RS66865B1 - Formulacije lipidnih nanočestica za komponente crispr/cas - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ova patentna prijava ostvaruje pravo prvenstva na osnovu privremene patentne prijave SAD br. 62/315,602 podnete 30. marta 2016. godine, privremene patentne prijave SAD br. 62/375,776 podnete 16. avgusta 2016. godine, privremene patentne prijave SAD br.62/433,228 podnete 12. decembra 2016. godine i privremene patentne prijave SAD br.62/468,300 podnete 7. marta 2017. godine.

[0002] Isporuka biološki aktivnih agenasa (uključujući terapijski relevantna jedinjenja) subjektima često je otežana usled teškoća u dospevanju tih agenasa do ciljne ćelije ili tkiva. Konkretno, transport mnogih biološki aktivnih agenasa unutar živih ćelija može biti ograničen ćelijskim membranskim sistemima.

[0003] Jedna klasa biološki aktivnih agenasa koja je naročito zahtevna za isporučivanje u ćelije su biološki lekovi, uključujući proteine, lekove zasnovane na nukleinskim kiselinama i njihove derivate. Određene nukleinske kiseline i proteini stabilni su samo ograničeno vreme u ćelijama ili plazmi, a često su i visoko naelektrisani, što dodatno komplikuje njihovo prodiranje kroz ćelijske membrane. Formulacije koje mogu stabilizovati i omogućiti efikasno isporučivanje takvih agenasa u ćelije stoga su od posebnog interesa. Lipidni nosači, biorazgradivi polimeri i različiti konjugatni sistemi mogu se koristiti za poboljšanje isporučivanja ovih biološki aktivnih agenasa u ćelije.

[0004] Trenutno postoji niz komponenti i formulacija za uređivanje gena u ćelijama in vivo, koje pružaju značajan potencijal za lečenje genetskih, virusnih, bakterijskih, autoimunih, kancerogenih i inflamatornih bolesti, kao i bolesti povezanih sa starenjem. Nekoliko ovih tehnologija uređivanja koristi ćelijske mehanizme za popravku dvostrukih prekida (engl. Double-Stranded Breaks, „DSB“) koje stvaraju enzimi kao što su meganukleaze, nukleaze povezane sa sistemom klasterisanih, redovno razmaknutih kratkih palindromski ponavljajućih nizova (engl. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, „CRISPR“), odnosno „Cas“ nukleaze, cinkfinger nukleaze (engl. Zinc-Finger Nucleases, „ZFN“) i nukleaze slične transkripcionim aktivatorima (engl. Transcription Activator-Like Effector Nucleases, „TALEN“). Kada dođe do stvaranja DSB u ćeliji, ćelija može izvršiti popravku prekida putem jednog od više mehanizama. Jedan takav proces uključuje neposredno spajanje nehomolognih krajeva DNK (engl. Non-Homologus End Joining, „NHEJ“) na mestu prekida. Tokom procesa NHEJ, ćelija može dodati ili ukloniti nukleotide, što rezultuje sekvencom izmenjenom u odnosu na originalnu sekvencu pre prekida. U drugim okolnostima, ćelije popravljaju DSB pomoću mehanizama popravke zasnovanih na homologiji (engl. Homology-Directed Repair, „HDR“) ili putem homologne rekombinacije (engl. Homologous Recombination, „HR“), pri čemu se za usmeravanje popravke koristi endogeni ili egzogeni šablon koji je homologan sa oba kraja DSB. Nekoliko ovih tehnologija uređivanja koristi ćelijske mehanizme za popravku jednolančanih ili dvostrukih prekida („DSB“).

[0005] CRISPR/Cas sistemi za uređivanje gena deluju u ćeliji kao ribonukleoproteinski kompleksi. Potrebne su formulacije za isporuku proteinskih i nukleinskih komponenti CRISPR/Cas sistema u ćeliju, kao što je ćelija kod pacijenta.

[0006] WO 2014/204726 se odnosi na isporuku, projektovanje i optimizaciju sistema, metoda i formulacija za manipulaciju sekvencama i/ili aktivnostima ciljanih sekvenci, uključujući metode usmeravanja formiranja CRISPR kompleksa u eukariotskim ćelijama radi uređivanja ili modifikacije ciljnog mesta u genomskom lokusu od interesa, u cilju izmene stanja bolesti ili zdravstvenog stanja.

[0007] WO 2010/129687 se odnosi na metode isporuke agenasa zasnovanih na nukleinskim kiselinama u imunske ćelije.

[0008] Wang et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2016 May; 36(5): 783-786, se odnosi na ciljanje gena PCSK9 pomoću CRISPR-Cas9 sistema u ljudskim hepatocitima in vivo, koristeći humanizovane miševe kao platformu za pretkliničku procenu primene somatskog in vivo uređivanja genoma.

[0009] Whitehead et al., (2014) Nat Commun. 5: 4277, opisuju razgradive lipidne nanočestice i njihovu in vivo aktivnost u isporuci siRNK u hepatocite.

[0010] Ovim dokumentom autori obezbeđuju formulacije zasnovane na lipidnim nanočesticama koje su korisne za isporuku komponenti CRISPR/Cas sistema za uređivanje gena. Sam pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima.

[0011] Ovde je opisana metoda proizvodnje genetski modifikovane ćelije jetre, koja obuhvata dovođenje ćelije u kontakt sa lipidnim nanočesticama (LNP) koje sadrže: mRNK Cas nukleaze klase 2, vodeću RNK, CCD lipid, pomoćni lipid, neutralni lipid i stealth lipid. Takođe su obezbeđene lipidne nanočestice (LNP) koje sadrže mRNK Cas nukleaze klase 2, vodeće RNK, CCD lipid, pomoćni lipid, neutralni lipid i stealth lipid.

[0012] Ovde je opisana metoda uređivanja gena, koja obuhvata isporuku mRNK Cas nukleaze klase 2 i vodeće RNK u ćeliju jetre, pri čemu su mRNK Cas nukleaze klase 2 i vodeće RNK formulisane kao najmanje jedna LNP formulacija koja sadrži: CCD lipid, pomoćni lipid, neutralni lipid i stealth lipid. Ovde je opisana metoda primene CRISPR-Cas kompleksa u ćeliji jetre, koja obuhvata dovođenje ćelije u kontakt sa lipidnim nanočesticama (LNP) koje sadrže: mRNK Cas nukleaze klase 2, vodeću RNK, CCD lipid, pomoćni lipid, neutralni lipid i stealth lipid.

[0013] Ovde je opisana metoda promene ekspresije gena u ćeliji jetre, koja obuhvata primenu terapijski efikasne količine mRNK Cas nukleaze klase 2 i vodeće RNK subjektu, u obliku jedne ili više LNP formulacija, pri čemu najmanje jedna LNP formulacija sadrži: vodeću RNK ili mRNK Cas nukleaze klase 2, CCD lipid, pomoćni lipid, neutralni lipid i stealth lipid.

[0014] Metoda proizvodnje genetski modifikovane ćelije jetre može obuhvatati dovođenje ćelije u kontakt sa lipidnim nanočesticama (LNP) koje sadrže: mRNK Cas nukleaze klase 2, vodeću RNK koja jeste ili kodira jednolančanu vodeću RNK (sgRNK), CCD lipid, pomoćni lipid, neutralni lipid i stealth lipid.

[0015] mRNK Cas nukleaze klase 2 može biti formulisana u prvoj LNP formulaciji, dok je vodeća RNK formulisana u drugoj LNP formulaciji. U drugim aspektima, mRNK Cas nukleaze klase 2 i vodeća RNK mogu biti formulisane zajedno u jednoj LNP formulaciji.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0016]

Sl. 1 prikazuje ekspresiju GFP nakon isporuke različitih LNP formulacija u ćelije hepatocita poreklom od miša (Hepa1.6), u količinama od 100 ng i 500 ng eGFP mRNK po jažici.

Sl. 2 prikazuje ekspresiju gLUC kod miševa nakon primene različitih LNP formulacija u različitim dozama, što rezultuje dozno zavisnim odgovorom.

Sl. 3A prikazuje efikasnost uređivanja pri ciljanju Faktora VII kod miševa nakon primene različitih LNP formulacija.

Sl. 3B prikazuje efikasnost uređivanja pri ciljanju TTR gena kod miševa nakon primene različitih LNP formulacija.

Sl. 4A prikazuje efikasnost uređivanja pri ciljanju TTR gena kod miševa nakon isporuke različitih LNP formulacija prema različitim režimima doziranja, pri čemu su gRNK i mRNK za Cas9 formulisane odvojeno.

Sl. 4B prikazuje efikasnost uređivanja pri ciljanju TTR gena kod miševa nakon isporuke LNP formulacije u kojoj su gRNK i mRNK za Cas9 formulisane odvojeno.

Sl. 5 prikazuje efikasnost uređivanja pri ciljanju Faktora VII ili TTR gena u ćelijama nakon primene različitih LNP formulacija u kojima su gRNK i mRNK za Cas9 formulisane odvojeno.

Sl. 6 prikazuje efikasnost uređivanja pri ciljanju Faktora VII ili TTR gena kod miševa nakon primene različitih LNP formulacija u kojima su gRNK i mRNK za Cas9 formulisane odvojeno.

Sl. 7 prikazuje efikasnost uređivanja u ćelijama nakon primene različitih LNP formulacija u kojima su gRNK i mRNK za Cas9 formulisane zajedno i isporučene u različitim koncentracijama.

Sl. 8A prikazuje efikasnost uređivanja pri ciljanju TTR gena kod miševa nakon primene različitih LNP formulacija.

Sl. 8B prikazuje efikasnost uređivanja pri ciljanju Faktora VII kod miševa nakon primene različitih LNP formulacija.

Sl. 9 prikazuje PCR amplifikaciju DNK sa mesta ekscizije, izolovane iz životinja kojima su primenjene različite LNP formulacije.

Sl. 10 prikazuje nivoe TTR u serumu kod miševa kojima su primenjene različite LNP formulacije u kojima su gRNK i mRNK za Cas9 formulisane zajedno.

Sl. 11 prikazuje relativnu aktivnost Faktora VII kod miševa nakon primene različitih LNP formulacija u kojima su gRNK i mRNK za Cas9 formulisane zajedno.

Sl. 12A prikazuje efikasnost uređivanja pri ciljanju TTR gena kod miševa nakon primene LNP-169 u različitim dozama, što rezultuje dozno zavisnim odgovorom. Sl. 12B prikazuje nivoe TTR u serumu kod miševa, u različitim danima, nakon primene LNP-169 u različitim dozama, što rezultuje dozno zavisnim odgovorom.

Sl. 13A prikazuje efikasnost uređivanja pri ciljanju TTR gena kod miševa nakon primene različitih LNP formulacija u kojima je odnos mRNK za Cas9 i sgRNK variran. Sl. 13B prikazuje nivoe TTR u serumu kod miševa, na dva različita dana, nakon primene različitih LNP formulacija u kojima je odnos mRNK za Cas9 i sgRNK variran. Sl. 14A prikazuje efikasnost uređivanja pri ciljanju TTR gena kod miševa nakon primene LNP-169 u jednoj ili dve doze.

Sl. 14B prikazuje nivoe TTR u serumu kod miševa devet dana nakon primene LNP-169 u jednoj ili dve doze.

Sl. 15 prikazuje efikasnost uređivanja pri ciljanju TTR gena u slezini kod miševa nakon primene različitih LNP formulacija.

Sl. 16 prikazuje efikasnost uređivanja pri ciljanju TTR gena kod miševa nakon primene različitih LNP formulacija.

Sl. 17 prikazuje efikasnost uređivanja pri ciljanju TTR gena u primarnim hepatocitima poreklom od miša nakon isporuke LNP-169 u ćelije, u različitim koncentracijama, u prisustvu mišjeg seruma.

Sl. 18 prikazuje porast vezivanja LNP za ApoE kako se povećava količina prisutnog ApoE.

Sl. 19 prikazuje efikasnost uređivanja pomoću različitih LNP formulacija, pri čemu je vodeća RNK isporučena kao DNK ekspresiona kaseta.

Fig. 20 prikazuje da efikasnost uređivanja korelira između kultura primarnih hepatocita i ćelija jetre miševa in vivo.

Sl. 21 prikazuje specifičan spektar popravke nakon uređivanja u ćelijskoj liniji Neuro 2A in vitro u poređenju sa primarnim hepatocitima poreklom od miša.

Sl. 22 prikazuje sličan spektar popravke nakon uređivanja u primarnim hepatocitima poreklom od miša u poređenju sa ćelijama jetre miševa in vivo.

Sl. 23 prikazuje koncentraciju mRNK za Cas9 i vodeće RNK u plazmi u funkciji vremena.

Sl. 24 prikazuje koncentraciju mRNK za Cas9 i vodeće RNK u tkivu jetre u funkciji vremena.

Sl. 25 prikazuje koncentraciju mRNK za Cas9 i vodeće RNK u tkivu slezine u funkciji vremena.

Sl. 26A prikazuje relativne koncentracije mRNK za Cas9 i vodeće RNK u plazmi i u tkivu u funkciji vremena.

Sl. 26B prikazuje koncentraciju lipida A u plazmi i u tkivu u funkciji vremena.

Sl. 27 prikazuje promenu nivoa citokina u plazmi u funkciji vremena nakon primene LNP.

Sl. 28 prikazuje nivoe TTR u serumu miševa tokom vremena nakon primene LNP. Sl. 29A prikazuje uređivanje TTR gena tokom vremena kod miševa nakon primene LNP.

Sl. 29B prikazuje uređivanje TTR gena i nivoe TTR u serumu tokom vremena kod miševa nakon primene LNP.

Sl. 30 prikazuje nivoe citokina u serumu miševa nakon primene LNP formulacija koje sadrže različite mRNK preparate.

Sl. 31 prikazuje koncentraciju TTR u serumu miševa nakon primene LNP formulacija koje sadrže različite mRNK preparate.

Sl. 32 prikazuje nivoe uređivanja TTR gena tokom vremena kod miševa nakon primene LNP formulacija koje sadrže različite mRNK preparate.

Sl. 33 prikazuje koncentraciju TTR u serumu miševa nakon primene LNP formulacija čuvanih na -80°C ili 4°C.

Sl. 34 prikazuje nivoe uređivanja TTR gena kod miševa nakon primene LNP formulacija čuvanih na -80°C ili 4°C.

Sl. 35 prikazuje koncentraciju u serumu miševa nakon primene različitih formulacija.

Sl. 36 prikazuje nivoe uređivanja TTR gena u jetri miševa nakon primene različitih formulacija.

DETALJAN OPIS

[0017] Ovo obelodanjivanje opisuje formulacije lipidnih nanočestica (LNP) koje sadrže komponente CRISPR/Cas sistema (tzv. „teret formulacije“) za isporuku u ćeliju, kao i metode njihove primene. LNP može sadržati (i) CCD lipid, (ii) neutralni lipid, (iii) pomoćni lipid i (iv) stealth lipid. Teret formulacije može obuhvatati mRNK koja kodira Cas nukleazu, kao što je Cas9, i vodeću RNK ili nukleinsku kiselinu koja kodira vodeću RNK.

CRISPR/Cas teret formulacije

[0018] CRISPR/Cas teret formulacije koji se isporučuje putem LNP formulacije uključuje mRNK molekul koji kodira Cas nukleazu, omogućavajući ekspresiju Cas nukleaze u ćeliji. Teret formulacije dalje sadrži jednu ili više vodećih RNK ili nukleinskih kiselina koje kodiraju vodeće RNK. Teret formulacije može dalje sadržati šablonsku nukleinsku kiselinu za potrebe popravke ili rekombinacije.

Cas nukleaza

[0019] Jedna od komponenti opisanih formulacija može biti mRNK koja kodira Cas nukleazu, poznata i kao mRNK Cas nukleaze. mRNK može biti modifikovana radi poboljšanja stabilnosti i/ili imunogenih svojstava. Modifikacije se mogu primeniti na jedan ili više nukleozida unutar mRNK. Primeri hemijskih modifikacija nukleobaza mRNK uključuju pseudouridin, 1-metil-pseudouridin i 5-metil-citidin. Razmatraju se i dodatne poznate modifikacije za poboljšanje stabilnosti, ekspresije i imunogenosti. mRNK koja kodira Cas nukleazu može biti optimizovana po kodonima za ekspresiju u određenom tipu ćelija, kao što su eukariotske ćelije, ćelije sisara, a posebno ljudske ćelije. mRNK može kodirati ljudsku kodonski optimizovanu Cas9 nukleazu ili ljudsku kodonski optimizovanu Cpf nukleazu kao Cas nukleazu. mRNK može biti prečišćena. Prečišćavanje mRNK može se vršiti metodom taloženja (npr. LiCl taloženje, taloženje alkoholom ili ekvivalentna metoda, npr. kao što je opisano u ovom dokumentu). mRNK se može prečistiti i metodom zasnovanom na hromatografiji, kao što je HPLC zasnovana metoda ili njena ekvivalentna varijanta (npr. kao što je opisano u ovom dokumentu). mRNK se može prečistiti kombinacijom metode taloženja (npr. LiCl) i HPLC zasnovane metode.

[0020] Pored kodirajuće sekvence za Cas nukleazu, mRNK može sadržati 3' ili 5' neprevodivu regiju (UTR). 3' ili 5' UTR može poticati iz sekvence ljudskog gena. Primeri 3' i 5' UTR regija uključuju α- i β-globin, albumin, HSD17B4 i elongacioni faktor 1α eukariota. Pored toga, mogu se koristiti i 5' i 3' neprevodive regije (UTR) virusnog porekla, uključujući UTR sekvence ortopoksvirusa i citomegalovirusa. mRNK može uključivati 5' kapu, kao što je m7G(5')ppp(5')N. Pored toga, ova kapa može biti kapa-0, gde nukleotid N ne sadrži 2'OMe; ili kapa-1, gde nukleotid N sadrži 2'OMe; ili kapa-2, gde nukleotidi N i N+1 sadrže 2'OMe. Ova kapa takođe može imati strukturu m2<7,3'-O>G(5')N, kao što je uključena putem analoga kape sa obrnutom orijentacijom (engl. Anti-Reverse-Cap Analog, ARCA), i može obuhvatati slične strukture tipa kapa-0, kapa-1, kapa-2 i sl. 5'-kapa može regulisati nuklearni izvoz, sprečiti razgradnju od strane egzonukleaza, promovisati translaciju i promovisati eksciziju introna u blizini 5'-kraja. Elementi koji stabilizuju kape uključuju fosforotioatne veze, boranofosfatne modifikacije i metilenske mostove. Pored toga, kape mogu sadržati i nenukleinske komponente koje deluju kao vezujući elementi za eukariotski faktor inicijacije translacije 4E, eIF4E. mRNK može sadržati poli(A) rep. Ovaj rep može imati dužinu od oko 40 do oko 300 nukleotida. Rep može biti dužine od oko 40 do oko 100 nukleotida. Rep može biti dužine od oko 100 do oko 300 nukleotida. Rep može biti dužine od oko 100 do oko 300 nukleotida. Rep može biti dužine od oko 50 do oko 200 nukleotida. Rep može biti dužine od oko 50 do oko 250 nukleotida. Rep može biti dužine od oko 100, 150 ili 200 nukleotida. Poli(A) rep može sadržati modifikacije koje sprečavaju razgradnju od strane egzonukleaza, uključujući fosforotioatne veze i modifikacije nukleobaza. Pored toga, poli(A) rep može sadržati 3' „kapu“ koja bi mogla uključivati modifikovane ili neprirodne nukleobaze ili druge sintetičke grupe.

[0021] Ovde opisane mRNK mogu obuhvatati barem jedan element koji je sposoban da modifikuje intracelularni polu-život RNK. Polu-život RNK može biti produžen. Poluživot RNK može biti skraćen. Element može biti u stanju da poveća stabilnost RNK.

Element može biti u stanju da smanji stabilnost RNK. Element može promovisati razgradnju RNK. Element može aktivirati translaciju. Element može biti unutar 3' UTR RNK. Na primer, element može biti signal za razgradnju mRNK. Element može sadržati signal za poliadenilaciju (PA). PA može biti prisutan u 3' UTR RNK. RNK može da ne sadrži PA, čime postaje podložna bržoj razgradnji u ćeliji nakon transkripcije. Element može sadržati najmanje jedan AU-bogati element (ARE). Element ne mora nužno sadržati ARE. ARE elemente mogu vezivati ARE-vezujući proteini (ARE-BP) na način koji zavisi od tipa tkiva, tipa ćelije, vremenske tačke, ćelijske lokalizacije i okruženja. ARE može biti dužine od 50 do 150 nukleotida. ARE može sadržati najmanje jednu kopiju sekvence AUUUA. Najmanje jedan ARE može biti dodat 3' UTR regiji RNK. Element može biti posttranskripciona regulatorna regija virusa hepatitisa drvenastog mrmota (Woodchuck Hepatitis Virus, WHV), poznata kao WPRE (engl. Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element), koja formira tercijarnu strukturu radi pojačavanja ekspresije transkripta. WPRE se može dodati u 3' UTR RNK. Element može biti izabran među drugim motivima RNK sekvence koji su prisutni u transkriptima sa brzim ili sporim profilom razgradnje. Pored toga, svaki element se može koristiti samostalno. Element se može koristiti u kombinaciji sa jednim ili više drugih elemenata.

[0022] Nukleaza kodirana isporučenom mRNK može biti Cas protein iz CRISPR/Cas sistema. Cas protein može sadržati najmanje jedan domen koji stupa u interakciju sa vodećom RNK („gRNK”). Pored toga, Cas protein može biti usmeren ka ciljnoj sekvenci pomoću vodeće RNK. Vodeća RNK stupa u interakciju sa Cas proteinom, kao i sa ciljnom sekvencom, usmeravajući vezivanje na ciljnu sekvencu. Vodeća RNK može da obezbedi specifičnost ciljanog cepanja, dok Cas protein može biti univerzalan i uparen sa različitim vodećim RNK kako bi se cepale različite ciljne sekvence. Cas protein može cepati jednolančanu ili dvolančanu DNK. Cas protein može cepati RNK.

[0023] Cas protein može izvršiti zasecanje RNK. Cas protein može sadržati najmanje jedan DNK-vezujući domen i najmanje jedan nukleazni domen. Nukleazni domen može biti heterologan u odnosu na DNK-vezujući domen. CRISPR/Cas sistem može sadržati komponente klase 1 ili klase 2, uključujući ribonukleoproteinske komplekse. Videti npr. Makarova et al., Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397 (2015). CRISPR/Cas sistemi klase 2 imaju jednoproteinske efektore. Cas proteini tipova II, V i VI mogu biti jednoproteinske, vodećom RNK navođene endonukleaze, koje se u ovom dokumentu nazivaju „nukleaze klase 2 Cas”. Nukleaze klase 2 Cas uključuju, na primer, proteine Cas9, Cpfl, C2c1, C2c2 i C2c3. Cpfl protein, Zetsche et al., Cell, 163: 1-13 (2015), je homologan sa Cas9 i sadrži nukleazni domen sličan RuvC domenu. Videti npr. Zetsche, tabele S1 i S3.

[0024] Cas protein može poticati iz CRISPR/Cas sistema tipa II, tj. biti Cas9 protein iz CRISPR/Cas9 sistema, ili iz CRISPR/Cas sistema tipa V, npr. Cpf1 protein. Cas protein može poticati iz CRISPR/Cas sistema klase 2, tj. biti jednoproteinska Cas nukleaza kao što je Cas9 protein ili Cpfl protein. Proteini iz porodica nukleaza klase 2 Cas su enzimi sa DNK-endonukleaznom aktivnošću i mogu biti usmereni da cepaju željenu ciljnu nukleinsku kiselinu dizajniranjem odgovarajuće vodeće RNK, kako je dalje opisano u ovom dokumentu.

[0025] Komponenta CRISPR/Cas sistema klase 2 može poticati iz sistema tipa IIA, IIB, IIC, V ili VI. Cas9 i njegovi ortolozi su obuhvaćeni ovim obelodanjivanjem. Primeri vrsta koje ne ograničavaju obim ovog obelodanjivanja, a iz kojih Cas9 protein ili druge komponente mogu poticati, uključuju: Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sp., Staphylococcus aureus, Listeria innocua, Lactobacillus gasseri, Francisella novicida, Wolinella succinogenes, Sutterella wadsworthensis, Gamma proteobacterium, Neisseria meningitidis, Campylobacter jejuni, Pasteurella multocida, Fibrobacter succinogene, Rhodospirillum rubrum, Nocardiopsis dassonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptosporangium roseum, Alicyclobacillus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides, Bacillus selenitireducens, Exiguobacterium sibiricum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus buchneri, Treponema denticola, Microscilla marina, Burkholderiales bacterium, Polaromonas naphthalenivorans, Polaromonas sp., Crocosphaera watsonii, Cyanothece sp., Microcystis aeruginosa, Synechococcus sp., Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii, Caldicelulosiruptor becscii, Candidatus Desulforudis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Finegoldia magna, Natranaerobius thermophilus, Pelotomaculum thermopropionium, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus ferrooxidans, Allochromatium vinosum, Marinobacter sp., Nitrosococcus halophilus, Nitrosococcus watsoni, Pseudoalteromonas haloplanktis, Ktedonobacter racemifer, Methanohalobium evestigatum, Anabaena variabilis, Nodularia spumigena, Nostoc sp., Arthrospira maxima, Arthrospira platensis, Arthrospira sp., Lyngbya sp., Microcoleus chthonoplastes, Oscillatoria sp., Petrotoga mobilis, Thermosipho africanus, Streptococcus pasteurianus, Neisseria cinerea, Campylobacter lari, Parvibaculum lavamentivorans, Corynebacterium diphtheria ili Acaryochloris marina. Cas9 protein može biti iz Streptococcus pyogenes. Cas9 protein može biti iz Streptococcus thermophilus. Cas9 protein može biti iz Staphylococcus aureus. Cpfl protein može biti iz Francisella tularensis, Lachnospiraceae bacterium, Butyrivibrio proteoclasticus, Peregrinibacteria bacterium, Parcubacteria bacterium, Smithella, Acidaminococcus, Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens, Moraxella bovoculi, Leptospira inadai, Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, ili Porphyromonas macacae. Cpf1 protein može biti iz Acidaminococcus ili Lachnospiraceae.

[0026] Cas nukleaza klase 2 može sadržati najmanje jedan nukleazni domen sličan RuvC-u, kao što je Cas9 ili Cpfl protein. Cas nukleaza klase 2 može sadržati više od jednog nukleaznog domena. Na primer, Cas nukleaza klase 2 može sadržati najmanje jedan nukleazni domen sličan RuvC-u i najmanje jedan nukleazni domen sličan HNH-u. Cas nukleaza klase 2 može biti sposobna da uvede DSB u ciljnu sekvencu. Cas nukleaza klase 2 može biti modifikovana tako da sadrži samo jedan funkcionalan nukleazni domen. Na primer, Cas nukleaza klase 2 može biti modifikovana tako da je jedan od nukleaznih domena mutiran ili potpuno ili delimično deletovan da bi se smanjila njegova aktivnost cepanja nukleinske kiseline. Cas nukleaza klase 2 može biti modifikovana tako da ne sadrži funkcionalan nukleazni domen sličan RuvC-u. Cas nukleaza klase 2, npr. Cas9 protein, može biti modifikovana tako da ne sadrži funkcionalan nukleazni domen sličan HNH-u. Za Cas nukleaze klase 2 kod kojih je samo jedan nukleazni domen funkcionalan, Cas nukleaza klase 2 može biti nikaza koja je sposobna da uvede jednolančani prekid („zasecanje“) u ciljnu sekvencu. Konzervirana aminokiselina unutar nukleaznog domena Cas nukleaze klase 2 može biti supstituisana da bi se smanjila ili izmenila nukleazna aktivnost. Mutacija nukleaznog domena može inaktivirati aktivnost cepanja DNK. Mutacija nukleaznog domena može inaktivirati jedan nukleazni domen Cas nukleaze klase 2, što rezultuje nikazom. Nikaza može sadržati supstituciju aminokiseline u nukleaznom domenu sličnom RuvC-u. Primerne supstitucije aminokiselina u nukleaznom domenu sličnom RuvC-u uključuju D10A (zasnovano na Cas9 proteinu S. pyogenes , videti npr. UniProtKB - Q99ZW2 (CAS9_STRP1)). Dalje primerne supstitucije aminokiselina uključuju D917A, E1006A i D1255A (zasnovano na sekvenci Francisella novicida U112 Cpfl (FnCpf1) (UniProtKB - A0Q7Q2 (CPF1_FRATN)). Nikaza može sadržati supstituciju aminokiseline u nukleaznom domenu sličnom HNH-u. Primerne supstitucije aminokiselina u nukleaznom domenu sličnom HNH-u uključuju E762A, H840A, N863A, H983A i D986A (zasnovano na Cas9 proteinu S. pyogenes ). Primerne mutacije menjaju konzervirane katalitičke ostatke u nukleaznom domenu i menjaju nukleolitičku aktivnost domena. Nukleazni sistem opisan ovde može sadržati nikazu i par vodećih RNK koje su komplementarne, respektivno, sens i antisens lancu ciljne sekvence. gRNK mogu usmeriti nikazu da cilja i uvede DSB generisanjem zaseka na suprotnim lancima ciljne sekvence (tj. dvostruko zasecanje). Takođe se može koristiti himerna Cas nukleaza klase 2, gde jedan domen ili region proteina može biti zamenjen delom drugog proteina. Na primer, nukleazni domen može biti zamenjen domenom iz drugačije nukleaze kao što je Fok1. Cas nukleaza klase 2 može biti modifikovana tako da smanji ili eliminiše nukleaznu aktivnost. Može se koristiti za vezivanje i moduliranje ekspresije ili aktivnosti DNK sekvence.

[0027] Cas protein može biti komponenta Cascade kompleksa CRISPR/Cas sistema tipa I. Na primer, Cas protein može biti Cas3 protein. Cas protein može biti iz CRISPR/Cas sistema tipa II. Cas protein može biti iz CRISPR/Cas sistema tipa III. Cas protein može biti iz CRISPR/Cas sistema tipa IV. Cas protein može biti iz CRISPR/Cas sistema tipa V. Cas protein može biti iz CRISPR/Cas sistema tipa VI. Cas protein može imati aktivnost cepanja RNK.

[0028] Nukleaza može biti fuzionisana sa najmanje jednim heterolognim proteinskim domenom. Najmanje jedan proteinski domen može biti lociran na N-kraju, C-kraju, ili na unutrašnjoj lokaciji nukleaze. Proteinski domen može olakšati transport nukleaze u jedro ćelije. Na primer, proteinski domen može biti signal nuklearne lokalizacije (NLS). Nukleaza može biti fuzionisana sa 1-10 NLS(a). Nukleaza može biti fuzionisana sa 1-5 NLS(a). Nukleaza može biti fuzionisana sa jednim NLS-om. Kada se koristi jedan NLS, NLS može biti na N-kraju ili C-kraju nukleaze. Nukleaza može biti fuzionisana sa više od jednog NLS-a. Nukleaza može biti fuzionisana sa 2, 3, 4 ili 5 NLS-a. Nukleaza može biti fuzionisana sa dva NLS-a. U određenim okolnostima, dva NLS-a mogu biti ista (npr. dva SV40 NLS-a) ili različita. Nukleaza može biti fuzionisana sa dve SV40 NLS sekvence na karboksi kraju. Nukleaza može biti fuzionisana sa dva NLS-a, jednim na N-kraju i jednim na C-kraju. Nukleaza može biti fuzionisana sa 3 NLS-a. Nukleaza može biti fuzionisana bez NLS-a. NLS može biti monopartitna sekvenca, kao što je, npr. SV40 NLS, PKKKRKV ili PKKKRRV. NLS može biti bipartitna sekvenca, kao što je NLS nukleoplazmina, KRPAATKKAGQAKKKK. Jedan PKKKRKV NLS može biti na C-kraju nukleaze.

[0029] Proteinski domen može biti sposoban da modifikuje intracelularni polu-život nukleaze. Polu-život nukleaze može biti produžen. Polu-život nukleaze može biti skraćen. Proteinski domen može biti sposoban da poveća stabilnost nukleaze. Proteinski domen može biti sposoban da smanji stabilnost nukleaze. Proteinski domen može delovati kao signalni peptid za degradaciju proteina. Degradacija proteina može biti posredovana proteolitičkim enzimima, kao što su, na primer, proteazomi, lizozomske proteaze ili kalpain proteaze. Proteinski domen može sadržati PEST sekvencu. Nukleaza može biti modifikovana dodatkom ubikvitina ili poliubikvitinskog lanca. Ubikvitin može biti protein sličan ubikvitinu (UBL). Neiscrpni primeri proteina sličnih ubikvitinu uključuju mali modifikator sličan ubikvitinu (SUMO), protein unakrsne reaktivnosti sa ubikvitinom (UCRP, takođe poznat kao interferonom-stimulisan gen-15 (ISG15)), modifikator povezan sa ubikvitinom-1 (URM1), protein eksprimiran u neuronskim prekursorskim ćelijama i razvojno regulisan naniže - 8 (NEDD8, takođe nazvan Rub1 kod S. cerevisiae), protein povezan sa humanim leukocitnim antigenom F (FAT10), autofagija-8 (ATG8) i -12 (ATG12), Fau protein sličan ubikvitinu (FUB1), membranski usidren UBL (MUB), ubikvitin fold-modifikator-1 (UFM1) i protein sličan ubikvitinu-5 (UBL5).

[0030] Proteinski domen može biti marker domen. Neiscrpni primeri marker domena uključuju fluorescentne proteine, afinitetne oznake za prečišćavanje, epitopske oznake i sekvence reporter gena. Marker domen može biti fluorescentni protein. Neiscrpni primeri pogodnih fluorescentnih proteina uključuju zelene fluorescentne proteine (npr. GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, sfGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), žute fluorescentne proteine (npr. YFP, EYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), plave fluorescentne proteine (npr. EBFP, EBFP2, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), cijan fluorescentne proteine (npr. ECFP, Cerulean, CyPet, AmCyan1, Midoriishi-Cyan), crvene fluorescentne proteine (npr. mKate, mKate2, mPlum, DsRed monomer, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomer, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred) i narandžaste fluorescentne proteine (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Monomeric Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato), ili bilo koji drugi odgovarajući fluorescentni protein. Marker domen može biti oznaka za prečišćavanje i/ili epitopska oznaka. Neiscrpni primeri oznaka uključuju glutationsku-S-transferazu (GST), protein koji vezuje hitin (CBP), protein koji vezuje maltozu (MBP), tioredoksin (TRX), poli(NANP), tandem afinitetnu prečišćavajuću oznaku (TAP) tag, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, 8xHis, biotinski nosač karboksilne grupe (BCCP), poli-His i kalmodulin. Neiscrpni primeri reporter gena uključuju glutationsku-S-transferazu (GST), peroksidazu rena (HRP), hloramfenikol acetiltransferazu (CAT), beta-galaktozidazu, beta-glukuronidazu, luciferazu ili fluorescentne proteine.

[0031] Proteinski domen može usmeriti nukleazu ka određenoj organeli, tipu ćelije, tkivu ili organu. Proteinski domen može usmeriti nukleazu ka mitohondrijama.

[0032] Proteinski domen može biti efektorski domen. Kada je nukleaza usmerena ka ciljnoj sekvenci, npr. kada je Cas9 protein usmeren ka ciljnoj sekvenci pomoću vodeće RNK, efektorski domen može da modifikuje ili utiče na ciljnu sekvencu. Efektorski domen može biti izabran iz domena za vezivanje nukleinskih kiselina, nukleaznog domena, domena za epigenetsku modifikaciju, domena za transkripcionu aktivaciju, domena za metilaciju ili domena za transkripcionu represiju. Domen za modifikaciju DNK može biti domen za metilaciju, kao što je domen za demetilaciju ili metiltransferazu. Efektorski domen može biti domen za modifikaciju DNK, kao što je domen za bazno uređivanje. Domen za modifikaciju DNK može biti domen za uređivanje nukleinske kiseline koji unosi specifičnu izmenu u DNK, kao što je deaminazni domen. Videti WO 2015/089406; US 2016/0304846. Domeni za uređivanje nukleinskih kiselina, deaminazni domeni i Cas9 varijante opisani su u WO 2015/089406 i US 2016/0304846.

Vodeća RNK

[0033] Teret formulacije za LNP formulaciju može uključivati najmanje jednu vodeću RNK. Vodeća RNK može usmeravati Cas nukleazu klase 2 ka ciljnoj sekvenci na ciljnom molekulu nukleinske kiseline, pri čemu vodeća RNK hibridizuje sa ciljnom sekvencom, a Cas nukleaza je seče ili moduliše. Vodeća RNK može se vezati za i obezbeđuje specifičnost preseka putem Cas nukleaze klase 2. Vodeća RNK i Cas protein mogu formirati ribonukleoproteinski kompleks (RNP), npr. CRISPR/Cas kompleks. CRISPR kompleks može biti CRISPR/Cas9 kompleks tipa II. CRISPR/Cas kompleks može biti CRISPR/Cas kompleks tipa V, kao što je kompleks Cpf1/vodeća RNK. Cas nukleaza može biti Cas nukleaza sastavljena od jednog proteina, npr. Cas9 ili Cpf1 protein. Vodeća RNK može ciljati presek koji sprovodi Cas9 protein.

[0034] Vodeća RNK za CRISPR/Cas9 nukleazni sistem sastoji se od CRISPR RNK (crRNK) i tracr RNK (tracr). crRNK može sadržati sekvencu za ciljanje koja je komplementarna ciljnoj sekvenci na ciljnom molekulu nukleinske kiseline i sa njom hibridizuje. crRNK takođe može da sadrži vezujuću sekvencu (flagpole) koja je komplementarna i uparuje se sa delom tracrRNK. crRNK može biti strukturno slična prirodno transkribovanoj crRNK iz CRISPR lokusa bakterije, pri čemu sekvenca za ciljanje deluje kao spejser u CRISPR/Cas9 sistemu, a vezujuća sekvenca (flagpole) odgovara delu ponavljajuće sekvence koja obrubljuje spejsere u CRISPR lokusu. Vodeća RNK može ciljati bilo koju sekvencu od interesa putem sekvence za ciljanje crRNK. Stepen komplementarnosti između sekvence za ciljanje vodeće RNK i ciljne sekvence na ciljnom molekulu nukleinske kiseline može iznositi približno 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100%. Sekvenca za ciljanje vodeće RNK i ciljana sekvenca na ciljnom molekulu nukleinske kiseline mogu biti 100% komplementarne. Sekvenca za ciljanje vodeće RNK i ciljana sekvenca na ciljnom molekulu nukleinske kiseline mogu sadržati najmanje jednu neusaglašenost. Na primer, sekvenca za ciljanje vodeće RNK i ciljana sekvenca na ciljnom molekulu nukleinske kiseline mogu sadržati 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 neusaglašenosti. Sekvenca za ciljanje vodeće RNK i ciljana sekvenca na ciljnom molekulu nukleinske kiseline mogu sadržati 1-6 neusaglašenosti. Sekvenca za ciljanje vodeće RNK i ciljana sekvenca mogu sadržati 5 ili 6 neusaglašenosti. Dužina sekvence za ciljanje može zavisiti od korišćenog CRISPR/Cas sistema i njegovih komponenti. Na primer, različiti Cas proteini iz različitih bakterijskih vrsta imaju različite optimalne dužine sekvence za ciljanje. Shodno tome, sekvenca za ciljanje može sadržati 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ili više od 50 nukleotida. Sekvenca za ciljanje može sadržati 18-24 nukleotida u dužini. Sekvenca za ciljanje može sadržati 19-21 nukleotid u dužini. Sekvenca za ciljanje može sadržati 20 nukleotida u dužini.

[0035] Vezujuća sekvenca (flagpole) može sadržati bilo koju sekvencu sa dovoljnom komplementarnošću prema tracr RNK kako bi se omogućilo formiranje funkcionalnog CRISPR/Cas kompleksa. Vezujuća sekvenca (flagpole) može sadržati celu ili deo sekvence (takođe nazvane „tag“ ili „vezujuća regija“) prirodno prisutne crRNK koja je komplementarna tracr RNK u okviru istog CRISPR/Cas sistema. Vezujuća sekvenca (flagpole) može sadržati celu ili deo ponavljajuće sekvence iz prirodnog CRISPR/Cas sistema. Vezujuća sekvenca (flagpole) može sadržati skraćenu ili modifikovanu „tag“ ili vezujuću sekvencu. Stepen komplementarnosti između tracr RNK i dela vezujuće sekvence (flagpole) koji hibridizuje sa tracr RNK duž kraće od dve sekvence može iznositi oko 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili više, ali manje od 100%. Bez teorijskog ograničavanja na određeni mehanizam, moguće je da tracr RNK i deo vezujuće sekvence (flagpole) nisu 100% komplementarni duž cele dužine kraće sekvence zbog prisustva jedne ili više „bulge“ strukture u tracr RNK i/ili zbog „wobble“ uparivanja baza između tracr i vezujuće sekvence (flagpole). Dužina vezujuće sekvence (flagpole) može zavisiti od korišćenog CRISPR/Cas sistema ili od upotrebljene tracr RNK. Na primer, vezujuća sekvenca (flagpole) može sadržati 10-50 nukleotida ili više od 50 nukleotida u dužini. Vezujuća sekvenca (flagpole) može sadržati 15-40 nukleotida u dužini. Vezujuća sekvenca (flagpole) može sadržati 20-30 nukleotida u dužini. Vezujuća sekvenca (flagpole) može sadržati 22 nukleotida u dužini. Kada se koristi dvostruka vodeća RNK, dužina vezujuće sekvence (flagpole) može biti neograničena.

[0036] Tracr RNK može sadržati celu ili deo sekvence divljeg tipa tracr RNK iz prirodno prisutnog CRISPR/Cas sistema. tracr RNK može sadržati skraćenu ili modifikovanu varijantu tracr RNK divljeg tipa. Dužina tracr RNK može zavisiti od korišćenog CRISPR/Cas sistema. tracr RNK može sadržati 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ili više od 100 nukleotida u dužini. tracr može imati najmanje 26 nukleotida u dužini. tracr može imati najmanje 40 nukleotida u dužini. tracr RNK može sadržati određene sekundarne strukture, kao što su, npr. jedna ili više hairpin ili stem-loop struktura, ili jedna ili više bulge struktura.

[0037] Vodeća RNK može se sastojati od dva RNK molekula i u ovom dokumentu se naziva „dvostruka vodeća RNK“ ili „dgRNK“. dgRNK može sadržati prvi RNK molekul koji sadrži crRNK i drugi RNK molekul koji sadrži tracr RNK. Prvi i drugi RNK molekul mogu formirati RNK dupleks putem uparivanja baza između vezujuće sekvence (flagpole) na crRNK i tracr RNK.

[0038] Vodeća RNK može se sastojati od jednog RNK molekula i u ovom dokumentu se naziva „jednostruka vodeća RNK“ ili „sgRNK“. sgRNK može sadržati crRNK koja je kovalentno povezana sa tracr RNK. crRNK i tracr RNK mogu biti povezane kovalentno pomoću linkera. Jednomolekulska vodeća RNK može sadržati stem-loop strukturu formiranu putem uparivanja baza između vezujuće sekvence (flagpole) na crRNK i tracr RNK. sgRNK može biti „Cas9 sgRNK“, sposobna da posreduje u RNK-usmerenom preseku DNK pomoću Cas9 proteina. sgRNK može biti „Cpfl sgRNK“, sposobna da posreduje u RNK-usmerenom preseku DNK pomoću Cpf1 proteina.

Vodeća RNK može sadržati crRNK i tracr RNK u meri dovoljnoj za formiranje aktivnog kompleksa sa Cas9 proteinom i posredovanje u RNK-usmerenom preseku DNK. Vodeća RNK može sadržati crRNK dovoljnu za formiranje aktivnog kompleksa sa Cpfl proteinom i posredovanje u RNK-usmerenom preseku DNK. Videti Zetsche 2015.

[0039] Takođe su obuhvaćene i nukleinske kiseline, npr. ekspresione kasete, koje kodiraju vodeću RNK opisanu u ovom dokumentu. Pojam „nukleinska kiselina vodeće RNK“ koristi se ovde da označi vodeću RNK (npr. sgRNK ili dgRNK) i ekspresionu kasetu vodeće RNK, što predstavlja nukleinsku kiselinu koja kodira jednu ili više vodećih RNK.

[0040] Nukleinska kiselina može biti DNK molekul. Nukleinska kiselina može sadržati nukleotidnu sekvencu koja kodira crRNK. Nukleotidna sekvenca koja kodira crRNK može sadržati sekvencu za ciljanje koja je obrubljena celom ili delom ponavljajuće sekvence iz prirodnog CRISPR/Cas sistema. Nukleinska kiselina može sadržati nukleotidnu sekvencu koja kodira tracr RNK. crRNK i tracr RNK mogu biti kodirane odvojenim molekulima nukleinske kiseline. crRNK i tracr RNK mogu biti kodirane istim molekulom nukleinske kiseline. crRNK i tracr RNK mogu biti kodirane na suprotnim lancima istog molekula nukleinske kiseline. crRNK i tracr RNK mogu biti kodirane na istom lancu istog molekula nukleinske kiseline. Ekspresiona kaseta može kodirati sgRNK. Ekspresiona kaseta može kodirati sgRNK za Cas9 nukleazu. Ekspresiona kaseta može kodirati sgRNK za Cpfl nukleazu.

[0041] Nukleotidna sekvenca koja kodira vodeću RNK može biti funkcionalno povezana (operabilno vezana) sa najmanje jednom transkripcionom ili regulatornom kontrolnom sekvencom, kao što je promotor, 3' UTR ili 5' UTR. U jednom primeru, promotor može biti tRNK promotor, npr. tRNK<Lys3>ili himerna tRNK. Videti Mefferd et al., RNA. 2015 21:1683-9; Scherer et al., Nucleic Acids Res. 2007 35: 2620-2628. Promotor može biti prepoznat od strane RNK polimeraze III (Pol III). Neiscrpni primeri promotora za Pol III uključuju promotore U6 i H1. Nukleotidna sekvenca koja kodira vodeću RNK može biti operabilno vezana za mišji ili ljudski U6 promotor. Ekspresiona kaseta može biti modifikovana nukleinska kiselina. Ekspresiona kaseta može sadržati modifikovani nukleozid ili nukleotid. Ekspresiona kaseta može sadržati modifikaciju na 5' kraju, na primer modifikovani nukleozid ili nukleotid koji služi za stabilizaciju i sprečavanje integracije kaseta. Ekspresiona kaseta može sadržati dvostruku DNK sa modifikacijom na 5' kraju oba lanca. Ekspresiona kaseta može sadržati invertovani dideoksi-T ili invertovani apurinski nukleozid ili nukleotid kao modifikaciju na 5' kraju.

Ekspresiona kaseta može sadržati oznaku kao što su biotin, destiobiotin-TEG, digoksigenin i fluorescentne markere, uključujući, na primer, FAM, ROX, TAMRA i AlexaFluor.

[0042] Više od jedne vodeće RNK može se koristiti u okviru CRISPR/Cas nukleaznog sistema. Svaka vodeća RNK može sadržati različitu sekvencu za ciljanje, tako da CRISPR/Cas sistem vrši presek više različitih ciljnih sekvenci. Jedna ili više vodećih RNK može imati ista ili različita svojstva, kao što su aktivnost ili stabilnost unutar CRISPR/Cas kompleksa. Kada se koristi više od jedne vodeće RNK, svaka vodeća RNK može biti kodirana u istom ili u različitim ekspresionim kasetama. Promotori koji se koriste za ekspresiju više vodećih RNK mogu biti isti ili različiti.

Hemijski modifikovane RNK

[0043] Modifikovani nukleozidi ili nukleotidi mogu biti prisutni u vodećoj RNK ili mRNK. Vodeća RNK ili mRNK koja kodira Cas nukleazu, a koja sadrži jedan ili više modifikovanih nukleozida ili nukleotida, naziva se „modifikovana“ RNK, što označava prisustvo jedne ili više komponenti ili konfiguracija koje nisu kanonske i/ili su prirodno prisutne, a koriste se umesto ili pored standardnih A, G, C i U ostataka. Modifikovana RNK može biti sintetisana sa nekanonskim nukleozidom ili nukleotidom, ovde nazvanim „modifikovanim“. Modifikovani nukleozidi i nukleotidi mogu uključivati jedno ili više od sledećeg: (i) izmenu, npr. zamenu, jednog ili oba nelinkujuća atoma kiseonika fosfata i/ili jednog ili više linkujućih atoma kiseonika fosfata u fosfodiestarskoj vezi (primer modifikacije okosnice); (ii) izmenu, npr. zamenu, komponente riboznog šećera, npr. 2’-hidroksilne grupe na ribozi (primer modifikacije šećera); (iii) potpunu zamenu fosfatne grupe sa „defosfo“ linkovima (primer modifikacije kostura); (iv) modifikaciju ili zamenu prirodne nukleobaze, uključujući zamenu nekanonskom bazom (primer modifikacije baze); (v) zamenu ili modifikaciju riboza-fosfatnog kostura (primer modifikacije kostura); (vi) modifikaciju 3’ ili 5’ kraja oligonukleotida, npr. uklanjanje, modifikaciju ili zamenu terminalne fosfatne grupe ili konjugaciju molekula, kapa ili linkera (modifikacije kape na 3’ ili 5’ kraju mogu obuhvatati modifikaciju šećera i/ili kostura); i (vii) modifikaciju ili zamenu šećera (primer modifikacije šećera).

[0044] Gore navedene modifikacije mogu se kombinovati kako bi se dobile modifikovane RNK koje sadrže nukleozide i nukleotide (zajednički naziv „ostaci“) sa dve, tri, četiri ili više modifikacija. Na primer, modifikovani ostatak može imati i modifikovani šećer i modifikovanu nukleobazu. Svaka baza u gRNK može biti modifikovana, npr. sve baze imaju modifikovanu fosfatnu grupu, kao što je fosforotioatna grupa. Sve ili gotovo sve fosfatne grupe u molekulu sgRNK mogu biti zamenjene fosforotioatnim grupama. Modifikovane RNK mogu sadržati najmanje jedan modifikovani ostatak na ili blizu 5’ kraja RNK. Modifikovane RNK mogu sadržati najmanje jedan modifikovani ostatak na ili blizu 3’ kraja RNK.

[0045] Modifikovani ostaci mogu biti inkorporirani u vodeću RNK. Modifikovani ostaci mogu biti inkorporirani u mRNK. Vodeća RNK može sadržati jedan, dva, tri ili više modifikovanih ostataka. Vodeća RNK može sadržati jedan, dva, tri ili više modifikovanih ostataka na svakom od 5’ i 3’ kraja vodeće RNK. mRNK može sadržati 5, 10, 15, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 ili više modifikovanih ostataka. Od ukupnog broja pozicija u modifikovanoj vodećoj RNK ili mRNK, najmanje 5% (npr. najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95% ili oko 100%) može biti modifikovanih nukleozida ili nukleotida. Nemodifikovane nukleinske kiseline mogu biti podložne razgradnji, npr. dejstvom ćelijskih nukleaza. Na primer, nukleaze mogu hidrolizovati fosfodiestarske veze nukleinskih kiselina. Shodno tome, u jednom aspektu, vodeće RNK opisane u ovom dokumentu mogu sadržati jedan ili više modifikovanih nukleozida ili nukleotida, npr. radi povećanja stabilnosti prema nukleazama. mRNK opisane ovde takođe mogu sadržati jedan ili više modifikovanih nukleozida ili nukleotida, npr. radi povećanja stabilnosti prema nukleazama. Modifikovani RNK molekuli opisane u ovom dokumentu mogu izazivati smanjen urođeni imunski odgovor kada se unesu u populaciju ćelija, kako in vivo tako i ex vivo.Pojam „urođeni imunski odgovor“ uključuje ćelijski odgovor na egzogene nukleinske kiseline, uključujući jednolančane nukleinske kiseline, koji podrazumeva indukciju ekspresije i oslobađanja citokina, naročito interferona, kao i ćelijsku smrt.

[0046] Fosfatna grupa u modifikovanom ostatku može biti izmenjena zamenom jednog ili više atoma kiseonika drugim supstituentom. Dalje, modifikovani ostatak, npr. ostatak prisutan u modifikovanoj nukleinskoj kiselini, može uključivati potpunu zamenu neizmenjene fosfatne grupe modifikovanom fosfatnom grupom, kako je opisano u ovom dokumentu. Modifikacija okosnice fosfatne kičme može uključivati izmene koje rezultuju ili neutralnim linkerom, ili linkerom sa naelektrisanjem koje nije simetrično raspoređeno.

[0047] Primeri modifikovanih fosfatnih grupa uključuju: fosforotioate, fosforoselenate, boranofosfate, estre boranofosfata, vodonične fosfonate, fosforoamidate, alkil- ili arilfosfonate i fosfotriestre. Fosforni atom u neizmenjenoj fosfatnoj grupi je ahiralan. Međutim, zamena jednog od ne-vezanih atoma kiseonika jednim od gore navedenih atoma ili grupa može učiniti fosforni atom hiralnim. Takav stereo-centar na fosforu može imati konfiguraciju „R“ (označeno u ovom dokumentu kao Rp) ili „S“ (označeno u ovom dokumentu kao Sp). Okosnica molekula takođe može biti modifikovana zamenom vezujućeg atoma kiseonika (tj. atoma kiseonika koji povezuje fosfat sa nukleozidom) azotom (mostni fosforoamidati), sumporom (mostni fosforotioati) ili ugljenikom (mostni metilenfosfonati). Zamena može biti izvršena na jednom ili na oba vezujuća atoma kiseonika.

[0048] Fosfatna grupa može biti zamenjena ne-fosfornim vezujućim jedinjenjima u određenim modifikacijama molekulske okosnice. Naelektrisana fosfatna grupa može biti zamenjena neutralnom funkcionalnom grupom. Primeri grupa koje mogu zameniti fosfatnu grupu uključuju, bez ograničenja, npr. metilfosfonat, hidroksilamin, siloksan, karbonat, karboksimetil, karbamat, amid, tioeter, etilenoksidni linker, sulfonat, sulfonamid, tioformacetal, formacetal, oksim, metilenimino, metilenmetilimino, metilenhidrazo, metilendimetilhidrazo i metilenoksimetilimino.

[0049] Mogu se konstruisati i molekulski skafoldi koji imitiraju nukleinske kiseline, pri čemu su fosfatni linker i ribozni šećer zamenjeni nukleozidima otpornim na nukleazu ili nukleotidnim surogatima. Takve modifikacije mogu obuhvatati modifikacije molekulske okosnice i šećerne komponente. Nukleobaze mogu biti povezane putem surogatne okosnice. Primeri uključuju, bez ograničenja, morfolino, ciklobutil, pirolidinske i peptidne nukleinsko-kiselinske (PNA) surogat nukleozide.

[0050] Modifikovani nukleozidi i nukleotidi mogu sadržati jednu ili više modifikacija na šećernoj komponenti, tj. na modifikaciji šećera. Na primer, 2'-hidroksilna grupa (OH) može biti modifikovana, npr. zamenjena različitim „oksi” ili „deoksi” supstituentima. Modifikacije 2'-hidroksilne grupe mogu povećati stabilnost nukleinske kiseline, budući da se hidroksilna grupa više ne može deprotonisati u 2'-alkoksidni jon.

[0051] Primeri modifikacija 2'-hidroksilne grupe uključuju alkoksi ili ariloksi supstituente (OR, gde „R“ može biti, npr. alkil, cikloalkil, aril, aralkil, heteroaril ili šećer); poli(etilen-glikole) (PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR gde „R“ može biti, npr. H ili opciono supstituisani alkil, a „n“ može biti ceo broj od 0 do 20 (npr. od 0 do 4, od 0 do 8, od 0 do 10, od 0 do 16, od 1 do 4, od 1 do 8, od 1 do 10, od 1 do 16, od 1 do 20, od 2 do 4, od 2 do 8, od 2 do 10, od 2 do 16, od 2 do 20, od 4 do 8, od 4 do 10, od 4 do 16, i od 4 do 20). Modifikacija 2'-hidroksilne grupe može biti 2'-O-Me. Modifikacija 2'-hidroksilne grupe može biti 2'-fluoro modifikacija, pri čemu je 2' hidroksilna grupa zamenjena fluoridom. Modifikacija 2'-hidroksilne grupe može uključivati tzv. „zaključane“ nukleinske kiseline (engl. Locked Nucleic Acids, LNA), kod kojih 2'-hidroksilna grupa može biti povezana npr., C1-6 alkilenskim ili C1-6 heteroalkilenskim mostom, sa 4' ugljenikom istog riboznog šećera, gde primeri mostova uključuju metilen, propilen, etarski most ili amino mostove; O-amino (gde amino može biti, npr. NH2; alkilamino, dialkilamino, heterociklil, arilamino, diarilamino, heteroarilamino ili diheteroarilamino, etilendiamin ili poliamino), kao i aminoalkoksi O(CH2)n-amino, (gde amino može biti, npr. NH2; alkilamino, dialkilamino, heterociklil, arilamino, diarilamino, heteroarilamino ili diheteroarilamino, etilendiamin ili poliamino). Modifikacija 2'-hidroksilne grupe može uključivati tzv. „otključane“ nukleinske kiseline (engl. Unlocked Nucleic Acids, UNA), kod kojih ribozni prsten nema vezu između C2' i C3'. Takođe, 2'-OH modifikacija može uključivati metoksi-etil grupu (MOE), (OCH2CH2OCH3, npr. derivat PEG-a).

[0052] Modifikacije 2'-„deodeksi“ tipa mogu uključivati vodonik (tj. deoksiribozne šećere, npr. na visećim krajevima delimične dsRNK); halogene (npr. bromo, hloro, fluoro ili jodo); amino grupe (pri čemu amino može biti, npr. -NH2, alkilamino, dialkilamino, heterociklični amino, arilamino, diarilamino, heteroarilamino, diheteroarilamino ili aminokiselina); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-amino (pri čemu amino može biti, npr. kao što je opisano ovde); -NHC(O)R (pri čemu R može biti, npr. alkil, cikloalkil, aril, aralkil, heteroaril ili šećer); cijano; merkaptogrupe; alkil-tio-alkil grupe; tioalkoksi grupe; i alkil, cikloalkil, aril, alkenil i alkilnil grupe, koje mogu biti opciono supstituisane, npr. aminom, kako je ovde opisano. Modifikacija šećera može uključivati šećernu komponentu kod koje jedan ili više atoma ugljenika imaju suprotnu stereokonfiguraciju u odnosu na odgovarajući ugljenik u ribozi. Tako, modifikovana nukleinska kiselina može sadržati nukleotide sa, npr. arabinozom, kao šećerom. Modifikovane nukleinske kiseline mogu takođe sadržati abazične šećere. Ovi abazični šećeri mogu biti dodatno modifikovani na jednom ili više svojih konstitutivnih atoma. Modifikovane nukleinske kiseline takođe mogu sadržati jedan ili više šećera u L-obliku, npr. L-nukleozide.

[0053] Modifikovani nukleozidi i modifikovani nukleotidi opisani ovde, koji se mogu ugraditi u modifikovanu nukleinsku kiselinu, mogu sadržati modifikovanu bazu, koja se takođe naziva nukleobaza. Primeri nukleobaza uključuju, bez ograničenja, adenin (A), guanin (G), citozin (C) i uracil (U). Ove nukleobaze mogu biti hemijski modifikovane ili potpuno zamenjene, kako bi se dobili modifikovani ostaci koji se mogu ugraditi u modifikovane nukleinske kiseline. Nukleobaza nukleotida može biti nezavisno izabrana iz grupe purina, pirimidina, analoga purina ili analoga pirimidina. Nukleobaza može uključivati, na primer, prirodne i sintetske derivate baza.

[0054] Prilikom upotrebe dvostruke vodeće RNK, svaka od komponenti crRNK i tracr RNK može sadržati modifikacije. Takve modifikacije mogu biti prisutne na jednom ili oba kraja crRNK i/ili tracr RNK. Kada se koristi sgRNK, jedan ili više ostataka na jednom ili oba kraja sgRNK mogu biti hemijski modifikovani, ili cela sgRNK može biti hemijski modifikovana. Dakle, može sadržati modifikaciju na 5'-kraju. Takođe, može sadržati modifikaciju na 3'-kraju. Jedan ili više (ili svi) nukleotida u jednolančanom prepustu molekula vodeće RNK mogu biti deoksinukleotidi. Modifikovana mRNK može sadržati modifikacije na 5'- i/ili 3'-kraju.

Šablonska nukleinska kiselina

[0055] Formulacije opisane ovde mogu sadržati šablonsku nukleinsku kiselinu. Šablon se može koristiti za izmenu ili umetanje nukleotidne sekvence na ili blizu ciljnog mesta za Cas nukleazu.

[0056] Šablon se može koristiti za homologne rekombinacije. Homologna rekombinacija može rezultovati integracijom šablonske sekvence ili njenog dela u ciljni molekul nukleinske kiseline. Može se obezbediti jedan šablon. Alternativno, mogu se obezbediti dva ili više šablona tako da homologna rekombinacija može da se dogodi na dva ili više ciljnih mesta. Na primer, različiti šabloni mogu se obezbediti za popravku jednog gena u ćeliji ili dva različita gena u ćeliji. Više kopija najmanje jednog šablona može biti obezbeđeno ćeliji. Različiti šabloni mogu biti obezbeđeni u nezavisnim brojevima kopija ili u nezavisnim količinama.

[0057] Šablon se može koristiti u popravci usmerenoj homologijom, koja podrazumeva invaziju DNK lanca na mestu prekida u nukleinskoj kiselini. Popravka usmerena homologijom može dovesti do uključivanja šablonske sekvence u uređeni ciljni molekul nukleinske kiseline. Može se obezbediti jedan šablon. Alternativno, dva ili više šablona sa različitim sekvencama mogu se koristiti na dva ili više mesta putem popravke usmerene homologijom. Na primer, različiti šabloni mogu se obezbediti za popravku jednog gena u ćeliji ili dva različita gena u ćeliji. Više kopija najmanje jednog šablona može biti obezbeđeno ćeliji. Različiti šabloni mogu biti obezbeđeni u nezavisnim brojevima kopija ili u nezavisnim količinama.

[0058] Šablon se može koristiti u uređivanju gena posredovanom nehomolognim spajanjem krajeva. Moguće je da šablonska sekvenca nema sličnosti sa nukleinskom sekvencom u blizini mesta prekida. Šablon ili deo šablonske sekvence može biti inkorporiran. Može se obezbediti jedan šablon. Dva ili više šablona sa različitim sekvencama mogu biti umetnuti na dva ili više mesta putem nehomolognog spajanja krajeva. Na primer, različiti šabloni mogu se obezbediti za umetanje jednog šablona u ćeliju ili dva različita šablona u ćeliju. Različiti šabloni mogu biti obezbeđeni u nezavisnim brojevima kopija. Šablon može sadržati granične invertovane terminalne ponovljene (ITR) sekvence.

[0059] Šablonska sekvenca može odgovarati endogenoj sekvenci ciljne ćelije. Kako se koristi u ovom dokumentu, pojam „endogena sekvenca“ odnosi se na sekvencu koja je prirodno prisutna u ćeliji. Pojam „egzogenа sekvenca“ odnosi se na sekvencu koja nije prirodno prisutna u ćeliji, ili na sekvencu čije je prirodno mesto u genomu ćelije na drugoj lokaciji. Endogena sekvenca može biti genomska sekvenca ćelije. Endogena sekvenca može biti hromozomska ili ekstrahromozomska sekvenca. Endogena sekvenca može biti plazmidska sekvenca ćelije. Šablonska sekvenca može biti u velikoj meri identična delu endogene sekvence u ćeliji na ili u blizini mesta prekida, ali da sadrži najmanje jednu izmenu nukleotida. Popravka cepanog ciljnog molekula nukleinske kiseline pomoću šablona može dovesti do mutacije koja uključuje inserciju, deleciju ili supstituciju jednog ili više nukleotida ciljne nukleinske kiseline. Mutacija može izazvati jednu ili više izmena aminokiselina u proteinu koji se eksprimuje iz gena koji sadrži ciljnu sekvencu. Mutacija može izazvati jednu ili više izmena nukleotida u RNK koja se transkribuje iz ciljnog gena. Mutacija može promeniti nivo ekspresije ciljnog gena. Mutacija može dovesti do povećane ili smanjene ekspresije ciljnog gena. Mutacija može rezultovati utišavanjem ekspresije gena (knockdown). Mutacija može rezultovati inaktivacijom gena (knockout). Mutacija može rezultovati obnovljenom funkcijom gena. Popravka cepanog ciljnog molekula nukleinske kiseline pomoću šablona može dovesti do promene u sekvenci egzona, introna, regulatorne sekvence, sekvence za transkripcionu regulaciju, sekvence za translacionu regulaciju, mesta za splajsovanje ili nekodirajuće sekvence ciljnog gena.

[0060] Šablonska sekvenca može sadržati egzogenu sekvencu. Egzogena sekvenca može sadržati sekvencu koja kodira protein ili RNK, funkcionalno povezanu sa egzogenim promotorskim elementom, tako da, nakon integracije egzogene sekvence u ciljni molekul nukleinske kiseline, ćelija može da eksprimira protein ili RNK koji je kodiran integrisanom sekvencom. Nakon integracije egzogene sekvence u ciljni molekul nukleinske kiseline, ekspresija integrisane sekvence može biti regulisana endogenom sekvencom promotora. Egzogena sekvenca može biti hromozomska ili ekstrahromozomska sekvenca. Egzogena sekvenca može sadržati cDNK sekvencu koja kodira protein ili deo proteina. Egzogena sekvenca može sadržati sekvencu egzona, introna, regulatornu sekvencu, sekvencu za transkripcionu kontrolu, sekvencu za translacionu kontrolu, mesto za splajsovanje ili nekodirajuću sekvencu. Integracija egzogene sekvence može rezultovati obnovljenom funkcijom gena. Integracija egzogene sekvence može rezultovati unošenjem gena (knock-in). Integracija egzogene sekvence može rezultovati isključivanjem gena (knock-out).

[0061] Šablon može biti bilo koje odgovarajuće dužine. Šablon može sadržati 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000 ili više nukleotida u dužini. Šablon može biti jednolančana nukleinska kiselina. Šablon može biti dvolančana ili delimično dvolančana nukleinska kiselina. Jednolančani šablon može imati 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ili 200 nukleotida u dužini. Šablon može sadržati nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna delu ciljang molekula nukleinske kiseline koji sadrži ciljnu sekvencu (tj. „homologni krak“). Šablon može sadržati homologni krak koji je komplementaran sekvenci lociranoj uzvodno ili nizvodno od mesta cepanja na ciljnom molekulu nukleinske kiseline. Šablon može sadržati prvi homologni krak i drugi homologni krak (takođe nazvane prva i druga nukleotidna sekvenca), koji su komplementarni sekvencama lociranim uzvodno, odnosno nizvodno od mesta cepanja. Kada šablon sadrži dva homologna kraka, svaki krak može biti iste ili različite dužine, a sekvenca između homolognih krakova može biti u velikoj meri slična ili identična ciljnoj sekvenci između tih krakova, ili može biti potpuno nepovezana. Stepen komplementarnosti između prve nukleotidne sekvence na šablonu i sekvence uzvodno od mesta preseka, kao i između druge nukleotidne sekvence na šablonu i sekvence nizvodno od mesta preseka, može omogućiti homolognu rekombinaciju, kao što je, na primer, visoko dosledna homologna rekombinacija, između šablona i ciljnog molekula nukleinske kiseline. Stepen komplementarnosti može iznositi približno 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100%. Stepen komplementarnosti može iznositi približno 95%, 97%, 98%, 99% ili 100%. Stepen komplementarnosti može biti najmanje 98%, 99% ili 100%. Stepen komplementarnosti može biti 100%.

[0062] Šablon može sadržati ssDNK ili dsDNK sa graničnim invertovanim terminalnim ponovljenim (ITR) sekvencama. Šablon se može obezbediti u obliku plazmida, minicirkla, nanocirkla ili PCR proizvoda.

Prečišćavanje nukleinskih kiselina

[0063] Nukleinska kiselina može biti prečišćena. Nukleinska kiselina može se prečistiti metodom taloženja (npr. LiCl taloženjem, alkoholnim taloženjem ili ekvivalentnom metodom, npr. kako je opisano u ovom dokumentu). Nukleinska kiselina može se prečistiti metodom zasnovanom na hromatografiji, kao što je HPLC metoda ili ekvivalentna metoda (npr. kako je opisano u ovom dokumentu). Nukleinska kiselina može se prečistiti kombinacijom metode taloženja (npr. LiCl taloženjem) i metode zasnovane na HPLC-u.

Ciljne sekvence

[0064] CRISPR/Cas sistem iz ovog opisa može biti usmeren ka ciljnoj sekvenci na ciljnom molekulu nukleinske kiseline i izvršiti njen presek. Na primer, ciljnu sekvencu može prepoznati i preseći Cas nukleaza. Cas nukleaza klase 2 može biti usmerena vodećom RNK ka ciljnoj sekvenci ciljnog molekula nukleinske kiseline, gde vodeća RNK hibridizuje sa ciljnom sekvencom, a Cas protein vrši njen presek. Vodeća RNK može hibridizovati sa ciljnom sekvencom, a Cas protein izvršiti njen presek, pod uslovom da ciljana sekvenca sadrži odgovarajući PAM motiv. Ciljna sekvenca može biti komplementarna sa sekvencom za ciljanje u okviru vodeće RNK. Stepen komplementarnosti između sekvence za ciljanje vodeće RNK i dela odgovarajuće ciljne sekvence koji hibridizuje sa vodećom RNK može iznositi približno 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100%. Regija homologije u ciljnoj sekvenci može se nalaziti neposredno uz odgovarajuću PAM sekvencu. Ciljna sekvenca može sadržati sekvencu koja je 100% komplementarna sa sekvencom za ciljanje vodeće RNK. Ciljna sekvenca može sadržati najmanje jednu neusaglašenost, deleciju ili inserciju u poređenju sa sekvencom za ciljanje vodeće RNK. Na primer, ciljna sekvenca i sekvenca za ciljanje vodeće RNK mogu sadržati 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 neusaglašenosti, opcionalno u delu ciljne sekvence koji se nalazi uz PAM sekvencu. Ciljna sekvenca i sekvenca za ciljanje vodeće RNK mogu sadržati 1-9 neusaglašenosti. Ciljna sekvenca i sekvenca za ciljanje vodeće RNK mogu sadržati 3-6 neusaglašenosti. Ciljna sekvenca i sekvenca za ciljanje vodeće RNK mogu sadržati 5 ili 6 neusaglašenosti.

[0065] Dužina ciljne sekvence može zavisiti od korišćenog sistema nukleaza. Na primer, sekvenca za ciljanje vodeće RNK u okviru CRISPR/Cas sistema može sadržati 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ili više od 50 nukleotida u dužini, a ciljna sekvenca je odgovarajuće dužine, opcionalno u neposrednoj blizini PAM sekvence. Ciljna sekvenca može sadržati 15-24 nukleotida u dužini. Ciljna sekvenca može sadržati 17-21 nukleotid u dužini. Ciljna sekvenca može sadržati 20 nukleotida u dužini. Kada se koriste nikaze, ciljana sekvenca može sadržati par ciljnih sekvenci koje prepoznaje par nikaza koje seku suprotne lance DNK molekula. Ciljna sekvenca može sadržati par ciljnih sekvenci koje prepoznaje par nikaza koje seku isti lanac DNK molekula. Ciljna sekvenca može obuhvatati deo ciljnih sekvenci koje prepoznaje jedna ili više Cas nukleaza.

[0066] Ciljni molekul nukleinske kiseline može biti bilo koji DNK ili RNK molekul koji je endogenog ili egzogenog porekla za ćeliju. Ciljni molekul nukleinske kiseline može biti epizomalna DNK, plazmid, genomska DNK, virusni genom, mitohondrijska DNK ili hromozom iz ćelije ili u ćeliji. Ciljna sekvenca ciljnog molekula nukleinske kiseline može biti genomska sekvenca iz ćelije ili u ćeliji. Ćelija može biti ćelija sisara. Ćelija može biti ćelija glodara. Ćelija može biti ljudska ćelija. Ćelija može biti ćelija jetre. Ćelija može biti ljudska ćelija jetre. Ćelija jetre može biti hepatocit. Hepatocit može biti ljudski hepatocit. Ćelija jetre može biti matična ćelija. Ljudska ćelija jetre može biti jetrena sinusoidalna endotelna ćelija (engl. Liver Sinusoidal Endothelial Cell, LSEC). Ljudska ćelija jetre može biti Kupffer-ova ćelija.

[0067] Ljudska ćelija jetre može biti jetrena stelatna ćelija. Ljudska ćelija jetre može biti tumorska ćelija. Ćelija može sadržati receptore koji se vezuju za ApoE. Ljudska ćelija jetre može biti matična ćelija jetre. Videti npr. Wang, et al. Nature, 2015; Font-Burgada, et al. Cell, 2015, 162:766-799.

[0068] Ciljna sekvenca može biti virusna sekvenca. Ciljna sekvenca može biti sekvenca patogena. Ciljna sekvenca može biti sintetička sekvenca. Ciljna sekvenca može biti hromozomska sekvenca. Ciljna sekvenca može sadržati spoj translokacije, npr. translokaciju povezanu sa karcinomom. Ciljna sekvenca može se nalaziti na eukariotskom hromozomu, kao što je ljudski hromozom. Ciljna sekvenca može biti sekvenca specifična za jetru, tj. ona koja se eksprimira u ćelijama jetre.

[0069] Ciljna sekvenca može se nalaziti u kodirajućoj sekvenci gena, intronskoj sekvenci gena, regulatornoj sekvenci, sekvenci za transkripcionu kontrolu gena, sekvenci za translacionu kontrolu gena, mestu za splajsovanje ili nekodirajućoj sekvenci između gena. Gen može biti gen koji kodira protein. Gen može biti gen za nekodirajuću RNK. Ciljna sekvenca može obuhvatati ceo ili deo gena povezanog sa bolešću. U pojedinim slučajevima, gen može biti eksprimiran u jetri.

[0070] Ciljna sekvenca može biti locirana u negeničkom funkcionalnom mestu u genomu koje kontroliše aspekte organizacije hromatina, kao što su mestа sidrenja (scaffold) ili regije kontrole lokusa.

[0071] Kada je u pitanju Cas nukleaza, kao što je Cas nukleaza klase 2, ciljana sekvenca može se nalaziti neposredno uz Protospacer-Adjacent Motiv („PAM“). PAM može biti neposredno uz ili na 1, 2, 3 ili 4 nukleotida udaljenosti od 3’ kraja ciljne sekvence. Dužina i sekvenca PAM motiva može zavisiti od korišćenog Cas proteina. Na primer, PAM može biti izabran iz konsenzusnog ili specifičnog PAM motiva za određeni Cas9 protein ili Cas9 ortolog, uključujući one prikazane na Sl. 1 kod Ran et al., Nature, 520: 186-191 (2015), i Sl. S5 kod Zetsche 2015. PAM može biti dugačak 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 nukleotida. Neiscrpni primeri PAM sekvenci uključuju NGG, NGGNG, NG, NAAAAN, NNAAAAW, NNNNACA, GNNNCNNA, TTN i NNNNGATT (gde N označava bilo koji nukleotid, a W označava A ili T). PAM sekvenca može biti NGG. PAM sekvenca može biti NGGNG. PAM sekvenca može biti TTN. PAM sekvenca može biti NNAAAAW.

Lipidna formulacija

[0072] Ovde su predstavljene različite LNP formulacije za CRISPR/Cas terete formulacije. Takve LNP formulacije mogu uključivati CCD lipid, zajedno sa pomoćnim lipidom, neutralnim lipidom i stealth lipidom. Pojmom „lipidna nanočestica“ označava se nanočestica koja sadrži više (tj. dva ili više) lipidnih molekula fizički povezanih međumolekulskim silama. LNP mogu biti, npr. mikrosfere (uključujući unilamelarne i multilamelarne vezikule, npr. „lipozomi“ - lamelarne lipidne dvoslojne strukture koje mogu biti pretežno sferične i sadržati vodeno jezgro, npr. koje sadrži značajan deo RNK molekula), dispergovana faza u emulziji, micele ili unutrašnja faza u suspenziji. Emulzije, micele i suspenzije mogu predstavljati pogodne formulacije za lokalnu i/ili topikalnu primenu.

[0073] LNP formulacije opisane ovde se preferencijalno preuzimaju od strane ćelija jetre (npr. hepatocita). Štaviše, LNP formulacije su biorazgradive, što znači da se ne akumuliraju do citotoksičnih nivoa in vivo pri terapijski efikasnoj dozi. Dakle, neke LNP formulacije ne izazivaju urođeni imunski odgovor koji dovodi do značajnih neželjenih efekata na nivou terapijske doze. Neke LNP formulacije opisane ovde ne izazivaju toksičnost pri terapijskoj dozi. LNP formulacije specifično se vezuju za apolipoproteine, kao što je apolipoprotein E (ApoE), u krvi. Apolipoproteini su proteini koji cirkulišu u plazmi i ključni su za regulaciju transporta lipida. ApoE predstavlja jednu klasu apolipoproteina koji interaguju sa proteoglikanima bogatim heparin-sulfatom na površini ćelija jetre tokom preuzimanja lipoproteina. (Videti npr. Scherphof and Kamps, The role of hepatocytes in the clearance of liposomes from the blood circulation. Prog Lipid Res.2001 May;40(3):149-66).

CCD lipidi

[0074] Lipidne formulacije za isporuku biološki aktivnih agenasa mogu se prilagoditi tako da preferencijalno ciljaju ćelije ili organe jetre. Određene lipidne formulacije preferencijalno ciljaju ćelije koje vezuju apolipoprotein E (ApoE), kao što su ćelije koje eksprimiraju receptor za ApoE. Lipidne formulacije za isporuku CRISPR/Cas mRNK i komponenti vodeće RNK u ćeliju jetre sadrže CCD lipid.

[0075] CCD lipid može biti Lipid A, koji je (9Z,12Z)-3-((4,4-bis(oktiloksi)butanoil)oksi)-2-((((3-(dietilamino)propoksi)karbonil)oksi)metil)propil oktadeka-9,12-dienoat, poznat i kao 3-((4,4-bis(oktiloksi)butanoil)oksi)-2-((((3-(dietilamino)propoksi)karbonil)oksi)metil)propil (9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dienoat. Lipid A može biti prikazan kao:

[0076] Lipid A može se sintetisati u skladu sa WO2015/095340 (npr. str.84-86).

[0077] CCD lipid može biti Lipid B, koji je ((5-((dimetilamino)metil)-1,3-fenilen)bis(oksi))bis(oktan-8,1-dil)bis(dekanoat), takođe poznat kao ((5-((dimetilamino)metil)-1,3-fenilen)bis(oksi))bis(oktan-8,1-dil)bis(dekanoat). Lipid B može biti prikazan kao:

[0078] Lipid B može se sintetisati u skladu sa WO2014/136086 (npr. str.107-09). CCD lipid može biti Lipid C, koji je 2-((4-(((3-(dimetilamino)propoksi)karbonil)oksi)heksadekanoil)oksi)propan-1,3-dil (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(oktadeka-9,12-dienoat). Lipid C može biti prikazan kao:

[0079] CCD lipid može biti Lipid D, koji je 3-(((3-(dimetilamino)propoksi)karbonil)oksi)-13-(oktanoiloksi)tridecil 3-oktilundekanoat. Lipid D može biti prikazan kao:

[0080] Lipid C i Lipid D mogu se sintetisati u skladu sa WO2015/095340.

[0081] CCD lipid takođe može biti ekvivalent Lipidu A, Lipidu B, Lipidu C ili Lipidu D. CCD lipid može biti ekvivalent Lipidu A ili ekvivalent Lipidu B.

[0082] CCD lipidi pogodni za upotrebu u LNP formulacijama opisanima ovde su biorazgradivi in vivo. CCD lipidi imaju nisku toksičnost (npr. podnose se u životinjskim modelima bez neželjenih efekata u dozama većim ili jednakim od 10 mg/kg). LNP formulacije koje sadrže CCD lipid mogu uključivati one kod kojih se najmanje 75% CCD lipida uklanja iz plazme u roku od 8, 10, 12, 24 ili 48 sati, ili za 3, 4, 5, 6, 7 ili 10 dana. LNP formulacije koje sadrže CCD lipid mogu uključivati one kod kojih se najmanje 50% mRNK ili vodeće RNK uklanja iz plazme u roku od 8, 10, 12, 24 ili 48 sati, ili za 3, 4, 5, 6, 7 ili 10 dana. LNP formulacije koje sadrže CCD lipid mogu uključivati one kod kojih se najmanje 50% LNP uklanja iz plazme u roku od 8, 10, 12, 24 ili 48 sati, ili za 3, 4, 5, 6, 7 ili 10 dana, na primer merenjem lipida (npr. CCD lipida), RNK (npr. mRNK) ili proteinske komponente. Enkapsulirani lipid u poređenju sa slobodnim lipidom, RNK ili proteinskom komponentom LNP može se kvantifikovati.

[0083] Klirens lipida može se meriti prema metodama opisanim u literaturi. Videti Maier, M.A., et al. Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics. Mol. Ther.2013, 21(8), 1570-78 ("Maier"). Na primer, kod Maier, LNP-siRNK sistemi koji sadrže siRNK usmerenu na luciferazu primenjeni su kod mužjaka C57Bl/6 miševa starih šest do osam nedelja, u dozi od 0,3 mg/kg putem intravenske bolus injekcije u lateralnu repnu venu. Uzorkovanje krvi, jetre i slezine vršeno je u vremenskim tačkama 0,083; 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8; 24; 48; 96 i 168 sati nakon doziranja. Pre uzorkovanja tkiva, miševima je sprovedena perfuzija fiziološkim rastvorom, a uzorci krvi obrađeni su za izdvajanje plazme. Svi uzorci analizirani su metodom LC-MS. Dalje, Maier opisuje i proceduru za procenu toksičnosti nakon primene LNP-siRNK formulacija. Na primer, siRNK usmerena na luciferazu davana je u dozama od 0, 1, 3, 5 i 10 mg/kg (5 životinja po grupi) kao pojedinačna intravenska bolus injekcija zapremine 5 mL/kg kod mužjaka Sprague-Dawley pacova. Nakon 24 sata, iz jugularne vene svesnih životinja uzeto je oko 1 mL krvi, iz koje je izolovan serum. U 72. satu nakon doziranja, sve životinje su eutanazirane radi obdukcije. Izvršena je procena kliničkih znakova, telesne mase, biohemije seruma, mase organa i histopatologije. Iako se kod Maier opisuju metode za procenu LNP-siRNK formulacija, ove metode mogu se primeniti i za procenu eliminacije, farmakokinetike i toksičnosti formulacija opisanih u ovom dokumentu.

[0084] CCD lipidi dovode do povećane brzine eliminacije. Brzina eliminacije može se odnositi na eliminaciju lipida, na primer brzinu kojom se CCD lipid uklanja iz krvi, seruma ili plazme. Brzina eliminacije može se odnositi na eliminaciju RNK, na primer brzinu kojom se mRNK ili vodeća RNK uklanja iz krvi, seruma ili plazme. Brzina eliminacije može predstavljati brzinu kojom se LNP uklanja iz krvi, seruma ili plazme. Brzina eliminacije može predstavljati brzinu kojom se LNP uklanja iz tkiva, kao što je tkivo jetre ili slezine. Visoka brzina eliminacije može doprineti bezbednosnom profilu bez značajnih neželjenih efekata. CCD lipidi smanjuju akumulaciju LNP u cirkulaciji i tkivima. Smanjenje akumulacije LNP u cirkulaciji i tkivima može doprineti bezbednosnom profilu bez značajnih neželjenih efekata.

[0085] CCD lipidi opisani u ovom dokumentu mogu biti jonišući u zavisnosti od pH sredine u kojoj se nalaze. Na primer, u blago kiseloj sredini, CCD lipidi mogu biti protonisani i stoga nositi pozitivno naelektrisanje. Nasuprot tome, u blago bazičnoj sredini, kao što je krv u kojoj je pH približno 7,35, CCD lipidi mogu ostati neprotonisani i samim tim bez naelektrisanja. CCD lipidi iz ovog obelodanjivanja mogu biti protonisani pri pH vrednosti od najmanje približno 9. CCD lipidi iz ovog obelodanjivanja mogu biti protonisani pri pH vrednosti od najmanje približno 9. CCD lipidi iz ovog obelodanjivanja mogu biti protonisani pri pH vrednosti od najmanje približno 10.

[0086] Sposobnost CCD lipida da nosi električni naboj povezana je sa njegovim intrinzičnim pKa. Na primer, CCD lipidi opisani u ovom dokumentu mogu imati pKa u opsegu od približno 5,8 do 6,2. Ovo može biti korisno jer je pokazano da su katjonski lipidi sa pKa vrednostima između približno 5,1 i 7,4 efikasni za isporuku tereta formulacije u jetru. Takođe je pokazano da su katjonski lipidi sa pKa vrednostima između približno 5,3 i 6,4 efikasni za isporuku u tumore. Videti npr. WO 2014/136086.

Dodatni lipidi

[0087] „Neutralni lipidi“ za upotrebu u lipidnoj formulaciji prema ovom opisu su neutralni, elektroneutralni ili cviterjonski lipidi. Primeri neutralnih fosfolipida pogodnih za upotrebu prema ovom opisu uključuju, između ostalog 5-heptadecilbenzen-1,3-diol (rezorcinol), dipalmitoilfosfatidilholin (DPPC), distearoilfosfatidilholin (DSPC), fosfatidilholin (DOPC), dimiristoilfosfatidilholin (DMPC), fosfatidilholin (PLPC), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin (DAPC), fosfatidiletanolamin (PE), fosfatidilholin žumanca (EPC), dilaureoilfosfatidilholin (DLPC), dimiristoilfosfatidilholin (DMPC), 1-miristoil-2-palmitoil fosfatidilholin (MPPC), 1-palmitoil-2-miristoil fosfatidilholin (PMPC), 1-palmitoil-2-stearoil fosfatidilholin (PSPC), 1,2-diarahidil-sn-glicero-3-fosfatidilholin (DBPC), 1-stearoil-2-palmitoil fosfatidilholin (SPPC), 1,2-diejkosenoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin (DEPC), palmitoiloleoil fosfatidilholin (POPC), lizofosfatidilholin, dioleoilfosfatidiletanolamin (DOPE), dilinoleoilfosfatidilholin, distearoilfosfatidiletanolamin (DSPE), dimiristoilfosfatidiletanolamin (DMPE), dipalmitoilfosfatidiletanolamin (DPPE), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamin (POPE), lizofosfatidiletanolamin, kao i njihove kombinacije. Neutralni fosfolipid može biti izabran iz grupe koja uključuje distearoilfosfatidilholin (DSPC) i dimiristoilfosfatidiletanolamin (DMPE). Neutralni fosfolipid može biti distearoilfosfatidilholin (DSPC). Neutralni lipidi imaju ulogu u stabilizaciji i poboljšanju obrade LNP formulacija.

[0088] „Pomoćni lipidi“ su lipidi koji poboljšavaju transfekciju (npr. transfekciju nanočestice koja sadrži biološki aktivnu supstancu). Mehanizam delovanja pomoćnih lipida uključuje poboljšanje stabilnosti čestica. Pomoćni lipid može povećati membransku fuzogenost. Pomoćni lipid može biti iz grupe steroida, sterola ili alkil rezorcinola. Pomoćni lipidi pogodni za upotrebu uključuju, između ostalog, holesterol, 5-heptadecilresorcinol i holesterol hemisukcinat. Pomoćni lipid može biti holesterol. Pomoćni lipid može biti holesterol hemisukcinat.

[0089] „Stealth lipidi“ su lipidi koji utiču na dužinu vremena tokom kojeg nanočestice mogu postojati in vivo (npr. u krvi). Stealth lipidi mogu doprineti procesu formulacije, na primer smanjenjem agregacije čestica i kontrolom njihove veličine. Stealth lipidi koji se ovde koriste mogu modulisati farmakokinetička svojstva LNP formulacija. Stealth lipidi imaju hidrofilnu čeonu grupu povezanu sa lipidnom komponentom. Stealth lipidi pogodni za upotrebu u lipidnoj formulaciji prema ovom opisu i informacije o njihovoj biohemiji mogu se pronaći kod Romberg et al., Pharmaceutical Research, Vol.25, No.

1, 2008, pg.55-71 i Hoekstra et al., Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52. Dodatni pogodni PEG-lipidi opisani su, npr. u patentu WO 2006/007712.

[0090] Hidrofilna čeona grupa stealth lipida može sadržati polimernu komponentu izabranu iz polimera na bazi PEG (takođe poznat kao poli(etilen oksid)), poli(oksazolina), poli(vinil alkohola), poli(glicerola), poli(N-vinilpirolidona), poliamino kiselina, i poli[N-(2-hidroksipropil)metakrilamida].

[0091] Stealth lipidi mogu sadržati lipidnu komponentu. Lipidna komponenta stealth lipida može biti izvedena iz diacilglicerola ili diacilglicamida, uključujući one koji sadrže dialkilglicerolsku ili dialkilglicamidnu grupu, sa dužinom alkilnog lanca pojedinačno u rasponu od približno C4 do C40, zasićenih ili nezasićenih ugljenikovih atoma, pri čemu lanac može sadržati jednu ili više funkcionalnih grupa, kao što su na primer amidna ili estarska grupa. Dialkilglicerolska ili dialkilglicamidska grupa može dodatno sadržati jednu ili više supstituisanih alkilnih grupa.

[0092] Osim ako nije drugačije naznačeno, pojam „PEG“ kako je ovde korišćen označava bilo koji polietilen glikol ili drugi polialkilen etarski polimer. PEG može biti opcionalno supstituisan linearni ili razgranati polimer etilen-glikola ili etilen-oksida. PEG može biti nesupstituisan. PEG takođe može biti supstituisan npr.. sa jednom ili više alkilnih, alkoksilnih, acilnih, hidroksilnih ili arilnih grupa. Pojam može obuhvatati PEG kopolimere, kao što su PEG-poliuretan ili PEG-polipropilen (videti npr. J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and, biomedical applications (1992)); Alternativno, pojam može isključivati PEG kopolimere. PEG može imati molekulsku masu u rasponu od približno 130 do približno 50.000, od približno 150 do približno 30.000, od približno 150 do približno 20.000, od približno 150 do približno 15.000, od približno 150 do približno 10.000, od približno 150 do približno 6.000, od približno 150 do približno 5.000, od približno 150 do približno 4.000, od približno 150 do približno 3.000, od približno 300 do približno 3.000, od približno 1.000 do približno 3.000 ili od približno 1.500 do približno 2.500.

[0093] PEG (npr. konjugovan sa lipidom, kao što je stealth lipid) može biti tzv. „PEG-2K“, takođe poznat kao „PEG 2000“, sa prosečnom molekulskom masom od oko 2.000 daltona. PEG-2K je ovde predstavljen sledećom formulom (I), gde je n jednako 45, što znači da brojčano-prosečni stepen polimerizacije obuhvata oko 45 podjedinica.

Međutim, može se koristiti i drugi PEG poznati u oblasti, uključujući, npr. one gde brojčano-prosečni stepen polimerizacije obuhvata oko 23 podjedinice (n=23) i/ili 68 podjedinica (n=68). n može biti u opsegu od približno 30 do približno 60. n može biti u opsegu od približno 35 do približno 55. n može biti u opsegu od približno 40 do približno 50. n može biti u opsegu od približno 42 do približno 48. n može biti 45. Grupa R može biti izabrana iz vodonika (H), supstituisanih alkila, i nesupstituisanih alkila. R može biti nesupstituisani alkil. R može biti metil.

[0094] Stealth lipid može biti izabran iz sledećih jedinjenja: PEG-dilaureoilglicerol, PEG-dimiristoilgliserol (PEG-DMG) (kataloški broj GM-020, NOF, Tokio, Japan), PEG-dipalmitoilgliserol, PEG-distearoilgliserol (PEG-DSPE) (kataloški broj DSPE-020CN, NOF, Tokio, Japan), PEG-dilaureilglicamid, PEG-dimiristoilglicamid, PEG-dipalmitoilglicamid, PEG-distearoilglicamid, PEG-holesterol (1-[8'-(holest-5-en-3[beta]-oksi)karboksamido-3',6'-dioksooktanoil]karbamoil-[omega]-metilpolietilenglikol), PEG-DMB (3,4-ditetradeksoibenzoil-[omega]-metil-polietilenglikol etar), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi(polietilenglikol)-2000] (PEG2k-DMG) (kat. #880150P, Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, SAD), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi(polietilenglikol)-2000] (PEG2k-DSPE) (kat. #880120C, Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, SAD), 1,2-distearoilsn-glicerol, metoksipolietilenglikol (PEG2k-DSG; GS-020, NOF, Tokio, Japan), polietilenglikol-2000-dimetakrilat (PEG2k-DMA), 1,2-disteariloksipropil-3-amin-N-[metoksi(polietilenglikol)-2000] (PEG2k-DSA). Stealth lipid može biti PEG2k-DMG.

Stealth lipid može biti PEG2k-DSPE. Stealth lipid može biti PEG2k-DMA. Stealth lipid može biti PEG2k-DSA. Stealth lipid može biti PEG2k-C11. Stealth lipid može biti PEG2k-C14. Stealth lipid može biti PEG2k-C16. Stealth lipid može biti PEG2k-C18.

LNP formulacije

[0095] LNP može sadržati: (i) CCD lipid za enkapsulaciju i izlazak iz endozoma, (ii) neutralni lipid za stabilizaciju, (iii) pomoćni lipid, takođe za stabilizaciju, i (iv) stealth lipid.

[0096] Teret formulacije uključuje mRNK koja kodira Cas nukleazu, kao što je Cas9, i vodeću RNK ili nukleinsku kiselinu koja kodira vodeću RNK. LNP formulacija sadrži CCD lipid, izabran između: Lipida A, Lipida B, Lipida C ili Lipida D. CCD lipid može biti Lipid A. CCD lipid može biti Lipid B. LNP formulacija može sadržati CCD lipid, neutralni lipid, pomoćni lipid i stealth lipid. Pomoćni lipid može biti holesterol. Neutralni lipid može biti DSPC. Stealth lipid može biti PEG2k-DMG. LNP formulacija može sadržati Lipid A, pomoćni lipid, neutralni lipid i stealth lipid. LNP formulacija može sadržati CCD lipid, DSPC, holesterol i stealth lipid. LNP formulacija može sadržati stealth lipid koji sadrži PEG. CCD lipid je izabran iz grupe: Lipid A, Lipid B, Lipid C ili Lipid D. LNP formulacija može sadržati CCD lipid izabran iz Lipid A ili Lipid B, holesterol, DSPC i PEG2k-DMG.

[0097] LNP formulacija može sadržati CCD lipid i mRNK koja kodira Cas nukleazu. LNP formulacija može sadržati CCD lipid, mRNK koja kodira Cas nukleazu i najmanje jednu drugu lipidnu komponentu. U nekim formulacijama koje sadrže mRNK koja kodira Cas nukleazu, LNP može uključivati najmanje jednu drugu lipidnu komponentu izabranu iz pomoćnog lipida, neutralnog lipida ili stealth lipida. U određenim formulacijama koje sadrže mRNK koja kodira Cas nukleazu, pomoćni lipid može biti holesterol. U drugim formulacijama koje sadrže mRNK koja kodira Cas nukleazu, neutralni lipid može biti DSPC. U dodatnim formulacijama koje sadrže mRNK koja kodira Cas nukleazu, stealth lipid može biti PEG2k-DMG. LNP formulacija može sadržati CCD lipid, pomoćni lipid, neutralni lipid, stealth lipid, i mRNK koja kodira Cas nukleazu. U specifičnim formulacijama koje sadrže mRNK koja kodira Cas nukleazu, CCD lipid može biti izabran iz grupe: Lipid A, Lipid B, Lipid C ili Lipid D. U dodatnim formulacijama koje sadrže mRNK koja kodira Cas nukleazu, CCD lipid može biti izabran iz Lipid A, Lipid B, Lipid C ili Lipid D, pomoćni lipid može biti holesterol, neutralni lipid DSPC, a stealth lipid PEG2k-DMG. CCD lipid u formulacijama koje sadrže mRNK koja kodira Cas nukleazu može biti Lipid A. CCD lipid u formulacijama koje sadrže mRNK koja kodira Cas nukleazu može biti Lipid B. CCD lipid u formulacijama koje sadrže mRNK koja kodira Cas nukleazu može biti Lipid C. CCD lipid u formulacijama koje sadrže mRNK koja kodira Cas nukleazu može biti Lipid D.

[0098] LNP formulacija može sadržati CCD lipid i mRNK koja kodira Cas nukleazu klase 2. LNP formulacija može sadržati CCD lipid, mRNK koja kodira Cas nukleazu klase 2, i najmanje jednu drugu lipidnu komponentu. U nekim formulacijama koje sadrže mRNK za Cas nukleazu klase 2, LNP uključuje najmanje jednu drugu lipidnu komponentu izabranu između pomoćnog lipida, neutralnog lipida ili stealth lipida. U određenim formulacijama koje sadrže mRNK za Cas nukleazu klase 2, pomoćni lipid je holesterol. U drugim formulacijama koje sadrže mRNK za Cas nukleazu klase 2, neutralni lipid je DSPC. U dodatnim formulacijama koje sadrže mRNK za Cas nukleazu klase 2, stealth lipid može biti PEG2k-DMG. LNP formulacija može sadržati CCD lipid, pomoćni lipid, neutralni lipid, stealth lipid i mRNK za Cas nukleazu klase 2. U specifičnim formulacijama koje sadrže mRNK za Cas nukleazu klase 2, CCD lipid može biti izabran iz grupe: Lipid A, Lipid B, Lipid C ili Lipid D. U dodatnim formulacijama koje sadrže mRNK za Cas nukleazu klase 2, CCD lipid može biti izabran iz Lipid A, Lipid B, Lipid C ili Lipid D, pomoćni lipid može biti holesterol, neutralni lipid DSPC, a stealth lipid PEG2k-DMG. CCD lipid u formulacijama koje sadrže mRNK koja kodira Cas nukleazu klase 2 može biti Lipid A. CCD lipid u formulacijama koje sadrže mRNK koja kodira Cas nukleazu klase 2 može biti Lipid B. CCD lipid u formulacijama koje sadrže mRNK koja kodira Cas nukleazu klase 2 može biti Lipid C. CCD lipid u formulacijama koje sadrže mRNK koja kodira Cas nukleazu klase 2 može biti Lipid D.

[0099] LNP formulacija može sadržati vodeću RNK. LNP formulacija može sadržati CCD lipid, vodeću RNK, pomoćni lipid, neutralni lipid i stealth lipid. U određenim LNP formulacijama koje sadrže vodeću RNK, pomoćni lipid je holesterol. U drugim formulacijama koje sadrže vodeću RNK, neutralni lipid je DSPC. U dodatnim formulacijama koje sadrže vodeću RNK, stealth lipid može biti PEG2k-DMG ili PEG2k-C11. LNP formulacija sadrži Lipid A, Lipid B, Lipid C ili Lipid D, pomoćni lipid, neutralni lipid, stealth lipid i vodeću RNK. U određenim formulacijama koje sadrže vodeću RNK, CCD lipid je Lipid A. U određenim formulacijama koje sadrže vodeću RNK, CCD lipid je Lipid B. U određenim formulacijama koje sadrže vodeću RNK, CCD lipid je Lipid C. U određenim formulacijama koje sadrže vodeću RNK, CCD lipid je Lipid D. U dodatnim formulacijama koje sadrže vodeću RNK, CCD lipid je Lipid A, Lipid B, Lipid C ili Lipid D; pomoćni lipid je holesterol; neutralni lipid je DSPC; a stealth lipid je PEG2k-DMG.

[0100] LNP formulacija može sadržati odnos mRNK za Cas nukleazu klase 2 prema nukleinskoj kiselini gRNK u rasponu od približno 25:1 do približno 1:25. LNP formulacija može sadržati odnos mRNK za Cas nukleazu klase 2 prema nukleinskoj kiselini vodeće RNK u rasponu od približno 10:1 do približno 1:10. Kako je ovde izmereno, odnosi su izraženi po masi. LNP formulacija može sadržati odnos mRNK za Cas nukleazu klase 2 prema nukleinskoj kiselini vodeće RNK u rasponu od približno 5:1 do približno 1:5. LNP formulacija može sadržati odnos mRNK za Cas nukleazu klase 2 prema nukleinskoj kiselini vodeće RNK od približno 1:1. LNP formulacija može sadržati odnos mRNK za Cas nukleazu klase 2 prema nukleinskoj kiselini vodeće RNK u rasponu od približno 1:1 do približno 1:5. LNP formulacija može sadržati odnos mRNK za Cas nukleazu klase 2 prema nukleinskoj kiselini vodeće RNK od približno 10:1. LNP formulacija može sadržati odnos mRNK za Cas nukleazu klase 2 prema nukleinskoj kiselini vodeće RNK od približno 1:10. Odnos može biti približno 25:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5, 1:10 ili 1:25.

[0101] LNP formulacija može sadržati sgRNK. LNP formulacija može sadržati Cas9 sgRNK. LNP formulacija može sadržati Cpfl sgRNK. U nekim formulacijama koje sadrže sgRNK, LNP uključuje CCD lipid, pomoćni lipid, neutralni lipid i stealth lipid. U određenim formulacijama koje sadrže sgRNK, pomoćni lipid može biti holesterol. U drugim formulacijama koje sadrže sgRNK, neutralni lipid može biti DSPC. U dodatnim formulacijama koje sadrže sgRNK, stealth lipid može biti PEG2k-DMG ili PEG2k-C11. LNP formulacija može sadržati CCD lipid, pomoćni lipid, neutralni lipid, stealth lipid i sgRNK. U specifičnim formulacijama koje sadrže sgRNK, CCD lipid je Lipid A, Lipid B, Lipid C ili Lipid D. U dodatnim formulacijama koje sadrže sgRNK, CCD lipid je Lipid A, Lipid B, Lipid C ili Lipid D; pomoćni lipid može biti holesterol; neutralni lipid može biti DSPC; a stealth lipid može biti PEG2k-DMG.

[0102] LNP formulacija sadrži mRNK koja kodira Cas nukleazu i vodeću RNK, koja može biti sgRNK. LNP formulacija može sadržati CCD lipid, mRNK koja kodira Cas nukleazu, vodeću RNK, pomoćni lipid, neutralni lipid i stealth lipid. U određenim formulacijama koje sadrže mRNK koja kodira Cas nukleazu i vodeću RNK, pomoćni lipid može biti holesterol. U nekim formulacijama koje sadrže mRNK koja kodira Cas nukleazu i vodeću RNK, neutralni lipid može biti DSPC. U dodatnim formulacijama koje sadrže mRNK koja kodira Cas nukleazu i vodeću RNK, stealth lipid može biti PEG2k-DMG ili PEG2k-C11. LNP formulacija može sadržati CCD lipid, pomoćni lipid, neutralni lipid, stealth lipid, mRNK koja kodira Cas nukleazu i vodeću RNK. U specifičnim formulacijama koje sadrže mRNK koja kodira Cas nukleazu i vodeću RNK, CCD lipid može biti Lipid A, Lipid B, Lipid C ili Lipid D. U dodatnim formulacijama koje sadrže mRNK koja kodira Cas nukleazu i vodeću RNK, CCD lipid je Lipid A, Lipid B, Lipid C ili Lipid D; pomoćni lipid može biti holesterol; neutralni lipid može biti DSPC; a stealth lipid može biti PEG2k-DMG.

[0103] LNP formulacije opisane ovde mogu sadržati šablonsku nukleinsku kiselinu. Šablonska nukleinska kiselina može biti koformulisana sa mRNK koja kodira Cas nukleazu, kao što je mRNK za Cas nukleazu klase 2. Šablonska nukleinska kiselina može biti koformulisana sa vodećom RNK. Šablonska nukleinska kiselina može biti koformulisana i sa mRNK koja kodira Cas nukleazu i sa vodećom RNK. Šablonska nukleinska kiselina može biti formulisana odvojeno od mRNK koja kodira Cas nukleazu ili vodeće RNK. U takvim formulacijama, šablonska nukleinska kiselina može biti jednolančana ili dvolančana, u zavisnosti od željenog mehanizma popravke. Šablon može imati regione homologije sa ciljnom DNK ili sa sekvencama koje se nalaze u blizini ciljne DNK.

[0104] Ovim obelodanjivanjem takođe se obezbeđuju lipidne formulacije koje su definisane prema molarnim udelima komponentnih lipida u formulaciji. Mol-% CCD lipida je u rasponu od približno 30 mol-% do približno 60 mol-%. Mol-% CCD lipida može biti u rasponu od približno 35 mol-% do približno 55 mol-%. Mol-% CCD lipida može biti u rasponu od približno 40 mol-% do približno 50 mol-%. Mol-% CCD lipida može biti u rasponu od približno 42 mol-% do približno 47 mol-%. Mol-% CCD lipida može biti približno 45%. Mol-% CCD lipida u LNP seriji može odstupati za ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% ili ±2,5% od ciljne vrednosti mol-%. Varijabilnost između serija LNP može biti manja od 15%, manja od 10% ili manja od 5%.

[0105] Mol-% pomoćnog lipida je u rasponu od približno 30 mol-% do približno 60 mol-%. Mol-% pomoćnog lipida može biti u rasponu od približno 35 mol-% do približno 55 mol-%. Mol-% pomoćnog lipida može biti u rasponu od približno 40 mol-% do približno 50 mol-%. Mol-% pomoćnog lipida može biti u rasponu od približno 41 mol-% do približno 46 mol-%. Mol-% pomoćnog lipida može biti približno 44 mol-%. Mol-% pomoćnog lipida u LNP seriji može odstupati za ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% ili ±2,5% od ciljne vrednosti mol-%. Varijabilnost između serija LNP može biti manja od 15%, manja od 10% ili manja od 5%.

[0106] Mol-% neutralnog lipida je u rasponu od približno 1 mol-% do približno 20 mol-%. Mol-% neutralnog lipida može biti u rasponu od približno 5 mol-% do približno 15 mol-%. Mol-% neutralnog lipida može biti u rasponu od približno 7 mol-% do približno 12 mol-%. Mol-% neutralnog lipida može biti približno 9 mol-%. Mol-% neutralnog lipida u LNP seriji može odstupati za ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% ili ±2,5% od ciljne vrednosti mol-%. Varijabilnost između serija LNP može biti manja od 15%, manja od 10% ili manja od 5%.

[0107] Mol-% stealth lipida je u rasponu od približno 1 mol-% do približno 10 mol-%. Mol-% stealth lipida može biti u rasponu od približno 1 mol-% do približno 5 mol-%. Mol-% stealth lipida može biti u rasponu od približno 1 mol-% do približno 3 mol-%. Mol-% stealth lipida može biti približno 2 mol-%. Mol-% stealth lipida može biti približno 1 mol-%. Mol-% stealth lipida u LNP seriji može odstupati za ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% ili ±2,5% od ciljne vrednosti mol-%. Varijabilnost između serija LNP može biti manja od 15%, manja od 10% ili manja od 5%.

[0108] Ovim opisom se takođe obezbeđuju lipidne formulacije koje su opisane prema odnosu između pozitivno naelektrisanih aminskih grupa CCD lipida (N) i negativno naelektrisanih fosfatnih grupa (P) nukleinske kiseline koja se enkapsulira. Ovo se matematički može predstaviti jednačinom N/P. N/P odnos može biti u rasponu od približno 0,5 do približno 100. N/P odnos može biti u rasponu od približno 1 do približno 50. N/P odnos može biti u rasponu od približno 1 do približno 25. N/P odnos može biti u rasponu od približno 1 do približno 10. N/P odnos može biti u rasponu od približno 1 do približno 7. N/P odnos može biti u rasponu od približno 3 do približno 5. N/P odnos može biti u rasponu od približno 4 do približno 5. N/P odnos može biti približno 4. N/P odnos može biti približno 4,5. N/P odnos može biti približno 5.

[0109] LNP mogu biti formirane mešanjem vodenog rastvora RNK sa rastvorom lipida u organskom rastvaraču, npr.100% etanolu. Pogodni rastvori ili rastvarači uključuju ili mogu sadržati: vodu, PBS, Tris pufer, NaCl, citratni pufer, etanol, hloroforom, dietiletar, cikloheksan, tetrahidrofuran, metanol, izopropanol. Može se koristiti farmaceutski prihvatljiv pufer, npr. za in vivo primenu LNP formulacija. Pufer se može koristiti za održavanje pH formulacije koja sadrži LNP na pH 7,0 ili višem. Formulacija može imati pH u rasponu od približno 7,3 do približno 7,7 ili u rasponu od približno 7,4 do približno 7,6. Formulacija može imati pH približno 7,3, 7,4, 7,5, 7,6 ili 7,7. pH formulacije može se meriti pomoću mikro pH sonde. Formulacija može sadržati krioprotektant. Neiscrpni primeri krioprotektanata uključuju saharozu, trehalozu, glicerol, DMSO i etilen glikol.

[0112] LNP formulacije opisane ovde mogu imati veličinu u rasponu od približno 1 do približno 250 nm. LNP mogu imati veličinu od približno 10 do približno 200 nm. LNP mogu imati veličinu od približno 20 do približno 150 nm. LNP mogu imati veličinu od približno 50 do približno 150 nm. LNP mogu imati veličinu od približno 50 do približno 100 nm. LNP mogu imati veličinu od približno 50 do približno 120 nm. LNP mogu imati veličinu od približno 75 do približno 150 nm. LNP mogu imati veličinu od približno 30 do približno 200 nm. Osim ako nije drugačije naznačeno, sve pomenute veličine odnose se na prosečne veličine (prečnike) potpuno formiranih nanočestica, izmerene metodom dinamičkog rasipanja svetlosti pomoću uređaja Malvern Zetasizer. Uzorak nanočestica može biti razblažen u fosfatno-puferovanom rastvoru (PBS) tako da stopa brojanja iznosi približno 200-400 kcts. Podaci se mogu prikazati kao ponderisani prosek merenja intenziteta. LNP mogu biti formirane sa prosečnom efikasnošću enkapsulacije u rasponu od približno 50% do približno 100%. LNP mogu biti formirane sa prosečnom efikasnošću enkapsulacije u rasponu od približno 50% do približno 70%. LNP mogu biti formirane sa prosečnom efikasnošću enkapsulacije u rasponu od približno 70% do približno 90%. LNP mogu biti formirane sa prosečnom efikasnošću enkapsulacije u rasponu od približno 90% do približno 100%. LNP mogu biti formirane sa prosečnom efikasnošću enkapsulacije u rasponu od približno 75% do približno 95%.

Metode inženjeringa ćelija; inženjerisane ćelije

[0113] LNP formulacije opisane u ovom dokumentu mogu se koristiti u metodama za inženjering ćelija putem uređivanja gena, kako in vivo tako i in vitro.Metode mogu uključivati dovođenje ćelije u kontakt sa LNP formulacijom opisanom ovde. Ćelija može biti ćelija sisara. Ćelija može biti ćelija glodara. Ćelija može biti ljudska ćelija. Ćelija može biti ćelija jetre. Ćelija može biti ljudska ćelija jetre. Ćelija jetre može biti hepatocit. Hepatocit može biti ljudski hepatocit. Ćelija jetre može biti matična ćelija. Ljudska ćelija jetre može biti jetrena sinusoidalna endotelna ćelija (engl. Liver Sinusoidal Endothelial Cell, LSEC). Ljudska ćelija jetre može biti Kupffer-ova ćelija. Ljudska ćelija jetre može biti jetrena stelatna ćelija. Ljudska ćelija jetre može biti tumorska ćelija. Ljudska ćelija jetre može biti matična ćelija jetre. Ćelija može sadržati receptore koji se vezuju za ApoE.

[0114] Obezbeđene su inženjerisane ćelije, na primer inženjerisana ćelija dobijena iz bilo kog tipa ćelije navedenog u prethodnom stavu. Takve inženjerisane ćelije se proizvode u skladu sa metodama opisanim u ovom dokumentu. Inženjerisana ćelija može biti prisutna unutar tkiva ili organa, npr. u jetri subjekta.

[0115] U nekim od metoda i ćelija opisanih ovde, ćelija sadrži modifikaciju, na primer inserciju ili deleciju („indel“) ili supstituciju nukleotida u ciljnoj sekvenci. Modifikacija može obuhvatati inserciju 1, 2, 3, 4, 5 ili više nukleotida u ciljnu sekvencu. Modifikacija može obuhvatati inserciju od 1 ili 2 nukleotida u ciljnu sekvencu. Modifikacija može obuhvatati deleciju 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ili 25 ili više nukleotida u ciljnoj sekvenci. Modifikacija može obuhvatati deleciju od 1 ili 2 nukleotida u ciljnoj sekvenci. Modifikacija može obuhvatati „indel“ koji rezultuje frameshift mutacijom u ciljnoj sekvenci. Modifikacija može obuhvatati supstituciju 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ili 25 ili više nukleotida u ciljnoj sekvenci. Modifikacija može obuhvatati supstituciju od 1 ili 2 nukleotida u ciljnoj sekvenci. Modifikacija može obuhvatati jednu ili više izmena u vidu insercije, delecije ili supstitucije nukleotida koje nastaju inkorporacijom šablonske nukleinske kiseline, na primer bilo koje od šablonskih nukleinskih kiselina opisanih u ovom dokumentu.

[0116] Može se obezbediti populacija ćelija koja sadrži inženjerisane ćelije, na primer populacija ćelija koja sadrži ćelije inženjerisane u skladu sa metodama opisanim ovde. Populacija može sadržati inženjerisane ćelije uzgajane in vitro. Populacija može biti prisutna unutar tkiva ili organa, npr. u jetri subjekta. Najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% ili više ćelija u populaciji može biti inženjerski izmenjeno. Metod opisan ovde može rezultovati efikasnošću uređivanja od najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95%, pri čemu se efikasnost uređivanja definiše detekcijom „indel“ mutacija. Metod opisan ovde može rezultovati efikasnošću modifikacije DNK od najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95%, pri čemu se efikasnost modifikacije DNK definiše detekcijom promene u sekvenci, bilo putem insercije, delecije, supstitucije ili na drugi način. Metod opisan ovde može rezultovati nivoom efikasnosti uređivanja ili nivoom efikasnosti modifikacije DNK u rasponu od približno 5% do približno 100%, od približno 10% do približno 50%, od približno 20% do približno 100%, od približno 20% do približno 80%, od približno 40% do približno 100% ili od približno 40% do približno 80%.

[0117] U nekim od metoda i ćelija opisanih ovde, ćelije unutar populacije sadrže modifikaciju, npr. „indel“ ili supstituciju u ciljnoj sekvenci. Modifikacija može obuhvatati inserciju 1, 2, 3, 4, 5 ili više nukleotida u ciljnu sekvencu. Modifikacija može obuhvatati inserciju od 1 ili 2 nukleotida u ciljnu sekvencu. Modifikacija može obuhvatati deleciju 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ili 25 ili više nukleotida u ciljnoj sekvenci. Modifikacija može obuhvatati deleciju od 1 ili 2 nukleotida u ciljnoj sekvenci. Modifikacija može obuhvatati „indel“ koji rezultuje frameshift mutacijom u ciljnoj sekvenci. Najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% ili više inženjerisanih ćelija u populaciji može sadržati frameshift mutaciju. Modifikacija može obuhvatati supstituciju 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ili 25 ili više nukleotida u ciljnoj sekvenci. Modifikacija može obuhvatati supstituciju od 1 ili 2 nukleotida u ciljnoj sekvenci. Modifikacija može obuhvatati jednu ili više izmena u vidu insercije, delecije ili supstitucije nukleotida koje nastaju inkorporacijom šablonske nukleinske kiseline, na primer bilo koje od šablonskih nukleinskih kiselina opisanih u ovom dokumentu.

Metode lečenja

[0118] Pozivanje na metode lečenja u narednim paragrafima ovog opisa tumači se kao pozivanje na jedinjenja, farmaceutske formulacije i lekove prema ovom otkriću, za upotrebu u metodama lečenja ljudskog (ili životinjskog) organizma putem terapije (ili za in vivo dijagnostiku).

[0119] LNP formulacije opisane ovde mogu se koristiti za uređivanje gena in vivo i in vitro.Dakle, jedna ili više LNP formulacija opisanih ovde može se primeniti na subjekta kome je takva terapija potrebna. Terapijski efikasna količina formulacije opisane ovde može doći u kontakt sa ćelijom subjekta kome je takva terapija potrebna. Genetski inženjerisana ćelija može se proizvesti dovođenjem ćelije u kontakt sa LNP formulacijom opisanom u ovom dokumentu.

[0120] Metode mogu uključivati primenu tLNP formulacije na ćeliju povezanu sa poremećajem jetre. Metode mogu uključivati lečenje poremećaja jetre. Metode mogu uključivati dovođenje jetrene ćelije u kontakt sa LNP formulacijom. Metode mogu uključivati dovođenje hepatocita u kontakt sa LNP formulacijom. Metode mogu uključivati dovođenje ćelije koja vezuje ApoE u kontakt sa LNP formulacijom.

[0121] LNP formulacija koja sadrži mRNK koja kodira Cas nukleazu, gRNK i šablon može se primeniti na ćeliju, kao što je ćelija koja vezuje ApoE. U određenim slučajevima, LNP formulacija koja sadrži Cas nukleazu i sgRNK može se primeniti na ćeliju, kao što je ćelija koja vezuje ApoE. LNP formulacija koja sadrži mRNK koja kodira Cas nukleazu, gRNK i šablon može se primeniti na ćeliju jetre. U određenim slučajevima, LNP formulacija koja sadrži Cas nukleazu i sgRNK može se primeniti na ćeliju jetre. U nekim slučajevima, ćelija jetre može biti u telu subjekta. Subjekt može primiti jednu dozu LNP formulacije. U drugim primerima, subjekt može primiti više doza LNP formulacije. Kada se primenjuje više od jedne doze, doze se mogu davati u razmaku od približno 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 ili 28 dana; približno 2, 3, 4, 5 ili 6 meseci; ili približno 1, 2, 3, 4 ili 5 godina.

[0122] LNP formulacija koja sadrži mRNK koja kodira Cas nukleazu može se primeniti na ćeliju jetre (takođe nazvana jetrena ćelija), nakon čega sledi primena formulacije koja sadrži gRNK i opciono šablon. LNP formulacija koja sadrži mRNK koja kodira Cas nukleazu i gRNK može se primeniti na ćeliju jetre, nakon čega sledi primena formulacije koja sadrži šablon na ćeliju. LNP formulacija koja sadrži mRNK koja kodira Cas nukleazu može se primeniti na ćeliju jetre, nakon čega sledi sekvencijalna primena LNP formulacije koja sadrži gRNK, a zatim primena LNP formulacije koja sadrži šablon na tu ćeliju. Kada se LNP formulacija koja sadrži mRNK koja kodira Cas nukleazu primeni pre LNP formulacije koja sadrži gRNK, između ove dve primene može postojati vremenski razmak od približno 4, 6, 8, 12 ili 24 sata; ili 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 dana.

[0123] LNP formulacije se mogu koristiti za uređivanje gena koje rezultuje inaktivacijom gena (gene knockout). LNP formulacije se mogu koristiti za uređivanje gena koje rezultuje korekcijom gena. LNP formulacije se mogu koristiti za uređivanje ćelije koje rezultuje insercijom gena.

[0124] Primena LNP formulacija može rezultovati uređivanjem gena koje dovodi do postojanog odgovora. Na primer, primena može rezultovati trajanjem odgovora u trajanju od jednog dana, jednog meseca, jedne godine ili duže. U kontekstu ovog dokumenta, „trajanje odgovora“ znači da, nakon što su ćelije uređene pomoću LNP formulacije opisane ovde, rezultujuća modifikacija ostaje prisutna određeni vremenski period nakon primene LNP formulacije. Modifikacija se može detektovati merenjem nivoa ciljnog proteina. Modifikacija se može detektovati detekcijom ciljne DNK. Trajanje odgovora može biti najmanje 1 nedelja. Trajanje odgovora može biti najmanje 2 nedelje. Trajanje odgovora može biti najmanje 1 mesec. Trajanje odgovora može biti najmanje 2 meseca. Trajanje odgovora može biti najmanje 4 meseca. Trajanje odgovora može biti najmanje 6 meseci. Trajanje odgovora može biti približno 26 nedelja. Trajanje odgovora može biti najmanje 1 godina. Trajanje odgovora može biti najmanje 5 godina. Trajanje odgovora može biti najmanje 10 godina. Postojani odgovor može biti detektabilan nakon najmanje 6 meseci, bilo merenjem nivoa ciljnog proteina ili detekcijom ciljne DNK.

[0125] LNP formulacije se mogu primenjivati parenteralno. LNP formulacije se mogu primenjivati direktno u krvotok, u tkivo, u mišić ili u unutrašnji organ. Primena može biti sistemska, npr. putem injekcije ili infuzije. Primena može biti lokalna. Odgovarajući načini primene uključuju intravensku, intraarterijsku, intratekalnu, intraventrikularnu, intrauretralnu, intrasternalnu, intrakranijalnu, subretinalnu, intravitrealnu, intrakameralnu (u prednju očnu komoru), intramuskularnu, intrasinovijalnu i supkutanu primenu. Odgovarajući uređaji za primenu uključuju injektore sa iglom (uključujući mikroigle), injektore bez igle i tehnike infuzije.

[0126] LNP formulacije će se uobičajeno, ali ne nužno, primenjivati kao formulacija u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa. Pojam „ekscipijens“ obuhvata svaki sastojak osim jedinjenja opisanih u ovom dokumentu, drugih lipidnih komponenti i biološki aktivnog agensa. Ekscipijens može imati funkcionalnu (npr. kontrola brzine oslobađanja leka) i/ili nefunkcionalnu (npr. pomoć u preradi ili razblaživač) ulogu u formulaciji. Izbor ekscipijensa u velikoj meri zavisi od faktora kao što su način primene, uticaj ekscipijensa na rastvorljivost i stabilnost, i priroda oblika doziranja.

[0127] Parenteralne formulacije su obično vodeni ili uljani rastvori ili suspenzije. Kada je formulacija vodena, ekscipijensi mogu uključivati šećere (uključujući, između ostalog, glukozu, manitol, sorbitol itd.), soli, ugljene hidrate i pufer rastvore (po mogućstvu do pH između 3 i 9); međutim, za određene primene, formulacija može biti pogodnija kao sterilni nevodeni rastvor ili kao suvi oblik koji se koristi u kombinaciji sa odgovarajućim rastvaračem, kao što je sterilna, pirogena voda za injekcije (WFI).

[0128] Metode uređivanja gena mogu modifikovati ciljni gen za faktor VII. LNP formulacije mogu se primeniti na ćeliju jetre radi modifikacije gena za faktor VII. LNP formulacije se mogu koristiti za lečenje poremećaja jetre, kao što je deficit faktora VII.

Metode mogu modulirati aberantnu aktivnost faktora VII. LNP formulacija može se primeniti za lečenje ili prevenciju hemofilije, odnosno nemogućnosti kontrole zgrušavanja krvi. Videti, npr. Lapecorella, M. and Mariani, G. Factor VII deficiency: defining the clinical picture and optimizing therapeutic options. Haemophilia (2008), 14, 1170-1175. LNP formulacije mogu se primeniti za lečenje ili prevenciju trombofilije, stanja u kojem krv ima povećanu sklonost ka stvaranju ugrušaka.

[0129] Kada dođe do povrede tkiva, dolazi do formiranja ekvimolarnog kompleksa između zimogena faktora VII i tkivnog faktora, što dovodi do cepanja na poziciji 152 u sekvenci faktora VII, čime nastaje aktivirani faktor VII, odnosno faktor VIIa. Kompleks faktor VIIa/tkivni faktor vodi do koagulacije. Metode lečenja poremećaja povezanih sa faktorom VII uključuju metode za povećanje koagulacije faktora VIIa, metode za poboljšanje zgrušavanja krvi ili metode za poboljšanje koagulacionog profila krvi. Ove metode mogu se koristiti za primenu LNP formulacije subjektu sa deficitom faktora VII. Metode se takođe mogu koristiti za primenu LNP formulacije subjektu koji je prethodno lečen zbog deficita faktora VII, npr. rekombinantnim faktorom VIIa.

[0130] Metode uređivanja gena mogu modifikovati ciljni gen TTR. LNP formulacije se mogu koristiti za lečenje poremećaja povezanih sa ekspresijom TTR u jetri, kao što je amiloidoza. LNP formulacija može se primeniti za lečenje ili prevenciju amiloidoze, uključujući transtiretinsku amiloidozu. Videti npr. Patel, K. and Hawkins, P. Cardiac amyloidosis: where are we today? J. Intern. Med. (2008), 278, 126-144. Poremećaj povezan sa TTR može dovesti do akumulacije amiloidnih depozita. Zbog toga, metode lečenja ili prevencije poremećaja povezanog sa TTR uključuju metode za snižavanje nivoa TTR, metode za smanjenje proizvodnje TTR, metode za redukciju amiloidnih depozita, metode za lečenje nasledne transtiretinske amiloidoze, metode za lečenje nenasledne transtiretinske amiloidoze, kao i metode za delovanje na amiloidne depozite u srcu, autonomnim i perifernim nervima. Metode za lečenje ili prevenciju poremećaja povezanog sa TTR mogu uključivati primenu LNP formulacije subjektu kod kojeg su dijagnostikovani amiloidni depoziti. Metode se mogu koristiti za primenu LNP formulacije subjektu kome je potrebno smanjenje proizvodnje TTR. Metode uređivanja gena usmerene su na ciljni gen koji može biti izabran iz grupe SERPINA1, FVIII, FIX, SERPING1, KLKBl, KNGl, FXII, ASS1, ASL, BCKDHA, BCKDHB, G6PC, GO/HAO1, AGXT, PCCA, PCCB, OTC, LIPA, ABCB11, GALT, ATP7B i PAH.Metode uređivanja gena mogu se koristiti za lečenje subjekta koji boluje od bolesti iz sledeće grupe: deficit alfa-1-antitripsin, hemofilija A, hemofilija B, hereditarni angioedem (HAE), citrulinemija tip 1, argininosukcinska acidurija, bolest urina sa mirisom javorovog sirupa, bolest skladištenja glikogena, primarna hiperoksalurija tip 1, propionska acidemija, deficit ornitin transkarbamilaze, bolest skladištenja holesteril estara, progresivna porodična intrahepatična holestaza, galaktozemija, Vilsonova bolest i fenilketonurija.

[0131] Reči „jedan“, „neki“ ili „taj“, kada se koriste u kombinaciji sa izrazom „koji obuhvata“ u patentnim zahtevima i/ili opisu, mogu značiti „jedan“, ali su takođe u skladu sa značenjem „jedan ili više“, „najmanje jedan“ i „jedan ili više od jednog“. Upotreba reči „ili“ znači „i/ili“ osim ako nije drugačije naznačeno. Upotreba izraza „uključujući“ i „sadržavajući“, kao i njihovih oblika kao što su „uključuje“, „uključeno“, „sadrži“ i „sadržano“, nije ograničavajuća. Svi rasponi navedeni u ovoj prijavi uključuju i krajnje vrednosti osim ako nije drugačije navedeno.

PRIMERI

Primer 1. Materijali i metode.

Formulacija lipidnih nanočestica (LNP)

[0132] LNP su formulisane sa molarnim odnosom CCD lipidnog amina prema fosfatu RNK (N:P) od približno 4,5. Komponente lipidnih nanočestica rastvorene su u 100% etanolu u sledećim molarnim udelima: 45 mol-% (12,7 mM) CCD lipida (npr. Lipid A ili Lipid B); 44 mol-% (12,4 mM) pomoćnog lipida (npr. holesterol); 9 mol-% (2,53 mM) neutralnog lipida (npr. DSPC); i 2 mol-% (,563 mM) PEG (npr. PEG2k-DMG ili PEG2k-C11). RNK teret formulacije je rastvoren u acetatnom puferu koncentracije 50 mM, pH 4,5, pri čemu je koncentracija RNK tereta formulacije bila približno 0,45 mg/mL.

[0133] LNP su formirane mikrofluidnim mešanjem lipidnog i RNK rastvora pomoću uređaja Precision Nanosystems NanoAssemblr<™>Benchtop Instrument, u skladu sa protokolom proizvođača. Odnos vodenog i organskog rastvarača od 2:1 održavan je tokom mešanja korišćenjem različitih protoka. Nakon mešanja, LNP formulacije su sakupljene, razblažene u fosfatnom puferovanom rastvoru (PBS, približno 1:1), a zatim je preostali pufer zamenjen PBS-om (100-struki višak u odnosu na zapreminu uzorka), preko noći na 4°C uz blago mešanje, korišćenjem Slide-a-Lyzer<™>G2 dijalizne kasete od 10 kDa (ThermoFisher Scientific). Dobijena smeša je zatim filtrirana pomoću sterilnog filtera veličine 0,2 µm. Dobijeni filtrat je čuvan na temperaturi od 2-8°C. Izolovane LNP su karakterisane radi određivanja efikasnosti enkapsulacije, indeksa polidisperznosti i prosečne veličine čestica, kao što je opisano u nastavku.

u vodi. Za mRNK prečišćenu pomoću HPLC, nakon taloženja LiCl-om i rekonstitucije, mRNK je prečišćena pomoću RP-IP HPLC metode (videti, npr. Kariko, et al. Nucleic Acids Research, 2011, Vol.39, No.21 e142). Frakcije odabrane za objedinjavanje su kombinovane i desalinisane putem taloženja natrijum-acetatom i etanolom, kao što je opisano iznad. Za sve metode, koncentracija transkripta je određena merenjem apsorbancije pri 260 nm (Nanodrop), a transkript je analiziran kapilarnom elektroforezom pomoću Bioanalyzer uređaja (Agilent).

[0135] IVT metodom je takođe generisana sgRNK, sličnim postupkom. DNK šablon za sgRNK generisan je anelovanjem gornjeg oligonukleotida koji sadrži samo sekvencu promotera T7 RNK polimeraze i donjeg oligonukleotida koji sadrži šablon za sgRNK i komplementarnu sekvencu promotorskom regionu. Anealovani šablon je korišćen direktno u IVT reakciji pod sledećim uslovima: 125 nM šablona; 7,5 mM svakog od GTP, ATP, CTP i UTP; 5 U/µL T7 RNK polimeraze (NEB); 1 U/µL mišjeg RNaza inhibitora (NEB); 0,004 U/µL neorganske pirofosfataze iz E. coli (NEB) i 1x reakcioni pufer. Reakcija je inkubirana na 37°C tokom 8 sati, nakon čega je dodat TURBO DNase (ThermoFisher) do konačne koncentracije od 0,01 U/µL, i inkubacija je nastavljena još 30 minuta radi uklanjanja DNK šablona. Transkript sgRNK je pročišćen pomoću MegaClear Transcription Clean-up kompleta u skladu sa protokolom proizvođača (ThermoFisher). Koncentracija transkripta određena je apsorbancijom pri 260 nm (Nanodrop), a transkript je analiziran metodom PAGE elektroforeze.

Analitika formulacije

[0136] LNP formulacije su analizirane radi određivanja prosečne veličine čestica, polidisperznosti (pdi), ukupnog sadržaja RNK i efikasnosti enkapsulacije RNK. Prosečna veličina čestica i polidisperznost mereni su dinamičkim rasipanjem svetlosti (DLS) pomoću uređaja Malvern Zetasizer DLS. LNP uzorci su razblaženi 30X u PBS pre merenja DLS metodom. Prikazana je Z-prosečna veličina (Z-average diameter), koja predstavlja intenzitetno zasnovano merenje prosečne veličine čestica, zajedno sa vrednošću pdi.

[0137] Za određivanje ukupne koncentracije RNK i efikasnosti enkapsulacije korišćen je fluorescentni test. LNP su razblažene 75X u 1x TE puferu kako bi se nalazile unutar linearnog opsega boje RiboGreen<®>(ThermoFisher Scientific, kataloški broj R11491).

50 µL razblaženih LNP dodatno je pomešano sa 50 µL 1x TE pufera ili 1x TE pufera sa 0,2% Triton X-100, u duplikatima. Uzorci su inkubirani na 37°C tokom 10 minuta kako bi Triton potpuno disruptovao LNP i omogućio interakciju ukupne RNK sa bojom RiboGreen<®>. Uzorci za standardnu krivu pripremljeni su korišćenjem početnog rastvora RNK koji je upotrebljen za pravljenje LNP, prateći iste korake. Razblažena RiboGreen<®>boja (100 µL, 100X u 1x TE puferu, prema uputstvu proizvođača) zatim je dodata svakom uzorku i ostavljena da inkubira 10 minuta na sobnoj temperaturi, zaštićeno od svetlosti. Za očitavanje uzoraka korišćen je SpectraMax M5 čitač mikrotitarskih ploča (Molecular Devices), sa podešenim talasnim dužinama za pobudu, automatsko odsecanje i emisiju na 488 nm, 515 nm i 525 nm, redom. Efikasnost enkapsulacije (%EE) izračunata je prema sledećoj jednačini:

gde je Fluorescence @ 525 nm - triton prosečna vrednost fluorescencije za uzorak bez Tritona, a Fluorescence @ 525 nm triton prosečna vrednost fluorescencije za uzorak sa Tritonom. Ukupna koncentracija RNK određena je korišćenjem linearne standardne krive i prosečne fluorescencije za uzorak sa Tritonom.

[0138] Ista procedura može se koristiti za određivanje efikasnosti enkapsulacije DNK tereta formulacije. Za jednolančanu DNK može se koristiti boja Oligreen, a za dvolančanu DNK boja Picogreen.

[0139] Vrednosti prosečne veličine čestica, polidisperznosti i %EE prikazane su u tabeli 1 u nastavku, za različite LNP formulacije.

Tabela 1. Rezime podataka o LNP formulacijama

T7E1 test

[0140] T7E1 test je korišćen u nekim primerima za detekciju mutacionih događaja u genomskoj DNK, kao što su insercije, delecije i supstitucije nastale putem nehomolognog spajanja krajeva (NHEJ) nakon cepanja DNK pomoću Cas9 (Videti npr. Cho et al., Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology.2013; 31, 230-232).

[0141] Genomske DNK regije ciljane pomoću CRISPR/Cas9 sistema amplifikovane su PCR metodom, denaturisane na 95°C tokom 10 minuta, a zatim ponovo anealovane spuštanjem temperature sa 95°C na 25°C brzinom od 0,5°C u sekundi. Kombinacija DNK za formiranje heterodupleksa ukazala je na prisustvo mutacija u amplifikovanom regionu. Ponovo anealovani heterodupleksi zatim su digestovani bakteriofagnom resolvazom T7E1 (New England Biolabs) na 37°C tokom 25 minuta ili duže, radi generisanja dvostrukolančanih prekida na mestima gde je T7E1 nukleaza prepoznala nepodudaranja. Rezultujući DNK fragmenti analizirani su pomoću Fragment Analyzer uređaja i kvantifikovani radi procene efikasnosti uređivanja. Za kvantitativnu analizu efikasnosti uređivanja korišćeno je sekvenciranje sledeće generacije (Next-Generation Sequencing), kako je opisano u ovom dokumentu.

Sekvenciranje naredne generacije („NGS”) i analiza

Efikasnosti ciljanog cepanja

[0142] Radi kvantitativnog određivanja efikasnosti uređivanja na ciljanoj lokaciji u genomu, korišćeno je duboko sekvenciranje kako bi se identifikovalo prisustvo insercija i delecija nastalih tokom procesa uređivanja gena.

[0143] PCR prajmeri su dizajnirani oko ciljne lokacije (npr. TTR, FVII), a genomska regija od interesa je amplifikovana. Sekvence prajmera date su u nastavku. Dodatni PCR je sproveden u skladu sa protokolom proizvođača (Illumina) radi dodavanja potrebne hemije za sekvenciranje. Amplikoni su sekvencirani pomoću uređaja Illumina MiSeq. Dobijeni očitani nizovi poravnati su prema referentnom ljudskom genomu (npr. hg38), nakon eliminacije nizova niskog kvaliteta. Rezultujući fajlovi sa očitanim sekvencama mapirani su u odnosu na referentni genom (BAM fajlovi), pri čemu su odabrani oni očitani nizovi koji preklapaju ciljanu regiju, a zatim je izračunat broj nizova divljeg tipa u odnosu na broj nizova koji sadrže inserciju, supstituciju ili deleciju. Procenat uređivanja (npr. „efikasnost uređivanja” ili „procenat uređivanja”) definisan je kao ukupan broj nizova sa insercijama ili delecijama podeljen sa ukupnim brojem očitanih sekvenci, uključujući i sekvence divljeg tipa.

Isporuka LNP in vitro

[0144] Mišje ćelijske linije (Neuro2A i Hepa1.6) su kultivisane u DMEM podlozi dopunjenoj sa 10% fetalnog goveđeg seruma i zasejane su u gustini od 15.000 ćelija/jažici 24 sata pre transfekcije sa LNP formulacijom, 18-24 sata pre lize i analize kako je ovde opisano (npr. ekspresija reportera, T7E1 test, NGS). Primarni mišji hepatociti (Invitrogen) su kultivisani u gustini od 15.000 ćelija po jažici u medijumu za zasejavanje hepatocita (Invitrogen), koristeći ploče sa 96 jažica obložene kolagenom. Nakon 5 sati, medijum za zasejavanje je uklonjen i zamenjen medijumom za održavanje hepatocita koji je sadržao LNP i 3% mišjeg seruma (prethodno inkubiranog 5 minuta na 37°C). Ćelije su transfektovane 42-48 sati pre lize i analize, kako je ovde opisano (npr. T7E1 test, NGS). I za ćelijske linije i za primarne hepatocite, LNP je razblažen i dodat ćelijama počevši od 100 ng Cas9 mRNK i približno 30 nM vodeće RNK po jažici, vršeći serijska razblaženja na polu-logaritamski način do 0,1 ng Cas9 mRNK i 0,03 nM vodeće RNK po jažici.

Isporuka LNP in vivo

[0145] U svakoj studiji korišćene su ženke CD-1 miševa, starosti od 6 do 10 nedelja. Životinje su izvagane i grupisane prema telesnoj težini radi pripreme rastvora za doziranje na osnovu prosečne težine grupe. LNP su dozirani putem lateralne repne vene u zapremini od 0,2 mL po životinji (približno 10 mL po kilogramu telesne težine). Životinje su posmatrane približno 6 sati nakon doze radi uočavanja neželjenih efekata. Telesna težina je merena dvadeset četiri sata nakon primene, a životinje su eutanazirane u različitim vremenskim tačkama eksangvinacijom putem srčane punkcije pod izofluranskom anestezijom. Krv je sakupljena u epruvete sa separatorom seruma ili u epruvete koje sadrže puferovani natrijum citrat za plazmu, kako je ovde opisano. Za studije koje uključuju in vivo uređivanje, tkivo jetre je sakupljeno iz medijalnog režnja ili iz tri nezavisna režnja (npr. desnog medijalnog, levog medijalnog i levog lateralnog režnja) od svake životinje za ekstrakciju i analizu DNK. Za neke studije, takođe je sakupljeno tkivo slezine.

Izolacija genomske DNK

[0146] Genomska DNK je ekstrahovana iz 10 mg tkiva korišćenjem kompleta Invitrogen PureLink Genomic DNA Kit (Kat. K1820-02) prema protokolu proizvođača, što uključuje homogenizaciju tkiva u puferu za lizu (približno 200 µL/10 mg tkiva) i taloženje DNK. Svi uzorci DNK su normalizovani na koncentraciju od 100 ng/µL za PCR i naknadnu NGS analizu, kako je ovde opisano.

Transtiretinska (TTR) ELISA analiza

[0147] Krv je sakupljena i serum je izolovan kao što je naznačeno. Ukupni nivoi TTR u serumu su određeni korišćenjem kompleta Mouse Prealbumin (Transthyretin) ELISA Kit (Aviva Systems Biology, Kat. OKIA00111). Reagensi i standardi iz kompleta su pripremljeni prema protokolu proizvođača. Mišji serum je razblažen do konačnog razblaženja od 10.000 puta sa 1x razređivačem za test. To je postignuto sprovođenjem dva uzastopna 50-struka razblaženja, što je rezultovalo 2.500-strukim razblaženjem. Konačni korak razblaženja od 4 puta je sproveden za ukupno razblaženje uzorka od 10.000 puta. Oba razblaženja standardne krive (po 100 µL) i razblaženi uzorci seruma su dodati u svaku jažicu ELISA ploče prethodno obložene vezujućim antitelom. Ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi 30 minuta pre pranja. Konjugat enzim-antitelo (100 µL po jažici) je dodat za inkubaciju od 20 minuta. Nevezani konjugat antitela je uklonjen i ploča je ponovo oprana pre dodavanja hromogene supstratne otopine. Ploča je inkubirana 10 minuta pre dodavanja 100 µL rastvora za zaustavljanje, npr. sumporne kiseline (približno 0,3 M). Ploča je očitana na SpectraMax M5 čitaču ploča pri apsorbanciji od 450 nm. Nivoi TTR u serumu su izračunati pomoću SoftMax Pro softvera ver.6.4.2 korišćenjem logističke krive sa četiri parametra sa standardne krive. Konačne vrednosti seruma su korigovane za razblaženje u testu.

Test aktivnosti Faktora-VII (FVII)

[0148] Krv je sakupljena za plazmu kao što je naznačeno. Nivoi aktivnosti Faktora VII u plazmi mereni su korišćenjem test kompleta BIOPHEN FVII (Anaria Diagnostics, Kat. A221304). Reagensi iz kompleta su pripremljeni prema protokolu proizvođača. Plazma je razblažena 10.000 puta puferom za razblaživanje uzoraka iz kompleta, sprovođenjem dva uzastopna 50-struka razblaženja što je rezultovalo 2.500-strukim razblaženjem. Konačni korak razblaženja od 4 puta je sproveden za ukupno razblaženje uzorka od 10.000 puta. Razblaženi uzorak (30 µL) je dodat reagensu 1 iz kompleta (30 µL). Zatim je reagens 2 iz kompleta (60 µL) dodat na ploču, koja je potom inkubirana na 37°C tokom 7 minuta. Reagens 3 iz kompleta (60 µL) je zatim dodat na ploču i ploča je inkubirana dodatnih 5 minuta na 37°C, pre dodavanja sirćetne kiseline (20% v/v u vodi, 60 µL) kako bi se zaustavila enzimska reakcija. Ploča je očitana na SoftMax M5 čitaču ploča pri 405 nM. Relativne vrednosti FVII aktivnosti su izračunate na osnovu kalibracione krive pripremljene iz plazme kontrolnih životinja i prikazane su kao procenat kontrole vehikuluma.

Primer 2. In vitro isporuka eGFP mRNK enkapsuliranih LNP formulacija.

[0149] LNP formulacije koje sadrže mRNK koja kodira eGFP (TriLink, Kat. L-6101) su pripremljene kao što je opisano u primeru 1. Komponente svakog LNP preparata uključuju CCD lipid (45 mol-%), holesterol (44 mol-%), DSPC (9 mol-%) i PEG2k-DMG ili PEG2k-C11 (2 mol-%). LNP-002, -006, -007, -010 i -011 uključuju Lipid A kao CCD lipid, dok LNP-012 i -013 uključuju Lipid B kao CCD lipid. LNP-002, -010 i -012 uključuju PEG2k-DMG, a LNP-006, -007, -011 i -013 uključuju PEG2k-C11. Detalji za LNP su navedeni u tabeli 1, uključujući prosečnu veličinu čestica, polidisperznost i efikasnost enkapsulacije. LNP formulacije su isporučene mišjoj hepatocitnoj ćelijskoj liniji (Hepa1.6) kao što je opisano u primeru 1, sa ukupnim količinama isporučene eGFP mRNK od 100 ng ili 500 ng po jažici, za svaki LNP. Ćelije su inkubirane sa LNP formulacijama približno 18 sati, a ekspresija eGFP je merena korišćenjem analizatora CytoFLEX Cell Analyzer (Beckman Coulter).

[0150] Kao što je prikazano na Sl.1, ekspresija eGFP je uočena za svaku formulaciju. LNP formulacije koje sadrže Lipid A (LNP-002, -006, -007, -010 i -011) uspešno su isporučile eGFP mRNK. LNP formulacije koje sadrže Lipid B (LNP-012 i -013) takođe su isporučile eGFP mRNK. LNP formulacije koje uključuju PEG2k-C11 i PEG2k-DMG stealth lipide efikasno isporučuju mRNK u ovim eksperimentima, demonstrirajući in vitro isporuku mRNK mišjoj hepatocitnoj ćelijskoj liniji korišćenjem LNP formulacija.

Primer 3. In vivo isporuka gLUC mRNK enkapsuliranih LNP formulacija.

[0151] LNP formulacije koje sadrže mRNK koja kodira Gaussia luciferazu (gLUC) (TriLink, Kat. L-6123) su pripremljeni kao što je opisano u primeru 1 i testirani za in vivo isporuku mRNK kod životinja.Komponente svakog LNP preparata uključuju CCD lipid (45 mol-%), holesterol (44 mol-%), DSPC (9 mol-%) i PEG2k-DMG (2 mol-%). LNP-014 je uključivao Lipid A, dok je LNP-015 uključivao Lipid B. Detalji za ove formulacije su navedeni u tabeli 1, kao što su prosečna veličina čestica, polidisperznost i efikasnost enkapsulacije. Doze gLUC mRNK od 0,1 mg/kg i 0,3 mg/kg isporučene su sa svakom LNP formulacijom. Životinje su eutanazirane 24 sata kasnije, sa sakupljanjem krvi i izolacijom seruma izvedenim kao što je opisano u primeru 1. Ekspresija luciferaze u serumu je merena korišćenjem kompleta Pierce<™>Gaussia Luciferase Flash Assay Kit (ThermoFisher Scientific, kataloški broj 16158) prema protokolu proizvođača.

[0152] Kao što je prikazano na Sl.2, povećanja ekspresije gLUC zavisna od doze su uočena za svaku životinju (n=5 za svaku grupu) u poređenju sa PBS kontrolom. LNP formulacije koje su obuhvatale bilo Lipid A ili Lipid B pokazali su efikasnu in vivo isporuku i ekspresiju mRNK, mereno aktivnošću luciferaze.

Primer 4. In vivo isporuka i uređivanje uz korišćenje LNP formulacija sa enkapsuliranom Cas9 mRNK (mRNK-LNP) i LNP formulacija sa dvostruko enkapsuliranom vodećom RNK (dgRNK-LNP).

[0153] LNP formulacije za isporuku CRISPR/Cas RNK komponenti (npr. gRNK i mRNK koja kodira Cas9) za in vivo uređivanje u jetri testirane su na CD-1 miševima. U ovim eksperimentima, dgRNK i mRNK su formulisane odvojeno.

[0154] LNP formulacije su pripremljene sa in vitro transkribovanom Cas9 mRNK i hemijski modifikovanom dgRNK (usmerenom na TTR ili FVII), odvojeno, kako je opisano u primeru 1. dgRNK molekuli korišćeni u ovom primeru hemijski su sintetisani i nabavljeni od komercijalnih dobavljača, s tim da su fosforotioatne veze postavljene između tri terminalna nukleotida na oba 5' i 3' kraja crRNK i trRNK koji zajedno čine dvostruki vodič. Komponente svakog LNP preparata (LNP-093, -094, -095, -096 i -097) uključuju CCD lipid (Lipid A) (45 mol-%), holesterol (44 mol-%), DSPC (9 mol-%) i PEG2k-DMG (2 mol-%). Detalji za ove formulacije dati su u tabeli 1, uključujući prosečnu veličinu čestica, polidisperznost i efikasnost enkapsulacije. Korišćena su dva različita režima doziranja: (1) kombinovanje mRNK-LNP formulacije (LNP-097) i dgRNK-LNP formulacije (LNP-093, -094, -095 ili -096) u jednakim količinama (po masi RNK) i primena kombinovane formulacije tokom dva uzastopna dana (svakog dana primenjivano je po 1 mg/kg svake RNK-komponente, ukupno 2 mg/kg); ili (2) primena mRNK-LNP formulacije (LNP-097) četiri sata pre primene dgRNK-LNP formulacije (LNP-093, -094, -095 i -096), takođe tokom dva uzastopna dana (svaka formulacija primenjivana u dozi od 1 mg/kg). Životinje su eutanazirane pet dana nakon prve doze u svakoj grupi. Pored poređenja sa kontrolnom grupom (životinje koje su primale PBS), svaka eksperimentalna grupa imala je internu kontrolu za sekvenciranje, a PCR reakcije za NGS analizu, kako je opisano u primeru 1, sprovedene su za oba cilja kod svake životinje (n = 3 po grupi). Genomska DNK iz jetre je izolovana i analizirana pomoću NGS metode, kao što je opisano u primeru 1.

[0155] Kao što je prikazano na Sl.3A i 3B, in vivo uređivanje (približno 1,8%-2,8%) je zapaženo u jetrama životinja koje su primile LNP formulacije usmerene na FVII, bilo putem istovremenog doziranja (A1 (LNP-093/-097) ili A2 (LNP-094/-097)) ili prethodnog doziranja (A3 (LNP-093/-097)). Životinje koje su primile LNP formulacije koje ciljaju TTR pokazale su približno 2%-4,5% uređivanja u jetrama životinja, pri istovremenom doziranju dgRNK sa Cas9 mRNK (B1 (LNP-095/LNP-097) ili B2 (LNP-096/-097)) ili pri prethodnom doziranju (B3 (LNP-095/-097) ili B4 (LNP-096/-097)). Analize seruma i plazme su sprovedene za sve životinje, kao što je opisano u primeru 1, pri čemu nijedna životinja nije pokazala statistički značajne razlike (u poređenju sa životinjama koje su primile PBS) ni u ukupnom nivou TTR u serumu ni u aktivnosti FVII u plazmi (podaci nisu prikazani).

Primer 5. In vitro i in vivo isporuka i uređivanje pomoću dgRNK-LNP formulacija i IVT sgRNK-LNP formulacija.

[0156] Ispitana je efikasnost LNP formulacija koje sadrže hemijski modifikovanu dgRNK i LNP formulacija koje sadrže in vitro transkribovanu (IVT) sgRNK, u kontekstu istovremenog doziranja sa Cas9 mRNK-LNP.

[0157] LNP-115, -116, -117, -120, -121 i -123 su formulisani u skladu sa primerom 1, a detalji o konkretnim formulacijama dati su u tabeli 1. Formulacije iz ovog primera testirane su za isporuku u ćelije Neuro2A, korišćenjem postupka opisanog u primeru 1.

[0158] LNP-121 (gRNK) i LNP-120 (Cas9 mRNK) su pomešani i primenjeni pri koncentracijama gRNK od 152 nM, 76 nM i 38 nM, uz mRNK u količinama od 570 ng, 285 ng i 142 ng po jažici, redom; LNP-123 (gRNK) i LNP-120 su pomešani i primenjeni pri koncentracijama gRNK od 156 nM, 78 nM i 39 nM, uz mRNK u količinama od 528 ng, 264 ng i 132 ng po jažici, redom; i LNP-116 (gRNK) je pomešan sa LNP-120 (Cas9 mRNK) i primenjen pri koncentracijama gRNK od 124 nM, 62 nM i 31 nM, uz mRNK u količinama od 460 ng, 229 ng i 114 ng po jažici, redom.

[0159] LNP-121 je primenjen pri koncentracijama gRNK od 198 nM, 99 nM i 49,5 nM; LNP-123 pri koncentracijama gRNK od 189 nM, 94,5 nM i 47 nM; a LNP-116 pri koncentracijama gRNK od 124 nM, 62 nM i 31 nM, dok je Cas9 mRNK (100 ng po jažici) dodat u eksperimente pomoću LF2K, u skladu sa uputstvom proizvođača. Uređivanje je zapaženo u uzorcima koji su uključivali istovremeno doziranje IVT sgRNK-LNP (LNP-123) sa Cas9 mRNK, korišćenjem bilo LNP (LNP-120) ili LF2K, kao i sa hemijski modifikovanom dgRNK pri testiranim koncentracijama gRNK (LNP-121).

[0160] Formulacije u ovom primeru su zatim testirane in vivo. Životinjama je, kao što je opisano u primeru 1, davana mešavina Cas9 mRNK-LNP i jednog od gRNK-LNP-ova (1 mg/kg svake formulacije, svakog dana), tokom dva uzastopna dana, pri čemu je jedna formulacija bila dozirana samo jedan dan (n = 5 po grupi). Životinje su eutanazirane 6 dana nakon prve doze (odnosno 7 dana u grupi koja je primila samo jednu dozu), a jetreno tkivo je prikupljeno i analizirano pomoću NGS metode, kao što je opisano u primeru 1.

[0161] Kao što je prikazano na Sl.4A, isporuka i pojedinačnih i dvostrukih doza bila je efikasna. Nije uočena statistički značajna razlika između grupe koja je primila jednu dozu u jednom danu (LNP-121 i LNP-120; C na Sl.4A) i grupe koja je primila dve doze u dva uzastopna dana pri istovremenom doziranju Cas9 mRNK-LNP sa hemijski modifikovanim dgRNK-LNP-ovima (LNP-116 i LNP-120, A na Sl.4A; LNP-121 i LNP-120, B na Sl.4B). Životinje koje su primile Cas9 mRNK-LNP istovremeno dozirane sa nemodifikovanim IVT sgRNK-LNP-ovima (LNP-123 i LNP-120, D na Sl.4B) pokazale su relativno niže nivoe uređivanja u poređenju sa dgRNK-LNP-ovima korišćenim u ovom primeru (Sl. 4B). Ovi eksperimenti potvrđuju da LNP-ovi koji sadrže modifikovanu dgRNK ili IVT sgRNK omogućavaju in vitro i in vivo uređivanje kada se istovremeno doziraju sa Cas9 mRNK-LNP-ovima. Nivoi in vivo uređivanja uočenih pri upotrebi LNP-ova koji sadrže IVT sgRNK u ovom eksperimentu mogu biti pod uticajem nečistoća u izolovanoj IVT sgRNK.

Primer 6. In vitro i in vivo isporuka i uređivanje pomoću modifikovanih dgRNK-LNP-ova ili modifikovanih sgRNK-LNP-ova.

[0162] LNP-ovi koji sadrže hemijski modifikovanu dgRNK i LNP-ovi koji sadrže hemijski modifikovanu sgRNK takođe su testirani pri istovremenom doziranju sa Cas9 mRNK-LNP-ovima.

[0163] LNP formulacije su formulisane sa hemijski modifikovanom dgRNK (koja cilja TTR ili FVII), hemijski modifikovanom sgRNK (koja cilja TTR ili FVII) i IVT Cas9 mRNK, kao što je opisano u primeru 1. dgRNK u ovom primeru su hemijski sintetisane i nabavljene od komercijalnih dobavljača, s fosforotioatnim vezama između tri terminalne nukleobaze na 5' i 3' krajevima i crRNK i trRNK koje čine dvostruki vodič. sgRNK u ovom primeru takođe je bila hemijski sintetisana i nabavljena od komercijalnog dobavljača, sa 2'-O-metil modifikacijama i fosforotioatnim vezama na i između tri terminalne nukleobaze na 5' i 3' krajevima sgRNK. Komponente svakog LNP preparata uključuju CCD lipid (Lipid A, 45 mol-%), holesterol (44 mol-%), DSPC (9 mol-%) i PEG2k-DMG (2 mol-%). LNP-136, -137, -138, -139 i -140 su korišćeni u ovim eksperimentima.

[0164] Detalji su dati u tabeli 1, uključujući prosečnu veličinu čestica, polidisperznost i efikasnost enkapsulacije.

[0165] Formulacije iz ovog primera testirane su za isporuku u ćelije Neuro2A, kao što je opisano u primeru 1. Ćelije su ko-transfektovane vodećom LNP formulacijom i Cas9 mRNK LNP formulacijom dodavanjem svake formulacije direktno u medijum za ćelijsku kulturu, čime su postignute koncentracije navedene u tabeli 2, a procenat uređivanja je utvrđen T7E1 testom, kao što je opisano u primeru 1. Na Sl. 5 oznake predstavljaju formulacije, kako je opisano u tabeli 2.

Tabela 2. Formulacije korišćene u primeru 6

[0166] Velika povećanja u uređivanju su izmerena za obe mete prilikom upotrebe hemijski modifikovanih sgRNK-LNP-ova ko-transfektovanih sa Cas9 mRNK-LNP-ovima, u poređenju sa testiranim dgRNK-LNP formulacijama (Sl. 5). Hemijski modifikovani sgRNK-LNP-ovi ko-transfektovani sa Cas9 mRNK-LNP-ovima (LNP-138 i -139, Sl.5) doveli su do približno 35-50% uređivanja u ćelijama pri ciljanju FVII i 65-70% uređivanja pri ciljanju TTR.

[0167] Formulacije u ovom primeru zatim su testirane in vivo.Životinjama je, kao što je opisano u primeru 1, primenjena mešavina Cas9 mRNK-LNP formulacije (LNP-140) i jedne od testiranih gRNK-LNP formulacija (LNP-136, -137, -138 i -139), pri čemu je svaka komponenta dozirana u količini od 1 mg/kg/dan (ukupno 2 mg/kg/dan), tokom dva uzastopna dana (n = 5 po grupi). Životinje su eutanazirane 6 dana nakon prve doze, a jetreno tkivo je prikupljeno i analizirano pomoću NGS metode, kao što je opisano u primeru 1. Na Sl.6 A1 i A2 predstavljaju primenu mešavine formulacija LNP-136 i LNP-140; B1 i B2 predstavljaju primenu mešavine formulacija LNP-139 i LNP-140; C1 i C2 predstavljaju primenu mešavine formulacija LNP-137 i LNP-140; D1 i D2 predstavljaju primenu mešavine formulacija LNP-138 i LNP-140. Kao što je prikazano na Sl. 6, izmerena su povećanja u uređivanju (približno 10% do 32% uređivanja) za obe mete kada su korišćene hemijski modifikovane sgRNK-LNP formulacije dozirane zajedno sa Cas9 mRNK-LNP formulacijama, u poređenju sa količinom uređivanja koja je nastala upotrebom dgRNK-LNP formulacija (približno 2% do 5% uređivanja). Životinje koje su primile dgRNK-LNP formulacije ciljajući TTR pokazale su manje od 5% uređivanja u dve biopsije jetre, dok su sgRNK-LNP formulacije rezultovale prosečnim procentom uređivanja od preko 20% (sa vrhom od preko 30% kod jedne životinje). Slično tome, životinje koje su primile dgRNK-LNP formulacije ciljajući FVII pokazale su manje od 3% uređivanja u dve biopsije jetre, dok su sgRNK-LNP formulacije rezultovale prosečnim procentom uređivanja od približno 10% (sa vrhom od preko 12% kod jedne životinje).

[0168] Ovi rezultati su potvrdili da LNP formulacije, zasebno formulisane sa Cas9 mRNK i gRNK (i dgRNK i sgRNK), postižu in vivo uređivanje kada se doziraju zajedno, a LNP formulacije postižu in vivo uređivanje kada se Cas9 mRNK-LNP formulacije doziraju pre gRNK-LNP formulacija.

Primer 7. In vitro i in vivo isporuka i uređivanje korišćenjem LNP formulacija koje obuhvataju sgRNK ko-formulisane sa Cas9 mRNK.

[0169] LNP formulacije formulisane za isporuku Cas9 mRNK i sgRNK, enkapsuliranih zajedno u LNP formulaciji, takođe efikasno isporučuju CRISPR/Cas komponente.

[0170] LNP formulacije su formulisane sa IVT Cas9 mRNK zajedno sa hemijski modifikovanom sgRNK (ciljajući TTR ili FVII), kao što je opisano u primeru 1. Odnos mRNK:sgRNK je bio približno 1:1, po težini RNK komponente. sgRNK u ovom primeru je hemijski sintetizovana i nabavljena od komercijalnog dobavljača, sa 2'-O-metil modifikacijama i fosforotioatnim vezama na i između tri terminalna nukleotida na oba 5' odnosno 3' kraja sgRNK. Komponente svakog LNP preparata uključuju CCD lipid (Lipid A, 45 mol-%), holesterol (44 mol-%), DSPC (9 mol-%) i PEG2k-DMG (2 mol-%).

LNP-152, -153, -154 i -155 su korišćeni u ovim eksperimentima, a detalji ovih formulacija su navedeni u tabeli 1, uključujući prosečnu veličinu čestica, polidisperznost i efikasnost enkapsulacije.

[0171] Formulacije iz ovog primera su testirane za isporuku Neuro2A ćelijama, kao što je opisano u primeru 1. Ćelije su transfektovane formulacijama i procenat uređivanja je određen korišćenjem NGS-a, kao što je opisano u primeru 1.

[0172] Na Sl. 7, A predstavlja primenu LNP-152; B predstavlja primenu LNP-153; C predstavlja primenu LNP-154; D predstavlja primenu LNP-155; a E predstavlja primenu kombinacije LNP-152 i LNP-153. Svaka formulacija je primenjena u dozama od 300 ng Cas9 mRNK i 93 nM gRNK; 100 ng Cas9 mRNK i 31 nM gRNK; 30 ng Cas9 mRNK i 10 nM gRNK; i 10 ng Cas9 mRNK i 3 nM gRNK. Kao što je prikazano na Sl.

7, primena svake LNP formulacije rezultovala je robusnom efikasnošću uređivanja, pri čemu su neke formulacije rezultovale uređivanjem više od 80% ćelija (LNP-153 i -155). Ćelije su tretirane kombinacijom dve LNP formulacije (LNP-152 i LNP-153) koje ciljaju FVII, što je takođe rezultovalo efikasnim uređivanjem (približno 70-90% uređivanja), kao i ekscizijom dela FVII gena koji se nalazi između dve isporučene sgRNK (Sl.7 i podaci koji nisu prikazani).

[0173] Formulacije iz ovog primera su takođe testirane in vivo. Životinje su dozirane kao što je opisano u primeru 1 (n=4 za svaku grupu). Tretmanske grupe koje su primile LNP formulacije ciljajući FVII primile su pojedinačnu dozu (od 2 mg/kg), pri čemu je jedna od tretmanskih grupa primila pojedinačnu, kombinovanu dozu (LNP-152 i LNP-153) od 2 mg/kg (npr.1 mg/kg svakog od LNP-152 i LNP-153). Tretmanske grupe koje su primile LNP formulacije ciljajući TTR primile su dve doze (svaka po 2 mg/kg), pri čemu je druga doza isporučena četiri dana nakon prve doze (tj. doza 1 prvog dana, doza 2 petog dana). Životinje u svim grupama su eutanazirane 8 dana nakon prve doze, sa sakupljanjem i analizom krvi i tkiva jetre kao što je opisano u primeru 1. Svaka formulacija je primenjena na četiri životinje.

[0174] Na Sl.8A, 8B i 9, A predstavlja primenu LNP-152; B predstavlja primenu LNP-153; a C predstavlja primenu kombinacije LNP-152 i LNP-153. Svaka formulacija je testirana na četiri životinje. Kao što je prikazano na Sl.8A i 8B, svaka LNP formulacija koja je testirana rezultovala je robusnom in vivo efikasnošću uređivanja. Kod životinja tretiranih LNP formulacijama koje ciljaju TTR sekvencu, više od 50% ćelija jetre iz svake biopsije kod nekih životinja pokazalo je indel mutacije na ciljnom mestu, sa ukupnim prosekom (za sve biopsije svih životinja) za svaku tretmansku grupu od 45,2 ± 6,4% (LNP-154) i 51,1 ± 3,7% (LNP-155) (Sl.8A).

[0175] Životinje tretirane LNP formulacijama koje ciljaju FVII sekvencu pokazale su raspon procenta uređivanja u biopsijama jetre, sa maksimalnim primećenim uređivanjem većim od 70% ćelija jetre koje su uređene iz uzoraka biopsije (npr. imaju indel ili ekscizioni događaj na ili između ciljnog(ih) mesta) kod jedne životinje koja je primila obe LNP formulacije ciljajući FVII sekvencu. Ukupni proseci (za sve biopsije svih životinja) za svaku tretmansku grupu (LNP-152, LNP-153, kao i LNP-152 i LNP-153) iznosili su 16,9 ± 6,5%, 38,6 ± 13,2% i 50,7 ± 15,0%, respektivno (Sl.8B). Kod životinja koje su primile obe LNP formulacije ciljajući FVII, ekscizija posredničke genomske DNK između ciljnih mesta za svaku sgRNK detektovana je PCR-om, kao i indel mutacije na jednom ili oba ciljna mesta (Sl.9).

[0176] Na Sl.10 i 11, A predstavlja primenu LNP-152; B predstavlja primenu LNP-153; C predstavlja primenu LNP-154; D predstavlja primenu LNP-155; a E predstavlja primenu kombinacije LNP-152 i LNP-153. Robusno in vivo uređivanje koje je primećeno kada su LNP formulacije primenjene u ovom primeru takođe je rezultovalo fenotipskim promenama. Kao što je prikazano na Sl.10, velika smanjenja (do približno 75%) nivoa TTR u serumu uočena su kod životinja tretiranih LNP formulacijama koje ciljaju TTR sekvencu (ali ne kod kontrolnih životinja niti kod životinja tretiranih LNP formulacijama koje ciljaju FVII). Slično tome, smanjeni nivoi aktivnosti FVII u plazmi uočeni su kod životinja tretiranih LNP formulacijama koje ciljaju FVII (ali ne kod kontrolnih životinja niti kod životinja tretiranih LNP formulacijama koje ciljaju TTR) (Sl.

11).

Primer 8. Varijacija parametara formulacije.

[0177] LNP formulacije, formulisane za isporuku Cas9 mRNK i gRNK zajedno u jednoj formulaciji, testirane su (1) u rasponu doza; (2) sa izmenjenim odnosima mRNK:gRNK; (3) za efikasnost sa jednom dozom naspram dve doze; i (4) da li LNP formulacije bivaju preuzete od strane slezine i rezultuju uređivanjem u njoj.

[0178] LNP formulacije su formulisane sa IVT Cas9 mRNK zajedno sa hemijski modifikovanom sgRNK (ciljajući TTR), kao što je opisano u primeru 1. Testirani odnosi (po težini RNK komponente) mRNK:sgRNK bili su približno 1:1 (LNP-169), približno 10:1 (LNP-170) ili približno 1:10 (LNP-171). sgRNK korišćena u ovom primeru obuhvata 2'-O-metil modifikacije i fosforotioatne veze na i između tri terminalna nukleotida na oba 5' odnosno 3' kraja sgRNK. Komponente svakog LNP preparata uključivale su Lipid A (45 mol-%), holesterol (44 mol-%), DSPC (9 mol-%) i PEG2k-DMG (2 mol-%). LNP-169, -170 i LNP-171 su korišćeni u ovim eksperimentima. Detalji su navedeni u tabeli 1, uključujući prosečnu veličinu čestica, polidisperznost i efikasnost enkapsulacije.

Studija odgovora na dozu

[0179] U ovoj studiji, životinje su dozirane prvog dana, kao što je opisano u primeru 1, sa LNP-169 u dozama od 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg ili 2 mg/kg (n=5 za svaku grupu). Petog i devetog dana sakupljena je krv za analizu nivoa TTR u serumu. Jetra i slezina su sakupljene prilikom nekropsije devetog dana za NGS analizu, kao što je opisano u primeru 1.

[0180] Kao što je prikazano na Sl.12A, primena sve tri doze rezultovala je značajnom efikasnošću uređivanja u jetri, sa linearnim odgovorom na dozu koji je imao r<2>vrednost 0,9441. U grupi sa najvišom dozom (2 mg/kg), skoro 60% ćelija jetre kod jedne životinje je bilo uređeno na TTR ciljnom mestu, pri čemu je grupa imala prosek od oko 50% uređenih ćelija jetre. Svaka životinja kojoj je primenjena najviša doza takođe je pokazala statistički značajna smanjenja nivoa TTR u serumu mereno 5. i 9. dana nakon primene, sa prosečnim smanjenjem od 75% nivoa TTR u serumu (u poređenju sa životinjama kojima je primenjen PBS; Sl.12B).

Menjanje odnosa mRNK:gRNK

[0181] Prvog dana, životinjama je primenjena, kao što je opisano u Primeru 1, LNP-169 u odnosu mRNK:gRNK od 1:1 (tj.1 mg/kg mRNK, 1 mg/kg gRNK, za ukupnu dozu RNK od 2 mg/kg), LNP-170 u odnosu od 10:1 (tj.1,8 mg/kg mRNK, 0,18 mg/kg gRNK, za ukupnu dozu RNK od 1,98 mg/kg) ili LNP-171 u odnosu od 1:10 (tj. 0,18 mg/kg mRNK, 1,8 mg/kg gRNK, za ukupnu dozu RNK od 1,98 mg/kg) (n=5 za svaku grupu). (Napomena: Grupa koja je primila dozu sa odnosom mRNK:gRNK od 1:1 i podaci o njoj su ista grupa i podaci kao što je opisano u studiji odgovora na dozu u ovom primeru, supra.) Krv je sakupljena 5. i 9. dana, i izmereni su nivoi TTR u serumu. Jetra i slezina su sakupljene prilikom nekropsije devetog dana za NGS analizu, kao što je opisano u primeru 1.

[0182] Kao što je prikazano na Sl.13A, primena LNP-169 (mRNK:gRNK odnos od 1:1) rezultovala je uređivanjem skoro 60% ćelija kod jedne životinje na TTR ciljnom mestu, pri čemu je grupa imala prosek od oko 50% uređivanja. Životinje koje su primile LNP formulacije u odnosu 1:10 i 10:1 takođe su pokazale uređivanje, pri čemu je prosečan procenat uređivanja za grupu koja je primila LNP-171 bio približno 32%, a za grupu koja je primila LNP-170 približno 17% u ovom eksperimentu. Dodatno, kao što je prikazano na Sl.13B, statistički značajna smanjenja nivoa TTR u serumu detektovana su za svaku tretmansku grupu 5. dana (u poređenju sa PBS kontrolom). Do devetog dana, grupe koje su primile 1:1 mRNK:sgRNK i 1:10 mRNK:sgRNK zadržale su statistički značajna smanjenja nivoa TTR u serumu.

Pojedinačna doza naspram dve doze

[0183] U ovoj studiji, jedna grupa životinja primila je pojedinačnu dozu LNP-169 (od 2 mg/kg) prvog dana, dok je druga grupa primila dve doze LNP-169 (svaka po 2 mg/kg) sa prvom dozom primenjenom prvog dana i drugom dozom petog dana, primenjeno kao što je opisano u primeru 1 (n=5 za obe grupe). (Napomena: Grupa koja je primila pojedinačnu dozu LNP-169 i podaci o njoj su ista grupa i podaci kao što je opisano u studijama odgovora na dozu i odnosa mRNK:gRNK u ovom primeru, supra). Krv je sakupljena za analizu nivoa TTR u serumu iz obe grupe petog dana (pre primene druge doze za grupu koja je primila drugu dozu), i ponovo prilikom nekropsije devetog dana, kao što je opisano u primeru 1.

[0184] Kao što je prikazano na Sl.14A, u grupi koja je primila pojedinačnu dozu LNP-169, primećeno je skoro 60% uređivanja TTR ciljnog mesta kod jedne životinje, pri čemu je grupa imala prosek od oko 50% uređivanja. Slični prosečni brojevi su postignuti kod životinja koje su primile dve doze LNP-169, sa manjom standardnom devijacijom i sa prosekom grupe od približno 55% uređivanja TTR ciljnog mesta. Kao što je prikazano na Sl.14B, obe grupe pokazale su značajna smanjenja nivoa TTR u serumu.

Procena preuzimanja i uređivanja u slezini

[0185] Slezina svake životinje u gorenavedenim studijama (u okviru ovog primera) sakupljena je prilikom nekropsije kako bi se utvrdilo da li su LNP formulacije usmerene na i preuzete od strane slezine, čime bi rezultovale uređivanjem gena. Genomska DNK je ekstrahovana iz tkiva slezine i podvrgnuta NGS analizi kao što je opisano u primeru 1.

[0186] Na Sl. 15, A predstavlja LNP-169 primenjen u dozi od 2 mg/kg u 2 doze; B predstavlja LNP-169 sa odnosom mRNK:gRNK od 1:1 u dozi od 0,1 mg/kg kao pojedinačna doza; C predstavlja LNP-169 sa odnosom mRNK:gRNK od 1:1 u dozi od 0,5 mg/kg kao pojedinačna doza; D predstavlja LNP-169 sa odnosom mRNK:gRNK od 1:1 u dozi od 2 mg/kg kao pojedinačna doza; E predstavlja LNP-170 sa odnosom mRNK:gRNK od 10:1 u dozi od 2 mg/kg kao pojedinačna doza; i F predstavlja LNP171 sa odnosom mRNK:gRNK od 1:10 u dozi od 2 mg/kg kao pojedinačna doza. Kao što je prikazano na Sl.15, značajno manje uređivanja (manje od približno 2% ćelija) uočeno je u slezinama ovih životinja u poređenju sa njihovim jetrama. U ovim studijama, uočeno je uređivanje od približno 50% u jetri (npr. u onim grupama koje su primile LNP-169). Ovi rezultati ukazuju na to da su ovde obezbeđene LNP formulacije uglavnom usmerene na jetru, naspram slezine.

Primer 9. Komparativna in vivo između (1) modifikovanih dgRNK-LNP formulacija doziranih zajedno sa Cas9 mRNK-LNP formulacijama i (2) LNP formulacija koje obuhvataju Cas9 mRNK i modifikovanu dgRNK zajedno u jednoj formulaciji.

[0187] LNP formulacije formulisane za isporuku Cas9 mRNK i modifikovane dgRNK, bilo kao zasebne LNP formulacije ili zajedno u jednoj formulaciji, efikasno isporučuju CRISPR/Cas komponente. LNP formulacije su formulisane sa IVT Cas9 mRNK, bilo zajedno sa (LNP-174, -175) ili odvojeno od (LNP-172, -173) hemijski modifikovane dgRNK (ciljajući TTR), kao što je opisano u primeru 1. I crRNK i trRNK koje čine dgRNK u ovom primeru obuhvataju fosforotioatne veze između tri terminalna nukleotida na oba 5' i 3' kraja svake RNK. Komponente svakog LNP preparata uključuju CCD lipid (Lipid A, 45 mol-%), holesterol (44 mol-%), DSPC (9 mol-%) i PEG2k-DMG (2 mol-%). LNP-172, -173, -174 i -175 su korišćeni u ovim eksperimentima. Sastavi LNP-174 i LNP-175 bili su identični, osim što su crRNK i trRNK koje čine dgRNK u LNP-175 prvo prethodno anealovane jedna sa drugom pre formulisanja sa LNP. Ovo je postignuto tako što su crRNK i trRNK prvo inkubirane zajedno na 95°C tokom 10 minuta, pre hlađenja na sobnu temperaturu i nastavljanja sa formulacijom, kako je prethodno opisano. Ostali detalji u vezi sa LNP formulacijama su navedeni u tabeli 1, uključujući prosečnu veličinu čestica, polidisperznost i efikasnost enkapsulacije.

[0188] Životinje su dozirane svakom LNP formulacijom u dozi od 2 mg/kg kao što je opisano u primeru 1 (n=5 za svaku grupu). Jetre su sakupljene prilikom nekropsije 8 dana nakon primene, a genomska DNK je izolovana i podvrgnuta NGS analizi, kao što je opisano u primeru 1.

[0189] Na Sl.16, A predstavlja primenu dgRNK split-formulacije (LNP-172 i LNP-173); B predstavlja primenu dgRNK ko-formulacije (LNP-174); a C predstavlja primenu formulacije gde je dgRNK bila prethodno anealovana (LNP-175). Kao što je prikazano na Sl. 16, uređivanje je detektovano u jetrama iz svake grupe (sa približno 4-6% uređivanja). Kod životinja koje su primile LNP formulaciju ko-formulisanu sa Cas9 mRNK i dgRNK zajedno, kao i životinje koje su primile mRNK i dgRNK iz zasebno formulisanih LNP formulacija, pokazano je uređivanje. Efikasnost uređivanja merena korišćenjem LNP formulacija sa dgRNK (bilo zajedno sa ili odvojeno od Cas9 mRNK) znatno je niža od onih detektovanih korišćenjem LNP formulacija sa sgRNK (videti npr. primere 6-8).

Primer 10. ApoE vezivanje LNP formulacija i transfekcija primarnih hepatocita.

[0190] Kao što je pokazano u primeru 8, LNP formulacije ovde navedene efikasno se preuzimaju u jetri, a samo u manjoj meri u slezini. Ovaj primer pruža podatke o ApoE-posredovanom preuzimanju u primarnim hepatocitima i obezbeđuje test za ispitivanje vezivanja LNP-ApoE koji je pokazao da se LNP formulacije vezuju za ApoE.

Isporuka LNP formulacija primarnim hepatocitima.

[0191] Pored drugih proteina, serum obezbeđuje izvor ApoE u medijumima za kulturu, i stoga je testirano da li LNP formulacijama treba serum (npr. kao izvor ApoE) za preuzimanje u primarne hepatocite. Ovo je postignuto dodavanjem LNP formulacija primarnim hepatocitima in vitro, sa i bez prisustva seruma.

[0192] LNP formulacije su isporučene primarnim mišjim hepatocitima kao što je opisano u primeru 1. U odsustvu bilo kakvog seruma, T7E1 testom nije detektovano nikakvo uređivanje za bilo koju testiranu LNP formulaciju (podaci nisu prikazani). Međutim, kada su LNP formulacije inkubirane sa 3% mišjeg seruma pre transfekcije, LNP formulacije su preuzete od strane hepatocita, što je rezultovalo uređivanjem. Reprezentativni set podataka prikazan je na Sl.17. U ovom eksperimentu, LNP-169 (ciljajući TTR) je prethodno inkubiran u 3% mišjeg seruma, a zatim je dodat primarnim mišjim hepatocitima u različitim koncentracijama. Oznake na Sl. 17 definisane su u tabeli 3 i opisuju koncentraciju primenjenog LNP-169. Kao što je prikazano na Sl.17, dodavanje seruma rezultovalo je povećanjem uređivanja na TTR ciljnom mestu zavisnim od doze, mereno NGS-om. Ovi rezultati sugerišu da ApoE prisutan u serumu posreduje u preuzimanju LNP formulacija u hepatocitima.

Tabela 3. Koncentracija primenjenog LNP-169

ApoE test vezivanja

[0193] LNP formulacije su inkubirane sa rekombinantnim ApoE3, najčešćim oblikom ApoE, a zatim razdvojene pomoću heparinske afinitetne kolone, koristeći gradijent soli na HPLC-u. U HPLC hromatogramu su postojale dve grupe pikova, koje odgovaraju LNP formulacijama vezanim za ApoE3 i nevezanim LNP formulacijama. Nevezane su slobodne LNP formulacije koje se nisu vezale za ApoE3 i slobodno su prošle kroz heparinsku kolonu. Vezani deo je bio pik sa dužim retencionim vremenom, koji predstavlja kompleks LNP/ApoE3 vezan za heparinsku kolonu i eluiran je u gradijentu soli. Za izračunavanje vezivanja, procenat površine vezanog pika izračunat je deljenjem površine pika koji odgovara LNP formulacijama vezanim za ApoE3, sa zbirom površina oba pika.

[0194] LNP formulacije su formulisane sa Cas9 mRNK i hemijski modifikovanom sgRNK, kao što je opisano u primeru 1. sgRNK korišćene u ovom primeru su hemijski sintetizovane i nabavljene od komercijalnih dobavljača, sa 2'-O-metil modifikacijama i fosforotioatnim vezama na i između tri terminalna nukleotida na oba 5' odnosno 3' kraja sgRNK. Komponente svakog LNP preparata (LNP-169 i LNP-171) uključuju Lipid A (45 mol-%), holesterol (44 mol-%), DSPC (9 mol-%) i PEG2k-DMG (2 mol-%). Detalji za ove formulacije dati su u tabeli 1, uključujući prosečnu veličinu čestica, polidisperznost i efikasnost enkapsulacije. Koristeći matični ApoE3 rastvor (rekombinantni humani apolipoprotein E3, R&D Systems, kat. #4144-AE-500) u koncentraciji od 0,5 mg/mL, ApoE3 je dodat uzorcima LNP formulacija u koncentracijama od 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL i 300 µg/mL. Uzorci su inkubirani preko noći na sobnoj temperaturi.

[0195] Pripremljena su dva pufera (po 500 mL); Pufer A je 20 mM Tris pufer, podešen na pH 8,0, a Pufer B je 20 mM Tris pufer, sa 1 M NaCl, podešen na pH 8,0. Gradijent i protok za HPLC analizu su opisani u nastavku.

[0196] Nakon inkubacije uzoraka preko noći, svaki uzorak je analiziran HPLC-om i procenat površine vezanog pika izračunat je kao što je prethodno opisano.

[0197] Kao što je prikazano na Sl. 18, sa povećanjem količine ApoE3, više LNP formulacija (i LNP-169 (predstavljen isprekidanom linijom) i -171 (predstavljen punom linijom)) vezano je za heparinsku kolonu, tj. kao rezultat vezivanja za ApoE3. Ovi rezultati ukazuju na to da se LNP formulacije vezuju za ApoE3.

Primer 11. In vitro i in vivo isporuka i uređivanje korišćenjem LNP formulacija sa sgRNK izraženom iz DNK ekspresionih kaseta.

[0198] Ovaj primer demonstrira uređivanje gena korišćenjem LNP formulacija napunjenih Cas9 mRNK i ekspresionom kasetom koja kodira sgRNK.

Isporuka LNP in vitro

[0199] Amplikoni koji kodiraju sgRNK pripremljeni su PCR amplifikacijom DNK sekvence koja sadrži U6 promotor povezan sa sgRNK koja cilja mišji TTR. Svaki prajmer je sadržao invertovani dideoksiT nukleotid na 5' kraju kako bi se sprečila integracija DNK amplikona u genomsku DNK. PCR produkt je prečišćen ekstrakcijom fenol/hloroformom, nakon čega je usledilo taloženje etanolom. DNK pelet je osušen i resuspendovan u TE puferu.

[0200] LNP formulacije su formulisane sa IVT Cas9 mRNK („mRNK-LNP“ ili LNP-178) ili ekspresionom kasetom sgRNK („DNK-LNP“ ili LNP-176) kao što je opisano u primeru 1. IVT Cas9 mRNK i ekspresiona kaseta sgRNK su takođe zasebno formulisane sa Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher) prema uputstvima proizvođača („mRNK LF2K“ ili „DNK LF2K“, respektivno). Formulacije su primenjene na mišje Neuro2A ćelije (100 ng Cas9 mRNK i 100 ng ekspresione kasete sgRNK) direktnim razblaživanjem u medijumu za ćelijsku kulturu u svakoj jažici prema sledećim režimima:

• Ko-isporuka Cas9 mRNK i ekspresione kasete sgRNK;

• ekspresiona kaseta sgRNK primenjena 2 sata pre Cas9 mRNK; i

• Cas9 mRNK primenjena 2 sata pre ekspresione kasete sgRNK.

[0201] Ćelije su inkubirane 48 sati nakon transfekcije, a ćelijski lizati su analizirani T7E1 testom kao što je opisano u primeru 1. Kao što je prikazano na Sl. 19, viši procenti TTR uređivanja su primećeni kada su i mRNK i DNK komponente formulisane u LNP formulacijama, u poređenju sa situacijom kada je jedna komponenta ili druga bila formulisana sa Lipofectamine-om 2000.

Primer 12. Uređivanje in vitro naspram in vivo.

[0202] Cas9 mRNK i hemijski modifikovana sgRNK koje ciljaju različite mišje TTR sekvence formulisane su i dozirane miševima (2 mg/kg) kao što je opisano u primeru 1. Isti LNP preparati su korišćeni za transfekciju primarnih mišjih hepatocita in vitro. sgRNK u ovom primeru je hemijski sintetizovana i nabavljena od komercijalnog dobavljača, sa 2'-O-metil modifikacijama i fosforotioatnim vezama na i između tri terminalna nukleotida na oba 5' odnosno 3' kraja sgRNK.

Tabela 4. Formulacije korišćene u primeru 12

[0203] Budući da NGS pruža specifične rezultate sekvenciranja pored ukupne efikasnosti uređivanja, obrasci uređivanja specifični za sekvencu upoređeni su sa Neuro 2A ćelijama. Slika 21 prikazuje reprezentativne podatke koji demonstriraju da se obrasci insercije i delecije značajno razlikuju između mišjih Neuro2A ćelija (transfektovanih Cas9 mRNK i gRNK) i primarnih mišjih hepatocita (transfektovanih LNP formulacijama koje sadrže Cas9 mRNK i gRNK). Primarni mišji hepatociti su dali obrasce uređivanja vrlo slične onima primećenim in vivo (transfektovani LNP formulacijama koje sadrže Cas9 mRNK i gRNK) (Slika 22). Kao što je prikazano na Sl.

22, 53,2% uređivanja merenih na primarnim hepatocitima miša bile su delecije (prvenstveno delecije od 1 bp), a 16,8% su bile insercije (prvenstveno insercije od 1 bp), što čini ukupno 70% uređivanja. Od ukupno 70% uređivanja, 64,5% uređivanja rezultovalo je frameshift mutacijom, što predstavlja ~92% ukupno izmerenih uređivanja (nije prikazano). Slično tome, prikazani su reprezentativni podaci za procente uređivanja i tipove uređenja uočenih prilikom isporuke Cas9 mRNK i gRNK bazirane na LNP formulaciji u ćelije jetre miša in vivo: 46,6% uređivanja merenih u ćelijama jetre miša in vivo bile su delecije (ponovo, prvenstveno delecije od 1 bp), a 12,9% su bile insercije (ponovo, prvenstveno insercije od 1 bp), što čini ukupno 59,5% uređivanja. Od ukupno 59,5% uređivanja, 57,4% uređivanja rezultovalo je frameshift mutacijom, što predstavlja ~96% uređivanja merenih in vivo (nije prikazano).

Primer 13. Farmakokinetika CRISPR/Cas9 komponenti isporučenih LNP formulacijom.

[0204] LNP-294, koja je sadržala Cas9 mRNK i sgRNK usmerenu na mišji TTR, formulisana je kao što je opisano u primeru 1. Odnos mRNK prema gRNK potvrđen je HPLC metodom. Životinje su dozirane svakom LNP formulacijom u dozi od 2 mg/kg, kao što je opisano u primeru 1 (n=3 za svaku grupu), a žrtvovane su u sledećim vremenskim tačkama: 5 min, 15 min, 30 min, 60 min, 2 časa, 4 časa, 6 časova, 12 časova, 24 časa, 72 časa i 7 dana. Prilikom nekropsije, prikupljeni su plazma, jetra i slezina za qPCR analizu nivoa Cas9 mRNK i gRNK. Slika 23 prikazuje koncentracije ovih komponenti u plazmi, slika 24 prikazuje koncentracije u jetri, a slika 25 prikazuje koncentracije u slezini. Izračunati su sledeći farmakokinetički parametri za koncentracije u plazmi:

Tabela 5. Farmakokinetički parametri

[0205] Slika 26A prikazuje relativne odnose sgRNK prema Cas9 mRNK u plazmi i tkivu.

[0206] Merena je i indukcija citokina kod tretiranih miševa. Za ovu analizu, približno 50-100 µL krvi je prikupljeno zarezivanjem repne vene radi merenja citokina u serumu. Krv je ostavljena da koaguliše na sobnoj temperaturi približno 2 časa, a zatim centrifugirana na 1000xg tokom 10 minuta pre prikupljanja seruma. Za analizu citokina u prikupljenim uzorcima korišćen je multipleksni test sa magnetnim zrncima baziran na Luminex tehnologiji (Affymetrix ProcartaPlus, kataloški broj Exp040-00000-801) kojim su mereni IL-6, TNF-alfa, IFN-alfa i MCP-1. Reagensi i standardi iz kompleta su pripremljeni prema protokolu proizvođača. Mišji serum je razblažen 4 puta korišćenjem priloženog diluenta za uzorke i 50 µL je dodato u jažice koje su sadržale 50 µL razblaženih magnetnih zrnaca obloženih antitelima. Ploča je inkubirana 2 časa na sobnoj temperaturi, a zatim je oprana. Razblaženo biotin antitelo (50 µL) je dodato zrncima i inkubirano 1 čas na sobnoj temperaturi. Zrnca su ponovo oprana pre dodavanja 50 µL razblaženog streptavidin-PE u svaku jažicu, nakon čega je usledila inkubacija od 30 minuta. Zrnca su oprana još jednom, a zatim suspendovana u 100 µL pufera za ispiranje i očitana na uređaju Bio-Plex 200 (Bio-Rad). Podaci su analizirani korišćenjem analitičkog paketa Bioplex Manager ver. 6.1, pri čemu su koncentracije citokina izračunate na osnovu standardne krive korišćenjem petoparametarskog logističkog uklapanja krive. Slika 27 prikazuje nivoe citokina u plazmi kod tretiranih miševa tokom vremena. Kao što je prikazano na Sl.27, svaki od citokina je imao merljiv porast između 2-4 časa nakon tretmana, a svaki se vratio na početne vrednosti do 12-24 časa.

[0207] Tri različite vodeće sekvence su zasebno formulisane, prema primeru 1, i injektirane u miševe (n=3) kako bi se odredio farmakokinetički profil Lipida A. Nivoi Lipida A u jetri i plazmi miša mereni su LC/MS metodom. Slika 26B prikazuje koncentracije Lipida A u plazmi i jetri tokom vremena. Tmax u jetri je postignut u roku od 30 minuta od primene, dok je T1/2 u plazmi i jetri postignut u roku od približno 5-6 časova od primene LNP formulacije.

Primer 14. Trajanje odgovora za in vivo uređivanje

[0208] Cas9 mRNK i hemijski modifikovana sgRNK usmerena na sekvencu mišjeg TTR formulisane su kao što je opisano u primeru 1:

Tabela 6. Informacije o formulaciji za LNP 402.

[0209] LNP formulacije su dozirane miševima (jedna doza od 3 mg/kg, 1 mg/kg ili 0,3 mg/kg) kao što je opisano u primeru 1. Kod kohorti miševa su mereni nivoi TTR u serumu 1, 2, 4, 9, 13 i 16 nedelja nakon doziranja, i uređivanje TTR u jetri 1, 2, 9 i 16 nedelja nakon doziranja. Da bi se izmerilo uređivanje TTR u jetri, uzorak tkiva jetre prikupljen je iz medijalnog režnja od svake životinje određene kohorte radi ekstrakcije i analize DNK. Genomska DNK je ekstrahovana iz 10 mg tkiva korišćenjem kompleta za ekstrakciju baziranog na zrncima, MagMAX-96 DNA Multi-Sample Kit (ThermoFisher, kataloški broj 4413020) prema protokolu proizvođača, što uključuje homogenizaciju tkiva u puferu za lizu (približno 400 µL/10 mg tkiva) i taloženje DNK. Svi uzorci DNK su normalizovani na koncentraciju od 100 ng/µL za PCR i naknadnu NGS analizu.

[0210] sgRNK u ovom primeru je hemijski sintetizovana i nabavljena od komercijalnog dobavljača, sa 2'-O-metil modifikacijama i fosforotioatnim vezama kao što je prikazano ispod (m = 2'-OMe; * = fosforotioat):sg282:

[0211] Slika 28 prikazuje nivoe TTR u serumu miša tokom vremena, a slika 29A prikazuje odgovarajuće procente uređivanja merene pomoću NGS. Slika 29B prikazuje nivoe TTR u serumu miša tokom vremena i odgovarajuće procente uređivanja merene pomoću NGS, tokom 16 nedelja nakon doziranja.

Primer 15. Formulacije koje koriste mRNK preparate.

[0212] Cas9 mRNK je pripremljena kao što je opisano u primeru 1, koristeći protokole prečišćavanja samo taloženjem i HPLC prečišćavanjem. LNP formulacija je formulisana koristeći HPLC prečišćenu mRNK (LNP492) i upoređena sa LNP formulacijom formulisanom korišćenjem mRNK obrađene samo taloženjem (LNP490, LNP494). mRNK Cas9 kao teret formulacije LNP494 pripremljena je korišćenjem različite sintezne partije mRNK obrađene samo taloženjem.

Tabela 7. Formulacije korišćene u primeru 15.

[0213] Miševi su dozirani sa 0,5 ili 1 mg/kg svake formulacije kao što je opisano u primeru 1, LNP isporuka in vivo. sgRNK korišćena u ovom primeru bila je sg282, kao što je opisano u primeru 14.

[0214] Slika 30 prikazuje aktivnost citokina u serumu miša 4 časa nakon doziranja. Slika 31 prikazuje nivoe koncentracije TTR u serumu miša, a slika 32 prikazuje nivoe uređivanja TTR u jetri miša.

Tabela 8. Oznake slika na slikama 30, 31 i 32.

Primer 16. Zamrznute formulacije

[0215] LNP formulacije su formulisane sa molarnim odnosom Lipida A prema RNK fosfatu (N:P) od približno 4,5. Komponente lipidne nanočestice su rastvorene u 100% etanolu sa sledećim molarnim odnosima: 45 mol-% (12,7 mM) Lipida A; 44 mol-% (12,4 mM) holesterola; 9 mol-% (2,53 mM) DSPC; i 2 mol-% (0,563 mM) PEG2k-DMG. RNK teret formulacije je rastvoren u acetatnom puferu koncentracije 50 mM, pH 4,5, pri čemu je koncentracija RNK tereta formulacije bila približno 0,45 mg/mL. Za ovu studiju korišćen je sg282 opisan u primeru 14.

Tabela 9. LNP formulacije korišćene u primeru 16.

[0216] LNP formulacije (LNP493, LNP496) su formirane mikrofluidnim mešanjem rastvora lipida i RNK korišćenjem uređaja Precision Nanosystems NanoAssemblr<™>Benchtop Instrument, prema protokolu proizvođača. Odnos vodenog i organskog rastvarača od 2:1 održavan je tokom mešanja korišćenjem različitih protoka. Nakon mešanja, LNP formulacije su prikupljene, razblažene u 50 mM Tris puferu, pH 7,5. Formulisane LNP formulacije su filtrirane korišćenjem 0,2 µm sterilnog filtera. Dobijeni filtrat je pomešan 1:1 sa 10% w/v saharoze 90 mM NaCl pripremljenom u 50 mM Tris puferu na pH 7,5. Finalna LNP formulacija sa 5% w/v saharoze, 45 mM NaCl, 50 mM Tris puferom čuvana je na 4°C i -80°C tokom 1,5 dana do dana doziranja.

[0217] LNP formulacije su primenjene miševima u dozama od 0,5 i 1 mg/kg (zamrznuta formulacija je odmrznuta na 25°C jedan čas pre primene). Slika 33 prikazuje nivoe koncentracije TTR u serumu miša, a slika 34 prikazuje nivoe uređivanja TTR u jetri miša nakon doziranja.

Tabela 10. Oznake slika na slikama 33 i 34.

[0218] sgRNK u ovom primeru je hemijski sintetizovana i nabavljena od komercijalnog dobavljača, sa 2'-O-metil modifikacijama i fosforotioatnim vezama kao što je prikazano ispod (m = 2'-OMe; * = fosforotioat):sg396:

Primer 17: Alternativni procesi LNP formulacije.

[0219] LNP formulacije su formulisane sa molarnim odnosom Lipida A prema RNK fosfatu (N:P) od približno 4,5. Komponente lipidne nanočestice su rastvorene u 100% etanolu sa sledećim molarnim odnosima: 45 mol-% (12,7 mM) Lipida A; 44 mol-% (12,4 mM) holesterola; 9 mol-% (2,53 mM) DSPC; i 2 mol-% (0,563 mM) PEG2k-DMG. RNK teret formulacije je rastvoren u acetatnom puferu (u finalnoj koncentraciji od 25 mM natrijum acetata, pH 4,5) ili citratnom puferu (u finalnoj koncentraciji od 25 mM natrijum citrata, 100 mM NaCl, pH 5), što je rezultovalo koncentracijom RNK tereta formulacije od približno 0,45 mg/mL. Za ovu studiju korišćen je sg282 opisan u primeru 14.

[0220] LNP formulacije su formirane mikrofluidnim mešanjem rastvora lipida i RNK korišćenjem uređaja Precision Nanosystems NanoAssemblr<™>Benchtop Instrument, prema protokolu proizvođača, ili mešanjem unakrsnim protokom. LNP563 i LNP564 su pripremljene korišćenjem NanoAssemblr preparacije, gde je odnos vodenog i organskog rastvarača od 2:1 održavan tokom mešanja primenom različitih protoka, 8 mL/min za vodenu i 4 mL/min za organsku fazu. Nakon mešanja, LNP formulacije su prikupljene i 1:1 razblažene u 50 mM Tris puferu, pH 7,5. LNP formulacije su dijalizovane u 50 mM Tris puferu, pH 7,5 preko noći i sledećeg dana filtrirane korišćenjem 0,2 µm sterilnog filtera. Dobijeni filtrat je koncentrovan i pomešan 1:1 sa 10% w/v saharoze 90 mM NaCl pripremljenom u 50 mM Tris puferu na pH 7,5. Finalna LNP formulacija sa 5% w/v saharoze, 45 mM NaCl, 50 mM Tris puferom čuvana je na 4°C i -80°C tokom 1,5 dana do dana doziranja.

Tabela 11. Informacije o LNP formulacijama korišćenim u primeru 17.

[0221] LNP561 i LNP562 su pripremljene korišćenjem tehnike unakrsnog protoka; špric pumpa je korišćena sa dva šprica RNK pri 0,45 mg/mL, jednim špricom organske faze koja sadrži lipide i jednim špricom vode. One su mešane brzinom od 40 mL/min sa varijabilnim dužinama cevi; vodene i organske faze su protiskivane kroz „peek cross“ od 0,5 mm, a ovaj izlaz je uveden u T-spojnicu od 1 mm povezanu sa cevima za vodu. LNP formulacije su inkubirane na sobnoj temperaturi jedan čas, a zatim razblažene vodom u odnosu 1:1. Na kratko, LNP formulacije i voda su ubrizgane brzinom od 25 mL/min u T-spojnicu od 1 mm pomoću špric pumpe.

[0222] Za prečišćavanje i koncentraciju korišćena je tangencijalna protočna filtracija. Konkretno za ovu proceduru, Vivaflow 50 kertridži kompanije Sartorius se pune sa 500 mL vode, a zatim se LNP formulacije unose pomoću Pall Minimate sistema sa brzinom protoka od 60 mL/min. Linija permeata se steže kako bi se održala fiksna brzina protoka od oko 1,7 mL/min. Kada se LNP formulacije koncentrišu, 15-ostruka zapremina PBS-a ili 5% saharoze, 45 mM NaCl, 50 mM Tris-a pri pH 7,5 unosi se pod vakuumom sa brzinom protoka od 80 mL/min. Linija permeata se steže kako bi se održala brzina protoka od 1,9 mL/min. Kada je dijafiltracija završena, LNP formulacije se koncentrišu i sakupljaju u sterilnu epruvetu za sakupljanje bez DNaze i RNaze i čuvaju na 4°C za PBS formulacije, ili na 4°C ili -80°C za TSS (tj. tris, saharoza i so) formulacije do dana doziranja.

[0223] LNP formulacije su primenjene miševima u dozama od 1,0 i 2 mg/kg (zamrznuta formulacija je odmrznuta na 25°C jedan čas pre primene). Slika 35 prikazuje nivoe koncentracije TTR u serumu miša, dok slika 36 prikazuje nivoe uređivanja TTR u jetri miša nakon doziranja različitim formulacijama.

Tabela 12. Oznake slika na slikama 35 i 36.

Primer 18. Isporuka LNP formulacija višim vrstama.

[0224] Formulacije su pripremljene slično onima opisanim u primeru 14. U određenim eksperimentima, sgRNK je modifikovana istim hemijskim modifikacijama kao i u sg282, ali sa ciljajućim sekvencama specifičnim za sekvence TTR pacova. Primećeno je efikasno uređivanje u jetri pacova. Doza od 2 mg/kg (ukupni teret formulacije) i doza od 5 mg/kg (ukupni teret formulacije) su dobro tolerisane u eksperimentu. Slične formulacije koje sadrže mRNK koja kodira GFP takođe su dobro tolerisane kod neljudskih primata u dozama od 1 mg/kg i 3 mg/kg.

Sekvence

[0225] Sekvence opisane u prethodnim primerima date su u nastavku (polinukleotidne sekvence od 5' ka 3'):

Cas9 mRNK (kodirajuća sekvenca za Cas9 je podebljana; HA oznaka je podebljana i podvučena; 2xNLS je podvučeno):

„Cas9 1xNLS, bez HA oznake” pominje se u tabeli 11 i koristi u primeru 17:

cr002 (crRNK koja cilja FVII; ciljana sekvenca je podvučena):

AGGGCUCUUGAAGAUCUCCCGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG

sg001 (sgRNK koja cilja FVII; ciljana sekvenca je podvučena):

cr003 (crRNK koja cilja TTR; ciljana sekvenca je podvučena):

CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG

sg006 (sgRNK koja cilja TTR, dobijena putem IVT; ciljana sekvenca je podvučena):

sg003 (sgRNK koja cilja TTR; ciljana sekvenca je podvučena):

sg007 (sgRNK koja cilja FVII; ciljana sekvenca je podvučena):

sg002 (sgRNK koja cilja FVII; ciljana sekvenca je podvučena):

sg004 (sgRNK koja cilja TTR; ciljana sekvenca je podvučena):

sg005 (sgRNK koja cilja TTR; ciljana sekvenca je podvučena):

cr004 (crRNK koja cilja FVII; ciljana sekvenca je podvučena):

A*G*G*GCUCUUGAAGAUCUCCCGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*U*U*G cr005 (crRNK koja cilja TTR; ciljana sekvenca je podvučena):

C*C*A*GUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*U*U*G sg008 (sgRNK koja cilja FVII; ciljana sekvenca je podvučena):

sg009 (sgRNK koja cilja TTR; ciljana sekvenca je podvučena):

sg010 (sgRNK koja cilja FVII; ciljana sekvenca je podvučena):

sg002 (sgRNK koja cilja FVII; ciljana sekvenca je podvučena):

sg011 (sgRNK koja cilja TTR; ciljana sekvenca je podvučena):

sg012 (sgRNK koja cilja TTR; ciljana sekvenca je podvučena):

ec001 (ekspresiona kaseta - amplikon za ekspresiju sgRNK koja cilja TTR; U6 promotor je podebljan, ciljna sekvenca je podvučena; konstrukt sadrži invertovani dideoksi T na svakom 5' kraju):

[0226] Prajmer parovi za NGS analizu FVII ciljnog mesta ciljanog pomoću cr001: Forward:

[0227] Prajmer parovi za NGS analizu FVII ciljnog mesta ciljanog pomoću cr002 i sg001:

Forward:

GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGACATAGGTGTGACCCTCACAATC

[0229] Prajmer parovi za NGS analizu TTR ciljnog mesta ciljanog pomoću cr003 i sg003:

Forward:

Reverse:

[0230] Prajmer parovi za NGS analizu TTR ciljnog mesta ciljanog pomoću sg004: Forward:

[0231] Prajmer parovi za NGS analizu TTR ciljnog mesta ciljanog pomoću sg005: Forward:

[0232] Prajmer parovi za PCR amplifikaciju sg004 ekspresione kasete:

/5InvddT/ = invertovani dideoksi T

Forward:

/5InvddT/GCTGCAAGGCGATTAAGTTG

Reverse:

/5InvddT/TAGCTCACTCATTAGGCACC

Tabela 13. Vodeće sekvence za TTR kod miša.

Tabela 14. Vodeće sekvence za TTR kod čoveka.

Claims (17)

Patentni zahtevi

1. Formulacija lipidnih nanočestica (LNP) koja sadrži:

mRNK koja kodira Cas nukleazu;

nukleinsku kiselinu vodeće RNK; i

više komponentnih lipida koji uključuju:

pomoćni lipid, pri čemu je pomoćni lipid izabran iz grupe steroida, sterola i alkilrezorcinola;

neutralni lipid, pri čemu je neutralni lipid neutralan, nenaelektrisan ili cviterjonski lipid; „stealth” lipid, pri čemu „stealth” lipid ima hidrofilnu čeonu grupu povezanu sa lipidnom grupom; i

jonizujući lipid izabran iz:

Lipida A: (9Z,12Z)-3-((4,4-bis(oktiloksi)butanoil)oksi)-2-((((3-(dietilamino)propoksi)karbonil)oksi)metil)propil-oktadeka- 9, 12-dienoata

Lipida B: ((5-((dimetilamino)metil)-1,3-fenilen)bis(oksi))bis( oktan-8,1-diil)bis(dekanoata),

Lipida C: 2-((4-(((3-(dimetilamino)propoksi)karbonil)oksi)heksadekanoil)oksi)propan-1,3-diil (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(oktadeka-9,12-dienoata), i

Lipida D: 3-(((3-(dimetilamino)propoksi)karbonil)oksi)-13-(oktanoiloksi)tridecil-3-oktilundekanoata;

pri čemu komponentni lipidi obuhvataju od 30 mol-% do 60 mol-% jonizujućeg lipida, od 30 mol-% do 60 mol-% pomoćnog lipida, od 1 mol-% do 20 mol-% neutralnog lipida, i od 1 mol-% do 10 mol-% „stealth” lipida.

2. Formulacija LNP prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je mRNK koja kodira Cas nukleazu mRNK Cas nukleaze klase 2, a nukleinska kiselina vodeće RNK jeste ili kodira sgRNK.

3. Formulacija LNP prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu je nukleinska kiselina vodeće RNK sgRNK.

4. Formulacija LNP prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je pomoćni lipid izabran iz grupe koja obuhvata holesterol, 5-heptadecilresorcinol i holesterol hemisukcinat.

5. Formulacija LNP prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je pomoćni lipid holesterol.

6. Formulacija LNP prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je neutralni lipid izabran iz grupe DSPC i DMPE.

7. Formulacija LNP prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je neutralni lipid DSPC.

8. Formulacija LNP prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je „stealth” lipid izabran iz grupe PEG2k-DMG i PEG2k-C11.

9. Formulacija LNP prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je „stealth” lipid PEG2k-DMG.

10. Formulacija LNP prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je jonizujući lipid Lipid A.

11. Formulacija LNP prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu najmanje jedna LNP formulacija sadrži Lipid B, holesterol, DSPC i PEG2k-DMG.

12. Formulacija LNP prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu najmanje jedna LNP formulacija sadrži Lipid A, holesterol, DSPC i PEG2k-DMG.

13. Formulacija LNP prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu lipidne čestice u LNP formulaciji imaju prosečnu veličinu od 75 nm do 150 nm.

14. Formulacija LNP prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu su mRNK i nukleinska kiselina vodeće RNK ko-enkapsulirane u LNP formulaciji.

15. Formulacija LNP prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva za upotrebu u genetskom uređivanju ćelije jetre.

16. Formulacija LNP za upotrebu prema patentnom zahtevu 15, pri čemu je ćelija jetre hepatocit.

17. Formulacija LNP za upotrebu prema patentnom zahtevu 15, pri čemu je ćelija jetre matična ćelija.