RS67417B1 - Humana antitela na fel d1 i postupci njihove upotrebe - Google Patents

Humana antitela na fel d1 i postupci njihove upotrebe

Info

Publication number
RS67417B1
RS67417B1 RS20251155A RSP20251155A RS67417B1 RS 67417 B1 RS67417 B1 RS 67417B1 RS 20251155 A RS20251155 A RS 20251155A RS P20251155 A RSP20251155 A RS P20251155A RS 67417 B1 RS67417 B1 RS 67417B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
fel
antibody
cat
seq
antigen
Prior art date
Application number
RS20251155A
Other languages
English (en)
Inventor
Jamie Orengo
Andrew J Murphy
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48326501&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS67417(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS67417B1 publication Critical patent/RS67417B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/35—Allergens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/14—Decongestants or antiallergics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16311—Influenzavirus C, i.e. influenza C virus
    • C12N2760/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Description

[0001] Opis pronalaska
[0003] OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PRONALAZAK ODNOSI
[0005] Predmetni pronalazak se odnosi na humana antitela i fragmente koji vezuju antigen humanih antitela koji specifično vezuju alergen iz mačke Fel d1, terapijske kompozicije koje sadrže antitela i postupke upotrebe ovih antitela.
[0007] POZNATO STANJE TEHNIKE
[0009] Fel d1 protein je mačji protein koji se izlučuje i koji pripada sekretoglobinskoj familiji malih heterodimernih proteina povezanih disulfidnim vezama koji se mogu pronaći samo kod sisara (Klug J. i saradnici (2000), Ann N. Y. Acad. Sci.923:348-354). Glavni je uzrok alergije na mačke kod lјudi (Platts-Mills T.A. i saradnici (1997), J. Allergy Clin. Immunol.100:S2-S24). Oko 90-95% pacijenata alergičnih na mačke karakteriše IgE odgovor na Fel d1 protein (van Ree i saradnici (1999), J. Allergy Clin. Immunol.
[0010] 104:1223-1230). Simptomi kod pacijenta kod koga dolazi do alergijskog odgovora na Fel d1, mogu biti opsega od blagog rinitisa i konjuktivitisa do astmatičnih odgovora opasnih po život. Fel d1 proizvode lojne žlezde i skvamozne žlezde, kao i skvamozne epitelne ćelije, i prenosi se na krzno lizanjem i lickanjem (Bartholome K. i saradnici (1985), J. Allergy Clin. Immunol.76:503-506; Charpin C. i saradnici (1991), J. Allergy Clin. Immunol.88:77-82; Dabrowski A.J. (1990) i saradnici, J. Allergy Clin. Immunol.
[0011] 86:462-465). Prisutan je i u plјuvačnim, perianalnim i suznim žlezdama (Andersen M.C. i saradnici (1985), J. Allergy Clin. Immunol.76:563-569; van Milligen F.J. (1992) i saradnici, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol.92(4):375-378), a deluje da su glavni rezervoari koža i krzno (Mata P. i saradnici (1992), Ann. Allergy 69(4):321-322).
[0012] [0003] Prirodan Fel d1 je heterodimerni glikoprotein od približno 18 kDa. Svaki heterodimer sadrži dva polipeptidna lanca, koji su kovalentno povezani sa tri međulančane disulfidne veze i koji su kodirani sa dva odvojena gena (Duffort OA i saradnici (1991), Mol. Immunol. 28:301-309; Morgenstern JP i saradnici (1991), PNAS 88:9690-9694; Griffith I.J. i saradnici (1992), Gene 113:263-268; Kristensen A.K. i saradnici (1997), Biol. Chem.378:899-908). Lanac 1 sadrži 70 aminokiselinskih ostataka, dok lanac 2 sadrži oko 90-92 aminokiselinska ostataka. Strukturno, dva lanca su slična, ali je identičnost sekvenci samo 10-15% (Kaiser L. i saradnici (2003), J. Biol. Chem. 278(39):37730-37735). Iako se svaki lanac pojedinačno ponekad označava kao Fel d1, oba lanca su potrebna za potpun proteinski alergen.
[0013] Funkcija proteina Fel d1 kod životinje nije poznata, ali kod osetlјivih lјudi protein prouzrokuje IgG ili IgE reakciju (bilo u vidu alergijskog ili astmatičnog odgovora). Iako su poznati i drugi mačji alergeni, uklјučujući Fel d2 (albumin) i Fel d3 (cistatin), od 60% do 90% proizvedenog anti-mačjeg IgE je usmereno na Fel d1 (Leitermann K. i saradnici, (1984), J Allergy Clin. Immunol. 74:147-153; Lowenstein H. i saradnici, (1985), Allergy 40:430-441; van Ree R. i saradnici, (1999), J. Allergy Clin. Immunol.104:1223-1230; Ichikawa K. i saradnici, (2011), Clin. Exp. Allergy, 31:1279-1286).
[0014] Imunoglobulin E (IgE) je odgovoran za preosetlјivost tipa 1, koja se sama po sebi manifestuje alergijskim rinitisom, alergijskim konjuktivitisom, polenskom groznicom, alergijskom astmom, alergijom na venom pčela i alergijama na hranu. IgE cirkuliše u krvi i vezuje se za FcεR1α receptore visokog afiniteta za IgE na bazofilima i mastocitima. Kod većine alergijskih reakcija, alergeni ulaze u organizam udisanjem, gutanjem ili kroz kožu. Alergen se zatim vezuje za prethodno obrazovan IgE koji je prethodno vezan za receptor visokog afiniteta na površinama mastocita i bazofila, što rezultuje unakrsnim povezivanjem nekoliko IgE molekula i pokretanjem oslobađanja histamina i drugih inflamatornih medijatora, a što dalje prouzrokuje razne alergijske simptome.
[0015] Lečenje alergija podrazumeva upotrebu steroida za suzbijanje imunske aktivnosti, kao i bronhijalnih dilatatora za ublažavanje simptoma astme. Desenzibilizaciona terapija se takođe upotrebljava kod izrazito alergičnih pacijenata. Kombinacije peptidnih vakcina na određene alergene su bile ispitivane kod desenzitizovanih osoba, npr. za Fel d1 (pogledati US2010/0239599A1 i EP2380591A2). Kao tretmani za alergije su predlagana i antitela, pošto ona mogu biti u stanju da blokiraju ulazak alergenih molekula u sluzokožna tkiva ili pošto mogu vezivati alergen pre nego što mu se ukaže prilika da se veže za IgE koji je vezan za receptor visokog afiniteta na mastocitima ili bazofilima, čime se sprečava oslobađanje histamina i drugih inflamatornih medijatora iz ovih ćelija.
[0016] U.S. patent broj 5,670,626 opisuje upotrebu monoklonskih antitela za lečenje alergijskih oboljenja posredovanih sa IgE, kao što su alergijski rinitis, alergijska astma i alergijski konjuktivitis, blokiranjem vezivanja alergena za sluzokožna tkiva. U.S. patent broj 6,849,259 opisuje upotrebu antitela specifičnih za alergen, da bi se inhibirala alergijska inflamacija u in vivo mišjem modelu alergije. Opisani su sistemi antitela na bazi mleka i na bazi jaja. Na primer, US20030003133A1 prijavljuje upotrebu mleka kao nosača alergena u cilju indukovanja oralne tolerancije na mačju perut i druge alergene. Kompozicije i postupci za smanjenje alergijskog odgovora na alergen iz okoline kod životinja, upotrebom molekula koji inhibira sposobnost alergena da se veže za mastocite, opisane su u US2010/0143266. De Groot i saradnici su opisali druga anti-Fel d1 antitela (de Groot i saradnici (1988), J. Allergy Clin. Immunol.82:778-786).
[0017] Uermösi i saradnici (2010), Journal of Allergy and Clinical Immunology, 126, 375-383 se odnosi na istraživanje mehanizama kojima IgG molekuli specifični za alergen i indukovani desenzitizacijom, inhibiraju alergijske reakcije. WO 2008/145142 A1 odnosi se na stabilizovana IgG4 antitela, postupke za proizvodnju stabilizovanih IgG4 antitela, i upotrebe stabilizovanih IgG4 antitela kao leka. WO 2008/119353 A1 odnosi se na ex vivo postupak za dobijanje bispecifičnog antitela.
[0019] KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0020] Pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži (1) terapeutsku količinu dva ili više izolovana u potpunosti humana monoklonska antitela (mAt) koja specifično vezuju mačji alergen Fel d1, i ili njihove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrži (i) prvo izolovano humano monoklonsko antitelo, i (ii) drugo humano monoklonsko antitelo, kao što je definisano u patentnim zahtevima, i (2) jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa. Takva antitela mogu biti korisna za vezivanje Fel d1 alergena in vivo, nakon izlaganja osetljivog pacijenta mačjem alergenu, a koja kao takva, mogu delovati bilo na pospešivanje klirensa Fel d1 ili na blokiranje vezivanja alergena za prethodno obrazovan IgE na površini mastocita ili bazofila. Delujući tako, antitela pronalaska mogu sprečavati oslobađanje histamina ili drugih inflamatornih medijatora iz mastocita ili bazofila, čime se sprečavaju ili umanjuju nepovoljni efekti koji se uočavaju kod pacijenata osetlјivih na mačji alergen. U određenim primerima izvođenja, antitela mogu biti sposobna da smanje, svedu na minimum ili spreče najmanje jedan simptom kod pacijenata osetlјivih na mačji alergen Fel d1, kao što su kijanje, smetnje u disanju, začeplјenje nosa, kašalј, zviždanje u grudima, bronhokonstrikcija, rinitis ili konjuktivitis. U određenim primerima izvođenja, antitela mogu biti sposobna da spreče još ozbilјnije in vivo komplikacije koje su povezane sa izlaganjem mačjem alergenu kod osetljivih pojedinaca, kao što su astmatični odgovori, anafilasa ili čak smrt.
[0021] Antitela pronalaska mogu biti pune dužine (na primer, IgG1 ili IgG4 antitelo) ili mogu sadržavati samo deo koji vezuje antigen (na primer, sadržavati samo Fab, F(ab')<2>ili scFv fragment), a mogu biti i modifikovana tako da utiču na funkcionalnost, npr. tako da eliminišu rezidualne efektorske funkcije (Reddy i saradnici, (2000), J. Immunol.164:1925-1933).
[0022] U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen je izotipa različitog od IgA izotipa.
[0023] U jednom primeru izvođenja, izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen je izotipa koji je izabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2 i IgG4.
[0024] U jednom aspektu iz opisa, izolovano humano antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, specifično vezuje Fel d1 sa K<D>koja je jednaka ili manja od 10<-6>M. U jednom izvođenju, izolovano humano antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, specifično vezuje Fel d1 sa K<D>koja je jednaka ili manja od 1,8 nM.
[0025] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, obuhvata tri CDR-a teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) sadržana unutar bilo koje od sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 i 460; i tri CDR-a lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) sadržana unutar bilo koje od sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 i 468. Postupci i tehnike za identifikaciju CDR sekvenci unutar HCVR i LCVR aminokiselinskih sekvenci su dobro poznati u oblasti tehnike i mogu biti upotrebljeni za identifikovanje CDR sekvenci unutara određenih HCVR i/ili LCVR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde prijavljene. Konvencije za primer koje mogu biti upotrebljene da bi se identifikovale granice CDR sekvenci obuhvataju, npr. Kabatovu definiciju, definiciju po Čotiji (engl. Chothia) i AtM definiciju. U pricipu, Kabatova definicija se zasniva na varijabilnosti sekvenci, definicija po Čotiji se zasniva na lokaciji strukturnih regiona petlje, dok AbM definicija podrazumeva kombinaciju pristupa po Kabatu i Čotiji. Pogledati npr. "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani i saradnici, (1997), J. Mol. Biol.273:927-948; i Martin i saradnici, (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272. Za identifikaciju CDR sekvenci unutar antitela su dostupne i javne baze podataka.
[0026] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata tri CDR-a teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) sadržana unutar bilo koje od sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 i 460; i tri CDR-a lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) sadržana unutar bilo koje od sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 i 468.
[0027] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 i 460.
[0028] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 i 460.
[0029] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 i 468.
[0030] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži LCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 i 468.
[0031] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži: (a) HCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 i 460; i (b) LCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298,250, 314, 330, 346, 362, 378 i 468.
[0032] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži: (a) HCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 i 460; i (b) LCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 i 468.
[0033] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži:
[0034] (a) HCDR1 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372 i 462;
[0035] (b) HCDR2 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 374 i 464;
[0036] (c) HCDR3 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232,248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376 i 466;
[0037] (d) LCDR1 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs:12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380 i 470;
[0038] (e) LCDR2 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs:
[0039] 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334,
[0040] 350, 366, 382 i 472; i
[0041] (f) LCDR3 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs:
[0042] 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336,
[0043] 352, 368, 384 i 474.
[0044] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži:
[0045] (a) HCDR1 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 20, 68, 132, 164, 244,308, 324, 372 i 462;
[0046] (b) HCDR2 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 22, 70, 134, 166, 246, 310, 326, 374 i 464;
[0047] (c) HCDR3 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 24, 72, 136, 168, 248, 312, 328, 376 i 466;
[0048] (d) LCDR1 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 28, 76, 140, 172, 252, 316, 332, 380 i 470;
[0049] (e) LCDR2 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 30, 78, 142, 174, 254, 318, 334, 382 i 472; i
[0050] (f) LCDR3 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 32, 80, 144, 176, 256, 320, 336, 384 i 474.
[0052] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 370/378 i 460/468.
[0054] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 i 460/468.
[0056] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138 i 162/170.
[0058] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18/26 i 322/330.
[0060] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18/26 i 306/314.
[0061] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18/26 i 370/378.
[0062] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 242/250 i 306/314.
[0063] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 242/250 i 322/330.
[0064] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, interaguje sa najmanje jednom aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka na pozicijama od oko pozicije 15 do oko pozicije 24 u SEQ ID NO: 396; aminokiselinskih ostataka na pozicijama od oko pozicije 85 do oko pozicije 103 u SEQ ID NO: 396; aminokiselinskih ostataka na pozicijama od oko pozicije 85 do oko pozicije 104 u SEQ ID NO: 396; i aminokiselinskih ostataka na pozicijama od oko pozicije 113 do oko pozicije 116 u SEQ ID NO: 396.
[0065] U jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo koje se vezuje za Fel d1 ili njegov fragment koji vezuje antigen, interaguju sa aminokiselinskim ostacima na pozicijama od oko pozicije 15 do oko pozicije 24 u SEQ ID NO: 396.
[0066] U jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, interaguju sa aminokiselinskim ostacima na pozicijama od oko pozicije 85 do oko pozicije 103 u SEQ ID NO: 396.
[0067] U jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, interaguju sa aminokiselinskim ostacima na pozicijama od oko pozicije 85 do oko pozicije 104 u SEQ ID NO: 396.
[0068] U jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, interaguju sa aminokiselinskim ostacima na pozicijama od oko pozicije 113 do oko pozicije 116 u SEQ ID NO: 396.
[0069] U jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, interaguje sa najmanje jednom aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 402, 403, 404 i 412.
[0070] U jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, interaguje sa SEQ ID NO: 402.
[0071] U jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, interaguje sa SEQ ID NO: 403.
[0072] U jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, interaguje sa SEQ ID NO: 404.
[0073] U jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, interaguje sa SEQ ID NO: 426.
[0074] U jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koje se vezuje za Fel d1 interaguje sa SEQ ID NO: 412.
[0075] U jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji interaguje sa SEQ ID NOs: 402, 403, 404 i/ili 426, sadrži tri HCDRs sadržana u varijabilnom region teškog lanca SEQ ID NO: 18 i tri LCDRs sadržana u varijabilnom regionu SEQ ID NO: 26.
[0076] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, interaguje sa SEQ ID NO: 402, 403, 404 i/ili 426, uključuje HCDR1 SEQ ID NO: 20; HCDR2 SEQ ID NO: 22; HCDR3 SEQ ID NO: 24; LCDR1 SEQ ID NO: 28; LCDR2 SEQ ID NO: 30 i LCDR3 SEQ ID NO: 32.
[0077] U jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji interaguju sa SEQ ID NO: 412 sadrži tri HCDR-a sadržana u varijabilnom regionu teškog lanca SEQ ID NO: 306 i tri LCDR-a sadržana u varijabilnom regionu lakog lanca SEQ ID NO: 314.
[0078] Prema jednom aspektu opisa, izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji interaguju sa SEQ ID NO: 412, sadrže HCDR1 iz SEQ ID NO: 308; HCDR2 iz SEQ ID NO: 310; HCDR3 iz SEQ ID NO: 312; LCDR1 iz SEQ ID NO: 316; LCDR2 iz SEQ ID NO: 318 i LCDR3 iz SEQ ID NO: 320.
[0079] Prema jednom aspektu opisa, humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20, 22 i 24, tim redom, i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 28, 30 i 32, tim redom.
[0080] Prema jednom aspektu opisa, humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 68, 70 i 72, tim redom, i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 76, 78 i 80, tim redom.
[0081] Prema jednom aspektu opisa, humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 132, 134 i 136, tim redom, i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 140, 142 i 144, tim redom.
[0082] Prema jednom aspektu opisa, humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 164, 166 i 168, tim redom, i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 172, 174 i 176, tim redom.
[0083] Prema jednom aspektu opisa, humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 244, 246 i 248, tim redom, i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 252, 254 i 256, tim redom.
[0084] Prema jednom aspektu opisa, humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 308, 310 i 312, tim redom, i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 316, 318 i 320, tim redom.
[0085] Prema jednom aspektu opisa, humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 324, 326 i 328, tim redom, i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 332, 334 i 336, tim redom.
[0086] Prema jednom aspektu opisa, humano antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 372, 374 i 376, tim redom, i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 380, 382 i 384, tim redom.
[0087] Prema jednom aspektu, opis obezbeđuje u potpunosti humano monoklonsko antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu antitelo ili njegov fragment ispoljavaju jednu ili više od sledećih karakteristika: (i) sadrže HCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 i 460 ili njihove suštinski slične sekvence koja im je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; (ii) sadrže LCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 i 468 ili njihove suštinski slične sekvence koja im je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; (iii) sadrže HCDR3 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 24, 72, 136, 168, 248, 312, 328, 376 i 466 ili njihove suštinski slične sekvence koja im je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; i domen LCDR3 sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 32, 80, 144, 176, 256, 320, 336, 384 i 474 ili njihove suštinski slične sekvence koja im je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; (iv) sadrže HCDR1 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 20, 68, 132, 164, 244, 308, 324, 372 i 462 ili njihove suštinski slične sekvence koja im je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; HCDR2 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 22, 70, 134, 166, 246, 310, 326, 374 i 464 ili njihove suštinski slične sekvence koja im je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; LCDR1 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 28, 76, 140, 172, 252, 316, 332, 380 i 470 ili njihove suštinski slične sekvence koja im je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; i LCDR2 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 30, 78, 142, 174, 254, 318, 334, 382 i 472 ili njihove suštinski slične sekvence koja im je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje
[0090] 1
[0091] 99%; (v) vezuju se za Fel d1 sa K<D>koja je jednaka ili manja od 10<-6>, a poželjno koja je jednaka ili manja od 10<-9>; (vi) pokazuju efikasnost u najmanje jednom životinjskom modelu anafilakse ili inflamacije; i (vii) u kompeticiji su sa referentnim antitelom u vezivanju za Fel d1.
[0092] "Referentno antitelo" može podrazumevati, na primer, antitela koja sadrže kombinaciju parova aminokiselinskih sekvenci teškog lanca i lakog lanca koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 i 460/468.
[0093] Prema jednom aspektu opisa, u potpunosti humano monoklonsko antitelo koje se vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži HCDR1 sekvencu koja je formule X<1>- X<2>- X<3>- X<4>- X<5>-X<6>- X<7>- X<8>(SEQ ID NO: 386) gde je X<1>Gly, X<2>je Phe, Tyr ili Gly, X<3>je Thr ili Ser, X<4>je Phe ili Ile, X<5>je Ser, Arg, Thr ili Asn, X<6>je Asn, Thr, Asp ili Ser, X<7>je Tyr i X<8>je Asn, Tyr ili Ala; HCDR2 sekvencu koja je formule X<1>- X<2>- X<3>- X<4>- X<5>- X<6>- X<7>- X<8>(SEQ ID NO: 387), gde je X<1>Ile, X<2>je Tyr, Ser ili Asn, X<3>je Tyr, Ser, Gly, Pro ili Asp, X<4>je Asp, Arg ili Ser, X<5>je Gly, Val ili Ser, X<6>je Ser, Gly, Arg ili Tyr, X<7>je Tyr, Arg, Thr, Ser ili Asn i X<8>je Ile, Thr, Ala, Ser ili je odsutan; HCDR3 sekvencu koja je formule X<1>- X<2>- X<3>- X<4>- X<5>- X<6>- X<7>-X<8>- X<9>- X<10>- X<11>- X<12>- X<13>- X<14>- X<15>- X<16>(SEQ ID NO: 388), gde je X<1>Ala, X<2>je Lys ili Arg, X<3>je Arg, Gly, His, Ser, Asp, Leu ili Thr, X<4>je Thr, Pro, Arg, Gly ili Glu, X<5>je Leu, Val, Gly, Lys, Tyr ili Asn, X<6>je Ser, Arg, Thr, Ala, Tyr, Phe ili Trp, X<7>je Tyr, Gly, Arg, Ala, Asn, Asp, His ili Asn, X<8>je Tyr, Thr, Ser ili His, X<9>je Val, Ser, Ala, Phe, Pro ili je odsutan, X<10>je Met, Gly, Asp, Pro, Val ili je odsutan, X<11>je Asp, Tyr, Ser, Gly, Phe ili je odsutan, X<12>je Val, Asp, Phe ili je odsutan, X<13>je Phe, Asp ili je odsutan, X<14>je Phe, Tyr ili je odsutan, X<15>je Asp ili je odsutan, X<16>je Tyr ili je odsutan; LCDR1 sekvencu koja je formule X<1>- X<2>- X<3>- X<4>- X<5>- X<6>-X<7>- X<8>- X<9>- X<10>- X<11>- X<12>(SEQ ID NO: 389), gde je X<1>Gin, X<2>je Gly, Ser ili Asp, X<3>je Ile ili Val, X<4>je Ser, Leu, Asn ili Gly, X<5>je Asn, Tyr, Gly ili Ser, X<6>je Tyr, Ser, Phe ili Trp, X<7>je Ser ili je odsutan, X<8>je Asn ili je odsutan, X<9>je Asn ili je odsutan, X<10>je Lys ili je odsutan, X<11>je Gin ili je odsutan, X<12>je Tyr ili je odsutan; LCDR2 sekvencu koja je formule X<1>- X<2>- X<3>(SEQ ID NO: 390), gde je X<1>Ala, Trp, Asp, Tyr, Lys, Gly ili Ser, X<2>je Ala ili Thr i X<3>je Ser; i LCDR3 sekvencu koja je formule X<1>- X<2>- X<3>- X<4>- X<5>- X<6>- X<7>- X<8>- X<9>(SEQ ID NO: 391), gde je X<1>Gin, Leu ili His, X<2>je Lys, Gin ili His, X<3>je Tyr, Ser ili Leu, X<4>je Tyr, Asn, Gly, Asp ili Ser, X<5>je Ser, Asp ili Asn, X<6>je Leu, Ala, Tyr, Thr ili Phe, X<7>je Pro ili Arg, X<8>je Leu, Phe, Tyr ili Thr i X<9>je Thr ili je odsutan.
[0094] Prema jednom aspektu, opis karakterišu humano antitelo ili fragment koji vezuje antigen specifični za Fel d1, koji sadrže HCVR kodiran segmentima nukleotidne sekvence koji su izvedeni iz V<H>, D<H>i J<H>germinativnih sekvenci, i LCVR kodiran segmentima nukleotidne sekvence koji su izvedeni iz V<K>i J<K>germinativnih sekvenci, u kombinacijama koje su prikazane u Tabeli 2.
[0095] [0059] Pronalazak obuhvata antitela koja karakteriše modifikovan obrazac glikozilacije. U pojedinim primenama, može biti korisna modifikacija koja obezbeđuje uklanjanje nepoželjnog mesta glikozilacije ili npr. uklanjanje fukoznog ostatka, da bi se time povećala funkcija ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) (pogledati Shield i saradnici (2002) JBC 277:26733). U drugim primenama, može biti uvedena modifikacija galaktozilacije da bi se modifikovala citotoksičnost zavisne od komplemenata (CDC).
[0096] Dalji aspekt opisa obezbeđuje izolovano antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji su u kompeticiji specifičnog vezivanja za Fel d1 sa antitelom, ili fragmentom koji vezuje antigen, i koji sadrže regione koje određuju komplementarnost (CDR) varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR), pri čemu je HCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 i 460; kao i CDR sekvence varijabilnih regiona lakog lanca (LCVR), pri čemu je LCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 i 468.
[0097] Jedan aspekt opisa obezbeđuje izolovano antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji su u kompeticiji specifičnog vezivanja za Fel d1 sa antitelom, ili fragmentom koji vezuje antigen, i koji sadrže regione koje određuju komplementarnost (CDR) varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR), pri čemu je HCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 i 460; kao i CDR sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR), pri čemu je LCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 i 468.
[0098] Prema srodnom aspektu, opis obezbeđuje izolovano antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji su u kompeticiji specifičnog vezivanja za Fel d1 sa antitelom, ili fragmentom koji vezuje antigen, koji obuhvataju CDR sekvence teškog i lakog lanca sadržane unutar parova sekvenci teškog i lakog lanca koji su izabrani iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 i 460/468.
[0099] Dalji aspekt opisa obezbeđuje izolovano antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji vezuju isti epitop na Feld 1 kao antitelo ili fragment koji vezuje antigen i koji sadrže regione koji određuju komplementarnost (CDR) iz varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR), pri čemu je HCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 i 460; kao i CDR sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR), pri čemu je LCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 i 468.
[0100] [0064] Jedan aspekt opisa obezbeđuje izolovano antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji vezuju isti epitop na Fel d1 kao antitelo ili fragment koji vezuje antigen i koji sadrže regione koji određuju komplementarnost (CDR) varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR), pri čemu je HCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 i 460; kao i CDR sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR), pri čemu je LCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 i 468.
[0101] U srodnom aspektu, opis obezbeđuje izolovano antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji vezuju isti epitop na Fel d1 kao antitelo ili fragment koji vezuje antigen, i koji sadrže CDR sekvence teškog i lakog lanca sadržane unutar parova sekvenci teških i lakih lanaca izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 i 460/468.
[0102] Dalji aspekt opisa obezbeđuje bispecifičan molekul koji vezuje antigen koji se specifično vezuje za Fel d1, pri čemu molekul sadrži dva domena koji vezuju antigen (dva kraka) koji sadrže HCVR aminokiselinsku sekvencu i LCVR aminokiselinsku sekvencu iz bilo koja dva ili iz više od antitela koja su ovde opisana.
[0103] Prema jednom aspektu opisa, bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži prvi domen koji vezuje antigen koji sadrži HCVR aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 370 i LCVR aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 378, i drugi domen koji vezuje antigen koji sadrži HCVR aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 18 i LCVR aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 378.
[0104] Prema jednom aspektu opisa, bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži prvi domen koji vezuje antigen koji sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 372, 374 i 376, tim redom, i tri regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 380, 382 i 384, tim redom; pri čemu drugi domen koji vezuje antigen sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 20, 22 i 24, i tri regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 380, 382 i 384, tim redom.
[0105] Prema jednom aspektu opisa, bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži prvi domen koji vezuje antigen koji sadrži HCVR aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 306 i LCVR aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 314, kao i drugi domen koji vezuje antigen koji sadrži HCVR aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 18 i LCVR aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 314.
[0106] Prema jednom aspektu opisa, bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži tri regiona koja određuju komplementarnost teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 308, 310 i 312, tim redom, i tri regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 316, 318 i 320, tim redom; pri čemu drugi domen koji vezuje antigen sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) koji se sastoje od
[0109] 1
[0110] aminokiselinskih sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 20, 22 i 24, i tri regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 316, 318 i 320, tim redom,.
[0111] Prema jednom aspektu, opis obezbeđuje izolovano antitelo specifično za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji su u kompeticiji vezivanja za Fel d1 sa bilo kojim od bispecifičnih molekula opisa koji vezuju antigen.
[0112] Prema jednom aspektu, opis obezbeđuje izolovano antitelo specifično za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji se vezuju za isti epitop na Fel d1 kao i bilo koji od bispecifičnih molekula opisa koji vezuju antigen.
[0113] Prema jednom aspektu, bispecifičan molekul koji vezuje antigen je izolovano humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1.
[0114] Prema jednom aspektu, bispecifičan molekul koji vezuje antigen je izolovano humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, pri čemu humano monoklonsko antitelo predstavlja monospecifično antitelo ili bispecifično antitelo.
[0115] Prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži najmanje jedan bispecifičan molekul koji vezuje antigen, kao što je ovde opisano, i farmaceutski prihvatlјiv nosač ili razblaživač.
[0116] Prema jednom aspektu, opis obezbeđuje postupak za lečenje pacijenta koji ispoljava osetlјivost ili alergijsku reakciju na mačku, mačju perut, mačju dlaku ili njen ekstrakt, ili na Fel d1 protein, ili postupak za lečenje najmanje jednog simptoma ili komplikacije povezanih sa osetlјivošću na, ili sa alergijskom reakcijom na mačku, mačju perut, mačju dlaku ili njen ekstrakt, ili na Fel d1 protein, pri čemu postupak obuhvata primenu efektivne količine jednog ili više od bispecifičnih molekula koji vezuju antigen opisa, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži efektivnu količinu jednog ili više od bispecifičnih molekula koji vezuju antigen opisa, pacijentu kome je to potrebno, i pri čemu pacijenta karakteriše smanjena osetlјivost na, ili smanjena alergijska reakcija na mačku, mačju perut, mačju dlaku ili njen ekstrakt, ili na Fel d1 protein, ili pacijent nije iskusio bilo kakvu senzitivnost na, ili alergijsku reakciju na, mačku, mačju perut, mačju dlaku ili njen ekstrakt, ili na protein Fel d1, ili pri čemu pacijent ispoljava smanjenje najmanje jednog simptoma ili komplikacije koji su povezani sa osetlјivošću na, ili sa alergijskom reakcijom na mačku, mačju perut, mačju dlaku ili njen ekstrakt, ili na protein Fel d1, ili pacijent ispoljava smanjenje učestalosti i/ili trajanja najmanje jednog simptoma ili komplikacije povezane sa osetlјivošću na, ili sa alergijskom reakcijom na, mačku, mačju perut, mačju dlaku ili njen ekstrakt, ili na Fel d1 protein, nakon primene bispecifičnih molekula koji vezuju antigen ili kompozicija koje sadrže bispecifične molekule koji vezuju antigen predmetnog opisa.
[0117] Prema jednom aspektu, opis obezbeđuje efektivnu količinu drugog terapijskog sredstava za primenu zajedno sa najmanje jednim bispecifičnim molekulom koji vezuje antigen opisa, a koji je od koristi u umanjenju alergijske reakcije na mačku, mačju perut ili protein Fel d1.
[0118] Drugo terapijsko sredstvo može biti izabrano iz grupe koja se sastoji od kortikosteroida, bronhijalnog dilatatora, antihistaminika, epinefrina, dekongestiva, kortikosteroida, drugog različitog antitela za Fel d1 i peptidne vakcine.
[0119] Prema jednom aspektu, rezultat lečenja sa jednim ili sa više bispecifičnih molekula koji vezuju antigen opisa, samostalno ili u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom, može biti smanjenje alergijskog rinitisa, alergijskog konjuktivitisa, alergijske astme ili anafilaktičkog odgovora nakon izlaganja pacijenta mački, mačjoj peruti ili Fel d1 proteinu.
[0120] Prema daljem aspektu, opis obezbeđuje molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju Fel d1 antitela ili njihove fragmente. Ovde su takođe prikazani rekombinantni ekspresioni vektori koji sadrže nukleinske kiseline opisa, kao i ćelije domaćine u koje su takvi vektori uvode. Takođe su obezbeđeni postupci za proizvodnju antitela gajenjem ćelija domaćina u kulturi ćelija, pod uslovima koji omogućavaju proizvodnju antitela i zatim izdvajanje dobijenih antitela.
[0121] Prema jednom aspektu, opis obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji sadrži HCVR kodiran sekvencom nukleinske kiseline izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369 i 459, ili njihove suštinski slične sekvence koja im je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99%.
[0122] Prema jednom aspektu, HCVR kodira sekvenca nukleinske kiseline koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 17, 65, 129, 161, 241, 305, 321, 369 i 459.
[0123] Prema jednom aspektu, antitelo ili njegov fragment dalјe sadrže LCVR koga kodira sekvenca nukleinske kiseline izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 377 i 467 ili njihove suštinski slične sekvence koja im je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99%.
[0124] Prema jednom aspektu, LCVR kodira sekvenca nukleinske kiseline izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 25, 73, 137, 169, 249, 313, 329, 377 i 467.
[0125] Prema jednom aspektu, opis takođe obezbeđuje antitelo ili fragment antitela koji vezuje antigen koji sadrže HCDR3 domen koga kodira nukleotidna sekvenca izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375 i 465 ili njihove suštinski slične sekvence koja im je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; i LCDR3 domen koga kodira nukleotidna sekvenca izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239,
[0128] 1
[0129] 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383 i 473 ili njihove suštinski slične sekvence koja im je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%.
[0130] Prema jednom aspektu, opis obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji dodatno sadrži HCDR1 domen koga kodira nukleotidna sekvenca izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371 i 461 ili suštinski slična sekvencakoja je sa identičnošću sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; HCDR2 domen koga kodira nukleotidna sekvenca izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357, 373 i 463 ili njihove suštinski slične sekvence koja im je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; LCDR1 domen koga kodira nukleotidna sekvenca izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379 i 469 ili njihove suštinski slične sekvence koja im je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; i LCDR2 domen koga kodira nukleotidna sekvenca izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381 i 471 ili njihove suštinski slične sekvence koja im je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%.
[0131] Takođe je prikazana farmaceutska kompozicija koja sadrži terapijski efektivnu količinu jednog ili više izolovanih humanih antitela ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen koji se specifično vezuju za Fel d1, zajedno sa jednim ili sa više farmaceutski prihvatlјivih eksipijenasa.
[0132] Kao što je gore navedeno, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži terapijski efektivnu količinu dva ili više od izolovanih humani antitela koja se specifično vezuju za Fel d1, ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen, zajedno sa jednim ili sa više farmaceutski prihvatlјivih eksipijenasa.
[0133] Farmaceutska kompozicija pronalaska sadrži:
[0135] a) izolovano prvo, u potpunosti humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje sadrži HCVR sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 18; i LCVR sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 26; i
[0137] b) izolovano drugo, u potpunosti humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje sadrži HCVR sa aminokiselinskom sekvencom kao što je prikazana u SEQ ID NO: 306; i LCVR sa aminokiselinskom sekvencom koja je prikazana u SEQ ID NO: 314.
[0139] Prema jednom aspektu, opis obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži:
[0142] 1
[0143] a) izolovano prvo, u potpunosti humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1 ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži HCVR sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 242; i LCVR sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 250; i
[0145] b) izolovano drugo, u potpunosti humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje sadrži HCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 306, 322 i 460; i LCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 314, 330 i 468.
[0147] U jednom aspektu opisa, farmaceutska kompozicija sadrži:
[0149] a) izolovano prvo, u potpunosti humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci koji se sastoji od SEQ ID NO: 18/26; i
[0151] b) izolovano drugo, u potpunosti humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 66/74, 130/138, 162/170, 306/314, 322/330 370/378 i 460/468.
[0153] U jednom aspektu opisa, farmaceutska kompozicija sadrži:
[0155] a) izolovano prvo humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci koji se sastoji od SEQ ID NO: 18/26; i
[0157] b) izolovano drugo humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci koji se sastoji od SEQ ID NO: 130/138.
[0159] U jednom aspektu opisa, farmaceutska kompozicija sadrži:
[0161] a) izolovano prvo humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci koji se sastoji od SEQ ID NO: 18/26; i
[0164] 1
[0165] b) izolovano drugo humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci koji se sastoji od SEQ ID NO: 322/330.
[0167] U pronalasku, farmaceutska kompozicija sadrži:
[0168] a) izolovano prvo humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci koji se sastoji od SEQ ID NO: 18/26; i
[0169] b) izolovano drugo humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci koji se sastoji od SEQ ID NO: 306/314.
[0171] U aspektu opisa, farmaceutska kompozicija sadrži:
[0173] a) izolovano prvo humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci koji se sastoji od SEQ ID NO: 18/26; i
[0175] b) izolovano drugo humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci koji se sastoji od SEQ ID NO: 370/378.
[0177] Prema jednom aspektu opisa, farmaceutska kompozicija sadrži:
[0179] a) izolovano prvo, u potpunosti humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci koji se sastoji od SEQ ID NO: 242/250; i
[0181] b) izolovano drugo, u potpunosti humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 306/314 i 322/330.
[0183] Prema jednom aspektu opisa, farmaceutska kompozicija sadrži
[0185] a) izolovano prvo humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci koji se sastoji od SEQ ID NO: 242/250; i
[0188] 1
[0189] b) izolovano drugo humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci koji se sastoji od SEQ ID NO: 306/314.
[0191] Prema jednom aspektu opisa, farmaceutska kompozicija sadrži
[0193] a) izolovano prvo humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci koji se sastoji od SEQ ID NO: 242/250; i
[0195] b) izolovano drugo humano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za Fel d1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci koji se sastoji od SEQ ID NO: 322/330.
[0197] Prema jednom aspektu opisa, farmaceutska kompozicija sadrži dva ili više izolovanih humanih monoklonskih antitela koja se specifično vezuju za Fel d1, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrže HCVR/LCVR parove aminokiselinskih sekvenci izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 i 460/468.
[0198] U jednom aspektu opisa, farmaceutska kompozicija sadrži četiri izolovana humana monoklonska antitela koja se specifično vezuju za Fel d1, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, pri čemu humana antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen sadrže HCVR/LCVR parove aminokiselinskih sekvenci izabrane iz grupe SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138 i 162/170.
[0199] U aspektu opisa, ovde opisana kompozicija predstavlјa kombinaciju terapijski efektivne količine jednog ili više anti-Fel d1 antitela opisa ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen i terapijski efektivne količine drugog terapijskog sredstva.
[0200] Drugo terapijsko sredstvo može biti lek tipa malog molekula, protein/polipeptid, antitelo, molekul nukleinske kiseline, kao što je anti-sens molekul ili siRNA. Drugo terapijsko sredstvo može biti sintetisano ili prirodno izvedeno.
[0201] Drugo terapijsko sredstvo može biti bilo koje sredstvo čija je prednost da se može kombinovati sa antitelom opisa ili njegovim fragmentom, na primer, sa antitelom drugačijim od onih koja su ovde opisana, a koje je sposobno da blokira vezivanje Fel d1 za IgE prisutan na mastocitima ili bazofilima. Drugo terapijsko sredstvo može takođe biti bilo koje sredstvo koje se upotrebljava u standarnoj nezi tokom lečenja alergijskog odgovora na bilo koji alergen. Takvo drugo terapijsko sredstvo može biti antihistaminik, epinefrin, dekongestant, kortikosteroid ili peptidna vakcina.
[0204] 1
[0205] U određenim aspektima, drugo terapijsko sredstvo može biti sredstvo koje potpomaže da se suprotno deluje na, ili da se smanje bilo koji mogući sporedni efekti povezani sa antitelom ili fragmentom koji vezuje antigen antitela pronalaska, ukoliko se takvi sporedni efekti pojave.
[0206] Bitno je takođe napomenuti da farmaceutski prihvatlјive kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljene u kombinovanim terapijama, tj. da antitela i farmaceutski prihvatlјive kompozicije mogu biti primenjene istovremeno sa, pre ili nakon primene jednog ili više drugih želјenih terapeutika ili medicinskih procedura. Izbor konkretne kombinacije terapija (terapeutika ili procedura) za upotrebu u kombinovanom režimu, uzeće se u obzir kompatibilnost želјenih terapeutika i/ili procedura i želјeni terapijski efekat koji je potrebno postići. Potrebno je napomenuti i da primenjene terapije mogu postići želјeni efekat za isti poremećaj (na primer, antitelo može biti primenjeno istovremeno sa drugim sredstvom koje se upotrebljava za lečenje istog poremećaja) ili mogu postići različite efekte (npr. kontrolu bilo kakvih neželjenih efekata). Kako se ovde upotrebljava, dodatna terapijska sredstva koja se obično primenjuju u lečenju i prevenciji ogređenog oboljenja ili stanja, pogodna su za bolest ili stanje koje se leči.
[0207] Kada se istovremeno primenjuje više terapeutika, doze mogu biti prilagođenje shodno okolnostim, kao što je poznato u relevantnoj oblasti tehnike.
[0208] Pronalazak takođe obezbeđuje efektivnu količinu farmaceutske kompozicije pronalaska za upotrebu u postupku lečenja pacijenta koji ispoljava osetljivost na, ili alergijsku reakciju na, mačku, mačju perut, ekstrakt mačje dlake, ili na Fel d1 protein, ili za lečenje najmanje jednog simptoma ili komplikacije povezanih sa osetljivosti na, ili alergijskom reakcijom na mačku, mačju perut, ekstrakt mačje dlake, ili na Fel d1 protein, koji obuhvata primenu farmaceutske kompozicije pronalaska pacijentu kome to potrebno, pri čemu osetljivost na, ili alergijska reakcija na, mačku, mačju perut, ekstrakt mačje dlake, ili na Fel d1 protein je ili sprečena, ili smanjene ozbiljnosti i/ili trajanja, ili najmanje jedan simptom ili komplikacija je povezana sa osetljivosti na, ili alergijskom reakcijom na, mačku, mačju perut, ekstrakt mačje dlake, ili na Fel d1 protein, je smanjena, ili poboljšana, ili je učestalost i/ili trajanje, ili ozbiljnost osetljivosti na, ili alergijske reakcije na mačku, mačju perut, ekstrakt mačje dlake, ili na Fel d1 protein, smanjena nakon primene farmaceutske kompozicije pronalaska.
[0210] U jednom izvođenju, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju iz pronalaska za upotrebu u lečenju pacijenta koji ispoljava osetlјivost ili alergijsku reakciju na mačku, mačju perut, ekstrakt mačje dlake ili protein Fel d1, ili za lečenje najmanje jednog simptoma ili komplikacije povezanih sa osetlјivošću na, ili sa alergijskom reakcijom na mačku, mačju perut, ekstrakt mačje dlake ili protein Fel d1, i pri čemu se osetlјivost na, ili alergijska reakcija na mačku, mačju perut, ekstrakt mačje dlake ili Fel d1 protein bilo sprečava ili se smanjuje u ozbiljnosti i/ili trajanju, ili se sprečava ili
[0213] 2
[0214] ublažava najmanje jedan simptom ili komplikacija koji su povezani sa osetlјivošću na, ili sa alergijskom reakcijom na mačku, mačju perut, mačju dlaku ekstrakt ili protein Fel d1, ili se učestalost i/ili trajanje ili ozbiljnost osetlјivosti ili alergijske reakcije na mačku, mačju perut, ekstrakt mačje dlake ili Fel d1 protein smanjuje.
[0215] Prema jednom aspektu, opis obezbeđuje upotrebu farmaceutske kompozicije koja sadrži jedno ili više antitela iz opisa, ili jedan ili više bispecifičnih molekula koji vezuju antigen koji se specifično vezuju za Fel d1, u cilju proizvodnje medikamenta za upotrebu u lečenju pacijenta koji ispoljava osetlјivost ili alergijsku reakciju na mačku, mačju perut, ekstrakt mačje dlake ili protein Fel d1, ili za lečenje najmanje jednog simptoma ili komplikacija koji su povezani sa osetlјivošću na, ili sa alergijskom reakcijom na mačku, mačju perut, ekstrakt mačje dlake ili Fel d1 protein, pri čemu se osetlјivost na, ili alergijska reakcija na mačku, mačju perut, ekstrakt mačje dlake ili Fel d1 protein sprečava ili umanjuje u ozbiljnosti i/ili trajanju, ili se sprečava ili poboljšava najmanje jedan simptom ili komplikacija povezana sa osetlјivošću na, ili sa alergijskom reakcijom na mačku, mačju perut, ekstrakt mačje dlake ili protein Fel d1, ili sa smanjuje učestalost i/ili trajanje ili ozbiljnost osetlјivosti ili alergijske reakcije na mačku, mačju perut, ekstrakt mačje dlake ili na protein Fel d1.
[0216] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje upotrebu farmaceutske kompozicije pronalaska, pri čemu se kompozicija primenjuje u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom korisnim za umanjenje alergijske reakcije na mačku, mačju perut, ekstrakt mačje dlake ili Fel d1 protein. U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje upotrebu farmaceutske kompozicije kao što je prethodno opisano, pri čemu je drugo terapijsko sredstvo izabrano od kortikosteroida, bronhijalnog dilatatora, antihistaminika, epinefrina, dekongestiva, drugog različitog antitela na Fel d1 i peptidne vakcine.
[0217] U određenim primerima izvođenja, antitela pronalaska mogu biti sposobna da smanje, svedu na minimum ili spreče najmanje jedan od simptoma kod pacijenta osetlјivog na mačji alergen Fel d1, kao što su kijanje, zapušenost, začeplјenje nosa, kašalј, zviždanje u grudima, bronhokonstrikcija, rinitis ili konjuktivitis.
[0218] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija pronalaska može takođe biti uporebljena za sprečavanje ozbilјnijih in vivo komplikacija povezanih sa alergijom na Fel d1, uklјučujući astmatične reakcije, anafilaktički šok ili čak smrt koja je posledica anafilakse.
[0219] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija pronalaskа se primenjuje pacijentu u kombinaciji sa drugim terapijskim sredstvom.
[0220] U drugom primeru izvođenja, drugo terapijsko sredstvo je izabrano iz grupe koja se sastoji od antihistaminika, epinefrina, dekongestiva, kortikosteroida, drugog različitog antitela na Fel d1, peptidne vakcine i bilo koje druge palijativne terapije korisne za smanjenje težine alergijske reakcije ili za ublažavanje najmanje jednog simptoma povezanog sa alergijskom reakcijom.
[0221] Ostali primeri aspekata će postati jasni nakon pregleda detalјnog opisa koji sledi. Bilo koje reference u opisu na postupke lečenja se odnose na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove iz predemetnog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja humanog (ili životinjskog) tela terapijom.
[0223] DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0225] Pre opisa postupaka pronalaska, potrebno je pojasniti da ovaj pronalazak nije ograničen na specifične postupke i eksperimentalne uslove koji su opisani u tekstu specifikacije, pošto takvi postupci i uslovi mogu varirati. Podrazumeva se takođe da je terminologija koja je ovde upotrebljena navedena samo u svrhu opisa konkretnih primera izvođenja i da nije predviđeno da bude ograničavajuća, pošto će područej predmetnog pronalaska biti ograničeno samo priloženim patentnim zahtevima.
[0226] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji su ovde upotrebljeni su sa istim značenjem koje se uobičajeno podrazumeva od strane prosečno iskusnog stručnjaka iz oblasti tehnike kojoj pronalazak pripada. Kao što se ovde upotrebljava, termin "oko/otprilike", kada se koristi u vezi sa određenom navedenom numeričkom vrednošću, označava da vrednost može varirati u odnosu na navedenu vrednost za ne više od 1%. Na primer, kako se ovde upotrebljava, termin „oko 100“ uklјučuje 99 i 101 i sve vrednosti između (na primer, 99,1; 99,2; 99,3; 99,4 itd.).
[0227] Iako u praksi ili ispitivanju predmetnog pronalaska mogu biti upotrebjeni bilo koji postupci ili materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani, u delu koji sledi su opisani poželjni postupci i materijali.
[0229] Definicije
[0231] [0118] Termin "Fel d1" ili "FELD1", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na najmanje jedan Fel d1 protein, bilo u prirodnom/nativnom obliku ili na onaj koji je rekombinantno proizveden. Protein Fel d1 sadrži, ili se alternativno sastoji od lanca 1 (označenog takođe kao lanac A) Fel d1 (SEQ ID NO: 392) i lanca 2 (označenog takođe kao lanac B) Fel d1 (SEQ ID NO: 393). Prirodni Fel d1 protein je heterodimerni glikoprotein od približno 18 kDa koji se sastoji od dva lanca sintetisana na osnovu dva nezavisna gena (pogledati Duffort O.A. i saradnici (1991), Mol. Immunol.28:301-309; Kristensen A.K. i saradnici, (1997), Biol. Chem.378:899-908; Kaiser L. i saradnici (2003), J. Biol. Chem.278(39):37730-37735). Rekombinantno proizveden Fel d1 protein je takođe prikazan kao SEQ ID NO: 396, pri čemu ova sekvenca sadrži aminokiselinske ostatke od 18 do 109 iz Fel d1 lanca B navedenog pod GenBank pristupnim brojem NP_001041619.1 (bez signalne sekvence) koji je fuzionisan u jenom nizu sa aminokiselinskim ostacima 19-88 lanca A iz Fel d1 koji je naveden pod GenBank pristupnim brojem NP_001041618.1 (bez signalne sekvence i sa mutacijom D27G, što odgovara glicinu na poziciji 101 u SEQ ID NO: 396). Primeri ostalih rekombinantno proizvedenih Fel d1 konstrukata pronalaska su navedeni u SEQ ID NO: 385, 394, 395 i 397.
[0232] "Lanac 1" ili "lanac A" Fel d1 je polipeptid koji sadrži ili koji se, alternativno, sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 392 ili njene homologne sekvence. Termin sekvenca homologna SEQ ID NO: 392, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na polipeptid koji je identičan sa SEQ ID NO: 392 u više od 70%, poželјno više od 80%, još poželјnije više od 90% i čak još poželјnije više od 95%. Aminokiselinska sekvenca lanca 1 Fel d1 takođe je obezbeđena u GenBank bazi podataka sa pristupnim brojem P30438 ili sa pristupnim brojem NP_001041618.1, gde je uključen i signalni peptid koji se u zrelom proteinu uklanja.
[0233] "Lanac 2", ili "lanac B" Fel d1 je polipeptid koji sadrži ili koji se, alternativno, sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 393 ili njene homologne sekvence. Termin sekvenca homologna SEQ ID NO: 393, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na polipeptid koji koji je identičan sa SEQ ID NO: 393 u više od 70%, poželјno više od 80%, još poželјnije više od 90% i čak još poželјnije više od 95%. Aminokiselinska sekvenca lanca 2 Fel d1 takođe je obezbeđena u GenBank bazi podataka sa pristupnim brojem P30440 ili sa pristupnim brojem NP_001041619.1, gde je uključen i signalni peptid koji se u zrelom proteinu uklanjna.
[0234] Termin "Fel d1 fragment", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na polipeptid koji sadrži ili se alternativno sastoji od najmanje jednog antigenog mesta iz Fel d1. Prema jednom aspektu, termin "Fel d1 fragment”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na polipeptid koji sadrži ili se alternativno sastoji od najmanje dva antigena mesta iz Fel d1. Prema jednom aspektu, antigena mesta su kovalentno povezana. Prema jednom aspektu, antigena mesta su povezana najmanje jednom peptidnom vezom. Prema jednom aspektu, dve antigena mesta su povezana najmanje jednom peptidnom vezom i spejserom između antigenih mesta. Prema jednom aspektu, najmanje dva antigena mesta potiču iz lanca 1 Fel d1 i iz lanca 2 Fel d1. Prema jednom aspektu, najmanje dva antigena mesta sadrže aminokiselinske sekvence 23-92 iz proteina sa pristupnim brojem P30438 u GenBank bazi i aminokiselinske sekvence 18-109 iz proteina sa pristupnim brojem P30440u GenBank bazi. Prema jednom aspektu, najmanje dva antigena mesta potiču iz lanca 1 Fel d1 i iz lanca 2 Fel d1. Prema jednom aspektu, najmanje dva antigena mesta sadrže aminokiselinske sekvence 19-88 iz proteina sa pristupnim brojem NP_001041618.1 u GenBank bazi i aminokiselinske sekvence 18-109 iz proteina sa pristupnim brojem NP_001041618.1 u GenBank bazi. Prema jednom aspektu, najmanje dva antigena mesta sadrže aminokiselinsku sekvencu unutar bilo koje od SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 ili 397. Prema jednom aspektu, bilo koji od Fel d1 fragmenata je sposoban da indukuje in vivo proizvodnju antitela koja se specifično vezuju za Fel d1 koji se javlja u prirodi ili za rekombinantno proizveden Fel d1.
[0237] 2
[0238] Termin "antitelo", kako se ovde upotrebljava, označava bilo koji molekul ili molekulski kompleks koji vezuje antigen, koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) i koji se specifično vezuje za ili interaguje sa određeni antigenom (npr. Fel d1). Predviđeno je da se termin "antitelo", kako se ovde upotrebljava, odnosi na imunoglobulinske molekule koji se sastoje od četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca koji su međusobno povezani disulfidnim vezama (tj. oni su "potpuni molekuli antitela"), kao i njihove multimere (npr. IgM) ili njihove fragmente koji vezuju antigen. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca ("HCVR" ili "V<H>") i konstantnog regiona teškog lanca (koji se sastoji od domena C<H>1, C<H>2 i C<H>3). Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca ("LCVR ili "V<L>") i konstantnog regiona lakog lanca (C<L>). V<H>i V<L>regioni mogu dalјe biti podeljeni na regione hipervarijabilnosti, označene kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), koji su naizmenično raspoređeni sa regionima koji su više evolutivno očuvani i označeni kao uokvirujući regioni (FR). Svaki V<H>i V<L>se sastoji od tri CDR-a i četiri FR-a, raspoređenih od amino kraja ka karboksilnom kraju po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Prema određenim aspektima opisa, FR sekvence antitela (ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen) mogu biti identične sa humanim germinativnim sekvencama ili mogu biti prirodno ili veštački modifikovane. Konsenzusna aminokiselinska sekvenca može biti definisana na osnovu upotredne analize dve ili više CDR sekvenci.
[0239] Moguća je takođe supstitucija jednog ili više od CDR ostataka ili izostavlјanje jednog ili više CDR-ova. U naučnoj literaturi su opisana antitela u kojima može biti izostavljen jedan ili dva CDR-a za vezivanje. Padlan i saradnici (1995, FASEB J.9:133-139) su analizirali regione kontakta između antitela i njihovih antigena, na osnovu objavlјenih kristalnih struktura i zaklјučili su da je samo od oko jedne petine do jedne trećine CDR ostataka zapravo u kontaktu sa antigenom. Padlan je takođe pronašao mnoga antitela u kojima aminokiseline jednog ili dva CDR nisu bile u kontatku sa antigenom (pogledati takođe, Vajdos i saradnici (2002), J Mol Biol 320:415-428).
[0240] Ostaci iz CDR koji nisu u kontaktu sa antigenom mogu biti identifikovani na osnovu prethodnih studija (na primer, ostaci H60-H65 u CDRH2 često nisu potrebni), iz regiona CDR po Kabatu koji se nalaze izvan CDR regiona po Čotiji, molekulskim modelovanjem i/ili empirijski. Ukoliko je CDR ili njegov ostatak(ostaci) izostavlјen, obično je supstituisan sa aminokiselinom koja zauzima odgovarajuću poziciju u sekvenci drugog humanog antitela ili u konsenzusnoj sekvenci takve sekvence. Pozicije za supstituciju unutar CDR regiona, kao i aminokiseline za supstituciju, takođe mogu biti odabrane empirijski. Empirijske supstitucije mogu biti konzervativne ili nekonzervativne supstitucije.
[0241] [0125] Potpuno humana monoklonska antitela koja se specifično vezuju za Fel d1, kao što je ovde prijavljeno, mogu sadržavati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u uokvirujućem i/ili CDR regionima varijabilnih domena teškog i lakog lanca u poređenju sa odgovarajućim germinativnim sekvencama. Takve mutacije lako mogu biti utvrđene upoređivanjem aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane sa germinativnim sekvencama dostupnim u, na primer, javnim bazama podataka sa sekvencama antitela. Predmetni opis obuhvata antitela, i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji su izvedeni iz bilo koje od ovde opisanih aminokiselinskih sekvenci, pri čemu je jedna ili više aminokiselina unutar jednog ili više uokvirujućih i/ili CDR regiona mutirana u odgovarajući ostatak(ostatke) germinativne sekvence iz koje je antitelo izvedeno, ili u odgovarajući ostatak(ostatke) druge humane germinativne sekvence, ili je konzervativnom supstitucijom aminokiselina mutirana u odgovarajući ostatak(ostatke) germinativne sekvence (ovakve promene u sekvenci se ovde kolektivno označavaju kao "germinativne mutacije"). Prosečno iskusan stručnjak može lako proizvesti brojna antitela i fragmente koji vezuju antigen koji sadrže jednu ili više pojedinačnih germinativnih mutacija ili njihove kombinacije, polazeći od sekvenci varijabilnih regiona teških i lakih lanaca koji su ovde opisani. Prema određenim aspektima, svi od uokvirujućih i/ili CDR ostataka unutar V<H>i/ili V<L>domena mogu biti povratno mutirani u ostatke koji se mogu pronaći u originalnoj germinativnoj sekvenci iz koje je antitelo izvedeno. Prema drugim aspektima, samo određeni ostaci se povratno mutiraju u prvobitnu germinativnu sekvencu, npr. navedeno podrazumeva samo mutirane ostatke koji se nalaze unutar 8 aminokiselina FR1 ili unutar poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili samo mutirane ostatke koji se nalaze unutar CDR1, CDR2 ili CDR3. Prema ostalim aspektima, jedan ili više od uokvirujućih i/ili CDR ostataka se mutira u odgovarajući/odgovarajuće ostatak(ostatke) iz različite germinativne sekvence (tj. germinativne sekvence koja je različita od germinativne sekvence iz koje je antitelo prvobitno izvedeno). Štaviše, antitela predmetnog opisa mogu sadržavati bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnih mutacija unutar uokvirujućih i/ili CDR regiona, npr. pri čemu su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene germinativne sekvence, dok su određeni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne germinativne sekvence zadržavaju ili se mutiraju na odgovarajući ostatak druge germinativne sekvence. Jednom dobijena, antitela i fragmenti koji vezuju antigen koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija, mogu lako biti ispitiani u pogledu jedne ili više željenih osobina, kao što su pobolјšana specifičnost vezivanja, povećan afinitet vezivanja, pobolјšana ili pojačana antagonistička ili agonistička biološka svojstva (što može biti slučaj), smanjena imunogenost itd. Antitela i fragmenti koji vezuju antigen dobijeni na ovaj opšti način obuhvaćeni predmetnim opisom.
[0242] Predmetni opis takođe obuhvata u potpunosti humana monoklonska antitela koja sadrže varijante bilo koje od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane, a koje sadrže jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, predmetni opis obuhvata antitela koja sadrže HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinske sekvence sa, npr.10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje itd., konzervativnih supstitucija aminokiselina u odnosu na bilo koju od ovde opisanih HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci.
[0245] 2
[0246] Predviđeno je da termin "humano antitelo", kako se ovde upotrebljava, obuhvata antitela koja sadrže varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. Humana mAt opisa mogu sadržavati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim germinativnim imunoglobulinskim sekvencama (tj. mutacije uvedene nasumičnom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer, u CDR regionaima, a naročito u CDR3. Ipak, nije predviđeno da termin "humano antitelo", kako se ovde upotrebljava, obuhvata mAt u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativnih linija drugih vrsta sisara (npr. iz miša) i uvedene u vidu graftova u humane FR sekvence.
[0247] Kao što se ovde upotrebljava, izraz "molekul koji vezuje antigen" označava protein, polipeptid ili molekulski kompleks koji sadrži ili se sastoji od najmanje jednog regiona koji određuje komplementarnost (CDR) koji se samostalno, ili u kombinaciji sa jednim ili sa više dodatnih CDR i/ili uokvirujućih regiona (FR), specifično vezuje za određeni antigen. Prema određenim aspektima, molekul koji vezuje antigen je antitelo ili fragment antitela, kao što su ovi pojmovi ovde definisani na drugom mestu.
[0248] Kao što se ovde upotrebljava, termin "bispecifičan molekul koji vezuje antigen" označava protein, polipeptid ili molekulski kompleks koji sadrži najmanje prvi domen koji vezuje antigen i drugi domen koji vezuje antigen (tj. dva kraka). Svaki domen koji vezuje antigen unutar bispecifičnog molekula koji vezuje antigen sadrži najmanje jedan CDR koji se samostalno, ili u kombinaciji sa jednim ili sa više dodatnih CDR i/ili FR regiona, specifično vezuje za određeni antigen. U kontekstu predmetnog pronalaska, prvi domen koji vezuje antigen specifično vezuje prvi antigen na Fel d1, dok drugi domen koji vezuje antigen specifično vezuje drugi, jasno različit antigen na Fel d1.
[0249] Termini "specifično vezuje" ili "specifično se vezuje za" ili slično, označavaju da antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obrazuju kompleks sa antigenom koji je relativno stabilan u fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje može biti okarakterisano ravnotežnom konstantom disocijacije od najmanje oko 1x10<-6>M ili manje (tj. manja K<D>označava čvršće vezivanje). Postupci kojima se određuje da li se dva molekula specifično vezuju, dobro su poznati u oblasti tehnike i uklјučuju, na primer, ravnotežnu dijalizu, površinsku plazmonsku rezonancu i slično. Kao što je ovde opisano, antitela koja se specifično vezuju za Fel d1 su identifikovana površinskom plazmonskom rezonancom, npr. upotrebom BIACORE™ sistema. Štaviše, multispecifična antitela koja se vezuju za Fel d1 i jedan ili više dodatnih antigena ili bispecifična antitela koja se vezuju za dva različita regiona Fel d1 (na primer, lanac 1 i/ili lanac 2 Fel d1) ipak se smatraju antitelima koja se "specifično vezuju", kao što je ovde upotrebljavano.
[0250] Termin antitelo "visokog afiniteta" se odnosi na ona mAt koja su sa afinitetom vezivanja za Fel d1 koji se može izraziti kao K<D>od najmanje 10<-8>M; poželјno 10<-9>M; poželјnije 10<-10>M, još poželјnije 10-
[0253] 2
[0254] <11>M, čak još poželјnije 10<-12>M, a koja je izemerena površinskom plazmonskom rezonancom, npr. upotrebom BIACORE™ sistema ili afinitetnog ELISA testa u rastvoru.
[0255] Pod pojmom "spora brzina disocijacije", "Koff" ili "kd" podrazumeva se antitelo koje disocira od Fel d1, sa konstantom brzine od 1 x 10<-3>s<-1>ili manje, poželјno 1 x 10<-4>s<-1>ili manje, što se određuje površinskom plazmonskom rezonancom, npr. upotrebom BIACORE™ sistema.
[0256] Termini "deo koji vezuje antigen" antitela, "fragment koji vezuje antigen" antitela i slični, kako se ovde upotrebljavaju, obuhvataju bilo koji polipeptid ili glikoprotein koji se javlja u prirodi, može biti dobijen enzimskim, sintetskim ili putem genetičkog inženjeringa, a koji se specifično vezuje za antigen da bi se obrazovao kompleks. Termini "deo koji vezuje antigen" antitela ili "fragment antitela", kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost vezivanja za Fel d1.
[0257] Specifični primeri izvođenja, antitelo ili fragmenti antitela pronalaska mogu biti konjugovani sa terapijskom strukturom ("imunokonjugatom"), poput kortikosteroida, drugog anti-Fel d1 antitela ili epinefrina, sa vakcinom ili bilo kojom drugom terapijskom strukturom koja je korisna za lečenje alergijskog odgovora na Fel d1.
[0258] Predviđeno je i da se "izolovano antitelo", kako se ovde upotrebljava, odnosi na antitelo koje je suštinski oslobođeno od drugih antitela (At) sa različitim antigenim specifičnostima (npr. sa izolovanim antitelom koje specifično vezuje Fel d1, ili sa njegovim fragmentom koji je suštinski oslobođen od antitela koja sepcifično vezuju antigene drugačije od Fel d1.
[0259] Predviđeno je da se termini "blokirajuće antitelo" ili "neutrališuće antitelo", kako se ovde upotrebljavaju (ili "antitelo koje neutrališe aktivnost Fel d1"), odnose na antitelo ili njegov deo koji se vezuje za antigen, koji kada se vezuju za Fel d1 dovode do inhibicije najmanje jedne biološke aktivnosti Fel d1. Na primer, antitelo pronalaska može biti od pomoći u prevenciji primarnog alergijskog odgovora na Fel d1. Alternativno, antitelo pronalaska može ispoljiti sposobnost da spreči sekundarni alergijski odgovor na Fel d1, ili najmanje jedan simptom alergijskog odgovora na Fel d1, uklјučujući kijanje, kašlјanje, astmatično stanje ili anafilaktički odgovor prouzrokovan sa Fel d1. Ovakva inhibicija biološke aktivnosti Fel d1 može biti procenjena merenjem jednog ili više pokazatelјa Fel d1 biološke aktivnosti upotrebom jednog ili više od nekoliko standardnih in vitro ili in vivo testova (kao što je test pasivne kožne anafilakse, što je ovde opisano) ili drugi in vivo analiza koje su poznate u oblasti tehnike (na primer, drugih životinjskih modela da bi se potražila zaštita od izazova sa Fel d1 nakon primene jednog ili više od ovde opisanih antitela).
[0260] Termin "površinska plazmonska rezonanca", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na optički fenomen koji omogućava analizu biomolekulskih interakcija u realnom vremenu detektovanjem promena u koncentraciji proteina unutar matriksa biosenzora, na primer, upotrebom BIACORE™ sistema (Pharmacia Biosensor AB, Upsala, Švedska i Piscataway, N.J.).
[0263] 2
[0264] Predviđeno je da se termin "K<D>", kako se ovde upotrebljava, odnosi na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije antitela i antigena.
[0265] Termin "epitop" se odnosi na antigenu determinantu koja interaguje sa specifičnim mestom vezivanja antigena u varijabilnom regionu molekula antitela poznatom kao paratop. Jedan antigen može imati više od jednog epitopa. Stoga, različita antitela se mogu vezivati za različite regione antigena i mogu ih karakterisati različita biološka dejstva. Termin "epitop" se takođe odnosi na mesto na antigenu na koje reaguju B i/ili T ćelije. Takođe se odnosi na region antigena za koji se vezuje antitelo. Epitopi mogu biti bilo linearni ili konformacioni. Linearni epitop je onaj proizveden od strane susednih aminokiselinskih ostataka u polipeptidnom lancu. Konformacioni epitop se proizvodi prostornom susednom pozicijom aminokiselina iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. U određenim primerima izvođenja, epitopi mogu uključivati determinante koje su hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforilne grupe ili sulfonil grupe, i, u određenim primerima izvođenja, mogu biti sa specifičnim trodimenzionalnim strukturin karakteristikama i/ili specifičnim karakteristikama naelektrisanja. Epitopi takođe mogu biti definisani kao strukturni ili funkcionalni. Funkcionalni epitopi su uglavnom podskup strukturnih epitopa i sa onim su ostacima koji direktno doprinose afinitetu interakcije. Epitopi koji se obrazuju od susednih aminokiselina se obično zadržavaju izloženima denaturišućim rastvaračima, dok se epitopi koji se obrazuju tercijanim uvijanjem opično gube prilikom tretamana sa denaturišućim rastvaračima. Epitop obično obuhvata najmanje 3, i češće, najmanje 5 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji.
[0266] Termin "suštinski identitet" ili "suštinski identičan", kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, ukazuje da, kada je optimalno poravnat sa odgovarajućim nukleotidnim insertima ili delecijama u odnosu na drugu nukleinsku kiselinu (ili njen komplementaran lanac), postoji identitet nukleotidne sekvence u najmanje oko 90%, a poželјnije najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% nukleotidnih baza, što je izmereno bilo kojim dobro poznatim algoritmom za identičnost sekvenci, kao što su FASTA, BLAST ili GAP, kao što se razmatra u nastavku teksta. Molekul nukleinske kiseline koji je suštinski idetničan referentom molekulu nukleinske kiseline, može, u određenim slučajevima, kodirati polipetid sa istom ili suštinski istom aminokiselinskom skevencom kao polipeptid kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline.
[0267] Kako se primenjuje na polipeptide, termin "suštinska sličnost" ili "suštinski sličan" označava da su dve peptidne sekvence, kada su optimalno poravnate, kao što je upotrebom programa GAP ili BESTFIT uz korišćenje zadatih ograničenja razmaka, težine gapova, sa identičnošću sekvence od najmanje 90%, još poželјnije od najmanje 95%, 98% ili 99%. Poželјno je i da se pozicije ostataka, kada one nisu identične, razlikuju u vidu konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. "Konzervativna aminokiselinksa supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan sa drugim
[0270] 2
[0271] aminokiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac (R grupu) sa sličnim hemijskim osobinama (npr. naelektrisanjem ili hidrofobnošću). U pricipu, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće bitno promeniti funkcionalne osobine proteina. U slučajevima kada se dve ili više aminokiselinskih sekvenci razlikuju jedna od druge po konzervativnoj supstituciji, procenat ili stepen sličnosti mogu biti podeđen nagore kako bi se korigovala konzervativna priroda supstitucije. Načini uvođenja ovih podešavanja su dobro pozanti iskusnim stručnjacima. (pogledati npr. Pearson (1994) Methods Mol. Biol.24:307-331). Primeri grupa aminokiselina sa bočnim lancima sličnih hemijskih osobina obuhvataju 1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatične-hidroksilne bočne lance: serin i treonin; 3) bočne lance koji sadrže amid: asparagin i glutamin; 4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin i triptofan; 5) bazne bočne lance: lizin, arginin i histidin; 6) kisele bočne lance: aspartat i glutamat i 7) bočne lance koji sadrže sumpor: cistein i metionin. Poželjne konzervativne aminokiselinske supstitucione grupe su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamataspartat i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja promena sa pozitivnom vrednošću u PAM250 log matrici verovatnoće koja je prijavljena u Gonnet i saradnici ((1992) Science 256:144345). "Umereno konzervativna" zamena je bilo koja promena sa negativnom vrednošću u u vrednost u PAM250 log matrici verovatnoće.
[0272] Za polipeptide, sličnost sekvenci se obično meri upotrebom komuterskog programa za analizu sekvenci. Program za analizu proteina uparuje slične sekvence upotrebom parametara sličnosti koji se dodeljuju raznim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uklјučujući konzervativne aminokiselinske supstitucije. Na primer, GCG kompjuterski program sadrži programe kao što su GAP i BESTFIT koji mogu biti upotrebljeni sa zadatim parametrima da bi se odredila homologija sekvenci ili identičnost sekvenci između dva blisko srodna peptide, kao što su homologni peptide iz različitih vrsta organizama ili između proteina divljeg tipa i njegovog mutanta. Pogledati, npr. GCG verzija 6.1. Polipeptidne sekvence takođe mogu biti upotređene upotrebom FASTA sa zadatim ili preporučenim parametrima; program u verziji GCG 6.1. FASTA (npr. FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnanja i procenat identitea sekvenci za regione koji se najbolje preklapaju između zadate i sekvence koja se pretražuje (Pearson (2000), navedeno iznad). Drugi poželјni algoritam prilikom upotređivanja sekvenci pronalaska sa bazama podataka koje sadrže veliki broj sekvenci iz različitih organizama predstavlja kompjuterski program BLAST, naročito BLASTP ili TBLASTN, uz upotrebu zadatih parametara. (pogledati, npr. Altschul i saradnici (1990) J. Mol. Biol.215: 403410 i (1997) Nucleic Acids Res.25:3389 402).
[0273] Antitelo ili fragment antitela za upotrebu u postupcima mogu biti monospecifični, bispecifični ili multispecifični. Multispecifična antitela mogu biti specifična za različite epitope jednog cilјnog polipeptida ili mogu sadržavati domene koji vezuju antigen koji su specifični za epitope više od jednog cilјnog polipeptida. Primer bispecifičnog formata antitela koji može biti upotrebljen u kontekstu
[0276] 2
[0277] predmetnog pronalaska obuhvata upotrebu prvog imunoglobulinskog (Ig) C<H>3 domena i drugog Ig C<H>3 domena, pri čemu se prvi i drugi IgC<H>3 domeni međusobno razlikuju u najmanje jednoj aminokiselini i pri čemu razlika u najmanje jednoj aminokiselini smanjuje vezivanj bispecifičnog antitela za protein A u poređenju sa bispecifičnim antitelom kome nedostaje razlika u aminokiselinama. U jednom primeru izvođenja, prvi Ig C<H>3 domen vezuje protein A, dok drugi Ig C<H>3 domen sadrži mutaciju koja smanjuje ili ukida vezivanje za protein A, poput modifikacije H95R (prema IMGT numeraciji egzona; H435R prema EU numeraciji). Drugi C<H>3 može dodatno sadržati Y96F modifikaciju (prema IMGT; Y436F prema EU). Dodatne modifikacije koje mogu biti pronađene unutar drugog C<H>3 obuhvataju: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M i V82I (prema IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M i V422I prema EU) u slučaju IgG1 mAt; N44S, K52N i V82I (prema IMGT; N384S, K392N i V422I prema EU) u slučaju IgG2 mAt; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q i V82I (prema IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q i V422I prema EU) u slučaju IgG4 mAt. Razmatrane su i prethodno opisane varijacije u antitelima bispecifičnog formata.
[0278] Pod frazom "terapijski efektivna količina" se podrazumeva količina koja proizvodi želјeni efekat radi koga se nešto i primenjuje. Tačna količina će zavisiti od svrhe lečenja i biće propisana od starena iskusnog stučnjaka, upotrebom poznatih tehnika (pogledati, na primer, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
[0279] Antitela pronalaska mogu biti upotrebljena za “desenzibilizaciju“ osobe osetlјive na mačke. Termin "desenzibilizacija" je ovde definisan kao smanjenje alergijske reakcije kod osobe osetljive na mačke, nakon izloženosti mačkama, mačjoj peruti ili njihovim proizvodima, npr. Fel d1 (do nivoa manjeg od onog koji bi osoba osetljiva na mačke inače iskusila).
[0281] Opšti opis pronalaska
[0283] Domaća mačka je izvor mnogih alergena u zatvorenom, a težina simptoma kod pojedinaca koji ispoljavaju osetlјivost na mačje alergene je opsega od relativno blagog rinitisa i konjuktivitisa do potencijalno po život opasnog astmatičnog stanja (Lau S. i saradnici (2000), Lancet 356:1392-1397). Iako deluje da pacijenti koje karakteriše takva osetljivost na mačke, odgovaraju na različite molekule koji se mogu pronaći u mačjoj peruti i krznu, deluje i da je glavni alergen Fel d1 (Felis domesticus alergen 1). Pokazano je tako da više od 80% pacijenata koji su alergični na mačke imaju IgE antitela na ovaj alergen (van Ree R. i saradnici (1999), J. Allergy Clin. Immunol 104:1223-1230).
[0284] [0147] Fel d1 protein je heterodimerni kiseli glikoprotein od približno 18 kDa koji sadrži oko 10-20% N-vezanih uglјenih hidrata. Svaki heterodimer sadrži dva polipeptidna lanca koji su kodirani sa dva odvojena gena (Duffort OA i saradnici (1991), Mol. Immunol.28:301-309; Morgenstern JP i saradnici (1991), PNAS 88:9690-9694; Griffith I.J. i saradnici (1992), Gene 113:263-268). Lanac 1 sadrži oko 70 aminokiselinskih ostataka, dok lanac 2 sadrži oko 90-92 aminokiselinska ostataka. Za prirodni Fel d1 je predloženo prisustvo tri međulančane disulfidne veze koje povezuju dva lanca (Kristensen A.K. i saradnici (1997), Biol. Chem. 378:899-908), koje je i potvrđeno za rekombinantni Fel d1 u kristalnoj strukturi (Kaiser L. i saradnici (2003), J. Biol. Chem. 278:37730-37735; Kaiser L. i saradnici, (2007), J. Mol. Biol.370:714-727). Iako se svaki lanac ponekad pojedinačno označava kao "Fel d1", oba lanca su potrebna za potpun proteinski alergen.
[0285] Fel d1 proizvode lojne žlezde i skvamozne žlezde, kao i skvamozne epitelne ćelije, i prenosi se na krzno lizanjem i lickanjem (Bartholome K. i saradnici (1985), J. Allergy Clin. Immunol.76:503-506; Charpin C. i saradnici (1991), J. Allergy Clin. Immunol. 88:77-82; Dabrowski A.J. (1990) i saradnici, J. Allergy Clin. Immunol. 86:462-465). Prisutan je i u plјuvačnim, perianalnim i suznim žlezdama (Andersen M.C. i saradnici (1985), J. Allergy Clin. Immunol. 76:563-569; van Milligen F.J. (1992) i saradnici, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol.92(4):375-378), a deluje da su glavni rezervoari koža i krzno (Mata P. i saradnici (1992), Ann. Allergy 69(4):321-322).
[0286] Funkcija proteina Fel d1 kod životinje nije poznata, ali kod osetlјivih lјudi on prouzrokuje IgG ili IgE reakciju (bilo u vidu alergijskog ili astmatičnog odgovora). Iako su poznati i drugi mačji alergeni, uklјučujući Fel d2 (albumin) i Fel d3 (cistatin), od 60% do 90% proizvedenog anti-mačjeg IgE je usmereno na Fel d1 (Leitermann K. i saradnici, (1984), J Allergy Clin. Immunol.74:147-153; Lowenstein H. i saradnici, (1985), Allergy 40:430-441; van Ree R. i saradnici, (1999), J. Allergy Clin. Immunol.
[0287] 104:1223-1230; Ichikawa K. i saradnici, (2011), Clin. Exp. Allergy, 31:1279-1286).
[0288] Imunoglobulin E (IgE) je odgovoran za preosetlјivost tipa 1, koja se sama po sebi manifestuje alergijskim rinitisom, alergijskim konjuktivitisom, polenskom groznicom, alergijskom astmom, alergijom na venom pčela i alergijama na hranu. IgE cirkuliše u krvi i vezuje se za Fc receptore visokog afiniteta za IgE, na bazofilima i mastocitima. Kod većine alergijskih reakcija, alergeni ulaze u organizam udisanjem, gutanjem ili kroz kožu. Alergen se zatim vezuje za prethodno obraznovan IgE koji je već vezan za receptor visokog afiniteta na površinama mastocita i bazofila, što rezultuje unakrsnim povezivanjem nekoliko IgE molekula i pokretanjem oslobađanja histamina i drugih inflamatornih medijatora što dalje prouzrokuje razne alergijske simptome.
[0289] Tretman za alergije na mačke uklјučuje desenzibilizacionu terapiju, koja obuhvata injekcije sa rastućim dozama bilo neprečišćenog ekstrakta mačje peruti, bilo kratkih peptida izvedenih iz Fel d1. Upotrebom neprečišćenog ekstrakta mačje peruti, Lilјa i saradnici su pokazali da nakon tri godine takvog lečenja, pacijenti alergični na mačke i dalјe ispoljavaju sistemske simptome (Lilјa Q. i saradnici (1989), J. Allergy Clin. Immunol.83:37-44 i Hedlin i saradnici (1991), J. Allergy Clin. Immunol.87:955-964). Rezultat upotrebe kratkih peptida izvedenih iz Fel d1 za desenzibilizaciju je bio u vidu razlike koja nije bila bitno drugačija između grupe koja je dobijala peptid i placebo kontrolne grupe (Oldfield W.L. i saradnici (2002), Lancet, 360:47-53). Efikasnost je uočena samo kada us pacijentima primenjivane
[0292] 1
[0293] velike količine (750 ug) kratkog peptida (Norman P.S. i saradnici (1996), Am. J. Respir. Crit. Care Med.
[0294] 154:1623-1628). Pored toga, kod pacijenata kojima je divan i neprečišćen ekstrakt mačje peruti, prijavljene su astmatične reakcije, kao i kod pacijenata kojima je divan tretman sa kratkim Fel d1 peptidima. Shodno navedenom, u oblasti lečenja alergije na mačke i dalje postoji potreba za alternativnim strategijama lečenja pacijenata osetlјivih na mačje alergene, naročito na Fel d1.
[0295] Antitela su predložena kao opšta strategija lečenja za alergije, pošto ona mogu biti sposobna da blokiraju ulazak alergenih molekula u služokožna tkiva, ili pošto mogu vezati alergen pre nego što bude imao priliku da se veže za IgE koji je vezan za receptor visokog afiniteta na mastocitima ili bazofilima, čime se sprečava oslobađanje histamina i drugih inflamatornih medijatora iz ovih ćelija. U.S. patent broj 5,670,626 opisuje upotrebu monoklonskih antitela za lečenje alergijskih oboljenja posredovanih sa IgE, kao što su alergijski rinitis, alergijska astma i alergijski konjuktivitis, blokiranjem vezivanja alergena za tkivo sluzokože. U.S. patent broj 6,849,259 opisuje upotrebu antitela specifičnih za alergen da bi se inhibirala alergijska inflamacija u in vivo mišjem modelu alergije. Opisani su sistemi antitela na bazi mleka i jaja. Na primer, US20030003133A1 prijavljuje upotrebu mleka kao nosača za alergene u cilju indukovanja oralne tolerancije na mačju perut i druge alergene. Kompozicije i postupci za smanjenje alergijskog odgovora kod životinje na alergen iz okoline, upotrebom molekula koji inhibira sposobnost alergena da se vezuje za mastocite, opisani su u US2010/0143266. Druga antitela na Fel d1 su opisana od strane De Groot-a i saradnika (de Groot i saradnici (1988), J. Allergy Clin. Immunol.
[0296] 82:778-786).
[0297] U potpunosti humana antitela koja su vode opisana, pokazuju specifično vezivanje za Fel d1 i mogu biti korisna u lečenju pacijenata koji pate od alergija na mačke, a nakročito kod pacijenata koji pokazuju osetlјivost na Fel d1 alergen. Upotreba takvih antitela može biti efektivan način lečenja pacijenata koji pate od alergija na mačju perut, ili antitela mogu biti upotrebljena za prevenciju pojačanog odgovora na Fel d1 nakon drugog izlaganja, ili pak pratećih simptoma povezanih sa alergijom, ili antitela mogu biti upotrebljena za smanjenje ozbiljnosti i/ili trajanje alergijskog odgovora povezanog sa primarnim izlaganjem mački koja luči Fel d1 alergen ili sa ponovnom pojavom simptoma nakon drugog izlaganja. Antitela mogu biti upotrebljena samostalno ili u vidu dodante terapije sa drugim terapijskim strukturama ili modalitetima koji su poznati u oblasti tehnike lečenja takvih alergija, kao što su, ali bez ograničavanja na, lečenje sa kortikosteroidima ili epinefrinom. Ona mogu biti upotrebljena zajedno sa drugim ili trećim različitim antitelom specifičnim za Fel d1. Mogu biti upotrebljena i sa imunoterapijom specifičnom za alergen (SIT).
[0298] U određenim slučajevima, antitela se dobijaju iz miševa imunizovanih sa primarnim imunogenom, kao što je prirodni Fel d1, koji može biti nabavljen komercijalno (pogledati, na primer, Indoor Biotech, kat. br. NA-FD1-2) ili koji može biti proizveden rekombinantno. U određenim slučajevima, imunogen može biti bilo lanac 1 iz Fel d1 ili lanac 2 iz Fel d1, ili to može biti kombinacija i
[0301] 2
[0302] lanca 1 i lanca 2 koji se primenjuju jedan za drugim ili istovremeno. Aminokiselinska sekvenca lanca 1 pune dužine (označeni i kao FELD1 A) je prikazana kao SEQ ID NO: 392. Aminokiselinske sekvence lanca 1 pune dužine takođe mogu biti nađene u GenBank bazi podataka pod pristupnim brojevima P30438 i NP_001041618.1. Aminokiselinska sekvenca lanca 2 pune dužine (označeni i kao FELD1 B) prikazana je kao SEQ ID NO: 393. Aminokiselinske sekvence lanca 2 pune dužine takođe mogu biti nađene u GenBank bazi podataka pod pristupnim brojevima PP30440 i NP_001041619.1.
[0303] U određenim slučajevima, rekombinantno proizveden Fel d1 imunogen može biti napravljen direktnom fuzijom dva lanca Fel d1, kao što je opisano u publikaciji Kaiser-a i saradnika, da bi se proizveo fuzioni produk sa sličnim obrascem ponovnog uvijanja kao što je onaj koji karakteriše prirodan Fel d1 (Kaiser L. i saradnici, (2003), J. Biol. Chem. 278(39):37730-37735). U određenim slučajevima, imunogen može biti fuzioni protein kao što je onaj prikazan u konstruktima iz SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 ili 397, nakon čega sledi imunizacija sa sekundarnim imunogenom ili a imunogeno aktivnim fragmentom prirodnog ili rekombinantno proizvedenog Fel d1.
[0304] Imunogen može biti biološki aktivan i/ili imunogeni fragment prirodnog ili rekombinantno proizvedenog Fel d1, ili to može biti DNK koja kodira njegov aktivni fragment. Fragment može biti izveden iz bilo N-kraja ili C-kraja bilo lanca 1 ili lanca 2, ili iz bilo N-kraja ili C-kraja i lanca 1 i lanca 2. Za upotrebu u vidu imunogena za pripremu antitela za Fel d1, fragmenti mogu biti pripremljeni sa bilo koje pozicije unutar lanca 1 ili lanca 2.
[0305] [0157] U određenim slučajevima, imunogen može biti fuzioni protein koji obuhvata bilo koji ili više od sledećeg: i) aminokiselinske ostatke 18-109 lanca 2 iz Fel d1 (pogledati pristupni broj P30440 u GenBank bazi, kao i SEQ ID NO: 393) fuzionisane preko C-kraja direktno sa N-krajem aminokiselinskih ostataka 23-92 lanca 1 iz Fel d1 (pogledati pristupni broj P30438 u GenBank bazi, kao i SEQ ID NO: 392); ii) aminokiselinske ostatke 23-92 lanca 1 iz Fel d1 (pogledati pristupni broj P30438 u GenBank bazi, kao i SEQ ID NO: 392) fuzionisane preko C-kraja sa N-krajem aminokiselinskih ostataka 18-109 lanca 2 iz Fel d1 (pogledati pristupni broj P30440 u GenBank bazi, kao i SEQ ID NO: 393); iii) aminokiselinske ostatke 18-109 lanca 2 iz Fel d1 (pogledati pristupni broj NP_001041619.1 u GenBank bazi) fuzionisane preko C-kraja direktno sa N-krajem aminokiselinskih ostataka 19-88 lanca 1 iz Fel d1 (pogledati pristupni broj NP_001041618.1 u GenBank bazi), kao što je konstrukt prikazan u SEQ ID NO: 394 ili 396; iv) aminokiselinske ostatke 19-88 lanca 1 iz Fel d1 (pogledati pristupni broj NP_001041618.1 u GenBank bazi) fuzionisane preko C-kraja sa N-krajem aminokiselinskih ostataka 18-109 lanca 2 iz Fel d1 (pogledati pristupni broj NP_001041619.1 u GenBank bazi). Pogledati takođe SEQ ID NO: 395. U određenim slučajevima, fuzioni protein može biti sa oznakom na C terminalnom kraju konstrukta, kao što je myc-myc-heksahistidinski tag (pogledati SEQ ID NO: 385, 396 ili 397 za takve konstrukte.). U srodnim slučajevima, fuzioni protein može sadržavati Fc region mišjeg antitela kuplovan sa C terminalnim krajem konstrukta (pogledati SEQ ID NO: 394 ili 395 za takve konstrukte.). U određenim slučajevima, lanci 1 i 2 su povezani preko linkera koji je poznat stručnjacima iz oblasti, npr. (G<4>S)<3>(pogledati SEQ ID NO: 395 i 397 za takav konstrukt.).
[0306] U određenim slučajevima, antitela koja se specifično vezuju za Fel d1 mogu biti pripremljena upotrebom fragmenata prethodno naznačenih regiona, ili peptide koji se protežu izvan naznačenih regiona za oko 5 do oko 20 aminokiselinskih ostataka, polazeći od bilo kog, ili od oba od N ili C terminalnih krajeva regiona koji su ovde opisani. U određenim slučajevima, bilo koja kombinacija prethodno naznačenih regiona, ili njihovih fragmenata, može biti upotrebljena u pripremi antitela specifičnih za Fel d1. U određenim slučajevima, bilo koji ili više od prethodno naznačenih regiona Fel d1, ili njihovih fragmenata, mogu biti upotrebljeni za pripremu monospecifičnih, bispecifičnih ili multispecifičnih antitela.
[0308] Fragmenti antitela koji vezuju antigen
[0310] Ukoliko nije drugačije specifično naznačeno, podrazumeva se da pojam "antitelo", kako se ovde upotrebljava, obuhvata molekule antitela koji sadrže dva teška imunoglobulinska lanca i dva laka imunoglobulinska lanca (tj. to su "potpuni molekuli antitela"), kao i njihove fragmenti koji vezuju antigen. Termini "deo koji vezuje antigen" antitela, "fragment koji vezuje antigen" antitela i slični, kako se ovde upotrebljavaju, obuhvataju bilo koji polipeptid ili glikoprotein koji se javlja u prirodi, može biti dobijen enzimskim, sintetskim ili putem genetičkog inženjeringa, a koji se specifično vezuje za antigen da bi se obrazovao kompleks. Termini "deo koji vezuje antigen" antitela ili "fragment antitela", kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na jedan ili na više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja bilo za lanac 1 i/ili lanac 2 iz Fel d1. Fragment antitela može podrazumevati Fab fragment, F(ab')<2>fragment, Fv fragment, dAb fragment, fragment koji sadrži CDR ili izolovan CDR. Fragmenti antitela koji vezuju antigen mogu biti izvedeni, npr. iz potpunih molekula antitela upotrebom bilo koje pogodne standardne tehnike, kao što su proteolitička digestija ili tehnike rekombinantnog genetičkog inženjeringa koje obuhvataju manipulaciju i ekspresiju DNK koja kodira varijabilne i (po izboru) konstantne domene antitela. Takva DNK je poznata i/ili lako dostupna iz, npr. komercijalnih izvora, DNK biblioteka (uklјučujući, npr. fagne biblioteke antitela) ili mogu biti sintetisane. DNK može biti sekvencirana i hemijski se sa njom može maniputlisati ili mogu biti upotrebljene tehnike molekularne biologije, na primer, da bi se se povezali jedan ili više varijabilnih i/ili konstantnih domena u odgovarajuću konfiguraciju, ili da bi se uveli kodoni, kreirali cisteinski ostaci, modifikovale dodale ili deletirale aminokiseline itd.
[0311] Neograničavajući primeri fragmenata koji vezuju antigen obuhvataju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab')2 fragmente; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) jednolančane Fv (scFv) molekule; (vi) dAb fragmente; i (vii) jedinice minimalnog prepoznavanja koje se sastoje od aminokiselinskih ostataka koji
[0314] 4
[0315] oponašaju hipervarijabilni region antitela (npr. izolovan region za određivanje komplementarnosti (CDR), kao što je CDR3 peptid) ili ograničeni peptid FR3-CDR3-FR4. Ostali konstruisani molekuli, kao što su antitela specifična za domen, jednodomenska antitela, antitela sa deletiranim domenom, himerna antitela, antitela sa CDR graftom, dimerna antitela, trimerna antitela, tetramerna antitela, miniantitela, nanoantitela (npr. monovalentna nanoantitela, bivalentna nanoantitela itd.), mali modularni imunofarmaceutici (SMIP) i varijabilni IgNAR domeni iz morskog psa takođe su obuhvaćeni unutar termina "fragment koji vezuje antigen", kako se on ovde upotrebljava.
[0316] Fragment antitela koji vezuje antigen obično sadrži najmanje jedan varijabilni domen. Varijabilni domen može biti bilo koje veličine ili sastava aminokiselina i obično će sadržavati najmanje jedan CDR, koji je susedan ili unutar okvira čitanja sa jednom ili sa više od uokvirujućih sekvenci. U fragmentima koji vezuju antigen koji sadrže V<H>domen povezan sa V<L>domenom, V<H>i V<L>domeni mogu biti postavljeni jedan u odnosu na drugog u bilo kom pogodnom rasporedu. Na primer, varijabilni region može biti dimeran i sadržavati V<H>- V<H>, V<H>- V<L>ili V<L>- V<L>dimere. Alternativno, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržavati monomerni V<H>ili V<L>domen.
[0317] U određenim slučajevima, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržavati najmanje jedan varijabilni domen koji je kovalentno povezan sa najmanje jednim konstantnim domenom. Neograničavajuće konfiguracije koje predstavljaju primer varijabilnih i konstantnih domena, a koje se mogu naći unutar fragmenta antitela koji vezuje antigen obuhvataju: (i) V<H>-C<H>1; (ii) V<H>-C<H>2; (iii) V<H>-C<H>3; (iv) V<H>-C<H>1 -C<H>2; (v) V<H>-C<H>1 - C<H>2-C<H>3; (vi) V<H>-C<H>2-C<H>3; (vii) V<H>-C<L>; (viii) V<L>-C<H>1 ; (ix) V<L>-C<H>2; (x) V<L>-C<H>3; (xi) V<L>-C<H>1-C<H>2; (xii) V<L>-C<H>1-C<H>2-C<H>3; (xiii) V<L>-C<H>2-C<H>3; i (xiv) V<L>-CL. U bilo kojoj konfiguraciji varijabilnih i konstantnih domena, uklјučujući bilo koju od prethodno navedenih konfiguracija za primer, varijabilni i konstantni domeni mogu biti bilo direktno povezani jedan sa drugim ili mogu biti povezani celokupnim ili delom zglobnog ili linkerskog regiona. Zglobni region se može sastojati od najmanje 2 (npr. 5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiselina, što rezultuje fleksibilnom ili polufleksibilnom vezom između susednih varijabilnih i/ili konstantnih domena u jednom polipeptidnom molekulu. Štaviše, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržavati homo-dimer ili hetero-dimer (ili drugi multimer) bilo koje od prethodno navedenih konfiguracija varijabilnog i konstantnog domena, koje su nekovalentnim vezama povezane jedna sa drugom i/ili sa jednim ili sa više od monomernih V<H>ili V<L>domena (npr. disulfidnom vezom(vezama)).
[0318] [0163] Kao i kod potpunih molekula antitela, fragmenti koji vezuju antigen mogu biti monospecifični ili multispecifični (npr. bispecifični). Multispecifični fragment antitela koji vezuje antigen obično sadrži najmanje dva različita varijabilna domena, pri čemu je svaki varijabilni domen sposoban da se specifično vezuje za poseban antigen ili za drugi epitop na istom antigenu. Bilo koji format multispecifičnog antitela, uklјučujući formate bispecifičnog antitela koji su ovde opisani, može biti prilagođen za uptorebu u kontekstu fragmenta koji vezuje antigen iz antitela predmetnog pronalaska, upotrebom rutinskih tehnika koje su dostupne u oblasti tehnike.
[0320] Priprema humanih antitela
[0322] Postupci generisanja humanih antitela kod transgenih miševa su poznati u oblasti tehnike. Bilo koji takvi poznati postuci mogu biti upotrebljeni u kontekstu predmetnog pronalaska za pravlјenje humanih antitela koja se specifično vezuju za Fel d1.
[0323] Upotrebom VELOCIMMUNE™ tehnologije (pogledati, na primer, US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) ili bilo kog drugog poznatog postupka za generisanje monoklonskih antitela, inicijalno se izoluju himerna antitela visokog afiniteta za Fel d1 sa humanim varijabilnim regionom i mišjim konstantnim regionom. Tehnologija VELOCIMMUNE® podrazumeva generisanje transgenog miša koji u genomu sadrži humane varijabilne regione teških i lakih lanaca koji su operativno povezani sa endogenim lokusima mišjih konstantnih regiona tako da miš proizvodi antitelo koje sadrži humani varijabilni region i mišji konstantni region kao odgovor na antigenu stimulaciju. DNK koja kodira varijabilne regione teških i lakih lanaca antitela se izoluje i operativno povezuje sa DNK koja kodira konstantne regione humanih teških i lakih lanaca. DNK se zatim eksprimira u ćeliji koja je sposobna da eksprimira u potpunosti humano antitelo.
[0324] U principu, VELOCIMMUNE® miš se izlaže antigenu od interesa, pa se iz miševa koji eksprimiraju antitela izdvajaju limfne ćelije (poput B-ćelija). Limfne ćelije mogu biti fuzionisane sa ćelijskom linijom mijeloma da bi se pripremile imortalizovane hibridomske ćelijske linije, nakon čega se takve ćelijske linije hibridoma pregledaju i selektuju da bi se identifikovala ćelijska linija hibridoma koja proizvodi antitela specifična za antigen od interesa. DNK koja kodira varijabilne regione teškog i lakog lanca može biti izolovana i povezana sa poželјnim izotipskim konstantnim regionima teškog i lakog lanca. Takav protein antitela može biti proizveden u ćeliji, kao što je CHO ćelija. Alternativno, DNK koja kodira himerna antitela specifična za antigen ili varijabilne domene lakih i teških lanaca može biti izolovana direktno iz limfocita specifičnih za antigen.
[0325] U početku, izoluju se himerna antitela visokog afiniteta koja sadrže humani varijabilni region i mišji konstantan region. Kao što je navedeno ispod, u eksperimentalnom delu, antitela su okarakterisana i selektovana tako da ih karakterišu poželjne osobine, uklјučujući afinitet, selektivnost, epitop itd.. Konstantni regioni miša su zamenjeni želјenim konstantnim regionom čoveka da bi se generisalo u potpunosti humano antitelo pronalaska, na primer, divlјi tip ili modifikovan IgG1 ili IgG4. Iako izabran konstantni region može varirati u zavisnosti od specifične upotrebe, visok afinitet vezivanja za antigen i ciljna specifičnost su karakteristike koje su određene varijabilnim regionom.
[0326] U principu, antitela predmetnog pronalaska poseduju veoma visoke afinitete, obično poseduju K<D>od oko 10<-12>do oko 10<-9>M, izmeren vezivanjem za antigen bilo imobilisan na čvrstoj fazi ili kada je on u fazi rastvora. Mišji konstantni regioni su zamenjeni želјenim humanim konstantnim regionima da bi se generisala potpuno humana antitela pronalaska. Iako izabrani konstantan region može varirati u zavisnosti od specifične upotrebe, visok afinitet vezivanja za antigen i ciljna specifičnost su karakteristike su određene varijabilnim regionom.
[0328] Bioekvivalenti
[0330] Anti-Fel d1 antitela i fragmenti antitela predmetnog opisa obuhvataju proteine čije aminokiselinske sekvence odstupaju od onih za opisana antitela, ali koji zadržavaju sposobnost vezivati Fel d1. Ovakva varijantna antitela i fragmenti antitela sadrže jedan ili više adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina u poređenju sa matičnom sekvencom, ali ispoljavaju biološku aktivnost koja je suštinski ekvivalentna onoj koja karakteriše opisana antitela. Slično tome, DNK sekvence koje kodiraju antitelo predmetnog pronalaska obuhvataju sekvence koje sadrže jednu ili više adicija, delecija ili supstitucija nukleotida u poređenju sa prijavljenom sekvencom, ali koje kodiraju antitelo ili fragment antitela koji je suštinski bioekvivalentan antitelu ili fragmentu antitela opisa.
[0331] Dva proteina koja vezuju antigen, ili antitela, smatraju se bioekvivalentnim ukoliko su, na primer, farmaceutski ekvivalenti ili farmaceutske alternative čija brzina i opseg apsorpcije ne pokazuju značajnu razliku kada se primenjuju u istoj molarnoj dozi i pod sličnim eksperimentalnim uslovima, bilo jednokratno ili u vidu višestruke doze. Pojedina antitela će se smatrati ekvivalentima ili farmaceutskim alternativama ukoliko su ekvivalentna u pogledu opsega njihovih apsorpcija, iako to nisu po brzini apsorpcije, odnosno smatraju se bioekvivalentnima pošto su takve razlike u stopi apsorpcije namerne i odnose se na obeležavanje koje nije suštinsko za postizanje efektivne koncentracije leka u organizmu prilikom, npr. hronične upotrebe, tako da se smatraju medicinski nevažnima za određeni ispitivani lekoviti proizvod.
[0332] Dva proteina koja se vezuju za antigen mogu biti bioekvivalentna ukoliko nisu prisutne klinički značajne razlike u njihovoj bezbednosti, čistoći i potenciji.
[0333] Dva proteina koja vezuju antigen mogu biti bioekvivalentna ukoliko pacijent može da bude prebačen jedan ili više puta između referentnog proizvoda i biološkog proizvoda bez očekivanog povećanja rizika od neželjenih dejstava, uklјučujući klinički značajnu promenu u imunogenosti ili smanjenu efikasnost, u poređenju sa kontinuiranom terapijom bez takvog prebacivanja.
[0334] Dva proteina koja vezuju antigen mogu biti bioekvivalentna ukoliko oba deluju preko zajedničkog mehanizma ili mehanizama delovanja za stanje ili stanja za koje se upotrebljavaju, u meri u kojoj su takvi mehanizmi poznati.
[0335] Bioekvivalencija može biti pokazana in vivo i/ili in vitro postupcima. Merenje bioekvivalencije obuhvata, npr. (a) in vivo test na lјudima ili drugim sisarima, gde se koncentracija antitela ili njegovih metabolita meri u krvi, plazmi, serumu ili drugoj biološkoj tečnosti u funkciji od vremena; (b) in vitro test koji je u korelaciji sa ili koji može poslužiti za razumno predviđanje humanih in vivo podataka o bioraspoloživosti; (c) in vivo test na lјudima ili drugim sisarima u kome se odgovarajuće akutno farmakološko dejstvo antitela (ili njegovog ciljnog molekula) meri u funkciji vremena; i (d) dobro kontrolisano kliničko ispitivanje kojim se utvrđuje bezbednost, efikasnost ili bioraspoloživost ili bioekvivalenciju antitela.
[0336] Bioekvivalentne varijante antitela pronalaska mogu se konstruisati, na primer, uvođenjem raznih supstitucija ostataka ili sekvenci ili delecijama terminalnih ili unutrašnjih ostataka ili sekvenci koje nisu potrebne za biološku aktivnost. Na primer, ostaci cisteina koji nisu bitni za biološku aktivnost i mbou biti deletirani ili zamenjeni sa drugim aminokiselinama da bi se sprečilo obrazovanje nepotrebnih ili nepravilnih međumolekulskih disulfidnih mostova nakon renaturacije. U drugom kontekstu, bioekvivalentna antitela mogu obuhvatati varijante antitela koje sadrže promene u aminokiselinama, koje modifikuju karakteristike glikozilacije antitela, tj mutacije koje eliminišu ili uklanjaju glikozilaciju.
[0338] Biološke karakteristike antitela
[0340] U principu, antitela predmetnog opisa mogu funkcionisati vezivanjem bilo za lanac 1 ili za lanac 2 Fel d1, ili i za lanac 1 i za lanac 2 iz Fel d1 ili za fragment bilo lanca 1 ili lanca 2.
[0341] Prema određenim aspektima, antitela predmetnog opisa mogu vezivati epitop koji je lociran u najmanje C-terminalnom regionu bilo lanca 1 ili lanca 2 Fel d1. Prema jednom aspektu, antitela se mogu vezivati za epitop unutar N-terminalnog regiona bilo lanca 1 ili lanca 2 Fel d1.
[0342] U određenim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska mogu delovati blokiranjem ili inhibicijom vezivanja IgE za mastocite ili bazofile kod pacijenta osetlјivog na Fel d1 alergen.
[0343] Prema određenim aspektima, antitela predmetnog opisa mogu funkcionisati vezivanjem za bilo koji drugi region ili fragment lanca 1 ili lanca 2 pune dužine iz prirodnog Fel d1 proteina, čije su aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 392 (lanac 1) i SEQ ID NO: 393 (lanac 2).
[0344] [0180] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti bispecifična antitela. Bispecifična antitela mogu vezivati jedan epitop u lancu 1 i mogu takođe vezivati jedan epitop u lancu 2. Bispecifična antitela mogu vezivati dva različita epitopa u lancu 1. Bispecifična antitela mogu vezivati dva različita epitopa u lancu 2. Bispecifična antitela se mogu vezivati za dva različita mesta unutar istog heliksa bilo na jednom od lanca 1 ili lanca 2, ili se mogu vezivati za isti heliks i na lancu 1 i lancu 2. Struktura Fel d1 je detalјnije opisana u publikaciji Kaiser-a i saradnika (Kaiser L. i saradnici (2003), J. Biol. Chem. 278(39):37730 37735), gde autori zapažaju da Fel d1 sastoji od osam heliksa, H1-H4 i H5-H8, koji odgovaraju lancima 2 i 1, tim redom, u prirodnom Fel d1.
[0345] Prema jednom aspektu, opis obezbeđuje u potpunosti humano monoklonsko antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji se vezuju za lanac 1 i/ili lanac 2 iz Fel d1, pri čemu antitelo ili njegov fragment ispoljavaju jednu ili više do sledećih karakteristika: (i) sadrže HCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354 i 370, ili njihovih suštinski sličnih sekvenci koje su im identične najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; (ii) sadrže LCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362 i 378, ili njihovih suštinski sličnih sekvenci koje su im identične najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; (iii) sadrže HCDR3 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360 i 376, ili njihovih suštinski sličnih sekvenci koje su im identične najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; i LCDR3 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368 i 384, ili njihovih suštinski sličnih sekvenci koje su im identične najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; (iv) sadrže HCDR1 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356 i 372, ili njihovih suštinski sličnih sekvenci koje su im identične najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; HCDR2 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358 i 374, ili njihovih suštinski sličnih sekvenci koje su im identične najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; LCDR1 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364 i 380, ili njihovih suštinski sličnih sekvenci koje su im identične najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; i LCDR2 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366 i 382, ili njihovih suštinski sličnih sekvenci koje su im identične najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; (v) vezuje se za lanac 1 i/ili lanac 2 Fel d1 sa K<D>jednakom ili manjom od 10<-9>; (vi) ne reaguje unakrsno sa, ili se vezuje za, uteroglobin; ili (vii) blokira izlivanje boje in vivo, kroz kapilare, u mišjem modelu pasivne kutane anafilakse (PCA) upotrebom mišjeg IgE specifičnog za Fel d1.
[0346] Prema jednom aspektu, opis obezbeđuje upotrebu kombinacije dva ili više u potpunosti humana antitela, ili njihovih fragmenata, za pripremu kompozicije, pri čemu se antitela vezuju za lanac 1 i/ili lanac 2 iz Fel d1 i pri čemu je svako antitelo ili njegov fragment koji je sadržan u kompoziciji sa jednom ili sa više od sledećih karakteristika: (i) sadrži HCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354 i 370 ili suštinski slične sekvence koja je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; (ii) sadrži LCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362 i 378 ili suštinski slične sekvence koja je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; (iii) sadrži HCDR3 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232,248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360 i 376 ili suštinski slične sekvence koja je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; i LCDR3 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368 i 384 ili suštinski slične sekvence koja je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; (iv) sadrži HCDR1 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356 i 372 ili suštinski slične sekvence koja je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; HCDR2 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358 i 374 ili suštinski slične sekvence koja je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; LCDR1 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364 i 380 ili suštinski slične sekvence koja je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; i LCDR2 domen sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366 i 382 ili suštinski slične sekvence koja je identična najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; (v) vezuje se za lanac 1 i/ili lanac 2 Fel d1 sa K<D>jednakom ili manjom od 10<-9>; (vi) ne reaguje unakrsno sa, ili se vezuje za, uteroglobin; (vii) blokira izlivanje boje in vivo, kroz kapilare u mišjem modelu pasivne kutane anafilakse (PCA) upotrebom mišjeg IgE specifičnog za Fel d1; ili (viii) kada se kombinuju sa drugim antitelom pronalaska ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, smanjuju učestalost ćelija koje luče sluz u plućima životinja izloženih Fel d1.
[0349] 4
[0350] Antitela na Fel d1, kada se koriste samostalno ili u kombinaciji, mogu biti sposobna da se vežu za i da neutrališu najmanje jedan biološki efekat Fel d1, što je određivano u in vitro ili in vivo testovima. Sposobnost antitela pronalaska da se vezuju za i neutrališu aktivnost Fel d1 može biti izmerena upotrebom bilo kog standardnog postupka poznatog stručnjacima iz oblasti tehnike, uklјučujući testove vezivanja ili neutralizacije aktivnosti (npr. zaštite od anafilakse), kao što je ovde opisano.
[0351] Neograničavajući in vitro testovi za primer, za merenje aktivnosti vezivanja, ilustrovani su ovde u Primerima 4. U Primerima 4, afiniteti vezivanja i kinetičke konstante humanih Anti-Fel d1 antitela su određivane površinskom plazmonskom rezonancom, a merenja su rađena upotrebom T200 Biacore instrumenta.
[0352] Fel d1 proteini ili peptidi mogu biti modifikovani tako da uklјučuju adiciju ili supstituciju određenih ostataka u cilju označavanja ili u svrhu konjugacije sa molekulima nosača, kao što je KLH. Na primer, cistein može biti dodat bilo na N-terminalni ili C-terminalni kraj peptida, ili može biti dodata linkerska sekvenca da bi se pripremio peptid za konjugaciju sa, na primer, KLH u cilju imunizacije. Antitela specifična za Fel d1 ne moraju sadržavati dodatne obeleživače ili strukture ili mogu sadržavati obeleživače ili strukture na N-kraju ili C-kraju. U jednom primeru izvođenja, obeleživač ili struktura je biotin. U testu vezivanja, lokacija obeleživača (ukoliko je prisutan) može biti određena orijentacijom peptide u odnosu na površinu za koju je peptid vezan. Na primer, ukoliko je površina obložena avidinom, peptid koji sadrži N-terminalni biotin biće orijentisan tako da će deo peptida na C-kraju biti postavljen dalje od površine.
[0354] Mapiranje epitopa i srodne tehnologije
[0356] Termin "epitop", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na antigenu determinantu koja interaguje sa specifičnim mestom vezanja antigena u varijabilnom regionu molekula antitela koji je poznat kao paratop. Jedan antigen može imati više od jednog epitopa. Stoga, različita antitela se mogu vezivati za različita površine antigena i mogu imati različita biološka dejstva. Epitopi mogu biti bilo konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop se proizvodi prostorno postavljenim aminokiselinama iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca tako da budu susedne jedne drugima. Linearni epitop je onaj koji se proizvodi od strane susdenih aminokiselinskih ostataka u polipeptidnom lancu. Pod određenim okolnostima, epitop može sadržavati ostatke saharida, fosforil grupe ili sulfonil grupe na antigenu.
[0357] [0187] Predmetni opis obuhvata i Anti-Fel d1 antitela koja interaguju sa jednom ili sa više aminokiselina koja se nalaze u jednom ili u više regiona lanca 1 ili lanca 2 molekula Fel d1, uklјučujući, npr. lanac 1 (lanac A) kao što je prikazano u SEQ ID NO: 392, ili lanac 2 (lanac B) kao što je prikazano u SEQ ID NO: 393, ili unutar komparabilnih regiona rekombinantno proizvedenog Fel d1 proteina, kao što je prikazano u bilo kojoj od SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 ili 397. Epitop za koji se antitela vezuju se može sastojati od pojedinačnog uzastopnog niza od 3 ili više (npr.3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više) aminokiselina koje se nalaze unutar bilo kog od prethodno navedenih regiona ili segmenata molekula Fel d1 (npr. unutra linearnog epitopa bilo u lancu 1 ili u lancu 2, ili u regionau koji se proteže duž i lanca 1 i lanca 2). Alternativno, epitop može biti sastavljen od mnoštva aminokiselina (ili aminokiselinskih sekvenci) koje nisu susedni i smeštene su unutar jednog ili oba od prethnodno navedenih regiona ili segmenata molekula Fel d1 (npr. konformacioni je epitop).
[0358] Razne tehnike koje su poznate prosečno iskusnim stručnjacima, mogu biti upotrebljene za određivanje da li antitelo "interaguje sa jednom ili sa više aminokiselina" unutar polipeptida ili proteina. Tehnike za primer obuhvataju, na primer, rutinske testove unakrsnog blokiranja, poput onih opisanih u Antibodies, Harlov i Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Drugi postupci podrazumevaju alaninsku skenirajuću mutacionu analizu, analizu sa blotovanjem peptide (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), kristalografske studije analize cepanja peptida i NMR analize. Dodatno, mogu biti upotrebljeni postupci poput isecanja epitopa, ekstrakcije epitopa i hemijske modifikacije antigena (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). Još jedan od potupaka koji može biti upotrebljen za identifikaciju aminokiselina unutar polipeptida sa kojim antitelo interaguje je vodonik/deuterijumska izmena koja se detektuje masenom spektrometrijom. Uopšte rečeno, postupak vodonik/deuterijumske izmene podrazumeva obeležavanje proteina od interesa sa deuterijumom, nakon čega sledi vezivanje antitela za protein koji je obeležen deuterijumom. U sledećem koraku, kompleks proteina i antitela se prebacuje u vodu, a protoni koji mogu biti zamenjeni unutar aminokiselina koje su zaštićene kompleksom sa antitelom, podležu povratnoj izmeni deuterijuma u vodonik sa stopom koja je sporija nego u slučaju protona koji se mogu izmeniti unutar aminokiselina kojie nisu deo površine kontakta. Rezultata navedeno je da aminokiseline koje čine deo površine kontakta u kompeksu proteina i antitela mgou zadržati deuterijum i tako ispoljiti relativno veću masu u poređenju sa aminokiselinama koje nisu uključene u kontakt. Nakon disocijacije antitela, cilјni protein se podvrgava cepanju, upotrebom proteaza, i dalje analizi masenom spektrometrijom, čime se određuju ostaci koji su obeleženi deuterijumom, a koji odgovaraju specifičnim aminokiselinama preko kojih antitelo interaguje. Pogledati, npr. Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2): 252-259; Engen i Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A. Rendgenska kristalografija kompleksa antigena i antitela može takođe biti upotrebljena u svrhu mapiranja epitopa.
[0359] [0189] Profilisanje potpomognuto modifikacijom (MAP), poznato i kao Profilisanje antitela zasnovano na strukturi antigena (ASAP), postupak je koji kategoriše veliki broj monoklonskih antitela (mAt) usmerenih na isti antigen shodno sličnosti profila vezivanja svakog antitela za hemijski ili enzimski modifikovane površine antigena (US 2004/0101920). Svaka kategorija može odražavati jedinstveni epitop koji je bilo jasno različit od ili se delimično preklapa sa epitopom koji predstavlja neku drugu kategoriju. Ova tehnologija omogućava brzo filtriranje genetički identičnih antitela, tako da karakterizacija može biti fokusirana na genetički jasno različita antitela. Kada se primenjuje na skrining hibridoma, MAP može olakšati identifikaciju retkih hibridomskih klonova koji proizvode mAt sa želјenim karakteristikama. MAP može biti upotrebljen za sortiranje antitela pronalaska u grupe antitela koja se vezuju za različite epitope.
[0360] Prema određenim aspektima, Anti-Fel d1 antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, vezuju se za epitop unutar bilo kog ili više od regiona koji su prikazani u vidu primera za lanac 1 ili lanac 2 Fel d1, bilo u prirodnom obliku, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 392 (lanac 1) i SEQ ID NO: 393 (lanac 2), ili u vidu rekombinantno proizvedenog proteina, kao što je prikazano u bilo kojoj od SEQ ID NOS: 385, 394, 395, 396, i 397, ili za njihov fragment. Prema određenim aspektima, antitela opisa, kao što je prikazano u Tabeli 1, interaguju sa najmanje jednom aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka na pozicijama od oko pozicije 15 do oko pozicije 24 u SEQ ID NO: 396; aminokiselinskih ostataka na pozicijama od oko pozicije 85 do oko pozicije 103 u SEQ ID NO: 396; aminokiselinskih ostataka na pozicijama od oko pozicije 85 do oko pozicije 104 u SEQ ID NO: 396; aminokiselinskih ostataka na pozicijama od oko pozicije 113 do oko pozicije 116 u SEQ ID NO: 396. Ovi regioni su dodatno prikazani u vidu primera u SEQ ID NO: 402, 403, 404, 412 i 426.
[0361] Predmetni opis takođe obuhvata anti-Fel d1 antitela koja se vezuju za isti epitop ili deo epitopa, kao i bilo koje od specifičnih antitela za primer koja su ovde opisana u Tabeli 1 ili antitelo koje sadrži CDR sekvence bilo kog antitela za primer koje je opisano u Tabeli 1. Slično navedenom, predmetni opis takođe obuhvata anti-Fel d1 antitela koja su u kompeticiji vezivanja za Fel d1 ili Fel d1 fragment sa bilo kojim od specifičnih antitela za primer koja su ovde opisana u Tabeli 1 ili antitelo koje sadrži CDR sekvence bilo kog antitela za primer koje je opisano u Tabeli 1.
[0362] Da li se antitelo vezuje za isti epitop kao referentno anti-Fel d1 antitelo ili je sa njim u kompeticiji vezivanja, lako može biti utvrđeno upotrebom rutinskih postupaka koji su poznati u oblasti tehnike. Na primer, da bi se utvrdilo da li se antitelo koje se ispituje vezuje za isti epitop kao referentno anti-Fel d1 antitelo pronalaska, omogućava se da se referentno antitelo veže za Fel d1 protein ili peptid u uslovima zasićenja. Zatim se procenjuje sposobnost ispitivanog antitela da se veže za Fel d1 molekul. Ukoliko je antitelo koje se ispituje sposobno da se veže za Fel d1 nakon vezivanja referentnog antitela za Fel d1 u uslovima zasićenja, može biti zaključeno da se ispitivano antitelo vezuje za različit epitop u odnosu na referentno anti-Fel d1 antitelo. S druge strane, ukoliko ispitivano antitelo nije u stanju da se veže za Fel d1 molekul nakon vezivanja referentnog antitela za Fel d1 u uslovima zasićenja, moguće je da se antitelo koje se ispituje vezuje za isti epitop kao epitop za koji se vezuje referentno anti-Fel d1 antitelo pronalaska.
[0363] Da bi se utvrdilo da li je antitelo u kompeticiji vezivanja sa referentnim anti-Fel d1 antitelom, prethodno opisana metodologija vezivanja se izvodi u dve orijentacije: u prvoj orijentaciji, referentnom
[0366] 4
[0367] antitelu je dozvolјeno da se vezuje za Fel d1 molekul u uslovima zasićenja, nakon čega sledi procena vezivanja antitela koje se ispituje za Fel d1 molekul. U drugoj orijentaciji, antitelu koje se ispituje je dozvolјeno da se vezuje za Fel d1 molekul u uslovima zasićenja, nakon čega sledi procena vezivanja referentnog antitela za Fel d1 molekul. Ukoliko je u obe orijentacije samo prvo antitelo (u zasićenju) sposobno da se veže za Fel d1 molekul, tada se može zaljučiti da su antitelo koje se ispituje i referentno antitelo u kompeticiji vezivanja za Fel d1. Bitno je napomenuti i da antitelo koje je u kompeticiji za vezivanje sa referentnim antitelom, ne mora nužno da se vezuje za identični epitop kao referentno antitelo, ali može sterički blokirati vezivanje referentnog antitela vezivanjem za preklapajući ili susedan epitop.
[0368] Dva antitela se vezuju za isti ili preklapajući epitop ukoliko svako od njih kompetitivno inhibira (blokira) vezivanje drugog za antigen. Preciznije, višak jednog antitela od 1, 5, 10, 20 ili 100 puta inhibira vezivanje drugog za najmanje 50%, ali poželjno 75%, 90% ili čak 99%, što se meri komptitivnim testom vezivanj (pogledati, npr. Junghans i saradnici, Cancer Res. 1990. 50:1495-1502). Alternativno, dva antitela imaju isti epitop ukoliko suštinski sve mutacije aminokiselina u antigenu koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu vezivanje i drugog. Dva antitela imaju preklapajuće epitope ukoliko pojedine mutacije aminokiselina koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu vezivanje i drugog.
[0369] Dodatni rutinski eksperimenti (npr. mutiranje petida i analize vezivanja) mogu biti sprovedeni da bi se potvrdilo da li utvrđeno odsustvo vezianja antitela koje se ispituje predstavlja u stvari posledicu vezivanja za isti epitop kao što je to za referentno antitelo ili da li je za nedostatak utvrđenog vezivanja odgovorno steričko blokiranje (ili neki drugi fenomen). Eksperimenti ove vrste mogu biti urađeni upotrebom ELISA, RIA, površinske plazmonske resonance, protočne citometrije ili bilo kog drugog kvantitativnog ili kvalitativnog testa vezivanja antitela koji je dostupan u oblasti tehnike.
[0371] Imunokonjugati
[0373] [0196] Pronalazak obuhvata humano monoklonsko anti-Fel d1 antitelo konjugovano na terapijsku strukturu ("imunokonjugat"), kao što je sredstvo koje je sposobno da smanji ozbilјnost alergijskog odgovora na Fel d1 alergen prisutan u mačjoj peruti ili na mačkama ili na površini koja prestavlja okruženje u kome mačke mogu boraviti, ili da ublaži najmanje jedan simptom povezan sa izlaganjem mačkama, mačjoj peruti ili alergenu Fel d1, uklјučujući rinitis, konjuktivitis ili poteškoće sa disanjem ili njihovu ozbiljnost. Takav agens može biti kortikosteroid, drugo, različito antitelo na Fel d1 ili vakcina. Pri izboru tipa terapijske strukture koja može biti konjugovana na anti-Fel d1 antitelo potrebno je uzeti u obzir stanje koje će biti lečeno i želјeni terapijski efekat koji je potrebno postići. Alternativno, ukoliko je želјeni terapijski efekat lečenje posledica ili simptoma povezanih sa izlaganjem Fel d1 alergenu ili lečenje bilo kog drugog stanja koje je rezutat takvog izlaganja, kao što je, ali nije ograničeno na, rinitis ili konjuktivitis, može biti prednost da se konjuguje agens koji je pogodan za lečenje posledica ili simptoma stanja ili da se ublaže sporedni efekti antitela pronalaska. Primeri pogodnih sredstava za obrazovanje imunokonjugata su poznati u oblasti tehnike, pogledati na primer, WO 05/103081.
[0375] Multispecifična antitela
[0377] Antitela pronalaska mogu biti monospecifična, bispecifična ili multispecifična. Multispecifična antitela mogu biti specifična za različite epitope jednog cilјnog polipeptida ili mogu sadržati domene koji vezuju antigen specifične za više od jednog cilјnog polipeptida. Pogledanti, npr. Tutt i saradnici, 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer i saradnici, 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Antitela predmetnog pronalaska mogu biti povezana ili istovremeno eksprimirana sa drugim funkcionalnim molekulom, na primer, sa drugim peptidom ili proteinom. Na primer, antitelo ili njegov fragment mogu biti funkcionalno povezani (npr. hemijskim kuplovanjem, genetičkom fuzijom, nekovalentnim povezivanjem ili na neki drugi način) sa jednim ili sa više drugih molekulskih entiteta, kao što su drugo antitelo ili fragment antitela, a da bi se proizvelo bispecifično ili multispecifično antitelo sa drugom specifičnošću vezivanja. Na primer, predmetni opis obuhvata bispecifična antitela u kojima jedan krak imunoglobulina može biti specifičan za lanac 1 Fel d1, ili njegov fragment, a drugi krak imunoglobulina može biti specifičan za lanac 2 Fel d1, ili drugi terapijski cilјni molekul, ili može biti konjugovan sa terapijskom strukturom.
[0378] Određeni aspekti za primer predmentog opisa obuhvataju bispecifičan molekul koji vezuje antigen, a koji je bispecifično antitelo. Svaki domen koji vezuje antigen bispecifičnog antitela sadrži varijabilni domen teškog lanca (HCVR) i varijabilni domen lakog lanca (LCVR). HCVR se takođe može označiti kao V<H>region, dok se LCVR može takođe označiti kao V<L>region. Svaki HCVR i LCVR obično sadrži tri CDR sekvence koje se smenjuju sa ukupno četiri FR sekvence, pri čemu su iste raspoređene od amino-kraja ka karboksilnom kraju po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Tri CDR sekvence unutar HCVR mogu biti ovde označene kao HCDR1, HCDR2 i HCDR3; dok se tri CDR sekvence unutar LCVR ovde mogu označavati kao LCDR1, LCDR2 i LCDR3.
[0379] U bispecifičnim molekulima koji vezuju antigen, svaki domen koji vezuje antigen može sadržavati ili se sastojati od punog molekula antitela ili fragmenta antitela koji vezuje antigen. Termini "deo koji vezuje antigen" antitela, "fragment koji vezuje antigen" antitela i slični, kako se ovde upotrebljavaju, obuhvataju bilo koji polipeptid ili glikoprotein koji se javlja u prirodi, može biti dobijen enzimskim, sintetskim ili putem genetičkog inženjeringa, a koji se specifično vezuje za antigen da bi se obrazovao kompleks. Fragmenti antitela koji vezuju antigen mogu biti izvedeni, na primer, iz potpunih molekula antitela upotrebom bilo koje pogodne standardne tehnike, kao što su proteolitička digestija
[0382] 4
[0383] ili tehnike rekombinantnog genetičkog inženjeringa koje uključuju manipulaciju i ekspresiju DNK koja kodira varijabilne i po izboru konstantne domene antitela. Takva DNK je poznata i/ili je lako dostupna iz, na primer, komercijalnih izvora, DNK biblioteka (uklјučujući, na primer, fagne biblioteke antitela) ili može biti stetisana. DNK se može sekvencirati i podvrgavati hemijskim manipulacijama ili se mogu upotrebiti tehnike molekularne biologije, na primer, da bi se jedan ili više varijabilnih i/ili konstantnih domena uveli u odgovarajuću konfiguraciju, ili da bi se uveli kodoni, kreirali cisteinski ostaci, modifikovale, adirale ili deletirale aminokiseline itd.
[0384] Neograničavajući primeri fragmenata koji vezuju antigen koji mogu biti uklјučeni u bispecifične molekule koji vezuju antigen obuhvataju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab')2 fragmente; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) jednolančane Fv (scFv) molekule; (vi) dAb fragmente; i (vii) jedinice minimalnog prepoznavanja koje se sastoje od aminokiselinskih ostataka koji oponašaju hipervarijabilni region antitela. Ostali konstruisani molekuli, kao što su antitela specifična za domen, antitela sa jednim domenom, antitela sa deletiranim domenom, himeran antitela, antitela sa CDR graftom, dimerna antitela, trimerna antitela, tetramerna antitela, mini-antitela, nanoantitela (npr. monovalentna nanoantitela, bivalentna nanoantitela itd.), mali modularni imunofarmaceutici (SMIP) i varijabilni IgNAR domeni iz morskog psa takođe su obuhvaćeni unutar termina "fragment koji vezuje antigen", kako se on ovde upotrebljava.
[0385] Fragment antitela koji vezuje antigen obično sadrži najmanje jedan varijabilni domen. Varijabilni domen može biti bilo koje veličine ili sastava aminokiselina i obično će sadržavati najmanje jedan CDR, koji je susedan ili unutar okvira čitanja sa jednom ili sa više od uokvirujućih sekvenci. U fragmentima koji vezuju antigen koji sadrže V<H>domen povezan sa V<L>domenom, V<H>i V<L>domeni mogu biti postavljeni jedan u odnosu na drugog u bilo kom pogodnom rasporedu. Na primer, varijabilni region može biti dimeran i sadržavati V<H>- V<H>, V<H>- V<L>ili V<L>- V<L>dimere. Alternativno, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržavati monomerni V<H>ili V<L>domen.
[0386] Fragment antitela koji vezuje antigen iz bispecifičnog molekula koji vezuje antigen može sadržavati najmanje jedan varijabilni domen koji je kovalentno povezan sa najmanje jednim konstantnim domenom. Neograničavajuće konfiguracije koje predstavljaju primer varijabilnih i konstantnih domena, a koje se mogu naći unutar fragmenta antitela koji vezuje antigen obuhvataju: (i) V<H>-C<H>1; (ii) V<H>-C<H>2; (iii) V<H>-C<H>3; (iv) V<H>-C<H>1 -C<H>2; (v) V<H>-C<H>1 - C<H>2-C<H>3; (vi) V<H>-C<H>2-C<H>3; (vii) V<H>-C<L>; (viii) V<L>-C<H>1 ; (ix) V<L>-C<H>2; (x) V<L>-C<H>3; (xi) V<L>-C<H>1-C<H>2; (xii) V<L>-C<H>1-C<H>2-C<H>3; (xiii) V<L>-C<H>2-C<H>3; i (xiv) V<L>-CL. U bilo kojoj konfiguraciji varijabilnih i konstantnih domena, uklјučujući bilo koju od prethodno navedenih konfiguracija za primer, varijabilni i konstantni domeni mogu biti bilo direktno povezani jedan sa drugim ili mogu biti povezani celokupnim ili delom zglobnog ili linkerskog regiona. Zglobni region se može sastojati od najmanje 2 (npr.5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiselina, što rezultuje fleksibilnom ili polu-fleksibilnom vezom između susednih varijabilnih i/ili konstantnih domena u
[0389] 4
[0390] jednom polipeptidnom molekulu. Štaviše, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržavati homodimer ili hetero-dimer (ili drugi multimer) bilo koje od prethodno navedenih konfiguracija varijabilnog i konstantnog domena, koje su nekovalentnim vezama povezane jedna sa drugom i/ili sa jednim ili sa više od monomernih V<H>ili V<L>domena (npr. disulfidnom vezom(vezama)).
[0391] Prvi domen koji vezuje antigen i drugi domen koji vezuje antigen mogu biti direktno ili indirektno povezani jedan sa drugim da bi obrazovao bispecifičan molekul koji se vezuje za antigen. Alternativno, svaki od prvog domena koji vezuje antigen i drugog domena koji vezuje antigen može biti povezan za poseban multimerizujući domen. Udruživanje jednog multimerizujućeg domena sa drugim multimerizujućim domenom olakšava povezanost između dva domena koja vezuju antigen, obrazujući tako bispecifičan molekul koji vezuje antigen. Kao što se ovde upotrebljava, "multimerizujući domen" je bilo koji makromolekul, protein, polipeptid, peptid ili aminokiselina koja je sa sposobnošću da se udruži sa drugim multimerizujućim domenom iste ili slične strukture ili konstitucije. Na primer, multimerizujući domen može biti polipeptid koji sadrži imunoglobulinski C<H>3 domen. Neograničavajući primer multimerizirajuće komponente je Fc domen imunoglobulina, npr. Fc domen IgG-a izabran od izotipova IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4, kao i bilo koji alotip unutar svake izotipske grupe. Multimerizujući domen može biti Fc fragment ili aminokiselinska sekvenca dužine od 1 do oko 200 aminokiselina koja sadrži najmanje jedan cisteinski ostatak. Multimerizujući domen može biti cisteinski ostatak ili kratki peptid koji sadrži cistein. Ostali multimerizujući domeni obuhvataju peptide ili polipeptide koji sadrže ili se sastoje od leucinskog zipera, motiva heliks-petlјa ili motiva namotanog kalema.
[0392] Bilo koji format bispecifičnog antitela ili tehnologija njegovog dobijanja može biti upotrebljena za sitnezu bispecifičnih molekula koji vezuju antigen. Na primer, antitelo ili njegov fragment koje karakteriše prva specifičnost vezivanja antigena, mobu biti funkcionalno povezani (npr. hemijskim kuplovanjem, genetičkom fuzijom, nekovalentnim povezivanjem ili na neki drugi način) sa jednim ili sa više drugih molekulskih entiteta, kao što su drugo antitelo ili fragment antitela koje karakteriše druga specifičnost vezivanja antigena, a da bi se proizveo bispecifičan molekul koji vezuje antigen.
[0393] Primer formata bispecifičnog antitela koji može biti upotrebljen u kontekstu predmetnog pronalaska obuhvata upotrebu prvog imunoglobulinskog (Ig) C<H3>domena i drugog Ig C<H3>domena, pri čemu se prvi i drugi IgC<H3>domeni međusobno razlikuju u najmanje jednoj aminokiselini i pri čemu najmanje jedna različita aminokiselina smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela za Protein A, u poređenju sa bispecifičnim antitelom kod koga nedostaje razlika u aminokiselinama. Prvi Ig C<H3>domen može vezivati Protein A, dok drugi Ig C<H3>domen sadrži mutaciju koja smanjuje ili ukida vezivanje za Protein A, poput H95R modifikacije (prema IMGT numeraciji egzona; H435R prema EU numeraciji). Drugi C<H>3 može dodatno sadržati Y96F modifikaciju (prema IMGT; Y436F prema EU). Dodatne modifikacije koje mogu biti pronađene unutar drugog C<H>3 obuhvataju: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M i V82I (prema IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M i V422I prema EU) u slučaju IgG1 mAt;
[0396] 4
[0397] N44S, K52N i V82I (prema IMGT; N384S, K392N i V422I prema EU) u slučaju IgG2 mAt; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q i V82I (prema IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q i V422I prema EU) u slučaju IgG4 mAt. Razmatrane su i prethodno opisane varijacije u antitelima bispecifičnog formata.
[0398] Ostali primeri bispecifičnih formata koji mogu biti upotrebljeni u kontekstu predmetnog pronalaska obuhvataju, bez ograničenja, npr. bispecifične formate zasnovane na scFv ili dimernim antitelima, IgG-scFv fuzije, dvostruko varijabilni domen (DVD)-Ig, kvadrome, format tipa “dugme u rupicu” (engl. knobs-into-holes), uobičajen laki lanac (npr. uobičajen laki lanac sa formatom tipa “dugme u rupicu” itd.), CrossMab, CrossFab, (SEED)antitelo, leucinski ziper, dualno antitelo, IgG1/IgG2, Fab sa dvostrukim dejstvom (DAF)-IgG i Mab<2>bispecifične formate (pogledati npr. Klein i saradnici 2012, mAbs 4:6, 1-11 i reference koje se navode, kao revijski pregled prethodno navedenih formata). Bispecifična antitela takođe mogu biti konstruisana upotrebom konjugacije peptide i nukelinskih kiselina, npr. pri čemu se aminokiselina koja se ne javlja u prirodi, sa ortogonalnom hemijskom reaktivnošću, upotrebljava za generisanje konjugata antitela specifičnog za mesto i oligonukleotida, koji se zatim udružuje sam sa sobom u multimerne komplekse sa definisanim sastavom, valencom i geometrijom. (pogledati npr. Kazane i saradnici, J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec.4, 2012]).
[0400] Terapijska primena i formulacije
[0402] Pronalazak obezbeđuje terapijske kompozicije koje sadrže anti-Fel d1 antitela pronalaska ili njihove fragmente koji vezuju antigen. Primena terapijskih kompozicija u skladu sa pronalaskom će biti primenjena pogodnim putem primene uključujući, ali ne ograničavajući se na, intravensku, supkutanu, intramuskularnu, intranazalnu primenu, primenu sa pogodnim nosačima, eksipijensima i drugim sredstvima koja se ugrađujuu u formulacije da bi se obezbedili poboljšan prenos, isporuka, tolerancija i slično. Mnoštvo odgovarajućih formulacija se može pronaći u zborniku koji je poznat svim farmaceutskim hemičarima: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ove formulacije obuhvataju, na primer, praškove, paste, masti, želee, voskove, ulјa, lipide, vezikule koji sadrže (katjonske ili anjonske) lipide (poput LIPOFECTIN™), DNK konjugate, anhidrovane apsorpcione paste, emulzije tipa ulјe-u-vodi i voda-u-ulju, Carbowax™ emulzije (polietilen glikoli raznih molekulskih težina), polučvrste gelove i polučvrste smeše koje sadrže Carbowax™. Pogledati takođe -Powell i saradnici "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52: 238-311.
[0403] Doza antitela može varirati u zavisnosti od starosti i veličine subjekta kome će se primenjivati, cilјnog oboljenja, uslova, načina primene i sličnog. Kada se antitelo predmetnog pronalaska upotrebljava za lečenje rinitisa ili konjuktivitisa povezanog sa izlaganjem mački ili mačjoj peruti kod
[0406] 4
[0407] osobe koja je osetljiva na Fel d1, ili za prevenciju anafilaktičkog odgovora na mačji alergen ili za smanjivanje ozbiljnosti alergijske reakcije, preporučuje se intravenska primena antitela predmetnog pronalaska normalno u jednoj dozi od oko 0,01 do oko 30 mg/kg telesne težine, poželјnije od oko 0,02 do oko 7, oko od 0,03 do oko 5 ili od oko 0,05 do oko 3 mg/kg telesne težine. U zavisnosti od ozbilјnosti stanja, učestalost i trajanje lečenja mogu biti prilagođeni. U određenim primerima izvođenja, antitelo pronalaska ili njegov fragment koji vezuje antigen mogu biti primenjeni u početnoj dozi od najmanje oko 0,1 mg do oko 800 mg, oko 1 do oko 500 mg, oko 5 do oko 300 mg ili od oko 10 do oko 200 mg, do oko 100 mg ili do oko 50 mg. U određenim primerima izvođenja, početnu dozu može pratiti primena druge ili mnoštva narednih doza antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, u količini koja može biti približno ista ili manja od početne doze, pri čemu su naredne doze razdvojene najmanje od 1 do 3 dana; najmanje jednu nedelјu, najmanje 2 nedelјe; najmanje 3 nedelјe; najmanje 4 nedelјe; najmanje 5 nedelјa; najmanje 6 nedelјa; najmanje 7 nedelјa; najmanje 8 nedelјa; najmanje 9 nedelјa; najmanje 10 nedelјa; najmanje 12 nedelјa; ili najmanje 14 nedelјa.
[0408] Razni sistemi za isporuku su poznati i mogu biti upotrebljeni za primenu farmaceutske kompozicije pronalaska, npr. inkapsulacija u lipozome, mikročestice, mikrokapsule, upotreba rekombinantnih ćelija sposobnih da exprimiraju mutirane viruse, endocitoze posredovane receptorom (pogledati, npr. Wu i saradnici (1987) J. Biol. Chem.262:4429-4432). Postupci uvođenja obuhvataju, ali nisu ograničeni na, intradermalni, transdermalni, intramuskularni, intraperitonealni, intravenski, supkutani, intranazalni, epiduralni i oralni put primene. Kompozicija može biti primenjena bilo kojim konvencionalnim načinom primene, na primer, infuzijom ili bolusnom injekcijom, apsorpcijom kroz epitelne ili mukokutane ovojnice (npr. kroz oralnu sluzokožu, rektalnu i crevnu sluzokožu itd.), a može biti primenjena i zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima. Primena može biti sistemska ili lokalna.
[0409] Farmaceutska kompozicija takođe može biti isporučena unutar vezivkule, naročito lipozoma (pogledati, na primer, Langer (1990) Science 249:1527-1533).
[0410] U određenim situacijama, farmaceutska kompozicija može biti isporučena u sistemu sa kontrolisanim oslobađanjem. U jednom primeru izvođenja, može biti upotrebljena pumpa. U drugom primeru izvođenja, mogu biti upotrebljeni polimerni materijali. U još jednom izvođenju, sistem sa kontrolisanim oslobađanjem može biti postavlјen u blizinu mesta ciljanog delovanja kompozicije, čime primena zahteva samo frakciju sistemske doze.
[0411] Preparati za injeciranje mogu obuhvatati dozne oblike za intravenske, supkutane, intrakutane i intramuskularne injekcije, infuzije tipa kap-po-kao itd. Ovi preparati za injeciranje mogu biti pripremljeni postupcima koji su opšte poznati. Na primer, preparati za injeciranje mogu biti pripremljeni, npr. rastvaranjem, resuspendovanjem ili emulgovanjem antitela ili njegove soli koji su prethnodno opisani, u sterilnom vodenom medijumu ili ulјanom medijumu koji se uobičajeno upotrebljavaju za injekcije. Kao vodeni medijum za injekcije, mogu se upotrebiti, na primer, fiziološki
[0414] 4
[0415] rastvor, izotoničan rastvor koji sadrži glukozu i druga pomoćna sredstva itd., koji mogu biti upotrebljeni u kombinaciji sa odgovarajućim sredstvom za rastvaranje poput alkohola (npr. etanola), polialkohola (npr. propilen glikola, polietilen glikola), nejonskog surfaktanta [npr. polisorbata 80, HCO-50 (polioksietilenskog (50 mol) adukta hidrogenizovanog ricinusovog ulјa)] itd. Kao uljani medijum koriste se, npr. ulje susama, sojino ulјe itd., koji mogu biti upotrebljeni u kombinaciji sa sredstvom za rastvaranje kao što je benzil benzoat, benzil alkohol itd.. Poželјno je da tako pripremlјena injekcija ispunjava odgovarajuću ampulu.
[0416] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može biti isporučena supkutano ili intravenski, standardnom iglom i špricem. Dodatno, u vezi supkutane isporuke, za isporuku farmaceutkse kompozije predmentog pronalaska je najpogodnija primena pen-uređajem. Takav penuređaj isporuku može biti za višekratnu upotrebu ili za jednokratnu upotrebu. Pen-uređaj za višekratnu upotrebu obično koristi uložak koji se može zamenjivati, a koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Jednom kada je sva farmaceutska kompozicija unutar uloška primeni i kada je patrona prazna, prazan uložak lako može biti odbačen i zamenjen sa novim uloškom koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Penuređaj tada može biti ponovo upotrebljen. U pen-uređaju za jednokratnu upotrebu, nema uloška koji se može menjati. Umesto toga, pen-uređaj za jednokratnu upotrebu je prethodno ispunjen sa farmaceutskom kompozicijom koja se nalazi u rezervoaru unutar uređaja. Jednom kada se rezervoar sa farmaceutskom kompozicijom isprazni, baca se ceo uređaj.
[0417] Za supkutanu isporuku farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska, primenu mogu imati brojni pen-uređaji za višekratnu upotrebu, kao i uređaji za samoinjeciranje. Primeri obuhvataju, ali sigurno nisu ograničeni na, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Velika Britanija), DISETRONIC™ pen-uređaj (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Švajcarska), HUMALOG MIX 75/25™ pen-uređaj, HUMALOG™ pen-uređaj, HUMALIN 70/30™ pen-uređaj (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II i III (Novo Nordisk, Kopenhagen, Danska), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Kopenhagen, Danska), BD™ pen-uređaj (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ i OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Nemačka), da se nabroji samo nekoliko. Primeri pen-uređaja za jednokratnu upotrebu koji imaju primenu u supkutanoj isporuci farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska obuhvataju, ali sigurno nisu ograničeni na, SOLOSTAR™ pen-uređaj (sanofi-aventis), FLEXSPEN™ (Novo Nordisk) i KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICK™ autoinjektor (Amgen, Thousands Oaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Študgard, Nemačka), EPIPEN (Dey, L.P.) i HUMIRA™ pen-uređaj (Abbott Labs, Abbott Park, IL), da se nabroji samo nekoliko.
[0418] [0215] Pogodno je da se prethodno opisane farmaceutske kompozicije za oralnu ili parenteralnu upotrebu pripremaju u jediničnim doznim oblicima koji se uklapaju u dozu aktivnih sastojaka. Takvi dozni oblici u jedničnom dozi obuhvataju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije itd. Količina prethodno navedenog antitela u njima je uglavnom od oko 5 do oko 500 mg po doznom obliku u jediničnoj dozi; posebno kod oblika za injeciranje, a poželјno je i da ostali dozni oblici sadrže od oko 5 do oko 100 mg i od 10 do oko 250 mg prethodno navedenog antitela.
[0420] Terapeutske upotrebe antitela
[0422] Zbog njihove interakcije sa Fel d1, predmetna antitela su korisna u lečenju primarnog odgovora nakon izlaganja osobe mački, mačjoj peruti ili okruženju koje sadrži protein Fel d1; ili u lečenju najmanje jednog simptoma povezanog sa alergijskim odgovorom, kao što su svrab očiju, konjuktivitis, rinitis, zviždanje u grudima, poteškoće u disanju; ili za prevenciju sekundarnog odgovora na Fel d1 alergen, uklјučujući ozbilјniji anafilaktički odgovor; ili za smanjenje ozbiljnosti, trajanja i/ili učestalosti simptoma nakon ponovnog izlaganja mačjem alergenu. Shodno navedenom, predviđeno je da se antitela predmetnog pronalaska mogu upotrebljavati profilaktički ili terapijski.
[0423] U još jednom dodatnom primeru izvođenja pronalaska, predmetna antitela se upotrebljavaju u pripremi farmaceutske kompozicije za lečenje pacijenata koji pate od osetlјivosti na mačke, mačju perut, mačju dlaku ili njihov ekstrakt i/ili protein Fel d1. U još jednom primeru izvođenja pronalaska, predmetna antitela se upotrebljavaju u pripremi farmaceutske kompozicije za smanjenje ozbilјnosti nakon primarnog izlaganja Fel d1, ili za smanjenje ozbiljnosti, trajanja i/ili broja alergijskih odgovora na Fel d1. U sledećem primeru izvođenja pronalaska, predmetna antitela se upotrebljavaju kao dodatna terapija bilo kom drugom sredstvu korisnom za lečenje mačjih alergena, uklјučujući kortikosteroide, vakcine, imunoterapiju specifičnu za alergene (SIT) ili bilo koju drugu palijativnu terapiju koja je poznata stručnjacima u ovoj oblasti.
[0425] Kombinovane terapije
[0427] Kombinovane terapije mogu uključivati anti-Fel d1 antitelo pronalaska i bilo koje dodatno terapijsko sredstvo koje je se može povolјno kombinovati sa antitelom pronalaska ili sa biološki aktivnim fragmentom antitela pronalaska.
[0428] Na primer, može biti upotrebljeno drugo terapijsko sredstvo, poput kortikosteroida, a da bi se potpomoglo smanjenje alergijskih simptoma nakon izlaganja mački, mačjoj peruti, mačjoj dlaci ili njenom ekstraktu ili Fel d1, ili nakon izlaganja okruženju kome mačka prebiva. Antitela mogu takođe biti upotrebljena u kombinaciji sa drugim terapijama, kao što je vakcina specifična za Fel d1 alergen. Dodatna terapijski aktivna komponenta(e) može biti primenjena pre, istovremeno sa ili nakon primene Anti-Fel d1 antitela predmetnog pronalaska. Za potrebe predmetnog opisa, ovakvi režimi primene se razmatraju primenama anti-Fel d1 antitela "u kombinaciji sa" drugom terapijski aktivnom komponentom.
[0431] 1
[0432] Režimi primene
[0434] Prema određenim aspektima opisa, višestruke doza jednog ili više od anti-Fel d1 antitela (kombinacije antitela) ili bispecifičnog molekula koji vezuje antigen, mogu biti primenjene subjektu tokom definisanog vremenskog perioda. Postupci u skladu sa ovim aspektom, obuhvataju sekvencijalnu primenu subjektu višestrukih doza antitela, kombinacije antitela ili bispecifičnog molekula koji vezuje antigen pronalaska. Kao što je ovde upotrebljavano, "sekvencijalna primenu" označava da se svaka doza antitela, kombinacije antitela ili bispecifičnog molekula koji vezuje antigen daje subjektu u različitoj vremenskoj tački, npr. različitim danima koji su razdvojeni unapred određenim intervalom (npr. trajanja u satima, danima, nedeljama ili mesecima). Predmetni opis obuhvata postupke koje podrazumevaju sekvencalnu primenu jedne početne doze antitela, kombinacije antitela ili molekula koji vezuje specifični antigen pacijentu, a zatim primenu jedne ili više sekundarnih doza antitela, a po izboru i jedne ili više tercijarnih doza antitela.
[0435] Termini "početna doza", "sekundarne doze" i "tercijarne doze" odnose se na vremensku sekvencu primene antitela, kombinacije antitela ili bispecifičnog molekula koji vezuje antigen pronalaska. Prema tome, "početna doza" je doza koja se daje na početku režima lečenja (označava se takođe kao "bazalna doza"); "sekundarne doze" su doze koje se primenjuju nakon početne doze; a "tercijarne doze" su doze koje se primenjuju nakon sekundarnih doza. Svaka od početne, sekundarne i tercijarne doze može sadržavati istu količinu antitela, kombinacije antitela ili bispecifičnog molekula koji vezuje antigen, a koje se uglavnom mogu razlikovati jedne od drugih u pogledu učestalosti primene. U određenim aspektima, međutim, količina antitela, kombinacije antitela ili bispecifičnog molekula koji vezuje antigen, koja je sadržana u početnoj, sekundarnim i/ili tercijarnim dozama varira u odnosu na druge (npr. podešava se naviše ili naniže kako je prikladno) tokom vremena trajanja tretmana. U određenim primerima izvođenja, dve ili više (npr. 2, 3, 4 ili 5) doza se primenjuje na početku režima lečenja u vidu "doze za opterećivanje", nakon čega slede naredne doze koje se primenjuju sa manjom učestalošću (npr. "doze održavanja").
[0436] U jednom oglednom primeru aspekta, svaka sekundarna i/ili tercijarna doza se primenjuje 1 do 26 (npr.1, 1½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11, 11½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½, 15, 15½, 16, 16½, 17, 17½, 18, 18½, 19, 19½, 20, 20½, 21, 21½, 22, 22½, 23, 23½, 24, 24½, 25, 25½, 26, 26½ ili više) nedelјa nakon prve prethodne doze. Fraza "prva prethodna doza", kako se ovde upotrebljava, podrazumeva, u nizu višestrukih primene, dozu antitela, kombinacije antitela ili bispecifičnog molekula koji vezuje antigen, koja se primenjuje pacijentu pre primene prve sledeće doze u niu bez primene doze između (interventne doze).
[0437] Postupci prema ovom aspektu mogu obuhvatati primenu pacijentu bilo kog broja sekundarnih i/ili tercijarnih doza antitela, kombinacije antitela ili bispecifičnog molekula koji vezuje antigen, a koji
[0440] 2
[0441] se specifično vezuju za Fel d1. Na primer, u određenim primerima izvođenja, pacijentu se daje samo jedna sekundarna doza. U drugim primerima izvođenja, pacijentu se daju dve ili više (npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više) sekundarnih doza. Slično tome, u određenim aspektima, pacijentu se daje samo jedna tercijarna doza. U drugim aspektima, pacijentu se primenjuju dve ili više (npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više) tercijarnih doza.
[0442] U aspektima koji uklјučuju višestruke sekundarne doze, svaka sekundarna doza može biti primenjena sa istom učestalošću kao i ostale sekundarne doze. Na primer, svaka sekundarna doza može biti primenjena pacijentu 1 do 2 nedelјe nakon poslednje prethodne doze. Slično tome, u primerima izvođenja koja uklјučuju više tercijarnih doza, svaka tercijalna doza može biti primenjen sa jednakom frekvencijom kao ostale tercijarne doze. Na primer, svaka tercijalna doza može biti primenjena pacijentu 2 do 4 nedelјe nakon poslednje prethodne doze. Alternativno, frekvencija primene sekundarnih i/ili tercijarnih doza pacijentu može varirati tokom perioda režima lečenja. Učestalost primene može takođe biti podešena tokom perioda lečenja od strane lekara, u zavisnosti od potreba svakog individualnog pacijenta, a nakon kliničkog pregleda.
[0444] Dijagnostičke upotrebe antitela
[0446] Anti-Fel d1 antitela mogu takođe biti upotrebljena za detekciju i/ili merenje Fel d1 u uzorku, npr. u dijagnostičke svrhe. Predviđeno je da potvrda alergijskog odgovora za koji se pretpostavlja je prouzrokovan sa Fel d1 može biti dobijena merenjem prisustva bilo Fel d1, upotrebom bilo kog jednog ili više od antitela. Primer dijagnostičkih testova za Fel d1 može obuhvatati, npr. kontakt uzorka dobijenog iz pacijenta sa anti-Fel d1 antitelom, pri čemu je anti-Fel d1 antitelo obeleženo obeleživačem koji se može detektovati ili reporterskim molekulom reporterom, ili antitelo može biti upotrebljeno kao ligand za hvatanje i selektivnu izolaciju Fel d1 proteina iz uzoraka pacijenta. Alternativno, neobeleženo anti-Fel d1 antitelo može biti upotrebljeno u dijagnostičkim primenama u kombinaciji sa sekundarnim antitelom koje je i samo obeleženo molekulom koji se može detektovati. Obeleživač koji se može detektovati ili reporterski molekul može biti radioizotop, poput<3>H,<14>C,<32>P,<35>S ili<125>J; fluorescentna ili hemiluminescentna grupa poput fluorescein izotiocijanata ili rodamina; ili enzimim poput alkalne fosfataze, β-galaktozidaze, peroksidaze rena ili luciferaze. Specifični testovi za primer koji mogu biti upotrebljeni za detekciju ili merenje Fel d1 u uzorku uklјučuju enzimski povezanu imunosorbentnu analizu (ELISA), radioimunoanalizu (RIA) i sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom (FACS).
[0447] [0226] Uzorci koji mogu biti upotrebljeni u Fel d1 dijagnostičkim testovima obuhvataju bilo koji uzorak tkiva ili tečnosti koji se može dobiti iz pacijenta, a koji sadrži detektabilne količine Fel d1 proteina, ili njegovih fragmenata, u normalnim ili patološkim uslovima. U principu, nivoi Fel d1 u određenom uzorku koji je dobijen iz zdravog pacijenta/ koji ne pati od alergija (npr. pacijenta koji ne pati od osetljivosti povezane sa prisustvom Fel d1) meriće se tako da se inicijalno uspostavi bazalni, ili standardni, nivo Fel d1. Ovaj bazalni nivo Fel d1 može zatim biti upoređen sa nivoima Fel d1 koji su izmereni u uzorcima dobijenim iz osoba za koje se sumnja da su osetljive na Fel d1 u mačjoj peruti ili koje su sa simptomima povezanim sa takvim stanjem.
[0449] PRIMERI
[0451] Primeri koji slede su navedeni tako da prosečno iskusnim stručnjacima obezbede potpun opis pronalaska, kao i opis načina pravlјenja i primene postupaka i kompozicija pronalaska, pri čemu nije predviđeno da isti ne ograničavaju područje onoga što pronalažači smatraju njihovim pronalaskom. Uloženi su napori da se osigura tačnost u pogledu upotrebljeni brojeva (npr. količine, temperature itd.), ali je potrebno uzeti u obzir i pojedine eksperimentalne greške i odstupanja. Ukoliko nije drugačije naznačeno, delovi su težinski delovi, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperature je u stepenima Celzijusa, a pritisak je blizu ili jednak atmosferskom.
[0453] Primer 1. Generisanje humanih antitela na Fel d1
[0455] Imunogen koji podrazumeva bilo koji od onih koji slede, može biti upotrebljen za generisanje antitela na Fel d1. U određenim primerima izvođenja, antitela pronalaska su dobijena iz miševa imunizovanih sa primarnim imunogenom, kao što je Fel d1 pune dužine koji se javlja u prirodi (nFel d1), a koji može biti komercijalno nabavljen (npr. od kompanije Indoor Biotechnologies, kat. br. LTN-FD1-1) ili izolovan sa mačje dlake ili peruti hromatografijom na koloni u više koraka (pogledati, na primer, Chapman MD i saradnici (1988), J. Immunol. 140:812-818) ili koji može biti rekombinantno proizveden (pogledati pristupne brojeve P30438 ili NP_001041618.1 u GenBank bazi podataka, za aminokiselinsku sekvencu pune dužine lanca 1 iz Fel d1 (označenog i kao lanac A ili FELD1 A; pogledati takođe SEQ ID NO: 392), kao i pristupne brojeve P30440 ili NP_001041619.1 za aminokiselinsku sekvencu pune dužine lanca 2 iz Fel d1 (označenog i kao lanac B ili FELD B; pogledati takođe SEQ ID NO: 393); ili kao što su fragmenti bilo lanca 1 ili lanca 2, ili fragmente i lanca 1 i lanca 2 Fel d1 proteina, nakon čega je sledila imunizacija sa sekundarnim imunogenom ili sa imunogeno aktivnim fragmentom prirodnog proteina. Životinje mogu biti imunizovane bilo proteinom lanca 1 samostalno ili proteinom lanca 2 samostalno, ili sa oba proteina lanca 1 i lanca 2, koja se primenjuju jedan za drugim ili istovremeno. Upotrebom delova lanca 1 i lanca 2, zajedno sa raznim strategijama uvođenja linkera ili spejsera koje su poznate stručnjacima iz oblasti tehnike, mogu biti pripremljeni i razni konstrukti. Ovi konstrukti mogu biti upotrebljeni samostalno, ili u raznim kombinacijama, da bi se indukovao odgovor u vidu sinteze antitela in vivo. Na primer, rekombinantni Fel d1 konstrukti, kao što su oni koji su
[0458] 4
[0459] prikazani u vidu primera u SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 ili 397, ili njihovi fragmenti, mogu biti upotrebljeni kao imunogeni.
[0460] U određenim primerima izvođenja, antitela pronalaska su dobijen iz miševa imunizovanih sa primarnim imunogenom, kao što je biološki aktivan i/ili imunogeni fragment prirodnog Fel d1, ili kao što je DNK koja kodira njegov aktivni fragment. Fragment može biti izveden iz N-terminalnog ili C-terminalnog domena bilo lanca 1 i/ili lanca 2 Fel d1.
[0461] U određenim primerima izvođenja, rekombinantno proizveden Fel d1 imunogen može biti sintetisan direktnom fuzijom dva lanca Fel d1, kao što je opisano u publikaciji Kaiser-a i saradnika, a da bi se proizveo fuzioni produkt sa obrascem ponovnog uvijanja koji je sličan onome koji karakteriše prirodan Fel d1 (Kaiser L. i saradnici, (2003), J. Biol. Chem. 278(39):37730-37735). U određenim primerima izvođenja, imunogen može biti fuzioni protein kao što je onaj prikazan u konstruktima SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 ili 397, nakon čega sledi imunizacija sa sekundarnim imunogenom, ili sa imunogeno aktivnim fragmentom prirodnog ili rekombinantno proizvedenog Fel d1.
[0462] U određenim primerima izvođenja, konstrukti rekombinantnog Fel d1 proteina koji su upotrebljeni u ovde opisanim studijama, sastoje se od bilo i) B lanca Fel d1 (lanac 2) i A lanca Fel d1 (lanac 1) koji su povezani u kontinuriani fuzionisan molekul sa istim okvirom čitanja (sa Fel d1 B lancem na N-kraju) ili ii) kontinuiranog fuzionog molekula sa istim okvirom čitanja sa Fel d1 A lancem na N-tkraju, nakon koga slede fleksibilan linker [(Gly4Ser)<3>] i Fel d1 B. Ovakvi konstrukti mogu takođe sadržavati C-terminalan tag (myc-myc-His6 ili mišji IgG2a Fc region), kao što je navedeno u nastavku teksta. Proteini su ekaprimirani u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO ćelijama). Egzogena signalna sekvenca koja je upotrebljena za pospešivanje ekspresije u CHO ćelijama nije uklјučena u listu sekvenci.
[0463] [0232] U određenim primerima izvođenja, imunogen može biti fuzioni protein koji obuhvata bilo koji ili više od sledećeg: i) aminokiselinske ostatke 18-109 lanca 2 iz Fel d1 (pogledati pristupni broj P30440 u GenBank bazi, kao i SEQ ID NO: 393) fuzionisane preko C-kraja direktno sa N-krajem aminokiselinskih ostataka 23-92 lanca 1 iz Fel d1 (pogledati pristupni broj P30438 u GenBank bazi, kao i SEQ ID NO: 392); ii) aminokiselinske ostatke 23-92 lanca 1 iz Fel d1 (pogledati pristupni broj P30438 u GenBank bazi, kao i SEQ ID NO: 392) fuzionisane preko C-kraja sa N-krajem aminokiselinskih ostataka 18-109 lanca 2 iz Fel d1 (pogledati pristupni broj P30440 u GenBank bazi, kao i SEQ ID NO: 393); iii) aminokiselinske ostatke 18-109 lanca 2 iz Fel d1 (pogledati pristupni broj NP_001041619.1 u GenBank bazi) fuzionisane preko C-kraja direktno sa N-krajem aminokiselinskih ostataka 19-88 lanca 1 iz Fel d1 (pogledati pristupni broj NP_001041618.1 u GenBank bazi), kao što je konstrukt prikazan u SEQ ID NO: 394 ili 396; iv) aminokiselinske ostatke 19-88 lanca 1 iz Fel d1 (pogledati pristupni broj NP_001041618.1 u GenBank bazi) fuzionisane preko C-kraja sa N-krajem aminokiselinskih ostataka 18-109 lanca 2 iz Fel d1 (pogledati pristupni broj NP_001041619.1 u GenBank bazi). Pogledati takođe SEQ ID NO: 395. U određenim primerima izvođenja, fuzioni protein može biti sa oznakom na C terminalnom kraju konstrukta, kao što je myc-myc-heksahistidinski tag (pogledati SEQ ID NO: 385, 396 ili 397 za takve konstrukte.). U srodnim primerima izvođenja, fuzioni protein može sadržavati Fc region mišjeg antitela kuplovan sa C terminalnim krajem konstrukta (pogledati SEQ ID NO: 394 ili 395 za takve konstrukte.). U određenim primerima izvođenja, lanci 1 i 2 su povezani preko linkera koji je poznat stručnjacima iz oblasti, npr. sa (G<4>S)<3>(pogledati SEQ ID NO: 395 i 397 za takav konstrukt.).
[0464] U određenim primerima izvođenja, antitela koja se specifično vezuju za Fel d1 mogu biti pripremljena upotrebom fragmenata prethodno naznačenih regiona, ili peptida koji se protežu izvan naznačenih regiona za oko 5 do oko 20 aminokiselinskih ostataka, polazeći od bilo kog, ili od oba od N ili C terminalnih krajeva regiona koji su ovde opisani. U određenim primerima izvođenja, bilo koja kombinacija prethodno naznačenih regiona, ili njihovih fragmenata, može biti upotrebljena u pripremi antitela specifičnih za Fel d1. U određenim primerima izvođenja, bilo koji ili više od prethodno naznačenih regiona Fel d1, ili njihovih fragmenata, mogu biti upotrebljeni za pripremu monospecifičnih, bispecifičnih ili multispecifičnih antitela.
[0465] Proteini pune dužine, ili njihovi fragmenti, koji su upotrebljeni kao imunogeni, kao što je prethodno navedeno, primenjivani su direktno, sa adjuvansom za stimulaciju imunog odgovora, VELOCIMMUNE® mišu koji sadrži DNK koja kodira varijabilne regione humanog imunoglobulinskog teškog i kapa lakog lanca. Imunski odgovor antitela je praćen imunoanalizom specifičnom za Fel d1. Kada je postignut želјeni imunski odgovor, izdvojeni su splenociti i fuzionisani su mišjim ćelijama mijeloma da bi se očuvala njihova vijabilnosti i obrazovale hibridomske ćelijske linije. Hibridomske ćelijske linije su pregledane i selektovane da bi se identifikovala ćelijsk linija koji proizvodi antitela specifična za Fel d1. Upotrebom ove tehnike i raznih imunoogena koji su prethodno opisani, dobijeno je nekoliko anti-Fel d1, himernih antitela (tj. dobijena su antitela koja poseduju humane varijabilne domene i mišje konstantne domene); određena ogledna antitela generisana na ovaj način su označena kao H1M1230N, H1M1234N, H1M1241N, H2M1233N, H2M1236N, H2M1237N i H2M1242N.
[0466] Anti-Fel d1 antitela su takođe izolovana direktno iz antigen-pozitivnih B ćelija bez fuzije sa ćelijama mijeloma, kao što je opisano u U.S.2007/0280945A1. Upotrebom obog postupka, dobijeno je nekoliko u potpunosti humanih anti-Fel d1 antitela je dobijeno (tj. dobijena su antitela koja poseduju humane varijabilne domene i humane konstantne domene); antitela za primer koja su generisana na ovaj način, označena su kao: H4H2574P, H4H2590S, H4H2592B, H4H2594S, H4H2597P, H4H2606B, H4H2607B, H4H2608B, H4H2636P, H4H2645P, H4H2793P, H4H2797P i H4H2864P.
[0467] Biološka svojstva oglednih antitela generisanih u skladu sa postupcima ovog Primera, detalјno su opisana u Primerima koji su navedeni u tekstu koji sledi.
[0468] Primer 2. Varijabilni region teškog i lakog lanca aminokiselinskih sekvenci
[0470] U Tabeli 1 su navedeni parovi aminokiselinskih sekvenci varijabilnog regiona teškog i lakog lanca izabranih antitela koja su specifična za Fel d1 i njihovih odgovarajućih parametara identifikacije za antitela. Antitela se ovde obično navode prema sledećoj nomenklaturi: prefiks je Fc (npr. "H4H", "H1M," H2M"), nakon koga sledi numerički parametar identifikacije (npr. "1232", kao što je prikazano u Tabeli 1), a zatim i "P" ili "N" sufiks. Stoga, prema ovoj nomenklaturi, antitelo može biti označeno kao, npr. "H1M1232N". Prefiksi H4H, H1M i H2M u oznakama antitela koja su ovde upotrebljena, ukazuju na određeni Fc region antitela. Na primer, "H2M" antitelo sadrži mišji IgG2 Fc, dok antitelo "H4H" sadrži humani IgG4 Fc. Bitno je napomenuti za prosečno iskusne stručnjake iz oblasti tehnike, da H1M ili H2M antitelo može biti prevedeno u H4H antitelo i obrnuto, ali i da će u svakom slučaju, varijabilni domeni (uklјučujući CDR sekvence) koji su naznačeni numeričkim markerima prikazanim u Tabeli 1, ostati isti. Antitela sa istom numeričkom oznakom antitela, ali koja se razlikuju u slovu sufiksa tipa N, B, S ili P, odnose se na antitela sa identičnim CDR sekvencama u teškim i lakim lancima koja su sa varijacijama u skevnci u regionima koji ispadaju izvan CDR sekvenci (tj. u uokvirujućim regionima). Shodno navedenom, N, B, S i P varijante određenog antitela sadrže identične CDR sekvence unutar svojih varijabilnih regiona teškog i lakog lanca, ali se razlikuju jedan od drugoga po svojim uokvirujćim regionima.
[0472] Tabela 1
[0475]
[0476]
[0479] Primer 3. Analiza upotrebe varijabilnih gena
[0481] Da bi se analizirala struktura proizvedenih antitela, klonirane su i sekvencirane nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione antitela. Iz sekvence nukleinskih kiselina i predviđene aminokiselinske sekvence antitela, upotreba gena (V<H>, D, J<H,>V<K>ili J<K>) je identifikovana za svaki varijabilni region teškog lanca (HCVR) i varijabilni region lakog lanca (LCVR). Tabela 2 prikazuje upotrebu gena za odabrana antitela u skladu sa pronalaskom.
[0483] Tabela 2
[0486]
[0487]
[0490] Primer 4. Vezivanje antitela za Fel d1 određeno površinskom plazmonskom rezonancom
[0492] [0239] Asocijativne i disocijativne konstante stope vezivanje (k<a>i k<d>, tim redom) i izračunavanje ravnotežnih konstanti disocijacije i disocijativnih poluživota (K<D>i t<1/2>, tim redom) vezivanja antigena za anti-Fel d1 monoklonska antitela određiveni su biosenzorskom analizom upotrebom površinske plazmonske rezonance u realnom vremenu (na Biacore T200 ili Biacore 2000 sistemu). Senzorska površina Biacore sistema je derivatizovana bilo sa poliklonskim zečjim anti-mišjim antitelom (GE Healthcare, kat. br. BR-1008-38) ili sa monoklonskim mišjim anti-humanim Fc antitelom (GE Healthcare, kat. br. BR-1008-39) da bi se “zarobila” anti-Fel d1 antitela, eksprimirana sa mišjim Fc (prefiks ID antitela - H1M, H2M, H2aM, H2bM) ili humanim IgG4 Fc (prefiks ID antitela - H4H), tim redom. Za kinetičke primene, najmanje dve različite koncentracije (raspona od 390 pM do 67nM) prirodnog Fel d1 (Indoor Biotech, kat. br. NA-FD1-2) ili rekombinantne verzije proteina, Fel d1 (B-A)-mmH (SEQ ID NO: 396) injecirane su preko površine sa pričvršćenim anti-Fel d1 monoklonskim antitelom, na 25°C, pri brzini protoka od 50 µl/min u puferu za protok (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,05% P20, 3 mM MgCl<2>, 3mM CaCl<2>). Fel d1 (B-A)-mmH je eksprimiran u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO), a sastojao se od aminokiselina 18-109 iz Fel d1 B (pristupni br. P30440) fuzionisanih uz očuvanje istog okvira čitanja sa aminokiselinama 23-92 iz Fel d1 A (pristupni br. P30438) na čijem C kraju se nalazio myc-myc-heksahistidinski tag. Asocijacija antitela i antige je proaćena tokom od 3 do 5 minuta, a disocijacija antigena od pričvršćenog monoklonskog antitela (samo u puferu za protok, na 25°C) praćena je tokom 10 ili 15 minuta. Kinetičke konstante stope asocijacije (k<a>) i disocijacije (k<d>) su određivane obradom i uklapanjem podataka u model vezivanja tipa 1:1 upotrebom kompjuterskog programa Scrubber 2.0 za očitavanja sa krive. Ravnotežna konstanta disocijacije vezivanj (K<D>) i disocijativni poluživot (t<1/2>) su izračunavani iz konstanti kinetičke brzine kao: K<D>= k<d>/k<a>i t<1/2>= In(2)/k<d>. Parametri vezivanja za različita monoklonska anti-Fel d1 antitela su prikazani u Tabeli 3 i Tabeli 4. Tabela 3 prikazuje Biacore afinitete na 25°C za vezivanje prirodnog Fel d1 za pričvršćena monoklonska anti-Fel d1 antitela, a Tabela 4 prikazuje Biacore afinitete na 25°C za vezivanje rekombinantnog Fel d1 za pričvršćena monoklonska anti-Fel d1 antitela.
[0493] Kao što je prikazano u Tabeli 3, 10 od 25 ispitivanih antitela je karakterisala K<D>vrednosti vezivanja za prirodni Fel d1 od ispod 1 nM, pri čemu je opseg iznosio od 207 pM do 982 pM. Kao što je prikazano u Tabeli 4, 17 od 25 ispitivanih antitela je karakterisala K<D>vrednosti vezivanja za rekombinantan Fel d1 od ispod 1 nM, pri čemu je opseg iznosio od 144 pM do 924 pM. U ovim eksperimentalnim uslovima, dva antitela, H4H2574B i H4H2793P, su se vezivala za rekombinantan, ali ne i za prirodan Fel d1.
[0495] Tabela 3
[0498]
[0499]
[0501] Tabela 4
[0502]
[0505] 1
[0506]
[0509] Primer 5. Unakrsna kompeticija anti-Fel d1 antitela u vezivanju za prirodni (n) Fel d1
[0511] Eksperiment vezivanja je izveden upotrebom Octet Red biosenzornog sistema (Fortebio Inc.) da bi se utvrdila unakrsna kompeticija u vezivanju za prirodni Fel d1 (nFel d1; Indoor Biotechnologies, kat. br. NA-FD1-2) za panel od 8 anti-Fel d1 antitela. Eksperiment je izveden na 25°C u HBST puferu (0,01 M HEPES pH 7,4; 0,15M NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% v/v Surfaktant P20) koji je sadržavao 0,1 mg/mL BSA. Između svakog koraka vezivanja rađen je korak pranja sa HBST puferom, a ploče su treskane tokom koraka vezivanja i pranja upotrebom orbitalnog šejkera za ploče, na brzini od 1000 obrtaja/min. Prvo anti-Fel d1 antitelo (mAt-1) je pričvršćavano tokom 2 minuta za površinu biosenzora prevučenu sa antihFc, upotrebom koncentrovanog osnovnog rastvora antitela od 10ug/mL (finalni nivo “hvatanja” ∼1,5nm jedinica odgovora). Obloženi vrhovi senzora su tada blokirani tokom 5 minuta sa 100ug/mL rastvora nerelevantnog antitela. Vrhovi senzora su zatim potoplјeni u bunariće koji su sadržavali 500 nM nFel d1 u trajanju od 5 minuta, a zatim i u bunariće koji su sadržavali rastvor drugog anti-Fel d1 antitela (mAt-2) koncentracije 50 ug/mL. U rastvor mAt-2 je potom dodato 100 ug/mL nerelevantnog antitela da bi se nespecifično vezivanje svelo na minimum. Odgovori vezivanja za vezivanje mAt-2 za nFel d1 koji je bio u prethodno obrazovanom kompleksu sa mAt-1, izmeren je za matricu od 8x8 antitela (Tabela 5). Od svake vrednosti vezivanja dobijene za vezivanje mAt-2 za različitu mAt-1/Fel d1
[0514] 2
[0515] površinu za hvatanje (donji deo kolona u Tabeli 5) oduzimana je vrednost auto-kompeticije za mAt-1/Fel d1/mAt-2 (gde mAt-1 = mAt-2; dijagonalno u Tabeli 5). Vrednosti ispod 0,10nm ukazuju na unakrsnu kompeticiju mAt-1 i mAt-2 za zajedničko vezivno mesto na Fel d1.
[0516] Četiri antitela, H4H2636P, H4H1616N, H4H2645P i H4H2864P, bila su u dvosmernoj kompeticiji jedni sa drugima u vezivanju za nFel d1, ali nisu bila u kompeciji sa bilo kojim drugim anti-Fel d1 antitelima. Dva antitela, H4H1232N i H4H2597P, bila su u dvosmernoj kompeticiji jedno sa drugim u vezivanju za nFel d1. I H4H1232N i H4H2597P su bila u jednosmernoj kompeticiji sa H4H1300N. Dvosmerna kompeticija sa H4H1300N nije se mogla odrediti pošto H4H1300N nije prethodno obrazovao komleks sa nFel d1. H4H1238N nije bio u kompeticiji sa bilo kojim od anti-Fel d1 antitela u vezivanja za nFel d1.
[0518] Tabela 5
[0521]
[0524] Primer 6. Efekat anti-Fel d1 antitela u in vivo modelu pasivne kožne anafilakse (PCA)
[0526] [0243] In vivo model pasivne kožne anafilakse (PCA) je upotrebljen za procenu in vivo degranulacije mastocita. Model obuhvata intradermalno ubrizgavanje antiseruma specifičnog za alergen u lokalno područje na koži nakon čega sledi intravenska injekcija antigena zajedno sa bojom. Alergijska reakcija izaziva dilataciju kapilara i povećanu vaskularnu propustlјivost na mestu senzibilizacije, što rezultuje preferencijalnim nakuplјanjem boje na ovom mestu. Boja može biti ekstrahovana iz tkiva i kvantifikovana spektrofotometrijski. Ekstravazacija (izlivanje) boje iz tkiva koje je senzibilisano ispitivanim antiserumom je upotređivana sa ekstravazacijom u tkivu senzibilisanom nerelevantnim antiserumom.
[0527] Antiserumi su generisani imunizovanjem Balb/c miševa sa 5 µg prirodnog Fel d1 proteina prečišćenog iz ekstrakta mačje dlake (Indoor Biotechnologies, kat. br. LTN-FD1-1), 5 µg ekstrakta neprečišćenog agergena kikirikija (Greer Laboratories, kat. br. XPF171D3A25) ili 1250 bioekvivalentnih alergijskih jedinica (BAU) standardizovanog ekstrakta mačje dlake (Greer Laboratories, kat. br. GTE3A01) u rastvoru aluma od 1 mg/ml (Pierce, kat. br.77161) u 1X fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom. Dve nedelјe kasnije (dan14) senzibilisanim miševima je data bust-doza alergena idetničnih onima koji su upotrebljeni u inicijalnoj imunizaciji. Dve nedelјe nakon bust-doze (dan 28), miševi su žrtvovani i prikuplјen je serum. Ukupna koncentracija IgE u izolovanom antiserumu je određena ELISA postupkom. Finalana koncentracija antiseruma je razblažena do 2400ng/mL IgE u 1X fiziološkom rastvoru puferisanom sa fosfatima.
[0528] Da bi se utvrdio efekat anti-Fel d1 antitela na degranulaciju mastocita u PCA modelu, pre senzibilizacije uha sa antiserumom generisanim kao što je prethodno opisano, grupama Balb/c miševa za eksperimente sa jednom vremenskom tačkom su najpre supkutano injicirani bilo humanog kontrolno antitelo IgG4 izotipa, anti-Fel d1 antitelo ili kombinacija anti-Fel d1 antitela u dozama od 5 mg/kg (ukupna doza antitela, 2,5 mg/kg za svako antitelo), osim ukoliko je drugačije naznačeno, dok su za eksperimente sa rasponom doza injecirane konecentracije opsega od 0,06 mg/kg do 2 mg/kg. Tri dana nakon pretretmana sa antitelima, jedna grupa miševa („grupa za prirodni Fel d1“) je senzibilisana intradermalnom injekcijom sa 10 µl antiseruma dobijenog za prirodan Fel d1 ili sa 10 µl antiseruma koji je dobijen tretmanom sa ekstraktom kikirikija (negativna kontrola) u desno i levo uvo svakog miša, tim redom. Druga grupa miševa („grupa za mačji ekstrakta “) je bila senzibilisana sa 20 µL antiseruma dobijenog za ekstrakt mačje dlake ili sa 20 µL antiseruma dobijenog za kikiriki (negativna kontrola) u desno i levo uvo svakog miša, tim redom. Dvadeset i četiri sata nakon senzibilizacije, miševima u grupa za prirodni Fel d1 je data intravenska injekcija (100 µL po mišu) rastvora sa 0,25 µg/mL prirodnog Fel d1 (Indoor Biotechnologies, kat. br. LTN-FD1-1) koji je bio rastvoren u 1X fiziološkom rastvoru puferisanom sa fosfatima koji je sadržavao 0,5% (w/v) Evansove plave boje (Sigma, kat. br. E2129). Slično tome, 24 sata nakon senzibilizacije, miševi u grupi za mačiji ekstrakt, primili su 250BAU standardizovanog ekstrakta mačje dlake [standardizovan ekstrakt mačje dlake (Greer Laboratories, kat. br. GTE3A01)] koji je bio rastvoren u 1X fiziološkom rastvoru puferisanom sa fosfatima koji je sadržavao 0,5% (w/v) Evansove plave boje (Sigma, kat. br. E2129). Sat vremena nakon izlaganja antigenu, miševi su žrtvovani, uši su disekovane i stavljene u 1 mL formamida, nakon čega su inkubirane tokom 3 dana na 56° C da bi se iz tkiva ekstahovala Evansova plava boja. Tkivo ušiju je zatim uklonjeno iz formamida, obrisano da bi se uklonio višak tečnosti i izmereno je. Alikvoti od dve stotine mikrolitara svakog formamidskog ekstrakta je prebačeno u duplikatu u mikrotitar ploče sa 96 mesta. Apsorbanca
[0531] 4
[0532] dobijenih supernanatanata je izmerena na 620 nm. OD je preveden u koncentraciju Evansove plave boje upotrebom standardne krive. Prosečna koncentracija Evansove plave boje koja se izlila u tkivo uha senzibilisanog antiserumom (normalizovana težinom tkiva uha) izračunata je za grupu koja je tretirana izotipskim kontrolim antitelom i definisana je kao F(izotip, prosek). Smanjenje ekstravazacije Evansove plave boje koje je rezultat pretretmana sa antitelom je izračunato po mišu, oduzimanjem količine Evansove plave boje koja je dobijena za senzibilisano uho iz grupe koja je bila tretirana anti-Fel d1 antitelom ili ekstraktom, definisane kao F(mAt,i), od F(izotip, prosek). Ovaj broj je zatim podelјen sa razlikom između F(izotip, prosek) i količine boje za senzibilisano uho iz grupe koja je bila tretirana antitelom za kikiriki [P(mAt,i)], pa je pomnožen sa 100 da bi se dobio sveukupan procenat smanjenja u ekstravazaciji boje za svakog miša (% smanjenja).
[0534] % Smanjenja (po mišu) = 100*[F(izotip,prosek)-F(mAt,i)]/[F(izotip,prosek)-P(mAt,i)]
[0536] Za svaku grupu je dalje izračunata prosečna vrednost procenta smanjanja u izlivanju boje. Rezultati iz grupe za prirodni Fel d1, izraženi kao (srednja vrednost ± SD) procenta smanjenja Evansove plave, prikazani su u Tabeli 6 i Tabeli 7, dok su u Tabeli 8 prikazani rezultati iz grupe za ekstrakt mačje dlake.
[0537] Kao što je prikazano u Tabeli 6, sedam grupa miševa za prirodni Fel d1, kada su oni bili tretirani specifičnim kombinacijama anti-Fel d1 antitela u fiksnim koncentracijama, ispoljili su smanjenja u ekstravazaciji boje opsega od 79% do 103% u poređenju sa miševima koji su primali kontrolno antitelo. Miševi tretirani sa kombinacijama parova antitela H4H2590S/H4H1238N, H4H2590S/H4H2574P ili H4H1232N/H4H1616N ispoljili su smanjenje ekstravazacije boje manje od 3%, pokazujući da nisu sva ispitivana anti-Fel d1 bila efikasna u ovom modelu.
[0538] Dodatno, urađeni su i eksperimenti sa rasponom doze sa miševima iz grupe za prirodni Fel d1, kao što je prikazano u Tabeli 7. Pojedinačna antitela nisu bila tako efikasna u smanjenju ekstravazacije boje kao kombinacije anti-Fel d1 antitela u ispitivanim dozama.
[0539] Specifičan par anti-Fel d1 antitela (H4H2636P i H4H1232N) u višestrukim nivoima doza, kao i svako od ovih anti anti-Fel d1 antitela samostalno, u jednoj (najvišoj) dozi, dalјe je ispitan u PCA modelu, upotrebom miševa koji su bili senzibilisani i izloženi ekstraktu mačje dlake, kao što je prikazano u Tabeli 8. U dozi od 2 mg/kg, ova pojedinačna anti-Fel d1 antitela nisu bila tako efikasna u smanjenju ekstravazacije boje kao kombinacija dva antitela. Kombinacija H4H2636P i H4H1232N, u dozi i od 2 mg/kg i od 1 mg/kg smanjila je ekstravazaciju boje za više od 90% u poređenju sa izotipskom kontrolom u PCA modelu nakon upotrebe ekstrakta mačje dlake kao antigena.
[0540] Sva smanjenja koja su bila statistički značajna (p <0,05) u poređenju sa izotipskom kontrolom, što je utvrđeno dvofaktorskim ANOVA testom sa Bonferroni-jevim post-testom, obeležena su zvezdicom (*). Broj upotrebljenih miševa po grupi (n) je naznačen u tabelama unutar zagrada.
[0542] Tabela 6
[0545]
[0546] Tabela 7
[0547]
[0548]
[0551] Tabela 8
[0554]
[0557] Primer 7. Efekat anti-Fel d1 antitela u in vivo model upale pluća
[0559] In vivo mišji model upale pluća upotrebljen je za procenu efekata na upalu pluća i nakuplјanje sluzi izazvanih alergenom, koji mogu biti povezani sa astmom ili rinokonjuktivitisom. Model podrazumeva ponavljanje intranazalne primene alergena kod miševa prethodno senzibilisanih na alergen. Inflamacija povezana sa alergenom može prouzrokovati povećano nakuplјanje sluzi u plućima, migraciju eozinofila u pluća, povećanje ukupnog IgE i nivoa IgG1 specifičnog za alergen u serumu.
[0560] Balb/c miševi su intraperitonealno imunizovani sa 1ug prirodnog Fel d1 proteina, prečišćenog iz ekstrakta mačje dlake (Indoor Biotechnologies, kat. br. LTN-FD1-1), u rastvoru aluma od 1mg/ml (Pierce, kat. br. 77161) sa 1X fiziološkim rastvorom puferisanim sa fosfatima. Sedam dana kasnije, senzibilisanim miševima je intraperitonealni data bust-oza od 1ug prirodnog Fel d1, u rastvoru 1 mg/mL aluma sa 1X fiziološkim rastvorom puferisanim sa fosfatima. Dana 17, 21 i 25, grupama miševa (n=5), supkutano je injecirano humano kontrolno antitelo IgG4 izotipa ili kombinacija anti-Fel d1 antitela, H4H1232N i H4H2636P sa odnosom od 1:1, u dozi od 20 mg/kg (ukupna doza antitela). Dana 20, 24 i 28, miševi su intranazalno izloženi dejstvu 0,05ug prirodnog Fel d1 razblaženog u 20 uL 1X fiziološkog rastvora puferisanog sa fosfatima. Kontrolni miševi su istim denim izlagani dejstvu 20 uL 1X fiziološkog rastvora puferisanog sa fosfatima. Dana 32, svi miševi su žrtvovani i prikupljena su njihova pluća. Protokol eksperimentalnog doziranja i lečenja za grupe miševa je prikazan u Tabeli 9.
[0561] Da bi se odredili cirkulišući ukupni IgE i IgG1 specifičan za Fel d1 u serumu miševa, uzorci seruma su sakuplјeni za svakog miša terminalnim zasecanjem srca, upotrebom TB šprica od 1 ml sa pričvršenom iglom od 27G1/2 (Becton Dickinson, kat. br.309306). Uzorci krvi su stavlјeni u epruvete za odvajanje seruma tipa BD microtainer® (Becton Dickinson, kat. br. 365956), pa su centrifugirani i potom su serumi prebačeni u čistu epruvetu za čuvanje do analize.
[0562] Za određivanje koncentracije ukupnog IgE u uzorcima seruma za svakog miša, upotrebljen je OPTEIA komplet za sendvič ELISA postupak (BD Biosciences, kat. br. 555248) prema uputstvima proizvođača. Uzorci seruma su razblaživani i inkubirani sa anti-lgE antitelom za hvatanje kojim su bile obložene mikrotitar ploče sa 96 mesta. Ukupan IgE je detektovan upotrebom biotiniziranog anti-mišjeg IgE sekundarnog antitela. Kao standard je korišćen prečišćen mišji IgE obležen peroksidaza rena (HRP). Za detekciju aktivnosti HRP je upotrebljen hromogen 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) (BD OPTEIA supstratni reagens, BD, kat. br.555214). Zatim je dodat 1M rastvor sumporne kiseline da bi se reakcija zaustavila i izmerena je apsorbanca na 450 nm, upotrebom čitača mikrotitar ploča tipa Molecular Devices SpectraMax M5. Analiza podataka je urađena upotrebom kompjuterskog programa Prism™. Srednje količine cirkulišućih nivoa IgE u serumu za svaku eksperimentalnu grupu su izražene u ng/mL (± SEM), kao što je prikazano u Tabeli 10. Miševi koji su intranazalno izlagani Fel d1, kada su lečeni kombinacijom anti-Fel d1 antitela, ispoljili su značajan pad u količini cirkulišučeg IgE [6683 (± 1394) ng/mL] u poređenju sa miševima koji su primili izotipsko kontrolno antitelo [14080 (± 1505) ng/mL].
[0563] Da bi se odredili nivoi IgG1 specifičnog za Fel d1 u uzorcima seruma iz svakog miša, korišćen je ELISA postupak. Ploče obložene Fel d1 su inkubirane sa serijski razblaženim uzorcima mišjeg seruma, nakon čega je sledila inkubacija sa anti-miš IgG1-HRP konjugovanim antitelom (BD Biosciences, kat. br.
[0564] 559626). Svi uzorci su razvijeni sa TMB rastvorom i analizirani su kao što je prethodno opisano. Relativni nivoi cirkulišućeg IgG1 u serumu predstavlјeni su kao titarske jedinice (titarske jedinice su izračunate množenjem izmerenog OD sa faktorom razblaženja potrebnim za postizanje OD450 koji je bio dva puta veći u odnosu na signal pozadine). Srednje vrednosti serumskih nivoa cirkulišućeg IgG1 specifičnog za Fel d1 za svaku eksperimentalnu grupu su izražene kao titar x 10<3>(± SEM), kao što je prikazano u Tabeli 11. Miševi koji su intranazalno izlagani Fel d1, kada su tretirani kombinacijom anti-Fel d1 antitela, ispoljili su značajno smanjenje količine nivoa IgG1 specifičnog za Fel d1 u serumu [titar od 105,3 (± 31,33) x10<3>] u poređenju sa miševima koji su primal izotipsko kontrolno antitelo [titar od 526,1 (± 144,0) x10<3>].
[0566] Uzorkovanje pluća za analizu ćelijskog infiltrata:
[0568] [0256] Nakon eksangvinacije, desno plućno krilo iz svakog miša je uklonjeno i stavlјeno je u malu petri šolju koja je sadržavala Eagle-ov medijum modifikovan po Dulbecco-u (DMEM) (Irvine Scientific, kat. br. 9033), nakon čega je isečeno na kockice veličine od približno 2 do 3 mm. Kockice su prebačene u epruvetu koja je sadržavala rastvor DNaze od 20 µg/mL (Roche, kat. br. 10104159001) i 0,7 U/mL Liberaze TH (Roche, kat. br. 05401151001) razblažene u Hank-ovom balansiranom slanom rastvoru (HBSS) (Gibco, kat. br. 14025 ), pa su inkubirane u vodenom kupatilu na 37°C tokom 20 minuta uz vorteksovanje na svakih 5 minuta. Ova reakcija je zatim zaustavlјena dodavanjem etilendiamintetrasirćetne kiseline (EDTA) (Gibco, kat. br. 15575) u finalnoj koncentraciji od 10mM. Svako pluće je dalje izmacerirano, profiltrirano kroz filter od 70µm, centrifugirano, a zatim je talog pluća resuspendovan u 4 mL ACK pufera za lizu (Gibco, kat. br.10492) da bi se uklonila crvena krvna globule. Nakon inkubacije od 3 minute na sobnoj temperaturi, dodat je DMEM da bi se deaktivirao ACK pufer. Ćelijske suspenzije su centrifugirane, pa su taloži ćelija resuspendovani u 10 mL MACS puferskog rastvora (smeša Miltenyi auto MACS rastvora za ispiranje (Militenyi Biotec, kat. br. 130-091-222) i MACS BSA (Militenyi Biotec, kat. br.130- 091-376)]. Resuspendirani uzorci su profiltrirani kroz filter od 70µm, pa je po 1x10<6>ćelije zasejano u mikrotitar ploče sa 96 mesta i V oblikom dna. Ćelije su ponovo centrifugirane i talog je ponovo resuspendovan u prečišćen pacovski anti-mišji CD16/CD32 Fc blokirajući pufer (BD Biosciences Clone: 2.4G2, kat. br. 553142) razblažen u MACS puferu, tokom 15 minuta na 40°C. Ćelije su dalje isprane dva puta, a zatim su inkubirane u odgovarajućoj smeši antitela (opisanoj u Tabeli 12) razblaženoj u MACS puferu, tokom 30 minuta, na 4° C i zaštićene od svetlosti. Nakon inkubacije sa antitelima, ćelije su isprane dva puta u MACS puferu, pa su resuspendovane u BD citofix puferu (BD Biosciences, kat. br.554655) tokom 15 minuta na 4°C, ponovo uz zaštitu od svetlosti. Ćelije su konačno isprane, resuspendovane u MACS puferu i potom prebačene u BD FACS epruvete (BD Biosciences, kat. br. 352235) radi analize eozinofila protočnom citometrijom. Eozinofili su definisani kao ćelije koje su bile CD45<+>, GR1-, CD11c<lo>, SiglecF<hi>. Podaci su u Tabeli 13 izraženi kao frekvencija eozinofila u CD45<+>ćelijama (± SEM).
[0569] Miševi koji su intranazalno izlagani Fel d1, kada su tretirani kombinacijom anti-Fel d1 antitela, ispoljili su značajan pad u učekstalosti eozinofila u CD45<+>populaciji ćelija u poređenju sa miševima koji nisu primali antitelo (smanjenje od 67%) ili koji su primal izotipsko kontrolno antitelo (smanjenje od 46%), kao što je prikazano u Tabeli 13.
[0571] Uzorkovanje pluća za histološku analizu:
[0573] Nakon eksangvinacije, leva plućna krila su uklonjena i stavlјena u epruvete koje su sadržavale 5 mL rastvora 4% (w/v) paraformaldehida (Boston Bioproducts, kat. br. BM-155) u 1X fizolološkom rastvoru puferisanom sa fosfatima, nakon čega su čuvani na sobnoj temperaturi tokom 3 dana. Uzorci pluća su posušeni i prebačeni u epruvete sa 70%-tnim etanolom, za histološku analizu. Uzorci su poslati u Histoserv, Inc (Germantown, MD) radi sečenja i šifovog bojenja perjodnom kiselinom (PAS).
[0574] [0259] Približno 35 digitalnih slika duž cele površine svakog od preseka pluća obojenog upotrebom PAS postupka, snimljeno je upotrebom Zeiss Axioplan 2 Imaging svetlosnog mikroskopa sa Zeiss AxioCam MRc kamerom. Potom je od manjih slika napravlјena cela slika pluća, koja je dalje analizirana upotrebom ImageJ programa uz pomoć dodatnog programa za postavljanje praga za boje. Regioni nakupljanja sluzi u bronhijalnom lumenu su identifikovani i kvantifikovani putem praga boje koji je odabrao korisnik, pa je normalizovan u odnosu na ukupnu površinu lumena koja je identifikovana i kvantifikovana posebnim podešavanjem praga boje. Procenat bronhijalnog lumena u kome je bila prisutna nagomilana sluz, za svako plućno krilo je izražen kao [(površina prekrivena sluzi/površina lumena) x 100], pa je zatim izračunata vrednost za svaku tretiranu grupu. Rezultati, izraženi kao srednja vredost procenta opstrukcije pluća (± SEM), prikazani su u Tabeli 14..
[0575] Miševi tretirani kombinacijom anti-Fel d1 antitela su ispoljili trend u smanjenju nakupljanja sluzi u bronhijama pluća (5,21 /- 0,81% nagomilane sluzi) u poređenju sa miševima koji su primali kontrolno antitelo (10,81 /- 1,13% nagomilane sluzi) u modelu upale pluća, kao što je prikazano u Tabeli 14.. Nisu primećene razlike u veličini lumena bronhija ili ukupnoj veličini pluća između grupa miševa.
[0577] Tabela 9: Protokol eksperimentalnih doza i lečenja za grupe Balb/c miševa
[0580]
[0583] Tabela 10: Ukupni nivoi cirkulišućeg IgE u mišjem serumu
[0585]
[0589] 1
[0590] Tabela 11: Cirkulišući IgG1 specifičan za Fel d1 u mišjem serumu
[0592]
[0594] Tabela 12: Antitela uporebljena za analizu protočnom citometrijom
[0596]
[0598] Tabela 13: Učestalost eozinofila u CD45+ ćelijama određena protočnom citometrijom
[0600]
[0604] 2
[0605] Tabela 14. Opstrukcija pluća (površina prekrivna sluzi/površina lumena, %)
[0607]
[0610] Primer 8. Mapiranje epitopa izmenom vodonika i deuterijuma
[0612] Da bi se utvrdili epitopi Fel d1 (heterodimernog proteina koji se sastoji od Fel d1 lanca A i FELD1 lanca B) koje prepoznaju dva anti-Fel d1 antitela, urađene su studije sa izmenom vodonika/deuterijum (H/D) za svako antitelo u zajedničkom kompleksu sa Fel d1. Pre eksperimenata H/D izmene, rekombinantan Fel d1 eksprimiran od strane CHO ćelija, koji se sastojao od aminokiselina 18-109 iz B lanca Feld 1 (GenBank pristupni broj NP_001041619.1) fuzionisanih uz isti okvir čitanja sa aminokiselinama 19-88 iz FELD1 A (GenBank pristupni broj NP_001041618.1) na čijem se C-kraju nalazio myc-myc-heksahistidinski tag i koji je sadržavao D27G mutaciju (Fel d1B-A-mmH; SEK ID: 396), deglikoziliran je na 37°C tokom 4 sata u nativnim uslovima upotrebom PNGase F (New England BioLabs, kat. br.0704). Za ovu studiju, dva anti-FELD1 antitela (H4H1232N i H4H2636P) kovalentno su vezana za N-hidroksisukcinimidne (NHS) agarozne globule (GE Lifescience, kat. br. 17-0906-01) prema protokolu proizvođača.
[0613] [0262] Za mapiranje epitopa vezivanja Fel d1B-A-mmH koga prepoznaje H4H1232N, urađena su dva seta eksperimenata H/D izmene (sve reakcije vezivanja i izmene su rađene na sobnoj temperaturi). U prvom eksperimentu je upotrebljen format „u-rastvor/sa-globula“ (engl. on-solution/off-beads, onizmena u rastvor, zatim off-izmena sa globula). Za on-izmenu, deglikozilovan protein Fel d1B-A-mmH je deuterizovan tokom 5 i 10 minuta (u dva odvojena pod-eksperimenta) u PBS puferu na pH 7,4, pripremlјenom sa D<2>O (PBS-D), a zatim sje isti vezivan za globule sa H4H1232N tokom inkubacije od 2 minuta, u PBS-D-u. Ko-kompleks Fel d1B-A-mmH vezanog za H4H1232N globule je zatim ispran PBS puferom na pH 7,4 koji je bio pripremljen sa H<2>O (PBS-H), pa je inkubiran u PBS-H polovinu vremena od on-izmene (off-izmena), čime je odzvoljeno da samo epitopi na Fel d1B-A-mmH koji su vezani za H4H1232N antitela ostanu deuterizovani. Nakon off-izmene, vezan Fel d1B-A-mmH je eluiran sa globula upotrebom ledeno hladnog 0,1% vodenog rastvora trifluorosirćetne kiseline (TFA). Eluirani Fel d1B-A-mmH je dalje podvrgnut digestiji sa imobilisanim pepsinom (Thermo Scientific, kat. br.20343) tokom 5 minuta na 4°C. Dobijeni peptidi su delaniziovani na 4°C korišćenjem ZipTip hromatografskih nastavaka za pipete (Millipore, kat. br. ZTC18S096) prema protokolu proizvođača, nakon čega su odmah analizirani na UltrafleXtreme matriksu, laserskim desorpcionom jonizacijom sa masenim spektrometrom (MS), na osnovu vremena leta (MALDI-TOF).
[0614] Drugi eksperiment se označava kao 'na-glubule/sa-globula' (engl. on-beads/off-beads, onizmena na globule, nakon čega sledi off-izmena sa globula). Za ovaj eksperiment, deglikozilirani Fel d1B-A-mmH je najpre vezan za globule sa H4H1232N, nakon čega je inkubiran tokom 5 ili 10 minuta (u odvojenim pod-eksperimentima) u PBS-D kako bi se omogućila izmena. Sledeći koraci (off-izmena, digestija pepsinom i MS analiza) su izvedeni kao što je prethodno opisano za 'on-rastvor/off-globule' proceduru. Centroidne vrednosti ili prosečni odnosi mase-i-naelektrisanja (m/z) svih detektovanih peptida su izračunati i upoređeni između eksperimenata on-rastvor/off-globule i on-globule/offglobule. Peptidi koji su ispoljili povećanu masu nakon postupka on-rastvor/off-globule u poređenju sa postupkom on-globule/off-globule uključivala su aminokiseline unutar Fel d1 proteina koje su bile zaštićene od izmene kao rezultat vezivanja antitela i stoga su ukazali na regione vezivanja epitopa.
[0615] Eksperiment H/D izmene za vezivanje Fel d1B-A-mmH za anti-Fel d1 antitelo H4H2636P, urađen je upotrebom iste procedure kao što je ona opisana prethodno za H4H1232N, ali sa globulama za koje je bio vezan H4H2636P umesto globula sa vezanim H4H1232N.
[0616] Poređenje centroidnih m/z vrednosti za sve peptide detektovane u eksperimentu H/D izmene sa Fel d1B-A-mmH i H4H1232N su prikazani u Tabeli 15. Ovi peptidi su identifikovani tečnom hromatografijom na matrisku uz upotrebu laserskog desorpcionog jonizacionog (LC-MALDI) MS. Većina peptičnih peptida je imala slične centroidne vrednosti (razlike <0,3 m/z jedinica) i za protokol tipa onrastvor/off-globule i on-globule/off-globule, za svako od dva različita vremena on-izmene i off-izmene. Ipak, tri peptida sa aminokiselinama koje su se protezale od 85-103, 85-104 i 113-127 u Fel d1B-A-mmH (SEQ ID NO: 396) karakterisale su razlike u m/z centroidnim vrednostima koje su iznosile > 0,3 za experimente i od 5 minuta i 10 minuta. Razlike između ovih centroidnih vrednosti u on-rastvor/offgloblue i on-globule/off-globule protokolima su u Tabeli 15 naznačene podebljanim slovima. Pošto drugi peptid, sa aminokiselinama 117-127 iz SEQ ID NO: 396, nije pokazao zadržavanje deuterona nakon off-izmene, region koji je bio zaštićen od izmene u peptide 113-127 može biti smanjene na ostatke 113-116 iz SEQ ID NO: 396. Dva regiona, ostaci 85-104 (SEQ ID NO: 403) i 113-116 (SEQ ID NO: 426) bili su zaštićeni od potpune off-izmene kao rezultat vezivanja H4H1232N za Fel d1B-A-mmH nakon on-izmene. Stoga, ova dva segmenta su definisana H/D postupkom izmene kao diskontinuirani epitop za vezivanje H4H1232N antitela za protein Fel d1B-A-mmH.
[0617] Poređenja centroidnih m/z vrednosti za peptide detektovane u H/D eksperimentu izmene sa kompleksom Fel d1B-A-mmH i H4H2636P su prikazani u Tabeli 16. Samo jedan peptid, sa
[0620] 4
[0621] aminokiselinama 15-24 iz FELD1B-A-mmH, pokazao je porast centroidnih vrednosti m/z za > 0,3 m/z u uslovima on-rastvor/off-globule u poređenju sa on-globule/off-globule uslovima, što ukazuje da je ovaj segment bio zaštićen od potune off-izmene vezivanjem za H4H2636P. Razlike centroidnih veće od 0,3 m/z su u Tabeli 16 naznačene podebljanim slovima. Stoga, aminokiseline unutar ovog regiona koga čine aminokiselin 15-24 (SEQ ID NO: 412) prema H/D postupku izmene obuhvata eptitop za vezivanje H4H2636P antitela za Fel d1B-A-mmH protein.
[0623] Tabela 15: Efekat vezivanja H4H1232N za Fel d1B-A-mmH na H/D izmenu, izmeren Centroidnim m/z vrednostima peptida dobijenih digestijom
[0625]
[0626]
[0628] Tabela 16: Efekat vezivanja H4H2636P za Fel d1B-A-mmH na H/D izmenu, izmeren Centroidnim m/z vrednostima peptida dobijenih digestijom
[0629]
[0630]
[0633] Primer 9. Generisanje bispecifičnih antitela
[0635] Opis proizvedenih Fel d1 bispecifičnih antitela
[0637] Bispecifična antitela koja sadrže domene vezivanja teškog i lakog lanca iz parova određenih antitela anti-Fel d1 koja su opisana u predmetnom pronalasku, konstruisana su upotrebom standardnih metodologija. Ant-Fel d1 antitela koja su upotrebljena za konstrukte bispecifičnih antitela ovog primera, dobijena su imunizovanjem Veloclmmune® miša primarnim imunogenom, kao što je prirodni Fel d1 pune dužine, koji može biti nabavljen komercijalno (npr. od kompanije Indoor Biotechnologies, kat. br. LTN-FD1 -1) ili izolovan iz mačje dlake ili peruti hromatografijom na koloni u više koraka (pogledati, na primer, Chapman MD, i saradnici (1988), J. Immunol. 140:812-818), ili proizveden rekombinantno (pogledati GenBank pristupne brojeve P30438 ili NP_001041618.1 za aminokiselinsku sekvencu lanca 1 pune dužine iz Fel d1 (označenog i kao lanac A ili FELD1 A; pogledati takođe SEQ ID NO: 392) i GenBank pristupne brojeve P30440 ili NP_001041619.1 za aminokiselinsku sekvencu lanca 2 pune dužine iz Fel d1 (označenog i kao lanac lanac B ili FELD B; pogledati takođe SEQ ID NO: 393), ili imunogen mogu biti fragmenti bilo kog od lanca 1 ili lanac 2, ili fragmenti i iz lanca 1 i iz lanca 2 proteina Fel d1, nakon čega sledi imunizacija sekundarnim imunogenom, ili imunogeno aktivnim fragmentom prirodnog proteina. U jednom primeru izvođenja, upotrebljen imunogen je prikazan u vidu primera u SEQ ID NO: 394 (fuzija Fel d1 lanac 2 -lanac1-mFc uz očuvanje okvira čitanja) ili u SEQ ID NO: 395 (fuzija Fel d1 lanca 1 upotrebom linkera i lanac 2 - mFc).
[0638] Bispecifična antitela proizvedena u skladu sa predmetnim primerom sadrže dva domena koja vezuju antigen (tj. "vezujuće krake 1 i 2").
[0639] Jedno od bispecifičnih antitela, označeno sa H4H3467D sadrži zajednički kapa laki lanac u oba Fab kraka, izveden iz antitela H4H2864P (SEQ ID NO: 378). U jednom Fab kraku iz H4H3467D je upotrebljen varijabilni region teškog lanca (V<H>) iz antitela H4H2864P (SEQ ID NO: 370), dok je u drugom Fab kraku upotrebljen V<H>region iz H4H1232N (SEQ ID NO: 18).
[0640] Drugo bispecifično antitelo pronalaska, označeno sa H4H8751 D, sadrži zajednički kapa laki lanac u oba Fab kraka, izveden iz antitela H4H2636P (SEQ ID NO: 314). U jednom Fab kraku iz H4H8751 D je upotrebljen V<H>region iz H4H2636P (SEQ ID NO: 306), dok je u drugom Fab kraku upotrebljen V<H>region iz H4H1232N (SEQ ID NO: 18).
[0641] Tabela 17 u nastavku, obezbeđuje komponentne delove doena koji vezuju antigen za dva bispecifična antitela napravlјena u skladu sa Primerom 9. Marker sekvence amino kiselina za različite varijabilne regione teškog i lakog lanca koji su izvedeni iz matičnih antitela (koji su upotrebljeni za pripremu bispecifičnih antitela) takođe su navedeni u Tabeli 17.
[0643] Tabela 17. Sastavni delovi dva kraka proizvedenih bispecifičnih antitela
[0645]
[0648] Tabele 18A i 18B u nastavku prikazuju markere aminokiselinskih sekvenci za različite varijabilne regione teškog lanca (Tabela 18A) i varijabilne regione lakog lanca (Tabela 18B) i njihove odgovarajuće sekvence regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) kod dva bispecifična antitela koja su ovde opisana.
[0650] Tabela 18A. Marker HCVR i HCDR sekvenci za proizvedena bispecifična antitela
[0653]
[0656] Tabela 18B. Marker LCVR i LCDR sekvenci za proizvedena bispecifična antitela
[0659]
[0660]
[0663] Biacore analiza bispecifičnih antitela za određivanje vrednosti asocijacije i disocijacije
[0665] Asocijativne i disocijativne konstante stope vezivanje (k<a>i k<d>, tim redom) i izračunavanje ravnotežnih konstanti disocijacije i disocijativnih poluživota (K<D>i t<1/2>, tim redom) vezivanja prirodnog Fel d1 (označenog dalje i kao nFel d1) za prečišena anti-Fel d 1 monospecifična i bispecifična antitela, određiveni su biosenzorskom analizom upotrebom površinske plazmonske rezonance u realnom vremenu na Biacore 2000 instrumentu. Na CM5 čipu, upotrebom EDC-NHS hemije, senzorska površina Biacore sistema je derivatizovana sa monoklonskim mišjim anti-humanim Fc antitelom (GE, kat. br. BR-1008-39) da bi se “zarobila” anti-Fel d1 monospecifična i bispecifična antitela. Sve Biacore studije vezivanju su rađene na 25° C u HBSP puferu za protok (0,01 M HEPES pH 7,4; 0,15M NaCl, 3mM CaCl<2>, 3mM MgCl<2>, 0,05% v/v Surfaktant P20). Različite koncentracije nFel d1 (Indoor Biotech, kat. br. NA-FD1-2) (opsega od 600 nM do 2,34nM, razblaženja od 6 puta) pripremlјene u HBSP puferu za protok, pa su injecirane preko površine obložene anti-Fel d1 antitelom sa brzinom protoka od 50µL/min. Asocijacija nFeld1 sa zaroblјenim monoklonskim antitelima je praćena tokom 4 minuta, dok je disocijacija nFel d1 u HBSP pufer za protok praćena tokom 7 minuta. Kinetička konstanta stopa asocijacija (k<a>) i disocijacija (k<d>) su određene uklapanjem senzograma u relanom vremeu u model vezivanja tipa 1:1 sa ograničenjima prenosa mase, upotrebom kompjuterskog programa Scrubber 2.0 za očitavanja sa krive. Ravnotežna konstanta disocijacije vezivanja (K<D>) i disocijativni poluživot (t<1/2>) su izračunavani potom iz konstanti kinetičke brzine kao: K<D>(M) = k<d>/ k<a>i t<½>(min) = [In2/(60*k<d>)].
[0666] Parametri kinetike vezivanja nFel d1 za različita monospecifična i bespecifična anti-Fel d1 antitela na 25°C su prikazani u Tabeli 19. Tri monospecifična anti-Fel d1 antitela su bila vezana za nFel d1 sa K<D>vrednostima opsega od 155pM do 1,6nM. Dva bi specifična anti-Fel d1 antitela, H4H3467D i H4H8751 D, bila su vezana za nFel d1 sa K<D>vrednosti ma od 250pM i 347pM, tim redom.
[0668] Tabela 19: Kinetika vezivanja monospecifičnih i bispecifičnih anti-Fel d1 antitela, koja se vezuju za nFel d1 na 25°C.
[0671]
[0672]
[0675] Da bi se utvrdila in vivo efikasnost anti-Fel d1 bispecifičnih u poređenju sa njihovim monospecifična matična antitela, ova antitela su zajedno sa izotipskim kontrolnim antitelom ispitana u PCA in vivo modelu, upotrebom prirodnog Fel d1 i za senzibilizaciju i za izlaganje, što je prethodno opisano (pogledati Primer 6). Antitela su u ovoj studiji primenjena u koncentraciji od 1 mg/kg ukupnog antitela (0,5mg/kg svakog antitela je upotreblјeno kada su dva antitela bila primenjena istovremeno), a upotrebljeno je 8 miševa po eksperimentalnoj grupi. Podaci za svaku eksperimentalnu grupu su izraženi kao procenat smanjenja ekstravazacije boje ± SD i prikazani su u Tabeli 20.
[0676] Mono-specifična antitela H4H1232N i H4H2864P su prouzrokovala smanjenje ekstravazacije boje za 67 (± 26)% i 81 (± 26)%. Kombinacija monospecifičnih antitela, H4H1232N i H4H2864P, prouzrokovala je smanjenje ekstravazacije boje od 98 (± 3,5)%, dok je bispecifično H4H3467D, sastavlјeno od monospecifičnih antitela, H4H1232N i H4H2864P, izazvalo smanjenja ekstravazacije boje od 93 ( ± 11)%.
[0677] Monospecifična antitela H4H1232N i H4H2636P su prouzrokovala smanjenje ekstravazacije boje od 64 (± 33)% i 8,7 (± 79)%, tim redom, u drugom eksperimentu. Kombinacija monospecifičnih antitela, H4H1232N i H4H2636P, prouzrokovala je smanjenje ekstravazacije boje za 90 (± 15)%, dok je bispecifično H4H8751 D, sastavlјeno od monospecifičnih antitela, H4H1232N i H4H2636P, prouzrokovalo smanjenje ekstravazacije boje od 77 (± 20)%.
[0679] Tabela 20: Efekat anti-Fel d1 bispecifičnih antitela i njihovih matičnih monospecifičnih antitela u in vivo modelu pasivne kožne anafilakse (PCA)
[0682]
[0683]
[0686] 1

Claims (8)

1. Patentni zahtevi
1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži:
(1) terapeutski efektivnu količinu dva ili više izolovanih humanih monoklonskih antitela ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen koji se specifično vezuju za Fel d1 koji sadrže:
(i) prvo izolovano humano monoklonsko antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 18 i varijabilni regon lakog lanca (LCVR) sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 26, i
(ii) drugo izolovano humano monoklonsko antitelo koje sadrži HCVR sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 306 i LCVR sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 314; i
(2) jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa.
2. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1, pri čemu jedno ili više izolovanih humanih monoklonskih antitela ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen je izotipa koji nije IgA izotip.
3. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1, pri čemu jedno ili više izolovanih humanih monoklonskih antitela ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen je izotipa odabranog iz grupe koja se sastoji iz IgG1, IgG2 i IgG4.
4. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1, gde kompozicija dalje sadrži terapeutski efektivnu količinu izolovanog humanog monoklonskog antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen koje je odabrano iz grupe koja se sastoji iz antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen koji sadrži:
(a) HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci koji se sastoji iz SEQ ID NOs: 66/74;
(b) HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci koji se sastoji iz SEQ ID NOs: 130/138; i
(c) HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci koji se sastoji iz SEQ ID NOs: 162/170.
5. Efektivna količina farmaceutske kompozicije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, za upotrebu u postupku lečenja pacijenta koji ispoljava osetljivost na, ili alergijsku reakciju na, mačku, mačju perut, mačju dlaku ili njen ekstrakt, ili na Fel d1 protein, pri čemu navedeni postupak obuhvata davanje farmaceutske kompozicije pacijentu kome je to potrebno, pri čemu je osetljivost na, ili alergijska reakcija na, mačku, mačju perut, mačju dlaku ili njen ekstrakt, ili na Fel d1 protein je ili sprečena, ili smanjene ozbiljnosti i/ili trajanja, ili je učestalost i/ili trajanje, ili ozbiljnost osetljivosti na ili alergijske reakcije na, mačku, mačju perut, mačju dlaku ili njen ekstrakt, ili na Fel d1 protein, smanjena nakon primene kompozicije.
2
6. Efektivna količina farmaceutske kompozicije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, za upotrebu u postupku lečenja bar jednog simptoma ili komplikacije povezane sa osetljivnosti na, ili alergijskom reakcijom na mačku, mačju perut, mačju dlaku ili njen ekstrakt, ili na Fel d1 protein, pomenuti postupak obuhvata davanje farmaceutske kompozicije pacijentu kome je to potrebno, pri čemu najmanje jedan simptom ili komplikacija je povezana sa osetljivosti na, ili alergijskom reakcijom na, mačku, mačju perut, mačju dlaku ili njen ekstrakt, ili na Fel d1 protein je sprečena, ili poboljšana, ili je učestalost i/ili trajanje, ili ozbiljnost osetljivosti na ili alergijske reakcije na, mačku, mačju perut, mačju dlaku ili njen ekstrakt, ili na Fel d1 protein smanjena nakon primene kompozicije.
7. Efektivna količina farmaceutske kompozicije za upotrebu prema patentnom zahtevu 5 ili 6 pri čemu pomenuti postupak dalje obuhvata davanje efektivne količine drugog terapeutskog agensa korisnog za umanjenje alergijske reakcije na mačku, mačju perut, mačju dlaku ili njen ekstrakt, ili na Fel d1 protein, opciono pri čemu je drugi terapeutski agens odabran iz grupe koje se sastoji od kortikosteroida, a bronhijalnog dilatatora, antihistaminika, epinefrina, dekongestiva, drugog različitog antitela na Fel d1 i peptidne vaccine
8. Efektivna količina farmaceutske kompozicije za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, 6 ili 7, pri čemu tretman dovodi do smanjenja u alergijskom rinitisu, alergijskom konjuktivitisu, alergijskoj astmi, ili anafilaktičkom odgovoru nakon izlaganja pacijenta mački, mačjoj peruti, mačjoj dlaci ili njenom ekstraktu, ili na Fel d1 protein.
Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5
RS20251155A 2012-05-03 2013-05-02 Humana antitela na fel d1 i postupci njihove upotrebe RS67417B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261642083P 2012-05-03 2012-05-03
US201261718044P 2012-10-24 2012-10-24
US201361783312P 2013-03-14 2013-03-14
EP21194412.9A EP3978522B1 (en) 2012-05-03 2013-05-02 Human antibodies to fel d1 and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS67417B1 true RS67417B1 (sr) 2025-12-31

Family

ID=48326501

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211475A RS62636B1 (sr) 2012-05-03 2013-05-02 Humana antitela na fel d1 i postupci njihove upotrebe
RS20200539A RS60282B1 (sr) 2012-05-03 2013-05-02 Humana antitela na fel d1 i postupci njihove upotrebe
RS20251155A RS67417B1 (sr) 2012-05-03 2013-05-02 Humana antitela na fel d1 i postupci njihove upotrebe

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211475A RS62636B1 (sr) 2012-05-03 2013-05-02 Humana antitela na fel d1 i postupci njihove upotrebe
RS20200539A RS60282B1 (sr) 2012-05-03 2013-05-02 Humana antitela na fel d1 i postupci njihove upotrebe

Country Status (33)

Country Link
US (6) US9079948B2 (sr)
EP (4) EP2844672B1 (sr)
JP (2) JP6400569B2 (sr)
KR (1) KR102185516B1 (sr)
CN (2) CN110240651B (sr)
AR (1) AR090914A1 (sr)
AU (2) AU2013256251C1 (sr)
BR (2) BR122019023685B1 (sr)
CA (1) CA2871077C (sr)
CY (2) CY1124023T1 (sr)
DK (2) DK3978522T3 (sr)
ES (3) ES2898372T3 (sr)
FI (1) FI3978522T3 (sr)
HR (3) HRP20200652T1 (sr)
HU (2) HUE049440T2 (sr)
IL (1) IL235121B (sr)
IN (1) IN2014DN08767A (sr)
JO (1) JO3820B1 (sr)
LT (3) LT3660047T (sr)
MX (2) MX377634B (sr)
MY (3) MY195564A (sr)
NZ (2) NZ733480A (sr)
PL (3) PL3660047T3 (sr)
PT (3) PT3660047T (sr)
RS (3) RS62636B1 (sr)
RU (1) RU2658491C2 (sr)
SG (3) SG10201608378UA (sr)
SI (3) SI3660047T1 (sr)
SM (3) SMT202500396T1 (sr)
TW (2) TWI644921B (sr)
UY (1) UY34782A (sr)
WO (1) WO2013166236A1 (sr)
ZA (3) ZA201407302B (sr)

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090137416A1 (en) 2001-01-16 2009-05-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Isolating Cells Expressing Secreted Proteins
DK3028565T3 (da) 2009-07-08 2017-11-13 Kymab Ltd Dyremodeller og terapeutiske molekyler
CN103945689B (zh) 2011-09-19 2016-10-19 科马布有限公司 免疫球蛋白基因多样性的操纵及多抗体治疗剂
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
JO3820B1 (ar) 2012-05-03 2021-01-31 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية لـ fel d1وطرق لاستخدامها
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
EP3564671B1 (en) 2013-08-23 2021-09-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Diagnostic tests and methods for assessing safety, efficacy or outcome of allergen-specific immunotherapy (sit)
SG11201602236SA (en) 2013-10-01 2016-04-28 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
TWI701042B (zh) 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
ES2809455T3 (es) 2014-11-17 2021-03-04 Regeneron Pharma Métodos para tratamiento tumoral usando anticuerpo biespecífico CD3xCD20
EP3277725B1 (en) 2015-03-30 2020-11-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to fc gamma receptors
TWI797060B (zh) 2015-08-04 2023-04-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
CN108025059B (zh) * 2015-09-08 2022-09-09 苏黎世大学 抗猫过敏的组合物
AU2017252527A1 (en) 2016-04-18 2018-11-08 Celldex Therapeutics, Inc. Agonistic antibodies that bind human CD40 and uses thereof
WO2018039499A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Host cell protein modification
EP4717709A2 (en) * 2016-12-22 2026-04-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating an allergy with allergen-specific monoclonal antibodies
JP7112409B2 (ja) * 2017-01-24 2022-08-03 ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー 抗Ｆｅｌ Ｄ１抗体を含む組成物及びヒトのネコアレルギーの少なくとも１つの症状を減少させる方法
KR102659791B1 (ko) 2017-07-06 2024-04-23 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 당단백질을 만들기 위한 세포 배양 과정
CN111479618B (zh) 2017-12-22 2022-08-02 瑞泽恩制药公司 用于表征药物产品杂质的系统和方法
EA202091689A1 (ru) 2018-01-31 2020-10-22 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Система и способ определения характеристик примесей, представляющих собой варианты, отличающиеся по размеру и заряду, в продукте, представляющем собой лекарственное средство
TW202311746A (zh) 2018-02-02 2023-03-16 美商再生元醫藥公司 用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法
MX2020008988A (es) 2018-02-28 2020-09-28 Regeneron Pharma Sistemas y metodos para la identificacion de contaminantes virales.
US12259355B2 (en) 2018-03-19 2025-03-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Microchip capillary electrophoresis assays and reagents
MY202358A (en) 2018-03-19 2024-04-24 Regeneron Pharma Microchip capillary electrophoresis assays and reagents
US12253490B2 (en) 2018-03-19 2025-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Microchip capillary electrophoresis assays and reagents
TW202016125A (zh) 2018-05-10 2020-05-01 美商再生元醫藥公司 用於定量及調節蛋白質黏度之系統與方法
CN112166119B (zh) * 2018-05-18 2024-12-20 陈扎克伯格生物中心旧金山公司 从人中分离过敏原特异性抗体的方法及其用途
CN112218877B (zh) 2018-08-27 2025-07-25 瑞泽恩制药公司 拉曼光谱在下游纯化中的应用
BR112020026348A2 (pt) 2018-08-30 2021-03-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Método para avaliar a estequiometria e distribuição de tamanho de complexos de proteínas, para selecionar um medicamento de proteína principal e para caracterizar complexos de proteínas, e, composição farmacêutica
AU2020208396A1 (en) 2019-01-16 2021-05-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying free thiols in proteins
CN113785203A (zh) 2019-05-13 2021-12-10 里珍纳龙药品有限公司 改进的竞争性配体结合测定
PH12022550630A1 (en) 2019-09-24 2023-03-27 Regeneron Pharma Systems and methods for chromatography use and regeneration
US12297451B1 (en) 2019-10-25 2025-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cell culture medium
CN114760986A (zh) 2019-11-25 2022-07-15 里珍纳龙药品有限公司 使用非水性乳液的持续释放调配物
EP4354145B1 (en) 2020-01-21 2025-09-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Deglycosylation methods for electrophoresis of glycosylated proteins
WO2022046925A1 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating an allergy with allergen-specific monoclonal antibodies
BR112023003273A2 (pt) 2020-08-31 2023-05-02 Regeneron Pharma Estratégias de alimentação de asparagina para melhorar desempenho da cultura celular e mitigar variantes da sequência de asparagina
MX2023006077A (es) 2020-11-25 2023-06-06 Regeneron Pharma Formulaciones de liberacion sostenida mediante emulsificacion por membrana no acuosa.
KR20230121854A (ko) 2020-12-17 2023-08-21 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 단백질-캡슐화 마이크로겔의 제작
US12031151B2 (en) 2021-01-20 2024-07-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of improving protein titer in cell culture
WO2022187323A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for quantifying and modifying protein viscosity
US12467094B2 (en) 2021-03-11 2025-11-11 IgGenix, Inc. Methods and systems for predicting allergic response
CA3211302A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Ross Kenyon Methods and systems for developing mixing protocols
BR112023024984A2 (pt) 2021-06-01 2024-02-20 Regeneron Pharma Tampão de amostra de eletroforese aquosa, método para identificar contaminantes ou impurezas em uma amostra de droga proteica, e, kit
TW202326138A (zh) 2021-09-08 2023-07-01 美商再生元醫藥公司 用於定量抗體及其他含Ｆｃ蛋白之高通量及基於質譜之方法
EP4405390A1 (en) 2021-09-20 2024-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of controlling antibody heterogeneity
WO2023059803A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ph meter calibration and correction
EP4413364A2 (en) 2021-10-07 2024-08-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods of ph modeling and control
MX2024005090A (es) 2021-10-26 2024-07-19 Regeneron Pharma Sistemas y metodos para generar agua de laboratorio y distribuir agua de laboratorio a diferentes temperaturas.
CN114113278B (zh) * 2021-11-24 2024-08-02 中国计量科学研究院 一种基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法
EP4444348A4 (en) * 2021-12-08 2025-12-03 Iggenix Inc COMBINATIONS FOR ALLERGY THERAPY
JP2025508233A (ja) 2022-03-18 2025-03-21 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ポリペプチド変異体を分析するための方法およびシステム
CA3251374A1 (en) 2022-06-23 2023-12-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. METHODS FOR IDENTIFYING AND EVALUATING GENETIC SIGNATURES OF CAT ALLERGY IN A SUBJECT BY DETERMINING A STRATIFIED SCORE BASED ON GENE EXPRESSION.
CN120418653A (zh) 2022-12-16 2025-08-01 里珍纳龙药品有限公司 评估色谱柱完整性的方法和系统
WO2024158961A1 (en) 2023-01-25 2024-08-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mass spectrometry-based characterization of antibodies co-expressed in vivo
US20240245779A1 (en) 2023-01-25 2024-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modeling liquid protein composition stability
TW202445138A (zh) 2023-02-01 2024-11-16 美商再生元醫藥公司 用於生物巨分子分析之具質譜法的不對稱流場流分離
TW202446462A (zh) 2023-02-22 2024-12-01 美商再生元醫藥公司 系統適用性參數及管柱老化
WO2024182636A1 (en) 2023-03-01 2024-09-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-fel d1 antibody formulations
EP4688165A1 (en) 2023-03-31 2026-02-11 ALK-Abelló A/S Allergen binding antibodies suitable for treating tree pollen allergies
TW202508625A (zh) 2023-05-01 2025-03-01 美商再生元醫藥公司 使用苯酚或苯甲醇之多劑量抗體藥物產品
CN117004650B (zh) * 2023-06-25 2024-05-14 山东立菲生物产业有限公司 一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白、制备方法及应用
US20250086164A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for assessing chromatographic column integrity
WO2025064403A2 (en) 2023-09-18 2025-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for developing chromatography protocols
TW202532098A (zh) 2023-09-29 2025-08-16 美商再生元醫藥公司 使用控制成核之冷凍乾燥
CN117069865B (zh) * 2023-10-12 2024-03-01 中国农业科学院饲料研究所 一种基于T细胞抗原表位猫过敏原蛋白嵌合肽cFel d 1的原核表达及其卵黄抗体的制备
US20250129117A1 (en) 2023-10-18 2025-04-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rapid purification of monoclonal antibody from in-process upstream cell culture material
AR134213A1 (es) 2023-11-02 2025-12-10 Regeneron Pharma Métodos para reducir la actividad de la lipasa mediante estrés
WO2025166281A1 (en) 2024-02-01 2025-08-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Platform for charge-detection mass spectrometry analysis of aavs
WO2025175164A1 (en) 2024-02-16 2025-08-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of producing concentrated formulated drug substances comprising proteins, and concentrated formulated drug substance made by the methods
WO2025194043A1 (en) 2024-03-15 2025-09-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Polysorbate and polyoxyethylene sorbitan as excipients for stable protein formulations
CN117964767B (zh) * 2024-03-29 2024-08-06 北京恩泽康泰生物科技有限公司 抗rage抗体、细胞外囊泡及其制备方法和应用
WO2025259840A1 (en) 2024-06-13 2025-12-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for scaled chromatography
WO2026025028A1 (en) 2024-07-26 2026-01-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making ultra-high concentrated protein formulations using lyophilization
WO2026060350A1 (en) 2024-09-13 2026-03-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of improving photo stability and controlling formation of hmw species in biologic formulations, and biologic formulations produced by the methods

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5512283A (en) 1990-07-06 1996-04-30 Allergene, Inc. Methods for the selective suppression of an immune response to dust mite der Pi
WO1993013772A1 (en) 1992-01-21 1993-07-22 Immulogic Pharmaceutical Corporation Methods for using histamine derivatives as immunomodulators and in immunotherapeutics
AU5958494A (en) * 1992-12-21 1994-07-19 Tanox Biosystems, Inc. Allergen-specific iga monoclonal antibodies and related products for allergy treatment
GB0002386D0 (en) 2000-02-02 2000-03-22 Novartis Nutrition Ag Therapeutic composition
US6849259B2 (en) 2000-06-16 2005-02-01 Symphogen A/S Polyclonal antibody composition for treating allergy
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20040101920A1 (en) 2002-11-01 2004-05-27 Czeslaw Radziejewski Modification assisted profiling (MAP) methodology
WO2005103081A2 (en) 2004-04-20 2005-11-03 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
MX2007011160A (es) * 2005-03-18 2007-11-13 Cytos Biotechnology Ag Conjugados de alergenos de gato y usos de los mismos.
US7566456B2 (en) * 2005-06-23 2009-07-28 Haiming Chen Allergen vaccine proteins for the treatment and prevention of allergic diseases
GB0513878D0 (en) * 2005-07-06 2005-08-10 Mars Inc Cat allergen
WO2007065633A1 (en) 2005-12-05 2007-06-14 Imvision Ag Modulation of the immune response by administration of intralymphatic transduction allergen (itag) -molecules
WO2007113633A2 (en) 2006-04-03 2007-10-11 Pfizer Products Inc. Immunogenic compositions comprising cat allergen fel dl
DK2374818T3 (da) 2006-06-02 2013-01-21 Regeneron Pharma Højaffinitetsantistoffer mod human IL-6-receptor
AT503690A1 (de) * 2006-06-09 2007-12-15 Biomay Ag Hypoallergene moleküle
EP1921142A1 (en) * 2006-11-07 2008-05-14 Cytos Biotechnology AG Selection of human monoclonal antibodies by eukaryotic cell display
NO347649B1 (no) * 2006-12-14 2024-02-12 Regeneron Pharma Humant antistoff eller antistoff fragment som spesifikt binder human deltaliknende ligand 4 (hDII4), nukleinsyremolekyl som koder for slike og vektor og vert-vektorsystemer, samt fremgangsmåte for fremstilling, sammensetning og anvendelse.
CN101802015B (zh) * 2007-03-29 2015-05-06 根马布股份公司 双特异性抗体及其制造方法
EP2666787B1 (en) 2007-05-31 2022-02-09 Genmab A/S STABLE IgG4 ANTIBODIES
GB0710529D0 (en) 2007-06-01 2007-07-11 Circassia Ltd Vaccine
JP5873631B2 (ja) 2007-07-09 2016-03-01 ネステク ソシエテ アノニム 環境アレルゲンによって引き起こされるアレルギーを軽減する方法
EP2187964B1 (en) 2007-08-10 2014-10-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human nerve growth factor
JO3340B1 (ar) * 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
NZ609557A (en) 2010-10-06 2014-12-24 Regeneron Pharma Stabilized formulations containing anti-interleukin-4 receptor (il-4r) antibodies
JO3820B1 (ar) 2012-05-03 2021-01-31 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية لـ fel d1وطرق لاستخدامها
EP3564671B1 (en) 2013-08-23 2021-09-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Diagnostic tests and methods for assessing safety, efficacy or outcome of allergen-specific immunotherapy (sit)
EP4717709A2 (en) 2016-12-22 2026-04-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating an allergy with allergen-specific monoclonal antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
SI3660047T1 (sl) 2021-12-31
US20220025029A1 (en) 2022-01-27
AR090914A1 (es) 2014-12-17
CY1124819T1 (el) 2022-11-25
CN104411719A (zh) 2015-03-11
CA2871077C (en) 2021-08-17
EP3978522A3 (en) 2022-07-06
AU2013256251A1 (en) 2014-11-06
JP2015523962A (ja) 2015-08-20
FI3978522T3 (fi) 2025-11-13
HUE049440T2 (hu) 2020-09-28
EP3978522B1 (en) 2025-10-01
CN110240651B (zh) 2024-03-08
ES3049982T3 (en) 2025-12-19
JP6603269B2 (ja) 2019-11-06
PL3978522T3 (pl) 2026-01-05
SI3978522T1 (sl) 2025-11-28
EP3660047B1 (en) 2021-10-13
JO3820B1 (ar) 2021-01-31
ES2780392T3 (es) 2020-08-25
HRP20251429T1 (hr) 2026-01-02
AU2018203087B9 (en) 2020-03-26
ZA201407302B (en) 2021-08-25
SMT202200014T1 (it) 2022-03-21
RU2014148502A (ru) 2016-06-27
ES2898372T3 (es) 2022-03-07
CN110240651A (zh) 2019-09-17
SG11201406748QA (en) 2014-11-27
SI2844672T1 (sl) 2020-07-31
PT3978522T (pt) 2025-10-17
AU2018203087B2 (en) 2020-03-12
US20160376358A1 (en) 2016-12-29
KR20150005666A (ko) 2015-01-14
US20150299303A1 (en) 2015-10-22
PL2844672T3 (pl) 2020-08-10
US11174305B2 (en) 2021-11-16
AU2013256251B2 (en) 2018-04-12
JP2017153491A (ja) 2017-09-07
CA2871077A1 (en) 2013-11-07
US20170210790A1 (en) 2017-07-27
IL235121B (en) 2019-06-30
MX377634B (es) 2025-03-10
NZ733480A (en) 2019-03-29
LT3978522T (lt) 2025-11-25
IN2014DN08767A (sr) 2015-05-22
SG10201608378UA (en) 2016-11-29
SG10202102919XA (en) 2021-05-28
HUE057062T2 (hu) 2022-04-28
US20180305446A1 (en) 2018-10-25
US20130295097A1 (en) 2013-11-07
TWI644921B (zh) 2018-12-21
MY181422A (en) 2020-12-21
NZ701124A (en) 2017-07-28
ZA202005273B (en) 2023-11-29
ZA202202846B (en) 2023-11-29
RS62636B1 (sr) 2021-12-31
EP2844672A1 (en) 2015-03-11
AU2013256251C1 (en) 2018-08-23
IL235121A0 (en) 2014-12-31
AU2018203087A1 (en) 2018-05-24
BR112014026852B1 (pt) 2023-01-03
JP6400569B2 (ja) 2018-10-03
EP4653056A2 (en) 2025-11-26
SMT202500396T1 (it) 2025-11-10
US9475869B2 (en) 2016-10-25
PT3660047T (pt) 2021-11-30
MX2014013371A (es) 2015-02-05
MY164101A (en) 2017-11-30
PL3660047T3 (pl) 2022-02-14
BR112014026852A2 (pt) 2017-07-18
SMT202000241T1 (it) 2020-07-08
PT2844672T (pt) 2020-04-30
EP3660047A1 (en) 2020-06-03
US10047153B2 (en) 2018-08-14
DK2844672T3 (da) 2020-04-20
BR122019023685B1 (pt) 2023-01-17
US12252530B2 (en) 2025-03-18
LT3660047T (lt) 2021-11-10
MY195564A (en) 2023-02-02
DK3978522T3 (da) 2025-10-27
HK1202123A1 (en) 2015-09-18
EP3978522A2 (en) 2022-04-06
CN104411719B (zh) 2019-05-14
KR102185516B1 (ko) 2020-12-02
LT2844672T (lt) 2020-04-10
HRP20200652T1 (hr) 2020-07-10
EP2844672B1 (en) 2020-02-12
RU2658491C2 (ru) 2018-06-21
CY1124023T1 (el) 2022-03-24
WO2013166236A1 (en) 2013-11-07
HRP20211932T1 (hr) 2022-03-18
MX2020003864A (es) 2020-08-13
TW201803901A (zh) 2018-02-01
RS60282B1 (sr) 2020-06-30
UY34782A (es) 2013-11-29
US9079948B2 (en) 2015-07-14
TW201406779A (zh) 2014-02-16
US10047152B2 (en) 2018-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12252530B2 (en) Human antibodies to Fel d1 and methods of use thereof
US20230203141A1 (en) Methods of treating an allergy with allergen-specific monoclonal antibodies
HK40129065A (en) Human antibodies to fel d1 and methods of use thereof
HK40062763A (en) Human antibodies to fel d1 and methods of use thereof
HK40062763B (en) Human antibodies to fel d1 and methods of use thereof
HK40028441A (en) Human antibodies to fel d1 and methods of use thereof
HK40028441B (en) Human antibodies to fel d1 and methods of use thereof
HK1202123B (en) Human antibodies to fel d1 and methods of use thereof