RS67051B1

RS67051B1 - Vakcina protiv svinjskog parvovirusa

Info

Publication number: RS67051B1
Application number: RS20250609A
Authority: RS
Inventors: Eric Martin Vaughn; Scott Eugene Bucklin; Troy James KAISER; Jeremy Kroll; Philip Utley
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh
Priority date: 2016-11-03
Filing date: 2017-11-02
Publication date: 2025-08-29
Also published as: EA201991065A1; US20200030438A1; CN109803678B; EP3534945A1; CL2019001049A1; US10485866B2; MX2019005137A; JP2021097679A; CN109803678A; UA127859C2; WO2018083154A1; PT3534945T; JP6876127B2; TWI781962B; FI3534945T3; EP4570264A3; CA3042573A1; AU2017353378B2; MY191490A; AU2017353378A1

Description

Opis

[0001] Ova prijava sadrži spisak sekvenci u skladu sa 37 C.F.R.1.821 - 1.825

POZADINA PRONALASKA

[0002] Svinjski parvovirus je autonomni replikacioni virus podfamilije Parvovirinae roda Protoparvovirus unutar familije Parvoviridae koja sadrži jednolančani DNK molekul od oko 5100 nukleotida (Cotmore et al.2014: Arch Virol.: 159(5): 1239-1247; Molitor et al., 1984: Virology: 137(2): 241-54.). Samo minus lanac DNK je pakovan u virione. Genom virusa kodira tri kapsidna proteina (VP1, VP2, VP3) i jedan nestrukturni protein (NS1). Kapsid parvovirusa je prečnika oko 22-25 nanometara i sastoji se od VP1 i VP2 podjedinica. Ovi proteini su izvedeni iz alternativno spojenih verzija istog RNK molekula i stoga se preklapaju u sekvenci. Dalje, svinjski parvovirus pokazuje visok nivo sličnosti sekvenci sa virusom panleukopenije mačaka, parvovirusima pasa i parvovirusom glodara (Ranz et al., 1989: J. gen. Virol: 70:2541-2553).

[0003] Iako postoje razlike u sojevima parvovirusa svinja, od kojih su neki izuzetno patogeni, a drugi manje patogeni ili potpuno nepatogeni, kada se virus uspostavi ili postane endemičan u nekoj zemlji, čini se da patogeni sojevi cirkulišu u populaciji.

[0004] Infekcija parvovirusom svinja (PPV) je čest uzrok reproduktivnog neuspeha kod priplodnih svinja širom sveta. Serološke studije pokazuju da je parvovirus svinja široko rasprostranjen u svim regionima sveta koji se bave proizvodnjom svinja, sa do 80% životinja koje pokazuju serokonverziju.

[0005] Svinjski parvovirus (PPV) uzrokuje reproduktivni neuspeh kod svinja, što dovodi do smrti i fetalne mumifikacije, mrtvorođenosti i drugih reproduktivnih neuspeha kod gravidnih krmača. (Joo & Johnson. 1976 Veterinary Bulletin 46, 653-660; Mengeling. 1978. J. Am. Vet. Med. Assoc. 172, 1291-1294).

[0006] PPV izaziva reproduktivni neuspeh kada su osetljive (neimune) nazimice i krmače zaražene tokom trudnoće. Ovo je jedini put da virus izazove bolest. Infekcija kod svinje se javlja nakon gutanja ili udisanja virusa. PPV zatim cirkuliše u krvotoku, a kod skotne svinje prelazi placentu i inficira embrione i fetuse u razvoju. Nakon prirodne infekcije razvija se aktivni imunitet koji verovatno traje za života svinje. Ako se aktivni imunitet pojavi pre trudnoće, to ne utiče na prasad u razvoju. Po rođenju prasad dobija majčinski imunitet u kolostrumu od krmače i taj majčinski imunitet traje do 20 nedelja starosti. Što je veći nivo aktivnog imuniteta kod krmače, to više majčinskog imuniteta ona prenosi na svoju prasad. Nakon toga može doći do prirodne infekcije PPV-om.

[0007] Bolest izazvana PPV-om kod svinja često se naziva SMEDI (akronim za mrtvorođenost, mumifikaciju, embrionalnu smrt i neplodnost). Ako dođe do infekcije na dan 0-30 trudnoće, može doći do smrtnosti embriona, što dovodi do smanjenja veličine legla. Najočiglednija karakteristika nakon infekcije u 30-70 dana trudnoće je rođenje mumificirane prasadi. Mumifikacija je proces sterilne digestije tkiva prasadi koja umiru u materici nakon što skelet počne da se stvrdnjava. PPV infekcija je takođe povezana sa mrtvorođenčadi i slabošću prasadi ako se infekcija pojavi u kasnijim fazama graviditeta. Abortus može biti i posledica PPV infekcije, ali nije čest klinički znak ove bolesti. Sve u svemu, PPV infekcija smanjuje broj prasadi rođenih po krmači godišnje.

[0008] Trenutno dostupne PPV vakcine proizvode se uzgojem nativnog virusa na primarnim ćelijama svinjskog porekla ili u utvrđenim ćelijskim linijama. Nakon toga, infektivni virus se izoluje i inaktivira hemijskim agensima kako bi završio sa vakcinom protiv virusa ubijene cele ćelije. Međutim, takvi procesi uzgoja nativnog infektivnog virusa su problematični u smislu biosigurnosnih i bezbednosnih pitanja. Stoga postoji potreba za rekombinantnim PPV vakcinama.

[0009] Vakcine podjedinice zasnovane na rekombinantnim proteinima mogu patiti od slabe imunogenosti zbog nepravilnog savijanja ciljnog proteina ili loše prezentacije imunološkom sistemu. Dalje, vakcine koje ubijaju cele ćelije predstavljaju sve antigene nativnog virusa, dok u vakcini sa podjedinicom postoji ograničenje na specifičnu sekvencu aminokiselina.

[0010] Rekombinantne PPV vakcine su već opisane u prethodnom stanju tehnike, međutim, do sada su komercijalno dostupne samo vakcine sa ubijenim celim ćelijama. Dakle, čini se da do sada nije razvijena nijedna odgovarajuća vakcina rekombinantne PPV podjedinice koja se pokazala efikasnom i bezbednom. Do sada opisane vakcine rekombinantne PPV podjedinice nisu testirane u kontrolisanim, laboratorijskim eksperimentima izazova. Vakcine rekombinantne PPV podjedinice koje su procenjene, nisu delovale kao i PPV vakcine sa ubijenim celim ćelijama ili vakcine rekombinantne PPV podjedinice nisu bile bezbedne (prikazane neželjene reakcije). Stoga i dalje postoji potreba da vakcine rekombinantne PPV podjedinice budu visoko efikasne i bezbedne.

[0011] Identifikovani su terenski izolati svinjskog parvovirusa (PPV) koji se genetski i antigenski razlikuju od sojeva vakcine. PPV virus genotipa 2, PPV-27a, je visoko virulentan kod gravidnih nazimica nakon eksperimentalne infekcije, što je pokazano visokim mortalitetom među fetusima krmača zaraženih sa PPV-27a (85%) u poređenju sa krmačama zaraženim sa drugim sojevima PPV, npr. PPV-NADL-2. Međutim, trenutno dostupne komercijalne vakcine protiv PPV zasnovane su na inaktiviranim preparatima sojeva celog virusa PPV genotipa 1 izolovanih pre nekih 30 godina (Jozwik et al 2009; Journal of General Virology; 90; 2437-2441). Dakle, postoji potreba za novim vakcinama koje štite od novih visoko virulentnih patogenih sojeva PPV koji bolje odgovaraju PPV na terenu.

[0012] Dalje prethodno stanje tehnike je sledeće:

EP 0551 449 A1 obelodanjuje metodu za proizvodnju vakcine VP2 podjedinice protiv svinjskog parvovirusa.

Cadar D et al. (Infection, Genetics and Evolution 2012, 12: 1163-1171) opisuje filogenu i evolucionu genetiku parvovirusa svinja kod divljih svinja.

Streck AF et al. (Journal of General Virology 2011, 92: 2628-2636) opisuje visoku stopu evolucije virusa u kapsidnom proteinu svinjskog parvovirusa.

WO 88/02026 se odnosi na prazne virusne vakcine sa kapsidom.

Martinez C et al. (Vaccine 1992, 10(10): 684-690), obelodanjuje proizvodnju praznih kapsida parvovirusa svinja sa visokom imunogenom aktivnošću.

Xu F et al. (Applied and Environmental Microbiology 2007, 73(21):7041-7047) opisuje indukciju imunoloških odgovora kod miševa nakon intragastrične primene proteina Lactobacillus casei koji proizvodi svinjski parvovirus VP2 protein.

[0013] Štaviše, postoji potreba za novim i boljim vakcinama protiv ekstremno patogenih sojeva PPV, koje pružaju širu zaštitu od različitih (heterolognih) sojeva (unakrsna zaštita) PPV.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0014] Pre nego što se opišu aspekti ovog pronalaska, mora se napomenuti da, kako se ovde koristi i u priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine "neki", "jedan" i "ovaj" uključuju referencu množine, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, pozivanje na „antigen“ uključuje množinu antigena, pozivanje na „virus“ je pozivanje na jedan ili više virusa i njihovih ekvivalenata koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti, i tako dalje. Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se koriste ovde imaju isto značenje koje obično razume stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Iako se bilo koje metode i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su opisani u ovom dokumentu, mogu koristiti u praksi ili testiranju ovog pronalaska, sada su opisane poželjne metode i materijali. Sve ovde pomenute publikacije se spominju u svrhu opisivanja i otkrivanja ćelijskih linija, vektora i metodologija, kako je navedeno u publikacijama koje se mogu koristiti u vezi sa pronalaskom. Ništa u ovom dokumentu ne treba tumačiti kao priznanje da pronalazak nema pravo da antidatira takvo obelodanjivanje na osnovu prethodnog pronalaska.

[0015] Ovaj pronalazak rešava probleme inherentne prethodnom stanju tehnike i pruža jasan napredak u stanju tehnike. Generalno, ovaj pronalazak obezbeđuje virusni protein 2 (VP2) svinjskog parvovirusa (PPV) kako je navedeno u priloženim patentnim zahtevima.

[0016] Povoljno, eksperimentalni podaci dobijeni ovim pronalaskom obelodanjuju da je PPV VP2 podjedinica vakcine ovog pronalaska bezbedna i efikasna u sprečavanju viremije i PPV infekcije kod fetusa. Dalje, eksperimentalni podaci dobijeni ovim pronalaskom obelodanjuju da vakcina ovog pronalaska ima širok spektar zaštite, jer vakcina štiti od heterolognih severnoameričkih, kao i heterolognih evropskih sojeva PPV izazova.

[0017] Povoljno, eksperimentalni podaci dobijeni ovim pronalaskom obelodanjuju da je PPV VP2 podjedinica vakcine ovog pronalaska jednako efikasna kao i ceo ubijeni virus, što je iznenađujući efekat. Međutim, opsežni procesi inaktivacije (koji su neophodni za inaktivaciju nativne PPV prilikom generisanja vakcina protiv celog virusa) mogli bi se izbeći korišćenjem rekombinantne podjedinice vakcine koja se sastoji od PPV VP2.

[0018] Termin „svinjski parvovirus“ ili „PPV“ je dobro poznat stručnjaku u ovoj oblasti. Međutim, "parvovirus svinja" je autonomni replicirajući virus roda parvovirusa unutar familije Parvoviridae koji sadrži molekul jednolančane DNK. Genom virusa kodira tri kapsidna proteina (VP1, VP2, VP3) i jedan nestrukturni protein (NS1). Bolest izazvana PPV-om kod svinja često se naziva SMEDI (akronim za mrtvorođenost, mumifikaciju, embrionalnu smrt i neplodnost). Termin „parvovirus svinja“ obuhvata sve moguće sojeve, genotipove, fenotipove i serotipove parvovirusa svinja.

[0019] Termin „virusni protein 2“ ili „VP2“ odnosi se na kapsidni protein VP2 svinjskog parvovirusa. Termin "virusni protein 2" ili "VP2" je dobro poznat stručnjaku u ovoj oblasti.

[0020] Termini „protein“, „aminokiselina“ i „polipeptid“ se koriste naizmenično. Termin „protein“ se odnosi na sekvencu aminokiselina sastavljenu od prirodnih aminokiselina, kao i njihovih derivata. Prirodne aminokiseline su dobro poznate u struci i opisane su u standardnim udžbenicima biohemije. Unutar sekvence aminokiselina, aminokiselinski ostaci su povezani peptidnim vezama. Dalje, dva kraja aminokiselinske sekvence se nazivaju karboksilni terminus (C-terminus) i amino terminus (N-terminus). Termin „protein“ obuhvata u suštini prečišćene proteine ili proteinske preparate koji se dodatno sastoje od drugih proteina. Dalje, termin se odnosi i na proteinske fragmente. Štaviše, uključuje hemijski modifikovane proteine. Takve modifikacije mogu biti veštačke modifikacije ili prirodne modifikacije kao što su fosforilacija, glikozilacija, miristilacija i slično.

[0021] Termin „pri čemu se numerisanje pozicija aminokiselina odnosi na sekvencu aminokiselina divljeg tipa PPV VP2“ odnosi se na numerisanje pozicija aminokiselina koje se odnose na sekvencu aminokiselina divljeg tipa PPV VP2 proteina pune dužine. Poželjno je da se numerisanje aminokiselinskih pozicija kao što je ovde pomenuto odnosi na divlji tip PPV VP2 proteinske sekvence koja ima 579 aminokiselinskih ostataka, uključujući metioninski ostatak na (N-terminalnoj) aminokiselinskoj poziciji 1. Termin „pri čemu se numerisanje pozicija aminokiselina odnosi na sekvencu aminokiselina divljeg tipa PPV VP2“ obuhvata divlji tip PPV VP2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1 (PPV 27a VP2).

[0022] U ovom pronalasku PPV VP2 je kao što je navedeno u priloženim patentnim zahtevima.

[0023] Numerisanje pozicija aminokiselina se odnosi na sekvencu aminokiselina kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1. Generalno, ovaj pronalazak obezbeđuje virusni protein 2 (VP2) svinjskog parvovirusa (PPV) kako je navedeno u priloženim patentnim zahtevima, pri čemu se numerisanje pozicija aminokiselina odnosi na sekvencu aminokiselina divljeg tipa PPV VP2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1.

[0024] U jednom aspektu ovog pronalaska PPV VP2 je rekombinantni PPV VP2.

[0025] Termin „rekombinantni“ kako se ovde koristi, posebno se odnosi na molekul proteina koji je eksprimiran iz molekula rekombinantne DNK, kao što je polipeptid koji je proizveden tehnikama rekombinantne DNK. Primer takvih tehnika uključuje slučaj kada se DNK koja kodira eksprimirani protein (npr. PPV VP2) ubaci u odgovarajući ekspresioni vektor, poželjno ekspresioni vektor bakulovirusa, koji se zauzvrat koristi da transficira, ili u slučaju ekspresionog vektora bakulovirusa da inficira, ćeliju domaćina radi proizvodnje proteina ili polipeptida kodiranog od strane DNK. Termin „rekombinantni PPV VP2“, kako se ovde koristi, stoga se posebno odnosi na molekul proteina koji je eksprimiran iz molekula rekombinantne DNK.

[0026] U jednom aspektu ovog pronalaska PPV VP2 je rekombinantni bakulovirus eksprimirani PPV VP2.

[0027] Termin „bakulovirus“ ili „bakulovirusni sistem“ je dobro poznat stručnjaku u ovoj oblasti. Dalje, termin "bakulovirus" je naveden u nastavku.

[0028] U ovom pronalasku, PPV VP2 je virusni protein 2 (VP2) svinjskog parvovirusa (PPV) koji se sastoji od

● izoleucinskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 25, i

● serinskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 36, i

● izoleucinskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 37, i

● ostatka glutaminske kiseline ili ostatka glutamata na aminokiselinskoj poziciji 228, i ● serinskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 414, i

● glutaminskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 419, i

● treoninskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 436,

pri čemu se numerisanje aminokiselinske pozicije odnosi na aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa PPV VP2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1.

[0029] SEQ ID NO:4 je sekvenca nukleotida PPV 27a VP2 optimizovana kodonom koja je dalje modifikovana tako da ima dva ClaI restrikciona enzimska mesta (aminokiselinska pozicija 25 je ostatak izoleucina, aminokiselinska pozicija 36 je serinski ostatak, aminokiselinska pozicija 37 je ostatak izoleucina) tako da okružuje region kodiranja VP2 koji se sastoji od ponavljanja glicina. Međutim, mesta ClaI restriktivnih enzima uvedena su na način da ne poremete region kodiranja VP2. SEQ ID NO:2 je sekvenca proteina koja odgovara SEQ ID NO:4. SEQ ID NO:3 je sekvenca nukleotida PPV 27a VP2 optimizovana kodonom (bez ClaI restrikcionih enzimskih mesta). SEQ ID NO:1 je sekvenca proteina koja odgovara SEQ ID NO:3. SEQ ID NO: 5 do 16 obelodanjuju dalje sekvence proteina PPV VP2 sa (SEQ ID NO: 5 do 10) ili bez (SEQ ID NO: 11 do 16) ClaI restrikcionih enzimskih mesta.

[0030] Termini „nukleinska kiselina“ ili „sekvenca nukleinske kiseline“ ili „nukleotidna sekvenca“ ili „polinukleotid“ se ovde koriste naizmenično i odnose se na polinukleotide uključujući DNK molekule, RNK molekule, cDNK molekule ili derivate. Termin obuhvata jednolančane kao i dvolančane polinukleotide. Nukleinska kiselina ovog pronalaska obuhvata izolovane polinukleotide (tj. izolovane iz svog prirodnog konteksta) i genetski modifikovane oblike. Štaviše, obuhvaćeni su i hemijski modifikovani polinukleotidi, uključujući prirodno modifikovane polinukleotide kao što su glikozilirani ili metilirani polinukleotidi ili veštački modifikovani polinukleotidi kao što su biotinilisani polinukleotidi. Dalje, termini "nukleinska kiselina" i "polinukleotid" su zamenljivi i odnose se na bilo koju nukleinsku kiselinu. Termini „nukleinska kiselina“ i „polinukleotid“ takođe posebno uključuju nukleinske kiseline sastavljene od baza različitih od pet biološki prisutnih baza (adenin, gvanin, timin, citozin i uracil).

[0031] Termin „identičnost“ ili „identičnost sekvence“ poznat je u struci i odnosi se na odnos između dve ili više polipeptidnih sekvenci ili dve ili više polinukleotidnih sekvenci, odnosno referentne sekvence i date sekvence koju treba uporediti sa referentnom sekvencom.

Identičnost sekvence se određuje upoređivanjem date sekvence sa referentnom sekvencom nakon što su sekvence optimalno poravnate kako bi se proizveo najviši stepen sličnosti sekvence, što je određeno podudaranjem između nizova takvih sekvenci. Nakon takvog poravnanja, identičnost sekvence se utvrđuje na osnovu pozicije po poziciji, npr. sekvence su "identične" na određenoj poziciji ako su na toj poziciji nukleotidi ili aminokiselinski ostaci identični. Ukupan broj takvih identičnosti pozicija se zatim deli sa ukupnim brojem nukleotida ili rezidua u referentnoj sekvenci da bi se dobio % identičnosti sekvence.

Identičnost sekvence može se lako izračunati poznatim metodama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, one koje su opisane u Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988) , Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); i Carillo, H., i Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Poželjne metode za određivanje identičnosti sekvence su dizajnirane tako da daju najveće podudaranje između testiranih sekvenci. Metode za određivanje identičnosti sekvence kodirane su u javno dostupnim računarskim programima koji određuju identičnost sekvence između datih sekvenci. Primeri takvih programa uključuju, ali nisu ograničeni na, programski paket GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN i FASTA (Altschul,S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). BLASTX program je javno dostupan iz NCBI i drugih izvora (BLASTManual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894,, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)). Ovi programi optimalno poravnavaju sekvence koristeći podrazumevane težine praznina kako bi proizveli najviši nivo identičnosti sekvence između datih i referentnih sekvenci. Kao ilustracija, kod polinukleotida koji ima nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje, na primer, 85%, poželjno 90%, još poželjnije 95% "identičnosti sekvence" u odnosu na referentnu nukleotidnu sekvencu, predviđeno je da nukleotidna sekvenca datog polinukleotida bude identična referentnoj sekvenci, osim što data polinukleotidna sekvenca može uključivati do 15, poželjno do 10, još poželjnije do 5 tačkastih mutacija na svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence. Drugim rečima, u polinukleotidu koji ima nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 85%, poželjno 90%, još poželjnije 95% identičnosti u odnosu na referentnu nukleotidnu sekvencu, do 15%, poželjno 10%, još poželjnije 5% nukleotida u referentnoj sekvenci može biti izbrisano ili supstituisano drugim nukleotidom, ili se određeni broj nukleotida do 15%, poželjno 10%, još poželjnije 5% ukupnih nukleotida u referentnoj sekvenci može insertovati u referentnu sekvencu. Ove mutacije referentne sekvence mogu se javiti na 5'- ili 3' -terminalnim pozicijama referentne nukleotidne sekvence ili bilo gde između tih terminalnih pozicija, međusobno raspoređenih ili pojedinačno među nukleotidima u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više kontinuiranih grupa unutar referentne sekvence.

Analogno tome, kod polipeptida koji ima datu aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje, na primer, 85%, poželjno 90%, još poželjnije 95% identičnosti sekvence u odnosu na referentnu aminokiselinsku sekvencu, predviđeno je da je data aminokiselinska sekvenca polipeptida identična referentnoj sekvenci, osim što data polipeptidna sekvenca može uključivati do 15, poželjno do 10, još poželjnije do 5 aminokiselinskih alteracija na svakih 100 aminokiselina referentne aminokiselinske sekvence. Drugim rečima, da bi se dobila data polipeptidna sekvenca koja ima najmanje 85%, poželjno 90%, još poželjnije 95% identičnosti sekvence sa referentnom aminokiselinskom sekvencom, do 15%, poželjno do 10%, još poželjnije do 5% aminokiselinskih ostataka u referentnoj sekvenci može biti izbrisano ili supstituisano drugom aminokiselinom, ili određeni broj aminokiselina do 15%, poželjno do 10%, još poželjnije do 5% ukupnog broja aminokiselinskih ostataka u referentnoj sekvenci može biti umetnuto u referentnu sekvencu. Ove alteracije referentne sekvence mogu se javiti na aminokiselinskim ili karboksi terminalnim pozicijama referentne aminokiselinske sekvence ili bilo gde između tih terminalnih pozicija, međusobno raspoređenih ili pojedinačno među ostacima u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više kontinuiranih grupa unutar referentne sekvence. Poželjno, pozicije ostataka koje nisu identične razlikuju se po konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama. Međutim, konzervativne supstitucije nisu uključene kao podudaranje prilikom određivanja identičnosti sekvence.

[0032] Termini „identičnost“, „identičnost sekvence“ i „procentualna identičnost“ ovde se koriste naizmenično. Za potrebe ovog pronalaska, ovde je definisano da se radi određivanja procentualne identičnosti dve aminokiselinske sekvence ili dve sekvence nukleinskih kiselina, sekvence poravnavaju u svrhu optimalnog poređenja (npr. praznine se mogu uvesti u sekvencu prve aminokiseline ili nukleinske kiseline za optimalno poravnanje sa drugom aminokiselinskom sekvencom ili sekvencom nukleinske kiseline). Zatim se upoređuju aminokiselinski ili nukleotidni ostaci na odgovarajućim aminokiselinskim ili nukleotidnim pozicijama. Kada je pozicija u prvoj sekvenci zauzeta istim aminokiselinskim ili nukleotidnim ostacima kao odgovarajuća pozicija u drugoj sekvenci, onda su molekuli identični na toj poziciji. Procentualna identičnost između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje dele sekvence [tj. % identičnost = broj identičnih pozicija/ukupan broj pozicija (tj. preklapajućih pozicija) x 100]. Poželjno, dve sekvence su iste dužine.

[0033] Poređenje sekvenci može se izvršiti na celoj dužini dve sekvence koje se upoređuju ili na fragmentu dve sekvence. Tipično, poređenje će se izvršiti po celoj dužini dve sekvence koje se upoređuju. Međutim, identičnost sekvence se može sprovesti nad regionom od, na primer, dvadeset, pedeset, sto ili više kontinuiranih aminokiselinskih ostataka.

[0034] Kvalifikovana osoba će biti svesna činjenice da je dostupno nekoliko različitih računarskih programa za određivanje homologije između dve sekvence. Na primer, poređenje sekvenci i određivanje procentualne identičnosti između dve sekvence može se postići korišćenjem matematičkog algoritma. U poželjnom otelotvorenju, procentualna identičnost između dve sekvence aminokiselina ili nukleinskih kiselina određuje se pomoću Needleman and Wunsch [J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)] algoritma koji je ugrađen u GAP program u Accelrys GCG softverskom paketu (dostupno na http://www.accelrys.com/products/gcg/), koristeći ili Blosum 62 matricu ili PAM250 matricu, i težinu praznine od 16, 14, 12, 10, 8, 6 ili 4 i težinu dužine od 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. Kvalifikovana osoba će ceniti da će svi ovi različiti parametri dati nešto drugačije rezultate, ali da ukupna procentualna identičnost dve sekvence nije značajno izmenjena kada se koriste različiti algoritmi.

[0035] Proteinske sekvence ili sekvence nukleinskih kiselina ovog pronalaska mogu se dalje koristiti kao „sekvenca upita“ za obavljanje pretrage u javnim bazama podataka kako bi se, na primer, identifikovali drugi članovi familije ili srodne sekvence. Takve pretrage se mogu izvršiti pomoću BLASTN i BLASTP programa (verzija 2.0) Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. BLAST pretrage proteina mogu se vršiti pomoću BLASTP programa, rezultat=50, dužina reči =3 da bi se dobile sekvence aminokiselina homologne proteinskim molekulima pronalaska. Da bi se dobila poravnanja sa prazninama za potrebe poređenja, Gapped BLAST se može koristiti kao što je opisano u Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Prilikom korišćenja programa BLAST i Gapped BLAST, mogu se koristiti podrazumevani parametri odgovarajućih programa (npr., XBLAST i NBLAST). Pogledajte početnu stranicu Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (National Center for Biotechnology Information) na http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

[0036] Dalje, ovaj pronalazak pruža imunogeni sastav koji se sastoji od PPV VP2 kao što je zaštićeno patentom.

[0037] Termin „imunogeni sastav“ se odnosi na sastav koji se sastoji od najmanje jednog antigena, koji izaziva imunološki odgovor u domaćinu kome se daje imunogeni sastav. Takav imunološki odgovor može biti ćelijski i/ili antitelima posredovan imunološki odgovor na imunogeni sastav pronalaska. Poželjno je da imunogeni sastav indukuje imuni odgovor i, još poželjnije, daje zaštitni imunitet protiv jednog ili više kliničkih znakova PPV infekcije. Domaćin je takođe opisan kao „ispitanik“. Poželjno, bilo koji od domaćina ili ispitanika koji su opisani ili pomenuti u ovom dokumentu su svinje.

[0038] Obično, „imunološki odgovor“ uključuje, ali nije ograničen na jedan ili više sledećih efekata: proizvodnju ili aktivaciju antitela, B ćelija, pomoćnih T ćelija, supresorskih T ćelija i/ili citotoksičnih T ćelija i/ili gama-delta T ćelija, usmerenih specifično na antigen ili antigene uključene u imunogeni sastav pronalaska. Poželjno, domaćin će pokazati ili zaštitni imunološki odgovor ili terapijski odgovor.

[0039] „Zaštitni imunološki odgovor“ ili „zaštitni imunitet“ će se pokazati ili smanjenjem ili izostankom kliničkih znakova koje obično pokazuje zaraženi domaćin, bržim vremenom oporavka i/ili smanjenim trajanjem infektivnosti ili smanjenim titrom patogena u tkivima ili telesnim tečnostima ili izlučevinama zaraženog domaćina.

[0040] U slučaju da domaćin pokaže zaštitni imunološki odgovor takav da će se povećati otpornost na novu infekciju i/ili smanjiti klinička težina bolesti, imunogeni sastav se opisuje kao „vakcina“.

[0041] U jednom aspektu ovog pronalaska, imunogeni sastav je formulisan za primenu jedne doze.

[0042] Zapremina za jednu dozu je definisana na drugom mestu ovde.

[0043] Imunogeni sastav se, poželjno, primenjuje lokalno ili sistemski. Pogodni putevi primene koji se konvencionalno koriste su oralna ili parenteralna primena, kao što su intranazalna, intravenska, intramuskularna, intraperitonealna, supkutana, kao i inhalacija. Međutim, u zavisnosti od prirode i načina delovanja jedinjenja, imunogeni sastav se može primeniti i drugim putevima. Međutim, najpoželjniji imunogeni sastav se primenjuje intramuskularno.

[0044] U jednom aspektu ovog pronalaska, imunogeni sastav se primenjuje intramuskularno.

[0045] U jednom aspektu ovog pronalaska, imunogeni sastav je bezbedan za nazimice i/ili krmače tokom graviditeta i laktacije.

[0046] U jednom aspektu ovog pronalaska, imunogeni sastav je bezbedan za nazimice i/ili krmače od 30 dana gestacije, poželjno od 40 dana gestacije.

[0047] U jednom aspektu ovog pronalaska imunogeni sastav dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0048] Termin „farmaceutski prihvatljiv nosač“ uključuje sve rastvarače, disperzione medije, premaze, agense za stabilizaciju, razblaživače, konzervanse, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense, agense za odlaganje adsorpcije, adjuvanse, imunološke stimulanse i njihove kombinacije.

[0049] „Razblaživači“ mogu uključivati vodu, fiziološki rastvor, dekstrozu, etanol, glicerol i slično. Izotonični agensi mogu uključivati natrijum hlorid, dekstrozu, manitol, sorbitol i laktozu, između ostalog. Stabilizatori uključuju albumin i alkalne soli etilendiamintetrasirćetne kiseline, između ostalog.

[0050] U jednom aspektu ovog pronalaska farmaceutski prihvatljiv nosač je karbomer.

[0051] Poželjno, imunogeni sastav može dalje uključivati jedan ili više drugih imunomodulatornih agenasa kao što su npr. interleukini, interferoni ili drugi citokini. Količine i koncentracije adjuvansa i aditiva korisnih u kontekstu ovog pronalaska može lako odrediti kvalifikovani stručnjak.

[0052] U nekim aspektima, imunogeni sastav ovog pronalaska sadrži adjuvans. "Adjuvansi" kao što se ovde koristi, mogu uključivati aluminijum hidroksid i aluminijum fosfat, saponine npr. Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), emulziju vode u ulju, emulziju ulje u vodi, emulziju voda u ulju u vodi. Emulzija se može posebno zasnivati na lakom tečnom parafinskom ulju (tip Evropske farmakopeje); izoprenoidnom ulju kao što je skvalan ili skvalen; ulju koje nastaje oligomerizacijom alkena, posebno izobutena ili decena; estrima kiselina ili alkohola koji sadrže linearnu alkil grupu, posebno biljna ulja, etil oleat, propilen glikol di-(kaprilat/kaprat), gliceril tri-(kaprilat/kaprat) ili propilen glikol dioleat; estrima razgranatih masnih kiselina ili alkohola, posebno estrima izostearinske kiseline. Ulje se koristi u kombinaciji sa emulgatorima za formiranje emulzije. Emulgatori su poželjno nejonski surfaktanti, posebno estri sorbitana, manida (npr. anhidromanitol oleat), glikola, poliglicerola, propilen glikola i oleinske, izostearinske, ricinoleinske ili hidroksistearinske kiseline, koji su opciono etoksilirani, i polioksipropilen-polioksietilen kopolimernih blokova, posebno pluronskih proizvoda, posebno L121. Vidi Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) i Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997). Primeri adjuvansa su SPT emulzija opisana na strani 147 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M.

Newman, Plenum Press, 1995, i emulzija MF59 opisana na strani 183 ove iste knjige.

[0053] Dalja instanca adjuvansa je jedinjenje izabrano između polimera akrilne ili metakrilne kiseline i kopolimera maleinskog anhidrida i alkenil derivata. Povoljna adjuvantna jedinjenja su polimeri akrilne ili metakrilne kiseline koji su umreženi, posebno sa polialkenil etrima šećera ili polialkohola. Ova jedinjenja su poznata po terminu karbomer ( Phameuropa Vol.8, No. 2, June 1996). Stručnjaci u ovoj oblasti takođe mogu da se pozovu na U.S. Patent No. 2,909,462 koji opisuje takve akrilne polimere umrežene sa polihidroksilovanim jedinjenjem koje ima najmanje 3 hidroksilne grupe, poželjno ne više od 8, pri čemu se atomi vodonika od najmanje tri hidroksila zamenjuju nezasićenim alifatskim radikalima koji imaju najmanje 2 atoma ugljenika. Poželjni radikali su oni koji sadrže od 2 do 4 atoma ugljenika, npr. vinili, alili i druge etilenski nezasićene grupe. Nezasićeni radikali mogu sami da sadrže druge supstituente, kao što je metil. Proizvodi koji se prodaju pod nazivom Carbopol; (BF Goodrich, Ohio, USA) su posebno prikladni. Unakrsno su povezani sa alil saharozom ili sa alil pentaeritritolom. Među njima se mogu pomenuti Carbopol 974P, 934P i 971P. Najpoželjnija je upotreba Carbopol 971P. Među kopolimerima maleinskog anhidrida i alkenil derivata, nalaze se kopolimeri EMA (Monsanto), koji su kopolimeri maleinskog anhidrida i etilena. Rastvaranje ovih polimera u vodi dovodi do kiselog rastvora koji će biti neutralisan, poželjno do fiziološkog pH, kako bi se dobio rastvor adjuvansa u koji će biti ugrađen sam imunogeni, imunološki ili vakcinalni sastav.

[0054] Dalji pogodni adjuvansi uključuju, ali nisu ograničeni na, RIBI adjuvantni sistem (Ribi Inc.), blok kopolimer (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), monofosforil lipid A, Avridin lipid-amin adjuvans, toplotno labilni enterotoksin iz E. coli (rekombinantan ili drugačiji), toksin kolere, IMS 1314 ili muramil dipeptid, ili prirodne ili rekombinantne citokine ili njihove analoge ili stimulanse endogenog oslobađanja citokina, između ostalog.

[0055] Očekuje se da se adjuvans može dodati u količini od oko 100 µg do oko 10 mg po dozi, poželjno u količini od oko 100 µg do oko 10 mg po dozi, poželjnije u količini od oko 500 µg do oko 5 mg po dozi, još poželjnije u količini od oko 750 µg do oko 2,5 mg po dozi, a najpoželjnije u količini od oko 1 mg po dozi. Alternativno, adjuvans može biti u koncentraciji od oko 0,01% do 50%, poželjno u koncentraciji od oko 2% do 30%, poželjnije u koncentraciji od oko 5% do 25%, još poželjnije u koncentraciji od oko 7% do 22%, a najpoželjnije u koncentraciji od 10% do 20% po zapremini konačnog proizvoda.

[0056] U jednom aspektu ovog pronalaska imunogeni sastav sadrži između oko 0,1 µg i 50 µg PPV VP2 antigena. Poželjno je da imunogeni sastav sadrži između oko 0,2 µg i 40 µg, poželjnije između oko 0,3 µg i 30 µg, poželjnije između oko 0,4 µg i 20 µg i još poželjnije između oko 0,5 µg i 10 µg sa količinom od 0,5 µg, 0,75 µg, 1 µg, 1,25 µg, 1,5 µg, 2 µl, 2,5 µg, 3 µg, 3,5 µg, 4 µg, 4,5 µg, 5 µg, 5,5 µg, 6 µg, 6,5 µg, 7 µg, 7,5 µg, 8 µg, 8,5 µg, 9 µg, 9,5 µg ili 10 µg PPV VP2 antigena koji je najpoželjniji.

[0057] U jednom aspektu ovog pronalaska imunogeni sastav je vakcina.

[0058] Termin „vakcina“ je već opisan na drugom mestu ovog dokumenta. Međutim, u slučaju kada domaćin pokaže zaštitni imunološki odgovor, takav da će se povećati otpornost na novu infekciju i/ili smanjiti klinička težina bolesti, imunogeni sastav se opisuje kao "vakcina".

[0059] U jednom aspektu ovog pronalaska imunogeni sastav štiti od homolognog i/ili heterolognog izazova. Dalje, eksperimentalni podaci dobijeni ovim pronalaskom obelodanjuju da vakcina ovog pronalaska ima širok spektar zaštite, jer vakcina štiti od heterolognih severnoameričkih, kao i heterolognih evropskih sojeva izazova.

[0060] Termini „štiti“ i „profilaksa“ i „prevenirajući“ koriste se naizmenično u ovoj patentnoj prijavi. Ovi termini su definisani na drugom mestu.

[0061] U jednom aspektu ovog pronalaska imunogeni sastav štiti od izazova sa severnoameričkim i/ili evropskim izolatima.

[0062] Termin „severnoamerički i evropski izolati“ je dobro poznat stručnjaku u ovoj oblasti. Termin „severnoamerički i/ili evropski izolati“ obuhvata sve izolate koji su bili ili će biti izolovani u Severnoj Americi i Evropi.

[0063] U jednom aspektu ovog pronalaska imunogeni sastav je unakrsna zaštita od severnoameričkih i/ili evropskih izolata.

[0064] U jednom aspektu ovog pronalaska imunogeni sastav je efikasan u lečenju i/ili profilaksi kliničkih znakova izazvanih PPV infekcijom kod ispitanika kome je to potrebno. Termini „lečenje i/ili profilaksa“, „klinički znaci“ i „potreba“ definisani su na drugom mestu.

[0065] Dalje, ovaj pronalazak obezbeđuje polinukleotid kako se zahteva patentom, koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja kodira PPV VP2 kao što je ovde opisano.

[0066] Dalje, ovaj pronalazak obezbeđuje polinukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja kodira PPV VP2 kao što se zahteva patentom.

[0067] Dalje, ovaj pronalazak obezbeđuje polinukleotid koji se sastoji ili se sastoji od nukleotidne sekvence SEQ ID NO:4.

[0068] Dalje, ovaj pronalazak pruža vektor kao što je patentirano, koji se sastoji od polinukleotida kao što se zahteva patentom.

[0069] U jednom aspektu ovog pronalaska vektor je ekspresioni vektor.

[0070] U ovom pronalasku vektor je bakulovirusni vektor.

[0071] Termin „vektor“ je dobro poznat stručnjaku u ovoj oblasti. Termin "vektor" kako je poznat u struci odnosi se na polinukleotidni konstrukt, obično plazmid ili virus, koji se koristi za prenos genetskog materijala na ćeliju domaćina. Vektori mogu biti, na primer, virusi, plazmidi, kosmidi ili fagi. Vektor koji se ovde koristi može se sastojati od DNK ili RNK. U nekim otelotvorenjima, vektor se sastoji od DNK. "Ekspresioni vektor" je vektor koji je sposoban da usmeri ekspresiju proteina kodiranog od jednog ili više gena koje nosi vektor kada je prisutan u odgovarajućem okruženju. Vektori su poželjno sposobni za autonomnu replikaciju. Tipično, vektor ekspresije se sastoji od promotera transkripcije, gena i terminatora transkripcije. Ekspresija gena se obično stavlja pod kontrolu promotera, a za gen se kaže da je "operativno povezan sa" promoterom.

[0072] Kao što se ovde koristi, termin „operativno povezan“ se koristi za opisivanje veze između regulatornih elemenata i gena ili njegovog regiona kodiranja. Tipično, ekspresija gena se stavlja pod kontrolu jednog ili više regulatornih elemenata, na primer, bez ograničenja, konstitutivnih ili inducibilnih promotera, regulatornih elemenata specifičnih za tkivo i pojačivača. Za gen ili region kodiranja se kaže da je "operabilno povezan" ili "operativno povezan" ili "operativno povezan sa" regulatornim elementima, što znači da je gen ili region kodiranja kontrolisan ili pod uticajem regulatornog elementa. Na primer, promoter je operativno povezan sa sekvencom kodiranja ako promoter utiče na transkripciju ili ekspresiju sekvence kodiranja.

[0073] Vektori i metode za pravljenje i/ili korišćenje vektora (ili rekombinanata) za ekspresiju mogu biti ili analogni metodama obelodanjenim u: U.S. Pat. No.4.603.112 , 4.769.330 , 5.174.993 , 5.505.941 , 5.338.683 , 5.494.807, 4.722.848 , 5.942.235 , 5.364.773 , 5.762.938, 5.770.212, 5.942.235 , 382.425, PCT publikacijama WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018; Paoleti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996; Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October

1996; Smith et al., U.S. Pat. No.4,745,051 (rekombinantni bakulovirus); Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (Humana Press Inc.1995); Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No.12, p.2156-2165; Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol.4, No.3, p.406; EPA0370 573; U.S. application No. 920,197, filed Oct.16, 1986; EP patent publication No.0 265 785; U.S. Pat. No.

4,769,331 (rekombinantni herpesvirus); Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996; Andreansky et al., „The application of genetically engineering herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors,“ PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996; Robertson et al., „Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes“, PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996; Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996; Kitson et al., J. Virol.65, 3068-3075, 1991; U.S. Pat. Nos.5,591,439, 5,552,143; WO 98/00166; allowed U.S. application Ser. Nos.08/675,556, i 08/675,566 oba podneta Jul. 3, 1996 (rekombinantni adenovirus); Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol.3) p.237-52, 1993; Ballay et al. EMBO Journal, vol.4, str. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990; Prevec et al., J. Gen Virol.70, 42434; PCT WO 91/11525; Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem.269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993; i McClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996; i U.S. Pat. Nos.

5,591,639, 5,589,466, i 5,580,859, kao i WO 90/11092, WO 93/19183, WO 94/21797, WO 95/11307, WO 95/20660; Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistry, koji se odnose na DNK ekspresione vektore, inter alia. Vidi takođe WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (lentiviral expression system); Sanford et al., U.S. Pat. No.

4,945,050 ; Fischbachet al. (Intracel); WO 90/01543; Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp.271-283 (1997), (DNA vector systems); Szoka et al., U.S. patent No.

4,394,448 (metoda insercije DNK u žive ćelije); McCormick et al., U.S. Pat. No.5,677,178 (upotreba citopatskih virusa); i U.S. Pat. No.5,928,913 (vektori za isporuku gena); kao i druga dokumenta navedena u ovom dokumentu.

[0074] Termin „regulatorni element“ i „kontrolni element ekspresije“ koriste se naizmenično i odnose se na molekule nukleinske kiseline koji mogu uticati na ekspresiju operativno povezane sekvence kodiranja u određenom organizmu domaćinu. Ovi termini se široko koriste i obuhvataju sve elemente koji promovišu ili regulišu transkripciju, uključujući promotere, osnovne elemente potrebne za baznu interakciju RNK polimeraze i transkripcionih faktora, uzvodne elemente, pojačivače i elemente odgovora. Primerni regulatorni elementi kod prokariota uključuju promotere, sekvence operatera i mesta vezivanja ribosoma.

Regulatorni elementi koji se koriste u eukariotskim ćelijama mogu uključivati, bez ograničenja, transkripcione i translacione kontrolne sekvence, kao što su promoteri, pojačivači, signali spajanja, signali poliadenilacije, terminatori, signali degradacije proteina, unutrašnji element unosa ribosoma (IRES), 2A sekvence i slično, koji obezbeđuju i/ili regulišu ekspresiju sekvence kodiranja i/ili proizvodnju kodiranog polipeptida u ćeliji domaćinu.

[0075] Kao što se ovde koristi, termin „promoter“ je nukleotidna sekvenca koja omogućava vezivanje RNK polimeraze i usmerava transkripciju gena. Tipično, promoter se nalazi u 5'-nekodirajućem regionu gena, proksimalno od transkripcionog početnog mesta gena. Elementi sekvence unutar promotera koji funkcionišu u pokretanju transkripcije često se karakterišu konsenzusnim nukleotidnim sekvencama. Primeri promotera uključuju, ali nisu ograničeni na promotere bakterija, kvasca, biljaka, virusa i sisara (uključujući ljude). Promoter može biti inducibilan, represibilan i/ili konstitutivan. Inducibilni promoteri iniciraju povećane nivoe transkripcije iz DNK pod njihovom kontrolom kao odgovor na neku promenu uslova kulture, kao što je promena temperature.

[0076] Kao što se ovde koristi, termin „pojačivač“ se odnosi na vrstu regulatornog elementa koji može povećati efikasnost transkripcije, bez obzira na udaljenost ili orijentaciju pojačivača u odnosu na početno mesto transkripcije.

[0077] Generisanje virusnog vektora može se postići korišćenjem bilo kojih pogodnih tehnika genetskog inženjeringa dobro poznatih u struci, uključujući, bez ograničenja, standardne tehnike restriktivne digestije endonukleaze, ligacije, transformacije, prečišćavanja plazmida i sekvenciranja DNK, na primer kao što je opisano u Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)).

[0078] Termin „bakulovirus“ je dobro poznat stručnjaku u ovoj oblasti. Međutim, kako se ovde koristi, „bakulovirus“ posebno označava sistem za proizvodnju željenog proteina u ćeliji insekta korišćenjem rekombinantnog vektora bakulovirusa dizajniranog da eksprimira navedeni protein. Sistem ekspresije bakulovirusa generalno obuhvata sve elemente neophodne za postizanje ekspresije rekombinantnog proteina u ćelijama insekata i obično uključuje inženjering bakulovirusnog vektora za ekspresiju željenog proteina, uvođenje inženjerskog bakulovirusnog vektora u ćelije insekata, kultivaciju ćelija insekata koje sadrže inženjerski bakulovirusni vektor u odgovarajućoj hranljivoj podlozi tako da se željeni protein eksprimira i, oporavak proteina. Tipično, inženjering bakulovirusnog vektora podrazumeva konstrukciju i izolaciju rekombinantnih bakulovirusa u kojima se sekvenca kodiranja za izabrani gen insertuje iza promotera za neesencijalni virusni gen, pri čemu se većina trenutno korišćenih sistema ekspresije bakulovirusa zasniva na sekvenci virusa Autographa californica nuclear polyhedrosis (AcMNPV) ((Virology 202 (2), 586-605 (1994), NCBI Accession No.:

NC_001623). Sistemi ekspresije bakulovirusa su dobro poznati u struci i opisani su, na primer, u "Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual" by David R. O'Reilly, Lois Miller, Veme Luckow, pub. by Oxford Univ. Press (1994), "The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide" by Linda A. King, R. D. Possee, published by Chapman & Hall (1992). Primer neograničavajućeg primera bakulovirusnog sistema za proizvodnju rekombinantnog proteina je npr. opisan u WO 2006/072065 A2.

[0079] Poželjni vektori bakulovirusa uključuju bakulovirus kao što je BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, Calif.) ili DiamondBac (Sigma Aldrich), posebno pod uslovom da proizvodne ćelije budu ćelije insekata. Iako je sistem ekspresije bakulovirusa poželjan, stručnjaci u ovoj oblasti shvataju da će drugi sistemi ekspresije raditi u svrhe ovog pronalaska.

[0080] Dalje, ovaj pronalazak obezbeđuje ćeliju koja je zaštićena patentom i koja se sastoji od polinukleotida ili vektora kako se zahteva patentom.

[0081] Termin „bakulovirus“ je dobro poznat stručnjaku u ovoj oblasti. Termin „ćelija“ obuhvata eukariotsku ćeliju kao što je životinjska ćelija, protist ćelija, biljna ćelija ili ćelija gljivica. Poželjno je da eukariotska ćelija bude ćelija sisara kao što su CHO, BHK ili COS, ili gljivična ćelija kao što je Saccharomyces cerevisiae, ili ćelija insekta kao što je Sf9.

[0082] U ovom pronalasku ćelija je ćelija insekta kao što je patentni zahtev.

[0083] „Ćelija insekta“ kako se ovde koristi označava ćeliju ili ćelijsku kulturu izvedenu iz vrste insekta. Od posebnog interesa u pogledu ovog pronalaska su ćelije insekata dobijene od vrsta Spodoptera frugiperda i Trichoplusia ni.

[0084] Poželjno je da je ćelija insekta, kao što je ovde pomenuto, ćelija Spodoptera frugiperda (Sf) ili ćelija iz ćelijske linije izvedene iz Spodoptera frugiperda, i poželjnije je da se izabere iz grupe koja se sastoji od ćelije Sf9 i ćelije Sf+. Shodno tome, ćelije insekata, kao što je ovde pomenuto, su poželjno Spodoptera frugiperda (Sf) ćelije ili ćelije iz ćelijske linije izvedene iz Spodoptera frugiperda, i još poželjnije da su izabrane iz grupe koja se sastoji od Sf9 ćelija i Sf+ ćelija.

[0085] U ovom pronalasku, ćelija insekta je izabrana iz grupe koja se sastoji od Sf9 ćelija i Sf+ ćelija.

[0086] Dalje, ovaj pronalazak obezbeđuje česticu sličnu virusu koja se sastoji od PPV VP2 kao što se zahteva patentom.

[0087] Termin „čestica nalik virusu“ (VLP) obuhvata praznu virusnu ljusku iz virusa koja se ne replicira. VLP se generalno sastoje od jednog ili više virusnih proteina, kao što su, ali ne ograničavajući se na one proteine koji se nazivaju proteini kapsida, premaza, ljuske, površine i/ili omotača ili polipeptidi koji formiraju čestice izvedeni iz ovih proteina. VLP se mogu spontano formirati nakon rekombinantne ekspresije proteina u odgovarajućem sistemu ekspresije. Prisustvo VLP nakon rekombinantne ekspresije virusnih proteina može se detektovati konvencionalnim tehnikama poznatim u struci, kao što su elektronska mikroskopija, rendgenska kristalografija i slično. Vidi, npr. Baker et al. , Biophys. J. (1991) 60 :1445-1456; Hagensee et al., J. Virol . (1994) 68:4503-4505. Na primer, krioelektronska mikroskopija se može izvršiti na vitrifikovanim vodenim uzorcima dotičnog VLP preparata, a slike snimljene u odgovarajućim uslovima ekspozicije.

[0088] Termin „čestica nalik virusu“ (VLP) takođe obuhvata VLP koji se sastoje od više PPV VP2.

[0089] U jednom aspektu ovog pronalaska čestica slična virusu sastoji se od mnoštva PPV VP2 kao što je ovde opisano.

[0090] Dalje, ovaj pronalazak pruža metodu proizvodnje PPV VP2 kao što se zahteva patentom, koji se sastoji od transfekcije ćelije sa vektorom kao što se zahteva patentom.

[0091] Dalje, ovaj pronalazak pruža metodu proizvodnje PPV VP2 kao što se zahteva patentom, koja se sastoji od inficiranja ćelije insekta kao što se zahteva patentom sa vektorom bakulovirusa kao što se zahteva patentom.

[0092] Sastavi mogu, po želji, biti predstavljeni u pakovanju ili dozatoru koji može sadržati jedan ili više jediničnih oblika doziranja koji sadrže aktivni sastojak. Pakovanje može, na primer, da sadrži metalnu ili plastičnu foliju, kao što je blister pakovanje. Pakovanje ili dozator mogu biti praćeni uputstvima za primenu poželjno za primenu na životinjama, posebno svinjama. Opciono povezano sa takvim posudama može biti obaveštenje u obliku propisanom od strane državne agencije koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih ili bioloških proizvoda, koje sadrži odobrenje agencije za proizvodnju, upotrebu ili prodaju za primenu kod ljudi.

[0093] Stoga je ovde opisan komplet koji se sastoji od PPV VP2 ili imunogenog sastava kako je ovde opisano.

[0094] Opciono, komplet dalje sadrži uputstvo za lečenje i/ili profilaksu bolesti svinja.

[0095] Opciono, komplet dalje sadrži uputstvo za lečenje i/ili profilaksu PPV infekcija.

[0096] U drugom aspektu ovog pronalaska, PPV virus je inaktiviran, što rezultira celim inaktiviranim virusom sa virusnim proteinom 2 (VP2), kao što se zahteva patentom.

[0097] Dakle, ovaj pronalazak se takođe odnosi na inaktivirani parvovirus svinja (PPV) koji ima virusni protein 2 (VP2) koji se sastoji od

● izoleucinskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 25, i

● serinskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 36, i

● izoleucinskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 37, i

● glutaminskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 419, i

● treoninskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 436,

[0098] Štaviše, ovaj pronalazak se takođe odnosi na imunogeni sastav koji se sastoji od inaktiviranog svinjskog parvovirusa (PPV) koji ima virusni protein 2 (VP2) koji se sastoji od ● izoleucinskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 25, i

● serinskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 36, i

● izoleucinskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 37, i

● glutaminskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 419, i

● treoninskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 436,

[0099] Za potrebe ovog pronalaska može se koristiti bilo koja konvencionalna metoda inaktivacije. Dakle, inaktivacija se može izvršiti hemijskim i/ili fizičkim tretmanima koji su poznati stručnjaku u ovoj oblasti. Poželjne metode inaktivacije uključuju adiciju ciklizovanog binarnog etilenimina (BEI) uključujući adiciju rastvora 2-bromoetilenamin hidrobromida (BEA), koji je ciklizovan u binarni etilenimin (BEI). Poželjna dodatni hemijski agensi za inaktivaciju obuhvataju, ali nisu ograničeni na Triton X-100, natrijum deoksiholat, cetiltrimetilamonijum bromid, β-propiolakton, timerosal, fenol i formaldehid (formalin). Međutim, inaktivacija takođe može da se sastoji od koraka neutralizacije. Poželjni neutralizacioni agensi uključuju, ali nisu ograničeni na natrijum tiosulfat, natrijum bisulfit i slično.

[0100] Poželjni uslovi inaktivacije formalinom uključuju koncentraciju formalina između od oko 0,02% (v/v) - 2,0% (v/v), poželjnije od oko 0,1% (v/v) - 1,0% (v/v), još poželjnije od oko 0,15% (v/v) - 0,8% (v/v), još poželjnije od oko 0,16% (v/v) - 0,6% (v/v), a najpoželjnije oko 0,2% (v/v) - 0,4% (v/v). Vreme inkubacije zavisi od otpornosti PPV-a. Generalno, proces inaktivacije se izvodi sve dok se ne detektuje da nema razvoja PPV u odgovarajućem sistemu kultivacije.

[0101] Poželjno, inaktivirani PPV ovog pronalaska je inaktiviran formalinom, poželjno korišćenjem koncentracija opisanih u prethodnom tekstu.

[0102] Inaktivirani PPV pronalaska može se ugraditi u liposome korišćenjem poznate tehnologije kao što je ona koja je opisana u Nature, 1974, 252, 252-254 ili Journal of Immunology, 1978, 120, 1109-13. U drugom otelotvorenju pronalaska, inaktivirani PPV pronalaska može se konjugovati sa odgovarajućim biološkim jedinjenjima kao što su polisaharidi, peptidi, proteini ili slično, ili njihovom kombinacijom.

[0103] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na upotrebu:

● PPV VP2 kao što je zahtevano patentom,

● imunogenog sastava kao što se zahteva patentom,

● polinukleotida kao što se zahteva patentom,

● vektora kao što se zahteva patentom,

● ćelije kao što se zahteva patentom,

● vektora bakulovirusa kao što se zahteva patentom, i/ili

● čestice slične virusu kao što se zahteva patentom

za pripremu leka, poželjno vakcine.

[0104] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na upotrebu PPV VP2 kao što se zahteva patentom, ili imunogenog sastava kao što se zahteva patentom, za pripremu leka za lečenje i/ili prevenciju infekcije PPV-om, smanjenje, prevenciju i/ili lečenje kliničkih znakova izazvanih infekcijom PPV-om i/ili za lečenje i/ili prevenciju bolesti izazvane infekcijom PPV-om.

[0105] Dalje, ovaj pronalazak pruža primenu u metodi imunizacije ispitanika, koja se sastoji od primene imunogenog sastava takvom ispitaniku kao što se zahteva patentom.

[0106] Termin „imunizacija“ se odnosi na aktivnu imunizaciju primenom imunogenog sastava na ispitaniku koji se imunizuje, čime se izaziva imunološki odgovor protiv antigena uključenog u takav imunogeni sastav.

[0107] Poželjno je da imunizacija rezultira smanjenjem incidence određene PPV infekcije u krdu i/ili smanjenjem težine kliničkih znakova uzrokovanih ili povezanih sa određenom PPV infekcijom.

[0108] Dalje, imunizacija ispitanika kome je potreban imunogeni sastav kako je ovde predviđeno, rezultira sprečavanjem infekcije ispitanika PPV infekcijom. Još poželjnije, imunizacija rezultira efikasnim, dugotrajnim imunološkim odgovorom na PPV infekciju. Podrazumeva se da će navedeni vremenski period trajati više od 1 meseca, poželjno više od 2 meseca, poželjno više od 3 meseca, poželjnije više od 4 meseca, poželjnije više od 5 meseci, poželjnije više od 6 meseci. Podrazumeva se da imunizacija možda neće biti efikasna kod svih imunizovanih ispitanika. Međutim, termin zahteva da značajan deo ispitanika iz krda bude efikasno imunizovan.

[0109] Poželjno je da se u ovom kontekstu predvidi krdo ispitanika koji bi normalno, tj. bez imunizacije, razvili kliničke znakove uzrokovane ili povezane sa PPV infekcijom. Da li su ispitanici krda efikasno imunizovani može bez daljnjeg da utvrdi stručnjak u ovoj oblasti. Poželjno je da imunizacija bude efikasna ako su klinički znaci u najmanje 33%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, još poželjnije kod najmanje 95% i najpoželjnije kod 100% ispitanika datog krda smanjeni po učestalosti ili težini za najmanje 10%, još poželjnije za najmanje 20%, još poželjnije za najmanje 30%, još poželjnije za najmanje 40%, još poželjnije za najmanje 50%, još poželjnije za najmanje 60%, još poželjnije za najmanje 70%, još poželjnije za najmanje 80%, još poželjnije za najmanje 90%, još poželjnije za najmanje 95% i najpoželjnije za 100% u poređenju sa ispitanicima koji ili nisu imunizovani ili su imunizovani imunogenim sastavom koji je bio dostupan pre ovog pronalaska, ali je naknadno zaražen određenim PPV-om.

[0110] Dalje, ovaj pronalazak pruža primene u metodi lečenja i/ili sprečavanja kliničkih znakova izazvanih PPV infekcijom kod ispitanika kome je to potrebno, metoda koja se sastoji od primene terapijski efikasne količine imunogenog sastava na ispitaniku, kako se zahteva patentom.

[0111] Kao što je prikazano u odeljku Primeri, pokazalo se da je imunogeni sastav, kako je ovde predviđeno, efikasan u lečenju i/ili sprečavanju kliničkih znakova izazvanih PPV infekcijom kod ispitanika kome je to potrebno.

[0112] Termin „lečenje i/ili profilaksa“ odnosi se na smanjenje incidence određene PPV infekcije u krdu i/ili smanjenje težine kliničkih znakova uzrokovanih ili povezanih sa određenom PPV infekcijom. Dakle, termin „lečenje i/ili profilaksa“ se takođe odnosi na smanjenje broja životinja u krdu koje se zaraze određenim PPV-om (= smanjenje učestalosti određene PPV infekcije) i/ili na smanjenje težine kliničkih znakova koji su obično povezani sa ili uzrokovani PPV infekcijom u grupi životinja kod kojih su životinje primile efikasnu količinu imunogenog sastava kako je ovde predviđeno u poređenju sa grupom životinja kod kojih životinje nisu primile takav imunogeni sastav.

[0113] „Lečenje i/ili profilaksa“ generalno podrazumeva primenu efikasne količine imunogenog sastava ovog pronalaska na ispitaniku ili krdu ispitanika kojima je potreban ili koji bi mogli imati koristi od takvog lečenja/profilakse. Termin „lečenje“ se odnosi na primenu efikasne količine imunogenog sastava nakon što je ispitanik ili barem neke životinje iz krda već zaražene takvim PPV-om i pri čemu takve životinje već pokazuju neke kliničke znakove uzrokovane ili povezane sa takvom PPV infekcijom. Termin „profilaksa“ se odnosi na primenu na ispitaniku pre bilo kakve infekcije takvog ispitanika PPV-om ili barem kada takva životinja ili nijedna životinja u grupi životinja ne pokazuje nikakve kliničke znakove uzrokovane ili povezane sa infekcijom takvim PPV-om. Termini "profilaksa" i "sprečavanje" se koriste naizmenično u ovoj prijavi patenta.

[0114] Termin „efikasna količina“ koji se ovde koristi znači, ali nije ograničen na količinu antigena, koja izaziva ili je u stanju da izazove imunološki odgovor kod ispitanika. Takva efikasna količina je u stanju da smanji učestalost određene PPV infekcije u krdu i/ili da smanji težinu kliničkih znakova određene PPV infekcije.

[0115] Poželjno je da se klinički znaci smanje po učestalosti ili težini za najmanje 10%, poželjnije za najmanje 20%, još poželjnije za najmanje 30%, još poželjnije za najmanje 40%, još poželjnije za najmanje 50%, još poželjnije za najmanje 60%, još poželjnije za najmanje 70%, još poželjnije za najmanje 80%, još poželjnije za najmanje 90%, još poželjnije za najmanje 95% i najpoželjnije za 100% u poređenju sa ispitanicima koji ili nisu lečeni ili su lečeni imunogenim sastavom koji je bio dostupan pre ovog pronalaska, ali je naknadno zaražen određenim PPV-om.

[0116] Termin „klinički znaci“ koji se ovde koristi odnosi se na znake infekcije ispitanika od PPV. Klinički znaci infekcije zavise od izabranog patogena. Primeri takvih kliničkih znakova uključuju, ali nisu ograničeni na prolaznu leukopeniju i reproduktivni neuspeh koji karakterišu embrionalna i/ili fetalna infekcija i smrt, ili njihove kombinacije. Primeri kliničkih znakova koji su direktno uočljivi uključuju smanjenu veličinu legla, povećanu mumifikaciju embriona ili fetusa po leglu, autolizaciju embriona ili fetusa, smanjenu veličinu embriona ili fetusa, smanjenu težinu embriona ili fetusa i slično ili njihove kombinacije. Dalji primeri takvih kliničkih znakova uključuju, ali nisu ograničeni na povećanu viremiju, povećano virusno opterećenje u ciljanim tkivima i krvi, povećano širenje PPV-a na okruženje i slično ili njihove kombinacije.

[0117] Poželjno je da se klinički znaci smanje u incidenciji ili težini kod lečenog ispitanika u poređenju sa ispitanicima koji ili nisu lečeni ili su lečeni imunogenim sastavom koji je bio dostupan pre ovog pronalaska, ali je naknadno inficiran određenim PPV-om, odnose se na prolaznu leukopeniju i reproduktivni neuspeh koji karakterišu embrionalna i/ili fetalna infekcija i smrt, ili njihove kombinacije.

[0118] Termin „u potrebi“ ili „iz potrebe“, kako se ovde koristi, znači da je primena/lečenje povezano sa podsticanjem ili poboljšanjem zdravstvenih ili kliničkih znakova ili bilo kojim drugim pozitivnim lekovitim efektom na zdravlje životinja (uključujući njihove embrione ili fetuse) koje primaju imunogeni sastav u skladu sa ovim pronalaskom.

[0119] Termin „smanjujući“ ili „smanjeno“ ili „smanjenje“ ili ''niži'' se koriste naizmenično u ovoj prijavi. Termin „smanjenje“ znači da je klinički znak smanjen za najmanje 10%, poželjnije za najmanje 20%, još poželjnije za najmanje 30%, još poželjnije za najmanje 40%, još poželjnije za najmanje 50%, još poželjnije za najmanje 60%, još poželjnije za najmanje 70%, još poželjnije za najmanje 80%, još poželjnije za najmanje 90%, još poželjnije za najmanje 95%, najpoželjnije za 100% u poređenju sa ispitanicima koji nisu lečeni (nisu imunizovani), ali su naknadno zaraženi određenim PPV-om.

[0120] Dalje, imunogeni sastavi ovog pronalaska mogu se koristiti u metodi smanjenja reproduktivnog neuspeha kod ispitanika, u poređenju sa ispitanikom neimunizovane kontrolne grupe iste vrste, metoda koja se sastoji od primene terapijski efikasne količine imunogenog sastava na ispitaniku kao što je zahtevano patentom.

[0121] Kao što je prikazano u odeljku Primeri, dokazano je da je imunogeni sastav, kako je ovde predviđeno, efikasan u smanjenju reproduktivnog neuspeha.

[0122] Dalje, imunogeni sastavi ovog pronalaska mogu se koristiti u metodi smanjenja embrionalne i fetalne smrti kod ispitanika, u poređenju sa ispitanikom neimunizovane kontrolne grupe iste vrste, metoda koja se sastoji od primene terapijski efikasne količine imunogenog sastava na ispitaniku kao što je zahtevano patentom.

[0123] Kao što je prikazano u odeljku Primeri, dokazano je da je imunogeni sastav, kako je ovde predviđeno, efikasan u smanjenju embrionalne i fetalne smrti.

[0124] Štaviše, imunogeni sastavi ovog pronalaska mogu se koristiti u metodi za aktivnu imunizaciju priplodnih svinja (krmača i nazimica) za zaštitu embriona i fetusa od infekcije parvovirusom svinja, metoda koja se sastoji od primene terapijski efikasne količine imunogenog sastava na takve svinje (krmače i nazimice), kako je zahtevano patentom.

[0125] U jednom aspektu ovog pronalaska, navedeni ispitanik je izabran iz grupe koju čine svinje, goveda, mačke i psi.

[0126] Poželjno, navedeni ispitanik je svinja. Mora se shvatiti da svinja obuhvata ženke i mužjake. Semena tečnost može da sadrži PPV i iz tog razloga su ženke i mužjaci priplodnih životinja obuhvaćeni izrazom „svinje“. Dakle, izraz „svinja“ obuhvata muške životinje kao što su veprovi, kao i ženske životinje kao što su nazimice i krmače.

[0127] Termin „nazimica“, kako se ovde koristi, odnosi se na svinjski, poželjno svinju, pre i tokom prve gestacije/graviditeta. Nasuprot tome, termin „krmača“, kako se ovde koristi, odnosi se na svinjski, po mogućnosti svinju, nakon prvog prašenja, - kao pozitivan rezultat njene prve gestacije/graviditeta.

[0128] U jednom aspektu ovog pronalaska, navedeni ispitanik je svinja, poželjno nazimica i/ili krmača.

[0129] U jednom aspektu ovog pronalaska, imunogeni sastav se primenjuje jednom.

[0130] Podrazumeva se da se jedna doza daje samo jednom.

[0131] Zapremina doze po ispitaniku zavisi od puta vakcinacije i starosti ispitanika. Poželjno je da pojedinačna doza ima ukupnu zapreminu između oko 0,2 ml i 2,5 ml, poželjnije između oko 0,2 ml i 2,0 ml, još poželjnije između oko 0,2 ml i 1,75 ml, još poželjnije između oko 0,2 ml i 1,5 ml, još poželjnije između oko 0,4 ml i 1,25 ml, još poželjnije između oko 0,4 ml i 1,0 ml sa jednom dozom od 0,5 ml ili dozom od 1,0 ml koja je najpoželjnija. Najpoželjnija pojedinačna doza ima ukupnu zapreminu od 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml ili 2 ml.

[0132] U jednom aspektu ovog pronalaska, imunogeni sastav se primenjuje u dve ili više doza.

[0133] Kao što je prikazano u odeljku Primeri, dokazano je da je imunogeni sastav kao što je ovde predviđeno efikasan nakon primene dve doze ispitaniku kome je to potrebno.

[0134] Međutim, imunogeni sastav se može primeniti u dve ili više doza, pri čemu se prva doza primenjuje pre primene druge doze (docepljivanja). Poželjno, druga doza se daje najmanje 15 dana nakon prve doze. Još poželjnije, druga doza se daje između 15 dana i 40 dana nakon prve doze. Poželjno, druga doza se daje najmanje 17 dana nakon prve doze. Još poželjnije, druga doza se daje između 17 dana i 30 dana nakon prve doze. Poželjno, druga doza se daje najmanje 19 dana nakon prve doze. Još poželjnije, druga doza se daje između 19 dana i 25 dana nakon prve doze. Poželjno, druga doza se daje najmanje 21 dan nakon prve doze. Još poželjnije, druga doza se daje oko 21 dan nakon prve doze ili 21 dan nakon prve doze. U poželjnom aspektu režima dvostruke primene, i prva i druga doza imunogenog sastava se primenjuju u istoj količini. Poželjno, svaka doza je u gore navedenim poželjnim količinama, pri čemu je najpoželjnija doza od 1 ml ili 2 ml za prvu i drugu dozu. Pored prvog i drugog režima doziranja, alternativno otelotvorenje obuhvata dalje naredne doze. Na primer, u ovim aspektima može se primeniti treća, četvrta ili peta doza. Poželjno je da se sledeći režimi treće, četvrte i pete doze primenjuju u istoj količini kao i prva doza, pri čemu je vremenski okvir između doza u skladu sa vremenom između prve i druge gore navedene doze.

[0135] Zapremina doze po ispitaniku zavisi od puta vakcinacije i starosti ispitanika. Poželjno, ukupna zapremina je između oko 0,2 ml i 5 ml, poželjnije između oko 0,5 ml i 3,0 ml, još poželjnije između oko 1,0 ml i 2,5 ml, još poželjnije između oko 1,0 ml i 2,0 ml.

Najpoželjnija zapremina je 1 ml, 1,5 ml, 2 ml ili 2,5 ml po dozi.

[0136] Imunogeni sastav se, poželjno, primenjuje lokalno ili sistemski. Pogodni putevi primene koji se konvencionalno koriste su oralna ili parenteralna primena, kao što su intranazalna, intravenska, intramuskularna, intraperitonealna, supkutana, kao i inhalacija.

Međutim, u zavisnosti od prirode i načina delovanja jedinjenja, imunogeni sastav se može primeniti i drugim putevima. Na primer, takvi drugi putevi uključuju intrakutano, intravenozno, intravaskularno, intraarterijski, intraperitonealno, intratekalno, intratrahealno, intrakutano, intrakardijalno, intralobularno, intralobarno, intramedularno, intrapulmonarno, intrarektalno i intravaginalno. Međutim, poželjniji je imunogeni sastav koji se primenjuje subkutano ili intramuskularno. Međutim, najpoželjniji imunogeni sastav se primenjuje intramuskularno.

[0137] U jednom aspektu ovog pronalaska, imunogeni sastav se primenjuje intramuskularno.

[0138] U jednom aspektu ovog pronalaska, navedeni imunogeni sastav se daje nazimicama i/ili krmačama.

[0139] Poželjno je da se imunogeni sastav primenjuje na nazimicama i/ili krmačama starosti najmanje tri 3 meseca, poželjnije najmanje 4 meseca starosti, najpoželjnije najmanje 5 meseci starosti.

[0140] U jednom aspektu ovog pronalaska, imunogeni sastav se primenjuje na nazimicama i/ili krmačama starosti najmanje tri 3 meseca.

[0141] U jednom aspektu ovog pronalaska, navedeni imunogeni sastav se daje nazimicama i/ili krmačama pre trudnoće.

[0142] U režimu sa 2 injekcije, druga doza navedenog imunogenog sastava se poželjno daje nazimicama i/ili krmačama 2, 3, 4 ili 5 nedelja pre pripusta/oplodnje, najpoželjnije oko 3 nedelje pre pripusta/oplodnje. Prvobitno, prva doza navedenog imunogenog sastava se daje nazimicama i/ili krmačama 2, 3, 4, 5 ili 6 nedelja pre primene druge doze, najpoželjnije oko 3 nedelje pre primene druge doze. Međutim, nakon primene režima 2 vakcinacije, poželjno je da se nazimice i/ili krmače revakcinišu svakih 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 meseci, najpoželjnije oko svakih 6 meseci.

[0143] U jednom aspektu ovog pronalaska, navedeni imunogeni sastav se daje nazimicama i/ili krmačama tokom graviditeta i laktacije.

[0144] U jednom aspektu ovog pronalaska, imunogeni sastav je bezbedan za nazimice i/ili krmače tokom graviditeta i laktacije.

[0145] U jednom aspektu ovog pronalaska, imunogeni sastav je bezbedan za nazimice i/ili krmače od 30 dana gestacije, poželjno od 40 dana gestacije.

[0146] Poželjno je da imunogeni sastav ovog pronalaska sadrži između 0,1 µg i 50 µg, poželjno između 0,25 µg i 25 µg, poželjnije između 0,5 µg i 12,5 µg, još poželjnije između 0,5 µg i 5 µg, najpoželjnije između 0,5 µg i 2 µg PPV VP2 antigena. Još poželjnije, imunogeni sastav ovog pronalaska obuhvata PPV VP2 antigen ovog pronalaska u količinama od oko 0,25 µg, 0,5 µg, 0,75 µg, 1 µg, 1,25 µg, 1,5 µg, 1,75 µg, 2 µg, 2,25 µg, 2,5 µg , 2,75 µg, 3 µg, 3,5 µg, 4 µg, 4,5 µg ili 5 µg.

[0147] U jednom aspektu ovog pronalaska imunogeni sastav sadrži između 0,1 µg i 50 µg PPV VP2 antigena, poželjno između 0,5 µg i 10 µg PPV VP2 antigena.

[0148] U jednom aspektu ovog pronalaska imunogeni sastav štiti od homolognog i/ili heterolognog izazova.

[0149] U jednom aspektu ovog pronalaska imunogeni sastav štiti od izazova sa severnoameričkim i/ili evropskim izolatima.

[0150] U jednom aspektu ovog pronalaska imunogeni sastav je unakrsna zaštita od severnoameričkih i/ili evropskih izolata.

[0151] U jednom aspektu ovog pronalaska pomenuta metoda rezultira poboljšanjem parametra efikasnosti izabranog iz grupe koja se sastoji od: smanjene prolazne leukopenije i reproduktivnog neuspeha koji karakterišu embrionalna i/ili fetalna infekcija i smrt, ili njihove kombinacije, u poređenju sa ispitanikom iz neimunizovane kontrolne grupe iste vrste.

[0152] U jednom aspektu ovog pronalaska pomenuta metoda rezultira poboljšanjem parametra efikasnosti izabranog iz grupe koja se sastoji od: smanjene veličine legla, povećane mumifikacije embriona ili fetusa po leglu, autolizacije embriona ili fetusa, smanjene veličine embriona ili fetusa, smanjene težine embriona ili fetusa, povećane viremije, povećanog virusnog opterećenja unutar ciljanih tkiva i krvi, povećanog prenosa/osipanja PPV na jedinke u okruženju, ili njihovih kombinacija, u poređenju sa ispitanikom neimunizovane kontrolne grupe iste vrste.

PRIMERI

[0153] Sledeći primeri su navedeni u nastavku kako bi se ilustrovala specifična otelotvorenja ovog pronalaska. Ovi primeri su samo ilustrativni i podrazumeva se da ne ograničavaju obim ili osnovne principe ovog pronalaska.

PRIMER 1:

PRIPREMA PODJEDINICE PPV VAKCINE

[0154] PPV VP2 antigen je izabran da bude eksprimiran u ćelijama insekata zaraženim bakulovirusom na osnovu izolata German PPV 27a. Nukleotidna sekvenca svinjskog parvovirusa (PPV) 27a VP2 je dobijena iz Genbank Accession AY684871.1. Regija kodiranja PPV 27a VP2 je reverzno translirana i optimizovana kodonom za Drosophila (SEQ ID NO:4 i SEQ ID NO:3). Gen PPV 27a VP2 optimizovan kodonom je hemijski sintetisan u Integrated DNA Technologies. Gen PPV 27a je zatim subkloniran u vektor prenosa bakulovirusa pVL1393 i ko-transficiran sa linearizovanom okosnicom bakulovirusa DiamondBac<®>u ćelije Sf9 insekata kako bi se generisao rekombinantni bakulovirus koji sadrži gen PPV 27a VP2 pod kontrolom promotera poliedrina.

[0155] Kada je eksprimiran u Sf9 ćelijama insekata, PPV VP2 se sam grupisao u VLP bez omotača (podaci nisu prikazani).

[0156] PPV VP2 antigen je potpomognut sa karbomerom (Carbopol).

PRIMER 2:

DOKAZ O KONCEPTUALNOJ STUDIJI PPV VAKCINE

[0157] U svim ispitivanjima na životinjama pre početka ispitivanja životinje su u dobrom zdravstvenom i nutritivnom statusu. Pre postupka randomizacije sprovodi se zdravstveni pregled. Tokom trajanja ispitivanja koristi se nemedicinska hrana za životinje. Obroci hrane su odgovarajući za starost, stanje i vrstu ogledne životinje u skladu sa standardnim operativnim postupkom objekta. Voda se obezbeđuje ad libitum tokom ispitivanja.

[0158] Cilj ove studije vakcinacija-izazov je da se utvrdi dokaz efikasnosti određivanja konceptualne doze za vakcinu protiv podjedinice svinjskog parvovirusa (PPV) pre pripusta (videti Primer 1). Nazimice se vakcinišu i uzgajaju pre izazova živim virulentnim PPV izolatom (PPV 002346-5; severnoamerički soj) u približno 40 dana gestacije (dG). Fetusi se procenjuju na PPV infekciju pri približno 90 dG.

[0159] Dizajn ispitivanja je opisan u Tabeli 1.

Tabela 1: Dizajn ispitivanja

[0160] Korišteno je šezdeset i sedam nazimica poreklom iz krda koje je prethodno bilo negativno na PPV bez prethodne istorije reproduktivnih bolesti ili vakcinacije protiv PPV. Nazimice su randomizovane u 6 terapijskih grupa (T) od n=9 pomešanih u 3 obora koja primaju vakcinaciju na D0 i docepljene na D21: T1 NC (negativna kontrola vode za injekcije), T2 PPV 10 µg, T3 PC (pozitivna kontrola; ceo, inaktivirani svinjski parvovirus (PPV), Erysipelothrix rűopathiae, Leptospira canicola, L.grippotyphosa, L. hardjo, L. icterohaemorrhagiae i L. Pomona; komercijalno dostupan; koristi se prema uputstvu za proizvodnju). Uključene su tri netretirane kontrolne nazimice (NTX), po jedna po oboru.

Nakon vakcinacije, nazimice su sinhronizovane (primenom Matrix<®>; altrenogest, Intervet Schering-Plough Animal Health; po etiketi za 14 uzastopnih dana, D18 do D31), a zatim su oplođene između D35 i D42. Pedeset četiri od 67 nazimica su ostale skotne. Na D80 (približno 40 dG), NTX nazimice su obducirane, a preostale nazimice su inokulisane sa 6 ml PPV soja PPV002346-5 (severnoamerički soj) pri 4,25 log10TCID50po dozi (2 ml intramuskularno i 2 ml po nozdrvi intranazalno). Uzorkovanje krvi nazimica vršeno je nedeljno, osim tokom sinhronizacije i razmnožavanja (D35 - D70). Serologija se izvodi na serumima iz D0, D7, D14, D21, D28 i D73; serologija i lančana reakcija polimeraze (PCR) (kao što je opisano u Jozwik et al.2009; Journal of General Virology, 90, 2437-2441) za viremiju vrši se na serumima iz D80, D87, D94, D101, D108, D115, D122 i D128. Nazimice su obducirane na D129 ili D130 (približno 90 dG). Na obdukciji je uklonjen svaki reproduktivni trakt, beležen je položaj fetusa u materici, stanje fetusa, veličina i težina.

Prikupljeni su uzorci torakalnog ispirka i pluća iz svakog fetusa. Uzorci torakalnog ispirka su prikupljeni aseptično iz svakog fetusa. Ukratko, 3 ml sterilnog PBS-a je ubrizgano u grudnu šupljinu sterilnom iglom i špricem. Tečnost je aspirirana nazad u špric i ubrizgavana u odgovarajuću, sterilnu SST (epruvetu za separaciju seruma) odgovarajuće veličine. Torakalni ispirci su testirani na prisustvo PPV pomoću PCR i na prisustvo PPV antitela inhibicijom hemaglutinacije (HI). Plućno tkivo je čuvano zamrznuto.

Viremija nazimica (PPV)

[0161] Sve nazimice su negativne na PPV viremiju pre izazova na D0, D73 (podaci nisu prikazani) i D80 (Tabela 2). Sve negativne kontrole su viremične na D87, a 4/7 su viremične na D94.

[0162] T3 nazimice nakon vakcinacije serokonvertuju nakon docepljivanja. T2 ima serološki odgovor na inicijalnu vakcinaciju i ostaje seropozitivan nakon docepljivanja. T1 kontrolne nazimice ostaju serološki negativne na PPV do izazova. Nakon izazova, sve nazimice negativne kontrole su viremične na D87 (sedam dana nakon izazova). Jedna nazimica T3 je viremična na D87. Sve ostale nazimice nisu viremične u ovim vremenskim tačkama (vidi Tabelu 2).

[0163] NTX nazimice su ostale seronegativne i svi njihovi fetusi su bili PPV negativni po PCR na uzorcima torakalnog ispirka.

Tabela 2: Raspodela učestalosti PPV-pozitivnih (PCR) nazimica kada su izazvane PPV-om u 40 dana gestacije (dG) na D80.

Rezultati fetusa

[0164] Svi NTX fetusi se smatraju normalnim na D80 nekropsiji (Tabela 3). Na završnoj nekropsiji na D129 i D130 uredno 22,5% T1 (Negativna kontrola) fetusa dok je 98,39% fetusa u T3 i 97,62% fetusa u T2 uredno. Prosečna veličina i težina fetusa T1 (Negativna kontrola) je 11,5 cm, odnosno 168,8 g, dok je prosečna veličina i težina fetusa u T217,5 cm, odnosno 590,1 g.

[0165] Svi T4 (NTX) fetusi su PPV negativni određeno PCR-om na uzorcima torakalnog ispirka (videti Tabelu 3). PPV infekcija je potvrđena kod 67/80 T1 fetusa negativne kontrole (83,75%). Šezdeset dva od 67 fetusa negativne kontrole za koje je potvrđeno da su zaraženi PPV-om su mumificirani. Nasuprot tome, PPV infekcija se potvrđuje samo u 0,79% kod T2 fetusa.

[0166] Na osnovu parametra zaključka za utvrđivanje efikasnosti kako je navedeno u Evropskoj farmakopeji (monografija 01/2008: 0965), sve vakcine [uključujući pozitivnu kontrolu (PPV sa inaktiviranom celom ćelijom)] ispunjavaju kriterijume za zaštitu od infekcije (>80% fetusa negativno na PPV).

Tabela 3: Detalji legla: broj, veličina, težina i stanje fetusa i laboratorijska potvrda PPV infekcije (PCR na uzorcima torakalnog ispirka).

Zaključak:

[0167] PPV vakcina ovog pronalaska pokazala je zaštitu fetusa nakon virulentnog heterolognog PPV izazova. Rezultati studije pokazuju da je vakcina bezbedna kada se primenjuje pre pripusta i efikasna u značajnom smanjenju viremije i transplacentarne infekcije kod fetusa. Dalje, pokazano je da vakcina štiti od heterolognog severnoameričkog PPV soja izazova. Dalje, pokazano je da je podjedinica PPV VP2 proteina podjednako efikasna kao i ceo ubijeni virus.

PRIMER 3:

UTVRĐIVANJE MINIMALNE IMUNIZACIONE DOZE PPV VAKCINE - ZAŠTITA OD HETEROLOGNOG SEVERNOAMERIČKOG PPV SOJA:

[0168] Cilj ove studije vakcinacija-izazov je da se utvrdi minimalna imunizaciona doza (MID) za vakcinu protiv svinjskog parvovirusa (PPV). Nazimice su izazvane živim virulentnim izolatom PPV serotipa 1 (PPV 002346-5) na približno 40 dana gestacije (dG). Vakcina se smatra efikasnom ako je ≥ 80% fetusa u vakcinisanoj grupi negativno na PPV nakon izazova. Potporni parametri uključuju veličinu fetusa, težinu i stanje, status viremije nazimica nakon izazova i serološki status nazimica.

[0169] Nazimice (bez prethodne istorije reproduktivnih bolesti ili vakcinacije protiv PPV) su randomizovane u terapijske grupe: T01 negativna kontrola (placebo (PMP) koji se podudara sa proizvodom) i T02 = 1,0 µg PPV/2 ml doze). Nelečene/neizazvane (NTX) nazimice su nasumično dodeljene oborima kao kontrole opšteg zdravstvenog stanja.

[0170] Nazimicama je dato 2 ml odgovarajućeg tretmana intramuskularno na D0 i D21.

Nakon vakcinacije, nazimice su oplođene između D37 i D50, a zatim su procenjene na status trudnoće na D74. Na D81, nazimice u gestaciji su izazvane sa 6,77 log10TCID50/6 ml PPV serotipa 1 intramuskularno i intranazalno. Krv nazimica je uzorkovana nedeljno osim tokom sinhronizacije estrusa i oplodnje (D36-D73). Testovi inhibicije hemaglutinacije (HI) su izvedeni na serumima iz D7, D14, D21, D28 i D35; HI i lančana reakcija polimeraze (PCR) (vidi primer 2) za viremiju je izvedena na serumima iz D-3, D74, D80, D88, D95, D102 i D127. Nazimice su nekropsirane na D128 i D129 (približno 90 dG). Na obdukciji je uklonjen reproduktivni trakt svake krmače, beležen je položaj fetusa u materici, stanje fetusa, veličina i težina. Uzorci torakalnog ispirka (vidi Primer 2) su prikupljeni od svakog fetusa i testirani na prisustvo PPV putem PCR.

Viremija nazimica (PPV)

[0171] Vakcine se smatraju bezbednim jer životinje ne pokazuju nenormalnu telesnu temperaturu 24 sata ili 48 sati nakon vakcinacije, nema nenormalnih lokalnih reakcija koje se mogu pripisati vakcini i nema kliničkih znakova povezanih sa vakcinacijom (podaci nisu prikazani).

[0172] Sve nazimice su negativne na PPV viremiju pre vakcinacije, pre izazova na D74 i na D80. Stoga, nakon vakcinacije, nisu primećeni klinički znaci povezani sa primenom vakcine. Na D88, svih deset nazimica T01 su viremične, a sve vakcinisane nazimice su negativne. Svi ostali uzorci krvi na D95, D102 i D127 su negativni na PPV viremiju za sve tretirane grupe (Tabela 4).

Tabela 4: Raspodela učestalosti PPV-pozitivnih (PCR) nazimica kada su izazvane PPV-om u 40 dana gestacije (dG) na D81.

Rezultati fetusa

[0173] Na finalnoj nekropsiji na D128 i D129, 38% T01 (Negativna kontrola) fetusa je u normalnom stanju, dok je 95% fetusa u vakcinalnoj grupi u normalnom stanju. Prosečna veličina i težina fetusa T01 (Negativna kontrola) je 14,4 cm, odnosno 245,9 g, dok je prosečna veličina i težina fetusa iz vakcinisanih skotnih ženki 19,3 cm, odnosno 550 g (Tabela 5). Dakle, vakcinisana grupa ispunjava kriterijume za zaštitu od infekcije PPV-om kao parametar zaključka za efikasnost PPV-a utvrđen od strane Ph. Eur.01/2008:0965 je > 80% fetusa u tretiranoj grupi mora biti negativno na PPV.

[0174] PPV infekcija je potvrđena u 113/146 fetusa negativne kontrole (T01) (77%).

Međutim, PPV infekcija u vakcinisanoj grupi (T02) iznosi samo 10%.

Tabela 5: Detalji legla: broj, veličina, težina i stanje fetusa i laboratorijska potvrda PPV infekcije (PCR na uzorcima torakalnog ispirka).

Zaključak:

[0175] PPV VP2 podjedinica vakcine ovog pronalaska pokazuje zaštitu fetusa nakon izazova virulentnim heterolognim PPV. Rezultati ove studije otkrivaju da je vakcina bezbedna i efikasna u sprečavanju viremije kod nazimica i PPV infekcije kod fetusa kada se koristi samo 1 µg PPV VP2 podjedinice vakcine. Dalje, pokazano je da vakcina štiti od heterolognog severnoameričkog PPV soja izazova.

PRIMER 4:

UTVRĐIVANJE MINIMALNE IMUNIZACIONE DOZE PPV VAKCINE - ZAŠTITA OD HETEROLOGNOG EU PPV SOJA

[0176] Cilj ove studije je procena početka imuniteta vakcine protiv parvovirusa svinja (koja se ovde naziva i PPV ili PPV VP2 vakcina). Pored toga, bezbednost i efikasnost se procenjuju korišćenjem randomizovane, slepe, negativno kontrolisane studije vakcinacija - izazov .

[0177] Nazimice su nasumično dodeljene u tri grupe. U grupama 1 i 2 nazimice su vakcinisane dva puta, u intervalu od tri nedelje (na D0 i D21). Druga doza je data tri nedelje pre pripusta. Svi tretmani su primenjeni intramuskularnim (IM) putem u zapremini od 2 ml. Grupa 2 je primila PPV vakcinu, dok je grupa 1 placebo grupa koja prima sterilni razblaživač kao kontrolni proizvod, a grupa 3 je služila kao stroga kontrola, bez ikakvog tretmana.

[0178] Nazimice su sinhronizovane sa estrusom i tri nedelje nakon druge vakcinacije veštački su oplođene. Životinje koje su zatrudnele izazvane su na D84 između 39. i 42. dana gestacije virulentnim, heterolognim PPV sojem.

[0179] Dana D132-135, oko 90. dana gestacije, nazimice su eutanazirane, nekropsirane i fetusi su procenjeni.

Tabela 6: Dizajn ispitivanja

Procena PPV viremije kod nazimica pre i posle izazova pomoću PCR:

[0180] Sve životinje su negativne na PPV po PCR na D-6 i D-1 pre vakcinacije koje ispunjavaju kriterijume za uključivanje. Nakon vakcinacije sve životinje u strogoj kontrolnoj i kontrolnoj grupi proizvoda su negativne na PPV antigen do izazova, stoga se PPV infekcija pre izazova može isključiti.

[0181] Viremija je istražena na 7 (D90), 14 (D97) i 21 (D104) dana nakon izazova i na dan nekropsije. Posle izazova nije detektovana viremija kod vakcinisanih životinja, viremija se javljala samo kod nevakcinisanih kontrolnih životinja.

[0182] Na D90, (7 dana nakon izazova) već 95% nevakcinisanih kontrolnih životinja je pozitivno na PPV. Na D97 i dalje 60% ovih životinja ima pozitivan rezultat, dok su na D104 sve životinje testirane negativno na PPV. Nasuprot tome, u vakcinisanoj grupi sve životinje testirane na dan D90, D97 ili D104 su negativne na PPV.

Tabela 7: Broj životinja sa viremijom nakon izazova

Rezultati fetusa

[0183] Procenat fetusa zaraženog PPV-om bio je 91,4% u kontrolnoj grupi, ali samo 4,3% u PPV grupi (videti Tabelu 8).

Tabela 8 Procenat pozitivnih fetusa po grupi i veličini legla

Procena stanja fetusa

[0184] Svi fetusi su procenjeni na njihovo stanje i raspoređeni u tri kategorije: normalni, mumificirani i autolizirani.

[0185] Većina mumificiranih i autoliziranih fetusa nalazi se u kontrolnoj grupi. Samo 39,8% fetusa u ovoj grupi je u normalnom stanju, dok je u vakcinisanim grupama 97,4% (PPV grupa) fetusa u normalnom stanju (vidi Tabelu 9).

Tabela 9: Fetalno stanje

Zaključak:

[0186] PPV vakcina ovog pronalaska pokazuje zaštitu fetusa nakon virulentnog heterolognog PPV izazova što ukazuje na to da je vakcina bezbedna i efikasna u sprečavanju viremije i PPV infekcije kod fetusa kada se koristi samo 1 µg vakcine. Dalje, pokazano je da vakcina takođe štiti od heterolognog evropskog soja PPV. Dakle, vakcina ima širok spektar zaštite jer vakcina štiti od heterolognih severnoameričkih, kao i heterolognih evropskih sojeva izazova.

[0187] Svi sastavi i metode koji su ovde obelodanjeni i za koje se zahteva patent mogu se izraditi i izvršiti bez nepotrebnog eksperimentisanja u svetlu ovog obelodanjivanja. Preciznije, biće očigledno da određeni agensi koji su i hemijski i fiziološki povezani mogu biti zamenjeni ovde opisanim agensima, dok bi se postigli isti ili slični rezultati.

Claims

Patentni zahtevi

1. Virusni protein 2 (VP2) svinjskog parvovirusa (PPV) koji se sastoji od

izoleucinskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 25, i

serinskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 36, i

izoleucinskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 37, i

ostatka glutaminske kiseline ili ostatka glutamata na aminokiselinskoj poziciji 228, i serinskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 414, i

glutaminskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 419, i

treoninskog ostatka na aminokiselinskoj poziciji 436,

2. Imunogeni sastav koji obuhvata PPV VP2 prema zahtevu 1.

3. Imunogeni sastav prema zahtevu 2, pri čemu imunogeni sastav dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, pri čemu je farmaceutski prihvatljiv nosač poželjno karbomer.

4. Imunogeni sastav prema zahtevu 2 ili 3, pri čemu je imunogeni sastav vakcina.

5. Polinukleotid koji se sastoji od sekvence koja kodira PPV VP2 prema zahtevu 1.

6. Bakulovirusni vektor koji se sastoji od polinukleotida prema zahtevu 5.

7. Ćelija koja se sastoji od polinukleotida prema zahtevu 5 ili vektora prema zahtevu 6, pri čemu ćelija je ćelija insekta izabrana iz grupe koja se sastoji od: Sf9 ćelija, Sf+ ćelija.

8. Čestica slična virusu koja se sastoji od PPV VP2 prema zahtevu 1.

9. Metoda proizvodnje PPV VP2 prema zahtevu 1, koja se sastoji od transfekcije ćelije insekta izabrane iz grupe koja se sastoji od: Sf9 ćelija, Sf+ ćelija, sa vektorom prema zahtevu 6.

10. PPV VP2 prema zahtevu 1, imunogeni sastav prema bilo kom od zahteva 2 do 4, polinukleotid prema zahtevu 5, vektor prema zahtevu 6, ćelija prema zahtevu 7 i/ili čestice slične virusu prema zahtevu 8 za upotrebu kao lek.

11. Imunogeni sastav prema bilo kom od zahteva 2 do 4 za upotrebu u metodi lečenja i/ili sprečavanja infekcije PPV-om i/ili za upotrebu u metodi smanjenja, prevencije i/ili lečenja kliničkih znakova izazvanih PPV infekcijom kod ispitanika kome je to potrebno, metoda koja se sastoji od primene na ispitaniku terapeutski efikasne količine imunogenog sastava prema bilo kom od zahteva 2 do 4, i pri čemu je ispitanik nazimica ili krmača.

12. Imunogeni sastav prema bilo kom od zahteva 2 do 4 za upotrebu u metodi iz zahteva 11, pri čemu se takvi klinički znaci izazvani PPV infekcijom biraju iz grupe koja se sastoji od: prolazne leukopenije i reproduktivnog neuspeha koji je naznačen time što je embrionalna i fetalna infekcija i smrt, smanjena veličina legla, povećana mumifikacija embriona ili fetusa po leglu, autolizacija embriona ili fetusa, smanjena veličina embriona ili fetusa, smanjena težina embriona ili fetusa, povećana viremija, povećano virusno opterećenje unutar ciljanih tkiva i krvi, povećana transmisija/osipanje PPV na jedinke u okruženju, ili njihove kombinacije.

13. Imunogeni sastav prema bilo kom od zahteva 2 do 4 za upotrebu u metodi smanjenja reproduktivnog neuspeha kod ispitanika, u poređenju sa ispitanikom neimunizovane kontrolne grupe iste vrste, metoda se sastoji od primene na ispitaniku terapeutski efikasne količine imunogenog sastava prema bilo kom od zahteva 2 do 4, pri čemu je ispitanik nazimica ili krmača.

14. Imunogeni sastav prema bilo kom od zahteva 2 do 4 za upotrebu u metodi smanjenja embrionalne i fetalne smrti kod ispitanika, u poređenju sa ispitanikom neimunizovane kontrolne grupe iste vrste, metoda se sastoji od primene na ispitaniku terapeutski efikasne količine imunogenog sastava prema bilo kom od zahteva 2 do 4, pri čemu je ispitanik nazimica ili krmača.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Kneginje Ljubice 5, 11000 Beograd

44