JP6853257B2 - Ｈｔｔリプレッサー及びその使用 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年９月２３日出願の米国仮特許出願第６２／２２２，５８８号に対する利益を主張するものであり、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、ハンチントン病の診断及び治療分野のものである。
ハンチントン舞踏病とも呼ばれるハンチントン病（ＨＤ）は、運動障害、認知障害、及び精神的障害を伴う進行性疾患である。この疾患の平均発症年齢は３５〜４４歳であるが、症例の約１０％においては２１歳以前に発症し、疾患と診断された後の平均寿命は１５〜１８年である。有病率は、西ヨーロッパ家系で１００，０００人中約３〜７人である。
ハンチントン病は、１９９０年代初期に初めて特性決定されたトリヌクレオチドリピート伸長障害の一例である（Ｄｉ Ｐｒｏｓｐｅｒｏ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｂｅｃｋ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５６−７６５を参照）。この障害は、３つ１組のヌクレオチドの不安定な反復の局所的伸長を伴い、その伸長した反復が存在する遺伝子は機能喪失、毒性機能獲得、またはその両方を生じる可能性がある。トリヌクレオチドリピートは、非コード遺伝子領域及びコード遺伝子領域を含めた、遺伝子のいずれの部分にも位置し得る。コード領域内に位置する反復には、一般にグルタミンをコードするトリプレット（ＣＡＧ）またはアラニンをコードするトリプレット（ＣＧＡ）いずれかの反復が含まれる。非コード配列内に伸長した反復領域が、遺伝子の異常発現をもたらす可能性がある一方で、コード領域内に伸長した反復（コドン反復障害とも呼ばれる）は、ミスフォールディング及びタンパク質凝集を引き起こすことがある。異常なタンパク質に関連する正確な病態生理学的原因は、判明していない場合が多い。一般的にトリヌクレオチド伸長を受ける野生型遺伝子において、正常な集団ではこれらの領域に可変数の反復配列が含まれるが、罹患した集団では２倍から対数オーダーの反復回数の増加まで、反復回数が増加し得る。ＨＤの場合、巨大細胞質タンパク質ハンチンチン（Ｈｔｔ）のＮ末端コード領域内に反復が挿入される。正常なＨｔｔアレルに含まれるＣＡＧリピートが１５〜２０回であるのに対して、３５回以上の反復を含むアレルは、ＨＤを引き起こす可能性があるアレルとみなすことができ、疾患を発症するリスクを与える可能性がある。３６〜３９回の反復を含んでいるアレルは、浸透性が不完全であると考えられており、それらのアレルが内在する個人は、疾患を発症することもしないこともある（または後年に症状を発症することがある）。それに対して４０回以上の反復を含んでいるアレルは、完全な浸透性であると考えられる。実際に、これほど多くの反復を有するＨＤアレルを保有している無症候者はまったく報告されていない。若年発症型ＨＤ（２１歳未満）を有する個人はしばしば、６０回以上のＣＡＧリピートを有することが見出されている。ＣＡＧリピートの増加に加えて、ＨＤは反復配列内に＋１及び＋２のフレームシフトを伴う可能性があり、その結果、その領域はポリグルタミンではなくポリセリンポリペプチド（＋１フレームシフトの場合、ＡＧＣリピートによってコードされる）トラックをコードすることになることも示されている（Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４３：８９３−８９６）。
ＨＤにおいて変異型Ｈｔｔアレルは通常、顕性形質として一方の親から遺伝する。ＨＤ患者から生まれた子供は、他方の親がその障害に罹患していなかった場合、５０％の確率で疾患を発症する。場合によっては、親が中間体のＨＤアレルを有し、無症候性である場合もあるが、反復伸長に起因してその子供に疾患が発現する。加えて、ＨＤアレルはまた、表現促進として知られる現象を示す可能性もあり、その場合、精子形成中の反復領域の不安定な性質に起因して数世代にわたり重度の増加または発症年齢の低下が観察される。
さらに、Ｈｔｔにトリヌクレオチドの伸長があると、線条体内の中型有棘ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）投射ニューロンに神経喪失が生じるほか、新皮質においても神経喪失が生じる。エンケファリンを含有し、淡蒼球外節に投射する中型有棘ニューロンは、サブスタンスＰを含有し、淡蒼球内節に投射するニューロンよりも影響を受ける。ハンチントン病の有病者が重大な影響を受ける他の脳領域には、黒質、大脳皮質３層、５層、及び６層、海馬のＣＡ１領域、頭頂葉の角回、小脳のプルキンエ細胞、視床下部の外側隆起核、ならびに視床中心核−束傍核（ｃｅｎｔｒｏｍｅｄｉａｌｐａｒａｆａｓｃｉｃｕｌａｒ）複合体（Ｗａｌｋｅｒ（２００７）Ｌａｎｃｅｔ ３６９：２１８−２２８）が含まれる。
正常なＨｔｔタンパク質の役割は、十分に理解されていないが、神経発生、アポトーシス細胞死、及び小胞輸送に関与している可能性がある。加えて、野生型Ｈｔｔが、線条体ニューロンの生存促進因子である、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の産生を刺激するという証拠が存在する。ＨＤのマウスモデルにおいてＨＤの進行がＢＤＮＦ発現の減少と相関すること（Ｚｕｃｃａｔｏ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２（２）：１３３−１３９）、またＨＤのマウスモデルにおいて、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター媒介性遺伝子送達によるＢＤＮＦまたはグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）いずれかの送達が、線条体ニューロンを保護できること（Ｋｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ，（２００４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ９（５）：６８２−６８８）が示されている。
ＨＤに対する診断及び治療の選択肢は、現在のところ非常に限定されている。診断に関しては、改変された（変異型）Ｈｔｔ（ｍＨＴＴ）のレベルが疾患負担スコアと有意な関連性を示し、可溶性ｍＨＴＴ種の濃度が疾患進行とともに上昇する。しかしながら、低濃度のｍＨＴＴは、患者ＣＮＳにおいて定量化することが困難であり、ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＤの神経病理生物学上の役割に関する研究に限界があり、ＨＴＴ降下薬による標的関与の実証を阻んでいる。例えば、Ｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ８５：ｅ４を参照のこと。
治療に関しては、化合物ゲルダナマイシンによるシャペロニンの過剰発現または熱ショック応答の誘導などの、伸長したポリグルタミントラクトを通じて生じるタンパク質凝集に伴う毒性を予防するように設計された、いくつかの可能性のある手法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいてこのような毒性の低減を示している。その他の治療は、疾患の臨床徴候にアポトーシスが果たす役割を標的としている。例えば、対となるマウスの子孫の動物モデルで、一方の親がＨＤアレルを含み、他方の親がカスパーゼ１に対してドミナントネガティブのアレルを有した場合に、カスパーゼ活性の遮断による疾患症状の緩徐化が示されている。さらに、カスパーゼによる変異型ＨＤ Ｈｔｔの切断が、疾患の病原性に役割を果たす可能性がある。カスパーゼ−６耐性の変異型Ｈｔｔを有するトランスジェニックマウスは、カスパーゼ非耐性の変異型Ｈｔｔアレルを有するマウスと比較して、正常な神経機能を維持することが見出され、線条体神経変性を発症しなかった（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｃｅｌｌ １２５：１１７９−１１９１を参照）。アポトーシス経路のメンバーを標的とする分子もまた、総体的症状に対して緩徐化効果を有することが示されている。例えば、いずれもカスパーゼ活性を阻害する化合物ｚＶＡＤ−ｆｍｋ及びミノサイクリンは、マウスにおいて疾患徴候を緩徐化することが示されている。薬物レマセミドもまたヒトの小規模なＨＤ治験に使用されてきたが、これは、この化合物がＮＤＭＡ受容体への変異型Ｈｔｔの結合を阻止して、神経細胞に対する毒性作用の影響を阻止すると考えられたためである。しかしながら、これらの治験において、ニューロン機能の統計的に有意な改善はまったく観察されなかった。これに加えて、ハンチントン研究グループが、補酵素Ｑを使用した無作為二重盲検試験を行った。補酵素Ｑ１０で治療された患者間では疾患進行が緩徐化する傾向が観察されたものの、全機能的能力の低下速度に関しては有意な変化は見られなかった。（Ｄｉ Ｐｒｏｓｐｅｒｏ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｂｅｃｋ，前掲）。
ジンクフィンガータンパク質（「ＺＦＰ」）、ＴＡＬ−エフェクタードメイン（「ＴＡＬＥ」）、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ転写因子系（Ｃａｓ及び／またはＣｆｐ１系を含む）由来のＤＮＡ結合ドメインを含む組換え転写因子及びヌクレアーゼは、内因性遺伝子の遺伝子発現を制御する能力を有する。例えば、米国特許第９，０４５，７６３号、同第９，００５，９７３号、同第８，９５６，８２８号、同第８，９４５，８６８号、同第８，５８６，５２６号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，８８８，１２１号、同第７，９７２，８５４号、同第７，９１４，７９６号、同第７，９５１，９２５号、同第８，１１０，３７９号、同第８，４０９，８６１号、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６００６３２３１号、同第２００８０１５９９９６号、同第２０１０００２１８２６４号、同第２０１２００１７２９０号、同第２０１１０２６５１９８号、同第２０１３０１３７１０４号、同第２０１３０１２２５９１号、同第２０１３０１７７９８３号、及び同第２０１３０１７７９６０号及び同第２０１５００５６７０５号、ならびに米国出願第１４／７０６，７４７号、Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９７３−９７６、Ｐｌａｔｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊ．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｐｂｉ．１２２８４を参照のこと。各開示は目的を問わず全体として参照により本明細書に組み込まれる。さらに、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ系（例えば、「ＴｔＡｇｏ」とも呼ばれるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来。Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８−２６１を参照）に基づいた標的ヌクレアーゼが開発されており、これもまた、ゲノム編集及び遺伝子治療に使用される可能性を有し得る。ジンクフィンガータンパク質を含むこれらの遺伝子操作された転写因子を用いた臨床試験は、こうした新規な転写因子が様々な病態を治療できることを示している。（例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０：４７９−４８１を参照）。ヌクレアーゼ媒介性切断には、標的ＤＮＡ配列中の二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを誘導するように遺伝子操作されたヌクレアーゼの使用を伴い、それによって非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの、エラーが起こりやすい経路による切断の修復、または修復テンプレートを使用した修復（相同組換え修復すなわちＨＤＲ）により、遺伝子のノックアウトまたは目的配列の挿入（標的化組み込み）をもたらすことができる。外部から供給される修復テンプレート（例えば、「ドナー」または「導入遺伝子」）を用いない二本鎖切断の導入は一般に、細胞性ＮＨＥＪ経路により導入される変異（「インデル（ｉｎｄｅｌ）」と呼ばれる挿入及び／または欠失）を介した標的遺伝子の不活性化に使用される。例えば、米国特許公開第２０１１００８２０９３号は、Ｈｔｔを標的とする特異的ジンクフィンガータンパク質を開示し、米国特許公開第２０１３０２５３０４０号は、ＨｔｔなどのＨＤアレルの発現を調節するＤＮＡ結合タンパク質に関する。米国公開第２０１５０３３５７０８号は、中型有棘ニューロンを改変する方法に関する。
しかしながら、脳への広範な送達を示す治療法を含めた、ハンチントン病の診断、研究、治療、及び／または予防のための方法が依然として必要とされている。
米国特許第９，０４５，７６３号 米国特許第９，００５，９７３号 米国特許第８，９５６，８２８号 米国特許第８，９４５，８６８号 米国特許第８，５８６，５２６号 米国特許第６，５３４，２６１号 米国特許第６，５９９，６９２号 米国特許第６，５０３，７１７号 米国特許第６，６８９，５５８号 米国特許第７，０６７，３１７号
Ｄｉ Ｐｒｏｓｐｅｒｏ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｂｅｃｋ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５６−７６５ Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４３：８９３−８９６ Ｗａｌｋｅｒ（２００７）Ｌａｎｃｅｔ ３６９：２１８−２２８ Ｚｕｃｃａｔｏ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２（２）：１３３−１３９ Ｋｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ，（２００４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ９（５）：６８２−６８８ Ｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ８５：ｅ４ Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｃｅｌｌ １２５：１１７９−１１９１
本明細書ではハンチントン病を診断、予防、及び／または治療するための方法及び組成物を開示する。特に、本明細書では、（Ｈｔｔ発現を抑制する）Ｈｔｔリプレッサーを含め、ハンチントン疾患の治療を目的としたＨＤ Ｈｔｔアレルの改変（例えばその発現を調節する）方法及び組成物を提供する。本明細書に記載の組成物（Ｈｔｔリプレッサー）は、例えば、対象における細胞死の減少、アポトーシスの減少、細胞機能（代謝）の増加、及び／または運動不全の軽減により、対象に治療的利益を与える。また、霊長類の脳における二方向性の軸索輸送を可能にする方法及び組成物を提供する。驚くべきことにかつ予想外に、本発明者らは、使用されてきた他のＡＡＶ血清型とは異なり、ＡＡＶ９が、ＡＡＶ９投与部位から離れた脳領域への順行性及び逆行性の軸索輸送を含め、脳全体に広範な送達を示すことを見出した。したがって、本明細書では、Ｈｔｔ遺伝子に結合する非天然型ジンクフィンガータンパク質であって、Ｆ１〜Ｆ５に指示される５つのジンクフィンガードメインを含み、そのジンクフィンガードメインが、表１の単一の行に示される認識ヘリックス領域配列を含んでいるジンクフィンガータンパク質について記載する。
したがって、一態様では、遺伝子操作された（非天然型）Ｈｔｔリプレッサーを提供する。リプレッサーは、ＨＤアレル（例えば、Ｈｔｔ）の発現を調節する系（例えば、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質、またはＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ−ＴＦ）を含み得る。遺伝子操作されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、認識ヘリックスまたはＲＶＤ）が、あらかじめ選択された標的部位に結合するように（例えば、選択及び／または合理的な設計によって）改変された非天然型ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質である。本明細書に記載のジンクフィンガータンパク質はいずれも、１、２、３、４、５、６またはそれ以上のジンクフィンガーを含むことができ、各ジンクフィンガーは、選択された配列（複数可）（例えば、遺伝子（複数可））の標的サブ部位に結合する認識ヘリックスを有する。同様に、本明細書に記載のＴＡＬＥタンパク質はいずれも、任意の数のＴＡＬＥ ＲＶＤを含むことができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＶＤが非特異的ＤＮＡ結合を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの認識ヘリックス（またはＲＶＤ）が非天然型である。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質は、４５６４３または４６０２５と命名されたタンパク質において認識ヘリックスを有する（表１）。ある特定の実施形態では、リプレッサーは、転写抑制ドメインに機能可能に連結されたＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、単一ガイドＲＮＡ）を含んでいる。いくつかの実施形態では、これらのＺＦＰ−ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ−ＴＦ、またはＴＡＬＥ−ＴＦには、ＤＮＡに結合したときに多量体化を可能にするタンパク質相互作用ドメイン（または「二量体化ドメイン」）が含まれる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣａｓタンパク質、またはＴＡＬＥタンパク質を、融合タンパク質の一部として制御ドメイン（または機能ドメイン）と機能的に連結して配置することができる。機能ドメインは、例えば、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、及び／またはヌクレアーゼ（切断）ドメインであり得る。活性化ドメインまたは抑制ドメインのいずれかを選択してＤＮＡ結合ドメインとともに使用することにより、そのような分子を遺伝子発現の活性化または抑制に使用することができる。いくつかの実施形態では、変異型Ｈｔｔ発現の下方制御に使用できる転写抑制ドメインに融合された、本明細書に記載の変異型Ｈｔｔを標的とするＺＦＰ、ｄＣａｓ、またはＴＡＬＥを含む分子を提供する。いくつかの実施形態では、野生型Ｈｔｔアレルを上方制御できる転写活性化ドメインに融合された、野生型Ｈｔｔアレルを標的とするＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはＴＡＬＥを含む融合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、制御ドメインの活性が外因性小分子またはリガンドによって制御され、外因性リガンドの非存在下では細胞の転写機構との相互作用が起こらない。一方で、他の実施形態では外因性小分子またはリガンドにより相互作用が阻止される。そのような外部リガンドは、ＺＦＰ−ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦ、またはＴＡＬＥ−ＴＦが転写機構と相互作用する程度を制御する。制御ドメイン（複数可）は、１つ以上のＺＦＰ、ｄＣａｓ、またはＴＡＬＥの間、１つ以上のＺＦＰ、ｄＣａｓ、またはＴＡＬＥ及びそれらのいずれかの組み合わせの外側を含む、１つ以上のＺＦＰ、ｄＣａｓ、またはＴＡＬＥの任意の部分（複数可）に機能的に連結することができる。本明細書に記載の融合タンパク質はいずれも、医薬組成物に製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作されたＤＮＡ結合ドメインを、融合タンパク質の一部としてヌクレアーゼ（切断）ドメインと機能的に連結して配置することができる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼにはＴｔａｇｏヌクレアーゼを含む。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などのヌクレアーゼ系を特定の単一ガイドＲＮＡとともに利用し、ヌクレアーゼをＤＮＡの標的位置に標的化することができる。ある特定の実施形態では、そのようなヌクレアーゼ及びヌクレアーゼ融合体を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、または神経幹細胞などの幹細胞における変異型Ｈｔｔアレルの標的化に利用してもよく、その場合、ヌクレアーゼ融合体の活性により、野生型の回数のＣＡＧリピートを含むＨｔｔアレルが得られることになる。したがって、本明細書に記載のＨｔｔリプレッサーはいずれも、二量体化ドメイン及び／または機能ドメイン（例えば、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、またはヌクレアーゼドメイン）をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、改変細胞（例えば、幹細胞）を含む医薬組成物を提供する。
さらに別の態様では、１つ以上の本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルス（例えば、ＡＡＶまたはＡｄ）ベクター及び／または非ウイルス（例えば、プラスミドまたはｍＲＮＡベクター）に保持される。こうしたポリヌクレオチドを含む宿主細胞（例えば、ＡＡＶベクター）、ならびに／または本明細書に記載のポリヌクレオチド、タンパク質、及び／もしくは宿主細胞を含む医薬組成物もまた提供する。
他の態様では、本発明には標的細胞へのドナー核酸の送達を含む。ドナーは、ヌクレアーゼ（複数可）をコードする核酸の前、後、またはそれと一緒に送達することができる。ドナー核酸は、細胞のゲノム、例えば内因性遺伝子座に組み込もうとする外因性配列（導入遺伝子）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ドナーは、標的切断部位との相同領域に隣接する全長遺伝子またはその断片を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ドナーは相同領域がなく、相同性に依存しない機構（すなわちＮＨＥＪ）によって標的遺伝子座に組み込まれる。ドナーは任意の核酸配列、例えば、ヌクレアーゼ誘導性二本鎖切断の相同性組換え修復のための基質として使用した場合に、内因性染色体座にドナー特異的欠失を生じさせる、あるいは（またはそれに加えて）新規なアレル形態（例えば、転写因子結合部位を除去する点変異）の内因性遺伝子座を形成するような核酸を含み得る。いくつかの態様では、ドナー核酸は、組み込みにより遺伝子修正事象または標的化された欠失を生じさせるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。いくつかの態様では、ｍＲＮＡは化学的に修飾されていてもよい（例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（２）：１５４−１５７を参照）。他の態様では、ｍＲＮＡはＡＲＣＡキャップを含んでもよい（米国特許７，０７４，５９６及び８，１５３，７７３を参照）。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは未修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドとの混合物を含んでもよい（米国特許公開２０１２−０１９５９３６を参照）。
さらに別の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む遺伝子送達ベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクター）、組み込み能力をもつレンチウイルスベクターまたは組み込み欠損レンチウイルスベクターを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ）、またはアデノウイルス随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ６ベクターまたはＡＡＶ９ベクターである。したがって、本明細書では、標的遺伝子への標的化組み込みのために、少なくとも１つのヌクレアーゼ（ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）をコードする配列及び／またはドナー配列を含む、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター、ＬＶ、またはアデノウイルス随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）もまた提供する。ある特定の実施形態では、Ａｄベクターは、Ａｄ５／Ｆ３５ベクターなどのキメラＡｄベクターである。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）または組み込み能力をもつレンチウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ベクターは、ＶＳＶ−Ｇエンベロープまたは他のエンベロープを用いて偽型化される。
加えて、核酸及び／またはタンパク質（例えば、ＺＦＰ、Ｃａｓ、またはＴＡＬＥ、またはＺＦＰ、Ｃａｓ、もしくはＴＡＬＥを含む融合タンパク質）を含む医薬組成物も提供する。例えば、ある特定の組成物は、制御配列に機能可能に連結された、本明細書に記載のＺＦＰ、Ｃａｓ、またはＴＡＬＥのうちの１つをコードする配列を含む核酸を、薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて含み、その場合、この制御配列により細胞での核酸の発現が可能になる。ある特定の実施形態では、コードされるＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはＴＡＬＥは、ＨＤ Ｈｔｔアレルに特異的である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＨＤ Ｈｔｔアレルを調節するＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはＴＡＬＥ、及び神経栄養因子を調節するＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはＴＡＬＥを含む。タンパク質を用いた組成物は、本明細書で開示される１つ以上のＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはＴＡＬＥ、及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
さらに別の態様では、本明細書に記載のタンパク質、ポリヌクレオチド、及び／または組成物のいずれかを含む単離された細胞も提供する。
別の態様では、細胞（例えば、対象の脳、例えば線条体のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの神経細胞）におけるＨｔｔ遺伝子の発現を改変する方法であって、その細胞に、本明細書に記載の１種以上のタンパク質、ポリヌクレオチド、及び／または細胞を投与することを含む方法について本明細書に記載する。Ｈｔｔ遺伝子は、少なくとも１つの野生型及び／または変異型Ｈｔｔアレルを含み得る。ある特定の実施形態では、Ｈｔｔ発現が抑制される。
別の態様では、本明細書に記載の方法及び組成物（タンパク質、ポリヌクレオチド、及び／または細胞）を使用してハンチントン病を治療及び／または予防する方法を本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、この方法には、ウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えばプラスミド）、及び／またはそれらの組み合わせを使用してポリヌクレオチド及び／またはタンパク質を送達することができる組成物を伴う。いくつかの実施形態では、方法には、ＺＦＰまたはＴＡＬＥを含むか、または本発明のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、Ｔｔａｇｏ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系で改変された幹細胞集団を含む組成物を伴う。対象は、少なくとも１つの変異型Ｈｔｔアレル及び／または野生型Ｈｔｔアレルを含み得る。
さらに別の態様では、ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）ベクターを使用して対象の脳にＨｔｔのリプレッサーを送達する方法について本明細書に記載する。カニューレの使用を含む任意の好適な手段によって、任意の脳領域、例えば線条体（例えば、被殻）に送達することができる。いくつかの実施形態では、送達は、くも膜下空間への直接注射によるものである。さらなる実施形態では、送達は静脈内注射によるものである。ＡＡＶ９ベクターは、ベクターを直接投与していない脳領域への順行性及び逆行性の軸索輸送によるものを含め、対象の脳へのリプレッサーの広範な送達を提供する（例えば、被殻への送達の結果、皮質、黒質、視床などの他の構造に送達される）。ある特定の実施形態では、対象はヒトであり、他の実施形態では、対象は非ヒト霊長類である。
したがって、他の態様では、対象のＨＤを予防及び／または治療する方法であって、対象に変異型Ｈｔｔアレルのリプレッサーを投与することを含む方法について本明細書に記載する。リプレッサーは、ポリヌクレオチド形態で（例えば、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）及び／または非ウイルスベクター（例えば、プラスミド及び／またはｍＲＮＡ）を使用して）、タンパク質形態で、及び／または本明細書に記載の医薬組成物（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ＡＡＶベクター、タンパク質、及び／または細胞を含む医薬組成物）によって投与することができる。ある特定の実施形態では、リプレッサーは対象のＣＮＳ（例えば、被殻）に投与される。このリプレッサーは、限定されないものの、ＨＤに罹患した対象のＨＤニューロンにおけるＨｔｔ凝集体の形成を減少させること；ニューロンまたはニューロン集団（例えば、ＨＤニューロンまたはＨＤニューロンの集団）の細胞死を減少させること；及び／またはＨＤ対象における運動障害（例えば、クラスピング）を軽減させることを含む治療的利益をもたらすことができる。
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、変異型Ｈｔｔアレルのリプレッサーは、ＺＦＰ−ＴＦ、例えば変異型Ｈｔｔアレル及び転写抑制ドメイン（例えば、ＫＯＸ、ＫＲＡＢなど）に特異的に結合するＺＦＰを含む融合タンパク質であってよい。他の実施形態では、変異型Ｈｔｔアレルのリプレッサーは、ＴＡＬＥ−ＴＦ、例えば変異型Ｈｔｔアレル及び転写抑制ドメイン（例えば、ＫＯＸ、ＫＲＡＢなど）に特異的に結合するＴＡＬＥポリペプチドを含む融合タンパク質であってよい。いくつかの実施形態では、変異型ＨｔｔアレルリプレッサーはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦであり、そのＣａｓタンパク質中のヌクレアーゼドメインは、タンパク質がこれ以上ＤＮＡを切断しないように不活性化されている。得られたＣａｓ ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ドメインは、変異型Ｈｔｔアレルを抑制する転写リプレッサー（例えば、ＫＯＸ、ＫＲＡＢなど）に融合される。さらに別の実施形態では、リプレッサーには、変異型Ｈｔｔアレルを切断し、それによって不活性化することによって、変異型Ｈｔｔアレルを抑制するヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、及び／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を含み得る。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼによる切断後の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって挿入及び／または欠失（「インデル」）を導入する。他の実施形態では、ヌクレアーゼが、（相同組換え方法または非相同組換え方法によって）ドナー配列を導入し、このドナー組み込みにより変異型Ｈｔｔアレルが不活性化される。
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、リプレッサーを、タンパク質、ポリヌクレオチド、またはタンパク質とポリヌクレオチドとの任意の組み合わせとして対象（例えば、脳）に送達することができる。ある特定の実施形態では、リプレッサー（複数可）は、ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）ベクターを使用して送達される。他の実施形態では、リプレッサーの少なくとも１つの構成要素（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｓｇＲＮＡ）がＲＮＡ形態で送達される。他の実施形態では、リプレッサー（複数可）は、本明細書に記載の発現構築物のいずれかの組み合わせ、例えば、ある発現構築物（例えばＡＡＶ９などのＡＡＶ）上の１つのリプレッサー（またはその一部）、別の発現構築物（ＡＡＶまたは他のウイルスまたは非ウイルス構築物）上の１つのリプレッサー（またはその一部）の組み合わせを使用して送達される。
さらに、本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、リプレッサーは望ましい効果を与える任意の濃度（用量）で送達することができる。好ましい実施形態では、リプレッサーは、１０，０００〜５００，０００ベクターゲノム／細胞（すなわちそれらの間の任意の値）のアデノ随伴ウイルスベクターを使用して送達される。ある特定の実施形態では、リプレッサーは、２５０〜１，０００（すなわちそれらの間の任意の値）のＭＯＩでレンチウイルスベクターを使用して送達される。他の実施形態では、リプレッサーは、１５０〜１，５００ｎｇ／１００，０００細胞（すなわちそれらの間の任意の値）のプラスミドベクターを使用して送達される。他の実施形態では、リプレッサーは、１５０〜１，５００ｎｇ／１００，０００細胞（すなわちそれらの間の任意の値）のｍＲＮＡとして送達される。
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本方法は、対象の１つ以上のＨＤニューロンにおいて変異型Ｈｔｔアレルを約７０％以上、約７５％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上、または約９５％以上抑制することができる。
さらなる態様では、本明細書に記載の発明は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ ＴＦ）、ＴＡＬＥ（ＴＡＬＥ−ＴＦ）、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦ、例えばＺＦＰ−ＴＦ、ＴＡＬＥ−ＴＦ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦのうちの１つ以上を含むＨｔｔ調節転写因子などの１つ以上のＨｔｔ調節転写因子を含む。ある特定の実施形態では、Ｈｔｔ調節転写因子は、対象の１つ以上のＨＤニューロンにおいて変異型Ｈｔｔアレルの発現を抑制することができる。対象の１つ以上のＨＤニューロンにおける変異型Ｈｔｔアレルの抑制は、未処理（野生型）のニューロンと比較して、約７０％以上、約７５％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上、または約９５％以上の抑制であり得る。ある特定の実施形態では、Ｈｔｔ調節転写因子を使用して、本明細書に記載の方法のうち１つ以上を達成することができる。
いくつかの実施形態では、明白な臨床症状を分析するために、治療有効性をハンチントン病統一評価尺度（ＵＨＤＲＳ）（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ（１９９６）Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ １１（２）：１３６−１４２）を使用して測定する。他の実施形態では、患者における有効性をＰＥＴ及びＭＲＩイメージングを使用して測定する。いくつかの実施形態では、変異型Ｈｔｔ調節転写因子による治療は、明白な臨床症状のさらなる発現を予防し、何らかのさらなる神経機能の喪失を予防する。他の実施形態では、変異型Ｈｔｔ調節転写因子による治療は、臨床症状を改善し、ニューロン機能を改善する。
１つ以上のＡＡＶ９ Ｈｔｔモジュレーター（例えば、リプレッサー）、ならびに／または本明細書に記載のＨｔｔモジュレーターの構成要素を含むポリヌクレオチド及び／もしくはＨｔｔモジュレーター（またはその構成要素）をコードするポリヌクレオチドを含むキットもまた提供する。キットにはさらに、細胞（例えば、ニューロン）、試薬（例えば、ＣＳＦ中のｍＨｔｔタンパク質を検出及び／または定量するための試薬）、及び／または本明細書に記載の方法を含む使用上の説明書が含まれていてもよい。
したがって、本開示は、限定するものではないが、以下の番号付き実施形態を包含する：
１．Ｈｔｔ遺伝子に結合する非天然型ジンクフィンガータンパク質であって、Ｆ１〜Ｆ５に指示される５つのジンクフィンガードメインを含み、そのジンクフィンガードメインが、表１の単一の行に示される認識ヘリックス領域配列を含んでいるジンクフィンガータンパク質。
２．ＤＮＡに結合したときにジンクフィンガータンパク質の多量体化を可能にする二量体化ドメインをさらに含む、１のＨｔｔリプレッサー。
３．１または２のジンクフィンガータンパク質と機能ドメインとを含む融合タンパク質。
４．機能ドメインが、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、及びヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、３の融合タンパク質。
５．１〜２の１つ以上のジンクフィンガータンパク質または３もしくは４の１つ以上の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
６．５のポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクター。
７．ベクターがＡＡＶ９ベクターである、６のＡＡＶベクター。
８．１〜２に記載の１つ以上のジンクフィンガータンパク質、または３もしくは４による１つ以上の融合タンパク質、５による１つ以上のポリヌクレオチド、または６もしくは７による１つ以上のＡＡＶベクターを含む宿主細胞。
９．１〜２の１つ以上のジンクフィンガータンパク質、または３もしくは４による１つ以上の融合タンパク質、５による１つ以上のポリヌクレオチド、または６もしくは７による１つ以上のＡＡＶベクターを含む医薬組成物。
１０．細胞におけるＨｔｔ遺伝子の発現を改変する方法であって、５による１つ以上のポリヌクレオチドまたは６もしくは７による１つ以上のＡＡＶベクターを細胞に投与することを含む方法。
１１．Ｈｔｔ遺伝子が少なくとも１つの変異型アレルを含む、１０の方法。
１２．Ｈｔｔ遺伝子が野生型である、１０の方法。
１３．融合タンパク質が抑制ドメインを含み、Ｈｔｔ遺伝子の発現が抑制される、１０〜１２のいずれかの方法。
１４．細胞が神経細胞である、１０〜１３のいずれかの方法。
１５．神経細胞が脳内のものである、１４の方法。
１６．神経細胞が脳の線条体内のものである、１５の方法。
１７．ハンチントン病の治療及び／または予防を必要とする対象に行う方法であって、５による１つ以上のポリヌクレオチド、または６もしくは７による１つ以上のＡＡＶベクターを、必要とする対象に投与することを含む方法。
１８．細胞におけるＨｔｔ遺伝子の発現を改変する方法であって、１つ以上のＡＡＶ９ベクター、１つ以上のＨｔｔリプレッサーをコードするＡＡＶ９ベクターを細胞に投与することを含む方法。
１９．Ｈｔｔ遺伝子が少なくとも１つの変異型アレルを含む、１８の方法。
２０．Ｈｔｔ遺伝子が野生型である、１８の方法。
２１．融合タンパク質が抑制ドメインを含み、Ｈｔｔ遺伝子の発現が抑制される、１８〜２１のいずれかの方法。
２２．細胞が神経細胞である、１８〜２１のいずれかの方法。
２３．神経細胞が脳内のものである、２２の方法。
２４．神経細胞が脳の線条体内のものである、２３の方法。
２５．ハンチントン病の治療及び／または予防を必要とする対象に行う方法であって、１つ以上のＡＡＶ９ベクター、１つ以上のＨｔｔリプレッサーをコードするＡＡＶ９ベクターを、必要とする対象に投与することを含む方法。
開示全体を考慮すれば、当業者にとってこれらの態様及び他の態様は明白であろう。
図１Ａ〜図１Ｊは、ＡＡＶ９ベクターをＮＨＰ被殻に注入した後の結果を示す画像である。２匹の正常な非ヒト霊長類（ＮＨＰ−１及びＮＨＰ−２と命名）の両側被殻へのＡＡＶ９−ＧＦＰ（１００μＬ）のＭＲＩ誘導注入を比較したパネルを図１Ａ及び図１Ｂに示し、各対象の３次元再構成図を図１Ｃ及び１Ｄに示す。青色で標識された各被殻（ｎ＝４）の再構成された容積の測定値は、ＮＨＰ−１が約８５０μＬ、ＮＨＰ−２が約６２５μＬであった。橙色で標識された、ＡＡＶ９−ＧＦＴ粒子及びキレート化ガドリニウムイメージング試薬を含む注入液は各注入あたり約３５０μＬに分配した。図１Ｅ、図１Ｆ、及び図１Ｇはそれぞれ、ＮＨＰ−１のカニューレ軌道経路の冠状図、左矢状図、及び右矢状図を示し、図１Ｈ、図１Ｉ、及び図１Ｊはそれぞれ、ＮＨＰ−２のカニューレ軌道経路の冠状図、左矢状図、及び右矢状図を示す。 同上 図２Ａ〜図２Ｈは、ＮＨＰの被殻及び自然免疫状態におけるＡＡＶ９媒介性ＧＦＰ発現を示す。図２Ａ及び図２Ｂは、被殻内のＧＦＰ染色を示す。ボックス領域の高倍率画像が下段に示されており、これは高用量（「ＨＤ」、左半球、１．５×１０１３ｖｇ／ｍＬ）または低用量（「ＬＤ」、右半球、１．５×１０１２ｖｇ／ｍＬ）いずれかのベクターを投与した被殻でのＮｅｕＮ陽性細胞を表す。図２Ｃ及び図２Ｄは、形質導入の主要領域（ＰＡＴ）を白色で表したグラフであり、ＧＦＰ陽性シグナル「外部」の被殻内の領域は「ｏＰＡＴ」であり、灰色で示されている。ナイーブ対照ＮＨＰと並行して実施された、被殻内のＰＡＴ及びｏＰＡＴでの３つの冠状面におけるＮｅｕＮ陽性細胞の数は、低用量の半球と高用量の半球とを比較したとき、ＮｅｕＮシグナルに検出可能な差は示されなかった。共局在化したＧＦＰ陽性／ＮｅｕＮ陽性細胞の数から、形質導入はＰＡＴでは約７４％有効であり、ｏＰＡＴでは有効性が低いかまたはゼロであると判明した。データは平均細胞数＋ＳＤで表す。ＰＡＴ及びｏＰＡＴ内に形質導入された細胞についてのウィルコクソンの符号順位Ｓ検定によるＰ値（＊）は０．０１未満である。図２Ａ〜図２Ｄのスケールバーは５０μＭである。図２Ｅ、図２Ｆ、図２Ｇ、及び図２Ｈは、自然免疫状態での遠位（図２Ｅ及び図２Ｆ）と近位（図２Ｇ及び図２Ｈ）との比較を示す。陽性染色されたＭＨＣＩＩ（図２Ｅ及び図２Ｇ、スケールバー５０μｍ）の上方制御及びＩｂａ１活性化（図２Ｆ及び図２Ｈ、スケールバー２００μｍ）が、遠位部位と比較して注入部位の近位に示されている。 同上 図３Ａ〜図３Ｆは、指定した標的（ＮｅｕＮ、ＧＦＡＰ、Ｉｂａ１、赤色）、ＧＦＰ（緑色）、及び二重標識免疫蛍光（黄色）の被殻内における注入部位でのＡＡＶ９ベクターの細胞指向性を示す画像である。図３Ａ、図３Ｂ、及び図３ＣはＮＨＰ−１における結果を示し、図３Ｄ、図３Ｅ、及び図３ＦはＮＨＰ−２における結果を示す。二重標識免疫蛍光は、ＮｅｕＮ陽性細胞体及びＧＦＡＰ陽性細胞体の両方においてＧＦＰ発現を示した。対照的に、キャプシドはＩｂａ１陽性細胞体を形質導入しなかった。このことは、ＡＡＶ９がミクログリアに形質導入しないと思われることを示している。スケールバーは５０μｍである。 同上 図４Ａ及び図４Ｂは、被殻から皮質へのＡＡＶ９の逆行性軸索輸送を示す。ＮＨＰ−１（図４Ａ）及びＮＨＰ−２（図４Ｂ）の前部（ｉ及びｉｉ）及び後部（ｉｉｉ及びｉｖ）からカニューレ管までの処理された冠状脳断面は、皮質線条体の投影に沿ったＡＡＶ９−ＧＦＰの強固な軸索輸送を示した。「ｉ」「ｉｉ」「ｉｉｉ」及び「ｉｖ」と表記された黒い四角内の領域の高倍率画像は、高用量ベクターを受けた半球内の皮質細胞体及び線維におけるＧＦＰ発現の増加を示しており、対側と比較して用量効果を示している。スケールバーは２００μｍである。 図５Ａ及び図５Ｂは遠位領域への軸索輸送を示す。図５ＡはＮＨＰ−１の結果を示し、図５ＢはＮＨＰ−２の結果を示す。被殻にＡＡＶ９を注入すると、被殻からの作用を受けることが知られている多くの遠位領域にＧＦＰ陽性細胞が生じた。示されているのは、抗ＧＦＰ免疫組織化学であり、各冠状断面の概算位置はカニューレ管の１２ｍｍ後方である。下段の高倍率画像は、淡蒼球（「ＧＰ」）、視床、視床下部ヌクレアーゼ（「ＳＴＮ」）、内側前脳束（「ＭＦＢ」）、及び黒質（「ＳＮ」）の左半球及び右半球に対応する。スケールバーは５００μｍである。 図６Ａ及び図６Ｂは、黒質網様部及び黒質緻密部へのＡＡＶの軸索輸送を示す。図６ＡはＮＨＰ−１の結果を示し、図６ＢはＮＨＰ−２の結果を示す。黒質緻密部（「Ｓｎｃ」）のＧＦＰ陽性（緑色）及びチロシンヒドロキシラーゼ陽性（赤色）細胞体及び繊維、ならびに黒質網様部（「ＳＮｒ」）の繊維において二重標識免疫蛍光（黄色）が認められる。チロシンヒドロキシラーゼ（「ＴＨ」）染色は、ドーパミン作動性ニューロンを識別する。ＳＮｒ及びＳＮｃにおける細胞体の形質導入は、それぞれ順行性及び逆行性の軸索輸送の両方を示す。同側（高用量）半球と対側（低用量）半球との間で、ＧＦＰの発現の増加が観察された。スケールバーは５００μｍである。 霊長類の脳における神経連絡経路を示す模式図である。高用量（左）と低用量（右）のＮＨＰ脳半球間での順行性及び逆行性の輸送系及び用量効果を例示する。灰色で網掛けされた線条体注射部位（「Ｓｔｒ」）のＡＡＶ９−ＧＦＰウイルス粒子は、皮質（「Ｃｔｘ」）、視床（「Ｔｈ」）、及び黒質緻密部（「ＳＮｃ」）を含む二次脳領域へ逆行性輸送された。ウイルス粒子の順行性輸送は、黒質網様部（「ＳＮｒ」）を標的とした。血管周囲拡散または順行性軸索手段のいずれかによる淡蒼球（「ＧＰ」）への輸送によって、視床下核（「ＳＴＮ」）への軸索輸送が生じる。ニューロンのＧＦＰ陽性線維の存在は、灰色のストロークで示され、ＧＦＰ陽性細胞体は黒い点で示されている。形質導入された細胞体の欠如は、白丸で示されている。 ＺＦＰ４６０２５、ＺＦＰ４５６４３、またはＧＦＰ対照のいずれかで処理したＨＤ患者由来の線維芽細胞における野生型Ｈｔｔ遺伝子（灰色のバー、ＣＡＧ１８）または変異型Ｈｔｔ遺伝子（黒色のバー、ＣＡＧ４５）の発現プロファイルを示すグラフである。データは、野生型Ｈｔｔアレルの発現がすべてのサンプルにおいてほぼ一定であるのに対して、変異型Ｈｔｔ特異的ＺＦＰで処理された細胞は、高用量のＺＦＰ ｍＲＮＡで変異型Ｈｔｔの発現が減少したことを示す。 ＺＦＰ４６０２５、ＺＦＰ４５６４３、またはＧＦＰ対照のいずれかで処理したＨＤ患者由来の線維芽細胞における野生型Ｈｔｔ遺伝子（灰色のバー、ＣＡＧ２１）または変異型Ｈｔｔ遺伝子（黒色のバー、ＣＡＧ３８）の発現プロファイルを示すグラフである。データは、野生型Ｈｔｔアレルの発現がすべてのサンプルにおいてほぼ一定であるのに対して、変異型Ｈｔｔ特異的ＺＦＰで処理された細胞は、高用量のＺＦＰ ｍＲＮＡで変異型Ｈｔｔの発現が減少したことを示す。 ＨＤ胚性幹細胞から分化したニューロンにおける野生型Ｈｔｔ遺伝子（灰色のバー、ＣＡＧ１７）または変異型Ｈｔｔ遺伝子（黒色のバー、ＣＡＧ４８）の発現プロファイルを示すグラフである。データは、高用量のＺＦＰをコードするｍＲＮＡで、野生型Ｈｔｔアレルは抑制されないが、変異型Ｈｔｔ遺伝子が抑制されることを示している。 図１１Ａ及び図１１Ｂは、使用するＺＦＰがＡＡＶ６またはＡＡＶ９ウイルスベクターのいずれかを使用して送達されたＣＡＧ１７／４８分化型ニューロンにおけるＨｔｔの発現を示すグラフである。ＺＦＰ４６０２５、４５６４３、またはＧＦＰ対照をコードするＡＡＶ６ベクター（図１１Ａ）またはＡＡＶ９ベクター（図１１Ｂ）を使用して、ＨＤ胚性幹細胞（ＥＳＣ）ＧＥＮＥＡ０２０（ＧＥＮＥＡ／ＣＨＤＩ）から分化したニューロンに２連で感染させた。このデータは、ＧＦＰ対照で処理した細胞または模擬感染プロトコルを経た細胞と比較して、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９のいずれかによって送達された場合、変異型ＨｔｔアレルがＺＦＰによって抑制されたことを示している。 図１２Ａ及び図１２Ｂは、ＨＤニューロンの表現型特性に対するＺＦＰによる治療効果を示すグラフである。図１２Ａは、ニューロンにおけるＡＴＰレベルが、ＶＥＮＵＳ対照または模擬処理細胞で処理された細胞よりもＺＦＰで処理されたＨＤニューロンにおいて高いことを示す。これと比較して、野生型ニューロンは、ＺＦＰ処理による影響をまったく示さない。図１２Ｂは、ＴＵＮＥＬ陽性（アポトーシスのマーカー）である細胞の割合を示しており、これはＺＦＰで処理されたＨＤニューロンが対照サンプルよりも少ない数のＴＵＮＥＬ陽性細胞を有することを示している。比較のため、グラフには野生型ニューロンからのデータも示している。 図１３Ａ〜図１３Ｃは、ＺＦＰ４６０２５、ＺＦＰ４５６４３、またはＧＦＰ対照をコードするＡＡＶ９ベクターの線条体内注入により、ＨｄｈＱ５０／Ｈｄｈ＋（Ｑ５０）ヘテロ接合マウスにおけるＺＦＰのｉｎ ｖｉｖｏ活性を試験した結果を示すグラフである。Ｑ５０マウスは、内在性マウスＨｄｈ遺伝子のエキソン１が４８のＣＡＧをもつヒトＨｔｔ遺伝子のエキソン１に置換されたノックインアレルを含む。注射後５週間で、処理した線条体のアレル特異的ｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＺＦＰ４５６４３及びＺＦＰ４６０２５は、ビヒクル注入対照と比較して変異型Ｈｔｔアレル（Ｑ５０）をそれぞれ７９％及び７４％抑制することを示した。野生型アレル（Ｑ７）はいずれのＺＦＰによっても制御されなかった（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。またＺＦＰ４５６４３の活性を注射後１２週に試験し（図１３Ｃ）、野生型アレル（Ｑ７）の抑制を伴わずに変異型Ｈｔｔ（Ｑ５０）の有意な抑制（７０％）が観察された。
本明細書では、ハンチントン病（ＨＤ）の検出、疾患進行のモニタリング、治療及び／または予防のための組成物を広範にＣＮＳへ送達する組成物及び方法を開示する。特に、本明細書に記載の組成物及び方法は、Ｈｔｔリプレッサーの送達にＡＡＶ９ベクターを使用し、送達部位を越えた機能的Ｈｔｔリプレッサーの拡散を可能にする。Ｈｔｔリプレッサー（例えば、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ ＴＦ）、ＴＡＬＥ（ＴＡＬＥ−ＴＦ）、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦ、例えばＺＦＰ−ＴＦ、ＴＡＬＥ−ＴＦ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦを含み、変異型Ｈｔｔアレルの発現を抑制するＨｔｔ調節転写因子などのＨｔｔ調節転写因子）は、例えばＨＤニューロンにおけるＨｔｔの凝集を減少させること、ＨＤニューロンのエネルギーを増加させること（例えば、ＡＴＰレベルを上昇させること）、ＨＤニューロンにおけるアポトーシスを減少させること、及び／またはＨＤ対象における運動障害を軽減することにより、ＨＤの影響及び／または症状が軽減または消失するようにＣＮＳを改変する。
一般
本明細書に開示される方法の実施ならびに組成物の調製及び使用には、特に記載のない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造及び分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、ならびに当技術分野の範囲内である関連分野における従来技術を用いる。これらの技術は文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７及び定期改訂版；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ” （Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．） Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照のこと。
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、及び「オリゴヌクレオチド」は同義に使用され、線状または環状立体構造であり、かつ一本鎖またはニ本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的では、これらの用語はポリマーの長さに関する限定であると解釈されるべきではない。各用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分、及び／またはリン酸部分が修飾されているヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は同じ塩基対形成特異性を有し、すなわちＡの類似体はＴと塩基対を形成する。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は同義に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語はまた、１つ以上のアミノ酸が、対応する天然型アミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸間）での配列特異的で非共有結合的な相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用のすべての構成要素が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格内のリン酸残基との接触）。このような相互作用は一般に、１０−６Ｍ−１以下の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」とは結合の強度を指し、ＫＤの減少と相関して結合親和性は増加する。
「結合タンパク質」とは、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、及び／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それ自体に結合する（それによりホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）ことができ、かつ／または、異なるタンパク質（単数または複数）の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、２種類以上の結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性、及びタンパク質結合活性を有する。
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位によってその構造が安定化される、結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的な方法でＤＮＡに結合する、タンパク質または大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略される場合が多い。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。この反復ドメインは、ＴＡＬＥとその同種の標的ＤＮＡ配列との結合に関与する。単一の「リピート単位」（「リピート」とも称する）は通常、３３〜３５アミノ酸長であり、天然型ＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともある程度の配列相同性を示す。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照のこと。
「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核生物Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質である。ＴｔＡｇｏは細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。例えば、Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８−２６１，Ｇ．Ｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，６５２）を参照のこと。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えばＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡを含めた、必要なすべての構成要素である。「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間での遺伝子情報の交換過程を指し、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組み換えによるドナーの獲得を含むが、これらに限定されない。本開示の目的では、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば相同組換え修復機構を介した細胞内の二本鎖切断の修復中に起こるそのような交換の特殊な形態を指す。この過程にはヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、ニ本鎖切断を受けた分子）の鋳型修復に「ドナー」分子を使用する。またドナーから標的への遺伝子情報の伝達をもたらすことから、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」という様々な名称で知られている。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、このような伝達は、切断された標的とドナーとの間で生じるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、及び／またはドナーを使用して、標的の一部になる遺伝子情報を再合成する「合成依存的な鎖アニーリング」、及び／または関連過程に関与する可能性がある。このような特殊なＨＲは多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように標的分子の配列の改変をもたらす。
ジンクフィンガー結合ドメインまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、天然型ジンクフィンガータンパク質の認識へリックス領域の遺伝子操作（１つ以上のアミノ酸の改変）によって、またはＴＡＬＥタンパク質のＲＶＤの遺伝子操作によって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「遺伝子操作」することができる。したがって、遺伝子操作されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、非天然型であるタンパク質である。ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥの遺伝子操作方法の非限定的な例は、設計及び選択である。「設計された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥとは、その設計／組成が主として合理的基準によってもたらされる、天然には存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準には、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰ設計及び結合データの情報を格納するデータベース内で情報を処理するためのコンピューターアルゴリズムの適用が含まれる。「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥとは、その産生が、主としてファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択などの実験プロセスからもたらされる、天然には見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；同第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；同第６，７４６，８３８号；同第７，２４１，５７３号；同第６，８６６，９９７号；同第７，２４１，５７４号及び同第６，５３４，２６１号を参照のこと。またＷＯ０３／０１６４９６を参照のこと。
用語「配列」とは、任意の長さのヌクレオチド配列を指すが、これは、線状、環状、または分枝状であり得、かつ一本鎖または二本鎖のいずれでもあり得る、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。用語「ドナー配列」とは、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば２〜１０，０００ヌクレオチド長（またはその間もしくはそれ以上の任意の整数値）であり得、好ましくは約１００〜１，０００ヌクレオチド長（すなわちその間の任意の整数）、より好ましくは約２００〜５００ヌクレオチド長である。
「標的部位」または「標的配列」とは、結合のための十分な条件が存在する場合に、結合分子が結合する核酸の一部を規定する核酸配列である。
「外因性」分子とは、通常は細胞内に存在しないが、１つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法、またはその他の方法によって細胞内に導入することができる分子である。「通常の細胞内での存在」は、細胞の特定の発達段階及び環境条件を基準にして決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間だけ存在する分子は、成体筋細胞に対して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に対して外因性分子である。外因性分子には、例えば、機能不全型内因性分子の機能型、または正常機能型内因性分子の機能不全型を含むことができる。
外因性分子は、とりわけ、小分子（コンビナトリアル化学プロセスによって生成されるものなど）、高分子（タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾誘導体など）、または上記分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体などであり得る。核酸にはＤＮＡ及びＲＮＡを含み、一本鎖またはニ本鎖であり得、線状、分枝状、または環状であり得、任意の長さであり得る。核酸には、二重鎖を形成することができるもの、ならびに三重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号及び同第５，４２２，２５１号を参照のこと。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構成因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、及びヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。
外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、感染性ウイルスゲノム、細胞内に導入されたプラスミドもしくはエピソーム、または通常は細胞内に存在しない染色体を含むことができる。細胞内に外因性分子を導入するための方法は当業者に既知であり、脂質媒介性導入（すなわち、中性脂質及び陽イオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性導入、及びウイルスベクター媒介性導入を含むが、これらに限定されない。外因性分子はまた、内因性分子と同じ種類の分子であり得るが、細胞が由来するものとは異なる種に由来し得る。例えば、本来はマウスまたはハムスターに由来する細胞株にヒト核酸配列が導入されてもよい。
対照的に、「内因性」分子とは、特定の環境条件下で特定の発達段階にある特定の細胞内に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸には、染色体、ミトコンドリア、葉緑体、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然型エピソーム核酸を含むことができる。その他の内因性分子としてはタンパク質、例えば転写因子及び酵素を挙げることができる。
「融合」分子とは、２つ以上のサブユニット分子が好ましくは共有結合的に連結した分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子でも、または異なる化学型の分子でもあり得る。第１の種類の融合分子の例としては、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと１つ以上の活性化ドメインとの融合体）及び融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２の種類の融合分子の例としては、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの融合体、及び副溝結合物質と核酸との融合体が挙げられるが、これらに限定されない。この用語はまた、ポリヌクレオチドの構成要素がポリペプチドの構成要素と会合して機能分子を形成する系（例えば、単一のガイドＲＮＡが機能ドメインと会合して遺伝子発現を調節するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を含む。
細胞内の融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達から得ることができ、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが細胞に送達され、そのポリヌクレオチドが転写され、その転写物が翻訳されて融合タンパク質を生成することによって得ることもできる。トランススプライシング、ポリペプチド切断、及びポリペプチドライゲーションもまた、細胞内のタンパク質の発現に関与し得る。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの細胞への送達方法は、本開示に別記する。
「多量体化ドメイン」（「二量体化ドメイン」または「タンパク質相互作用ドメイン」とも称する）は、ＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦのアミノ末端領域、カルボキシ末端領域、またはアミノ及びカルボキシ末端領域に組み込まれたドメインである。このドメインは、複数のＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦ単位の多量体化を可能にし、その結果、多量体化ＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦが、野生型の回数を有する長さの短いトラクトと比べて、トリヌクレオチドリピートドメインの大きなトラクトに優先的に結合するようになる。多量体化ドメインの例としては、ロイシンジッパーが挙げられる。多量体化ドメインはまた、小分子によって制御されてもよく、その場合、多量体化ドメインは、小分子または外部リガンドの存在下でのみ別の多量体化ドメインと相互作用できるように適切な立体構造をとる。この方法では、外因性リガンドを使用して、これらのドメインの活性を制御することができる。
本開示の目的で「遺伝子」とは、遺伝子産物（下記を参照）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を制御するすべてのＤＮＡ領域を含み、そのような制御配列がコード配列及び／または転写される配列に隣接しているか否かを問わない。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列（リボソーム結合部位及び配列内リボソーム進入部位など）、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位、及び遺伝子座調節領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
「遺伝子発現」とは、遺伝子内に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、または任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物にはまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及び編集などのプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチン化、及びグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
遺伝子発現の「調節」とは、遺伝子活性の変化を指す。発現の調節には、遺伝子の活性化及び遺伝子の抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、改変、不活性化、ランダム変異）を用いて発現を調節することができる。遺伝子の不活性化とは、本明細書に記載のＺＦＰタンパク質もＴＡＬＥタンパク質も含まない細胞と比較した、遺伝子発現の何らかの低下を指す。したがって、遺伝子の不活性化は部分的または完全であり得る。
「目的領域」とは、細胞クロマチンの任意の領域であり、例えば、外因性分子に結合することが望ましい遺伝子、またはそのような遺伝子内のもしくは遺伝子に隣接する非コード配列などである。結合は、標的ＤＮＡ切断及び／または標的組換えを目的としたものであり得る。目的領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性ウイルスゲノム内に存在し得る。目的領域は、遺伝子のコード領域内、（例えば、リーダー配列、トレーラー配列、またはイントロンなどの）転写される非コード領域内、またはコード領域の上流もしくは下流いずれかの非転写領域内に存在し得る。目的領域は、単一のヌクレオチド対程度の小ささであるか、または最大２，０００ヌクレオチド対長であるか、またはヌクレオチド対の任意の整数値であり得る。
「真核」細胞としては、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、及びヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「機能的連結」及び「機能的に連結された」（または「機能可能に連結された）とは、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが、他の構成要素のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介できる可能性を許容するように構成要素が配置された、２つ以上の構成要素（配列要素など）の並置に関連して同義に使用される。例示的な説明として、転写制御配列が、１つ以上の転写制御因子の有無に応じてコード配列の転写レベルを調節する場合、プロモーターなどの転写制御配列はコード配列に機能的に連結されている。転写制御配列は一般に、シスでコード配列と機能的に連結されるが、それに直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、互いに近接していない場合でも、コード配列に機能的に連結される転写制御配列である。
融合ポリペプチドに関して、用語「機能的に連結された」とは、構成要素の各々が、他の構成要素と連結されたとき、機能的に連結されていない場合に予測されるものと同じ機能を実行するという事実を指すことがある。例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインと融合される融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドの状態で、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位及び／またはその結合部位に結合することができると同時に、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することが可能である場合、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとは機能的に連結されている。遺伝子発現の制御が可能なドメインに融合されたＺＦＰは、「ＺＦＰ−ＴＦ」または「ジンクフィンガー転写因子」と総称され、一方、遺伝子発現の制御が可能なドメインに融合されたＴＡＬＥは、「ＴＡＬＥ−ＴＦ」または「ＴＡＬＥ転写因子」と総称される。ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインと融合される融合ポリペプチド（「ＺＦＮ」または「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」）の場合、融合ポリペプチド状態で、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位及び／またはその結合部位に結合可能であると同時に、切断ドメインが標的部位の近傍でＤＮＡを切断可能である場合、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとは機能的に連結されている。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインと融合される融合ポリペプチド（「ＴＡＬＥＮ」または「ＴＡＬＥヌクレアーゼ」）の場合、融合ポリペプチド状態で、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位及び／またはその結合部位に結合可能であると同時に、切断ドメインが標的部位の近傍でＤＮＡを切断可能である場合、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとは機能的に連結されている。Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインと融合される融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチド状態で、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位及び／またはその結合部位に結合することができると同時に、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することが可能である場合、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとは機能的に連結されている。Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインと融合される融合ポリペプチドの場合、融合ポリペプチド状態で、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位及び／またはその結合部位に結合可能であると同時に、切断ドメインが標的部位の近傍でＤＮＡを切断可能である場合、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとは機能的に連結されている。
タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」とは、その配列が、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子よりも多いか、少ないか、もしくは同じ数の残基を有することができ、かつ／または１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含むことができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸とハイブリダイズする能力）を決定する方法は、当技術分野において周知である。同様に、タンパク質の機能を決定する方法も周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によって評価することができる。上記のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．を参照のこと。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または相補性（遺伝子的相補性または生化学的相補性の両方）によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，５８５，２４５号及びＰＣＴ ＷＯ９８／４４３５０を参照のこと。
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することが可能である。一般に、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、及び「遺伝子導入ベクター」は、目的遺伝子の発現を誘導することが可能であり、かつ遺伝子配列を標的細胞に導入することができる、任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニング、及び発現ビヒクル、ならびに組み込みベクターを包含する。
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、必ずしも必要ではないが好ましくは通常のアッセイにおいて容易に測定される、タンパク質産物を産生する任意の配列を指す。好適なレポーター遺伝子には、抗体の耐性（例えばアンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、染色されたタンパク質または蛍光タンパク質または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに細胞成長の増強及び／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）が含まれるが、これらに限定されない。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ、または任意の検出可能なアミノ酸配列の１つ以上のコピーが含まれる。「発現タグ」には、目的遺伝子の発現をモニターするために、望ましい遺伝子配列に機能可能に連結することができるレポーターをコードする配列が含まれる。
ＤＮＡ結合ドメイン
本明細書に記載の方法は、Ｈｔｔ遺伝子の標的配列に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメイン、特に複数のトリヌクレオチドリピートを含む変異型Ｈｔｔアレルに結合するＤＮＡ結合ドメインを含む組成物、例えばＨｔｔ調節転写因子を使用する。例えばＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）またはＤＮＡ結合ポリヌクレオチド（例えば、単一ガイドＲＮＡ）といった、いずれのポリヌクレオチドまたはポリペプチドＤＮＡ結合ドメインも、本明細書に開示される組成物及び方法に使用することができる。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号６の９〜２８（すなわち１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７を含む、その間の任意の値）の連続するヌクレオチドを含む標的部位に結合する。
ある特定の実施形態では、Ｈｔｔ調節転写因子、またはその中のＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。標的部位ＺＦＰの選択、ならびに融合タンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）の設計及び構築方法は、当業者に既知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；同第５，７８９，５３８号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６及びＷＯ０３／０１６４９６に詳細が記載されている。
ある特定の実施形態では、ＺＦＰは、変異型Ｈｔｔアレルまたは野生型Ｈｔｔ配列のいずれかに選択的に結合することができる。Ｈｔｔ標的部位は一般に、少なくとも１つのジンクフィンガーを含むが、複数のジンクフィンガー（例えば、２、３、４、５、６、またはそれ以上のフィンガー）を含むこともある。通常、ＺＦＰには少なくとも３つのフィンガーが含まれている。ある種のＺＦＰは４、５、または６つのフィンガーを含み、ＺＦＰによっては８、９、１０、１１、または１２個のフィンガーを含む。３つのフィンガーを含むＺＦＰは一般に、９または１０ヌクレオチドを含む標的部位を認識し、４つのフィンガーを含むＺＦＰは一般に、１２〜１４ヌクレオチドを含む標的部位を認識する一方で、６つのフィンガーを含むＺＦＰは、１８〜２１ヌクレオチドを含む標的部位を認識することができる。ＺＦＰはまた、１つ以上の制御ドメインを含む融合タンパク質であり得、そのドメインは、転写活性化ドメインまたは抑制ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、一緒に連結された２つのＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインを含む。このようなジンクフィンガータンパク質は、したがって８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のフィンガーを含み得る。いくつかの実施形態では、２つのＤＮＡ結合ドメインが伸長可能な柔軟なリンカーを介して連結され、その結果、１つのＤＮＡ結合ドメインが４、５、または６つのジンクフィンガーを含み、第２のＤＮＡ結合ドメインがさらに４、５、または５つのジンクフィンガーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、フィンガーアレイが、８、９、１０、１１、もしくは１２またはそれ以上のフィンガーを含む１つのＤＮＡ結合ドメインを含むような、標準的なフィンガー間リンカーである。他の実施形態では、リンカーは柔軟なリンカーなどの不定型のリンカーである。ＤＮＡ結合ドメインは少なくとも１つの制御ドメインに融合され、「ＺＦＰ−ＺＦＰ−ＴＦ」構造をとると考えることができる。これらの実施形態の具体的な例として、「ＺＦＰ−ＺＦＰ−ＫＯＸ」と称することができる、柔軟なリンカーで連結され、ＫＯＸリプレッサーと融合された２つのＤＮＡ結合ドメインを含むもの、及び「ＺＦＰ−ＫＯＸ−ＺＦＰ−ＫＯＸ」と称することができる、２つのＺＦＰ−ＫＯＸ融合タンパク質がリンカーを介して一緒に融合されたものがある。
あるいは、ＤＮＡ結合ドメインはヌクレアーゼに由来してもよい。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、及びＩ−ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼの認識配列が知られている。また、米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．５：３３７９−３３８８；Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２、１１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８；Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３及びＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｃａｔａｌｏｇｕｅを参照のこと。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように遺伝子操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９−６６；米国特許公開第２００７０１１７１２８号を参照のこと。
「両手型」ジンクフィンガータンパク質とは、２つのジンクフィンガードメインが２つの不連続な標的部位に結合するように、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの２つのクラスタが、間に挿入されたアミノ酸によって分離されているタンパク質である。両手型のジンクフィンガー結合タンパク質の例は、４つのジンクフィンガーのクラスタがタンパク質のアミノ末端に位置し、３つのフィンガーのクラスタがカルボキシル末端に位置するＳＩＰ１である（Ｒｅｍａｃｌｅ ｅｔ ａｌ，（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １８（１８）：５０７３−５０８４を参照）。このタンパク質におけるジンクフィンガーの各クラスタは、固有の標的配列に結合可能であり、２つの標的配列間の空間に多くのヌクレオチドを含むことができる。両手型ＺＦＰは、例えば、ＺＦＰの一方または両方に融合された機能ドメインを含んでもよい。したがって、この機能ドメインは、ＺＦＰの一方もしくは両方の外側に結合されてもよく（図１Ｃを参照）、またはＺＦＰの間に位置（両方のＺＦＰに結合）してもよい（図４を参照）ことは明らかとなる。
Ｈｔｔ標的化ＺＦＰの具体的な例は、目的を問わずその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１３０２５３０４０号、ならびに以下の表１に開示されている。この表の第１列は、ＺＦＰの内部参照名（番号）であり、表２の第１列の同じ名称に対応する。「Ｆ」は、フィンガーを指し、「Ｆ」の後ろの番号は、どのジンクフィンガーであるかを指す（例えば、「Ｆ１」はフィンガー１を指す）。
Figure 0006853257
これらのタンパク質の標的部位に関する配列及び位置は、表２に開示されている。ＺＦＰ認識ヘリックスが接触する標的部位のヌクレオチドは、大文字で示され、接触しないヌクレオチドは小文字で示される。
Figure 0006853257
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、天然型または遺伝子操作された（非天然型）ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号を参照のこと。
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原性細菌は、重要な作物に多くの病害を引き起こすことが知られている。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、植物細胞内に２５を超える異なるエフェクタータンパク質を注入する保存的なＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。この注入されるタンパク質の一つとして、植物の転写活性化因子を模倣し、植物のトランスクリプトームを操作する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）が挙げられる（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４８−６５１を参照）。このタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインを含んでいる。最も十分に特性決定されたＴＡＬＥの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａに由来するＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１８：１２７−１３６及びＷＯ２０１００７９４３０を参照）。ＴＡＬＥにはタンデムリピートの集中ドメインが含まれ、各リピートはこのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要である約３４個のアミノ酸を含んでいる。加えて、ＴＡＬＥは、核局在化配列及び酸性転写活性化ドメインを含んでいる（概説については、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ Ｓ，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６３（３）：２５６−２７２を参照）。加えて、植物病原性細菌であるＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍでは、ｂｒｇ１１及びｈｐｘ１７と命名された２つの遺伝子が、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍの次亜種１系統ＧＭＩ１０００及び次亜種４系統ＲＳ１０００において、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ（２００７）Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ Ｍｉｃｒｏ ７３（１３）：４３７９−４３８４を参照）。これらの遺伝子は、互いのヌクレオチド配列が９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７のリピートドメインにある１，５７５ｂｐの欠失分のみが異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。
これらのＴＡＬＥの特異性は、タンデムリピートに見られる配列に依存する。反復された配列には約１０２ｂｐが含まれ、各リピートは通常、互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓ ｅｔ ａｌ、前掲）。リピートの多型は通常、１２位及び１３位に位置し、１２位及び１３位の超可変二残基（ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓ）の同一性と、ＴＡＬＥの標的配列における連続したヌクレオチドの同一性との間に１対１の対応関係が存在すると思われる（Ｍｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０１ ａｎｄ Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９−１５１２を参照）。実験によって、これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識のためのコードは、１２位及び１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＮＧがＴに結合するようなコードであることが決定されている。このＤＮＡ結合リピートを、リピートの新たな組み合わせ及び回数を用いてタンパク質に組み立てて、新たな配列と相互作用することが可能である人工転写因子が作製されている。加えて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号及び米国公開第２０１３０１９６３７３号は、Ｎキャップポリペプチド、Ｃキャップポリペプチド（例えば、＋６３、＋２３１、または＋２７８）及び／または新規（不定型）ＲＶＤを有するＴＡＬＥについて記載している。
例示的なＴＡＬＥは、米国特許公開第２０１３０２５３０４０号に記載されており、その全体が参照により組み込まれる。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインには、二量体化ドメイン及び／または多量体化ドメイン、例えばコイルドコイル（ＣＣ）及び二量体化ジンクフィンガー（ＤＺ）が含まれる。米国特許公開第２０１３０２５３０４０号を参照のこと。
なおさらなる実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の単一ガイドＲＮＡ、例えば２０１５００５６７０５に開示されるｓｇＲＮＡを含む。
真核生物のＲＮＡｉ経路に類似するという仮説がある、古細菌及び多くの細菌におけるＲＮＡ媒介性のゲノム防御経路の存在について説得力のある証拠が最近明らかになった（概説については、Ｇｏｄｄｅ ａｎｄ Ｂｉｃｋｅｒｔｏｎ，２００６．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．６２：７１８−７２９；Ｌｉｌｌｅｓｔｏｌ ｅｔ ａｌ．，２００６．Ａｒｃｈａｅａ ２：５９−７２；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ １： ７．；Ｓｏｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：１８１−１８６を参照）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系または原核生物ＲＮＡｉ（ｐＲＮＡｉ）として知られる、この経路は、２つの進化的に、かつ多くの場合は物理的に連結された遺伝子座、すなわち系のＲＮＡ構成要素をコードするＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ（クラスタ化等間隔短鎖回文リピート））遺伝子座と、タンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座から生じることが提唱されている（Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１５６５−１５７５；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：４８２−４９６；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ １：７；Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．，２００５．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１：ｅ６０を参照）。微生物宿主のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子、ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介性の核酸切断の特異性をプログラムすることができる非コードＲＮＡエレメントの組み合わせを含んでいる。個々のＣａｓタンパク質は、真核生物ＲＮＡｉ機構のタンパク質成分とそれほど共通した配列類似性を有しないが、類似の予測される機能（例えばＲＮＡ結合、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼなど）を有する（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ １：７）。ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子は、多くの場合、ＣＲＩＳＰＲリピート−スペーサーアレイと会合する。４０を超える様々なＣａｓタンパク質ファミリーが記載されている。これらのタンパク質ファミリーのうち、Ｃａｓ１は、様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の中でも広く普及していると思われる。ｃａｓ遺伝子及び反復構造の特定の組み合わせを使用して、８つのＣＲＩＳＰＲサブタイプ（Ｅｃｏｌｉ、Ｙｐｅｓｔ、Ｎｍｅｎｉ、Ｄｖｕｌｇ、Ｔｎｅａｐ、Ｈｍａｒｉ、Ａｐｅｒｎ、及びＭｔｕｂｅ）が規定されており、そのうちのいくつかは、ＲＡＭＰ（ｒｅｐｅａｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｙｓｔｅｒｉｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする追加の遺伝子モジュールと関連している。複数のＣＲＩＳＰＲサブタイプが単一のゲノム中に存在していてもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓサブタイプの散在的分布は、系が微生物の進化時に遺伝子水平伝播を受けることを示唆している。
当初、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて説明されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最も十分に特性決定されている系のうちの１つであり、４つの連続するステップで標的ＤＮＡ二本鎖の切断を実行する。まず、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ、及びｔｒａｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。次に、ｔｒａｃｒＲＮＡはｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの反復領域とハイブリダイズして、個々のスペーサー配列を含む成熟ｃｒＲＮＡへのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介する。このプロセシングは、Ｃａｓ９タンパク質の存在下で二本鎖に特異的なＲＮａｓｅ ＩＩＩによって発生する。３番目に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、さらなる標的認識に必要であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとのワトソン−クリック塩基対形成によりＣａｓ９を標的ＤＮＡに誘導する。加えて、ｔｒａｃｒＲＮＡはまた、ｃｒＲＮＡとその３’末端で塩基対を形成し、この会合によりＣａｓ９活性を誘発する際に存在していなければならない。最後に、Ｃａｓ９が標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内の二本鎖切断を生じさせる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、（ｉ）「獲得（ａｄａｐｔａｔｉｏｎ）」と呼ばれるプロセスで、今後の攻撃予防のため、ＣＲＩＳＰＲアレイに外来ＤＮＡ配列を挿入する、（ｉｉ）関連するタンパク質を発現する、ならびにアレイを発現してプロセシングする、それに続いて（ｉｉｉ）外来核酸にＲＮＡ媒介性の干渉を行うという３つのステップで構成される。このように、細菌細胞において、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能に関与している。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は多くの異なる細菌で見出されている。Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ（（２０１３）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ４２（４）：２３７７−２５９０）により公開されたゲノムに対するＢＬＡＳＴ検索により、３４７種の細菌にＣａｓ９のオルソログが発見された。さらに、このグループは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、及びＦ．ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ９オルソログを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＮＡ標的のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ切断を実証した。したがって、用語「Ｃａｓ９」は、ＤＮＡ結合ドメイン及び２つのヌクレアーゼドメインを含むＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼを指し、この場合のＣａｓ９をコードする遺伝子は好適であれば、どの細菌に由来してもよい。
Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを有し、一方のヌクレアーゼドメインはＨＮＨエンドヌクレアーゼに類似しており、他方のヌクレアーゼドメインはＲｕｖエンドヌクレアーゼドメインに類似している。ＨＮＨ型ドメインは、ｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を切断する役割を担っていると思われるが、Ｒｕｖドメインは非相補鎖を切断する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインのうちの１つだけが機能的である、Ｃａｓニッカーゼを生成するように遺伝子操作することができる（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ、前掲を参照）。ニッカーゼは、酵素の触媒ドメインでのアミノ酸の特異的変異によって、またはドメインの一部または全部をこれ以上機能しないように切断することにより生成することができる。Ｃａｓ ９は２つのヌクレアーゼドメインを含んでいるため、この手法はどちらのドメインに対しても行うことができる。そのようなＣａｓ９ニッカーゼを２つ使用することにより、標的ＤＮＡにおいて二本鎖切断を達成することができる。ニッカーゼはそれぞれＤＮＡの一方の鎖を切断し、２つ使用すると二本鎖切断が生じることになる。
通常ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡのアニーリングによって形成されるヘアピンを含む、遺伝子操作された「単一ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）の使用により、ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の必要性を回避することができる（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６及びＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１１４３を参照）。Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓでは、二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体がＣａｓ関連ＲＮＡと標的ＤＮＡとの間に形成される場合、遺伝子操作されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合体またはｓｇＲＮＡがＣａｓ９の標的ＤＮＡ切断を誘導する。Ｃａｓ９タンパク質、及びＰＡＭ配列を含む遺伝子操作されたｓｇＲＮＡを含むこの系は、ＲＮＡ誘導型ゲノム編集に使用されており（Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ、前掲参照）、またＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと同様の編集効率を有しており、ｉｎ ｖｉｖｏでのゼブラフィッシュ胚ゲノム編集に有用とされている（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１（３）：２２７を参照）。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一次産物は、侵入者が標的とする配列を含む短いＲＮＡであると思われ、この経路でのその仮説的役割に基づいて、ガイドＲＮＡまたは原核生物サイレンシングＲＮＡ（ｐｓｉＲＮＡ）と呼ばれる（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ １：７；Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００８．ＲＮＡ，１４：２５７２−２５７９）。ＲＮＡ分析は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座転写物が反復配列内で切断され、個々の侵入者が標的とする配列及び隣接する反復断片を含む約６０〜７０ｎｔのＲＮＡ中間体を放出することを示している（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：７５３６−７５４１；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：４６９−４８１；Ｌｉｌｌｅｓｔｏｌ ｅｔ ａｌ．２００６．Ａｒｃｈａｅａ ２：５９−７２；Ｂｒｏｕｎｓ ｅｔ ａｌ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９６０−９６４；Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ，２００８．ＲＮＡ，１４：２５７２−２５７９）。古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓでは、この中間体ＲＮＡがさらに安定した約３５〜４５ｎｔの豊富な成熟ｐｓｉＲＮＡにプロセシングされる（Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．２００８．ＲＮＡ，１４：２５７２−２５７９）。
通常、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡのアニーリングによって形成されるヘアピンを含む、遺伝子操作された「単一ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）の使用により、ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の必要性を回避することができる（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６及びＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１１４３を参照）。Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓでは、二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体がＣａｓ関連ＲＮＡと標的ＤＮＡとの間に形成される場合、遺伝子操作されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合体またはｓｇＲＮＡがＣａｓ９の標的ＤＮＡ切断を誘導する。Ｃａｓ９タンパク質、及びＰＡＭ配列を含む遺伝子操作されたｓｇＲＮＡを含むこの系は、ＲＮＡ誘導型ゲノム編集に使用されており（Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ、前掲参照）、またＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと同様の編集効率を有しており、ｉｎ ｖｉｖｏでのゼブラフィッシュ胚ゲノム編集に有用とされている（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１（３）：２２７を参照）。
キメラまたはｓｇＲＮＡを、任意の望ましい標的と相補的な配列を含むように遺伝子操作することができる。いくつかの実施形態では、ガイド配列は約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、もしくはそれ以上、またはそれを超えるヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、またはそれより少ないヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、標的に対して相補的である、Ｇ［ｎ１９］形態の２２塩基と、それに続くＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系で使用されるＮＧＧまたはＮＡＧ形態のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。したがって、一方法では、（ｉ）ＺＦＮヘテロ二量体の認識配列を、関連するゲノム（ヒト、マウス、または特定の植物種）の標準配列とアラインメントし、（ｉｉ）ＺＦＮ半部位間のスペーサー領域を同定し、（ｉｉｉ）スペーサー領域に最も近接するモチーフＧ［Ｎ２０］ＧＧの位置を同定し（そのようなモチーフの複数がスペーサーと重複する場合、スペーサーに対して中心に位置するモチーフが選択される）、ｉｖ）そのモチーフをｓｇＲＮＡのコアとして使用することによって、目的の遺伝子の既知のＺＦＮ標的を利用することにより、ｓｇＲＮＡを設計することができる。この方法は、実証されたヌクレアーゼ標的を利用できる点で有利である。あるいは、Ｇ［ｎ２０］ＧＧ式に適合する好適な標的配列を単に同定することにより、任意の目的領域を標的とするｓｇＲＮＡを設計することができる。ｓｇＲＮＡは、相補性領域とともに、ｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分の尾部領域に伸長する追加のヌクレオチドを含み得る（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７を参照）。尾部は、＋６７〜＋８５ヌクレオチド、またはその間の任意の数であってよく、＋８５ヌクレオチドの長さが好ましい。短縮形ｓｇＲＮＡ、「ｔｒｕ−ｇＲＮＡ」もまた使用することができる（Ｆｕ ｅｔ ａｌ， （２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３２（３）：２７９を参照）。ｔｒｕ−ｇＲＮＡでは、相補性領域が１７または１８ヌクレオチド長に減少する。
さらに、別のＰＡＭ配列を利用することもでき、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９を使用してＮＧＧの代わりにＮＡＧをＰＡＭ配列にすることができる（Ｈｓｕ ２０１４、前掲）。その他のＰＡＭ配列には、最初のＧを欠失するものも含み得る（Ｓａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｊｏｕｎｇ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３２（４）：３４７）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓをコードするＣａｓ９ ＰＡＭ配列に加えて、他の細菌源に由来するＣａｓ９タンパク質に特異的な他のＰＡＭ配列を使用することができる。例えば、以下に示すＰＡＭ配列（前掲のＳａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｊｏｕｎｇ、及びＥｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ，（２０１３）Ｎａｔ Ｍｅｔｈ １０（１１）：１１１６から改変）はこれらのＣａｓ９タンパク質に特異的である：
種 ＰＡＭ
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＮＧＧ
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＮＡＧ
Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＮＧＧ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＮＧＧＮＧ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＮＮＡＡＡＷ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＮＮＡＧＡＡ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＮＮＮＧＡＴＴ
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＮＮＮＡＣＡ
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ ＮＮＮＮＧＡＴＴ
Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ＧＮＮＮＣＮＮＡ
Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ ＮＧ
したがって、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系での使用に適した標的配列を、ガイドライン［ｎ１７、ｎ１８、ｎ１９、またはｎ２０］（Ｇ／Ａ）Ｇに従って選択することができる。あるいは、ＰＡＭ配列が、ガイドラインＧ［ｎ１７、ｎ１８、ｎ１９、ｎ２０］（Ｇ／Ａ）Ｇに従っていてもよい。非Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ細菌に由来するＣａｓ９タンパク質の場合、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＰＡＭ配列を別のＰＡＭで置き換えて、同じガイドラインを使用することができる。
最も好ましいのは、オフターゲット配列の可能性を回避する、特異性の尤度が最も高い標的配列を選択することである。そのような望ましくないオフターゲット配列は、以下の属性を考慮することによって同定することができる：ｉ）利用されるＣａｓ９タンパク質で機能することが知られているＰＡＭ配列が後ろに続く標的配列の類似性；ｉｉ）望ましい標的配列からのミスマッチが３未満である類似標的配列；ｉｉｉ）ミスマッチがＰＡＭ近位領域ではなくＰＡＭ遠位領域に位置する、ｉｉ）と同様の類似標的配列（「シード」領域（Ｗｕ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ２８８９）と称される場合もある、ＰＡＭに直接隣接するまたは近位の１〜５ヌクレオチドは認識にとって最も重要であるため、シード領域に位置するミスマッチを有する推定オフターゲット部位は、ｓｇＲＮＡによって最も認識されにくい可能性があるといういくつかの証拠が存在する）；及びｉｖ）ミスマッチの空間が連続していないか、または４ヌクレオチド超、離れている（Ｈｓｕ ２０１４、前掲）類似標的配列。したがって、どのＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系が使用されていても、上記の基準を用いてゲノム内に見込まれるオフターゲット部位数の分析を実施することによって、ｓｇＲＮＡの適切な標的配列を同定することができる。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然型Ｃａｓタンパク質の「機能的誘導体」であってもよい。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通する定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」は、対応する天然配列ポリペプチドと共通した生物学的活性を有する限り、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドの誘導体及びその断片を含むが、これらに限定されない。本明細書で企図される生物学的活性は、機能的誘導体がＤＮＡ基質を断片に加水分解する能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列変種、共有結合修飾体の両方、及びその融合体を包含する。いくつかの態様では、機能的誘導体は、天然型Ｃａｓタンパク質の単一の生物学的特性を含み得る。他の態様では、機能的誘導体は、天然型Ｃａｓタンパク質の生物学的特性の一部を含み得る。好適なＣａｓポリペプチドの誘導体またはその断片には、Ｃａｓタンパク質の変異体、融合体、共有結合修飾体、またはその断片を含むが、これらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはその断片、ならびにＣａｓタンパク質の誘導体またはその断片を含むＣａｓタンパク質は、細胞から得ることも、化学的に合成することもでき、またはこれらの２つの手順の組み合わせによるものであってもよい。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞であっても、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、より高い発現レベルで内因性のＣａｓタンパク質を産生するように、もしくは核酸が内因性のＣａｓと同じもしくは異なるＣａｓをコードする外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であってもよい。場合によって、細胞はＣａｓタンパク質を天然に産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
特定の遺伝子を標的とする例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、例えば米国公開第２０１５００５６７０５号に開示されている。
したがって、ヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断するヌクレアーゼドメインと組み合わせて、ドナー（導入遺伝子）を挿入することが望ましい任意の遺伝子内の標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む。
融合分子
ＤＮＡ結合ドメインは、本明細書に記載の方法に使用される任意の追加分子（例えば、ポリペプチド）と融合されていてもよい。ある特定の実施形態では、本方法は、少なくとも１つのＤＮＡ結合分子（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、または単一ガイドＲＮＡ）及び異種制御（機能）ドメイン（またはその機能的断片）を含む融合分子を用いる。
ある特定の実施形態では、機能ドメインは転写制御ドメインを含む。一般的なドメインとしては、例えば転写因子ドメイン（アクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー）、サイレンサー、癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）；ＤＮＡ修復酵素及びその関連因子と修飾因子；ＤＮＡ再配列酵素及びその関連因子と修飾因子；クロマチン関連タンパク質及びその修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼ、及びデアセチラーゼ）；ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）及びその関連因子と修飾因子が挙げられる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国公開第２０１３０２５３０４０号を参照のこと。
活性化の達成に適したドメインとしては、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７１，５９５２−５９６２（１９９７）を参照）核内ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３−３８３（１９９８）を参照）；核内因子カッパＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ ＆ Ｂａｒｉｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０−５６１８（１９９８）及びＤｏｙｌｅ ＆ Ｈｕｎｔ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ８：２９３７−２９４２（１９９７））；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８））、またはＶＰ６４などの人工キメラ機能ドメイン（Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４６２３−３３）、及びデグロン（Ｍｏｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊ．１８，６４３９−６４４７）が挙げられる。その他の例示的な活性化ドメインとしては、Ｏｃｔ １、Ｏｃｔ−２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ−２、及びＣＴＦ１（Ｓｅｉｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１１，４９６１−４９６８（１９９２）、ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２Ａ、及びＥＲＦ−２が挙げられる。例えば、Ｒｏｂｙｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９−３４７；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２３：２５５−２７５；Ｌｅｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：１−１１；Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ−Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４６：７７−８９；ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３−１２；Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７−２８３；及びＬｅｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９−５０４．を参照のこと。その他の例示的な活性化ドメインとしては、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、−６、−７、及び−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ、ならびにＴＲＡＢ１が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：２１−２９；Ｏｋａｎａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：８７−９９；Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２９８−３０９；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：４１９−４２９；Ｕｌｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：５８４４−５８４９；Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１−８；Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３−４４；及びＨｏｂｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１５，３４８−１５，３５３を参照のこと。
例示的な抑制ドメインとしては、ＫＲＡＢ Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ−β誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ−ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、及びＭｅＣＰ２が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４５１−４５４；Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４３−４４６；Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４７−４５０；及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２５：３３８−３４２を参照のこと。その他の例示的な抑制ドメインとしては、ＲＯＭ２及びＡｔＨＤ２Ａが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：３０５−３２１；及びＷｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１９−２７を参照のこと。
融合分子は、当業者に周知であるクローニング法及び生化学的コンジュゲート法によって構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメイン及び機能ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）を含む。融合分子はまた場合により、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０中型Ｔ抗原からのシグナルなど）及びエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧ及びヘマグルチニンなど）を含む。融合タンパク質（及びそれらをコードする核酸）は、融合体の構成要素間で翻訳リーディングフレームが保存されるように設計される。
一方の機能ドメイン（またはその機能的断片）のポリペプチド構成要素と、他方の非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、インターカレーター、副溝結合物質、核酸）との融合体は、当業者に既知の生化学的コンジュゲート法によって構築される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）Ｃａｔａｌｏｇｕｅを参照のこと。副溝結合物質とポリペプチドとの融合体を作製するための方法及び組成物は記載済みである。Ｍａｐｐ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：３９３０−３９３５。
当業者に知られているように、融合分子は、薬学的に許容される担体とともに製剤化されてもよい。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５、及び譲受人共通のＷＯ００／４２２１９を参照のこと。
融合分子の機能的構成要素／ドメインは、融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列にいったん結合すると、遺伝子の転写に影響を及ぼすことが可能である、多様な種々の構成要素のいずれかから選択することができる。したがって、機能的構成要素には、アクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー、及びサイレンサーなどの種々の転写因子ドメインが含まれ得るが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質はＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼドメインを含み、遺伝子操作された（ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを介して意図された核酸標的を認識することができる機能的要素を構築し、かつヌクレアーゼ活性によってＤＮＡ結合部位の近傍でＤＮＡ切断を生じさせるヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼ）を構築する。
したがって、本明細書に記載の方法及び組成物は、広く適用可能であり、目的とする任意のヌクレアーゼを含み得る。ヌクレアーゼの非限定的な例としては、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられる。ヌクレアーゼは、異種ＤＮＡ結合ドメイン及び切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬＥＮ；異種切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含んでもよく、またはその代わりに、天然型ヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを、選択された標的部位に結合するように改変することができる（例えば、同種の結合部位とは異なる部位に結合するように遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ）。
ヌクレアーゼドメインは、任意のヌクレアーゼ、例えば任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ由来であってもよい。本明細書に記載のＨｔｔ ＤＮＡ結合ドメインと融合できる好適なヌクレアーゼ（切断）ドメインの非限定的な例としては、任意の制限酵素、例えばＩＩＳ型制限酵素（例えば、ＦｏｋＩ）由来のドメインが挙げられる。ある特定の実施形態では、切断ドメインは、切断活性に二量体化を必要とする切断ハーフドメインである。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号；同第８，４０９，８６１号及び同第７，８８８，１２１号を参照のこと。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、切断には２つの融合タンパク質が必要である。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つの切断ハーフドメインが同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来することも、または各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来することもできる。加えて、２つの融合タンパク質の対応する標的部位への結合により、切断ハーフドメインが互いに空間的に配向して配置され、切断ハーフドメインが、例えば二量体化によって機能的切断ドメインを形成することが可能であるように、２つの融合タンパク質の標的部位が互いに配置されていることが好ましい。
ヌクレアーゼドメインはまた、切断活性を有し、本明細書に記載のヌクレアーゼとともに使用することもできる任意のメガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ドメイン由来であってもよく、これには、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、及びＩ−ＴｅｖＩＩＩを含むが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼはコンパクトＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これは、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連結する単一鎖の融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ領域に局在するニッカーゼとして作用することも、またはＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインが、メガヌクレアーゼ（例えば、ＴｅｖＩ）ヌクレアーゼドメインに対してどこに配置されているかに応じて二本鎖切断を行うこともできる（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｎａｔ Ｃｏｍｍ：１−８ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２を参照）。
他の実施形態では、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼはメガＴＡＬである。このメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメイン及びメガヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは単量体として活性であり、活性に二量体化を必要としない。（Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ：１−１３，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１２２４を参照）。
加えて、メガヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインはまた、ＤＮＡ結合機能も示し得る。任意のＴＡＬＥＮを追加のＴＡＬＥＮ（例えば、１つ以上のメガＴＡＬを有する１つ以上のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ））及び／またはＺＦＮと組み合わせて使用してもよい。
加えて、切断ドメインには、例えばオフターゲットの切断作用を低減または排除する絶対ヘテロ二量体を形成するために、野生型と比較して１つ以上の改変を含んでいてもよい。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号；及び同第８，６２３，６１８号を参照のこと。
本明細書に記載のヌクレアーゼは、二本鎖標的（例えば、遺伝子）において二本鎖または一本鎖切断を生じさせることができる。一本鎖切断（「ニック」）の生成は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７０３，４８９号に記載されており、これには、ヌクレアーゼドメインのうちの１つの触媒ドメインの変異により、どのようにニッカーゼが生じるかについて記載されている。
したがって、ヌクレアーゼ（切断）ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するか、または多量体化（例えば、二量体化）して機能的な切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」法を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで核酸標的部位に組み立てられてもよい（例えば、米国特許公開第２００９００６８１６４号を参照のこと）。そのようなスプリット酵素の構成要素は、個々の発現構築物上で発現させても、または１つのオープンリーディングフレーム内で連結させてもよく、この場合、個々の構成要素は、例えば、自己切断２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって分離される。構成要素は、個々のジンクフィンガー結合ドメインであっても、またはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであってもよい。
ヌクレアーゼは、使用前に、例えば米国公開第２００９０１１１１１９号に記載されるような酵母を用いた染色体系で、活性をスクリーニングすることができる。ヌクレアーゼ発現構築物は、当技術分野において既知の方法を使用して容易に設計することができる。
融合タンパク質の発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えば、ラフィノース及び／またはガラクトースの存在下で活性化（抑制解除）され、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあってもよい。ある特定の実施形態では、プロモーターは、例えば高親和性結合部位の取り込みにより、融合タンパク質の発現を自己制御する。例えば、２０１４年３月１８日出願の米国出願第６１，９５５，００２号を参照のこと。
送達
本明細書に記載のタンパク質及び／またはポリヌクレオチド（例えば、Ｈｔｔリプレッサー）、ならびにタンパク質及び／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、例えば、ｍＲＮＡを介したタンパク質の注入、及び／または発現構築物（例えば、プラスミド、レンチウイルスベクター、ＡＡＶベクター、Ａｄベクターなど）の使用を含む任意の好適な手段によって標的細胞に送達することができる。好ましい実施形態では、リプレッサーはＡＡＶ９を使用して送達される。
本明細書に記載のジンクフィンガータンパク質を含むタンパク質を送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，６０７，８８２号；同第６，６８９，５５８号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；同第７，１６３，８２４号に記載されており、各開示はすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない、任意のベクター系を使用することができる。また、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；同第７，１６３，８２４号を参照のこと。さらに、これらのベクターはいずれも、１つ以上のＤＮＡ結合タンパク質コード配列を含み得ることは明らかとなる。したがって、１つ以上のＨｔｔリプレッサーが細胞に導入される場合、そのタンパク質の構成要素及び／またはポリヌクレオチドの構成要素をコードする配列は、同じベクターに保持されていても、異なるベクターに保持されていてもよい。複数のベクターが使用される場合、各ベクターは、１つまたは複数のＨｔｔリプレッサーまたはその構成要素をコードする配列を含んでもよい。
従来のウイルス及び非ウイルス系の遺伝子導入方法を使用して、遺伝子操作されたＨｔｔリプレッサーをコードする核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）及び標的組織に導入することができる。またそのような方法を使用して、そのようなリプレッサー（またはその構成要素）をコードする核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に投与することもできる。ある特定の実施形態では、リプレッサーをコードする核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子治療に使用するために投与される。非ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、及びリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化された核酸を含む。ウイルスベクター送達系には、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡ及びＲＮＡウイルスを含む。遺伝子治療手順の概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ（ｅｄｓ．）（１９９５）；及びＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９４）を参照のこと。
核酸の非ウイルス系送達の方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸複合体、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、人工ビリオン、及びＤＮＡ取り込みの薬剤による増強が挙げられる。例えばＳｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用したソノポレーションも、核酸の送達に使用することができる。好ましい実施形態では、１つ以上の核酸がｍＲＮＡとして送達される。また、キャップ付加されたｍＲＮＡの使用により翻訳効率及び／またはｍＲＮＡ安定性を増加させることも好ましい。特に、ＡＲＣＡ（ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｃａｐ ａｎａｌｏｇ（アンチリバースキャップアナログ））キャップまたはその変種が好ましい。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許ＵＳ７０７４５９６及びＵＳ８１５３７７３を参照のこと。
その他の例示的な核酸送達系としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）、及びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ，（例えば、ＵＳ６００８３３６を参照）によって提供されているものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、及び同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬が市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適である、陽イオン性脂質及び中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のものが挙げられる。送達は、細胞（ｅｘ ｖｉｖｏ投与）または標的組織（ｉｎ ｖｉｖｏ投与）に対するものであり得る。
免疫脂質複合体などの標的化リポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、及び同第４，９４６，７８７号を参照）。
その他の送達方法としては、送達対象の核酸をＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）にパッケージングする使用法が挙げられる。このＥＤＶは、二重特異性抗体を使用して標的組織に特異的に送達され、その抗体の一方のアームは、標的組織に対する特異性を有し、他方のアームは、ＥＤＶに対する特異性を有する。抗体はＥＤＶを標的細胞表面に運び、次いでＥＤＶがエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。細胞内に取り込まれると、その内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（７）：６４３を参照）。
ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスを用いた系を使用した、遺伝子操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸の送達には、体内の特定の細胞にウイルスの標的を定め、ウイルスのペイロードを核に輸送するため高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターを患者に直接投与する（ｉｎ ｖｉｖｏ）ことも、またはベクターを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を処理し、改変細胞を患者に投与する（ｅｘ ｖｉｖｏ）こともできる。ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を送達するためのウイルスを用いた従来の系としては、遺伝子導入のためのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、及び単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスによる遺伝子導入方法によって可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現が得られる。さらに、多くの異なる細胞型及び標的組織において、高い形質導入効率が観察されている。
レトロウイルスの指向性は、外来性エンベロープタンパク質を組み込むことによって改変することができ、それにより標的細胞の対象に見込まれる標的集団が広がる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入するかまたは感染させることが可能であり、一般に高いウイルス力価を生じるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来性配列のパッケージングが可能である、シス作用性の長末端反復からなる。ベクターの複製及びパッケージングにはシス作用性ＬＴＲは最小限で十分であり、その後、これを使用して治療用遺伝子を標的細胞に組み込み、恒久的な導入遺伝子の発現を提供する。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びそれらの組み合わせに基づくものが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照）。
一過性の発現が好ましい用途では、アデノウイルスによる系を使用することができる。アデノウイルスによるベクターは、多くの細胞型において非常に効率の高い形質導入が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高力価かつ高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた、例えば、核酸及びペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生において、ならびにｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子治療手順を目的として、標的核酸による細胞への形質導入に使用される（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照）。組換えＡＡＶベクターの構築については、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含む、複数の刊行物に記載されている。
現在のところ、少なくとも６つのウイルスベクター手法が、臨床試験における遺伝子導入に利用可能であり、これらはヘルパー細胞株に挿入される遺伝子による欠損ベクターの補完を伴う手法を利用して、形質導入剤を生成する。
ｐＬＡＳＮ及びＭＦＧ−Ｓは、臨床試験に使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８−３０５（１９９５）；Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）；Ｍａｌｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：２２ １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療用ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０（１９９５））。ＭＦＧ−Ｓをパッケージしたベクターについて５０％以上の形質導入効率が観察されている。（Ｅｌｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）；Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損型及び非病原性のパルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスを用いた、有望な代替遺伝子送達系である。ベクターはすべて、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノムへの組み込みに起因した、効率的な遺伝子導入及び安定した導入遺伝子送達が、このベクター系の主要な特長である。（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２−３（１９９８）、Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ ｒｈ１０を含む他のＡＡＶ血清型、ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、及びＡＡＶ２／６などの偽型ＡＡＶもまた、本発明において使用することができる。好ましい実施形態では、ＡＡＶ９が使用される。
複製欠損型組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生することができ、複数の異なる細胞型に容易に感染する。大半のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、及び／またはＥ３遺伝子を置換するように遺伝子操作され、その後、その複製欠損型ベクターが、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞に伝播される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、及び筋肉中に見られるものなどの非分裂分化細胞を含む、複数の種類の組織にｉｎ ｖｉｖｏで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな収容力を有する。臨床試験でのＡｄベクターの使用例は、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療に関わるものであった（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験での遺伝子導入にアデノウイルスベクターが使用されたその他の例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：１ ５−１０（１９９６）；Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７ １０８３−１０８９（１９９８）；Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）；Ｔｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）；Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。
パッケージング細胞は、宿主細胞を感染させることが可能であるウイルス粒子の形成に使用される。そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、及びレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする産生細胞株によって生成される。ベクターは通常、パッケージング及びその後の宿主への組み込みに必要な最小限のウイルス配列を含有し（該当する場合）、それ以外のウイルス配列は、発現対象のタンパク質をコードする発現カセットによって置換される。欠損したウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療に使用されるＡＡＶベクターは通常、宿主ゲノムへのパッケージング及び組み込みに必要とされる、ＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを保有する。ウイルスＤＮＡは細胞株にパッケージングされ、これには他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐ及びｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠失するヘルパープラスミドが含まれる。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠失しているため、相当量でパッケージングされることはない。アデノウイルスの混入は、例えば、ＡＡＶよりもアデノウイルスのほうが影響を受けやすい熱処理によって低減することができる。
多くの遺伝子治療用途では、遺伝子治療ベクターが、特定の組織型に対する高度の特異性をもって送達されることが望ましい。そのため、ウイルスの外表面のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、所与の細胞型に対する特異性を有するようにウイルスベクターを修飾することができる。リガンドは、目的の細胞型に存在することが知られている受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：９７４７−９７５１（１９９５）によると、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように修飾することができ、その組換えウイルスは、ヒト上皮成長因子受容体を発現するある特定のヒト乳癌細胞に感染することが報告された。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス標的細胞対にも拡張することができる。例えば、繊維状ファージを遺伝子操作して、実質的にいかなる選ばれた細胞受容体に対しても特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示することができる。上記の説明は、主としてウイルスベクターに該当するものであるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターは、特異的な標的細胞による取り込みを優先する特異的な取り込み配列を含むように遺伝子操作することができる。
遺伝子治療ベクターは、以下に記載されるように、一般に全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または脳への直接注入を含む、頭蓋内注入）または局所適用による個々の患者への投与によって、ｉｎ ｖｉｖｏ送達することができる。あるいは、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または万能ドナー造血幹細胞などの細胞にｅｘ ｖｉｖｏでベクターを送達し、その後、通常はベクターを組み込んだ細胞の選択後に、その細胞を患者に再移植することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、ポリヌクレオチド及び／またはタンパク質）をｉｎ ｖｉｖｏで直接送達する。組成物（細胞、ポリヌクレオチド、及び／またはタンパク質）は中枢神経系（ＣＮＳ）に直接投与することができ、これには脳または脊髄への直接注射を含むが、これに限定されない。海馬、黒質、マイネルト基底核（ＮＢＭ）、線条体、及び／または皮質を含むが、これに限定されない脳の１つ以上の領域を標的にすることができる。ＣＮＳ送達の代わりに、またはそれに加えて、組成物を全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、心臓内、筋肉内、くも膜下、皮下、及び／または頭蓋内注入）することができる。本明細書に記載の組成物を対象に直接送達（ＣＮＳへの直接送達を含む）するための方法及び組成物には、注射針アセンブリによる直接注入（例えば、定位注入）が含まれるが、これには限定されない。そのような方法は、例えば、脳への組成物（発現ベクターを含む）の送達に関する米国特許第７，８３７，６６８号；同第８，０９２，４２９号、及び米国特許公開第２００６０２３９９６６号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
投与される有効量は、患者によって異なり、投与方式及び投与部位に応じて異なる。したがって、有効量は、組成物を投与する医師によって決定されるのが最善であり、適切な投与量は、当業者によって容易に決定することができる。組み込み及び発現に十分な時間（例えば、一般に４〜１５日）をとった後、治療用ポリペプチドの血清または他の組織レベルの分析及び投与前の初期レベルとの比較により、投与量が低すぎるか、適切な範囲内にあるか、または高すぎるかを決定する。初期投与とそれ以降の投与に適した投与計画もまた変更可能であるが、必要であれば最初の投与とそれ以降の投与を類型化する。以降の投与は、毎日から毎年、さらには数年ごとを範囲とする変更可能な間隔で投与することができる。ある特定の実施形態では、ＡＡＶなどのウイルスベクターを使用する場合、投与される用量は、１ｘ１０１０〜５ｘ１０１５ｖｇ／ｍｌ（すなわちその間の任意の値）、さらにより好ましくは１ｘ１０１１〜１ｘ１０１４ｖｇ／ｍｌ（すなわちその間の任意の値）、さらにより好ましくは１ｘ１０１２〜１ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ（すなわちその間の任意の値）である。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用してヒトの脳に直接ＺＦＰを送達するには、線条体あたり１ｘ１０１０〜５ｘ１０１５（または、例えば１ｘ１０１１〜１ｘ１０１４ｖｇ／ｍｌ、もしくは１ｘ１０１２〜１ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌを含む、その間の任意の値）の用量範囲のベクターゲノムを適用することができる。上記のように、投与量は、他の脳構造及び送達プロトコルの違いに応じて変更することができる。ＡＡＶベクターを脳に直接送達する方法は、当技術分野において既知である。例えば、米国特許第９，０８９，６６７号；同第９，０５０，２９９号；同第８，３３７，４５８号；同第８，３０９，３５５号；同第７，１８２，９４４号；同第６，９５３，５７５号；及び同第６，３０９，６３４号を参照のこと。
診断、研究のため、または遺伝子治療のためのｅｘ ｖｉｖｏ細胞トランスフェクション（例えば、宿主生物へのトランスフェクト細胞の再注入による）は、当業者に周知されている。好ましい実施形態では、細胞は、対象生物から単離され、少なくとも１種のＨｔｔリプレッサーまたはその構成要素でトランスフェクトされ、対象生物（例えば、患者）に再注入される。好ましい実施形態では、Ｈｔｔリプレッサーの１つ以上の核酸がＡＡＶ９を使用して送達される。他の実施形態では、Ｈｔｔリプレッサーの１つ以上の核酸がｍＲＮＡとして送達される。また、キャップ付加されたｍＲＮＡの使用により翻訳効率及び／またはｍＲＮＡ安定性を増加させることも好ましい。特に、ＡＲＣＡ（ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅｃａｐａｎａｌｏｇ（アンチリバースキャップアナログ））キャップまたはその変種が好ましい。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０７４，５９６号及び同第８，１５３，７７３号を参照のこと。ｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクションに適した種々の細胞型は、当業者に周知されている（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ ｅｄ．９９４））、患者からの細胞の単離及び培養方法の考察についてはその中で引用される参考文献を参照のこと）。
一実施形態では、細胞トランスフェクション及び遺伝子治療を目的としたｅｘ ｖｉｖｏ処置に幹細胞が使用される。幹細胞を使用することの利点は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで他の細胞型に分化できること、あるいは哺乳動物（細胞のドナーなど）に導入でき、それが骨髄に生着することである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−αなどのサイトカインを使用して、ＣＤ３４＋細胞を臨床的に重要な免疫細胞型へとｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させるための方法が知られている（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）を参照）。
幹細胞は、形質導入及び分化のために、既知の方法を使用して単離される。例えば、幹細胞は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（汎Ｂ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、及びＩａｄ（分化抗原提示細胞）などの不要な細胞に結合する抗体で骨髄細胞をパニングすることによって、骨髄細胞から単離される（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）を参照）。
修飾された幹細胞もまた、いくつかの実施形態で使用することができる。例えば、アポトーシスへの耐性を与えられた神経幹細胞を治療用組成物として使用してもよく、その幹細胞はまた、本発明のＺＦＰ ＴＦを含む。アポトーシスへの耐性は、幹細胞内でＢＡＸまたはＢＡＫ特異的ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮを使用してＢＡＸ及び／またはＢＡＫをノックアウトすることによって（米国特許第８，５９７，９１２号を参照）、または例えばカスパーゼ−６特異的ＺＦＮを再び使用してカスパーゼ内で破壊されるものをノックアウトすることによって、生じさせることができる。これらの細胞は、変異型または野生型Ｈｔｔを制御することが知られているＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦでトランスフェクトすることができる。
治療用ＺＦＰ核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）はまた、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。あるいは、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、分子を導入して血液または組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される、注射、注入、局所適用、及びエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない経路のうちのいずれかによる。そのような核酸の投与に適した方法が、利用可能であるとともに当業者に周知されており、特定の組成物の投与に複数の経路を使用することができるが、特定の経路の方が、別の経路よりも即時的かつ効果的な反応が得られる場合が多い。
造血幹細胞へのＤＮＡの導入方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に開示されている。造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞への導入遺伝子の導入に有用なベクターとしては、アデノウイルス３５型が挙げられる。
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への導入遺伝子の導入に適したベクターとしては、非組み込み型レンチウイルスベクターが挙げられる。例えば、Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３８２−１１３８８；Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１；Ｚｕｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０； Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：２１７−２２２を参照のこと。
部分的に、薬学的に許容される担体は、投与される具体的な組成物によって、ならびに組成物の投与に使用される具体的な方法によって決定される。したがって、以下に記載されるように、医薬組成物に適する多種多様な製剤が利用可能である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８９を参照）。
上記のように、開示される方法及び組成物は、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、及びヒト細胞を含むが、これらに限定されない、任意の種類の細胞内で使用することができる。タンパク質発現に適した細胞株は、当業者に既知であり、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ｐｅｒＣ６、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｓｃｈｉａ、及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの真菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞株の子孫、変種、及び誘導体もまた使用することができる。好ましい実施形態では、方法及び組成物は、脳細胞、例えば線条体に直接送達される。
用途
本明細書に記載のＨｔｔ結合分子（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏなど）、及びそれらをコードする核酸は、様々な用途に使用することができる。これらの用途には、Ｈｔｔ結合分子（ＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を含む）を対象（例えば、ＡＡＶ９などのＡＡＶ）に投与して、対象内での標的遺伝子の発現調節に使用する治療方法が含まれる。調節は、抑制形態、例えば、ＨＤ疾患状態に寄与するｍＨｔｔの抑制であり得る。あるいは、内因性細胞遺伝子の発現の活性化または発現の増加が疾患状態を改善できる場合、調節は活性化形態であり得る。なおさらなる実施形態では、調節は、例えば変異型Ｈｔｔ遺伝子の不活性化のための（例えば、１つ以上のヌクレアーゼによる）切断であり得る。そのような用途の場合、上記のように、Ｈｔｔ結合分子、またはより一般的には、それらをコードする核酸が、薬学的に許容される担体とともに医薬組成物として製剤化される。
Ｈｔｔ結合分子またはそれらをコードするベクターは、単独で、または他の好適な成分（例えば、リポソーム、ナノ粒子、または当技術分野で既知の他の成分）と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることができる（すなわち、「噴霧」することができる）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などのような加圧された許容される噴射剤に入れることができる。例えば静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下経路などによる非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含み得る、水性及び非水性の等張滅菌注射液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、及び防腐剤を含み得る、水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。組成物は、例えば、静脈内注入により、経口的に、局所的に、腹腔内に、膀胱内に、頭蓋内に、またはくも膜下に投与することができる。化合物の製剤は、アンプル及びバイアルなどの単位用量または複数用量の密閉容器で提供することができる。注射液及び懸濁液は前述のような無菌散剤、顆粒剤、及び錠剤から調製することができる。
患者に投与される用量は、時間の経過とともに有益な治療反応を患者に生じさせるのに十分であるべきである。用量は、使用される具体的なＨｔｔ結合分子の有効性及びＫｄ、標的細胞、患者の病態、ならびに治療される患者の体重または体表面積によって決定される。用量の規模はまた、特定の患者における特定の化合物またはベクターの投与に伴う何らかの有害な副作用の存在、性質、及び程度によって決定される。
有益な治療応答は、複数の方法で測定することができる。例えば、不随意的な痙攣または苦悶動作、固縮または筋拘縮（ジストニア）などの筋肉の問題、眼球運動の低速化または異常、歩行、姿勢及びバランスの障害、身体的言語生成または嚥下の困難、ならびに随意運動の障害などのハンチントン病に付随する運動障害の改善を測定することができる。認知障害及び精神障害などの他の機能障害もまた、治療に伴う改善の徴候についてモニターすることができる。ＵＨＤＲＳ尺度は、疾患の臨床的特徴を定量化するために使用することができる。
前駆症状を示す患者にとって、ＨＤで発生する広範な神経変性の前に疾患を治療する機会が得られるため、治療が特に重要であり得る。この損傷は、上記の明白な症状が発現する前に起こる。ＨＤ病変は、主として線条体の中型有棘ニューロンにおける変異型Ｈｔｔの毒性効果と関連する。この中型有棘ニューロンは、遺伝子転写因子、神経伝達物質受容体及び電位開口型チャネルに関与するｃＡＭＰ及びｃＧＭＰシグナル伝達カスケードを制御するホスホジエステラーゼ１０Ａ（ＰＤＥ１０Ａ）を高レベルに発現するが（Ｎｉｃｃｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｂｒａｉｎ １３８：３０１６−３０２９）、ＨＤマウスでは、このＰＤＥ１０Ａの発現が減少することが示されており、またヒトでの検死研究でも同様のことが見出された。近年、ＰＤＥ１０Ａ酵素に対するリガンドである陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）リガンド（例えば、１１Ｃ−ＩＭＡ１０７（Ｎｉｃｃｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ、前掲）、１８ＦＭＮＩ−６５９（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ（２０１４）ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ ７１（１２）：１５２０−１５２８））が開発されており、これらの分子が、前駆症状のＨＤ患者を評価するために使用されている。研究によると、症状が発現する前であってもＨＤ患者においてＰＤＥ１０Ａレベルが変化することが示されている。したがって、ＰＥＴによるＰＤＥ１０Ａレベルの評価を治療前、治療中、及び治療後に行うことによって、本発明の組成物の治療有効性を測定することができる。「治療有効性」は、臨床的及び分子測定値の改善を意味することができ、さらに患者の中型有棘ニューロン機能のそれ以上の何らかの低下もしくは有棘ニューロンの消失の増加、またはＨＤに伴う明白な臨床的症状のさらなる発現を防止することを意味することができる。
以下の実施例は、Ｈｔｔモジュレーターにジンクフィンガータンパク質が含まれる、本開示の例示的な実施形態に関する。これは例示のみを目的としており、ＴＡＬＥ−ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、追加のＺＦＰ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、追加のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例えば、Ｃｆｐ系）、遺伝子操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含むが、これらに限定されない他のＨｔｔモジュレーター（例えば、リプレッサー）を使用できることが理解されるであろう。
実施例１：Ｈｔｔリプレッサー
Ｈｔｔを標的とするジンクフィンガータンパク質４５６４３及び４６０２５（表１を参照）は、本質的に米国特許第６，５３４，２６１号；米国特許公開第２０１５００５６７０５号；同第２０１１００８２０９３号；同第２０１３０２５３０４０号；及び米国出願第１４／７０６，７４７号に記載のように遺伝子操作した。表１は、これらのＺＦＰのＤＮＡ結合ドメインの認識ヘリックスを示し、表２は、これらのＺＦＰの標的配列を示す。ＺＦＰを評価して、その標的部位に結合することを明らかにした。
ＺＦＰ４５６４３及びＺＦＰ４６０２５は、Ｈｔｔを抑制するＺＦＰ−ＴＦを形成するようにＫＲＡＢ抑制ドメインに機能可能に連結した。ＺＦＰ ＴＦをヒト細胞（例えば、ＨＤ患者由来の細胞）にトランスフェクトし、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用してＨｔｔの発現をモニターした。いずれのＺＦＰ−ＴＦも変異型Ｈｔｔ発現を選択的に抑制するのに有効であることが判明した。プラスミドとして、ｍＲＮＡ形態で、Ａｄベクターに、レンチウイルスベクターに、及び／またはＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ９）に製剤化する場合、ＺＦＰ−ＴＦは機能的リプレッサーである。
実施例２：物質及び方法
動物。本試験には、２匹のアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ、４〜１５齢、４ｋｇ超）を加えた。実験は、米国国立衛生研究所のガイドライン、及びカリフォルニア大学サンフランシスコ校のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されたプロトコルに従って実施した。
ベクター調製。サイトメガロウイルスプロモーターの制御下にある、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含有するＡＡＶ９を、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：９３８−９４５に以前に記載されたＨＥＫ−２９３細胞の三重トランスフェクションによって生成した。ＡＡＶ９−ＧＦＰを使用直前にリン酸緩衝生理食塩水及び０．００１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のプルロニックＦ−６８で濃度１．４×１０１３ｖｇ／ｍｌ（高用量）または１．４×１０１２ｖｇ／ｍｌ（低用量）に希釈した。
手術及びベクター注入。各ＮＨＰに、頭蓋骨装着式、ＭＲ適合性の一時プラスチックプラグの定位固定を行った。次いで、動物をＭＲＩ適合性定位フレームに仰向けに置いた。骨切除開頭術後、カニューレガイドを両半球上方の頭蓋骨に固定した。プラグを配置した後、挿管した動物をＭＲＩスイート内のプラットフォームテーブルに移動させ、イソフルラン（１〜３％）を吸入させた。滅菌状態のガイドにＭＲ可視トレーサー（Ｐｒｏｈａｎｃｅ、Ｓｉｎｇｅｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を充填して、ＭＲ画像中のプラグ位置を特定し、脳内部の標的構造への軌道を算出した。次いで、ＮＨＰをＭＲマグネット内に移動させ、標的識別と手術計画のため、高解像度の解剖学的ＭＲスキャンを取得した。標的を選択した後、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９：１０４８−１０５７；Ｋｒａｕｚｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ １０３：９２３−９２９；及びＦｉａｎｄａｃａ ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ５：１２３−１２７に以前に記載されているように、３ｍｍ刻みのチップを有するカスタム設計されたセラミック製溶融シリカ逆流防止カニューレを使用してベクターを注入した。
カニューレを、ＭＲＩ適合性注入ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に搭載された１ｍｌシリンジに取り付けた。１μｌ／分で注入を開始し、カニューレ先端に注入液が見えたら、ガイド軸を通してカニューレを脳に導入した。深さストッパーがガイド軸の頂部に達したら、カニューレを固定ネジで固定した。注入速度は、１μｌ／分で開始し、最終的に５μｌ／分まで増加させた。各ＮＨＰの各被殻（両側）同時に、前交連及び後交連の被殻に及ぶ注入を施した。半球あたりの総注入容積は、両半球で１００μｌであった。注入が終了したら、ガイドデバイスを頭蓋骨から取り外して、動物を飼育ケージに戻し、モニターしながら麻酔から回復させた。
ＭＲＩの取得。動物をＳｉｅｍｅｎｓ Ｖｅｒｉｏ Ｍａｇｎｅｔｏｍ ３．０Ｔ ＭＲＩ（Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）でスキャンした。最初のスキャンで、フリップ角４°で得られるＴ１強調高速低角度ショット（ＦＬＡＳＨ）を取得し、カニューレ先端のガドリニウムをトレースするプロトン密度の強調画像を生成した（８ｍｓ ＴＥ、２８ｍｓ ＴＲ、３回の励起、２５６×３×１９２マトリックス、１４×１４ｍｍ視野、１ｍｍスライス）。以降のスキャンはすべて、Ｔ１強調を強め、Ｇｄシグナルの拡張を強調するために、フリップ角４０°で連続的に取得した。
組織処理。ＡＡＶ９を注入した動物に、ＡＡＶ−ＧＦＰの注入後約３週間、冷生理食塩水、続いて４％パラホルムアルデヒドで経心腔的灌流を行った。以前に確立された方法を用いて脳を採取し、組織学的に分析した。簡潔には、ブレインマトリックスを用いて６ｍｍの冠状ブロックを採取し、直ちにパラホルムアルデヒド中で一晩、後固定し、さらに翌日３０％（ｗ／ｖ）スクロース中で凍結保護した。スライドミクロトームを使用して、４０μｍの連続切片に切断した。我々が以前に確立した方法でＧＦＰ発現を視覚化するために、浮遊切片に色素染色（ｃｈｒｏｍａｇｅｎｉｃ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。
免疫組織化学染色。血清型ごとに切片を順に採取し、次の処理まで凍結保護溶液（０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、３０％グリセロール、及び３０％エチレングリコール）の入った１００ウェル容器に４℃で保存した。浮遊切片に免疫組織化学染色を行った。簡潔には、各免疫組織化学工程のたびに、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いた手順ではＰＢＳで、または蛍光染色では０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで洗浄を行った。室温で３０分間かけて内因性ペルオキシダーゼ活性（ペルオキシダーゼを用いた手順の場合）を停止させた。室温で６０分間、ＰＢＳＴ中の２０％ウマ血清で切片をインキュベートすることにより、非特異的染色のブロッキングを行った。その後、切片を特異的一次抗体と一晩インキュベートした。免疫組織化学手順に使用した一時抗体は以下の通りであった：ポリクローナルウサギ抗Ｉｂａ１、ＰＡｂ、１：５００（ｗｗｗ．ｂｉｏｃａｒｅ．ｎｅｔ／）；ＨＲＰを用いた染色に１：１０，０００のモノクローナルマウス及び抗ＧＦＡＰ、蛍光染色に１：１０００のポリクローナルウサギ及び抗ＧＦＡＰ（ｗｗｗ．ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ）；ＨＲＰを用いた染色に１：５，０００、蛍光染色に１：５００のモノクローナルマウス抗ＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；１：１０００のモノクローナル及びマウス抗ＴＨ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ３１８）；ポリクローナルマウス及びモノクローナルウサギ抗ＧＦＰ、それぞれ１：２００及び１：５００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。すべての抗体をＤａ Ｖｉｎｃｉ希釈液（Ｂｉｏｃａｒｅ）に溶解した。室温にて５分間ＰＢＳ中で３回すすいだ後、ＨＲＰを用いた染色用の切片を、Ｍａｃｈ ２抗マウスＨＲＰポリマー（Ｂｉｏｃａｒｅ）またはＭａｒｃｈ ２抗ウサギＨＲＰポリマー（Ｂｉｏｃａｒｅ）とともに室温で１時間インキュベートした。結合したＨＲＰの活性を、３，３’−ジアミノベンジジンペルオキシド基質（Ｖｅｃｔｒｏ Ｌａｂｓ）を含む市販のキットによって可視化した。ＮｅｕＮ染色切片をクレシルバイオレット染色で対比染色した。最後に、ゼラチンを塗布したスライドに免疫染色された切片を載せ、アルコール及びキシレンで脱水し、Ｃｙｔｏｓｅａｌ（商標）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、カバースリップで覆った。
異なる抗原の二重蛍光免疫染色のために（ＧＦＰ／ＧＦＡＰ、ＧＦＰ／ＮｅｕＮ、ＧＦＰ／ＴＨ、及びＧＦＰ／Ｉｂａ１）、一次抗体の組み合わせを４℃で一晩インキュベートすることにより一次抗体のカクテルとして切片に適用した。すべての一次抗体をＤａＶｉｎｃｉ希釈液（Ｂｉｏｃａｒｅ）に溶解した。ＰＢＳＴ中で３回洗浄した後、モノクローナル一次抗体を、次の適切な二次蛍光色素コンジュゲート抗体、ヤギ抗マウスＤｙＬｉｇｈｔ ５４９（赤）（Ｂｉｏｃａｒｅ）、ヤギ抗ウサギＤｙＬｉｇｈｔ ５４９、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ヤギ抗マウスＤｙＬｉｇｈｔ ４８８（緑）、ヤギ抗ウサギＤｙＬｉｇｈｔ ４８８、及びロバ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８と暗所で２時間インキュベートすることにより可視化した。二次抗体はすべて蛍光抗体希釈液（Ｂｉｏｃａｒｅ）で１：１，０００希釈により溶解した。切片は、蛍光用封入剤Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ｈａｒｄ Ｓｅｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を用い、カバースリップで覆った。対照切片を一次抗体なしで処理したが、各条件下で有意な免疫染色は観察されなかった。
半定量的分析。分布容積（Ｖｄ）分析は、Ｂｒａｉｎｌａｂ ｉＰｌａｎ Ｆｌｏｗ Ｓｕｉｔｅ（Ｂｒａｉｎｌａｂ、Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ；ｗｗｗ．ｂｒａｉｎｌａｂ．ｃｏｍ）を用いて実施した。注入部位、カニューレ管、及びカニューレ先端を冠状面、体軸面、及び矢状面のＴ１強調ＭＲ画像で特定した。Ｔ１ガドリニウムシグナル及び標的被殻を強調するため関心領域（ＲＯＩ）の輪郭を抽出した。画像の連続及びＲＯＩの３次元容積再構成を分析し、注入の推定Ｖｄ及び注入液の総量（Ｖｉ）に対するその比を決定した。
脳切片の分析。処理された切片をすべて検査し、ＣＣＤカラービデオカメラ及び画像解析システム（Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｚｅｉｓｓ）を備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）でデジタル撮影した。サルごとにＧＦＰ陽性細胞及びＮｅｕＮ陽性細胞の数を、冠状断面から被殻に至る両半球について決定した。蛍光顕微鏡を使用して切片中の二重標識細胞の数を決定した。切片または焦点の位置を変えずに、２つの個別の手段（赤色ローダミン及び緑色フルオレセインイソチオシアネート；共局在化は黄色に見える）からの画像をマージすることにより二重標識切片の顕微鏡写真を得た（対物レンズｘ２０及びｘ４０、ＡｐｏＴｏｍｅモードによるＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ顕微鏡）。各二重染色では、注射部位から約５００μｍの距離の前部及び後部の切片を選択した。ＧＦＰ／ＮｅｕＮ、ＧＦＰ／ＧＦＡＰ、ＧＦＰ／ＴＨ、及びＧＦＰ／Ｉｂａ１を発現する細胞の割合を特定するために、各切片を、最初に１つの手段を使用して表現型特異的細胞（ＴＨ、ＧＦＡＰ、Ｉｂａ１、またはＮｅｕＮ）の存在について分析し、次に複合手段を使用して同時染色された細胞数について分析した。
ＮｅｕＮ及びＧＦＰで染色された切片を使用して、被殻（両側）における３種類のレベルの注射部位で３つの切片から計数した。ＮｅｕＮ陽性及びＧＦＰ陽性細胞を、両方の形質導入領域の５つの無作為に取得したフレーム（３５０μｍ２）から２００倍の倍率で計数した。形質導入されていない領域では、５つの無作為のフレームを、規定された発現の境界から３５０μｍの距離で取得した。これらの分析は、ｉｎ ｖｉｖｏでの形質導入細胞の総数を反映していないが、ベクターの定量的比較は可能であった。各サンプル領域の細胞数を各動物の切片にわたって平均し、最終データをＮｅｕＮ陽性及びＧＦＰ陽性の平均数として示す。
実施例３：注入及び形質導入効率
我々は、ＡＡＶ２が、ラット及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の脳実質に注入されたとき、ニューロンに沿って順方向に輸送される神経向性ベクターであることを以前に示した。例えば、Ｃｉｅｓｉｅｌｓｋａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９：９２２−９２７； Ｋｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ ４８：２２８−２３５を参照のこと。無傷のウイルス粒子のこの輸送は十分に強固であるため、投射する神経終末からベクターが放出され、遠位ニューロンを形質導入できることは明らかである。したがって、ＡＡＶ２のＮＨＰ視床への注入は、皮質内全体に含まれる皮質ニューロンの強固な形質導入をもたらした。対照的に、ＡＡＶ６は、軸索に沿って逆方向に輸送され、ＡＡＶ２と同様にほぼ神経向性である。例えば、Ｓａｌｅｇｉｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０（３）：３４８−５２；Ｓａｎ Ｓｅｂａｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０：１１７８−１１８３を参照のこと。例えば、ＮＨＰ被殻の形質導入は、皮質線条体ニューロンの導入遺伝子発現をもたらす。
この研究では、２匹のＮＨＰに、高用量（ＨＤ；左半球；１．５×１０１３ｖｇ／ｍＬ）または低用量（ＬＤ；右半球；１．５×１０１２ｖｇ／ｍＬ）いずれかのＡＡＶ９−ＧＦＰの被殻注入を施した。Ｃｉｅｓｉｅｌｓｋａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２１：１５８−１６６；Ｓａｍａｒａｎｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２２：３２９−３３７に以前に記載されているように、ＧＦＰに対する細胞媒介性応答から生じる交絡の可能性を制限するために、術後の生存段階を意図的に短くした（３週間）。
ＭＲＩのガドリニウム強調シグナルの分布を、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔ Ｆｕｎｃｔ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ８９：１４１−１５１に以前に記載されているように容積測定して評価した。結果を図１に示す。注目すべき点として、霊長類の被殻のおおよその形状は、矢状方向に幾分円錐形であり、前断面は広く、後断面に向かって狭くなっている。しかしながらＭＲＩ造影剤による被殻の適用範囲は、ほぼ全体に及んだ。ＧＦＰとガドリニウムシグナルとの重複部は、注入液が十分に含有され、被殻の前部及び内側部に漏れがほとんどなく、ＭＲ画像のコントラスト領域の３倍の領域に広がっていることを示していた。ＧＦＰ発現の免疫組織化学染色の輪郭を抽出し、注入の空間的境界内の様々な冠状レベルでの連続するベースラインＭＲ画像から再構成された被殻の輪郭に重ね合わせた。これはＡＡＶ２で見られたものとはかなり異なり、導入遺伝子の発現がＭＲＩシグナルとほぼ正確に相関する（Ｆｉａｎｄａｃａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ ４７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｔ２７−３５）。
さらに、ＨＤ及びＬＤいずれの被殻においても、強固なレポーター発現が多量の細胞体及び神経線維に顕著であった（図２Ａ〜図２Ｄ）。以前に記載された方法（Ｃｉｅｓｉｅｌｓｋａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２１：１５８−１６６）に基づいて、カニューレ管面の周りの形質導入の主要領域（ＰＡＴ；ｍｍ２）全体を免疫蛍光することによりＧＦＰ＋／ＮｅｕＮ＋ニューロンを計数した。ＧＦＰ陽性神経発現の強度は、形質導入領域から３５０μｍ以下の異質な周辺部（以下ＰＡＴ「外部」（ｏＰＡＴ）と記載）沿いで急に減少した。本研究のこの部分では、ベクター依存性効果を確認するために、ＰＡＴ及びｏＰＡＴ、ならびに２匹の健常な未処置のサル由来の処理済み被殻切片において、ＮｅｕＮ＋細胞体の計数を実施した。
さらに、神経細胞体におけるＡＡＶ９媒介性形質導入及びＧＦＰ発現を明らかにすると思われるＮｅｕＮ陽性及びＧＦＰ陽性標識に関して、ＰＡＴ及びｏＰＡＴでの形質導入効率に用量依存性があるかどうかを分析した。抗ＧＦＰ応答の蓄積が比較的遅く、ＡＡＶ９−ＧＦＰ注入後６週間を超えると顕著であったが、３週間では顕著でなかったという以前の我々の観察と一致して、ＡＡＶ９−ＧＦＰの形質導入に起因する神経喪失の証拠は見つからなかったが、ミクログリアの活性化及びＭＨＣ−ＩＩの上方制御の証拠は見られた（図２Ｅ〜図２Ｈ）。
脳、主としてアストロサイト（Ｃｏｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ １０６：６９−７７）及びミクログリア（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｎｎ Ｍｅｄ ３４：４９１−５００）における抗原提示には複数の機構が存在する。注入部位でのニューロン標的及びグリア標的に対するＡＡＶ９の細胞特異性を決定するために、ニューロンに対するＮｅｕＮ神経マーカー、アストロサイトに対するグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、及びミクログリア特異的マーカーＩｂａ１を含む、導入遺伝子及び細胞特異的マーカーで脳切片を免疫染色した。
図３に示す、細胞マーカーそれぞれによるＧＦＰに対する二重免疫蛍光染色から明らかなように、導入遺伝子はニューロン及びアストロサイトの両方において容易に発現されたが、ミクログリアは、隣接する細胞体及びニューロン繊維における大量のＧＦＰ発現にもかかわらず形質導入されなかった。しかしながら、形質導入された領域におけるミクログリアの活性化は容易に観察可能であった（図２Ｅ〜図２Ｈ）が、これは局所環境の自然免疫状態を感知するミクログリアの能力を示している。
実施例４：軸索輸送
被殻へのＡＡＶ９−ＧＦＰの注入は、遠位構造に形質導入を生じさせた。ＧＦＰ染色は、例えば前頭前野、前頭皮質、及び頭頂皮質の細胞体で観察された（図４）。ＧＦＰ陽性細胞体及び繊維はまた、視床及び大脳基底核の構成部位（黒質緻密部（ＳＮｃ）及び黒質網様部（ＳＮｒ）ならびに視床下核（ＳＴＮ）を含む）、ならびに内側前脳束（ＭＦＢ）の繊維にも存在していた（図５）。遠位の遺伝子座への軸索輸送には強いベクター用量依存性があった（図７）。したがって、低用量では見られなかったが、高用量のＡＡＶ９では、被殻とＳＴＮとの間に直接的な神経連絡がないという事実にもかかわらず、ＳＴＮに細胞体標識が見られた。我々は、ＡＡＶ２を用いた大脳基底核内（Ｃｉｅｓｉｅｌｓｋａ ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９：９２２−９２７，及びＫｅｌｌｓ（２０１２）、前掲）、及び視床から皮質への（Ｋｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：２４０７−２４１１）このような間接的な順行性輸送について以前から着目していた。ただし、ＡＡＶ９−ＧＦＰ輸送の有意な用量依存性は、最初は淡蒼球、次にＳＴＮという２段階でベクターが輸送されることを意味する。黒質網様部（ＳＮｒ）内のＧＦＰ陽性細胞体の存在に加え、被殻からＳＮｒに投射するニューロンを標識する繊維の存在によってＡＡＶ９の順行性輸送がさらに裏付けられた（図６）。意外にも、黒質緻密部（ＳＮｃ）内の細胞体もまたＧＦＰ陽性であり、このことは被殻からの逆行性輸送によりＳＮｃが高度に分岐した投射を送ることを示している。ＳＴＮと著しい差はなかったものの、この領域の形質導入に対するＡＡＶ９−ＧＦＰの用量効果は明白であった。
したがって、ＡＡＶ９が軸索に沿って双方向に輸送されるという結論を得た。これは霊長類の脳におけるＡＡＶ９の顕著な分布を少なくとも部分的に説明する現象である。ＡＡＶ９は、軸索輸送及び細胞型特異性の点で、ＡＡＶ２及びＡＡＶ６とは極めて異なっていた。ＡＡＶ９は、アストロサイト及びニューロンを形質導入したが、ミクログリアを形質導入しなかった。ベクターは、順行性及び逆行性両方の軸索方向に輸送された。これらのデータは、霊長類の脳におけるＡＡＶ９分布の理解を発展させ、ハンチントン病などの著しい皮質線条体病変を伴う神経疾患治療における有用性を裏付けるものである。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いたベクターによる神経系遺伝子治療の臨床開発がより一般的になるにつれて、霊長類の脳におけるＡＡＶの血清型特異的な挙動がますます重要視されている。このことは、パーキンソン病（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９：１０４８−１０５７）などの疾患、及び芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）欠損（Ｓａｎ Ｓｅｂａｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ ３）などの希少神経障害における神経外科的介入の臨床開発を促進する、より効率的で進歩したベクター注入技術の場合に特に当てはまる。この新しい臨床応用技術では、術中ＭＲＩを用いてＡＡＶ２の実質細胞注入を視覚化する。その有用性は、ＭＲＩ造影剤の分布と最終的な導入遺伝子発現との間の顕著な相関によるものである。しかしながら、ＡＡＶ９ではこの密接な相関関係が幾分崩れている。ＧＦＰの発現は、注入容積を有意に（約３倍）上回る容積に拡張された。このことは、間質または脈管の輸送プロセスが初回加圧注入（ＣＥＤ）の結果に重要な役割を果たすことを強調している（Ｈａｄａｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １４：６９−７８）。我々の意見では、ＡＡＶ２の場合、豊富なヘパラン硫酸プロテオグリカン（Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：１４３８−１４４５）に対するベクターの結合活性が、ＡＡＶ２の注入部位を限定する効果があり、導入遺伝子発現の分布がＭＲＩ造影剤の分布と厳密に一致する。対照的に、ＡＡＶ９の一次受容体はＨＳＰＧではなく（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８６：１３５３２−１３５４０）、その結果、このベクターは、血管外膜と結合して、所与の注入容積に対してはるかに大きな容積の発現を生じ得る。
ＡＡＶ９は、神経組織において広い指向性を示し（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９：１０５８−１０６９；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １；Ｆｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２７：５９−６５）、ニューロン及びアストロサイトの両方、ならびにおそらく他の細胞型にも形質導入する。ＡＡＶ９が脳の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に形質導入する能力は、ＡＰＣにおける外来（非自己）タンパク質の発現（Ｃｉｅｓｉｅｌｓｋａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２１：１５８−１６６；Ｓａｍａｒａｎｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４） Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２２：３２９−３３７；Ｆｏｒｓａｙｅｔｈ ａｎｄ Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚ（２０１５）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２３：６１２）、及びその結果生じる神経毒性の適応免疫応答の関与に関する懸念を起こさせる。言うまでもなく、自己タンパク質を発現する場合にはこれが問題となる可能性は低いが、本研究では、以前と同様、アストロサイト及びミクログリアに対するＩｂａ１の活性化及びＭＨＣ−ＩＩの上方制御を観察した。いずれのグリア型も、個々に独自の機能を有する脳のＡＰＣである。しかしながら、これらの細胞がＧＦＰ提示に対して明らかに応答性であった場合でも、ＡＡＶ９−ＧＦＰによるミクログリアへの形質導入の証拠は見られなかった。ＧＦＰ発現に対する適応応答に関して重要なＡＰＣはアストロサイトであるというのが我々の結論である。
脳におけるＡＡＶ血清型の挙動に関する最も顕著な発見の１つは、軸索輸送の現象であった。無傷のＡＡＶ粒子を長距離にわたり輸送するニューロンの能力は、当初ＡＡＶ２について報告されたが、この同じ現象は単純ヘルペス（Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２４８１−２４９４；Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ １８：３５−５１；Ｌｉｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５：４３４３−４３５６；及びＭｃＧｒａｗ ａｎｄ Ｆｒｉｅｄｍａｎ（２００９）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８３：４７９１−４７９９）及び狂犬病ウイルス（Ｇｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ４５：６１９−６３４；Ｋｅｌｌｙ ａｎｄ Ｓｔｒｉｃｋ（２０００）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０３：６３−７１；Ｋｌｉｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２：２３７−２４５；Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒａｌ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ １：５）についても記載されている。上記のウイルスの主要な逆行性輸送とは対照的に、ＡＡＶ２は、ＣＮＳニューロンにおいて順行性輸送を受ける。すなわち、ＡＡＶ２の粒子は、無傷の状態で神経細胞体からシナプス末端に輸送され、そこで放出されて、遠位のニューロンにより取り込まれる。Ｃｉｅｓｉｅｌｓｋａ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９：９２２−９２７；Ｋｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ ４８：２２８−２３５；Ｋｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：２４０７−２４１１を参照のこと。この現象には、一次形質導入位置での非常に効率的な分布及び形質導入を必要とし、初期にその現象が検出されなかった理由は、この効率度を実際に達成できるのはＣＥＤのみであることから説明することができる。ＮＨＰ視床へのＡＡＶ２の注入は、皮質層Ｖ／ＶＩに位置する錐体ニューロンを主とする、導入遺伝子の広範な皮質発現をもたらす。同様に、ＮＨＰ被殻またはラット線条体のＡＡＶ２による形質導入は、線条体ＧＡＢＡ作動性ニューロンからの投射を受ける、ＳＮｒ内の細胞体での導入遺伝子発現はもたらすが、線条体に投射するＳＮｃでは発現しない。ＡＡＶ２の順行性輸送とは対照的に、ＡＡＶ６は排他的に逆方向に輸送され、ＡＡＶ２とほぼ同様の神経向性である（Ｓａｌｅｇｉｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０（３）：３４８−５２；Ｓａｎ Ｓｅｂａｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０：１１７８−１１８３）。
ＡＡＶ９の軸索輸送は、本研究において双方向であることが見出された。ＡＡＶ９−ＧＦＰの被殻への注入は、被殻に投射する皮質線条体ニューロンでの導入遺伝子の発現をもたらし、ＧＦＰの発現はまたＳＮｃニューロンにおいても見出され、それによりこの血清型の逆行性輸送を確認した。ＡＡＶ６（Ｓａｎ Ｓｅｂａｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０：１１７８−１１８３）に見られるよりも大幅に効率的であるこの現象は、大脳基底核及び皮質線条体ニューロン両方の変性が疾患の神経病理の中心である（Ｂｅｒａｒｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ １４：３９８−４０３）ハンチントン病の治療法を考案する上で有益である。治療用ＡＡＶ９によるヒト被殻の効率的な形質導入は、線条体への皮質投射もまた標的とすることができる。
しかしながら、それに加えて、このベクターはＳＮｒ及びＳＴＮへと順方向に輸送された。ＳＴＮニューロンの標識はベクター用量に極めて依存しており、ＳＮｒ内より顕著であった。このことは、軸索及び／または血管周囲輸送による淡蒼球（ＧＰ）を介する間接的経路を用いたＡＡＶ９−ＧＦＰの輸送条件を示している。ＡＡＶ９が初回被殻注入量を超えて効率的に広がる能力は、血管周囲の強力な機構を示唆している。しかしながら、ＡＡＶ９の双方向性軸索輸送の現象は、ベクターの非常に広範な分布が必須である用途にとって、このベクターがこれほど有望であるとみなされる理由の一端を説明することができる。
実施例５：Ｈｔｔリプレッサーの送達
例えば、米国公開第２０１５００５６７０５号；同第２０１１００８２０９３号；同第２０１３０２５３０４０号；及び同第２０１５０３３５７０８号ならびに本明細書に記載されているようなＨｔｔリプレッサー（ＺＦＰ−ＴＦ、ＴＡＬＥ−ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦ）は、実施例１に記載したようにウイルス（例えば、ＡＡＶ９などのＡＡＶ）を使用してＨＤモデルマウス、ＮＨＰ、またはヒト対象の線条体に送達される。
Ｈｔｔリプレッサーは、広範な発現を示し、Ｈｔｔ発現、Ｈｔｔ凝集体の形成を減少させ、アポトーシスを減少させ、かつ／または対象における運動障害（例えば、クラスピング）を軽減させ、ＨＤの予防及び／または治療に有効である。
実施例６：ＨＤ患者の線維芽細胞及びＨＤ患者の幹細胞由来のニューロンにおける変異型Ｈｔｔの抑制
ＺＦＰ４６０２５及びＺＦＰ４５６４３は、ＨＤ患者由来のＣＡＧ１８／４５線維芽細胞において変異型ＨＴＴを選択的に抑制する（図８）。ＧＦＰ対照、ＺＦＰ４６０２５及びＺＦＰ４５６４３をコードするｍＲＮＡ（５０，０００細胞あたり０．１、１、１０、または１００ｎｇ）を、Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用してＨＤ線維芽細胞ＧＭ０２１５１（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ＨＴＴ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。各サンプルにおけるＷｔ Ｈｔｔ（ＣＡＧ１８）及び変異型Ｈｔｔ（ＣＡＧ４５）のレベルを、ＳＮＰ ｒｓ３６３０９９ Ｃ／Ｔ（エキソン２９）に基づくカスタムのアレル特異的ｑＰＣＲアッセイによって３連で測定し、ＧＡＰＤＨのレベルに正規化した。ＺＦＰサンプルのＨｔｔ／ＧＡＰＤＨ比を、モックトランスフェクトされたサンプルでの比（１に設定）にスケーリングした。データを平均±ＳＤで表す。データは、ＺＦＰ４６０２５及びＺＦＰ４５６４３両方による変異型Ｈｔｔアレル（ＣＡＧ４５）の選択的抑制を示している。
ＺＦＰ４６０２５及びＺＦＰ４５６４３は、ＨＤ患者由来のＣＡＧ２１／３８線維芽細胞において変異型ＨＴＴを選択的に抑制する（図９）。ＧＦＰ対照、ＺＦＰ４６０２５及び４５６４３のｍＲＮＡ（５０，０００細胞あたり０．１、１、１０、または１００ｎｇ）を、Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用してＨＤ線維芽細胞ＮＤ３０２５９（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、Ｈｔｔ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。各サンプルにおけるＷｔ Ｈｔｔ（ＣＡＧ２１）及び変異型Ｈｔｔ（ＣＡＧ３８）のレベルを、ＳＮＰ ｒｓ３６２３３１ Ｃ／Ｔ（エキソン５０）に基づくカスタムのアレル特異的ｑＰＣＲアッセイによって３連で測定し、ＧＡＰＤＨのレベルに正規化した。ＺＦＰサンプルのＨｔｔ／ＧＡＰＤＨ比を、モックトランスフェクトされたサンプルでの比（１に設定）にスケーリングした。データを平均±ＳＤで表す。データは、ＺＦＰ４６０２５及びＺＦＰ４５６４３両方による変異型ＨＴＴアレル（ＣＡＧ４５）の選択的抑制を示している。
図８及び９のデータは、ＺＦＰ４６０２５及びＺＦＰ４５６４３が、野生型及び変異型Ｈｔｔアレルの両方で、異なるＣＡＧリピート長を有する患者由来細胞において変異型Ｈｔｔアレルからの転写を選択的に抑制できることを示している。
ＺＦＰ４６０２５及びＺＦＰ４５６４３は、一過性ｍＲＮＡトランスフェクションによってＣＡＧ１７／４８ニューロン中の変異型Ｈｔｔを選択的に抑制する（図１０）。ＧＦＰ対照、ＺＦＰ４６０２５及びＺＦＰ４５６４３のｍＲＮＡ（１５０，０００細胞あたり１５、１５０、３００、または１，５００ｎｇ）を、Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用してＨＤ胚性幹細胞（ＥＳＣ）ＧＥＮＥＡ０２０（ＧＥＮＥＡ／ＣＨＤＩ）から分化したニューロンにトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、Ｈｔｔ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。各サンプルにおける野生型Ｈｔｔ（ＣＡＧ１７）及び変異型Ｈｔｔ（ＣＡＧ４８）のレベルを、エキソン６７のＳＮＰ ｒｓ３６２３０７に基づくアレル特異的ｑＰＣＲアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって３連で測定し、ＧＡＰＤＨのレベルに正規化した。ＺＦＰサンプルのＨｔｔ／ＧＡＰＤＨ比を、モックトランスフェクトされたサンプルでの比（１に設定）にスケーリングした。データを平均±ＳＤで表す。データは、ＨＤニューロンにおける、ＺＦＰ４６０２５及び４５６４３両方による変異型Ｈｔｔアレル（ＣＡＧ４８）の選択的抑制を示している。
使用するＺＦＰがＡＡＶ６ウイルスベクターまたはＡＡＶ９ウイルスベクターのいずれかを使用して送達された分化型ＣＡＧ１７／４８ニューロンについても実験を実施した。ＺＦＰ４６０２５、ＺＦＰ４５６４３、またはＧＦＰ対照をコードするＡＡＶ６ベクターを使用して、ＨＤ胚性幹細胞（ＥＳＣ）ＧＥＮＥＡ０２０（ＧＥＮＥＡ／ＣＨＤＩ）から分化したニューロンに２連で感染させた。使用されたＡＡＶ用量は、ＺＦＰについては細胞あたり１Ｅ＋４、５Ｅ＋４、または１Ｅ＋５ベクターゲノム（ｖｇ）であり、ＧＦＰについては細胞あたり１Ｅ＋５ｖｇであった。感染の２１日後、ＨＴＴ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。各サンプルにおけるＷｔ Ｈｔｔ（ＣＡＧ１７）及び変異型Ｈｔｔ（ＣＡＧ４８）のレベルを、エキソン６７のＳＮＰ ｒｓ３６２３０７に基づくアレル特異的ｑＰＣＲアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって３連で測定し、ＧＡＰＤＨのレベルに正規化した。ＺＦＰサンプルのＨｔｔ／ＧＡＰＤＨ比を、モックトランスフェクトされたサンプルでの比（１に設定）にスケーリングした。データを平均±ＳＤで表す（図１１Ａ）。
ＺＦＰ４６０２５、ＺＦＰ４５６４３、またはＧＦＰ対照をコードするＡＡＶ９ベクターを使用して、ＨＤ胚性幹細胞（ＥＳＣ）ＧＥＮＥＡ０２０（ＧＥＮＥＡ／ＣＨＤＩ）から分化したニューロンに２連で感染させた。使用されたＡＡＶ用量は、ＺＦＰについては細胞あたり１Ｅ＋５、５Ｅ＋５、または５Ｅ＋６ベクターゲノム（ｖｇ）であり、ＧＦＰについては細胞あたり５Ｅ＋６ｖｇであった。感染の２１日後、ＨＴＴ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。各サンプルにおける野生型Ｈｔｔ（ＣＡＧ１７）及び変異型Ｈｔｔ（ＣＡＧ４８）のレベルを、エキソン６７のＳＮＰ ｒｓ３６２３０７に基づくアレル特異的ｑＰＣＲアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって３連で測定し、ＧＡＰＤＨのレベルに正規化した。ＺＦＰサンプルのＨｔｔ／ＧＡＰＤＨ比を、モックトランスフェクトされたサンプルでの比（１に設定）にスケーリングした。データを平均±ＳＤで表す（図１１Ｂ）。
実施例７：ＺＦＰ４６０２５及びＺＦＰ４５６４３はＨＤに関連する細胞表現型をレスキューする
以前の研究では、ＨＤ患者由来細胞におけるＣＡＧリピートの伸長に伴う表現型の変化が示されている（Ｊｕｎｇ−ｉｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，４４６（３），３５９−３７１；ＨＤ ＩＰＳＣ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，（２０１２）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１１（２），２６４−２７８；Ａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１１（２），２５３−２６３）。これらの公開された知見と一致して、我々は、ＣＡＧ１７／４８ニューロンが非ＨＤ（正常）ニューロンと比較して細胞内ＡＴＰレベルの有意な減少を有することを見出した（図１２Ａ）。ニューロンがＺＦＰ４６０２５またはＺＦＰ４５６４３をコードするレンチウイルスベクターに感染してから２１日後、細胞内ＡＴＰレベルは対照細胞と比較してそれぞれ１．７倍及び１．８倍増加し、変異型ＨｔｔサイレンシングがＨＤニューロンのエネルギー欠損をレスキューすることを示した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＤニューロンの別の表現型は、プログラム細胞死に対して感受性が増加している。成長因子の離脱により、アポトーシスを受けるＣＡＧ１７／４８ニューロンのパーセント比は、正常なニューロンのものよりも４〜５倍高かった（図１２Ｂ）。レンチウイルス感染後１２日目、成長因子の離脱から２日後、ＺＦＰ４６０２５及びＺＦＰ４５６４３は、アポトーシス細胞数を野生型細胞で見られる数へと減少させた。
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＨＤ患者（ＣＡＧ１７／４８）または正常対象由来の培養ニューロンの細胞内ＡＴＰレベルを測定した。このとき、各サンプルの細胞数はＡｐｏＬｉｖｅ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して決定した。ＭＯＩが５００であるＹＦＰ−ＶｅｎｕｓまたはＺＦＰ−ＴＦ（４５６４３または４６０２５−ＫＯＸ−２Ａ−Ｖｅｎｕｓ）のいずれかを発現するＬＶにニューロンを３連で感染させた。
レンチウイルス感染後２１日目に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、製造業者の指示に従ってニューロンの細胞内［ＡＴＰ］レベルを測定した。発光値を各サンプルの細胞数で正規化した。次いで、異なる細胞／処理から得た細胞値ごとのＡＴＰレベルを、模擬感染させたＨＤニューロンのレベル（１と設定）に正規化した。データ（図１２Ａ）を平均±ＳＤで表す。
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）アッセイを使用して、成長因子の離脱によって誘導されたＨＤニューロン及び非ＨＤニューロンの細胞死を測定した。ＭＯＩが５００であるＹＦＰ−ＶｅｎｕｓまたはＺＦＰ−ＴＦ（４５６４３または４６０２５−ＫＯＸ−２Ａ−Ｖｅｎｕｓ）のいずれかを発現するＬＶにニューロンを３連で感染させた。細胞を１２日間培養した後、添加剤（成長因子）を何も加えない新鮮なｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に培地を交換した。細胞をこの成長因子離脱培地中で４８時間保持した。ＴＵＮＥＬアッセイは、ＡｐｏＢｒｄＵ Ｒｅｄ ＤＮＡ断片キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を使用して行った。４％パラホルムアルデヒドを用いて氷上で１５分間ニューロンを固定した。製造業者の推奨事項（ＡｐｏＢｒｄＵ Ｒｅｄ ＤＮＡ断片キット、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）に従ってＴＵＮＥＬ陽性細胞を定量化することによりアポトーシスを評価した。フローサイトメトリーを使用して、抗ＢｒｄＵ−Ｒｅｄ染色によってアポトーシスを測定した。データ（図１２Ｂ）を平均±ＳＤで表す。
このように、本明細書に記載のリプレッサーは、未処理の細胞と比較して、細胞死の減少、細胞機能の増加（細胞内ＡＴＰレベルによって測定される）、及びアポトーシスに対する細胞感受性の低下を含むがこれらに限定されない、ＨＤ関連表現型をレスキューすることによる治療上の利点を提供する。
実施例８：ＺＦＰ４６０２５及びＺＦＰ４５６４３はマウス線条体の変異型Ｈｔｔを抑制する
ＺＦＰ４６０２５、ＺＦＰ４５６４３、またはＧＦＰ対照をコードするＡＡＶ９ベクターの線条体内注入により、ＨｄｈＱ５０／Ｈｄｈ＋（Ｑ５０）ヘテロ接合マウス（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７：４０４−４１０）におけるＺＦＰのｉｎ ｖｉｖｏ活性を試験した。Ｑ５０マウスは、内因性マウスＨｄｈ遺伝子のエキソン１が４８のＣＡＧをもつヒトＨｔｔ遺伝子のエキソン１に置換されたノックインアレルを含む。注射後５週間で、処理した線条体のアレル特異的ｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＺＦＰ４５６４３及びＺＦＰ４６０２５は、ビヒクル注入対照と比較して変異型Ｈｔｔアレル（Ｑ５０）をそれぞれ７９％及び７４％抑制することを示した。野生型アレル（Ｑ７）はいずれのＺＦＰによっても制御されなかった（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。またＺＦＰ４５６４３の活性を注射後１２週に試験し（図１３Ｃ）、野生型アレル（Ｑ７）の抑制を伴わずに変異型Ｈｔｔ（Ｑ５０）の有意な抑制（７０％）が観察された。試験期間にわたって、いずれの動物においても明白な毒性は観察されなかった。行動試験（例えば、クラスピング試験）もまた実施し、本明細書に記載のリプレッサーがｉｎ ｖｉｖｏで治療的（臨床的）利益をもたらすことを示している。
１０〜１１齢のＨｄｈＱ５０／Ｈｄｈ＋（Ｑ５０）ヘテロ接合マウス（性別混合）に、ＡＡＶ９ベクター（ＺＦＰ４６０２５、ＺＦＰ４５６４３、またはＧＦＰ、群あたりｎ＝４）または製剤緩衝液（ビヒクル、ｎ＝３）の両側線条体内注入を施した。２回の３μｌ注射を各線条体に行った（合計６μｌ、線条体あたり１．１Ｅ＋１０ベクターゲノムに相当）。前部の注入に使用した座標は、Ａ／Ｐ＋１．４、Ｍ／Ｌ＋／−１．７、Ｄ／Ｖ−３．５であり、後部の注入ではＡ／Ｐ＋０．２、Ｍ／Ｌ＋／−２．３、Ｄ／Ｖ−３．２であった。注射後５週（ＺＦＰ４６０２５及びＺＦＰ４５６４３）及び１２週（ＺＦＰ４５６４３）でマウスを犠牲死させ、各線条体を３つ（前部、中部、及び後部）のスライスに切開し、ＲＮＡ単離及びｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。変異型Ｈｔｔアレル（Ｑ５０）及びｗｔアレル（Ｑ７）からの発現をアレル特異的ｑＰＣＲアッセイによって測定し、ＨｔｔレベルをＡＴＰ５Ｂ、ＲＰＬ３８、及びＥＩＦ４Ａ２レベルの幾何平均で正規化した。（ｎｓ：ｐ＞０．０５、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、Ｓｉｄａｋ検定による一元配置分散分析）。
図１３に示すように、処理した線条体のアレル特異的ｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＺＦＰ４５６４３及びＺＦＰ４６０２５は、ビヒクル注入対照と比較して変異型Ｈｔｔアレル（Ｑ５０）をそれぞれ７９％及び７４％抑制することを示した。野生型アレル（Ｑ７）はいずれのＺＦＰによっても制御されなかった。またＺＦＰ４５６４３の活性を注射後１２週に試験し、野生型アレル（Ｑ７）の抑制を伴わずに変異型Ｈｔｔ（Ｑ５０）の有意な抑制（７０％）が観察された。
したがって、本明細書に記載のＨｔｔリプレッサーは、広範な発現を示し、Ｈｔｔ発現、Ｈｔｔ凝集体の形成を減少させ、アポトーシスを減少させ、かつ／または対象における運動障害（例えば、クラスピング）を軽減させ、またＨＤの予防及び／または治療に有効である。
実施例９：ＺＦＰ４６０２５及びＺＦＰ４５６４３の治療有効性の測定
ＨＤ患者を、様々な用量のＺＦＰ４６０２５またはＺＦＰ４５６４３で治療する。ＨＤ患者をＵＨＤＲＳ尺度を用いて評価すると、患者は治療後に改善を示している。また有効性を、ＰＤＥ１０ＡのＰＥＴトレーサー１８ＦＭＮＩ−６５９、及びＭＲＩを使用したＰＥＴイメージング分析によって測定する。簡潔には、ＺＦＰ（例えば、ＺＦＰをコードするＡＡＶ９ベクター）に曝露された脳の領域（例えば、被殻内の領域）を、ＺＦＰ製剤と混合されたガドリニウム造影剤及びＭＲＩによって特定する。治療前及び治療後に、約５ｍＣｉの１８ＦＭＮＩ−６５９を約５μｇの質量用量で３分間の注入期間にわたって患者に投与した。ＰＥＴスキャナーを使用して９０分間、連続３Ｄ ＰＥＴ画像を取得する。ＭＲＩスキャナーを使用してＭＲＩ画像も取得し、ＰＥＴ画像をＭＲＩ画像と位置合わせして解剖学対応の画像を生成し分析する。大脳基底核（淡蒼球、尾状核、及び被殻（線条体）を含む）について標準取り込み値を算出し、小脳などの参照領域に対して正規化する（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ、前掲）。治療時にＭＲＩによって特定されたＺＦＰに曝露された脳領域のＰＤＥ１０Ａ ＰＥＴシグナルを治療後に測定し、治療前の同じ領域のシグナルレベルと比較する。ＨＤ患者をＺＦＰ４６０２５またはＺＦＰ４５６４３で治療することにより、中型有棘ニューロンの何らかのさらなる消失（ＰＤＥ１０Ａレベルで測定）、及び明白な臨床症状のさらなる発症から患者を保護する。患者によっては、ＺＦＰによる治療はＨＤの症状を逆転させる。
本明細書で述べるすべての特許、特許出願、及び刊行物は、目的を問わず参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
理解を明確にする目的で、例示及び実施例によってある程度詳細に開示内容を示したが、本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく、種々の変更及び改変がなされ得ることが当業者には明らかであろう。したがって、上記の説明事項及び実施例は、限定として解釈されるべきではない。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
Ｈｔｔ遺伝子に結合する非天然型ジンクフィンガータンパク質であって、Ｆ１〜Ｆ５に指示される５つのジンクフィンガードメインを含み、前記ジンクフィンガードメインが、表１の単一の行に示される認識ヘリックス領域配列を含む、前記ジンクフィンガータンパク質。
(項目２)
項目１に記載のジンクフィンガータンパク質と機能ドメインとを含む融合タンパク質。
(項目３)
前記機能ドメインが、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、及びヌクレアーゼドメインである、項目２に記載の融合タンパク質。
(項目４)
項目１〜３のいずれかに記載の１つ以上のジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(項目５)
項目４に記載のポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクター。
(項目６)
項目１〜３のいずれかに記載の１つ以上のジンクフィンガータンパク質、項目４に記載のポリヌクレオチド、及び／または項目５に記載のＡＡＶベクターを含む宿主細胞。
(項目７)
項目４に記載の１つ以上のポリヌクレオチド、及び／または項目５に記載の１つ以上のＡＡＶベクターを含む医薬組成物。
(項目８)
細胞におけるＨｔｔ遺伝子の発現を改変する方法であって、項目４に記載の１つ以上のポリヌクレオチド、項目５に記載の１つ以上のＡＡＶベクター、及び／または項目７に記載の１つ以上の医薬組成物を前記細胞に投与することを含む、前記方法。
(項目９)
前記Ｈｔｔ遺伝子が少なくとも野生型及び／または１つの変異型アレルを含む、項目８に記載の方法。
(項目１０)
前記融合タンパク質が抑制ドメインを含み、かつ前記Ｈｔｔ遺伝子の発現が抑制される、項目８または項目９のいずれかに記載の方法。
(項目１１)
前記細胞が神経細胞である、項目８〜１０のいずれかに記載の方法。
(項目１２)
前記神経細胞が脳内のものである、項目１１に記載の方法。
(項目１３)
前記神経細胞が前記脳の線条体内のものである、項目１２に記載の方法。
(項目１４)
ハンチントン病の治療及び／または予防を必要とする対象に行う方法であって、項目４に記載の１つ以上のポリヌクレオチド、項目５に記載の１つ以上のＡＡＶベクター、及び／または項目７に記載の１つ以上の医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む、前記方法。

Claims (6)

  1. 変異型Ｈｔｔ遺伝子に結合する非天然型ジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ−ＴＦ）であって、前記ジンクフィンガータンパク質がＦ１〜Ｆ５に指示される５つのジンクフィンガードメインを含み、前記ジンクフィンガードメインが、以下の表の単一の行に示される認識ヘリックス領域配列を含み、
    Figure 0006853257

    前記ジンクフィンガータンパク質転写因子が転写抑制ドメインを含む、ジンクフィンガータンパク質転写因子。
  2. 請求項１に記載の１つ以上のジンクフィンガータンパク質転写因子をコードするポリヌクレオチド。
  3. 請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクター。
  4. 請求項１に記載の１つ以上のジンクフィンガータンパク質転写因子を含む宿主細胞。
  5. 請求項２に記載の１つ以上のポリヌクレオチド、及び／または請求項３に記載の１つ以上のＡＡＶベクターを含む医薬組成物。
  6. それを必要とする対象におけるハンチントン病（ＨＤ）の治療及び／または予防のための、請求項５に記載の組成物。
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