RS67191B1

RS67191B1 - Postupci za prečišćavanje ponovo uvijenog fc-peptidnog fuzionog proteina

Info

Publication number: RS67191B1
Application number: RS20250895A
Authority: RS
Inventors: Sebastian Damerow; Elisa Mir; László Zoltán Baranyai; Zoltán Sütö
Original assignee: Richter Gedeon Nyrt
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2025-10-31
Also published as: PT4263568T; DK4263568T3; FI4263568T3; WO2022129460A1; US12540160B2; SMT202500333T1; CA3200462A1; EP4263568A1; PL4263568T3; AU2021399935A1; US20240101598A1; SI4263568T1; HUE072796T2; ES3040791T3; LT4263568T; HRP20251064T1; MX2023007131A; EP4263568B1

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na postupke prečišćavanja Fc-peptidnih fuzionih proteina eksprimovanih u mikroorganizmima pomoću niza hromatografija kao što je prikazano u priloženim patentnim zahtevima. Ti postupci obuhvataju afinitetnu hromatografiju, multimodalnu hromatografiju (eng. mixed-mode chromatography), i katjonsko-izmenjivačku hromatografiju, čime se obezbeđuju Fcpeptidni fuzioni proteini sa stepenom čistoće za farmaceutsku upotrebu, u suštini bez nečistoća povezanih sa procesom i sa veoma niskim nivoima nečistoća povezanih sa proizvodom, koje nastaju usled razaranja ćelija, rastvaranja iz inkluzionih tela, i potonjeg ponovnog uvijanja (eng. refolding).

STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0002] Upotreba terapijskih peptida je atraktivan farmaceutski pristup. Terapijski peptidi često pokazuju potentnu bilošku aktivnost i visoku specifičnost, kao i dobro prodiranje u tkiva zbog svoje male veličine. Međutim, mnogi biološki aktivni peptidi imaju ograničen poluživot usled svog brzog bubrežnog klirensa, koji ograničava njihovo izlaganje u ciljanom tkivu i njihova farmakološka dejstva. Nasuprot tome, imunoglobulin (IgG) pokazuje duži poluživot usled svoje velike veličine i pH-zavisnog vezivanja neonatalnog Fc-receptora (FcRn) koji spasava IgG od degradacije (Pyzik et al.2015).

[0003] Fc-peptidni fuzioni proteini (peptitela) kombinuju biološku aktivnost peptidā sa stabilnošću monoklonskih antitela. Da bi se konstruisali ti FC-peptidni fuzioni proteini, aktivni visokoafinitetni peptid fuzioniše se u okviru sa Fc domenom jednog IgG (Shimamoto et al.2012). Integracija Fc domena IgG ima za cilj da produži polu-život putem FcRn zaštite. Visokoafinitetni peptid predstavlja biološki aktivan region i konstruiše se tako da se maksimalno uvećava njegova aktivnost. Peptidne sekvence se izoluju iz biblioteka faga ili poznatih sekvenci i integrišu se rekombinantnim tehnikama kloniranja. Poboljšavanje afiniteta peptida za njegovu metu može se postići dupliranjem njegove sekvence, alteracijom peptidne sekvence ili adicijom specifično projektovanih susednih spejsera, ostataka, ili linkerskih sekvenci. Orijentacija sekvence peptida može promeniti njegovu aktivnost, npr., peptidi su aktivniji kada se fuzionišu sa karboksi terminusom Fc domena umesto sa amino terminusom (Shimamoto et al.2012). Homodimerizacija dva Fc molekula generiše minimum dva peptida u jednom peptitelu, povećavajući avidnost za njegovu metu.

[0004] Prototip peptitela, romiplostim (Nplate®), odobrile su za lečenje imunološke trombocitopenične purpure (IP) Američka agencija za hranu i lekove (FDA – United States Food and Drug Administration) 2008. i Evropska agencija za lekove (EMA – European Medicines Agency) 2009, respektivno. Strukturalno, romiplostim se sastoji od peptidnog mimetičkog trombopoietina (TPO) fuzionisanog sa Fc domenom IgG1. Endogeni TPO je glikoproteinski hormon proizveden u jetri i vezivanje TPO za njegov receptor c-Mlp aktivira signalnu kaskadu koja reguliše diferencijaciju i proliferaciju magakariocita u koštanoj srži sa istovremenim povećanjem trombocita. Kloniranje i karakterizacija TPO sredinom 1990-ih dovela je do generisanja glikoziliranog rekombinantnog proteina pune dužine koji je identičan engodenom TPO (rhTPO), i neglikoziliranog, pegilovanog, skraćenog rekombinantnog proteina (PEG-rHuMGDF). Nalaz da je PEG-rHuMGDF indukovao unakrsno reagujuća antitela, koja su neutralisala endogeni TPO (Li et al.2001), doveo je do razvoja romiplostima. 14 aminokiselinska peptidna komponenta romiplostima identifikovana je na osnovu skeniranja biblioteka rekombinantnih faga nasumičnih peptida koji stimulišu TPO-zavisne ćelijske linije (Cwirla et al.1997). Afinitet peptida je optimizovan mutagenezom i adicijom susednog linkera. Peptid romiplostima ne deli nijednu homologiju sekvenci sa endogenim TPO čime se svodi na minimum razvijanje unakrsno reagujućih antitela. Romiplostim je homodimer sastavljen od dve identične jednolančane podjedinice, svaka podjedinica se sastoji od dva tandemska ponavljanja TPO-vezujuće peptidne sekvence koja su separisana pomoću linkera sa osam glicinskih ostataka i fuzionisana sa karboksi termunusom Fc humanog IgG1 pomoću drugog linkera sa pet glicinskih ostataka. Romiplostim se proizvodi tehnologijom rekombinantne DNK u E. coli. Podražavanjem funkcije endogenog TPO, romiplostim deluje kao agonist TPO receptora koji aktivira međućelijske transkripcione putanje putem TPO receptora c-Mlp da bi se povećala proizvodnja trombocita.

[0005] Prekomerna ekspresija heterolognih rekombinantnih polipeptida u transformisanim mikroorganizmima često dovodi do formiranja takozvanih inkluzionih tela (IBs), koja sadrže rekombinantni protein u nenativnoj formi. Ta inkluziona tela su visoko refraktilni, amorfni agregati i polipeptidi u njima su generalno odvijeni, redukovani, neaktivni i barem delimično nerastvorljivi u običnom vodenom puferu. Procesi za dobijanje rekombinantnih proteina iz inkluzionih tela opisani su u oblasti tehnike i generalno obuhvataju lizu i razaranje ćelija, za čim sledi centrifugiranje. Pelet koji sadrži veliku razmeru inkluzionih tela obično se ispira detergentima da bi se uklonile lipidne membrane, lipopolisaharidi (LPS), drugi ćelijski ostaci i drugi zagađivači. Naučna literatura obezbeđuje mnoge postupke za izolovanje i prečišćavanje inkluzionih tela i za rastvaranje i ponovno uvijanje rekombinantnog proteina nakon toga u njegovo nativno stanje. (Termini „ponovno uvijanje“ i „renaturacija“ se ovde upotrebljavaju sinonimno.) Za rastvaranje rekombinantnog proteina mogu se primeniti različite strategije. Pored jonskih i nejonskih detergenata, kao što su natrijum dodecil sulfat (SDS) ili N-laurilsarkozin (sarkozil), haotropni reagensi, kao što su guanidin hidrohlorid (GuHCl) ili urea, upotrebljavaju se za rastvaranje proteina od interesa. Često se rastvaranje izvodi pod alkalnim uslovima (pH 8 do 12,5) u prisustvu redukujućih agenasa, kao što su ditiotreitol (DTT), ditioeritrol (DTE) ili 2-merkaptoetanol (ME) (Marston 1986, Rudolph 1990, Rudolph and Lilie 1996, Dietrich et al. 2003). Tipično je rastvoreni protein prvo potpuno redukovan i neaktivan, a zatim se podvrgava ponovnom uvijanju pre hromatografskog prečišćavanja. Na primer, EP0219874 prikazuje generičke postupke za ponovno uvijanje rekombinantnih proteina iz inkluzionih tela E. coli. Za rastvaranje su upotrebljavani haotropni agensi GuHCl i arginin pri visokoj pH. EP0219874 opisuje formiranje disulfidnih mostova pod redoks uslovima koji su obezbeđeni pomoću GSH/GSSG. Rudolph (1990) opisuje sledeći niz koraka: a) upotreba GuHCl ili uree za rastvaranje pri pH 8–9 pod reduktivnim uslovima (DTT, DTE ili 2-ME), b) uklanjanje reagenasa dijalizom ili gel hromatografijom (Sephadex G‑25) i c) formiranje disulfida (= ponovno uvijanje) pomoću sistemā za oksidativno preuređivanje (eng. oxido-shuflfing) ili pomoću reverzibilne hemijske modifikacije tiolā proteina, pri čemu su oba zasnovana na dejstvu dodatog GSH/GSSG. Rudolph i Lilie (1996) naglašavaju aditive koji se upotrebljavaju tokom ponovnog uvijanja, koji mogu uticati na rastvorljivost i stabilnost neuvijenog proteina, međuproizvoda uvijanja, i nativnog uvijenog proteina. Autori sugerišu generički osnovni protokol za rastvaranje i ponovno uvijanje: a) Rastvaranje sa 6 M GuHCl i 100 mM DTT pri pH 8, b) redukujući agensi se uklanjaju pomoću dijalize i pH se podešava do 4,5 i c) uvijanje se izvodi pomoću velikog razblaženja (1 : 200) u puferu sa EDTA i GSH/GSSG pri pH 7,5 do 8,5. Dietrich et al. (2003) opisuju rastvaranje proteina iz inkluzionih tela E. coli sa 6 M GuHCl pod reduktivnim uslovima (DTE). Inkubacija za ponovno uvijanje izvedena je pri pH 9 u 1 M arginina u prisustvu GSH/GSSG. Finalno prečišćavanje izvedeno je pomoću hromatografije hidrofobnih interakcija (HIC – hydrophobic interaction chromatography) za kojom je sledila katjonsko-izmenjivačka hromatografija (CEX) pomoću SP sefaroze. Napomena o primeni dostupna od GE Healthcare 2007 (Application Note 18‑1112‑33, 1‑4) takođe je revidirani opšti protokol. Rastvaranje se preporučuje sa 8 M uree ili 6 M GuHCl. Ponovno uvijanje je opisano kao spora dijaliza ili razblaživanje blizu neutralne pH. Alternativno, hromatografski korak se može upotrebiti za ponovno uvijanje. Sugerisani hromatografski postupci obuhvataju hromatografiju sa isključivanjem veličine čestica (SEC – size exclusion chromatography), jonsko-izmenjivačku hromatografiju (IEX) i hromatografiju hidrofobnih interakcija (HIC) koja je sugerisana umesto dijalize ili razblaživanja. WO0002901 opisuje opšti postupak za ponovno uvijanje primenjivanjem visokog pritiska unutar rezervoara za ponovno uvijanje. Opciono, haotropni agensi i/ili redoks jedinjenja (DTT/GSSG) prisutni su u puferima za ponovno uvijanje. WO2011005488 se odnosi na ponovno uvijanje Fc-fuzionih proteina sa puferom koji sadrži denaturant, kao što su urea, dimetil urea ili drugi haotropi, supresor agregacije, kao što je arginin, stabilizator proteina, kao što su glicerol ili saharoza, i redoks komponentu, kao što su cistein ili cistamin. WO2010151688 povezuje ponovno uvijanje i prečišćavanje Fc-fuzionih proteina. Protein koji sadrži Fc direktno se prečišćava iz smeše za ponovno uvijanje koja obuhvata glicerol, guanidin, ureu, i arginin bez potrebe za razblaživanjem pufera za ponovno uvijanje pre nanošenja na matriks za separaciju, kao što su afinitetna hromatografija sa proteinom A i katjonsko-izmenjivačka hromatografija, respektivno.

[0006] U slučaju peptitela, ponovno uvijanje redukovanih monomernih polipeptida zahteva oksidaciju dimera. Fc deo peptitela, koji obično odgovara Fc delu humanog IgG1, sastoji se od dva lanca povezana pomoću dva disulfidna mosta. Uz to, CH2 i CH3 domeni Fc dela svaki poseduje dva međulančana disulfidna mosta na svakom lancu. Sveukupno, Fc deo obuhvata dvanaest cisteina. Uspešno ponovno uvijanje peptitela dovelo bi do dimernog Fc dela koji ima šest disulfida u desnom položaju, dva međulanca i četiri međulančana mosta (videti Sliku 1). Očigledno je da će proces ponovnog uvijanja nositi takođe nekoliko nekompletnih, pogrešno uvijenih i neželjenih vrsta, kao što su sulfidne varijante, tj. vaijante sa neuparenim cisteinima, trisulfidima i pogrešno uparenim sulfidnim varijantama sa disulfidnim mostovima u pogrešnim konfiguracijama. Te nečistoće povezane sa proizvodom moraju se ukloniti tokom narednog prečišćavanja, zajedno sa drugim nečistoćama kao što su nečistoće povezane sa procesom, kako bi se proizveo bezbedan faramceutski proizvod visoke čistoće za ljudsku upotrebu.

[0007] Izbor efikasnih i ekonomičnih nishodnih sekvenci za prečišćavanje polipeptida proizvedenih tehnologijom rekombinantne DNK krucijalni je korak u razvoju svakog novog biofarmaceutskog proizvoda predviđenog za terapijsku upotrebu. Generalno kompleksna kompozicija rastvora za ponovno uvijanje za rekombinantne polipeptide eksprimovane u bakterijskim inkluzionim telima postavlja visoke zahteve za hromatografiju za hvatanje i naredne hromatografije za fino prečišćavanje. Čitav nishodni proces mora da: (i) obradi veliku masu proteina, (ii) efikasno ukloni povećane nečistoće povezane sa procesom i proizvodom do nivoa ispod definisanog kriterijuma prihvatljivosti, (iii) održi ekonomske prinose, i (iv) osigura dovoljan kvalitet proteinskog leka. Obično je nishodni proces odgovoran za veći deo ukupnih troškova proizvodnje terapijskog rekombinantnog proteina.

[0008] Ponovo uvijeni rekombinantni proteini izvedeni iz inkluzionih tela mikroorganizama tipično su povezani sa visokim opterećenjem nečistoćama povezanim sa procesom i proizvodom. Nečistoće povezane sa procesom su nečistoće koje se izvode iz bilo ushodnih ili nishodnih delova procesa proizvodnje i obuhvataju proteine ćelije domaćina (HCP – host cell proteins), DNK ćelije domaćina (HCDNA – host cell DNA), endotoksine, i različite izluževine iz procesnih materijala. Nečistoće povezane sa proizvodom, kao što su sulfidne varijante (redukovane forme, slobodni cistein, disulfidna pogrešna uparivanja), naelektrisane varijante, agregati, oksidisane vrste (metionin, triptofan), deamidovane vrste (asparagin), karbamilovane vrste, skraćene vrste (C- i N-terminal), monomeri, i druge neželjene varijante proizvoda teško je analizirati. Njihovo uklanjanje je veliki izazov za nishodni proces. Prisustvo bilo koje od tih nečistoća je potencijalni zdravstveni rizik za pacijente, te je otuda njihovo smanjenje u finalnom proizvodu bezbednosni zahtev. Mogu se tolerisati samo veoma male rezidualne količine.

[0009] Klasična procedura za prečišćavanje ponovno uvijenih polipeptida izvedenih iz inkluzionih tela sledi niz hromatografija za hvatanje – srednja – za fino prečišćavanje, praćenih koracima filtracija i koncentrovanja ili dijalize u različitim pozicijama nishodnog niza.

[0010] Jedan od najčešćih koraka hvatanja koji se upotrebljava za prečišćavanje molekula koji nose Fc jeste afinitetna hromatografija sa Proteinom A ili Proteinom G u kojoj se imunoglobulin mora uhvatiti iz uzorka koji obuhvata Fc-protein zajedno sa nečistoćama. Taj tip hvatanja pruža izuzetnu selektivnost za proteine koji nose Fc, usled čega uklanjanje većine zagađivača dovodi do čistoće u visini od 95% u jednom koraku (Gagnon 1996). Fc-protein se separiše od nečistoća zbog selektivnog vezivanja Fc dela za afinitetne ligande smole za hromatografiju za hvatanje, dok se nečistoće ne vezuju za smolu te se stoga dobijaju u protočnoj frakciji, dok se Fc-protein dobija u eluatu. Taj efikasan korak prečišćavanja je jedna od prednosti koje karakterišu sistem fuzije Fc.

[0011] Tipično, nishodni proces prečišćavanja za Fc fuzioni protein sastoji se od tri koraka hromatografije, koji počinju korakom hvatanja sa proteinom A i za kojim slede dva koraka hromatografija za fino prečišćavanje radi uklanjanje nečistoća u tragovima. Sažet prikaz tog opšteg procesa u skladu je sa zajedničkom platformom za monoklonska antitela i Fc fuzione proteine u biofarmaceutskoj industriji (Fahrner et al.2001, Shukla et al.2008). Koraci hromatografija za fino prečišćavanje služe za redukovanje nečistoća povezanih sa procesom i povezanih sa proizvodom. U slučaju bakterijskog sistema domaćina koji se upotrebljava za proizvodnju Fc fuzionisanih malih ili srednje velikih peptida, rekombinantno eksprimovani polipeptidi nisu glikozilovani. Normalno prisutan N-vezani oligosaharid Fc domena je odsutan, što dovodi do ograničene rastvorljivosti, tendencije za agregiranje i precipitiranje, i postavlja dalje visoke zahteve za izbor odgovarajućih hromatografija i njihovih uslova. Hromatografije za fino prečišćavanje, koje se uobičajeno upotrebljavaju za prečišžavanje antitela i Fc fuzionih proteina, obično se biraju od jonsko- i katjonsko-izmenjivačke hromatografije, hromatografije hidrofobnih interakcija, multimodalne hromatografije, hidroksiapatitne hromatografije, hidrofobno naeleketrisane indukcione hromatografije, i afinitetne hromatografije sa imobilisanim metalnim jonima (Gagnon 1996, Liu 2010).

[0012] Postoje različiti primeri u literaturi za prečišćavanje Fc-peptidnog fuzionog proteina romiplostima. Na primer, Linderholm i Chamow (2014) pozivaju se na tipičnu šemu prečišćavanja Fc-peptidnog fuzionog proteina koja uključuje centrifugiranje/filtraciju da bi se dobio izbistren supernatant, za čim sledi hromatografija sa proteinom A pre finog prečišćavanja dodatnim koracima hromatografije. Izazovi u prečišćavanju Fc-peptidnog fuzionog proteina uključuju optimizaciju uslova elucije da bi se održala biološka aktivnost, redukovanje agregacije proteina, i identifikovanje tehnika za fino prečišćavanje koje omogućavaju visoku čistoću i prinos. Zhang et al. (2020) opisuju proceduru prečišćavanja katjonskoizmenjivačke i hidrofobne hromatografije do prvih redukovanih endogenih proteina ćelije domaćina pre hromatografije sa proteinom A. WO0024770 i WO0024782 opisuju prečišćavanje Fc-TPO mimetičkog peptida (Fc-TMP-TMP). Nakon rastvaranja inkluzionih tela guanidinom, Tris-om i DTT-om, smeša je razblažena ureom, Tris-om, argininom i cisteinom. Tokom mešanja smeše, Fc-TMP-TMP monomerske podjedinice dimerizuju da bi formirale disulfidno-vezano jedinjenje. Nakon toga, kiselo staloženi Fc-TPO mimetički peptid prečišćen je na katjonsko-izmenjivačkoj hromatografiji u režimu vezivanja. Fayaz et al. (2016) opisuju konstruisanje romiplostima, ekspresiju u E. coli i analizu. Nakon procesa lize, separacije, denaturisanja i rastvaranja, peptitela su ponovo uvijena i prečišćena pomoću afinitetne hromatografije na sefarozi sa proteinom A. WO2017168296 prikazuje prečišćavanje Fc fuzionog proteina pomoću serije koraka koji obuhvataju Protein A kao korak hvatanja, za čim sledi anjonsko-izmenjivačka hromatografija i hromatografija hidrofobnih interakcija, pre katjonsko-izmenjivačke hromatografije kao finalnog koraka finog prečišćavanja. Dokument EP3436473 A1 prikazuje postupak za prečišćavanje Fc-peptidnog fuzionog proteina koji se razlikuje u nizu koraka prečišćavanja i nadalje ne pominje ponovno uvijanje Fc fuzionog peptida. Dokument WO 2020200980 A1 prikazuje prečišćavanje imunoglobulina koje obuhvata korake po redosledu: hvatanje sa proteinom A (vezivanje-ispiranje-eluiranje), katjonsko-izmenjivačka hromatografija (vezivanje-eluiranje), i multimodalna hromatografija (vezivanje-eluiranje) i UF/DF. Dokument ne pominje prečišćavanje ponovo uvijenog Fc-peptidnog fuzionog proteina.

SUŠTINA PRONALASKA

[0013] Predmetni pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Bilo koji predmet koji spada izvan obima patentnih zahteva obezbeđen je samo za svrhe informisanja. Predmetni pronalazak se odnosi na nove postupke za prečišćavanje rekombinantnih Fc-peptidnih fuzionih proteina ekstrahovanih iz inkluzionih tela i ponovo uvijenih u biološki aktivne, homodimerske molekule. Postupci obuhvataju niz postupaka hromatografije koji obuhvata afinitetnu hromatografiju za hvatanje, srednju hromatografiju i hromatografiju za fino prečišćavanje.

[0014] Ključni problem prečišćavanja ponovo uvijenih Fc-peptidnih fuzionih proteina ispostavilo se da je prisustvo sulfidnih varijanti, koje imaju slična fizičko-hemijska svojstva i slično hromatografsko ponašanje. Pošto se u finalnom farmaceutskom proizvodu te nečistoće povezane sa proizvodom tolerišu samo u veoma niskim nivoima, one se moraju smanjiti tokom procesa prečišćavanja. Posebno se tokom procesa ponovnog uvijanja formiraju velike količine sulfidnih varijanti. Stoga je predmetni pronalazak razvio postupke koji prevazilaze zajedničko prečišćavanje sulfidnih varijanti i drugih nečistoća. Posebno, pronalazak obezbeđuje postupke za prečišćavanje rekombinantnih Fc-peptidnih fuzionih proteina od nečistoća bez znatnijeg gubitka rekombinantnog Fc-peptidnog fuzionog proteina, tj. tokom procesa prečišćavanja regeneriše se visok procenat pravilno uvijenog rekombinantnog Fc-peptidnog fusionog proteina.

[0015] Da bi se postigla tražena visoka čistoća rekombinantnog proteina predviđenog za terapijsku upotrebu, dva ili više koraka hromatografskog finog prečišćavanja slede nakon afinitetne hromatografije za hvatanje.

[0016] Postupci prema pronalasku uključuju specifične uslove i izabrane pufere da bi se izbegla neželjena sekundarna modifikacija, kao što su agregacija, precipitacija, oksidacija, deamidacija, skraćivanje ili drugi tipovi degradacije Fc-peptidnih fuzionih proteina. Postupci ciljaju na stepen kvaliteta za farmaceutsku upotrebu smanjujući nečistoće povezane sa proizvodom, kao što su sulfidne varijante ili izmenjene varijante Fc-peptidnih fuzionih proteina u finalnom proizvodu, koji je formulisana farmaceutska kompozicija ili pripremna farmaceutska kompozicija koja sadrži Fc-peptidni fuzioni protein visoke čistoće. Formulacija i željena koncentracija Fc-peptidnog fuzionog proteina omogućavaju se finalnim korakom dijafiltracije/ultrafiltracije, koji je takođe deo pronađenog niza za prečišćavanje.

[0017] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak za prečišćavanje ponovo uvijenog Fcpeptidnog fuzionog proteina iz kompozicije koja obuhvata Fc-peptidni fuzioni protein i najmanje jednu nečistoću, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake po sledećem redosledu:

a) izvođenje afinitetne hromatografije za hvatanje;

b) izvođenje multimodalne hromatografije;

c) izvođenje katjonsko-izmenjivačke hromatografije; i

d) izvođenje ultrafiltracije/dijafiltracije;

gde se Fc-peptidni fuzioni protein izvodi iz inkluzionih tela mikroorganizama; i

gde najmanje jedna nečistoća jeste sulfidna vaijanta Fc-peptidnog fuzionog proteina; i

gde se hromatografije a), b) i c) izvode u režimu vezivanje-eluiranje, opciono sa jednim ili više koraka ispiranja.

[0018] Fc-peptidni fuzioni proten može biti eksprimovan u mikroorganizmima, poželjno u bakterijama, poželjnije u E. coli.

[0019] U jednom izvođenju, ponovno uvijeni Fc-peptidni fuzioni protein je ne-glikozilovani, dimerni Fcpeptidni fuzioni protein. Pošto je Fc-peptidni fuzioni protein lišen prirodnog obrasca glikozilacije, njegov strukturni integritet i rastvorljivost su redukovani u poređenju sa glikozilovanim Fc-peptidnim fuzionim proteinima. Otuda postupak prema pronalasku posebno prevazilazi probleme prečišćavanja neglikozilovanih Fc-peptidnih fuzionih proteina pomoću specifičnog postupka prečišćavanja koji omogućava regeneraciju Fc-peptidnog fuzionog proteina u razumnim prinosima dok se uklanjaju nečistoće, posebno sulfidne varijante Fc-peptidnog fuzionog proteina.

[0020] Fuzionisani Fc domen može biti izveden iz humanog imunoglobulina, poželjno iz IgG, poželjnije iz IgG1.

[0021] Peptidna sekvenca može biti receptorski agonist, poželjno mimetik trombopoietina. Tako, u jednom poželjnom izvođenju, Fc-peptidni fuzioni protein jeste romiplostim. Romiplostim je homodimer sastavljen od dve identične jednolančane podjedinice. Aminokiselinska sekvenca romiplostima, posebno monomerski lanac romiplostima, izložen je u SEQ ID NO: 1:

[0022] Poželjno, peptidi su fuzionisani na C-terminusu humanog IgG1-Fc.

[0023] Dužina peptida fuzionisanog za monomerni Fc lanac može biti u opsegu od 15 do 100 aminokiselina, poželjno od 25 do 70 aminokiselina, najpoželjnije od 30 do 50 aminokiselina.

[0024] Specifična izvođenja se odnose na postupak za prečišćavanje Fc-peptidnog fuzionog proteina nakon njegove ekspresije u inkluzionim telima mikroorganizama, njegovog rastvaranja i ponovnog uvijanja, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake po sledećem redosledu:

a) izvođenje hromatografije za hvatanje sa proteinom A, gde je Fc-peptidni fuzioni protein eluiran sa opadajućim gradijentom pH;

b) izvođenje multimodalne hromatografije, gde je Fc-peptidni fuzioni protein eluiran sa opadajućim gradijentom pH iz pozitivno naelektrisanog medijuma za multimodalnu hromatografiju;

c) izvođenje katjonsko-izmenjivačke hromatografije; gde je Fc-peptidni fuzioni protein eluiran iz jakog katjonsko-izmenjivačkog medijuma, poželjno sa naelektrisanim grupama ‑R-SO3- vezanim sa hidrofilnim polimernim matriksom;

d) izvođenje ultrafiltracije/dijafiltracije.

[0025] Elucija proteina A sa opadajućim gradijentom pH pruža mogućnost za selektivno sakupljanje čvrsto vezanog Fc-peptidnog fuzionog proteina i time dovodi do redukcije varijanti koje imaju svojstva manje čvrstog vezivanja. Iznenađujuće, upotrebljavanjem režima hromatografije sa opadajućim gradijentom pH, dimeri Fc-peptidnih fuzionih proteina separišu se od većine monomera Fc-peptidnih fuzionih proteina.

[0026] Alternativno, umesto gradijenta pH, može se upotrebljavati postepeno ispiranje proteina A puferima sa sniženom pH. pH pufera za ispiranje mora se izabrati na optimalan način da bi se eluirali monomeri dok intaktni dimeri ostaju vezani.

[0027] Mora se pomenuti da uvođenje koraka hvatanja sa proteinom A dovodi do kontaminacije Fcpeptidnog fuzionog proteina izluženim ligandom, tj. proteinom A. Biranjem robusnije smole sa rekombinantnim proteinom A, kao što je MabSelect SuRe, izluživanje je prilično nisko, tj.10–15 ppm. Ipak, naredne hromatografije moraju da uklone izluženi protein A. Izabrani tip i režim srednje multimodalne hromatografije iz koraka b) i katjonsko-izmenjivačke hromatografije iz koraka c) dovode do efektivnog smanjenja izluženog proteina A do nivoa koji se ne mogu detektovati (< 0.5 ppm).

[0028] Postupak obezbeđuje uzorke sa odličnom visokom relativnom čistoćom. Relativna čistoća nakon elucije iz smole za hvatanje iz koraka a) može biti u opsegu od 75 do 95%, poželjno 80–95%, kao što je 81 do 94% definisano kao procenat glavnog maksimuma u obrnutoj fazi ultra-visokoperformansne tečne hromatografije (RP-UPLC – ultra-high-performance chromatography). Relativna čistoća nakon elucije iz multimodalne smole iz koraka b) može biti 90% ili više, poželjno 93% ili više, poželjnije 95% ili više, kao što je 95% do 96%, definisano kao procenat glavnog maksimuma u RP-UPLC. Relativna čistoća nakon elucije iz katjonsko-izmenjivačke hromatografije iz koraka c) može biti 95% ili više, poželjno 96% ili više, poželjnije od 97% ili više, definisano kao procenat glavnog maksimuma u RP-UPLC. Relativna čistoća je definisana kao procenat glavnog maksimuma u RP-UPLC.

[0029] Postupak RP-HPLC je primenjen da bi se odredila čistoća uzorka i da bi se kvantifikovale nečistoće povezane sa proizvodom. Tehnika RP-UPLC se zasniva na separaciji molekulā prema njihovoj polarnosti. Separacija je izvedena na koloni C-4 sa gradijentom acetonitril/voda. Različiti molekuli eluiraju u različitim vremenima zadržavanja usled njihove različite hidrofobnosti. Detektovanje se zasnivalo na UV apsorpciji.

Oblasti pojedinačnih maksimuma koje predstavljaju nečistoće povezane sa proizvodom i Fc-peptidni fuzioni protein određene su integracijom i predstavljene kao procenat ukupne oblasti maksimuma. Kvantifikacija glavnog maksimuma zasniva se na oblasti maksimuma u odnosu na spolja izmereni standard.

[0030] U specifičnim izvođenjima, ultrafiltracija/dijafiltracija iz koraka d) dovodi do formulisane farmaceutske kompozicije ili pripremne farmaceutske kompozicije.

[0031] U jednom poželjnom izvođenju, formulisana farmaceutska kompozicija ili pripremna farmaceutska kompozicija obuhvata prečišćeni Fc-peptidni fuzioni protein, vodu, pufer i najmanje jedno dalje jedinjenje izabrano od detergenta, stabilizatora, soli, šećera i poliola.

[0032] U najpoželjnijem izvođenju, formulisana pripremna farmaceutska kompozicija puni se u staklene fiole, liofilizuje i zaptiva. Na taj način se dobija finalna farmaceutska kompozicija.

[0033] Tako se dalji aspekti pronalaska odnose na postupak proizvodnje Fc-peptidnog fuzionog proteina u mikroorganizmima, gde je Fc-peptidni fuzioni protein prisutan u inkluzionim telima;

1) Ekspresija Fc-peptidnog fuzionog proteina u mikroorganizmima, gde je Fc-peptidni fuzioni protein prisutan u inkluzionim telima;

2) Liza mikroorganizama;

3) Sedimentacija inkluzionih tela;

4) Rastvaranje inkluzionih tela;

5) Ponovno uvijanje Fc-peptidnog fuzionog proteina prisutnog u inkluzionim telima;

6) Adaptiranje rastvora koji sadrži ponovo uvijeni Fc-peptidni fuzioni protein;

7) Prečišćavanje Fc-peptidnog fuzionog proteina

a) izvođenje afinitetne hromatografije za hvatanje;

b) izvođenje multimodalne hromatografije;

c) izvođenje katjonsko-izmenjivačke hromatografije; i

d) izvođenje ultrafiltracije/dijafiltracije;

i opciono formulisanje prečišćenog peptida u farmaceutsku kompoziciju;

SAŽET OPIS SLIKA NACRTA

[0034]

Slika 1: Struktura peptitela.

Šematska struktura primera Fc-peptidnog fuzionog proteina (peptitela). Primer je romiplostim, prototip peptitela. Primer peptitela je homodimer sastavljen od dva identična lanca od kojih se svaki sastoji od dva tandemska ponavljanja receptor-vezujućih sekvenci koje su separisane linkerom i fuzionisane sa karboksi terminusom IgG1 Fc pomoću drugog linkera. Homodimerni molekul sadrži dvanaest cisteina, koji formiraju dva međulanca i četiri međulančana disulfidna mosta.

Slika 2: Šema nishodnog procesa Fc-peptidnog fuzionog proteina eksprimovanog u inkluzionim telima bakterija.

Opšta šema procesa koja uključuje lizu bakterija, rastvaranje Fc-peptidnog fuzionog proteina iz inkluzionih tela, ponovno uvijanje u željenu strukturnu konformaciju, prečišćavanje Fc-peptidnog fuzionog proteina nizom od tri hromatografije i finalni korak ultrafiltracije/dijafiltracije.

Slika 3: Šema prečišćavanja ponovno uvijenog Fc-peptidnog fuzionog proteina izvedenog iz inkluzionih tela bakterija.

Detaljnija šema procesa koja počinje sa ponovo uvijenim Fc-peptidnim fuzionim proteinom. Nakon afinitetne hromatografije za hvatanje sledi srednja multimodalna hromatografija i finalna katjonskoizmenjivačka hromatografija. Sve tri hromatografije izvode se u režimu vezivanje-eluiranje i Fcpeptidni fuzioni protein se eluira promenom pH u sve tri hromatografije. Pre srednje multimodalne hromatografije, korak kondicioniranja dovodi do pH-indukovane precipitacije. Finalni korak ultrafiltracije/dijafiltracije dovodi do formulisane farmaceutske kompozicije ili pripremne farmaceutske kompozicije.

Slika 4: Šema prečišćavanja ponovo uvijenog Fc-peptidnog fuzionog proteina, izabranog hromatografskog medijuma i pripreme finalne farmaceutske kompozicije.

Slika prikazuje finalno izabrani i poželjni hromatografski medijum (Tabela 1) i dodatno obuhvata finalne korake koji dovode do liofilizovane faramaceutske kompozicije. Srednja pripremna farmaceutska kompozicija, označena kao supstanca leka, filtrira se i liofilizuje dovodeći do finalne farmaceutske kompozicije, označene kao proizvod leka.

Slika 5: Relativna čistoća romiplostima tokom celog procesa prečišćavanja.

Relativna čistoća koja je definisana kao glavni maksimum (MP – main peak) u RP-UPLC tri nezavisna ciklusa prečišćavanja, koja se znatno povećava tokom celog procesa prečišćavanja, počevši od koraka ponovnog uvijanja, za kojim slede korak hvatanja, srednji korak i finalni korak finog prečišćavanja.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0035] Predmetni pronalazak obezbeđuje nove postupke za prečišćavanje ponovo uvijenih Fc-peptidnih fuzionih proteina. Posebno, obezbeđuje nove postupke za dobijanje aktivnih Fc-peptidnih fuzionih proteina visoke čistoće, što omogućava industrijsku proizvodnju farmaceutske kompozicije za ljudsku upotrebu.

[0036] Tako se prvi aspekat pronalaska odnosi na postupak za prečišćavanje ponovo uvijenog Fc-peptidnog fuzionog proteina iz kompozicije koja obuhvata Fc-peptidni fuzioni protein i najmanje jednu nečistoću, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake po sledećem redosledu:

a) izvođenje afinitetne hromatografije za hvatanje u režimu vezivanje-eluiranje;

b) izvođenje multimodalne hromatografije u režimu vezivanje-eluiranje;

c) izvođenje katjonsko-izmenjivačke hromatografije u režimu vezivanje-eluiranje; i

d) izvođenje ultrafiltracije/dijafiltracije;

gde se hromatografije a), b) i c) izvode opciono sa jednim ili više koraka ispiranja.

[0037] Kako se upotrebljava ovde, termin „ponovo uvijeni Fc-peptidni fuzioni protein“ odnosi se na polipeptid koji obuhvata peptid, fuzionisan pomoću genetičko-tehnoloških postupaka sa Fc delom imunoglobulina, koji je rekombinantno eksprimovan u mikroorganizmima u nerastvorljivom obliku ili u obliku ograničene rastvorljivosti, rastvoren i ponovo uvijen pomoću redoks tretiranja u biološki aktivnu konformaciju. Termin „ponovo uvijeni Fc-peptidni fuzioni protein“ odnosi se na pravilno uvijeni Fc-peptidni fuzioni protein. „Ponovo uvijeni Fc-peptidni fuzioni protein“ ne eksprimuje se u eukariotskim ćelijama, posebno se ne eksprimuje u ćelijama sisara. Tipično, „ponovo uvijeni Fc-peptidni fuzioni protein“ je neglikozilovani Fc-fuzioni peptid. On sadrži dve međumolekulske i četiri međumolekulske pravilno formirane disulfidne veze. Određenije, odnosi se na Fc-peptidni fuzioni protein koji sadrži sulfidnu konfiguraciju koja se sastoji od sledećih 6 disulfidnih veza: disulfidne veze koje povezuju cistein C206 i cistein C148 u svakom monomeru, disulfidne veze koje povezuju cistein C102 i cistein C42 u svakom monomeru, disulfidnu vezu koja povezuje dva monomerna lanca jedan sa drugim, svaki na njihovom cisteinu C10, i disulfidnu vezu koja povezuje dva monomerna lanca jedan sa drugim, svaki na njihovom cisteinu C7.

[0038] „Fc-peptidna fuzija“ znači gensku fuziju DNK koja enkodira ciljani peptid sa DNK koja enkodira Fcdeo, tj. CH2/CH3 domene, imunoglobulina, eksprimujući jedan pojedinačni polipeptid.

[0039] Termin „Fc“ se odnosi na Fc domen, fragment koji može kristalisati, antitela. Poželjno, termin „Fc“ se odnosi na Fc fragment imunoglobulina IgG1.

[0040] Termin „peptid“ se odnosi na aminokiselinsku sekvencu koja ima manje od 500 aminokiselina, poželjno manje od 200 aminokiselina, kao što je manje od 100 aminokiselina, manje od 50 aminokiselina, na primer 41 aminokiselinu.

[0041] U jednom specifičnom izvođenju, peptid obuhvata najmanje jednu vezujuću sekvencu. Poželjno, peptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je agonist receptora, poželjno mimetik agonista receptora koji se javlja u prirodi, poželjnije, mimetik trombopoietina, tj. koji ima TPO-vezujuću sekvencu. Posebno, peptid obuhvata tandemsko ponavljanje TPO-vezujuće sekvence, opciono separisano linkerom. U jednom specifičnom izvođenju, peptid obuhvata sekvencu TPO-vezujuća sekvenca – linker – TPO-vezujuća sekvenca – linker, gde je C-terminalni linker fuzionisan sa Fc delom Fc-peptidnog fuzionog proteina.

[0042] Termini „Fc-peptidni fuzioni protein“, „Fc-fuzioni peptid“, „peptid-Fc fuzioni protein“ i „peptitelo“ ovde se upotrebljavaju naizmenično i odnose se na rekombinantne polipeptide konstruisane fuzionisanjem gena koji kodira biološki aktivni peptid u okviru sa genom koji kodira Fc domen IgG što dovodi do peptidlgG(Fc) himere sa strukturom nalik antitelu. Posebno se Fc domen koji uključuje peptid dimerizuje, što dovodi do homodimerske strukture Fc-peptidnog fuzionog proteina. Termin „Fc-peptidni fuzioni protein“ ne uključuje proteine pune dužine fuzionisane sa Fc domenom.

[0043] Kako se upotrebljava ovde, termin „redoks tretiranje“ odnosi se na proces ponovnog uvijanja odvijenog ili delimično odvijenog monomernog Fc-peptidnog fuzionog proteina. Prisustvo redoks sistema kao što je glutation red/oks (GSH/GSSG) ili cistein/cistin omogućava tiol-disulfidnu izmenu tokom koraka ponovnog uvijanja i promoviše formiranje disulfida. U slučaju Fc-peptidnih fuzionih proteina, redoks tretiranje bi trebalo da dovede do dimerizacije primarno eksprimovanog monomera (videti stanje tehnike pronalaska).

[0044] Dalja tretiranja ponovo uvijenog Fc-peptidnog fuzionog proteina pre prečišćavanja putem hromatografskih koraka mogu biti centrifugiranje, ultrafiltracija, dijafiltracija, dubinska filtracija, mikrofiltracija, razblaživanje, ili podešavanje pH.

[0045] Kako se upotrebljava ovde, termin „pripremna farmaceutska kompozicija“ odnosi se na farmaceutsku kompoziciju koja se podvrgava daljim adaptiranjima da bi se postigla faza finalnog proizvoda. Te adaptacije mogu obuhvatati filtraciju, razblaživanje ili koncentrovanje, podešavanje pH i/ili osmolarnost, i liofilizaciju. U jednom poželjnom izvođenju, pripremna farmaceutska kompozicija je formulisani glavni deo leka koji se skladišti kao smrznut ili tečan, što zahteva samo filtraciju i alikvotiranje u finalne posude, kao što su fiole, špricevi, ampule ili karpule. U sledećem poželjnom izvođenju, pripremna farmaceutska kompozicija je samo sterilno filtrirana, alikvotirana u finalne posude, tj. staklene fiole, zatim liofilizovana i zaptivena.

[0046] Termin „nečistoća“ se odnosi na bilo koji materijal koji je različit od Fc-peptidnog fuzionog proteina od interesa. Termin „nečistoća“ uključuje „nečistoće povezane sa procesom“ i „nečistoće povezane sa proizvodom“. „Nečistoće povezane sa procesom“ koje se izvode iz bilo ushodnih ili nishodnih delova procesa proizvodnje obuhvataju proteine ćelije domaćina (HCP), DNK ćelije domaćina (HCDNA), endotoksine, viruse, lipide, RNK, različite izluževine iz procesnih materijala, kao što su izluženi protein A, komponente medijuma kulture, ostatke ćelija i njihove agregate i fragmente. „Nečistoće povezane sa proizvodom“ obuhvataju sulfidne varijante Fc-peptidnog fuzionog proteina, npr. redukovane forme, slobodni cistein, i pogrešna uparivanja disulfida monomernih i dimernih varijanti, povrh toga obuhvataju naelektrisane varijante, agregate, oksidovane vrste, deamidovane vrste, karbamilovane vrste, C- i N-terminalno skaraćene vrste, monomere, i druge neželjene proizvodne varijante Fc-peptidnog fuzionog proteina. Termin „nečistoće povezane sa proizvodom“ posebno se odnosi na sulfidne varijante Fcpeptidnog fuzionog proteina.

[0047] Termin „sulfidna varijanta“ se posebno odnosi na Fc-peptidni fuzioni protein koji sadrži sulfidnu konfiguraciju koja se razlikuje u jednoj ili nekoliko disulfidnih veza grupe od 6 disulfidnih veza koja se sastoji od disulfidnih veza koje povezuju cistein C206 i cistein C42 u svakom monomeru, disulfidnih veza koje povezuju dva monomerna lanca svaki na njihovom cisteinu C10 i disulfidnih veza koje povezuju dva monomerna lanca svaki na njihovom cisteinu C7.

[0048] Termin „pogrešno uparen“ se odnosi na nepravilno uparene disulfidne veze. Termin se odnosi na modifikacije disulfidnih veza u međulancu i međulancu Fc-peptidnog fuzionog proteina, posebno se odnosi na modifikacije disulfidne veze u monomernim i dimernim varijantama Fc-peptidnog fuzionog proteina. Termini „slobodni cistein“, „otvoreni disulfid“, „otvorena disulfidna veza“ ili „otvoreni disulfidni most“ odnose se na nepravilnu oksidaciju cisteina. Termin „disulfidna veza“ se odnosi na funkconalnu grupu sa strukturom R-S-S-R i veza se naziva disulfidni most, koji je obično izveden pomoću dve tiolne grupe u dva cisteinska ostatka. U jednom specifičnom izvođenju, termin „nečistoće povezane sa proizvodom“ odnosi se na monomere i dimere Fc-peptidnog fuzionog proteina sa otvorenim disulfidnim vezama.

[0049] Termin „precipitacija“ se odnosi na nečistoće koje nisu rastvorljive ili imaju ograničenu rastvorljivost, i/ili su u nerastvorljivom stanju. Precipitacije mogu dovesti do zamućenih rastvora uzoraka.

[0050] Kako se upotrebljava ovde, termin „hromatografski medijumi“ ili „hromatografski medijum“ treba razumeti kao hromatografski materijal ili medijum u obliku kuglica, pločica, kristala, monolita, mebrana, vlakana, mreža vlakana ili bilo koje čvrste faze. „Medijum“ nosi funkcionalne grupe na koje se poziva kao na „ligande“ vezane, direktno ili putem spejsera, za glavnu strukturu, na koju se poziva kao na „matriks“. Izuzetak su smole za gel hromatografiju za hromatografiju sa isključivanjem veličine čestica koja je tipično bez ikakvog vezanog liganda. Termin „medijumi“ ne ograničava postupke prema pronalasku samo na hromatografiju na koloni koja koristi smole za hromatografiju već takođe uključuje druge tipove hromatografije, na primer membransku hromatografiju, koja koristi membranske adsorbense. Posebno, u jonsko-izmenjivačkoj hromatografiji, smola za jonsko-izmenjivačku hromatografiju ili membranski adsorbens za jonsko-izmenjivačku hromatografiju oba su obuhvaćeni pronalaskom.

[0051] „Smola“ znači bilo koji hromatografski materijal ili medijum u obliku kuglica koje obuhvataju matriks sa vezanom funkcionalnom grupom (ligandom) koja može stupiti u inerakciju sa proteinom ili najmanje jednim zagađivačem. Izuzetak su smole za gel hromatografiju za hromatografiju sa isključivanjem veličine čestica koje su tipično bez ikakvog vezanog liganda. Smole se mogu isporučivati kao kuglice različitih veličina i napunjene u kolone. Alternativno, mogu se koristiti unapred napunjene kolone.

[0052] Pod terminom „matriks“ ili „čvrsta faza“ misli se na ne-vodeni, nerastvorljivi matriks za koji ligand može prianjati. Ovde je matriks od interesa generalno onaj koji obuhvata staklo, keramiku, silicijum dioksid, celulozu, agarozu, metakrilat polimer ili polistiren.

[0053] Pod „ligandom“ se misli na bilo koju funkcionalnu grupu koja stupa u interakciju sa Fc-peptidnim fuzionim proteinom ili sa najmanje jednim zagađivačem i koja je kovalentno vezana za „matriks“.

[0054] Termin „režim vezivanja“ ili „režim vezivanja i eluiranja“ odnosi se na uslove hromatografije u kojima se uzorak koji sadrži Fc-peptidni fuzioni protein koji treba prečistiti nanosi na hromatografski medijum, gde se Fc-peptidni fuzioni protein vezuje za hromatografski medijum. Tako se Fc-peptidni fuzioni protein zadržava na hromatografskom medijumu, dok nečistoće u uzorku mogu biti prisutne u nevezujućoj frakciji, koja se takođe naziva protočna frakcija. Kada se korak hromatografije sprovodi u vezujućem režimu, jedan ili više koraka ispiranja mogu se izvoditi nakon vezivanja Fc-peptidnog fuzionog proteina za hromatografski medijum i pre eluiranja Fc-peptidnog fuzionog proteina iz medijuma. Da bi se dobio Fc-peptidni fuzioni protein, Fc-peptidni fuzioni protein se zatim eluira i dobija u eluatu, koji se zatim može dalje prečišćavati u daljem hromatografskom koraku, po želji. Elucija Fc-peptidnog fuzionog proteina može se izvoditi pomoću selektivnih uslova koji dupuštaju da zagađivači ostanu vezani za medijum, dok se Fc-peptidni fuzioni protein eluira.

[0055] Izvođenje koraka hromatografije u „vezujućem režimu“ ne znači nužno da se vezuje 100% Fcpeptidnog fuzionog proteina. U kontekstu predmetnog pronalaska, „vezan za hromatografsku smolu“ ili „vezan za hromatografski medijum“ znači da se najmanje 50% Fc-peptidnog fuzionog proteina vezuje, poželjno se najmanje 75% Fc-peptidnog fuzionog proteina vezuje, poželjnije se najmanje 85% Fc-peptidnog fuzionog proteina vezuje, a najpoželjnije se više od 95% Fc-peptidnog fuzionog proteina vezuje za smolu ili medijum.

[0056] U kontekstu predmetnog pronalaska, razume se da se korak afinitetne hromatografije za hvatanje, korak srednje multimodalne hromatografije i korak katjonsko-izmenjivačke hromatografije za fino prečišćavanje svi izvode u režimu vezivanja, gde se korak hvatanja smatra korakom prve hromatografije, koji se izvodi u režimu vezivanja. Alternativno, korak finalne katjonsko-izmenjivačke hromatografije za fino prečišćavanje prema pronalasku može se izvoditi dva puta u nizu, gde se dve hromatografije izvode sa istim hromatografskim medijumom u režimu vezivanje-eluiranje, i gde se dve hromatografije izvode pod različitim uslovima, opciono sa jednim ili više koraka ispiranja.

[0057] U jednom poželjnom izvođenju, vezani Fc-peptidni fuzioni proteini iz prve katjonsko-izmenjivačke hromatografije eluiraju se povećanjem pH vrednosti, a vezani Fc-peptidni fuzioni proteini iz druge katjonsko-izmenjivačke hromatografije eluiraju se povećanjem jonske jačine. Dalje se razume da je druga katjonsko-izmenjivačka hromatografija opciona, a najpoželjniji je niz od samo tri hromatografije, tj. afinitetna hromatografija, multimodalna hromatografija i katjonsko-izmenjivačka hromatografija dovešće do dovoljne čistoće u većini slučajeva. U najpoželjnijem izvođenju, elucija vezanog Fc-peptidnog fuzionog proteina izvodi se pomoću gradijenta pH ili pH koraka u sve tri hromatografije.

[0058] Termin „režim protoka“ odnosi se na hromatografske uslove u kojima se uzorak koji sadrži Fcpeptidni fuzioni protein od interesa nanosi na hromatografsku smolu ili medijum, gde se Fc-peptidni fuzioni protein ne vezuje za hromatografsku smolu, već je uglavnom prisutan u frakciji koja nije vezana za smolu ili medijum i stoga je sadržana u protočnoj frakciji. Razvijene hromatografije prema predmetnom pronalasku ne upotrebljavaju režim protoka. Međutim, postupci prema predmetnom pronalasku mogu biti dopunjeni dodatnim srednjim ili hromatografijama za fino prečišćavanje u režimu protoka. Nečistoće se mogu vezivati za smolu ili medijum u tom režimu.

[0059] Kao dodatni srednji koraci ili koraci finog prečišćavanja, mogu se koristiti i drugi tipovi hromatografija. Na primer, anjonsko-izmenjivačka hromatografija na koloni i anjonsko-izmenjivačka membranska hromatografija mogu se koristiti kao srednji ili korak finog prečišćavanja, najpoželjnije u režimu protoka. Druga mogućnost je primenjivanje hidroksiapatitne hromatografije, posebno hromatografije sa hidroksiapatitnom keramikom u režimu vezivanja.

[0060] „Korak ispiranja“ ili „ispirajući korak“ je korak koji se izvodi u hromatografiji u režimu vezivanja, nakon što je Fc-peptidni fuzioni protein nanet na hromatografsku kolonu, ali pre nego što je Fc-peptidni fuzioni protein eluiran iz kolone. Korak ispiranja dodatno uklanja zagađivače koji su manje čvrsto ili nespecifično vezani za matriks, za Fc-peptidni fuzioni protein, i/ili za ligand, bez znatnijeg eluiranja Fcpeptidnog fuzionog proteina iz smole. U koraku ispiranja, smola se ispira željenim puferom za ispiranje (npr. pufer za ispiranje prolazi kroz hromatografsku kolonu sve dok se UV apsorpcija merena u izlazu kolone ne vrati do osnovne vrednosti). Tokom korakā ispiranja, protein od interesa ostaje vezan za hromatografski medijum.

[0061] Termin „elucija“ se razume kao proces, koji desorbuje protein od interesa iz hromatografskog medijuma menjanjem uslova rastvora tako da se puferske komponente takmiče sa proteinom od interesa za mesto liganda na hromatografskoj smoli. Drugi režim elucije javlja se u afinitetnoj hromatografiji, na primer upotrebljavajuči protein A. U tom slučaju, pufer za eluciju može menjati konformaciju liganda ili Fcpeptidnog fuzionog proteina, čime se slabi vezivanje. Fc-peptidni fuzioni protein može se eluirati iz jonskoizmenjivačkih smola menjanjem jonske jačine pufera koji okružuje jonsko-izmenjivački materijal tako da se joni pufera u mobilnoj fazi takmiče sa molekulom za naelektrisana jonska mesta jonsko-izmenjivačke smole. Alternativno, promena u pH utiče na amfoterni protein, a povećanje pH iznad pl proteina od tada sprečava njegovo vezivanje za katjonsko-izmenjivačku smolu i protein eluira. Isti efekat se javlja na smoli za anjonskoizmenjivačku hromatografiju kada se pH smanjuje ispod pl proteina. Kao što se razume ovde, termin „elucija“ obuhvata izokratsku eluciju, eluciju u jednom koraku i gradijentnu eluciju, sa prethodnim koracima ispiranja ili bez njih. Elucija Fc-peptidnog fuzionog proteina može se sprovoditi povećanjem jonske jačine ili provodljivosti u mobilnoj fazi, na šta se utiče povećavanjem koncentracije soli u puferskom rastvoru. Alternativno, povećanje ili smanjivanje u pH vrednosti može biti pogodno. Mogu se koristiti diskontinuirani stepenasti gradijenti, linearni gradijenti, nelinearni gradijenti ili pogodna kombinacija takvih gradijenata.

[0062] Puferi pogodni za ispiranje i za eluciju mogu se izabrati od acetata, citrata, sukcinata, maleata, malonata, Tris-HCl, Tris-fosforne kiseline, Tris-acetata, Tris-glicina, fosfata, sukcinata, MES, MOPS, PIPES, PHEPES, etanolamina, bistrisa, blicina, histidina i drugih pogodnih pufera sa dodatkom soli, kao što su fosfati, sulfati ili hloridi, kao što su NaCl ili KCl. Jonska jačina i koncentracija soli, posredstvom kojih se postiže elucija, zavisne su od pH vrednosti puferskog rastvora i pl Fc-peptidnog fuzionog proteina. Pufer za ispiranje može dalje obuhvatati detergent (npr. polisorbat), rastvarač (npr. heksilen glikol, izopropanol, ili etanol), ili polimer (npr. polietilen glikol). Nadalje, pufer za ispiranje može uključivati haotropne reagense (npr. ureu ili arginin) i/ili inhbitore proteaze (npr. EDTA).

[0063] Kako se upotrebljava ovde, termin „pufer“ odnosi se na rastvor koji se odupire promenama u pH delovanjem komponenata kiselinsko-baznog konjugata.

[0064] Postupak prema pronalasku može se upotrebljavati za prečišćavanje Fc-peptidnog fuzionog proteina u malom i velikom obimu. Poželjno, postupak se sprovodi u velikom obimu.

[0065] „Mali obim“, takođe označen kao „laboratorijski obim“, odnosi se na prečišćavanje uzoraka koji sadrže manje od 5 g Fc-peptidnog fuzionog proteina, manje od 2,5 g Fc-peptidnog fuzionog proteina, ili manje od 1 g Fc-peptidnog fuzionog proteina. „Mali obim“ se takođe odnosi na procese prečišćavanja u kojima protein eluiran iz kolone koraka hvatanja iznosi manje od 5 g Fc-peptidnog fuzionog proteina, manje od 2,5 g Fc-peptidnog fuzionog proteina, ili manje od 1 g Fc-peptidnog fuzionog proteina.

[0066] „Veliki obim“, koji se takođe naziva „proizvodni obim“ ili „obim proizvodnje“ ili „komercijalni obim“, odnosi se na prečišćavanje uzoraka koji sadrže više od 5 g Fc-peptidnog fuzionog proteina, više od 20 g Fcpeptidnog fuzionog proteina, više od 50 g Fc-peptidnog fuzionog proteina ili više od 100 g Fc-peptidnog fuzionog proteina. „Veliki obim“ se takođe odnosi na procese prečišćavanja u kojima protein eluiran iz kolone koraka hvatanja iznosi više od 5 g Fc-peptidnog fuzionog proteina, više od 20 g Fc-peptidnog fuzionog proteina, više od 50 g Fc-peptidnog fuzionog proteina ili više od 100 g Fc-peptidnog fuzionog proteina.

[0067] Hromatografije iz koraka a), b) i c) mogu se eluirati sa gradijentom pH ili pH korakom. Poželjno, gradijent pH je linearni gradijent pH.

Ekspresija i ponovno uvijanje

[0068] Predmetni pronalazak ne zavisi od specifičnih postupaka za ekspresiju i ponovno uvijanje Fcpeptidnih fuzionih proteina. Međutim, mogle bi se primeniti sledeće opšte karakteristike, koje nisu obavezne:

- Ekspresija u mikroorganizmima, poželjno u bakterijama, poželjnije u E. coli

- Ekspresija u nerastvorljivom obliku ili oblicima ograničene rastvorljivosti, poželjno u mikroorganizmima, poželjnije u inkluzionim telima

- Prikupljanje mikroorganizama, poželjno centrifugiranjem

- Liza mikroorganizama, poželjno mehaničkim sredstvima

- Sedimentacija nerastvorljivog materijala, poželjno izolovanje i ispiranje inkluzionih tela

- Rastvaranje pogodnim postupcima, poželjno hemijskim agensima, najpoželjnije haotropnim agensima pod reduktivnim uslovima

- Inkubacija za ponovno uvijanje, poželjno pri visokoj pH i sa redoks jedinjenjima, poželjnije, redoks jedinjenja su sulfhidrilni redoks parovi

- Adaptiranje rastvora za ponovno uvijanje pre afinitetne hromatografije za hvatanje, poželjno filtracijom, podešavanjem pH i razblaženjem

[0069] U eksperimentima koji su doveli do predmetnog pronalaska, uočeno je da su rastvori za ponovno uvijanje Fc-peptidnih fuzionih proteina sadržali nekoliko različitih proizvodnih varijanti zajedno sa Fcpeptidnim fuzionim proteinom od interesa koji je trebalo prečistiti, koji se vezuje za afinitetnu smolu za hvatanje. Posebno, različite sulfidne varijante Fc-peptidnog fuzionog proteina ispostavile su se kao nečistoće koje je najteže smanjiti tokom procesa prečišćavanja, kao i u strukturnoj analizi. Predmetni pronalazak obezbeđuje rešenje kako da se redukuju te nečistoće u finalnom proizvodu.

[0070] Poželjno se pH jedinjenja koje sadrži Fc-peptidni fuzioni protein i najmanje jednu nečistoću podešava do pH u opsegu od 4 do 6, poželjno 4,5 do 5,5, poželjnije 5.

Korak hromatografije za hvatanje: afinitetna hromatografija

[0071] Termin „korak hvatanja“ se razume kao korak prve hromatografije koja se sprovodi u režimu vezivanja. Korak hvatanja za prečišćavanje Fc-peptidnog fuzionog proteina ili imunoglobulina obično se sprovodi kao korak afinitetne hromatografije. Protein A ili njegovi derivati ili analozi uglavnom se upotrebljavaju kao afinitetno sredstvo za hvatanje. Prema predmetnom pronalasku, afinitetna hromatografija uspešno je upotrebljavana za hvatanje Fc-peptidnih fuzionih proteina. Termin „afinitetna hromatografija“ za ovaj pronalazak znači postupak selektivnog vezivanja Fc-dela iz rastvora za ponovno uvijanje na osnovu visoko specifične interakcije između liganda i Fc-dela.

[0072] Kako se upotrebljava ovde, termin „afinitetna hromatografija sa proteinom A“ odnosi se na afinitetnu hromatografiju koja kao ligande koristi prirodne ili rekombinantne proteine mikrobnog porekla (npr. Staphylococcus aureus, Streptococcus, Peptostreptococcus magnus) ili varijante izvedene od njih, ili sintetičke peptide koji mogu biti mikrobnog porekla sa sposobnošću da se vezuju za Fc delove imunoglobulinā. Primeri proteina ili peptida koji se vezuje za Fc imunoglobulina jeste protein A. Ligandi mogu obuhvatati jedan ili više od E, D, A, B i C domena proteina A. Poželjnije, ligandi obuhvataju domen B proteina A ili konstruisani protein Z. Primer smole koja kao ligand koristi 14 kDa peptid rekombinantno proizveden pomoću Saccharomyces cerevisiae jeste IgSelect (GE Healthcare). Taj ligand je specifično projektovan za visok afinitet za sve potklase humanog IgG-Fc. Upotrebom koraka afinitetne hromatografije sa proteinom A kao koraka hvatanja nakon ponovnog uvijanja Fc-peptidnih fuzionih proteina, postupak koristi prednost znatne specifičnosti vezivanja afinitetne hromatografije sa proteinom A u prečišćavanju imunoglobulinā.

[0073] U jednom poželjnom izvođenju, smola za hromatografiju sa proteinom A, koja se upotrebljava za korak hvatanja, obuhvata alkalno tolerantan derivat proteina A kao ligand, vezan za visoko umreženu agarozu. U jednom poželjnijem izvođenju, alkalno tolerantan derivat proteina A je alkalno stabilizovana tetramerna varijanta domena B proteina A.

[0074] Kako bi se smola za afinitetnu hromatografiju sa proteinom A učinila otpornijom na grube uslove čišćenja i kako bi se obezbedila zaštita protiv efekata međuserijske unakrsne kontaminacije, danas je uobičajeno upotrebljavati afinitetne smole sa proteinom A, koje nose ligande specijalno konstruisane da osiguraju alkalnu toleranciju, visok kapacitet vezivanja i malo oslobađanje ligandā. Veliki nedostatak tih poboljšanih smola je, međutim, to što su one znatno skuplje od konvencionalnih smola sa proteinom A. Važna prednost postupka prema predmetnom pronalasku je to što se mogu upotrebljavati i konvencionalne smole sa proteinom A, kao i noviji proizvodi smole sa proteinom A nove generacije.

[0075] Primeri uobičajenih smola sa proteinom A koje se mogu upotrebljavati za svrhu pronalaska mogu uključivati, ali nisu ograničeni na njih, Unosphere SUPrA (Bio-Rad), Protein A Ceramic HyperD F (Pall Corporation), Poros MabCapture A (Applied Biosystems), ProSep HC, ProSep Ultra i ProSep Ultra Plus (EMD Millipore), Protein A Sepharose FF, rProtein A Sepharose FF, rmp Protein A Sepharose FF, MabSelect, MabSelect SuRe, MabSelect SuRe LX, MabSelect Xtra, MabSelect PrismA (GE Healthcare) i Toyopearl rProtein A (Tosoh Bioscience).

[0076] Kada se upotrebljava ovde, termin „protein A“ obuhvata protein A regenerisan iz njegovog nativnog izvora, protein A proizveden sintetički ili biosintetički (npr. sintezom peptida ili rekombinantnim tehnikama), i njegove varijante koje zadržavaju sposobnost da vezuju proteine koji imaju CH2/CH3 i/ili Fc regione. Poželjno, mogu se upotrebljavati smole sa visokim kapacitetom vezivanja i/ili alkalnom stabilnošću. Na primer, može se upotrebljavati protein A, derivat proteina A, ili alkalno stabilizovani afinitetni medijum izveden iz proteina A. Poželjno, mogu se upotrebljavati alkalno stabilizovani ligandi izvedeni iz proteina A (E. coli). Alkalno stabilizovni ligand izveden iz proteina A može se kuplovati sa visoko umreženim agaroznim matriksom, poželjno imobilisan hemijski stabilnom tio-etarskom vezom. Jedan primer je MabSelect SuRe kompanije GE Healthcare Life Sciences, koji se može brzo i efikasno očistiti nakon ciklusa sa sve do 0,5 M NaOH. Alkalno stabilizovni ligand iz MabSelect SuRe izveden je iz B domena proteina A i suštinski mu nedostaje VH3 vezujući domen koji daje višu pH elucije. Poželjni proizvod je MabSelect SuRe LX koji ima viši kapacitet vezivanja nego MabSelect SuRe.

[0077] U jednom poželjnom izvođenju, pufer za protein A za ekvilibraciju sadrži barem jedan haotropni agens izbaran iz grupe koja se sastoji od arginina i uree. Najpoželjniji pufer za ekvilibraciju je etanolamin uključujući arginin i ureu. Poželjna početna pH je oko pH 4,5 do 7, poželjnije oko pH 5 do 6, najpoželjnije oko pH 5.

[0078] Jedan ili nekoliko koraka ispiranja između nanosa uzorka na afinitetnu kolonu sa proteinom A i elucije Fc-peptidnog fuzionog proteina iz kolone sa proteinom A mogu se uključiti koristeći specijalni pufer (pufere) za ispiranje. Pufer za ispiranje je pufer koji se upotrebljava za uklanjanje nečistoća iz smole sa proteinom A bez uklanjanja znatnih količina Fc-peptidnog fuzionog proteina od interesa koji je vezan za protein A. Pufer za ispiranje može obuhvatati so i detergent (npr. polisorbat); so i rastvarač (npr. heksilen glikol); so visoke koncentracije (npr. Tris pufer visoke molarnosti); ili so i polimer (npr. polietilen glikol). Nadalje, pufer za ispiranje može uključivati haotropne reagense (npr. ureu ili arginin) i/ili inhibitore proteaze (npr. EDTA). Najzad, pufer za ispiranje može imati nižu pH kao pufer za nanošenje i/ili višu pH kao pufer za eluciju.

[0079] Poželjni pufer za ispiranje za protein A je etanolamin sa argininom i ureom. Poželjna pH je oko pH 4,5 do 7, poželjnije oko pH 5 do 6, najpoželjnije oko pH 5.

[0080] Za eluciju Fc-peptidnog fuzionog proteina od interesa iz kolone sa proteinom A, primenjuje se pufer za eluciju. Poželjno, pufer za eluciju ima nisku pH i time prekida interakcije između proteina A i Fc-peptidnog fuzionog proteina od interesa menjanjem proteinske konformacije. Poželjno, pufer za eluciju sa niskom pH ima pH u opsegu od oko 2 do oko 5, najpoželjnije u opsegu od oko 3 do oko 4. Primeri pufera koji će kontrolisati pH u tom opsegu uključuju fosfat, acetat, citrat, glicin i amonijumske pufere, kao i njihove kombinacije.

[0081] Poželjno, pufer za eluciju u koraku hvatanja, npr. hromatografiji sa proteinom A, sadrži ureu. Koncentracija uree u puferu za eluciju može biti oko 0,1 M ili više, na primer oko 0,3 M ili više, poželjno 0,5 M ili više. U nekim izvođenjima, koncentracija uree u puferu za eluciju je u opsegu od oko 0,1 M do oko 3 M, poželjno u opsegu od 0,3 M do 2 M, poželjnije u opsegu od oko 0,5 M do oko 1M, najpoželjnije koncentracija uree u puferu za eluciju je oko 0,5 M.

[0082] Poželjni puferi su citratni i acetatni puferi. Razmatraju se drugi puferi za eluciju, uključujući pufere sa visokom pH (npr. oni koji imaju pH od 9 ili više) ili puferi koji obuhvataju jedinjenje ili kompoziciju kao što je MgCl2(2 mM) za eluiranje Fc-peptidnog fuzionog proteina od interesa. Pufer može imati koncentraciju citrata (kao što je natrijum-citrat) od 20 mM do 200mM, poželjno 50 mM do 150 mM citrata, najpoželjnije 100mM.

[0083] Poželjno, pufer za protein A za eluciju, za korak elucije, jeste natrijum-citrat sa ureom pri pH 3 do 4.

[0084] Poželjniji postupak elucije proteina A je gradijentna elucija sa opadajućim gradijentom pH. Tipično, gradijent je linearni gradijent. Gradijentna elucija se može izvoditi sa natrijum-citratom sa ureom. Gradijent pH može početi na oko pH 5,5 i može se završti na oko pH 2,5. Gradijent se može generisati mešanjem dva pufera (npr. počinjanje sa 100% pufera A koji ima pH od oko 5,5 i mešanje u njega pufera B koji ima pH od oko 2,5 dok se ne postigne 100% pufera B). Pufer A i pufer B mogu sadržati limunsku kiselinu sa ureom. Elucija sa opadajućim linearnim gradijentom pH može obuhvatati dva ili više, poželjno tri segmenta. Na primer, u segmentu (i) u 1 do 3 zapremine kolone, poželjno u 1 zapremini kolone, procenat pufera B se podiže od 0% do sadržaja u opsegu od oko 20% do 50%, poželjno od oko 30% do oko 40%, na primer 37%, u segmentu (ii) pufer B se dalje podiže u okviru 5 do 20 CV, poželjno 10 do 15 CV, na primer 13,8 CV, do sadržaja u opsegu od oko 60% do oko 95%, poželjno oko 70% do oko 80%, na primer 75%, i u segmentu (iii) pufer B se podiže u okviru 1 do 3 CV, poželjno 1 CV do finalnog sadržaja od oko 90% ili više, poželjno oko 95% ili više, poželjnije oko 100%. U jednom daljem izvođenju, elucija sa opadajućim linearnim gradijentom pH može obuhvatati tri ili više, poželjno četiri segmenta. Na primer, u segmentu (i) pufer B se podiže u okviru 0,01 do 0,5 zapremina kolone, poželjno u okviru 0,1 zapremine kolone, procenat pufera B se podiže od 0% do sadržaja u opsegu od oko 10% do oko 20%, na primer 17%, u segmentu (ii) pufer B se podiže u okviru 1 do 3 zapremine kolone, poželjno u okviru 1 zapremine kolone, procenat pufera B se podiže od 0% do sadržaja u opsegu od oko 20% do oko 50%, poželjno od oko 30% do oko 40%, na primer 37%, u segmentu (iii) pufer B se dalje podiže u okviru 5 do 20 CV, poželjno 10 do 15 CV, na primer 13,8 CV, do sadržaja u opsegu od oko 60% do oko 95%, poželjno oko 70% do oko 80%, na primer oko 75%, i u segmentu (iv) pufer B se podiže u okviru 0,1 do 1 CV, poželjno 0,5 CV do finalnog sadržaja od oko 90% ili više, poželjno oko 95% ili više, poželjnije oko 100%.

[0085] Eluat iz hromatografije sa proteinom A sakuplja se direktno u puferu za stabilizaciju. Poželjno, eluat iz hromatografije sa proteinom A razblažuje se u liniji uz mešanje u puferu za stabilizaciju koji obuhvata D-manitol, saharozu, L-histidin, Tween 20, pH 5,0. Poželjno, eluat iz hromatografije sa proteinom A razblažuje se do finalne koncentracije proteina od oko 0,5 do 3 mg/mL, poželjno do oko 1,5 do 2,5 mg/mL, na primer do oko 1,8 mg/mL.

[0086] Otuda se jedno specifično izvođenje odnosi na postupak za prečišćavanje ponovo uvijenog Fcpeptidnog fuzionog proteina iz kompozicije koja obuhvata Fc-peptidni fuzioni protein i najmanje jednu nečistoću, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake po sledećem redosledu:

a) izvođenje afinitetne hromatografije za hvatanje u režimu vezivanje-eluiranje; i

b) izvođenje multimodalne hromatografije u režimu vezivanje-eluiranje; i

d) izvođenje ultrafiltracije/dijafiltracije; i

gde se hromatografije a), b) and c) izvode opciono sa jednim ili više koraka ispiranja, i

gde se Fc-peptidni fuzioni protein eluira iz medijuma za afinitetnu hromatografiju iz koraka a) sa opadajućim gradijentom pH.

[0087] U jednom poželjnom izvođenju, pronalazak se odnosi na postupak za prečišćavanje ponovo uvijenog Fc-peptidnog fuzionog proteina iz kompozicije koja obuhvata Fc-peptidni fuzioni protein i najmanje jednu nečistoću, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake po sledećem rasporedu:

a) izvođenje hromatografije za hvatanje sa proteinom A u režimu vezivanje-eluiranje; i

b) izvođenje multimodalne hromatografije u režimu vezivanje-eluiranje; i

d) izvođenje ultrafiltracije/dijafiltracije; i

gde se hromatografije a), b) i c) izvode opciono sa jednim ili više koraka ispiranja, i

gde barem jedan pufer koji se upotrebljava za hromatografiju sa proteinom A iz koraka a) uključuje ureuu; i

gde se Fc-peptidni fuzioni protein eluira iz medijuma za hromatografiju sa proteinom A iz koraka a) sa opadajućim gradijentom pH; i

gde medijum za hromatografiju sa proteinom A iz koraka a) obuhvata alkalno tolerantan derivat proteina A kao ligand, poželjno alkalno stabilizovanu tetramernu varijantu domena B proteina A vezanu za umreženi agarozni matriks.

[0088] U jednom specifičnom izvođenju, pronalazak se odnosi na postupak za prečišćavanje ponovo uvijenog Fc-peptidnog fuzionog proteina iz kompozicije koja obuhvata Fc-peptidni fuzioni protein i najmanje jednu nečistoću, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake po sledećem redosledu:

a) izvođenje hromatografije za hvatanje sa proteinom A u režimu vezivanje-eluiranje, gde se eluat sakuplja u puferu za stabilizaciju; i

b) izvođenje multimodalne hromatografije u režimu vezivanje-eluiranje; i

d) izvođenje ultrafiltracije/dijafiltracije; i

gde barem jedan od pufera za ispiranje i eluiranje upotrebljenih u hromatografiji sa proteinom A iz koraka a) uključuje ureu; i

gde medijum za hromatografiju sa proteinom A iz koraka a) obuhvata alkalno tolerantni derivat proteina A kao ligand, poželjno alkalno stabilizovanu tetramernu varijantu domena B proteina A vezanu za umreženi agarozni matriks,

gde pufer za stabilizaciju iz koraka a) obuhvata D-manitol, saharozu, L-histidin, Tween 20, pH 5,0.

Korak srednje hromatografije: multimodalna hromatografija

[0089] Postupak prema pronalasku dalje obuhvata korak multimodalne hromatografije kao srednji korak, tj. sprovodi se u nishodnom nizu nakon afinitetne hromatografije.

[0090] Medijumi na koje se poziva kao na multimodalne medijume ili smole jesu hromatografski medijumi koji poseduju funkcionalne grupe koje se sastoje od bilo naelektrisanih hidrofobnih jonsko-izmenjivačkih liganda ili kristalnih minerala kao što su hidroksiapatit ili fluoroapatit. Umesto „hromatografije sa mešovitim režimom (eng. mixed-mode chromatography)“, ponekad se upotrebljava termin „multimodalna hromatografija (eng. multi modal chromatography)“ ili u vezi sa specifičnom procedurom „hidrofobna hromatografija sa indukcijom naelektrisanja“. Multimodalna hromatografija je interakcija najmanje dva principa, hidrofobne interakcije i jonske izmene ili afinitetne interakcije sa metalom i jonske izmene. Multimodalna hromatografija obezbeđuje manje predvidivu selektivnost koja se ne može reprodukovati postupkom hromatografije sa jednim režimom kao što je hromatografija sa jonskom izmenom ili sa hidrofobnim interakcijama, respektivno. Pozitivno naelektrisani hidrofobni ligandi pripadaju grupi anjonsko-izmenjivačkom mešovitom režimu (na primer CaptoAdhere), i negativno naelektrisani ligandi pripadaju katjonsko-izmenjivačkom mešovitom režimu (na primer Capto MMC). Neki multimodalni medijumi imaju cviterjonski karakter (na primer Bakerbond ABx). Drugi multimodalni medijumi poseduju hidrofobne ligande koji se mogu jonizovati i konvertovati od nenaelektrisanih do pozivitivno naelektrisanih snižavanjem pH (na primer MEP HyperCel). Najzad, hidroksiapatitni i fluoroapatitni medijumi imaju kompleksnije multimodalne funkcije tako što poseduju pozitivno naelektrisane jone kalcijuma i negativno naelektrisane fosfatne grupe.

[0091] U jednom poželjnom izvođenju, multimodalna hromatografija koja se upotrebljava kao srednji korak koristi smolu koja ima hidrofobnu i jonsko-izmenjivačku funkciju. Poželjnije su multimodalne smole koje sadrže pozitivno naelektrisane N-benzil-N-metil etanolaminske ligande, koji su vezani za visoko umreženi agarozni matriks.

[0092] Najpoželjnija multimodalna smola koja se upotrebljava za srednji korak b) jeste CaptoAdhere ImpRes (GE Healthcare Life Science).

[0093] Sledeći uslovi mogu se primeniti kada se nanosi pozitivno naelektrisana smola za multimodalnu hromatografiju u režimu vezivanje-eluiranje: pH 6 do pH 9, poželjno oko pH 6,5 do 8; najpoželjnije oko pH 7. Opciono, može se upotrebiti jedan ili više koraka ispiranja. Uslovi zavise od pl Fc-peptidnog fuzionog proteina i mogu se specifično podešavati u skladu sa željenom separacijom. Elucija sa opadajućim gradijentom pH je poželjni režim za multimodalnu hromatografiju. U najpoželjnijem izvođenju, gradijent se izvodi sa natrijum fosfatnim puferom, počinje na oko pH 7 i završava se na oko pH 5.

[0094] U jednom poželjnom izvođenju, elucija sa gradijentom pH za multimodalnu hromatografiju može se izvoditi sa natrijum fosfatom sa NaCl. Gradijent može biti generisan mešanjem dva pufera (npr., počinjanje sa 100% pufera A koji ima pH od oko 7 i mešanje u njega pufera B koji ima pH od oko 5 dok se ne postigne 70% pufera B). Elucija sa opadajućim gradijentom pH može obuhvatati dva segmenta. Na primer, u segmentu (i) pufer B se povećava u okviru 1 do 3 CV, poželjno u okviru 2 CV, procenat pufera B se podiže sa 0% do sadržaja u opsegu od oko 5% do 50%, poželjno od oko 10% do oko 30%, na primer 20%, i u segmentu (ii) pufer B se dalje povećava u okviru 5 do 30 CV, poželjno 10 do 20 CV, na primer 16,7 CV, do sadržaja u opsegu od oko 60% do oko 95%, poželjno oko 65% do oko 80%, na primer oko 70%.

[0095] U nekim izvođenjima, pronalazak se odnosi na postupak za prečišćavanje ponovo uvijenog Fcpeptidnog fuzionog proteina izvedenog iz inkluzionih tela mikroorganizama iz kompozicije koja obuhvata Fc-peptidni fuzioni protein i najmanje jednu nečistoću, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake po sledećem redosledu:

a) izvođenje hromatografije za hvatanje sa proteinom A u režimu vezivanje-eluiranje; opciono sa jednim ili više koraka ispiranja; i

b) izvođenje multimodalne hromatografije u režimu vezivanje-eluiranje; opciono sa jednim ili više koraka ispiranja; i

c) izvođenje katjonsko-izmenjivačke hromatografije u režimu vezivanje-eluiranje, opciono sa jednim ili više koraka ispiranja; i

d) izvođenje ultrafiltracije/dijafiltracije; i

gde se Fc-peptidni fuzioni protein eluira iz medijuma za multimodalnu hromatografiju iz koraka b) sa opadajućim gradijentom pH od oko pH 7 do oko pH 5; i gde medijum za multimodalnu hromatografiju iz koraka b) obuhvata pozitivno naelektrisan N-benzil-N-metil etanolamin kao ligand vezan za visoko umreženi agarozni matriks; i

gde puferi koji se upotrebljavaju za multimodalnu hromatografiju jesu fosfatni puferi, poželjno natrijum fosfatni puferi sa natrijum hloridom.

[0096] Korak multimodalne hromatografije sa pozitivnim naelektrisanjem u režimu vezivanja separiše naelektrisane varijante Fc-peptidnog fuzionog proteina i dalje redukuje proteine ćelije domaćina, DNK ćelije domaćina, agregate, fragmente, sulfidne varijante, endotoksine i izluženi protein A.

[0097] U jednom poželjnom izvođenju, multimodalnoj hromatografiji prethodi korak kondicioniranja. Korak kondicioniranja priprema zbirni uzorak elucije sa proteinom A za dalje prečišćavanje. Korak kondicioniranja obuhvata sledeće korake: Nakon koraka zadržavanja, zbirni uzorak elucije sa proteinom A se razblažuje i podešava se pH. Poželjno, razblaživanje je četiri puta i pH se podešava do oko pH 7. U jednom poželjnijem izvođenju, razblaživanje je dva puta i pH se podešava do oko pH 7. Poželjno, pufer je natrijum fosfat. NaCl se dodaje do finalne koncentracije od 25 mM. Kondicionirani eluat proteina A se inkubira i filtrira. Poželjno, inkubacija se izvodi tokom 30 do oko 60 minuta.

[0098] U nekim izvođenjima, pronalazak se odnosi na postupak za prečišćavanje ponovo uvijenog Fcpeptidnog fuzionog proteina izvedenog iz inkluzionih tela mikroorganizama iz kompozicije koja obuhvata Fc-peptidni fuzioni protein i najmanje jednu nečistoću, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake po sledećem redosledu:

a) izvođenje hromatografije za hvatanje proteina A u režimu vezivanje-eluiranje; opciono sa jednim ili više koraka ispiranja; i

d) izvođenje ultrafiltracije/dijafiltracije; i

gde medijumu za multimodalnu hromatografiju iz koraka b) prethodi korak kondicioniranja; i gde korak kondicioniranja obuhvata razblaživanje, podešavanje pH, inkubaciju, i filtraciju eluata iz hromatografije za hvatanje sa proteinom A iz koraka a).

[0099] U nekim izvođenjima, pronalazak se odnosi na postupak za prečišćavanje ponovo uvijenog Fcpeptidnog fuzionog proteina iz kompozicije koja obuhvata Fc-peptidni fuzioni protein i najmanje jednu nečistoću, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake po sledećem redosledu:

a) izvođenje afinitetne hromatografije za hvatanje u režimu vezivanje-eluiranje upotrebljavajući alkalno-stabilizovani derivat proteina A kao ligand;

b) izvođenje multimodalne hromatografije u režimu vezivanje-eluiranje upotrebljavajući N-benzil-N-metil etanol amin kao ligand;

c) izvođenje katjonsko-izmenjivačke hromatografije u režimu vezivanje-eluiranje upotrebljavajući R-SO3- kao ligand; i

izvođenje ultrafiltracije/dijafiltracije;

[0100] U specifičnijim izvođenjima, pronalazak se odnosi na postupak za prečišćavanje ponovo uvijenog Fc-peptidnog fuzionog proteina iz kompozicije koja obuhvata Fc-peptidni fuzioni protein i najmanje jednu nečistoću, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake po sledećem redosledu:

d) izvođenje afinitetne hromatografije za hvatanje u režimu vezivanje-eluiranje upotrebljavajući alkalno-stabilizovani derivat proteina A kao ligand;

e) izvođenje multimodalne hromatografije u režimu vezivanje-eluiranje upotrebljavajući N-benzil-N-metil etanol amin kao ligand;

f) izvođenje katjonsko-izmenjivačke hromatografije u režimu vezivanje-eluiranje upotrebljavajući R-SO3- kao ligand; i

g) izvođenje ultrafiltracije/dijafiltracije;

gde se hromatografije a), b) i c) izvode opciono sa jednim ili više koraka ispiranja,

Korak hromatografije za fino prečišćavanje: katjonsko-izmenjivačka hromatografija

[0101] Postupak kao što je opisan ovde dalje obuhvata korak katjonsko-izmenjivačke hromatografije kao korak finog prečišćavanja.

[0102] Katjonsko-izmenjivačka hromatografija se oslanja na interakcije naelektrisanja između proteina u uzorku i naelektrisanja imobilisanih na smoli. U katjonsko-izmenjivačkoj hromatografiji, molekuli koji treba da se vežu jesu pozitivno naelektrisani, a imobilisane funkcionalne grupe (ligandi) su negativno naelektrisane. Uobičajeno upotrebljavane katjonsko-izmenjivačke smole su S smole (sulfonat), SP smole (sulfopropil), SiB smole (sulfoizobutil), SE smole (sulfoetil), i CM smole (karboksimetil).

[0103] Međutim, korak katjonsko-izmenjivačke hromatografije se generalno može izvoditi sa svim uobičajeno komercijalno dostupnim katjonsko-izmenjivačkim smolama ili membranama. Katjonskoizmenjivačke smole se mogu upotrebljavati u obliku unapred napunjenih kolona ili membrana na kojima su fiksirane funkcionalne grupe, npr. sulfonska kiselina. Alternativno, smole se mogu nabaviti kao rasuti materijal i kolone puni korisnik. Ne postoje specifična ograničenja u pogledu kapaciteta i dimenzija kolona osim uobičajenih. Stručnjak u oblasti tehnike zna koju količinu katjonsko-izmenjivačke smole i veličinu kolone treba upotrebiti. To zavisi od ukupnog obima procesa.

[0104] Tipično komercijalno dostupni proizvodi uključuju, na primer, Macro-Prep High S, Macro-Prep CM, Unosphere Rapid S, Unosphere Rapid S40, Nuvia S, i Nuvia HR-S (Bio-Rad, California, USA), Toyopearl CM, Toyopearl SP, Toyopearl Sulfate 650 F, i Toyopearl GigaCap S (Tosoh Bioscience, Germany), Millipore ProRes S, Fractogel EMD COO‑, Fractogel EMD SO3‑, Fractogel EMD SE Hicap, Eshmuno CPX (Merck KGaA, Germany), Biosepra CM Ceramic HyperD, Biosepra S Ceramic HyperD, S HyperCel (Pall Corperation, New York, USA), Poros HS, Poros XS (Applied Biosystems, Germany), YMC BioPro SmartSep 30S, YMC BioPro SmartSep 70S (YMC Europe), CM-Sepharose FF, SP-Sepharose FF, S-Sepharose FF, SP-Sepharose HP, SP-Sepharose XL, SP-Sepharose Big Beads, CM-Sephadex, Capto S, Capto SP ImpRes, i Source S (svi GE Healthcare, Germany).

[0105] Poželjne smole za katjonsku izmenu prema ovom pronalasku su jaki katjonski izmenjivači koji upotrebljavaju sulfonatne, sulfopropilne, ili sulfoizobutilne ligande. Poželjniji su sulfonatni ili sulfopropilni ligandi vezani za čvrste matrikse kao što su visoko umrežena agaroza, npr. Nuvia HR-S, ili poli(stirenvinilbenzen), npr. Poros 50 HS, ili polimetakrilat, npr. Fractogel EMD SO3‑. Najpoželjnija smola za katjonsku izmenu je jaki katjonski izmenjivač BioPro SmartSep S30 (YMC Europe) sa SO3- grupama vezanim za hidrofilni polimerni matriks

[0106] Uobičajeno se katjonsko-izmenjivačka hromatografija izvodi pomoću pufera pri pH vrednostima između 4 i 7.

[0107] Katjonsko-izmenjivačka hromatografija se može ekvilibrisati puferom koji ima pH od oko pH 4 do oko pH 8, poželjno od oko pH 5 do pH 7. Koncentracija pufera može biti u opsegu od 10 mM do 200 mM, poželjno u opsegu od 50 mM do 100 mM.

[0108] Primeri pufera koji se upotrebljavaju za katjonsko-izmenjivačku hromatografiju jesu limunska kiselina, mlečna kiselina, ćilibarna kiselina, mravlja kiselina, butanska dikiselina, sirćetna kiselina, malonska kiselina, glicin, MES, PIPES, fosfat, bistris, Tris, ili njihove mešavine. Izbor pufera zavisi od željenih pH i pl Fcpeptidnog fuzionog proteina.

[0109] Poželjni pufer koji se upotrebljava za katjonsko-izmenjivačku hromatografiju jeste Tris. U jednom poželjnom izvođenju, pH Tris pufera podešava se sa HCl ili fosfornom kiselinom.

[0110] Za eluciju se može upotrebljavati povećanje u pH pufera za eluciju, koje se obezbeđuje bilo jednim korakom ili gradijentom.

[0111] Jedno poželjno izvođenje za izvođenje katjonsko-izmenjivačke hromatografije jeste pH od oko pH 5,5 do 7,5 za nanošenje i ispiranje, i pH od oko 6 do 8 za korak elucije.

[0112] U jednom izvođenju, eluat iz multimodalne hromatografije se nanosi na kolonu za katjonskoizmenjivačku hromatografiju nakon koraka zadržavanja. Poželjno, korak zadržavanja se sprovodi pri temperaturi od 2 do 10° C.

[0113] Tako se, u jednom poželjnom izvođenju, pronalazak odnosi na postupak za prečišćavanje ponovo uvijenog Fc-peptidnog fuzionog proteina dobijenog iz inkluzionih tela mikroorganizama iz kompozicije koja obuhvata Fc-peptidni fuzioni protein i najmanje jednu nečistoću, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake po sledećem redosledu:

c) izvođenje katjonsko-izmenjivačke hromatografije u režimu vezivanje-eluiranje; i opciono sa jednim ili više koraka ispiranja; i

d) izvođenje ultrafiltracije/dijafiltracije; i

gde barem jedan pufer koji se upotrebljava za katjonsko-izmenjivačku hromatografiju iz koraka c) jeste Tris pufer; i

gde se Fc-peptidni fuzioni protein eluira jednim korakom iz medijuma za katjonsko-izmenjivačku hromatografiju iz koraka c) povećanjem pH; i

gde medijum za katjonsko-izmenjivačku hromatografiju iz koraka c) jeste medijum za hromatografiju sa jakim katjonskim izmenjivačem, koji obuhvata naelektrisane grupe ‑R-SO3‑ vezane za hidrofilni polimerni matriks.

[0114] Korak katjonsko-izmenjivačke hromatografije separiše naelektrisane varijante Fc-peptidnog fuzionog proteina i može dalje smanjiti rezidualne proteine ćelije domaćina, rezidualnu DNK domaćina, agregate, fragmente, sulfidne varijante, endotoksine i izluženi protein A. Kao korak finog prečišćavanja, različite uklonjene nečistoće su u veoma malim količinama, tj. samo u tragovima.

[0115] Alternativno, katjonsko-izmenjivačka hromatografija se može izvoditi korišćenjem eluata sa gradijentom sa rastućom jonskom jačinom. Najpoželjnija je hromatografija BioPro SmartSep S30 sa gradijentnom elucijom sa L-argininom. Natrijum sukcinatni pufer je poželjni pufer za taj postupak, sa pH u opsegu od pH 5 do 7, poželjno pH 6. Vezani Fc-peptidni fuzioni protein može biti eluiran pomoću rastućeg linearnog gradijenta L-arginina u natrijum sukcinatu.

[0116] Opciono, alternativni katjonsko-izmenjivački postupak sa gradijentnom elucijom sa argininom može se izvoditi kao drugi katjonsko-izmenjivački korak (c2) nakon prve katjonsko-izmenjivačke hromatografije sa pH elucijom u koracima (c1). Taj drugi katjonsko-izmenjivački korak pod izmenjenim uslovima može dalje smanjiti nečistoće po želji.

[0117] U nekim izvođenjima, korak (c) se izvodi dva puta u nizu, pri čemu postupak obuhvata korak c) po sledećem redosledu:

c1) izvođenje prve katjonsko-izmenjivačke hromatografije; i

c2) izvođenje druge katjonsko-izmenjivačke hromatografije;

gde se hromatografije c1) i c2) izvode sa istim hromatografskim medijumom u režimu vezivanjeeluiranje; i

gde se hromatografije c1) i c2) izvode pod različitim uslovima, opciono sa jednim ili više koraka ispiranja.

[0118] Različiti uslovi obuhvataju promene u pH ili u provodljivosti upotrebom elucije u koracima ili gradijentne elucije. U jednom poželjnom izvođenju, različiti uslovi su pH elucija u koracima (c1) i gradijentna elucija sa argininom (c2).

Ultrafiltracija/dijafiltracija sa tangencijalnim protokom (TF-UFIDF)

[0119] Postupak prema pronalasku dalje obuhvata finalni korak ultrafiltracije/dijafiltracije. Ultrafiltracija je forma membranske filtracije u kojoj pritisak potiskuje tečnost na polupropusnu membranu. Suspendovane čvrste supstance i rastvorene supstance velike molekulske mase se zadržavaju, dok voda i rastvorene supstance male molekulske mase prolaze kroz membranu. Ultrafiltracija je postupak koji se uobičajeno upotrebljava za separaciju, prečišćavanje i koncentrovanje makromolekulskih rastvora, naročito proteinskih rastvora. Ultrafiltracija se može kombinovati sa dijafiltracijom. Taj režim je pogodan za izmenu pufera, uklanjanje soli i drugih mikrovrsta iz rastvora putem ponovljenog ili kontinuiranog razblaživanja i ponovnog koncentrovanja. Ultrafiltracija se može izvoditi sa naslaganim membranama u filtracionom sistemu sa tangencijalnim protokom ili poprečnim protokom (TFF ili TF-UF), naročito za obradu zapremina velikih uzoraka. Pored kaseta, za ultrafiltraciju se uobičajeno upotrebljavaju sistemi sa šupljim vlaknima. Granične veličine membrana kreću se od oko 1 do 300 kDa. Za Fc-peptidne fuzione proteine, tipične granične veličine za ultrafiltracione membrane su 10–50 kDa. U okviru predmetnog pronalaska, poželjna je granična veličina molekulske mase od 30 kDa za UF membrane.

[0120] U nishodnom nizu terapijskog proteina, korak ultrafiltracije/dijafiltracije često je finalni korak i upotrebljava se za formulisanje proteinskog leka. Uz to, finalna koncentracija se može podešavati. U slučaju Fc-peptidnog fuzionog proteina, jedno poželjno izvođenje dovodi do formulisane farmaceutske kompozicije ili pripremne farmaceutske kompozicije. Pripremna farmaceutska kompozicija može biti supstanca leka kao glavni deo, koji je spreman za sterilno filtriranje u fiole i dalje se podvrgava liofilizaciji da bi se formirala finalna farmaceutska kompozicija.

[0121] U jednom specifičnom izvođenju, pronalazak se odnosi na postupak za prečišćavanje ponovo uvijenog Fc-peptidnog fuzionog proteina dobijenog iz inkluzionih tela mikroorganizama iz kompozicije koja obuhvata Fc-peptidni fuzioni protein i najmanje jednu nečistoću, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake po sledećem redosledu:

a) izvođenje hromatografije za hvatanje sa proteinom A u režimu vezivanje-eluiranje, opciono sa jednim ili više koraka ispiranja; i

b) izvođenje multimodalne hromatografije u režimu vezivanje-eluiranje, opciono sa jednim ili više koraka ispiranja; i

d) izvođenje ultrafiltracije/dijafiltracije; i

gde se ultrafiltracija/dijafiltracija iz koraka d) upotrebljava za formulaciju i podešavanje finalne koncentracije Fc-peptidnog fuzionog proteina; i

gde se ultrafiltracija/dijafiltracija iz koraka d) izvodi u režimu tangencijalnog protoka; i

gde se ultrafiltracija/dijafiltracija iz koraka d) izvodi sa membranom koja ima nominalnu graničnu vrednost od oko 10 kDa do 50 kDa.

PRIMERI

[0122] Postupci prema pronalasku za prečišćavanje Fc-peptidnog fuzionog proteina potkrepljeni su i ilustrovani pozivanjem na sledeće primere.

Primer 1: Priprema ponovo uvijenih Fc-peptidnih fuzionih proteina

[0123] Fc-peptidni fuzioni proteini su eksprimovani u E. coli u nerastvorljivom ili ograničeno rastvorljivom obliku i akumulirani u takozvanim inkluzionim telima. Priprema romiplostima izabrana je kao primer za Fcpeptidne fuzione proteine. Bakterije su prikupljene centrifugiranjem, a sediment bakterijskih ćelija je inokulisan u puferu za lizu na bazi Tris-a. Bakterije su razorene pod pritiskom, propuštanjem kroz homogenizator. Inkluziona tela su izdvojena iz ostataka ćelija centrifugiranjem i resuspendovanjem u puferu za ispiranje na bazi Tris-a i izdvojena na isti način kao ranije. Nakon inkubacije na sobnoj temperaturi, procedura ispiranja je ponovljena. Finalni sediment inkluzionih tela čuvan je zamrznut na ‑20° C. Zamrznuta inkluziona tela rastvorena su pomoću klasičnih standardnih procedura (Rudolph 1990), pod alkalnim i reduktivnim uslovima sa puferom na bazi Tris-a, koji obuhvata guanidin-HCl i DTT. Nakon inkubacije, rastvorena inkluziona tela podvrgnuta su redoks tretiranju u prisustvu cisteina/cistina da bi se omogućila međusobna razmena tiola i disulfida tokom ponovnog uvijanja i da bi se podstaklo formiranje disulfida. Ponovno uvijanje je zaustavljeno razblaživanjem sa sirćetnom kiselinom i podvrgnuto je pH-indukovanoj precipitaciji nečistoća. Rastvor za ponovno uvijanje je izbistren pomoću dubinske filtracije i mikrofiltracije, razblažen i podešen za pH (pH 5). Relativna početna čistoća ponovo uvijenog romiplostima, kako je izmereno pomoću RP-UPLC, bila je oko 52–62%, kao što je prikazano u Tabeli 1.

Tabela 1: Relativna početna čistoća romiplostima u rastvoru za ponovno uvijanje

Primer 2: Izbor hromatografskih medijuma

[0124] Procesne hromatografske smole različitih dobavljača testirane su na njihovu efikasnost kao korak hvatanja, srednji i korak finog prečišćavanja pod različitim režimima i uslovima elucije. Na osnovu toga je afinitetna hromatografija sa proteinom A bila poželjna kao korak hvatanja, a jonsko-izmenjivačka i multimodalna hromatografija su razmatrane za naredne korake. Ispitivanje je izvođeno u različitim obimima sa rastvorima za ponovno uvijanje romiplostima dobijenog prema Primeru 1. Hromatografski ciklusi izvođeni su pomoću sistema Akta Purifier (GE Healthcare) na sobnoj temperaturi.

[0125] Poseban naglasak je stavljen na separaciju brojnih nečistoća povezanih sa proizvodom. Tabela 2 prikazuje finalni izbor hromatografskih smola. MabSelect SuRe LX je dala najbolje rezultate i bila je izabrani afinitetni medijum. Pozitivno naelektrisane multimodalne smole ispostavile su se kao povoljne u odnosu na uobičajeno upotrebljavane anjonsko-izmenjivačke medijume. Capto Adhere ImpRes je izabrana za srednji korak. Katjonsko-izmenjivačka hromatografija kao finalni korak finog prečišćavanja dovršila je niz (Slika 2). Poređeni su mnogi različiti medijumi, a najbolji rezultati dobijeni su za jak katjonski izmenjivač BioPro SmartSep S30 (Tabela 2).

Tabela 2: Poželjni hromatografski medijumi

Primer 3: Afinitetna hromatografija sa proteinom A sa MabSelect SuRe LX

[0126] Afinitetna hromatografija izvedena je sa MabSelect SuRe LX (Tabela 2). Uzorak je uzet nakon podešavanja pH, razblaživanja i filtracije rastvora za ponovno uvijanje kao što je opisano u Primeru 1.

[0127] Dimenzije kolone bile su 7 cm u prečniku x 19 cm visine sloja (napunjena zapremina oko 730 mL). Kolona sa proteinom A ekvilibrisana je sa 1,25 M uree, 150 mM etanolamina, 200 mM L-arginin hidrohlorida, pH 5,0 (3 CV). Rastvor proizvoda je nanet sa 10–18 mg proteina po mL smole. Kolona je isprana puferom za ekvilibraciju (1,5 CV). Da bi se redukovala količina nečistoća povezanih sa proizvodom, kao što su redukovane izoforme i izoforme disulfidnih veza, poređeni su efekat elucije u koracima i gradijentne elucije na hromatografiju sa proteinom A. Za eluciju u koracima, pufer je sadržavao 100 mM Na-citrata i 0,5 M uree pri pH 3,5. Gradijentna elucija je izvedena mešanjem pufera A koji sadrži 100 mM Na-citrata, 0,5 M uree pri pH 5,5 i pufera B koji sadrži 100 mM Na-citrata, 0,5 M uree pri pH 2,5. Elucija sa opadajućim linearnim gradijentom pH sastojala se od tri segmenta: (i) 0–37% B (1 CV), (ii) 37–75% B (13,8 CV), i (iii) 75–100% B (1 CV). Brzine protoka bile su 100 cm/h. Tabela 3 prikazuje efekat pH elucije u koracima i pH gradijentne elucije na hromatografiji sa proteinom A na redukciju nečistoća romiplostima povezanih za proizvodom. Nečistoće povezane sa proizvodom grupisane su u skladu sa njihovim maksimumima izmerenim pomoću RP-UPLC u monomernim varijantama i dimernim varijantama romiplostima sa različitim otvorenim i pogrešno uparenim disulfidnim vezama.

Tabela 3: Poređenje pH elucije u koracima i pH-gradijentne elucije na afinitetnu hromatografiju sa proteinom A za sulfidne varijante romiplostima

(nastavak)

[0128] Elucija u koracima je dovela do redukcije od oko 45% za monomerne varijante sa otvorenim disulfidnim vezama i od oko 12% za pogrešno uparene dimere, respektivno. Iznenađujuće, veoma velika redukcija kritičnih monomera sa otvorenim disulfidima dobijena je elucijom sa opadajućim gradijentom pH na hromatografiji sa proteinom A. Varijante sa otvorenim disulfidima smanjene su do oko 93%. Monomeri su očigledno pokazivali slabije vezivanje za protein A nego dimeri i eluirani su pre dimera. Nije se mogao detektovati nikakav dalji efekat na redukciju već niskog nivoa izoformi dimerizovanog romiplostima sa otvorenim disulfidima.

Primer 3.1: Stabilizacija eluata proteina A

[0129] Da bi se sprečila precipitacija, eluat proteina A sakupljan je direktno uz mešanje u puferu za stabilizaciju. Testirana su tri alternativna pufera: pufer 1 sadržao je 4% D-manitola (m/v), 2% saharoze (m/v), 20 mM L-histidina, 0,004% Tween 20, pH 5,0; pufer 2 sa 20 mM NaAC, 50 mM NaCl, pH 5,0; i pufer 3 sadržao je 100 mM Na-citrata, 0,5 M uree pri pH 5,5. Za sva tri pufera nije uočena nikakva precipitacija direktno nakon elucije. Međutim, nakon ciklusa zamrzavanje-odmrzavanje pri ‑70° C, pufer 2 i pufer 3 pokazivali su proteinsku precipitaciju eluata sa proteinom A, dok nasuprot tome za pufer 1 nije uočena nikakva precipitacija. Proteinska precipitacija u eluatu sa proteinom A javljala se pri proteinskoj koncentraciji > 2 mg/mL. Podešavanje proteinske koncentracije eluata sa proteinom A do 1,8 mg/mL do 2 mg/mL dalje je sprečilo precipitaciju uzorka i poboljšalo skladištenje na 2–8° C.

Primer 4: Kondicioniranje i multimodalna hromatografija sa Capto Adhere ImpRes

[0130] Nakon koraka zadržavanja na 2–8° C, zbirni uzorak elucije sa proteinom A dobijen u Primeru 3 pripremljen je u koraku kondicioniranja za dalje prečišćavanje. Zbirni uzorak elucije za hvatanje razblažen je četiri puta sa 20 mM NaH2PO4, pH 7 i, ako je neophodno, pH je podešena do pH 7,0. Alternativno, zbirni uzorak elucije za hvatanje razblažen je dva puta sa 100 mM natrijum fosfata i, ako je neophodno, pH je podešena sa 1 M NaOH do pH 7,0. NaCl je dodat do finalne koncentracije od 25 mM. Nakon pH-indukovane precipitacije, rastvor je inkubiran tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi da bi se precipitatu omogućilo da se staloži. Za izbistravanje, rastvor je filtriran kroz filtersku kapsulu Supor EKV od 0,2 μm (Pall Corporation).

[0131] Kondicioniranje zbirnog uzorka elucije sa proteinom A pre srednjeg koraka prečišćavanja otkrilo je pozitivan efekat na redukciju monomera romiplostima (Tabela 4).

Tabela 4: Redukcija monomernih varijanti romiplostima putem kondicioniranja i srednje multimodalne hromatografije

[0132] Kondicionirani i izbistreni zbirni uzorak elucije sa proteinom A dalje je prečišćavan na multimodalnoj smoli Capto Adhere ImpRes kao srednji korak prečišćavanja koji upotrebljava ligand N-benzil-N-metil etanolamin (Tabela 2) i nosi pozitivno naelektrisane grupe i, pored funkcija anjonskog izmenjivača, obezbeđuje i hidrofobne interakcije. Multimodalna hromatografija redukovala je naelektrisane varijante i pogrešno uparene disulfidne izoforme kada je izvođena u režimu vezivanja. Veličina napunjene kolone bila je 7 cm u prečniku x 20,5 visine sloja (napunjena zapremina oko 789 mL). Smola je ekvilibrisana u dva koraka koja su se sastojala od (i) 500 mM NaH2PO4, pH 7 (3 CV) i (ii) 20 mM NaH2PO4i 25 mM NaCl, pH 7 (5 CV). Podešen i izbistren zbirni uzorak elucije sa proteinom A nanet je na kolonu sa 3 mg proteina po mL smole za čim je sledio pufer za ekvilibraciju (1,5 CV). Elucija sa gradijentom pH izvedena je mešanjem pufera A koji sadrži 20 mM NaH2PO4, 25 mM NaCl pri pH 7 i pufera B koji sadrži 20 mM NaH2PO4, 25 mM NaCl pri pH 5 u sledećim odnosima i sekvencama: (i) 0–10% B (1 CV) i (ii) 10–70% B (24 CV). Alternativno, elucija sa pH gradijentom izvedena je mešanjem pufera A koji sadrži 20 mM NaH2PO4, 25 mM NaCl pri pH 7 i pufera B koji sadrži 20 mM NaH2PO4, 25 mM NaCl pri pH 5 u sledećim odnosima i sekvencama: (i) 0–20% B (2 CV) i (ii) 20–70% B (16,7 CV). Brzina protoka bila je 110 cm/h.

[0133] Multimodalna hromatografija povećala je relativnu čistoću od oko 68% u nanosu do oko 85% u zbirnom uzorku elucije. Za monomerne varijante romiplostima sa nepravilnim otvorenim disulfidnim mostovima, postignuta je redukcija od oko 47%, a pogrešno uparene dimerne varijante romiplostima redukovane su za oko 58%.

Primer 5: Katjonsko-izmenjivačka hromatografija sa BioPro SmartSep S30

[0134] Dalja separacija zagađivača povezanih sa procesom i supstanci povezanih sa proizvodom, kao što su naelektrisane varijante i pogrešno uparene disulfidne varijante, postignuta je hromatografijom sa jakim katjonskim izmenjivačem sa ‑R-SO3‑ ligandima (Tabela 2). Kolona je napunjena smolom BioPro SmartSep S30 (YMC, Europe), 5 cm u prečniku x 20 cm visine sloja (napunjena zapremina oko 392 mL) i ekvilibrisana sa 100 mM Tris-a podešenog sa 85% mM fosforne kiseline do pH 6,75 (8 CV). Rastvor dobijen iz srednjeg koraka kao što je opisano u Primeru 4 nanet je direktno na kolonu sa oko 2,5–8 mg proteina po mL smole. Kolona je isprana puferom za ekvilibraciju (3 CV). Vezani protein eluiran je pH elucijom u koracima pri 18 mM Tris-a podešenog sa 85% mM fosforne kiseline do pH 7,6 u 40 CV. Hromatografija je izvođena pri 150 cm/h. Eluat je separisan u frakcijama da bi se omogućilo specifično sakupljanje zbirnog uzorka. Katjonskoizmenjivačka hromatografija sa pH elucijom u koracima dovela je do relativne čistoće od oko 97% (glavni maksimum u RP-UPLC) sa oko 0,8% preostalih pogrešno uparenih disulfidnih dimera romiplostima.

[0135] Opciono, razvijena je druga BioPro SmartSep S30 hromatografija sa gradijentnom elucijom sa argininom. Kolona je ekvilibrisana sa 20 mM Na-sukcinata, pH 6 (5 CV). Eluat iz prve katjonsko-izmenjivačke hromatografije podešen je do pH 6 sa 10% fosforne kiseline, provučen kroz EKV filter od 0,2 μm (Pall), i nanet na kolonu sa <5 mg po mL smole. Kolona je isprana ekvilibracionim puferom (3 CV). Vezani protein je eluiran pomoću rastućeg linearnog gradijenta od 0 mM do 250 mM L-arginina u 20 mM Na-sukcinata, pH 6 u 49 CV. Eluat je separisan u frakcije da bi se omogućilo specifično sakupljanje zbirnog uzorka. Brzine protoka bile su 150 cm/h. Kolona je regenerisana sa (i) 2 M NaCl (3 CV, 150 cm/h) i (ii) 1 M NaOH (3 CV, 40 cm/h) u obrnutom protoku, i skladištena u 20 mM NaOH. Drugi katjonsko-izmenjivački korak pod izmenjenim uslovima može dalje smanjiti nečistoće, po želji. Međutim, za finalno razvijen proces romiplostima, drugi katjonsko-izmenjivački korak nije bio obavezan.

Primer 6: Ultrafiltracija/dijafiltracija sa tangencijalnim protokom (TF-UF/DF)

[0136] Cilj koraka ultrafiltracije/dijafiltracije je podešavanje koncentracije proteinskog rastvora i prenošenje Fc-peptidnog fuzionog proteina u pufer za finalnu formulaciju, koji pored pufera sadrži druge sastojke finalnog glavnog dela formulacije, kao što su detergenti, stabilizatori, soli, šećeri, i/ili polioli.

[0137] Korak TF-UF/DF je izveden upotrebljavajući membranu Hydrosart 30 kDa (Sartorius). Transmembranski pritisak procesa UF/DF podešen je do 0,5 bara. Nije bilo gubitka proizvoda u tom koraku. Finalna koncentracija glavnog dela Fc-peptidnog fuzionog proteina podešena je do 1 g po L. Finalna mikrofiltracija (sterilna filtracija) izvedena je filterskom kapsulom Supor EKV od 0,2 μm (Pall Corporation).

Primer 7: Napredovanje relativne čistoće tokom koraka procesa

[0138] Niz koraka prečišćavanja nakon ponovnog uvijanja koji obuhvata afinitetnu hromatografiju sa proteinom A, multimodalnu hromatografiju i katjonsko-izmenjivačku hromatografiju izveden je kao što je opisano u prethodnim primerima. Relativna čistoća nakon svakog koraka prečišćavanja od tri ciklusa prečišćavanja koje započinju sa 9,5–13,5 g ispranih i zamrznutih inkluzionih tela prikazana je na Slici 5. Relativna čistoća koja je definisana kao procenat glavnog maksimuma u RP-UPLC znatno se povećava tokom celog procesa prečišćavanja.

[0139] Proces prečišćavanja tri uzastopne serije počeo je sa relativnom čistoćom od oko 61–76% u rastvoru za ponovno uvijanje. To je bilo nešto više nego relativna početna čistoća iz eksperimenata koji su doveli do Tabele 1. Nakon afinitetne hromatografije za hvatanje sa proteinom A i gradijentne elucije, relativna čistoća se povećala do oko 81–94%. Srednja multimodalna hromatografija podigla je relativnu čistoću do 95–96%, a finalna katjonsko-izmenjivačka hromatografija za fino prečišćavanje, koja je dalje uklonila samo tragove, dovela je do relativne čistoće od oko ≥ 97%.

[0140] Iznenađujuće, srednji korak nakon koraka sa proteinom A pokazao je visok potencijal za uklanjanje izluženog proteina A (Tabela 5). Multimodalna hromatografija znatno je redukovala izluženi protein A do veoma niskih nivoa ili ispod granice detekcije testa, respektivno. Katjonsko-izmenjivačka hromatografija kao korak finog prečišćavanja još je više smanjila nivoe izluženog proteina A. Izluženi protein A izmeren je pomoću testa ELISA.

Tabela 5: Izluženi protein A nakon koraka hvatanja, srednjeg koraka i koraka finog prečišćavanja.

Primer 8: Karakterizacija finalne čistoće romiplostima

[0141] Tabela 6 otkriva finalnu čistoću tri različite serije romiplostima izmerene pomoću četiri različita analitička postupka.

Tabela 6: Finalna čistoća romi lostima merena različitim analitičkim ostu cima

[0142] SDS-poliakrilamidna gel elektroforeza (SDS-PAGE) sa bojenjem srebrom i denzitometrijskom evaluacijom otkrila je relativnu čistoću (glavni pojas) od najmanje oko 97,8%. Taj postupak može detaktovati samo ograničen spektar nečistoća, kao što su proteini ćelije domaćina i skraćene forme romiplostima. Postupak sa isključivanjem veličine čestica (SEC)‑HPLC identifikuje vrste sa različitim molekulskim veličinama, kao što su monomeri i agregati. Čistoća glavnog maksimuma je u visini od 99,6 do 99,8%. Katjonska izmena (CEX) HPLC detektuje naelektrisane varijante romiplostima i relativna čistoća sa tim postupkom bila je 97,8–99,3%. Najzad, reverzno-fazna ultra-visokoefikasna hromatografija (RP-UPLC) otkrila je finalnu čistoću od oko 97%. Ostali su samo tragovi nečistoća povezanih sa proizvodom. Kao što je prikazano u Tabeli 7, druge nečistoće, kao što su DNK ćelije domaćina (HC-DNA), proteini ćelije domaćina (HCP) i izluženi protein A su ispod granica detekcije upotrebljenih testova ili na veoma niskim nivoima, HCP-ELISA (< 20 ppm HCP), qPCR (< 0,018 ppm HCDNA) i Protein A-ELISA (0,01 ppm), respektivno.

Tabela 7: Nečistoće povezane sa proizvodom u finalnoj fazi prečićavanja

Primer 9: Karakterizacija nečistoća povezanih sa proizvodom

[0143] Strukturna karakterizacija varijanti romiplostima, upotrebljavajući opsežnu LC-MS tehnologiju i peptidno mapiranje intaktnog fuzionog proteina, podjedinica, redukovanih i neredukovanih uslova i analiza N-terminala izvođeni su sa uzorcima iz različitih faza procesa prečišćavanja i različitim serijama. Pored toga, analizirane su i različite serije komercijalno dostupnog romiplostima, koji se prodaje pod trgovačkim imenom NPlate®.

[0144] Pored pravilno uvijenog i intaktnog romiplostima, koji sadrži šest disulfidnih mostova i očekivani disulfidni obrazac kao glavnu komponentu, različite varijante romiplostima sa višim nivoima oksidacije (M1, M33, M209 i W264), pogrešno uparenim disulfidnim vezama (C7-C10 i C102-C148), slobodnim cisteinima na različitim položajima ili deaminovanim asparaginom (N96, N165) identifikovane su kao nečistoće povezane sa proizvodom (Tabela 8).

Tabela 8: Identifikovane nečistoće povezane sa proizvodom romiplostima

[0145] Redukovane i oksidovane varijante romiplostima dalje su karakterisane u skladu sa njihovim položajem maksimuma pomoću RP-UPLC (Tabela 8). Različite varijante kao što su monomeri sa dve do četiri otvorene disulfidne veze, trimeri, tetrameri, i oksidovane vrste romiplostima predstavljene su pomoću RRT < 1.0. Dimeri romiplostima sa bilo jednim ili dva pogrešno uparena disulfidna mosta identifikovani su pomoću RRT > 1.0 (Tabela 9).

Tabela 9: Procena maksimuma redukovanih i oksidovanih varijanti romiplostima u RP-UPLC

[0146] Te nečistoće povezane sa proizvodom iz Tabele 7 i 8 detektovane su samo u tragovima u finalnoj fazi prečišćavanja, kao i u NPlate®.

SPISAK REFERENCI

[0147]

1. Cwirla SE, Balasubramanian P, Duffin DJ, Wagstrom CR, Gates CM, Singer SC, Davis AM, Tansik RL, Mattheakis LC, Boytos CM, Schatz PJ, Baccanari DP, Wrighton NC, Barrett RW, Dower WJ (1997) Peptide agonist of the thrombopoietin receptor as potent as the natural cytokine. Science 276(5319): 1696‑1699 2. Dietrich A, Rudolph R, Schäffner J. (2003) Industrial Protein Folding. BIOforum Europe GIT Verlag GmbH & Co. KG Darmstadt 1‑3

3. Fahrner RL, Knudsen HL, Basey CD, Galan W, Feuerhelm D, Anderlaan MV, Blank GS (2001) Industrial Purification of Pharmaceutical Antibodies: Development, Operation, and Validation of Chromatography Processes. Biotechnol. Genet. Eng. Rev.18: 301‑327

4. Fayaz S, Fard-Esfahani P, Golkar M, Allahyari M, Sadegh S (2016) Expression, purification and biological activity assessment of romiplostim biosimilar peptibody. Daru 24: 18

5. Gagnon P (1996) Purification Tools for Monoclonal Antibodies. Validated Biosystems 1‑253

6. GE Healthcare (2007) Purification and renaturation of recombinant proteins produced in Escherichia coli as inclusion bodies. Application Note 18‑1112‑33, 1‑4

7. Li J, Yang C, Xia Y, Bertino A, Glaspy J, Roberts M, Kuter DJ (2001) Thrombocytopenia caused by the development of antibodies to thrombopoietin. Blood 8(12): 3241‑3248

8. Linderholm AL and Chamow SM (2014) Immunoglobulin Fc-Fusion Proteins. BioProcess International 12(9): 30‑35

9. Liu HF (2010) Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. mAbs 2(5): 480‑499

10. Marston FAO (1986) The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli. Biochem. J.240: 1‑12

11. Pyzik M, Rath T, Lencer WI, Baker K, Blumberg RS (2015) FcRn: The Architect Behind the Immune and Nonimmune Functions of IgG and Albumin. J Immunol 194(10): 4595‑4603

12. Rudolph R (1990) Renaturation of recombinant, disulfide-bonded proteins from "inclusion bodies". In Modern Methods in Protein‑ and Nucleic Acid Research, Walter de Gryter, New York 149‑171

13. Rudolph R and Lilie H (1996) In vitro folding of inclusion body proteins. FASEB J 10: 49‑56

14. Shimamoto G, Gegg C, Boone T, Quéva C (2012) Peptibodies - A flexible alternative format to antibodies. mAbs 4(5): 586‑591

15. Shukla AA, Jiang C, Ma J, Rubacha M, Flansburg L, Lee SS (2008) Demonstration of robust host cell protein clearance in biopharmaceutical downstream processes. Biotechnol. Prog.24, 615‑622

16. Zhang L, Jiang C, Chen X, Gu J, Song Q, Zhong H, Xiong S, Qingfeng Dong Q, Yu J, Deng N (2020) Largescale production, purification, and function of a tumor multi-epitope vaccine: Peptibody with bFGF/VEGFA. Eng Life Sci.20, 422‑436

17. EP0219874

Claims

Patentni zahtevi

1. Postupak za prečišćavanje ponovo uvijenog Fc-peptidnog fuzionog proteina iz kompozicije koja obuhvata Fc-peptidni fuzioni protein i najmanje jednu nečistoću, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake po sledećem redosledu:

b) izvođenje multimodalne hromatografije u režimu vezivanje-eluiranje;

d) izvođenje ultrafiltracije/dijafiltracije;

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, gde najmanje jedna nečistoća jeste sulfidna varijanta Fcpeptidnog fuzionog proteina, poželjno gde sulfidna varijanta obuhvata najmanje jednu pogrešno uparenu disulfidnu vezu.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde se Fc-peptidni fuzioni protein eluira iz medijuma za afinitetnu hromatografiju iz koraka a) sa opadajućim linearnim gradijentom pH,

poželjno gde gradijent pH započinje na oko pH 5,5 i završava se na oko pH 2,5.

4. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se korak a) izvodi sa medijumum za hromatografiju sa proteinom A,

poželjno gde medijum za hromatografiju sa proteinom A obuhvata alkalno tolerantan derivat proteina A kao ligand, poželjno alkalno stabilizovanu tetramernu varijantu domena B proteina A vezanu za umreženi agarozni matriks.

5. Postupak prema patentnom zahtevu 4, gde barem jedan od pufera za ispiranje i pufera za eluciju koji se upotrebljavaju u hromatografiji sa proteinom A iz koraka a) uključuje ureu.

6. Postupak prema patentnom zahtevu 5, gde pufer za ispiranje i pufer za eluciju koji se upotrebljavaju u hromatografiji sa proteinom A iz koraka a) uključuje ureu.

7. Postupak prema patentnim zahtevima 4 do 6, gde se u koraku a) eluat iz hromatografije za hvatanje sa proteinom A sakuplja u puferu za stabilizaciju,

poželjno gde pufer za stabilizaciju iz koraka a) obuhvata D-manitol, saharozu, L-histidin, Tween 20, i poželjno gde je pH pufera za stabilizaciju iz koraka a) u opsegu od 3,5 do 6,5, poželjno 4 do 6, poželjnije između 4,5 do 5,5, najpoželjnije oko 5.

8. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se korak b) izvodi sa pozitivno naelektrisanim medijumom za multimodalnu hromatografiju, poželjno gde pozitivno naelektrisani medijum za multimodalnu hromatografiju obuhvata N-benzil-N-metil etanolamin kao ligand vezan za visoko umreženi agarozni matriks.

9. Postupak prema patentnom zahtevu 8, gde se Fc-peptidni fuzioni protein eluira iz pozitivno naelektrisanog medijuma za multimodalnu hromatografiju iz koraka b) sa opadajućim gradijentom pH, poželjno gde se gradijent pH formira mešanjem dva pufera koji imaju pH vrednosti od oko pH 5 i oko pH 7.

10. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde multimodalnoj hromatografiji iz koraka b) prethodi korak kondicioniranja, poželjno gde korak kondicioniranja obuhvata razblaživanje, podešavanje pH, inkubaciju i filtraciju eluata iz afinitetne hromatografije za hvatanje iz koraka a).

11. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se korak c) izvodi sa jakim katjonskoizmenjivačkim medijumom, poželjno sa naelektrisanim grupama ‑R-SO3- vezanim za hidrofilni polimerni matriks.

12. Postupak prema patentnom zahtevu 11, gde se Fc-peptidni fuzioni protein eluira iz jakog katjonskoizmenjivačkog medijuma povećanjem pH vrednosti.

13. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde korak d) dovodi do formulisane farmaceutske kompozicije ili pripremne farmaceutske kompozicije,

poželjno gde formulisana farmaceutska kompozicija ili pripremna farmaceutska kompozicija obuhvata prečišćeni Fc-peptidni fuzioni protein, vodu, pufer i barem jedno dalje jedinjenje izabrano od detergenta, stabilizatora, soli, šećera i poliola,

i poželjno gde farmaceutska kompozicija jeste liofilizat.

14. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde Fc-peptidni fuzioni protein jeste monomer ili dimer, poželjno dimer, i poželjno gde ponovo uvijeni Fc-peptidni fuzioni protein jeste agonist receptora, poželjno gde agonist receptora jeste mimetik trombopoietina, poželjno romiplostim.

15. Postupak za proizvođenje ponovo uvijenog Fc-peptidnog fuzionog proteina, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake po sledećem redosledu:

1) Ekspresija Fc-peptidnog fuzionog proteina u mikroorganizmima gde je Fc-peptidni fuzioni protein prisutan u inkluzionim telima;

2) Liza mikroorganizama;

3) Sedimentacija inkluzionih tela;

4) Rastvaranje inkluzionih tela;

7) Prečišćavanje Fc-peptidnog fuzionog proteina koji obuhvata sledeće korake po sledećem redosledu:

b) izvođenje multimodalne hromatografije;

c) izvođenje katjonsko-izmenjivačke hromatografije; i

d) izvođenje ultrafiltracije/dijafiltracije;

i opciono formulisanje prečišćenog peptida u farmaceutsku kompoziciju