ES3037893T3 - Crystalline form of jak inhibitor and application thereof - Google Patents

Abstract

Una forma cristalina de un inhibidor de JAK y una aplicación de la misma en la preparación de un fármaco para tratar enfermedades relacionadas con JAK1 y/o TYK2. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Forma cristalina de un inhibidor de JAK y aplicación de esta

Campo técnico

La presente invención se refiere a una forma cristalina como un inhibidor de JAK y una aplicación de esta en la preparación de fármacos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con JAK1 o TYK2.

Antecedentes de la técnica

Una cinasa JAK es una familia de tirosina cinasas no receptoras intracelulares con cuatro miembros: JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2 (Robert Roskoski Jr. (2016)). JAK1, JAK2 y TYK2 se expresan en células de tejidos humanos. JAK3 se expresa principalmente en células de tejido hematopoyético, principalmente en células de médula ósea, timocitos, células NK, linfocitos B y linfocitos T activados. A partir de un análisis de la expresión o mutación adquirida funcionalmente, JAK1 y JAK3 están más relacionadas con la regulación inmunitaria, mientras que<j>AK2 está directamente relacionada con la generación de glóbulos rojos y plaquetas. A partir de un análisis de la deficiencia funcional, la deficiencia funcional de JAK1 y JAK2 provocará la muerte de embriones de ratón de ratones. Las enfermedades relacionadas con la deficiencia funcional de JAK1 y JAK2 no se encuentran en el cuerpo humano, lo que indica indirectamente la importancia de las funciones fisiológicas de JAK1 y JAK2. La deficiencia funcional de JAK3 puede provocar deficiencia inmunitaria integral grave. Existen pocos estudios sobre la función de TYK2, que se ha informado que provoca defectos relacionados con la inmunidad intrínseca. (James D. Clark, (2014)).

Aguas abajo de las JAK está la familia de activadores de transcripción y transducción de señales (STAT). La vía JAK-STAT transmite señales extracelulares de una variedad de citocinas, factores de crecimiento y hormonas al núcleo, y es responsable de la expresión de miles de genes que codifican proteínas. Cuando las citocinas se unen a sus receptores, los miembros de la familia JAK se autofosforilan y/o se transfosforilan entre sí, después se fosforilan por STAT y después migran al núcleo para regular la transcripción. La transducción de señales intracelulares de JAK-STAT es aplicable al interferón, la mayoría de las interleucinas y a una variedad de citocinas y factores endocrinos, tales como EPO, TPO, GH, OSM, LIF, CNTF, GM C<s>F y PRL (Vainchenker W. y otros (2008)). Los diferentes miembros de la familia JAK se unen a diferentes receptores de citocinas selectivamente para proporcionar especificidad de transducción de señales, para desempeñar diferentes funciones fisiológicas. Este modo de acción selectivo hace a los inhibidores de JAK capaces de aplicarse al tratamiento de enfermedades de una manera relativamente específica. Los receptores de IL-2 o IL-4, junto con una cadena y común, se unen a JAK1 y JAK3, y el receptor tipo I que tiene la misma estructura p se une a JAK2. Los receptores tipo I que usan gpl30 (glucoproteína 130) y los receptores tipo I activados por citocinas heterodiméricas se unen preferentemente a JAK1/2 y TYK2, y los receptores tipo I activados por citocinas similares a hormonas se unen a y activan la cinasa<j>AK2. Los receptores tipo II de un interferón se unen a JAK1 y TYK2, mientras que los receptores de la familia de citocinas de IL-10 se unen a JAK1/2 y TYK2. Varias uniones específicas de las citocinas anteriores y sus receptores a los miembros de la familia JAK sirven a diferentes funciones fisiológicas, lo que proporciona de esta manera una posibilidad para el tratamiento de diferentes enfermedades.

La vía de señalización JAK-STAT está involucrada en muchos procesos biológicos importantes, tales como la proliferación celular, la diferenciación, la apoptosis y la regulación inmunitaria. Los datos clínicos existentes muestran que la inhibición de JAK2 durante un tiempo prolongado inhibirá las citocinas tales como G-CSF, TPO y EPO, lo que afecta por tanto la proliferación y diferenciación de las células madre hematopoyéticas. La inhibición de JAK3 disminuirá el número de células NK y aumentará la probabilidad de infección. Por lo tanto, un inhibidor de JAK puede afectar el número y la función de leucocitos, eritrocitos y linfocitos en grados variables. Sin embargo, los inhibidores selectivos de JAK1 o/y TYK2 con un rango de acción estrecho sobre las citocinas pueden mantener teóricamente la eficacia y mejorar la seguridad (Daniella M. Schwartz, y otros (2017)).

El documento US16/220,688 describe el filgotinib, que es un fármaco de la compañía Galápagos en fase clínica III para el tratamiento de la artritis reumatoide,

Resumen

La presente invención proporciona la forma cristalina A de un compuesto de fórmula (I), con picos de difracción característicos mostrados en un espectro de difracción de rayos X en polvo (XRPD) en los siguientes ángulos 26: 6,91 ± 0,20°, 12,21 ± 0,20° y 19,06 ± 0,20°.

En algunas modalidades de la presente invención, los picos de difracción característicos están presentes en el espectro de difracción de rayos X en polvo de la forma cristalina A anterior en los siguientes ángulos 26: 6,91 ± 0,20°, 12,21 ± 0,20°, 13,69 ± 0,20°, 19,06 ± 0,20°, 19,86 ± 0,20°, 20,59 ± 0,20°, 22,06 ± 0,20° y 27,52 ± 0,20°.

En algunas modalidades de la presente invención, los picos de difracción característicos están presentes en el espectro de difracción de rayos X en polvo de la forma cristalina A anterior en los siguientes ángulos 26: 6,91±0,20°, 10,34±0,20°, 12,21±0,20°, 13,69±0,20°, 18,11±0,20°, 19,06±0,20°, 19,86± 0,20°, 20,59±0,20°, 22,06±0,20° y 27,52±0,20°.

En algunas modalidades de la presente invención, los picos de difracción característicos están presentes en el espectro de difracción de rayos X en polvo de la forma cristalina A anterior en los siguientes ángulos 26: 6,91 ± 0,20°, 10,34 ± 0,20°, 12,21 ± 0,20°, 13,69 ± 0,20°, 17,44 ± 0,20°, 18,11 ± 0,20°, 19,06 ± 0,20°, 19,86 ± 0,20°, 20,59 ± 0,20°, 22,06 ± 0,20°, 24,46 ± 0,20° y 27,52 ± 0,20°.

En algunas modalidades de la presente invención, la forma cristalina A anterior tiene un espectro de XRPD mostrado en la Figura 1.

En algunas modalidades de la presente invención, los datos del análisis del espectro de XRPD de la forma cristalina A anterior se muestran en la Tabla 1.

T ).

En algunas modalidades de la presente invención, la forma cristalina A anterior tiene un valor de pico endotérmico respectivamente a 152,19± 3 °C y 216,79 ± 3 °C en una curva de calorimetría diferencial de barrido; y un valor de pico exotérmico a 161,50 ± 3 °C.

En algunas modalidades de la presente invención, la forma cristalina A anterior tiene un espectro de DSC mostrado en la Figura 2.

La presente invención proporciona una forma cristalina B del compuesto de fórmula (I), con picos de difracción característicos en un espectro de difracción de rayos X en polvo en los siguientes ángulos 20: 5,13 ± 0,20°, 19,14 ± 0,20° y 21,18 ± 0,20°.

En algunas modalidades de la presente invención, los picos de difracción característicos están presentes en el espectro de difracción de rayos X en polvo de la forma cristalina B anterior en los siguientes ángulos 20: 5,13 ± 0,20°, 7,34 ± 0,20°, 10,14 ± 0,20°, 10,56 ± 0,20°, 11,72 ± 0,20°, 16,67 ± 0,20°, 19,14 ± 0,20° y 21,18 ± 0,20°. En algunas modalidades de la presente invención, los picos de difracción característicos están presentes en el espectro de difracción de rayos X en polvo de la forma cristalina B anterior en los siguientes ángulos 20: 5,13 ± 0,20°, 7,34 ± 0,20°, 10,14 ± 0,20°, 10,56 ± 0,20°, 11,72 ± 0,20°, 16,67 ± 0,20°, 19,14 ± 0,20°, 21,18 ± 0,20° y 21,78 ± 0,20°.

En algunas modalidades de la presente invención, la forma cristalina B anterior tiene un espectro de XRPD mostrado en la Figura 3.

En algunas modalidades de la presente invención, los datos del análisis del espectro de XRPD de la forma cristalina B anterior se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2: Datos analíticos^ del es ectro de XRPD de la forma cristalina B del com uesto de fórmula I)

En algunas modalidades de la presente invención, la forma cristalina B anterior tiene un valor de pico endotérmico respectivamente a 193,99 ±3 °C y 216,93 ±3 °C en una curva de calorimetría diferencial de barrido; y un valor de pico exotérmico a 200,10 ± 3 °C.

En algunas modalidades de la presente invención, la forma cristalina B anterior tiene un espectro de DSC mostrado en la Figura 4.

En algunas modalidades de la presente invención, la forma cristalina B anterior muestra una pérdida de peso de hasta 0,535 % en una curva de análisis termogravimétrico (TGA) a 120 ± 3 °C.

En algunas modalidades de la presente invención, la forma cristalina B anterior tiene un espectro de TGA mostrado en la Figura 5.

La presente invención proporciona una forma cristalina C del compuesto de fórmula (I), con picos de difracción característicos en un espectro de difracción de rayos X en polvo en los siguientes ángulos 20: 8,92 ± 0,20°, 18,66 ± 0,20° y 20,26 ± 0,20°.

En algunas modalidades de la presente invención, los picos de difracción característicos están presentes en el espectro de difracción de rayos X en polvo de la forma cristalina C anterior en los siguientes ángulos 20: 5,76 ± 0,20°, 8,92 ± 0,20°, 11,50 ± 0,20°, 16,35 ± 0,20°, 18,66 ± 0,20°, 19,17 ± 0,20°, 20,26 ± 0,20° y 24,79 ± 0,20°. En algunas modalidades de la presente invención, la forma cristalina C anterior tiene un espectro de XRPD mostrado en la Figura 6.

En algunas modalidades de la presente invención, los datos del análisis del espectro de XRPD de la forma cristalina C anterior se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3: Datos analíticos del es ectro de XRPD de la forma cristalina C del com uesto de fórmula I).

En algunas modalidades de la presente invención, la forma cristalina C anterior tiene un punto de partida de pico endotérmico en 215,48 °C en una curva de calorimetría diferencial de barrido.

En algunas modalidades de la presente invención, la forma cristalina C anterior tiene un espectro de DSC mostrado en la Figura 7.

La presente invención proporciona una forma cristalina D del compuesto de fórmula (I), con picos de difracción característicos en un espectro de difracción de rayos X en polvo en los siguientes ángulos 20: 7,12 ± 0,20°, 20,54 ± 0,20° y 21,42 ± 0,20°.

En algunas modalidades de la presente invención, los picos de difracción característicos están presentes en el espectro de difracción de rayos X en polvo de la forma cristalina D anterior en los siguientes ángulos 20: 7,12 ± 0,20°, 12,45 ± 0,20°, 14,64 ± 0,20°, 18,31 ± 0,20°, 20,54 ± 0,20°, 21,42 ± 0,20° y 28,72 ± 0,20°.

En algunas modalidades de la presente invención, los picos de difracción característicos están presentes en el espectro de difracción de rayos X en polvo de la forma cristalina D anterior en los siguientes ángulos 20: 7,12 ± 0,20°, 10,28 ± 0,20°, 12,45 ± 0,20°, 14,64 ± 0,20°, 17,50 ± 0,20°, 18,31 ± 0,20°, 20,54 ± 0,20°, 21,42 ± 0,20° y 28,72 ± 0,20°.

En algunas modalidades de la presente invención, la forma cristalina D anterior tiene un espectro de XRPD mostrado en la Figura 8.

En algunas modalidades de la presente invención, los datos del análisis del espectro de XRPD de la forma cristalina D anterior se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4: Datos analíticos^ del es ectro de XRPD de la forma cristalina D del com uesto de fórmula I)

La invención proporciona además las formas cristalinas A, B, C y D anteriores para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con JAK1 y/o TYK2.

En algunas modalidades de la invención, las formas cristalinas A, B, C y D anteriores son para su uso en el tratamiento de la artritis reumatoide.

Efecto técnico

El compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la presente invención tiene un buen efecto farmacológico in vivo, y sus formas cristalinas son estables y menos afectadas por la luz, el calor y la humedad, y tienen una alta solubilidad, de esta manera tiene una amplia perspectiva como un medicamento.

Definición y descripción

A menos que se indique de cualquier otra manera, los siguientes términos y frases usados en la presente descripción pretenden tener los siguientes significados. Una frase o término específico no debe considerarse incierto o poco claro sin una definición especial, sino que debe entenderse de acuerdo con un significado ordinario. Cuando aparece un nombre comercial en la presente descripción, se pretende que se refiera a su producto básico correspondiente o sus ingredientes activos.

El compuesto intermedio de la invención puede prepararse mediante una variedad de métodos de síntesis bien conocidos para los expertos en la técnica, que incluyen las modalidades específicas enumeradas más abajo, las modalidades formadas por su combinación con otros métodos de síntesis química, y los métodos de reemplazo equivalentes bien conocidos para los expertos en la técnica. Las modalidades preferidas incluyen, pero no se limitan a, las modalidades de la presente invención.

La reacción química de las modalidades específicas de la presente invención se completa en un solvente adecuado, que es adecuado para los cambios químicos de la invención y los reactivos y materiales requeridos. Para obtener los compuestos de la presente invención, a veces es necesario que los expertos en la técnica modifiquen o seleccionen una etapa de síntesis o proceso de reacción sobre la base de las modalidades existentes.

La presente invención se describirá en relación con ejemplos que, sin embargo, no impondrán ninguna limitación a la presente invención.

Todos los solventes usados en la invención están disponibles comercialmente y pueden usarse sin necesidad de purificación adicional.

El solvente usado en la invención puede estar disponible comercialmente. En la presente invención se usan las siguientes abreviaturas: DCM que representa diclorometano; DMF que representa N,N-dimetilformamida; DMSO que representa dimetilsulfóxido; EtOH que representa etanol; MeOH que representa metanol; TFA que representa ácido trifluoroacético; TsOH que representa ácido p-toluenosulfónico; mp que representa punto de fusión; EtSOaH que representa ácido etanosulfónico; MeSOaH que representa ácido metanosulfónico; ATP que representa trifosfato de adenosina; HEPES que representa ácido 4-hidroxietil piperazin etanosulfónico; EGTA que representa ácido etilenglicol bis(2-aminoetil éter) tetraacético; MgCh que representa dicloruro de magnesio; MnCl2 que representa dicloruro de manganeso; DTT que representa ditiotreitol; DCC que representa diciclohexilcarbodiimida; DMAP que representa 4-dimetilaminopiridina; EA que representa acetato de etilo; LiHMDS que representa hexametildisilicilaminolitio; Pd(dppf)Ch.CH2Ch representa el complejo de diclorometano de dicloruro de [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]paladio; EDCI que representa 1-etil-3(3-dimetilpropilamina) carbodiimida; y HOBt que representa 1-hidroxibenzotriazol.

Métodos específicos de XRPD, DSC y TGA (que incluyen modelo y parámetros del equipo)

Un método de difracción de rayos X en polvo (XRPD) usado en la presente invención

Se usan aproximadamente 10-20 mg de muestra para la detección por XRPD.

Los parámetros de XRPD detallados son los siguientes:

Tubo de luz: Cu, Cu: K-Alfa (A= 1,54179 A).

Tensión del tubo de luz: 40 kV, corriente del tubo de luz: 40 mA

Ranura de divergencia: 0,60 mm

Ranura del detector: 10,50 mm

Ranura antidispersión: 7,10 mm

Intervalo de barrido: 3-40 grados

Velocidad de barrido: 10 grad/min

Velocidad del disco de muestras: 15 rpm/0 rpm

Un método de escáner calorimétrico diferencial (DSC) usado en la presente solicitud

Una muestra (0,5-1 mg) se coloca en un recipiente de aluminio de DSC para la prueba. En la condición de 50 ml/min de N2, la muestra se calienta de 30 °C a 250 °C a una velocidad de calentamiento de 10 °C/min. Un método de analizador termogravimétrico (TGA) usado en la presente solicitud

Una muestra (2-5 mg) se coloca en un recipiente de platino de TGA para la prueba. En la condición de 25 ml/min de N2, la muestra se calienta de temperatura ambiente a 300 °C o se calienta para perder peso de 20 % a una velocidad de calentamiento de 10 °C/min.

Un método de análisis de cromatografía líquida (HPLC) usado en la presente solicitud

Método de HPLC para la prueba y el análisis del contenido

Breve descripción de las Figuras

Figura 1: Espectro de XRPD de la forma cristalina A.

Figura 2: Espectro de DSC de la forma cristalina A.

Figura 3: Patrón de XRPD de la forma cristalina B.

Figura 4: Espectro de DSC de la forma cristalina B.

Figura 5: Espectro de TGA de la forma cristalina B.

Figura 6: Patrón de XRPD de la forma cristalina C.

Figura 7: Espectro de DSC de la forma cristalina C.

Figura 8: Espectro de XRPD de la forma cristalina D.

Descripción detallada

Para comprender mejor el contenido de esta invención, lo siguiente se describirá en detalle en combinación con ejemplos específicos, sin embargo, las modalidades específicas no pretenden imponer ninguna limitación al alcance de esta invención.

Ejemplo 1: preparación del compuesto de fórmula (I).

Etapa 1: Se dejó caer LiHMDS (1 M, 51,2 ml) en solución de THF (150 ml) que contenía el compuesto1-1(10,2 g, 42,6 mmol) a -78 °C. Después de que la solución de reacción se agitó a -78 °C durante 1 hora, se añadió una solución en THF (150 ml) de 1,1,1-trifluoro-A/-fenil-W-(trifluorometilsulfonil)metanosulfonamida (16,7 g, 46,9 mmol) a la solución de reacción, y después la mezcla se agitó a 15 °C durante 12 horas. La reacción se inactivó con 250 ml de cloruro de amonio saturado, se diluyó con 200 ml de agua, y después se extrajo con acetato de etilo (200 ml * 3). Las fases orgánicas se combinaron, se lavaron con agua salada saturada, se secaron con sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron para obtener los compuestos1-2.El producto crudo se usó directamente para la siguiente reacción sin purificación.

RMN 1H (400 MHz, CDCla) 85,63 (br s, 1H) ,3,50-3,65 (m, 4H), 2,34 (br s, 4H), 1,88 (br t, J=5,90 Hz, 2H), 1,37 (s, 9H).

Etapa 2: se añadieron acetato de potasio (12,7 g, 129,3 mmol) y Pd (dppf)Ch.CH2Ch (3,5 g, 4,3 mmol) a una solución de DMF (100 ml) disuelta con el compuesto1-2(16 g, 43,1 mmol) y borato de pinacol (12,0 g, 47,4 mmol), se reemplazó con nitrógeno 3 veces y se agitó a 70 °C en atmósfera de nitrógeno durante 3 horas. La solución de reacción se dispersó en una mezcla de 300 ml de agua y 400 ml de acetato de etilo. La fase orgánica se separó, se lavó con agua salada saturada, se secó con sulfato de sodio, se filtró y se concentró para obtener un producto crudo. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice para obtener el compuesto1-3.

RMN 1H (400 MHz, CDCla) 86,46 (br s, 1H), 3,71 -3,53 (m, 4H), 2,31 (br d, J=3,0 Hz, 2H), 2,24 -2,16 (m, 2H), 1,74 (t, J=6,3 Hz, 2H), 1,44 (s, 9H), 1,26 (s, 12H).

Etapa 3: en una atmósfera de nitrógeno, se añadieron carbonato de potasio (3,8 g, 27,3 mmol) y Pd (dppf)Cl2.CH2Cl2 (744 mg, 911,0 |jmol) a una solución de dioxano (60 ml) y agua (15 ml) que contenía el compuesto1-3(3,5 g, 10,0 mmol) y A/-(5-bromo-[1,2,4]triazolo [1,5-a]piridin-2-il) ciclopropano formamida (2,6 g, 9,1 mmol). La solución de reacción se agitó a 90 °C durante 3 horas. La solución de reacción se concentró, y el producto crudo resultante se separó y purificó mediante cromatografía en columna para obtener el compuesto1-4.LCMS (ESI) m/z: 424,3[M H]+.

Etapa 4: se añadieron ácido clorhídrico/acetato de etilo (4 M, 30 ml) a una solución de diclorometano (10 ml) disuelta con los compuestos1-4(3,5 g, 8,2 mmol), y la solución de reacción se agitó a 25 °C durante 0,5 horas. El sólido se precipitó, se filtró y se secó para obtener el compuesto1-5(3,3 g de clorhidrato, producto crudo), que se usó directamente en la siguiente reacción sin purificación.

LCMS (ESI) m/z: 324,1[M H]+.

Etapa 5: Se añadió Pd/C (1 g, 10 %) a una solución de metanol (100 ml) disuelta con el compuesto1-5(3,0 g, 8,34 mmol, clorhidrato) en una atmósfera de nitrógeno. Se reemplazó con hidrógeno tres veces y después se agitó a 30 °C en atmósfera de hidrógeno (0,2068427 MPa (30 psi)) durante 12 horas. La solución de reacción se filtró y se concentró para obtener el compuesto1-6(3 g de clorhidrato, producto crudo), que se usó directamente en la siguiente reacción sin purificación.

LCMS (ESI) m/z: 326,2 [M H]+.

Etapa 6: se disolvió el compuesto1-6(0,87 g, 2,40 mmol, clorhidrato) en N, N-dimetilformamida (10 ml), se añadieron HOBt (487 mg, 3,6 mmol) y EDCI (691 mg, 3,6 mmol), y después se añadieron ácido (1S)-2,2-difluorociclopropil fórmico (323 mg, 2,6 mmol) y dietilamina de diisopropilo (621 mg, 4,8 mmol) a la solución. La solución de reacción se agitó a 15 °C durante 12 horas. Después, se concentró a presión reducida para obtener un residuo, que se sometió a una HPLC preparativa (sistema neutral) para obtener el compuesto de fórmula (I).

RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 87,32-7,73 (m, 2H), 6,95 (br s, 1H), 3,62-4,22 (m, 4H), 3,45 (br s, 1H), 3,18-3,37 (m, 1H), 2,61 (br s, 1H), 1,45-2,27 (m, 10H), 0,78-1,17 (m, 4H). LCMS (ESI) m/z: 430,0[M H]+.

Ejemplo 2: Método de preparación de formas cristalinas individuales

Se pusieron 50 mg del compuesto de fórmula (I) en un vial de vidrio de 2,0 ml, y se añadieron 0,4 ml de una mezcla de metanol y agua (relación de volumen 1:1) para obtener una suspensión. La suspensión se añadió con magnetones, y se agitó en un agitador magnético calentado (40 °C). Después de agitar durante 100 horas, las muestras suspendidas se centrifugaron y se colocaron en un horno de secado al vacío a 35 °C durante toda la noche. Se determinó que la muestra seca era la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) mediante XRPD (como se muestra en la Figura 1) y DSC (como se muestra en la Figura 2) al mismo tiempo.

Se añadieron aproximadamente 50 mg del compuesto de fórmula (I) en un vial de vidrio de 2,0 ml y se añadieron 0,4 ml de acetato de etilo. Después de añadir los magnetones, la muestra anterior se agitó en un agitador magnético calentado (40 °C). Después de agitar durante 100 horas, la muestra suspendida se centrifugó y se colocó en un horno de secado al vacío a 35 °C durante toda la noche. Se determinó que la muestra seca era la forma cristalina B del compuesto de fórmula (I) mediante XRPD (como se muestra en la Figura 3) y DSC (como se muestra en la Figura 4) y TGA (como se muestra en la Figura 5) al mismo tiempo.

La forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) se calentó a 170 °C, y la forma cristalina A se cambió a una nueva forma cristalina, es decir, la forma cristalina C del compuesto de fórmula (I), como se confirmó mediante XRPD (como se muestra en la Figura 6) y DSC (como se muestra en la Figura 7) al mismo tiempo.

Se añadieron aproximadamente 50 mg de compuesto de fórmula (I) a un vial de vidrio de 2,0 ml, y se añadieron 0,4 ml de mezcla de etanol y agua (relación en volumen 1:1) para obtener una suspensión. La suspensión se añadió con magnetones, y se agitó en un agitador magnético calentado (40 °C). Después de agitar durante 100 horas, la muestra suspendida se centrifugó y se colocó en un horno de secado al vacío a 35 °C durante toda la noche. Se determinó que la muestra seca era la forma cristalina D del compuesto de fórmula (I) mediante XRPD (como se muestra en la Figura 8).

Ejemplo 3: Estudio de la estabilidad sólida de la forma cristalina B del compuesto de fórmula (I)

Se colocaron aproximadamente 5 mg de la forma cristalina B en una botella de vidrio seca y limpia, se extendieron en una capa delgada, que fue como una muestra de prueba formal. Se colocó bajo las condiciones de prueba de factores influyentes (60 °C, 92,5 % de HR) y condiciones de aceleración (40 °C/75 % de HR y 60 °C/75 % de HR). Las muestras se expusieron completamente, se cubrieron con papel de aluminio y se penetraron con pequeños agujeros. Las muestras se recolectaron y analizaron a los 5 y 10 días. Las muestras colocadas bajo luz (luz visible 1200000 lux, UV 200 W) se expusieron completamente a temperatura ambiente. Los resultados experimentales mostraron que la forma cristalina no cambia bajo las condiciones de factores influyentes (alta temperatura -60 °C, alta humedad-92,5 % de HR, luz) y aceleración (40 °C/75 % de HR y 60 °C/75 % de HR).

Ejemplo 4: Estudio de la solubilidad en medio biológico de la forma cristalina B del compuesto de fórmula (I) 1. Experimento de solubilidad de la forma cristalina B en bioensayo

Se añadieron aproximadamente 2 mg de muestra de la forma cristalina B a un frasco de muestra, y después se añadieron 1,0 ml de diferentes solventes [agua pura, SGF (jugo gástrico simulado), FaSSIF (jugo intestinal simulado en estado de ayuno), FeSSIF (jugo intestinal simulado en estado de alimentación)] y se agitaron, respectivamente. La botella se agitó en un oscilador de temperatura constante a 37 °C. Después de agitarla durante 24 horas, se centrifugó y se probó la solubilidad de un sobrenadante obtenido. Después de que se diluyó el sobrenadante (diluyente ACN/H2O (1/1)) durante un determinado número de veces (debido a una baja solubilidad del compuesto, el sobrenadante se diluyó dos veces, excepto para SGF, que se diluyó 10 veces), se determinó la concentración mediante HPLC.

2. Preparación del diluyente y la fase móvil

Diluyente: acetonitrilo: agua=1:1. Fase móvil A: Solución acuosa de TFA al 0,1 %, por ejemplo: 1 ml de TFA se transfirió a 1 l de agua pura, se mezcló uniformemente y se desgasificó con ultrasonido. Fase móvil B: acetonitrilo al 100 %.

3. Preparación de la sustancia de referencia y la solución de muestra

Preparación de la solución de STD: se usó la forma cristalina B como sustancia de referencia. Se añadieron aproximadamente 5 mg de la sustancia de referencia en una botella de vidrio, se disolvieron con 10 ml de diluyente y se disolvieron completamente mediante ultrasonido durante aproximadamente 10 min, después se enfrió a temperatura ambiente y se agitó. Se prepararon dos porciones paralelas y se marcaron correspondientemente como STD1 y STD2. El STD1 correspondiente se diluyó con diluyente en 10, 100, 1000 y 2000 veces, y se probó mediante una curva estándar.

Preparación de la solución de muestra: después de que el sobrenadante se diluyó (diluyente ACN/H2O (1/1)) durante un determinado número de veces (la solubilidad del compuesto es pequeña, el sobrenadante se diluye dos veces excepto SGF, y el SGF se diluye 10 veces), se agitó bien, se puso en un vial de fase líquida de 1,5 ml para la prueba, y se determinó la concentración mediante HPLC.

4. Resultados de solubilidad en medios biológicos

Tabla 5 Resultados de solubilidad en medio bioló ico de la forma cristalina B

Conclusión experimental: la forma cristalina B tiene una buena solubilidad en medios biológicos simulados, lo que es propicio para obtener una buena biodisponibilidad in vivo.

Prueba de actividad biológica

Ejemplo experimental 1: prueba de actividad in vitro de las cinasas JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2 Materiales experimentales

Las proteasas JAK1, JAK2, JAK3, TYK2 humanas recombinantes, los principales instrumentos y reactivos se proporcionaron por Eurofins en el Reino Unido.

Método experimental

Dilución de JAK2, JAK3 y TYK2: ácido 3-(N-morfolin) propanosulfónico 20 mM (MOPS), EDTA 1 mM, Brij al 0,01 %-glicerol al 35,5 %, p-mercaptoetanol al 0,1 %, 1 mg/ml de BSA; Dilución de JAK1: TRIS 20 mM, EDTA 0,2 mM, p-mercaptoetanol al 0,1 %, Brij al 0,01 %-glicerol al 35,5 %. Todos los compuestos se prepararon en una solución de DMSO al 100 % y alcanzaron 50 veces la concentración determinada final. El compuesto de prueba se diluyó por tres veces el gradiente de concentración, con una concentración final de 10 jM a 0,001 |jM, 9 concentraciones en total. El contenido de DMSO en la reacción de detección fue del 2 %. La solución madre de trabajo del compuesto de prueba se añadió a un agujero de determinación como un primer componente de reacción, y después se añadieron los componentes restantes de acuerdo con el esquema detallado en el método de determinación más abajo.

Reacción enzimática de JAK1 (H)

Se incubaron juntos JAK1 (h), junto con Tris/HCl 20 mM, pH 7,5, EDTA 0,2 mM, MGEEPLYWSFPAKKK 500 |jM, acetato de magnesio 10 mM y [<y>-33P]-ATP (actividad y concentración del cual se adaptaron según fuera necesario). Se añadió una mezcla de Mg/ATP para iniciar la reacción. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 40 minutos, se añadió ácido fosfórico al 0,5 % para terminar la reacción. Después se goteó 10 j l del reactivo en una almohadilla de filtro P30, se lavó con ácido fosfórico al 0,425 % tres veces y después con metanol una vez dentro de 4 minutos, se secó y se contó mediante centelleo.

Reacción enzimática de JAK2 (h)

Se incubaron JAK2(h), junto con MOPS 8 mM, pH 7,0, EDTA 0,2 mM, KTFCGTPEYLAPEVRREPRILSEEEQEMFRDFDYIADWC 100 jM , acetato de magnesio 10 mM y [<y>-33P]-ATP (actividad y concentración del cual se adaptaron según fuera necesario). Se añadió una mezcla de Mg/ATP para iniciar la reacción. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 40 minutos, se añadió ácido fosfórico al 0,5 % para terminar la reacción. Después se goteó 10 j l del reactivo en una almohadilla de filtro P30, se lavó con ácido fosfórico al 0,425 % tres veces y después con metanol una vez dentro de 4 minutos, se secó y se contó mediante centelleo.

Reacción enzimática de JAK3 (h)

Se incubaron JAK3 (h), junto con MOPS 8 mM, pH 7,0, EDTA 0,2 mM, GGEEEEYFELVKKKK 500 jM , acetato de magnesio 10 mM y [<y>-33P]-ATP (actividad y concentración del cual se adaptaron según fuera necesario). Se añadió una mezcla de Mg/ATP para iniciar la reacción. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 40 minutos, se añadió ácido fosfórico al 0,5 % para terminar la reacción. Después se goteó 10 j l del reactivo en una almohadilla de filtro P30, se lavó con ácido fosfórico al 0,425 % tres veces y después con metanol una vez dentro de 4 minutos, se secó y se contó mediante centelleo.

Reacción enzimática de TYK2 (h)

Se incubaron TYK2 (h), junto con MOPS 8 mM, pH 7,0, EDTA 0,2 mM, GGMEDIYFEFMGGKKK 250 jM , acetato de magnesio 10 mM y [<y>-33P]-ATP (actividad y concentración del cual se adaptaron según fuera necesario). Se añadió una mezcla de Mg/ATP para iniciar la reacción. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 40 minutos, se añadió ácido fosfórico al 0,5 % para terminar la reacción. Después se goteó 10 j l del reactivo en una almohadilla de filtro P30, se lavó con ácido fosfórico al 0,425 % tres veces y después con metanol una vez dentro de 4 minutos, se secó y se contó mediante centelleo.

Análisis de datos

Los resultados de IC50 se obtuvieron del análisis de XLFIT5 (fórmula 205) de la compañía IDBS. Ver Tabla 6 para más detalles.

T l R l l r ri in vir l m r n l r n li i

Conclusión: el compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la presente invención muestra una buena inhibición selectiva de JAK1 y/o TYK2 en la prueba de actividad in vitro de cuatro subtipos de cinasas JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2.

Ejemplo experimental 2: prueba de farmacocinética (PK)

Una solución transparente obtenida después de disolver el compuesto de prueba se administró a ratones (C57BL/6) o ratas (SD) machos (en ayunas durante toda la noche, 7-8 semanas de edad) por la vena de la cola y por sonda gástrica. Después de la administración del compuesto de prueba, la sangre se recolectó por separado de la vena mandibular a las 0,117, 0,333, 1, 2, 4, 7 y 24 horas en un grupo de inyección intravenosa (2 mg/kg) y 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 y 24 horas en un grupo de sonda gástrica (15 mg/kg), y se centrifugó para obtener un plasma. La concentración del fármaco en la sangre se determinó mediante LC-MS/MS y se usó el software farmacocinético WinNonlin™ versión 6.3 para calcular los parámetros farmacocinéticos relevantes mediante el método trapezoide logarítmico lineal del modelo no atrioventricular. Los resultados de la prueba son los siguientes:

Conclusión: el compuesto de fórmula (I) de la invención tiene buena biodisponibilidad oral y alta exposición en ratones, lo que es propicio para producir una buena eficacia del fármaco in vivo.

Ejemplo experimental 3: estudio farmacodinámico in vivo de la artritis inducida por colágeno (CIA) en ratones Propósito del experimento:

La artritis reumatoide (AR) es un tipo de enfermedad autoinmunitaria que se produce con frecuencia, con una tasa de incidencia global de aproximadamente 1 %. Se debe a la reacción autoinmunitaria que provoca inflamación, lesión y deformidad de las articulaciones y, en los casos graves, provocará una reacción inflamatoria sistémica. La investigación y el desarrollo de fármacos para la AR ayudará a aliviar los síntomas de la artritis reumatoide y a mejorar la calidad de vida de los pacientes. El modelo de artritis en ratones inducida por colágeno se usa a menudo para evaluar la eficacia de los fármacos en el tratamiento de la AR, y su patogenia y síntomas se correlacionan significativamente con las enfermedades de AR. El modelo se inyecta con colágeno tipo II para activar la reactividad de las células B y las células T al colágeno óseo, y las células B y las células T activadas entran en una articulación para provocar daño articular, lo que conduce a una serie de síntomas similares a la artritis reumatoide humana. La artritis inducida por colágeno en ratones se usa a menudo para evaluar su efectividad en la evaluación preclínica de compuestos candidatos para el tratamiento farmacológico de la artritis reumatoide.

El propósito de este experimento es investigar el efecto terapéutico del compuesto de fórmula (I) y el compuesto de referencia Filgotinib sobre la artritis inducida por colágeno en ratones, para proporcionar información farmacodinámica preclínica para estudios clínicos posteriores.

Método experimental:

1. Inmunización con colágeno tipo II/adyuvante completo de Freund

Preparación de ácido acético: El ácido acético 2 N se diluyó a 100 mM, se filtró con una membrana de filtro de 0,22 micras y se almacenó a 4 °C.

Solución de colágeno tipo II bovino: el colágeno tipo II bovino (CII) se disolvió en solución de ácido acético 100 mM y se almacenó a 4 °C durante toda la noche. Una concentración final del colágeno fue de 8 mg/ml.

Preparación de una emulsión: la solución de CII almacenada durante toda la noche se mezcló con un volumen igual de adyuvante completo de Freund, se homogeneizó en un homogeneizador de alta velocidad en hielo a 30 000 rpm durante aproximadamente 60 minutos hasta que la solución formó una emulsión estable.

2. Inducción de la artritis:

Los ratones se asignaron aleatoriamente a diferentes grupos de tratamiento. El día para la primera inmunización se registró como día 0, y los días posteriores se marcaron en orden.

Los ratones DBA/1 se anestesiaron con isoflurano y se inyectaron por vía subcutánea en la cola (2-3 cm desde la raíz de la cola) con 50 j l de emulsión de colágeno preparada (que incluye 200 |jg de CII). El día 21, se inyectó el mismo volumen de emulsión de colágeno en la cola con el mismo método. Los ratones en el grupo normal no se inmunizaron.

3. Administración y diseño de la dosis

El día 28, cuando la puntuación clínica promedio alcanzó aproximadamente 1 puntuación, se seleccionaron 50 ratones con incidencia moderada y se dividieron aleatoriamente en 5 grupos de tratamiento de acuerdo con su peso y puntuación, con 8 ratones en cada grupo.

Se administró dexametasona (DEX.), como fármaco de referencia para medir si el modelo se establece con éxito, mediante una dosis de 0,3 mg/kg (la dosis comúnmente usada en el modelo CIA). Además, de acuerdo con los resultados de un experimento previo en la etapa temprana de este experimento, se determinaron el diseño de la dosis relevante del compuesto de prueba y del compuesto de referencia Filgotinib, como se muestra en la Tabla 8-1: un primer grupo eran ratones normales sin ningún tratamiento; a un segundo grupo se le dio un grupo de control que contenía solo solvente; a un tercer grupo se le dio dexametasona a una dosis de 0,3 mg/kg; a un sexto grupo y a un octavo grupo se le dieron 15 mg/kg y 15 mg/kg, respectivamente. Los ratones se administraron dos veces al día durante 14 días.

Tabla 8-1 Gru o diseño de dosis

4. Determinación del índice de incidencia de artritis

Observación clínica: el estado de salud básico y los cambios de peso de ratones DBA/1 se observaron todos los días desde 7 días antes de la inmunización hasta 21 días después de la inmunización (registrado una vez a la semana). Después del día 22, el estado de salud, la morbilidad y los cambios de peso de los ratones se observaron todos los días (registrados al menos tres veces a la semana) hasta el final del experimento.

Puntuación clínica: después de potenciar la inmunidad, la incidencia de ratones se observó todos los días. Tras el inicio de la enfermedad (síntomas clínicos de artritis), los ratones se puntuaron de 0-4 puntos de acuerdo con los diferentes grados de la enfermedad (enrojecimiento, hinchazón, deformación articular). La puntuación máxima de cada extremidad fue 4 puntos, y la puntuación máxima de cada animal fue 16 puntos. Los criterios de puntuación se muestran en la Tabla 8-2. La puntuación se realizó al menos tres veces a la semana.

T l -2 ri ri n i n líni l rrii

5. Procesamiento estadístico

Los datos experimentales se expresaron como media ± error estándar (media ± SEM), y el área bajo la curva (AUC) se analizó mediante ANOVA unidireccional, (P < 0,05) se consideró una diferencia significativa.

Resultados experimentales:

1. puntuación clínica y tasa de incidencia:

El día 28 después de la primera inmunización (el día 7 después de la segunda inmunización), los ratones comenzaron a desarrollar síntomas clínicos de artritis. La administración se inició el día 28. Los resultados detallados del experimento se mostraron en la Tabla 8-3: la puntuación clínica promedio del grupo de control de solvente aumentó gradualmente a 5,8 en el día 41, lo que sugiere un establecimiento exitoso del modelo de artritis inducida por colágeno. El compuesto de fórmula (I) y Filgotinib a la misma dosis de 15 mg/kg pueden reducir significativamente la puntuación clínica de los ratones con artritis en el punto final del experimento (el día 41). A esta dosis, la puntuación clínica promedio de los compuestos de fórmula (I) y el Filgotinib se redujo a 1,5 y 5,6 (ver Tabla 8-3 para los valores). Puede verse que el compuesto de fórmula (I) puede reducir eficazmente la artritis inducida por colágeno a 15 mg/kg. La dexametasona a 0,3 mg/kg (grupo G3) puede inhibir significativamente la puntuación clínica de la artritis inducida por colágeno. La puntuación clínica se mantuvo en aproximadamente 0,3 desde el día 27 y disminuyó a 0 el día 31 (la puntuación clínica se redujo a 0, por favor ver la Tabla 8-3 para los valores).

T l - * P n i n líni r m i n l r n li i

Al analizar la curva de puntuación clínica de cada animal en cada grupo, se calculó el área bajo la curva (AUC), y se calculó la tasa de inhibición de los grupos de administración individuales con relación al grupo de control de solvente a través de un AUC promedio entre grupos. Los resultados detallados se muestran en la Tabla 8 4: el compuesto de fórmula (I) y el Filgotinib pueden reducir el AUC de la puntuación clínica de los animales con artritis a la misma dosis de 15 mg/kg, y las tasas de inhibición son 59,9 % y 18,7 %, respectivamente. La dexametasona también puede reducir significativamente la puntuación clínica de los animales con artritis, con una tasa de inhibición del 97,3 %.

Tabla 8-4 * Área bao la curva de incidencia

Diversos factores de tratamiento también pueden afectar la incidencia de la artritis inducida por colágeno. Los resultados detallados del experimento se muestran en la Tabla 8-5: la tasa de incidencia de compuestos de fórmula (I) alcanzó el 63 % en el día 29 y se mantuvo hasta el final del experimento (ver Tabla 8-5 para valores específicos). La tasa de incidencia del grupo de Filgotinib disminuyó después de la primera administración y después aumentó gradualmente hasta que alcanzó el 100 % después de la última administración. La incidencia de artritis en el grupo de control de solvente alcanzó y se mantuvo en 100 % en el día 34 después de la inmunización. La tasa de incidencia del grupo de control positivo de 0,3 mg/kg de dexametasona comenzó a disminuir después de la administración y disminuyó al 0 % el día 31.

- *

2. Peso

Los resultados detallados del experimento se mostraron en la Tabla 8-6: en comparación con el grupo normal, el peso corporal de los ratones disminuyó después del modelado inmunitario. El peso corporal de los grupos de administración individuales disminuyó del día 28 al día 34, y después el peso corporal comenzó a aumentar lentamente. El grupo de dexametasona tuvo la mayor pérdida de peso, pero no hubo una diferencia significativa en comparación con otros grupos. No hubo diferencia significativa entre el compuesto de fórmula (I) y el Filgotinib, que tiene una tendencia de cambio de peso corporal básicamente igual (ver Tabla 8-6 para valores específicos), lo que sugiere que el compuesto tiene poco efecto sobre el peso corporal de los ratones.

T l - * P r r l r m i n l r n li i

Conclusión: en los modelos de artritis inducida por colágeno (CIA) en ratones, el compuesto de fórmula (I) muestra un buen efecto de tratamiento de la enfermedad, no tiene un efecto significativo sobre el peso corporal de los ratones y es mejor que el del Filgotinib en ratones a la misma dosis.

Ejemplo experimental 4: estudio farmacodinámico in vivo de la artritis inducida por adyuvante (AIA) en ratas

Propósito del experimento:

El modelo en ratas de la artritis inducida por adyuvante (AIA) es uno de los modelos animales usados comúnmente en la investigación de la enfermedad de la artritis reumatoide y el desarrollo de nuevos fármacos. Su patogenia y síntomas clínicos son similares a los de la enfermedad de la artritis reumatoide humana. En este modelo, la inyección de Mycobacterium tuberculosis en la almohadilla plantar indujo células inmunitarias y anticuerpos con función de lesión ósea y articular, lo que provocó una respuesta sistemática, que incluye hinchazón articular, osteólisis, lesión sinovial y otros síntomas similares a la artritis reumatoide humana. El propósito de este experimento es evaluar el efecto terapéutico del compuesto de fórmula (I) en el modelo en rata de artritis inducida por adyuvante, mediante el uso de dexametasona y Filgotinib como compuestos de referencia. En este experimento hay 8 grupos: grupo normal, grupo de control de solvente (grupo de vehículo), grupos de dosis de 1 mg/kg BID, 3 mg/kg BID, 10 mg/kg BID y 30 mg/kg BID del compuesto de fórmula (I), grupo de fármaco positivo de 0,3 mg/kg QD de dexametasona y grupo del compuesto de referencia de 30 mg/kg de Filgotinib. Todas las ratas, excepto el grupo normal, se inyectan por vía subcutánea con el adyuvante completo de Freund para inducir artritis el día 0. De acuerdo con el protocolo experimental, los grupos se dividen de acuerdo con el peso corporal y se puntúan en el día 13, y la administración se continuó durante 14 días. Durante el experimento, se monitorean el peso corporal, el volumen de la pata (medido tres veces a la semana después del día 13) y la puntuación clínica. Al final del experimento, se recoge la pata trasera derecha de las ratas para el análisis de tinción con hematoxilina eosina (HE) y la puntuación patológica.

Método experimental

1. Modelo de artritis

Preparación de adyuvante: se pesaron 100 mg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra, se trituraron durante aproximadamente 5 minutos, se añadieron 3 ml de aceite de parafina para disolver el polvo, y se transfirieron a una botella dispensadora marrón. A continuación, el mortero se lavó dos veces con 3 ml y 4 ml de aceite de parafina, respectivamente, y la solución obtenida se transfirió a la botella dispensadora marrón para alcanzar una concentración final de 10 mg/ml. Se realizó trituración ultrasónica, que incluye tratamiento ultrasónico en una mezcla de agua con hielo durante aproximadamente 30 minutos.

2. Inducción de artritis

El adyuvante preparado se agitó y se mezcló, se extrajo con una jeringa de vidrio de 1 ml (aguja 20G) y después con una aguja 25g para eliminar las burbujas. Las ratas se anestesiaron con isoflurano. Antes de inmunizar a cada una de las ratas, la jeringa se colocó boca abajo para mezclar completamente el Mycobacterium tuberculosis. Después de la anestesia, se inyectó 0,1 ml de adyuvante por vía subcutánea en una planta de una pata izquierda de una rata. Se inyectó 0,1 ml de aceite de parafina por vía subcutánea en una planta de una rata normal. El día de la inyección del adyuvante fue el día 0.

3. Administración

En el día 13, todos los animales mostraron síntomas de artritis tales como eritema o hinchazón en las patas. Estos se estratificaron y se dividieron aleatoriamente en grupos de acuerdo con la puntuación, el volumen y el peso de la pata. Ver la Tabla 9-1 para el agrupamiento. 70 ratas se dividieron en 7 grupos, 10 ratas en cada grupo y 5 ratas en el grupo normal. De acuerdo con la Tabla 9-1, la dosificación de cada grupo fue la siguiente. El volumen de administración intragástrica fue 5 ml/kg. El compuesto se administró dos veces al día durante 14 días.

Tabla 9-1 A ru ación diseño de dosis

4. Determinación del índice de incidencia de artritis

Peso: pesados tres veces a la semana desde el día 13 al día 27.

Volumen de la pata: medido una vez antes de la inmunización y tres veces a la semana desde el día 13 al día 27.

Puntuación: puntuado tres veces a la semana desde el día 13 al día 27. De acuerdo con los diferentes grados de lesiones (enrojecimiento, hinchazón, deformación articular), la puntuación se evalúa de acuerdo con el estándar de 0-4 puntos. La puntuación máxima de cada extremidad es 4 puntos, y la puntuación máxima de cada animal es 12 puntos (excepto para la extremidad trasera izquierda en el lado de la inyección). Los criterios de puntuación se muestran en la Tabla 9-2.

T l -2 ri ri n i n líni l rrii

5. Análisis patológico

El día 27, las ratas se sacrificaron. Después de la recolección de sangre, se tomó la pata trasera derecha de las ratas, se empapó en solución de formalina al 10 %, se descalcificó con solución de ácido fórmico, se incluyó en parafina, se cortó, se tiñó con HE y se observó al microscopio. El grado de lesión articular se evaluó desde cuatro aspectos: infiltración de células inflamatorias, formación de pannus, lesión del cartílago y resorción ósea, y se puntuó de acuerdo con el estándar de 0-4. Los criterios de puntuación son los siguientes (tabla 9-3):

T l - ri ri n i n l l í l rrii

6. Procesamiento estadístico

Los datos experimentales se expresaron como media ± error estándar (media ± SEM), y el peso, la puntuación clínica y la puntuación patológica se analizaron mediante ANOVA unidireccional, (P < 0,05) se consideró una diferencia significativa.

Resultado experimental

1. Puntuación clínica

En este experimento, se evaluó el efecto del compuesto de fórmula (I) sobre la mejora de la puntuación clínica en el modelo de artritis en ratas (AIA), con dexametasona y Filgotinib como referencia. En el día 6 después de la inmunización con adyuvante, las ratas comenzaron a tener síntomas de artritis. Después de la administración en el día 13, la puntuación clínica promedio del grupo de control de solvente aumentó gradualmente. Los resultados experimentales mostraron que la puntuación clínica promedio del grupo de control de solvente alcanzó su punto máximo el día 24 y se mantuvo en aproximadamente 8 puntos, lo que marca el establecimiento exitoso del modelo AIA (Tabla 9-4).

En el punto final (el día 27), el compuesto de fórmula (I) inhibió significativamente las puntuaciones clínicas de ratas con artritis a cuatro dosis de 1, 3, 10 y 30 mg/kg (P < 0,0001 en comparación con el grupo de control de solvente), y redujo las puntuaciones clínicas de ratas con artritis a 5,4, 3,9, 3,2 y 2,7 respectivamente de manera dependiente de la dosis (P < 0,0001 en comparación con el grupo de dosis alta y el grupo de dosis baja). Entre ellos, el efecto del compuesto de fórmula (I) a 30 mg/kg es el más evidente (a partir del día 17, hay una diferencia muy significativa en comparación con el grupo de control de solvente, P < 0,0001). La puntuación clínica promedio de artritis de este grupo disminuyó desde el pico de 6,0 en el día 13 a 2,7 en el día 27 (Tabla 9-4). La puntuación del compuesto de referencia Filgotinib a 30 mg/kg BID disminuyó a 5,1 en el punto final experimental en el día 27, que fue significativamente menor que el del grupo de control de solvente (P < 0,001), pero significativamente mayor que el del compuesto de fórmula (I) a 30 mg/kg BID (P < 0,001). El efecto de mejora del compuesto de fórmula (I) sobre la puntuación clínica de la artritis es significativamente mejor que el del Filgotinib a la misma dosis.

La puntuación clínica promedio del grupo de tratamiento con dexametasona de control positivo alcanzó el valor más alto de 6,0 puntos después del día 13. Después de la administración, la puntuación clínica continuó disminuyendo hasta 2,7 puntos en el punto final experimental en el día 27. Desde el día 17, hubo una diferencia muy significativa en comparación con el grupo de control de solvente (Tabla 9-4).

2. Volumen de la pata

Este experimento evaluó el efecto del compuesto de fórmula (I) sobre el volumen de las patas en el modelo de artritis en ratas (AIA), con dexametasona y Filgotinib como referencia. El volumen promedio de la pata de los animales en el grupo de control de solvente aumentó constantemente de 1,9 ml el día 13 a 2,9 ml al final del experimento el día 27, lo que marca el establecimiento exitoso del modelo de AIA (tabla 9-5). Al final del experimento, el compuesto de fórmula (I) pudo inhibir significativamente el aumento del volumen de la pata de ratas con artritis a las dosis de 1, 3, 10 y 30 mg/kg (P < 0,0001 en comparación con el grupo de control de solvente), y el volumen promedio de la pata de ratas con artritis disminuyó a 1,91 ml, 1,59 ml, 1,26 ml y 1,21 ml respectivamente de una manera dependiente de la dosis (P < 0,0001 en comparación con el grupo de dosis alta y el grupo de dosis baja). El compuesto de referencia Filgotinib a 30 mg/kg BID disminuyó a 1,91 puntos en el punto final experimental el día 27, que fue significativamente menor que el del grupo de control de solvente (P<0,0001), pero significativamente mayor que el del compuesto de fórmula (I) a 30 mg/kg BID (P<0,0001). El efecto del compuesto de fórmula (I) sobre la mejora del volumen de la pata de rata es significativamente mejor que el del Filgotinib a la misma dosis. El grupo de tratamiento con dexametasona de control positivo también inhibió bien el aumento del volumen de la pata promedio. Después de la administración, el volumen de la pata disminuyó constantemente y se mantuvo en 1,21 ml hasta el final del experimento. Desde el día 17, hubo una diferencia muy significativa en comparación con el grupo de control de solvente, P < 0,0001 (Tabla 9-5)

3. Peso

En comparación con el grupo normal, el peso corporal de las ratas después del modelado inmunitario disminuyó. Después de la administración en el día 13, el peso corporal de cada grupo de administración aumentó lenta y continuamente en comparación con el grupo de control de solvente, mientras que el peso corporal del grupo de control positivo con dexametasona se recuperó lentamente. Este resultado sugiere que las ratas tienen buena tolerancia al Filgotinib y los compuestos de fórmula (I). El peso corporal del grupo de compuesto de fórmula (I) a 30 mg/kg aumentó más rápido, y la tendencia del aumento del peso corporal a cuatro dosis mostró una relación dependiente de la dosis (tabla 9-6).

4. Resultados de la prueba histopatológica

La puntuación patológica total de las ratas con artritis en el grupo de control de solvente fue 16 ± 0,00. La puntuación del compuesto de fórmula (I) se redujo a 13,3 ± 0,44 a la dosis de 1 mg/kg (P = 0,09 en comparación con el grupo de control de solvente), y la tasa de inhibición fue 16,9 %. A las dosis de 3 mg/kg, 10 mg/kg y 30 mg/kg, las puntuaciones patológicas de las ratas con artritis se redujeron significativamente a 11,3 ± 1,64, 4,4 ± 1,16 y 1,6 ± 0,47, respectivamente. Los valores de P fueron 0,014, < 0,0001 y < 0,0001, respectivamente. Las tasas de inhibición fueron 29,4 %, 72,5 % y 90 %. La puntuación patológica total del compuesto de referencia Filgotinib a 30 mg/kg fue 15,2 ± 0,49 y la tasa de inhibición fue 5 %. No hubo diferencia significativa en comparación con el grupo de solvente. La puntuación patológica total del compuesto de fórmula (I) a la misma dosis (30 mg/kg) fue significativamente menor que la del Filgotinib (P<0,0001). El compuesto de control dexametasona de 0,3 mg/kg redujo significativamente la puntuación patológica de las ratas con artritis a 4,4 ± 0,8, P < 0,0001, y la tasa de inhibición fue del 72,5 % (Tabla 9-7).

-

Conclusión: las ratas en el grupo de control de solvente tenían los síntomas clínicos de artritis y continúan agravándose. En comparación con el grupo de control de solvente, los compuestos de fórmula (I) (1,3,10,30 mg/kg), Filgotinib (30 mg/kg) y dexametasona (0,3 mg/kg) mostraron efectos inhibitorios significativos sobre la artritis inducida por adyuvante, que mostraron un tiempo de inicio retardado y síntomas clínicos y cambios patológicos reducidos significativamente. El efecto terapéutico del compuesto de fórmula (I) en el modelo de artritis inducida por adyuvante fue dependiente de la dosis. Los resultados experimentales anteriores muestran que el compuesto de fórmula (I) tiene un efecto terapéutico evidente sobre la artritis inducida por adyuvante en ratas, y el efecto es mejor que el del Filgotinib.

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES 1. Una forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) tiene picos de difracción característicos en los siguientes ángulos 20 en un espectro de difracción de rayos X en polvo (XRPD) medido mediante el uso de radiación CuKal: 6,91 ± 0,20°, 12,21 ± 0,20° y 19,06 ± 0,20°:
2. 2. La forma cristalina A de acuerdo con la reivindicación 1, en donde tiene picos de difracción característicos en los siguientes ángulos 20 en el espectro de difracción de rayos X en polvo (XRPD): 6.91 ± 0,20°, 12,21 ± 0,20°, 13,69 ± 0,20°, 19,06 ± 0,20°, 19,86 ± 0,20°, 20,59 ± 0,20°, 22,06 ± 0,20° y 27,52 ± 0,20°.
3. 3. La forma cristalina A de acuerdo con la reivindicación 2, en donde tiene picos de difracción característicos en los siguientes ángulos 20 en el espectro de difracción de rayos X en polvo (XRPD): 6.91 ± 0,20°, 10,34 ± 0,20°, 12,21 ± 0,20°, 13,69 ± 0,20°, 18,11 ± 0,20°, 19,06 ± 0,20°, 19,86 ± 0,20°, 20,59 ± 0,20°, 22,06 ± 0,20° y 27,52 ± 0,20°.
4. 4. La forma cristalina A de acuerdo con la reivindicación 3, en donde tiene picos de difracción característicos en los siguientes ángulos 20 en el espectro de difracción de rayos X en polvo (XRPD): 6.91 ± 0,20°, 10,34 ± 0,20°, 12,21 ± 0,20°, 13,69 ± 0,20°, 17,44 ± 0,20°, 18,11 ± 0,20°, 19,06 ± 0,20°, 19,86 ± 0,20°, 20,59 ± 0,20°, 22,06 ± 0,20°, 24,46 ± 0,20° y 27,52 ± 0,20°.
5. 5. La forma cristalina A de acuerdo con la reivindicación 4, en donde tiene un espectro de XRPD mostrado en la Figura 1.
6. 6. La forma cristalina A de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde tiene un valor de pico endotérmico respectivamente a 152,19± 3 °C y 216,79 ± 3 °C en una curva de calorimetría diferencial de barrido; y un valor de pico exotérmico a 161,50 ± 3 °C.
7. 7. La forma cristalina A de acuerdo con la reivindicación 6, en donde tiene un espectro de DSC mostrado en la Figura 2.
8. 8. Una forma cristalina B del compuesto de fórmula (I) tiene picos de difracción característicos en un espectro de difracción de rayos X en polvo en los siguientes ángulos 20 medidos mediante el uso de radiación CuKa1: 5,13 ± 0,20°, 19,14 ± 0,20° y 21,18 ± 0,20°:
9. 9. La forma cristalina B de acuerdo con la reivindicación 8, en donde tiene picos de difracción característicos en el espectro de difracción de rayos X en polvo en los siguientes ángulos 20: 5,13 ± 0,20°, 7,34 ± 0,20°, 10,14 ± 0,20°, 10,56 ± 0,20°, 11,72 ± 0,20°, 16,67 ± 0,20°, 19,14 ± 0,20° y 21,18 ± 0,20°.
10. 10. La forma cristalina B de acuerdo con la reivindicación 9, en donde tiene picos de difracción