RS67367B1

RS67367B1 - Bioreaktor sa fiksiranim slojem sa pumpom/sistemom creva sa konstantnim protokom

Info

Publication number: RS67367B1
Application number: RS20251094A
Authority: RS
Inventors: Eva Kristiina Räsänen; Hanna P Lesch; Piia Kristiina Valonen; Tarja Hannele Tuunanen; Milla Jonna Karoliina Karnaattu; Minna Kristiina Karhinen; Achim Müller; Seppo Yla-Herttuala
Original assignee: Ferring Ventures Ltd
Priority date: 2016-04-14
Filing date: 2017-04-03
Publication date: 2025-11-28
Also published as: WO2018007873A4; LT3722435T; US20190031998A1; KR102718795B1; WO2018007873A1; US20220364036A1; US20240247218A1; US20190218495A1; KR20240025689A; ES3053142T3; EP3497224B1; RS67444B1; HRP20251455T1; US11261416B2; ES3054035T3; PT3722436T; US11242504B2; CN116144500A; PL3722436T3; FI3722435T3

Description

[0001] Opis

[0002] Povezane prijave

[0003] Ova prijava polaže pravo prioriteta u odnosu na privremenu patentnu prijavu Sjedinjenih Država serijski br.62/322651, podnetu 14. aprila 2016.

[0005] Osnova pronalaska

[0006] Poboljšali smo kulturu adherentnih ćelija u komercijalnom obimu razvijajući poboljšani bioreaktor koji obezbeđuje povećanje produktivnosti od ~50% u odnosu na bioreaktore iz prethodnog stanja tehnike, istovremeno eliminišući izvor kontaminacije.

[0008] Komercijalno dostupni bioreaktori za kulturu adherentnih ćelija uključuju, na primer, bioreaktor iCELLis<™>Nano u laboratorijskom obimu (komercijalno dostupan od Pall Corporation, Cambridge Masachusetts) i bioreaktor iCELLis<™>500 u komercijalnom obimu, koji obezbeđuje zapreminu do 65 litara medijuma za ćelijsku kulturu i supstrat za ćelijsku kulturu od poliestarskih mikrovlakana medicinske čistoće koji obezbeđuje do 500 m<2>površine za rast koja je dostupna ćelijama. Poboljšali smo funkciju takvih bioreaktora u komercijalnom obimu definisanjem procesnih koraka u malom obimu a zatim proširivanjem na veliki obim. Pall Life Science, proizvođač brenda bioreaktora iCELLis<™>, preporučivao je recirkulaciju ili perfuziju kao strategiju napajanja. Strategija napajanja u malom obimu (Nano<™>) ispitana je recirkulacijom i kasnije optimizovana perfuzijom.

[0010] [0004] Perfuzija je korak procesa u kome se ćelije u bioreaktoru kontinualno napajaju svežim medijumom dok se istovremeno uklanja ista količina istrošenog medijuma, što omogućava rast ćelija sa velikom gustinom (Vellinga et al.2014). Brzina perfuzije može da varira u zavisnosti od tipa upotrebljene ćelijske linije, polipeptidnog proizvoda koji te ćelije proizvode, specifičnog korišćenog medijuma za ćelijsku kulturu i upotrebljenog sistema za rast ćelija. Važan aspekt uklanjanja istrošenog medijuma je i uklanjanje metaboličkih sporednih proizvoda (koji mogu biti toksični) iz ćelijske kulture. Ovi sporedni proizvodi mogu imati negativan efekat na vijabilnost ćelija, i dalje mogu da oštete produktivnost proizvodnih ćelija ili ćelija domaćina.

[0012] Opcije za perfuziju uključuju šaržnu perfuziju i perfuziju sa dolivanjem (kod koje se vrši napajanje svežim medijumom, ali se ne vrši uklanjanje istrošenog medijuma). Pristup sa dolivanjem je i strategija recirkulacije, kod koje se zapremina medijuma za ćelijsku kulturu uvećava samo putem kontejnera za eksterni medijum, i medijum recirkuliše iz rezervoara ili kontejnera za medijum u bioreaktor i nazad, pri čemu se ne vrši stvarno uklanjanje istrošenog ili iskorišćenog medijuma.

[0014] Proizvođač iCELLis<™>linije bioreaktora (Pall Life Technologies) prodaje iCELLis<™>500 kao bioreaktor pogodan za perfuziono dolivanje. Napravili smo vrlo iznenađujuće otkriće tokom našeg prvog eksperimenta sa iCELLis<™>500: u stanju koje je obezbedio proizvođač, oprema zapravo ne može da vrši perfuziju, ako se koristi standardno crevo iCELLis<™>500 i sistem pumpi podešen na najsporiju dostupnu izlaznu brzinu pumpe.

[0016] Razložili smo komercijalno dostupni aparat i našli smo razloge za neuspeh.

[0017] Komercijalno dostupni aparat se proizvodi tako da odvodno crevo ima veći unutrašnji prečnik nego napojno crevo. Ova konfiguracija treba da spreči neželjeno prelivanje tečnih medijuma tako što obezbeđuje da napojni tok ne može biti veći od izlaznog. Neočekivano smo našli da ova konfiguracija negativno utiče na efikasnost pumpe i produktivnost uzgajanih ćelija.

[0018] Naprotiv, našli smo da je najbolje da odvodno crevo ima jednak unutrašnji prečnik kao napojno crevo ili manji od njega. Našli smo da je odvodno crevo za komercijalno obezbeđeni („osnovni“) medijum imalo preveliki unutrašnji prečnik, dajući preveliku zapreminu unutrašnjeg prostora za protok medijuma. Ova velika zapremina unutrašnjeg creva omogućavala je formiranje nepoželjnih vazdušnih džepova i mehurova u crevu.

[0020] Pored toga, odvodno crevo za osnovni medijum bilo je integrisano u sistem sa previše slabom pumpom koji nije mogao da obezbedi adekvatan protok medijuma iz bioreaktora. Razlog može biti taj što formiranje mehurova vazduha zauzvrat nepovoljno utiče na pravilan izlazni kapacitet odvodne pumpe. Odvodna pumpa radi tako što stvara negativan pritisak u odvodnom crevu, i izvlači medijume u odvodno crevo. Međutim, za razliku od tečnog medijuma, vazdušni mehurovi se šire u ovom okruženju sa negativnim pritiskom, apsorbujući veliki deo energije negativnog pritiska, i tako osujećuju rad pumpe.

[0021] Kratak opis

[0022] Rešili smo nedostatke svojstvene komercijalno dostupnom aparatu pomoću rekonstrukcije bioreaktora sa većom peristaltičkom pumpom koja može da obezbedi odgovarajuću (manju) brzinu izlaza fluida, i zamene odvodnog creva crevom sa manjim unutrašnjim prečnikom, čime se sprečava nastajanje nepoželjnih vazdušnih mehurova u odvodnom crevu.

[0024] Druga sugestija koju smo dali proizvođaču je da pravi bioreaktore sa manjim prečnikom creva kako bi se poboljšao protok medijuma u crevu.

[0026] Takođe smo konstruisali i testirali novu konfiguraciju priključka za uzorkovanje koji otklanja rizik da će kompromitovani aseptični filter kontaminirati celu proizvodnu šaržu.

[0028] Pronalazak je definisan u priloženom skupu zahteva.

[0030] Ovde je otkriven bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija koji sadrži supstrat za kulturu adherentnih ćelija i pumpu koja može da obezbedi odvođenje medijuma ćelijske kulture konstantnom brzinom manjom od oko 50 ml medijuma na 1800 ćelija dnevno. U konkretnom otelotvorenju, pumpa može da obezbedi minimalno odvođenje konstantnom brzinom od najviše oko 16,7 ml medijuma na 1800 ćelija dnevno. U još jednom otelotvorenju, supstrat obezbeđuje najmanje oko 60 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija, konkretno najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija. U još jednom otelotvorenju, bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma ćelijske kulture.

[0032] Ovde je takođe objavljen rekombinantni polipeptid proizveden uzgajanjem adherentnih proizvodnih ćelija u bioreaktoru za adherentne ćelije opisanom u prethodnom odeljku. U konkretnom otelotvorenju, polipeptid obuhvata virus. U još jednom otelotvorenju, virus obuhvata virusni kapsid koji sadrži nevirusni transgen.

[0034] Ovde je takođe dalje objavljen postupak za uzgajanje adherentnih ćelija na supstratu koji obuhvata:

[0035] a. dobijanje bioreaktora opisanog u odeljcima od drugog do poslednjeg, i zatim b. dodavanje medijuma za ćelijsku kulturu i ćelija u bioreaktor, i zatim

[0036] c. uzgajanje ćelija u adherentnom režimu na supstratu, uz kruženje medijuma za ćelijsku kulturu oko ćelija brzinom manjom od oko 50 ml medijuma na 1800 ćelija dnevno.

[0038] U konkretnom otelotvorenju ovog postupka, supstrat obezbeđuje najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija. U drugom otelotvorenju, bioreaktor je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma za ćelijsku kulturu.

[0040] Ovde je dalje objavljen bioreaktor za uzgajanje adherentnih ćelija koji obuhvata kontejner koji sadrži supstrat za kulturu adherentnih ćelija i pumpu konfigurisanu tako da obezbedi odvođenje medijuma ćelijske kulture konstantnom brzinom uz izlaznu zapreminu pumpe koja je dovoljna da u pomenutom medijumu za ćelijsku kulturu održi parametar odabran iz grupe koja se sastoji od: koncentracije laktata u pomenutom medijumu od najviše 1,58 grama/litar; koncentracije glukoze u pomenutom medijumu od oko 0,5 do 1,0 grama/litar; i koncentracije glukoze u pomenutom medijumu od najmanje oko 2,89 grama/litar. U konkretnom otelotvorenju, bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma za ćelijsku kulturu. U drugom otelotvorenju, supstrat obezbeđuje najmanje oko 60 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija, konkretno najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija. U drugom otelotvorenju, pumpa bioreaktora za uzgajanje adherentnih ćelija je konfigurisana tako da obezbedi odvođenje medijuma za ćelijsku kulturu konstantnom brzinom uz izlaznu zapreminu pumpe koja je dovoljna da u pomenutom medijumu za ćelijsku kulturu održi koncentraciju laktata u pomenutom medijumu od najviše 1,58 grama/litar. U konkretnom otelotvorenju, pumpa je konfigurisana tako da obezbedi odvođenje medijuma za ćelijsku kulturu konstantnom brzinom uz izlaznu zapreminu pumpe koja je dovoljna da u pomenutom medijumu za ćelijsku kulturu održi koncentraciju glukoze u pomenutom medijumu od oko 0,5 do 1,0 grama/litar. U još jednom otelotvorenju, pumpa je konfigurisana tako da obezbedi odvođenje medijuma ćelijske kulture konstantnom brzinom uz izlaznu zapreminu pumpe koja je dovoljna da u pomenutom medijumu za ćelijsku kulturu održi koncentraciju glukoze u pomenutom medijumu od najmanje oko 2,89 grama/litar.

[0042] [0018] Ovde je takođe objavljen rekombinantni polipeptid koji proizvode adherentne proizvodne ćelije za uzgajanje u bioreaktoru za adherentne ćelije iz prethodnog odeljka. U konkretnom otelotvorenju, polipeptid obuhvata virus. U još jednom otelotvorenju, virus obuhvata virusni kapsid koji sadrži nevirusni transgen.

[0044] Ovde je dalje objavljen postupak za uzgajanje adherentnih ćelija na supstratu koji obuhvata:

[0045] a. dobijanje bioreaktora opisanog u odeljcima od drugog do poslednjeg, i zatim b. dodavanje medijuma za ćelijsku kulturu i ćelija u bioreaktor, i zatim

[0046] c. uzgajanje ćelija u adherentnom režimu na supstratu, uz kruženje medijuma za ćelijsku kulturu oko ćelija takvom brzinom da se u pomenutom medijumu za ćelijsku kulturu održi parametar odabran iz grupe koja se sastoji od: koncentracije laktata u pomenutom medijumu od najviše 1,58 grama/litar; koncentracije glukoze u pomenutom medijumu od oko 0,5 do 1,0 grama/litar; i koncentracije glukoze u pomenutom medijumu od najmanje oko 2,89 grama/litar.

[0048] U konkretnom otelotvorenju, supstrat obezbeđuje najmanje oko 60 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija, konkretno najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija. U još jednom otelotvorenju, bioreaktor je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma za ćelijsku kulturu.

[0050] Ovde je takođe opisan bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija koji obezbeđuje supstrat za rast adherentnih ćelija i konfigurisan je da sadrži medijum za ćelijsku kulturu i da ima pumpu koja može da pumpa pomenute medijume, pri čemu je pumpa konfigurisana tako da obezbedi odvođenje medijuma konstantnom brzinom uz izlaznu zapreminu manju od oko 50 ml medijuma po m<2>površine supstrata na dan. U konkretnom otelotvorenju, bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma za ćelijsku kulturu. U daljem otelotvorenju, supstrat obezbeđuje najmanje oko 60 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija, konkretno najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija. U još jednom otelotvorenju, pumpa je povezana sa supstratom preko creva koje ima unutrašnji prečnik dimenzionisan da primi izlaznu zapreminu fluida pumpe bez nastajanja vazdušnih mehurova u crevu.

[0052] [0022] Otkriće takođe obezbeđuje rekombinantni polipeptid proizveden uzgajanjem adherentnih proizvodnih ćelija u bioreaktoru za adherentne ćelije iz prethodnog odeljka. U konkretnom otelotvorenju, polipeptid obuhvata virus. U drugom konkretnom otelotvorenju, virus obuhvata virusni kapsid koji sadrži nevirusni transgen.

[0054] Ovde je takođe objavljen postupak za uzgajanje adherentnih ćelija na supstratu koji obuhvata:

[0055] a. dobijanje bioreaktora opisanog u odeljcima od drugog do poslednjeg, i zatim b. dodavanje medijuma za ćelijsku kulturu i ćelija u bioreaktor, i zatim

[0056] c. uzgajanje ćelija u adherentnom režimu na supstratu, uz kruženje medijuma za ćelijsku kulturu oko ćelija brzinom manjom od oko 50 ml medijuma po m<2>površine supstrata dnevno. U konkretnom otelotvorenju, supstrat obezbeđuje najmanje oko 60 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija, konkretno najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija. U daljem otelotvorenju, bioreaktor je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma za ćelijsku kulturu.

[0058] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak koji obuhvata:

[0059] a. dobijanje bioreaktora za kulturu adherentnih ćelija koji ima supstrat za kulturu adherentnih ćelija i prvo crevo za uzorkovanje koje ima ulazni kraj i izlazni kraj, ulazni kraj prvog creva za uzorkovanje je u komunikaciji sa supstratom, pri čemu tečnost može da teče od supstrata u ulazni kraj prvog creva za uzorkovanje, kroz prvo crevo za uzorkovanje, i izlazi iz bioreaktora na izlaznom kraju prvog creva za uzorkovanje; i zatim

[0060] b. dodavanje medijuma za ćelijsku kulturu u bioreaktor, zasejavanje ćelija u bioreaktor i uzgajanje ćelija koje prianjaju za supstrat, i

[0061] c. proticanje medijuma za ćelijsku kulturu kroz prvo crevo za uzorkovanje, i zatim d. uklanjanje, iz izlaznog kraja prvog creva za uzorkovanje, najmanje jednog uklonjenog dela medijuma za ćelijsku kulturu; i zatim

[0062] e. trajno zaptivanje prvog creva za uzorkovanje bez vraćanja na izlazni kraj creva za uzorkovanje količine materijala uklonjenog dela medijuma za ćelijsku kulturu.

[0064] U konkretnom otelotvorenju, bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija dalje obuhvata drugo crevo za uzorkovanje koje ima ulazni kraj i izlazni kraj, ulazni kraj je u komunikaciji sa supstratom pri čemu tečnost može da teče od supstrata u ulazni kraj drugog creva za uzorkovanje, kroz drugo crevo za uzorkovanje, i izlazi iz bioreaktora na izlaznom kraju creva za uzorkovanje; pri čemu postupak dalje obuhvata:

[0065] f. proticanje medijuma za ćelijsku kulturu kroz drugo crevo za uzorkovanje, i zatim g. uklanjanje, iz izlaznog kraja drugog creva za uzorkovanje, drugog uklonjenog dela medijuma za ćelijsku kulturu; i zatim

[0066] h. trajno zaptivanje drugog creva za uzorkovanje bez vraćanja na izlazni kraj drugog creva za uzorkovanje količine materijala uklonjenog dela medijuma za ćelijsku kulturu.

[0068] U konkretnom otelotvorenju, bioreaktor je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma za ćelijsku kulturu. U još jednom otelotvorenju, supstrat obezbeđuje najmanje oko 60 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija, konkretno najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija. U drugom otelotvorenju, ćelije koje prianjaju za supstrat eksprimiraju rekombinantni polipeptid.

[0070] Dalje je objavljen rekombinantni polipeptid proizveden po postupku iz prethodnog odeljka. U konkretnom otelotvorenju, polipeptid obuhvata virus. U drugom otelotvorenju, virus obuhvata virusni kapsid koji sadrži nevirusni transgen.

[0072] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija koji obuhvata:

[0073] a. supstrat za kulturu adherentnih ćelija u protočnoj vezi sa prvim parom creva za uzorkovanje koja mogu da se zatvore, pri čemu medijum za ćelijsku kulturu može da teče od supstrata kroz svako crevo za uzorkovanje, pri čemu svako crevo za uzorkovanje može aseptično da se zatvori nakon što medijum za ćelijsku kulturu proteče od supstrata kroz crevo za uzorkovanje, kako bi se sprečilo dalje proticanje medijuma kroz crevo za uzorkovanje; i

[0074] b. najmanje jedno od para creva za uzorkovanje je konfigurisano tako da se aseptično pričvrsti za odvojivi kontejner za uzorkovanje.

[0076] [0029] U konkretnom otelotvorenju, bioreaktor je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma za ćelijsku kulturu. U drugom otelotvorenju, bioreaktor dalje obuhvata drugi par creva za uzorkovanje koja mogu da se zatvore, pri čemu, najmanje jedno od drugog para creva za uzorkovanje je konfigurisano tako da se aseptično pričvrsti za odvojivi kontejner za uzorkovanje. U još jednom otelotvorenju, bioreaktor dalje obuhvata treći par creva za uzorkovanje koja mogu da se zatvore, pri čemu, najmanje jedno od trećeg para creva za uzorkovanje je konfigurisano tako da se aseptično pričvrsti za odvojivi kontejner za uzorkovanje. U drugom otelotvorenju, supstrat obezbeđuje najmanje oko 60 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija, konkretno najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija.

[0078] Takođe je objavljen rekombinantni polipeptid proizveden u bioreaktoru opisanom u prethodnom odeljku. U konkretnom otelotvorenju, polipeptid obuhvata virus. U daljem otelotvorenju, virus obuhvata virusni kapsid koji sadrži nevirusni transgen.

[0080] Ovde je takođe dalje otkriven sud bioreaktora za kulturu adherentnih ćelija koji ima supstrat za kulturu adherentnih ćelija i pumpu koja može da obezbedi odvođenje medijuma ćelijske kulture konstantnom brzinom dovoljnom da se medijum za ćelijsku kulturu u sudu zameni manje od jednom otprilike svaka 3 ½ dana. U konkretnom otelotvorenju, pumpa može da obezbedi odvođenje medijuma ćelijske kulture konstantnom brzinom dovoljnom da se medijum za ćelijsku kulturu u sudu zameni manje od jednom otprilike svaka 4 ½ dana. U daljem konkretnom otelotvorenju, supstrat obezbeđuje najmanje oko 60 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija, konkretno najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija. U još jednom otelotvorenju, bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma ćelijske kulture.

[0082] Takođe je objavljen rekombinantni polipeptid proizveden uzgajanjem adherentnih proizvodnih ćelija u bioreaktoru za adherentne ćelije opisanom u prethodnom odeljku. U konkretnom otelotvorenju, polipeptid obuhvata virus. U drugom otelotvorenju, virus obuhvata virusni kapsid koji sadrži nevirusni transgen.

[0084] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak za uzgajanje adherentnih ćelija na supstratu koji obuhvata:

[0085] a. dobijanje bioreaktora opisanog u odeljcima od drugog do poslednjeg, i zatim b. dodavanje medijuma za ćelijsku kulturu i ćelija u bioreaktor, i zatim

[0086] c. uzgajanje ćelija u adherentnom režimu na supstratu, uz kruženje medijuma za ćelijsku kulturu oko ćelija brzinom manjom od oko 50 ml medijuma na 1800 ćelija dnevno.

[0088] [0034] U konkretnom otelotvorenju, supstrat obezbeđuje najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija. U daljem otelotvorenju, bioreaktor je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma za ćelijsku kulturu.

[0090] Kratak opis slika

[0091]

[0092] Slika 1 šematski prikazuje dve različite metode perfuzije.

[0093] Slika 2 prikazuje način da se sud bioreaktora poveže sa priključkom za uzorkovanje.

[0094] Slika 3 prikazuje verziju našeg poboljšanog priključka za uzorkovanje.

[0096] Detaljan opis

[0097] Primenili smo način da poboljšamo strategiju dovođenja i odvođenja medijuma kod bioreaktora velikog kapaciteta sa kulturom adherentnih ćelija kao što je, na primer, bioreaktor iCELLis<™>500. Komercijalno dostupni bioreaktoru velikog kapaciteta su konstruisani da recirkulišu medijum velikom brzinom; mi smo otkrili da perfuzija medijuma malom brzinom neočekivano poboljšava učinak proizvodnih ćelija. Naš pristup predstavlja jedini pogodan način da se postigne prihvatljivo spor i konstantan protok medijuma za ćelijsku kulturu u sud bioreaktora i iz njega. Konstantan protok medijuma podržava veliku virusnu produktivnost kod inficiranih, transficiranih ili transdukovanih proizvodnih ćelija, pri čemu se izbegava prevelika potrošnja medijuma.

[0099] Sudovi bioreaktora za kulturu adherentnih ćelija obezbeđuju supstrat za koji uzgajane ćelije mogu da prianjaju i da na njemu rastu. Ovaj supstrat je smešten u kontejneru koji sadrži tečni medijum za ćelijsku kulturu.

[0101] Komercijalno dostupni bioreaktori za kulturu adherentnih ćelija opremljeni su „napojnim“ i „odvodnim“ pumpama. Ove pumpe pumpaju medijume za ćelijsku kulturu u kontejner koji sadrži supstrat, odnosno iz njega, i tako obezbeđuju uzgajanim ćelijama svež medijum za uzgajanje i uklanjaju istrošeni medijum i pripadajuće otpadne proizvode uzgajanja.

[0103] Primer 1 - povremeno pumpanje

[0104] [0039] Pumpe mogu biti programirane da rade neprekidno. Radeći neprekidno minimalnom brzinom, napojne i odvodne pumpe iCELLis<™>500 iz prethodnog stanja tehnike proizvode najmanje oko 42,3 l protoka medijuma dnevno (kada rade najmanjom mogućom brzinom, 24 o/min). Kako je kapacitet bioreaktora oko 25 litara, medijum u reaktoru se kompletno zameni skoro dva puta dnevno.

[0106] Koristili smo komercijalno dostupni sud bioreaktora velikog kapaciteta za kulturu adherentnih ćelija da uzgajamo transficirane „proizvodne“ ćelije koje eksprimiraju virusne polipeptide i proizvode virusne čestice. Našli smo da su ove proizvodne ćelije najproduktivnije kada se medijum za ćelijsku kulturu perfunduje brzinom manjom od izlazne zapremine najsporije pumpe u komercijalno dostupnom aparatu.

[0107] Pronalazak je definisan u priloženom skupu zahteva.

[0109] Ovde je otkriven bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija koji sadrži supstrat za kulturu adherentnih ćelija i pumpu koja može da obezbedi odvođenje medijuma ćelijske kulture konstantnom brzinom manjom od oko 50 ml medijuma na 1800 ćelija dnevno. U konkretnom otelotvorenju, pumpa može da obezbedi minimalno odvođenje konstantnom brzinom od najviše oko 16,7 ml medijuma na 1800 ćelija dnevno. U još jednom otelotvorenju, supstrat obezbeđuje najmanje oko 60 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija, konkretno najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija. U još jednom otelotvorenju, bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma ćelijske kulture.

[0111] Ovde je takođe objavljen rekombinantni polipeptid proizveden uzgajanjem adherentnih proizvodnih ćelija u bioreaktoru za adherentne ćelije opisanom u prethodnom odeljku. U konkretnom otelotvorenju, polipeptid obuhvata virus. U još jednom otelotvorenju, virus obuhvata virusni kapsid koji sadrži nevirusni transgen.

[0113] Ovde je takođe dalje objavljen postupak za uzgajanje adherentnih ćelija na supstratu koji obuhvata:

[0114] a. dobijanje bioreaktora opisanog u odeljcima od drugog do poslednjeg, i zatim b. dodavanje medijuma za ćelijsku kulturu i ćelija u bioreaktor, i zatim

[0115] c. uzgajanje ćelija u adherentnom režimu na supstratu, uz kruženje medijuma za ćelijsku kulturu oko ćelija brzinom manjom od oko 50 ml medijuma na 1800 ćelija dnevno.

[0117] [0044] U konkretnom otelotvorenju ovog postupka, supstrat obezbeđuje najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija. U drugom otelotvorenju, bioreaktor je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma za ćelijsku kulturu.

[0119] Ovde je dalje objavljen bioreaktor za uzgajanje adherentnih ćelija koji obuhvata kontejner koji sadrži supstrat za kulturu adherentnih ćelija i pumpu konfigurisanu tako da obezbedi odvođenje medijuma ćelijske kulture konstantnom brzinom uz izlaznu zapreminu pumpe koja je dovoljna da u pomenutom medijumu za ćelijsku kulturu održi parametar odabran iz grupe koja se sastoji od: koncentracije laktata u pomenutom medijumu od najviše 1,58 grama/litar; koncentracije glukoze u pomenutom medijumu od oko 0,5 do 1,0 grama/litar; i koncentracije glukoze u pomenutom medijumu od najmanje oko 2,89 grama/litar. U konkretnom otelotvorenju, bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma za ćelijsku kulturu. U drugom otelotvorenju, supstrat obezbeđuje najmanje oko 60 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija, konkretno najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija. U drugom otelotvorenju, pumpa bioreaktora za uzgajanje adherentnih ćelija je konfigurisana tako da obezbedi odvođenje medijuma za ćelijsku kulturu konstantnom brzinom uz izlaznu zapreminu pumpe koja je dovoljna da u pomenutom medijumu za ćelijsku kulturu održi koncentraciju laktata u pomenutom medijumu od najviše 1,58 grama/litar. U konkretnom otelotvorenju, pumpa je konfigurisana tako da obezbedi odvođenje medijuma za ćelijsku kulturu konstantnom brzinom uz izlaznu zapreminu pumpe koja je dovoljna da u pomenutom medijumu za ćelijsku kulturu održi koncentraciju glukoze u pomenutom medijumu od oko 0,5 do 1,0 grama/litar. U još jednom otelotvorenju, pumpa je konfigurisana tako da obezbedi odvođenje medijuma ćelijske kulture konstantnom brzinom uz izlaznu zapreminu pumpe koja je dovoljna da u pomenutom medijumu za ćelijsku kulturu održi koncentraciju glukoze u pomenutom medijumu od najmanje oko 2,89 grama/litar.

[0121] Ovde je takođe objavljen rekombinantni polipeptid koji proizvode adherentne proizvodne ćelije za uzgajanje u bioreaktoru za adherentne ćelije iz prethodnog odeljka. U konkretnom otelotvorenju, polipeptid obuhvata virus. U još jednom otelotvorenju, virus obuhvata virusni kapsid koji sadrži nevirusni transgen.

[0122] dostupni aparat. Da bismo postigli odgovarajuće malu brzinu perfuzije medijuma za naše svrhe, programirali smo pumpe da rade u određenom vremenskom intervalu, nakon koga sledi interval u kome pumpe uopšte ne pumpaju.

[0123] Zbog ove potrebe da izlaz pumpe varira, u praksi smo videli da osnovna odvodna pumpa bioreaktora iCELLis<™>500 koju obezbeđuje proizvođač ne može da uklanja medijum iz suda bioreaktora na dobro kontrolisan način. Zato smo počeli da testiramo sposobnost pumpi sa manjim učinkom koje mogu da obezbede odgovarajuće mali izlazni protok.

[0125] Primer 2 - pumpanje konstantnom malom brzinom

[0126] Onda smo ispitivali da li promenljivi protok medijuma koji se koristi u prethodnom stanju tehnike može na neki način da utiče na ćelijsku kulturu. Da bismo to uradili, zamenili smo napojnu pumpu iz prethodnog stanja tehnike dostavljenu uz bioreaktor iCELLis<™>500 drugom pumpom koja može da obezbedi manju izlaznu zapreminu, oko 16,7 l/dan. Za sud bioreaktora kapaciteta 25 litara, to znači da se medijumi u sudu izmene jednom na svaka 3 ½ do 4 ½ dana, a ne gotovo dva puta dnevno, što je normalno za prethodno stanje tehnike. Time se protok npr. preko površine supstrata od 100 m<2>smanjuje sa najmanje 42,3 l na 100 m<2>dnevno na 16,7 l na 100 m<2>dnevno. Ova manja brzina napojne pumpe nam je po prvi put omogućila da napojna pumpa radi konstantno, bez periodičnog zaustavljanja.

[0128] Tokom tog rada je zapaženo da odvodna pumpa koju je obezbedio proizvođač nije mogla da izvrši uklanjanje medijuma iz suda bioreaktora tokom procesa kao što je planirano. Zato smo na sličan način zamenili odvodnu pumpu iz prethodnog stanja tehnike koju je obezbedio proizvođač pumpom sa manjim učinkom.

[0130] Izveli smo ciklus u proizvodnom komercijalnom obimu, koristeći rekombinantne adherentne proizvodne ćelije da bismo proizveli rekombinantni adenovirus koji nosi transgen (koristan, npr. za gensku terapiju), pri čemu je u procesu uzgajanja kulture adherentnih ćelija korišćena kombinacija osnovne napojne pumpe iCELLis<™>500 i naše odvodne pumpe sa manjim učinkom. Koristili smo nekoliko transgena (npr. koji kodiraju interferon, ili herpes simpleks timidin kinazu). Naš postupak generalno ima prednosti u proizvodnji vektora sa bilo kojom vrstom transgena (uključujući terapeutske transgene kao što je zeleni fluorescentni protein), ili bilo kojim drugim genetskim elementom ili nukleotidnom sekvencom (npr. virusni vektor koji sadrži transgen RNK, shRNK, IngRNK, eRNK, itd.).

[0132] [0051] Takođe smo izveli tri proizvodna ciklusa u proizvodnom obimu, pri čemu smo koristili našu odvodnu pumpu sa manjim učinkom i takođe smo zamenili osnovnu napojnu pumpu iCELLis<™>500 sa velikim učinkom pumpom sa manjim učinkom. Dobili smo znatno veću proizvodnju adenovirusa u adherentnim proizvodnim ćelijama u svakom od ova tri ciklusa. U ova tri ciklusa,

[0133] Ovde je dalje objavljen postupak za uzgajanje adherentnih ćelija na supstratu koji obuhvata:

[0134] a. dobijanje bioreaktora opisanog u odeljcima od drugog do poslednjeg, i zatim b. dodavanje medijuma za ćelijsku kulturu i ćelija u bioreaktor, i zatim

[0135] c. uzgajanje ćelija u adherentnom režimu na supstratu, uz kruženje medijuma za ćelijsku kulturu oko ćelija takvom brzinom da se u pomenutom medijumu za ćelijsku kulturu održi parametar odabran iz grupe koja se sastoji od: koncentracije laktata u pomenutom medijumu od najviše 1,58 grama/litar; koncentracije glukoze u pomenutom medijumu od oko 0,5 do 1,0 grama/litar; i koncentracije glukoze u pomenutom medijumu od najmanje oko 2,89 grama/litar.

[0137] U konkretnom otelotvorenju, supstrat obezbeđuje najmanje oko 60 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija, konkretno najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija. U još jednom otelotvorenju, bioreaktor je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma za ćelijsku kulturu.

[0139] Ovde je takođe opisan bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija koji obezbeđuje supstrat za rast adherentnih ćelija i konfigurisan je da sadrži medijum za ćelijsku kulturu i da ima pumpu koja može da pumpa pomenute medijume, pri čemu je pumpa konfigurisana tako da obezbedi odvođenje medijuma konstantnom brzinom uz izlaznu zapreminu manju od oko 50 ml medijuma po m<2>površine supstrata na dan. U konkretnom otelotvorenju, bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma za ćelijsku kulturu. U daljem otelotvorenju, supstrat obezbeđuje najmanje oko 60 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija, konkretno najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija. U još jednom otelotvorenju, pumpa je povezana sa supstratom preko creva koje ima unutrašnji prečnik dimenzionisan da primi izlaznu zapreminu fluida pumpe bez nastajanja vazdušnih mehurova u crevu.

[0141] Otkriće takođe obezbeđuje rekombinantni polipeptid proizveden uzgajanjem adherentnih proizvodnih ćelija u bioreaktoru za adherentne ćelije iz prethodnog odeljka. U konkretnom otelotvorenju, polipeptid obuhvata virus. U drugom konkretnom otelotvorenju, virus obuhvata virusni kapsid koji sadrži nevirusni transgen.

[0142] Ovde je takođe objavljen postupak za uzgajanje adherentnih ćelija na supstratu koji obuhvata:

[0143] a. dobijanje bioreaktora opisanog u odeljcima od drugog do poslednjeg, i zatim b. dodavanje medijuma za ćelijsku kulturu i ćelija u bioreaktor, i zatim

[0144] c. uzgajanje ćelija u adherentnom režimu na supstratu, uz kruženje medijuma za ćelijsku kulturu oko ćelija brzinom manjom od oko 50 ml medijuma po m<2>površine supstrata dnevno. U konkretnom otelotvorenju, supstrat obezbeđuje najmanje oko 60 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija, konkretno najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija. U daljem otelotvorenju, bioreaktor je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma za ćelijsku kulturu.

[0146] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak koji obuhvata:

[0147] a. dobijanje bioreaktora za kulturu adherentnih ćelija koji ima supstrat za kulturu adherentnih ćelija i prvo crevo za uzorkovanje koje ima ulazni kraj i izlazni kraj, ulazni kraj prvog creva za uzorkovanje je u komunikaciji sa supstratom, pri čemu tečnost može da teče od supstrata u ulazni kraj prvog creva za uzorkovanje, kroz prvo crevo za uzorkovanje, i izlazi iz bioreaktora na izlaznom kraju prvog creva za uzorkovanje; i zatim

[0148] b. dodavanje medijuma za ćelijsku kulturu u bioreaktor, zasejavanje ćelija u bioreaktor i uzgajanje ćelija koje prianjaju za supstrat, i

[0149] c. proticanje medijuma za ćelijsku kulturu kroz prvo crevo za uzorkovanje, i zatim se produktivnost virusnih čestica po ćeliji povećala za 49,4% u poređenju sa produktivnošću kada se koriste pumpe sa većim učinkom iz prethodnog stanja tehnike.

[0151] [0057] Kada smo promenili proces da radimo sa pumpom sa manjim učinkom, naša produktivnost virusa po ćeliji se neočekivano povećala za 49,4%. Ne želeći da vežemo zakonsko pokriće našeg patenta za bilo koju naučnu uzročnu teoriju, ovo poboljšanje može biti posledica konstantnog napajanja suda bioreaktora svežim medijumom, održavajući stabilan nivo nutrijenata u medijumima u kontaktu sa uzgajanim ćelijama. Na primer, našli smo da su adherentne ćelije najproduktivnije kada je protok medijuma suštinski konstantan i dovoljno spor da se u medijumu za ćelijsku kulturu održi nivo laktata od najviše oko 1,6 grama laktata / litar medijuma za uzgajanje. Takođe, našli smo da su neke adherentne proizvodne ćelije najproduktivnije kada se koncentracija glukoze u medijumu za uzgajanje održava na nivou od oko 0,5 do oko 1,0 grama glukoze na litar medijuma. Druge adherentne proizvodne ćelije su najproduktivnije pri koncentraciji glukoze koja je viša (npr. najmanje oko 2,9 grama po litru) ali se održava da bude relativno konstantna usled sporog ali suštinski konstantnog protoka medijuma. Alternativno, to može biti posledica malog ali konstantnog spiranja neželjenih ćelijskih otpadnih proizvoda sa ćelijske površine. Alternativno, to može biti posledica izbegavanja fizičkog napona na smicanje koji deluje na uzgajane ćelije kada se koristi veći protok medijuma koji je potreban za opremu iz prethodnog stanja tehnike.

[0152] Alternativno, ovaj porast može biti posledica manjeg protoka medijuma koji omogućava da svaka proizvodna ćelija duže vremena proizvodi čestice nalik na virus. Šta god da je uzrok (jedan ili više), našli smo da manji, konstantan protok medijuma neočekivano i značajno povećava produktivnost adherentnih proizvodnih ćelija.

[0154] Ovaj porast je posebno neočekivan zbog činjenice da suspenziona ćelijska kultura (npr. kesa za suspenzionu ćelijsku kulturu CultiBag RM<™>koju prodaje Sartorius Corp., Cambridge Massachusetts) obezbeđuje manje-više konstantan protok medijuma preko ćelijske površine, pa ipak je suspenziona ćelijska kultura poznata u struci kao manje produktivna od adherentne ćelijske kulture.

[0156] Pumpe sa manjim učinkom takođe mogu uspešno da se koriste za inokulaciju ćelija domaćina u sud adherentnog bioreaktora, za izvlačenje uzoraka medijuma za ćelijsku kulturu tokom ćelijskog rasta, i za sakupljanje npr. medijuma za uzgajanje na kraju ćelijskog rasta. Neočekivano smo našli da su svi ovi procesi brži kada se za obavljanje ovih funkcija koristi pumpa sa manjim učinkom, što je nelogično.

[0158] Naš sistem može jednostavno da se umnoži ako se napravi komercijalno dostupni sud bioreaktora velikog kapaciteta za kulturu adherentnih ćelija, odvoji se napojno i odvodno crevo sa pumpi dostavljenih sa tim bioreaktorom, i ta creva se povežu sa eksternim pumpama. Uz

[0159] d. uklanjanje, iz izlaznog kraja prvog creva za uzorkovanje, najmanje jednog uklonjenog dela medijuma za ćelijsku kulturu; i zatim

[0160] e. trajno zaptivanje prvog creva za uzorkovanje bez vraćanja na izlazni kraj creva za uzorkovanje količine materijala uklonjenog dela medijuma za ćelijsku kulturu.

[0161] U konkretnom otelotvorenju, bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija dalje obuhvata drugo crevo za uzorkovanje koje ima ulazni kraj i izlazni kraj, ulazni kraj je u komunikaciji sa supstratom pri čemu tečnost može da teče od supstrata u ulazni kraj drugog creva za uzorkovanje, kroz drugo crevo za uzorkovanje, i izlazi iz bioreaktora na izlaznom kraju creva za uzorkovanje; pri čemu postupak dalje obuhvata:

[0162] f. proticanje medijuma za ćelijsku kulturu kroz drugo crevo za uzorkovanje, i zatim g. uklanjanje, iz izlaznog kraja drugog creva za uzorkovanje, drugog uklonjenog dela medijuma za ćelijsku kulturu; i zatim

[0163] h. trajno zaptivanje drugog creva za uzorkovanje bez vraćanja na izlazni kraj drugog creva za uzorkovanje količine materijala uklonjenog dela medijuma za ćelijsku kulturu.

[0165] U konkretnom otelotvorenju, bioreaktor je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma za ćelijsku kulturu. U još jednom otelotvorenju, supstrat obezbeđuje najmanje oko 60 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija, konkretno najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija. U drugom otelotvorenju, ćelije koje prianjaju za supstrat eksprimiraju rekombinantni polipeptid.

[0167] Dalje je objavljen rekombinantni polipeptid proizveden po postupku iz prethodnog odeljka. U konkretnom otelotvorenju, polipeptid obuhvata virus. U drugom otelotvorenju, virus obuhvata virusni kapsid koji sadrži nevirusni transgen.

[0169] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija koji obuhvata:

[0170] a. supstrat za kulturu adherentnih ćelija u protočnoj vezi sa prvim parom creva za uzorkovanje koja mogu da se zatvore, pri čemu medijum za ćelijsku kulturu može da teče od supstrata kroz svako crevo za uzorkovanje, pri čemu svako crevo za uzorkovanje može aseptično da se zatvori nakon što medijum za ćelijsku kulturu proteče od supstrata kroz crevo za uzorkovanje, kako bi se sprečilo dalje proticanje medijuma kroz crevo za uzorkovanje; i

[0171] b. najmanje jedno od para creva za uzorkovanje je konfigurisano tako da se aseptično pričvrsti za odvojivi kontejner za uzorkovanje.

[0173] [0065] U konkretnom otelotvorenju, bioreaktor je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma za ćelijsku kulturu. U drugom otelotvorenju, bioreaktor dalje obuhvata drugi par creva za uzorkovanje koja mogu da se zatvore, pri čemu, najmanje jedno od drugog para creva za uzorkovanje je konfigurisano tako da se aseptično pričvrsti za odvojivi kontejner za uzorkovanje. U još jednom otelotvorenju, bioreaktor dalje obuhvata treći par creva za uzorkovanje koja mogu da se zatvore, pri čemu, najmanje jedno od trećeg para creva za uzorkovanje je konfigurisano tako da se aseptično pričvrsti za odvojivi kontejner za uzorkovanje. U drugom otelotvorenju, supstrat obezbeđuje najmanje oko 60 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija, konkretno najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija.

[0175] Takođe je objavljen rekombinantni polipeptid proizveden u bioreaktoru opisanom u prethodnom odeljku. U konkretnom otelotvorenju, polipeptid obuhvata virus. U daljem otelotvorenju, virus obuhvata virusni kapsid koji sadrži nevirusni transgen.

[0177] Ovde je takođe dalje otkriven sud bioreaktora za kulturu adherentnih ćelija koji ima supstrat za kulturu adherentnih ćelija i pumpu koja može da obezbedi odvođenje medijuma ćelijske kulture konstantnom brzinom dovoljnom da se medijum za ćelijsku kulturu u sudu zameni manje od jednom otprilike svaka 3 ½ dana. U konkretnom otelotvorenju, pumpa može da obezbedi odvođenje medijuma ćelijske kulture konstantnom brzinom eksternih pumpi. Međutim, kod eksternih pumpi rukovalac može izgubiti sposobnost da upravlja njima preko kompjutera koji upravlja bioreaktorom (i ugrađenim pumpama). Na primer, komercijalno dostupni adherentni bioreaktor velikog kapaciteta obično obuhvata senzor koji meri nivo tečnog medijuma za ćelijsku kulturu u sudu bioreaktora, radi praćenja da li je supstrat za ćelijsku kulturu adekvatno zaronjen u medijum. Eksterne pumpe možda neće biti automatski regulisane putem povratnih kontrolnih petlji koje se automatski aktiviraju putem nivoa tečnog medijuma za ćelijsku kulturu određenog senzorom u sudu bioreaktora. Slično tome, komercijalno dostupni adherentni bioreaktori velikog kapaciteta obično imaju uređaj za snimanje koji snima brzinu rada pumpi. Korišćenjem eksternih pumpi, izlaz možda neće biti automatski evidentiran na kompjuteru. Ovi nedostaci mogu da se prevaziđu kalibracijom eksternih pumpi pre upotrebe i redovnim ručnim praćenjem protoka medijuma za uzgajanje u sud bioreaktora i iz njega, i snimanjem svih koraka ručno u proizvodnu evidenciju šarže. Alternativno, nove pumpe mogu da se povežu na kontrolni kompjuter bioreaktora, tako da pumpe malog učinka mogu da se regulišu i prate slično i istovremeno, kao i za sam bioreaktor.

[0178] Pumpama može da se upravlja putem softvera ili eksterne kalibracije, ili regulacijom putem nominalne brzine motora (o/min), ili koristeći ravnotežu ili sistem za kontrolu putem mase. Alternativno, pumpama može da se upravlja ručno, ili mogu da imaju automatsku kontrolu brzine ili bilo koji drugi pogodan način za kontrolu pumpe. Precizni postupak za regulaciju nije od kritičnog značaja, sve dok pumpa može da obezbedi neprekidan izlaz sa malim protokom za koji smo neočekivano utvrdili da je povoljan za povećanu proizvodnju adherentnih ćelija.

[0180] Naš manji protok je delotvoran za kasete adherentnih ćelija veće površine (npr. kaseta od 500 m<2>). Manji protok takođe može delotvorno da se koristi sa kasetama supstrata manje površine, na primer kasete sa 66 m<2>vlakana.

[0182] Naš sistem može da se koristi za uzgajanje adherentnih proizvodnih ćelija koje eksprimiraju virusni polipeptid i tako proizvode rekombinantne viruse ili čestice nalik na virus (koristimo termin „virus“ u priloženim pravnim zahtevima da obuhvatimo i viruse i čestice nalik na virus).

[0184] Primer 3 - priključak za jednosmerno uzorkovanje

[0185] Priključak bioreaktora za uzorkovanje se koristi za uzimanje tečnih uzoraka medijuma za ćelijsku kulturu iz suda bioreaktora npr. radi provere pH ili merenja glukoze, metabolita i otpadnih ćelijskih proizvoda (npr. laktata) ili drugih supstanci u medijumu.

[0187] Neočekivano smo našli da je osnovni priključak za uzorkovanje ponuđen kao deo komercijalno dostupnog iCELLis<™>osetljiv na kontaminaciju. Uspešno smo medijum dovoljno da se medijum za ćelijsku kulturu u sudu zameni manje od jednom otprilike svaka 4 ½ dana. U daljem konkretnom otelotvorenju, supstrat obezbeđuje najmanje oko 60 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija, konkretno najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija. U još jednom otelotvorenju, bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma ćelijske kulture.

[0189] [0073] Takođe je objavljen rekombinantni polipeptid proizveden uzgajanjem adherentnih proizvodnih ćelija u bioreaktoru za adherentne ćelije opisanom u prethodnom odeljku. U konkretnom otelotvorenju, polipeptid obuhvata virus. U drugom otelotvorenju, virus obuhvata virusni kapsid koji sadrži nevirusni transgen.

[0191] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak za uzgajanje adherentnih ćelija na supstratu koji obuhvata:

[0192] a. dobijanje bioreaktora opisanog u odeljcima od drugog do poslednjeg, i zatim b. dodavanje medijuma za ćelijsku kulturu i ćelija u bioreaktor, i zatim

[0193] c. uzgajanje ćelija u adherentnom režimu na supstratu, uz kruženje medijuma za ćelijsku kulturu oko ćelija brzinom manjom od oko 50 ml medijuma na 1800 ćelija dnevno.

[0195] U konkretnom otelotvorenju, supstrat obezbeđuje najmanje oko 400 m<2>površine za kulturu adherentnih ćelija. U daljem otelotvorenju, bioreaktor je konfigurisan tako da sadrži najmanje oko 20 litara medijuma za ćelijsku kulturu.

[0196] konstruisali novi priključak za uzorkovanje za bioreaktor radi otklanjanja potrebe za pumpanjem medijuma u sud bioreaktora i iz njega u bocu za uzorkovanje. Na taj način smanjujemo rizik od kontaminacije usled uzorkovanja.

[0198] Šematski crtež bioreaktora za adherentno uzgajanje prikazan je na Slici 2. Bioreaktor se sastoji od suda [1] koji sadrži supstrat za ćelijsku kulturu [2] za koji ćelije prianjaju kada se uzgajaju u adherentnom režimu. Sud [1] napunjen je tečnim medijumom za ćelijsku kulturu koji ispira supstrat za ćelijsku kulturu [2]. Sud [1] ima odušku koja sadrži filter za vazduh [3] koji ima izlaznu odušku [4]. Izlazna oduška [4] može da ventilira višak gasa iz suda bioreaktora a filter [3] filtrira gas koji teče kroz filter da spreči čestične zagađivače (npr. virusne čestice, spore gljiva) da izađu iz suda bioreaktora ili u njega uđu. Filter [3] je poželjno odvojivo povezan sa sudom [1] preko ventilacionog creva [5]. Alternativno, filter može biti ugrađen u telo suda [1], iako tada postoji rizik da se omogući prskanje tečnog medijuma za ćelijsku kulturu na filter i da se on zapuši. Poželjno, ventilaciono crevo ima stezaljku [6] koja omogućava da tehničar zatvori ventilaciono crevo [5] po želji.

[0200] [0077] Sud [1] takođe ima crevo za uzorkovanje [7] sa ulaznim krajem [7a] koji ulazi u tečni medijum za ćelijsku kulturu i tako može da uvuče tečni medijum. Poželjno, crevo za uzorkovanje [7] takođe ima stezaljku [8] koja omogućava da tehničar zatvori crevo za uzorkovanje [7] po želji. Crevo za uzorkovanje [7] ima vezu [9] koja omogućava njegovo povezivanje sa uređajem za uzorkovanje. Uređaj za uzorkovanje može biti odvojiva kesa za uzorkovanje ili boca. Međutim, preporučujemo da uređaj za uzorkovanje sadrži priključak za uzorkovanje [Slika 3] koji može da se poveže sa dve odvojive kese za uzorkovanje ili boce.

[0202] Priključak za uzorkovanje [Slika 3] povezan je [9] sa crevom za uzorkovanje [7]. Priključak za uzorkovanje obuhvata crevo za otpad [10] koje ima ulazni kraj [10a] i izlazni kraj [10b], i izlazni kraj [7b] creva za uzorkovanje [7] koji može da se poveže sa uklonjivim kontejnerom za uzorkovanje [11]. Kontejner za uzorkovanje [11] može biti, na primer, kesa ili boca.

[0204] Komercijalno dostupni priključak za uzorkovanje iz prethodnog stanja tehnike zasniva se na ideji da prvih približno 200 ml medijuma za ćelijsku kulturu služi samo za ispiranje, i pumpa se kroz priključak da se ispere unutrašnjost priključka. Taj medijum za ispiranje izlazi iz priključka kroz izlazni otvor u bocu za privremeno skladištenje. Dodatni medijum za ćelijsku kulturu se onda pumpa kroz priključak, i sakuplja se uzorak. Nakon što se uzme uzorak, oko 200 ml medijuma za ispiranje ćelijske kulture koji je prvobitno sakupljen u boci za privremeno skladištenje pumpanjem se iz boce vraća u priključak i u sud bioreaktora [1], tako da što manje medijuma ostane u priključku za uzorkovanje. Boca za privremeno skladištenje i crevo mogu da se isprazne jer konfiguracija iz prethodnog stanja tehnike obezbeđuje aseptični filter u boci za uzorkovanje, i taj filter omogućava da okolni vazduh izlazi i ulazi u bocu (kada se tečnost pumpa u bocu odnosno iz boce), pri čemu filter filtrira zagađivače nošene vazduhom u okolni vazduh i tako sprečava kontaminaciju medijuma za ćelijsku kulturu.

[0206] Međutim, ako je narušena celovitost filtera, to može predstavljati glavni rizik od kontaminacije koji se teško detektuje sve dok cela proizvodna šarža ne bude kontaminirana. Koristeći komercijalno dostupnu konfiguraciju iz prethodnog stanja tehnike, zapravo smo napravili kontaminaciju proizvodne šarže u komercijalnom obimu. Procenjujući neuspeh, primećeno je da je aseptični filter za vazduh u boci za uzorkovanje polomljen, mada nije jasno kako se to desilo.

[0208] Zato smo konstruisali novi priključak za uzorkovanje koristeći različitu tehniku uzorkovanja. Uspešno smo ga ispitali najmanje na četiri proizvodne šarže u komercijalnom obimu, i nismo imali nikakvih problema.

[0209] Pomoću našeg priključka za uzorkovanje otklonili smo potrebu da pumpamo tečnost medijuma za ćelijsku kulturu iz suda bioreaktora i nazad. Naprotiv, sa našim priključkom za uzorkovanje, kada se tečnost uzme is suda bioreaktora, nikad se ponovo ne pumpa nazad. Time se znatno smanjuje rizik od kontaminacije.

[0211] Naš priključak za uzorkovanje je opisan na Slici 3. Naš priključak za uzorkovanje poželjno izrađujemo od komercijalno dostupnog creva C-flex, creva Masterflex<™>, stezaljki i komercijalno dostupnih polimernih konektora creva. Crevo može biti nesterilno ili sterilisano npr. tehnikama na bazi temperature ili vlage, kao što je autoklav, ili sterilizacija gama zračenjem ili na bazi gasa kao što je etilen. Crevo može biti gotovo ili prilagođeno od strane korisnika. Samo je poželjno da bude kompatibilno sa komercijalno dostupnim sterilnim vezama tako da može da se grana sa vezama bilo kog tipa, i pogodno za zaptivanje i zavarivanje.

[0213] Naš priključak za uzorkovanje može biti povezan sa bioreaktorom kao što je bioreaktor iCELLis<™>500 preko MPC konektora. Kada se koristi sa bioreaktorom iCELLis, naš priključak za uzorkovanje može kompletno da zameni priključak za uzorkovanje koji nudi Pall Life Sciences kao deo komercijalno dostupnog početnog kompleta, koji se prodaje sa bioreaktorom iCELLis<™>500.

[0215] U našem priključku za uzorkovanje koristimo dva creva da uzmemo jedan uzorak. Jedno crevo se koristi da ispere unutrašnjost priključka, a drugo crevo se koristi nakon ispiranja da se uzme uzorak. Na primer, crevo [15] može da se koristi za ispiranje priključka a zatim se koristi crevo [7] za uzimanje uzorka.

[0217] Na početku, kesa ili boca [11, 17, 19] za uzorkovanje za jednokratnu upotrebu aseptično se pričvrsti (poželjno zavarivanjem) na crevo za uzorkovanje [7]. Takođe (što preporučujemo) boca za uzorkovanje [19] može da se pričvrsti za prvi vod (za ispiranje) od ova dva [15]. Alternativno, prvi vod može da se prazni u bocu za otpad, itd.

[0219] [0087] U cilju upotrebe našeg postupka uzorkovanja, tečni medijum za ćelijsku kulturu se pumpa od suda bioreaktora [1] ili pratećeg rezervoara za medijume kroz priključak radi ispiranja unutrašnjosti. To se radi zbog ispiranja priključka i dovođenja svežeg medijuma/tečnosti iz suda [1] u priključak. Ovaj medijum od ispiranja se uklanja iz priključka preko creva za ispiranje [15] u kontejner za medijum od ispiranja [19]. Crevo za ispiranje [15] se onda zaptiva ili zatvara. To je moguće uraditi pomoću stezaljke za crevo [12] (kao što je prikazano). Alternativno, crevo može da se zaptiva pomoću zaptivnog zatvarača [na 15b], ili se zatvara zavarivanjem [na 15b], itd. Način zaptivanja ovde nije naročito važan. Crevo za ispiranje [15] nakon toga ostaje zaptiveno u preostalom delu proizvodnog ciklusa. U priloženim pravnim zahtevima, ukazujemo na zaptivanje u preostalom delu proizvodnog ciklusa kao „trajno“ zaptivanje jer je ono suštinski trajno u sklopu datog proizvodnog ciklusa (tj. traje do njegovog kraja).

[0221] Izlazni kraj [7b] creva za uzorkovanje koji ide u kontejner za uzorkovanje [11], onda se otvara [13]. Sveži medijum/tečnost pumpa se iz suda bioreaktora [1] (npr. od dela bioreaktora u kome je smešten supstrat adherentne ćelijske kulture) u crevo za uzorkovanje [7], a zatim iz njega [7b] u kontejner za uzorkovanje [11]. Mada smo prikazali jedan kontejner za uzorkovanje ([11]), alternativno može da se koristi nekoliko kontejnera za uzorkovanje i da se uzme nekoliko fizički odvojenih uzoraka. Crevo za uzorkovanje [7] se onda zatvara [13]. Kontejner za uzorkovanje [11] onda može da se zatvori i ukloni sa izlaza [7b] creva za uzorkovanje. Nakon uzimanja uzorka, dve grane priključka [15, 7] ostaju zaptivene u preostalom vremenu trajanja proizvodnog ciklusa. Preporučujemo da se oba creva isprazne da bi se uklonio zaostali medijum, kako bi se smanjio rizik od kontaminacije.

[0223] Kese za uzorkovanje [11] obezbeđuju port za uzorkovanje koji se koristi za aseptično izvlačenje tečnosti iz kese za uzorkovanje radi testa. Tako može aseptično da se uzme nekoliko uzoraka iz jedne kese.

[0225] [0090] Da bi se omogućilo redno uzorkovanje u različitim terminima, korisno je obezbediti nekoliko pari creva za uzorkovanje. U tom slučaju, drugo (ili naredno) uzorkovanje može da se izvrši na sličan način kao i prvo, koristeći različit par creva priključka i drugu kesu za uzorkovanje pričvršćenu za drugo crevo tog drugog para creva. Na primer, da bi se uzeo drugi uzorak, može da se koristi vod [10] kao crevo za ispiranje i vod [16] kao crevo uzorkovanje, dok se uzorak uzima u kontejner [17]). Medijum/tečnost koji su preostali u priključku od prvog uzorkovanja odbacuju se ispumpavanjem iz priključka [10b], poželjno u prijemni sud ili kontejner za ispiranje ili otpad sve dok sveži medijum/tečnost iz supstrata bioreaktora ne napuni priključak. Drugo crevo za ispiranje [10] se onda zaptiva ili zatvara. To je moguće uraditi pomoću stezaljke za crevo [12] (kao što je prikazano). Alternativno, crevo može da se zaptiva pomoću zaptivnog zatvarača, ili se zatvara zavarivanjem, itd. Način zaptivanja ovde nije naročito važan. Drugo crevo za ispiranje [10] nakon toga ostaje zaptiveno u preostalom delu proizvodnog ciklusa.

[0227] Drugo crevo za uzorkovanje [16] se onda otvara [13]. Sveži medijum/tečnost se pumpa iz suda bioreaktora [1] (npr. od dela bioreaktora u kome je smešten supstrat adherentne ćelijske kulture) u drugo crevo za uzorkovanje [16], a zatim iz njega [16b] u drugi kontejner (kontejnere) za uzorkovanje [17]. Crevo za uzorkovanje drugog para [16] se onda zatvara [13]. Kontejner (kontejneri) za uzorkovanje [17] onda može da se zaptiva i ukloni. Nakon uzimanja uzorka, dve grane priključka [10, 16] ostaju zaptivene u preostalom vremenu trajanja proizvodnog ciklusa.

[0229] Ova konfiguracija može da se ponavlja po želji, obezbeđujući onoliko parova creva za ispiranje i uzorkovanje koliko se želi da se omogući broj različitih termina po želji.

[0231] Kod našeg porta za uzorkovanje, trenutni nedostatak je potreba da se konstruiše priključak (umesto da se nabavi na tržištu). Drugi nedostatak može biti upotreba nekoliko kesa za uzorkovanje za svaku proizvodnu šaržu. Međutim, ovi nedostaci su u velikoj meri kompenzovani smanjenom mogućnošću kontaminacije proizvodne šarže, koja kod proizvodnje u komercijalnom obimu predstavlja značajan finansijski rizik.

Claims

1. Patentni zahtevi

1. Bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija koji obuhvata:

supstrat za kulturu adherentnih ćelija, i

pumpu koja može da obezbedi odvođenje medijuma za ćelijsku kulturu konstantnom brzinom dovoljnom da se medijum za ćelijsku kulturu u sudu zameni manje od jednom otprilike svaka 3 ½ dana, i pri čemu je bioreaktor konfigurisan da sadrži najmanje 20 litara medijuma za ćelijsku kulturu.

2. Bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija iz zahteva 1, pri čemu pumpa može da obezbedi odvođenje medijuma ćelijske kulture konstantnom brzinom dovoljnom da se medijum za ćelijsku kulturu u sudu zameni najviše jednom svaka 4 ½ dana.

3. Bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija iz zahteva 1, pri čemu supstrat ima površinu od najmanje 60 m<2>.

4. Bioreaktor za kulturu adherentnih ćelija iz zahteva 3, pri čemu supstrat ima površinu od najmanje 400 m<2>.

5. Postupak za uzgajanje adherentnih ćelija na supstratu koji obuhvata:

a. dobijanje bioreaktora iz zahteva 1, a zatim

b. dodavanje medijuma za ćelijsku kulturu i ćelija u bioreaktor, i zatim

c. uzgajanje ćelija u adherentnom režimu na supstratu, uz kruženje medijuma za ćelijsku kulturu oko ćelija brzinom dovoljnom da se medijum za ćelijsku kulturu u bioreaktoru zameni manje od jednom otprilike svaka 3 ½ dana.

6. Postupak iz zahteva 5, pri čemu ćelije u adherentnom režimu proizvode rekombinantni polipeptid.

7. Postupak iz zahteva 6, u kome ćelije u adherentnom režimu proizvode virus.

8. Postupak iz zahteva 7, u kome virus obuhvata virusni kapsid koji sadrži nevirusni transgen.

9. Postupak iz zahteva 5, pri čemu supstrat ima površinu od najmanje 400 m<2>.