ES3040791T3 - Methods for the purification of refolded fc-peptide fusion protein - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a nuevos métodos para la purificación de proteínas de fusión Fc-péptido (pepticuerpos) derivadas de cuerpos de inclusión tras su expresión en procariotas. En particular, se refiere a métodos cromatográficos de los péptidos de fusión tras su replegamiento y dimerización, que comprenden cromatografías de captura por afinidad, intermedias y de purificación. Estos métodos facilitan la reducción de impurezas relacionadas con el producto, como variantes de sulfuro o variantes de carga de las proteínas de fusión Fc-péptido en el producto final. Además, la presente invención se refiere a condiciones específicas y tampones seleccionados que evitan la agregación, la precipitación y la degradación de las proteínas de fusión Fc-péptido. Finalmente, los métodos de la presente invención dan como resultado una composición farmacéutica formulada o una composición farmacéutica en fase de pre-expresión que contiene una proteína de fusión Fc-péptido de alta pureza. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para la purificación de la proteína de fusión FC-péptido replegada

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para purificar proteínas de fusión Fc-péptido expresadas en microorganismos usando una secuencia de cromatografías como se describe en las reivindicaciones adjuntas. Estos métodos comprenden cromatografía de afinidad, cromatografía de modo mixto y cromatografía de intercambio catiónico, proporcionando de este modo las proteínas de fusión Fc-péptido con pureza de calidad farmacéutica, sustancialmente exentas de impurezas relacionadas con el procedimiento y con niveles muy bajos de impurezas relacionadas con el producto, que resultan de la alteración celular, solubilización de cuerpos de inclusión y del replegamiento posterior.

Antecedentes de la invención

El uso de péptidos terapéuticos es un enfoque farmacéutico atractivo. Los péptidos terapéuticos a menudo presentan una potente actividad biológica y una alta especificidad, así como una buena penetración tisular debido a su pequeño tamaño. Sin embargo, muchos péptidos biológicamente activos tienen una semivida limitada debido a su rápida eliminación renal, que limita su exposición en el tejido diana y sus efectos farmacológicos. Por el contrario, la inmunoglobulina (IgG) presenta una semivida prolongada debido a su gran tamaño y a la unión dependiente del pH del receptor de Fc neonatal (FcRn) que rescata la IgG de la degradación (Pyzik et al. 2015).

Las proteínas de fusión Fc-péptido (pepticuerpos) combinan la actividad biológica de péptidos con la estabilidad de anticuerpos monoclonales. Para modificar estas proteínas de fusión Fc-péptido, se fusiona un péptido activo de alta afinidad en el marco con el dominio Fc de una IgG (Shimamoto et al. 2012). La integración del dominio Fc de IgG pretende prolongar la semivida a través de la protección de FcRn. El péptido de alta afinidad representa la región biológicamente activa y se modifica para maximizar su actividad. Las secuencias peptídicas se aíslan de bibliotecas de fagos o secuencias conocidas y se integran mediante técnicas de clonación recombinante. La mejora de la afinidad del péptido por su diana puede conseguirse mediante la duplicación de su secuencia, alteración de la secuencia peptídica o adición de espaciadores, restos o secuencias conectoras flanqueantes específicamente diseñadas. La orientación de la secuencia peptídica puede alterar su actividad, p. ej., los péptidos son más activos cuando se fusionan al extremo carboxi del dominio Fc en lugar del extremo amino (Shimamoto et al. 2012). La homodimerización de dos moléculas de Fc genera un mínimo de dos péptidos en un pepticuerpo, aumentando la avidez por su diana.

El pepticuerpo prototipo, romiplostim (Nplate®) fue aprobada para el tratamiento de la púrpura trombocitopénica inmune (ITP) por la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos (FDA) en 2008 y por la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) en 2009, respectivamente. Estructuralmente, romiplostim está compuesto por un peptidomimético de trombopoyetina (TPO) fusionado con el dominio Fc de IgG1. La TPO endógena es una hormona glicoproteínica producida en el hígado y la unión de la TPO a su receptor c-Mlp desencadena una cascada de señalización que regula la diferenciación y proliferación de megacariocitos en la médula ósea con un aumento simultáneo de plaquetas. La clonación y caracterización de la TPO a mediados de la década de 1990 condujo a la generación de una proteína recombinante glicosilada, de longitud completa, idéntica a la TPO endógena (rhTPO) y una proteína recombinante, truncada, pegilada, no glicosilada (PEG-rHuMGDF). El hallazgo de que PEG-rHuMGDF inducía anticuerpos de reacción cruzada, que neutralizaban la TPO endógena (Li et al. 2001) condujo al desarrollo de romiplostim. El componente peptídico de 14 aminoácidos de romiplostim se identificó del cribado de bibliotecas de fagos recombinantes de péptidos aleatorios que estimulan líneas celulares dependientes de TPO (Cwirla et al. 1997). La afinidad del péptido se optimizó por mutagénesis y adición de conectores flanqueantes. El péptido de romiplostim no comparte homología de secuencia con la TPO endógena minimizando el desarrollo de anticuerpos de reacción cruzada. Romiplostim es un homodímero compuesto por dos subunidades monocatenarias idénticas, cada subunidad consiste en dos repeticiones en tándem de la secuencia peptídica de unión a TPO separadas por un conector de ocho glicinas y fusionadas al extremo carboxi de un Fc de IgG 1 humana por otro conector de cinco glicinas. Romiplostim se produce mediante tecnología de ADN recombinante en E. coli. Al imitar la función de la TPO endógena romiplostim actúa como un agonista del receptor de TPO que activa las rutas transcripcionales intracelulares a través del receptor de TPO c-Mlp para aumentar la producción de plaquetas.

La sobreexpresión de polipéptidos recombinantes heterólogos en microorganismos transformados a menudo da como resultado la formación de los denominados cuerpos de inclusión (IB), que contienen la proteína recombinante en forma no nativa. Estos cuerpos de inclusión son agregados amorfos altamente refractarios y los polipéptidos en los mismos generalmente están desplegados, reducidos, inactivos y son al menos parcialmente insolubles en tampones acuosos comunes. Los procedimientos para obtener proteínas recombinantes a partir de cuerpos de inclusión están descritos en la técnica y generalmente comprenden la lisis y la alteración de las células seguido de centrifugación. El sedimento que comprende una gran proporción de cuerpos de inclusión normalmente se lava con detergentes para eliminar membranas lipídicas, lipopolisacáridos (LPS), otros restos celulares y otros contaminantes. La bibliografía científica proporciona muchos métodos para aislar y purificar cuerpos de inclusión y solubilizar y volver a plegar la proteína recombinante posteriormente a su estado nativo. (Los términos ''replegamiento'' y "renaturalización" se usan como sinónimos en el presente documento). Se pueden aplicar diferentes estrategias para solubilizar la proteína recombinante. Además de detergentes iónicos o no iónicos, tales como dodecilsulfato de sodio (SDS) o N-laurilsarcosina (sarcosil), se usan reactivos caotrópicos, tales como hidrocloruro de guanidina (GuHCl) o urea, para solubilizar una proteína de interés. A menudo, la solubilización se realiza en condiciones alcalinas (pH 8 a 12,5) en presencia de agentes reductores, tales como ditiotreitol (DTT), ditioeritrol (DTE) o 2-mercaptoetanol (ME) (Marston 1986, Rudolph 1990, Rudolph y Lilie 1996, Dietrich et al. 2003). Típicamente, la proteína solubilizada primero se reduce completamente y se inactiva, y después experimenta replegamiento antes de la purificación cromatográfica. Por ejemplo, el documento EP0219874 describe métodos genéricos para el replegamiento de proteínas recombinantes de cuerpos de inclusión de E. coli. Para la solubilización, se usaron los agentes caotrópicos GuHCl y arginina a pH alto. El documento EP0219874 describe la formación de puentes disulfuro en condiciones redox proporcionadas por GSH/GSSG. Rudolph (1990) describe la siguiente secuencia de etapas: a) el uso de GuHCl o urea para solubilización a pH 8-9 en condiciones reductoras (DTT, DTE o 2-ME), b) separación de reactivos por diálisis o cromatografía en gel (Sephadex G-25) y c) formación de disulfuro (= replegamiento) por sistemas de reordenamiento de óxido o por modificación química inversa de tioles de proteína, ambos basados en el efecto de GSH/GSSG añadidos. Rudolph y Lilie (1996) destacan los aditivos usados durante el replegamiento que pueden afectar a la solubilidad y estabilidad de la proteína no plegada, los productos intermedios de plegamiento y la proteína plegada nativa. Los autores sugieren un protocolo básico genérico para la solubilización y replegamiento: a) Solubilización con GuHCl 6 M y DTT 100 mM a pH 8, b) se separan los agentes reductores mediante diálisis y se ajusta el pH a 4,5 y c) se realiza el plegamiento mediante dilución alta (1:200) en un tampón con EDTA y GSH/GSSG a pH 7,5 a 8,5. Dietrich et al. (2003) describe la solubilización de proteínas de cuerpos de inclusión de E. coli con GuHCl 6 M en condiciones reductoras (DTE). La incubación de replegamiento se realizó a pH 9 en arginina 1 M en presencia de GSH/GSSG. La purificación final se realizó usando cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) seguido de cromatografía de intercambio catiónico (CEX) usando SP Sepharose. Una nota de aplicación disponible en GE Healthcare 2007 (Nota de aplicación 18-1112-33, 1-4) también revisaba los protocolos generales. La solubilización se recomienda con urea 8 M o GuHCl 6 M. El replegamiento se describe como diálisis lenta o dilución cerca de pH neutro. Alternativamente, se puede usar una etapa cromatográfica para el replegamiento. Los métodos cromatográficos sugeridos comprenden cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), cromatografía de intercambio iónico (IEX) y cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) que se sugiere en lugar de diálisis o dilución. La publicación internacional WO0002901 describe un método general para el replegamiento aplicando alta presión dentro de un tanque de replegamiento. Opcionalmente, están presentes agentes caotrópicos y/o compuestos redox (DTT/GSSG) en los tampones de replegamiento. La publicación internacional WO2011005488 Se refiere al replegamiento de proteínas de fusión con Fc con un tampón que contiene un desnaturalizante, tal como urea, dimetilurea u otros caótropos, un supresor de la agregación, tal como arginina, un estabilizante de proteínas, tal como glicerol o sacarosa, y un componente redox, tal como cisteína o cistamina. La publicación internacional WO2010151688 conecta el replegamiento y la purificación de proteínas de fusión con Fc. La proteína que contiene Fc se purifica directamente de la mezcla de replegamiento que comprende glicerol, guanidina, urea y arginina sin la necesidad de diluir el tampón de replegamiento antes de la aplicación a una matriz de separación, tal como cromatografía de afinidad de proteína A y cromatografía de intercambio catiónico, respectivamente.

En el caso de pepticuerpos, el replegamiento de los polipéptidos monoméricos reducidos requiere una oxidación del dímero. La parte Fc del pepticuerpo, que corresponde habitualmente a la parte Fc de IgG1 humana, consiste en dos cadenas unidas por dos puentes disulfuro. Además, los dominios CH2 y CH3 de la parte Fc poseen cada uno dos puentes disulfuro intracatenarios en cada cadena. En conjunto, el resto Fc comprende doce cisteínas. Un replegamiento satisfactorio de un pepticuerpo daría como resultado un resto Fc dimérico que tiene seis disulfuros en la posición correcta, dos puentes intercatenarios y cuatro intracatenarios (véase la Figura 1). Es evidente que el proceso de replegamiento también llevará varias especies incompletas, mal plegadas y no deseadas, como variantes de sulfuro, es decir, variantes con cisteínas no emparejadas, trisulfuros y variantes de sulfuro no emparejadas con puentes disulfuro en una configuración errónea. Estas impurezas relacionadas con el producto tienen que eliminarse durante la purificación posterior, junto con otras impurezas tales como impurezas relacionadas con el procedimiento, con el fin de producir un producto farmacéutico seguro y altamente puro para uso humano.

La selección de secuencias posteriores eficientes y económicas para la purificación de polipéptidos producidos por tecnología de ADN recombinante es una etapa crucial en el desarrollo de cada nuevo producto biofarmacéutico destinado para uso terapéutico. La composición generalmente compleja de la solución de replegamiento para polipéptidos recombinantes expresados en cuerpos de inclusión bacterianos establece altas demandas sobre la cromatografía de captura y sobre las cromatografías de pulido posteriores. Todo el procedimiento de fase posterior tiene que: (i) gestionar una masa de proteína elevada, (ii) eliminar eficazmente el aumento de impurezas relacionadas con el procedimiento y el producto a niveles por debajo de los criterios de aceptación definidos, (iii) mantener los rendimientos económicos, y (iv) asegurar una calidad suficiente del fármaco proteico. Normalmente, el procedimiento de fase posterior representa una parte principal de los costes totales de fabricación de una proteína recombinante terapéutica.

Las proteínas recombinantes replegadas derivadas de cuerpos de inclusión de microorganismos están asociadas típicamente con una alta carga de impurezas relacionadas con el procedimiento y el producto. Las impurezas relacionadas con el procedimiento son impurezas que proceden de las partes de fase anterior o fase posterior del procedimiento de fabricación y comprenden proteínas de la célula hospedante (HCP), ADN de la célula hospedante (HCADN), endotoxinas y diversos lixiviados de materiales del procedimiento. Las impurezas relacionadas con el producto, tales como variantes de sulfuro (formas reducidas, cisteína libre, emparejamientos erróneos de disulfuro), variantes cargadas, agregados, especies oxidadas (metionina, triptófano), especies desamidadas (asparagina), especies carbamiladas, especies truncadas (C- y N-terminales), monómeros y otras variantes de producto no deseadas son difíciles de analizar. Su eliminación es un gran desafío para el procedimiento de fase posterior. La presencia de cualquiera de estas impurezas es un riesgo potencial para la salud de los pacientes y, por lo tanto, su agotamiento en el producto final es un requisito de seguridad. Sólo se pueden tolerar cantidades residuales muy bajas.

El procedimiento clásico para purificar polipéptidos derivados de cuerpos de inclusión replegados sigue la secuencia de cromatografías de captura-intermedio-pulido, acompañadas de filtraciones y etapas de concentración o diálisis en diversas posiciones de la secuencia de fase posterior.

Una de las etapas de captura más frecuentes usadas para la purificación de moléculas que llevan Fc es la cromatografía de afinidad con proteína A o proteína G en la que la inmunoglobulina tiene que ser capturada de una muestra que comprende la Fc-proteína junto con impurezas. Este tipo de captura ofrece una selectividad excepcional para proteínas que llevan Fc, eliminando de este modo la mayoría de los contaminantes dando como resultado purezas tan altas como de 95% en una única etapa (Gagnon 1996). La Fc-proteína se separa de las impurezas debido a la unión selectiva del resto Fc a los ligandos de afinidad de la resina de cromatografía de captura, mientras que las impurezas no se unen a la resina y, por lo tanto, se obtienen en el flujo continuo, mientras que la Fc-proteína se obtiene en el eluato. Esta etapa de purificación eficaz es una de las ventajas que caracterizan al sistema de fusión de Fc.

Típicamente, un proceso de purificación de fase posterior para una proteína de fusión con Fc consiste en tres etapas de cromatografía que comienzan con una etapa de captura de Proteína A y seguida de dos etapas de cromatografía de pulido para la eliminación impurezas en trazas. Este esquema general del procedimiento es concordante con una plataforma común para anticuerpos monoclonales y proteínas de fusión con Fc en la industria biofarmacéutica (Fahrner et al. 2001, Shukla et al. 2008). Las etapas de cromatografía de pulido sirven para reducir las impurezas relacionadas con el procedimiento y relacionadas con el producto. En el caso de un sistema hospedante bacteriano utilizado para la producción de péptidos pequeños o de tamaño medio fusionados con Fc, los polipéptidos expresados de forma recombinante no están glicosilados. El oligosacárido unido a N del dominio Fc normalmente presente está ausente, dando como resultado una solubilidad limitada, una tendencia a agregarse y precipitar, y establece demandas más altas sobre la selección de cromatografías apropiadas y sus condiciones. Las cromatografías de pulido, que se usan comúnmente para la purificación de anticuerpos y proteínas de fusión con Fc, se seleccionan normalmente de cromatografía de intercambio aniónico y catiónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de modo mixto, cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de inducción de carga hidrófoba y cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (Gagnon 1996, Liu 2010).

Existen varios ejemplos en la bibliografía para la purificación de la proteína de fusión Fc-péptido romiplostim. Por ejemplo, Linderholm y Chamow (2014) se refieren a un esquema de purificación típico de la proteína de fusión Fc-péptido que incluye centrifugación/filtración para producir un líquido sobrenadante clarificado seguido de cromatografía de proteína A antes de pulir con etapas de cromatografía adicionales. Los retos en la purificación de la proteína de fusión Fc-péptido incluyen la optimización de las condiciones de elución para mantener la actividad biológica, reducción de la agregación de proteínas y la identificación de técnicas de pulido que permiten una alta pureza y rendimiento. Zhang et al. (2020) describen un procedimiento de purificación de intercambio catiónico y cromatografía hidrófoba para reducir primero las proteínas endógenas de la célula hospedante antes de la cromatografía de proteína A. Las publicaciones internacional WO0024770 y WO0024782 describen la purificación de un peptidomimético de Fc-TPO (Fc-TMP-TMP). Después de la solubilización de los cuerpos de inclusión con guanidina, T ris y DTT, la mezcla se diluyó con urea, T ris, arginina y cisteína. Durante la agitación de la mezcla, las subunidades monoméricas de Fc-TMP-TMP dimerizan para formar un compuesto unido por disulfuro. Después de eso, el peptidomimético de Fc-TPO precipitado con ácido se purificó en cromatografía de intercambio catiónico en modo de unión. Fayaz et al. (2016) describe la construcción de romiplostim, la expresión en E. coli y el análisis. Después del procedimiento de lisis, separación, desnaturalización y solubilización, los pepticuerpos se replegaron y purificaron mediante cromatografía de afinidad de proteína A-sefarosa. La publicación internacional WO2017168296 describe la purificación de una proteína de fusión con Fc usando una serie de etapas que comprenden Proteína A como etapa de captura, seguido de cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de interacción hidrófoba, antes de la cromatografía de intercambio catiónico como etapa de pulido final. El documento EP3436473 A1 describe un método para la purificación de una proteína de fusión Fc-péptido que difiere en la secuencia de las etapas de purificación y además no dice nada sobre el replegamiento del péptido de fusión con Fc. La publicación internacional WO 2020200980 A1 describe la purificación de una inmunoglobulina que comprende las etapas en el orden de captura de proteína A (unión-lavado-elución), cromatografía de intercambio catiónico (uniónelución) y cromatografía de modo mixto (unión-elución) y UF/DF. El documento no dice nada sobre la purificación de una proteína de fusión Fc-péptido replegada.

Sumario de la invención

La presente invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia que caiga fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos. La presente invención se refiere a nuevos métodos para la purificación de proteínas de fusión Fc-péptido recombinantes extraídas de cuerpos de inclusión y replegadas en moléculas homodiméricas biológicamente activas. Los métodos comprenden una secuencia de métodos cromatográficos que comprenden cromatografías de captura de afinidad, intermedia y pulido.

El problema clave de purificar proteínas de fusión Fc-péptido replegadas resultó ser la presencia de variantes de sulfuro, que tienen propiedades fisicoquímicas similares y comportamiento cromatográfico similar. Puesto que en un producto farmacéutico final estas impurezas relacionadas con el producto se toleran sólo a niveles muy bajos, tienen que agotarse durante el procedimiento de purificación. En particular, durante el proceso de replegamiento se forman altas cantidades de variantes de sulfuro. Por lo tanto, la presente invención desarrolló métodos que superan la copurificación de las variantes de sulfuro y otras impurezas. En particular, la invención proporciona métodos para la purificación de proteínas de fusión Fc-péptido recombinantes de impurezas sin pérdida significativa de la proteína de fusión Fc-péptido recombinante, es decir, durante el procedimiento de purificación se recupera un alto porcentaje de la proteína de fusión Fc-péptido recombinante plegada correctamente.

Para conseguir la alta pureza requerida de la proteína recombinante destinada a uso terapéutico, dos o más etapas de pulido cromatográfico siguen a la cromatografía de captura de afinidad.

Los métodos de la invención incluyen condiciones específicas y tampones seleccionados para evitar modificaciones secundarias no deseadas, tales como agregación, precipitación, oxidación, desamidación, truncamiento u otros tipos de degradación de las proteínas de fusión Fc-péptido. Los métodos tienen como objetivo la calidad farmacéutica disminuyendo las impurezas relacionadas con el producto, tales como variantes de sulfuro o variantes cargadas de las proteínas de fusión Fc-péptido en el producto final, que es una composición farmacéutica formulada o una composición farmacéutica de pre-etapa que contiene una proteína de fusión Fc-péptido de alta pureza. La formulación y concentración de proteína de fusión Fc-péptido deseada se posibilitan mediante una etapa final de diafiltración/ultrafiltración, que es también una parte de la secuencia de purificación inventada.

En un aspecto, la invención proporciona un método para la purificación de una proteína de fusión Fc-péptido replegada a partir de una composición que comprende la proteína de fusión Fc-péptido y al menos una impureza, comprendiendo el método las siguientes etapas en el siguiente orden:

a) realizar una cromatografía de captura de afinidad;

b) realizar una cromatografía de modo mixto;

c) realizar una cromatografía de intercambio catiónico; y

d) realizar una ultrafiltración/diafiltración;

en donde la proteína de fusión Fc-péptido deriva de cuerpos de inclusión de microorganismos; y en donde la al menos una impureza es una variante de sulfuro de la proteína de fusión Fc-péptido; y en donde las cromatografías a), b) y c) se realizan en modo de unión-elución, opcionalmente con una o más etapas de lavado.

La proteína de fusión Fc-péptido puede expresarse en microorganismos, preferiblemente en bacterias, más preferiblemente en E. coli.

En una realización, la proteína de fusión Fc-péptido replegada es una proteína de fusión Fc-péptido dimérica, no glicosilada. Puesto que la proteína de fusión Fc-péptido carece del patrón de glicosilación natural, su integridad estructural y solubilidad se reducen en comparación con proteínas de fusión Fc-péptido glicosiladas. Por lo tanto, el método de la invención supera en particular los problemas de purificación de proteínas de fusión Fc-péptido no glicosiladas mediante un método de purificación específico que permite recuperar la proteína de fusión Fc-péptido con rendimientos razonables mientras se eliminan impurezas, en particular variantes de sulfuro de la proteína de fusión Fc-péptido.

El dominio Fc fusionado puede derivar de inmunoglobulina humana, preferiblemente de IgG, más preferiblemente de IgG1.

La secuencia peptídica puede ser un agonista del receptor, preferiblemente un mimético de trombopoyetina. Por lo tanto, en una realización preferida, la proteína de fusión Fc-péptido es romiplostim. Romiplostim es un homodímero compuesto por dos subunidades monocatenarias idénticas. La secuencia de aminoácidos de romiplostim, en particular una cadena monomérica de romiplostim, se expone en la SEQ ID NO: 1:

MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVE

VHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ

VYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV

DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGIEGPTLRQWLAARAGGGGGGG

GIEGPTLRQWLAARA

Preferiblemente, los péptidos se fusionan en el extremo C-terminal de IgG1-Fc humana.

La longitud del péptido fusionado a la cadena Fc monomérica puede variar de 15 a 100 aminoácidos, preferiblemente de 25 a 70 aminoácidos, lo más preferiblemente de 30 a 50 aminoácidos.

Realizaciones específicas se refieren a un método para purificar una proteína de fusión Fc-péptido después de su expresión en cuerpos de inclusión de microorganismos, su solubilización y replegamiento, comprendiendo el método las siguientes etapas en el siguiente orden:

a) realizar una cromatografía de captura de proteína A, en donde la proteína de fusión Fc-péptido se eluye con un gradiente de pH decreciente;

b) realizar una cromatografía de modo mixto, en donde la proteína de fusión Fc-péptido se eluye con un gradiente de pH decreciente de un medio de cromatografía de modo mixto cargado positivamente;

c) realizar una cromatografía de intercambio catiónico; en donde la proteína de fusión Fc-péptido se eluye de un medio de intercambio catiónico fuerte, preferiblemente con grupos cargados -R-SO<3>-- unidos a una matriz polimérica hidrófila;

d) realizar una ultrafiltración/diafiltración.

La elución de la proteína A con un gradiente de pH decreciente ofrece la posibilidad de una acumulación selectiva de proteína de fusión Fc-péptido fuertemente unida y, por lo tanto, da como resultado una reducción de variantes que tienen propiedades de unión menos fuertes. Sorprendentemente, usando un modo de gradiente de pH decreciente de cromatografía, los dímeros de proteínas de fusión Fc-péptido se separan de la mayoría de los monómeros de proteína de fusión Fc-péptido.

Alternativamente, en lugar de un gradiente de pH, se puede usar un lavado por etapas de Proteína A con tampones de pH reducido. El pH de los tampones de lavado se tiene que seleccionar de una manera óptima para eluir monómeros mientras que los dímeros intactos permanecen unidos.

Debe mencionarse que la introducción de una etapa de captura de Proteína A da como resultado la contaminación de la proteína de fusión Fc-péptido con ligando lixiviado, es decir, Proteína A. Mediante la selección de una resina de Proteína A recombinante más robusta, tal como MabSelect SuRe, la lixiviación es bastante baja, es decir, 10-15 ppm. Sin embargo, las cromatografías posteriores tienen que eliminar la proteína A lixiviada. El tipo y modo seleccionados de la cromatografía de modo mixto intermedia de la etapa b) y la cromatografía de intercambio catiónico de la etapa c) dan como resultado un agotamiento eficaz de la Proteína A lixiviada a niveles no detectables (< 0,5 ppm).

El método proporciona muestras con una excelente pureza relativa alta. La pureza relativa después de la elución de la resina de captura de la etapa a) puede estar en el intervalo de 75 a 95 %, preferiblemente de 80 95 %, tal como de 81 a 94 %, definido como el porcentaje del pico principal en la cromatografía de ultra alto rendimiento en fase inversa (RP-UPLC). La pureza relativa después de la elución de la resina de modo mixto de la etapa b) puede ser de 90 % o más, preferiblemente de 93 % o más, más preferiblemente de 95 % o más, tal como de 95 % a 96 % definido como porcentaje del pico principal en RP-UPLC. La pureza relativa después de la elución de la cromatografía de intercambio catiónico de la etapa c) puede ser de 95 % o más, preferiblemente de 96 % o más, más preferiblemente de 97 % o más, definida como el porcentaje del pico principal en RP-UPLC. La pureza relativa se define como el porcentaje del pico principal en RP-UPLC.

El método de RP-HPLC se aplicó para determinar la pureza de la muestra y cuantificar las impurezas relacionadas con el producto. La técnica RP-UPLC se basa en la separación de moléculas según su polaridad. La separación se realizó en una columna C-4 con un gradiente de acetonitrilo/agua. Las diferentes moléculas eluyen a diferentes tiempos de retención debido a su diferente hidrofobicidad. La detección se basó en la absorción de UV. Las áreas de los picos individuales que representan impurezas relacionadas con el producto y la proteína de fusión Fc-péptido se determinan por integración y se representan como un porcentaje del área total del pico. La cuantificación del pico principal se basa en el área del pico con respecto a un patrón medido externamente.

En realizaciones específicas, la ultrafiltración/diafiltración de la etapa d) da como resultado una composición farmacéutica formulada o una composición de pre-etapa farmacéutica.

En una realización preferida, la composición farmacéutica formulada o composición de pre-etapa farmacéutica comprende la proteína de fusión Fc-péptido purificada, agua, un tampón y al menos un compuesto adicional seleccionado de un detergente, un estabilizante, una sal, un azúcar y un poliol.

En la realización más preferida, la composición de pre-etapa farmacéutica formulada se carga en viales de vidrio, se liofiliza y se sella. De este modo da como resultado la composición farmacéutica final.

Por lo tanto, un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para producir una proteína de fusión Fc-péptido en microorganismos en donde la proteína de fusión Fc-péptido está presente en cuerpos de inclusión;

1) Expresión de una proteína de fusión Fc-péptido en microorganismos en donde la proteína de fusión Fcpéptido está presente en cuerpos de inclusión;

2) Lisis de los microorganismos;

3) Sedimentación de los cuerpos de inclusión;

4) Solubilización de los cuerpos de inclusión;

5) Replegamiento de la proteína de fusión Fc-péptido presente en los cuerpos de inclusión;

6) Adaptación de la solución que contiene la proteína de fusión Fc-péptido replegada;

7) Purificación de la proteína de fusión Fc-péptido

a) realizar una cromatografía de captura de afinidad;

b) realizar una cromatografía de modo mixto;

c) realizar una cromatografía de intercambio catiónico; y

d) realizar una ultrafiltración/diafiltración;

y opcionalmente formular el péptido purificado en una composición farmacéutica;

en donde las cromatografías a), b) y c) se realizan en modo de unión-elución, opcionalmente con una o más etapas de lavado.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Estructura de un pepticuerpo.

Una estructura esquemática de una proteína de fusión Fc-péptido de ejemplo (pepticuerpo). El ejemplo es romiplostim, el prototipo de un pepticuerpo. El pepticuerpo de ejemplo es un homodímero compuesto por dos cadenas idénticas, consistiendo cada una en dos repeticiones en tándem de secuencias de unión al receptor que están separadas por un conector y fusionadas al extremo carboxi de Fc de IgG1 por otro conector. La molécula homodimérica comprende doce cisteínas, que forman dos puentes disulfuro intercatenarios y cuatro intracatenarios.

Figura 2: Esquema de procedimiento de fase posterior de una proteína de fusión Fc-péptido expresada en cuerpos de inclusión de bacterias.

Un esquema de procedimiento general que incluye la lisis de bacterias, la solubilización de la proteína de fusión Fc-péptido fuera de los cuerpos de inclusión, el replegamiento en la conformación estructural deseada, la purificación de la proteína de fusión Fc-péptido mediante una secuencia de tres cromatografías, y una etapa final de ultrafiltración/diafiltración.

Figura 3: Esquema de purificación de una proteína de fusión Fc-péptido replegada derivada de cuerpos de inclusión de bacterias.

Un esquema de procedimiento más detallado partiendo de la proteína de fusión Fc-péptido replegada. La cromatografía de captura de afinidad va seguida de una cromatografía de modo mixto intermedia y una cromatografía de intercambio catiónico final. Las tres cromatografías se realizan en modo de unión-elución y la proteína de fusión Fc-péptido se eluye mediante un cambio del pH en las tres cromatografías. Antes de la cromatografía de modo mixto intermedia, una etapa de acondicionamiento conduce a precipitación inducida por pH. La etapa final de ultrafiltración/diafiltración da como resultado una composición farmacéutica formulada o una composición de pre-etapa farmacéutica.

Figura 4: Esquema de purificación de una proteína de fusión Fc-péptido replegada, medios cromatográficos seleccionados y preparación de la composición farmacéutica final.

Esta figura describe los medios cromatográficos finalmente seleccionados y preferidos (Tabla 1) y comprende adicionalmente las etapas finales que conducen a una composición farmacéutica liofilizada. La composición de pre-etapa farmacéutica intermedia, designada como sustancia activa, se filtra y se liofiliza dando como resultado la composición farmacéutica final, designada como fármaco.

Figura 5: Pureza relativa de romiplostim a lo largo de todo el procedimiento de purificación.

La pureza relativa que se define como el pico principal (MP) en RP-UPLC de tres ciclos de purificación independientes que aumenta significativamente a lo largo de todo el procedimiento de purificación, comenzando con la etapa de replegamiento, seguido de la etapa de captura, etapa intermedia y etapa de pulido final.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona nuevos métodos para la purificación de proteínas de fusión Fc-péptido replegadas. En particular, proporciona nuevos métodos para obtener proteínas de fusión Fc-péptido activas con alta pureza, que permiten la producción industrial de una composición farmacéutica para uso humano.

Por lo tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un método para la purificación de una proteína de fusión Fc-péptido replegada a partir de una composición que comprende la proteína de fusión Fc-péptido y al menos una impureza, comprendiendo el método las siguientes etapas en el siguiente orden:

a) realizar una cromatografía de captura de afinidad en modo de unión-elución;

b) realizar una cromatografía de modo mixto en modo de unión-elución;

c) realizar una cromatografía de intercambio catiónico en modo de unión-elución; y

d) realizar una ultrafiltración/diafiltración;

en donde las cromatografías a), b) y c) se realizan opcionalmente con una o más etapas de lavado.

Como se usa en el presente documento, la expresión "proteína de fusión Fc-péptido replegada" se refiere a un polipéptido que comprende un péptido, fusionado mediante métodos de ingeniería genética al resto Fc de una inmunoglobulina, expresado de manera recombinante en microorganismos en forma insoluble o en una forma de solubilidad limitada, solubilizado y replegado mediante tratamiento redox en la conformación biológicamente activa. La expresión "proteína de fusión Fc-péptido replegada" se refiere a la proteína de fusión Fc-péptido plegada correctamente. La "proteína de fusión Fc-péptido replegada" no se expresa en células eucariotas, en particular no se expresa en células de mamífero. Típicamente, la "proteína de fusión Fc-péptido replegada" es un péptido de fusión con Fc no glicosilado. Contiene dos enlaces disulfuro intermoleculares y cuatro intramoleculares formados correctamente. Más particularmente, se refiere a una proteína de fusión Fc-péptido que contiene una configuración de sulfuros que consiste en los siguientes 6 enlaces disulfuro: los enlaces disulfuro que conectan la cisteína C206 y la cisteína C148 dentro de cada monómero, los enlaces disulfuro que conectan la cisteína C102 y la cisteína C42 dentro de cada monómero, el enlace disulfuro que conecta las dos cadenas de monómeros entre sí, cada una en su cisteína C10 y el enlace disulfuro que conecta las dos cadenas de monómeros entre sí, cada una en su cisteína C7.

"Fusión Fc-péptido" significa la fusión génica de un ADN que codifica un péptido diana al ADN que codifica el resto Fc, es decir, dominios CH2/CH3, de una inmunoglobulina, que expresa un único polipéptido.

El término "Fc" se refiere al dominio Fc, el fragmento cristalizable, de un anticuerpo. Preferiblemente, el término "Fc" se refiere al fragmento Fc de una inmunoglobulina IgG1.

El término "péptido" se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene menos de 500 aminoácidos, preferiblemente menos de 200 aminoácidos, tal como menos de 100 aminoácidos, menos de 50 aminoácidos, por ejemplo 41 aminoácidos.

En una realización específica, el péptido comprende al menos una secuencia de unión. Preferiblemente, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos que es un agonista de receptor, preferiblemente un mimético de un agonista de receptor de origen natural, más preferiblemente, un mimético de trombopoyetina, es decir, que tiene una secuencia de unión de TPO. En particular, el péptido comprende una repetición en tándem de la secuencia de unión de TPO, opcionalmente separada por un conector. En una realización específica, el péptido comprende la secuencia secuencia de unión de TPO - conector - secuencia de unión de TPO - conector, en donde el conector C-terminal se fusiona con la parte Fc de la proteína de fusión Fc-péptido.

Las expresiones "proteína de fusión Fc-péptido", "péptido de fusión con Fc", "proteína de fusión péptido-Fc" y "pepticuerpo" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a polipéptidos recombinantes modificados por fusión de un gen que codifica un péptido biológicamente activo en el marco con el gen que codifica un dominio Fc de una IgG, dando como resultado una quimera péptido-lgG(Fc) con estructura similar a anticuerpo. En particular, el dominio Fc que incluye el péptido se dimeriza, dando como resultado una estructura homodimérica de la proteína de fusión Fc-péptido. La expresión "proteína de fusión Fc-péptido" no incluye proteínas de longitud completa fusionadas a un dominio Fc.

Como se usa en el presente documento, la expresión "tratamiento redox" se refiere al proceso de replegado de la proteína de fusión monomérica Fc-péptido no plegada o parcialmente no plegada. La presencia de un sistema redox tal como glutatión red/ox (GSH/GSSG) o cisteína/cistina permite el intercambio tiol-disulfuro durante la etapa de replegamiento y promueve la formación de disulfuro. En el caso de proteínas de fusión Fcpéptido, el tratamiento redox debería dar como resultado la dimerización del monómero expresado principalmente (véanse los antecedentes de la invención).

T ratamientos adicionales de la proteína de fusión Fc-péptido replegada antes de la purificación mediante etapas cromatográficas pueden ser centrifugación, ultrafiltración, diafiltración, filtración profunda, microfiltración, dilución o ajuste del pH.

Como se usa en el presente documento, la expresión "composición de pre-etapa farmacéutica" se refiere a una composición farmacéutica, que experimenta adaptaciones adicionales para lograr la etapa de producto final. Estas adaptaciones pueden comprender filtración, dilución o concentración, ajuste del pH y/u osmolaridad, y liofilización. En una realización preferida, la composición de pre-etapa farmacéutica es activa formulado a granel almacenado congelado o líquido, que requiere solo filtración y división en partes alícuotas en los recipientes finales, tales como viales, jeringas, ampollas o cartuchos. En otra realización preferida, la composición de pre-etapa farmacéutica solo se esteriliza por filtración, se divide en partes alícuotas en los recipientes finales, es decir, viales de vidrio, después se liofiliza y se sellan.

El término "impureza" se refiere a cualquier material que sea diferente de la proteína de fusión Fc-péptido de interés. El término "impureza" incluye "impurezas relacionadas con el procedimiento" e "impurezas relacionadas con el producto". Las "impurezas relacionadas con el procedimiento" que derivan de las partes anteriores o posteriores del procedimiento de fabricación comprenden proteínas de la célula hospedante (HCP), ADN de la célula hospedante (HCADN), endotoxinas, virus, lípidos, ARN, diversos lixiviados de materiales del procedimiento, tales como proteína A lixiviada, componentes de medios de cultivo, desechos celulares y agregados y fragmentos de los mismos. "Impurezas relacionadas con el producto" comprenden variantes de sulfuro de la proteína de fusión Fc-péptido, p. ej., formas reducidas, cisteína libre y emparejamientos erróneos de disulfuro de variantes monoméricas y diméricas, además comprende variantes cargadas, agregados, especies oxidadas, especies desamidadas, especies carbamiladas, especies truncadas en el extremo C y N, monómeros y otras variantes de producto no deseadas de la proteína de fusión Fc-péptido. La expresión "impurezas relacionadas con el producto" se refiere particularmente a variantes de sulfuro de la proteína de fusión Fc-péptido.

En particular, la expresión "variante de sulfuro" se refiere a la proteína de fusión Fc-péptido que contiene una configuración de sulfuros que difiere en uno o varios enlaces disulfuro del grupo de 6 enlaces disulfuro que consiste en los enlaces disulfuro que conectan la cisteína C206 y cisteína C148 dentro de cada monómero, y los enlaces disulfuro que conectan la cisteína C102 y cisteína C42 dentro de cada monómero, el enlace disulfuro que conecta las dos cadenas de monómeros cada una en su cisteína C10 y el enlace disulfuro que conecta las dos cadenas de monómeros cada una en su cisteína C7.

La expresión "mal emparejado" se refiere a enlaces disulfuro incorrectamente emparejados. La expresión se refiere a modificaciones de los enlaces disulfuro intercatenarios e intracatenarios de la proteína de fusión Fcpéptido, particularmente se refiere a modificaciones de enlaces disulfuro en las variantes monoméricas y diméricas de la proteína de fusión Fc-péptido. Las expresiones "cisterna libre", "disulfuro abierto", "enlace disulfuro abierto" o "puente disulfuro abierto" se refieren a una oxidación incorrecta de cisteína. La expresión "enlace disulfuro" se refiere a un grupo funcional con la estructura R-S-S-R y la unión se denomina puente disulfuro que normalmente deriva de dos grupos tiol en dos restos cisteína. En una realización específica, la expresión "impurezas relacionadas con el producto" se refiere a monómeros y dímeros de la proteína de fusión Fc-péptido con enlaces disulfuro abiertos.

El término "precipitación" se refiere a impurezas, que son no solubles o tienen una solubilidad limitada, y/o están en un estado no soluble. Las precipitaciones pueden conducir a soluciones de muestra turbias.

Como se usa en el presente documento, la expresión "medios de cromatografía" o "medio de cromatografía" debe entenderse como un material o medios de cromatografía en forma de perlas, placas, cristales, monolitos, membranas, fibras, malla de fibras o cualquier otra fase sólida. Los "medios" llevan grupos funcionales denominados "ligandos" unidos a una cadena principal, directamente o a través de un espaciador, denominado "matriz". Una excepción son las resinas de cromatografía en gel para la cromatografía de exclusión por tamaño que típicamente no tienen ningún ligando unido. El término "medios" no limita los métodos de la invención a sólo cromatografía en columna que emplea resinas cromatográficas sino que también incluye otros tipos de cromatografía, por ejemplo cromatografía de membrana que emplea adsorbentes de membrana. En particular, en la cromatografía de intercambio iónico, la invención comprende tanto una resina de cromatografía de intercambio iónico como un adsorbente de membrana de cromatografía de intercambio iónico.

"Resina" significa cualquier material o medio cromatográfico en forma de perlas que comprende una matriz con un grupo funcional unido (ligando) que puede interaccionar con la proteína o al menos un contaminante. Una excepción son las resinas de cromatografía en gel para la cromatografía de exclusión por tamaño que típicamente no tienen ningún ligando unido. Las resinas pueden suministrarse como perlas de diferentes tamaños y empaquetadas en columnas. Alternativamente, se pueden utilizar columnas preempaquetadas.

Por el término "matriz" o "fase sólida" se entiende una matriz no acuosa, no soluble a la que se puede adherir el ligando. La matriz de interés en el presente documento es generalmente una que comprende vidrio, material cerámico, sílice, celulosa, agarosa, polímero de metacrilato o poliestireno.

Por "ligando" se entiende cualquier grupo funcional, que interacciona con la proteína de fusión Fc-péptido o con al menos un contaminante y que está unido covalentemente a la matriz.

La expresión "modo de unión" o "modo de unión y elución" se refiere a condiciones de cromatografía en las que una muestra que contiene la proteína de fusión Fc-péptido que se va a purificar se aplica a un medio de cromatografía, en donde la proteína de fusión Fc-péptido se une al medio de cromatografía. Por lo tanto, la proteína de fusión Fc-péptido es retenida en el medio de cromatografía, mientras que las impurezas de la muestra pueden estar presentes en la fracción que no se une, también denominada fracción de flujo continuo. Cuando se lleva a cabo una etapa de cromatografía en el modo de unión, se pueden realizar una o más etapas de lavado después de la unión de la proteína de fusión Fc-péptido al medio de cromatografía y antes de eluir la proteína de fusión Fc-péptido del medio. Para obtener la proteína de fusión Fc-péptido, la proteína de fusión Fc-péptido luego se eluye y se obtiene en el eluato, que luego puede purificarse adicionalmente en una etapa cromatográfica adicional, si se desea. La elución de la proteína de fusión Fc-péptido puede realizarse usando condiciones selectivas que permitan que los contaminantes permanezcan unidos al medio mientras se eluye la proteína de fusión Fc-péptido.

Realizar una etapa de cromatografía en el "modo de unión" no significa necesariamente que se una el 100 % de la proteína de fusión Fc-péptido. En el contexto de la presente invención "unido a la resina de cromatografía" o "unido al medio de cromatografía" significa que al menos 50 % de la proteína de fusión Fc-péptido está unida, preferiblemente al menos 75 % de la proteína de fusión Fc-péptido está unida, más preferiblemente al menos 85 % de la proteína de fusión Fc-péptido está unida, y lo más preferiblemente más de 95 % de la proteína de fusión Fc-péptido está unida a la resina o medio.

En el contexto de la presente invención, se entiende que la etapa de cromatografía de captura de afinidad, la etapa de cromatografía de modo mixto intermedia y la etapa de cromatografía de intercambio catiónico de pulido se realizan todas en el modo de unión, en donde la etapa de captura se considera la primera etapa de cromatografía, que se realiza en el modo de unión. Alternativamente, la etapa de cromatografía de intercambio catiónico de pulido final de la invención puede realizarse dos veces en serie, en donde las dos cromatografías se realizan con el mismo medio de cromatografía en un modo de unión-elución, y en donde las dos cromatografías se realizan en condiciones diferentes, opcionalmente con una o más etapas de lavado.

En una realización preferida, las proteínas de fusión Fc-péptido unidas de la primera cromatografía de intercambio catiónico se eluyen mediante aumento del valor de pH, y las proteínas de fusión Fc-péptido unidas de la segunda cromatografía de intercambio catiónico se eluyen mediante aumento de la fuerza iónica. Se entiende además que la segunda cromatografía de intercambio catiónico es opcional y una secuencia de solo tres cromatografías es la más preferida, es decir, la cromatografía de afinidad, cromatografía de modo mixto y cromatografía de intercambio catiónico darán como resultado una pureza suficiente en la mayoría de los casos. En la realización más preferida, la elución de la proteína de fusión Fc-péptido unida se realiza mediante un gradiente de pH o etapa de pH en las tres cromatografías.

La expresión "modo de flujo continuo" se refiere a condiciones de cromatografía en donde una muestra que contiene la proteína de fusión Fc-péptido de interés se aplica a la resina o medio de cromatografía, en donde la proteína de fusión Fc-péptido no se une a la resina de cromatografía sino que está presente principalmente en la fracción que no está unida a la resina o medio y, por lo tanto, está contenida en el flujo continuo. Las cromatografías desarrolladas de la presente invención no hacen uso del modo de flujo continuo. Sin embargo, los métodos de la presente invención pueden complementarse mediante cromatografías intermedias o de pulido adicionales en un modo de flujo continuo. Las impurezas pueden unirse a la resina o medio en este modo.

Como etapas intermedias o de pulido adicionales, también se pueden emplear otros tipos de cromatografía. Por ejemplo, la cromatografía en columna de intercambio aniónico y la cromatografía en membrana de intercambio aniónico pueden emplearse como etapa intermedia o de pulido, lo más preferido en modo de flujo continuo. Otra posibilidad es aplicar cromatografía de hidroxiapatita, en particular cromatografía de hidroxiapatita cerámica en modo de unión.

La "etapa de lavar" o "etapa de lavado" es una etapa realizada en una cromatografía en modo de unión, después de que la proteína de fusión Fc-péptido se cargue en la columna de cromatografía, pero antes de que la proteína de fusión Fc-péptido se eluya de la columna. La etapa de lavado elimina adicionalmente los contaminantes unidos menos fuertemente o no específicamente a la matriz, a la proteína de fusión Fc-péptido y/o al ligando, sin eluir significativamente la proteína de fusión Fc-péptido de la resina. En la etapa de lavado, la resina se lava con el tampón de lavado deseado (p. ej., el tampón de lavado se pasa a través de la columna de cromatografía hasta que la absorción UV medida en la salida de la columna vuelve al valor inicial). Durante las etapas de lavado, la proteína de interés permanece unida al medio de cromatografía.

El término "elución" se entiende como un procedimiento, que desorbe una proteína de interés de un medio de cromatografía alterando las condiciones de la solución de manera que los componentes del tampón compitan con la proteína de interés por el sitio del ligando en la resina de cromatografía. Otro modo de elución ocurre en la cromatografía de afinidad, por ejemplo utilizando la Proteína A. En este caso, el tampón de elución puede alterar la conformación del ligando o la proteína de fusión Fc-péptido, aflojando así la unión. Una proteína de fusión Fc-péptido puede eluirse de las resinas de intercambio iónico alterando la fuerza iónica del tampón que rodea al material de intercambio iónico de manera que los iones del tampón en la fase móvil compitan con la molécula por los sitios iónicos cargados de la resina de intercambio iónico. Alternativamente, un cambio en el pH influye en la proteína anfótera y un aumento del pH por encima del pI de la proteína impide en lo sucesivo su unión a una resina de intercambio catiónico y la proteína eluye. El mismo efecto ocurre en una resina de cromatografía de intercambio aniónico cuando el pH disminuye por debajo del pI de la proteína. Como se entiende en el presente documento, el término "elución" comprende elución isocrática, elución de una sola etapa y elución en gradiente, con o sin etapas de lavado anteriores. La elución de la proteína de fusión Fcpéptido puede llevarse a cabo aumentando la fuerza iónica o conductividad en la fase móvil, lo que se ve afectado por el aumento de la concentración de sal en la solución tampón. Alternativamente, puede ser adecuado un aumento o disminución en el valor de pH. Se pueden emplear gradientes escalonados discontinuos, gradientes lineales, gradientes no lineales o una combinación adecuada de dichos gradientes.

Los tampones adecuados para el lavado y para la elución pueden seleccionarse de acetato, citrato, succinato, maleato, malonato, Tris-HCl, ácido tris-fosfórico, tris-acetato, tris-glicina, fosfato, succinato, MES, MOPS, PIPES, PHEPES, etanolamina, bistris, glicina, histidina y otros tampones adecuados con la adición de sales tales como fosfatos, sulfatos o cloruros, tales como NaCl o KCl. La fuerza iónica y la concentración de sal, por medio de las cuales se logra la elución, dependen del valor de pH de la solución tampón y el pI de la proteína de fusión Fc-péptido. El tampón de lavado puede comprender además un detergente (p. ej., polisorbato), un disolvente (p. ej., hexilenglicol, isopropanol o etanol) o un polímero (p. ej., polietilenglicol). Además, el tampón de lavado puede incluir reactivos caotrópicos (p. ej., urea o arginina) y/o inhibidores de proteasas (p. ej., EDTA).

Como se usa en el presente documento, el término "tampón" se refiere a una solución que resiste cambios en el pH por la acción de componentes conjugados ácido-base.

El método de la invención puede usarse para la purificación de proteínas de fusión Fc-péptido a pequeña y gran escala. Preferiblemente, el método se lleva a cabo a gran escala.

"Pequeña escala", también denominada "escala de laboratorio", se refiere a la purificación de muestras que contienen menos de 5 g de proteína de fusión Fc-péptido, menos de 2,5 g de proteína de fusión Fc-péptido o menos de 1 g de proteína de fusión Fc-péptido. "Pequeña escala" también se refiere a procedimientos de purificación en donde la proteína eluida de la columna de la etapa de captura asciende a menos de 5 g de proteína de fusión Fc-péptido, menos de 2,5 g de proteína de fusión Fc-péptido o menos de 1 g de proteína de fusión Fc-péptido.

"Gran escala", también denominada "escala de producción" o "escala de fabricación" o "escala comercial", se refiere a la purificación de muestras que contienen más de 5 g de proteína de fusión Fc-péptido, más de 20 g de proteína de fusión Fc-péptido, más de 50 g de proteína de fusión Fc-péptido o más de 100 g de proteína de fusión Fc-péptido. "Gran escala" también se refiere a procedimientos de purificación en donde la proteína eluida de la columna de la etapa de captura asciende a más de 5 g de proteína de fusión Fc-péptido, más de 20 g de proteína de fusión Fc-péptido, más de 50 g de proteína de fusión Fc-péptido o más de 100 g de proteína de fusión Fc-péptido.

Las cromatografías de las etapas a), b) y c) pueden eluirse con un gradiente de pH o una etapa de pH. Preferiblemente, el gradiente de pH es un gradiente de pH lineal.

Expresión y replegamiento

La presente invención no depende de métodos específicos para la expresión y replegamiento de proteínas de fusión Fc-péptido. Sin embargo, se podrían aplicar las siguientes características generales, que no son obligatorias:

- Expresión en microorganismos, preferiblemente en bacterias, más preferiblemente en E. coli

- Expresión en forma insoluble o formas de solubilidad limitada, preferiblemente dentro de microorganismos, más preferiblemente dentro de cuerpos de inclusión

- Cosecha de microorganismos, preferiblemente por centrifugación

- Lisis de microorganismos, preferiblemente por medios mecánicos

- Sedimentación del material insoluble, preferiblemente aislamiento y lavado de cuerpos de inclusión

- Solubilización con métodos adecuados, preferiblemente con agentes químicos, lo más preferiblemente con agentes caotrópicos en condiciones reductoras

- Incubación de replegamiento, preferiblemente a pH alto y con compuestos redox, más preferiblemente los compuestos redox son pares redox sulfhidrilo

- Adaptación de la solución replegada antes de la cromatografía de captura de afinidad, preferiblemente por filtración, ajuste del pH y dilución

En los experimentos que condujeron a la presente invención se observó que las soluciones de replegamiento de proteínas de fusión Fc-péptido contenían varias variantes de producto diferentes junto con la proteína de fusión Fc-péptido de interés que se iba a purificar que se unían a la resina de captura de afinidad. En particular, diversas variantes de sulfuro de la proteína de fusión Fc-péptido resultaron ser las impurezas más difíciles de agotar durante el procedimiento de purificación y también en el análisis estructural. La presente invención proporciona una solución de cómo reducir estas impurezas en el producto final.

Preferiblemente, el pH de la composición que comprende la proteína de fusión Fc-péptido y al menos una impureza se ajusta a un pH en el intervalo de 4 a 6, preferiblemente de 4,5 a 5,5, más preferiblemente 5.

Etapa de cromatografía de captura: cromatografía de afinidad

La expresión "etapa de captura" se entiende como la primera etapa de cromatografía llevada a cabo en el modo de unión. La etapa de captura para la purificación de una proteína de fusión Fc-péptido o una inmunoglobulina se lleva a cabo normalmente como una etapa de cromatografía de afinidad. La proteína A o derivados o análogos de la misma se usan principalmente como captura de afinidad. Según la presente invención, la cromatografía de afinidad se usó con éxito para capturar proteínas de fusión Fc-péptido. La expresión "cromatografía de afinidad" para esta invención significa un método de unión selectiva del resto Fc de la solución replegada basado en una interacción altamente específica entre un ligando y el resto Fc.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cromatografía de afinidad de proteína A" se refiere a cromatografía de afinidad que emplea como ligandos proteínas naturales o recombinantes de origen microbiano (p. ej., Staphylococcus aureus, Streptococcus, Peptostreptococcus magnus) o variantes derivadas de las mismas, o péptidos sintéticos que pueden ser de origen microbiano con la capacidad de unirse a restos Fc de inmunoglobulinas. Las proteínas de unión a inmunoglobulina de ejemplo pueden ser Proteína A, Proteína G, Proteína L o Proteína A/G. Preferiblemente, la proteína o péptido de unión a inmunoglobulina-Fc es Proteína A. Los ligandos pueden comprender uno o más de los dominios E, D, A, B y C de Proteína A. Más preferiblemente, los ligandos comprenden el dominio B de proteína A o la proteína Z modificada. Una resina de ejemplo que emplea como ligando un péptido de 14 kDa producido recombinantemente con Saccharomyces cerevisiae es IgSelect (GE Healthcare). Este ligando se diseñó específicamente para alta afinidad por todas las subclases de IgG-Fc humana. Usando una etapa de cromatografía de afinidad de Proteína A como la etapa de captura después del replegamiento de proteínas de fusión Fc-péptido, el método aprovecha la especificidad de unión significativa de la cromatografía de afinidad de Proteína A en la purificación de inmunoglobulinas.

En una realización preferida, la resina de cromatografía de Proteína A usada para la etapa de captura comprende un derivado de Proteína A tolerante a álcali como ligando, unido a agarosa altamente reticulada. En una realización más preferida, el derivado de Proteína A tolerante a álcali es una variante tetramérica estabilizada para álcali del dominio B de Proteína A.

Con el fin de hacer la resina de cromatografía de afinidad de Proteína A más resistente a condiciones de limpieza duras y para proporcionar protección contra efectos de contaminación cruzada entre ejecuciones, es común hoy en día usar resinas de afinidad de Proteína A mejoradas, que llevan ligandos especialmente diseñados para garantizar tolerancia al álcali, alta capacidad de unión y baja fuga de ligando. Un inconveniente principal de estas resinas mejoradas es, sin embargo, que son significativamente más costosas que las resinas de proteína A convencionales. Es una ventaja importante del método de la presente invención que se puedan usar tanto resinas convencionales de Proteína A como los productos más recientes de resina de Proteína A de nueva generación.

Los ejemplos de resinas de Proteína A comunes que se pueden usar para el propósito de la invención pueden incluir, pero no se limitan a, Unospher SUPrA (Bio-Rad), Proteína A Cerámica HyperD F (Pall Corporation), Poros MabCapture A (Applied Biosystems), ProSep HC, ProSep Ultra y ProSep Ultra Plus (EMD Millipore), Proteína A Sepharose FF, rProteína A Sepharose FF, rmp Proteína A Sepharose FF, MabSelect, MabSelect SuRe, MabSelect SuRe LX, MabSelect Xtra, MabSelect PrismA (GE Healthcare), y rProteína A de Toyopearl (Tosoh Bioscience).

Cuando se usa en el presente documento, el término "Proteína A" abarca la Proteína A recuperada de una fuente nativa de la misma, Proteína A producida sintética o biosintéticamente (p. ej., por síntesis de péptidos o por técnicas recombinantes), y variantes de la misma que conservan la capacidad de unirse a proteínas que tienen regiones CH2/CH3 y/o Fc. Preferiblemente, se pueden usar resinas con alta capacidad de unión y/o estabilidad alcalina. Por ejemplo, se puede usar proteína A, derivado de proteína A o medio de afinidad derivado de proteína A estabilizada para álcali. Preferiblemente, se pueden usar ligandos derivados de Proteína A (E. coli) estabilizados para álcali. El ligando derivado de proteína A estabilizado para álcali puede acoplarse a una matriz de agarosa altamente reticulada, preferiblemente inmovilizada con un enlace tioéter químicamente estable. Un ejemplo es MabSelect SuRe de GE Healthcare Life Sciences, que puede limpiarse rápida y eficazmente después de la ejecución con NaOH hasta 0,5 M. El ligando estabilizado para álcali de MabSelect SuRe deriva del dominio B de la proteína A y carece esencialmente del dominio de unión a VH3 proporcionando un pH de elución más alto. Un producto preferido es MabSelect SuRe LX que tiene una capacidad de unión mayor que MabSelect SuRe.

En una realización preferida, el tampón equilibrado de Proteína A contiene al menos un agente caotrópico seleccionado del grupo que consiste en arginina y urea. El tampón equilibrado más preferido es etanolamina que incluye arginina y urea. El pH de partida preferido es aproximadamente pH de 4,5 a 7, más preferiblemente aproximadamente pH de 5 a 6, lo más preferiblemente aproximadamente pH 5.

Se pueden incluir una o varias etapas de lavado entre la carga de muestra en la columna de afinidad de Proteína A y la elución de la proteína de fusión Fc-péptido de la columna de Proteína A empleando tampón(es) de lavado especial(es). El tampón de lavado es el tampón usado para eliminar impurezas de la resina de Proteína A sin eliminar cantidades significativas de la proteína de fusión Fc-péptido de interés unida a la Proteína A. El tampón de lavado puede comprender sal y detergente (p. ej., polisorbato); sal y disolvente (p. ej., hexilenglicol); sal en alta concentración (p. ej., tampón Tris de alta molaridad); o sal y polímero (p. ej., polietilenglicol). Además, el tampón de lavado puede incluir reactivos caotrópicos (p. ej., urea o arginina) y/o inhibidores de proteasas (p. ej., EDTA). Finalmente, el tampón de lavado puede tener un pH más bajo que el tampón de carga y/o un pH más alto que el tampón de elución.

Un tampón de lavado preferido para la proteína A es etanolamina con arginina y urea. El pH preferido es aproximadamente pH de 4,5 a 7, más preferiblemente aproximadamente pH de 5 a 6, lo más preferiblemente aproximadamente pH 5.

Para la elución de la proteína de fusión Fc-péptido de interés de la columna de Proteína A se aplica un tampón de elución. Preferiblemente, el tampón de elución tiene un pH bajo y, por lo tanto, altera las interacciones entre la proteína A y la proteína de fusión Fc-péptido de interés cambiando la conformación de la proteína. Preferiblemente, el tampón de elución de pH bajo tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, lo más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 4. Los ejemplos de tampones que controlarán el pH dentro de este intervalo incluyen tampones de fosfato, acetato, citrato, glicina y amonio, así como combinaciones de estos.

Preferiblemente, el tampón de elución de la etapa de captura, p. ej., la cromatografía de proteína A, contiene urea. La concentración de la urea en el tampón de elución puede ser de aproximadamente 0,1 M o más, tal como aproximadamente 0,3 M o más, preferiblemente 0,5 M o más. En algunas realizaciones, la concentración de la urea en el tampón de elución está en el intervalo de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 3 M, preferiblemente en el intervalo de 0,3 M a 2 M, más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1 M, lo más preferiblemente la concentración de la urea en el tampón de elución es de aproximadamente 0,5 M.

Los tampones preferidos son tampones citrato y acetato. Se contemplan otros tampones de elución, incluyendo tampones de pH alto (p. ej., los que tienen un pH de 9 o más) o tampones que comprenden un compuesto o composición tal como MgCl<2>(2 mM) para eluir la proteína de fusión Fc-péptido de interés. El tampón puede tener una concentración de citrato (tal como citrato de sodio) de 20 mM a 200 mM, preferiblemente de 50 mM a 150 mM de citrato, lo más preferiblemente de 100 mM.

Un tampón de elución de Proteína A preferido para la elución por etapas es citrato de sodio con urea a pH de 3 a 4.

Un método de elución de Proteína A más preferido es la elución en gradiente con un gradiente de pH decreciente. Típicamente, el gradiente es un gradiente lineal. La elución en gradiente se puede realizar con citrato de sodio con urea. El gradiente de pH puede comenzar a aproximadamente pH 5,5 y puede finalizar a aproximadamente pH 2,5. El gradiente puede generarse mezclando dos tampones (p. ej., comenzando con 100% de tampón A que tiene un pH de aproximadamente 5,5 y mezclando en él el tampón B que tiene un pH de aproximadamente 2,5 hasta que se alcanza 100% de tampón B). El tampón A y el tampón B pueden contener ácido cítrico con urea. La elución con gradiente de pH lineal decreciente puede comprender dos o más, preferiblemente tres segmentos. Por ejemplo, en el segmento (i) en 1 a 3 volúmenes de columna, preferiblemente en 1 volumen de columna, el porcentaje de tampón B se eleva de 0% a un contenido en el intervalo de aproximadamente 20% a aproximadamente 50%, preferiblemente de aproximadamente 30% a aproximadamente 40%, tal como 37%, en el segmento (ii) el tampón B se eleva adicionalmente en 5 a 20 CV, preferiblemente 10 a 15 CV, tal como 13,8 CV, hasta un contenido en el intervalo de aproximadamente 60% a aproximadamente 95%, preferiblemente de aproximadamente 70% a aproximadamente 80%, tal como aproximadamente 75% y en el segmento (iii) el tampón B se eleva en 1 a 3 CV, preferiblemente 1 CV hasta un contenido final de aproximadamente 90% o más, preferiblemente aproximadamente 95% o más, más preferiblemente aproximadamente 100%. En una realización adicional, la elución con gradiente de pH lineal decreciente puede comprender tres o más, preferiblemente cuatro segmentos. Por ejemplo, en el segmento (i) el tampón B se eleva en 0,01 a 0,5 volúmenes de columna, preferiblemente en 0,1 volúmenes de columna, el porcentaje de tampón B se eleva de 0% a un contenido en el intervalo de aproximadamente 10% a aproximadamente 20%, tal como 17%, en el segmento (ii) el tampón B se eleva en 1 a 3 volúmenes de columna, preferiblemente en 1 volumen de columna, el porcentaje de tampón B se eleva de 0% a un contenido en el intervalo de aproximadamente 20% a aproximadamente 50%, preferiblemente de aproximadamente 30% a aproximadamente 40%, tal como 37%, en el segmento (iii) el tampón B se eleva adicionalmente en 5 a 20 CV, preferiblemente 10 a 15 CV, tal como 13,8 CV, a un contenido en el intervalo de aproximadamente 60% a aproximadamente 95%, preferiblemente de aproximadamente 70% a aproximadamente 80%, tal como aproximadamente 75% y en el segmento (iv) el tampón B se eleva en 0,1 a 1 CV, preferiblemente 0,5 CV a un contenido final de aproximadamente 90% o más, preferiblemente aproximadamente 95% o más, más preferiblemente aproximadamente 100%.

El eluato de Proteína A se recoge directamente en un tampón estabilizante. Preferiblemente, el eluato de la cromatografía de Proteína A se diluye en línea con agitación en un tampón estabilizante que comprende D-manitol, sacarosa, L-histidina, Tween 20, pH 5,0. Preferiblemente, el eluato de la cromatografía de Proteína A se diluye a una concentración final de proteína de aproximadamente 0,5 a 3 mg/ml, preferiblemente a aproximadamente 1,5 a 2,5 mg/ml, tal como a aproximadamente 1,8 mg/ml.

Por lo tanto, una realización específica se refiere a un método para la purificación de una proteína de fusión Fc-péptido replegada de una composición que comprende la proteína de fusión Fc-péptido y al menos una impureza, comprendiendo el método las siguientes etapas en el siguiente orden:

a) realizar una cromatografía de captura de afinidad en modo de unión-elución; y

b) realizar una cromatografía de modo mixto en modo de unión-elución; y

c) realizar una cromatografía de intercambio catiónico en modo de unión-elución; y

d) realizar una ultrafiltración/diafiltración; y

en donde las cromatografías a), b) y c) se realizan opcionalmente con una o más etapas de lavado, y en donde la proteína de fusión Fc-péptido se eluye del medio de cromatografía de afinidad de la etapa a) con un gradiente de pH decreciente.

En una realización preferida, la invención se refiere a un método para la purificación de una proteína de fusión Fc-péptido replegada de una composición que comprende la proteína de fusión Fc-péptido y al menos una impureza, comprendiendo el método las siguientes etapas en el siguiente orden:

a) realizar una cromatografía de captura de proteína A en modo de unión-elución; y

b) realizar una cromatografía de modo mixto en modo de unión-elución; y

c) realizar una cromatografía de intercambio catiónico en modo de unión-elución; y

d) realizar una ultrafiltración/diafiltración; y

en donde las cromatografías a), b) y c) se realizan opcionalmente con una o más etapas de lavado, y en donde al menos un tampón usado para la cromatografía de proteína A de la etapa a) incluye urea; y en donde la proteína de fusión Fc-péptido se eluye del medio de cromatografía de Proteína A de la etapa a) con un gradiente de pH decreciente; y

en donde el medio de cromatografía de proteína A de la etapa a) comprende un derivado de proteína A tolerante a álcali como ligando, preferiblemente una variante tetramérica estabilizada frente a álcali del dominio B de proteína A unido a una matriz de agarosa reticulada.

En una realización específica, la invención se refiere a un método para la purificación de una proteína de fusión Fc-péptido replegada de una composición que comprende la proteína de fusión Fc-péptido y al menos una impureza, comprendiendo el método las siguientes etapas en el siguiente orden:

a) realizar una cromatografía de captura de proteína A en modo de unión-elución, en donde el eluato se recoge en un tampón estabilizante; y

b) realizar una cromatografía de modo mixto en modo de unión-elución; y

c) realizar una cromatografía de intercambio catiónico en modo de unión-elución; y

d) realizar una ultrafiltración/diafiltración; y

en donde las cromatografías a), b) y c) se realizan opcionalmente con una o más etapas de lavado, y en donde al menos uno del tampón de lavado y el de elución usado en la cromatografía de proteína A de la etapa a) incluye urea; y

en donde la proteína de fusión Fc-péptido se eluye del medio de cromatografía de Proteína A de la etapa a) con un gradiente de pH decreciente; y

en donde el medio de cromatografía de proteína A de la etapa a) comprende un derivado de proteína A tolerante a álcali como ligando, preferiblemente una variante tetramérica estabilizada frente a álcali del dominio B de proteína A unido a una matriz de agarosa reticulada,

en donde el tampón estabilizante de la etapa a) comprende D-manitol, sacarosa, L-histidina, Tween 20, pH 5,0. Etapa de cromatografía intermedia: cromatografía de modo mixto

El método de la invención comprende además una etapa de cromatografía de modo mixto como etapa intermedia, es decir, se lleva a cabo en la secuencia posterior después de la cromatografía de afinidad. Los medios denominados medios o resinas de modo mixto son medios cromatográficos que poseen grupos funcionales que consisten en ligandos de intercambio iónico hidrófobos cargados o minerales cristalinos tales como hidroxiapatita o fluorapatita. En lugar de "cromatografía de modo mixto" se usa a veces la expresión "cromatografía multimodal" o en relación con un procedimiento específico "cromatografía de inducción de carga hidrófoba". La cromatografía de modo mixto es una interacción de al menos dos principios, interacción hidrófoba e interacción de intercambio iónico o por afinidad metálica e intercambio iónico. La cromatografía de modo mixto proporciona una selectividad menos predecible que no puede reproducirse mediante un método de cromatografía de modo único, tal como cromatografía de intercambio iónico o de interacción hidrófoba, respectivamente. Los ligandos hidrófobos cargados positivamente pertenecen al grupo de modo mixto de intercambiador aniónico (por ejemplo CaptoAdhere), y los ligandos cargados negativamente pertenecen al modo mixto de intercambiador catiónico (por ejemplo Capto MMC). Algunos medios de modo mixto tienen carácter de ion híbrido (por ejemplo Bakerbond ABx). Otros medios de modo mixto poseen ligandos hidrófobos que son ionizables y se convierten de no cargados a cargados positivamente reduciendo el pH (por ejemplo, MEP HyperCel). Finalmente, los medios de hidroxiapatita y fluorapatita tienen funciones de modo mixto más complejas al poseer iones calcio cargados positivamente y grupos fosfato cargados negativamente.

En una realización preferida, la cromatografía de modo mixto usada como etapa intermedia utiliza una resina que tiene funciones hidrófobas y de intercambio aniónico. Son más preferidas las resinas de modo mixto que contienen ligandos de N-bencil-N-metiletanolamina cargados positivamente, que están unidos a una matriz de agarosa altamente reticulada.

La resina de modo mixto más preferida usada para la etapa intermedia b) es CaptoAdhere ImpRes (GE Healthcare Life Science).

Se pueden aplicar las siguientes condiciones cuando se carga la resina de cromatografía de modo mixto cargada positivamente en el modo de unión-elución: pH 6 a pH 9, preferiblemente aproximadamente pH 6,5 a 8; lo más preferiblemente aproximadamente pH 7. Opcionalmente, se pueden usar una o más etapas de lavado. Las condiciones dependen del pI de la proteína de fusión Fc-péptido y pueden ajustarse específicamente según la separación deseada. La elución con gradiente de pH decreciente es el modo preferido para la cromatografía de modo mixto. En la realización más preferida, el gradiente se lleva a cabo con tampón de fosfato de sodio, comienza a aproximadamente pH 7 y termina a aproximadamente pH 5.

En una realización preferida, la elución con gradiente de pH para la cromatografía de modo mixto se puede llevar a cabo con fosfato de sodio con NaCl. El gradiente puede generarse mezclando dos tampones (p. ej., comenzando con 100% de tampón A que tiene un pH de aproximadamente 7 y mezclando en él el tampón B que tiene un pH de aproximadamente 5 hasta que se alcanza 70% de tampón B). La elución con gradiente de pH decreciente puede comprender dos segmentos. Por ejemplo, en el segmento (i) el tampón B se aumenta en 1 a 3 CV, preferiblemente en 2 CV, el porcentaje de tampón B se eleva de 0% a un contenido en el intervalo de aproximadamente 5% a 50%, preferiblemente de aproximadamente 10% a aproximadamente 30%, tal como 20% y en el segmento (ii) el tampón B se aumenta adicionalmente en 5 a 30 CV, preferiblemente 10 a 20 CV, tal como 16,7 CV, a un contenido en el intervalo de aproximadamente 60% a aproximadamente 95%, preferiblemente de aproximadamente 65% a aproximadamente 80%, tal como aproximadamente 70%.

En algunas realizaciones, la invención se refiere a un método para la purificación de una proteína de fusión Fcpéptido replegada derivada de cuerpos de inclusión de microorganismos de una composición que comprende la proteína de fusión Fc-péptido y al menos una impureza, comprendiendo el método las siguientes etapas en el siguiente orden:

a) realizar una cromatografía de captura de proteína A en modo de unión-elución; opcionalmente con una o más etapas de lavado; y

b) realizar una cromatografía de modo mixto en modo de unión-elución; opcionalmente con una o más etapas de lavado; y

c) realizar una cromatografía de intercambio catiónico en modo de unión-elución, opcionalmente con una o más etapas de lavado; y

d) realizar una ultrafiltración/diafiltración; y

en donde la proteína de fusión Fc-péptido se eluye del medio de cromatografía de modo mixto de la etapa b) con un gradiente de pH decreciente de aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 5; y

en donde el medio de cromatografía de modo mixto de la etapa b) comprende N-bencil-N-metiletanolamina cargada positivamente como ligando unido a una matriz de agarosa altamente reticulada; y

en donde los tampones usados para la cromatografía de modo mixto son tampones de fosfato, preferiblemente tampones de fosfato de sodio con cloruro de sodio.

La etapa de cromatografía de modo mixto cargada positivamente en modo de unión separa las variantes de carga de la proteína de fusión Fc-péptido y reduce adicionalmente las proteínas de la célula hospedante, ADN de la célula hospedante, agregados, fragmentos, variantes de sulfuro, endotoxinas y proteína A lixiviada. En una realización preferida, la cromatografía de modo mixto está precedida por una etapa de acondicionamiento. La etapa de acondicionamiento prepara la mezcla de elución de Proteína A para purificación adicional. La etapa de acondicionamiento comprende las siguientes etapas: Después de una etapa de retención, la mezcla de elución de Proteína A se diluye y se ajusta el pH. Preferiblemente, la dilución es de cuatro veces y el pH se ajusta a aproximadamente pH 7. En una realización más preferida, la dilución es de dos veces y el pH se ajusta a aproximadamente pH 7. Preferiblemente, el tampón es fosfato sódico. Se añade NaCl a una concentración final de 25 mM. La mezcla de elución de Proteína A acondicionada se incuba y se filtra. Preferiblemente, la incubación se realiza durante aproximadamente 30 a aproximadamente 60 minutos. En algunas realizaciones, la invención se refiere a un método para la purificación de una proteína de fusión Fcpéptido replegada derivada de cuerpos de inclusión de microorganismos de una composición que comprende la proteína de fusión Fc-péptido y al menos una impureza, comprendiendo el método las siguientes etapas en el siguiente orden:

a) realizar una cromatografía de captura de proteína A en modo de unión-elución; opcionalmente con una o más etapas de lavado; y

b) realizar una cromatografía de modo mixto en modo de unión-elución; opcionalmente con una o más etapas de lavado; y

c) realizar una cromatografía de intercambio catiónico en modo de unión-elución, opcionalmente con una o más etapas de lavado; y

d) realizar una ultrafiltración/diafiltración; y

en donde el medio de cromatografía de modo mixto de la etapa b) está precedido por una etapa de acondicionamiento; y

en donde la etapa de acondicionamiento comprende dilución, ajuste del pH, incubación y filtración del eluato de la cromatografía de captura de proteína A de la etapa a).

En algunas realizaciones, la invención se refiere a un método para la purificación de una proteína de fusión Fcpéptido replegada de una composición que comprende la proteína de fusión Fc-péptido y al menos una impureza, comprendiendo el método las siguientes etapas en el siguiente orden:

a) realizar una cromatografía de captura de afinidad en modo de unión-elución usando derivado de Proteína A estabilizado frente a álcali como ligando;

b) realizar una cromatografía de modo mixto en modo de unión-elución usando N-bencil-N-metiletanolamina como ligando;

c) realizar una cromatografía de intercambio catiónico en modo de unión-elución usando R-SO<3>- como ligando; y

realizar una ultrafiltración/diafiltración;

en donde las cromatografías a), b) y c) se realizan opcionalmente con una o más etapas de lavado.

En realizaciones más específicas, la invención se refiere a un método para la purificación de una proteína de fusión Fc-péptido replegada de una composición que comprende la proteína de fusión Fc-péptido y al menos una impureza, comprendiendo el método las siguientes etapas en el siguiente orden:

d) realizar una cromatografía de captura de afinidad en modo de unión-elución usando derivado de Proteína A estabilizado frente a álcali como ligando;

e) realizar una cromatografía de modo mixto en modo de unión-elución usando N-bencil-N-metiletanolamina como ligando;

f) realizar una cromatografía de intercambio catiónico en modo de unión-elución usando R-SO<3>- como ligando; y

g) realizar una ultrafiltración/diafiltración;

en donde las cromatografías a), b) y c) se realizan opcionalmente con una o más etapas de lavado,

en donde la proteína de fusión Fc-péptido se eluye del medio de cromatografía de afinidad de la etapa a) con un gradiente de pH decreciente.

Etapa de cromatografía de pulido: cromatografía de intercambio catiónico

El método como se describe en el presente documento comprende además una etapa de cromatografía de intercambio catiónico como etapa de pulido.

La cromatografía de intercambio catiónico se basa en interacciones carga-carga entre las proteínas en la muestra y las cargas inmovilizadas sobre la resina. En la cromatografía de intercambio catiónico, las moléculas que se van a unir están cargadas positivamente y los grupos funcionales inmovilizados (ligandos) están cargados negativamente. Las resinas de intercambio catiónico comúnmente usadas son resinas S, (sulfonato), resinas SP (sulfopropilo), resinas SiB (sulfoisobutilo), resinas SE (sulfoetilo) y resinas CM (carboximetilo).

Sin embargo, en general, la etapa de cromatografía de intercambio catiónico se puede realizar con todas las resinas o membranas de intercambio catiónico comunes disponibles comercialmente. Las resinas de intercambio catiónico pueden usarse en forma de columnas o membranas preempaquetadas sobre las que se fija el grupo funcional, p. ej. ácido sulfónico. Alternativamente, las resinas pueden adquirirse como material a granel y las columnas pueden ser empaquetadas por el usuario. No existen limitaciones específicas en cuanto a la capacidad y dimensión de las columnas distintas de las habituales. El experto en la técnica conoce la cantidad de resina de intercambio catiónico y el tamaño de la columna que se va a usar. Esto depende de la escala global del procedimiento.

Los productos típicos disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, Macro-Prep High S, Macro-Prep CM, Unosphere Rapid S, Unosphere Rapid S40, Nuvia S, y Nuvia<h>R-S (Bio-Rad, California, EE.UU.), Toyopearl CM, Toyopearl SP, Toyopearl Sulfate 650 F, y Toyopearl GigaCap S (Tosoh Bioscience, Alemania), Millipore ProRes S, Fractogel<e>M<d>COO-, Fractogel EMD SO3-, Fractogel EMD SE Hicap, Eshmuno CPX (Merck KGaA, Alemania), Biosepra CM Ceramic HyperD, Biosepra S Ceramic HyperD, S HyperCel (Pall Corperation, Nueva York, EE.UU.), Poros HS, Poros XS (Applied Biosystems, Alemania), YMC BioPro SmartSep 30s , YMC BioPro SmartSep 70S (YMC Europa) CM-Sepharose FF, SP-Sepharose f F, S-Sepharose FF, SP-Sepharose HP, SP-Sepharose XL, SP-Sepharose Big Beads, CM-Sephadex, Capto S, Capto SP ImpRes y Source S (todos GE Healthcare, Alemania).

Las resinas de intercambio catiónico preferidas de esta invención son intercambiadores catiónicos fuertes que usan ligandos sulfonato, sulfopropilo o sulfoisobutilo. Son más preferidos los ligandos sulfonato o sulfopropilo unidos a matrices rígidas tales como agarosa altamente reticulada, p. ej. Nuvia HR-S, o poli(estirenovinilbenceno), p. ej. Poros 50 HS, o polimetacrilato, p. ej. Fractogel EMD SO3-. La resina de intercambio catiónico más preferida es el intercambiador catiónico fuerte BioPro SmartSep S30 (YMC Europe) con grupos SO3- unidos a una matriz polimérica hidrófila.

Habitualmente, la cromatografía de intercambio catiónico se realiza usando tampones a valores de pH entre 4 y 7.

La cromatografía de intercambio catiónico puede equilibrarse con un tampón que tiene un pH de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 8, preferiblemente de aproximadamente pH 5 a pH 7. La concentración de tampón puede estar en el intervalo de 10 mM a 200 mM, preferiblemente en el intervalo de 50 mM a 100 mM.

Ejemplos de tampones usados para la cromatografía de intercambio catiónico son ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, ácido fórmico, ácido butanodioico, ácido acético, ácido malónico, glicina, MES, PIPES, fosfato, bistris, Tris, o mezclas de los mismos. La selección del tampón depende del pH deseado y el pI de la proteína de fusión Fc-péptido.

El tampón preferido usado para la cromatografía de intercambio catiónico es Tris. En una realización preferida, el pH del tampón Tris se ajusta con HCl o ácido fosfórico.

Para la elución, se puede usar un aumento en el pH del tampón de elución, proporcionado por una sola etapa o un gradiente.

Una realización preferida para la realización de la cromatografía de intercambio catiónico es un pH de aproximadamente pH 5,5 a 7,5 para la carga y el lavado, y un pH de aproximadamente 6 a 8 para la elución por etapas.

En una realización, el eluato de la cromatografía de modo mixto se carga en la columna de cromatografía de intercambio catiónico después de una etapa de retención. Preferiblemente, la etapa de retención se lleva a cabo a una temperatura de 2 a 10 °C.

Por lo tanto, en una realización preferida, la invención se refiere a un método para la purificación de una proteína de fusión Fc-péptido replegada derivada de cuerpos de inclusión de microorganismos de una composición que comprende la proteína de fusión Fc-péptido y al menos una impureza, comprendiendo el método las siguientes etapas en el siguiente orden:

a) realizar una cromatografía de captura de proteína A en modo de unión-elución; opcionalmente con una o más etapas de lavado; y

b) realizar una cromatografía de modo mixto en modo de unión-elución; opcionalmente con una o más etapas de lavado; y

c) realizar una cromatografía de intercambio catiónico en modo de unión-elución; y, opcionalmente con una o más etapas de lavado; y

d) realizar una ultrafiltración/diafiltración; y

en donde al menos un tampón utilizado para la cromatografía de intercambio catiónico de la etapa c) es un tampón Tris; y

en donde la proteína de fusión Fc-péptido se eluye mediante una única etapa del medio de cromatografía de intercambio catiónico de la etapa c) mediante un aumento del pH; y

en donde el medio de cromatografía de intercambio catiónico de la etapa c) es un medio de cromatografía de intercambio catiónico fuerte que comprende grupos cargados -R-SO3- unidos a una matriz polimérica hidrófila.

La etapa de cromatografía de intercambio catiónico separa las variantes de carga de la proteína de fusión Fcpéptido y puede agotar adicionalmente las proteínas residuales de la célula hospedante, ADN residual del hospedante, agregados, fragmentos, variantes de sulfuro, endotoxinas y proteína A lixiviada. Como etapa de pulido, las diversas impurezas eliminadas están en cantidades muy bajas, es decir, solo cantidades en trazas.

Alternativamente, la cromatografía de intercambio catiónico puede realizarse utilizando elución en gradiente con una fuerza iónica creciente. Lo más preferido es una cromatografía BioPro SmartSep S30 con una elución en gradiente de L-arginina. El tampón de succinato sódico es un tampón preferido para este método, con un pH en el intervalo de pH 5 a 7, preferiblemente pH 6. La proteína de fusión Fc-péptido unida puede eluirse mediante un gradiente lineal creciente de L-arginina en succinato de sodio.

Opcionalmente, el método de intercambio catiónico alternativo con elución en gradiente de arginina puede realizarse como una segunda etapa de intercambio catiónico (c2) después de la primera cromatografía de intercambio catiónico con elución por etapas de pH (c1). Esta segunda etapa de intercambio catiónico en condiciones cambiadas puede agotar adicionalmente impurezas si se desea.

En algunas realizaciones, la etapa (c) se realiza dos veces en serie, comprendiendo el método la etapa c) en el siguiente orden:

c1) realizar una primera cromatografía de intercambio catiónico; y

c2) realizar una segunda cromatografía de intercambio catiónico;

en donde las cromatografías c1) y c2) se realizan con el mismo medio de cromatografía en modo de uniónelución; y

en donde las cromatografías c1) y c2) se realizan en diferentes condiciones, opcionalmente con una o más etapas de lavado.

Las diferentes condiciones comprenden cambios en el pH o en la conductividad usando elución por etapas o en gradiente. En una realización preferida, las diferentes condiciones son una elución por etapas de pH (c1) y una elución en gradiente de arginina (c2).

Ultrafiltración/diafiltración de flujo tangencial (TF-UF/DF)

Además, el método de la invención comprende una etapa final de ultrafiltración/diafiltración. La ultrafiltración es una forma de filtración por membrana en la que la presión fuerza un líquido contra una membrana semipermeable. Los sólidos suspendidos y los solutos de alto peso molecular son retenidos, mientras que el agua y los solutos de bajo peso molecular pasan a través de la membrana. La ultrafiltración es un método habitualmente usado para separar, purificar y concentrar soluciones macromoleculares, especialmente soluciones de proteínas. La ultrafiltración puede combinarse con diafiltración. Este modo es adecuado para el intercambio de tampón, para eliminar sales y otras microespecies de la solución mediante dilución y reconcentración repetidas o continuas. La ultrafiltración se puede realizar con membranas apiladas en un sistema de filtración de flujo tangencial o de flujo cruzado (TFF o TF-UF), especialmente para procesar grandes volúmenes de muestra. Además de los casetes, se usan habitualmente sistemas de fibras huecas para la ultrafiltración. Los tamaños de corte exclusión de la membrana varían de aproximadamente 1 a 300 kDa. Para las proteínas de fusión Fc-péptido, los cortes de exclusión típicos para las membranas de ultrafiltración son de 10-50 kDa. En el marco de la presente invención, se prefiere un corte de exclusión de peso molecular de 30 kDa para las membranas de UF.

En una secuencia posterior de una proteína terapéutica, una etapa de ultrafiltración/diafiltración es a menudo la etapa final y se usa para la formulación del fármaco proteico. Además, la concentración final puede ajustarse. En el caso de una proteína de fusión Fc-péptido, una realización preferida da como resultado una composición farmacéutica formulada o una composición de pre-etapa farmacéutica. La composición de pre-etapa farmacéutica puede ser la sustancia activa a granel, que está lista para esterilizarse por filtración en viales y además experimenta liofilización para formar la composición farmacéutica final.

En una realización específica, la invención se refiere a un método para la purificación de una proteína de fusión Fc-péptido replegada derivada de cuerpos de inclusión de microorganismos de una composición que comprende la proteína de fusión Fc-péptido y al menos una impureza, comprendiendo el método las siguientes etapas en el siguiente orden:

a) realizar una cromatografía de captura de proteína A en modo de unión-elución, opcionalmente con una o más etapas de lavado; y

b) realizar una cromatografía de modo mixto en modo de unión-elución, opcionalmente con una o más etapas de lavado; y

c) realizar una cromatografía de intercambio catiónico en modo de unión-elución, opcionalmente con una o más etapas de lavado; y

d) realizar una ultrafiltración/diafiltración; y

en donde la ultrafiltración/diafiltración de la etapa d) se usa para la formulación y ajuste de la concentración final de la proteína de fusión Fc-péptido; y

en donde la ultrafiltración/diafiltración de la etapa d) se realiza en el modo de flujo tangencial; y

en donde la ultrafiltración/diafiltración de la etapa d) se realiza con una membrana que tiene un corte de exclusión nominal de aproximadamente 10 kDa a 50 kDa.

Ejemplos

Los métodos de la invención para purificar proteínas de fusión Fc-péptido se apoyan e ilustran por referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1: Preparación de proteínas de fusión Fc-péptido replegadas

Las proteínas de fusión Fc-péptido se expresaron en E. coli en forma insoluble o soluble limitada y se acumularon en los denominados cuerpos de inclusión. La preparación de romiplostim se seleccionó como un ejemplo para las proteínas de fusión Fc-péptido. Las bacterias se recogieron por centrifugación y el sedimento de células bacterianas se inoculó en tampón de lisis basado en Tris. Las bacterias se rompieron a presión haciéndolos pasar a través de un homogeneizador. Los cuerpos de inclusión se separaron de los restos celulares por centrifugación y se resuspendieron en tampón de lavado basado en Tris y se separaron de la misma manera que antes. Después de la incubación a temperatura ambiente, se repitió el procedimiento de lavado. El sedimento final de cuerpos de inclusión se almacenó congelado a -20 °C. Los cuerpos de inclusión congelados se solubilizaron mediante procedimientos convencionales (Rudolph 1990) en condiciones alcalinas y reductoras con tampón basado en Tris que comprendía guanidina-HCl y DTT. Después de la incubación, los cuerpos de inclusión solubilizados se trataron por reducción-oxidación en presencia de cisteína/cistina para permitir el intercambio tiol-disulfuro durante el replegamiento y para promover la formación de disulfuro. El replegamiento se detuvo mediante dilución con ácido acético y se sometió a precipitación de impurezas inducida por pH. La solución replegada se aclaró mediante filtración profunda y microfiltración, se diluyó y se ajustó el pH (pH 5). La pureza inicial relativa de romiplostim replegado medida por RP-UPLC era de aproximadamente 52-62% como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1: Pureza inicial relativa de romiplostim en la solución replegada

MP = pico principal

Ejemplo 2: Selección de medios de cromatografía

Se ensayó la eficiencia de resinas de cromatografía de procesamiento de diferentes proveedores como etapa de captura, etapa intermedia y de pulido en diferentes modos y condiciones de elución. De este modo, se prefirió una cromatografía de afinidad de Proteína A como etapa de captura y se consideraron las cromatografías de intercambio iónico y modo mixto para las etapas posteriores. La investigación se realizó en diferentes escalas con soluciones replegadas de romiplostim obtenidas según el Ejemplo 1. Las series cromatográficas se realizaron con un Ákta Purifier System (GE Healthcare) a temperatura ambiente.

Se puso especial énfasis en la separación de las numerosas impurezas relacionadas con el producto. La Tabla 2 muestra la selección final de las resinas cromatográficas. MabSelect SuRe LX dio los mejores resultados y fue el medio de afinidad seleccionado. Las resinas de modo mixto cargadas positivamente resultaron ser ventajosas frente a los medios de intercambio aniónico habitualmente usados. Capto Adhere ImpRes se seleccionó para la etapa intermedia. Una cromatografía de intercambio catiónico como etapa de pulido final completó la secuencia (Figura 2). Se compararon muchos medios diferentes, y se obtuvieron los mejores resultados para el intercambiador catiónico fuerte BioPro SmartSep S30 (Tabla 2).

Tabla 2: Medios de cromatografía preferidos

MMC = cromatografía de modo mixto; CEX = cromatografía de intercambio catiónico

Ejemplo 3: Cromatografía de afinidad de proteína A con MabSelect SuRe LX

La cromatografía de afinidad se realizó con MabSelect SuRe LX (Tabla 2). La muestra se tomó después del ajuste del pH, dilución y filtración de la solución replegada como se describe en el Ejemplo 1.

Las dimensiones de la columna eran 7 cm de diámetro x 19 cm de altura de lecho (volumen empaquetado de aproximadamente 730 ml). La columna de Proteína A se equilibró con urea 1,25 M, etanolamina 150 mM, hidrocloruro de L-arginina 200 mM, pH 5,0 (3 CV). La solución de producto se cargó con 10-18 mg de proteína por ml de resina. La columna se lavó con tampón de equilibrado (1,5 CV). Para reducir la cantidad de impurezas relacionadas con el producto tales como isoformas reducidas e isoformas de enlaces disulfuro, se comparó el efecto de la elución por etapas y la elución en gradiente en la cromatografía de proteína A. Para la elución por etapas, el tampón contenía citrato-Na 100 mM y urea 0,5 M a pH 3,5. La elución en gradiente se realizó mezclando tampón A que contenía citrato-Na 100 mM, urea 0,5 M a pH 5,5 y tampón B que contenía citrato-Na 100 mM, urea 0,5 M a pH 2,5. La elución con gradiente de pH lineal decreciente consistió en tres segmentos: (i) 0-37% de B (1 CV), (ii) 37-75% de B (13,8 CV), y (iii) 75-100% de B (1 CV). Los caudales eran de 100 cm/h. La Tabla 3 muestra el efecto de la elución por etapas de pH y la elución en gradiente de pH en la cromatografía de proteína A en la reducción de impurezas relacionadas con el producto de romiplostim. Las impurezas relacionadas con el producto se agruparon según sus picos medidos por RP-UPLC en variantes monoméricas y variantes diméricas de romiplostim con diferentes enlaces disulfuro abiertos y mal emparejados.

Tabla 3: Comparación de la elución por etapas de pH y gradiente de pH en cromatografía de afinidad de proteína A para variantes de sulfuro de romiplostim

La elución por etapas dio como resultado una reducción de aproximadamente 45 % para variantes monoméricas con enlaces disulfuro abiertos y de aproximadamente 12 % para dímeros mal emparejados, respectivamente. Sorprendentemente, se obtuvo una reducción muy alta de los monómeros críticos con disulfuros abiertos mediante la elución en gradiente de disminución de pH en cromatografía de proteína A. Las variantes de disulfuro abiertas disminuyeron aproximadamente 93 %. Los monómeros mostraron obviamente una unión más débil a la Proteína A que los dímeros y eluyeron antes que los dímeros. No se pudo detectar ningún efecto adicional sobre la reducción del nivel ya bajo de isoformas de romiplostim dimerizadas con disulfuro abierto.

Ejemplo 3.1: Estabilización del eluato de proteína A

Para evitar la precipitación, el eluato de Proteína A se recogió directamente con agitación en un tampón estabilizante. Se ensayaron tres tampones alternativos: el tampón 1 contenía D-manitol al 4 % (p/v), sacarosa al 2 % (p/v), L-histidina 20 mM, Tween 20 al 0,004 %, pH 5,0; el tampón 2 con NaAC 20 mM, NaCl 50 mM, pH 5,0; y el tampón 3 contenía citrato-Na 100 mM, urea 0,5 M a pH 5,5. No se observó precipitación directamente después de la elución para los tres tampones. Sin embargo, después de un ciclo de congelacióndescongelación a -70 °C, el tampón 2 y el tampón 3 mostraron precipitación de proteínas del eluato de proteína A, en cambio para el tampón 1 no se observó precipitación. La precipitación de proteína en el eluato de proteína A ocurrió a una concentración de proteína > 2 mg/ml. El ajuste de la concentración de proteína del eluato de proteína A a 1,8 mg/ml a 2 mg/ml impidió aún más la precipitación de la muestra y mejoró el almacenamiento a 2-8 °C.

Ejemplo 4: Acondicionamiento y cromatografía de modo mixto con Capto Adhere ImpRes

Después de una etapa de retención a 2-8 °C, la mezcla de elución de proteína A obtenida en el Ejemplo 3 se preparó en una etapa de acondicionamiento para purificación adicional. La mezcla de elución de captura se diluyó cuatro veces con NaH2PO420 mM a pH y si era necesario, el pH se ajustó a pH 7,0. Alternativamente, la mezcla de elución de captura se diluyó dos veces con fosfato sódico 100 mM y, si era necesario, el pH se ajustó con NaOH 1 M a pH 7,0. Se añadió NaCl hasta una concentración final de 25 mM. Después de la precipitación inducida por el pH, la solución se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que el precipitado se depositara. Para la clarificación, la solución se filtró a través de una cápsula de filtro Supor EKV de 0,2 pm (Pall Corporation).

El acondicionamiento de la mezcla de elución de proteína A antes de la etapa de purificación intermedia puso de manifiesto un efecto positivo en la reducción de monómeros de romiplostim (Tabla 4).

Tabla 4: Reducción de variantes monoméricas de romiplostim por medio del acondicionamiento y cromatografía de modo mixto intermedia

La mezcla de elución de Proteína A acondicionada y clarificada se purificó adicionalmente en resina de modo mixto Capto Adhere ImpRes como etapa de purificación intermedia que hace uso del ligando N-bencil-N-metiletanolamina (Tabla 2) y lleva grupos cargados positivamente y proporciona además de funciones de intercambiador aniónico también interacciones hidrófobas. La cromatografía en modo mixto redujo las variantes cargadas y las isoformas de disulfuro mal emparejadas cuando se realizó en modo de unión. El tamaño de la columna empaquetada era 7 cm de diámetro x 20,5 cm de altura de lecho (volumen empaquetado de aproximadamente 789 ml). La resina se equilibró en dos etapas que consistían en (i) NaH2PO4500 mM, pH 7 (3 CV) y (ii) NaH2PO4 20 mM y NaCl 25 mM, pH 7 (5 CV). La mezcla de elución de Proteína A ajustada y clarificada se cargó en la columna con 3 mg de proteína por ml de resina seguido de tampón equilibrado (1,5 CV). Se realizó una elución en gradiente de pH mezclando tampón A que contenía NaH2PO420 mM, NaCl 25 mM a pH 7 y tampón B que contiene NaH2PO4 20 mM, NaCl 25 mM a pH 5 en las siguientes relaciones y secuencias: (i) 0-10% de B (1 CV) y (ii) 10-70% de B (24 CV). Alternativamente, la elución en gradiente de pH se realizó mezclando tampón A que contenía NaH2PÜ420 mM, NaCI 25 mM a pH 7 y tampón B que contenía NaH2PÜ4 20 mM, NaCl 25 mM a pH 5 en las siguientes relaciones y secuencias: (i) 0-20% de B (2 CV) y (ii) 20-70% de B (16,7 CV). El caudal era de 110 cm/h.

La cromatografía de modo mixto aumentó la pureza relativa de aproximadamente 68 % en la carga a aproximadamente 85 % en la mezcla de elución. Para variantes monoméricas de romiplostim con puentes disulfuro abiertos irregulares, se logró una reducción de aproximadamente 47 % y las variantes diméricas mal emparejadas de romiplostim se redujeron en aproximadamente 58 %.

Ejemplo 5: Cromatografía de intercambio catiónico con BioPro SmartSep S30

La separación adicional de contaminantes relacionados con el procedimiento y sustancias relacionadas con el producto tales como variantes de carga y variantes de disulfuro mal emparejadas se logró mediante cromatografía de intercambio catiónico fuerte con ligandos -R-SO3- (Tabla 2). La columna se empaquetó con resina BioPro SmartSep S30 (YMC, Europa), 5 cm de diámetro x 20 cm de altura de lecho (volumen empaquetado de aproximadamente 392 ml) y se equilibró con Tris 100 mM ajustado con ácido fosfórico al 85 % mM a pH 6,75 (8 CV). La solución obtenida de la etapa intermedia como se describe en el Ejemplo 4 se cargó directamente en la columna con aproximadamente 2,5-8 mg de proteína por ml de resina. La columna se lavó con tampón de equilibrado (3 CV). La proteína unida se eluyó mediante una elución por etapas de pH en Tris 18 mM ajustado con ácido fosfórico al 85 % mM a pH 7,6 en 40 CV. La cromatografía se realizó a 150 cm/h. El eluato se separó en fracciones para permitir la mezcla específica. La cromatografía de intercambio catiónico con elución por etapas de pH dio como resultado una pureza relativa de aproximadamente el 97 % (pico principal en RP-UPLC) quedando aproximadamente 0,8 % de dímeros disulfuro mal emparejados de romiplostim.

Opcionalmente, se desarrolló una segunda cromatografía BioPro SmartSep S30 con elución en gradiente de arginina. La columna se equilibró con succinato-Na 20 mM, pH 6 (5 CV). El eluato de la primera cromatografía de intercambio catiónico se ajustó a pH 6 con ácido fosfórico al 10%, se pasó a través de un filtro EKV de 0,2 pm (Pall) y se cargó en la columna con <5 mg por ml de resina. La columna se lavó con tampón de equilibrado (3 CV). La proteína unida se eluyó mediante un gradiente lineal creciente de L-arginina 0 mM a 250 mM en succinato-Na 20 mM, pH 6 en 49 CV. El eluato se separó en fracciones para permitir la mezcla específica. Los caudales eran 150 cm/h. La columna se regeneró con (i) NaCl 2 M (3<c>V, 150 cm/h) y (ii) NaOH 1 M (3 CV, 40 cm/h) en flujo inverso, y se almacenó en NaOH 20 mM. Esta segunda etapa de intercambio catiónico en condiciones cambiadas puede agotar adicionalmente impurezas si se desea. Sin embargo, para el procedimiento final desarrollado de romiplostim, una segunda etapa de intercambio catiónico era prescindible.

Ejemplo 6: Ultrafiltración/diafiltración de flujo tangencial (TF-UF/DF)

El objetivo de la etapa de ultrafiltración/diafiltración es ajustar la concentración de la solución de proteína y transferir la proteína de fusión Fc-péptido al tampón de formulación final, que además del tampón contiene otros ingredientes de la formulación a granel final tales como detergentes, estabilizantes, sales, azúcares y/o polioles.

La etapa de TF-UF/DF se realizó usando una membrana Hydrosart de 30 kDa (Sartorius). La presión transmembrana del procedimiento UF/DF se ajustó a 0,5 bar. No hubo pérdida de producto en esta etapa. La concentración aparente final de la proteína de fusión Fc-péptido se ajustó a 1 g por l. Se realizó una microfiltración final (filtración estéril) con una cápsula de filtro Supor EKV de 0,2 pm (Pall Corporation).

Ejemplo 7: Progreso de la pureza relativa a lo largo de las etapas del procedimiento

La secuencia de etapas de purificación después del replegamiento que comprende cromatografía de afinidad de proteína A, cromatografía de modo mixto y cromatografía de intercambio catiónico se realizó tal como se describe en los ejemplos anteriores. La pureza relativa después de cada etapa de purificación de tres series de purificaciones comenzando con 9,5-13,5 g de cuerpos de inclusión lavados y congelados se muestra en la Figura 5. La pureza relativa que se define como porcentaje del pico principal en RP-UPLC aumenta significativamente a lo largo todo el procedimiento de purificación.

El procedimiento de purificación de tres lotes consecutivos comenzó con una pureza relativa de aproximadamente 61-76 % en la solución replegada. Esto era algo mayor que la pureza inicial relativa de los experimentos que conducen a la Tabla 1. Después de la cromatografía de captura de afinidad con Proteína A y elución en gradiente, la pureza relativa aumentó a aproximadamente 81-94 %. La cromatografía de modo mixto intermedia aumentó la pureza relativa a 95-96 % y la cromatografía de pulido de intercambio catiónico final, que eliminó adicionalmente sólo cantidades en trazas, dio como resultado una pureza relativa de aproximadamente > 97 %.

Sorprendentemente, la etapa intermedia posterior a la etapa de Proteína A mostró un alto potencial para eliminar la proteína A lixiviada (Tabla 5). La cromatografía de modo mixto redujo significativamente la proteína A lixiviada a niveles muy bajos o por debajo del límite de detección del ensayo, respectivamente. La cromatografía de intercambio catiónico como etapa de pulido disminuyó los niveles de proteína A lixiviada aún más. La Proteína A lixiviada se midió por ELISA.

Tabla 5: Proteína A lixiviada después de la etapa de captura, intermedia y pulido.

Ejemplo 8: Caracterización de la pureza final de romiplostim

La Tabla 6 pone de manifiesto la pureza final de tres lotes de romiplostim diferentes medida por cuatro métodos analíticos diferentes.

Tabla 6: Pureza final de romiplostim medida por diferentes métodos analíticos

MP = pico principal

La electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) con tinción con plata y evaluación densitométrica puso de manifiesto una pureza relativa (banda principal) de al menos aproximadamente 97,8%. Este método puede detectar solo un espectro limitado de impurezas, tales como proteínas de la célula hospedante y formas truncadas de romiplostim. El método de exclusión por tamaño (SEC)-HPLC identifica especies con diferentes tamaños moleculares tales como monómeros y agregados. La pureza del pico principal es tan alta como de 99,6 a 99,8%. La HPLC de intercambio catiónico (CEX) detecta variantes de carga de romiplostim y la pureza relativa con este método era de 97,8-99,3 %. Finalmente, la cromatografía de ultra alto rendimiento en fase inversa (RP-UPLC) puso de manifiesto una pureza final de aproximadamente 97%. Sólo quedaron cantidades en trazas de impurezas relacionadas con el producto. Como se muestra en la Tabla 7, otras impurezas, tales como ADN de la célula hospedante (HC-ADN), proteínas de la célula hospedante (HCP) y Proteína A lixiviada están por debajo de los límites de detección de los ensayos usados o a niveles muy bajos, HCP-ELISA (< 20 ppm de HCP), qPCR (< 0,018 ppm de HCADN) y Proteína A-ELISA (0,01 ppm), respectivamente.

Tabla 7: Impurezas relacionadas con el procedimiento en la etapa de purificación final

Ejemplo 9: Caracterización de impurezas relacionadas con el producto

La caracterización estructural de variantes de romiplostim usando tecnología de LC-MS exhaustiva y mapeo peptídico de la proteína de fusión intacta, subunidades, condiciones reducidas y no reducidas y análisis N-terminal se realizaron con muestras de diferentes etapas del procedimiento de purificación y diferentes lotes. Además, también se analizaron diferentes lotes de romiplostim disponibles comercialmente, que se vende con el nombre comercial NPlate®.

Además del romiplostim correctamente plegado e intacto, que contiene seis puentes disulfuro y el patrón de disulfuros esperado como componente principal, se identificaron diferentes variantes de romiplostim con niveles de oxidación más altos (M1, M33, M209 y W264), enlaces disulfuro mal emparejados (C7-C10 y C102-C148), cisteínas libres en diferentes posiciones o asparagina desaminada (N96, N165) como impurezas relacionadas con el producto (Tabla 8).

Tabla 8: Impurezas relacionadas con el producto de romiplostim identificadas

Las variantes reducidas y oxidadas de romiplostim se caracterizaron adicionalmente según su posición de pico por RP-UPLC (Tabla 8). Diferentes variantes tales como monómeros con dos a cuatro enlaces disulfuro abiertos, trímeros, tetrámeros y especies oxidadas de romiplostim están representadas por RRT < 1,0. Los dímeros de romiplostim con uno o dos puentes disulfuro mal emparejados se identificaron por RRT > 1,0 (Tabla 9).

Tabla 9: Evaluación de picos de variantes reducidas y oxidadas de romiplostim en RP-UPLC

Estas impurezas relacionadas con el producto de las Tablas 7 y 8 solo se detectaron en trazas en la etapa de purificación final y en NPlate® también.

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la purificación de una proteína de fusión Fc-péptido replegada de una composición que comprende la proteína de fusión Fc-péptido y al menos una impureza, comprendiendo el método las siguientes etapas en el siguiente orden:

a) realizar una cromatografía de captura de afinidad en modo de unión-elución;

b) realizar una cromatografía de modo mixto en modo de unión-elución;

c) realizar una cromatografía de intercambio catiónico en modo de unión-elución; y

d) realizar una ultrafiltración/diafiltración;

en donde las cromatografías a), b) y c) se realizan opcionalmente con una o más etapas de lavado.

2. El método según la reivindicación 1, en donde la al menos una impureza es una variante de sulfuro de la proteína de fusión Fc-péptido, preferiblemente en donde la variante de sulfuro comprende al menos un enlace disulfuro mal emparejado.

3. El método según la reivindicación 1 o 2, en donde la proteína de fusión Fc-péptido se eluye del medio de cromatografía de afinidad de la etapa a) con un gradiente de pH lineal decreciente,

preferiblemente en donde el gradiente de pH comienza a aproximadamente pH 5,5 y termina a aproximadamente pH 2,5.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa a) se realiza con un medio de cromatografía de proteína A,

preferiblemente en donde el medio de cromatografía de Proteína A comprende un derivado de Proteína A tolerante a álcali como ligando, preferiblemente una variante tetramérica estabilizada frente a álcali del dominio B de Proteína A unida a una matriz de agarosa reticulada.

5. El método de la reivindicación 4, en donde al menos uno del tampón de lavado y el tampón de elución usados en la cromatografía de proteína A de la etapa a) incluye urea.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el tampón de lavado y el tampón de elución usados en la cromatografía de proteína A de la etapa a) incluyen urea.

7. El método de las reivindicaciones 4 a 6, en donde en la etapa a) el eluato de la cromatografía de captura de Proteína A se recoge en tampón estabilizante,

preferiblemente en donde el tampón estabilizante de la etapa a) comprende D-manitol, sacarosa, L-histidina, Tween 20,

y preferiblemente en donde el pH del tampón estabilizante de la etapa a) está en el intervalo de 3,5 a 6,5, preferiblemente de 4 a 6, más preferiblemente entre 4,5 y 5,5, lo más preferiblemente aproximadamente 5.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa b) se realiza con un medio de cromatografía de modo mixto cargado positivamente, preferiblemente en donde el medio de cromatografía de modo mixto cargado positivamente comprende N-bencil-N-metiletanolamina como ligando unido a una matriz de agarosa altamente reticulada.

9. El método de la reivindicación 8, en donde la proteína de fusión Fc-péptido se eluye del medio de cromatografía de modo mixto cargado positivamente de la etapa b) con un gradiente de pH decreciente, preferiblemente en donde el gradiente de pH se forma mezclando dos tampones que tienen valores de pH de aproximadamente pH 5 y aproximadamente pH 7.

10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la cromatografía de modo mixto de la etapa b) está precedida por una etapa de acondicionamiento, preferiblemente en donde la etapa de acondicionamiento comprende dilución, ajuste de pH, incubación y filtración del eluato de la cromatografía de captura de afinidad de la etapa a).

11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa c) se realiza con un medio de intercambio catiónico fuerte, preferiblemente con grupos cargados -R-SO<3>- unidos a una matriz polimérica hidrófila.

12. El método de la reivindicación 11, en donde la proteína de fusión Fc-péptido se eluye del medio de intercambio catiónico fuerte mediante un aumento del valor de pH.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa d) da como resultado una composición farmacéutica formulada o una composición de pre-etapa farmacéutica,

preferiblemente en donde la composición farmacéutica formulada o la composición de pre-etapa farmacéutica comprende la proteína de fusión Fc-péptido purificada, agua, un tampón y al menos un compuesto adicional seleccionado de un detergente, un estabilizante, una sal, un azúcar y un poliol,

y preferiblemente en donde la composición farmacéutica es un liofilizado.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la proteína de fusión Fc-péptido es un monómero o un dímero, preferiblemente un dímero, y preferiblemente en donde la proteína de fusión Fcpéptido replegada es un agonista de receptor, preferiblemente en donde el agonista de receptor es un mimético de trombopoyetina, preferiblemente romiplostim.

15. Un método para producir una proteína de fusión Fc-péptido replegada, comprendiendo el método las siguientes etapas en el siguiente orden:

1) Expresión de una proteína de fusión Fc-péptido en microorganismos en donde la proteína de fusión Fcpéptido está presente en cuerpos de inclusión;

2) Lisis de los microorganismos;

3) Sedimentación de los cuerpos de inclusión;

4) Solubilización de los cuerpos de inclusión;

5) Replegamiento de la proteína de fusión Fc-péptido presente en los cuerpos de inclusión;

6) Adaptación de la solución que contiene la proteína de fusión Fc-péptido replegada;

7) Purificación de la proteína de fusión Fc-péptido que comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

a) realizar una cromatografía de captura de afinidad en modo de unión-elución;

b) realizar una cromatografía de modo mixto;

c) realizar una cromatografía de intercambio catiónico; y

d) realizar una ultrafiltración/diafiltración;

y opcionalmente formular el péptido purificado en una composición farmacéutica

en donde las cromatografías a), b) y c) se realizan en modo de unión-elución, opcionalmente con una o más etapas de lavado.