RS67023B1 - Kristalni oblik inhibitora jak i njegova primena - Google Patents

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na kristalni oblik kao inhibitor JAK i njegovu primenu u pripremi lekova za lečenje bolesti povezanih sa JAK1 ili/i TYK2.

STANJE TEHNIKE

[0002] JAK kinaza je familija intracelularnih nereceptorskih tirozin kinaza sa četiri člana: JAK1, JAK2, JAK3 i TYK2 (Robert Roskoski Jr. (2016)). JAK1, JAK2 i TYK2 se eksprimiraju u ćelijama humanog tkiva. JAK3 se uglavnom eksprimira u ćelijama hematopoetskog tkiva, prvenstveno u ćelijama koštane srži, timocitima, NK ćelijama, aktiviranim B limfocitima i T limfocitima. Iz analize funkcionalno stečene ekspresije ili mutacije, JAK1 i JAK3 su više povezani sa imunološkom regulacijom, dok je JAK2 direktno povezan sa stvaranjem crvenih krvnih zrnaca i trombocita. Iz analize funkcionalne deficijencije, funkcionalna deficijencija JAK1 i JAK2 će izazvati smrt mišjih embriona. Bolesti povezane sa funkcionalnom deficijencijom JAK1 i JAK2 se ne nalaze u ljudskom telu, što indirektno ukazuje na važnost fizioloških funkcija JAK1 i JAK2. Funkcionalna deficijencija JAK3 može izazvati tešku sveobuhvatnu imunodeficijenciju. Postoji malo studija o funkciji TYK2, za koji je objavljeno da izaziva defekte povezane sa intrinzičkim imunitetom (James D. Clark, (2014)).

[0003] Nishodno od JAK nalazi se familija aktivatora signalne transdukcije i transkripcije (STAT). JAK-STAT put prenosi ekstracelularne signale iz različitih citokina, faktora rasta i hormona do jedra i odgovoran je za ekspresiju hiljada gena koji kodiraju proteine. Kada se citokini vezuju za svoje receptore, članovi JAK porodice se samofosforilišu i/ili transfosforilišu jedni sa drugima, zatim se STAT-fosforilišu, a zatim migriraju do jedra da bi regulisali transkripciju. JAK-STAT intracelularna signalna transdukcija je primenljiva na interferon, većinu interleukina i različite citokine i endokrine faktore, kao što su EPO, TPO, GH, OSM, LIF, CNTF, GM CSF i PRL (Vainchenker W. et al. (2008)). Različiti članovi JAK porodice selektivno se vezuju za različite citokinske receptore kako bi dali specifičnost signalne transdukcije, tako da igraju različite fiziološke uloge. Ovaj selektivni način delovanja čini inhibitore JAK sposobnim da se primene u lečenju bolesti na relativno specifičan način. IL-2 ili IL-4 receptori, zajedno sa zajedničkim γ lancem, vezuju se za JAK1 i JAK3, a receptor tipa I koji ima istu strukturu β vezuje se za JAK2. Receptori tipa I koji koriste gp130 (glikoprotein 130) i receptori tipa I aktivirani heterodimernim citokinima preferencijalno se vezuju za JAK1/2 i TYK2, i receptori tipa I aktivirani hormonskim citokinima vezuju se za i aktiviraju JAK2 kinazu. Receptori tipa II interferona vezuju se za JAK1 i TYK2, dok se receptori porodice citokina IL-10 vezuju za JAK1/2 i TYK2. Različita specifična vezivanja gore navedenih citokina i njihovih receptora za članove porodice JAK služe različitim fiziološkim funkcijama, čime se pruža mogućnost za lečenje različitih bolesti.

[0004] JAK-STAT signalni put je uključen u mnoge važne biološke procese, kao što su ćelijska proliferacija, diferencijacija, apoptoza i imunološka regulacija. Postojeći klinički podaci pokazuju da će inhibicija JAK2 tokom dužeg vremena inhibirati citokine kao što su G-CSF, TPO i EPO, što utiče na proliferaciju i diferencijaciju hematopoetskih matičnih ćelija. Inhibicija JAK3 će smanjiti broj NK ćelija i povećati verovatnoću infekcije. Stoga, inhibitor JAK može uticati na broj i funkciju leukocita, eritrocita i limfocita u različitom stepenu. Međutim, selektivni inhibitori JAK1 ili/i TYK2 sa uskim spektrom delovanja na citokine mogu teorijski održati efikasnost i poboljšati bezbednost (Daniella M. Schwartz, et al. (2017)).

[0005] US16/220,688 otkriva filgotinib, lek kompanije Galapagos u kliničkoj fazi III za lečenje reumatoidnog artritisa,

KRATAK OPIS

[0006] Predmetni pronalazak obezbeđuje kristalni oblik A jedinjenja formule (I), sa karakterističnim difrakcionim pikovima prikazanim u spektru rendgenske difrakcije praha (XRPD) pod sledećim uglom 2θ: 6.91 ± 0.20°, 12.21 ± 0.20° i 19.06 ± 0.20°.

[0007] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, karakteristični difrakcioni pikovi su prisutni u spektru rendgenske difrakcije praha gore navedenog kristalnog oblika A pod sledećim 2θ uglovima: 6.91 ± 0.20°, 12.21 ± 0.20°, 13.69 ± 0.20°, 19.06 ± 0.20°, 19.86 ± 0.20°, 20.59 ± 0.20°, 22.06 ± 0.20° i 27.52 ± 0.20°.

[0008] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, karakteristični difrakcioni pikovi su prisutni u spektru rendgenske difrakcije praha gore navedenog kristalnog oblika A pod sledećim 2θ uglovima: 6.91±0.20°, 10.34±0.20°, 12.21±0.20°, 13.69±0.20°, 18.11±0.20°, 19.06±0.20°, 19.86± 0.20°, 20.59±0.20°, 22.06±0.20° i 27.52±0.20°.

[0009] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, karakteristični difrakcioni pikovi su prisutni u spektru rendgenske difrakcije praha gore navedenog kristalnog oblika A pod sledećim 2θ uglovima: 6.91 ± 0.20°, 10.34 ± 0.20°, 12.21 ± 0.20°, 13.69 ± 0.20°, 17.44 ± 0.20°, 18.11 ± 0.20°, 19.06 ± 0.20°, 19.86 ± 0.20°, 20.59 ± 0.20°, 22.06 ± 0.20°, 24.46 ± 0.20° i 27.52 ± 0.20°.

[0010] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, gore navedeni kristalni oblik A ima spektar XRPD prikazan na slici 1.

[0011] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, podaci XRPD spektralne analize gore navedenog kristalnog oblika A prikazani su u Tabeli 1.

Tabela 1: Analitički podaci spektra XRPD kristalnog oblika A jedinjenja formule (I).

[0012] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, gore navedeni kristalni oblik A ima vrednost endotermnog pika, respektivno, na 152.19± 3°C i 216.79 ± 3°C na krivoj diferencijalne skenirajuće kalorimetrije; i vrednost egzotermnog pika na 161.50 ± 3°C.

[0013] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, gornji kristalni oblik A ima DSC spektar prikazan na Sl.2.

[0014] Predmetni pronalazak obezbeđuje kristalni oblik B jedinjenja formule (I), sa karakterističnim difrakcionim pikovima u spektru rendgenske difrakcije praha pod sledećim 2θ uglovima: 5.13 ± 0.20°, 19.14 ± 0.20° i 21.18 ± 0.20°.

[0015] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, karakteristični difrakcioni pikovi su prisutni u spektru rendgenske difrakcije praha gore navedenog kristalnog oblika B pod sledećim 2θ uglovima: 5.13 ± 0.20°, 7.34 ± 0.20°, 10.14 ± 0.20°, 10.56 ± 0.20°, 11.72 ± 0.20°, 16.67 ± 0.20°, 19.14 ± 0.20° i 21.18 ± 0.20°.

[0016] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, karakteristični difrakcioni pikovi su prisutni u spektru rendgenske difrakcije praha gore navedenog kristalnog oblika B pod sledećim 2θ uglovima: 5.13 ± 0.20°, 7.34 ± 0.20°, 10.14 ± 0.20°, 10.56 ± 0.20°, 11.72 ± 0.20°, 16.67 ± 0.20°, 19.14 ± 0.20°, 21.18 ± 0.20° i 21.78 ± 0.20°.

[0017] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, gore navedeni kristalni oblik B ima spektar XRPD prikazan na slici 3.

[0018] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, podaci XRPD spektralne analize gore navedenog kristalnog oblika B prikazani su u Tabeli 2.

Tabela 2: Analitički podaci spektra XRPD kristalnog oblika B jedinjenja formule (I)

[0019] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, gore navedeni kristalni oblik B ima vrednost endotermnog pika, respektivno, na 193.99 ±3°C i 216.93 ±3°C na krivoj diferencijalne skenirajuće kalorimetrije; i egzotermnu vrednost pika na 200.10 ± 3°C.

[0020] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, gore navedeni kristalni oblik B ima DSC spektar prikazan na slici 4.

[0021] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, gore navedeni kristalni oblik B pokazuje gubitak težine do 0.535% na krivoj termogravimetrijske analize (TGA) na 120 ± 3°C.

[0022] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, gore navedeni kristalni oblik B ima TGA spektar prikazan na slici 5.

[0023] Predmetni pronalazak obezbeđuje kristalni oblik C jedinjenja formule (I), sa karakterističnim difrakcionim pikovima u spektru rendgenske difrakcije praha pod sledećim 2θ uglovima: 8.92 ± 0.20°, 18.66 ± 0.20° i 20.26 ± 0.20°.

[0024] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, karakteristični difrakcioni pikovi su prisutni u spektru rendgenske difrakcije praha gore navedenog kristalnog oblika C pod sledećim 2θ uglovima: 5.76 ± 0.20°, 8.92 ± 0.20°, 11.50 ± 0.20°, 16.35 ± 0.20°, 18.66 ± 0.20°, 19.17 ± 0.20°, 20.26 ± 0.20° i 24.79 ± 0.20°.

[0025] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, gore navedeni kristalni oblik C ima spektar XRPD prikazan na slici 6.

[0026] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, podaci XRPD spektralne analize gore navedenog kristalnog oblika C prikazani su u Tabeli 3.

Tabela 3: Analitički podaci spektra XRPD kristalnog oblika C jedinjenja formule (I).

[0027] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, gore navedeni kristalni oblik C ima početnu tačku endotermnog pika na 215.48°C na krivoj diferencijalne skenirajuće kalorimetrije.

[0028] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, gore navedeni kristalni oblik C ima DSC spektar prikazan na slici 7.

[0029] Predmetni pronalazak obezbeđuje kristalni oblik D jedinjenja formule (I), sa karakterističnim difrakcionim pikovima u spektru rendgenske difrakcije praha pod sledećim 2θ uglovima: 7.12 ± 0.20°, 20.54 ± 0.20° i 21.42 ± 0.20°.

[0030] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, karakteristični difrakcioni pikovi su prisutni u spektru rendgenske difrakcije praha gore navedenog kristalnog oblika D pod sledećim 2θ uglovima: 7.12 ± 0.20°, 12.45 ± 0.20°, 14.64 ± 0.20°, 18.31 ± 0.20°, 20.54 ± 0.20°, 21.42 ± 0.20° i 28.72 ± 0.20°.

[0031] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, karakteristični difrakcioni pikovi su prisutni u spektru rendgenske difrakcije praha gore navedenog kristalnog oblika D pod sledećim 2θ uglovima: 7.12 ± 0.20°, 10.28 ± 0.20°, 12.45 ± 0.20°, 14.64 ± 0.20°, 17.50 ± 0.20°, 18.31 ± 0.20°, 20.54 ± 0.20°, 21.42 ± 0.20° i 28.72 ± 0.20°.

[0032] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, gore navedeni kristalni oblik D ima spektar XRPD prikazan na slici 8.

[0033] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, podaci XRPD spektralne analize gore navedenog kristalnog oblika D prikazani su u Tabeli 4.

Tabela 4: Analitički podaci spektra XRPD kristalnog oblika D jedinjenja formule (I)

[0034] Pronalazak dalje pruža gore navedene kristalne oblike A, B, C i D za upotrebu u lečenju bolesti povezanih sa JAK1 i/ili TYK2.

[0035] U nekim primerima izvođenja pronalaska, gore navedeni kristalni oblici A, B, C i D su za upotrebu u lečenju reumatoidnog artritisa.

Tehnički efekat

[0036] Jedinjenje formule (I) prema ovom pronalasku ima dobar efekat leka in vivo, i njegovi kristalni oblici su stabilni i manje pod uticajem svetlosti, toplote i vlage, i imaju visoku rastvorljivost, što mu daje široke perspektive kao lek.

Definicija i opis

[0037] Osim ako nije drugačije naznačeno, sledeći termini i izrazi koji se ovde koriste imaju sledeća značenja. Određeni izraz ili termin ne treba smatrati neizvesnim ili nejasnim bez posebne definicije, već treba da se tumače u skladu sa uobičajenim značenjem. Kada se ovde pojavljuje trgovačko ime, namera je da se odnosi na odgovarajući proizvod ili njegove aktivne sastojke.

[0038] Intermedijerno jedinjenje pronalaska može se pripremiti različitim postupcima sinteze dobro poznatim stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući specifične primere izvođenja navedene u nastavku, primere izvođenja nastale njegovom kombinacijom sa drugim postupcima hemijske sinteze i ekvivalentnim postupcima zamene dobro poznatim stručnjacima u ovoj oblasti. Poželjni primeri izvođenja uključuju, ali nisu ograničeni na, primere izvođenja ovog pronalaska.

[0039] Hemijska reakcija specifičnih primera izvođenja ovog pronalaska se završava u odgovarajućem rastvaraču, koji je pogodan za hemijske promene pronalaska i potrebne reagense i materijale. Da bi se dobila jedinjenja ovog pronalaska, ponekad je neophodno da stručnjaci u ovoj oblasti modifikuju ili odaberu korak sinteze ili postupak reakcije na osnovu postojećih primera izvođenja.

[0040] Predmetni pronalazak će biti opisan u vezi sa primerima koji, međutim, neće nametnuti nikakvo ograničenje za predmetni pronalazak.

[0041] Svi rastvarači korišćeni u pronalasku su komercijalno dostupni i mogu se koristiti bez potrebe za daljim prečišćavanjem.

[0042] Rastvarač koji se koristi u ovom pronalasku može biti komercijalno dostupan. U ovom pronalasku se koriste sledeće skraćenice: DCM predstavlja dihlorometan; DMF predstavlja N,N-dimetilformamid; DMSO predstavlja dimetil sulfoksid; EtOH predstavlja etanol; MeOH predstavlja metanol; TFA predstavlja trifluorosirćetnu kiselinu; TsOH predstavlja ptoluensulfonsku kiselinu; mp predstavlja tačku topljenja; EtSO3H predstavlja etansulfonsku kiselinu; MeSO3H predstavlja metansulfonsku kiselinu; ATP predstavlja adenozin trifosfat; HEPES predstavlja 4-hidroksietil piperazin etansulfonsku kiselinu; EGTA predstavlja etilen glikol bis(2-aminoetil etar) tetrasirćetnu kiselinu; MgCl2predstavlja magnezijum dihlorid; MnCl2predstavlja mangan dihlorid; DTT predstavlja ditiotreitol; DCC predstavlja dicikloheksilkarbodiimid; DMAP predstavlja 4-dimetilaminopiridin; EA predstavlja etil acetat; LiHMDS predstavlja heksametildisilicilaminolitijum; Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2predstavlja dihlorometanski kompleks [1,1'-bis(difenilfosfino)ferocen]paladijum dihlorida; EDCI predstavlja 1-etil-3(3-dimetilpropilamin)karbodiimid; i HOBt predstavlja 1-hidroksibenzotriazol.

Specifični postupci XRPD, DSC i TGA (uključujući model i parametre opreme)

Postupak rendgenske difrakcije praha (XRPD) koji se koristi u ovom pronalasku

[0043] Za XRPD detekciju se koristi oko 10-20 mg uzorka.

[0044] Detaljni XRPD parametri su sledeći:

Svetlosna cev: Cu, Cu: K-Alfa (λ= 1.54179Å).

Napon svetlosne cevi: 40 kV, struja svetlosne cevi: 40 mA

Divergentni prorez: 0.60 mm

Prorez detektora: 10.50 mm

Prorez protiv rasejanja: 7.10 mm

Opseg skeniranja: 3-40 stepeni

Brzina skeniranja: 10 stepeni/min

Brzina diska za uzorak: 15 rpm/0 rpm

Postupak diferencijalnog kalorimetrijskog skenera (DSC) koji se koristi u predmetnoj prijavi

[0045] Uzorak (0.5-1 mg) se stavlja u aluminijumsku posudu za DSC test. Pod uslovom od 50 ml/min N2, uzorak se zagreva od 30°C do 250°C brzinom zagrevanja od 10°C/min.

Postupak termogravimetrijskog analizatora (TGA) koji se koristi u ovoj prijavi

1

[0046] Uzorak (2-5 mg) se stavlja u platinasti lonac TGA za ispitivanje. Pod uslovom od 25 ml/min N2, uzorak se zagreva sa sobne temperature do 300°C ili zagreva do gubitka težine od 20% brzinom zagrevanja od 10°C/min.

Postupak analize tečnom hromatografijom (HPLC) koja se koristi u ovoj prijavi

HPLC postupak za ispitivanje i analizu sadržaja

[0047]

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0048]

Slika 1: spektar XRPD kristalnog oblika A.

Slika 2: spektar DSC kristalnog oblika A.

Slika 3: XRPD obrazac kristalnog oblika B.

Slika 4: spektar DSC kristalnog oblika B.

Slika 5: spektar TGA kristalnog oblika B.

Slika 6: XRPD obrazac kristalnog oblika C.

Slika 7: spektar DSC kristalnog oblika C.

Slika 8: spektar XRPD kristalnog oblika D.

DETALJAN OPIS

[0049] Radi boljeg razumevanja sadržaja ovog pronalaska, sledeće će biti dalje opisano u kombinaciji sa konkretnim primerima, međutim, konkretni primeri izvođenja nisu namenjeni da nametnu bilo kakvo ograničenje obima ovog pronalaska.

Primer 1: priprema jedinjenja formule (I).

[0050]

[0051] Korak 1: LiHMDS (1 M, 51.2 mL) je dodat u rastvor THF (150 ml) koji sadrži jedinjenje 1-1 (10.2 g, 42.6 mmol) na -78°C. Nakon što je reakcioni rastvor mešan na -78°C tokom 1 sata, rastvor 1,1,1-trifluoro-N-fenil-N-(trifluorometilsulfonil) metansulfonamida (16.7 g, 46.9 mmol) u THF (150 ml) je dodat u reakcioni rastvor, a zatim je smeša mešana na 15°C tokom 12 sati. Reakcija je ugašena sa 250 ml zasićenog amonijum hlorida, razblažena sa 200 ml vode, a zatim ekstrahovana etil acetatom (200 ml * 3). Organske faze su spojene, isprane zasićenom slanom vodom, osušene natrijum sulfatom, filtrirane i koncentrovane da bi se dobila jedinjenja.

1-2. Sirovi proizvod je direktno korišćen za sledeću reakciju bez prečišćavanja.

[0052]<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.63 (br s, 1H) ,3.50-3.65 (m, 4H), 2.34 (br s, 4H), 1.88 (br t, J=5.90 Hz, 2H), 1.37 (s, 9H).

[0053] Korak 2: kalijum acetat (12.7 g, 129.3 mmol) i Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2(3.5 g, 4.3 mmol) su dodati u rastvor DMF (100 ml) rastvoren sa jedinjenjem 1-2 (16 g, 43.1 mmol) i pinakol boratom (12.0 g, 47.4 mmol), zamenjen je azotom 3 puta i mešan na 70°C u atmosferi azota tokom 3 sata. Reakcioni rastvor je dispergovan u smeši od 300 ml vode i 400 ml etil acetata. Organska faza je odvojena, isprana zasićenom slanom vodom, osušena natrijum sulfatom, filtrirana i koncentrovana da bi se dobio sirovi proizvod. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na silika gelu da bi se dobilo jedinjenje 1-3.

[0054]<1>H NMR (400MHz, CDCl3) δ 6.46 (br s, 1H), 3.71 - 3.53 (m, 4H), 2.31 (br d, J=3.0 Hz, 2H), 2.24 - 2.16 (m, 2H), 1.74 (t, J=6.3 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.26 (s, 12H).

[0055] Korak 3: u atmosferi azota, kalijum karbonat (3.8 g, 27.3 mmol) i Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2(744 mg, 911.0 µmol) su dodati u rastvor dioksana (60 ml) i vode (15 ml) koji sadrži jedinjenje 1-3 (3.5 g, 10.0 mmol) i N-(5-bromo-[1,2,4] triazolo[1,5-a]piridin-2-il) ciklopropan formamid (2.6 g, 9.1 mmol). Reakcioni rastvor je mešan na 90°C tokom 3 sata. Reakcioni rastvor je koncentrovan, a dobijeni sirovi proizvod je odvojen i prečišćen hromatografijom na koloni da bi se dobilo jedinjenje 1-4. LCMS (ESI) m/z: 424.3 [M H]<+>.

[0056] Korak 4: hlorovodonična kiselina/etil acetat (4 M, 30 ml) su dodati u rastvor dihlorometana (10 ml) rastvoren jedinjenjima 1-4 (3.5 g, 8.2 mmol), i reakcioni rastvor je mešan na 25°C tokom 0.5 sati. Čvrsta supstanca je istaložena, filtrirana i osušena da bi se dobilo jedinjenje 1-5 (3.3 g hidrohlorida, sirovi proizvod), koji je direktno korišćen u sledećoj reakciji bez prečišćavanja.

[0057] LCMS (ESI) m/z: 324.1 [M H]<+>.

[0058] Korak 5: Pd/C (1 g, 10%) je dodat u rastvor metanola (100 ml) rastvoren jedinjenjem 1-5 (3.0 g, 8.34 mmol, hidrohlorid) u atmosferi azota. Zamenjen je vodonikom tri puta, a zatim je mešan na 30°C u atmosferi vodonika (0.2068427 MPa (30 psi)) tokom 12 sati. Reakcioni rastvor je filtriran i koncentrovan da bi se dobilo jedinjenje 1-6 (3 g hidrohlorida, sirovi proizvod), koji je direktno korišćen u sledećoj reakciji bez prečišćavanja.

[0059] LCMS (ESI) m/z: 326.2 [M H]+.

[0060] Korak 6: jedinjenje 1-6 (0.87 g, 2.40 mmol, hidrohlorid) je rastvoren u N,N-dimetilformamidu (10 ml), dodati su HOBt (487 mg, 3.6 mmol) i EDCI (691 mg, 3.6 mmol), a zatim su u rastvor dodati (1S)-2,2-difluorociklopropil mravlja kiselina (323 mg, 2.6 mmol) i

1

diizopropil etilamin (621 mg, 4.8 mmol). Reakcioni rastvor je mešan na 15°C tokom 12 sati. Zatim je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak, koji je podvrgnut preparativnoj HPLC (neutralni sistem) da bi se dobilo jedinjenje formule (I).

[0061]<1>H NMR (400MHz, CD3OD) δ 7.32-7.73 (m, 2H), 6.95 (br s, 1H), 3.62-4.22 (m, 4H), 3.45 (br s, 1H), 3.18-3.37 (m, 1H), 2.61 (br s, 1H), 1.45-2.27 (m, 10H), 0.78-1.17 (m, 4H). LCMS (ESI) m/z: 430.0[M H]<+>.

Primer 2: Postupak pripreme pojedinačnih kristalnih oblika

[0062] 50 mg jedinjenja formule (I) je stavljeno u staklenu bočicu od 2.0 ml, i dodato je 0.4 ml smeše metanola i vode (odnos zapremine 1:1) da bi se dobila suspenzija. Suspenzija je dodata magnetonima i mešana na zagrejanoj magnetnoj mešalici (40°C). Posle mešanja tokom 100 sati, suspendovani uzorci su centrifugirani i stavljeni u vakuumsku sušionicu na 35°C preko noći. Utvrđeno je da je osušeni uzorak kristalni oblik A jedinjenja formule (I) pomoću XRPD (kao što je prikazano na Sl.1) i DSC (kao što je prikazano na Sl.2) istovremeno.

[0063] Oko 50 mg jedinjenja formule (I) je dodato u staklenu bočicu od 2.0 ml i dodato je 0.4 ml etil acetata. Nakon dodavanja magnetona, gore navedeni uzorak je mešan na zagrejanoj magnetnoj mešalici (40°C). Nakon mešanja tokom 100 sati, suspendovani uzorak je centrifugiran i stavljen u vakuumsku sušionicu na 35°C preko noći. Utvrđeno je da je osušeni uzorak kristalni oblik B jedinjenja formule (I) pomoću XRPD (kao što je prikazano na Sl.3) i DSC (kao što je prikazano na Sl.4) i TGA (kao što je prikazano na Sl.5) istovremeno.

[0064] Kristalni oblik A jedinjenja formule (I) je zagrejan na 170°C, i kristalni oblik A je promenjen u novi kristalni oblik, odnosno kristalni oblik C jedinjenja formule (I), što je potvrđeno pomoću XRPD (kao što je prikazano na Sl.6) i DSC (kao što je prikazano na Sl.7) istovremeno.

[0065] Oko 50 mg jedinjenja formule (I) dodato je u staklenu bočicu od 2.0 ml, a zatim je dodato 0.4 ml smeše etanola i vode (odnos zapremine 1:1) da bi se dobila suspenzija. Suspenzija je dodata magnetonima i mešana na zagrejanoj magnetnoj mešalici (40°C). Nakon mešanja tokom 100 sati, suspendovani uzorak je centrifugiran i stavljen u vakuumsku sušionicu na 35°C preko noći. Utvrđeno je da je osušeni uzorak kristalni oblik D jedinjenja formule (I) pomoću XRPD (kao što je prikazano na slici 8).

Primer 3: Studija o čvrstoj stabilnosti kristalnog oblika B jedinjenja formule (I)

[0066] Oko 5 mg kristalnog oblika B je stavljeno u suvu i čistu staklenu bocu, rašireno u tankom sloju, koji je služio kao formalni test uzorak. Stavljen je pod uslove testiranja uticajnih faktora (60°C, 92.5% relativne vlažnosti) i uslove ubrzanja (40°C/75% relativne vlažnosti i 60°C/75% relativne vlažnosti). Uzorci su bili potpuno izloženi, prekriveni aluminijumskom folijom i probušeni malim rupama. Uzorci su sakupljeni i analizirani nakon 5 i 10 dana. Uzorci stavljeni pod svetlost (vidljiva svetlost 1200000 luksa, UV 200 W) bili su potpuno izloženi na sobnoj temperaturi.

[0067] Eksperimentalni rezultati su pokazali da se kristalni oblik ne menja pod uslovima uticajnih faktora (visoka temperatura -60°C, visoka vlažnost -92.5% relativne vlažnosti, svetlost) i ubrzanja (40°C/75% relativne vlažnosti i 60°C/75% relativne vlažnosti).

Primer 4: Studija rastvorljivosti kristalnog oblika B jedinjenja formule (I) u biološkoj sredini

1. Eksperiment biološke rastvorljivosti kristalnog oblika B

[0068] Oko 2 mg uzorka kristalnog oblika B dodato je u bočicu za uzorke, a zatim je dodato 1.0 ml različitih rastvarača [čista voda, SGF (simulirani želudačni sok), FaSSIF (simulirani crevni sok u stanju gladovanja), FeSSIF (simulirani crevni sok u stanju jela)] i promućkano, respektivno. Bočica je mućkana na oscilatoru konstantne temperature na 37°C. Nakon mućkanja tokom 24 sata, centrifugirana je, a dobijeni supernatant je testiran na rastvorljivost. Nakon što je supernatant razblažen (razblaživač ACN/H2O (1/1)) određeni broj puta (zbog niske rastvorljivosti jedinjenja, supernatant je razblažen dva puta, osim za SGF, koji je razblažen 10 puta), koncentracija je određena pomoću HPLC.

2 Priprema razblaživača i mobilne faze

[0069] Razblaživač: acetonitril:voda=1:1. Mobilna faza A: 0.1% vodeni rastvor TFA, na primer: 1 ml TFA je prebačen u 1 L čiste vode, ravnomerno pomešan i degaziran ultrazvukom. Mobilna faza B: 100% acetonitril.

3 Priprema referentne supstance i rastvora uzorka

1

[0070] Priprema STD rastvora: Kristalni oblik B je korišćen kao referentna supstanca. Oko 5 mg referentne supstance je dodato u staklenu bocu, rastvoreno sa 10 ml razblaživača i potpuno rastvoreno ultrazvukom tokom oko 10 minuta, zatim ohlađeno na sobnu temperaturu i promućkano. Pripremljena su dva paralelna dela i odgovarajuće označena kao STD1 i STD2. Odgovarajući STD1 je razblažen razblaživačem 10, 100, 1000 i 2000 puta i testiran standardnom krivom.

[0071] Priprema rastvora uzorka: nakon što je supernatant razblažen (razblaživač ACN/H2O (1/1)) određeni broj puta (rastvorljivost jedinjenja je mala, supernatant je razblažen dva puta osim SGF, i SGF je razblažen 10 puta), dobro promućkan, stavljen u bočicu tečne faze od 1.5 ml za testiranje, a koncentracija je određena pomoću HPLC.

4. Rezultati rastvorljivosti u biološkim medijumima

[0072]

Tabela 5 Rezultati rastvorljivosti u biološkom medijumu kristalnog oblika B

[0073] Eksperimentalni zaključak: kristalni oblik B ima dobru rastvorljivost u simuliranim biološkim medijima, što je pogodno za postizanje dobre bioraspoloživosti in vivo.

Test biološke aktivnosti

Eksperimentalni primer 1: in vitro test aktivnosti JAK1, JAK2, JAK3 i TYK2 kinaza

Eksperimentalni materijali

[0074] Rekombinantnu humanu JAK1, JAK2, JAK3, TYK2 proteazu, glavne instrumente i reagense obezbedila je kompanija Eurofins u Ujedinjenom Kraljevstvu.

Eksperimentalni postupak

1

[0075] Razblaživanje JAK2, JAK3 i TYK2: 20 mM 3-(N-morfolin) propansulfonska kiselina (MOPS), 1 mM EDTA, 0.01% Brij-35.5% glicerol, 0.1% β-merkaptoetanol, 1 mg/ml BSA; Razblaživanje JAK1: 20 mM TRIS, 0.2 mM EDTA, 0.1% β-merkaptoetanol, 0.01% Brij-35.5% glicerol. Sva jedinjenja su pripremljena u 100% DMSO rastvoru i dostigla su 50 puta veću konačnu određenu koncentraciju. Testirano jedinjenje je razblaženo trostrukim gradijentom koncentracije, sa konačnom koncentracijom od 10 µM do 0.001 µM, ukupno 9 koncentracija. Sadržaj DMSO u reakciji detekcije bio je 2%. Radni osnovni rastvor testiranog jedinjenja je dodat u otvor za određivanje kao prva komponenta reakcije, a zatim su preostale komponente dodate prema šemi detaljno opisanoj u postupku određivanja u nastavku.

Enzimska reakcija JAK1 (H)

[0076] JAK1 (h), zajedno sa 20 mM Tris/HCl, pH75, 0.2 mM EDTA, 500 µM MGEEPLYWSFPAKKK, 10 mM magnezijum acetata i [γ-<33>P]-ATP (čija je aktivnost i koncentracija prilagođena po potrebi) inkubirani su zajedno. Dodata je smeša Mg/ATP da bi se započela reakcija. Nakon inkubacije na sobnoj temperaturi tokom 40 minuta, dodato je 0.5% fosforne kiseline da bi se reakcija prekinula. Zatim je 10 µL reaktanta nakapano na P30 filtersku podlogu, isprano tri puta sa 0.425% fosforne kiseline, a zatim jednom metanolom u roku od 4 minuta, osušeno i brojano scintilacijom.

Enzimska reakcija JAK2 (h)

[0077] JAK2(h) je inkubiran zajedno sa 8 mM MOPS, pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 100 µM KTFCGTPEYLAPEVRREPRILSEEEQEMFRDFDYIADWC, 10 mM magnezijum acetata i [γ-<33>P]-ATP (čija je aktivnost i koncentracija prilagođena po potrebi). Dodata je smeša Mg/ATP da bi se započela reakcija. Posle inkubacije na sobnoj temperaturi tokom 40 minuta, dodato je 0.5% fosforne kiseline da bi se reakcija prekinula. Zatim je 10 µL reaktanta nakapano na P30 filtersku podlogu, isprano tri puta sa 0.425% fosforne kiseline, a zatim jednom metanolom u roku od 4 minuta, osušeno i brojano scintilacijom.

JAK3 (h) enzimska reakcija

[0078] JAK3 (h) je inkubiran zajedno sa 8 mM MOPS, pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 500 µM GGEEEEYFELVKKKK, 10 mM magnezijum acetata i [γ-<33>P]-ATP (čija je aktivnost i

1

koncentracija prilagođena po potrebi). Dodata je smeša Mg/ATP da bi se započela reakcija. Posle inkubacije na sobnoj temperaturi tokom 40 minuta, dodato je 0.5% fosforne kiseline da bi se reakcija prekinula. Zatim je 10 µL reaktanta nakapano na P30 filtersku podlogu, isprano tri puta sa 0.425% fosforne kiseline, a zatim jednom metanolom u roku od 4 minuta, osušeno i brojano scintilacijom.

Enzimska reakcija TYK2 (h)

[0079] TYK2 (h) je inkubiran zajedno sa 8 mM MOPS, pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 250 µM GGMEDIYFEFMGGKKK, 10 mM magnezijum acetata i [γ-<33>P]-ATP (čija je aktivnost i koncentracija prilagođena po potrebi). Dodata je smeša Mg/ATP da bi se započela reakcija. Posle inkubacije na sobnoj temperaturi tokom 40 minuta, dodato je 0.5% fosforne kiseline da bi se reakcija prekinula. Zatim je 10 µL reaktanta nakapano na P30 filtersku podlogu, isprano tri puta sa 0.425% fosforne kiseline, a zatim jednom metanolom u roku od 4 minuta, osušeno i brojano scintilacijom.

Analiza podataka

[0080] Rezultati IC50su dobijeni analizom XLFIT5 (formula 205) kompanije IDBS. Videti Tabelu 6 za detalje.

Tabela 6 Rezultati in vitro skrining testa jedinjenja prema ovoj prijavi

[0081] Zaključak: jedinjenje formule (I) prema ovom pronalasku pokazuje dobru selektivnu inhibiciju JAK1 i/ili TYK2 u in vitro testu aktivnosti četiri podtipa kinaze JAK1, JAK2, JAK3 i TYK2.

Eksperimentalni primer 2: farmakokinetički (PK) test

1

[0082] Bistri rastvor dobijen nakon rastvaranja testiranog jedinjenja je primenjen na mužjake miševa (C57BL/6) ili pacova (SD) (gladovanje preko noći, stari 7-8 nedelja) putem repne vene i sonde. Nakon primene testiranog jedinjenja, krv je sakupljena posebno iz mandibularne vene na 0.117, 0.333, 1, 2, 4, 7 i 24 sata u grupi sa intravenskom injekcijom (2 mg/kg) i 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 i 24 sata u grupi sa sondom (15 mg/kg), i centrifugirana da bi se dobila plazma. Koncentracija leka u krvi je određena pomoću LC-MS/MS i farmakokinetički softver WinNonlin<™>verzije 6.3 korišćen je za izračunavanje relevantnih farmakokinetičkih parametara metodom linearnog logaritamskog trapezoida bez atrioventrikularnog modela. Rezultati testa su sledeći:

Tabela 7 Rezultati farmakokinetičkog testa jedinjenja formule (I) kod miševa

[0083] Zaključak: Jedinjenje formule (I) pronalaska ima dobru oralnu bioraspoloživost i visoku izloženost kod miševa, što je pogodno za postizanje dobre efikasnosti leka in vivo.

Eksperimentalni primer 3: in vivo farmakodinamička studija artritisa indukovanog kolagenom (CIA) kod miševa

Svrha eksperimenta:

[0084] Reumatoidni artritis (RA) je vrsta česte autoimune bolesti, sa globalnom stopom incidence od oko 1%. Nastaje usled autoimune reakcije koja izaziva inflamaciju, povredu i deformaciju zglobova, a u teškim slučajevima izaziva sistemsku inflamatornu reakciju. Istraživanje i razvoj lekova za RA pomoći će u ublažavanju simptoma reumatoidnog artritisa i

1

poboljšanju kvaliteta života pacijenata. Model artritisa izazvanog kolagenom kod miševa se često koristi za procenu efikasnosti lekova u lečenju RA, a njegova patogeneza i simptomi su značajno povezani sa RA bolestima. Modelu se ubrizgava kolagen tipa II da bi se aktivirala reaktivnost B ćelija i T ćelija na koštani kolagen, a aktivirane B ćelije i T ćelije ulaze u zglob i izazivaju oštećenje zgloba, što dovodi do niza simptoma sličnih humanom reumatoidnom artritisu. Artritis izazvan kolagenom kod miševa se često koristi za procenu njegove efikasnosti u prekliničkoj evaluaciji jedinjenja kandidata za lečenje reumatoidnog artritisa lekovima.

[0085] Cilj ovog eksperimenta je ispitivanje terapeutskog dejstva jedinjenja formule (I) i referentnog jedinjenja filgotiniba na artritis izazvan kolagenom kod miševa, kako bi se obezbedile prekliničke farmakodinamičke informacije za naredne kliničke studije.

Eksperimentalni postupak:

1. Kolagen tipa II/kompletna Freund-ova ađuvansna imunizacija

[0086] Priprema sirćetne kiseline: 2N sirćetna kiselina je razblažena do 100 mM, filtrirana kroz membranski filter od 0.22 mikrona i čuvana na 4 °C.

[0087] Rastvor goveđeg kolagena tipa II: goveđi kolagen tipa II (CII) je rastvoren u rastvoru sirćetne kiseline od 100 mM i čuvan na 4 °C preko noći. Konačna koncentracija kolagena je bila 8 mg/ml.

[0088] Priprema emulzije: rastvor CII koji je čuvan preko noći pomešan je sa jednakom zapreminom kompletnog Freund-ovog ađuvansa, homogenizovan na homogenizatoru velike brzine na ledu na 30000 rpm tokom oko 60 minuta dok rastvor nije formirao stabilnu emulziju.

2. Indukcija artritisa:

[0089] Miševi su nasumično raspoređeni u različite grupe za tretman. Dan prve imunizacije je zabeležen kao dan 0, a naredni dani su označeni redosledom.

[0090] Miševi DBA/1 su anestezirani izofluranom i subkutano im je u rep (2-3 cm od korena repa) ubrizgano 50 µl pripremljene kolagenske emulzije (uključujući 200 µg CII).21. dana, ista zapremina kolagenske emulzije je ubrizgana u rep istim postupkom. Miševi u normalnoj grupi nisu imunizovani.

2

3. Primena i dizajn doze

[0091] 28. dana, kada je prosečna klinička ocena dostigla oko 1 ocenu, odabrano je 50 miševa sa umerenom incidencom i nasumično podeljeno u 5 grupa za tretman prema njihovoj težini i oceni, sa po 8 miševa u svakoj grupi.

[0092] Deksametazon (DEX), kao referentni lek za merenje da li je model uspešno uspostavljen, primenjen je u dozi od 0.3 mg/kg (doza koja se obično koristi u CIA modelu). Pored toga, prema rezultatima prethodnog eksperimenta u ranoj fazi ovog eksperimenta, određen je relevantni dizajn doze test jedinjenja i referentnog jedinjenja filgotiniba, kao što je prikazano u Tabeli 8-1: prva grupa su bili normalni miševi bez ikakvog tretmana; druga grupa je dobila kontrolna grupa koja je sadržala samo rastvarač; treća grupa je dobila deksametazon u dozi od 0.3 mg/kg; šesta i osma grupa su dobile 15 mg/kg i 15 mg/kg, respektivno. Na miševe je lek primenjen dva puta dnevno tokom 14 dana.

Tabela 8-1 Grupa i dizajn doze

4. Određivanje indeksa incidene artritisa

[0093] Kliničko posmatranje: osnovno zdravstveno stanje i promene težine DBA/1 miševa praćeni su svakog dana od 7 dana pre imunizacije do 21 dana posle imunizacije (beleženo jednom nedeljno). Posle 22. dana, zdravstveno stanje, morbiditet i promene težine miševa praćeni su svakog dana (beleženo najmanje tri puta nedeljno) do kraja eksperimenta.

[0094] Kliničko ocenjivanje: nakon pojačanog imuniteta, incidenca miševa je praćena svakog dana. Po početku bolesti (klinički simptomi artritisa), miševi su bodovani sa 0-4 poena prema različitim stepenima bolesti (crvenilo, otok, deformacija zglobova). Maksimalna ocena svakog ekstremiteta bila je 4 poena, a maksimalna ocena svake životinje bio je 16 poena. Kriterijumi ocenjivanja su prikazani u Tabeli 8-2. Ocenjivanje je vršeno najmanje tri puta nedeljno.

Tabela 8-2 Klinički kriterijumi za ocenjivanje artritisa

5. Statistička obrada

[0095] Eksperimentalni podaci su izraženi kao srednja vrednost ± standardna greška (srednja vrednost ± SEM) i površina ispod krive (AUC) je analizirana jednofaktorskom ANOVA analizom, (P < 0.05) je smatrana značajnom razlikom.

Eksperimentalni rezultati:

1. klinički skor i stopa incidence:

[0096] 28. dana posle prve imunizacije (7. dan posle druge imunizacije), miševi su počeli da razvijaju kliničke simptome artritisa. Primena je započeta 28. dana. Detaljni rezultati eksperimenta prikazani su u Tabeli 8-3: prosečna klinička ocena kontrolne grupe sa rastvaračem postepeno se povećala do 5.8, 41. dana, što ukazuje na uspešno uspostavljanje modela artritisa indukovanog kolagenom. Jedinjenje formule (I) i filgotinib u istoj dozi od 15 mg/kg mogu značajno smanjiti kliničku ocenu miševa sa artritisom na kraju eksperimenta (41. dan). Pri ovoj dozi, prosečna klinička ocena jedinjenja formule (I) i filgotiniba je smanjena do 1.5 i 5.6 (videti Tabelu 8-3 za vrednosti). Može se videti da jedinjenje formule (I) može efikasno smanjiti artritis indukovan kolagenom pri 15 mg/kg. 0.3 mg/kg deksametazona (G3 grupa) može značajno inhibirati kliničku ocenu artritisa indukovanog kolagenom. Klinička ocena je održana na oko 0.3 od 27. dana i smanjila se do 0, 31. dana (Klinička ocena je smanjena na do 0, videti Tabelu 8-3 za vrednosti).

Tabela 8-3 * Prosečna klinička ocena u ovoj prijavi

[0097] Analizom krive kliničke ocene svake životinje u svakoj grupi, izračunata je površina ispod krive (AUC), a stopa inhibicije pojedinačnih grupa za primenu u odnosu na kontrolnu grupu sa rastvaračem izračunata je preko prosečne AUC između grupa. Detaljni rezultati su prikazani u Tabeli 8-4: jedinjenje formule (I) i filgotinib mogu smanjiti kliničku ocenu AUC kod životinja sa artritisom pri istoj dozi od 15 mg/kg, a stope inhibicije su 59.9% i 18.7%, respektivno. Deksametazon takođe može značajno smanjiti klinički rezultat kod životinja sa artritisom, sa stopom inhibicije od 97.3%.

2

Tabela 8-4 * Površina ispod krive incidence

[0098] Različiti faktori lečenja takođe mogu uticati na učestalost artritisa indukovanog kolagenom. Detaljni rezultati eksperimenta prikazani su u Tabeli 8-5: stopa incidence jedinjenja formule (I) dostigla je 63%, 29. dana i održavala se do kraja eksperimenta (videti Tabelu 8-5 za specifične vrednosti). Stopa incidene grupe koja je primala filgotinib smanjila se posle prve primene, a zatim se postepeno povećavala dok nije porasla na 100% posle poslednje primene. Učestalost artritisa u kontrolnoj grupi koja je primala rastvarač dostigla je i održavala se na 100%, 34. dana posle imunizacije. Stopa incidence pozitivne kontrolne grupe sa 0.3 mg/kg deksametazona počela je da se smanjuje posle primene i pala je do 0%, 31. dana.

Tabela 8-5* Stopa incidence u predmetnoj prijavi

2. Težina

[0099] Detaljni rezultati eksperimenta prikazani su u Tabeli 8-6: u poređenju sa normalnom grupom, telesna težina miševa se smanjila posle imunološkog modeliranja. Telesna težina pojedinačnih grupa na koje je primenjena terapija smanjila se od 28. dana do 34. dana, a zatim je telesna težina počela polako da raste. Grupa koja je primala deksametazon imala je najveći gubitak težine, ali nije bilo značajne razlike u poređenju sa drugim grupama. Nije bilo značajne razlike između jedinjenja formule (I) i filgotiniba, sa u osnovi istim trendom promene telesne težine (videti Tabelu 8-6 za specifične vrednosti), što sugeriše da jedinjenje ima mali uticaj na telesnu težinu miševa.

Tabela 8-6 * Prosečna telesna težina u ovoj prijavi

[0100] Zaključak: u modelima artritisa indukovanog kolagenom (CIA) kod miševa, jedinjenje formule (I) pokazuje dobar efekat lečenja bolesti, nema značajan uticaj na telesnu težinu miševa i bolje je od filgotiniba kod miševa pri istoj dozi.

2

Eksperimentalni primer 4: in vivo farmakodinamička studija ađuvansom indukovanog artritisa (AIA) kod pacova

Svrha eksperimenta:

[0101] Model ađuvansom indukovanog artritisa (AIA) pacova jedan je od najčešće korišćenih životinjskih modela u istraživanju reumatoidnog artritisa i razvoju novih lekova. Njegova patogeneza i klinički simptomi su slični humanom reumatoidnom artritisu. U ovom modelu, injekcija Mycobacterium tuberculosis u jastučić stopala indukovala je imune ćelije i antitela sa funkcijom oštećenja kostiju i zglobova, što je izazvalo sistematski odgovor, uključujući oticanje zglobova, osteolizu, povredu sinovijalne membrane i druge simptome slične humanom reumatoidnom artritisu. Cilj ovog eksperimenta je da se proceni terapeutski efekat jedinjenja formule (I) na model ađuvansom indukovanog artritisa pacova, koristeći deksametazon i filgotinib kao referentna jedinjenja. U ovom eksperimentu postoji 8 grupa: normalna grupa, kontrolna grupa sa rastvaračem (grupa sa nosačem), grupe sa dozama jedinjenja formule (I) od 1 mg/kg dva puta dnevno, 3 mg/kg dva puta dnevno, 10 mg/kg dva puta dnevno i 30 mg/kg dva puta dnevno, grupa sa dozama deksametazona (I) pozitivne grupe sa deksametazonom od 0.3 mg/kg jednom dnevno i grupa sa referentnim jedinjenjem filgotinib od 30 mg/kg dva puta dnevno. Svim pacovima, osim normalne grupe, subkutano je injektiran Freund-ov kompletni ađuvans da bi se indukovao artritis nultog dana. Prema eksperimentalnom protokolu, grupe su podeljene prema telesnoj težini i ocenjivane 13. dana, a primena je nastavljena 14 dana. Tokom eksperimenta, prate se telesna težina, zapremina stopala (merena tri puta nedeljno posle 13. dana) i klinička ocena. Na kraju eksperimenta, sakuplja se desno zadnje stopalo pacova za bojenje hematoksilin eozinom (HE) i analizu patološke ocene.

Eksperimentalni postupak

1. Model artritisa

[0102] Priprema ađuvansa: 100 mg Mycobacterium tuberculosis H37Ra je izmereno, mleveno oko 5 minuta, dodato je 3 ml parafinskog ulja da bi se prah rastvorio i prebačeno u braon bocu za doziranje. Zatim je avan ispran dva puta sa 3 ml i 4 ml parafinskog ulja, respektivno, i dobijeni rastvor je prebačen u braon bocu za doziranje da bi se dostigla konačna koncentracija

2

od 10 mg/ml. Izvršeno je ultrazvučno drobljenje, uključujući ultrazvučnu obradu u smeši ledene vode oko 30 minuta.

2. Indukcija artritisa

[0103] Pripremljeni ađuvans je promućkan i pomešan, ekstrahovan staklenim špricem od 1 ml (igla od 20G), a zatim iglom od 25G da bi se eliminisali mehurići. Pacovi su anestezirani izofluranom. Pre imunizacije svakog pacova, špric je okrenut naopako da bi se Mycobacterium tuberculosis potpuno izmešao. Nakon anestezije, 0.1 ml ađuvansa je ubrizgano potkožno u taban levog stopala pacova.0.1 ml parafinskog ulja je ubrizgano potkožno u taban normalnog pacova. Dan za injekciju ađuvansa bio je dan 0.

3. Primena

[0104] 13. dana, sve životinje su pokazivale simptome artritisa kao što su eritem ili otok stopala. Stratifikovane su i nasumično podeljene u grupe prema oceni, zapremini stopala i težini. Videti Tabelu 9-1 za grupisanje.70 pacova je podeljeno u 7 grupa, 10 pacova u svakoj grupi i 5 pacova u normalnoj grupi. Prema Tabeli 9-1, doza svake grupe je bila sledeća. Zapremina intragastrične primene bila je 5 ml/kg. Jedinjenje je primenjivano dva puta dnevno tokom 14 dana.

Tabela 9-1 grupisanje i dizajn doze

2

4. Određivanje indeksa incidence artritisa

[0105] Težina: merena tri puta nedeljno od 13. dana do 27. dana.

[0106] Zapremina stopala: mereno jednom pre imunizacije i tri puta nedeljno od 13. dana do 27. dana.

[0107] Ocena: ocenjivan tri puta nedeljno od 13. dan do 27. dana. Prema različitim stepenima lezija (crvenilo, otok, deformacija zglobova), ocena se procenjuje prema standardu od 0-4 poena. Maksimalna ocena svakog ekstremiteta je 4 poena, a maksimalna ocena svake životinje je 12 poena (osim za levi zadnji ekstremitet na strani injekcije). Kriterijumi za ocenjivanje su prikazani u Tabeli 9-2.

Tabela 9-2 Klinički kriterijumi za ocenjivanje artritisa

2

5. Patološka analiza

[0108] 27. dana, pacovi su eutanazirani. Posle uzimanja krvi, uzeto je desno zadnje stopalo pacova, natopljeno u 10% rastvor formalina, dekalcifikovano rastvorom mravlje kiseline, ukalupljeno u parafin, disekovano, obojeno sa HE i posmatrano pod mikroskopom. Stepen oštećenja zgloba procenjen je sa četiri aspekta: infiltracija inflamatornih ćelija, formiranje panusa, oštećenje hrskavice i resorpcija kostiju, i ocenjivan je prema standardu od 0 do 4. Kriterijumi za ocenjivanje su sledeći (tabela 9-3):

Tabela 9-3 Kriterijumi za ocenjivanje patologije artritisa

2

6. Statistička obrada

[0109] Eksperimentalni podaci su izraženi srednjom vrednošću ± standardna greška (srednja vrednost ± SEM), i težina, klinička ocena i patološka ocena su analizirani jednofaktorskom ANOVA analizom, (P < 0.05) se smatralo značajnom razlikom.

Eksperimentalni rezultat

1. Klinička ocena

[0110] U ovom eksperimentu, procenjen je efekat jedinjenja formule (I) na poboljšanje kliničke ocene kod modela artritisa pacova (AIA), koristeći deksametazon i filgotinib kao referencu. 6. dana posle ađuvansne imunizacije, pacovi su počeli da imaju simptome artritisa. Posle primene 13. dana, prosečna klinička ocena kontrolne grupe sa rastvaračem se postepeno povećavala. Eksperimentalni rezultati su pokazali da je prosečna klinička ocena kontrolne grupe sa rastvaračem dostigla pik 24. dana i održavala se na oko 8 tačaka, što označava uspešno uspostavljanje AIA modela (Tabela 9-4).

[0111] Na krajnjoj tački (27. dan), jedinjenje formule (I) je značajno inhibiralo kliničke ocene pacova sa artritisom u četiri doze od 1, 3, 10 i 30 mg/kg (P < 0.0001 u poređenju sa kontrolnom grupom koja je primala rastvarač) i smanjilo kliničke ocene pacova sa artritisom do 5.4, 3.9, 3.2 i 2.7 respektivno na način zavisan od doze (P < 0.0001 u poređenju sa grupom sa visokom dozom i grupom sa niskom dozom). Među njima, efekat jedinjenja formule (I) 30 mg/kg je najočigledniji (od 17. dana, postoji veoma značajna razlika u poređenju sa kontrolnom grupom koja je primala rastvarač, P < 0.0001). Prosečna klinička ocena artritisa ove grupe smanjila se od pika od 6.0, 13. dana, do 2.7, 27. dana (Tabela 9-4). Ocena referentnog jedinjenja filgotiniba 30 mg/kg dva puta dnevno smanjena je do 5.1 na eksperimentalnom kraju 27. dana, što je bilo značajno niže nego kod kontrolne grupe sa rastvaračem (P < 0.001), ali značajno više nego kod jedinjenja formule (I) 30 mg/kg dva puta dnevno (P < 0.001). Efekat poboljšanja jedinjenja formule (I) na kliničku ocenu artritisa je značajno bolji nego kod filgotiniba u istoj dozi.

[0112] Prosečna klinička ocena pozitivne kontrolne grupe za lečenje deksametazonom dostigla je najvišu vrednost od 6.0 poena posle 13. dana. Posle primene, klinička ocena je nastavila da opada do 2.7 poena na eksperimentalnom kraju 27. dana. Od 17. dana, postojala je veoma značajna razlika u poređenju sa kontrolnom grupom koja je primala rastvarač (Tabela 9-4).

2 Zapremina stopala

[0113] Ovim eksperimentom je procenjen efekat jedinjenja formule (I) na zapreminu stopala kod modela artritisa pacova (AIA), sa deksametazonom i filgotinibom kao referencom. Prosečna zapremina stopala životinja u kontrolnoj grupi sa rastvaračem postepeno se povećavala od 1.9 ml 13. dana do 2.9 ml na kraju eksperimenta 27. dana, što označava uspešno uspostavljanje AIA modela (tabela 9-5). Na kraju eksperimenta, jedinjenje formule (I) je moglo značajno inhibirati povećanje zapremine stopala pacova sa artritisom u dozama od 1, 3, 10 i 30 mg/kg (P < 0.0001 u poređenju sa kontrolnom grupom koja je primala rastvarač), a prosečna zapremina stopala pacova sa artritisom je smanjena do 1.91 ml, 1.59 ml, 1.26 ml i 1.21 ml respektivno na način zavisan od doze (P < 0.0001 u poređenju sa grupom sa visokom dozom i grupom sa niskom dozom). Referentno jedinjenje filgotinib 30 mg/kg dva puta dnevno je smanjeno do 1.91 poena na kraju eksperimenta 27. dana, što je bilo značajno niže nego kod kontrolne grupe sa rastvaračem (P<0.0001), ali značajno više nego kod jedinjenja formule (I) 30 mg/kg dva puta dnevno (P<0.0001). Efekat jedinjenja formule (I) na poboljšanje zapremine stopala pacova je značajno bolji nego kod filgotiniba u istoj dozi. Grupa za lečenje deksametazonom, koja je bila pozitivna kontrola, takođe je dobro inhibirala povećanje prosečne zapremine stopala. Posle primene, zapremina stopala se postepeno smanjivala i održavala se na 1.21 ml do kraja eksperimenta. Od 17. dana, postojala je veoma značajna razlika u poređenju sa kontrolnom grupom koja je primala rastvarač, P < 0.0001 (Tabela 9-5)

1

3 Težina

[0114] U poređenju sa normalnom grupom, telesna težina pacova nakon imunološkog modeliranja se smanjila. Nakon primene 13. dana, telesna težina svake grupe koja je primala lek se polako i kontinuirano povećavala u poređenju sa kontrolnom grupom koja je primala rastvarač, dok se telesna težina pozitivne kontrolne grupe sa deksametazonom oporavljala sporo. Ovaj rezultat sugeriše da pacovi dobro tolerišu filgotinib i jedinjenja formule (I). Telesna težina grupe sa jedinjenjem formule (I) od 30 mg/kg se najbrže povećavala, a trend povećanja telesne težine posle četiri doze pokazao je zavisnost od doze (tabela 9-6).

4 Rezultati histopatoloških testova

[0115] Ukupna patološka ocena pacova sa artritisom u kontrolnoj grupi koja je primala rastvarač bila je 16 ± 0.00. Ocena jedinjenja formule (I) je smanjena do 13.3 ± 0.44 pri dozi od 1 mg/kg (P = 0.09 u poređenju sa kontrolnom grupom koja je primala rastvarač), a stopa inhibicije je bila 16.9%. Pri dozama od 3 mg/kg, 10 mg/kg i 30 mg/kg, patološke ocene pacova sa artritisom su značajno smanjene do 11.3 ± 1.64, 4.4 ± 1.16 i 1.6 ± 0.47, respektivno. P vrednosti su bile 0.014, < 0.0001 i < 0.0001, respektivno. Stope inhibicije su bile 29.4%, 72.5% i 90%. Ukupna patološka ocena referentnog jedinjenja filgotiniba 30 mg/kg bila je 15.2 ± 0.49, a stopa inhibicije je bila 5%. Nije bilo značajne razlike u poređenju sa grupom koja je primala rastvarač. Ukupna patološka ocena jedinjenja formule (I) u istoj dozi (30 mg/kg) bila je značajno niža od onog kod filgotiniba (P<0.0001). Kontrolno jedinjenje deksametazona od 0.3 mg/kg značajno je smanjilo patološku ocenu pacova sa artritisom do 4.4 ± 0.8, P < 0.0001, a stopa inhibicije je bila 72.5% (Tabela 9-7).

2

Tabela 9-7 Patološka ocena

[0116] Zaključak: pacovi u kontrolnoj grupi koja je primala rastvarač imali su kliničke simptome artritisa i nastavljaju da se pogoršavaju. U poređenju sa kontrolnom grupom koja je primala rastvarač, jedinjenja formule (I) (1, 3, 10, 30 mg/kg), filgotinib (30 mg/kg) i deksametazon (0.3 mg/kg) pokazali su značajne inhibitorne efekte na artritis indukovan ađuvansom, što je pokazalo odloženo vreme početka i značajno smanjenje kliničkih simptoma i patoloških promena. Terapeutski efekat jedinjenja formule (I) na modelu artritisa indukovanog ađuvansom bio je zavisan od doze. Gore navedeni eksperimentalni rezultati pokazuju da jedinjenje formule (I) ima očigledan terapeutski efekat na artritis indukovan ađuvansom kod pacova i da je efekat bolji od filgotiniba.

Claims (26)

1. Patentni zahtevi 1. Kristalni oblik A jedinjenja formule (I) ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim 2θ uglovima u spektru rendgenske difrakcije praha (XRPD) merenim upotrebom CuKα1 zračenja: 6.91 ± 0.20°, 12.21 ± 0.20° i 19.06 ± 0.20°:
2. 2. Kristalni oblik A prema patentnom zahtevu 1, pri čemu on ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim 2θ uglovima u spektru rendgenske difrakcije praha (XRPD): 6.91 ± 0.20°, 12.21 ± 0.20°, 13.69 ± 0.20°, 19.06 ± 0.20°, 19.86 ± 0.20°, 20.59 ± 0.20°, 22.06 ± 0.20° i 27.52 ± 0.20°.
3. 3. Kristalni oblik A prema patentnom zahtevu 2, pri čemu on ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim 2θ uglovima u spektru rendgenske difrakcije praha (XRPD): 6.91 ± 0.20°, 10.34 ± 0.20°, 12.21 ± 0.20°, 13.69 ± 0.20°, 18.11 ± 0.20°, 19.06 ± 0.20°, 19.86 ± 0.20°, 20.59 ± 0.20°, 22.06 ± 0.20° i 27.52 ± 0.20°.
4. 4. Kristalni oblik A prema patentnom zahtevu 3, pri čemu on ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim 2θ uglovima u spektru rendgenske difrakcije praha (XRPD): 6.91 ± 0.20°, 10.34 ± 0.20°, 12.21 ± 0.20°, 13.69 ± 0.20°, 17.44 ± 0.20°, 18.11 ± 0.20°, 19.06 ± 0.20°, 19.86 ± 0.20°, 20.59 ± 0.20°, 22.06 ± 0.20°, 24.46 ± 0.20° i 27.52 ± 0.20°.
5. 5. Kristalni oblik A prema patentnom zahtevu 4, pri čemu on ima spektar XRPD prikazan na Sl. 1.
6. 6. Kristalni oblik A prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, pri čemu on ima vrednost endotermnog pika respektivno na 152.19± 3°C i 216.79 ± 3°C na krivoj diferencijalne skenirajuće kalorimetrije; i vrednost egzotermnog pika na 161.50 ± 3°C.
7. 7. Kristalni oblik A prema patentnom zahtevu 6, gde pri čemu on ima DSC spektar prikazan na Sl. 2.
8. 8. Kristalni oblik B jedinjenja formule (I) ima karakteristične difrakcione pikove u spektru rendgenske difrakcije praha pod sledećim 2θ uglovima merenim upotrebom CuKα1 zračenja: 5.13 ± 0.20°, 19.14 ± 0.20° i 21.18 ± 0.20°:
9. 9. Kristalni oblik B prema patentnom zahtevu 8, pri čemu on ima karakteristične difrakcione pikove u spektru rendgenske difrakcije praha pod sledećim 2θ uglovima: 5.13 ± 0.20°, 7.34 ± 0.20°, 10.14 ± 0.20°, 10.56 ± 0.20°, 11.72 ± 0.20°, 16.67 ± 0.20°, 19.14 ± 0.20° i 21.18 ± 0.20°.
10. 10. Kristalni oblik B prema patentnom zahtevu 9, pri čemu on ima karakteristične difrakcione pikove u spektru rendgenske difrakcije praha pod sledećim 2θ uglovima: 5.13 ± 0.20°, 7.34 ± 0.20°, 10.14 ± 0.20°, 10.56 ± 0.20°, 11.72 ± 0.20°, 16.67 ± 0.20°, 19.14 ± 0.20°, 21.18 ± 0.20° i 21.78 ± 0.20°.
11. 11. Kristalni oblik B prema patentnom zahtevu 10, pri čemu on ima spektar XRPD prikazan na Sl. 3.
12. 12. Kristalni oblik B prema bilo kom od patentnih zahteva 8-11, pri čemu on ima vrednost endotermnog pika respektivno na 193.99 ±3°C i 216.93 ±3°C na krivoj diferencijalne skenirajuće kalorimetrije; i vrednost egzotermnog pika na 200.10 ± 3°C.
13. 13. Kristalni oblik B prema patentnom zahtevu 12, pri čemu on ima DSC spektar prikazan na Sl. 4.
14. 14. Kristalni oblik B prema bilo kom od patentnih zahteva 8-11, pri čemu on ima gubitak težine do 0.535% na krivoj termogravimetrijske analize (TGA) na 120 ± 3°C.
15. 15. Kristalni oblik B prema patentnom zahtevu 14, pri čemu on ima TGA spektar prikazan na Sl. 5.
16. 16. Kristalni oblik C jedinjenja formule (I) ima karakteristične difrakcione pikove u spektru rendgenske difrakcije praha pod sledećim 2θ uglovima merenim upotrebom CuKα1 zračenja: 8.92 ± 0.20°, 18.66 ± 0.20° i 20.26 ± 0.20°:
17. 17. Kristalni oblik C prema patentnom zahtevu 14, pri čemu on ima karakteristične difrakcione pikove u spektru rendgenske difrakcije praha pod sledećim 2θ uglovima: 5.76 ± 0.20°, 8.92 ± 0.20°, 11.50 ± 0.20°, 16.35 ± 0.20°, 18.66 ± 0.20°, 19.17 ± 0.20°, 20.26 ± 0.20° i 24.79 ± 0.20°.
18. 18. Kristalni oblik C prema patentnom zahtevu 17, pri čemu on ima spektar XRPD prikazan na Sl. 6.
19. 19. Kristalni oblik C prema bilo kom od patentnih zahteva 16-18, pri čemu on ima početnu tačku endotermnog pika na 215.48°C na krivoj diferencijalne skenirajuće kalorimetrije.
20. 20. Kristalni oblik C prema patentnom zahtevu 19, pri čemu on ima DSC spektar prikazan na Sl. 7.
21. 21. Kristalni oblik D jedinjenja formule (I) ima karakteristične difrakcione pikove u spektru rendgenske difrakcije praha pod sledećim 2θ uglovima merenim upotrebom CuKα1 zračenja: 7.12 ± 0.20°, 20.54 ± 0.20° i 21.42 ± 0.20°:
22. 22. Kristalni oblik D prema patentnom zahtevu 21, pri čemu on ima karakteristične difrakcione pikove prisutne u spektru rendgenske difrakcije praha pod sledećim 2θ uglovima: 7.12 ± 0.20°, 12.45 ± 0.20°, 14.64 ± 0.20°, 18.31 ± 0.20°, 20.54 ± 0.20°, 21.42 ± 0.20° i 28.72 ± 0.20°.
23. 23. Kristalni oblik D prema patentnom zahtevu 22, pri čemu on ima karakteristične difrakcione pikove u spektru rendgenske difrakcije praha pod sledećim 2θ uglovima: 7.12 ± 0.20°, 10.28 ± 0.20°, 12.45 ± 0.20°, 14.64 ± 0.20°, 17.50 ± 0.20°, 18.31 ± 0.20°, 20.54 ± 0.20°, 21.42 ± 0.20° i 28.72 ± 0.20°.
24. 24. Kristalni oblik D prema patentnom zahtevu 23, pri čemu on ima spektar XRPD prikazan na Sl. 8.
25. 25. Kristalni oblik A prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, kristalni oblik B prema bilo kom od patentnih zahteva 8-15, kristalni oblik C prema bilo kom od patentnih zahteva 16-20 i kristalni oblik D prema bilo kom od patentnih zahteva 21-24 za upotrebu u lečenju bolesti povezanih sa JAK1 i/ili TYK2.
26. 26. Kristalni oblik A prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, kristalni oblik B prema bilo kom od patentnih zahteva 8-15, kristalni oblik C prema bilo kom od patentnih zahteva 16-20 i kristalni oblik D prema bilo kom od patentnih zahteva 21-24 za upotrebu u lečenju reumatoidnog artritisa.