokušaj da se razvije dugodelujući fuzioni protein povezivanjem Fc regiona imunoglobulina G (IgG) sa molekulom FGF21 (videti WO 2013/188181). U slučaju jedne strukture Fc-FGF21, gde je Fc fuzionisan sa N-terminusom divljeg tipa FGF21, dok ne postoji izrazita razlika u in vitro aktivnosti u poređenju sa onom divljeg tipa FGF21, poznato je da je poluživot veoma kratak zbog in vivo degradacije proteina. Da bi se rešio ovaj problem, postojao je pokušaj da se poboljša poluživot in vivo uvođenjem nekoliko mutacija na određenim lokacijama FGF21 kako bi se oduprlo razgradnji proteina. Međutim, rizik od imunogenosti se može povećati sa uvođenjem višestrukih mutacija. Nasuprot tome, u slučaju FGF21-Fc strukture, gde je Fc spojen sa C-terminusom molekula FGF21, poznato je da postoji značajno smanjenje aktivnosti uzrokovano fuzijom na ovom mestu u poređenju sa Fc-FGF21 strukturom.

[0013] Kombinovana primena GLP-1 i FGF21 može imati sinergistički efekat u poređenju sa jednom primenom u zavisnosti od mehanizama delovanja i ciljnih tkiva u telu, a očekuje se potencijalno izuzetna antidijabetička efikasnost i dodatne prednosti. Efekti kombinovane primene GLP-1 i FGF21 ili GLP-1/FGF21 proteina sa dvostrukom funkcijom su već istraženi i prijavljeni (videti WO 2010/142665 i WO 2011/020319).

[0014] Moraju se rešiti različiti problemi kako bi se razvio protein sa dvostrukom funkcijom koji se sastoji od GLP-1 i FGF21. Pošto GLP-1 divljeg tipa i FGF21 divljeg tipa imaju veoma kratak poluživot in vivo, potrebno je da se primenjuju najmanje jednom dnevno, čak i ako su razvijeni kao terapeutski agensi. Shodno tome, tehnologije dugog dejstva kao što je Fc fuzija su potrebne kako bi se razvili dugodelujući protein sa dvostrukom funkcijom kako bi se poboljšala pogodnost za pacijente. U leku sa dvostrukom funkcijom za dve mete GLP-1 i FGF21, uvođenje mutacije(a) je od suštinskog značaja za održavanje aktivnosti i stabilnosti in vivo svakog leka, a treba rešiti probleme povezane sa promenama aktivnosti, strukture ili stabilnosti izazvane svakom mutacijom. Lekoviti efekti za dve mete GLP-1 i FGF21 treba da budu dobro izbalansirani, a dizajn lekova koji uzima u obzir in vitro aktivnosti, farmakokinetičke profile, farmakološku efikasnost na životinjskim modelima, kao i kliničku procenu efikasnosti kod ljudi je potreban za ovu svrhu. Protein sa dvostrukom funkcijom ima strukturu koja ne može postojati u ljudskom telu, i strukturno je složen u poređenju sa fuzionim proteinom za jednu metu. Pored toga, pošto je mutacija ili inženjering linkera potreban da bi se uravnotežila ova dva cilja, može se povećati mogućnost formiranja agregatnih kompleksa, a može biti potreban dalji inženjering proteina da bi se ovo sprečilo. Štaviše, potencijalna imunogenost se može povećati zbog novih sekvenci mutacija ili složenih struktura, koje treba adresirati ili izbegavati.

[0015] Predmetni pronalazači su nastojali da poboljšaju stabilnost, farmakokinetičke profile i farmakološku efikasnost proteina sa dvostrukom funkcijom, uključujući GLP-1 mutantne proteine i FGF21 mutantne proteine, i otkrili su da stabilnost, farmakokinetički profili i farmakološka efikasnost proteina sa dvostrukom funkcijom se može poboljšati kada je GLP-1 mutantni protein spojen sa Fc regionom imunoglobulina i novi FGF21 mutantni protein je spojen sa njim, čime se postiže predmetni pronalazak.

Opis Pronalaska

Tehnički Problem

[0016] Cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi protein sa dvostrukom funkcijom uključujući biološki aktivni protein i FGF21 mutantni protein sa poboljšanim farmakokinetičkim parametrima, visokom stabilnošću, malom mogućnošću formiranja kompleksa agregacije i smanjenom potencijalnom imunogenošću.

[0017] Drugi cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi farmaceutsku kompoziciju koja uključuje protein sa dvostrukom funkcijom za prevenciju ili lečenje poremećaja povezanih sa FGF21.

[0018] Dalji cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira protein sa dvostrukom funkcijom, ekspresioni vektor uključujući molekul nukleinske kiseline i ćeliju domaćina uključujući ekspresioni vektor.

Rešenje Problema

[0019] Predmetni pronalazak obezbeđuje protein sa dvostrukom funkcijom, protein sa dvostrukom funkcijom za upotrebu, farmaceutsku kompoziciju za upotrebu, izolovani molekul nukleinske kiseline, vektor ekspresije, i ćeliju domaćina kao što je definisano u priloženim zahtevima.

[0020] Predmetni pronalazak obezbeđuje protein sa dvostrukom funkcijom koji sadrži mutantni protein FGF21; biološki aktivan protein; i Fc region imunoglobulina, pri čemu mutantni protein FGF21 ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 6, 11 do 15 i 20 do 23;

pri čemu je biološki aktivni protein onaj izabran iz grupe koju čine peptid sličan glukagonu-1 (GLP-1), mutant GLP-1, i eksendin-4, pri čemu mutant GLP-1 ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 43 do 46; i

pri čemu protein sa dvostrukom funkcijom dalje sadrži linker, pri čemu linker povezuje mutantni protein FGF21 sa Fc regionom imunoglobulina.

[0021] Pored toga, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži protein sa dvostrukom funkcijom pronalaska za upotrebu u lečenju dijabetesa, gojaznosti, dislipidemije, metaboličkog sindroma, bolesti nealkoholne masne jetre, nealkoholnog steatohepatitisa ili kardiovaskularnih bolesti.

[0022] Dalje, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira protein sa dvostrukom funkcijom, ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline i ćeliju domaćina koja sadrži vektor ekspresije.

Pogodni Efekti Pronalaska

[0023] Protein sa dvostrukom funkcijom predmetnog pronalaska, pripremljen povezivanjem biološki aktivnog proteina i FGF mutantnog proteina sa Fc regionom imunoglobulina, ima poboljšanu farmakološku efikasnost, trajanje in vivo i stabilnost proteina. Pored toga, farmaceutska kompozicija koja uključuje protein sa dvostrukom funkcijom kao aktivni sastojak može da se koristi kao terapeutski agens za dijabetes, gojaznost, dislipidemiju, metabolički sindrom, bolesti nealkoholne masne jetre, nealkoholni steatohepatitis ili kardiovaskularne bolesti.

Kratak Opis Slika

[0024]

FIG.1A do 1C su grafikoni koji pokazuju in vitro aktivnosti fuzionih proteina uključujući mutantne proteine FGF21 (u daljem tekstu, "FGF21 mutantni fuzioni protein") korišćenjem ćelijske linije HEK293 u kojoj je humani β-kloto prekomerno eksprimiran. Nijedan FGF21 mutantni fuzioni protein nije pokazao značajno smanjenje aktivnosti usled uvođenja mutacije.

FIG.2A i 2B su grafikoni koji pokazuju in vitro aktivnosti FGF21 mutantnih fuzionih proteina sa različitim linkerima koji povezuju N-terminus FGF21 sa Fc regionom, koristeći ćelijsku liniju HEK293 u kojoj je humani β-kloto prekomerno eksprimiran. Nijedan FGF21 mutantni fuzioni protein nije pokazao značajno smanjenje aktivnosti, iako je prikazana mala razlika u aktivnosti u zavisnosti od sekvence linkera.

FIG.3 je grafik koji prikazuje in vitro aktivnosti RGE(Amgen), Fc-FGF21 (Lilli) i DFD1 korišćenjem ćelijske linije HEK293 u kojoj je humani β-kloto prekomerno eksprimiran. DFD1 i RGE (Amgen) su imali slične aktivnosti, dok je Fc-FGF21 (Lilli) imao in vitro aktivnost dva puta veću od ostalih proteina.

FIG.4 prikazuje stabilnost DFD4 i DFD 13 kako bi se potvrdio efekat EIRP mutacije FGF21 na stabilnost fuzionog proteina. Potvrđeno je da je DFD13 bio povezan sa nižom stopom agregata visoke molekulske težine (HMW %) u početnoj fazi i u vremenskoj tački od više od 2 nedelje kasnije u poređenju sa DFD4, što ukazuje da uvođenje EIRP mutacije poboljšava stabilnost FGF21 mutantnog fuzionog proteina, čime se smanjuje procenat HMW.

FIG.5 prikazuje koncentraciju svakog proteina u krvi tokom 96 sati nakon subkutane administracije FGF21 mutantnih fuzionih proteina. Podaci su naznačeni kao srednje vrednosti i standardna devijacija.

FIG.6 prikazuje nivoe glukoze u krvi u modelu ob/ob miša nakon jedne potkožne injekcije DFD18, DFD72, DFD74 ili Fc-FGF21 (Lilli). DFD18, DFD72 i DFD74 su imali efekat kontinuiranog snižavanja nivoa glukoze u krvi. Podaci su naznačeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti (S.E.M.).

FIG.7 prikazuje grafikone koji pokazuju promene u telesnoj težini u modelu ob/ob miša od dana primene do 14. dana nakon pojedinačne supkutane injekcije DFD18, DFD72, DFD74 ili Fc-FGF21 (Lilly). DFD18, DFD72 i DFD74 su svi imali efekat smanjenja telesne težine u poređenju sa grupom koja je tretirana PBS. Podaci su naznačeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti.

FIG.8 prikazuje grafikone koji pokazuju promene u nivoima glikovanog hemoglobina u modelu ob/ob miša na dan primene (1. dan) i 16. dan nakon pojedinačne supkutane injekcije DFD18, DFD72, DFD74 ili Fc-FGF21 (Lilli). DFD18, DFD72 i DFD74 su svi snizili nivoe glikiranog hemoglobina 16. dana u poređenju sa onima na dan primene. Podaci su naznačeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti.

FIG.9 prikazuje nivoe glukoze u krvi u HFD/STZ modelu miša nakon jedne potkožne injekcije DFD72 ili DFD74. Oba, i DFD72 i DFD74 su imali efekat kontinuiranog snižavanja nivoa glukoze u krvi. Podaci su naznačeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti.

FIG.10 prikazuje promene u telesnoj težini životinja na HFD/STZ modelu miša od dana primene do 14. dana nakon jedne potkožne injekcije DFD72 ili DFD74. Oba, i DFD72 i DFD74 su imali efekat smanjenja telesne težine u poređenju sa grupom koja je tretirana PBS. Podaci su naznačeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti.

FIG.11 prikazuje grafikone koji pokazuju promene u nivoima glikiranog hemoglobina u HFD/STZ modelu miša prvog dana i 13. dana nakon pojedinačne supkutane injekcije DFD72 ili DFD74. Uočeno je da su i DFD72 i DFD74 rezultirali većim smanjenjem nivoa glikovanog hemoglobina u poređenju sa grupom koja je tretirana PBS. Podaci su naznačeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti.

FIG.12 prikazuje promene u telesnim težinama merene u modelu miša izazvane dijetalnom ishranom usled gojaznosti od dana primene do 14. dana nakon jednokratne primene DFD18. DFD18 je imao značajan efekat na smanjenje telesne težine. Podaci su naznačeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti.

FIG.13 je grafikon koji prikazuje in vitro GLP-1 aktivnosti proteina sa dvostrukom funkcijom u zavisnosti od šarki koje povezuju C-terminus GLP-1 mutanata i GLP-1 sa Fc regionom koristeći CHO ćelijsku liniju u kojoj je humani GLP-1 receptor prekomerno eksprimiran.

Uopšteno, protein sa dvostrukom funkcijom koji uključuj GLP-1 GLP-1 sekvencu (DF2-D2) pokazuje 2 do 3 puta nižu aktivnost od onih drugih proteina sa dvostrukom funkcijom koji uključuju druge GLP-1 mutantne sekvence. Nije prikazana ni jedna značajna razlika u aktivnostima GLP-1 između proteina sa dvostrukom funkcijom koji uključuju mutantne sekvence osim GLP-1 (A2G) sekvence.

FIG.14 prikazuje grafikone koji pokazuju GLP-1 aktivnosti DFD59, DFD69, DFD112 i DFD114 i FGF21 aktivnosti DFD69, DFD112 i DFD114. In vitro GLP-1 aktivnosti tri proteina sa dvostrukom funkcijom (DFD69, DFD112 i DFD114) i Fc-spojenog GLP-1 mutanta uključujući no FGF21 (DFD59) su merene korišćenjem CHO ćelijske linije u kojoj humani GLP-1 receptor je prekomerno izražen. Tri proteina sa dvostrukom funkcijom pokazala su slične vrednosti EC50, a Fc-spojeni GLP-1 mutant (DFD59) pokazao je oko 2 puta veću aktivnost nego oni proteini sa dvostrukom funkcijom. In vitro aktivnosti proteina sa dvostrukom funkcijom u zavisnosti od FGF21 mutanata su merene korišćenjem HEK293 ćelijske linije u kojoj humani β-kloto je prekomerno izražen. Potvrđeno je da su in vitro aktivnosti FGF21 dela bile slične u tri proteina sa dvostrukom funkcijom.

FIG.15 prikazuje koncentracije proteina u krvi u odnosu na vreme tokom 240 sati nakon subkutane primene proteina sa dvostrukom funkcijom. Podaci su naznačeni kao srednje vrednosti i standardna devijacija.

FIG.16 prikazuje nivoe glukoze u krvi u db/db modelu miša nakon jedne potkožne injekcije DFD114 ili DFD59 i pojedinačne potkožne injekcije kombinacije DFD59 i DFD74. Grupe koje su tretirane sa proteinima sa dvostrukom funkcijom su pokazale jače efekte na snižavanje nivoa glukoze u krvi nego one koje su tretirane sa proteinima sa pojedinačnom funkcijom. Podaci su naznačeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti (S.E.M.). FIG.17 prikazuje grafikone koji pokazuju promene u telesnoj težini u db/db modelu miša od dana primene do 14. dana nakon pojedinačne potkožne injekcije DFD114 ili DFD59 i pojedinačne supkutane injekcije kombinacije DFD59 i DFD74. Grupe tretirane sa proteinima sa dvostrukom funkcijom pokazale su jače efekte na smanjenje telesne težine od onih koje su tretirane sa proteinima sa pojedinačnom funkcijom. Podaci su naznačeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti (S.E.M.).

FIG.18 prikazuje grafikone koji pokazuju promene u nivoima glikovanog hemoglobina u db/db modelima miša na dan primene (1. dan) i 16. dan nakon pojedinačne supkutane injekcije DFD114 ili DFD59 i jedne potkožne injekcije kombinacije DFD54 i DFD77. Grupe tretirane sa proteinima sa dvostrukom funkcijom pokazale su jače efekte na smanjenje nivoa glikovanog hemoglobina od onih koje su tretirane sa proteinima sa pojedinačnom funkcijom ili njihovom kombinacijom. Podaci su naznačeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti.

FIG.19 prikazuje nivoe glukoze u krvi u HFD/STZ modelu miša nakon jedne supkutane injekcije DFD114, DFD59, DFD74 ili DFD72 i jedne potkožne injekcije kombinacije DFD59 i DFD74. Grupe tretirane sa proteinima sa dvostrukom funkcijom pokazale su jače efekte na snižavanje nivoa glukoze u krvi od onih koje su tretirane sa proteinima sa pojedinačnom funkcijom. Podaci su naznačeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti (S.E.M.).

FIG.20 prikazuje promene telesne težine u HFD/STZ modelu miša od dana primene do 14. dana nakon pojedinačne potkožne injekcije DFD59, DFD72, DFD74 ili DFD114 i pojedinačne supkutane injekcije kombinacije DFD59 i DFD74. Grupe tretirane sa proteinima sa dvostrukom funkcijom pokazale su jači efekat na smanjenje telesne težine u odnosu na one tretirane sa proteinima sa pojedinačnom funkcijom. Podaci su naznačeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti (S.E.M.).

FIG.21 prikazuje promene nivoa glikovanog hemoglobina u HFD/STZ modelu miša na dan primene (1. dan) i 16. dan nakon pojedinačne supkutane injekcije DFD59, DFD72, DFD74 ili DFD114 i pojedinačne potkožne injekcije DFD759 i kombinacije DFD759. Grupe tretirane sa proteinima sa dvostrukom funkcijom pokazale su jače efekte na smanjenje nivoa glikovanog hemoglobina od onih koje su tretirane sa proteinima sa pojedinačnom funkcijom ili njihovom kombinacijom. Podaci su naznačeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti.

Najbolji Način za Sprovođenje Pronalaska

[0025] U daljem tekstu, predmetni pronalazak će biti opisan detaljnije.

[0026] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje protein sa dvostrukom funkcijom koji sadrži mutantni protein faktora rasta fibroblasta 21 (FGF21); biološki aktivan protein; i Fc region imunoglobulina, pri čemu mutantni protein FGF21 ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 6, 11 do 15 i 20 do 23;

pri čemu je biološki aktivni protein onaj izabran između grupe koju čine peptid sličan glukagonu-1 (GLP-1), mutant GLP-1 i eksendin-4, pri čemu mutant GLP-1 ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 43 do 46; i

pri čemu protein sa dvostrukom funkcijom dalje sadrži linker, pri čemu linker povezuje mutantni protein FGF21 sa Fc regionom imunoglobulina.

[0027] Protein FGF21 divljeg tipa, hormon za koji se zna da igra važnu ulogu u homeostazi glukoze i lipida, može biti poreklom od sisara kao što su ljudi, miševi, svinje, majmuni, itd., poželjno od ljudi. Još poželjnije, FGF21 protein divljeg tipa može biti humani FGF21 protein divljeg tipa koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 1.

[0028] Mutacija uključena u FGF21 mutantni protein je mutacija EIRP; ili kombinacija bilo koje od mutacija TGLEAV, TGLEAN, G170N i G174N i mutacije EIRP; ili kombinacija mutacije EIRP i mutacije A180E; ili kombinacija bilo koje od mutacija TGLEAV, TGLEAN, G170N i G174N, mutacije EIRP i mutacije A180E. FGF21 mutantni protein ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 6, 11 do 15 i 20 do 23.

[0029] U proteinu sa dvostrukom funkcijom, aminokiselinski ostatak N FGF21 mutantnog proteina uveden sa mutacijom može biti glikoziliran.

[0030] Biološki aktivni protein je onaj koji je odabran između GLP-1, njegovog mutanta i eksendina-4, pri čemu mutant GLP-1 ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 43 do 46.

[0031] Kao što je ovde korišćeno, izraz "Fc region", "Fc fragment" ili "Fc" se odnosi na protein, koji uključuje konstantni region teškog lanca 1 (CH1), konstantni region teškog lanca 2 (CH2) i konstantni region teškog lanca 3 (CH3) imunoglobulina, ali ne uključuje varijabilne regione teškog i lakog lanca i konstantni region lakog lanca 1 (CL1) imunoglobulina.

Dodatno, kao što je ovde korišćeno, izraz "mutant Fc regiona" se odnosi na onaj pripremljen sa supstitucijom dela aminokiseline(a) Fc regiona ili sa kombinovanjem Fc regiona različitih tipova.

[0032] Fc region imunoglobulina može biti ceo Fc region koji čini antitelo, njegov fragment ili mutant Fc regiona. Dodatno, Fc region uključuje molekul u obliku monomera ili multimera, i može dalje da obuhvata zglobni region konstantnog regiona teškog lanca. Mutant Fc regiona može biti modifikovan tako da spreči cepanje u zglobnom regionu. Štaviše, zglobne sekvence Fc mogu imati supstituciju u nekim aminokiselinskim sekvencama kako bi se smanjila ćelijski posredovana citotoksičnost (ADCC) ili komplement zavisna citotoksičnost (CDC). Pored toga, deo aminokiselinske sekvence Fc zglobne sekvence može biti supstituisan tako da inhibira preuređenje Fab regiona. Ostatak lizina na C-terminusu Fc može biti uklonjen.

[0033] Poželjno, Fc region imunoglobulina može biti bilo koji od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 i IgD Fc regiona; ili hibridni Fc, koji je njihova kombinacija. Dalje, hibridni Fc može uključivati IgG4 region i IgD region. Dalje, hibridni Fc region može uključivati deo zglobne sekvence i CH2 IgD Fc, i CH2 i CH3 sekvenci IgG4 Fc.

[0034] Pored toga, Fc fragment predmetnog pronalaska može biti u obliku glikozilovanog lanca divljeg tipa, više glikozilovanog lanca od divljeg tipa, manje glikozilovanog lanca od divljeg tipa, ili deglikozilovanog lanca. Povećanje, smanjenje ili uklanjanje glikozilovanog lanca može se izvesti uobičajenim postupkom poznatim u tehnici, kao što je hemijski postupak, enzimski postupak i postupak genetskog inženjeringa korišćenjem mikroorganizama.

[0035] Poželjno, Fc region imunoglobulina može biti predstavljen aminokiselinskom sekvencom odabranom od SEQ ID NO: 24 do 26, 47 i 48.

[0036] Protein sa dvostrukom funkcijom može uključivati biološki aktivni protein, Fc region imunoglobulina i FGF21 mutantni protein, koji su povezani ovim redosledom od N-terminusa do C-terminusa. Dalje, protein sa dvostrukom funkcijom može uključivati FGF21 mutantni protein, Fc region imunoglobulina i biološki aktivni protein, koji su povezani ovim redosledom od N-terminusa do C-terminusa. Poželjno, protein sa dvostrukom funkcijom može uključivati biološki aktivni protein, Fc region imunoglobulina i FGF21 mutantni protein, koji su povezani ovim redosledom od N-terminusa do C-terminusa.

[0037] Dalje, protein sa dvostrukom funkcijom može uključivati GLP-1 mutantni protein, Fc region imunoglobulina i FGF21 mutantni protein, koji su povezani ovim redosledom od N-terminusa do C-terminusa. Dalje, protein sa dvostrukom funkcijom može uključivati FGF21 mutantni protein, Fc region imunoglobulina i GLP-1 mutantni protein, koji su povezani ovim redosledom od N-terminusa do C-terminusa. Poželjno, protein sa dvostrukom funkcijom može uključivati GLP-1 mutantni protein, Fc region imunoglobulina i FGF21 mutantni protein, koji su povezani ovim redosledom od N-terminusa do C-terminusa.

[0038] Protein sa dvostrukom funkcijom dalje uključuje linker, pri čemu linker povezuje FGF21 mutantni protein sa Fc regionom imunoglobulina.

[0039] Linker može biti povezan sa N-terminusom, C-terminusom ili slobodnim radikalom Fc fragmenta, a takođe može biti povezan sa N-terminusom, C-terminusom ili slobodnim radikalom FGF21 mutantnog proteina. Kada je linker peptidni linker, veza se može javiti u bilo kom regionu. Na primer, linker može biti povezan sa C-terminusom Fc regiona imunoglobulina i N-terminusom mutantnog proteina FGF21 kako bi se formirao fuzioni protein Fc regiona imunoglobulina i FGF21 mutantnog proteina.

[0040] Dalje, protein sa dvostrukom funkcijom predmetnog pronalaska može biti u obliku u kome je biološki aktivni protein vezan za N-terminus Fc regiona imunoglobulina fuzionog proteina.

[0041] Kada su linker i Fc odvojeno eksprimirani i zatim povezani, linker može biti agens za umrežavanje poznato u tehnici. Primeri agensa za umrežavanje mogu da obuhvataju 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, imidoestre uključujući N-hidroksisukcinimid estar kao što je 4-azidosalicilna kiselina i disukcinimidil estri kao što su 3,3’-sukcinimid bipropionidiobidi i disukcinimidil estri, kao što je bis-N-maleimido-1,8-oktan, ali nisu ograničeni na to.

[0042] Dalje, linker može biti peptid. Poželjno, linker može biti peptid koji se sastoji od 10 do 30 aminokiselinskih ostataka.

[0043] Dalje, alanin može dodatno biti vezan za kraj linkera. Poželjno, linker može biti peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2 do 5.

[0044] Protein sa dvostrukom funkcijom može biti u obliku u kome je dimer ili multimer FGF21 mutantnih proteina, u kome je jedan ili više FGF21 mutantnih proteina povezanih zajedno, povezan sa Fc regionom imunoglobulina. Dodatno, protein sa dvostrukom funkcijom može biti u obliku dimera ili multimera u kome su dva ili više Fc regiona imunoglobulina povezana, pri čemu imunoglobulinski Fc regioni imaju FGF21 mutantni protein vezan za njih.

[0045] Dodatno, protein sa dvostrukom funkcijom može biti peptid koji poželjno ima aminokiselinsku sekvencu bilo kog od SEQ ID NO: 58 do 67. Još poželjnije, protein sa dvostrukom funkcijom može biti peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 65, 66 ili 67.

[0046] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži protein sa dvostrukom funkcijom za upotrebu u lečenju dijabetesa, gojaznosti, dislipidemije, metaboličkog sindroma, nealkoholne masne bolesti jetre, nealkoholnog steatohepatitisa ili kardiovaskularnih bolesti.

[0047] Dalje, farmaceutska kompozicija može dalje da sadrži farmaceutski nosač.

Farmaceutski nosač može biti bilo koji nosač sve dok je netoksičan materijal pogodan za isporuku antitela pacijentima. Na primer, destilovana voda, alkohol, masti, voskovi i neaktivne čvrste materije mogu biti uključene kao nosač. Farmaceutski prihvatljive pomoćne supstance (adjuvansi) (puferi, disperzanti) takođe mogu biti uključeni u farmaceutsku kompoziciju. U ovim formulacijama, koncentracija proteina sa dvostrukom funkcijom može značajno da varira.

[0048] Konkretno, farmaceutska kompozicija može da sadrži materijal za formulaciju za promenu, održavanje ili očuvanje pH, osmolarnosti, viskoziteta, transparentnosti, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobađanja, adsorpcije ili permeabilnosti kompozicije. Primeri pogodnog materijala za formulaciju mogu uključivati aminokiseline (npr. glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin), agense protiv mikroorganizama, antioksidanse (npr. askorbinsku kiselinu, natrijum sulft ili natrijum bisulfat), agense za puferiranje (npr. fosfat ili druge organske kiseline), agense za povećanje zapremine (npr. manitol ili glicin), agense za helatiranje (npr. etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA)), agense za stvaranje kompleksa (npr. kofein, polivinilpirolidion, βciklodekstrin, β-ciklodekstrin- ili monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati (npr. glukoza, manoza ili dekstrin), proteini (npr. serumski albumin, želatin ili imunoglobulin), agense za bojenje, agense za aromu, razblaživače, emulgatore, hidrofilne polimere (npr. polivinilpirolidin), polipeptide male molekulske težine, kontrajoni koji učestvuju u obrazovanju soli (npr. natrijum), konzervanse (npr. benzalkonijum hlorid, benzojeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid), rastvarače (npr. glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol), šećerne alkoholi (npr. manitol ili sorbitol), agense za suspendovanje, surfaktante ili humektante (npr., pluronik; PEG; sorbitan estar; polisorbat, npr., polisorbat 20 ili polisorbat 80; triton; trometamin; lecitin; holesterol ili tiloksapol), agense za poboljšanje stabilnosti (npr.

saharoza ili sorbitol), agense za poboljšanje rasta (npr. halogenidi alkalnih metala, poželjno, natrijum hlorid ili kalijum hlorid; ili manitol, sorbitol), agense za isporuku, razblaživače, ekscipijense i/ili farmaceutske pomoćne supstance, ali nisu ograničeni na njih.

[0049] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje protein sa dvostrukom funkcijom pronalaska za upotrebu u lečenju dijabetesa, gojaznosti, dislipidemije, metaboličkog sindroma, nealkoholne bolesti masne jetre, nealkoholnog steatohepatitisa ili kardiovaskularnih bolesti. Lečenje uključuje davanje proteina sa dvostrukom funkcijom subjektu kome je potrebno takvo lečenje, prvenstveno, davanje efikasne količine proteina sa dvostrukom funkcijom predmetnog pronalaska sisaru koji ima simptom dijabetesa, gojaznosti, dislipidemije, metaboličkog sindroma, bolesti nealkoholne masne jetre, nealkoholnog steatohepatitisa ili kardiovaskularnih bolesti koje su poremećaji povezani sa FGF21.

[0050] Farmaceutska kompozicija se može primeniti na bilo koji način. Kompozicija se može dati životinji direktno (npr., lokalno, primenom u oblasti tkiva injekcijom, transplantacijom ili sa lokalnom primenom) ili sistemski (npr., oralnom ili parenteralnom primenom) na bilo koji odgovarajući način. Kada se kompozicija daje parenteralno putem intravenozno-, subkutano-, oftalmološko-, intraperitonealno-, intramuskularno-, oralno-, rektalno-, intraorbitalno-, intracerebralno-, intrakranijalno-, intrapinkularno- intratekalno, intracistenalno, intrakapsularno, intranazalno ili aerosolno davanje, kompozicija je poželjno vodena ili može uključivati deo fiziološki primenljive tečne suspenzije ili rastvora za telo. Shodno tome, nosač ili nosač se mogu dodati u kompoziciju i isporučiti pacijentu pošto su fiziološki primenljivi. Prema tome, fiziološki odgovarajući fiziološki rastvor uopšteno može biti uključen kao nosač u vidu telesne tečnosti za formulacije.

[0051] Dalje, učestalost primene može da varira u zavisnosti od farmakokinetičkih parametara proteina sa dvostrukom funkcijom u formulacijama koje se koriste. Obično, lekari bi primenjivali kompoziciju sve dok se ne dostigne doza primene za postizanje željenog efekta. Shodno tome, kompozicija se može primeniti kao jedinična doza, najmanje dve doze sa vremenskim intervalima (može ili ne mora da sadrži istu količinu ciljanog proteina sa dvostrukom funkcijom) ili se primenjuje kontinuiranom injekcijom preko uređaja za transplantaciju ili katetera. Preciznost dodavanja odgovarajuće doze za davanje može rutinski da se obavlja od strane stručnjaka u ovoj oblasti i odgovara obimu posla koji oni rutinski obavljaju.

[0052] Dodatno, poželjna jedinična doza proteina sa dvostrukom funkcijom kod ljudi može biti u opsegu od 0.01 µg/kg do 100 mg/kg telesne težine, a poželjnije od 1 µg/kg do 10 mg/kg telesne težine. Iako je ovo optimalna količina, jedinična doza može da varira u zavisnosti od bolesti koja se leči ili prisustva/odsustva neželjenih efekata. Ipak, optimalna doza za davanje se može odrediti izvođenjem uobičajenog eksperimenta. Primena proteina sa dvostrukom funkcijom se može izvršiti periodičnom bolus injekcijom, spoljnim rezervoarom (npr., intravenska vreća) ili kontinuiranom intravenskom, potkožnom ili intraperitonealnom primenom iz unutrašnjeg izvora (npr. bioerodabilni implant).

[0053] Pored toga, protein sa dvostrukom funkcijom predmetnog pronalaska se može davati subjektu primaocu zajedno sa drugim biološki aktivnim molekulima. Optimalna kombinacija proteina sa dvostrukom funkcijom i drugog(ih) molekula(a), doznih oblika, i optimalnih doza se može odrediti uobičajenim eksperimentom dobro poznatim u tehnici.

[0054] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira protein sa dvostrukom funkcijom.

[0055] Kao što je ovde korišćeno, izraz "izolovani molekul nukleinske kiseline" se odnosi na molekul nukleinske kiseline predmetnog pronalaska, koji je izolovan iz najmanje 50 % proteina, lipida, ugljenih hidrata ili drugih materijala, otkrivenih u prirodi kada su ukupne nukleinske kiseline izolovane iz ćelije izvora; koji je operativno vezan za polinukleotid koji nije vezan u prirodi; ili koji je deo veće polinukleotidne sekvence i ne javlja se u prirodi. Poželjno, u izolovanim molekulima nukleinskih kiselina predmetnog pronalaska, nema suštinski prisutnih drugih kontaminiranih nukleinskih kiselina, ili drugih zagađivača koji su otkriveni u prirodnom okruženju i inhibiraju upotrebu nukleinskih kiselina u proizvodnji polipeptida, ili lečenju, dijagnostici, prevenciji ili istraživanju.

[0056] U tom slučaju, izolovani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju protein sa dvostrukom funkcijom mogu imati različite sekvence jedna sa drugom zbog redundance kodona. Štaviše, sve dok izolovana nukleinska kiselina može da proizvede protein sa dvostrukom funkcijom, izolovana nukleinska kiselina može biti na odgovarajući način modifikovana, ili se nukleotid može dodati na N-terminus ili C-terminus izolovane nukleinske kiseline u skladu sa željenim svrhama.

[0057] Izolovana nukleinska kiselina može uključivati, na primer, nukleotidnu sekvencu predstavljenu bilo kojim od SEQ ID NO: 71 do 80.

[0058] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline.

[0059] Kao što je ovde korišćenosti, izraz "ekspresioni vektor" se odnosi na vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline, koja je pogodna za transformaciju ćelije domaćina i usmerava ili kontroliše ekspresiju umetnute heterogene sekvence nukleinske kiseline. Ekspresioni vektor uključuje linearnu nukleinsku kiselinu, plazmid, fagemid, kosmid, RNK vektor, virusni vektor i njihove analoge. Primeri virusnog vektora uključuju retrovirus, adenovirus i adenopovezani virus, ali nisu ograničeni na njih.

[0060] Kao što je ovde korišćeno, izraz "ekspresija heterogene sekvence nukleinske kiseline" ili "ekspresija" ciljanog proteina se odnosi na transkripciju umetnute DNK sekvence, translaciju mRNK transkripta i proizvodnju proizvoda Fc fuzionog proteina, antitela ili fragmenta antitela.

[0061] Koristan ekspresioni vektor može biti RcCMV (Invitrogen, Carlsbad) ili njegov mutant. Korisni ekspresioni vektor može uključivati promoter humanog citomegalovirusa (CMV) za promovisanje kontinuirane transkripcije ciljanog gena u ćeliji sisara i signalnu sekvencu poliadenilacionog hormona rasta goveda za povećanje nivoa stabilnosti posttranskripcione RNK. U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, ekspresioni vektor je pAD15, koji je modifikovani vektor RcCMV.

[0062] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži ekspresioni vektor.

[0063] Kao što je ovde korišćeno, izraz "ćelija domaćin" se odnosi na prokariotsku ćeliju ili eukariotsku ćeliju u koju se može uvesti rekombinantni ekspresioni vektor. Kao što je ovde korišćeno, izraz "transformisan" ili "transfektovan" se odnosi na uvođenje nukleinske kiseline (npr. vektora) u ćeliju pomoću različitih tehnologija poznatih u tehnici.

[0064] Odgovarajuća ćelija domaćin može biti transformisana ili transfektovana sa DNK sekvencom predmentog pronalaska i može se koristiti za ekspresiju i/ili sekreciju ciljanog proteina. Primeri odgovarajućih ćelija domaćina koje se mogu koristiti u predmetnom pronalasku obuhvataju ćelije besmrtnog hibridoma, ćelije NS/0 mijeloma, 293 ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, CAP ćelije (ćelije izvedene iz humane amnionske tečnosti) i COS ćelije.

[0065] U daljem tekstu, primeri izvođenja predmetnog pronalaska će biti detaljno opisani sa referencom na primere. Međutim, ovi primeri prema predmetnom pronalasku mogu biti modifikovani u mnogo različitih oblika i obim predmetnog pronalaska ne treba tumačiti kao ograničen na primere koji su ovde izloženi.

Režim za Pronalazak

Primer Pripreme 1. Priprema i prečišćavanje fuzionog proteina koji sadrži FGF21 mutantni protein

Primer Pripreme 1-1. Priprema ekspresionog vektora za ekspresiju FGF21 mutantnih proteina

[0066] Kako bi se poboljšala stabilnost, aktivnost i farmakokinetički profili FGF21 u strukturi Fc-FGF21, sprovedene su studije mutacije FGF21.

[0067] Konkretno, mutantni proteini su dizajnirani za LLLE region (aminokiseline na pozicijama 98 do 101 od N-terminusa FGF21 proteina) i GPSQG region (aminokiseline na pozicijama 170 do 174 od N-terminusa FGF21 proteina), i A180 mesto, za koje se očekivalo da značajno utiču na aktivnosti proteina na osnovu analize 3-dimenzionalne strukture FGF21 proteina.

[0068] Položaj, informacije o sekvenci, cilj i očekivani efekat svake mutacije uvedene u FGF21 protein su navedeni u Tabeli 1 ispod (u Tabeli 1, N se odnosi na glikozilovani asparagin (N)). Dalje, FGF21 mutantni proteini koji uključuje mutacije opisane u Tabeli 1 su navedeni u Tabeli 2 u nastavku.

Tabela 1

Tabela 2

[0069] Ekspresioni vektori su pripremljeni da eksprimiraju aminokiseline tri komponente: fuzioni nosač, linker i FGF21 mutant ovim redosledom od N-terminusa do C-terminusa. Šifra materijala svakog FGF21 mutantnog fuzionog proteina, sekvenca mutacije uvedena u FGF21, sekvenca fuzionog nosača i sekvenca linkera su navedeni u Tabeli 3 u nastavku (u Tabeli 3, N se odnosi na glikozilovani asparagin (N)).

Tabela 3

[0070] Da bi se proizveli FGF21 mutantni fuzioni proteini, nukleotidne sekvence koje kodiraju svaki od FGF21 mutantnih proteina su sintetizovane konsultovanjem sa Bioneer Corporation (Koreja) na osnovu aminokiselinske sekvence svakog proteina. Sekvence restrikcijskih enzima NheI i NotI su dodate na 5’ terminusu i 3’ terminusu nukleotidnih sekvenci koje kodiraju svaki od FGF21 mutantnih proteina i inicijacijski kodon za translaciju proteina i lidersku sekvencu (MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPSHA) sposobne da izlučuju eksprimirani protein na spoljašnju stranu ćelije umetnute su pored sekvence restrikcionog enzima na 5' terminusu. Aterminacioni kodon je umetnut pored nukleotidne sekvence, koja kodira svaki od FGF21 mutantnih fuzionih proteina. Nukleotidna sekvenca koja kodira svaki od FGF21 mutantnih fuzionih proteina je klonirana u pTrans-empti ekspresionom vektoru korišćenjem dva restrikciona enzima NheI i NotI. Ekspresioni vektor pTrans-empti, koji ima jednostavnu strukturu uključujući CMV promoter, pUC izvedeno poreklo replikacije, SV40 izvedeno poreklo replikacije i gen otporan na ampicilin, je kupljen od CEVEC Pharmaceuticals (Nemačka).

[0071] U slučaju fuzionih proteina DFD6 (E. coli) i RGE (Amgen), nukleotidna sekvenca koja kodira svaki fuzioni protein je ubačena u pET30a ekspresioni vektor za ekspresiju u E. coli.

Primer Pripreme 1-2. Konstrukcija plazmidne DNK za ekspresiju FGF21 mutantnih fuzionih proteina

[0072] E. coli je transformisana sa svakim od ekspresionih vektora konstruisanih u Primeru pripreme 1-1 kako bi se dobila velika količina plazmidne DNK koja će se koristiti za ekspresiju. ûelije E. coli, čiji su ćelijski zidovi bili oslabljeni, transformisane su sa svakim od ekspresionih vektora kroz toplotni šok, a transformanti su postavljeni na LB ploče kako bi se dobile kolonije. Tako dobijene kolonije su inokulisane u LB medijum, kultivisane na 37°C tokom 16 sati, a svaka kultura E. coli koja sadrži svaki ekspresioni vektor dobijena je u zapremini od 100 mL. Tako dobijena E. coli je centrifugirana kako bi se uklonila podloga za kulturu, a zatim su dodavani rastvori P1, P2, P3 (QIAGEN, Cat No.: 12963) kako bi se razbili ćelijski zidovi, čime je dobijena DNK suspenzija u kojoj su proteini i DNK odvojeni.

Plazmidna DNK je prečišćena iz tako dobijene DNK suspenzije korišćenjem Qiagen DNK kolone za prečišćavanje. Eluirana plazmidna DNK je identifikovana elektroforezom u agaroznom gelu, a koncentracije i čistoće su izmerene korišćenjem nanodrop uređaja (Thermo scientifc, Nanodrop Lite). Tako dobijena DNK je korišćena za ekspresiju.

Primer Pripreme 1-3. Ekspresija fuzionih proteina u CAP-T ćelijama

[0073] Ljudske ćelijske linije su transfektovane sa svakim tipom plazmidne DNK dobijene u Primeru Pripreme 1-2. Svaki tip plazmidne DNK je transdukovan u CAP-T ćelije (CEVEC), koje su kultivisane u PEM medijumu (Life technologies), korišćenjem PEI rastvora (Polyplus, Cat. No.: 101-10N). Izmešani rastvor DNK i PEI rastvora je izmešan sa ćelijskom suspenzijom korišćenjem Freestyle293 medijuma za ekspresiju (Invitrogen), kultivisan na 37°C tokom 5 sati, i PEM medijum je dodat. Posle kultivisanja na 37°C tokom 5-7 dana, kultura je centrifugirana kako bi se uklonile ćelije i dobijen je supernatant koji uključuje FGF21 mutantne fuzione proteine.

Primer Pripreme 1-4. Ekspresija i prečišćavanje FGF21 mutantnih fuzionih proteina u E. coli

[0074] E. coli soj BL21 (DE3) je transformisan sa svakom plazmidnom DNK koja eksprimira DFD6 (E. coli) i RGE (Amgen) fuzione proteine. Transformisana E. coli koja eksprimira svaki fuzioni protein je inokulisana u 20 mL LB medijuma, kultivisana na 37°C tokom 15 sati uz mućkanje, a zatim je deo kulturnog medijuma inokulisan u 100 mL LB medijuma, i kultivisan na 37°C tokom 16 sati uz mućkanje. Po završetku kultivisanja, kultura je centrifugirana kako bi se dobili E. coli pelati, a zatim su ćelije poremećene korišćenjem disruptora ćelija visokog pritiska kako bi se dobila inkluziona tela.

[0075] Dobijena inkluziona tela su prečišćena ispiranjem i eluiranjem, nakon čega je usledio proces ponovnog savijanja proteina. Konkretno, dobijena inkluziona tela su isprana 2-3 puta rastvorom pufera (pH 8.0) koji sadrži 0.5 % Triton X-100, 50 mM Tris, 1 mM EDTA i 0.1 M NaCl kako bi se uklonio bakterijski protein, a zatim resuspendovana u 8 M urea puferu koji sadrži 8 M, 50 mM Tris i 1 mM DTT. Pošto su proteini u 8 M urea puferu potpuno denaturisani, postupak proteinskog ponovnog savijanja je izveden na sledeći način.

[0076] Za početak, 8 M urea pufera je postepeno razblaženo sa 20 mM rastvora glicinskog pufera (pH 9.0) kako bi se uklonila urea, a iz koncentracije od 2 M, CuSO4je dodat u koncentraciju od 80 µM kako bi se izazvalo stabilno savijanje proteina. Protein koji je završio proces rastvaranja je suspendovan u rastvoru PBS pufera (pH 7.4), i suspenzija je filtrirana sa filterom od 0.22 µm kako bi se uklonile nečistoće, a zatim ubačen u kolonu za afinitetnu hromatografiju za Protein A. Kolona je isprana sa 1X PBS rastvorom pufera (pH 7.4), a zatim su proteini eluirani korišćenjem 100 mM rastvora glicinskog pufera (pH 3.0) kako bi se pripremio DFD6 (E. coli) fuzioni protein.

[0077] U slučaju RGE (Amgen) fuzionog proteina, protein koji je završio proces ponovnog presavijanja je suspendovan u 50 mM rastvora Tris pufera (pH 8.0), suspenzija je filtrirana sa 0.22 µm filterom kako bi se uklonile nečistoće, a zatim je stavljen u kolonu anjonske izmenjivačke smole (POROS® HQ 50 µm, Thermo Fisher Scientifc). Kolona je isprana sa 50 mM rastvora Tris pufera (pH 8.0), a zatim je primenjen 50 mM rastvor Tris pufera (pH 8.0) duž gradijenta koncentracije kako bi se eluirao RGE(Amgen) fuzioni protein. RGE (Amgen) fuzioni protein dobijen smolom za izmenu anjona je izmešan sa amonijum sulfatom do koncentracije od 1 M, a zatim prečišćen korišćenjem kolone za hromatografiju sa hidrofobnom interakcijom (Phenil sepharose FF, GE Healthcare). Konkretno, kolona je isprana sa 50 mM rastvora Tris pufera (pH 8.0) koji sadrži 1 M amonijum sulfat, 50 mM rastvora Tris pufera (pH 8.0) je primenjeno duž gradijenta koncentracije, a eluirane frakcije su analizirane kroz 10 % Tris-glicin gel za elektroforezu. Gel je obojen coomassie brilliant blue R uz blago mućkanje, a frakcije koje sadrže FGF21 mutantni fuzioni protein visoke čistoće su sakupljene i zatim dijalizovane preko noći na 4°C korišćenjem finalnog rastvora pufera (1X PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4). Po završetku dijalize, dobijeni osnovni rastvor proteina je koncentrovan na 3000 rpm korišćenjem 30,000 MW filtera za centrifugiranje na 4°C. Koncentracija FGF21 mutantnog fuzionog proteina je izmerena putem BCA kvantitativne analize.

Eksperimentalni Primer 1. In vitro aktivnosti fuzionih proteina

Eksperimentalni Primer 1-1. Uticaj FGF21 mutacija na aktivnost proteina

[0079] Merene su in vitro aktivnosti fuzionih proteina DFD4, DFD5, DFD6, DFD6 (E. coli), DFD7, DFD9, DFD13, DFD18, DFD72, DFD73 i DFD74 pripremljenih u Primeru Pripreme 1.

[0080] Konkretno, in vitro aktivnosti FGF21 fuzionih proteina su procenjene korišćenjem ćelijske linije HEK293 (Yuhan Corporation, Koreja) koja je modifikovana da prekomerno ekspresije humani β-kloto, koreceptor FGF21. Za procenu aktivnosti, koncentrati koji sadrže fuzione proteine pripremljene u Primerima Pripreme 1-4 i 1-5 su podvrgnuti trostrukom serijskom razblaženju u koncentraciji od 3 µM. Nakon što su kultivisani u stanju nedostatka seruma tokom 5 sati, ćelijska linija prekomerno ekspresovanog humanog β-kloto je tretirana sa razblaženim fuzionim proteinima tokom 20 minuta, a zatim je lizirana dodavanjem pufera za citolizu (Cisbio/Cat# 64ERKPEG) uz mešanje na 60 rpm tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Rastvor ćelijskog lizata je izmešan sa antitelima (Cisbio/Cat# 64ERKPEG), koja mogu da detektuju kinazu regulisanu ekstracelularnim signalom (ERK) i fosforilisani ERK, i smeša je održavana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Fluorescencija je detektovana pomoću fluorometrijskog detektora (TECAN/GENiosPro). Aktivnosti fuzionih proteina su izmerene poređenjem njihovih EC50vrednosti.

[0081] Kao što je prikazano na FIG.1A do 1C, potvrđeno je da in vitro aktivnosti fuzionih proteina pripremljenih sa uvođenjem mutacionih sekvenci u divlji tip FGF21 proteina nisu bile inhibirane, a aktivnosti svakog fuzionog proteina su bile slične jedna drugoj. Takođe je potvrđeno da je kroz uzorak DFD6 (E. coli) eksprimiran u E. coli i uzorak DFD6 eksprimiran u životinjskim ćelijama, in vitro aktivnosti fuzionih proteina pripremljenih uvođenjem mutacije N-glikozilacije u divlji tip FGF21 proteina nisu inhibirane.

Eksperimentalni Primer 1-2. Uticaj sekvence linkera na aktivnost proteina

[0082] Merene su in vitro aktivnosti fuzionih proteina DFD1, DFD3, DFD4 i DFD13 pripremljenih u Primeru Pripreme 1.

[0083] Konkretno, merene su aktivnosti FGF21 fuzionih proteina korišćenjem koncentrata koji sadrže fuzione proteine pripremljene u Primeru Pripreme 1-5 u skladu sa postupcima opisanim u Eksperimentalnom Primeru 1-1. Rezultati su prikazani na FIG.2A i 2B.

[0084] Potvrđeno je da nijedan FGF21 mutantni fuzioni protein nije pokazao značajno smanjenje aktivnosti, iako je prikazana mala razlika u aktivnosti u zavisnosti od sekvence linkera, kao što je prikazano na FIG.2A i 2B.

[0085] Eksperimentalni Primer 1-3. Eksperimentalni rezultati za DFD1, RGE (Amgen) i Fc-FGF21 (Lilly)

[0086] Merene su in vitro aktivnosti fuzionog proteina DFD 1 pripremljenog u Primeru Pripreme 1 i kontrolnih proteina RGE (Amgen) i Fc-FGF21 (Lilly).

[0087] Konkretno, merene su aktivnosti FGF21 fuzionih proteina korišćenjem koncentrata koji sadrže fuzione proteine pripremljene u Primeru Pripreme 1-5 i kontrolne proteine u skladu sa postupcima opisanim u Eksperimentalnom Primeru 1-1. Rezultati su prikazani na FIG.3.

[0088] Potvrđeno je da DFD1 i RGE (Amgen) imaju sličnu in vitro aktivnost, dok je Fc-FGF21 (Lilly) imao in vitro aktivnost dva puta veću od onih drugih proteina, kao što je prikazano na FIG.3.

Eksperimentalni Primer 2. Procena stabilnosti fuzionih proteina

Eksperimentalni Primer 2-1. Eksperimentalni postupak za procenu stabilnosti

[0089] Da bi se izmerila količina proteinskih agregata u početnoj fazi pripreme uzorka, agregati visoke molekulske težine (% HMW) su kvantifikovani korišćenjem postupka ekskluzione hromatografije (hromatografije na hromatografskim sitima) (SEC-HPLC).

Rezultati su prikazani na FIG.4.

[0090] Konkretno, kolona TosoHaas modela TSK-GEL G3000SVXLje korišćena za SEC-HPLC postupak. Kolona je ekvilibrisana sipanjem puferskog rastvora (1X PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4) brzinom protoka od 1 mL/min. Osnovni rastvori proteina DFD4 i DFD13 pripremljeni u Primerima Pripreme 1-5 su koncentrovani do ciljne koncentracije od 20 mg/mL ili više na 3000 rpm korišćenjem 30,000 MW isečenog filtera za centrifugiranje na 4°C. Nakon merenja koncentracije svakog uzorka pomoću BCA kvantitativne analize, uzorci su razblaženi sa pufernim rastvorom (1X PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4) do konačne koncentracije od 20 mg/mL. U cilju kako bi se izmerio početni % HMW DFD4 i DFD13, 20 mg/mL uzoraka je razblaženo sa pufernim rastvorom (1X PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4) do konačne koncentracije od 1 mg/mL, a svaki uzorak u zapremini od 100 µl je analizirano sa SEC-HPLC kolonom.

[0091] Za procenu stabilnosti svakog uzorka, % HMW uzoraka je izmeren korišćenjem SEC-HPLC postupka na 4., 8. i 14. dana dok su se čuvali na 5°C, 25°C i 37°C dve nedelje.

[0092] Kao što je prikazano na FIG.4, potvrđeno je da je DFD13 imao manju količinu agregata visoke molekularne težine (HMW %) u početnoj fazi i do tačke od 2 nedelje u poređenju sa DFD4, što ukazuje da uvođenje EIRP mutacije poboljšava stabilnost FGF21 mutantnog fuzionog proteina, čime se smanjuje % HMW značajno.

Eksperimentalni Primer 2-2. Rezultati stabilnosti

[0093] U cilju istraživanja efekata EIRP mutacije uvedene u originalnu sekvencu LLLE (98-101) FGF21 na stabilnost, stabilnost DFD4 (SEQ ID NO: 29) i DFD13 (SEQ ID NO: 35) je izmerena u skladu sa postupcima opisanim u Eksperimentalnom Primeru 2-1. Rezultati analize za uzorak od nula sata (početna faza; Dan 0) i 4-, 8- i 14-dana uskladištenih uzoraka DFD4 i DFD13 su sumirani u Tabeli 4 u nastavku (u Tabeli 4, N.D. znači "nije otkriveno").

Tabela 4

Stabilnost DFD4 i DFD13 na 2 nedelje pri koncentraciji od 20 mg/mL (% HMW)

[0094] Kao što je prikazano u Tabeli 4, količina % HMW u početnoj fazi (Dan 0) je bila 0.91% za DFD4 i 0.56% za DFD13. Posle 2 nedelje, količina % HMW se povećala na 8.83% za DFD4, ali nije primećena u DFD13, pod uslovima skladištenja na 25°C. Pokazalo se da DFD13 ima nižu % HMW stopu u početnoj fazi i 2 nedelje, u poređenju sa DFD4, što ukazuje da se % HMV stopa FGF21 mutantnog fuzionog proteina značajno smanjila zbog uvođenja EIRP mutacije.

Eksperimentalni Primer 3. Farmakokinetička procena fuzionih proteina

Eksperimentalni Primer 3-1. Eksperimentalni postupak za farmakokinetičku procenu

[0095] Šestonedeljni muški ICR miševi kupljeni od Orient BIO (Koreja) podeljeni su u grupe (n = 3/vreme uzorkovanja krvi) da bi imali slične srednje vrednosti telesne težine jedan dan pre lečenja lekom, i supkutano primenjeni jednom sa odgovarajućim uzorkom od 1 mg/kg (2 mg/kg za RGE). Uzorci krvi su zatim prikupljeni na 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72 i 96 sati nakon injekcije, respektivno. Koncentracija intaktnog FGF21 proteina pune dužine u krvi je merena korišćenjem Intact human FGF21 ELISA Kit (F1231-K01, EagleBiosciences, SAD), koji ima imunoreaktivnost na N-terminus i C-terminus FGF21 proteina. Izmerene su koncentracije uzoraka u krvi sakupljenih do 96 sati nakon subkutane injekcije svakog fuzionog proteina u miševe i izračunati su farmakokinetički parametri svakog uzorka.

Eksperimentalni Primer 3-2. Procena farmakokinetičke aktivnosti

[0096] Na osnovu grafikona koji pokazuje koncentracije svakog proteina u krvi u zavisnosti od vremena nakon subkutane primene fuzionih proteina kod miševa (FIG.5), izračunati su farmakokinetički parametri. Podaci su prikazani u Tabeli 5 u nastavku.

Tabela 5

[0097] Farmakokinetički profil svakog fuzionog proteina je upoređen i procenjen na osnovu vrednosti površine ispod krive (AUC) koja ukazuje na stepen izloženosti leku.

[0098] Kao što je prikazano u Tabeli 5, poređenjem DFD4 sa DFD13 i DFD6 sa DFD73, utvrđeno je da je uvođenje EIRP sekvence dovelo do povećanja vrednosti AUC od približno 10 do 20 %. Upoređujući DFD9 sa DFD4, uvođenje TGLEAV je dovelo do približno 6-strukog povećanja vrednosti AUC.

[0099] Štaviše, mutacije TGLEAN, G170N i G174N su dizajnirane da produže poluživot uvođenjem N-glikozilacije u C-terminus FGF21, za koji je poznato da je proteolizovan in vivo. Povećanje AUC usled uvođenja N-glikozilacije je potvrđeno poređenjem mutanata sa svakim kontrolnim materijalom. Da bi se potvrdio efekat poboljšanja AUC usled uvođenja N-glikozilacije, vrednost AUC za DFD6 (E. coli) koji proizvodi E. coli koja nema glikozilaciju upoređena je sa onom u DFD6 koju proizvodi humanoj ćelijskoj liniji. DFD6 proizveden u humanoj ćelijskoj liniji pokazao je trostruko ili veće povećanje vrednosti AUC u poređenju sa DFD6 (E. coli) koji proizvodi E. coli, što je pokazalo poboljšanje farmakokinetičkog profila usled glikozilacije.

[0100] A180E je mutacija otkrivena u WO 2009/149171 u vlasništvu Amgen Inc. Kada je mutacija A180E dalje uvedena u mutantni DFD 13 ili DFD73 uključujući mutaciju TGLEAV ili G170N, respektivno, rezultirajući mutant DFD1, odnosno DFD7 pokazuje približno 2- do 3 puta dodatno povećanje vrednosti AUC.

[0101] Ukratko, potvrđeno je da su farmakokinetički parametri poboljšani uvođenjem različitih mutacija i njihovih kombinacija, u poređenju sa DFD9, divljim tipom FGF21 fuzionog proteina. Fuzioni protein koji pokazuje najpoboljšanu vrednost AUC je DFD74 koji sadrži mutacije EIRP, G170N i A180E, koji je pokazao približno 45 puta poboljšanje vrednosti AUC u poređenju sa DFD9. Štaviše, uzimajući u obzir RGE (Amgen) u dozi od 2 mg/kg telesne težine, DFD74 može imati veći stepen izloženosti leku u poređenju sa RGE. Ukupni efekti poboljšanja farmakokinetike usled mutacija su sumirani u Tabeli 6 u nastavku.

Tabela 6

Eksperimentalni Primer 4. Procena aktivnosti fuzionih proteina kod oblob miševa

Eksperimentalni Primer 4-1. Eksperimentalni metod za procenu aktivnosti kod oblob miševa

[0102] Oblob miševi, okarakterisani kao oni koji ispoljavaju hiperglikemiju, insulinsku rezistenciju, hiperfagiju, masnu jetru i gojaznost zbog genetskog nedostatka leptina, široko se koriste za proučavanje dijabetesa tipa 2. Mužjaci oblob miševa (Harlan, SAD) kupljeni su od Raonbio (Koreja). Ovi miševi su bili stari 5 do 6 nedelja u vreme dolaska, i 8 do 9 nedelja u vreme lečenja lekom nakon 3 nedelje adaptacije. Miševi su podeljeni u grupe (n=8/grupi) da bi imali slične srednje vrednosti za telesnu težinu i nivo glukoze u kaudalnoj krvi jedan dan pre lečenja lekom (Dan 0), a uzorci su jednom subkutano davani u skladu sa svakom od njihovih odgovarajućih doza. Dulbecco-ov fiziološki rastvor puferisan sa fosfatom (DPBS, Gibco, SAD) je primenjen kao nosač lečenja, a koncentracija glukoze u krvi je merena pomoću merača glukoze, GlucoDr (All Medicus, Koreja). Nivoi glukoze natašte i telesne težine mereni su svakog dana do 14. dana nakon primene. Nivo glikiranog hemoglobina je takođe meren u svakoj grupi pre primene i posle testa. Nivoi glikovanog hemoglobina su izračunati korišćenjem DCA 2000 HbAlc kompleta (Siemens, 5035C).

Eksperimentalni Primer 4-2. Procena aktivnosti kod oblob miševa

[0103] Promene nivoa glukoze u krvi natašte i telesne težine kod muških oblob miševa primećene su nakon pojedinačne supkutane injekcije od 30 ili 100 nmol/kg DFD18 i DFD72, ili 10, 30 ili 100 nmol/kg DFD74.

[0104] Potvrđeno je da su DFD18, DFD72 i DFD74 svi imali efekat snižavanja nivoa glukoze u krvi na način koji zavisi od doze. Upoređujući tri agensa u visokoj dozi od 100 nmol/kg, DFD72 i DFD74 su pokazali bolji efekat na snižavanje nivoa glukoze u krvi od DFD18 (FIG.

6). Pored toga, Fc-FGF21 (Lilly) koji je korišćen kao kontrolni materijal u testu, bio je manje efikasan u snižavanju nivoa glukoze u krvi u poređenju sa DFD18, DFD72 i DFD74 pri istom nivou doze (30 nmol/kg).

[0105] Što se tiče efekta na smanjenje telesne težine, upoređujući tri agensa u visokoj dozi od 100 nmol/kg, DFD72 je bio najefikasniji kod oblob miševa što je rezultiralo smanjenjem telesne težine od približno 6 %, a DFD18 je bio sledeći najefikasniji, praćen DFD74 (FIG.7).

[0106] Nakon završetka testa, izmereni su nivoi glikiranog hemoglobina koji su indikativni za srednje vrednosti glukoze u krvi i analizirane su promene srednjeg nivoa glukoze u krvi u svakoj test grupi. Sve tretirane grupe osim kontrolne grupe tretirane kontrolnim proteinom Fc-FGF21 (Lilly) pokazale su negativne vrednosti u odnosu na razliku između testa i proteina pre primene u poređenju sa kontrolnim materijalom u snižavanju glukoze u krvi (FIG.8).

Eksperimentalni Primer 5. Procena aktivnosti fuzionih proteina kod HFD/STZ miševa

Eksperimentalni Primer 5-1. Eksperimentalna metoda za procenu aktivnosti kod HFD/STZ miševa

[0107] Efekti FGF21 mutantnih fuzionih proteina na snižavanje glukoze u krvi i telesne težine su upoređeni i procenjeni u drugom dijabetičkom modelu, HFD/STZ modelu miša. Konvencionalni modeli miševa sa gojaznošću izazvani ishranom (indukovani hranjenjem miševa C57BL/6 ishranom sa visokim sadržajem masti od 60 kcal u trajanju od osam nedelja ili duže) imaju slabe hiperglikemijske i dijabetičke karakteristike, iako izazivaju insulinsku rezistenciju. HFD/STZ miševi, koji mogu da kompenzuju defekte na konvencionalnim modelima gojaznosti izazvane ishranom, sposobni su da proizvode disfunkcionalne β ćelije u pankreasu i smanjeno lučenje insulina kao rezultat ishrane sa visokim sadržajem masti (HFD) i primene niskog nivoa streptozotocina (STZ), i stoga su korisni za farmakološke studije dijabetesa tipa 2.

[0108] Konkretno, u cilju da se indukuje HFD/STZ model miša, C57BL/6 miševi (Japan SLC) su hranjeni na ishrani sa visokim sadržajem masti od 60 kcal tokom četiri nedelje, a zatim je davano 50 mg/kg STZ (Sigma, 85882) intraperitonealno svaki dan tokom 3 dana da izazove disfunkciju u β ćelijama pankreasa. Nakon hranjenja na ishrani sa visokim sadržajem masti tokom dodatne 2 nedelje, za test su korišćeni miševi sa nivoom glukoze u krvi koji nije natašte od 200 mg/dL ili više. Miševi su podeljeni u grupe (n=6/grupi) da bi imali slične srednje vrednosti telesne težine i kaudalnog nivoa glukoze u krvi jedan dan pre lečenja lekom (Dan 0), a uzorci su davani jednom subkutano prema svakoj od njihovih odgovarajućih doza. Dulbecco-ov fiziološki rastvor puferisan sa fosfatom (DPBS, Gibco, SAD) je primenjen kao sredstvo za lečenje, a koncentracija glukoze u krvi je merena pomoću merača glukoze, GlucoDr (All Medicus, Koreja). Nivoi glukoze natašte i telesna težina mereni su svakog dana do 14. dana nakon primene. Nivoi glikovanog hemoglobina su takođe mereni u svakoj grupi pre primene i posle testa. Nivoi glikovanog hemoglobina su izračunati korišćenjem DCA 2000 HbA1c kompleta (Siemens, 5035C).

Eksperimentalni Primer 5-2. Procena aktivnosti kod HFD/STZ miševa

[0109] Promene nivoa glukoze u krvi natašte i telesne težine tokom vremena kod mužjaka HFD/STZ miševa primećene su nakon jedne potkožne injekcije od 10 nmol/kg DFD72 ili DFD74.

[0110] Što se tiče promena u nivoima glukoze u krvi natešte, potvrđeno je da DFD72 i DFD74 imaju slične efekte na snižavanje nivoa glukoze u krvi, a efekat snižavanja glukoze u krvi je održan do 10. dana nakon primene, a zatim se izgubio sa metabolizmom lekova posle 10. dana (FIG.9). DFD72 je pokazao duži efekat od DFD74 u smislu promena nivoa glukoze u krvi nakon 10. dana nakon primene.

[0111] U pogledu efekta na smanjenje telesne težine usled primene FGF21 mutantnih proteina, potvrđeno je da i DFD72 i DFD74 imaju slične efekte na smanjenje telesne težine za približno 5 %, a efekat je nestao nakon 10. dana nakon primene (FIG.10).

[0112] Nakon završetka testa, mereni su nivoi glikovanog hemoglobina koji ukazuju na srednju vrednost glukoze u krvi i analizirane su promene srednjeg nivoa glukoze u krvi u svakoj test grupi. Dok je grupa sa nosačem imala povećanje nivoa glikovanog hemoglobina od 0.25, grupa tretirana sa DFD74 imala je povećanje od 0.1, a grupa tretirana sa DFD72 je imala smanjenje od 0.27 (FIG.11).

Eksperimentalni Primer 6. Aktivnost fuzionih proteina kod gojaznih miševa izazvanih ishranom

Eksperimentalni Primer 6-1. Eksperimentalni postupak za procenu aktivnosti kod gojaznih miševa izazvanih ishranom

[0113] Efekat smanjenja telesne težine DFD18, FGF21 mutantnog fuzionog proteina, procenjen je kod gojaznih miševa izazvanih ishranom. Za model gojaznosti izazvan ishranom, miševi C57BL/6J su kupljeni od Central Lab.Animal Inc. i hranjeni su ishranom sa visokim sadržajem masti koja sadrži 60 kcal % masti (istraživačka dijeta) tokom 8 do 12 nedelja. Miševi su podeljeni u grupe (n=8/grupa) da bi imali sličnu telesnu težinu jedan dan pre lečenja lekom (Dan 0), i potom 30 nmol/kg uzoraka su davani supkutano jednom.

Promene telesne težine su upoređene sa grupom tretiranom sa nosačem (PBS).

Eksperimentalni Primer 6-2. Aktivnost proteina kod gojaznih miševa izazvanih ishranom

[0114] Za promene u telesnoj težini tokom vremena u modelu gojaznih miševa izazvanih ishranom posle jednokratne primene od 30 nmol/kg DFD18, potvrđeno je da se efekat smanjenja telesne težine nastavlja do 10. dana nakon primene, a maksimalno smanjenje težine (oko 18 %) je održano do 11. dana nakon primene, koja je održavana do 14. dana (FIG.12).

Primer Pripreme 2. Priprema i prečišćavanje proteina sa dvostrukom funkcijom

Primer Pripreme 2-1. Priprema ekspresionog vektora za ekspresiju proteina sa dvostrukom funkcijom

[0115] U cilju da se identifikuju efekti sekvence GLP-1 mutantnog proteina i sekvence Fc zgloba spojenog sa njim na in vitro aktivnost, farmakokinetički profili i farmakološka efikasnost, raznih sekvenci za Fc spojene GLP-1 mutantne proteine su određeni. Sekvence GLP-1 mutantnih proteina su navedene u Tabeli 7 u nastavku, a sekvence Fc spojenih GLP-1 mutanata su navedene u Tabeli 8.

Tabela 7

Tabela 8

[0116] U Tabeli 8, HyFc5 se odnosi na SEQ ID NO: 47, a HyFc40 se odnosi na SEQ ID NO: 48.

[0117] u cilju da se istraže efekti sekvenci GLP-1 mutantnih proteina i FGF21 mutantnih proteina, sekvenca Fc šarke spojene za GLP-1 mutante, sekvenca linkera povezana između FGF21 mutantnih proteina i Fc na in vitro aktivnost, farmakokinetičke profile i farmakološku efikasnost, dizajnirane su različite sekvence za proteine sa dvostrukom funkcijom. Sekvence proteina sa dvostrukom funkcijom koje uključuju GEP-1 mutantne proteine i FGF21 mutantne proteine navedene su u Tabeli 9 u nastavku. Svaki protein sa dvostrukom funkcijom sadrži GLP-1 mutantni protein, Fc region imunoglobulina, linker i FGF21 mutantni protein povezan ovim redosledom od N-terminusa do C-terminusa.

Tabela 9

[0118] Preciznije, nukleotidne sekvence koje kodiraju svaki od proteina sa dvostrukom funkcijom su sintetizovane nakon konsultacija sa Bioneer Corporation (Koreja) na osnovu aminokiselinske sekvence svakog proteina. Sekvence restrikcionih enzima NheI i NotI su dodate na 5’ terminus i 3’ terminus nukleotidnih sekvenci koje kodiraju svaki od proteina sa dvostrukom funkcijom, a inicijacioni kodon za translaciju proteina i vodeća sekvenca (MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPSHA) koja omogućava izlučivanje eksprimiranog proteina na spoljašnju stranu ćelije su ubačeni pored sekvence restrikcionog enzima na 5’ terminusu. Terminacioni kodon je ubačen pored nukleotidne sekvence, koja kodira svaki od proteina sa dvostrukom funkcijom. Nukleotidna sekvenca koja kodira svaki od proteina sa dvostrukom funkcijom je klonirana u pTransempti ekspresioni vektor korišćenjem dva restrikciona enzima NheI i NotI. Ekspresioni vektor pTrans-empti, koji ima jednostavnu strukturu uključujući CMV promoter, pUC-izvedeno poreklo replikacije, SV40-izvedeno poreklo replikacije i gen otpornosti na ampicilin, kupljen je od CEVEC Pharmaceuticals (Nemačka).

Primer Pripreme 2-2. Konstrukcija plazmidne DNK za ekspresiju Fc-spojenih GLP-1 mutantnih proteina i proteina sa dvostrukom funkcijom

[0119] E. coli je transformisana sa svakim od ekspresionih vektora konstruisanih u Primeru Pripreme 2-1 kako bi se dobila velika količina plazmidne DNK koja će se koristiti za ekspresiju ćelija E. coli, sa ćelijskim zidovima oslabljenim toplotnim šokom, transformisane su sa svakim ekspresionim vektorom, a transformanti su postavljeni na LB ploču kako bi se dobile kolonije. Tako dobijene kolonije su inokulisane u LB medijum, kultivisane na 37°C tokom 16 sati, i svaka kultura E. coli koja sadrži svaki ekspresioni vektor je dobijena u zapremini od 100 mL. Nakon toga dobijena E. coli je centrifugirana kako bi se uklonila podloga za kulturu, a zatim su dodati rastvori P1, P2, P3 (QIAGEN, Kat. br.: 12963) kako bi se razbili ćelijski zidovi, čime je dobijena suspenzija DNK u kojoj su proteini i DNK razdvojeni. DNK plazmida je prečišćena iz tako dobijene DNK suspenzije korišćenjem Qiagen DNK kolone za prečišćavanje. Eluirana plazmidna DNK je identifikovana elektroforezom u agaroznom gelu, a koncentracije i čistoće su merene korišćenjem nanodrop uređaja (Thermo Scientifc, Nanodrop Lite). Tako dobijena DNK je korišćena za ekspresiju.

Primer Pripreme 2-3. Ekspresija Fc spojenih GLP-1 mutanata i proteina sa dvostrukom funkcijom u CAP-T ćelijama

[0120] Ljudske ćelijske linije su transformisane sa svakom plazmidnom DNK dobijenom u Primeru Pripreme 2-2. Svaki tip plazmidne DNK je transdukovan u CAP-T ćelije (CEVEC), koje su kultivisane u PEM medijumu (Life Technologies), korišćenjem PEI rastvora (Polyplus, Kat. br.: 101-10N). Izmešani DNK rastvor i PEI rastvor je pomešan sa ćelijskom suspenzijom korišćenjem ekspresionog medijuma Freestyle293 (Invitrogen), kultivisan na 37°C tokom 5 sati, a PEM medijum je dodat. Posle kultivisanja na 37°C tokom 5-7 dana, kultura je centrifugirana kako bi se uklonile ćelije i dobijen je supernatant koji sadrži svaki protein.

Primer Pripreme 2-4. Prečišćavanje Fc spojenih GLP-1 mutanata i proteina sa dvostrukom funkcijom

[0121] Kolona za afinitetnu hromatografiju proteina A (GE Healthcare) je uravnotežena sa 1X PBS puferskog rastvora (pH 7.4). Supernatant kulture koji uključuje svaki od Fc-spojenih GLP-1 mutanata i proteina sa dvostrukom funkcijom dobijenih u Primeru Pripreme 2-3 je filtriran sa 0.2 µm filterom, a zatim stavljen u kolonu za afinitetnu hromatografiju proteina A. Kolona je isprana sa 1X rastvorom PBS pufera (pH 7.4), a zatim su proteini eluirani korišćenjem 100 mM rastvora glicinskog pufera (pH 3.0). Proteini dobijeni afinitetnom hromatografijom su prečišćeni korišćenjem kolone sa anjon izmenjivačkom smolom (POROS® HQ 50 µm, Thermo Fisher Scientifc). Kolona anjon izmenjivačke smole je ekvilibrisana sa 50 mM rastvorom Tris pufera (pH 8.0), pre nego što su proteini eluirani afinitetnom hromatografijom napunjeni.

[0122] Posle ispiranja kolone sa 50 mM rastvora Tris pufera (pH 8.0), 50 mM rastvora Tris pufera (pH 8.0) je raspoređeno duž gradijenta koncentracije i eluirane frakcije su analizirane. Svaka eluirana frakcija je analizirana korišćenjem hromatografije za isključivanje po veličini (SEC-HPLC), a frakcije koje uključuju Fc-spojene GLP-1 mutante i proteine sa dvostrukom funkcijom sa visokom čistoćom su sakupljene i dijalizovane preko noći na 4°C korišćenjem finalnog rastvora pufera (1X PBS, 1 mM DTA, pH 7). Po završetku dijalize, dobijeni osnovni rastvor proteina je koncentrovan na 3,000 rpm korišćenjem 30,000 MW isečenog filtera za centrifugiranje na 4°C. Koncentracija svakog proteina je merena putem BCA kvantitativne analize.

Eksperimentalni Primer 7. In vitro aktivnost proteina sa dvostrukom funkcijom

Eksperimentalni Primer 7-1. Aktivnost DFD23, DFD24, DFD25, DFD26, DFD27, DFD28 i DFD29

[0123] In vitro GLP-1 aktivnosti proteina sa dvostrukom funkcijom DFD23, DFD24, DFD25, DFD26, DFD27, DFD28 i DFD29 su izmerene. Konkretno, kupljena je ćelijska linija CHO (Eurofns, HTS163C2), koja prekomerno ekspresuje humanog GLP-1 receptor i korišćena za procenu GLP-1 aktivnosti proteina sa dvostrukom funkcijom. Za procenu aktivnosti, uzorci koji sadrže fuzione proteine (proteinski osnovni rastvori pripremljeni u Primeru Pripreme 2-4; u daljem tekstu "uzorak") su podvrgnuti 4-strukom serijskom razblaživanju u koncentraciji od 25 nM. Nakon što je ćelijska linija humanog GLP-1 receptora koja eksprimira CHO tretirana 30 minuta, izmeren je proizvedeni intracelularni cAMP (Cisbio, 62AM4PEB). Aktivnost svakog proteina je procenjena poređenjem vrednosti EC50.

[0124] Kao što je prikazano na FIG.13, protein sa dvostrukom funkcijom koji sadrži sekvencu GLP-1 (A2G) pokazao je aktivnost približno 2-3 puta nižu od one za proteine sa dvostrukom funkcijom koji sadrže druge GLP-1 mutantne sekvence. Nije primećena značajna razlika u aktivnostima GLP-1 između proteina sa dvostrukom funkcijom koji sadrže mutacione sekvence osim GLP-1 (A2G) sekvence.

Eksperimentalni Primer 7-2. Aktivnosti DFD59, DFD69, DFD112 i DFD114

[0125] Merene su in vitro GLP-1 aktivnosti proteina sa dvostrukom funkcijom DFD69, DFD112 i DFD114 pripremljenih u Primeru Pripreme 2 i DFD59 (Fc-spojeni GLP-1 mutant). Konkretno, kupljena je ćelijska linija CHO (Eurofns, HTS163C2) koja prekomerno eksprimira humani GLP-1 receptor i korišćena za procenu GLP-1 aktivnosti proteina sa dvostrukom funkcijom. Za procenu aktivnosti, uzorak koji sadrži svaki od fuzionih proteina je podvrgnut 4-strukom serijskom razblaživanju u koncentraciji od 25 nM. Nakon što je CHO ćelijska linija sa prekomernom ekspresijom GLP-1 receptora tretirana 30 minuta, izmerena je proizvedena intracelularna cAMP (Cisbio, 62AM4PEB).

[0126] Kao što je prikazano na FIG.14, aktivnost svakog proteina je procenjena poređenjem vrednosti EC50. Tri proteina sa dvostrukom funkcijom pokazala su slične vrednosti EC50, a DFD59 (koji ne sadrži FGF21 mutant) pokazao je aktivnost približno 2 puta veću od onih proteina sa dvostrukom funkcijom.

[0127] Zatim su merene in vitro aktivnosti FGF21 dela u DFD69, DFD112 i DFD114.

Konkretno, in vitro aktivnosti FGF21 dela u proteinima sa dvostrukom funkcijom su procenjene korišćenjem HEK293 ćelijske linije koja prekomerno ekspresuje humani β-kloto (ko-receptor FGF21). Za procenu aktivnosti, uzorci koji sadrže svaki od proteina sa dvostrukom funkcijom podvrgnuti su trostrukom serijskom razblaživanju u koncentraciji od 3 µM. Nakon što su kultivisani u stanju nedostatka seruma tokom 5 sati, HEK293 ćelijska linija sa prekomernom ekspresijom humane β-kloto je tretirana 20 minuta, pre nego što su ćelije uzete dodavanjem pufera za citolizu (Cisbio/Cat# 64ERKPEG) uz mešanje na 60 rpm tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Rastvor ćelijskog lizata je izmešan sa antitelima koja mogu detektovati ERK i fosforilisani ERK, a smeša je održavana na sobnoj temperaturi 2 sata. Fluorescencija je detektovana pomoću fuorometrijskog detektora (TECAN/GENiosPro). Aktivnosti su merene upoređivanjem njihovih EC50vrednosti.

[0128] Potvrđeno je da su in vitro aktivnosti FGF21 dela proteina sa dvostrukom funkcijom DFD69, DFD112 i DFD114 slične, kao što je prikazano na FIG.14.

Eksperimentalni Primer 8. Farmakokinetička procena proteina sa dvostrukom funkcijom

Eksperimentalni Primer 8-1. Eksperimentalna metoda za farmakokinetičku procenu

[0129] Šestonedeljni muški ICR miševi kupljeni od Orient BIO (Koreja) podeljeni su u grupe (n = 3/vreme uzimanja uzorka krvi) kako bi imali sličnu srednju vrednost telesne težine jedan dan pre lečenja lekom, i supkutano primenjeni jednom sa odgovarajućim uzorkom u zapremini od 1 mg/kg. Uzeti su uzorci krvi 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 144, 192 i 240 sati nakon injekcije, respektivno. Koncentracija svakog proteina sa dvostrukom funkcijom u krvi merena je na osnovu FGF21 dela i GLP-1-Fc dela odvojeno. Koncentracija intaktnog dela FGF21 pune dužine proteina sa dvostrukom funkcijom u krvi merena je korišćenjem Intact humanog FGF21 ELISA kompleta (F1231-K01, Eagle Biosciences, SAD), koji ima imunoreaktivnost na N-terminus i C-terminus FGF21 proteina. Dalje, koncentracija aktivnog GLP-1-Fc dela proteina sa dvostrukom funkcijom u krvi je merena korišćenjem antitela, koje ima imunoreaktivnost na N-terminus GLP-1 i Fc, kao što je utvrđeno ELISA analizom. Izmerene su koncentracije FGF21 i GLP-1-Fc delova svakog proteina u uzorcima krvi prikupljenim do 240 sati nakon pojedinačne potkožne injekcije svakog proteina u miševe i izračunati su farmakokinetički parametri svakog proteina.

Eksperimentalni Primer 8-2. Rezultati farmakokinetičke aktivnosti

[0130] Na osnovu koncentracije svake aktivne supstance u krvi tokom vremena nakon pojedinačne potkožne primene svakog proteina kod miševa (FIG.15), izračunati su farmakokinetički parametri za FGF21 i GLP-1-Fc delove proteina sa dvostrukom funkcijom. Podaci su prikazani u Tabeli 10 u nastavku.

Tabela 10

[0131] Farmakokinetički profili svakog proteina sa dvostrukom funkcijom su upoređeni i procenjeni na osnovu vrednosti površine ispod krive (AUC), što ukazuje na stepen izloženosti leku.

[0132] Kao što je prikazano u Tabeli 10, za farmakokinetičke parametre FGF21 dela, DFD114 je pokazao najviši stepen izloženosti leku (AUC) i poluživot, a DFD112 je pokazao sledeću najveću vrednost AUC, praćen DFD69. DFD114 je pokazao približno 2 puta ili veći porast vrednosti AUC u poređenju sa DFD69. Što se tiče farmakokinetike GLP-1-Fc dela, četiri proteina (DFD59, DFD69, DFD112 i DFD114) koji sadrže istu GLP-1 mutantnu sekvencu pokazala su slične vrednosti AUC.

Eksperimentalni Primer 9. Procena aktivnosti kod db/db miševa

Eksperimentalni Primer 9-1. Postupak za procenu aktivnosti kod db/db miševa

[0133] db/db miševi, okarakterisani da imaju hiperglikemiju, insulinsku rezistenciju, hiperfagiju, masnu jetru i gojaznost zbog genetskog nedostatka receptora za leptin i koji pokazuju ozbiljniju hiperglikemiju i gojaznost od oblob miševa, široko se koriste za proučavanje dijabetesa tipa 2. Mužjaci db/db miševa (Harlan, SAD) kupljeni su od Raonbio (Koreja). Ovi miševi su bili stari 5 do 6 nedelja u vreme dolaska, i 8 do 9 nedelja u vreme lečenja lekom, nakon 3 nedelje adaptacije. Miševi su podeljeni u grupe (n=6/grupa) kako bi imali sličnu srednju vrednost telesne težine i kaudalnog nivoa glukoze u krvi jedan dan pre tretmana lekom (Dan 0), a uzorci su davani jednom subkutano prema svakoj od njihovih odgovarajućih doza. Dulbecco-ov fiziološki rastvor puferisan sa fosfatom (DPBS, Gibco, SAD) je primenjen kao nosač lečenja, a koncentracija glukoze u krvi je merena pomoću merača glukoze, GlucoDr (All Medicus, Koreja). Nivoi glukoze natašte i telesne težine mereni su svakog dana do 14. dana nakon primene. Nivo glikiranog hemoglobina je takođe meren u svakoj grupi pre primene i posle testa. Nivoi glikovanog hemoglobina su izračunati korišćenjem DCA 2000 HbAlc kompleta (Siemens, 5035C).

Eksperimentalni Primer 9-2. Procena aktivnosti kod db/db miševa

[0134] Promene nivoa glukoze u krvi bez gladovanja i telesne težine kod mužjaka db/db miševa su primećene nakon pojedinačne potkožne injekcije od 10 ili 30 nmol/kg proteina sa dvostrukom funkcijom DFD114, pojedinačne potkožne injekcije od 30 nmol/kg dugodelujućeg GLP-1-Fc DFD59 proteina sa pojedinačnom funkcijom, i kombinovane primene od 30 nmol/kg DFD59 i DFD74 (koji su GLP-1-Fc i Fc-FGF21 proteini sa pojedinačnom funkcijom, respektivno) kako bi se uporedio efekat DFD 114 proteina sa dvostrukom funkcijom sa kombinovanom primenom Fc-FGF21 i GLP-FGF21 proteina sa pojedinačnom funkcijom.

[0135] Dugodelujući GLP-1-Fc protein DFD59 je izazvao oštro smanjenje nivoa glukoze u krvi do 1. dana nakon primene, ali se smanjenje glukoze u krvi smanjilo posle 2. dana i nivo glukoze u krvi je bio sličan onom u grupi koja je tretirana nosačem posle 4. dana. U međuvremenu, grupa tretirana sa DFD 114 pokazala je odlične efekte na smanjenje glukoze u krvi do 3. dana nakon primene, a efekti na snižavanje nivoa glukoze u krvi brže su nestali posle 4. dana od primene u dozi od 10 nmol/kg nego kod 30 nmol/kg u krvi, što ukazuje na dozno zavisne razlike u trajanju efekta snižavanja glukoze u krvi. Grupe tretirane sa kombinovanom primenom svakog proteina pokazale su najtrajnije efekte na snižavanje nivoa glukoze u krvi u poređenju sa onima iz drugih grupa, što ukazuje da je kombinacija GLP-1 i FGF21 imala odličan efekat na kontrolu nivoa glukoze u krvi (FIG.16).

[0136] Što se tiče efekta na smanjenje telesne težine, grupe tretirane sa kombinacijom DFD59 i DFD74 pokazale su najveće efekte na smanjenje telesne težine, a grupa tretirana sa 30 nmol/kg DFD114 takođe je pokazala izvanredan efekat na smanjenje telesne težine (FIG.17).

[0137] Nakon završetka testova, mereni su nivoi glikovanog hemoglobina koji ukazuju na srednju vrednost glukoze u krvi i analizirane su promene srednjeg nivoa glukoze u krvi u svakoj test grupi. Kao što je prikazano na FIG.18, grupa tretirana nosačem je pokazala povećane nivoe glikovanog hemoglobina nakon završetka testova u poređenju sa grupom pre primene, a grupa tretirana sa DFD59 pokazala je sličan porast. Grupa tretirana sa 30 nmol/kg DFD114 pokazala je najveće smanjenje nivoa glikovanog hemoglobina, a grupa koja je primala kombinovanu primenu pokazala je sledeću najveću efikasnost, praćeno sa grupom tretiranom sa 10 nmol/kg DFD114. Prilikom procene proteina upoređivanjem na osnovu smanjenja nivoa glikovanog hemoglobina u svakoj tretiranoj grupi, potvrđeno je da je DFD 114 protein sa dvostrukom funkcijom pokazao jači efekat na snižavanje nivoa glukoze u krvi nego GLP-1-Fc ili Fc-FGF21 protein sa pojedinačnom funkcijom.

Eksperimentalni Primer 10. Aktivnost fuzionih proteina kod HFD/STZ miševa

Eksperimentalni Primer 10-1. Eksperimentalni postupak za procenu aktivnosti kod HFD/STZ miševa

[0138] Efekti proteina sa dvostrukom funkcijom na snižavanje glukoze u krvi i telesne težine su upoređeni i procenjeni u drugom dijabetičkom modelu, HFD/STZ modelu miša.

[0139] Konvencionalni model gojaznosti izazvan ishranom (indukovan hranjenjem miševa C57BL/6 ishranom sa visokim sadržajem masti od 60 kcal u trajanju od osam nedelja ili duže) ima slabe hiperglikemijske i dijabetičke karakteristike, iako izaziva insulinsku rezistenciju. HFD/STZ miševi, koji mogu da nadoknade nedostatke konvencionalnog modela gojaznosti izazvane ishranom izazvanih miševima, sposobni su da generišu disfunkcionalne β ćelije pankreasa i smanjeno lučenje insulina nakon dijete sa visokim sadržajem masti (HFD) i primene niskog nivoa streptozotocina (STZ2), i korišćeni su za farmakološke studije dijabetesa tipa 2. U cilju da se indukuje HFD/STZ model miša, C57BL/6 miševi su hranjeni na ishrani sa visokim sadržajem masti od 60 kcal tokom četiri nedelje, a zatim je 50 mg/kg STZ (Sigma, 85882) davano intraperitonealno svakog dana tokom 3 dana kako bi se izazvala disfunkcija β ćelija pankreasa. Nakon hranjenja na ishrani sa visokim sadržajem masti tokom dodatne 2 nedelje, miševi sa nivoom glukoze u krvi bez natašte od 200 mg/dL ili više su odabrani za testiranje. Miševi su podeljeni u grupe (n=6/grupa) u cilju da se ima slična srednja vrednost telesne težine i kaudalnog nivoa glukoze u krvi jedan dan pre lečenja lekom (Dan 0), a uzorci su davani jednom subkutano prema svakoj od njihovih odgovarajućih doza. Dulbecco-ov fiziološki rastvor puferisan sa fosfatom (DPBS, Gibco, SAD) je primenjen kao nosač za lečenje, a koncentracija glukoze u krvi je merena pomoću merača glukoze, GlucoDr (All Medicus, Koreja). Nivoi glukoze natašte i telesne težine mereni su svakog dana do 14. dana nakon primene. Nivo glikiranog hemoglobina je takođe meren u svakoj grupi pre primene i posle testa. Nivoi glikovanog hemoglobina su izračunati korišćenjem DCA 2000 HbAlc kompleta (Siemens, 5035C).

Eksperimentalni Primer 10-2. Aktivnost kod HFD/STZ miševa

[0140] Promene nivoa glukoze u krvi bez gladovanja i telesne težine tokom vremena kod mužjaka HFD/STZ miševa primećene su nakon jedne subkutane injekcije od 3 nmol/kg ili 10 nmol/kg DFD114 proteina sa dvostrukom funkcijom, 10 nmol/kg Fc spojenog GLP-1 mutanta DFD59, ili 10 nmol/kg svakog od Fc spojenih FGF21 mutanata DFD72 i DFD74. DFD59 i DFD74 su takođe subkutano ubrizgani jednom u količini od 10 nmol/kg svaki u cilju da se uporedi efekat kombinovane primene proteina sa pojedinačnom funkcijom sa proteinom sa dvostrukom funkcijom.

[0141] Kao što je prikazano na FIG.19, u vezi sa promenama nivoa glukoze u krvi do 4. dana, primena DFD72 i DFD74 (FGF21 proteini sa pojedinačnom funkcijom) je dovela do sporijeg smanjenja glukoze u krvi, dok je DFD114 (protein dugog dejstva koji uključuje GLP-1), DFD59 i kombinovana primena DFD59 i DFD74 pokazao brže smanjenje glukoze u krvi od 1. dana primene. Slično rezultatima kod db/db miševa, DFD59 je pokazao oštro smanjenje glukoze u krvi u ranoj fazi, ali je smanjenje glukoze u krvi polako nestalo nakon 4. dana. DFD114 je pokazao sličan obrazac pri niskoj dozi od 3 nmol/kg. U grupama koje su tretirane sa 10 nmol/kg DFD114, DFD72, DFD74 i kombinovanom primenom, primećeni su slični profili glukoze u krvi koji nisu bili natašte.

[0142] Što se tiče efekta na smanjenje telesne težine, grupa tretirana kombinovanom primenom DFD59 i DFD74 pokazala je najveći efekat na smanjenje telesne težine (7 do 8 %), a grupa tretirana sa 10 nmol/kg DFD114 takođe je pokazala izvanredan efekat na smanjenje telesne težine (približno 6 %) (FIG.20). Grupa tretirana sa DFD59 je pokazala smanjenje telesne težine za 5 % prvog dana nakon primene, ali je efekat nestao nakon 2. dana i postao sličan onom u grupi sa nosačem nakon 7. dana. Grupa tretirana sa svakim od dugog dejstva FGF21 proteina sa pojedinačanom funkcijom DFD72 i DFD74 pokazala je sporije smanjenje telesne težine za 4 do 5% do 7. dana nakon primene, a efekat je nestao nakon 10. dana.

[0143] Nakon završetka testova, mereni su nivoi glikovanog hemoglobina koji su indikativni za srednju vrednost glukoze u krvi i analizirane su promene srednjeg nivoa glukoze u krvi u svakoj test grupi (FIG.21). Grupa sa nosačem je imala povećanje nivoa glikovanog hemoglobina nakon završetka testa u poređenju sa tretiranom pre davanja, a grupa sa DF59 pokazuje slično povećanje. Nasuprot tome, grupa tretirana sa DFD 114 pokazala je smanjenje nivoa glikovanog hemoglobina na način zavisan od doze, a grupa tretirana sa 10 nmol/kg DFD114 imala je najveći efekat u smislu smanjenih nivoa glikovanog hemoglobina (-0.42 %). Grupa tretirana kombinovanom primenom DFD59 i DFD74 pokazala je smanjene nivoe glikovanog hemoglobina (-0.38 %) slične onima kod DFD114. Za dugog dejstva FGF21 proteina sa pojedinačnim dejstvom, primećeno je da je DFD72 superiorniji od DFD74. Upoređujući proteine zasnovane na smanjenim nivoima glikovanog hemoglobina u svakoj grupi, potvrđeno je da je DFD 114 protein sa dvostrukom funkcijom superioran na oba i GLP-1-Fc i Fc-FGF21 proteine pojedinačnog dejstva.

Eksperimentalni Primer 11. Predviđanje i procena imunogenosti

Eksperimentalni Primer 11-1. Postupak predviđanja imunogenosti i rezultata

[0144] Da bi se predvidela potencijalna imunogenost proteina sa dvostrukom funkcijom, za svaki protein je izvršena in silico analiza imunogenosti.

[0145] Konkretno, potencijalna imunogenost proteina sa dvostrukom funkcijom brzo je ispitana korišćenjem iTope™ i TCED™ metoda (Predviđanje imunogenosti terapeutskih proteina: validnost računarskih alata, BioDrugs, 2010). Prema dve metode, epitop T ćelije može se preciznije predvideti u poređenju sa in silico analitičkom metodom koja zavisi samo od analize vezivanja MHC klase II.

Eksperimentalni Primer 11-2. Ex vivo postupak procene imunogenosti i rezultata

[0146] Da bi se procenila potencijalna imunogenost proteina sa dvostrukom funkcijom, EpiScreen™ analiza (povećana bio-distribucija mozga i hemijska stabilnost i smanjena imunogenost projektovane varijante GDNF, Exp Neurol, 2015) je izvedena. Kada se otkrije imunogenost, aminokiselinske sekvence koje indukuju imunogenost mogu se identifikovati putem mapiranja epitopa T-ćelija, a deimunizovani mutanti sa minimalnom imunogenošću mogu biti dizajnirani i pripremljeni putem in silico predviđanja kako bi se ponovo procenila imunogenost.

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Protein sa dvostrukom funkcijom koji sadrži mutantni protein faktora rasta fbroblasta 21 (FGF21); biološki aktivan protein; i Fc region imunoglobulina,

pri čemu FGF21 mutantni protein ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NOs: 6, 11 do 15 i 20 do 23;

pri čemu biloški aktivni protein je onaj koji je odabran između grupe koja se sastoji od glukagon-sličnog peptid-1(GLP-1), mutant GLP-1, i eksendin-4, pri čemu mutant GLP-1 ima aminokiselinsku sekvencu od bilo koje SEQ ID NOs: 43 do 46; i pri čemu protein sa dvostrukom funkcijom dalje sadrži linker, pri čemu linker povezuje FGF21 mutantni protein za Fc region imunoglobulina.

2. Protein sa dvostrukom funkcijom prema zahtevu 1, pri čemu aminokiselinski ostatak N FGF21 mutantnog proteina uveden mutacijom je glikozilovan.

3. Protein sa dvostrukom funkcijom prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu biloški aktivni protein je GLP-1 ili mutant GLP-1, pri čemu mutant GLP-1 ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NOs: 43 do 46.

4. Protein sa dvostrukom funkcijom prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu je linker povezna za C-terminus Fc regiona imunoglobulina i N-terminus FGF21 mutantnog proteina.

5. Protein sa dvostrukom funkcijom prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu Fc region imunoglobulina je bilo koji od Fc regiona IgGI, IgG2, IgG3, IgG4 i IgD, ili hibrid Fc koji sadrži njihovu kombinaciju, poželjno pri čemu hibrid Fc sadrži IgG4 region i IgD region.

6. Protein sa dvostrukom funkcijom prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu protein sa dvostrukom funkcijom sadrži biološki aktivni protein, Fc region imunoglobulina i FGF21 mutantni protein, povezani ovim redosledom od N-terminusa do C-terminusa.

7. Protein sa dvostrukom funkcijom prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu je linker peptide koji se sastoji od 10 do 30 aminokiselinskih ostataka.

8. Protein sa dvostrukom funkcijom prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu linker ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NOs: 2 do 5.

9. Protein sa dvostrukom funkcijom prema bilo kom od zahteva 1 do 8, pri čemu protein sa dvostrukom funkcijom ima aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 ili SEQ ID NO: 67.

10. Protein sa dvostrukom funkcijom prema zahtevu 9, pri čemu protein sa dvostrukom funkcijom ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66.

11. Protein sa dvostrukom funkcijom prema bilo kom od zahteva 1 do 10 za upotrebu u lečenju dijabetesa, gojaznost, dislipidemije, metaboličkog sindroma, bolesti nealkoholne masne jetre, nealkoholnog steatohepatitisa ili kardiovaskularne bolesti.

12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži protein sa dvostrukom funkcijom prema bilo kom od zahteva 1 do 10 za upotrebu u lečenju dijabetesa, gojaznosti, dislipidemije, metaboličkog sindroma, bolesti nealkoholne masne jetre, nealkoholnog steatohepatitisa ili kardiovaskularnih bolesti.

13. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira protein sa dvostrukom funkcijom prema bilo kom od zahteva 1 do 10.

14. Ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 13.

15. ûelija domaćin koja sadrži ekspresioni vektor prema zahtevu 14.