RS66924B1 - Htt represori i njihova upotreba - Google Patents

Htt represori i njihova upotreba

Info

Publication number
RS66924B1
RS66924B1 RS20250597A RSP20250597A RS66924B1 RS 66924 B1 RS66924 B1 RS 66924B1 RS 20250597 A RS20250597 A RS 20250597A RS P20250597 A RSP20250597 A RS P20250597A RS 66924 B1 RS66924 B1 RS 66924B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cell
cells
domain
htt
zfp
Prior art date
Application number
RS20250597A
Other languages
English (en)
Inventor
Steven Froelich
Jeffrey C Miller
David Paschon
Edward J Rebar
Bryan Zeitler
H Steve Zhang
Original Assignee
Sangamo Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sangamo Therapeutics Inc filed Critical Sangamo Therapeutics Inc
Publication of RS66924B1 publication Critical patent/RS66924B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
    • C12N15/8645—Adeno-associated virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

OBLAST TEHNIKE
[0001] Ovde su obelodanjeni proteini cinkovih prstiju koji se ne javljaju u prirodi i vezuju za Htt gen, a mogu se koristiti u postupku lečenja i/ili sprečavanja Hantingtonove bolesti.
POZADINA
[0002] Hantingtonova bolest (HB), takođe poznata kao Hantingtonova horeja, je progresivni poremećaj motoričkih, kognitivnih i psihijatrijskih poremećaja. Prosečna starost početka ove bolesti je 35-44 godine, iako se u oko 10% slučajeva početak javlja pre 21. godine, a prosečan životni vek nakon dijagnoze bolesti je 15-18 godina. Učestalost je oko 3 do 7 među 100000 ljudi zapadnoevropskog porekla.
[0003] Hantingtonova bolest je primer poremećaja ekspanzije trinukleotidnih ponavljanja koji su prvi put okarakterisani početkom 1990-ih (videti Di Prospero and Fischbeck (2005) Nature Reviews Genetics 6:756-765 ). Ovi poremećaji uključuju lokalizovano širenje nestabilnih ponavljanja skupova od tri nukleotida i mogu dovesti do gubitka funkcije gena u kome se nalazi prošireno ponavljanje, dobitka toksične funkcije ili oba. Trinukleotidna ponavljanja mogu se nalaziti u bilo kom delu gena, uključujući nekodirajuće i kodirajuće regione gena. Ponavljanja koja se nalaze unutar kodirajućih regiona obično uključuju ili ponovljeni triplet koji kodira glutamin (CAG) ili triplet koji kodira alanin (CGA). Proširena ponavljanja regiona unutar nekodirajućih sekvenci mogu dovesti do abnormalne ekspresije gena, dok proširena ponavljanja unutar kodirajućih regiona (takođe poznata kao poremećaji ponavljanja kodona) mogu izazvati pogrešno savijanje i agregaciju proteina. Tačan uzrok patofiziologije povezane sa aberantnim proteinima često nije poznat.
Tipično, kod gena divljeg tipa koji su podložni trinukleotidnoj ekspanziji, ovi regioni sadrže varijabilan broj ponavljajućih sekvenci u normalnoj populaciji, ali kod pogođenih populacija, broj ponavljanja može se povećati od udvostručavanja do logaritamskog povećanja broja ponavljanja. Kod HH, ponavljanja se ubacuju unutar N-terminalnog kodirajućeg regiona velikog citozolnog proteina Hantingtina (Htt). Normalni Htt aleli sadrže 15-20 CAG ponavljanja, dok se aleli koji sadrže 35 ili više ponavljanja mogu smatrati potencijalno alelima koji izazivaju HD i predstavljaju rizik za razvoj bolesti. Aleli koji sadrže 36-39 ponavljanja smatraju se nepotpuno penetrantnim, a osobe koje nose te alele mogu, ali i ne moraju da razviju bolest (ili mogu razviti simptome kasnije u životu), dok se aleli koji sadrže 40 ili više ponavljanja smatraju potpuno penetrantnim. U stvari, nisu prijavljene asimptomatske osobe koje sadrže HD alele sa ovolikim brojem ponavljanja. One osobe sa juvenilnim početkom HD (<21 godine) često imaju 60 ili više CAG ponavljanja. Pored povećanja CAG ponavljanja, takođe je pokazano da HD može uključivati 1 i 2 pomeranja okvira čitanja unutar ponavljajućih sekvenci, tako da region kodira poli-serinski polipeptid (kodiran AGC ponavljanjima u slučaju 1 pomeranja okvira čitanja) umesto poli-glutamina (Davies and Rubinsztein (2006) Journal of Medical Genetics 43: 893-896).
[0004] Kod HD, mutantni Htt alel se obično nasleđuje od jednog roditelja kao dominantna osobina. Svako dete rođeno od pacijenta sa HD ima 50% šanse da razvije bolest ako drugi roditelj nije bio oboleo od poremećaja. U nekim slučajevima, roditelj može imati srednji HD alel i biti asimptomatski, dok, zbog ekspanzije ponavljanja, dete manifestuje bolest. Pored toga, HD alel takođe može pokazati fenomen poznat kao anticipacija, gde se povećanje težine ili smanjenje starosti početka primećuje tokom nekoliko generacija zbog nestabilne prirode ponavljajućeg regiona tokom spermatogeneze.
[0005] Štaviše, ekspanzija trinukleotida u Htt dovodi do gubitka neurona u projekcionim neuronima srednjeg bodljikavog tipa gama-aminobuterne kiseline (GABA) u strijatumu, pri čemu se gubitak neurona javlja i u neokorteksu. Neuroni srednjeg bodljikavog tipa koji sadrže enkefalin i projektuju se ka spoljašnjem globus palidumu su više uključeni od neurona koji sadrže supstancu P i projektuju se ka unutrašnjem globus palidumu. Druga područja mozga koja su značajno pogođena kod ljudi sa Hantingtonovom bolešću uključuju supstanciju nigru, kortikalne slojeve 3, 5 i 6, CA1 region hipokampusa, angularni girus u parijetalnom režnju, Purkinjeove ćelije malog mozga, lateralna tuberalna jezgra hipotalamusa i centromedijalparafascikularni kompleks talamusa (Walker (2007) Lancet 369:218-228).
[0006] Uloga normalnog Htt proteina je slabo shvaćena, ali može biti uključena u neurogenezu, apoptotsku ćelijsku smrt i transport vezikula. Pored toga, postoje dokazi da divlji tip Htt stimuliše proizvodnju neurotrofičnog faktora izvedenog iz mozga (BDNF), faktora koji doprinosi preživljavanju strijatalnih neurona. Pokazano je da progresija HB korelira sa smanjenjem ekspresije BDNF-a u mišjim modelima HB (Zuccato i dr (2005) Pharmacological Research 52(2): 133-139), i da isporuka BDNF-a ili neurotrofičnog faktora izvedenog iz glijalne ćelijske linije (GDNF) putem isporuke gena posredovane adeno-asociranim virusnim (AAV) vektorom može zaštititi straitalne neurone u mišjim modelima HB (Kells i dr., (2004) Molecular Therapy 9(5): 682-688).
[0007] Dijagnostičke i terapijske mogućnosti za HB su trenutno veoma ograničene. Što se tiče dijagnostike, izmenjeni (mutantni) nivoi Htt (mHTT) su značajno povezani sa rezultatom opterećenja bolešću, a koncentracija rastvorljivih mHTT vrsta se povećava sa progresijom bolesti. Međutim, teško je kvantifikovati mHTT u maloj količini u CNS-u pacijenta, što ograničava i proučavanje uloge u neuropatobiologiji HD in vivo i onemogućava demonstraciju angažovanja cilja lekovima koji snižavaju HTT. Videti npr., Wild i dr. (2014) J Neurol Neurosurg Psychiatry 85:e4.
[0008] Što se tiče lečenja, neke potencijalne metodologije osmišljene da spreče toksičnosti povezane sa agregacijom proteina koja se javlja kroz prošireni poliglutaminski trakt, kao što su prekomerna ekspresija šaperonina ili indukcija odgovora na toplotni šok jedinjenjem geldanamicin, pokazale su smanjenje ovih toksičnosti u in vitro modelima. Drugi tretmani ciljaju ulogu apoptoze u kliničkim manifestacijama bolesti. Na primer, usporavanje simptoma bolesti je pokazano putem blokade aktivnosti kaspaze u životinjskim modelima kod potomstva uparivanja miševa gde je jedan roditelj sadržao HD alel, a drugi roditelj je imao dominantno negativni alel za kaspazu 1. Pored toga, razlaganje mutantnog HD Htt kaspazom može igrati ulogu u patogenosti bolesti. Utvrđeno je da transgeni miševi koji nose mutant Htt otporan na kaspazu-6 održavaju normalnu neuronsku funkciju i nisu razvili strijatalnu neurodegeneraciju u poređenju sa miševima koji nose mutant Htt alel koji nije otporan na kaspazu (videti Graham i dr (2006) Cell 125: 1179-1191). Molekuli koji ciljaju članove apoptotskog puta takođe su pokazali da imaju usporavajući efekat na simptomologiju. Na primer, jedinjenja zVAD-fmk i minociklin, koja oba inhibiraju aktivnost kaspaze, pokazala su da usporavaju manifestaciju bolesti kod miševa. Lek remacemid je takođe korišćen u malim HD ispitivanjima na ljudima jer se smatralo da jedinjenje sprečava vezivanje mutantnog Htt za NDMA receptor kako bi se sprečilo ispoljavanje toksičnih efekata na nervnu ćeliju. Međutim, nisu primećena statistički značajna poboljšanja u funkciji neurona u ovim ispitivanjima. Pored toga, Hantingtonova studijska grupa je sprovela randomizovanu, dvostruko slepu studiju koristeći koenzim Q. Iako je primećen trend ka sporijem napredovanju bolesti kod pacijenata koji su lečeni koenzimom Q10, nije bilo značajne promene u stopi pada ukupnog funkcionalnog kapaciteta. (Di Prospero and Fischbeck, ibid ).
[0009] Rekombinantni transkripcioni faktori i nukleaze koji obuhvataju domene vezivanja za DNK iz proteina cinkovih prstiju („ZFP“), TAL-efektorskih domena („TALE“) i CRISPR/Cas sistema transkripcionih faktora (uključujući Cas i/ili Cfp1 sisteme) imaju sposobnost da regulišu ekspresiju endogenih gena. Videti npr., patenti SAD br.9,045,763 ; 9,005,973 ; 8,956,828 ; 8,945,868 ; 8,586,526 ; 6,534,261 ; 6,599,692 ; 6,503,717 ; 6,689,558 ; 7,067,317 ; 7,262,054 ; 7,888,121 ; 7,972,854 ; 7,914,796 ; 7,951,925 ; 8,110,379 ; 8,409,861 ; patente objave SAD 20030232410 ; 20050208489 ; 20050026157 ; 20050064474 ; 20060063231 ; 20080159996 ; 201000218264 ; 20120017290 ; 20110265198 ; 20130137104 ; 20130122591 ;
20130177983 i 20130177960 i 20150056705 i prijava SAD br.14/706,747 ; Perez-Pinera i dr. (2013) Nature Methods 10:973-976 ; Platek i dr. (2014) Plant Biotechnology J. doi: 10.1111/pbi.12284 ). Dalje, ciljane nukleaze se razvijaju na osnovu sistema Argonaute (npr. iz T. thermophilus, poznatog kao „TtAgo“, videti Swarts i dr (2014) Nature 507(7491): 258-261), koje takođe mogu imati potencijal za upotrebu u uređivanju genoma i genskoj terapiji. Klinička ispitivanja koja koriste ove inženjerske transkripcione faktore koji sadrže proteine cinkovih prstiju pokazala su da su ovi novi transkripcioni faktori sposobni za lečenje različitih stanja. (videti npr., Yu i dr. (2006) FASEB J.20:479-481 ). Nukleazno posredovano razlaganje podrazumeva upotrebu inženjerskih nukleaza za indukovanje dvolančanog prekida (DSB) ili zareza u ciljnoj DNK sekvenci tako da popravka prekida procesom nastalim greškom, kao što je nehomologno spajanje krajeva (NHEJ) ili popravka korišćenjem šablona za popravku (homologno usmerena popravka ili HDR) može rezultirati izbacivanjem gena ili umetanjem sekvence od interesa (ciljana integracija). Uvođenje dvolančanog prekida u odsustvu spoljašnjeg šablona za popravku (npr. „donor“ ili „transgen“) se obično koristi za inaktivaciju ciljanog gena putem mutacija (umetanja i/ili delecija poznatih kao „indeli“) uvedenih ćelijskim NHEJ putem. Na primer, patentne objave SAD 20110082093 i WO 2011/016840 obelodanjuju specifične proteine cinkovih prstiju usmerene na Htt. Patentna objava SAD br.20130253040 i WO 2013/130824 odnose se na proteine koji vezuju DNK i moduliraju ekspresiju HD alela kao što je Htt. Patentna objava SAD br. 20150335708 odnosi se na postupke modifikovanja srednjih bodljikavih neurona. EP 2441774 obelodanjuje okvire peptida sa cinkovim prstima koji se mogu koristiti za modulaciju ekspresije gena in vitro i/ili in vivo.
[0010] Međutim, i dalje postoji potreba za postupcima za dijagnozu, proučavanje, lečenje i/ili prevenciju Hantingtonove bolesti, uključujući i modalitete koji pokazuju široko rasprostranjenu isporuku u mozak. REZIME
[0011] Predmetni pronalazak pruža neprirodni protein cinkovog prsta koji se vezuje za Htt gen, pri čemu protein cinkovog prsta sadrži 5 domena cinkovog prsta poređanih od F1 do F5, gde domeni cinkovog prsta sadrže sekvence regiona heliksa prepoznavanja poređane kao što je prikazano u jednom redu sledeće tabele:
[0012] Pronalazak takođe pruža fuzione proteine, polinukleotide, AAV vektore i farmaceutske sastave, sve kako je navedeno u patentnim zahtevima.
[0013] Pronalazak dalje pruža postupak modifikovanja ekspresije Htt gena u ćeliji, pri čemu postupak obuhvata davanje ćeliji jednog ili više polinukleotida kako je definisano u patentnim zahtevima, jednog ili više AAV vektora kako je definisano u patentnim zahtevima i/ili jedne ili više farmaceutskih sastava kako je definisano u patentnim zahtevima, pri čemu se postupak sprovodi ex vivo ili in vitro.
[0014] Takođe je obezbeđen polinukleotid kako je definisano u patentnim zahtevima, AAV vektor kako je definisano u patentnim zahtevima i/ili farmaceutski sastav kako je definisan u patentnim zahtevima, za upotrebu u postupku lečenja i/ili sprečavanja Hantingtonove bolesti (HB) kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu postupak obuhvata davanje ispitaniku jednog ili više navedenih polinukleotida, AAV vektora i/ili farmaceutskih sastava gde je funkcionalni domen domen transkripcione represije. '
[0015] Iznenađujuće i neočekivano, sadašnji pronalazači su otkrili da, za razliku od drugih AAV serotipova koji su korišćeni, AAV9 pokazuje široko rasprostranjenu isporuku kroz mozak, uključujući anterogradni i retrogradni aksonski transport do regiona mozga udaljenih od mesta primene AAV9.
[0016] U određenim obelodanjivanjima, proteini cinkovih prstiju (ZFP) mogu biti postavljeni u operativnu vezu sa regulatornim domenom (ili funkcionalnim domenom) kao deo fuzionog proteina. Funkcionalni domen može biti, na primer, domen transkripcione aktivacije, domen transkripcione represije i/ili nukleazni (cepajući) domen. Izborom domena aktivacije ili domena represije za upotrebu sa domenom koji vezuje DNK, takvi molekuli se mogu koristiti ili za aktiviranje ili za represiju ekspresije gena. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je molekul koji sadrži ZFP kako je ovde opisano, fuzionisan sa domenom transkripcione represije koji se može koristiti za smanjenje ekspresije mutantnog Htt. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je fuzioni protein koji sadrži ZFP kako je ovde opisano, fuzionisan sa domenom za aktivaciju transkripcije koji može da pojača regulaciju alela divljeg tipa Htt. U određenim otelotvorenjima, aktivnost regulatornog domena je regulisana egzogenim malim molekulom ili ligandom tako da interakcija sa transkripcionim mehanizmom ćelije neće se odvijati u odsustvu egzogenog liganda, dok u drugim otelotvorenjima, egzogeni mali molekul ili ligand sprečava interakciju. Takvi spoljni ligandi kontrolišu stepen interakcije ZFP-TF sa transkripcionim mehanizmom. Regulatorni domen(i) može(ju) biti operativno povezan(i) sa bilo kojim delom(ima) jednog ili više ZFP-ova, uključujući između jednog ili više ZFP-ova, spolja u odnosu na jedan ili više ZFP-ova, i bilo koju njihovu kombinaciju. Bilo koji od fuzionih proteina opisanih ovde može se formulisati u farmaceutski sastav.
[0017] U nekim otelotvorenjima, protein cinkovog prsta, kako je ovde opisan, može biti postavljen u operativnu vezu sa domenima nukleaze (cepanja) kao deo fuzionog proteina. U nekim otelotvorenjima, nukleaza sadrži Ttago nukleazu. Takve nukleaze i fuzije nukleaza mogu se koristiti za ciljanje mutantnih Htt alela u matičnim ćelijama kao što su indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSC), ljudske embrionalne matične ćelije (hESC), mezenhimalne matične ćelije (MSC) ili neuronske matične ćelije, gde će aktivnost fuzije nukleaze rezultirati Htt alelom koji sadrži divlji tip broja CAG ponavljanja. Dakle, bilo koji od Htt represora opisanih ovde može dalje da sadrži domen dimerizacije i/ili funkcionalni domen (npr. domen transkripcione aktivacije, domen transkripcione represije ili domen nukleaze). U određenim otelotvorenjima, obezbeđeni su farmaceutski sastavi koje sadrže modifikovane ćelije (npr., matične ćelije).
[0018] U određenim ostvarenjima, polinukleotid se nosi na virusnom (npr., AAV ili Ad) vektoru i/ili nevirusnom (npr., plazmidnom ili mRNK vektoru). Takođe su obezbeđene ćelije domaćina koje sadrže ove polinukleotide (npr., AAV vektori) i/ili farmaceutski sastavi koji sadrže polinukleotide, proteine i/ili ćelije domaćina kako je ovde opisano.
[0019] U nekim otelotvorenjima, polinukleotid koji kodira protein koji vezuje DNK je mRNK. U nekim aspektima, mRNK može biti hemijski modifikovana (videti npr. Kormann i dr, (2011) Nature Biotechnology 29(2):154-157 ). U drugim aspektima, mRNK može da sadrži ARCA kapu (videti patente SAD 7,074,596 i 8,153,773 ). U daljim otelotvorenjima, mRNK može da sadrži mešavinu nemodifikovanih i modifikovanih nukleotida (videti patentnu objavu SAD 2012-0195936 ).
[0020] U određenim otelotvorenjima, AAV vektor je AAV6 ili AAV9 vektor.
[0021] U medicinskim upotrebama navedenim u patentnim zahtevima, represor se može isporučiti ispitaniku (npr. mozgu) kao protein, polinukleotid ili bilo koja kombinacija proteina i polinukleotida. U određenim otelotvorenjima, represor(i) se isporučuje(ju) korišćenjem AAV (npr., AAV9) vektora. U drugim otelotvorenjima, represor(i) se isporučuje(ju) korišćenjem kombinacije bilo koje od ovde opisanih ekspresionih konstrukcija, na primer jedan represor (ili njegov deo) na jednoj ekspresionoj konstrukciji (npr., AAV kao što je AAV9) i jedan represor (ili njegov deo) na posebnoj ekspresionoj konstrukciji (AAV ili druga virusna ili nevirusna konstrukcija).
[0022] Štaviše, u bilo kojoj od medicinskih upotreba navedenih u patentnim zahtevima, represori se mogu isporučiti u bilo kojoj koncentraciji (dozi) koja pruža željeni efekat. U preferiranim otelotvorenjima, represor se isporučuje korišćenjem adeno-asociranog virusnog vektora u količini od 10000 - 500000 vektor genom/ćelija (ili bilo koja vrednost između toga). U određenim otelotvorenjima, represor se isporučuje korišćenjem lentivirusnog vektora u MOI između 250 i 1000 (ili bilo koja vrednost između toga). U drugim otelotvorenjima, represor se isporučuje korišćenjem plazmidnog vektora u količini od 150-1500 ng/100000 ćelija (ili bilo koja vrednost između toga). U drugim otelotvorenjima, represor se isporučuje kao mRNK u količini od 150-1500 ng/100000 ćelija (ili bilo koja vrednost između toga).
[0023] U bilo kojoj od medicinskih upotreba navedenih u patentnim zahtevima, postupak može dati oko 70% ili više, oko 75% ili više, oko 85% ili više, oko 90% ili više, oko 92% ili više, ili oko 95% ili više represije mutantnih Htt alela u jednom ili više HD neurona ispitanika.
[0024] U nekim otelotvorenjima, terapijska efikasnost se meri korišćenjem Unificirane skale za procenu Hantingtonove bolesti (UHDRS) (Huntington Study Group (1996) Mov Disord 11(2):136-142) za analizu očiglednih kliničkih simptoma. U drugim otelotvorenjima, efikasnost kod pacijenata se meri korišćenjem PET i MRI snimanja. U nekim otelotvorenjima, tretman mutantnim Htt modulirajućim transkripcionim faktorom sprečava svaki dalji razvoj očiglednih kliničkih simptoma i sprečava svaki dalji gubitak funkcionalnosti neurona. U drugim otelotvorenjima, tretman mutantnim Htt modulirajućim transkripcionim faktorom poboljšava kliničke simptome i poboljšava funkciju neurona.
KRATAK OPIS SLIKA
[0025]
Slike 1A do 1J prikazuju rezultate nakon infuzije AAV9 vektora u NHP putamen. Uporedni paneli za MRI-vođenu infuziju AAV9-GFP (100 µL) u bilateralni putamen dva normalna ne-humana primata (označena kao NHP-1 i NHP-2) prikazani su na Slikama 1A i 1B, a trodimenzionalne rekonstrukcije svakog ispitanika prikazane su na slikama 1C i 1D. Rekonstruisane zapremine za svaki putamen (n=4), označene plavom bojom, iznosile su približno 850 µL za NHP-1 i 625 µL za NHP-2. Infuzija koja sadrži AAV9-GFT čestice i helatni gadolinijumski reagens za snimanje, označen narandžastom bojom, raspoređen je u približno 350 µL za svaku infuziju. Slike 1E, 1F i 1G prikazuju koronalni, sagitalni levi i sagitalni desni prikaz (respektivno) putanja kanile NHP-1, a Slike 1H, 1I i 1J prikazuju koronalni, sagitalni levi i sagitalni desni prikaz (respektivno) putanja kanile NHP-2.
Slike od 2A do 2H prikazuju AAV9-posredovanu ekspresiju GFP-a u putamenu NHP-a i urođeni imuni status. Slike 2A i 2B prikazuju GFP bojenje unutar putamena. Slike velikog uvećanja uokvirenih područja prikazane su ispod i prikazuju NeuN-pozitivne ćelije u putamenu kojima je primenjena ili visoka doza („HD“, leva hemisfera 1,5 × 1013 vg/mL) ili niska doza („LD“, desna hemisfera, 1,5 i 1012 vg/mL) vektora. Slike 2C i 2D su grafikoni koji prikazuju primarnu oblast transdukcije (PAT) prikazanu belom bojom, a oblast unutar putamena „van“ GFP-pozitivnog signala je „oPAT“ i prikazana je sivom bojom. Brojanje NeuN-pozitivnih ćelija u tri koronalne ravni pri PAT i oPAT, sprovedeno zajedno sa naivnim kontrolnim NHP ćelijama unutar putamena, nije pokazalo primetnu razliku u NeuN signalu kada su upoređene hemisfere sa niskom i visokom dozom. Brojanje ko-lokalizovanih GFP-pozitivnih/NeuN-pozitivnih ćelija pokazalo je da je transdukcija oko 74% efikasna u PAT sa niskom do nultom efikasnošću u oPAT. Podaci su predstavljeni kao srednji broj ćelija ±SD. P-vrednosti (*) od <0,01 za transdukovane ćelije unutar PAT i oPAT, Vilkoksonov S-test rangiran po znaku. Razmere za Slike 2A do 2D: 50 µM. Slike 2E, 2F, 2G i 2H prikazuju distalno (Slike 2E i 2F) i proksimalno (Slike 2G i 2H) poređenje urođenog imunog statusa. Pojačana ekspresija pozitivno obojenog MHCII (Slike 2E i 2G, skala od 50 µm) i aktivacije Iba1 (Slike 2F i 2H, skala od 200 µm) je prikazana proksimalno od mesta infuzije u poređenju sa distalnim mestom.
Slike 3A do 3F su snimljene i prikazuju ćelijski tropizam AAV9 vektora na mestu infuzije u putamenu naznačenih meta (NeuN, GFAP, Iba1 crvenom bojom), GFP (zelenom bojom) i dvostruko obeležene imunofluorescencije (žutom bojom). Slike 3A, 3B i 3C prikazuju rezultate u NHP-1, a Slike 3D, 3E i 3F prikazuju rezultate u NHP-2. Dvostruko obeležena imunofluorescencija otkrila je ekspresiju GFP-a i u NeuN-pozitivnim i u GFAP-pozitivnim ćelijskim telima. Nasuprot tome, kapsidi nisu transdukovali Iba1-pozitivna ćelijska tela, što ukazuje da AAV9 izgleda ne transdukuje mikrogliju. Razmere: 50 µm.
Slike 4A i 4B prikazuju retrogradni aksonski transport AAV9 iz putamena u korteks. Koronalni preseci mozga obrađeni od NHP-1 (Slika 4A) i NHP-2 (Slika 4B) anteriorno (i i ii) i zadnje (iii i iv) do trakta kanile pokazali su snažan aksonski transport AAV9-GFP duž kortiko-strijatalnih projekcija. Slike velikog uvećanja područja unutar crnog kvadrata označenih sa "i", "ii", "iii" i "iv." pokazuju povećanu ekspresiju GFP-a u kortikalnim ćelijskim telima i vlaknima unutar hemisfere koja prima vektor visoke doze, što ukazuje na efekat doze u odnosu na kontralateralnu stranu. Razmere: 200 µm.
Slike 5A i 5B prikazuju aksonski transport do distalnih regiona. Slika 5A prikazuje rezultate iz NHP-1, a Slika 5B prikazuje rezultate iz NHP-2. Infuzija AAV9 u putamen je rezultirala GFP-pozitivnim ćelijama u mnogim distalnim regionima za koje se zna da primaju efekte iz putamena. Prikazana je anti-GFP imunohistohemija sa približnim položajem svakog koronalnog preseka 12 mm iza trakta kanile. Slike velikog uvećanja ispod odgovaraju levoj i desnoj hemisferi globus palidusa („GP“), talamusa, subtalamske nukleaze („STN“), medijalnog snopa prednjeg mozga („MFB“) i supstancije nigre („SN“). Razmere: 500 µM.
Slike 6A i 6B prikazuju aksonski transport AAV do substantia nigra pars reticulata i pars compacta. Slika 6A prikazuje rezultate u NHP-1, a Slika 6B prikazuje rezultate u NHP-2. Dvostruko obeležena imunofluorescencija (žuta) je vidljiva za GFP-pozitivne (zelene) i tirozin hidroksilazu-pozitivne (crvene) ćelijske kodove i vlakna substantia nigra pars compacta („Snc“) i u vlaknima part reticulata („SNr“). Bojenje tirozin hidroksilazom („TH“) identifikuje dopaminergičke neurone. Transdukcija ćelijskih tela u SNr i SNc pokazuje i anterogradni i retrogradni aksonski transport, respektivno. Povećana ekspresija GFP-a je primećena između ipsilateralne (visoka doza) i kontralateralne (niska doza) hemisfere.
Razmere: 500 µm.
Slika 7 je šematski prikaz neuronskih puteva povezivanja u mozgu primata. Ilustrovani anterogradni i retrogradni transportni sistem i efekat doze između visoke (levo) i niske (desno) NHP moždane hemisfere. Virusne čestice AAV9-GFP na mestu strijatalne injekcije („Str“), osenčene sivom bojom, transportovane su retrogradno u sekundarne oblasti mozga, uključujući korteks („Ctx“), talamus („Th“) i substantia nigra parts compacta („SNc“). Anterogradni transport virusnih čestica usmeren na delove retikulate („SNr“). Transport, bilo perivaskularnim širenjem ili anterogradnim aksonskim putem do globus palidusa („GP“), doveo je do aksonskog transporta do subtalamičnog jedra („STN“). Prisustvo neuronskih GFP-pozitivnih vlakana naznačeno je sivim crtama, a tela GFP-pozitivnih ćelija crnim tačkama. Odsustvo transdukovanih ćelijskih tela naznačeno je praznim krugovima.
Slika 8 je grafikon koji prikazuje profile ekspresije ili gena divljeg tipa Htt (sive trake, CAG18) ili mutantnog Htt gena (crne trake, CAG45) u fibroblastima pacijenata sa HD koji su lečeni sa ZFP 46025, ZFP 45643 ili GFP kontrolom. Podaci pokazuju da, iako je ekspresija alela divljeg tipa Htt prilično konstantna u svim uzorcima, ćelije koje su tretirane mutantnim Htt-specifičnim ZFP-ovima imale su smanjenu ekspresiju mutantnog Htt pri višim dozama ZFP mRNK.
Slika 9 je grafikon koji prikazuje profile ekspresije ili gena divljeg tipa Htt (sive trake, CAG21) ili mutantnog gena Htt (crne trake, CAG38) u fibroblastima pacijenata sa HD koji su lečeni sa ZFP 46025, ZFP 45643 ili GFP kontrolom. Podaci pokazuju da, iako je ekspresija alela divljeg tipa Htt prilično konstantna u svim uzorcima, ćelije koje su tretirane mutantnim Htt-specifičnim ZFP-ovima imale su smanjenu ekspresiju mutantnog Htt pri višim dozama ZFP mRNK.
Slika 10 je grafikon koji prikazuje profile ekspresije ili gena divljeg tipa Htt (sive trake, CAG17) ili gena mutantnog Htt (crne trake, CAG48) u neuronima koji su diferencirani iz embrionalnih matičnih ćelija HD. Podaci pokazuju da je pri višim dozama mRNK koje kodiraju ZFP, mutantni Htt gen bio potisnut, dok alel divljeg tipa Htt nije.
Slike 11A i 11B su grafikoni koji prikazuju represiju Htt u CAG17/48 diferenciranim neuronima gde su ZFP-ovi isporučeni korišćenjem virusnih vektora AAV6 ili AAV9. AAV6 vektori (slika 11A) ili AAV9 vektori (Slika 11B) koji kodiraju ZFP 46025, 45643 ili GFP kontrolu korišćeni su za infekciju neurona diferenciranih iz HD embrionalnih matičnih ćelija (ESC) GENEA020 (GENEA/CHDI) u duplikatu. Podaci pokazuju da je mutantni Htt alel bio represiran ZFP-ovima kada su isporučeni AAV6 ili AAV9 u poređenju sa ćelijama tretiranim GFP kontrolom ili onima koje su prošle kroz protokol lažne infekcije.
Slike 12A i 12B su grafikoni koji prikazuju efekat tretmana sa ZFP-ovima na fenotipske karakteristike HD neurona. Slika 12A pokazuje da su nivoi ATP-a u neuronima viši u HD neuronima tretiranim ZFP-ovima nego u ćelijama tretiranim VENUS kontrolom ili ćelijama tretiranim imitiranom grupom.
Poređenja radi, neuroni divljeg tipa ne pokazuju nikakav efekat od tretmana ZFP-om. Slika 12B prikazuje procenat ćelija koje su pozitivne na TUNEL (marker za apoptozu) i pokazuje da HD neuroni tretirani ZFP-ovima imaju manji broj TUNEL pozitivnih ćelija nego kontrolni uzorci. Radi poređenja, grafikon takođe prikazuje podatke iz neurona divljeg tipa.
Slike 13A do 13C su grafikoni koji prikazuju in vivo aktivnost ZFP-ova testiranih kod heterozigotnih miševa HdhQ50/Hdh+ (Q50) intrastrijatalnom injekcijom AAV9 vektora koji kodiraju ZFP 46025, ZFP 45643 ili GFP kontrolu. Q50 miševi sadrže knock-in alel gde je ekson 1 endogenog mišjeg Hdh gena zamenjen eksonom 1 ljudskog Htt gena sa 48 CAG-ova. Pet nedelja nakon injekcije, alel-specifična qRT-PCR analiza tretiranog strijatuma pokazala je da ZFP 45643 i ZFP 46025 potiskuju mutantni Htt alel (Q50) za 79% i 74%, respektivno, u odnosu na kontrolu kojoj je ubrizgan nosač; alel divljeg tipa (Q7) nije bio regulisan nijednim ZFP-om (Slika 13A i 13B). Aktivnost ZFP 45643 je takođe testirana 12 nedelja nakon injekcije (Slika 13C), i primećena je značajna represija (70%) mutantnog Htt (Q50) bez represije alela divljeg tipa (Q7).
DETALJAN OPIS
[0026] Praksa postupaka, kao i priprema i upotreba ovde opisanih sastava, koriste, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike u molekularnoj biologiji, biohemiji, strukturi i analizi hromatina, računarskoj hemiji, ćelijskoj kulturi, rekombinantnoj DNK i srodnim oblastima, koje su u okviru veštine u ovoj oblasti. Ove tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Videti, na primer, Sambrook i dr.
MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel i dr., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego ; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol.304, "Chromatin" (P.M.
Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999 ; i METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.
Definicije
[0027] Termini „nukleinska kiselina“, „polinukleotid“ i „oligonukleotid“ koriste se naizmenično i odnose se na dezoksiribonukleotidni ili ribonukleotidni polimer, u linearnoj ili kružnoj konformaciji, i u jednolančanom ili dvolančanom obliku. Za potrebe predmetnog obelodanjivanja, ovi termini ne treba tumačiti kao ograničavajući u pogledu dužine polimera. Termini mogu obuhvatiti poznate analoge prirodnih nukleotida, kao i nukleotide koji su modifikovani u baznim, šećernim i/ili fosfatnim delovima (npr., fosforotioatne lančane lance). Generalno, analog određenog nukleotida ima istu specifičnost uparivanja baza; tj. analog A će se upariti bazama sa T.
[0028] Termini „polipeptid“, „peptid“ i „protein“ koriste se naizmenično da bi se odnosili na polimer aminokiselinskih ostataka. Termin se takođe primenjuje na polimere aminokiselina u kojima su jedna ili više aminokiselina hemijski analozi ili modifikovani derivati odgovarajuće prirodne aminokiseline.
[0029] „Vezivanje“ se odnosi na sekvencijalno specifičnu, nekovalentnu interakciju između makromolekula (npr., između proteina i nukleinske kiseline). Nisu sve komponente interakcije vezivanja specifične za sekvencu (npr., kontakti sa fosfatnim ostacima u DNK skeletu), sve dok je interakcija u celini sekvencijalno specifična. Takve interakcije se generalno karakterišu konstantom disocijacije (Kd) od 10-6 M-1 ili nižom. „Afinitet“ se odnosi na jačinu vezivanja: povećani afinitet vezivanja je u korelaciji sa nižim Kd.
[0030] „Vezujući protein“ je protein koji je sposoban da se nekovalentno veže za drugi molekul. Vezujući protein može se vezati, na primer, za molekul DNK (protein koji vezuje DNK), molekul RNK (protein koji vezuje RNK) i/ili molekul proteina (protein koji vezuje protein). U slučaju proteina koji vezuje protein, on se može vezati za sebe (da bi formirao homodimere, homotrimere itd.) i/ili se može vezati za jedan ili više molekula drugog proteina ili proteina. Vezujući protein može imati više od jedne vrste aktivnosti vezivanja. Na primer, proteini cink prsta imaju aktivnost vezivanja DNK, vezivanja RNK i vezivanja proteina.
[0031] „Protein cink prsta koji vezuje DNK“ (ili vezivni domen) je protein, ili domen unutar većeg proteina, koji vezuje DNK na način specifičan za sekvencu putem jednog ili više cink prstiju, koji su regioni sekvence aminokiselina unutar vezivnog domena čija je struktura stabilizovana koordinacijom cinkovog jona. Termin protein koji vezuje DNK sa cinkovim prstom često se skraćuje kao protein sa cinkovim prstom ili ZFP.
[0032] „TALE domen za vezivanje DNK“ ili „TALE“ je polipeptid koji sadrži jedan ili više TALE ponavljajućih domena/jedinica. Ponavljajući domeni su uključeni u vezivanje TALE-a za njegovu srodnu ciljnu DNK sekvencu. Jedna „ponavljajuća jedinica“ (takođe se naziva „ponavljanje“) je tipično dugačka 33-35 aminokiselina i pokazuje barem neku homologiju sekvence sa drugim TALE ponavljajućim sekvencama unutar prirodno prisutnog TALE proteina. Videti, npr., patent SAD br.8,586,526.
[0033] „TtAgo“ je prokariotski argonavtski protein za koji se smatra da je uključen u utišavanje gena. TtAgo potiče od bakterije Thermus thermophilus. Videti npr., Swarts i dr (2014) Nature 507(7491):258-261 , G. Sheng i dr., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.111, 652 ). „TtAgo sistem“ obuhvata sve potrebne komponente, uključujući, na primer, vodiče DNK za razlaganje pomoću TtAgo enzima. „Rekombinacija“ se odnosi na proces razmene genetskih informacija između dva polinukleotida, uključujući, ali ne ograničavajući se na, hvatanje donora nehomolognim spajanjem krajeva (NHEJ) i homolognu rekombinaciju. Za potrebe predmetnog obelodanjivanja, „homologna rekombinacija (HR)“ se odnosi na specijalizovani oblik takve razmene koji se odvija, na primer, tokom popravke dvolančanih prekida u ćelijama putem mehanizama popravke usmerenih na homologiju. Ovaj proces zahteva homologiju nukleotidne sekvence, koristi „donorski“ molekul za popravku „ciljnog“ molekula (tj. onog koji je doživeo dvolančani prekid) i poznat je pod različitim nazivima kao „nekrosover genska konverzija“ ili „genska konverzija kratkog trakta“, jer dovodi do prenosa genetskih informacija sa donora na cilj. Bez želje da budemo vezani bilo kojom posebnom teorijom, takav transfer može da uključuje korekciju neusklađenosti heterodupleksne DNK koja se formira između oštećene mete i donora, i/ili „sintetski zavisno žarenje lanca“, u kome se donor koristi za resintezu genetskih informacija koje će postati deo mete, i/ili povezane procese. Takav specijalizovani HR često rezultira izmenom sekvence ciljnog molekula tako da se deo ili cela sekvenca donorskog polinukleotida ugrađuje u ciljni polinukleotid.
[0034] Domeni za vezivanje cink prsta ili TALE domeni za vezivanje DNK mogu biti „inženjerisani“ da se vežu za unapred određenu nukleotidnu sekvencu, na primer putem inženjeringa (izmene jedne ili više aminokiselina) regiona spirale za prepoznavanje prirodno prisutnog proteina cink prsta ili inženjeringom RVD-ova TALE proteina. Stoga, inženjerisani proteini cink prsta ili TALE su proteini koji se ne javljaju prirodno. Neograničavajući primeri postupaka za inženjering proteina cink prsta ili TALE su dizajn i selekcija. „Dizajniran“ protein cink prsta ili TALE je protein koji se ne nalazi u prirodi čiji dizajn/sastav uglavnom proizilazi iz racionalnih kriterijuma. Racionalni kriterijumi za dizajn uključuju primenu pravila supstitucije i kompjuterizovanih algoritama za obradu informacija u bazi podataka koja čuva informacije o postojećim ZFP dizajnima i podacima o vezivanju. „Odabrani“ protein cink prsta ili TALE je protein koji se ne nalazi u prirodi čija proizvodnja prvenstveno proizilazi iz empirijskog procesa kao što je fagni displej, interakciona zamka ili hibridna selekcija. Videti, na primer, patente SAD 8,586,526; 6,140,081; 6,453,242; 6,746,838; 7,241,573; 6,866,997; 7,241,574 i 6,534,261; videti takođe WO 03/016496.
[0035] Termin „sekvenca“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu bilo koje dužine, koja može biti DNK ili RNK; može biti linearna, kružna ili razgranata i može biti jednolančana ili dvolančana. Termin „donorska sekvenca“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja je umetnuta u genom. Donorska sekvenca može biti bilo koje dužine, na primer između 2 i 10000 nukleotida dužine (ili bilo koje cele vrednosti između ili iznad toga), poželjno između oko 100 i 1000 nukleotida dužine (ili bilo kog celog broja između), još poželjnije između oko 200 i 500 nukleotida dužine.
[0036] „Ciljno mesto“ ili „ciljna sekvenca“ je sekvenca nukleinske kiseline koja definiše deo nukleinske kiseline za koji će se vezujući molekul vezati, pod uslovom da postoje dovoljni uslovi za vezivanje.
[0037] „Egzogeni“ molekul je molekul koji normalno nije prisutan u ćeliji, ali se može uneti u ćeliju jednom ili više genetskih, biohemijskih ili drugih postupaka. „Normalno prisustvo u ćeliji“ se određuje u odnosu na određenu fazu razvoja i uslove okoline ćelije. Tako, na primer, molekul koji je prisutan samo tokom embrionalnog razvoja mišića je egzogeni molekul u odnosu na odraslu mišićnu ćeliju. Slično tome, molekul indukovan toplotnim šokom je egzogeni molekul u odnosu na ćeliju koja nije izložena toplotnom šoku. Egzogeni molekul može da sadrži, na primer, funkcionalnu verziju neispravnog endogenog molekula ili neispravnu verziju normalno funkcionišućeg endogenog molekula.
[0038] Egzogeni molekul može biti, između ostalog, mali molekul, kao što je generisan kombinatornim hemijskim procesom, ili makromolekul kao što je protein, nukleinska kiselina, ugljeni hidrat, lipid, glikoprotein, lipoprotein, polisaharid, bilo koji modifikovani derivat iznad navedenih molekula ili bilo koji kompleks koji sadrži jedan ili više iznad navedenih molekula. Nukleinske kiseline uključuju DNK i RNK, mogu biti jednolančane ili dvolančane; mogu biti linearne, razgranate ili kružne; i mogu biti bilo koje dužine. Nukleinske kiseline uključuju one sposobne da formiraju duplekse, kao i nukleinske kiseline koje formiraju tripleks. Videti, na primer, patente SAD br.5,176,996 i 5,422,251. Proteini uključuju, ali nisu ograničeni na, proteine koji vezuju DNK, transkripcione faktore, faktore remodeliranja hromatina, metilovane proteine koji vezuju DNK, polimeraze, metilaze, demetilaze, acetilaze, deacetilaze, kinaze, fosfataze, integraze, rekombinaze, ligaze, topoizomeraze, giraze i helikaze.
[0039] Egzogeni molekul može biti isti tip molekula kao i endogeni molekul, npr., egzogeni protein ili nukleinska kiselina. Na primer, egzogena nukleinska kiselina može da sadrži inficirajući virusni genom, plazmid ili epizom unet u ćeliju ili hromozom koji normalno nije prisutan u ćeliji. Postupci za unošenje egzogenih molekula u ćelije su poznati stručnjacima u ovoj oblasti i uključuju, ali nisu ograničeni na, lipidom posredovan transfer (tj., lipozome, uključujući neutralne i katjonske lipide), elektroporaciju, direktnu injekciju, ćelijsku fuziju, bombardovanje česticama, koprecipitaciju kalcijum fosfatom, DEAE-dekstranom posredovan transfer i virusnim vektorom posredovan transfer. Egzogeni molekul takođe može biti isti tip molekula kao i endogeni molekul, ali izveden iz druge vrste od koje je ćelija izvedena. Na primer, humana sekvenca nukleinske kiseline može se uvesti u ćelijsku liniju koja je prvobitno izvedena iz miša ili hrčka.
[0040] Nasuprot tome, „endogeni“ molekul je onaj koji je normalno prisutan u određenoj ćeliji u određenoj fazi razvoja pod određenim uslovima okoline. Na primer, endogena nukleinska kiselina može da sadrži hromozom, genom mitohondrije, hloroplasta ili druge organele, ili prirodno prisutnu epizomalnu nukleinsku kiselinu. Dodatni endogeni molekuli mogu da uključuju proteine, na primer, transkripcione faktore i enzime.
[0041] „Fuzioni“ molekul je molekul u kome su dva ili više molekula podjedinica povezana, poželjno kovalentno. Molekuli podjedinica mogu biti istog hemijskog tipa molekula ili mogu biti različitih hemijskih tipova molekula. Primeri prvog tipa fuzionog molekula uključuju, ali nisu ograničeni na, fuzione proteine (na primer, fuzija između ZFP ili TALE DNK-vezujućeg domena i jednog ili više aktivacionih domena) i fuzione nukleinske kiseline (na primer, nukleinska kiselina koja kodira fuzioni protein opisan iznad). Primeri drugog tipa fuzionog molekula uključuju, ali nisu ograničeni na, fuziju između nukleinske kiseline koja formira tripleks i polipeptida, i fuziju između veziva za manje žlebove i nukleinske kiseline. Termin takođe uključuje sisteme u kojima se polinukleotidna komponenta povezuje sa polipeptidnom komponentom da bi formirala funkcionalni molekul (npr., CRISPR/Cas sistem u kome se jedna vodilja RNK povezuje sa funkcionalnim domenom da bi modulirala ekspresiju gena).
[0042] Ekspresija fuzionog proteina u ćeliji može nastati isporukom fuzionog proteina u ćeliju ili isporukom polinukleotida koji kodira fuzioni protein u ćeliju, pri čemu se polinukleotid transkribuje, a transkript se translira, da bi se generisao fuzioni protein. Trans-splajsing, razdvajanje polipeptida i ligacija polipeptida takođe mogu biti uključeni u ekspresiju proteina u ćeliji. Postupci za isporuku polinukleotida i polipeptida u ćelije su predstavljeni na drugim mestima u predmetnom obelodanjivanju.
[0043] „Domen multimerizacije“ (takođe se naziva „domen dimerizacije“ ili „domen interakcije proteina“) je domen ugrađen u amino, karboksi ili amino i karboksi terminalne regione ZFP TF ili TALE TF. Ovi domeni omogućavaju multimerizaciju više ZFP TF ili TALE TF jedinica tako da veći delovi trinukleotidnih ponovljenih domena postaju preferencijalno vezani multimerizovanim ZFP TF ili TALE TF u odnosu na kraće delove sa brojem dužina divljeg tipa. Primeri domena multimerizacije uključuju leucinske rajsferšluse. Domeni multimerizacije mogu biti regulisani i malim molekulima, pri čemu domen multimerizacije pretpostavlja odgovarajuću konformaciju kako bi omogućio interakciju sa drugim domenom multimerizacije samo u prisustvu malog molekula ili spoljašnjeg liganda. Na ovaj način, egzogeni ligandi se mogu koristiti za regulaciju aktivnosti ovih domena.
[0044] „Gen“, za potrebe predmetnog obelodanjivanja, uključuje DNK region koji kodira genski proizvod (videti ispod), kao i sve DNK regione koji regulišu proizvodnju genskog proizvoda, bez obzira da li su takve regulatorne sekvence pored kodirajućih i/ili transkribovanih sekvenci. Shodno tome, gen uključuje, ali nije nužno ograničen na, promoterske sekvence, terminatore, translacione regulatorne sekvence kao što su mesta vezivanja ribozoma i unutrašnja mesta ulaska ribozoma, pojačivače, prigušivače, izolatore, granične elemente, mesta porekla replikacije, mesta vezivanja za matriks i regione kontrole lokusa.
[0045] „Ekspresija gena“ se odnosi na konverziju informacija sadržanih u genu u genski proizvod. Genski proizvod može biti direktan transkripcioni proizvod gena (npr. iRNK, tRNK, rRNK, antisens RNK, ribozim, strukturna RNK ili bilo koja druga vrsta RNK) ili protein proizveden translacijom iRNK. Genski proizvodi takođe uključuju RNK koje su modifikovane procesima kao što su zatvaranje, poliadenilacija, metilacija i editovanje, i proteine modifikovane, na primer, metilacijom, acetilacijom, fosforilacijom, ubikvitinacijom, ADP-ribozilacijom, miristilacijom i glikozilacijom.
[0046] „Modulacija“ genske ekspresije odnosi se na promenu aktivnosti gena. Modulacija ekspresije može uključivati, ali nije ograničena na, aktivaciju gena i represiju gena. Genomsko uređivanje (npr., cepanje, alteracija, inaktivacija, slučajna mutacija) može se koristiti za modulaciju ekspresije. Inaktivacija gena odnosi se na bilo koje smanjenje genske ekspresije u poređenju sa ćelijom koja ne uključuje ZFP ili TALE protein kao što je ovde opisano. Dakle, inaktivacija gena može biti delimična ili potpuna.
[0047] „Region od interesa“ je bilo koji region ćelijskog hromatina, kao što je, na primer, gen ili nekodirajuća sekvenca unutar ili pored gena, u kome je poželjno vezati egzogeni molekul. Vezivanje može biti u svrhu ciljanog cepanja DNK i/ili ciljane rekombinacije. Region od interesa može biti prisutan u hromozomu, epizomu, organelarnom genomu (npr., mitohondrijalnom, hloroplastnom) ili genomu inficirajućeg virusa, na primer. Region od interesa može biti unutar kodirajućeg regiona gena, unutar transkribovanih nekodirajućih regiona kao što su, na primer, liderske sekvence, trejler sekvence ili introni, ili
1
unutar netranskribovanih regiona, bilo uzvodno ili nizvodno od kodirajućeg regiona. Region od interesa može biti mali kao jedan nukleotidni par ili do 2000 nukleotidnih parova dužine, ili bilo koja integralna vrednost nukleotidnih parova.
[0048] „Eukariotske“ ćelije uključuju, ali nisu ograničene na, gljivične ćelije (kao što je kvasac), biljne ćelije, životinjske ćelije, ćelije sisara i ljudske ćelije (npr., T-ćelije).
[0049] Termini „operativno povezivanje“ i „operativno povezano“ (ili „operativno povezano“) koriste se naizmenično u vezi sa jukstapozicijom dve ili više komponenti (kao što su elementi sekvence), u kojima su komponente raspoređene tako da obe komponente normalno funkcionišu i dozvoljavaju mogućnost da barem jedna od komponenti može posredovati u funkciji koja se vrši na barem jednoj od ostalih komponenti.
Ilustracije radi, transkripciona regulatorna sekvenca, kao što je promotor, je operativno povezana sa kodirajućom sekvencom ako transkripciona regulatorna sekvenca kontroliše nivo transkripcije kodirajuće sekvence kao odgovor na prisustvo ili odsustvo jednog ili više transkripcionih regulatornih faktora.
Transkripciona regulatorna sekvenca je generalno operativno povezana in cis sa kodirajućom sekvencom, ali ne mora biti direktno pored nje. Na primer, pojačivač je transkripciona regulatorna sekvenca koja je operativno povezana sa kodirajućom sekvencom, iako nisu susedne.
[0050] Što se tiče fuzionih polipeptida, termin „operativno povezan“ može se odnositi na činjenicu da svaka od komponenti obavlja istu funkciju u vezi sa drugom komponentom kao što bi to činila da nije tako povezana. Na primer, u vezi sa fuzionim polipeptidom u kome je ZFP ili TALE DNK-vezujući domen spojen sa aktivacionim domenom, ZFP ili TALE DNK-vezujući domen i aktivacioni domen su u operativnoj vezi ako je, u fuzionom polipeptidu, deo ZFP ili TALE DNK-vezujućeg domena u stanju da se veže za svoje ciljno mesto i/ili svoje mesto vezivanja, dok je aktivacioni domen u stanju da pojača ekspresiju gena. ZFP-ovi fuzirani sa domenima sposobnim za regulisanje ekspresije gena zajednički se nazivaju „ZFP-TF“ ili „transkripcioni faktori cink prsta“, dok se TALE-ovi fuzirani sa domenima sposobnim za regulisanje ekspresije gena zajednički nazivaju „TALE-TF“ ili „TALE transkripcioni faktori“. Kada je fuzioni polipeptid u kome je ZFP DNK-vezujući domen spojen sa domenom za cepanje („ZFN“ ili „cink prst nukleaza“), ZFP DNK-vezujući domen i domen za cepanje su u operativnoj vezi ako je u fuzionom polipeptidu deo ZFP DNK-vezujućeg domena u stanju da se veže za svoje ciljno mesto i/ili svoje mesto vezivanja, dok je domen za cepanje u stanju da cepa DNK u blizini ciljnog mesta. Kada je fuzioni polipeptid u kome je TALE DNK-vezujući domen spojen sa domenom za cepanje („TALEN“ ili „TALE nukleaza“), TALE DNK-vezujući domen i domen za cepanje su u operativnoj vezi ako je u fuzionom polipeptidu deo TALE DNK-vezujućeg domena u stanju da se veže za svoje ciljno mesto i/ili svoje mesto vezivanja, dok je domen za cepanje u stanju da cepa DNK u blizini ciljnog mesta. U odnosu na fuzioni polipeptid u kome je Cas DNK-vezujući domen spojen sa aktivacionim domenom, Cas DNK-vezujući domen i aktivacioni domen su u operativnoj vezi ako je u fuzionom polipeptidu deo Cas DNK-vezujućeg domena u stanju da se veže za svoje ciljno mesto i/ili svoje mesto vezivanja, dok je aktivacioni domen u stanju da poveća ekspresiju gena. Kada je fuzioni polipeptid u kome je Cas DNK-vezujući domen spojen sa domenom cepanja, Cas DNK-vezujući domen i domen cepanja su u operativnoj vezi ako je u fuzionom polipeptidu deo Cas DNK-vezujućeg domena u stanju da se veže za svoje ciljno mesto i/ili svoje mesto vezivanja, dok je domen cepanja u stanju da cepa DNK u blizini ciljnog mesta.
[0051] „Funkcionalni fragment“ proteina, polipeptida ili nukleinske kiseline je protein, polipeptid ili nukleinska kiselina čija sekvenca nije identična proteinu, polipeptidu ili nukleinskoj kiselini pune dužine, ali zadržava istu funkciju kao protein, polipeptid ili nukleinska kiselina pune dužine. Funkcionalni fragment može posedovati više, manje ili isti broj ostataka kao odgovarajući nativni molekul i/ili može sadržati jednu ili više aminokiselinskih ili nukleotidnih supstitucija. Postupci za određivanje funkcije nukleinske kiseline (npr., kodirajuća funkcija, sposobnost hibridizacije sa drugom nukleinskom kiselinom) su dobro poznate u struci. Slično tome, postupci za određivanje funkcije proteina su dobro poznate. Na primer, funkcija vezivanja DNK polipeptida može se odrediti, na primer, filterskim vezivanjem, elektroforetskim pomeranjem mobilnosti ili imunoprecipitacijom. Cepanje DNK može se testirati gel elektroforezom. Videti Ausubel i dr., supra. Sposobnost proteina da interaguje sa drugim proteinom može se odrediti, na primer, koimunoprecipitacijom, dvohibridnim testovima ili komplementacijom, kako genetskom tako i biohemijskom. Videti, na primer, Fields i dr. (1989) Nature 340:245-246 ; patent SAD br.5,585,245 i PCT WO 98/44350.
[0052] „Vektor“ je sposoban da prenosi genske sekvence u ciljne ćelije. Tipično, „vektorska konstrukcija“, „ekspresioni vektor“ i „vektor za prenos gena“ označavaju bilo koju konstrukciju nukleinske kiseline sposobnu da usmeri ekspresiju gena od interesa i koja može da prenese genske sekvence u ciljne ćelije. Dakle, termin uključuje kloniranje i ekspresione nosače, kao i integrišuće vektore.
[0053] „Reporterski gen“ ili „reporterska sekvenca“ odnosi se na bilo koju sekvencu koja proizvodi proteinski proizvod koji se lako meri, poželjno, iako ne nužno, u rutinskom testu. Pogodni reporterski geni uključuju, ali nisu ograničeni na, sekvence koje kodiraju proteine koji posreduju u otpornosti na antibiotike (npr., otpornost na ampicilin, otpornost na neomicin, otpornost na G418, otpornost na puromicin), sekvence koje kodiraju obojene ili fluorescentne ili luminescentne proteine (npr., zeleni fluorescentni protein, poboljšani zeleni fluorescentni protein, crveni fluorescentni protein, luciferaza) i proteine koji posreduju u poboljšanom rastu ćelija i/ili amplifikaciji gena (npr., dihidrofolat reduktaza). Epitopske oznake uključuju, na primer, jednu ili više kopija FLAG, His, myc, Tap, HA ili bilo koje detektabilne aminokiselinske sekvence. „Ekspresione oznake“ uključuju sekvence koje kodiraju reportere koji mogu biti operativno povezani sa željenom genskom sekvencom kako bi se pratila ekspresija gena od interesa.
Domeni koji se vezuju za DNK
[0054] Postupci opisani ovde koriste sastave, na primer Htt-modulišuće transkripcione faktore, koji sadrže DNK-vezujući domen koji se specifično vezuje za ciljnu sekvencu u Htt genu, posebno one koji se vezuju za mutantni Htt alel koji sadrži više trinukleotidnih ponavljanja. Bilo koji polinukleotidni ili polipeptidni DNK-vezujući domen može se koristiti u sastavima i postupcima opisanim ovde, na primer proteini koji se vezuju za DNK (npr., ZFP ili TALE) ili polinukleotidi koji se vezuju za DNK (npr., jednostruke vodeće RNK).
[0055] Izbor ciljnih mesta; ZFP-ovi i postupci za dizajn i konstrukciju fuzionih proteina (i polinukleotida koji ih kodiraju) poznati su stručnjacima u ovoj oblasti i detaljno su opisani u patentima SAD br.6,140,081 ; 5,789,538 ; 6,453,242 ; 6,534,261 ; 5,925,523 ; 6,007,988 ; 6,013,453 ; 6,200,759 ; WO 95/19431 ; WO 96/06166 ; WO 98/53057 ; WO 98/54311 ; WO 00/27878 ; WO 01/60970 WO 01/88197 ; WO 02/099084 ; WO 98/53058 ; WO 98/53059 ; WO 98/53060 ; WO 02/016536 i WO 03/016496.
[0056] ZFP-ovi takođe mogu biti fuzioni proteini koji uključuju jedan ili više regulatornih domena, koji domeni mogu biti domeni transkripcione aktivacije ili represije. U nekim otelotvorenjima, fuzioni protein sadrži dva ZFP DNK vezujuća domena povezana zajedno. Ovi cinkovi proteini mogu stoga da sadrže 8, 9, 10, 11, 12 ili više prstiju. U nekim otelotvorenjima, dva DNK vezujuća domena su povezana preko produžnog fleksibilnog linkera tako da jedan DNK vezujući domen sadrži 4, 5 ili 6 cinkovih prstiju, a drugi DNK vezujući domen sadrži dodatnih 4, 5 ili 5 cinkovih prstiju. U nekim otelotvorenjima, veznik je standardni međuprstni veznik tako da niz prstiju sadrži jedan DNK vezujući domen koji sadrži 8, 9, 10, 11 ili 12 ili više prstiju. U drugim otelotvorenjima, veznik je atipični veznik kao što je fleksibilni veznik. DNK vezujući domeni su spojeni sa najmanje jednim regulatornim domenom i mogu se smatrati arhitekturom „ZFP-ZFP-TF“. Specifični primeri ovih otelotvorenja mogu se nazvati „ZFP-ZFP-KOX“, koji obuhvata dva domena za vezivanje DNK povezana fleksibilnim veznikom i fuzionirana sa KOX represorom, i „ZFP-KOX-ZFP-KOX“, gde su dva ZFP-KOX fuziona proteina fuzionirana zajedno preko veznika.
[0057] „Dvoručni“ proteini sa cinkovim prstom su oni proteini u kojima su dva klastera domena za vezivanje DNK sa cinkovim prstom razdvojena posrednim aminokiselinama tako da se dva domena sa cinkovim prstom vezuju za dva diskontinuirana ciljna mesta. Primer dvoručnog tipa proteina za vezivanje cinkovim prstom je SIP1, gde se klaster od četiri cinkova prsta nalazi na amino-terminusu proteina, a klaster od tri prsta se nalazi na karboksil-terminusu (videti Remacle i dr, (1999) EMBO Journal 18 (18): 5073-5084). Svaki klaster cinkovih prstiju u ovim proteinima je sposoban da se veže za jedinstvenu ciljnu sekvencu, a razmak između dve ciljne sekvence može da obuhvati mnogo nukleotida. Dvoručni ZFP-ovi mogu da uključuju funkcionalni domen, na primer spojen sa jednim ili oba ZFP-a. Stoga će biti očigledno da funkcionalni domen može biti vezan za spoljašnjost jednog ili oba ZFP-a (videti Sliku 1C) ili može biti pozicioniran između ZFP-ova (vezan za oba ZFP-a) (videti Sliku 4).
[0058] Protein cinkovih prstiju koji se ne javlja u prirodi i vezuje za Htt gen ovog pronalaska sadrži sekvence regiona heliksa za prepoznavanje poređane kao što je prikazano u jednom redu Tabele 1 ispod, kao što je navedeno u patentnim zahtevima. Prva kolona u ovoj tabeli je interni referentni naziv (broj) za ZFP i odgovara istom nazivu u koloni 1 Tabele 2. „F“ se odnosi na prst, a broj koji sledi „F“ se odnosi na koji cinkani prst (npr., „F1“ se odnosi na prst 1).
[0059] Sekvenca i lokacija ciljnih mesta ovih proteina su obelodanjeni u Tabeli 2. Nukleotidi u ciljnom mestu koji su u kontaktu sa ZFP heliksima za prepoznavanje su označeni velikim slovima; nukleotidi koji nisu u kontaktu označeni su malim slovima.
[0060] U određenim otelotvorenjima, domeni vezivanja DNK uključuju domen dimerizacije i/ili multimerizacije, na primer, spiralnu zavojnicu (CC) i dimerizujućeg cinkovog prsta (DZ). Videti, patentnu objavu SAD br.20130253040.
Fuzioni molekuli
[0061] Domeni koji vezuju DNK mogu biti spojeni sa bilo kojim dodatnim molekulima (npr., polipeptidima) za upotrebu u postupcima opisanim ovde. U određenim otelotvorenjima, postupci koriste fuzione molekule koji sadrže najmanje jedan ZFP naveden u patentnim zahtevima i heterologni regulatorni (funkcionalni) domen (ili njegov funkcionalni fragment).
[0062] U određenim otelotvorenjima, funkcionalni domen sadrži transkripcioni regulatorni domen.
Uobičajeni domeni uključuju, npr., domene transkripcionih faktora (aktivatori, represori, koaktivatori, korepresori), prigušivače, onkogene (npr., myc, jun, fos, myb, max, mad, rel, ets, bcl, myb, članove porodice mos itd.); enzime za popravku DNK i njihove povezane faktore i modifikatore; enzime za preuređenje DNK i njihove povezane faktore i modifikatore; proteine povezane sa hromatinom i njihove modifikatore (npr., kinaze, acetilaze i deacetilaze); i enzimi koji modifikuju DNK (npr., metiltransferaze, topoizomeraze, helikaze, ligaze, kinaze, fosfataze, polimeraze, endonukleaze) i njihovi povezani faktori i modifikatori. Videti, npr., objavu SAD br.20130253040.
[0063] Pogodni domeni za postizanje aktivacije uključuju aktivacioni domen HSV VP16 (videti, npr., Hagmann i dr., J. Virol.71, 5952-5962 (1997 )) nuklearne hormonske receptore (videti npr., Torchia i dr., Curr. Opin. Cell. Biol.10:373-383 (1998 )); p65 podjedinica nuklearnog faktora kapa B ( Bitko & Barik, J. Virol.72:5610-5618 (1998 ) i Doyle & Hunt, Neuroreport 8:2937-2942 (1997 )); Liu i dr., Cancer Gene Ther.
5:3-28 (1998 )), ili veštačke himerne funkcionalne domene kao što je VP64 ( Beerli i dr., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14623-33 ), i degron ( Molinari i dr., (1999) EMBO J.18, 6439-6447 ). Dodatni primeri domena aktivacije uključuju, Oct 1, Oct-2A, Sp1, AP-2, i CTF1 ( Seipel i dr., EMBO J.11, 4961-4968 (1992 ) kao i p300, CBP, PCAF, SRC1 PvALF, AtHD2A i ERF-2. Videti na primer, Robyr i dr. (2000) Mol.
Endocrinol.14:329-347 ; Collingwood i dr. (1999) J. Mol. Endocrinol.23:255-275 ; Leo i dr. (2000) Gene 245:1-11 ; Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochim. Pol.46:77-89 ; McKenna i dr. (1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol.69:3-12 ; Malik i dr. (2000) Trends Biochem. Sci.25:277-283 ; i Lemon i dr. (1999) Curr. Opin. Genet. Dev.9:499-504. Dodatni primerni domeni aktivacije uključuju, ali nisu ograničeni na, OsGAI, HALF-1, C1, AP1, ARF-5,-6,-7, i -8, CPRF1, CPRF4, MYC-RP/GP, i TRAB1. Videti na primer, Ogawa i dr. (2000) Gene 245:21-29 ; Okanami i dr. (1996) Genes Cells 1:87-99 ; Goff i dr. (1991) Genes Dev.5:298-309 ; Cho i dr. (1999) Plant Mol. Biol.40:419-429 ; Ulmason i dr. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5844-5849 ; Sprenger-Haussels i dr. (2000) Plant J.22:1-8 ; Gong i dr. (1999) Plant Mol. Biol. 41:33-44 ; i Hobo i dr. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15348-15353.
[0064] Primeri domena represije uključuju, ali nisu ograničeni na, KRAB A/B, KOX, TGF-beta-inducibilni
1
rani gen (TIEG), v-erbA, SID, MBD2, MBD3, članovi DNMT familije (npr ., DNMT1, DNMT3A, DNMT3B), Rb, i MeCP2. Videti, na primer Bird i dr. (1999) Cell 99:451-454 ; Tyler i dr. (1999) Cell 99:443-446 ; Knoepfler i dr. (1999) Cell 99:447-450 ; i Robertson i dr. (2000) Nature Genet.25:338-342. Dodatni primeri represivnih domena uključuju, ali nisu ograničeni na, ROM2 i AtHD2A. Videti na primer, Chem i dr. (1996) Plant Cell 8:305-321 ; i Wu i dr. (2000) Plant J.22:19-27.
[0065] Fuzioni molekuli se konstruišu postupcima kloniranja i biohemijske konjugacije koje su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Fuzioni molekuli sadrže domen koji vezuje DNK i funkcionalni domen (npr., domen transkripcione aktivacije ili represije). Fuzioni molekuli takođe opciono sadrže signale nuklearne lokalizacije (kao što su, na primer, oni iz SV40 T-antigena) i epitopske oznake (kao što su, na primer, FLAG i hemaglutinin). Fuzioni proteini (i nukleinske kiseline koje ih kodiraju) su dizajnirani tako da se translacioni okvir za čitanje očuva među komponentama fuzije.
[0066] Fuzije između polipeptidne komponente funkcionalnog domena (ili njegovog funkcionalnog fragmenta) s jedne strane i DNK-vezujućeg domena koji nije protein (npr., antibiotik, interkalator, sredstvo za vezivanje malih žlebova, nukleinska kiselina) s druge strane, konstruišu se postupcima biohemijske konjugacije poznatim stručnjacima u ovoj oblasti. Videti na primer, katalog kompanije Pierce Chemical Company (Rockford, IL). Opisani su postupci i sastavi za stvaranje fuzija između sredstva za vezivanje malih žlebova i polipeptida. Mapp i dr. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3930-3935.
[0067] Fuzioni molekul može biti formulisan sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, kao što je poznato stručnjacima u ovoj oblasti. Videti, na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. izdanje, 1985; i WO 00/42219, u suvlasništvu.
[0068] Funkcionalna komponenta/domen fuzionog molekula može biti izabrana iz bilo koje od različitih komponenti sposobnih da utiču na transkripciju gena kada se fuzioni molekul veže za ciljnu sekvencu preko svog domena za vezivanje DNK. Stoga, funkcionalna komponenta može da uključuje, ali nije ograničena na, različite domene transkripcionih faktora, kao što su aktivatori, represori, koaktivatori, korepresori i prigušivači.
[0069] U određenim otelotvorenjima, fuzioni protein sadrži domen za vezivanje DNK i domen nukleaze da bi se stvorili funkcionalni entiteti koji su u stanju da prepoznaju svoju željenu ciljnu nukleinsku kiselinu preko svojih konstruisanih ZFP domena za vezivanje DNK i da stvore cink prst nukleazu koja uzrokuje da se DNK preseca blizu mesta vezivanja DNK putem nukleazne aktivnosti.
[0070] Domen nukleaze može biti izveden iz bilo koje nukleaze, na primer bilo koje endonukleaze ili egzonukleaze. Neograničavajući primeri odgovarajućih nukleaznih (domena za cepanje) koji se mogu fuzirati sa Htt domenima za vezivanje DNK, kao što je ovde opisano, uključuju domene iz bilo kog restrikcionog enzima, na primer restrikcionog enzima tipa IIS (npr., FokI). U određenim otelotvorenjima, domeni za cepanje su poludomeni za cepanje kojima je potrebna dimerizacija za aktivnost cepanja. Videti npr., patente SAD br.8,586,526 ; 8,409,861 i 7,888,121. Generalno, za cepanje su potrebna dva fuziona proteina ako fuzioni proteini sadrže poludomene za cepanje. Alternativno, može se koristiti jedan protein koji sadrži dva poludomena za cepanje. Dva poludomena cepanja mogu biti izvedena iz iste endonukleaze (ili njenih funkcionalnih fragmenata), ili svaki poludomen cepanja može biti izveden iz različite endonukleaze (ili njenih funkcionalnih fragmenata). Pored toga, ciljna mesta za dva fuziona proteina su poželjno raspoređena jedno u odnosu na drugo, tako da vezivanje dva fuziona proteina za njihova odgovarajuća ciljna mesta postavlja poludomene cepanja u prostornu orijentaciju jedan u odnosu na drugi, što omogućava poludomenima cepanja da formiraju funkcionalni domen cepanja, npr. dimerizacijom.
[0071] Nukleazni domen može takođe biti izveden iz bilo kog meganukleaznog (homing endonukleaznog) domena sa aktivnošću cepanja koji se takođe može koristiti sa nukleazama opisanim ovde, uključujući, ali ne ograničavajući se na I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-Ppo I, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII i I-TevIII.
[0072] Pored toga, domeni cepanja mogu uključivati jednu ili više promena u poređenju sa divljim tipom, na primer za formiranje obligatnih heterodimera koji smanjuju ili eliminišu efekte cepanja van cilja. Videti npr., patente SAD br.7,914,796 ; 8,034,598 ; i 8,623,618.
[0073] Nukleaze, kako je ovde opisano, mogu generisati dvolančane ili jednolančane prekide u dvolančanoj meti (npr., genu). Generisanje jednolančanih prekida („zareza“) je opisano, na primer, u patentu SAD br. 8,703,489, koji opisuje kako mutacija katalitičkog domena jednog od nukleaznih domena rezultira nikazom.
[0074] Dakle, nukleaza (domen cepanja) ili poludomen cepanja može biti bilo koji deo proteina koji zadržava aktivnost cepanja ili koji zadržava sposobnost multimerizacije (npr., dimerizacije) da bi se formirao funkcionalni domen cepanja.
[0075] Alternativno, nukleaze se mogu sastaviti in vivo na ciljnom mestu nukleinske kiseline korišćenjem takozvane tehnologije „razdvojenog enzima“ (videti npr., patentnu objavu SAD br.20090068164).
Komponente takvih razdvojenih enzima mogu se ekspresovati ili na odvojenim ekspresionim konstrukcijama, ili mogu biti povezane u jednom otvorenom okviru za čitanje gde su pojedinačne komponente razdvojene, na primer, samocepajućim 2A peptidom ili IRES sekvencom. Komponente mogu biti pojedinačni domeni za vezivanje cinkovim prstom ili domeni domena za vezivanje nukleinske kiseline meganukleaze.
[0076] Nukleaze se mogu testirati na aktivnost pre upotrebe, na primer u hromozomskom sistemu na bazi kvasca, kao što je opisano u objavi SAD br.20090111119. Konstrukti za ekspresiju nukleaza mogu se lako dizajnirati korišćenjem postupaka poznatih u struci.
[0077] Ekspresija fuzionih proteina može biti pod kontrolom konstitutivnog promotora ili inducibilnog promotora, na primer promotera galaktokinaze koji je aktiviran (de-represiran) u prisustvu rafinoze i/ili galaktoze i represiran u prisustvu glukoze. U određenim otelotvorenjima, promoter samoreguliše ekspresiju fuzionog proteina, na primer putem uključivanja mesta vezivanja visokog afiniteta. Videti, npr., prijavu SAD br.61,955,002, podnetu 18. marta 2014. godine.
Isporuka
[0078] Proteini i/ili polinukleotidi (npr., Htt represori) i sastavi koji sadrže proteine i/ili polinukleotide opisane ovde mogu se isporučiti ciljnoj ćeliji na bilo koji pogodan način, uključujući, na primer, injekciju proteina, putem mRNK i/ili korišćenjem ekspresione konstrukcije (npr., plazmid, lentivirusni vektor, AAV vektor, Ad vektor, itd.). U preferiranim otelotvorenjima, represor se isporučuje korišćenjem AAV9.
[0079] Postupci isporuke proteina koji sadrže proteine cinkovih prstiju, kao što je ovde opisano, opisane su, na primer, u patentima SAD br.6,453,242 ; 6,503,717 ; 6,534,261 ; 6,599,692 ; 6,607,882 ; 6,689,558 ; 6,824,978 ; 6,933,113 ; 6,979,539 ; 7,013,219 ; i 7,163,824.
[0080] Mogu se koristiti bilo koji vektorski sistemi, uključujući, ali ne ograničavajući se na, plazmidne vektore, retrovirusne vektore, lentivirusne vektore, adenovirusne vektore, poksvirusne vektore; vektore herpesvirusa i vektore adeno-asociranih virusa, itd. Videti takođe patente SAD br.8,586,526; 6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; i 7,163,824. Dalje, biće očigledno da bilo koji od ovih vektora može da sadrži jednu ili više sekvenci koje kodiraju proteine koji vezuju DNK. Stoga, kada se jedan ili više Htt represora uvedu u ćeliju, sekvence koje kodiraju proteinske komponente i/ili polinukleotidne komponente mogu se nalaziti na istom vektoru ili na različitim vektorima. Kada se koristi više vektora, svaki vektor može da sadrži sekvencu koja kodira jedan ili više Htt represora ili njihovih komponenti.
[0081] Konvencionalni postupci prenosa gena zasnovane na virusima i nevirusima mogu se koristiti za unošenje nukleinskih kiselina koje kodiraju genetski modifikovane Htt represore u ćelije (npr., ćelije sisara) i ciljna tkiva. Takvi postupci se takođe mogu koristiti za primenu nukleinskih kiselina koje kodiraju takve represore (ili njihove komponente) u ćelije in vitro. U određenim otelotvorenjima, nukleinske kiseline koje kodiraju represore se primenjuju za in vivo ili ex vivo upotrebu u genskoj terapiji. Sistemi za isporuku nevirusnih vektora uključuju DNK plazmide, golu nukleinsku kiselinu i nukleinsku kiselinu kompleksovanu sa sredstvom za isporuku kao što je lipozom ili poloksamer. Sistemi za isporuku virusnih vektora uključuju DNK i RNK viruse, koji imaju epizomalne ili integrisane genome nakon isporuke u ćeliju. Za pregled postupaka genske terapije, videti Anderson, Science 256:808-813 (1992 ); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993 ); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993 ); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993 ); Miller, Nature 357:455-460 (1992 ); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988 ); Vigne, Restorative
1
Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995 ); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995 ); Haddada i dr., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Böhm (eds.) (1995 ); i Yu i dr., Gene Therapy 1:13-26 (1994 ).
[0082] Postupci nevirusne isporuke nukleinskih kiselina uključuju elektroporaciju, lipofekciju, mikroinjekciju, biolistiku, virozome, lipozome, imunolipozome, polikation ili konjugate lipida:nukleinske kiseline, golu DNK, golu RNK, veštačke virione i apsorpciju DNK poboljšanu agensom. Sonoporacija korišćenjem, npr., Sonitron 2000 sistema (Rich-Mar) takođe se može koristiti za isporuku nukleinskih kiselina. U poželjnom otelotvorenju, jedna ili više nukleinskih kiselina se isporučuju kao iRNK. Takođe je poželjna upotreba zatvorenih iRNK radi povećanja translacione efikasnosti i/ili stabilnosti iRNK. Posebno su poželjne ARCA (anti-reverzni cap analog) cap ili njihove varijante. Videti patente SAD US7074596 i US8153773.
[0083] Dodatni primerni sistemi za isporuku nukleinskih kiselina uključuju one koje obezbeđuju Amaxa Biosystems (Keln, Nemačka), Maxcyte, Inc. (Rokvil, Merilend), BTX Molecular Delivery Systems (Holiston, Masačusets) i Copernicus Therapeutics Inc (videti na primer US6008336). Lipofekcija je opisana u npr. patentima SAD br.5,049,386; 4,946,787; i 4,897,355), a reagensi za lipofekciju se prodaju komercijalno (npr., Transfectam™ i Lipofectin™ i Lipofectamine™ RNAiMAX). Katjonski i neutralni lipidi koji su pogodni za efikasnu lipofekciju polinukleotida sa prepoznavanjem receptora uključuju one iz Felgnera, WO 91/17424, WO 91/16024. Isporuka može biti u ćelije (ex vivo primena) ili ciljna tkiva (in vivo primena).
[0084] Priprema kompleksa lipida i nukleinskih kiselina, uključujući ciljane lipozome kao što su imunolipidni kompleksi, dobro je poznata stručnjacima u ovoj oblasti (videti, npr., Crystal, Science 270:404-410 (1995 ); Blaese i dr., Cancer Gene Ther.2:291-297 (1995 ); Behr i dr., Bioconjugate Chem.5:382-389 (1994 ); Remy i dr., Bioconjugate Chem.5:647-654 (1994 ); Gao i dr., Gene Therapy 2:710-722 (1995 ); Ahmad i dr., Cancer Res.52:4817-4820 (1992 ); U.S. Pat. br.4,186,183 , 4,217,344 , 4,235,871 , 4,261,975 , 4,485,054 , 4,501,728 , 4,774,085 , 4,837,028 , i 4,946,787 ).
[0085] Dodatni postupci isporuke uključuju upotrebu pakovanja nukleinskih kiselina koje treba isporučiti u EnGeneIC transportna sredstva (EDV). Ovi EDV se specifično isporučuju u ciljna tkiva korišćenjem bispecifičnih antitela gde jedan krak antitela ima specifičnost za ciljno tkivo, a drugi ima specifičnost za EDV. Antitelo dovodi EDV na površinu ciljne ćelije, a zatim se EDV unosi u ćeliju endocitozom. Jednom kada se nađe u ćeliji, sadržaj se oslobađa (videti MacDiarmid i dr (2009) Nature Biotechnology 27(7):643).
[0086] Upotreba sistema zasnovanih na RNK ili DNK virusima za isporuku nukleinskih kiselina koje kodiraju inženjerske ZFP-ove koristi prednosti visoko razvijenih procesa za ciljanje virusa na određene ćelije u telu i transport virusnog tereta do jedra. Virusni vektori mogu se direktno primenjivati na pacijente (in vivo) ili se mogu koristiti za lečenje ćelija in vitro, a modifikovane ćelije se primenjuju na pacijente (ex vivo). Konvencionalni sistemi zasnovani na virusima za isporuku ZFP-ova uključuju, ali nisu ograničeni na, retrovirusne, lentivirusne, adenovirusne, adeno-asocirane, vektore vakcinije i herpes simpleks virusa za prenos gena. Integracija u genom domaćina je moguća postupcima prenosa gena retrovirusa, lentivirusa i adeno-asociranog virusa, što često rezultira dugoročnom ekspresijom umetnutog transgena. Pored toga, visoka efikasnost transdukcije je primećena u mnogim različitim tipovima ćelija i ciljnim tkivima.
[0087] Tropizam retrovirusa može se promeniti ugradnjom stranih proteina omotača, proširujući potencijalnu ciljnu populaciju ciljnih ćelija. Lentivirusni vektori su retrovirusni vektori koji su sposobni da transdukuju ili inficiraju ćelije koje se ne dele i obično proizvode visoke virusne titre. Izbor sistema za prenos retrovirusnih gena zavisi od ciljnog tkiva. Retrovirusni vektori se sastoje od cis-delujućih dugih terminalnih ponavljanja sa kapacitetom pakovanja za stranu sekvencu do 6-10 kb. Minimalni cis-delujući LTR-ovi su dovoljni za replikaciju i pakovanje vektora, koji se zatim koriste za integraciju terapeutskog gena u ciljnu ćeliju kako bi se obezbedila trajna ekspresija transgena. Široko korišćeni retrovirusni vektori uključuju one zasnovane na virusu mišje leukemije (MuLV), virusu leukemije gibon majmuna (GaLV), virusu imunodeficijencije majmuna (SIV), virusu humane imunodeficijencije (HIV) i njihovim kombinacijama (videti, npr., Buchscher i dr., J. Virol.66:2731-2739 (1992 ); Johann i dr., J. Virol.66:1635-1640 (1992 ); Sommerfelt i dr., Virol. 176:58-59 (1990 ); Wilson i dr., J. Virol.63:2374-2378 (1989 ); Miller i dr., J. Virol.65:2220-2224 (1991 );
1
PCT/US94/05700 ).
[0088] U primenama u kojima je poželjna prolazna ekspresija, mogu se koristiti sistemi zasnovani na adenovirusu. Vektori zasnovani na adenovirusu su sposobni za veoma visoku efikasnost transdukcije u mnogim tipovima ćelija i ne zahtevaju deobu ćelija. Sa takvim vektorima postignuti su visok titar i visoki nivoi ekspresije. Ovaj vektor se može proizvoditi u velikim količinama u relativno jednostavnom sistemu. Vektori adeno-asociranog virusa („AAV“) se takođe koriste za transdukciju ćelija ciljnim nukleinskim kiselinama, npr., u in vitro proizvodnji nukleinskih kiselina i peptida, i za in vivo i ex vivo postupke genske terapije (videti, npr., West i dr., Virology 160:38-47 (1987 ); patent SAD br.4,797,368 ; WO 93/24641 ; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994 ); Muzyczka, J. Clin. Invest.94:1351 (1994 ). Konstrukcija rekombinantnih AAV vektora opisana je u brojnim publikacijama, uključujući U.S. Pat. br.5,173,414 ; Tratschin i dr., Mol. Cell. Biol.5:3251-3260 (1985 ); Tratschin, i dr., Mol. Cell. Biol.4:2072-2081 (1984 ); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984 ); i Samulski i dr., J. Virol.63:03822-3828 (1989 ).
[0089] Trenutno je dostupno najmanje šest pristupa virusnim vektorima za transfer gena u kliničkim ispitivanjima, koji koriste pristupe koji uključuju komplementaciju defektnih vektora genima umetnutim u pomoćne ćelijske linije da bi se generisao transdukcioni agens.
[0090] pLASN i MFG-S su primeri retrovirusnih vektora koji su korišćeni u kliničkim ispitivanjima (Dunbar i dr., Blood 85:3048-305 (1995 ); Kohn i dr., Nat. Med.1:1017-102 (1995 ); Malech i dr., PNAS 94:22 12133-12138 (1997 )). PA317/pLASN je bio prvi terapeutski vektor korišćen u ispitivanju genske terapije. (Blaese i dr., Science 270:475-480 (1995 )). Efikasnost transdukcije od 50% ili više je primećena za MFG-S upakovane vektore. (Ellem i dr., Immunol Immunother.44(1):10-20 (1997 ); Dranoff i dr., Hum. Gene Ther.
1:111-2 (1997 ).
[0091] Rekombinantni adeno-asocirani virusni vektori (rAAV) su obećavajući alternativni sistemi za isporuku gena zasnovani na defektnom i nepatogenom parvovirusu adeno-asociranom virusu tipa 2. Svi vektori su izvedeni iz plazmida koji zadržava samo invertovane terminalne ponavljanja AAV od 145 bp koja okružuju kasetu za ekspresiju transgena. Efikasan prenos gena i stabilna isporuka transgena zbog integracije u genome transdukovane ćelije su ključne karakteristike ovog vektorskog sistema. (Wagner i dr., Lancet 351:91171702-3 (1998 ), Kearns i dr., Gene Ther.9:748-55 (1996 )). Drugi AAV Serotipovi, uključujući AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV 8.2, AAV9 i AAV rh10 i pseudotipizovani AAV kao što su AAV2/8, AAV2/5 i AAV2/6 takođe se mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom. U poželjnim otelotvorenjima, koristi se AAV9.
[0092] Rekombinantni adenovirusni vektori (Ad) sa nedostatkom replikacije mogu se proizvesti u visokom titru i lako inficirati brojne različite tipove ćelija. Većina adenovirusnih vektora je konstruisana tako da transgen zamenjuje gene Ad E1a, E1b i/ili E3; potom se vektor sa nedostatkom replikacije razmnožava u ljudskim ćelijama 293 koje obezbeđuju funkciju obrisanog gena in trans. Ad vektori mogu transdukovati više tipova tkiva in vivo, uključujući ćelije koje se ne dele, diferencirane, kao što su one koje se nalaze u jetri, bubrezima i mišićima. Konvencionalni Ad vektori imaju veliki kapacitet nošenja. Primer upotrebe Ad vektora u kliničkom ispitivanju je uključivao polinukleotidna terapija za antitumorsku imunizaciju intramuskularnom injekcijom (Sterman i dr., Hum. Gene Ther.7:1083-9 (1998 )). Dodatni primeri upotrebe adenovirusnih vektora za prenos gena u kliničkim ispitivanjima uključuju Rosenecker i dr., Infection 24:15-10 (1996 ); Sterman i dr., Hum. Gene Ther.9:71083-1089 (1998 ); Welsh i dr., Hum. Gene Ther.2:205-18 (1995 ); Alvarez i dr., Hum. Gene Ther.5:597-613 (1997 ); Topf i dr., Gene Ther.5:507-513 (1998 );
Sterman i dr., Hum. Gene Ther.7:1083-1089 (1998 ).
[0093] Ćelije za pakovanje se koriste za formiranje virusnih čestica koje su sposobne da inficiraju ćeliju domaćina. Takve ćelije uključuju 293 ćelije, koje pakuju adenovirus, i ps2 ćelije ili PA317 ćelije, koje pakuju retrovirus. Virusni vektori koji se koriste u genskoj terapiji obično se generišu pomoću ćelijske linije proizvođača koja pakuje vektor nukleinske kiseline u virusnu česticu. Vektori obično sadrže minimalne virusne sekvence potrebne za pakovanje i naknadnu integraciju u domaćina (ako je primenljivo), dok se druge virusne sekvence zamenjuju ekspresionom kasetom koja kodira protein koji treba da se ekspresuje. Nedostajuće virusne funkcije se obezbeđuju in trans od strane ćelijske linije za pakovanje. Na primer, AAV vektori koji se koriste u genskoj terapiji obično poseduju samo invertovane terminalne ponavljajuće (ITR)
1
sekvence iz AAV genoma koje su potrebne za pakovanje i integraciju u genom domaćina. Virusna DNK je upakovana u ćelijsku liniju koja sadrži pomoćni plazmid koji kodira druge AAV gene, naime rep i cap, ali mu nedostaju ITR sekvence. Ćelijska linija je takođe inficirana adenovirusom kao pomoćnim genom. Pomoćni virus promoviše replikaciju AAV vektora i ekspresiju AAV gena iz pomoćnog plazmida. Pomoćni plazmid nije upakovan u značajnim količinama zbog nedostatka ITR sekvenci. Kontaminacija adenovirusom može se smanjiti, npr., termičkom obradom na koju je adenovirus osetljiviji od AAV.
[0094] U mnogim primenama genske terapije, poželjno je da se vektor genske terapije isporuči sa visokim stepenom specifičnosti za određeni tip tkiva. Shodno tome, virusni vektor može biti modifikovan da ima specifičnost za dati tip ćelija ekspresijom liganda kao fuzionog proteina sa virusnim proteinom omotača na spoljašnjoj površini virusa. Ligand je izabran tako da ima afinitet za receptor za koji se zna da je prisutan na tipu ćelija od interesa. Na primer, Han i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995 ), izvestio je da se virus mišje leukemije Molonej može modifikovati da ekspresuje ljudski hereregulin spojen sa gp70, a rekombinantni virus inficira određene ćelije raka dojke kod ljudi koje ekspresuju receptor ljudskog epidermalnog faktora rasta. Ovaj princip se može proširiti na druge parove virus-ciljna ćelija, u kojima ciljna ćelija ekspresuje receptor, a virus ekspresuje fuzioni protein koji sadrži ligand za receptor na površini ćelije. Na primer, filamentozni fag može biti inženjerisan tako da prikazuje fragmente antitela (npr., FAB ili Fv) koji imaju specifičan afinitet vezivanja za praktično bilo koji izabrani ćelijski receptor. Iako se iznad navedeni opis prvenstveno odnosi na virusne vektore, isti principi mogu se primeniti i na nevirusne vektore. Takvi vektori mogu biti inženjerisani tako da sadrže specifične sekvence apsorpcije koje favorizuju apsorpciju od strane specifičnih ciljnih ćelija.
[0095] Vektori genske terapije mogu se isporučiti in vivo primenom kod pojedinačnog pacijenta, obično sistemskom primenom (npr. intravenskom, intraperitonealnom, intramuskularnom, subdermalnom ili intrakranijalnom infuzijom, uključujući direktnu injekciju u mozak) ili lokalnom primenom, kao što je opisano u nastavku. Alternativno, vektori se mogu dostaviti ćelijama ex vivo, kao što su ćelije eksplantirane od pojedinačnog pacijenta (npr., limfociti, aspirati koštane srži, biopsija tkiva) ili hematopoetske matične ćelije univerzalnog donora, nakon čega sledi reimplantacija ćelija u pacijenta, obično nakon selekcije ćelija koje su ugradile vektor.
[0096] Izum pruža polinukleotide, AAV vektore i farmaceutske sastave za upotrebu u postupku lečenja i/ili sprečavanja Hantingtonove bolesti (HB), kako je navedeno u patentnim zahtevima. Sastavi se mogu primenjivati direktno u centralni nervni sistem (CNS), uključujući, ali ne ograničavajući se na, direktnu injekciju u mozak ili kičmenu moždinu. Može se ciljati jedna ili više oblasti mozga, uključujući, ali ne ograničavajući se na, hipokampus, crnu supstancu (substantia nigra), bazalno jedro Majnerta (NBM), strijatum i/ili korteks. Alternativno ili pored primene u CNS, sastavi se mogu primenjivati sistemski (npr., intravenozno, intraperitonealno, intrakardijalno, intramuskularno, intratekalno, subdermalno i/ili intrakranijalnom infuzijom Postupci i sastavi za primenu sastava kako je ovde opisano direktno ispitaniku (uključujući direktno u CNS) uključuju, ali nisu ograničene na, direktnu injekciju (npr., stereotaktičku injekciju) putem sklopova igala. Takvi postupci su opisane, na primer, u patentima SAD br.7.837.668; 8.092.429, koji se odnose na isporuku sastava (uključujući vektore ekspresije) u mozak, i u patentnoj objavi SAD br.20060239966.
[0097] Efikasna količina koja se primenjuje variraće od pacijenta do pacijenta i u zavisnosti od načina primene i mesta primene. Shodno tome, efikasne količine najbolje određuje lekar koji daje sastave, a odgovarajuće doze može lako odrediti stručnjak u ovoj oblasti. Nakon što se ostavi dovoljno vremena za integraciju i ekspresiju (obično 4-15 dana, na primer), analiza nivoa terapeutskog polipeptida u serumu ili drugom tkivu i poređenje sa početnim nivoom pre primene utvrdiće da li je količina koja se primenjuje preniska, u pravom opsegu ili previsoka. Pogodni režimi za početnu i naknadne primene su takođe promenljivi, ali su tipični za početnu primenu praćenu naknadnim primenama ako je potrebno. Naknadne primene mogu se davati u različitim intervalima, od svakodnevnih, preko godišnjih, do svakih nekoliko godina. U određenim otelotvorenjima, kada se koristi virusni vektor kao što je AAV, primenjena doza je između 1 × 1010 i 5 × 1015 vg/ml (ili bilo koja vrednost između), još poželjnije između 1 × 1011 i 1 × 1014 vg/ml (ili bilo koja vrednost između), još poželjnije između 1 × 1012 i 1 × 1013 vg/ml (ili bilo koja vrednost između).
1
[0098] Da bi se ZFP-ovi direktno uneli korišćenjem adeno-asociranih virusnih (AAV) vektora u ljudski mozak, može se primeniti raspon doza od 1×1010 -5×1015 (ili bilo koja vrednost između, uključujući na primer između 1 × 1011 i 1 × 1014 vg/ml ili 1 x 1012 i 1 x 1013 vg/ml) vektorskog genoma po strijatumu. Kao što je navedeno, doze mogu varirati za druge strukture mozga i za različite protokole isporuke. Postupci isporuke AAV vektora direktno u mozak su poznate u struci. Videti npr., patente SAD br.9,089,667 ;
9,050,299 ; 8,337,458 ; 8,309,355 ; 7,182,944 ; 6,953,575 ; i 6,309,634.
[0099] Ex vivo transfekcija ćelija za dijagnostiku, istraživanje ili za gensku terapiju (npr., putem reinfuzije transfektovanih ćelija u organizam domaćina) je dobro poznata stručnjacima u ovoj oblasti. U poželjnom otelotvorenju, jedna ili više nukleinskih kiselina Htt represora se isporučuju korišćenjem AAV9. U drugim otelotvorenjima, jedna ili više nukleinskih kiselina Htt represora se isporučuju kao iRNK. Takođe je poželjna upotreba zatvorenih iRNK radi povećanja translacione efikasnosti i/ili stabilnosti iRNK. Posebno su poželjne ARCA (anti-reverzni cap analog) cap ili njihove varijante. Videti patente SAD 7,074,596 i 8,153,773.
Različiti tipovi ćelija pogodni za ex vivo transfekciju dobro su poznati stručnjacima u ovoj oblasti (videti, npr., Freshney i dr., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3. izdanje, 1994)) i reference navedene tamo za diskusiju o tome kako izolovati i kultivisati ćelije od pacijenata).
[0100] U jednom otelotvorenju, matične ćelije se koriste u ex vivo postupcima za transfekciju ćelija i gensku terapiju. Prednost korišćenja matičnih ćelija je u tome što se mogu diferencirati u druge tipove ćelija in vitro ili se mogu uneti u sisara (kao što je donor ćelija) gde će se nakalemiti u koštanu srž. Metode za diferencijaciju CD34+ ćelija in vitro u klinički važne tipove imunih ćelija korišćenjem citokina kao što su GM-CSF, IFN-γ i TNF-α su poznate (videti Inaba i dr., J. Exp. Med.176:1693-1702 (1992 )).
[0101] Matične ćelije se izoluju za transdukciju i diferencijaciju korišćenjem poznatih postupaka. Na primer, matične ćelije se izoluju iz ćelija koštane srži tretiranjem ćelija koštane srži antitelima koja vezuju neželjene ćelije, kao što su CD4+ i CD8+ (T ćelije), CD45+ (panB ćelije), GR-1 (granulociti) i Iad (diferencirane ćelije koje prezentuju antigen) (videti Inaba i dr., J. Exp. Med.176:1693-1702 (1992 )).
[0102] Mogu se koristiti i modifikovane matične ćelije. Na primer, neuronske matične ćelije koje su učinjene otpornim na apoptozu mogu se koristiti kao terapeutske sastave gde matične ćelije takođe sadrže ZFP TF pronalaska. Otpornost na apoptozu može nastati, na primer, nokautiranjem BAX i/ili BAK korišćenjem BAX- ili BAK-specifičnih TALEN ili ZFN (videti američki patent br.8,597,912) u matičnim ćelijama, ili onih koje su poremećene u kaspazi, ponovo korišćenjem ZFN specifičnih za kaspazu-6, na primer. Ove ćelije mogu biti transfektovane sa ZFP TF ili TALE TF za koje je poznato da regulišu mutantni ili divlji tip Htt.
[0103] U medicinskim upotrebama navedenim u patentnim zahtevima, vektori (npr., retrovirusi, adenovirusi, lipozomi itd.) koji sadrže terapeutske ZFP nukleinske kiseline mogu se takođe direktno primeniti u organizam radi transdukcije ćelija in vivo. Alternativno, može se primeniti i gola DNK. Primena se vrši bilo kojim od načina koji se obično koriste za uvođenje molekula u krajnji kontakt sa krvlju ili ćelijama tkiva, uključujući, ali ne ograničavajući se na, injekciju, infuziju, lokalnu primenu i elektroporaciju. Pogodni postupci primene takvih nukleinskih kiselina su dostupni i dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti, i, iako se može koristiti više od jednog načina za primenu određenog sastava, određeni put često može pružiti neposredniju i efikasniju reakciju od drugog puta.
[0104] Postupci za unošenje DNK u hematopoetske matične ćelije su obelodanjeni, na primer, u patentu SAD br.5,928,638. Vektori korisni za unošenje transgena u hematopoetske matične ćelije, npr., CD34+ ćelije, uključuju adenovirus tipa 35.
[0105] Vektori pogodni za unošenje transgena u imune ćelije (npr., T-ćelije) uključuju neintegrišuće lentivirusne vektore. Videti, na primer, Naldini i dr. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388 ; Dull i dr. (1998) J. Virol.72:8463-8471 ; Zuffery i dr. (1998) J. Virol.72:9873-9880 ; Follenzi i dr. (2000) Nature Genetics 25:217-222.
[0106] Farmaceutski prihvatljivi nosači se delimično određuju određenim sastavom koji se primenjuje, kao i određenim postupkom koji se koristi za primenu sastava. Shodno tome, postoji širok spektar odgovarajućih formulacija farmaceutskih sastava, kao što je opisano u nastavku (videti, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. izdanje, 1989).
1
[0107] Kao što je gore navedeno, opisane metode i kompozicije mogu se koristiti u bilo kojoj vrsti ćelija, uključujući, ali ne ograničavajući se na, prokariotske ćelije, gljivične ćelije, arhejske ćelije, biljne ćelije, ćelije insekata, životinjske ćelije, ćelije kičmenjaka, ćelije sisara i ljudske ćelije. Pogodne ćelijske linije za ekspresiju proteina poznate su stručnjacima u ovoj oblasti i uključuju, ali nisu ograničene na, COS, CHO (npr., CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (npr., HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), perC6, ćelije insekata kao što je Spodoptera fugiperda (Sf) i gljivične ćelije kao što su Saccharomyces, Pischia i Schizosaccharomyces. Takođe se mogu koristiti potomci, varijante i derivati ovih ćelijskih linija. U preferiranom otelotvorenju navedenih medicinskih upotreba, polinukleotidi, AAV vektori i/ili farmaceutski sastavi se direktno isporučuju u moždanu ćeliju, na primer u strijatumu.
Primene
[0108] Molekuli koji vezuju Htt (ZFP) kako je ovde opisano, i nukleinske kiseline koje ih kodiraju, mogu se koristiti za različite primene. Ove primene uključuju terapeutske postupke u kojima se molekul koji vezuje Htt (uključujući nukleinsku kiselinu koja kodira protein koji vezuje DNK) primenjuje na ispitanika (npr., AAV kao što je AAV9) i koristi se za modulaciju ekspresije ciljnog gena kod ispitanika. Modulacija može biti u obliku represije, na primer, represije mHtt koji doprinosi bolesnom stanju HD. Alternativno, modulacija može biti u obliku aktivacije kada aktivacija ekspresije ili povećana ekspresija endogenog ćelijskog gena može ublažiti bolesno stanje. U dodatnim otelotvorenjima, modulacija može biti cepanje (npr., jednom ili više nukleaza), na primer, radi inaktivacije mutantnog Htt gena. Kao što je iznad navedeno, za takve primene, molekuli koji vezuju Htt, ili tipičnije, nukleinske kiseline koje ih kodiraju, formulišu se sa farmaceutski prihvatljivim nosačem kao farmaceutski sastav.
[0109] Molekuli koji vezuju Htt, ili vektori koji ih kodiraju, sami ili u kombinaciji sa drugim pogodnim komponentama (npr. lipozomima, nanočesticama ili drugim komponentama poznatim u struci), mogu se pretvoriti u aerosolne formulacije (tj. mogu se „nebulizovati“) za primenu putem inhalacije. Aerosolne formulacije mogu se staviti u prihvatljive propelente pod pritiskom, kao što su dihlordifluorometan, propan, azot i slično. Formulacije pogodne za parenteralnu primenu, kao što je, na primer, intravenska, intramuskularna, intradermalna i potkožna primena, uključuju vodene i nevodene, izotonične sterilne rastvore za injekcije, koji mogu da sadrže antioksidante, pufere, bakteriostatske supstance i rastvorene supstance koje čine formulaciju izotoničnom sa krvlju predviđenog primaoca, i vodene i nevodene sterilne suspenzije koje mogu da sadrže sredstva za suspendovanje, solubilizere, sredstva za zgušnjavanje, stabilizatore i konzervanse. Sastavi se mogu primenjivati, na primer, intravenskom infuzijom, oralno, lokalno, intraperitonealno, intravezikalno, intrakranijalno ili intratekalno. Formulacije jedinjenja mogu biti dostupne u zatvorenim kontejnerima za jediničnu ili višedoznu primenu, kao što su ampule i bočice. Rastvori i suspenzije za injekcije mogu se pripremiti od sterilnih prahova, granula i tableta prethodno opisanih vrsta.
[0110] Doza koja se primenjuje pacijentu treba da bude dovoljna da izazove koristan terapeutski odgovor kod pacijenta tokom vremena. Doza se određuje efikasnošću i Kd određenog molekula koji vezuje Htt koji se koristi, ciljnom ćelijom i stanjem pacijenta, kao i telesnom težinom ili površinom pacijenta koji se leči. Veličina doze je takođe određena postojanjem, prirodom i obimom bilo kakvih neželjenih nuspojava koje prate primenu određenog jedinjenja ili vektora kod određenog pacijenta.
[0111] Koristan terapeutski odgovor može se meriti na više načina. Na primer, može se meriti poboljšanje poremećaja pokreta kod Hantingtonove bolesti, kao što su nevoljni trzaji ili izvijajući pokreti, problemi sa mišićima, kao što su rigidnost ili kontraktura mišića (distonija), spori ili abnormalni pokreti očiju, oštećen hod, držanje i ravnoteža, teškoće sa fizičkom produkcijom govora ili gutanjem i oštećenje voljnih pokreta. Druga oštećenja, kao što su kognitivni i psihijatrijski poremećaji, takođe se mogu pratiti radi utvrđivanja znakova poboljšanja povezanih sa lečenjem. UHDRS skala se može koristiti za kvantifikaciju kliničkih karakteristika bolesti.
[0112] Za pacijente koji su presimptomatski, lečenje može biti posebno važno jer pruža mogućnost lečenja bolesti pre opsežne neurodegeneracije koja se javlja kod Hantingtonove bolesti. Ovo oštećenje počinje pre razvoja očiglednih simptoma opisanih iznad. Patologija HD prvenstveno uključuje toksični efekat mutantnog Htt u strijatalnim srednjim bodljikavim neuronima. Ovi srednji bodljikavi neuroni ekspresuju visoke nivoe
2
fosfodiesteraze 10A (PDE10A) koja reguliše cAMP i cGMP signalne kaskade koje su uključene u faktore transkripcije gena, receptore neurotransmitera i naponski kontrolisane kanale (Niccolini i dr (2015) Brain 138:3016-3029), a pokazano je da je ekspresija PDE10A smanjena kod HD miševa, a postmortalne studije na ljudima su pokazale isto. Nedavno su razvijeni ligandi pozitronsko-emisione tomografije (PET) koji su ligandi za enzim PDE10A (npr., 11 C-IMA107, (Niccolini i dr, ibid; 18 FMNI-659 (Russell i dr (2014) JAMA Neurol 71(12):1520-1528), i ovi molekuli su korišćeni za procenu pre-simptomatskih pacijenata sa HD. Ispitivanja su pokazala da su nivoi PDE10A izmenjeni kod pacijenata sa HD čak i pre nego što se simptomi razviju. Stoga, procena nivoa PDE10A pomoću PET-a može se obaviti pre, tokom i posle lečenja kako bi se izmerila terapeutska efikasnost sastava predmetnog pronalaska. „Terapeutska efikasnost“ može značiti poboljšanje kliničkih i molekularnih merenja, a takođe može značiti zaštitu pacijenta od bilo kakvog daljeg smanjenja funkcije srednjeg bodljikavog neurona ili povećanja gubitka bodljikavog neurona, ili od daljeg razvoja očiglednih kliničkih prezentacija povezanih sa HD.
PRIMERI Primer 1: Htt represori
Proteini cinkovih prstiju 45643 i 46025 (videti Tabelu 1) usmereni na Htt su konstruisani u suštini kao što je opisano u patentu SAD br.6,534,261; patentnim objavama SAD br.20150056705; 20110082093;
20130253040; i prijavi SAD br.14/706,747. Tabela 1 prikazuje spirale za prepoznavanje DNK vezujućeg domena ovih ZFP-ova, dok Tabela 2 prikazuje ciljne sekvence ovih ZFP-ova. ZFP-ovi su procenjeni i pokazano je da se vezuju za svoja ciljna mesta.
[0114] ZFP-ovi 45643 i 46025 su operativno povezani sa KRAB represivnim domenom da bi se formirao ZFP-TF koji represira Htt. ZFP TF su transfektovani u ljudske ćelije (npr., ćelije izvedene od pacijenata sa HD) i ekspresija Htt je praćena korišćenjem RT-PCR u realnom vremenu. Utvrđeno je da su oba ZFP-TF efikasna u selektivnom suzbijanju ekspresije mutantnog Htt. ZFP-TF su funkcionalni represori kada su formulisani kao plazmidi, u obliku mRNK, u Ad vektorima, lentivirusnim vektorima i/ili u AAV vektorima (npr. AAV9).
Primer 2: Materijali i postupci
[0115] Životinje. Dva rezus majmuna (Macaca mulatta, 4-15 godina starosti, > 4 kg) su bila uključena u ovo ispitivanje. Eksperimenti su sprovedeni u skladu sa smernicama Nacionalnog instituta za zdravlje i protokolima koje je odobrio Komitet za institucionalnu negu i korišćenje životinja na Univerzitetu Kalifornije u San Francisku.
[0116] Priprema vektora. Zeleni fluorescentni protein (GFP) koji sadrži AAV9, pod kontrolom promotera citomegalovirusa, generisan je trostrukom transfekcijom ćelija HEK-293, kao što je prethodno opisano u Matsushita i dr. (1998) Gene Ther 5: 938-945. AAV9-GFP je razblažen neposredno pre upotrebe do koncentracije od 1,4 x 1013 vg/ml (visoka doza) ili 1,4 × 1012 vg/ml (niska doza) u fosfatno puferovanom fiziološkom rastvoru i 0,001% (vol/vol) Pluronik F-68.
[0117] Hirurška intervencija i infuzija vektora. Svaki NHP je podvrgnut stereotaksičkom postavljanju privremenih plastičnih čepova montiranih na lobanju, kompatibilnih sa MRT-om. Životinja je zatim postavljena na leđa u stereotaksički okvir kompatibilan sa MRT-om. Nakon kraniektomije, vodilice kanile su pričvršćene za lobanju preko obe hemisfere. Nakon postavljanja čepova, intubirana životinja je premeštena na sto sa platformom u sobi za magnetnu rezonancu i stavljena na inhalaciju izoflurana (1-3%). Vodiči su pod sterilnim uslovima napunjeni MR-vidljivim traserom (Prohance, Singem, Nemačka) kako bi se lokalizovali čepovi na MR slikama i izračunala putanja do ciljnih struktura unutar mozga. Zatim je NHP premešten u MR magnet i napravljen je anatomski MR snimak visoke rezolucije radi identifikacije cilja i hirurškog planiranja. Nakon što je cilj odabran, za vektorsku infuziju korišćena je posebno dizajnirana, keramička, silicijum dioksidna kanila otporna na refluks sa stepenastim vrhom od 3 mm, kao što je prethodno opisano u radu Richardson i dr. (2011) Mol Ther 19: 1048-1057 ; Krauze i dr. (2005) J Neurosurg 103: 923-929 ; i Fiandaca i dr. (2008). Neurotherapeutics 5: 123-127.
[0118] Kanila je bila pričvršćena za špric od 1 ml montiran na infuzionu pumpu kompatibilnu sa MRI (Harvard Apparatus, Boston, Masačusets). Infuzija je započeta brzinom od 1 µl/min, a nakon vizuelizacije infuzata na vrhu kanile, kanila je uvedena kroz vodilicu u mozak. Kada je graničnik dubine došao do vrha vodilice, osiguran je zavrtnjem za zaključavanje. Brzina infuzije je povećana sa početnih 1 µl/min na konačnih 5 µl/min. Svaki NHP je primao infuzije koje su pokrivale pre- i postkomisuralni putamen istovremeno u svakom putamenu (bilateralno). Ukupna zapremina infuzije po hemisferi bila je 100 µl u obe hemisfere. Nakon završetka infuzije, vodilice su uklonjene sa lobanje, a životinje su vraćene u svoje kućne kaveze i praćene tokom oporavka od anestezije.
[0119] Snimanje magnetnom rezonancom. Životinje su skenirane na Siemens Verio Magnetom 3.0T MRI aparatu (Siemens, Malvern, PA). T1-težinska brza snimanja iz niskog ugla (FLASH) dobijena sa uglom okretanja od 4° na prvom skeniranju proizvela su sliku ponderisanu gustinom protona kako bi se pratio gadolinijum na vrhu kanile (8 ms TE, 28 ms TR, 3 pobuđivanja, matrica 256 x 3 x 192, vidno polje 14 x 14 mm, preseci od 1 mm). Sva naredna skeniranja su serijski snimljena pod uglom okretanja od 40° kako bi se povećalo T1-težinovanje i istaklo pojačanje Gd signala.
[0120] Obrada tkiva. Životinje kojima je infuziran AAV9 su perfuzovane transkardijalno približno 3 nedelje nakon infuzije AAV-GFP hladnim fiziološkim rastvorom, a zatim 4% paraformaldehidom. Mozgovi su sakupljeni i histološki analizirani korišćenjem prethodno utvrđenih metoda. Ukratko, koronalni blokovi od 6 mm su sakupljeni putem moždane matrice i odmah postfiksirani u paraformaldehidu preko noći, a zatim krioprotektovani u 30% (w/v) saharoze sledećeg dana. Klizni mikrotom je korišćen za sečenje serijskih preseka od 40 µm. Hromogeno bojenje je izvršeno na slobodno plutajućim presecima kako bi se vizualizovala ekspresija GFP metodama koje smo prethodno utvrdili.
[0121] Imunohistohemija. Za svaki serotip, preseci su sakupljeni u nizu, čuvani u kontejnerima sa 100 otvora u rastvoru krioprotektora (0,5 M natrijum fosfatni pufer, pH 7,4, 30% glicerol i 30% etilen glikol) na 4°C do dalje obrade. Imunohistohemija je izvršena na slobodno plutajućim presecima. Ukratko, ispiranja sa PBS za proceduru zasnovanu na peroksidazi rena (HRP), ili u PBS sa 0,1% Tween 20 (PBST) za fluorescentno bojenje, izvršena su između svakog imunohistohemijskog koraka. Endogena peroksidazna aktivnost (za procedure zasnovane na peroksidazi) je ugašena tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Blokiranje nespecifičnog bojenja je postignuto inkubacijom preseka u 20% konjskom serumu u PBST-u tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, preseci su inkubirani preko noći sa specifičnim primarnim antitelima. Primarna antitela korišćena u imunohistohemijskim procedurama bila su sledeća: poliklonalno zečje anti-Iba1, PAb, 1:500 (www.biocare.net/); monoklonalno mišje i anti-GFAP, 1:10.000 za bojenje zasnovano na HRP-u i poliklonalno zečje i anti-GFAP 1: 1000 za fluorescenciju (www.millipore.com); monoklonalno mišje anti-NeuN, 1:5.000 za bojenje zasnovano na HRP-u i 1:500 za fluorescentno bojenje (Millipore); monoklonalno i mišje anti-TH, 1:1000 (Millipore, MAB318); poliklonalni mišji i monoklonalni zečji anti-GFP, 1:200 i 1:500, respektivno, (Life Technologies; Millipore). Sva antitela su rastvorena u Da Vinci razblaživaču (Biocare). Nakon tri ispiranja u PBS-u tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi, preseci za bojenje na bazi HRP-a inkubirani su ili sa Mach 2 anti-mišjim HRP polimerom (Biocare) ili March 2 antizečjim HRP polimerom (Biocare) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Aktivnost vezanog HRP-a je vizualizovana pomoću komercijalno dostupnog kompleta sa 3,3'-diaminobenzidin peroksidnim supstratom (Vectro Labs). Preseci obojeni NeuN-om su kontrastno obojeni Cresyl Violet bojom. Konačno, imunoobojeni preseci su montirani na želatinizovane pločice, dehidrirani u alkoholu i ksilenu i pokriveni sa Cytoseal™ (Fisher Scientific).
[0122] Za dvostruko fluorescentno imunobojenje različitih antigena (GFP/GFAP, GFP/NeuN, GFP/TH i GFP/Iba1), kombinacija primarnih antitela je primenjena na preseke kao koktel primarnih antitela inkubacijom preko noći na 4°C. Sva primarna antitela su rastvorena u DaVinci razblaživaču (Biocare).
Nakon tri ispiranja u PBST-u, monoklonska primarna antitela su vizualizovana inkubacijom u mraku tokom 2 sata sa odgovarajućim sekundarnim fluorohrom-konjugovanim antitelima: kozje anti-mišje DyLight 549 (crveno) (Biocare), kozje anti-zečje DyLight 549, magareće anti-zečje Alexa Fluor 555 (Life Technologies), kozje anti-mišje DyLight 488 (zeleno), kozje anti-zečje DyLight 488 i magareće anti-zečje Alexa Fluor 488. Sva sekundarna antitela su rastvorena u razblaženju 1:1.000 u Fluorescence Antibody Diluent-u (Biocare). Preseci su pokriveni Vectashield Hard Set-om, medijumom za fluorescenciju (Vector Labs). Kontrolni preseci su obrađeni bez primarnih antitela i nije primećeno značajno imunobojenje pod ovim uslovima.
[0123] Polukvantitativne analize. Analiza distributivne zapremine (Vd) je izvršena pomoću Brainlab iPlan Flow Suite-a (Brainlab, Minhen, Nemačka; www.brainlab.com). Mesta infuzije, putevi kanile i vrh kanile su identifikovani na T1-ponderisanim MR slikama u koronalnoj, aksijalnoj i sagitalnoj ravni. Regioni od interesa (ROI) su ocrtani da bi se ocrtao T1 gadolinijumski signal i ciljni putamen. Trodimenzionalne volumetrijske rekonstrukcije serije slika i ROI su analizirane da bi se odredio procenjeni Vd infuzija i njegov odnos u odnosu na ukupnu zapreminu infuzata (Vi).
[0124] Analiza preseka mozga. Svi obrađeni preseci su pregledani i digitalno fotografisani na Zeiss Axioskop mikroskopu (Zeiss) opremljenom CCD video kamerom u boji i sistemom za analizu slike (Axiovision Software; Zeiss). Za svakog majmuna, broj GFP-pozitivnih i NeuN-pozitivnih ćelija je određen u obe hemisfere od koronalnih preseka kroz putamen. Fluorescentna mikroskopija je korišćena za određivanje broja dvostruko obeleženih ćelija u presecima. Fotomikrografije za dvostruko obeležene preseke su dobijene spajanjem slika iz dva odvojena kanala (crveno-rodamin i zeleno-fluorescein izotiocijanat; kolokalizacija izgleda žuto) bez promene položaja preseka ili fokusa (objektiv x 20 i x 40, Carl Zeiss mikroskopija sa ApoTome režimom). Za svako dvostruko bojenje, preseci su odabrani prednji i zadnji na udaljenosti od ~500 µm od mesta injekcije. Da bi se identifikovao udeo ćelija koje ekspresuju GFP/NeuN, GFP/GFAP, GFP/TH i GFP/Iba1, svaki presek je analiziran prvo korišćenjem jednog kanala za prisustvo ćelija specifičnih za fenotip (TH, GFAP, Iba1 ili NeuN), a zatim kombinovanim kanalom za broj ko-obojenih ćelija.
[0125] Preseci obojeni za NeuN i GFP korišćeni su za brojanje iz tri preseka na tri različita nivoa mesta injekcije u putamenu (bilateralno). NeuN pozitivne i GFP pozitivne ćelije su brojane pri 200-strukom uvećanju iz 5 nasumično dobijenih frejmova (350 µm2) u obe transdukovane oblasti. U netransdukovanoj oblasti, 5 nasumično dobijenih frejmova je uzeto na udaljenosti od 350 µm od definisane granice ekspresije. Ove analize su omogućile kvantitativna poređenja vektora, iako ne odražavaju ukupan broj transdukovanih ćelija in vivo. Broj ćelija u svakom uzorkovanom regionu je usrednjen po presecima za svaku životinju, a konačni podaci su predstavljeni kao srednji broj NeuN pozitivnih i GFP pozitivnih.
Primer 3: Efikasnost infuzije i transdukcije
[0126] Ranije smo pokazali da je AAV2 neurotropni vektor koji se transportuje u anterogradnom smeru duž neurona kada se infuzira u parenhim mozga pacova i ne-humanih primata (NHP). Videti npr., Ciesielska i dr. (2011). Mol Ther 19: 922-927 ; Kells i dr. (2012) Neurobiol Dis 48: 228-235. Ovaj transport intaktnih virusnih čestica je dovoljno robustan da se vektor očigledno oslobađa iz projektovanih nervnih završetaka gde je u stanju da transdukuje distalne neurone. Dakle, infuzija AAV2 u NHP talamus je rezultirala robusnom transdukcijom kortikalnih neurona koji se u potpunosti nalaze u korteksu. Nasuprot tome, AAV6 se transportuje duž aksona u retrogradnom smeru i gotovo je jednako neurotropan kao i AAV2. Videti npr., Salegio i dr. (2012) Gene Ther.20(3):348-52 ; San Sebastian i dr. (2013) Gene Ther 20: 1178-1183. Na primer, transdukcija putamena NHP rezultira transgenskom ekspresijom kortiko-strijatalnih neurona.
[0127] U ovoj studiji, 2 NHP osobe su primile putaminalne infuzije AAV9-GFP ili u visokoj dozi (HD; leva hemisfera; 1,5 x 1013 vg/mL) ili u niskoj dozi (LD; desna hemisfera; 1,5 x 1012 vg/mL). Postoperativna faza života je namerno bila kratka (3 nedelje) kako bi se ograničile potencijalne zabune koje nastaju usled ćelijski posredovanih odgovora na GFP, kao što je prethodno opisano u Ciesielska i dr. (2013) Mol Ther 21: 158-166 ; Samaranch i dr. (2014) Mol Ther 22: 329-337.
[0128] Distribucija signala pojačanog gadolinijumom na MRI je procenjena volumetrijski, kao što je prethodno opisano u Richardson i dr. (2011) Stereotact Funct Neurosurg 89:141-151. Rezultati su prikazani na Slici 1. Treba napomenuti da je približan oblik putamena primata donekle koničan u sagitalnoj orijentaciji, sa širim poprečnim presekom na prednjem kraju koji se sužava prema zadnjem delu. Međutim, pokrivenost putamena kontrastnim reagensom za MRI bila je skoro potpuna. Preklapanje između signala GFP i gadolinijuma ukazivalo je na to da je infuzat bio dobro sadržan sa malim curenjem u prednjem i medijalnom delu putamena i proširen na površinu tri puta veću od površine kontrasta na MR snimku.
Imunohistohemijsko bojenje za ekspresiju GFP je ocrtano i postavljeno na obris putamena rekonstruisan iz osnovne sekvence MR slika na različitim koronalnim nivoima unutar prostornih granica infuzije. Ovo je sasvim drugačije od onoga što je viđeno sa AAV2 gde je ekspresija transgena korelirala skoro tačno sa MRI signalom (Fiandaca i dr. (2009) Neuroimage 47 Suppl 2: T27-35 ).
[0129] Štaviše, snažna ekspresija reportera bila je evidentna i u HD i u LD putamini sa obiljem ćelijskih tela
2
i neuronskih vlakana (Slike 2A do 2D). zbrojali smo GFP+/NeuN+ neurone imunofluorescencijom u primarnom području transdukcije (PAT; mm2) u ravni kanilarnog trakta, na osnovu prethodno opisanih metoda (Ciesielska i dr. (2013) Mol Ther 21:158-166 ). Intenzitet GFP-pozitivne neuronske ekspresije se brzo smanjio duž različitog perimetra ≤350 µm od transdukovanih područja, u daljem tekstu opisanih kao „van“ PAT (oPAT). U ovom delu ispitivanja, izvršili smo brojanje NeuN+ ćelijskih tela u PAT i oPAT, kao i u putaminalnim presecima obrađenim od dva zdrava, naivna majmuna kako bismo utvrdili efekte zavisne od vektora.
[0130] Dalje smo analizirali da li je efikasnost transdukcije na PAT i oPAT zavisila od doze u smislu NeuN-pozitivnih i GFP-pozitivnih oznaka koje izgleda da otkrivaju AAV9-posredovanu transdukciju i GFP ekspresiju u telima neuronskih ćelija. Nismo videli dokaze o bilo kakvom gubitku neurona usled AAV9-GFP transdukcije, što je u skladu sa našim prethodnim zapažanjima o relativno sporom nagomilavanju anti-GFP odgovora evidentnih više od 6 nedelja nakon infuzije AAV9-GFP, ali ne i nakon 3 nedelje, iako smo videli dokaze o aktivaciji mikroglije i povećanju MHC-II (Slike 2E do 2H).
[0131] Postoji niz mehanizama za prezentaciju antigena u mozgu, uglavnom astrociti (Cornet i dr. (2000) J Neuroimmunol 106:69-77 i mikroglija ( Nelson i dr. (2002) Ann Med 34:491-500 ). Da bismo odredili ćelijsku specifičnost AAV9 za neuronske i glijalne mete na mestu infuzije, imunobojili smo preseke mozga za transgen i ćelijski specifične markere, uključujući NeuN neuronski marker za neurone, glijalni fibrilarni kiseli protein (GFAP) za astrocite i Tha1, marker specifičan za mikrogliju.
[0132] Kao što je prikazano na Slici 3, dvostruko imunofluorescentno bojenje protiv GFP-a sa svakim od ćelijskih markera pokazalo je da je transgen lako ekspresovan i u neuronima i u astrocitima, dok mikroglija nije transdukovana uprkos masivnoj ekspresiji GFP-a u susednim ćelijskim telima i neuronskim vlaknima. Ipak, aktivacija mikroglije u transdukovanim regionima bila je lako uočljiva (Slike 2E do 2H), što ukazuje na sposobnost mikroglije da oseti urođeni imuni status svog lokalnog okruženja.
Primer 4: Aksonski transport
[0133] Infuzija AAV9-GFP u putamen dovela je do transdukcije u distalnim strukturama. GFP bojenje je primećeno, na primer, u ćelijskim telima prefrontalnog, frontalnog i parijetalnog korteksa (Slika 4). GFP-pozitivna ćelijska tela i vlakna bila su takođe prisutna u talamusu i komponentama bazalnih ganglija, uključujući substantia nigra pars compacta (SNc) i pars reticulata (SNr), kao i subtalamično jedro (STN) i u vlaknima medijalnog snopa prednjeg mozga (MFB) (Slika 5). Postojala je jaka zavisnost aksonalnog transporta do distalnih lokusa od vektorske doze (Slika 7). Dakle, visoka, ali ne i niska doza AAV9 dovela je do obeležavanja ćelijskog tela u STN uprkos činjenici da ne postoji direktna neuronska veza između putamena i STN. Ranije smo primetili takav indirektni anterogradni transport unutar bazalnih ganglija sa AAV2 (Ciesielska i dr (2011) Mol Ther 19:922-927, i Kells (2012), ibid i od talamusa do korteksa (Kells i dr. (2009) Proc Natl Acad Sci U S A 106: 2407-2411). Međutim, značajna zavisnost transporta AAV9-GFP od doze podrazumeva dvostepeni transport vektora, prvo do globus palidusa, a zatim do STN. Anterogradni transport AAV9 je dodatno potkrepljen prisustvom GFP-pozitivnih ćelijskih tela unutar substantia nigra pars reticulata (SNr) sa prisustvom vlakana koja obeležavaju neurone koji projektuju u SNr iz putamena (Slika 6). Iznenađujuće, ćelijska tela u substantia nigra pars compacta (SNc) su takođe bila GFP-pozitivna, što ukazuje na retrogradni transport iz putamena u koji SNc šalje visoko arborizovane projekcije. Iako nije bila tako dramatična razlika kao kod STN, postojao je jasan efekat doze AAV9-GFP na transdukciju u ovim oblastima.
[0134] Stoga zaključujemo da se AAV9 transportuje duž aksona u oba smera, fenomen koji barem delimično objašnjava izuzetnu distribuciju AAV9 u mozgu primata. AAV9 se značajno razlikovao od AAV2 i AAV6 u pogledu aksonskog transporta i specifičnosti ćelijskog tipa. AAV9 je transdukovao astrocite i neurone, ali ne i mikrogliju. Vektor je transportovan aksonalno i u anterogradnom i u retrogradnom smeru. Ovi podaci unapređuju naše razumevanje distribucije AAV9 u mozgu primata i pružaju podršku za njegovu upotrebu u lečenju neuroloških bolesti sa značajnom kortiko-strijatalnom patologijom, kao što je Hantingtonova bolest.
[0135] Kako klinički razvoj neurološke genske terapije vektorima zasnovanim na adeno-asociranom virusu (AAV) postaje sve češći, ponašanje specifičnih serotipova AAV u mozgu primata postaje sve važnije. Ovo je posebno tačno u kontekstu efikasnijih i naprednijih tehnologija vektorske infuzije koje pokreću klinički razvoj neurohirurških intervencija kod bolesti kao što je Parkinsonova bolest (Richardson i dr. (2011) Mol Ther 19: 1048-1057) i retkih neuroloških poremećaja kao što je nedostatak aromatične L-aminokiseline dekarboksilaze (AADC) (San Sebastian et (2014) Mol Ther Methods Clin Dev 3 ). Ova nova klinički primenjena tehnika koristi intraoperativnu magnetnu rezonancu za vizuelizaciju parenhimalnih infuzija AAV2. Njena korisnost proizilazi iz izvanredne korelacije između distribucije kontrastnog sredstva za magnetnu rezonancu i eventualne ekspresije transgena. Međutim, ova bliska korelacija donekle se prekida kod AAV9. Ekspresija GFP se proširila u zapreminu značajno (~3 puta) veću od zapremine infuzije, naglašavajući važnu ulogu intersticijalnih ili perivaskularnih transportnih procesa koji su se aktivirali kao rezultat početne infuzije pod pritiskom (CED) (Hadaczek i dr. (2006) Mol Ther 14: 69-78). U slučaju AAV2, tvrdili bismo da avidnost vektora za obilne heparan sulfat proteoglikane (Summerford i dr. (1998) J Virol 72: 1438-1445) pomaže da se AAV2 ograniči na mesto infuzije i blisko podudara distribuciju ekspresije transgena sa distribucijom kontrastnog sredstva za MRI. Nasuprot tome, primarni receptor za AAV9 nije HSPG (Shen i dr. (2011) J Biol Chem 286:13532-13540) i ovaj vektor može stoga angažovati perivaskulaturu kako bi postigao mnogo veći volumen ekspresije za dati volumen infuzije.
[0136] AAV9 pokazuje širok tropizam u nervnom tkivu ( Gray i dr. (2011) Mol Ther 19:1058-1069 ;
Hinderer i dr. (2014) Molecular Therapy - Methods & Clinical Development 1; Foust i dr. (2009) Nat Biotechnol 27: 59-65 , transdukujući i neurone i astrocite, kao i možda druge tipove ćelija. Sposobnost AAV9 da transdukuje ćelije koje prezentuju antigen (APC) u mozgu izazvala je zabrinutost u pogledu ekspresije stranih (ne-sopstvenih) proteina (Ciesielska i dr. (2013) Mol Ther 21: 158-166 ; Samaranch i dr. (2014) Mol Ther 22: 329-337 ; Forsayeth and Bankiewicz (2015) Mol Ther 23: 612 ) kod APK i posledičnog angažovanja neurotoksičnih adaptivnih imunih odgovora. Naravno, ovo verovatno neće biti problem kada se eksprimiraju sopstveni proteini, ali u ovom ispitivanju smo, kao i ranije, primetili aktivaciju Tha1 i povećanje MHC-II na astrocitima i mikrogliji. Obe vrste glije su moždane APK koje imaju jedinstvene individualne funkcije. Međutim, nismo videli dokaze o mikroglijalnoj transdukciji pomoću AAV9-GFP iako su ove ćelije jasno reagovale na prezentaciju GFP-a. Naš zaključak je da su astrociti ključne APK u pogledu adaptivnih odgovora na ekspresiju GFP-a.
[0137] Jedno od najupečatljivijih otkrića o ponašanju AAV serotipova u mozgu je fenomen aksonskog transporta. Sposobnost neurona da transportuju intaktne AAV čestice na velike udaljenosti prvi put je opisana za AAV2, iako je isti fenomen opisan i za Herpes simplex (Costantini i dr. (1999) Hum Gene Ther 10: 2481-2494 ; Diefenbach i dr. (2008) Rev Med Virol 18:35-51 ; Lilley i dr. (2001) J Virol 75: 4343-4356 ; i McGraw and Friedman (2009) J Virol 83:4791-4799 ) i Virus besnila (Gillet i dr. (1986) J Neuropathol Exp Neurol 45:619-634 ; Kelly and Strick (2000) J Neurosci Methods 103:63-71 ; Klingen i dr. (2008) J Virol 82: 237-245 ; Larsen i dr. (2007) Front Neural Circuits 1:5 ). Za razliku od primarno retrogradnog transporta iznad navedenih virusa, AAV2 podleže anterogradnom transportu u neuronima CNS-a; to jest, čestice AAV2 se transportuju netaknute iz tela neuronskih ćelija do sinaptičkih terminala gde se oslobađaju da bi ih neuroni na distalnim lokacijama preuzeli. Videti, Ciesielska, i dr. (2011) Mol Ther 19:922-927 ; Kells i dr. (2012) Neurobiol Dis 48: 228-235 ; Kells i dr. (2009) Proc Natl Acad Sci U S A 106:2407-2411. Ovaj fenomen zahteva veoma efikasnu distribuciju i transdukciju na primarnoj lokaciji transdukcije i može objasniti zašto nije otkriven ranije, s obzirom na to da samo CED zaista može postići ovaj stepen efikasnosti. Infuzija AAV2 u NHP talamus rezultira široko rasprostranjenom kortikalnom ekspresijom transgena, prvenstveno piramidalnih neurona smeštenih u kortikalnoj lamini V/VI. Slično tome, transdukcija NHP putamena ili pacovskog strijatuma sa AAV2 rezultira ekspresijom transgena u ćelijskim telima unutar SNr, koji prima projekcije iz strijatalnih GABAergičkih neurona, ali ne i SNc, koji se projektuje u strijatum. Za razliku od anterogradnog transporta AAV2, AAV6 se transportuje isključivo u retrogradnom smeru i gotovo je jednako neurotropan kao AAV2 (Salegio i dr. (2012) Gene Ther.20(3):348-52 ; San Sebastian i dr. (2013) Gene Ther 20: 1178-1183).
[0138] U ovom ispitivanju je utvrđeno da je aksonski transport AAV9 dvosmeran. Infuzija AAV9-GFP u putamen dovela je do ekspresije transgena u kortiko-strijatalnim neuronima koji se projektuju ka putamenu, a ekspresija GFP je takođe pronađena u SNc neuronima, čime se potvrđuje retrogradni transport ovog serotipa. Ovaj fenomen, značajno efikasniji nego što je viđen kod AAV6 (San Sebastian i dr. (2013) Gene Ther 20: 1178-1183), vredan je u osmišljavanju terapija za Hantingtonovu bolest kod kojih je degeneracija i bazalnih ganglijskih i kortiko-strijatalnih neurona centralna za neuropatologiju bolesti (Berardelli i dr. (1999) Mov Disord 14:398-403 ). Efikasna transdukcija ljudskog putamena terapeutskim AAV9 omogućava ciljanje i
2
kortikalnih projekcija ka strijatumu.
[0139] Pored toga, međutim, vektor je transportovan u anterogradnom smeru ka SNr i ka STN. Obeležavanje STN neurona je u velikoj meri zavisilo od doze vektora, više nego kod SNr, što odražava potrebu za transportom AAV9-GFP indirektnim putem kroz globus palidus (GP), aksonalnim i/ili perivaskularnim transportom. Sposobnost AAV9 da se efikasno širi izvan početne putaminalne zapremine infuzije sugeriše snažan perivaskularni mehanizam. Ipak, fenomen dvosmernog aksonskog transporta AAV9 može delimično objasniti zašto se ovaj vektor sa takvim entuzijazmom posmatra za primene u kojima je veoma široko rasprostranjena distribucija vektora neophodna.
Primer 5: Isporuka Htt represora
[0140] Htt represori (ZFP-TF, TALE-TF, CRISPR/Cas-TF), na primer kao što je opisano u objavama SAD br.20150056705; 20110082093; 20130253040; i 20150335708 i ovde se isporučuju u strijatum miševa modela HD, NHP ili ljudskih subjekata korišćenjem virusa (npr., AAV kao što je AAV9) kao što je navedeno u Primeru 1.
[0141] Htt represori pokazuju široko rasprostranjenu ekspresiju i smanjuju formiranje Htt ekspresije, Htt agregata; smanjuju apoptozu; i/ili smanjuju motoričke deficite (npr., hvatanje) kod subjekata i efikasni su u prevenciji i/ili lečenju HD.
Primer 6: Represija mutantnog Htt u fibroblastima pacijenata sa HD i u neuronima izvedenim iz matičnih ćelija pacijenata sa HD
[0142] ZFP 46025 i 45643 selektivno represiraju mutantni HTT u CAG18/45 fibroblastima izvedenim od pacijenata sa HD (Slika 8). mRNK koja kodira GFP kontrolu; ZFP 46025 i ZFP 45643 (0,1, 1, 10 ili 100 ng na 50000 ćelija) su transfektovane u HD fibroblaste GM02151 (Coriell Cell Repository) korišćenjem Nucleofactor-a (Lonza). Dvadeset četiri sata nakon transfekcije, nivoi ekspresije HTT su mereni pomoću qRT-PCR. Nivoi Wt Htt (CAG18) i mutantnog Htt (CAG45) u svakom uzorku mereni su prilagođenim alelspecifičnim qPCR testom zasnovanim na SNP rs363099 C/T (egzon 29) u triplikatima i normalizovani na nivoe GAPDH. Odnos Htt/GAPDH za ZFP uzorke skaliran je na odnos kod simuliranog transfektovanog uzorka (podešen na 1). Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± SD. Podaci pokazuju selektivnu represiju mutantnog Htt alela (CAG45) pomoću ZFP 46025 i ZFP 45643.
[0143] ZFP 46025 i 45643 selektivno represiraju mutantni Htt u CAG21/38 fibroblastima dobijenim od pacijenata sa HD (slika 9), mRNK za GFP kontrolu, ZFP 46025 i 45643 (0,1, 1, 10 ili 100 ng na 50.000 ćelija) su transfektovane u HD fibroblaste ND30259 (Coriell Cell Repository) korišćenjem Nucleofactor-a (Lonza). Dvadeset četiri sata nakon transfekcije, nivoi ekspresije Htt su mereni pomoću qRT-PCR. Nivoi Wt Htt (CAG21) i mutantnog Htt (CAG38) u svakom uzorku mereni su prilagođenim alel-specifičnim qPCR testom zasnovanim na SNP rs362331 C/T (egzon 50) u triplikatima i normalizovani na nivoe GAPDH. Odnos Htt/GAPDH za ZFP uzorke skaliran je na odnos kod simuliranog transfektovanog uzorka (podešen na 1). Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± SD. Podaci pokazuju selektivnu represiju mutantnog HTT alela (CAG45) i od strane ZFP 46025 i 45643.
[0144] Podaci na Slikama 8 i 9 pokazuju da ZFP 46025 i 45643 mogu selektivno represirati transkripciju iz mutantnih Htt alela u ćelijama izvedenim od pacijenata koje sadrže različite dužine CAG ponavljanja i na divljem tipu i na mutantnim Htt alelima.
[0145] ZFP 46025 i 45643 selektivno potiskuju mutirani Htt u CAG17/48 neuronima putem prolazne transfekcije mRNK (Slika 10). mRNK za GFP kontrolu, ZFP 46025 i 45643 (15, 150, 300 ili 1500 ng na 150000 ćelija) su transfektovane u neurone diferencirane iz HD embrionalnih matičnih ćelija (ESC) GENEA020 (GENEA/CHDI) korišćenjem Nucleofactor-a (Lonza). Dva dana nakon transfekcije, nivoi ekspresije Htt su mereni pomoću qRT-PCR. Nivoi divljeg tipa Htt (CAG17) i mutantnog Htt (CAG48) u svakom uzorku su mereni alel-specifičnim qPCR testom zasnovanim na SNP rs362307 u eksonu 67 (Applied Biosystems) u triplikatu i normalizovani na nivoe GAPDH. Odnos Htt/GAPDH za ZFP uzorke skaliran je na odnos kod simuliranog transfektovanog uzorka (podešen na 1). Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± SD. Podaci pokazuju selektivnu represiju mutantnog Htt alela (CAG48) pomoću ZFP 46025 i 45643 u HD neuronima.
2
[0146] Eksperimenti su takođe sprovedeni na diferenciranim CAG17/48 neuronima gde su ZFP-ovi isporučeni korišćenjem virusnih vektora AAV6 ili AAV9. AAV6 vektori koji kodiraju ZFP 46025, 45643 ili GFP kontrolu korišćeni su za infekciju neurona diferenciranih iz HD embrionalnih matičnih ćelija (ESC) GENEA020 (GENEA/CHDI) u duplikatu. Korišćene doze AAV bile su 1E+4, 5E+4 ili 1E+5 vektorski genom (vg) po ćeliji za ZFP-ove i 1E+5 vg po ćeliji za GFP. Dvadeset jedan dan nakon infekcije, nivoi ekspresije HTT su mereni pomoću qRT-PCR. Nivoi Wt Htt (CAG17) i mutantnog Htt (CAG48) u svakom uzorku mereni su alel-specifičnim qPCR testom zasnovanim na SNP rs362307 u eksonu 67 (Applied Biosystems) u triplikatima i normalizovani na nivoe GAPDH. Odnos Htt/GAPDH za ZFP uzorke skaliran je na odnos kod simuliranog transfektovanog uzorka (podešen na 1). Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± SD (Slika 11A).
[0147] AAV9 vektori koji kodiraju ZFP 46025, 45643 ili GFP kontrolu korišćeni su za infekciju neurona diferenciranih iz HD embrionalnih matičnih ćelija (ESC) GENEA020 (GENEA/CHDI) u duplikatu.
Korišćene doze AAV bile su 1E+5, 5E+5 ili 5E+6 vektorski genom (vg) po ćeliji za ZFP i 5E+6 vg po ćeliji za GFP. Dvadeset jedan dan nakon infekcije, nivoi ekspresije HTT su mereni pomoću qRT-PCR. Nivoi divljeg tipa Htt (CAG17) i mutantnog Htt (CAG48) u svakom uzorku su mereni alel-specifičnim qPCR testom zasnovanim na SNP rs362307 u eksonu 67 (Applied Biosystems) u triplikatu i normalizovani na nivoe GAPDH. Odnos Htt/GAPDH za ZFP uzorke skaliran je na odnos kod simuliranog transfektovanog uzorka (podešen na 1). Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± standardna devijacija (Slika 11B).
Primer 7: ZFP 46025 i 45643 spasavaju ćelijske fenotipove koji su povezani sa HD
[0148] Prethodna ispitivanja su pokazale fenotipske promene povezane sa proširenim CAG ponavljanjima u ćelijama izvedenim od pacijenata sa HD (Jung-il i dr., (2012) Biochemical Journal, 446(3), 359-371; HD IPSC Consortium, (2012) Cell Stem Cell, 11(2), 264-278; An i dr., (2012) Cell Stem Cell, 11(2), 253-263). U skladu sa ovim objavljenim nalazima, otkrili smo da su CAG17/48 neuroni imali značajno smanjenje intracelularnih nivoa ATP-a u poređenju sa ne-HD (normalnim) neuronima (Slika 12A). Dvadeset jedan dan nakon što su neuroni inficirani lentivirusnim vektorima koji kodiraju ZFP 46025 ili ZFP 45643, intracelularni nivoi ATP-a su se povećali 1,7 i 1,8 puta u poređenju sa kontrolnim ćelijama, respektivno, što ukazuje da utišavanje mutantnog Htt-a rešava energetski defekt u HD neuronima. Još jedan fenotip HD neurona in vitro je povećana podložnost programiranoj ćelijskoj smrti. Sa povlačenjem faktora rasta, procenat CAG17/48 neurona koji su podvrgnuti apoptozi bio je 4-5 puta veći od procenata normalnih neurona (Slika 12B).12 dana nakon lentivirusne infekcije, nakon čega je usledilo dva dana povlačenja faktora rasta, ZFP 46025 i 45643 su smanjili broj apoptotičnih ćelija na onaj koji se vidi u ćelijama divljeg tipa.
[0149] Intracelularni nivoi ATP-a kultivisanih neurona, dobijenih od pacijenta sa HD (CAG17/48) ili normalnog ispitanika, mereni su korišćenjem CellTiter-Glo® luminescentnog testa (Promega), gde je broj ćelija u svakom uzorku određen korišćenjem ApoLive-Glo® testa (Promega). Neuroni su inficirani u tri primerka sa LV koji ekspresuje ili YFP-Venus ili ZFP-TF (45643 ili 46025-KOX-2A-Venus) sa MOI od 500.
[0150] 21 dan nakon lentivirusne infekcije, intracelularni nivoi [ATP] u neuronima su mereni korišćenjem CellTiter-Glo luminescentnog testa (Promega) prema uputstvima proizvođača. Vrednosti luminescencije su normalizovane na broj ćelija u svakom uzorku. Vrednosti nivoa ATP-a po ćeliji iz različitih ćelija/tretmana su zatim normalizovane na vrednosti kod lažno inficiranih HD neurona (postavljeno kao 1). Podaci (Slika 12A) su izraženi kao srednja vrednost ± SD.
[0151] Ćelijska smrt HD i ne-HD neurona izazvana povlačenjem faktora rasta merena je korišćenjem testa obeležavanja krajeva terminalne deoksinukleotidil transferaze dUTP (TUNEL). Neuroni su inficirani u tri primerka sa LV koji ekspresuje ili YFP-Venus ili ZFP-TF (45643 ili 46025-KOX-2A-Venus) sa MOI od 500. Ćelije su kultivisane 12 dana, a zatim je medijum zamenjen svežim neurobazalnim medijumom bez ikakvih aditiva (faktora rasta). Ćelije su držane u ovom medijumu za povlačenje faktora rasta 48 sati. TUNEL test je izveden korišćenjem ApoBrdU Red kompleta za fragmentaciju DNK (BioVision). Neuroni su fiksirani sa 4% paraformaldehidom na ledu tokom 15 minuta. Apoptoza je procenjena kvantifikacijom TUNEL-pozitivnih ćelija prema preporukama proizvođača (ApoBrdU Red DNK fragmentacioni komplet, BioVision). Protočna citometrija je korišćena za merenje apoptoze bojenjem anti-BrdU-Red. Podaci (Slika 12B) su izraženi kao srednja vrednost ± SD.
2
[0152] Dakle, represori kako je ovde opisano pružaju terapeutske koristi spasavanjem fenotipova povezanih sa HD, uključujući, ali ne ograničavajući se na, smanjenje ćelijske smrti, povećanje ćelijske funkcije (mereno intracelularnim nivoima ATP) i smanjenje podložnosti ćelija apoptozi u poređenju sa netretiranim ćelijama.
Primer 8: ZFP 46025 i ZFP 45643 potiskuju mutantni Htt u mišjem strijatumu
[0153] In vivo aktivnost ZFP-ova je testirana na heterozigotnim miševima HdhQ50/Hdh+ (Q50) (White i dr. (1997) Nature Genetics 17: 404-410) intrastrijatalnom injekcijom AAV9 vektora koji kodiraju ZFP 46025, ZFP 45643 ili GFP kontrolu. Q50 miševi sadrže knock-in alel gde je ekson 1 endogenog mišjeg Hdh gena zamenjen eksonom 1 ljudskog Htt gena sa 48 CAG-ova. Pet nedelja nakon injekcije, alel-specifična qRT-PCR analiza tretiranog strijatuma pokazala je da ZFP 45643 i ZFP 46025 potiskuju mutantni Htt alel (Q50) za 79% i 74%, respektivno, u odnosu na kontrolu kojoj je ubrizgan nosač; alel divljeg tipa (Q7) nije bio regulisan nijednim ZFP-om (Slika 13A i 13B). Aktivnost ZFP 45643 je takođe testirana 12 nedelja nakon injekcije (Slika 13C), i primećena je značajna represija (70%) mutantnog Htt (Q50) bez represije alela divljeg tipa (Q7). Nije primećena očigledna toksičnost ni kod jedne od životinja tokom ispitivanja.
Bihejvioralna ispitivanja (npr., ispitivanja hvatanja) su takođe sprovedene i pokazuju da represori kako je ovde opisano pružaju terapeutsku (kliničku) korist in vivo.
[0154] Heterozigotni miševi HdhQ50/Hdh+ (Q50) (mešanog pola) primili su bilateralnu intrastrijatalnu injekciju AAV9 vektora (ZFP 46025, 45643 ili GFP, n=4 po grupi) ili formulacionog pufera (nosilac, n=3) u starosti od 10-11 nedelja. Dve injekcije od 3 µl su ubačene u svaki strijatum (ukupno 6 µl i 1,1E+10 vektorskog genoma po strijatumu). Koordinate korišćene za prednju infuziju bile su A/P 1,4, M/L /-1,7, D/V -3,5, a za zadnju infuziju A/P 0,2, M/L /-2,3, D/V - 3,2. U petoj nedelji (ZFP 46025 i 45643) i 12. nedelji (ZFP 45643) nakon injekcije, miševi su žrtvovani i svaki strijatum je diseciran na tri (prednji, srednji i zadnji) sloja za izolaciju RNK i qRT-PCR analizu. Ekspresija mutantnog Htt alela (Q50) i wt alela (Q7) merena je alel-specifičnim qPCR testovima, nivoi Htt su normalizovani na geometrijsku sredinu nivoa ATP5B, RPL38 i EIF4A2. (ns: p>0,05, *: p<0,05, **: p<0,01, ***: p<0,001, ****:p<0,0001, jednosmerna ANOVA sa Sidakovim testom).
[0155] Kao što je prikazano na Slici 13, alel-specifična qRT-PCR analiza tretiranog strijatuma pokazala je da su ZFP 45643 i ZFP 46025 potisnuli mutantni Htt alel (Q50) za 79% i 74%, respektivno, u odnosu na kontrolnu grupu kojoj je ubrizgan nosač; alel divljeg tipa (Q7) nije bio regulisan nijednim ZFP-om.
Aktivnost ZFP 45643 je takođe testirana 12 nedelja nakon injekcije i primećena je značajna represija (70%) mutantnog Htt (Q50) bez represije alela divljeg tipa (Q7).
[0156] Dakle, Htt represori kako je ovde opisano pokazuju široko rasprostranjenu ekspresiju i smanjuju formiranje Htt ekspresije, Htt agregata; smanjuju apoptozu; i/ili smanjuju motoričke deficite (npr., hvatanje) kod ispitanika i efikasni su u prevenciji i/ili lečenju HD.
Primer 9: Merenje terapijske efikasnosti ZFP 46025 i ZFP 45643
[0157] Pacijenti sa HD se leče ZFP 46025 ili ZFP 45643 u različitim dozama. Pacijenti sa HD se procenjuju pomoću UHDRS skale i pokazuju poboljšanje nakon lečenja. Efikasnost se takođe meri PET analizom snimanja korišćenjem 18 FMNI-659, PET trasera za PDE10A, i MRI. Ukratko, regioni mozga (npr. područja unutar putamena) koji su izloženi ZFP-u (npr. AAV9 vektor koji kodira ZFP) identifikuju se kontrastnim sredstvom gadolinijuma koje je pomešano sa ZFP formulacijom i MRI; pre i posle lečenja, pacijentima se daje približno 5 mCi 18 FMNI-659 u masenoj dozi od oko 5 µg tokom trominutnog perioda infuzije. Serijski 3D PET snimci se dobijaju tokom 90 minuta pomoću PET skenera. MRI snimci se takođe dobijaju pomoću MRI skenera, a PET snimci se poravnavaju sa MRI snimcima kako bi se generisali vizuelni prikazi zasnovani na anatomiji za analizu. Standardne vrednosti apsorpcije se izračunavaju za jezgra bazalnih ganglija (što uključuje globus palidus, kaudat i putamen (strijatum)) i normalizuju se na referentni region kao što je mali mozak (Russell i dr., ibid). PET signali PDE10A u regionima mozga koji su izloženi ZFP-u, identifikovanim MRI u vreme lečenja, mere se nakon lečenja i upoređuju sa nivoima signala u istom regionu pre lečenja. Lečenje pacijenata sa HD sa ZFP46025 ili ZFP45643 štiti pacijente od bilo kakvog dodatnog gubitka srednjeg bodljikavog neurona (mereno nivoima PDE10A) i od daljeg razvoja očiglednih kliničkih simptoma. Kod nekih pacijenata, lečenje ZFP-ovima preokreće simptome HD.
2

Claims (14)

  1. Patentni zahtevi 1. Neprirodni protein cinkovog prsta koji se vezuje za Htt gen, pri čemu protein cinkovog prsta sadrži 5 domena cinkovog prsta poređanih od F1 do F5, gde domeni cinkovog prsta obuhvataju sekvence regiona heliksa prepoznavanja poređane kao što je prikazano u jednom redu sledeće tabele:
  2. 2. Fuzioni protein koji sadrži protein cinkovog prsta iz patentnog zahteva 1 i funkcionalni domen.
  3. 3. Fuzioni protein iz patentnog zahteva 2, gde je funkcionalni domen izabran iz grupe: domen transkripcione aktivacije, domen transkripcione represije i domen nukleaze.
  4. 4. Polinukleotid koji kodira protein cinkovog prsta iz patentnog zahteva 1, ili fuzioni protein iz patentnog zahteva 2 ili patentnog zahteva 3.
  5. 5. AAV vektor koji sadrži polinukleotid iz patentnog zahteva 4.
  6. 6. Ćelija domaćin koja sadrži jedan ili više proteina cinkovog prsta iz patentnog zahteva 1, jedan ili više fuzionih proteina iz patentnog zahteva 2 ili 3, jedan ili više polinukleotida iz patentnog zahteva 4 i/ili jedan ili više AAV vektora iz patentnog zahteva 5.
  7. 7. Farmaceutski sastav koji sadrži jedan ili više polinukleotida prema patentnom zahtevu 4 i/ili jedan ili više AAV vektora prema patentnom zahtevu 5.
  8. 8. Postupak modifikovanja ekspresije Htt gena u ćeliji, koji obuhvata davanje ćeliji jednog ili više polinukleotida prema patentnom zahtevu 4, jednog ili više AAV vektora prema patentnom zahtevu 5 i/ili jednog ili više farmaceutskih sastava prema patentnom zahtevu 7, pri čemu se postupak sprovodi ex vivo ili in vitro.
  9. 9. Postupak prema patentnom zahtevu 8, gde Htt gen sadrži najmanje alel divljeg tipa i/ili jedan mutantni alel.
  10. 10. Postupak prema patentnom zahtevu 8 ili 9, gde jedan ili više polinukleotida i jedan ili više AAV vektora kodiraju fuzioni protein i gde fuzioni protein sadrži domen represije i ekspresija Htt gena je potisnuta.
  11. 11. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 8 do 10, gde je ćelija neuronska ćelija.
  12. 12. Polinukleotid prema patentnom zahtevu 4, AAV vektor prema patentnom zahtevu 5 i/ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 7, za upotrebu u postupku lečenja i/ili sprečavanja Hantingtonove bolesti (HB) kod ispitanika kome je to potrebno, gde postupak obuhvata davanje ispitaniku jednog ili više navedenih polinukleotida, AAV vektora i/ili farmaceutskih sastava, gde je funkcionalni domen transkripcioni domen represije.
  13. 13. Polinukleotid, AAV vektor i/ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, gde se primena vrši u neuronsku ćeliju u mozgu ispitanika.
  14. 14. Polinukleotid, AAV vektor i/ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, gde se neuronska ćelija nalazi u strijatumu. 2
RS20250597A 2015-09-23 2016-09-23 Htt represori i njihova upotreba RS66924B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562222588P 2015-09-23 2015-09-23
PCT/US2016/053374 WO2017053753A1 (en) 2015-09-23 2016-09-23 Htt repressors and uses thereof
EP16849721.2A EP3352776B1 (en) 2015-09-23 2016-09-23 Htt repressors and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66924B1 true RS66924B1 (sr) 2025-07-31

Family

ID=58387548

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250597A RS66924B1 (sr) 2015-09-23 2016-09-23 Htt represori i njihova upotreba

Country Status (22)

Country Link
US (3) US10435441B2 (sr)
EP (1) EP3352776B1 (sr)
JP (2) JP6853257B2 (sr)
KR (1) KR102803519B1 (sr)
CN (1) CN108348576B (sr)
AU (2) AU2016325613B2 (sr)
CL (1) CL2018000749A1 (sr)
DK (1) DK3352776T3 (sr)
EA (1) EA037993B1 (sr)
ES (1) ES3032775T3 (sr)
FI (1) FI3352776T3 (sr)
HR (1) HRP20250728T1 (sr)
HU (1) HUE071655T2 (sr)
IL (1) IL258030B (sr)
LT (1) LT3352776T (sr)
MX (1) MX391052B (sr)
PL (1) PL3352776T3 (sr)
PT (1) PT3352776T (sr)
RS (1) RS66924B1 (sr)
SI (1) SI3352776T1 (sr)
WO (1) WO2017053753A1 (sr)
ZA (2) ZA201801679B (sr)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013066438A2 (en) 2011-07-22 2013-05-10 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US20150166984A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting alpha-antitrypsin point mutations
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
KR20230145206A (ko) 2014-11-14 2023-10-17 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
DK3352776T3 (da) * 2015-09-23 2025-06-23 Sangamo Therapeutics Inc Htt-repressorer og deres anvendelse
WO2017070632A2 (en) 2015-10-23 2017-04-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US10584337B2 (en) 2016-05-18 2020-03-10 Voyager Therapeutics, Inc. Modulatory polynucleotides
IL297576B2 (en) 2016-05-18 2024-02-01 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating huntington's disease
WO2018027078A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
AU2017308889B2 (en) 2016-08-09 2023-11-09 President And Fellows Of Harvard College Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
KR20240007715A (ko) 2016-10-14 2024-01-16 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
WO2018165504A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
KR20190123328A (ko) 2017-03-09 2019-10-31 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 암 백신
CN110914310A (zh) 2017-03-10 2020-03-24 哈佛大学的校长及成员们 胞嘧啶至鸟嘌呤碱基编辑器
IL306092A (en) 2017-03-23 2023-11-01 Harvard College Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins
MX2019013172A (es) 2017-05-05 2020-09-07 Voyager Therapeutics Inc Composiciones y metodos para tratar la enfermedad de huntington.
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
EP3658573A1 (en) 2017-07-28 2020-06-03 President and Fellows of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (pace)
EP3676376B1 (en) 2017-08-30 2025-01-15 President and Fellows of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
CA3082251A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
EP3716767A4 (en) * 2017-10-24 2021-11-24 Sangamo Therapeutics, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF RARE DISEASES
US12406749B2 (en) 2017-12-15 2025-09-02 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
JP7332622B2 (ja) * 2018-04-18 2023-08-23 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ハンチンチン（ｈｔｔ）の調節のためのジンクフィンガータンパク質組成物
WO2019226953A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
EP3820495A4 (en) 2018-07-09 2022-07-20 The Broad Institute Inc. RNA-PROGRAMMABLE EPIGENETIC RNA MODIFIERS AND THEIR USES
WO2020092453A1 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof
EP3911349A4 (en) * 2019-01-15 2023-01-18 Sangamo Therapeutics, Inc. HTT REPRESSORS AND THEIR USES
US12351837B2 (en) 2019-01-23 2025-07-08 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
CN113710693B (zh) 2019-02-25 2025-07-15 马萨诸塞大学 Dna结合结构域反式激活因子及其用途
WO2020191241A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
WO2020214842A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
WO2021016453A1 (en) * 2019-07-23 2021-01-28 University Of Rochester Targeted rna cleavage with crispr-cas
US12435330B2 (en) 2019-10-10 2025-10-07 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing RNA
CA3177481A1 (en) 2020-05-08 2021-11-11 David R. Liu Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
TW202515898A (zh) * 2023-06-30 2025-04-16 日商武田藥品工業股份有限公司 Ｈｔｔ抑制物及其用途
KR102868476B1 (ko) 2025-02-20 2025-10-13 본아이에프 주식회사 냄비용 모듈형 교반기

Family Cites Families (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
JP4012243B2 (ja) 1994-01-18 2007-11-21 ザ スクリップス リサーチ インスティチュート 亜鉛フィンガータンパク質誘導体およびそのための方法
CA2186118C (en) 1994-03-23 2010-10-19 Richard W. Hanson Compacted nucleic acids and their delivery to cells
GB9824544D0 (en) 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
CA2196419C (en) 1994-08-20 2007-08-21 Yen Choo Improvements in or relating to binding proteins for recognition of dna
US5789538A (en) 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
US5928638A (en) 1996-06-17 1999-07-27 Systemix, Inc. Methods for gene transfer
US5925523A (en) 1996-08-23 1999-07-20 President & Fellows Of Harvard College Intraction trap assay, reagents and uses thereof
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
CA2329259C (en) 1998-05-27 2003-08-05 Avigen, Inc. Convection-enhanced delivery of aav vectors
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6503717B2 (en) 1999-12-06 2003-01-07 Sangamo Biosciences, Inc. Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function
US20100293669A2 (en) * 1999-05-06 2010-11-18 Jingdong Liu Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
AU2001250774B2 (en) 2000-02-08 2005-01-27 Sangamo Biosciences, Inc. Cells expressing zinc finger proteins for drug discovery
US20020061512A1 (en) 2000-02-18 2002-05-23 Kim Jin-Soo Zinc finger domains and methods of identifying same
AU2001263155A1 (en) 2000-05-16 2001-11-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for interaction trap assays
JP2002060786A (ja) 2000-08-23 2002-02-26 Kao Corp 硬質表面用殺菌防汚剤
US7067317B2 (en) 2000-12-07 2006-06-27 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
GB0108491D0 (en) 2001-04-04 2001-05-23 Gendaq Ltd Engineering zinc fingers
US7182944B2 (en) 2001-04-25 2007-02-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods of increasing distribution of nucleic acids
US20040224385A1 (en) 2001-08-20 2004-11-11 Barbas Carlos F Zinc finger binding domains for cnn
US7262054B2 (en) 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
ATE347593T1 (de) 2002-01-23 2006-12-15 Univ Utah Res Found Zielgerichtete chromosomale mutagenese mit zinkfingernukleasen
EP1504092B2 (en) 2002-03-21 2014-06-25 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US7074596B2 (en) 2002-03-25 2006-07-11 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Synthesis and use of anti-reverse mRNA cap analogues
US9447434B2 (en) 2002-09-05 2016-09-20 California Institute Of Technology Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
CN1897977A (zh) 2003-10-20 2007-01-17 Ns基因公司 帕金森氏病的体内基因治疗
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
KR20070060115A (ko) 2004-09-16 2007-06-12 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 단백질 생산을 위한 조성물 및 방법
WO2006042090A1 (en) 2004-10-05 2006-04-20 Avigen, Inc. Stepped cannula
WO2006121866A2 (en) 2005-05-05 2006-11-16 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Sequence enabled reassembly (seer) - a novel method for visualizing specific dna sequences
JP5238503B2 (ja) 2005-08-23 2013-07-17 ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア 対流増加送達を用いた治療薬の慢性的な送達のための逆流防止カニューレ及びシステム
SI2019683T2 (sl) 2006-04-25 2022-10-28 The Regents Of The University Of California Dajanje rastnih faktorjev za zdravljenje motenj CŽS
EP2027262B1 (en) 2006-05-25 2010-03-31 Sangamo Biosciences Inc. Variant foki cleavage half-domains
US7951925B2 (en) 2006-05-25 2011-05-31 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for gene inactivation
US7837668B2 (en) 2006-10-10 2010-11-23 Ceregene, Inc. Needle assembly for use in delivering precise dosages of proteinaceous pharmaceutical compositions and methods for use of same
US8110379B2 (en) 2007-04-26 2012-02-07 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration into the PPP1R12C locus
AR066660A1 (es) * 2007-05-23 2009-09-02 Genentech Inc Prevencion y tratamiento de condiciones del ojo asociadas con su complemento
US8153773B2 (en) 2007-06-19 2012-04-10 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Synthesis and use of anti-reverse phosphorothioate analogs of the messenger RNA cap
JP5763341B2 (ja) 2007-09-27 2015-08-12 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 生物学的活性のあるヌクレアーゼの迅速なインビボ同定法
CA2720903C (en) 2008-04-14 2019-01-15 Sangamo Biosciences, Inc. Linear donor constructs for targeted integration
JP5763530B2 (ja) 2008-06-10 2015-08-12 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｂａｘ−およびＢａｋ−欠損細胞株の生成のための方法および組成物
JP5908725B2 (ja) 2008-08-22 2016-04-26 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 標的一本鎖開裂および標的組込みのための方法、並びに組成物
EP3156494B8 (en) 2008-12-04 2018-09-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
CA2769262C (en) 2009-07-28 2019-04-30 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating trinucleotide repeat disorders
EA022786B1 (ru) 2009-07-31 2016-03-31 Этрис Гмбх Рнк с комбинацией из немодифицированных и модифицированных нуклеотидов для экспрессии белков
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
JP6137596B2 (ja) 2010-02-08 2017-05-31 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 遺伝子操作された切断ハーフドメイン
US9255259B2 (en) 2010-02-09 2016-02-09 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
US9567573B2 (en) 2010-04-26 2017-02-14 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing of a Rosa locus using nucleases
AU2011256838B2 (en) 2010-05-17 2014-10-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Novel DNA-binding proteins and uses thereof
CA2805442C (en) 2010-07-21 2020-05-12 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of an hla locus
PL2441774T3 (pl) 2010-10-15 2019-05-31 Fund Centre De Regulacio Genòmica Peptydy zawierające motywy palców cynkowych i ich zastosowania
EP2758529B1 (en) 2011-09-21 2019-03-20 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for regulation of transgene expression
US9222105B2 (en) 2011-10-27 2015-12-29 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of the HPRT locus
WO2013074999A1 (en) 2011-11-16 2013-05-23 Sangamo Biosciences, Inc. Modified dna-binding proteins and uses thereof
CA2865011C (en) * 2012-02-29 2021-06-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
EP2890780B8 (en) * 2012-08-29 2020-08-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
EP2997146A4 (en) 2013-05-15 2017-04-26 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
EP3929279A1 (en) 2014-03-18 2021-12-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for regulation of zinc finger protein expression
BR112016025849A2 (pt) 2014-05-08 2017-10-17 Chdi Foundation Inc métodos e composições para o tratamento da doença de huntington
SG10202112057QA (en) 2015-05-12 2021-12-30 Sangamo Therapeutics Inc Nuclease-mediated regulation of gene expression
DK3352776T3 (da) * 2015-09-23 2025-06-23 Sangamo Therapeutics Inc Htt-repressorer og deres anvendelse

Also Published As

Publication number Publication date
US20170096460A1 (en) 2017-04-06
ZA201903325B (en) 2020-09-30
NZ740590A (en) 2025-05-30
AU2016325613A1 (en) 2018-04-05
US10435441B2 (en) 2019-10-08
AU2020204035B2 (en) 2021-03-11
AU2016325613B2 (en) 2020-06-25
SI3352776T1 (sl) 2025-08-29
LT3352776T (lt) 2025-07-10
IL258030B (en) 2022-08-01
HRP20250728T1 (hr) 2025-08-15
DK3352776T3 (da) 2025-06-23
EP3352776B1 (en) 2025-03-19
KR20180054672A (ko) 2018-05-24
JP2021007405A (ja) 2021-01-28
CA2998500A1 (en) 2017-03-30
FI3352776T3 (fi) 2025-07-08
US11123443B2 (en) 2021-09-21
EP3352776A1 (en) 2018-08-01
US20210369872A1 (en) 2021-12-02
CN108348576B (zh) 2022-01-11
JP2018532428A (ja) 2018-11-08
AU2020204035A1 (en) 2020-07-09
EA201890493A1 (ru) 2018-09-28
US12551575B2 (en) 2026-02-17
US20200002390A1 (en) 2020-01-02
CN108348576A (zh) 2018-07-31
ZA201801679B (en) 2019-10-30
PT3352776T (pt) 2025-06-27
MX391052B (es) 2025-03-21
HK1256102A1 (zh) 2019-09-13
EA037993B1 (ru) 2021-06-21
EP3352776A4 (en) 2019-03-13
ES3032775T3 (en) 2025-07-24
IL258030A (en) 2018-05-31
HUE071655T2 (hu) 2025-09-28
PL3352776T3 (pl) 2025-09-22
JP6853257B2 (ja) 2021-03-31
CL2018000749A1 (es) 2019-04-26
KR102803519B1 (ko) 2025-05-08
BR112018005779A2 (pt) 2018-10-09
WO2017053753A1 (en) 2017-03-30
MX2018003491A (es) 2018-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12551575B2 (en) Htt repressors and uses thereof
EP3139966B1 (en) Compositions for use in treating huntington&#39;s disease
KR102674612B1 (ko) Tau 조절제 및 그것의 전달을 위한 방법 및 조성물
BR112014021104B1 (pt) Proteína de fusão de ocorrência não natural compreendendo um domínio de ligação de dna de dedo de zinco manipulado que se liga a um gene htt, seu uso, método in vitro de modificação da expressão de um gene htt em uma célula, e método de geração de um sistema modelo para o estudo da doença de huntington
CN113301909B (zh) Htt阻遏物及其应用
CA2998500C (en) Htt repressors and uses thereof
BR112018005779B1 (pt) Proteína dedo de zinco de ocorrência não natural que se liga ao gene htt, proteína de fusão, e uso de uma célula hospedeira
HK1256102B (en) Htt repressors and uses thereof
BR112019010014B1 (pt) Modulador genético de um gene de proteína tau associada a microtúbulo (mapt)
HK1232141B (en) Methods and compositions for treating huntington&#39;s disease