RS67563B1

RS67563B1 - Humana antitela na glikoprotein virusa ebole

Info

Publication number: RS67563B1
Application number: RS20251307A
Authority: RS
Inventors: Christos Kyratsous; William Olson; Peter Mason; Neil Stahl
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2015-01-26
Filing date: 2016-01-25
Publication date: 2026-01-30
Also published as: NZ733620A; MY189452A; MY196224A; US10081670B2; WO2016123019A1; SG11201705681YA; JP6829199B2; MY208081A; US11530255B2; CL2017001920A1; US20160215040A1; MD3250591T2; AU2016211783A1; MX2017009716A; EA038993B1; US12152067B2; LT3250591T; US10501526B2; MX392533B; CN113354732A

Description

[0001] Opis

[0003] OBLAST PRONALASKA

[0005] Predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata tri monoklonska antitela koja se vezuju za glikoprotein virusa ebole, i postupke njihove upotrebe.

[0007] STANJE TEHNIKE

[0009] Virus ebole (EBOV) i srodni filovirusi izazivaju tešku virusnu hemoragičnu groznicu kod ljudi i primata koji nisu ljudi, sa stopom smrtnosti do oko 90% kod humanih epidemija. (Murin, C.D. et al., (2014), Proc Natl Acad Sci USA, 111(48):17182-17187). Imunski mehanizmi koji posreduju u zaštiti su pod istragom, ali do danas nijedan tretman nije odobren za humanu upotrebu.

[0011] Glikoprotein (GP) virusa ebole je jedini protein prisutan na površini virusa i na inficiranim ćelijama. Pretpostavlja se da je odgovoran za vezivanje i fuziju virusa sa ćelijama domaćina. GP postoji u nekoliko oblika. Ovi GP-i su kodirani sa dva otvorena okvira za čitanje. Neuređena iRNK za GP proizvodi nestrukturni izlučeni, rastvorljivi GP (sGP – rastvorljivi GP) koji se sintetiše rano u toku infekcije (Volchkova, et al. (1995), Virology 214:421-430; Volchkova, VA et al., (1998), Virology 250:408-414; Sanchez, etal. (1996), Proc NatI Acad Sci USA, 93:3602-3607; Sanchez, etal. (1999) J. Infect. Dis.179 (suppl.1, S164)). sGP obrazuje dimere (Volchkova, etal. (1995), Virology 214:421-430; Falzarano, D. et al., Chembiochem (2006), 7:1605-1611) i velike količine su detektovane u krvi pacijenta i eksperimentalno inficiranih životinja (Sanchez, et al. (1996), Proc Natl Acad Sci USA, 93:3602-3607; Dolnik, O. et al., (2004), EMBO J 23:2175-2184).

[0013] Kasnije tokom infekcije, generiše se izmenjena iRNK, koja stiče kapacitet kodiranja iz drugog otvorenog okvira za čitanje. Ova izmenjena iRNK kodira oblik GP koji sadrži transmembranski (TM) domen koji omogućava da se ovaj oblik GP veže za plazma membranu ćelije i ugradi u virione gde služi kao funkcionalni protein/fuzioni protein ćelije domaćina koji se vezuje za receptor. Tokom biosinteze ovog oblika GP, protein se proteolitički obrađuje u dva proizvoda koji su povezani disulfidnim vezama. Proizvod na amino kraju se naziva GP1 (140 kDa), a proizvod cepanja na karboksi kraju se naziva GP2 (26 kDa) (Sanchez, et al. (1998), J. Virol.72:6442-6447).

[0015] [0005] GP virusa ebole (EBOV GP) može biti meta zaštitnih antitela, ali je uloga antitela u otpornosti na bolesti bila kontroverzna. Zanemarljivi serumski titri neutrališućih antitela kod pacijenata u rekonvalescenciji, zajedno sa nedoslednim rezultatima u postizanju zaštite eksperimentalnim prenosom imunih seruma na životinje, doveli su do spekulacija o ulozi neutrališućih antitela u oporavku od infekcije (Peters, CJ i LeDuc, JW, (1999), J. Infect. Dis.179 Suppl 1; Mikhailov, VV, (1994), Vopr. Virusol.39:82; Xu, L. etal., (1998), Nature Med.4:37). Međutim, u novijoj epidemiji virusa ebole, nekoliko pacijenata koji su oboleli od bolesti i koji su lečeni koktelom monoklonskih antitela (ZMapp) specifičnih za virusni GP oporavilo se od bolesti. Osim toga drugi pacijenti koji su lečeni serumom iz ovih pacijenata i od drugih pacijenata koji su preživeli nakon što su se zarazili, takođe su imali pozitivne ishode.

[0017] Opisano je nekoliko antitela koja vezuju GP virusa ebole (videti na primer, US patente br.

[0018] 6630144, 6875433, 7335356 i 8513391. Videti takođe EP1539238, EP2350270 i EP8513391).

[0020] Iako je tehnološki napredak poboljšao sposobnost proizvodnje poboljšanih kompozicija vakcina protiv antigen(a) virusa ebole, i dalje postoji potreba da se obezbede dodatni izvori zaštite kako bi se suprotstavili novim sojevima virusa ebole. Trenutno se procenjuje nekoliko kandidatskih terapija protiv virusa ebole, uključujući vakcine nakon izlaganja (Feldman, H, et al. (2007), PLos Pathog 3(1):e2), inhibitore malih molekula Cote, M. et al. (2011), Nature, 477(7364):344-348; Johansen, LM, et al. (2013), Sci Transl Med 5(190):190ra179; Warren, TK, et al., (2014), Nature, 508(7496):402-405), terapeutike zasnovane na siRNK (Geisbert, TW, etal., (2006), J. Infect Dis.

[0021] 193(12):1650-1657; Geisbert, TW et al., (2010), Lancet 375(9729):1896-1905), i monoklonska antitela. (Saphire, EO, (2013), Immunotherapy 5(11):1221-1233; Wong,G. etal. (2014), TrendsMicrobiol. 22(8):456-463; Qiu,Xetal., (2014), Hum. Vaccin. Immunother. 10(4):964-967). Pasivna primena antitela kod nehumanih primata pokazala se efikasnom (Dye, JM., etal., (2012), Proc Natl Acad Sci USA 109(13):5034-5039). U skorije vreme, koktel od tri antitela (ZMapp) se trenutno proizvodi u biljkama duvana i razvija se za ljudsku upotrebu (Qiu, X. et al., (2014), Nature 514(7520):47-53).

[0023] Xiangguo Qiu et al., (2012), PLoS Neglected Tropical Diseases 6(3):e1575 otkrivaju da monoklonska antitela specifična za GP ebole štite miševe i zamorčiće od smrtonosne infekcije virusom ebole. Xiangguo Qiu et al., (2012), Sci. Trans. Med.4(138):138ra81 opisuje lečenje makaki cinomolgusa zaraženih virusom ebole monoklonskim antitelima.

[0025] Iako se ideja o sastavu vakcine koji sadrži antigen od interesa (npr. GP) za dobijanje neutrališućih antitela kod pacijenta generalno smatra dobrim pristupom, njegova upotreba kod pacijenata koji su već bili izloženi virusu možda neće biti povoljna, jer bi telu trebalo nekoliko nedelja da odgovori na kompoziciju vakcine. Do tog trenutka, pacijent je možda već podlegao virusnoj infekciji, u zavisnosti od nivoa nege i dostupne palijativne terapije. Kod ovih pacijenata, ili kod bilo kog pacijenta koji nije u stanju da razvije efikasan odgovor antitela, može biti korisnije obezbediti kompoziciju koja već sadrži zaštitna antitela koja mogu ciljati epitope zajedničke za određeni soj EPOV-a ili za različite sojeve.

[0027] Shodno tome, i dalje postoji potreba u ovoj oblasti za identifikacijom novih antitela, koja se mogu koristiti za sprečavanje ili lečenje infekcije virusom ebole.

[0029] KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

[0031] Predmetni pronalazak pruža farmaceutsku kompoziciju koja sadrži prvo izolovano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za virus ebole (EBOV), pri čemu prvo izolovano monoklonsko antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) SEQ ID NO: 18 i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) SEQ ID NO: 26;

[0032] dalje sadrži drugo izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje se specifično vezuje za EBOV, pri čemu drugo izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HCVR aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66 i LCVR aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 74; i dalje sadrži treće izolovano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za EBOV, pri čemu treće izolovano monoklonsko antitelo sadrži HCVR aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146 i LCVR aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 154; pri čemu je HCVR svakog od prvog i trećeg izolovanog monoklonskog antitela povezan sa konstantnim domenom humanog IgG1.

[0034] Pronalazak dalje obezbeđuje gore navedenu farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u postupku sprečavanja, lečenja ili ublažavanja najmanje jednog simptoma EBOV infekcije, ili smanjenja učestalosti ili ozbiljnosti najmanje jednog simptoma EBOV infekcije, pri čemu postupak obuhvata davanje navedenog farmaceutskog sastava subjektu kome je to potrebno, opciono gde:

[0035] (a) najmanje jedan simptom je izabran iz grupe koja se sastoji od groznice, glavobolje, umora, gubitka apetita, mijalgije, dijareje, povraćanja, bolova u stomaku, dehidracije i neobjašnjivog krvarenja; ili

[0037] (b) farmaceutska kompozicija se primenjuje profilaktički ili terapeutski subjektu kome je to potrebno, kao što je subjekt koji pati od infekcije ebolom (EBOV), ili subjekt koji je izložen, ili u riziku od izlaganja eboli, ili od sticanja infekcije ebole, pri čemu je subjekt izabran iz grupe koja se sastoji od imunokompromitovane osobe, zdravstvenog radnika, osobe za koju se sumnja da je bila izložena osobi koja nosi virus ebola, osobe koja dolazi u fizički kontakt ili blisku fizičku blizinu sa zaraženom osobom, zaposlenog u bolnici, farmaceutskog istraživača, osoblja za održavanje odgovornog za čišćenje bolničke ustanove ili ustanove u kojoj je lečen pacijent oboleo od ebole, pojedinaca koji su posetili ili planiraju da posete područje ili zemlju za koju se zna ili se sumnja da ima epidemiju virusa ebole i čestog letača.

[0039] U daljem izvođenju, pronalazak obezbeđuje gore navedenu farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen za upotrebu prema gore navedenom postupku, pri čemu se navedena farmaceutska kompozicija primenjuje u kombinaciji sa drugim terapijskim sredstvom, opciono gde

[0041] je drugo terapijsko sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od antivirusnog leka, antiinflamatornog leka (npr., kortikosteroida i nesteroidnih antiinflamatornih lekova), različitog antitela za EBOV, vakcine za EBOV, TKM ebole (male interferirajuće RNK koje ciljaju virusnu RNK polimerazu), brincidofovira (CMX-001), favipiravira (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (antisens fosforodiamidatni morfolino oligomeri koji ciljaju gen VP24 virusa ebole) i interferona; i/ili gde se farmaceutska kompozicija primenjuje subkutano, intravenozno, intradermalno, intramuskularno, intranazalno ili oralno.

[0043] Pronalazak dalje obezbeđuje gore navedenu farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u postupku povećanja preživljavanja ili verovatnoće preživljavanja subjekta koji pati od infekcije EBOV-om, ili subjekta izloženog EBOV-u, ili u riziku od izlaganja, ili za sticanje EBOV-a, pri čemu postupak obuhvata davanje navedene farmaceutske kompozicije subjektu kome je to potrebno, opciono gde:

[0044] (a) farmaceutska kompozicija se primenjuje profilaktički ili terapeutski subjektu kome je to potrebno; i/ili

[0045] (b) subjekt kome je to potrebno, a koji je u riziku od izlaganja, ili za sticanje EBOV infekcije, je izabran iz grupe koja se sastoji od imunokompromitovane osobe, zdravstvenog radnika, osobe za koju se sumnja da je bila izložena osobi koja nosi virus ebole, osobe koja dolazi u fizički kontakt ili blisku fizičku blizinu sa zaraženom osobom, zaposlenog u bolnici, farmaceutskog istraživača, osoblja za održavanje odgovornog za čišćenje bolničke ustanove ili ustanove u kojoj je lečen pacijent oboleo od ebole, pojedinaca koji su posetili ili planiraju da posete područje ili zemlju za koju se zna ili se sumnja da ima epidemiju virusa ebole i čestog letača; i/ili

[0046] (d) farmaceutska kompozicija se primenjuje u kombinaciji sa drugim terapijskim sredstvom, kao što je drugo terapijsko sredstvo koje je izabrano iz grupe koja se sastoji od antivirusnog leka, antiinflamatornog leka (npr., kortikosteroidi i nesteroidni antiinflamatorni lekovi), različitog antitela protiv ebole, vakcine protiv ebole, TKM ebole (male interferirajuće RNK koje ciljaju virusnu RNK polimerazu), brincidofovira (CMX-001), favipiravira (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (antisens fosforodiamidatni morfolino oligomeri koji ciljaju gen VP24 virusa ebole) i interferona; i/ili (e) farmaceutska kompozicija se primenjuje subkutano, intravenozno, intradermalno, intramuskularno, intranazalno ili oralno.

[0048] Pronalazak takođe dalje obezbeđuje gore navedenu farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u postupku neutralizacije infektivnog EBOV-a ili inhibiranja ulaska EBOV-a u ćeliju kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata davanje navedene farmaceutske kompozicije subjektu kome je to potrebno;

[0050] opciono gde:

[0052] (a) farmaceutska kompozicija se profilaktički ili terapijski daje subjektu kome je to potrebno; i/ili (b) subjekt kome je to potrebno je izabran iz grupe koja se sastoji od imunokompromitovane osobe, zdravstvenog radnika, osobe za koju se sumnja da je bila izložena osobi koja nosi virus ebole, osobe koja dolazi u fizički kontakt ili blisku fizičku blizinu sa zaraženom osobom, zaposlenog u bolnici, farmaceutskog istraživača, osoblja za održavanje odgovornog za čišćenje bolničke ustanove ili ustanove u kojoj je lečen pacijent oboleo od ebole, pojedinaca koji su posetili ili planiraju da posete područje ili zemlju za koju se zna ili se sumnja da ima epidemiju virusa ebole i čestog letača; i/ili

[0053] (c) farmaceutska kompozicija se primenjuje u kombinaciji sa drugim terapijskim sredstvom, kao što je drugo terapijsko sredstvo koje je izabrano iz grupe koja se sastoji od antivirusnog leka, antiinflamatornog leka (npr., kortikosteroidi i nesteroidni antiinflamatorni lekovi), različitog antitela protiv EBOV, vakcine protiv EBOV, TKM ebole (male interferirajuće RNK koje ciljaju virusnu RNK polimerazu), brincidofovira (CMX-001), favipiravira (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (antisens fosforodiamidatni morfolino oligomeri koji ciljaju gen VP24 virusa ebole) i interferona; i/ili (d) farmaceutska kompozicija primenjuje subkutano, intravenozno, intradermalno, intramuskularno, intranazalno ili oralno.

[0055] U daljem izvođenju, pronalazak pruža gore navedenu farmaceutsku kompoziciju, gde je HCVR drugog izolovanog monoklonskog antitela povezan sa konstantnim domenom humanog IgG1.

[0057] [0017] Predmetni prikaz opisuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigene, a vezuju glikoprotein (GP) virusa ebole (EBOV). Antitela su korisna za inhibiranje ili neutralizaciju aktivnosti virusa ebole. U nekim aspektima, antitela su korisna za blokiranje vezivanja virusa ebole za ćeliju domaćina i/ili za sprečavanje ulaska virusa ebole u ćelije domaćina. U nekim aspektima, antitela funkcionišu tako što inhibiraju prenos virusa sa ćelije na ćeliju ili ubijaju ćelije zaražene virusom ebole, smanjujući proizvodnju patogenog virusa. U određenim aspektima, antitela su korisna u sprečavanju, lečenju ili ublažavanju najmanje jednog simptoma infekcije virusom ebole kod subjekta. U određenim aspektima, antitela se mogu primenjivati profilaktički ili terapijski subjektu koji ima ili je u riziku od sticanja infekcije virusom ebole. U određenim aspektima, kompozicije koje sadrže najmanje jedno antitelo prema predmetnom prikazu mogu se primeniti subjektu za koga je vakcina kontraindikovana ili za koga je vakcina manje efikasna, na primer, starijem pacijentu, veoma mladom pacijentu, pacijentu koji može biti alergičan na bilo koju ili više komponenti vakcine ili imunokompromitovanom pacijentu koji možda ne reaguje na imunogene u vakcini. U određenim aspektima, kompozicije koje sadrže najmanje jedno antitelo prema ovom otkriću mogu se primeniti medicinskom osoblju, hospitalizovanim pacijentima ili stanovnicima staračkih domova ili drugim pacijentima sa visokim rizikom tokom epidemije virusa ebole. U određenim aspektima, kompozicije koje sadrže najmanje jedno antitelo prema predmetnom prikazu mogu se primeniti kao prva linija lečenja pacijentima koji su već bili izloženi virusu ebole.

[0059] Antitela prema predmetnom prikazu mogu biti pune dužine (na primer, IgG1 ili IgG4 antitelo) ili mogu sadržati samo deo koji vezuje antigen (na primer, Fab, F(ab')2 ili scFv fragment), i mogu biti modifikovana da bi uticala na funkcionalnost, npr., da bi se povećala perzistencija u domaćinu ili da bi se eliminisale rezidualne efektorske funkcije (Reddy et al., 2000, J. Immunol.164:1925-1933). U određenim aspektima, antitela mogu biti bispecifična.

[0061] U prvom aspektu, predmetni prikaz obezbeđuje izolovana rekombinantna monoklonska antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen, a koji se specifično vezuju za EBOV GP.

[0063] Stoga, predmetni prikaz se odnosi na izolovano rekombinantno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, a koji se specifično vezuje za virus ebole (EBOV) i/ili glikoprotein virusa ebole (EBOV-GP), pri čemu antitelo sadrži par aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca/varijabilnog regiona lakog lanca (HCVR/LCVR) izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18/26, 66/74 i 146/154.

[0065] Predmetni prikaz se takođe odnosi na kompoziciju koja sadrži jedno ili više anti-EBOV antitela ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen prema otkriću za upotrebu u postupku za inhibiranje prenosa EBOV sa ćelije na ćeliju, ubijanja EBOV ćelija ili smanjenja proizvodnje patogenog EBOV, pri čemu postupak obuhvata izlaganje navedene kompozicije ćeliji inficiranoj EBOV, pri čemu izlaganje rezultira poboljšanom zaštitom ćelija od virusne infekcije, smrću ćelija inficiranih EBOV ili smanjenom proizvodnjom EBOV iz ćelija.

[0067] Predmetni prikaz se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedno ili više izolovanih monoklonskih antitela ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen i specifično se vezuju za EBOV i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač, pri čemu jedno ili više izolovanih monoklonskih antitela ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen sadrže par aminokiselinske sekvence HCVR/LCVR izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 18/26, 66/74 i 146/154.

[0069] Predmetni prikaz se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži (a) prvo anti-EBOV antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen; (b) drugo anti-EBOV antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen; (c) treće anti-EBOV antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, prema prikazu, pri čemu se prvo antitelo vezuje za, ili interaguje sa, prvim epitopom na EBOV, a drugo i/ili treće antitelo se vezuje za, ili interaguje(ju) sa različitim epitopom na EBOV; i (d) farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač, opciono gde:

[0070] (i) epitopi koji se vezuju za, ili interaguju sa, prvim, drugim i/ili trećim anti-EBOV antitelima ili njihovim fragmentima koji vezuju antigen, su različiti i ne preklapaju se; ili

[0071] (ii) prvo anti-EBOV antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen vezuje se za, ili interaguje sa jednim epitopom na jednom soju EBOV, a drugo i/ili treće anti-EBOV antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen vezuje se za, ili interaguje sa drugim i/ili trećim epitopom na istom soju ili na drugom soju EBOV, poželjno gde su EBOV sojevi odabrani iz grupe koja se sastoji od sojeva Zair.2014, Zair.1995, Sudan, Bundibugyo i Cote d'Ivoire.

[0073] Predmetni prikaz se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži prvo izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se specifično vezuje za EBOV, gde prvo izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HCVR aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 i LCVR aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26; opciono dodatno sadrži drugo izolovano monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za EBOV, pri čemu drugo izolovano monoklonsko antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrži HCVR aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66 i LCVR aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 74.

[0075] Predmetni prikaz se dalje odnosi na izolovani polinukleotidni molekul koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira HCVR i LCVR antitela kako je navedeno u predmetnom prikazu; vektor koji sadrži polinukleotidnu sekvencu; ili ćeliju koja ekspresuje vektor.

[0077] Predmetni prikaz se takođe odnosi na antitelo ili fragment koji vezuje antigen iz prikaza ili farmaceutsku kompoziciju iz prikaza za upotrebu u postupku sprečavanja, lečenja ili ublažavanja najmanje jednog simptoma EBOV infekcije, ili smanjenja učestalosti ili ozbiljnosti najmanje jednog simptoma EBOV infekcije, pri čemu postupak obuhvata davanje navedenog antitela ili fragmenta koji vezuje antigen, ili navedene farmaceutske kompozicije subjektu kome je to potrebno, opciono gde:

[0078] (a) postupak obuhvata davanje koktela antitela koji sadrži: (i) smešu najmanje dva anti-EBOV antitela; i/ili (ii) smešu tri anti-EBOV antitela, gde tri anti-EBOV antitela sadrže HCVR/LCVR parove aminokiselinskih sekvenci kao što je navedeno u SEQ ID NOs: 18/26, 66/74 i 146/154;

[0079] (b) najmanje jedan simptom je izabran iz grupe koja se sastoji od groznice, glavobolje, umora, gubitka apetita, mijalgije, dijareje, povraćanja, bolova u stomaku, dehidracije i neobjašnjivog krvarenja; ili

[0080] (c) farmaceutska kompozicija se primenjuje profilaktički ili terapijski subjektu kome je to potrebno, kao što je subjekt koji pati od infekcije ebolom (EBOV), ili subjekt izložen, ili u riziku od izlaganja ebolom, ili od dobijanja infekcije ebole, pri čemu je subjekt izabran iz grupe koja se sastoji od imunokompromitovane osobe, zdravstvenog radnika, osobe za koju se sumnja da je bila izložena osobi koja nosi virus ebola, osobe koja dolazi u fizički kontakt ili blisku fizičku blizinu sa zaraženom osobom, zaposlenog u bolnici, farmaceutskog istraživača, osoblja za održavanje odgovornog za čišćenje bolničke ustanove ili

[0081] (d) ustanove u kojoj je pacijent oboleo od ebole lečen, pojedinaca koji su posetili ili planiraju da posete područje ili zemlju za koju se zna ili se sumnja da ima epidemiju virusa ebole i čestog letača.

[0083] [0027] Predmetni prikaz se dalje odnosi na antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog prikaza, ili farmaceutsku kompoziciju predmetnog prikaza za upotrebu u postupku povećanja preživljavanja, ili verovatnoće preživljavanja subjekta koji pati od infekcije sa EBOV, ili subjekta izloženog EBOV-u, ili u riziku od izlaganja, ili za sticanje EBOV-a, pri čemu postupak obuhvata davanje najmanje jednog navedenog antitela ili fragmenta koji vezuje antigen, ili navedene farmaceutske kompozicije subjektu kome je to potrebno, opciono gde:

[0085] (a) postupak obuhvata davanje koktela antitela koji sadrži smešu od najmanje dva anti-EBOV antitela; i/ili

[0086] (b) postupak obuhvata davanje koktela antitela koji sadrži smešu od tri anti-EBOV antitela, pri čemu tri anti-EBOV antitela sadrže HCVR/LCVR parove aminokiselinske sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NOs: 18/26, 66/74 i 146/154; i/ili

[0087] (c) antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, ili koktel antitela se primenjuje profilaktički ili terapijski subjektu kome je to potrebno; i/ili

[0088] (d) subjekt kome je to potrebno, a koji je u riziku od izloženosti ili sticanja EBOV infekcije, izabran je iz grupe koja se sastoji od imunokompromitovane osobe, zdravstvenog radnika, osobe za koju se sumnja da je bila izložena osobi koja nosi virus ebole, osobe koja dolazi u fizički kontakt ili blisku fizičku blizinu sa zaraženom osobom, zaposlenog u bolnici, farmaceutskog istraživača, osoblja za održavanje odgovornog za čišćenje bolničke ustanove ili ustanove u kojoj je lečen pacijent oboleo od ebole, pojedinaca koji su posetili ili planiraju da posete područje ili zemlju za koju se zna ili se sumnja da ima epidemiju virusa ebole i čestog letača; i/ili

[0089] (e) antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, ili koktel antitela se primenjuje u kombinaciji sa drugim terapijskim sredstvom, kao što je drugo terapijsko sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od antivirusnog leka, antiinflamatornog leka (npr., kortikosteroidi i nesteroidni antiinflamatorni lekovi), različitog antitela za EBOV, vakcine za EBOV, TKM ebole (male interferirajuće RNK koje ciljaju virusnu RNK polimerazu) brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (antisens fosforodiamidatni morfolino oligomeri koji ciljaju gen VP24 virusa ebole) i interferona; i/ili

[0090] (f) farmaceutska kompozicija se primenjuje subkutano, intravenozno, intradermalno, intramuskularno, intranazalno ili oralno.

[0092] Predmetni prikaz pruža izolovano rekombinantno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, a koji se specifično vezuje za virus ebole (EBOV) i/ili glikoprotein virusa ebole (EBOV-GP), pri čemu antitelo ima jednu ili više sledećih karakteristika:

[0094] (a) sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (CDR) (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) sadržana unutar bilo koje od sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 18, 66, 146, 2, 34, 50, 82, 98, 114, 130, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290 i 306; i tri CDR-a lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) sadržana u bilo kojoj od sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 26, 74, 154, 10, 42, 58, 90, 106, 122, 138, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282 i 298; (b) je potpuno humano monoklonsko antitelo;

[0095] (c) vezuje se za EBOV ili virusu sličnu česticu (VLP) koja ekspresuje EBOV-GP sa konstantom disocijacije (KD) manjom od 10<-7>M, mereno u testu površinske plazmonske rezonance;

[0096] (d) pokazuje najmanje trostruko povećanje disocijativnog poluživota (t<1>/<2>) pri pH 5 ili pH 6 u odnosu na pH 7,4;

[0097] (e) pokazuje neutralizaciju Zair virusa ebole sa IC50 u rasponu od oko 10⁻¹¹ M do oko 10⁻⁹ M; (f) pokazuje vezivanje za ćelije koje eksprimiraju EBOV-GP, pokretanjem ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela;

[0098] (g) unakrsno reaguje sa jednim ili više sojeva EBOV odabranih iz grupe koja se sastoji od Zaire.2014, Zaire.1995, Sudana, Bundibugyo and Cote d'lvoire;

[0099] (h) vezuje se za rastvorljivi GP (sGP);

[0100] (i) unakrsno se takmiči sa referentnim antitelom, pri čemu referentno antitelo sadrži aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) i varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) izabrane iz grupe koja se sastoji od bilo koje od aminokiselinskih sekvenci HCVR i LCVR iz Tabele 1.

[0102] Predmetni prikaz obezbeđuje izolovano rekombinantno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, a koji se specifično vezuje za EBOV i/ili glikoprotein virusa ebole (EBOV GP), pri čemu antitelo ima dve ili više sledećih karakteristika:

[0104] (a) je potpuno humano monoklonsko antitelo;

[0105] (b) vezuje se za EBOV ili virusu sličnu česticu (VLP) koja ekspresuje EBOV GP sa konstantom disocijacije (K<D>) manjom od 10<-7>M, mereno u testu površinske plazmonske rezonance;

[0106] (c) pokazuje najmanje 3 puta veće vreme disocijativnog poluživota (t<1>/<2>) pri pH 5 ili pH 6 u odnosu na pH 7,4;

[0107] (d) pokazuje neutralizaciju Zair virusa ebole sa IC50 u rasponu od oko 10⁻¹¹ M do oko 10⁻⁹ M;

[0108] (e) pokazuje vezivanje za ćelije koje eksprimiraju EBOV GP, pokretanjem ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela;

[0109] (f) unakrsno reaguje sa jednim ili više sojeva EBOV izabranih iz grupe koja se sastoji od Zair.2014, Zair.1995, Sudana, Bundibugyo and Cote d'lvoire;

[0110] (g) vezuje se za rastvorljivi GP (sGP);

[0111] (h) unakrsno se takmiči sa referentnim antitelom, pri čemu referentno antitelo sadrži aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) i varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) izabrane iz grupe koja se sastoji od bilo koje od HCVR i LCVR aminokiselinske sekvence iz Tabele 1.

[0113] Primeri antitela protiv GP virusa ebole otkrivena ovde navedena su u Tabelama 1 i 2 ovde. Tabela 1 navodi identifikatore aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog lanca (HCVR), varijabilnih regiona lakog lanca (LCVR), regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) i regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) primera antitela protiv GP virusa ebole. Tabela 2 prikazuje identifikatore sekvenci nukleinskih kiselina HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 primera antitela protiv GP virusa ebole.

[0115] Ovde su prikazana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz bilo koje od HCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1, ili njihova suštinski slična sekvenca koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence sa njima.

[0117] Ovde su prikazana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz bilo koje od LCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1, ili njihova suštinski slična sekvenca koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence sa njima.

[0118] Ovde su prikazana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže par aminokiselinske sekvence HCVR i LCVR (HCVR/LCVR) koji sadrži bilo koju od HCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 uparenih sa bilo kojom od LCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1. Predmetni prikaz obezbeđuje antitela, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrže par aminokiselinske sekvence HCVR/LCVR sadržan u bilo kom od primera anti-GP antitela protiv virusa ebole navedenih u Tabeli 1.

[0120] U jednom aspektu predmetnog prikaza, izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen sadrži par aminokiselinske sekvence HCVR/LCVR izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 18/26, 66/74, 146/154, 2/10, 34/42, 50/58, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298 i 306/282.

[0122] U jednom aspektu predmetnog prikaza, izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen sadrži:

[0124] (a) HCDR1 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 20, 68, 148, 4, 36, 52, 84, 100, 116, 132, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292 i 308; (b) HCDR2 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 22, 70, 150, 6, 38, 54, 86, 102, 118, 134, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294 i 310; (c) HCDR3 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 24, 72, 152, 8, 40, 56, 88, 104, 120, 136, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296 i 312; (d) LCDR1 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 28, 76, 156, 12, 44, 60, 92, 108, 124, 140, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284 i 300;

[0125] (e) LCDR2 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 30, 78, 158, 14, 46, 62, 94, 110, 126, 142, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286 i 302;

[0126] (f) LCDR3 domen koji ima aminokiselinska sekvenca izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 32, 80, 160, 16, 48, 64, 96, 112, 128, 144, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288 i 304.

[0128] U određenim aspektima, par aminokiselinske sekvence HCVR/LCVR je izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18/26 (H1H17139P), 66/74 (H1H17161P) i 146/154 (H1H17203P).

[0130] Ovde su prikazana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže CDR1 teškog lanca (HCDR1) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz bilo koje od HCDR1 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili suštinski sličnu sekvencu sa najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence.

[0132] Ovde su prikazana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže CDR2 teškog lanca (HCDR2) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz bilo koje od HCDR2 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili suštinski sličnu sekvencu sa najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence.

[0134] Ovde su prikazana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže CDR3 teškog lanca (HCDR3) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz bilo koje od HCDR3 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili suštinski sličnu sekvencu sa najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence.

[0135] Ovde su prikazana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže CDR1 lakog lanca (LCDR1) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz bilo koje od LCDR1 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili suštinski sličnu sekvencu sa najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence.

[0137] Ovde su prikazana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže CDR2 lakog lanca (LCDR2) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz bilo koje od LCDR2 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili suštinski sličnu sekvencu sa najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence.

[0139] Ovde su prikazana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže CDR3 lakog lanca (LCDR3) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz bilo koje od LCDR3 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili suštinski sličnu sekvencu sa najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence.

[0141] Ovde su prikazana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže par aminokiselinske sekvence HCDR3 i LCDR3 (HCDR3/LCDR3) koji sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci HCDR3 navedenih u Tabeli 1 uparenih sa bilo kojom od aminokiselinskih sekvenci LCDR3 navedenih u Tabeli 1. Predmetni prikaz obezbeđuje antitela, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrže par aminokiselinske sekvence HCDR3/LCDR3 sadržan u bilo kom od primera antitela protiv GP virusa ebole navedenih u Tabeli 1. U određenim aspektima, par aminokiselinske sekvence HCDR3/LCDR3 je izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 24/32 (npr., H1H17139P), 72/80 (npr., H1H17161P) i 152/160 (npr., H1H17203P).

[0143] Ovde su prikazana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji obuhvataju skup od šest CDR-ova (tj. HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) sadržanih u bilo kom od primera antitela protiv GP virusa ebole navedenih u Tabeli 1. U određenim aspektima, skup aminokiselinske sekvence HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 je izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 20-22-24-28-30-32 (npr., H1H17139P), 68-70-72-76-78-80 (npr., H1H17161P); i 148-150-152-156-158-160 (npr., H1H17203P).

[0145] Predmetni prikaz obezbeđuje antitela, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, koji obuhvataju skup od šest CDR-ova (tj., HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) sadržanih u paru aminokiselinske sekvence HCVR/LCVR, kako je definisano bilo kojim od primera antitela protiv GP virusa ebole navedenih u Tabeli 1. Predmetni prikaz obuhvata antitela, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, koji obuhvataju skup aminokiselinske sekvence HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 sadržan u paru aminokiselinske sekvence HCVR/LCVR izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18/26 (npr., H1H17139P), 66/74 (npr., H1H17161P); i 146/154 (npr., H1H17203P). Postupci i tehnike za identifikaciju CDR-ova unutar HCVR i LCVR aminokiselinskih sekvenci su dobro poznati u oblasti tehnike i mogu se koristiti za identifikaciju CDR-ova unutar navedenih HCVR i/ili LCVR aminokiselinskih sekvenci opisanih ovde. Primeri konvencija koje se mogu koristiti za identifikaciju granica CDR-ova uključuju, npr., Kabatovu definiciju, Čotijinu definiciju i AbM definiciju. Uopšteno govoreći, Kabatova definicija se zasniva na varijabilnosti sekvence, Čotijina definicija se zasniva na lokaciji strukturnih regiona petlji, a AbM definicija je kompromis između Kabatovog i Čotijinog pristupa. Videti, npr., Kabat, "Sequencesof Proteinsof Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikanietal., J. Mol.

[0146] Biol.273:927-948(1997); and Martin etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:9268-9272 (1989). Javne baze podataka su takođe dostupne za identifikaciju CDR sekvenci unutar antitela.

[0148] Predmetni prikaz obuhvata antitela protiv virusa ebole koja imaju modifikovani obrazac glikozilacije. U nekim aspektima, modifikacija radi uklanjanja neželjenih mesta glikozilacije može biti korisna, ili antitelo koje nema fukozni deo prisutan na oligosaharidnom lancu, na primer, da bi se povećala funkcija ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) (videti Shield et al. (2002) JBC 277:26733). U drugim primenama, modifikacija galaktozilacije može se izvršiti kako bi se modifikovala citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC).

[0150] Ovde su takođe prikazana antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigene koji se takmiče za specifično vezivanje za virus ebole sa antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigene koji sadrži CDR-ove HCVR-a i CDR-ove LCVR-a, gde HCVR i LCVR imaju aminokiselinske sekvence izabrane iz HCVR i LCVR sekvenci navedenih u Tabeli 1.

[0152] Ovde su takođe prikazana antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, a koji su u unakrsnoj kompeticiji za vezivanje za virus ebole sa referentnim antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, a koji obuhvata CDR-ove HCVR-a i CDR-ove LCVR-a, pri čemu HCVR i LCVR imaju aminokiselinske sekvence izabrane iz HCVR i LCVR sekvenci navedenih u Tabeli 1.

[0154] Predmetni prikaz takođe pruža izolovana antitela i njihove fragmente koji vezuju antigene, a koji blokiraju vezivanje virusa ebole za ćeliju domaćina, i/ili ulazak u nju.

[0156] U određenim aspektima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen predmetnog pronalaska su bispecifični što obuhvata prvu specifičnost vezivanja za prvi epitop u virusu Ebole i drugu specifičnost vezivanja za drugi epitop u virusu Ebole, pri čemu su prvi i drugi epitop različiti i ne preklapaju se. U određenim aspektima bispecifični može obuhvatati prvi krak koji se vezuje za epitop u virusnom glikoproteinu i drugi krak koji se vezuje za epitop u drugom virusnom antigenu.

[0158] U drugom aspektu, predmetni prikaz obezbeđuje molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju anti-Ebola virusna antitela ili njihove delove. Na primer, predmetni prikaz obezbeđuje molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koju od aminokiselinskih sekvenci HCVR koje su navedene u Tabeli 1; u određenim aspektima iz prikaza molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu koja je odabrana od bilo koje od HCVR sekvenci nukleinskih kiselina navedenih u Tabeli 2, ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence.

[0160] Ovde su takođe prikazani molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koju od LCVR aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1; u određenim aspektima prikaza molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu koja je odabrana od bilo koje od sekvenci nukleinskih kiselina LCVR koje su navedene u Tabeli 2, ili njihove suštinski slične sekvence koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence.

[0162] [0053] Ovde su takođe prikazani molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koju od aminokiselinskih sekvenci HCDR1 koje su navedene u Tabeli 1; u određenim aspektima prikaza molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu koja je odabrana od bilo koje od sekvenci nukleinskih kiselina HCDR1 koje su navedene u Tabeli 2, ili njihove suštinski slične sekvence koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence u odnosu na tu sekvencu.

[0164] Ovde su takođe prikazani molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koju od aminokiselinskih sekvenci HCDR2 koje su navedene u Tabeli 1; u određenim aspektima prikaza molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu koja je odabrana od bilo koje od sekvenci nukleinskih kiselina HCDR2 koje su navedene u Tabeli 2, ili njihove suštinski slične sekvence koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence u odnosu na tu sekvencu.

[0166] Ovde su takođe prikazani molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koju od aminokiselinskih sekvenci HCDR3 koje su navedene u Tabeli 1; u određenim aspektima prikaza molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu koja je odabrana od bilo koje od sekvenci nukleinskih kiselina HCDR3 koje su navedene u Tabeli 2, ili njihove suštinski slične sekvence koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence u odnosu na tu sekvencu.

[0168] Ovde su takođe prikazani molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koju od aminokiselinskih sekvenci LCDR1 koje su navedene u Tabeli 1; u određenim aspektima prikaza molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu koja je odabrana od bilo koje od sekvenci nukleinskih kiselina LCDR1 koje su navedene u Tabeli 2, ili njihove suštinski slične sekvence koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence u odnosu na tu sekvencu.

[0170] Ovde su takođe prikazani molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koju od aminokiselinskih sekvenci LCDR2 navedenih u Tabeli 1; u određenim aspektima prikaza molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu odabranu iz sekvenci nukleinskih kiselina LCDR2 koje su navedene u Tabeli 2, ili njihove suštinski slične sekvence koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence u odnosu na tu sekvencu.

[0172] Ovde su takođe prikazani molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koji od aminokiselinskih sekvenci LCDR3 koje su navedene u Tabeli 1; u određenim aspektima prikaza molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu odabranu iz bilo koje od nukleinskih sekvenci LCDR3 koje su navedene u Tabeli 2, ili njihove suštinski slične sekvence koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence u odnosu na tu sekvencu.

[0174] Ovde su takođe prikazani molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju HCVR, pri čemu HCVR sadrži set od tri CDR-a (tj., HCDR1-HCDR2-HCDR3), pri čemu je set aminokiselinske sekvence HCDR1-HCDR2-HCDR3 kao što je definisan bilo kojim od primera antitela protiv GP virusa Ebole navedenih u Tabeli 1.

[0176] Ovde su takođe prikazani molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju LCVR, pri čemu LCVR sadrži skup od tri CDR-a (tj., LCDR1-LCDR2-LCDR3), gde je skup aminokiselinske sekvence LCDR1-LCDR2-LCDR3 onakav kakav je definisan bilo kojim od primera antitela protiv GP virusa Ebole navedenih u Tabeli 1.

[0178] [0061] Ovde su takođe prikazani molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju i HCVR i LCVR, gde HCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od HCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1, i gde LCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od LCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1. U određenim aspektima prikaza, molekul nukleinske kiseline obuhvata polinukleotidnu sekvencu izabranu iz bilo koje od HCVR nukleinskih sekvenci navedenih u Tabeli 2, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence sa njom, i polinukleotidnu sekvencu izabranu iz bilo koje od LCVR nukleinskih sekvenci navedenih u Tabeli 2, ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence sa njom. U određenim aspektima prikaza, molekul nukleinske kiseline kodira HCVR i LCVR, pri čemu su HCVR i LCVR izvedeni iz istog antitela protiv GP virusa Ebole navedenog u Tabeli 1.

[0180] Takođe su ovde prikazani molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koju od aminokiselinskih sekvenci teškog lanca navedenih u Tabeli 1. Takođe su ovde prikazani molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koju od aminokiselinskih sekvenci lakog lanca navedenih u Tabeli 1.

[0182] U srodnom aspektu, predmetni prikaz obezbeđuje rekombinantne ekspresione vektore sposobne da eksprimuju polipeptid koji sadrži varijabilni region teškog ili lakog lanca antitela protiv GP virusa Ebole. Na primer, predmetni prikaz obuhvata rekombinantne ekspresione vektore koji sadrže bilo koji od gore pomenutih molekula nukleinske kiseline, tj., molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od HCVR, LCVR i/ili CDR sekvenci kao što je navedeno u Tabeli 1. Takođe u obim ovog otkrića su uključene ćelije domaćina u koje su takvi vektori uvedeni, kao i postupci proizvodnje antitela ili njihovih delova kultivisanjem ćelija domaćina pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju antitela ili fragmenata antitela, i regenerisanje tako proizvedenih antitela i fragmenata antitela.

[0184] U trećem aspektu, prikaz obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedno ili više izolovanih monoklonskih antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen koji se vezuju specifično za GP virusa Ebole i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač. Jedno ili više izolovanih antitela mogu da sadrže par aminokiselinskih sekvenci HCVR/LCVR izabran iz grupe koju čine HCVR i LCVR sekvence koje su navedene u Tabeli 1. U jednom aspektu iz prikaza, par HCVR/LCVR aminokiselinskih sekvenci je izabran iz grupe koju čine SEQID NOs: 18/26,66/74, 146/154, 2/10, 34/42, 50/58, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298 i 306/282. U jednom aspektu, par HCVR/LCVR aminokiselinskih sekvenci je izabran iz grupe koju čine SEQ ID NOs:18/26, 66/74 i 146/154.

[0186] U srodnom aspektu, prikaz sadrži kompoziciju, koja je kombinacija najmanje dva antitela iz prikaza i farmaceutski prihvatljivog nosača ili razblaživača.

[0188] Pronalazak obezbeđuje kompoziciju, koja je kombinacija/koktel najmanje tri antitela kao što je definisano u patentnim zahtevima i farmaceutski prihvatljivi nosač ili razblaživač.

[0190] [0067] U jednom aspektu prikaz obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži (a) prvo antitelo protiv virusa Ebole, koje sadrži par aminokiselinske sekvence HCVR/LCVR kao što je opisano u Tabeli 1, ili njegov fragment koji vezuje antigen; (b) drugo antitelo protiv virusa Ebole, koje sadrži par aminokiselinske sekvence HCVR/LCVR kao što je opisano u Tabeli 1, ili njegov fragment koji vezuje antigen; i (c) treće antitelo protiv virusa Ebole, koje sadrži par aminokiselinske sekvence HCVR/LCVR kao što je opisano u Tabeli 1, ili njegov fragment koji vezuje antigen, gde se prvo antitelo vezuje za, ili interaguje sa, prvim epitopom na GP virusa Ebole, a drugo i/ili treće antitelo se vezuje za, ili interaguje(ju) sa različitim epitopom na GP virusa Ebole, i (d) farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

[0192] U drugom srodnom aspektu, prikaz sadrži kompoziciju, koji je kombinacija antitela protiv GP virusa Ebole i drugog terapijskog agensa.

[0194] U jednom aspektu, drugi terapijski agens je bilo koji agens koji je povoljno kombinovan sa antitelom protiv GP virusa Ebole. Primeri agenasa koja se mogu povoljno kombinovati sa antitelom protiv virusa Ebole obuhvataju, bez ograničenja, druge agense koji se vezuju i/ili inhibiraju aktivnost virusa Ebole (uključujući druga antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen, itd.) i/ili agense koja se direktno ne vezuju za virus Ebole ali ipak inhibiraju virusnu aktivnost, uključujući infektivnost ćelija domaćina.

[0196] Ovde je prikazana farmaceutska kompozicija koja obuhvata: (a) prvo antitelo protiv virusa Ebole koje sadrži par aminokiselinske sekvence HCVR/LCVR kao što je opisano u Tabeli 1, ili njegov antigen-vezujući fragment; (b) drugo antitelo protiv virusa Ebole koje sadrži par aminokiselinske sekvence HCVR/LCVR kao što je opisano u Tabeli 1, ili njegov antigen-vezujući fragment, gde se prvo antitelo vezuje za prvi epitop na GP virusa Ebole, a drugo antitelo se vezuje za drugi epitop na GP virusa Ebole, gde su prvi i drugi epitop različiti i ne preklapaju se; i (c) farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

[0198] Takođe je ovde prikazana farmaceutska kompozicija koja obuhvata: (a) prvo antitelo protiv virusa Ebole ili njegov antigen-vezujući fragment; (b) drugo antitelo protiv virusa Ebole ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu prvo antitelo nije u unakrsnoj kompeticiji sa drugim antitelom za vezivanje za virusa Ebole; i (c) farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

[0200] Takođe je ovde prikazana farmaceutska kompozicija koja obuhvata: (a) prvo antitelo protiv virusa Ebole ili njegov antigen-vezujući fragment; (b) drugo antitelo protiv virusa Ebole ili njegov antigen-vezujući fragment, koje interaguje sa različitim antigenom virusa Ebole, pri čemu se prvo antitelo vezuje za epitop na GP virusa Ebole, a drugo antitelo se vezuje za epitop na drugom antigenu virusa Ebole; i (c) farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

[0202] Takođe je ovde prikazana farmaceutska kompozicija koja obuhvata: (a) prvo antitelo protiv virusa Ebole ili njegov fragment koji vezuje antigen; (b) drugo antitelo protiv virusa Ebole ili njegov fragment koji vezuje antigen; (c) treće antitelo protiv virusa Ebole ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu se prvo antitelo vezuje za prvi epitop na GP virusa Ebole, a drugo i/ili treće antitelo se vezuje za drugi epitop na GP virusa Ebole, pri čemu su prvi, drugi i treći epitop različiti i ne preklapaju se; i (d) farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

[0204] Takođe je ovde prikazana farmaceutska kompozicija koja obuhvata: (a) prvo antitelo protiv virusa Ebole ili njegov fragment koji vezuje antigen; (b) drugo antitelo protiv virusa Ebole ili njegov fragment koji vezuje antigen; (c) treće antitelo protiv virusa Ebole ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu prvo antitelo može, ali i ne mora, da se takmiči sa drugim i/ili trećim antitelom za vezivanje za virus Ebole; i (d) farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

[0206] [0075] Takođe je ovde prikazana farmaceutska kompozicija koja obuhvata: (a) prvo antitelo protiv virusa Ebole ili njegov antigen-vezujući fragment; (b) drugo i/ili treće antitelo protiv virusa Ebole ili njegov antigen-vezujući fragment, koje interaguje sa različitim antigenom virusa Ebole, pri čemu se prvo antitelo vezuje za epitop na virusu Ebole, a drugo i/ili treće antitelo se vezuje za epitop na drugom antigenu virusa Ebole; i (c) farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

[0208] U jednom aspektu prikaza, farmaceutska kompozicija obuhvata prvo antitelo protiv virusa Ebole ili njegov fragment koji vezuje antigen i koji se vezuje za, ili interaguje sa jednim epitopom na jednom soju virusa Ebole i drugo i/ili treće antitelo protiv virusa Ebole ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za, ili interaguje sa drugim i/ili trećim epitopom na istom soju ili na drugom soju virusa Ebole. Sojevi virusa Ebole koji interaguju sa antitelom iz prikaza mogu biti izabrani iz grupe koja se sastoji od sojeva Zaire.2014, Zaire.1995, Sudan, Bundibugyo i Cote d'Ivoire ili njihovih varijanti.

[0210] U srodnom aspektu, prikaz obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata prvo izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuje specifično za GP virusa Ebole, pri čemu prvo izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1 aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20; HCDR2 aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22; HCDR3 aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24; LCDR1 aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; LCDR2 aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30 LCDR3 aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili rastvarač. Farmaceutska kompozicija može dalje da obuhvati drugo izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se specifično vezuje za GP virusa Ebole, pri čemu drugo izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 68; HCDR2 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 70; HCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 72; LCDR1 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 76; LCDR2 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 78 i LCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 80. Farmaceutska kompozicija može dalje da obuhvati treće izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se specifično vezuje za GP virusa Ebole, pri čemu treće izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HCDR1 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 148; HCDR2 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 150; HCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 152; LCDR1 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 156; LCDR2 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 158 i LCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 160.

[0212] U određenim aspektima, svako antitelo može biti formulisano kao zasebna formulacija i ako se utvrdi da je potrebno više od jednog antitela da bi se postigla maksimalna terapijska efikasnost, svaka od formulacija antitela može se ko-formulisati (istovremeno ili sekvencijalno), po potrebi. Alternativno, koktel antitela može biti ko-formulisan.

[0214] U određenim aspektima, kada se dva ili više antitela kombinuju zajedno u jednoj farmaceutskoj kompoziciji, ona se možda neće vezati za iste ili preklapajuće epitope na proteinu virusa Ebole. Dodatne kombinovane terapije i ko-formulacije koje uključuju antitela protiv virusa Ebole iz ovog prikaza su ovde opisane na drugom mestu.

[0216] [0080] Prikaz takođe pruža terapijske postupke za lečenje bolesti ili poremećaja povezanog sa virusom ebole (kao što je virusna infekcija kod subjekta), ili najmanje jednog simptoma povezanog sa virusnom infekcijom, ili učestalosti ili težine najmanje jednog simptoma povezanog sa EBOV infekcijom, korišćenjem antitela protiv GP virusa Ebole ili dela antitela koji vezuje antigen iz prikaza, ili koktela od najmanje dva ili više antitela iz prikaza, pri čemu terapijski postupci obuhvataju davanje terapeutski efektivne količine od najmanje dva ili više antitela ili fragmenata koji vezuju antigen iz prikaza subjektu kome je to potrebno. Postupci mogu obuhvatati davanje kombinacije (koktela) od najmanje tri antitela iz prikaza. Koktel antitela može da sadrži tri anti-EBOV antitela koja imaju parove aminokiselinskih sekvenci kao što je navedeno u SEQ ID NOs: 18/26, 66/74 i 146/154. Poremećaj koji se tretira je bilo koja bolest ili stanje koje je poboljšano, ublaženo, inhibirano ili sprečeno inhibicijom aktivnosti virusa Ebole. Prikaz takođe pruža postupke za sprečavanje, lečenje ili ublažavanje najmanje jednog simptoma infekcije virusom Ebole, pri čemu postupak obuhvata davanje terapijski efektivne količine najmanje jednog ili više anti-Ebola GP antitela ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen ovde prikazanih subjektu kome je to potrebno.

[0218] U srodnom aspektu, prikaz obezbeđuje postupak neutralizacije infektivnog EBOV-a, postupak obuhvata izlaganje ćelije inficirane sa EBOV-om kompoziciji koja sadrži jedno ili više anti-EBOV antitela ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen, pri čemu izlaganje rezultira poboljšanom zaštitom ćelije od virusne infekcije ili od ćelijske smrti. Izlaganje može biti in vitro ili in vivo. Postupci mogu obuhvatati davanje jednog ili više antitela iz prikaza. Postupci mogu obuhvatati davanje kombinacije (koktela) od najmanje tri antitela iz prikaza. Koktel antitela može obuhvatiti tri anti-EBOV antitela koja imaju parove aminokiselinskih sekvenci kao što je navedeno u SEQ ID NOs: 18/26, 66/74 i 146/154.

[0220] Ovde su prikazani postupci za ublažavanje ili smanjenje ozbiljnosti, trajanja ili učestalosti pojave najmanje jednog simptoma infekcije virusom Ebole kod subjekta primenom jednog ili više antitela protiv GP virusa Ebole iz prikaza, pri čemu je najmanje jedan simptom izabran iz grupe koja se sastoji od groznice, glavobolje, umora, gubitka apetita, mijalgije, dijareje, povraćanja, abdominalnog bola, dehidracije i neobjašnjivog krvarenja.

[0222] Ovde su prikazani postupci za smanjenje virusnog opterećenja kod subjekta, postupci obuhvataju davanje subjektu efektivne količine jednog ili više antitela ili njihovih fragmenata iz predmetnog prikaza koji vezuju GP virusa Ebole i blokiraju vezivanje i/ili ulazak virusa Ebole u ćeliju domaćina.

[0224] Ovde je prikazan postupak povećanja preživljavanja ili verovatnoće preživljavanja subjekta koji pati od infekcije sa EBOV, ili subjekta izloženog EBOV-u, ili u riziku od izlaganja, ili od sticanja EBOV-a, pri čemu postupak obuhvata davanje najmanje jednog antitela ili fragmenta koji vezuje antigen ovde prikazanog, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži najmanje jedno antitelo ovde prikazano subjektu kome je to potrebno.

[0226] Ovde je otkriven postupak povećanja preživljavanja ili verovatnoće preživljavanja subjekta koji pati od infekcije sa EBOV, ili subjekta izloženog EBOV-u, ili u riziku od izlaganja, ili za sticanje EBOV-a, pri čemu postupak obuhvata davanje koktela antitela koji sadrži mešavinu od najmanje dva ovde prikazana antitela protv EBOV. Postupak može da obuhvati davanje koktela antitela koji sadrži mešavinu od najmanje tri ovde prikazana anti-EBOV antitela. Koktel antitela koji se primenjuje može da sadrži mešavinu od najmanje tri ovde prikazana antitela protiv EBOV, pri čemu najmanje tri antitela sadrže HCVR/LCVR parove aminokiselinskih sekvenci kao što je navedeno u SEQID NO: 18/26, 66/74 i 146/154.

[0228] [0086] U jednom aspektu prikaza, subjekt kome je to potrebno je subjekt koji je u riziku od izlaganja ili sticanja infekcije virusom ebole, pri čemu je subjekt izabran iz grupe koja se sastoji od imunokompromitovane osobe, zdravstvenog radnika, osobe za koju se sumnja da je bila izložena osobi koja nosi virus ebole, osobe koja dolazi u fizički kontakt ili blisku fizičku blizinu sa zaraženom osobom, zaposlenog u bolnici, farmaceutskog istraživača, osoblja za održavanje odgovornog za čišćenje bolničke ustanove ili ustanove u kojoj je lečen pacijent oboleo od ebole, osoba koji su posetili ili planiraju da posete područje ili zemlju za koju se zna ili se sumnja da ima epidemiju virusa Ebole i koje često lete.

[0230] U jednom aspektu prikaza, subjekt kome je to potrebno može se primeniti najmanje jedno ovde prikazano anti-EBOV antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen opisan ovde u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom. Drugi terapijski agens može biti izabran iz grupe koja se sastoji od antivirusnog leka, antiinflamatornog leka (kao što su kortikosteroidi i nesteroidni antiinflamatorni lekovi), različitog antitela na EBOV, vakcine za EBOV, TKM ebole (male interferirajuće RNK koje ciljaju virusnu RNK polimerazu) brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (antisens fosforodiamidatni morfolino oligomeri koji ciljaju gen VP24 virusa ebole) i interferoni.

[0232] Farmaceutska kompozicija može se primenjivati subkutano, intravenozno, intradermalno, intramuskularno, intranazalno, ili oralno.

[0234] Pojačana zaštita može se primetiti kod sisara izloženog ili inficiranog EBOV-om kada se sisar tretira farmaceutskom kompozicijom koja sadrži koktel antitela, koji sadrži najmanje tri ovde opisana antitela.

[0236] Poboljšana zaštita koja se primećuje može se meriti smanjenjem ozbiljnosti ili učestalosti najmanje jednog simptoma povezanog sa EBOV infekcijom, smanjenjem virusnog opterećenja ili povećanjem preživljavanja sisara zaraženog EBOV-om. Najmanje jedan simptom može biti izabran iz grupe koja se sastoji od groznice, glavobolje, umora, gubitka apetita, mijalgije, dijareje, povraćanja, bolova u stomaku, dehidracije i neobjašnjivog krvarenja.

[0238] Pojačana zaštita može se primetiti kada se antitelo koristi samostalno ili kada se koristi u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapijskih agenasa ili anti-EBOV modaliteta lečenja.

[0240] Jedno ili više dodatnih terapijskih agenasa mogu biti izabrani iz grupe koja se sastoji iz antivirusnog leka, anti-inflamatornog leka (kao što su kortikosteroidi, i nesteroidni anti-inflamatorni lekovi), različitih antitela na virus Ebola, vakcina za virus Ebola, TKM Ebola (male interferirajuće RNK koje ciljaju virusnu RNK polimerazu) brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (antisens fosforodiamidat morfolino oligomeri koji ciljaju gen VP24 virusa Ebole) i interferoni.

[0242] Jedan ili više dodatnih terapijskih agenasa može sadržati jedno ili više anti-EBOV antitela.

[0244] Jedno ili više anti-EBOV antitela sadrže aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) i varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) izabranu iz grupe koja se sastoji iz bilo koje od aminokiselinskih sekvenci HCVR i LCVR u Tabeli 1.

[0246] Jedno ili više anti-EBOV antitela mogu sadržati aminokiselinski par sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) i varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 2/10,18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298 i 306/282.

[0248] Jedno ili više anti-EBOV antitela sadrže aminokiselinski par sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) i varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 18/26, 66/74 i 146/154.

[0249] Jedno ili više antitela ili njihovih fragmenata koji vezuju antigene mogu se primenjivati profilaktički ili terapijski kod subjekta koji ima, ili je u riziku da ima, ili je sklon razvoju infekcije virusom Ebole. Subjekti u riziku uključuju, ali nisu ograničeni na, imunokompromitovanu osobu, na primer, osobu koja je imunokompromitovana zbog autoimune bolesti, osobe sa ortopedskim lezijama koje primaju imunosupresivnu terapiju (na primer, nakon transplantacije organa), osobe sa ortopedskim lezijama koje pate od sindroma humane imunodeficijencije (HIV) ili sindroma stečene imunodeficijencije (SIDA), određenih oblika anemije koji iscrpljuju ili uništavaju bela krvna zrnca, osobe koje primaju zračenje ili hemoterapiju, osobe sa ortopedskim lezijama koje pate od inflamatornog poremećaja. Drugi subjekti u riziku od sticanja infekcije virusom ebole uključuju zdravstvene radnike ili bilo koju osobu koja dođe u fizički kontakt ili blisku fizičku blizinu sa zaraženom osobom, ili je izložena telesnim tečnostima ili tkivima zaraženih osoba, takođe ima povećan rizik od razvoja infekcije virusom Ebole. Osim toga, subjekt je u riziku od zaraze infekcijom virusom Ebole zbog blizine mesta izbijanja bolesti, npr. subjekt boravi u gusto naseljenom gradu ili u neposrednoj blizini subjekata sa potvrđenom ili sumnjivom infekcijom virusom Ebole, ili izbor zaposlenja, npr. osoblje za održavanje odgovorno za čišćenje bolničke ustanove ili ustanove u kojoj je lečen pacijent oboleo od Ebole, zaposleni u bolnici, farmaceutski istraživač, osoba koja je posetila ili planira da poseti područje ili zemlju za koju se zna ili se sumnja da ima epidemiju virusa Ebole, ili osoba koja često leti.

[0251] Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji je ovde prikazan može se primenjivati u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom subjektu kome je potrebno. Drugi terapijski agens može biti izabran iz grupe koja se sastoji iz anti-inflamatornog leka (kao što su kortikosteroidi, i nesteroidni anti-inflamatorni lekovi), antiinfektivni lekovi, antivirusni lekvi, različito antitelo na virus Ebola, vakcina za virus Ebola, ZMapp terapija, TKM Ebola (male interferirajuće RNK koje ciljaju virusnu RNK polimerazu) brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (antisens fosforodiamidat morfolinooligomeri koji ciljaju gen VP24 virusa Ebole), interferoni, dijetetski suplement kao što su antioksidansi i bilo koji drugi lek ili terapija poznata u oblasti tehnike korisna za ublažavanje najmanje jednog simptoma infekcije virusom Ebole ili za smanjenje virusnog opterećenja kod pacijenta. Drugo terapijsko sredstvo može biti sredstvo koje pomaže u suzbijanju ili smanjenju bilo kog mogućeg neželjenog efek(a)ta povezanog sa antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen iz predmetnog prikaza, ako se takvi neželjeni efekti pojave. Antitelo ili njegov fragment može se primenjivati subkutano, intravenozno, intradermalno, intraperitonealno, oralno, intranazalno, intramuskularno ili intrakranijalno. Antitelo se može primenjivati kao jedna intravenska infuzija za maksimalnu koncentraciju antitela u serumu subjekta. Antitelo ili njegov fragment može se primenjivati u dozi od oko 0,1 mg/kg telesne težine do oko 100 mg/kg telesne težine subjekta. Antitelo predmetnog prikaza može se primenjivati u jednoj ili više doza koje obuhvataju između 50 mg i 600 mg.

[0253] Predmetni prikaz takođe uključuje antitela protiv virusa Ebole ili njihove fragmente koji vezuju antigen prikaza za upotrebu u lečenju subjekta koji ima, ili se sumnja da ima ili je bio izložen virusu Ebola, ili za upotrebu u proizvodnji leka za lečenje bolesti ili poremećaja koji bi imali koristi od blokade vezivanja i/ili aktivnosti virusa Ebole.

[0255] Druga izvođenja će postati očigledna iz pregleda sledećeg detaljnog opisa. Bilo koje reference u opisu na postupke lečenja odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku terapijskog lečenja humanog (ili životinjskog) tela.

[0256] KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0258]

[0260] Slika 1: H1H17161P potentno neutralizuje živ EBOV.

[0262] Slika 2: Prikazuje interakciju tri Anti-EBOV Antitela sa ebola GP ili ebola rastvorljivim GP (sGP).

[0264] DETALJAN OPIS

[0266] Pre nego što se opišu predmetni postupci, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na opisane određene postupke, i eksperimentalne uslove, jer se takvi postupci i uslovi mogu razlikovati. Takođe treba razumeti da je terminologija koja se ovde koristi samo u svrhu opisivanja određenih izvođenja i nije namenjena da bude ograničavajuća, jer će obim predmetnog pronalaska biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima.

[0268] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što ga obično razume stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Iako se bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde mogu koristiti u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska, sada su opisani preferirani postupci i materijali.

[0270] Definicije

[0272] "Ebola virus" ili "EBOV" je roda iz porodice Filoviridae, za koji je poznato da izaziva tešku i brzo napredujuću hemoragičnu groznicu. Postoji mnogo različitih vrsta i sojeva virusa Ebole na osnovu nukleotidne sekvence i mesta izbijanja, na primer, Zair, šuma Tai (ranije poznata kao Cote d'lvoire ili Obala Slonovače), Sudan, Reston i Bundibuđo. Najsmrtonosniji oblici virusa su sojevi iz Zaira i Sudana. Soj Reston je jedini soj za koji se zna da inficira samo primate koji nisu ljudi. Termin "virus Ebole" takođe uključuje varijante virusa Ebole izolovane iz različitih izolata virusa Ebole.

[0274] Aminokiselinska sekvenca glikoproteina virusa ebole pune dužine, ovde označena kao "EBOV GP" ili "GP virusa ebole", ilustrovana je aminokiselinskom sekvencom koja se nalazi u pristupnim brojevima GenBankas AHX24649.1 (videti takođe SEQ ID NO: 314) i AHX24649.2 (videti takođe SEQ ID NO: 315). Termin takođe obuhvata GP virusa ebole ili njegov fragment povezan sa, na primer, histidinskom oznakom (npr. videti pristupni broj AHX24649.1 sa dekahistidinskom oznakom (SEQ ID NO: 318)), mišjim ili humanim Fc ili signalnom sekvencom. Aminokiselinska sekvenca "rastvorljivog GP" ili "sGP" prikazana je u pristupnom broju AHX24650 i kao SEQ ID NO 316 (sa signalnom sekvencom) i takođe SEQ ID NO: 317 (bez signalne sekvence, ali sa myc-myc-heksahistidinskom oznakom). Aminokiselinska sekvenca "GP1" počinje na aminoterminalnom kraju GP pune dužine na ostatku 1 i završava se na ostatku 501 SEQ ID NO: 315. Aminokiselinska sekvenca "GP2" obuhvata ostatke od 502 do 676 GP pune dužine prikazane kao SEQ ID NO: 315.

[0276] Termin "infekcija virusom ebole" ili "EBOV infekcija", kako se ovde koristi, odnosi se na tešku hemoragičnu groznicu koja nastaje usled izlaganja virusu, ili zaraženoj životinji, ili zaraženom humanom pacijentu, ili kontakta sa telesnim tečnostima ili tkivima životinje ili humanog pacijenta koji ima infekciju virusom ebole. "Simptomi povezani sa infekcijom virusom ebole" uključuju groznicu, glavobolju, umor, gubitak apetita, mijalgiju, dijareju, povraćanje, bol u stomaku, dehidraciju i neobjašnjivo krvarenje.

[0277] Termin "antitelo", kako se ovde koristi, odnosi se na molekule imunoglobulina sastavljene od četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama (tj., "puni molekuli antitela"), kao i na njihove multimere (npr. IgM) ili njihove fragmente koji vezuju antigen. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca ("HCVR" ili "V<H>") i konstantnog regiona teškog lanca (sastavljenog od domena C<H>1, C<H>2 i C<H>3). Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca ("LCVR ili "V<L>") i konstantnog regiona lakog lanca (C<L>). V<H>i V<L>regioni mogu se dalje podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazvane regioni koji određuju komplementarnost (CDR), isprepletene sa regionima koji su konzervativniji, nazvanim okvirni regioni (FR). Svaki V<H>i VL se sastoji od tri CDR i četiri FR, raspoređenih od amino-kraja do karboksi-kraja sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. U određenim aspektima predmetnog prikaza, FR antitela (ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen) mogu biti identični sekvencama humane germinativne linije ili mogu biti prirodno ili veštački modifikovani. Konsenzusna sekvenca aminokiselina može se definisati na osnovu uporedne analize dva ili više CDR.

[0279] Takođe je moguća supstitucija jednog ili više CDR ostataka ili izostavljanje jednog ili više CDR. Antitela su opisana u naučnoj literaturi u kojoj jedno ili dva CDR-a mogu se izostaviti za vezivanje. Padlan i dr. (1995 FASEB J. 9:133-139) analizirali su kontaktne regione između antitela i njihovih antigena, na osnovu objavljenih kristalnih struktura, i zaključili da samo oko jedne petine do jedne trećine CDR ostataka zapravo dolazi u kontakt sa antigenom. Padlan je takođe pronašao mnoga antitela u kojima jedan ili dva CDR-a nisu imala aminokiseline u kontaktu sa antigenom (videti takođe, Vajdos i dr.2002 J Mol Biol 320:415-428).

[0281] CDR ostaci koji ne kontaktiraju antigen mogu se identifikovati na osnovu prethodnih studija (na primer, ostaci H60-H65 u CDRH2 često nisu potrebni), iz regiona KabatCDR-a koji se nalaze izvan ChothiaCDR-a, molekularnim modeliranjem i/ili empirijski. Ako se CDR ili njegov(i) ostatak(ci) izostave, obično se zamenjuju aminokiselinom koja zauzima odgovarajuću poziciju u drugoj sekvenci humanog antitela ili konsenzusom takvih sekvenci. Pozicije za supstituciju unutar CDR-ova i aminokiselina za zamenu se takođe može empirijski odabrati. Empirijske supstitucije mogu biti konzervativne ili nekonzervativne supstitucije.

[0283] [0110] Potpuno humana monoklonska antitela protiv virusa ebole otkrivena ovde mogu da sadrže jednu ili više supstitucija, insercija i/ili delecija aminokiselina u okviru i/ili CDR regionima varijabilnih domena teškog i lakog lanca u poređenju sa odgovarajućim sekvencama germinativne linije. Takve mutacije se mogu lako utvrditi poređenjem sekvenci aminokiselina otkrivenih ovde sa sekvencama germinativne linije dostupnim, na primer, iz javnih baza podataka sekvenci antitela. Ovo otkriće uključuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji su izvedeni iz bilo koje od sekvenci aminokiselina otkrivenih ovde, gde je jedna ili više aminokiselina unutar jedne ili više okvira i/ili CDR regiona mutirana u odgovarajući(e) ostatak(ke) sekvence germinativne linije iz koje je antitelo izvedeno, ili u odgovarajući(e) ostatak(ke) druge sekvence humane germinativne linije, ili u konzervativnu supstituciju aminokiselina odgovarajućeg(ih) ostatka(aka) germinativne linije (takve promene sekvence se ovde zajednički nazivaju "germinativne mutacije"). Specijalista u ovoj oblasti, počevši od sekvenci varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje su ovde opisane, može lako da proizvede brojna antitela i fragmente koji vezuju antigene, a koji sadrže jednu ili više pojedinačnih mutacija germinativne linije ili njihovih kombinacija. U određenim aspektima, svi ostaci okvira i/ili CDR unutar V<H>i/ili V<L>domena su mutirani nazad na ostatke koji se nalaze u originalnoj sekvenci germinativne linije iz koje je antitelo izvedeno. U drugim aspektima, samo određeni ostaci su mutirani nazad na originalnu sekvencu germinativne linije, npr. samo mutirani ostaci koji se nalaze u prvih 8 aminokiselina FR1 ili u poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili samo mutirani ostaci koji se nalaze u CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim aspektima, jedan ili više ostataka okvira i/ili CDR su mutirani u odgovarajući(e) ostatak(ke) različite sekvence germinativne linije (tj., sekvence germinativne linije koja se razlikuje od sekvence germinativne linije iz koje je antitelo prvobitno izvedeno). Osim toga, antitela predmetnog prikaza mogu sadržati bilo koju kombinaciju dve ili više mutacija germinativne linije unutar okvira i/ili CDR regiona, npr., gde su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene germinativne sekvence, dok su određeni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne germinativne sekvence održavani ili su mutirani u odgovarajući ostatak različite germinativne sekvence. Jednom dobijena, antitela i fragmenti koji vezuju antigen, a koji sadrže jednu ili više mutacija germinativne linije, mogu se lako testirati na jedno ili više željenih svojstava, kao što su poboljšana specifičnost vezivanja, povećan afinitet vezivanja, poboljšana ili poboljšana antagonistička ili agonistička biološka svojstva (u zavisnosti od slučaja), smanjena imunogenost itd. Antitela i fragmenti koji vezuju antigen dobijeni na ovaj opšti način obuhvaćeni su predmetnim prikazom.

[0285] Predmetni prikaz takođe obuhvata potpuno humana monoklonska antitela protiv virusa ebole koja sadrže varijante bilo koje od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinske sekvence opisane ovde, koje imaju jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, predmetni prikaz obuhvata antitela protiv virusa ebole koja imaju HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinske sekvence sa, npr., 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje, itd. konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama u odnosu na bilo koju od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci ovde opisanih.

[0287] Termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, treba da obuhvati antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih imunoglobulinskih sekvenci germinativne linije. Humana monoklonska antitela iz predmetnog prikaza mogu da obuhvate aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim imunoglobulinskim sekvencama germinativne linije (npr., mutacije uvedene slučajnom ili lokalno specifičnom mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR, a posebno CDR3. Međutim, termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, nije namenjen da obuhvati monoklonska antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativne linije druge vrste sisara (npr., miša) prenete na humane FR sekvence. Termin obuhvata antitela rekombinantno proizvedena u nehumanom sisaru ili u ćelijama nehumanog sisara. Termin nije namenjen da obuhvati antitela izolovana iz ili generisana u humanom subjektu.

[0289] Termin "rekombinantno", kako se ovde koristi, odnosi se na antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigene iz ovog otkrića, kreirane, ekspresovane, izolovane ili dobijene tehnologijama ili metodama poznatim u struci kao tehnologija rekombinantne DNK, koje uključuju, npr., DNK splajsovanje i transgensku ekspresiju. Termin se odnosi na antitela eksprimirana u nehumanom sisaru (uključujući transgene nehumane sisare, npr., transgene miševe), ili ćelijskom (npr., CHO ćelije) ekspresionom sistemu ili izolovana iz rekombinantne kombinatorne biblioteke humanih antitela.

[0291] [0114] Termin "specifično se vezuje" ili "specifično se vezuje za" ili slično, znači da antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen formira kompleks sa antigenom koji je relativno stabilan pod fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje može se okarakterisati konstantom ravnotežne disocijacije od najmanje oko 1x10<-7>M ili manje (npr., manja K<D>označava čvršće vezivanje). Postupci za određivanje da li se dva molekula specifično vezuju dobro su poznati u oblasti tehnike i uključuju, na primer, ravnotežnu dijalizu, površinsku plazmonsku rezonancu i slično. Kao što je ovde opisano, antitela su identifikovana površinskom plazmonskom rezonancom, npr. BIACORE™, koja se specifično vezuju za virus ebole. Pored toga, multispecifična antitela koja se vezuju za jedan domen u virusu ebole i jedan ili više dodatnih antigena ili bispecifično koje se vezuje za dva različita regiona virusa ebole se ipak smatraju antitelima koja se "specifično vezuju", kako se ovde koristi.

[0293] Termin "antitelo visokog afiniteta" odnosi se na ona monoklonska antitela (mAt) koja imaju afinitet vezivanja za virus ebole, izražen kao K<D>, od najmanje 10<-7>M; poželjno 10<-8>M; poželjnije 10<-9>M, još poželjnije 10<-10>M, još poželjnije 10<-11>M, još poželjnije 10<-12>M, mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr., BIACORE™ ili ELISA testom afiniteta prema rastvoru.

[0295] Pod terminom "spora brzina disociranja", „K<off>“ ili „k<d>“ podrazumeva se antitelo koje se disocira od virusa ebole, ili virusu slične čestice koja ekspresuje GP virusa ebole, sa konstantom brzine od 1 x 10⁻³ s⁻¹ ili manje, poželjno 1 x 10⁻⁴ s⁻¹ ili manje, kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom, npr., BIACORE™.

[0297] Termini "deo antigena koji vezuje" antitela, "fragment antigena koji vezuje" antitela i slično, kako se ovde koriste, uključuju bilo koji prirodni, enzimski dobijeni, sintetički, ili genetski modifikovani polipeptid ili glikoprotein koji se specifično vezuje za antigen i formira kompleks. Termini "fragment antitela koji vezuje antigen" ili "fragment antitela", kako se ovde koriste, odnose se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost vezivanja za virus ebole.

[0299] U specifičnim aspektima, antitelo ili fragmenti antitela iz predmetnog prikaza mogu biti konjugovani sa delom kao što je ligand ili terapeutski deo ("imunokonjugat"), kao što je antivirusni lek, drugo antitelo protiv virusa ebole ili bilo koji drugi terapeutski deo koristan za lečenje infekcije izazvane virusom ebole.

[0301] "Izolovano antitelo", kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo koje je u suštini slobodno od drugih antitela (At) sa različitim antigenskim specifičnostima (npr., izolovano antitelo koje se specifično vezuje za virus ebole ili njegov fragment, u suštini je slobodno od At koji se specifično vezuju za antigene osim virusa ebole).

[0303] "Blokirajuće antitelo" ili "neutralizujuće antitelo", kako se ovde koristi (ili "antitelo koje neutrališe aktivnost virusa ebole" ili "antagonističko antitelo"), odnosi se na antitelo čije vezivanje za virus ebole rezultira inhibicijom najmanje jedne biološke aktivnosti virusa ebole. Na primer, antitelo prema predmetnom prikazu može sprečiti ili blokirati vezivanje virusa ebole za ćeliju domaćina ili njegov ulazak u nju. Pored toga, "neutralizujuće antitelo" je ono koje može neutralisati, tj., sprečiti, inhibirati, smanjiti, ometati ili ometati sposobnost patogena da započne i/ili održi infekciju kod domaćina. Koriste se termini "neutralizujuće antitelo" i "antitelo koje neutrališe" ili "antitela koja neutrališu" naizmenično ovde. Ova antitela se mogu koristiti, sama ili u kombinaciji, kao profilaktička ili terapeutska sredstva sa drugim antivirusnim sredstvima uz odgovarajuću formulaciju, ili u kombinaciji sa aktivnom vakcinacijom, ili kao dijagnostičko sredstvo.

[0305] [0121] "Ćelijski zavisna citotoksičnost posredovana citotoksičnošću" ili "ADCC" je mehanizam ćelijski posredovane imunološke odbrane pri čemu efektorska ćelija imunog sistema aktivno lizira ciljnu ćeliju, čiji su membransko-površinski antigeni vezani specifičnim antitelima, kao što su ona opisana ovde. Kao takav, to je jedan mehanizam putem kojeg, na primer, antitelo specifično za virus može delovati da ograniči širenje infekcije. Klasični ADCC je posredovan prirodnim ćelijama ubicama (NK ćelije), makrofagima, neutrofilima i u određenim slučajevima, eozinofilima.

[0307] Termin "površinska plazmonska rezonanca", kako se ovde koristi, odnosi se na optički fenomen koji omogućava analizu biomolekularnih interakcija u realnom vremenu detekcijom promena u koncentracijama proteina unutar biosenzorske matrice, na primer korišćenjem BIACORE™ sistema (Pharmacia Biosensor AB, Upsala, Švedska i Piskatavej, Nju Džerzi).

[0309] Termin "K<D>", kako se ovde koristi, odnosi se na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije antitelo-antigen.

[0311] Termin "epitop" odnosi se na antigensku determinantu koja interaguje sa specifičnim mestom vezivanja antigena u varijabilnom regionu molekula antitela poznatom kao paratop. Jedan antigen može imati više od jednog epitopa. Stoga, različita antitela mogu se vezati za različite oblasti na antigenu i mogu imati različite biološke efekte. Termin "epitop" se takođe odnosi na mesto na antigenu na koje reaguju B i/ili T ćelije. Takođe se odnosi na region antigena koji je vezan antitelom. Epitopi se mogu definisati kao strukturni ili funkcionalni. Funkcionalni epitopi su generalno podskup strukturnih epitopa i imaju one ostatke koji direktno doprinose afinitetu interakcije. Epitopi takođe mogu biti konformacioni, odnosno sastavljeni od nelinearnih aminokiselina. U određenim aspektima, epitopi mogu uključivati determinante koje su hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforilne grupe ili sulfonilne grupe, i, u određenim aspektima, mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja.

[0313] Termin "unakrsna kompeticija", kako se ovde koristi, znači da se antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen vezuje za antigen i inhibira ili blokira vezivanje drugog antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen. Termin takođe uključuje konkurenciju između dva antitela u obe orijentacije, tj., prvo antitelo koje se vezuje i blokira vezivanje drugog antitela i obrnuto. U određenim aspektima, prvo antitelo i drugo antitelo mogu se vezati za isti epitop. Alternativno, prvo i drugo antitelo mogu se vezati za različite, ali preklapajuće epitope tako da vezivanje jednog inhibira ili blokira vezivanje drugog antitela, npr., putem sterine prepreke. Unakrsna kompeticija između antitela može se meriti postupcima poznatim u oblasti tehnike, na primer, interferometrijskim testom biosloja u realnom vremenu, bez obeležavanja. Da bi se utvrdilo da li je ispitivano antitelo u unakrsnoj kompeticiji sa referentnim anti-GP antitelom virusa ebole iz predmetnog prikaza, referentnom antitelu se dozvoljava da se veže za GP ili peptid virusa ebole u uslovima zasićenja. Zatim se procenjuje sposobnost ispitivanog antitela da se veže za GP virusa ebole. Ako je ispitivano antitelo u stanju da se veže za GP virusa ebole nakon vezivanja u zasićenju sa referentnim GP antitelom virusa ebole, može se zaključiti da se test antitelo vezuje za drugačiji epitop od referentnog anti-GP antitela virusa ebole. S druge strane, ako ispitivano antitelo nije u stanju da se veže za GP virusa ebole nakon zasićenog vezivanja sa referentnim GP antitelom protiv virusa ebole, onda se ispitivano antitelo može vezati za isti epitop kao i epitop koji je vezan referentnim antitelom protiv GP virusa ebole iz predmetnog prikaza.

[0314] Termin "suštinski identitet" ili "suštinski identičan", kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, ukazuje da, kada je optimalno poravnat sa odgovarajućim nukleotidnim insercijama ili delecijama sa drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), postoji identitet nukleotidne sekvence u najmanje oko 90%, a poželjnije najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% nukleotidnih baza, mereno bilo kojim dobro poznatim algoritmom identiteta sekvence, kao što su FASTA, BLAST ili GAP, kao što je objašnjeno u nastavku. Molekul nukleinske kiseline koji ima značajan identitet sa referentnim molekulom nukleinske kiseline može, u određenim slučajevima, kodirati polipeptid koji ima istu ili značajno sličnu aminokiselinsku sekvencu kao polipeptid koji kodira referentni molekul nukleinske kiseline.

[0316] Kada se primenjuje na polipeptide, termin "suštinska sličnost" ili "suštinski sličan" znači da dve peptidne sekvence, kada su optimalno poravnate, kao što je to slučaj sa programima GAP ili BESTFIT korišćenjem podrazumevanih težina praznina, dele najmanje 90% identiteta sekvence, još poželjnije najmanje 95%, 98% ili 99% identiteta sekvence. Poželjno je da se pozicije ostataka, koje nisu identične, razlikuju konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama. "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac (R grupa) sa sličnim hemijskim svojstvima (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće značajno promeniti funkcionalna svojstva proteina. U slučajevima kada se dve ili više aminokiselinskih sekvenci razlikuju jedna od druge konzervativnim supstitucijama, procenat ili stepen sličnosti može se podesiti naviše da bi se korigovao konzervativni karakter supstitucije. Sredstva za ovo podešavanje su dobro poznata stručnjacima u ovoj oblasti. (Vidi, npr., Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-331). Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju 1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatično-hidroksilne bočne lance: serin i treonin; 3) bočne lance koji sadrže amide: asparagin i glutamin; 4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin i triptofan; 5) bazne bočne lance: lizin, arginin i histidin; 6) kisele bočne lance: aspartat i glutamat, i 7) bočne lance koji sadrže sumpor: cistein i metionin. Poželjne konzervativne grupe za supstituciju aminokiselina su: valin-leucinizoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je svaka promena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 logaritamskoj matrici verovatnoće objavljenoj u Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-45. "Umereno konzervativna" supstitucija je svaka promena koja ima nenegativnu vrednost u PAM250 logaritamskoj matrici verovatnoće.

[0318] [0128] Sličnost sekvenci za polipeptide se obično meri pomoću softvera za analizu sekvenci. Softver za analizu proteina upoređuje slične sekvence koristeći mere sličnosti dodeljene različitim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne supstitucije aminokiselina. Na primer, GCG softver sadrži programe kao što su GAP i BESTFIT koji se mogu koristiti sa podrazumevanim parametrima za određivanje homologije sekvence ili identiteta sekvence između blisko srodnih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divljeg tipa i njegovog muteina. Videti, npr., GCG verziju 6.1. Polipeptidne sekvence se takođe mogu uporediti pomoću FASTA sa podrazumevanim ili preporučenim parametrima; program u GCG verziji 6.1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) pruža poravnanja i procenat identiteta sekvenci regiona sa najboljim preklapanjem između sekvenci upita i pretrage (Pearson (2000) supra). Još jedan poželjni algoritam pri poređenju sekvence iz predmetnog prikaza sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je računarski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, koristeći podrazumevane parametre. Videti, npr., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 i (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-3402.

[0320] Pod frazom "terapijski efikasna količina" podrazumeva se količina koja proizvodi željeni efekat zbog kojeg se primenjuje. Tačna količina će zavisiti od svrhe lečenja i može je utvrditi stručnjak u ovoj oblasti koristeći poznate tehnike (videti, na primer, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).

[0322] Kako se ovde koristi, termin "subjekt" odnosi se na životinju, poželjno sisara, još poželjnije čoveka, kome je potrebno ublažavanje, prevencija i/ili lečenje bolesti ili poremećaja kao što je virusna infekcija. Subjekt može imati infekciju virusom ebole ili je predisponiran za razvoj infekcije virusom ebole. Subjekti "predisponirani za razvoj infekcije virusom ebole" ili subjekti "koji mogu biti pod povećanim rizikom od zaraze infekcijom virusom ebole" su subjekti sa oslabljenim imunološkim sistemom zbog autoimune bolesti, osobe koje primaju imunosupresivnu terapiju (na primer, nakon transplantacije organa), osobe koje pate od sindroma humane imunodeficijencije (HIV) ili sindroma stečene imunodeficijencije (SIDA), određenih oblika anemije koji iscrpljuju ili uništavaju bela krvna zrnca, osobe koje primaju zračenje ili hemoterapiju ili osobe koje pate od inflamatornog poremećaja. Pored toga, subjekti ekstremno mlade ili stare dobi su pod povećanim rizikom. Svaka osoba koja dođe u fizički kontakt ili blisku fizičku blizinu sa zaraženom životinjom ili ljudskim pacijentom, ili je izložena telesnim tečnostima ili tkivima zaražene životinje ili humanog pacijenta, ima povećan rizik od razvoja infekcije virusom ebole. Pored toga, subjekt je u riziku od zaraze virusom ebole zbog blizine mesta izbijanja bolesti, npr. subjekt boravi u gusto naseljenom gradu ili u neposrednoj blizini subjekata sa potvrđenom ili sumnjivom infekcijom virusom ebole, ili izbora zaposlenja, npr. bolnički radnik, farmaceutski istraživač, osoba koja je posetila ili planira da poseti područje ili zemlju za koju se zna ili se sumnja da ima epidemiju virusa ebole, ili česti letač.

[0324] Kako se ovde koriste, termini "lečiti", "lečenje" ili "tretman" odnose se na smanjenje ili ublažavanje težine najmanje jednog simptoma ili indikacije infekcije virusom ebole usled primene terapijskog sredstva kao što je antitelo predmetnog prikaza subjektu kome je to potrebno. Termini uključuju inhibiciju progresije bolesti ili pogoršanja infekcije. Termini takođe uključuju pozitivnu prognozu bolesti, tj. subjekt može biti bez infekcije ili može imati smanjene ili nikakve virusne titre nakon primene terapijskog sredstva kao što je antitelo predmetnog prikaza. Terapijsko sredstvo može se primeniti u terapeutskoj dozi subjektu.

[0326] Termini "sprečiti", "sprečavanje" ili "prevencija" odnose se na inhibiciju manifestacije infekcije virusom ebole ili bilo kojih simptoma ili indikacija infekcije virusom ebole nakon primene antitela predmetnog prikaza. Termin uključuje sprečavanje širenja infekcije kod subjekta izloženog virusu ili u riziku od infekcije virusom ebole.

[0328] [0133] Kako se ovde koristi, termin "antivirusni lek" odnosi se na bilo koje antiinfektivno sredstvo ili terapiju, bilo da je to hemijski deo, ili biološka terapija, koja se koristi za lečenje, sprečavanje ili ublažavanje virusne infekcije kod subjekta. Na primer, u ovom pronalasku, antivirusni lek može da sadrži, ali nije ograničen na, antitelo protiv virusa ebole (u jednom izvođenju, antitelo protiv virusa ebole može biti drugačije od onih opisanih ovde), vakcinu protiv virusa ebole, ZMapp terapiju, TKM ebola (male interferirajuće RNK koje ciljaju virusnu RNK polimerazu) brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (antisens fosforodiamidatni morfolino oligomeri koji ciljaju gen VP24 virusa ebole) i interferone. U predmetnom pronalasku, infekcija koja se leči je uzrokovana virusom ebole.

[0330] Opšti opis

[0332] Bolest virusa ebole je teška, često fatalna bolest uzrokovana filamentoznim virusnim česticama koje su članovi porodice Filoviridae. Postoji nekoliko poznatih vrsta iz roda virusa ebole koje su sposobne da izazovu bolest kod ljudi. To uključuje Zair, Sudan, šumu Tai (ranije Obala Slonovače) i Bundibuđo. Prirodni rezervoar virusa je nepoznat i do danas ne postoje odobrene terapije ili vakcine.

[0334] Genom virusa se sastoji od jednog lanca negativne RNK dužine približno 19 kb. Virioni ebole sadrže sedam proteina: površinski glikoprotein (GP), nukleoprotein (NP), četiri virionska strukturna proteina (VP40, VP35, VP30 i VP24) i RNK-zavisnu RNK polimerazu (L). (Feldman, et al. (1992) Virus Res. 24, 1-19).

[0336] Jedini protein prisutan na površini virusa je glikoprotein. Zbog RNK editovanja, transkripcija GP gena rezultira sintezom nekoliko iRNK specifičnih za GP gen koje kodiraju virusne GP, uključujući nestrukturni rastvorljivi GP (sGP) i površinski virionski GP ((Volchkova, VA et al., (1998), Virology 250:408-414). Oba GP se sintetišu kao molekul prekursora koji se proteolitički cepa ćelijskom proteazom furinom tokom intracelularne obrade (Volchkov, VE, et al., ((1998), Proc Natl Acad Sci USA 95:5762-5767). sGP formira dimere, dok je cepani karboksi-terminusni fragment monomer. Šiljci na površini virusa se formiraju kao trimer GP12 sastavljen od dve podjedinice GP1 i GP2 povezane disulfidnom vezom (Volchkova, VA et al., (1998), Virology 250:408-414; Falzarano, D. et al., (2006), Chembiochem 7:1605-1611). Poznato je da GP1 posreduje u vezivanju virusa za ćeliju domaćina, a GP2 je uključen u fuziju membrane (Sanchez, A. et al., (1996), Proc Natl Acad Sci USA 93:3602-3607; Alazard-Dany, N., et al. (2006), J. Gen. Virol.87:1247-1257).

[0338] Tokom infekcije sa EBOV, značajne količine rastvorljivih glikoproteina (sGP) se oslobađaju iz ćelija zaraženih virusom. Pokazano je da se ovaj oblik GP vezuje za antitela koja neutrališu virus, usmerena protiv površinskog ili virionskog GP (Dolnik, O. et al., (2004), EMBO J 23:2175-2184). Osim ove blokade antitelima, uloga rastvorljivog GP u smislu replikacije virusa i/ili patogenosti nije dobro definisana. Novije studije Escudero-Perez, etal., pokazale su da sGP može da se veže za neinficirane dendritične ćelije i makrofage i da ih aktivira i da indukuje lučenje pro- i antiinflamatornih citokina. Pored toga, pokazali su da sGP utiče na funkciju endotelnih ćelija i može uticati na vaskularnu permeabilnost. (Escudero-Perez, etal., (2014), PLOS Pathogens, Vol. 10, Issue 11:1-17). Ovo može objasniti disregulisanu inflamatornu reakciju domaćina nakon infekcije i može doprineti patogenosti virusa.

[0340] Pasivna imunoterapija za profilaksu ili lečenje zaraznih bolesti koristi se više od jednog veka, obično u obliku rekonvalescentnih humanih seruma koji sadrže visoke titre neutrališućih antitela (Good et al., (1991); Cancer68: 1415-1421). Danas su višestruko prečišćena monoklonska antitela trenutno u prekliničkom i kliničkom razvoju za upotrebu kao antimikrobna sredstva (Marasco et al 2007; Nature Biotechnology 25: 1421-1434). Opisana su određena antitela koja se vezuju za glikoprotein virusa ebole. (Videti npr. Audet et al. (2014), Scientific Reports 4:6881; Chen, et al. (2014), ACS Chem Biol.17. oktobar; 9(10):2263-73; Koellhoffer JF, et.al., (2012), Chembiochem 26. novembar; 13(17):2549-57; Qiu, X., et.al., Nature (2014) 2. oktobar;514(7520):47-53).

[0341] Pronalazači su ovde opisali potpuno humana antitela i njihove fragmente koji vezuju antigene, a koji se specifično vezuju za GP virusa ebole i moduliraju interakciju virusa ebole sa tim ćelijama. Antitela protiv GP virusa ebole mogu se vezati za virus ebole sa visokim afinitetom. U određenim aspektima, antitela predmetnog prikaza su blokirajuća antitela, pri čemu se antitela mogu vezati za GP virusa ebole i blokirati vezivanje za i/ili ulazak virusa u ćelije domaćina. U određenim aspektima, antitela predmetnog prikaza mogu blokirati vezivanje virusa ebole za ćelije i kao takva mogu inhibirati ili neutralisati virusnu infekciju ćelija domaćina. U određenim aspektima, antitela predmetnog prikaza mogu posredovati ćelijski zavisnoj citotoksičnosti (ADCC) i kao takva, mogu pomoći u uništavanju ćelija koje sadrže virus. U određenim aspektima, antitela mogu delovati na oba načina, npr. mogu neutralisati virusnu infektivnost i mogu posredovati u ADCC. U nekim aspektima, antitela mogu biti korisna za lečenje subjekta koji pati od infekcije virusom ebole. Antitela, kada se primene kod subjekta kome je to potrebno, mogu smanjiti infekciju virusom kao što je virus ebole kod subjekta. Mogu se koristiti za smanjenje virusnog opterećenja kod subjekta. Mogu se koristiti sama ili kao dodatna terapija sa drugim terapeutskim delovima ili modalitetima poznatim u struci za lečenje virusne infekcije. U određenim aspektima, ova antitela se mogu vezati za epitop na aminoterminusu GP virusa ebole. U određenim aspektima, ova antitela se mogu vezati za epitop na karboksi-terminusu GP virusa ebole. Pored toga, identifikovana antitela mogu se koristiti profilaktički (pre infekcije) kako bi se sisar zaštitio od infekcije, ili se mogu koristiti terapeutski (nakon što se infekcija uspostavi) da bi se ublažila prethodno uspostavljena infekcija ili da bi se ublažio najmanje jednan simptom povezan sa infekcijom.

[0343] Puna dužina aminokiselinske sekvence jednog primera GP virusa ebole prikazana je u pristupnim brojevima GenBankas AHX24649.1 i AHX24649.2, a takođe i u SEQ ID NO: 314 i 315, redom. GP1 se proteže od aminokiselinskih ostataka 1-501 pune dužine GP, a GP2 se proteže od aminokiselinskih ostataka 502 do 676 pune dužine GP prikazane u SEQ ID NO: 314 ili SEQ ID NO: 315). EBOV GP pune dužine, takođe prikazan pod brojem pristupa AHX24649.1, može biti spojen sa dekahistidinskom oznakom, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 318. Rastvorljivi GP (sGP) je prikazan kao GenBank pristupni broj AHX24650.1, a takođe i kao SEQ ID NO: 316 (sa priključenom signalnom sekvencom) i takođe kao SEQ ID NO: 317 (bez signalne sekvence, ali sadrži myc-myc-his oznaku).

[0345] U određenim aspektima, antitela prema ovom prikazu se dobijaju od miševa imunizovanih primarnim imunogenom, kao što je GP virusa ebole pune dužine, ili rekombinantnim oblikom GP virusa ebole ili njegovim fragmentima, nakon čega sledi imunizacija sekundarnim imunogenom, ili imunogeno aktivnim fragmentom GP virusa ebole. U određenim aspektima, antitela se dobijaju od miševa imunizovanih DNK koja kodira GP virusa ebole pune dužine (Zaire.2014, videti GenBank KJ660346.2; takođe SEQ ID NO: 313). Imunogen može biti biološki aktivan i/ili imunogeni fragment GP virusa ebole ili DNK koja kodira njegov aktivni fragment. Fragment može biti izveden iz bilo kog regiona virusnog GP, uključujući amino-terminalni fragment (npr. GP1) ili karboksi-terminalni fragment (npr. GP2). Peptidi mogu biti modifikovani tako da uključuju dodavanje ili supstituciju određenih ostataka za vezivanje ili u svrhu konjugacije sa molekulima nosačima, kao što je KLH. Na primer, cistein se može dodati ili na N-terminalni ili na C-terminalni kraj peptida, ili se može dodati linkerska sekvenca da bi se pripremio peptid za konjugaciju sa, na primer, KLH za imunizaciju.

[0347] [0142] Određena antitela protiv virusa ebole iz predmetnog prikaza mogu se vezati za virus ebole i neutralisati njegovu aktivnost, što je utvrđeno in vitro ili in vivo testovima. Sposobnost antitela iz predmetnog prikaza da se vežu za virus ebole i neutrališu njegovu aktivnost, a samim tim i vezivanje i/ili ulazak virusa u ćeliju domaćina, nakon čega sledi virusna infekcija, može se meriti korišćenjem bilo koje standardne metode poznate stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući testove vezivanja ili testove aktivnosti, kao što je ovde opisano.

[0349] Neograničavajući, primeri in vitro testova za merenje aktivnosti vezivanja ilustrovani su u Primeru 3, ovde. U Primeru 3, afinitet vezivanja i konstante disocijacije antitela protiv virusa ebole GP za virus ebole određeni su pomoću Biacore-a. U Primerima 4 i 7, testovi neutralizacije su korišćeni za određivanje infektivnosti različitih sojeva virusa ebole.

[0351] Antitela specifična za GP virusa ebole mogu da ne sadrže dodatne oznake ili delove, ili mogu da sadrže N-terminalnu ili C-terminalnu oznaku ili deo. U jednom izvođenju, oznaka ili deo je biotin. U testu vezivanja, lokacija oznake (ako postoji) može odrediti orijentaciju peptida u odnosu na površinu na koju je peptid vezan. Na primer, ako je površina obložena avidinom, peptid koji sadrži N-terminalni biotin biće orijentisan tako da će C-terminalni deo peptida biti distalan od površine. U jednom izvođenju, oznaka može biti radionuklid, fluorescentna boja ili oznaka koja se može detektovati pomoću MRI. U određenim aspektima, takva obeležena antitela mogu se koristiti u dijagnostičkim testovima, uključujući testove snimanja.

[0353] Fragmenti antitela koji vezuju antigen

[0355] Osim ako nije drugačije naznačeno, termin "antitelo", kako se ovde koristi, treba shvatiti da obuhvata molekule antitela koji sadrže dva teška lanca imunoglobulina i dva laka lanca imunoglobulina (tj., "kompletni molekuli antitela"), kao i njihove fragmente koji vezuju antigen. Termini "deo antitela koji vezuje antigen", "fragment antitela koji vezuje antigen" i slično, kako se ovde koriste, uključuju bilo koji prirodni, enzimski dostupan, sintetički ili genetski modifikovan polipeptid ili glikoprotein koji se specifično vezuje za antigen i formira kompleks. Termini "fragment antitela koji vezuje antigen" ili "fragment antitela", kako se ovde koriste, odnose se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za virus ebole. Fragment antitela može da uključuje Fab fragment, F(ab')2 fragment, Fv fragment, dAb fragment, fragment koji sadrži CDR ili izolovani CDR. U određenim aspektima, termin "fragment koji vezuje antigen" odnosi se na polipeptidni fragment multispecifičnog molekula koji vezuje antigen. Fragmenti antitela koji vezuju antigen mogu biti izvedeni, npr., iz kompletnih molekula antitela korišćenjem bilo kojih odgovarajućih standardnih tehnika kao što su proteolitička digestija ili tehnike rekombinantnog genetskog inženjeringa koje uključuju manipulaciju i ekspresiju DNK koja kodira varijabilne i (opciono) konstantne domene antitela. Takva DNK je poznata i/ili je lako dostupna iz, npr., komercijalnih izvora, DNK biblioteka (uključujući, npr., fag-antitela biblioteke), ili se može sintetizovati. DNK se može sekvencirati i manipulisati hemijski ili korišćenjem tehnika molekularne biologije, na primer, da bi se jedan ili više varijabilnih i/ili konstantnih domena rasporedili u odgovarajuću konfiguraciju, ili da bi se uveli kodoni, stvorili ostaci cisteina, modifikovali, dodali ili izbrisali aminokiseline itd.

[0357] Neograničavajući primeri fragmenata koji vezuju antigen uključuju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab')2 fragmente; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) jednolančane Fv (scFv) molekule; (vi) dAb fragmente; i (vii) minimalne jedinice za prepoznavanje koje se sastoje od aminokiselinskih ostataka koji imitiraju hipervarijabilni region antitela (npr. izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR) kao što je CDR3 peptid) ili ograničeni FR3-CDR3-FR4 peptid. Drugi modifikovani molekuli, kao što su antitela specifična za domen, antitela sa jednim domenom, antitela sa obrisanim domenom, himerna antitela, antitela sa prenetim CDR-om, diatela, triatela, tetratela, minitela, nanotela (npr.

[0358] monovalentna nanotela, bivalentna nanotela, itd.), mali modularni imunofarmaceutski proizvodi (SMIP) i varijabilni IgNAR domeni ajkula, takođe su obuhvaćeni izrazom "fragment koji vezuje antigen", kako se ovde koristi.

[0360] Fragment antitela koji vezuje antigen obično će sadržati najmanje jedan varijabilni domen. Varijabilni domen može biti bilo koje veličine ili sastava aminokiselina i generalno će sadržati najmanje jedan CDR, koji je pored ili u okviru sa jednom ili više okvirnih sekvenci. U fragmentima koji vezuju antigen i imaju V<H>domen povezan sa V<L>domenom, V<H>i V<L>domeni mogu biti smešteni jedan u odnosu na drugi u bilo kom pogodnom rasporedu. Na primer, varijabilni region može biti dimeran i sadržati V<H>- V<H>, V<H>- V<L>ili V<L>- V<L>dimere. Alternativno, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržati monomerni V<H>ili V<L>domen.

[0362] U određenim aspektima, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržati najmanje jedan varijabilni domen kovalentno povezan sa najmanje jednim konstantnim domenom. Neograničavajuće, primerne konfiguracije varijabilnih i konstantnih domena koje se mogu naći unutar fragmenta antitela koji vezuje antigen ovog otkrića uključuju: (i) V<H>-C<H>1; (ii) V<H>- Ch2; (iii) Vh -Ch3; (iv) Vh -Ch1-Ch2; (v) Vh -Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh -Ch2-Ch3; (vii) Vh -Cl; (viii) Vl -Ch1; (ix) Vl -Ch2; (x) Vl -C<h>3; (xi) V<L>-C<h>1-C<h>2; (xii) V<L>-C<h>1-C<h>2-C<h>3; (xiii) V<L>-C<h>2-C<h>3; and (xiv) V<L>-C<l>. U bilo kojoj konfiguraciji varijabilnih i konstantnih domena, uključujući bilo koju od gore navedenih primera konfiguracija, varijabilni i konstantni domeni mogu biti direktno povezani jedan sa drugim ili mogu biti povezani potpunim ili delimičnim zglobnim ili linkerskim regionom. Zglobni region može se sastojati od najmanje 2 (npr., 5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiselina, što rezultira fleksibilnom ili polufleksibilnom vezom između susednih varijabilnih i/ili konstantnih domena u jednom molekulu polipeptida. Osim toga, fragment antitela koji vezuje antigen predmetnog prikaza može da sadrži homodimer ili heterodimer (ili drugi multimer) bilo koje od konfiguracija varijabilnih i konstantnih domena navedenih gore u nekovalentnoj vezi jedni sa drugima i/ili sa jednim ili više monomernih V<H>ili V<L>domena (npr., disulfidnom vezom(ama)).

[0364] Kao i kod kompletnih molekula antitela, fragmenti koji vezuju antigen mogu biti monospecifični ili multispecifični (npr., bispecifični). Multispecifični fragment antitela koji vezuje antigen obično će obuhvatiti najmanje dva različita varijabilna domena, pri čemu je svaki varijabilni domen sposoban da se specifično veže za odvojeni antigen ili za drugi epitop na istom antigenu. Bilo koji format multispecifičnog antitela, uključujući primere formata bispecifičnih antitela opisane ovde, može se prilagoditi za upotrebu u kontekstu fragmenta koji vezuje antigen antitela predmetnog prikaza korišćenjem rutinskih tehnika dostupnih u oblasti tehnike.

[0366] Priprema humanih antitela

[0368] [0150] Postupci za generisanje humanih antitela u transgenim miševima su poznati u oblasti tehnike. Bilo koji takvi poznati postupci mogu se koristiti u kontekstu predmetnog prikaza za pravljenje humanih antitela koja se specifično vezuju za glikoprotein virusa ebole. Imunogen koji sadrži bilo koje od sledećih može se koristiti za generisanje antitela na virus ebole. Antitela se mogu dobiti od miševa imunizovanih sa punim, prirodnim GP virusa ebole (videti, na primer, pristupne brojeve GenBank AHX24649.1 (SEQ ID NO: 314) i AHX24649.2 (SEQ ID NO: 315) ili sa DNK koja kodira glikoprotein ili njegov fragment. Alternativno, GP virusa ebole ili njegov fragment mogu se proizvesti korišćenjem standardnih biohemijskih tehnika i modifikovati i koristiti kao imunogen. Imunogen može biti rekombinantno proizveden GP virusa ebole ili njegov fragment. Imunogen može biti komercijalno dostupan GP virusa ebole. U određenim aspektima, može se primeniti jedna ili više buster injekcija. Buster injekcije mogu sadržati jedan ili više komercijalno dostupnih GP virusa ebole. Imunogen može biti rekombinantni GP virusa ebole eksprimiran u E. coli ili u bilo kojim drugim eukariotskim ćelijama sisara kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO).

[0370] Korišćenjem VELOCIMMUNE® tehnologije (videti, na primer, US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) ili bilo kojom drugom poznatom metodom za generisanje monoklonskih antitela, prvo se izoluju himerna antitela visokog afiniteta na virus ebole GP, koja imaju humani varijabilni region i mišji konstantni region. VELOCIMMUNE® tehnologija uključuje generisanje transgenog miša čiji genom sadrži humane varijabilne regione teškog i lakog lanca operativno povezane sa endogenim lokusima konstantnog regiona miša, tako da miš proizvodi antitelo koje sadrži humani varijabilni region i mišji konstantni region kao odgovor na stimulaciju antigenom. DNK koja kodira varijabilne regione teškog i lakog lanca antitela je izolovana i operativno povezana sa DNK koja kodira humane konstantne regione teškog i lakog lanca. DNK se zatim ekspresuje u ćeliji sposobnoj da ekspresuje potpuno humano antitelo.

[0372] Generalno, VELOCIMMUNE® miš se izaziva antigenom od interesa, a limfatične ćelije (kao što su B-ćelije) se izoluju od miševa koji ekspresuju antitela. Limfatične ćelije mogu biti spojene sa ćelijskom linijom mijeloma da bi se pripremile besmrtne hibridomske ćelijske linije, a takve hibridomske ćelijske linije se skrininguju i selektuju da bi se identifikovale hibridomske ćelijske linije koje proizvode antitela specifična za antigen od interesa. DNK koja kodira varijabilne regione teškog i lakog lanca mogu biti izolovani i povezani sa poželjnim izotipskim konstantnim regionima teškog i lakog lanca. Takav protein antitela može biti proizveden u ćeliji, kao što je CHO ćelija. Alternativno, DNK koja kodira antigen-specifična himerna antitela ili varijabilne domene lakih i teških lanaca može biti izolovana direktno iz antigen-specifičnih limfocita.

[0374] U početku se izoluju himerna antitela visokog afiniteta koja imaju humani varijabilni region i mišji konstantni region. Kao u eksperimentalnom odeljku ispod, antitela su okarakterisana i odabrana na osnovu poželjnih karakteristika, uključujući afinitet, selektivnost, epitop itd. Mišji konstantni regioni se zamenjuju željenim humanim konstantnim regionom da bi se generisalo potpuno humano antitelo predmetnog prikaza, na primer, divljeg tipa ili modifikovani IgG1 ili IgG4. Dok izabrani konstantni region može da varira u zavisnosti od specifične upotrebe, karakteristike vezivanja antigena visokog afiniteta i specifičnosti cilja nalaze se u varijabilnom regionu.

[0376] Bioekvivalent

[0378] Antitela protiv virusa ebole (GP) i fragmenti antitela iz predmetnog prikaza obuhvataju proteine sa aminokiselinskim sekvencama koje se razlikuju od onih opisanih antitela, ali koje zadržavaju sposobnost vezivanja za virus ebole. Takva varijantna antitela i fragmenti antitela sadrže jednu ili više adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina u poređenju sa matičnom sekvencom, ali pokazuju biološku aktivnost koja je u suštini ekvivalentna aktivnosti opisanih antitela. Slično tome, DNK sekvence koje kodiraju antitela iz predmetnog prikaza obuhvataju sekvence koje sadrže jednu ili više adicija, delecija ili supstitucija nukleotida u poređenju sa otkrivenom sekvencom, ali koje kodiraju antitelo ili fragment antitela koji je u suštini bioekvivalentan antitelu ili fragmentu antitela otkrivenom ovde.

[0379] Dva proteina koji vezuju antigene, ili antitela, smatraju se bioekvivalentnim ako su, na primer, farmaceutski ekvivalenti ili farmaceutske alternative čija brzina i obim apsorpcije ne pokazuju značajnu razliku kada se primenjuju u istoj molarnoj dozi pod sličnim eksperimentalnim uslovima, bilo kao jedna doza ili kao višestruke doze. Neka antitela će se smatrati ekvivalentima ili farmaceutskim alternativama ako su ekvivalentna u stepenu apsorpcije, ali ne i u brzini apsorpcije, a ipak se mogu smatrati bioekvivalentnim jer su takve razlike u brzini apsorpcije namerne i odražavaju se u obeležavanju, nisu neophodne za postizanje efikasnih koncentracija leka u telu pri, npr., hroničnoj upotrebi, i smatraju se medicinski beznačajnim za određeni lek koji se proučava.

[0381] Dva proteina koja vezuju antigene su bioekvivalentna ako nema klinički značajnih razlika u njihovoj bezbednosti, čistoći ili potenciji.

[0383] Dva proteina koja vezuju antigene su bioekvivalentna ako pacijent može biti prebačen jednom ili više puta između referentnog proizvoda i biološkog proizvoda bez očekivanog povećanja rizika od neželjenih efekata, uključujući klinički značajnu promenu imunogenosti ili smanjenu efikasnost, u poređenju sa kontinuiranom terapijom bez takve promene.

[0385] Dva proteina koja vezuju antigene su bioekvivalentna ako oba deluju zajedničkim mehanizmom ili mehanizmima delovanja za stanje ili uslove upotrebe, u meri u kojoj su takvi mehanizmi poznati.

[0387] Bioekvivalentnost se može dokazati korišćenjem in vivo i/ili in vitro postupaka. Mere bioekvivalentnosti uključuju, npr., (a) in vivo test na ljudima ili drugim sisarima, u kome se koncentracija antitela ili njegovih metabolita meri u krvi, plazmi, serumu ili drugoj biološkoj tečnosti kao funkcija vremena; (b) in vitro test koji je u korelaciji sa podacima o in vivo biodostupnosti kod ljudi i razumno ih predviđa; (c) in vivo test na ljudima ili drugim sisarima u kome se odgovarajući akutni farmakološki efekat antitela (ili njegove mete) meri kao funkcija vremena; i (d) u dobro kontrolisanom kliničkom ispitivanju koje utvrđuje bezbednost, efikasnost ili biodostupnost ili bioekvivalentnost antitela.

[0389] Bioekvivalentne varijante antitela opisanih ovde mogu se konstruisati, na primer, pravljenjem različitih supstitucija ostataka ili sekvenci ili brisanjem terminalnih ili internih ostataka ili sekvenci koje nisu potrebne za biološku aktivnost. Na primer, ostaci cisteina koji nisu neophodni za biološku aktivnost mogu se izbrisati ili zameniti drugim aminokiselinama kako bi se sprečilo formiranje nepotrebnih ili netačnih intramolekularnih disulfidnih mostova nakon renaturacije. U drugim kontekstima, bioekvivalentna antitela mogu uključivati varijante antitela koje sadrže promene aminokiselina, koje modifikuju karakteristike glikozilacije antitela, npr. mutacije koje eliminišu ili uklanjaju glikozilaciju.

[0391] Antitela protiv virusa - ebole koja sadrže varijante Fc

[0393] [0161] Prema određenim aspektima predmetnog prikaza, obezbeđena su antitela protiv virusa ebole koja sadrže Fc domen koji sadrži jednu ili više mutacija koje pojačavaju ili smanjuju vezivanje antitela za FcRn receptor, npr., pri kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH. Na primer, predmetni prikaz obuhvata antitela protiv virusa ebole GP koja sadrže mutaciju u C<H>2 ili C<H>3 regionu Fc domena, gde mutacija(e) povećava(ju) afinitet Fc domena prema FcRn u kiseloj sredini (npr., u endozomu gde se pH kreće od oko 5,5 do oko 6,0). Takve mutacije mogu dovesti do povećanja poluživota antitela u serumu kada se primenjuje na životinji. Neograničavajući primeri takvih Fc modifikacija uključuju, npr., modifikaciju na poziciji 250 (npr., E ili Q); 250 i 428 (npr., L ili F); 252 (npr., L/Y/F/W ili T), 254 (npr., S ili T) i 256 (npr., S/R/Q/E/D ili T); ili modifikacija na poziciji 428 i/ili 433 (npr., H/L/R/S/P/Q ili K) i/ili 434 (npr., A, W, H, F ili Y[N434A, N434W, N434H, N434F ili N434Y]); ili modifikacija na poziciji 250 i/ili 428; ili modifikacija na poziciji 307 ili 308 (npr., 308F, V308F) i 434. U jednom aspektu, modifikacija obuhvata modifikaciju 428L (npr., M428L) i 434S (npr., N434S); modifikacija 428L, 259I (npr., V259I) i 308F (npr., V308F); modifikacija 433K (npr., H433K) i 434 (npr., 434Y); modifikacija 252, 254 i 256 (npr., 252Y, 254T i 256E); modifikacija 250Q i 428L (npr., T250Q i M428L); i modifikacija 307 i/ili 308 (npr., 308F ili 308P). U još jednom aspektu, modifikacija obuhvata modifikaciju 265A (npr., D265A) i/ili 297A (npr., N297A).

[0395] Na primer, predmetni prikaz obuhvata antitela protiv virusa ebole koja sadrže Fc domen koji obuhvata jedan ili više parova ili grupa mutacija izabranih iz grupe koja se sastoji od: 250Q i 248L (npr., T250Q i M248L); 252Y, 254T i 256E (npr., M252Y, S254T i T256E); 428L i 434S (npr., M428L i N434S); 2571 i 3111 (npr., P257I i Q311I); 2571 i 434H (npr., P257I i N434H); 376V i 434H (npr., D376V i N434H); 307A, 380A i 434A (npr., T307A, E380A i N434A); i 433K i 434F (npr., H433K i N434F). Sve moguće kombinacije gore navedenih mutacija Fc domena i drugih mutacija unutar varijabilnih domena antitela opisanih ovde razmatraju se u okviru predmetnog prikaza.

[0397] Predmetni prikaz takođe obuhvata antitela protiv virusa ebole koja sadrže himerni konstantni region teškog lanca (C<H>), gde himerni C<H>region sadrži segmente izvedene iz C<H>regiona više od jednog izotipa imunoglobulina. Na primer, antitela predmetnog prikaza mogu da sadrže himerni C<H>region koji sadrži delimični C<H>2 domen izveden iz molekula humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4, kombinovan sa delimičnim ili punim C<H>3 domenom izvedenim iz molekula humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4. Prema određenim aspektima, antitela predmetnog prikaza sadrže himerni C<H>region koji ima himerni zglobni region. Na primer, himerni zglob može da sadrži aminokiselinsku sekvencu "gornjeg zgloba" (aminokiselinski ostaci od pozicija 216 do 227 prema EU numerisanju) izvedena iz zglobnog regiona humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4, kombinovana sa sekvencom "donjeg zgloba" (aminokiselinski ostaci od pozicija 228 do 236 prema EU numerisanju) izvedena iz zglobnog regiona humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4. Prema određenim aspektima, himerni zglobni region sadrži aminokiselinske ostatke izvedene iz gornjeg zgloba humanog IgG1 ili humanog IgG4 i aminokiselinske ostatke izvedene iz donjeg zgloba humanog IgG2. Antitelo koje sadrži himerni C<H>region kao što je ovde opisano može, u određenim ostvarenjima, pokazivati modifikovane Fc efektorske funkcije bez negativnog uticaja na terapeutska ili farmakokinetička svojstva antitela. (Videti, npr., U.S. Privremena prijava br.61/759,578, podneta 1. februara 2013. godine).

[0399] Biološke karakteristike antitela

[0401] [0164] Generalno, antitela predmetnog prikaza funkcionišu vezivanjem za GP virusa ebole. Na primer, predmetni prikaz uključuje antitela i fragmente antitela koji vezuju antigen i vezuju GP virusa ebole (npr., na 25°C ili na 37°C) sa K<D>manjim od 10⁻⁷ M, mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde opisano. Antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu se vezati za GP virusa ebole sa K<D>manjim od oko 10nM, manjim od oko 5nM, manjim od oko 1nM, manjim od oko 500pM, manjim od 250pM ili manjim od 100pM, mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde opisano, ili suštinski sličnim testom.

[0403] Predmetni prikaz takođe obuhvata antitela i njihove fragmente koji vezuju antigene, a koji vezuju virus ebole sa poluživotom disocijacije (t<1>/<2>) većim od oko 3 minuta mereno površinskom plazmonskom rezonancom na 25°C, ili većim od oko 1 minuta mereno površinskom plazmonskom rezonancom na 37°C, npr., i najmanje 3 puta većim vremenom poluraspada (t<1>/<2>) pri pH 5 ili pH 6; koristeći format analize kako je ovde definisano, ili suštinski sličan test. Antitela ili fragmenti koji vezuju antigen ovog otkrića mogu se vezati za virus ebole sa t<1>/<2>većim od oko 10 minuta, većim od oko 30 minuta, većim od oko 60 minuta, većim od oko 100 minuta, većim od oko 200 minuta, većim od oko 300 minuta, većim od oko 400 minuta, većim od oko 500 minuta, većim od oko 600 minuta, većim od oko 700 minuta, većim od oko 800 minuta, većim od oko 900 minuta ili većim od oko 1000 minuta mereno površinskom plazmonskom rezonancom na 25°C ili na 37°C, npr., korišćenjem formata analize kako je ovde definisano (npr., format hvatanja mAt ili format hvatanja antigena), ili suštinski sličan test.

[0405] Predmetni prikaz takođe obuhvata antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen, a koji neutrališu infektivnost virusa ebole za njegove ćelije domaćina. U nekim aspektima, antitela pokazuju moć neutralizacije protiv VLP-ova Zaire.2014 sa IC<50>u rasponu od oko 10<-11>M do oko 10<-9>M. Antitela predmetnog prikaza takođe unakrsno reaguju sa VLP-ovima virusa ebole koji sadrže GP iz različitih sojeva EBOV, uključujući Zaire.1995, Zaire.2014, Ebola Sudan, Bundibuđo i Obala Slonovače (Obala Slonovače). Antitela predmetnog prikaza takođe posreduju u ADCC kao što je prikazano u Primeru 5. Pored toga, antitela predmetnog prikaza su u unakrsnoj kompeticiji sa drugim antitelima koja vezuju EBOV GP, kao što je prikazano u Primeru 6.

[0407] Predmetni prikaz daje izolovano rekombinantno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, a koji se specifično vezuje za GP virusa ebole, pri čemu antitelo ili njegov fragment pokazuje jednu ili više sledećih karakteristika: (a) je potpuno humano monoklonsko antitelo; (b) vezuje se za EBOV ili virusu sličnu česticu (VLP) koja ekspresuje glikoprotein virusa ebole sa konstantom disocijacije (K<D>) manjom od 10⁻⁷ M, mereno testom površinske plazmonske rezonance; (c) pokazuje najmanje trostruko povećanje poluživota disocijacije (t<1>/<2>) pri pH 5 ili pH 6 u odnosu na pH 7,4; (d) pokazuje neutralizaciju Zair virusa ebole sa IC<50>u rasponu od oko 10⁻¹⁰ M do oko 10⁻⁷ M; (e) pokazuje ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela ćelija zaraženih virusom ebole; (f) unakrsno reaguje sa jednim ili više sojeva VLP-ova virusa ebole odabranih iz grupe koja se sastoji od Zaira, 2014. godine, Zaira, 1995. godine, Sudana, Bundibuđoa i Obale Slonovače; (g) u unakrsnoj je kompeticiji sa referentnim antitelom, pri čemu referentno antitelo sadrži aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) i varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) izabrane iz grupe koja se sastoji od bilo koje od aminokiselinskih sekvenci HCVR i LCVR iz Tabele 1.

[0409] Antitela opisana ovde mogu posedovati jednu ili više gore navedenih bioloških karakteristika ili bilo koje njihove kombinacije. Određena svojstva antitela su sumirana u nastavku. Druge biološke karakteristike antitela biće očigledne osobi prosečnog stručnjaka u ovoj oblasti iz pregleda ovog otkrića, uključujući i ovde navedene radne primere.

[0410]

[0413] Mapiranje epitopa i srodne tehnologije

[0415] Predmetni prikaz uključuje antitela protiv virusa ebole koja interaguju sa jednom ili više aminokiselina koje se nalaze u GP virusa ebole. Epitop za koji se antitela vezuju može se sastojati od jedne susedne sekvence od 3 ili više (npr.3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više) aminokiselina koje se nalaze unutar molekula GP virusa ebole (npr., linearni epitop u domenu). Alternativno, epitop može se sastojati od više nesusednih aminokiselina (ili sekvenci aminokiselina) koje se nalaze unutar GP virusa ebole (npr., konformacioni epitop).

[0417] Različite tehnike poznate stručnjacima u ovoj oblasti mogu se koristiti za određivanje da li antitelo "interaguje sa jednom ili više aminokiselina" unutar polipeptida ili proteina. Primeri tehnika uključuju, na primer, rutinske testove unakrsnog blokiranja, kao što je opisano u Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Druge metode uključuju analizu mutacija skeniranjem alanina, analizu peptidnih blotova (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63), analizu cepanja peptida, kristalografske studije i NMR analizu. Pored toga, mogu se koristiti metode kao što su ekscizija epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena (Tomer (2000) Prot. Sci.9: 487-496). Još jedna metoda koja se može koristiti za identifikaciju aminokiselina unutar polipeptida sa kojima antitelo interaguje je razmena vodonika/deuterijuma detektovana masenom spektrometrijom. Generalno govoreći, metod razmene vodonik/deuterijum uključuje obeležavanje proteina od interesa deuterijumom, nakon čega sledi vezivanje antitela za protein obeležen deuterijumom. Zatim, kompleks protein/antitelo se prenosi u vodu, a zamenljivi protoni unutar aminokiselina koje su zaštićene kompleksom antitela podležu povratnoj razmeni deuterijumvodonik sporijom brzinom od zamenljivih protona unutar aminokiselina koje nisu deo interfejsa. Kao rezultat toga, aminokiseline koje čine deo interfejsa protein/antitelo mogu zadržati deuterijum i stoga pokazati relativno veću masu u poređenju sa aminokiselinama koje nisu uključene u interfejs. Nakon disocijacije antitela, ciljni protein se podvrgava cepanju proteazom i analizi masene spektrometrije, čime se otkrivaju ostaci obeleženi deuterijumom koji odgovaraju specifičnim aminokiselinama sa kojima antitelo interaguje. Videti, npr., Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem.73: 256A-265A.

[0419] Termin "epitop" odnosi se na mesto na antigenu na koje reaguju B i/ili T ćelije. B-ćelijski epitopi mogu se formirati i od susednih aminokiselina ili od nesusednih aminokiselina postavljenih jedna pored druge tercijarnim savijanjem proteina. Epitopi formirani od susednih aminokiselina se obično zadržavaju pri izlaganju denaturišućim rastvaračima, dok se epitopi formirani tercijarnim savijanjem obično gube pri tretmanu denaturišućim rastvaračima. Epitop obično uključuje najmanje 3, a češće najmanje 5 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji.

[0420] Profilisanje uz pomoć modifikacije (MAP), takođe poznato kao profilisanje antitela zasnovano na strukturi antigena (ASAP), je metoda koja kategorizuje veliki broj monoklonskih antitela (mAt) usmerenih protiv istog antigena prema sličnostima profila vezivanja svakog antitela za hemijski ili enzimski modifikovane površine antigena (videti US 2004/0101920). Svaka kategorija može odražavati jedinstveni epitop koji se ili jasno razlikuje ili se delimično preklapa sa epitopom koji predstavlja druga kategorija. Ova tehnologija omogućava brzo filtriranje genetski identičnih antitela, tako da se karakterizacija može fokusirati na genetski različita antitela. Kada se primeni na skrining hibridoma, MAP može olakšati identifikaciju retkih hibridomskih klonova koji proizvode mAt sa željenim karakteristikama. MAP se može koristiti za sortiranje antitela iz predmetnog prikaza u grupe antitela koja vezuju različite epitope.

[0422] Antitela protiv virusa ebole ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu se vezati za epitop unutar bilo kog jednog ili više regiona navedenih u GP virusa ebole, bilo u prirodnom obliku ili rekombinantno proizvedenim, ili za njegov fragment.

[0424] Predmetni prikaz uključuje antitela protiv GP virusa ebole koja se vezuju za isti epitop ili deo epitopa. Slično tome, ovo otkriće takođe uključuje antitela protiv GP virusa ebole koja se takmiče za vezivanje za GP virusa ebole ili njegov fragment sa bilo kojim od specifičnih primernih antitela opisanih ovde. Na primer, ovo otkriće uključuje antitela protiv GPP virusa ebole koja se unakrsno takmiče za vezivanje za virus ebole sa jednim ili više antitela dobijenih od tih antitela opisanih u Tabelama 1 i 2.

[0426] Lako se može utvrditi da li se antitelo vezuje za isti epitop kao, ili se takmiči za vezivanje sa, referentnim anti-ebola GP antitelom iz predmetnog prikaza, korišćenjem rutinskih postupaka poznatih u oblasti tehnike. Na primer, da bi se utvrdilo da li se test antitelo vezuje za isti epitop kao referentno antitelo protiv GP ebole iz otkrića, referentnom antitelu se dozvoljava da se veže za GP virusa ebole ili peptid u uslovima nedovoljne zasićenosti. Zatim se procenjuje sposobnost test antitela da se veže za GP virusa ebole. Ako je test antitelo u stanju da se veže za GP virusa ebole nakon zasićenog vezivanja sa referentnim anti-ebola GP antitelom, može se zaključiti da se test antitelo vezuje za drugačiji epitop od referentnog anti-ebola antitela. S druge strane, ako test antitelo nije u stanju da se veže za GP virusa ebole nakon zasićenog vezivanja sa referentnim anti-ebola GP antitelom, onda se test antitelo može vezati za isti epitop kao i epitop vezan referentnim anti-ebola GP antitelom iz otkrića.

[0428] Da bi se utvrdilo da li je antitelo u kompeticiji za vezivanje sa referentnim anti-ebola virusnim GP antitelom, gore opisana metodologija vezivanja se izvodi u dve orijentacije: U prvoj orijentaciji, referentnom antitelu se dozvoljava da se veže za GP virusa ebole pod uslovima zasićenja, nakon čega sledi procena vezivanja test antitela za GP virusa ebole. U drugoj orijentaciji, test antitelu se dozvoljava da se veže za GP virusa ebole pod uslovima zasićenja, nakon čega sledi procena vezivanja referentnog antitela za GP virusa ebole. Ako je, u obe orijentacije, samo prvo (zasićeno) antitelo sposobno da se veže za GP virusa ebole, onda se zaključuje da se test antitelo i referentno antitelo takmiče za vezivanje za GP virusa ebole. Kao što će razumeti stručnjak u ovoj oblasti, antitelo koje se takmiči za vezivanje sa referentnim antitelom ne mora nužno da se veže za identičan epitop kao referentno antitelo, ali može sterički blokirati vezivanje referentnog antitela vezivanjem preklapajućeg ili susednog epitopa.

[0429] Dva antitela se vezuju za isti ili preklapajući epitop ako svako kompetitivno inhibira (blokira) vezivanje drugog za antigen. To jest, 1-, 5-, 10-, 20- ili 100-struki višak jednog antitela inhibira vezivanje drugog za najmanje 50%, ali poželjno 75%, 90% ili čak 99%, mereno u testu kompetitivnog vezivanja (videti, npr., Junghans et al., Cancer Res. 199050:1495-1502). Alternativno, dva antitela imaju isti epitop ako u suštini sve mutacije aminokiselina u antigenu koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog. Dva antitela imaju preklapajuće epitope ako neke mutacije aminokiselina koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog.

[0431] Dodatna rutinska eksperimentisanja (npr., analize mutacije i vezivanja peptida) mogu se zatim sprovesti kako bi se potvrdilo da li je primećeni nedostatak vezivanja test antitela zapravo posledica vezivanja za isti epitop kao i referentno antitelo ili je sterno blokiranje (ili neki drugi fenomen) odgovorno za nedostatak primećenog vezivanja. Eksperimenti ove vrste mogu se izvesti korišćenjem ELISA, RIA, površinske plazmonske rezonance, protočne citometrije ili bilo kog drugog kvantitativnog ili kvalitativnog testa vezivanja antitela dostupnog u oblasti tehnike.

[0433] Imunokonjugati

[0435] Prikaz obuhvata humano monoklonsko antitelo protiv virusa ebole GP konjugovano sa terapeutskim delom ("imunokonjugat"), kao što je antivirusni lek za lečenje infekcije virusom ebole. Kako se ovde koristi, termin "imunokonjugat" odnosi se na antitelo koje je hemijski ili biološki povezano sa radioaktivnim agensom, citokinom, interferonom, ciljnim ili reporterskim delom, enzimom, peptidom ili proteinom ili terapeutskim sredstvom. Antitelo može biti povezano sa radioaktivnim agensom, citokinom, interferonom, ciljnom ili reporterskom grupom, enzimom, peptidom ili terapeutskim agensom na bilo kojoj lokaciji duž molekula, sve dok je sposobno da se veže za svoju metu. Primeri imunokonjugata uključuju konjugate antitela i lekova i fuzione proteine antitela i toksina. U jednom aspektu, agens može biti drugo različito antitelo na virus ebole ili GP virusa ebole. U određenim aspektima, antitelo može biti konjugovano sa agensom specifičnim za ćeliju zaraženu virusom. Vrsta terapeutskog dela koji može biti konjugovan sa antitelom protiv virusa ebole uzeće u obzir stanje koje se leči i željeni terapeutski efekat koji treba postići. Primeri pogodnih agenasa za formiranje imunokonjugata su poznati u oblasti tehnike; videti na primer, WO 05/103081.

[0437] Multispecifična antitela

[0439] Antitela predmetnog prikaza mogu biti monospecifična, bispecifična ili multispecifična. Multispecifična antitela mogu biti specifična za različite epitope jednog ciljnog polipeptida ili mogu sadržati domene koji vezuju antigen specifične za više od jednog ciljnog polipeptida. Videti, npr., Tutt et al., 1991, J. Immunol.147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol.22:238-244.

[0441] Bilo koji od multispecifičnih molekula koji vezuju antigen predmetnog prikaza, ili njihove varijante, mogu se konstruisati korišćenjem standardnih molekularno-bioloških tehnika (npr., tehnologija rekombinantne DNK i ekspresije proteina), kao što će biti poznato stručnjaku u ovoj oblasti.

[0443] U nekim aspektima, antitela specifična za virus ebole generišu se u bispecifičnom formatu ("bispecifično") u kome su varijabilni regioni koji se vezuju za različite domene virusa ebole povezani zajedno da bi se dobila specifičnost dvostrukog domena unutar jednog molekula za vezivanje.

[0444] Odgovarajuće dizajnirani bispecifični segmenti mogu poboljšati ukupnu efikasnost inhibicije proteina virusa ebole povećanjem i specifičnosti i avidnosti vezivanja. Varijabilni regioni sa specifičnošću za pojedinačne domene (npr., segmenti N-terminalnog domena), ili koji se mogu vezati za različite regione unutar jednog domena, upareni su na strukturnoj skeli koja omogućava svakom regionu da se istovremeno veže za odvojene epitope ili za različite regione unutar jednog domena. U jednom primeru za bispecifični segment, varijabilni regioni teškog lanca (V<H>) iz veziva sa specifičnošću za jedan domen se rekombinuju sa varijabilnim regionima lakog lanca (V<L>) iz niza veziva sa specifičnošću za drugi domen kako bi se identifikovali nesrodni V<L>partneri koji se mogu upariti sa originalnim V<H>bez narušavanja originalne specifičnosti za taj V<H>. Na ovaj način, jedan V<L>segment (npr. V<L>1) može se kombinovati sa dva različita VH domena (npr. V<H>1 i V<H>2) da bi se generisao bispecifični segment sastavljen od dva "kraka" vezivanja (V<H>1-V<L>1 i V<H>2-VL1). Upotreba jednog V<L>segmenta smanjuje složenost sistema i time pojednostavljuje i povećava efikasnost u procesima kloniranja, ekspresije i prečišćavanja koji se koriste za generisanje bispecifičnosti (videti, na primer, USSN13/022759 i US2010/0331527).

[0446] Alternativno, antitela koja se vezuju za više od jednog domena i druge mete, kao što su, ali ne ograničavajući se na, na primer, drugo različito antitelo protiv virusa ebole, mogu se pripremiti u bispecifičnom formatu korišćenjem tehnika opisanih ovde ili drugih tehnika poznatih stručnjacima u ovoj oblasti. Varijabilni regioni antitela koji se vezuju za različite regione mogu biti povezani zajedno sa varijabilnim regionima koji se vezuju za relevantna mesta na, na primer, virusu ebole, da bi se dobila dvostruka antigenska specifičnost unutar jednog molekula za vezivanje. Odgovarajuće dizajnirane bispecifičnosti ove prirode služe dvostrukoj funkciji. Varijabilni regioni sa specifičnošću za ekstracelularni domen kombinovani su sa varijabilnim regionom sa specifičnošću za spoljašnjost van ekstracelularnog domena i upareni su na strukturnoj skeli koja omogućava svakom varijabilnom regionu da se veže za odvojene antigene.

[0448] Primer formata bispecifičnog antitela koji se može koristiti u kontekstu ovog otkrića uključuje upotrebu prvog imunoglobulinskog (Ig) C<H>3 domena i drugog Ig C<H>3 domena, gde se prvi i drugi Ig C<H>3 domen razlikuju jedan od drugog za najmanje jednu aminokiselinu, i gde najmanje jedna razlika u aminokiselini smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela za protein A u poređenju sa bispecifičnim antitelom koje nema razliku u aminokiselini. U jednom aspektu, prvi Ig CH3 domen vezuje protein A, a drugi Ig C<H>3 domen sadrži mutaciju koja smanjuje ili ukida vezivanje za protein A, kao što je H95R modifikacija (prema IMGTexon numeraciji; H435R prema EU numeraciji). Drugi C<H>3 može dalje da sadrži Y96F modifikaciju (prema IMGT; Y436F prema EU). Dalje modifikacije koje se mogu naći unutar drugog C<H>3 uključuju: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M i V82I (od strane IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M i V422I od strane EU) u slučaju IgG1 antitela; N44S, K52N i V82I (IMGT; N384S, K392N i V422I od strane EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q i V82I (od strane IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q i V422I od strane EU) u slučaju IgG4 antitela. Varijacije gore opisanog formata bispecifičnog antitela su razmatrane u okviru predmetnog prikaza.

[0450] [0185] Drugi primeri bispecifičnih formata koji se mogu koristiti u kontekstu predmetnog prikaza uključuju, bez ograničenja, npr., scFv-bazirane bispecifične formate ili diatelo, IgG-scFv fuzije, DVD-Ig sa dvostrukim varijabilnim domenom, Quadroma, „dugmad-u-rupi“, zajednički laki lanac (npr., zajednički laki lanac sa „dugmadima-u-rupi“, itd.), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, leucinski patentni zatvarač, Duobody, IgG1/IgG2, Fab sa dvostrukim dejstvom (DAF)-IgG i Mab2 bispecifične formate (videti, npr., Klein et al. 2012, mAbs4:6,1-11, i reference navedene tamo, za pregled gore navedenih formata). Bispecifična antitela se takođe mogu konstruisati korišćenjem konjugacije peptid/nukleinska kiselina, npr. gde se neprirodne aminokiseline sa ortogonalnom hemijskom reaktivnošću koriste za generisanje konjugata antitela i oligonukleotida specifičnih za mesto, koji se zatim samoorganizuju u multimerne komplekse sa definisanim sastavom, valencijom i geometrijom. (Videti, npr., Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: 4. decembar 2012]).

[0452] Terapijske primene i formulacije

[0454] Pronalazak obezbeđuje terapeutske kompozicije koje sadrže GP antitela protiv virusa ebole ili njihove antigen-vezujuće fragmente predmetnog prikaza. Terapeutske kompozicije u skladu sa pronalaskom će se primenjivati sa odgovarajućim nosačima, ekscipijentima i drugim sredstvima koja su ugrađena u formulacije kako bi se obezbedio poboljšani prenos, isporuka, tolerancija i slično. Mnoštvo odgovarajućih formulacija može se naći u formularu poznatom svim farmaceutskim hemičarima: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ove formulacije uključuju, na primer, praškove, paste, masti, želee, voskove, ulja, lipide, vezikule koje sadrže lipide (katjonske ili anjonske) (kao što je LIPOFECTIN™), DNK konjugate, bezvodne apsorpcione paste, emulzije ulje-u-vodi i voda-u-ulju, emulzije karbovaksa (polietilen glikoli različitih molekulskih težina), polučvrste gelove i polučvrste smeše koje sadrže karbovaks. Videti takođe Powell et al. „Compendium of excipients for patient formulations“ PDA(1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

[0456] Doza antitela može varirati u zavisnosti od starosti i veličine subjekta kome se daje, ciljane bolesti, stanja, načina primene i slično. Kada se antitelo ovog otkrića koristi za lečenje bolesti ili poremećaja kod odraslog pacijenta, ili za sprečavanje takve bolesti, korisno je primenjivati antitelo ovog otkrića normalno u jednokratnoj dozi od oko 0,1 do oko 60 mg/kg telesne težine, poželjnije oko 5 do oko 60, oko 10 do oko 50 ili oko 20 do oko 50 mg/kg telesne težine. U zavisnosti od težine stanja, učestalost i trajanje tretmana mogu se prilagoditi. U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ovog otkrića može se primenjivati kao početna doza od najmanje oko 0,1 mg do oko 800 mg, oko 1 do oko 500 mg, oko 5 do oko 300 mg ili oko 10 do oko 200 mg, do oko 100 mg ili do oko 50 mg. U određenim aspektima, početna doza može biti praćena primenom druge ili više narednih doza antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen u količini koja može biti približno ista ili manja od one početne doze, pri čemu su naredne doze razdvojene za najmanje 1 dan do 3 dana; najmanje jednu nedelju, najmanje 2 nedelje; najmanje 3 nedelje; najmanje 4 nedelje; najmanje 5 nedelja; najmanje 6 nedelja; najmanje 7 nedelja; najmanje 8 nedelja; najmanje 9 nedelja; najmanje 10 nedelja; najmanje 12 nedelja; ili najmanje 14 nedelja.

[0458] Različiti sistemi za isporuku su poznati i mogu se koristiti za primenu farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska, npr., enkapsulacija u lipozomima, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije sposobne da ekspresuju mutantne viruse, endocitoza posredovana receptorima (videti, npr., Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Postupci unošenja uključuju, ali nisu ograničeni na, intradermalne, transdermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intravenske, subkutane, intranazalne, epiduralne i oralne puteve. Kompozicija se može primeniti bilo kojim pogodnim putem, na primer infuzijom ili bolus injekcijom, apsorpcijom kroz epitelne ili mukokutani prelazi (npr., oralna sluzokoža, rektalna i crevna sluzokoža, itd.) i može se primeniti zajedno sa drugim biološki aktivnim sredstvima. Primena može biti sistemska ili lokalna.

[0459] Farmaceutska kompozicija se takođe može isporučiti u vezikuli, posebno lipozomu (videti, na primer, Langer (1990) Science 249:1527-1533).

[0461] Upotreba nanočestica za isporuku antitela predmetnog prikaza je takođe ovde razmatrana. Nanočestice konjugovane sa antitelima mogu se koristiti i za terapeutske i za dijagnostičke primene. Nanočestice konjugovane sa antitelima i metode pripreme i upotrebe detaljno su opisane od strane Arruebo, M., et al. 2009 ("Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications" in J. Nanomat. Tom 2009, Article ID 439389, 24 stranice, doi: 10.1155/2009/439389). Nanočestice mogu biti razvijene i konjugovane sa antitelima sadržanim u farmaceutskim kompozicijama kako bi ciljale ćelije zaražene virusom. Nanočestice za isporuku lekova su takođe opisane, na primer, u US 8257740 ili US 8246995.

[0463] U određenim situacijama, farmaceutska kompozicija može se isporučiti u sistemu sa kontrolisanim oslobađanjem. U jednom izvođenju, može se koristiti pumpa. U drugom izvođenju, mogu se koristiti polimerni materijali. U drugom obliku, sistem sa kontrolisanim oslobađanjem može se postaviti u blizini cilja kompozicije, čime je potreban samo deo sistemske doze.

[0465] Injekcioni preparati mogu uključivati dozne oblike za intravenske, potkožne, intrakutane, intrakranijalne, intraperitonealne i intramuskularne injekcije, kap po kap infuzije itd. Ovi injekcioni preparati mogu se pripremiti postupcima koji su javno poznati. Na primer, injekcioni preparati mogu se pripremiti, npr., rastvaranjem, suspendovanjem ili emulgovanjem antitela ili njegove soli opisane gore u sterilnom vodenom medijumu ili uljanom medijumu koji se konvencionalno koristi za injekcije. Kao vodeni medijum za injekcije, tu su, na primer, fiziološki rastvor, izotonični rastvor koji sadrži glukozu i druga pomoćna sredstva, itd., koji se mogu koristiti u kombinaciji sa odgovarajućim sredstvom za rastvaranje kao što je alkohol (npr., etanol), polialkohol (npr., propilen glikol, polietilen glikol), nejonski surfaktant [npr., polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilen (50 mol) adukt hidrogenizovanog ricinusovog ulja)], itd. Kao uljani medijum, koriste se, npr., susamovo ulje, sojino ulje, itd., koji se mogu koristiti u kombinaciji sa sredstvom za rastvaranje kao što je benzil benzoat, benzil alkohol, itd. Tako pripremljena injekcija se poželjno puni u odgovarajuću ampulu.

[0467] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može se primeniti subkutano ili intravenozno standardnom iglom i špricem. Pored toga, u pogledu subkutane primene, uređaj za primenu u obliku olovke lako ima primenu u primeni farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska. Takav uređaj za primenu u obliku olovke može biti za višekratnu upotrebu ili za jednokratnu upotrebu. Uređaj za isporuku olovkom za višekratnu upotrebu generalno koristi zamenljivi kartridž koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Kada se sva farmaceutska kompozicija iz kartridža primeni i kartridž se isprazni, prazan kartridž se može lako odbaciti i zameniti novim kartridžom koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Uređaj za isporuku olovkom za jednokratnu upotrebu se zatim može ponovo koristiti. Kod uređaja za isporuku olovkom za jednokratnu upotrebu nema zamenljivog kartridža. Umesto toga, uređaj za isporuku olovkom za jednokratnu upotrebu dolazi unapred napunjen farmaceutskom kompozicijom koja se nalazi u rezervoaru unutar uređaja. Kada se rezervoar isprazni od farmaceutske kompozicije, ceo uređaj se odbacuje.

[0469] [0193] Brojni uređaji za isporuku olovkom za višekratnu upotrebu i autoinjektorom imaju primenu u potkožnoj isporuci farmaceutskog sastava ovog pronalaska. Primeri uključuju, ali svakako nisu ograničeni na, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Velika Britanija), DISETRONIC™ olovka (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Švajcarska), HUMALOG MIX75/25™ olovka, HUMALOG™ olovka, HUMALIN 70/30™ olovka (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II i III (Novo Nordisk, Kopenhagen, Danska), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Kopenhagen, Danska), BD™ olovka (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ i OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Nemačka), da nabrojimo samo neke. Primeri uređaja za jednokratnu upotrebu u obliku olovke za isporuku koji imaju primenu u potkožnoj isporuci farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska uključuju, ali svakako nisu ograničeni na, SOLOSTAR™ olovku (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) i KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICK™ autoinjektor (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Nemačka), EPIPEN (Dey, L.P.) i HUMIRA™ olovku (Abbott Labs, Abbott Park, IL), da nabrojimo samo neke.

[0471] Poželjno je da se farmaceutske kompozicije za oralnu ili parenteralnu upotrebu opisane gore pripremaju u dozne oblike u jediničnoj dozi koja odgovara dozi aktivnih sastojaka. Takvi dozni oblici u jediničnoj dozi uključuju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije itd. Količina sadržanog antitela je generalno oko 5 do oko 500 mg po doznom obliku u jediničnoj dozi; posebno u obliku injekcije, poželjno je da antitelo bude sadržano u oko 5 do oko 100 mg i u oko 10 do oko 250 mg za ostale dozne oblike.

[0473] Terapijske upotrebe antitela

[0475] Antitela predmetnog pronalaska su korisna za lečenje i/ili prevenciju bolesti ili poremećaja ili stanja povezanih sa infekcijom virusom Ebole i/ili za ublažavanje najmanje jednog simptoma povezanog sa takvom bolešću, poremećajem ili stanjem.

[0477] U određenim aspektima, antitela iz prikaza su korisna za lečenje subjekata koji pate od teške i akutne respiratorne infekcije izazvane virusom Ebole. U nekim aspektima, antitela iz prikaza su korisna u smanjenju virusnih titara ili smanjenju virusnog opterećenja kod domaćina. U jednom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen iz prikaza može se primenjivati u terapijskoj dozi pacijentu sa infekcijom virusom Ebole.

[0479] Jedno ili više antitela predmetnog prikaza mogu se primeniti da bi se ublažio ili sprečio ili smanjio stepen ozbiljnosti jednog ili više simptoma ili stanja bolesti ili poremećaja. Antitela se mogu koristiti za ublažavanje ili smanjenje stepena ozbiljnosti najmanje jednog simptoma infekcije virusom ebole, uključujući, ali ne ograničavajući se na, groznicu, glavobolju, umor, gubitak apetita, mijalgiju, dijareju, povraćanje, bol u stomaku, dehidraciju i neobjašnjivo krvarenje.

[0481] Takođe se ovde razmatra upotreba jednog ili više antitela predmetnog prikaza profilaktički kod subjekata koji su u riziku od razvoja infekcije virusom ebole, kao što su imunokompromitovana osoba, zdravstveni radnik, osoba za koju se sumnja da je bila izložena osobi koja nosi virus ebole, osoba koja dođe u fizički kontakt ili blisku fizičku blizinu sa zaraženom osobom, zaposleni u bolnici, farmaceutski istraživač, osoblje za održavanje odgovorno za čišćenje bolničke ustanove ili ustanove u kojoj je lečen pacijent oboleo od ebole, osobe koje su posetile ili planiraju da posete područje ili zemlju za koju se zna ili se sumnja da ima epidemiju virusa ebole ili koje često lete.

[0483] [0199] U daljem aspektu prikaza, predmetna antitela se koriste za pripremu farmaceutske kompozicije za lečenje pacijenata koji pate od infekcije virusom ebole. U drugom aspektu prikaza, predmetna antitela se koriste kao dodatna terapija sa bilo kojim drugim sredstvom ili bilo kojom drugom terapijom poznatom stručnjacima u oblasti tehnike korisnom za lečenje ili ublažavanje infekcije virusom ebole.

[0485] Kombinovane terapije

[0487] Kombinovane terapije mogu obuhvatiti antitelo protiv GP virusa ebole iz predmetnog prikaza i bilo koje dodatno terapeutsko sredstvo koje se može povoljno kombinovati sa antitelom iz predmetnog prikaza ili sa biološki aktivnim fragmentom antitela iz predmetnog prikaza. Antitela iz predmetnog prikaza mogu se sinergistički kombinovati sa jednim ili više lekova ili sredstava koja se koriste za lečenje infekcije virusom ebole.

[0489] Na primer, primeri sredstva za lečenje virusne infekcije mogu uključivati, npr., antivirusni lek, antiinflamatorni lek (kao što su kortikosteroidi i nesteroidni antiinflamatorni lekovi), različito antitelo protiv virusa ebole, vakcinu protiv virusa ebole, ZMapp terapiju, TKM ebola (male interferirajuće RNK koje ciljaju virusnu RNK polimerazu) brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (antisens fosforodiamidatni morfolino oligomeri koji ciljaju gen VP24 virusa ebole), interferone ili bilo koju drugu palijativnu terapiju za lečenje infekcije virusom ebole.

[0491] U nekim aspektima, antitela iz predmetnog prikaza mogu se kombinovati sa drugim terapijskim sredstvom kako bi se smanjilo virusno opterećenje kod pacijenta sa infekcijom virusom ebole ili kako bi se ublažio jedan ili više simptoma infekcije.

[0493] U određenim aspektima, drugo terapijsko sredstvo je drugo različito antitelo ili koktel antitela specifičan za GP virusa ebole, pri čemu različito antitelo ili antitela u koktelu mogu, ali i ne moraju da se vežu za isti epitop ili preklapajući epitop kao antitelo predmetnog prikaza. U određenim aspektima, drugo terapijsko sredstvo je antitelo na različiti protein virusa ebole. Drugo antitelo može biti specifično za jedan ili više različitih proteina virusa ebole iz različitih sojeva virusa. Ovde se razmatra upotreba kombinacije ("koktela") antitela iz predmetnog prikaza sa neutrališućom ili inhibitornom aktivnošću protiv virusa ebole. U nekim aspektima, nekonkurentna antitela mogu se kombinovati i primenjivati kod subjekta kome je to potrebno, kako bi se smanjila sposobnost virusa ebole da pobegne zbog mutacije. U nekim aspektima, antitela koja čine kombinaciju vezuju se za različite nepreklapajuće epitope na GP. Antitela koja čine kombinaciju mogu blokirati vezivanje i/ili ulazak virusa u i/ili fuziju sa ćelijama domaćina. Antitela mogu da interaguju sa GP iz soja EBOV odabranog iz Zaira, Sudana, Bundibuđa ili Obale Slonovače, i kada se koriste sami ili u kombinaciji sa bilo kojim ili više gore navedenih sredstava, mogu neutralisati bilo koji ili više navedenih sojeva virusa ebole.

[0495] Takođe se ovde razmatra upotreba kombinacije antitela protiv virusa ebole (GP) predmetnog prikaza, pri čemu kombinacija sadrži jedno ili više antitela koja nisu u unakrsnoj kompeticiji. U određenim aspektima, kombinacija obuhvata koktel koji sadrži mešavinu od najmanje tri antitela predmetnog prikaza. Antitela unutar koktela mogu se razlikovati po svojoj sposobnosti da neutrališu virus ili ćelije zaražene virusom, ili po svojoj sposobnosti da posreduju u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC), ili po svojoj sposobnosti da se vežu za rastvorljivi glikoprotein (sGP) EBOV.

[0497] [0205] Kako se ovde koristi, termin "u kombinaciji sa" znači da se dodatna terapijski aktivna komponenta(e) može primeniti pre, istovremeno sa ili posle primene najmanje jednog antitela protiv GP virusa ebole prema predmetnom prikazu, ili koktela koji sadrži jedno ili više antitela prema predmetnom prikazu. Termin "u kombinaciji sa" takođe uključuje sekvencijalnu ili istovremenu primenu antitela protiv GP virusa ebole i drugog terapijskog sredstva.

[0499] Dodatna terapijski aktivna komponenta(e) može se primeniti subjektu pre primene antitela protiv GP virusa ebole prema predmetnom prikazu. Na primer, prva komponenta se može smatrati primenjenom "pre" druge komponente ako se prva komponenta primeni 1 nedelju pre, 72 sata pre, 60 sati pre, 48 sati pre, 36 sati pre, 24 sata pre, 12 sati pre, 6 sati pre, 5 sati pre, 4 sata pre, 3 sata pre, 2 sata pre, 1 sat pre, 30 minuta pre, 15 minuta pre, 10 minuta pre, 5 minuta pre ili manje od 1 minuta pre primene druge komponente. U drugim aspektima, dodatna terapijski aktivna komponenta(e) može se primeniti subjektu nakon primene antitela protiv GP virusa ebole prema predmetnom prikazu. Na primer, prva komponenta se može smatrati primenjenom "posle" druge komponente ako se prva komponenta primenjuje 1 minut nakon, 5 minuta nakon, 10 minuta nakon, 15 minuta nakon, 30 minuta nakon, 1 sat nakon, 2 sata nakon, 3 sata nakon, 4 sata nakon, 5 sati nakon, 6 sati nakon, 12 sati nakon, 24 sata nakon, 36 sati nakon, 48 sati nakon, 60 sati nakon, 72 sata nakon primene druge komponente. U još nekim aspektima, dodatna terapeutski aktivna komponenta(e) može se primenjivati subjektu istovremeno sa primenom antitela protiv GP virusa ebole prema predmetnom prikazu. "Istovremena" primena, za potrebe predmetnog prikaza, uključuje, npr., primenu antitela protiv virusa GP ebole i dodatne terapijski aktivne komponente subjektu u jednom doznom obliku ili u odvojenim doznim oblicima koji se primenjuju subjektu u roku od oko 30 minuta ili manje jedan od drugog. Ako se primenjuju u odvojenim doznim oblicima, svaki dozni oblik može se primenjivati istim putem (npr., i antitelo protiv GP virusa ebole i dodatna terapijski aktivna komponenta mogu se primenjivati intravenozno, itd.); alternativno, svaki dozni oblik može se primenjivati različitim putem (npr., antitelo protiv GP virusa ebole može se primenjivati intravenozno, a dodatna terapeutski aktivna komponenta može se primenjivati oralno). U svakom slučaju, primena komponenti u jednoj dozi iz, u odvojenim doznim oblicima istim putem ili u odvojenim doznim oblicima različitim putevima smatra se "istovremenom primenom" za potrebe predmetnog prikaza. Za potrebe predmetnog prikaza, primena antitela protiv GP virusa ebole "pre", "istovremeno sa" ili "posle" (kako su ti termini gore definisani) primene dodatne terapijski aktivne komponente smatra se primenom antitela protiv GP virusa ebole "u kombinaciji sa" dodatnom terapijski aktivnom komponentom.

[0501] Predmetni prikaz obuhvata farmaceutske kompozicije u kojima je antitelo protiv GP virusa ebole iz predmetnog prikaza koformulisano sa jednom ili više dodatnih terapijski aktivnih komponenti kao što je ovde na drugom mestu opisano.

[0503] Režimi davanja

[0505] [0208] Prema određenim aspektima, jedna doza antitela protiv GP virusa ebole iz prikaza (ili farmaceutske kompozicije koja sadrži kombinaciju antitela protiv GP virusa ebole i bilo kog od dodatnih terapijski aktivnih agenasa pomenutih ovde) može se primeniti subjektu kome je to potrebno. Prema određenim aspektima predmetnog prikaza, višestruke doze antitela protiv GP virusa ebole (ili farmaceutske kompozicije koja sadrži kombinaciju antitela protiv GP virusa ebole i bilo kog od dodatnih terapijski aktivnih agenasa pomenutih ovde) mogu se primeniti subjektu tokom definisanog vremenskog perioda. Postupci prema ovom aspektu prikaza obuhvataju sekvencijalno primenjivanje subjektu višestrukih doza antitela protiv GP virusa ebole iz prikaza. Kako se ovde koristi, "sekvencijalno primenjivanje" znači da se svaka doza antitela protiv GP virusa ebole primenjuje subjektu u različitom vremenskom trenutku, npr., različitim danima razdvojenim unapred određenim intervalom (npr., satima, danima, nedeljama ili mesecima). Predmetni prikaz obuhvata postupke koji obuhvataju sekvencijalno davanje pacijentu jedne početne doze antitela protiv GP virusa ebole, nakon čega sledi jedna ili više sekundarnih doza antitela protiv GP virusa ebole, i opciono jedna ili više tercijarnih doza antitela protiv GP virusa ebole.

[0507] Termini "početna doza", "sekundarne doze" i "tercijarne doze" odnose se na vremenski redosled primene antitela protiv GP virusa ebole iz predmetnog prikaza. Dakle, "početna doza" je doza koja se primenjuje na početku režima lečenja (takođe se naziva "osnovna doza"); "sekundarne doze" su doze koje se primenjuju nakon početne doze; a "tercijarne doze" su doze koje se primenjuju nakon sekundarnih doza. Početna, sekundarna i tercijarna doza mogu sadržati istu količinu antitela protiv GP virusa ebole, ali se generalno mogu razlikovati jedna od druge u pogledu učestalosti primene. Međutim, u određenim aspektima, količina antitela protiv GP virusa ebole sadržana u početnoj, sekundarnoj i/ili tercijarnoj dozi varira jedna od druge (npr., podešava se naviše ili naniže po potrebi) tokom toka lečenja. U određenim aspektima, dve ili više (npr., 2, 3, 4 ili 5) doza se primenjuju na početku režima lečenja kao "doze punjenja", nakon čega slede naknadne doze koje se primenjuju ređe (npr., "doze održavanja").

[0509] U određenim primerima aspektima predmetnog prikaza, svaka sekundarna i/ili tercijarna doza se primenjuje 1 do 48 sati (npr., 1,1<1>/<2>, 2, 2%, 3, 3%, 4, 4%, 5, 5%, 6, 6%, 7, 7%, 8, 8%, 9, 9%, 10,10%, 11,11%, 12,12%, 13, 13%, 14,14%, 15, 15%, 16, 16%, 17, 17%, 18, 18%, 19, 19%, 20, 20%, 21, 21%, 22, 22%, 23, 23%, 24, 24%, 25, 25%, 26, 26%, ili više) nakon neposredno prethodne doze. Izraz "neposredno prethodna doza", kako se ovde koristi, znači, u nizu višestrukih primena, dozu antitela protiv GP virusa ebole, koja se primenjuje pacijentu pre primene sledeće doze u nizu bez međudoza.

[0511] Postupci prema ovom aspektu prikaza mogu obuhvatiti primenu pacijentu bilo kog broja sekundarnih i/ili tercijarnih doza antitela protiv GP virusa ebole. Na primer, u određenim aspektima, pacijentu se daje samo jedna sekundarna doza. U drugim aspektima, pacijentu se daju dve ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više) sekundarnih doza. Slično tome, u određenim aspektima, pacijentu se daje samo jedna tercijarna doza. U drugim aspektima, pacijentu se daju dve ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više) tercijarnih doza.

[0513] U određenim aspektima predmetnog prikaza, učestalost kojom se sekundarne i/ili tercijarne doze primenjuju kod pacijenta može varirati tokom režima lečenja. Učestalost primene takođe može biti prilagođena tokom lečenja od strane lekara u zavisnosti od potreba pojedinačnog pacijenta nakon kliničkog pregleda.

[0515] Dijagnostičke upotrebe antitela

[0517] Antitela protiv GP virusa ebole iz predmetnog prikaza mogu se koristiti za detekciju i/ili merenje virusa ebole u uzorku, npr., u dijagnostičke svrhe. Neki aspekti prikaza predviđaju upotrebu jednog ili više antitela iz predmetnog prikaza u testovima za detekciju bolesti ili poremećaja kao što je virusna infekcija. Primeri dijagnostičkih testova za virus ebole mogu obuhvatiti, npr., kontaktiranje uzorka, dobijenog od pacijenta, sa antitelom protiv GP virusa ebole iz predmetnog prikaza, pri čemu je antitelo protiv GP virusa ebole obeleženo detektabilnom oznakom ili reporterskim molekulom ili se koristi kao ligand za hvatanje za selektivnu izolaciju virusa ebole iz uzoraka pacijenata.

[0518] Alternativno, neobeleženo antitelo protiv GP virusa ebole može se koristiti u dijagnostičkim primenama u kombinaciji sa sekundarnim antitelom koje je samo detektabilno obeleženo. Detektabilna oznaka ili reporterski molekul može biti radioizotop, kao što su<3>H,<14>C,<32>P,<35>S, or<125>I; fluorescentni ili hemiluminescentni ostatak kao što je fluorescein izotiocijanat, ili rodamin; ili enzim kao što je alkalna fosfataza, p-galaktozidaza, peroksidaza rena ili luciferaza. Specifični primeri testova koji se mogu koristiti za detekciju ili merenje virusa ebole u uzorku uključuju enzimski povezani imunosorbentni test (ELISA), radioimunološki test (RIA) i sortiranje ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS).

[0520] Uzorci koji se mogu koristiti u dijagnostičkim testovima virusa ebole prema predmetnom prikazu uključuju bilo koji uzorak tkiva ili tečnosti koji se može dobiti od pacijenta, a koji sadrži detektabilne količine virusa ebole ili njegovih fragmenata, pod normalnim ili patološkim uslovima. Generalno, nivoi virusa ebole u određenom uzorku dobijenom od zdravog pacijenta (npr., pacijenta koji nije pogođen bolešću povezanom sa virusom ebole) biće mereni kako bi se inicijalno utvrdio osnovni, ili standardni, nivo virusa ebole. Ovaj osnovni nivo virusa ebole se zatim može uporediti sa nivoima virusa ebole izmerenim u uzorcima dobijenim od osoba za koje se sumnja da imaju stanje povezano sa virusom ebole ili simptome koji su u vezi sa takvim stanjem.

[0522] Antitela specifična za virus ebole mogu da ne sadrže dodatne oznake ili ostatke, ili mogu da sadrže N-terminalnu ili C-terminalnu oznaku ili ostatak. U jednom aspektu, oznaka ili ostatak je biotin. U testu vezivanja, lokacija oznake (ako postoji) može odrediti orijentaciju peptida u odnosu na površinu na kojoj je peptid vezan. Na primer, ako je površina obložena avidinom, peptid koji sadrži N-terminalni biotin biće orijentisan tako da će C-terminalni deo peptida biti distalan u odnosu na površinu.

[0524] PRIMERI

[0526] Sledeći primeri su dati kako bi se onima koji su stručnjaci u ovoj oblasti pružio potpun pregled i opis kako se prave i koriste postupci i kompozicije pronalaska, i nisu namenjeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom. Uloženi su napori da se obezbedi tačnost u pogledu korišćenih brojeva (npr., količine, temperatura itd.), ali treba uzeti u obzir neke eksperimentalne greške i odstupanja. Osim ako nije drugačije naznačeno, delovi su delovi po težini, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperatura je u stepenima Celzijusa, sobna temperatura je oko 25°C, a pritisak je na ili blizu atmosferskog.

[0528] Primer 1: Dobijanje humanih antitela na virus ebole

[0530] [0217] Humana antitela na virus ebole generisana su u mišu koji sadrži DNK koja kodira varijabilne regione teškog i kapa lakog lanca humanog imunoglobulina. U jednom aspektu, humana antitela na virus ebole generisana su u mišu VELOCIMMUNE®. U jednom aspektu, miševi VelocImmune® (VI) su imunizovani DNK koja kodira GP virusa ebole pune dužine [Zaire ebolavirus 2014 (GenBank: KJ660346.2)]. Antitela su generisana nakon ubrzanog režima koji se sastoji od 2 imunizacije razdvojene sa 2 nedelje. Imuni odgovor antitela praćen je imunološkim testom specifičnim za GP virusa ebole. Na primer, serumi su testirani na specifične titre antitela na prečišćeni GP virusa ebole pune dužine, proteine GP podjedinica (GP1 i GP2) i čestice slične virusu (VLP) koje ekspresuju GP virusa Ebole. Klonovi koji proizvode antitela izolovani su korišćenjem tehnologije sortiranja B-ćelija (BST) i postupaka hibridoma. Na primer, kada je postignut željeni imuni odgovor, splenociti su sakupljeni i spojeni sa ćelijama mišjeg mijeloma kako bi se sačuvala njihova vitalnost i formirale ćelijske linije hibridom. Ćelijske linije hibridoma su izložene skriningu i odabrane da bi se identifikovale ćelijske linije koje proizvode antitela specifična za GP virus ebole. Koristeći ovu tehniku i različite imunogene opisane gore, dobijeno je nekoliko himernih antitela (tj., antitela koja poseduju humane varijabilne domene i mišje konstantne domene); primerna antitela generisana na ovaj način označena su kao H1M17354N, H2aM17356N, H1M17357N, H2aM17358N, H2aM17359N i H2aM17360N.

[0531] Antitela protiv virusa ebole su takođe izolovana direktno iz antigen-pozitivnih mišjih B ćelija bez fuzije sa ćelijama mijeloma, kao što je opisano u američkom patentu 7582298. Korišćenjem ove metode, dobijeno je nekoliko potpuno humanih GP antitela protiv virusa ebole (tj., antitela koja poseduju humane varijabilne domene i humane konstantne domene); primerna antitela generisana na ovaj način označena su kao H1H17134P, H1H17139P, H1H17142P, H1H17151P, H1H17161P, H1H17162P, H1H17193P, H1H17196P, H1H17199P, H1H17203P, H1H17214P, H1H17219P, H1H17223P i H1H17228P.

[0532] Biološka svojstva primernih antitela generisanih u skladu sa metodama ovog primera detaljno su opisana u primerima navedenim u nastavku.

[0533] Primer 2: Aminokiselinske i nukleotidne sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca [0220] Tabela 1 prikazuje identifikatore aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog i lakog lanca i CDR-ova odabranih antitela protiv virusa ebole opisanih ovde. Odgovarajući identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina navedeni su u Tabeli 2.

[0534] Tabela 1: Identifikatori aminokiselinskih sekvenci

[0536]

[0537]

[0539] Tabela 2: Identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina

[0540]

[0542] (nastavak)

[0544]

[0545]

[0548] Antitela se ovde tipično nazivaju prema sledećoj nomenklaturi: prefiks Fc (npr. "H1H", "H2M" itd.), nakon čega sledi numerički identifikator (npr. "17139", "17161" itd., kao što je prikazano u Tabeli 1 ili 2), a zatim sufiks "P", "P2", "N", N2 ili "B". Prefiksi H1H i H2M na oznakama antitela koje se ovde koriste ukazuju na određeni izotip Fc regiona antitela. Dakle, prema ovoj nomenklaturi, antitelo se ovde može nazivati, npr., "H1H17359N", "H2aM17359N" itd. Na primer, antitelo "H1M" ima mišji IgG1 Fc, a antitelo "H2M" ima mišji IgG2 Fc (a ili b izotip) (svi varijabilni regioni su potpuno humani, što je označeno prvim "H" u oznaci antitela). Kao što će biti jasno osobi stručnoj u ovoj oblasti, antitelo koje ima određeni Fc izotip može se pretvoriti u antitelo sa različitim Fc izotipom (npr. antitelo sa mišjim IgG1 Fc može se pretvoriti u antitelo sa ljudskim IgG4, itd.), ali u svakom slučaju, varijabilni domeni (uključujući CDR) - koji su označeni numeričkim identifikatorima prikazanim u Tabeli 1 ili 2 - ostaće isti, a očekuje se da će svojstva vezivanja za antigen biti identična ili značajno slična bez obzira na prirodu Fc domena.

[0550] Primer 3: Vezivanje antitela za GP virusa ebole određeno površinskom plazmonskom rezonancom

[0552] A. Konstanta brzine disocijacije zavisna od pH na 37°C

[0554] [0222] Konstante brzine disocijacije vezivanja (k<d>) i poluživoti disocijacije (t<1>/<2>) za vezivanje GP virusa ebole za prečišćena monoklonska antitela protiv GP virusa ebole na 37°C određeni su korišćenjem biosenzorskog testa površinske plazmonske rezonance u realnom vremenu na Biacore T200 instrumentu. Površina CM4 Biacore senzora je derivatizovana aminskim kuplovanjem sa monoklonskim mišjim anti-humanim Fc antitelom (GE, # BR-1008-39) ili monoklonskim kozjim antimišjim Fc antitelom (GE, # BR-1008-38) radi hvatanja prečišćenih monoklonskih antitela protiv GP virusa ebole. Sve studije vezivanja Biacore-a u Primeru 3A su sprovedene u puferu sastavljenom od 0,01 M Na<2>HPO<4>/NaH<2>PO<4>, 0,15 M NaCl, 0,05% v/v surfaktanta P20 (PBS-P pufer za rad) pri pH vrednostima 7,4, 6,0 i 5,0. Testiranje niskog pH je sprovedeno da bi se procenilo da li antitela održavaju vezivanje pri niskom pH. Ovo bi imitiralo uslove sa kojima će se virus susresti tokom fuzije membrane, nakon zakiseljavanja endozoma. Različite koncentracije GP virusa ebole sa C-terminalnom polihistidinskom oznakom (EbolaGP.his; Sino Biologicals, kataloški broj 40442-V08B1) pripremljene u PBS-P puferu za rad (u rasponu od 90 nM do 11,1 nM, trostruka razblaženja) su ubrizgane preko površine zarobljene GP monoklonalnim antitelima protiv virusa ebole brzinom protoka od 25 µL/minuti. Asocijacija GP virusa ebole sa zarobljenim monoklonskim antitelom praćena je 5 minuta, a disocijacija GP virusa ebole u PBS-P puferu praćena je 6 minuta. Svi eksperimenti sa konstantama brzine disocijacije izvedeni su na 37°C. Konstante brzine kinetičke disocijacije (k<d>) određene su uklapanjem senzograma u realnom vremenu u model vezivanja 1:1 korišćenjem softvera za uklapanje krive Scrubber 2.0c. Vremena poluživota disocijacije (t<1>/<2>) izračunata su iz kinetičkih konstanti brzine kao:

[0557]

[0560] Parametri brzine disocijacije za vezivanje GP virusa ebole za prečišćena mAt protiv GP virusa ebole na 37°C prikazani su u Tabeli 3.

[0562] Tabela 3: Zavisnost poluživota disocijativnog poluživota od pH vrednosti na 37°C

[0565]

[0566] (nastavak)

[0569]

[0572] B. Afinitet vezivanja i kinetike na 25°C i 37°C

[0574] Konstante disocijacije ravnoteže (K<D>vrednosti) za vezivanje GP virusa ebole za prečišćena anti-ebola GP monoklonska antitela određena su korišćenjem biosenzora površinske plazmonske rezonance u realnom vremenu sa Biacore 4000 instrumentom. Površina CM4 Biacore senzora je derivatizovana aminskim kuplovanjem sa monoklonskim mišjim anti-humanim Fc antitelom (GE, # BR-1008-39) ili monoklonskim kozjim anti-mišjim Fc antitelom (GE, # BR-1008-38) radi hvatanja prečišćenih anti-ebola GP monoklonalnih antitela. Sve studije vezivanja Biacore-a u Primeru 3B su sprovedene u puferu sastavljenom od 0,01M HEPES pH 7,4, 0,15M NaCl, 3mM EDTA, 0,05%v/v surfaktanta P20 (HBS-ET pufer za rad). Različite koncentracije GP virusa ebole sa C-terminalnom polihistidinskom oznakom (Sino Biologicals, kataloški broj 40442-V08B1) pripremljene u HBS-ET puferu za rad (u rasponu od 90 nM do 3,3 nM, trostruka razblaženja) ubrizgane su preko površine zarobljene monoklonskim antitelom protiv GP virusa ebole brzinom protoka od 30 µL/minuti. Asocijacija GP virusa ebole sa zarobljenim monoklonskim antitelom praćena je 5 minuta, a disocijacija GP virusa ebole u HBS-ET puferu za rad praćena je 10 minuta. Svi eksperimenti kinetike vezivanja izvedeni su na 25°C i 37°C. Konstante brzine kinetičke asocijacije (ka) i disocijacije (kd) određene su uklapanjem senzorograma u realnom vremenu u model vezivanja 1:1 korišćenjem softvera za uklapanje krivih Scrubber2.0c. Konstante ravnoteže disocijacije vezivanja (KD) i vreme poluživota disocijacije (t<1>/<2>) izračunate su iz kinetičkih konstanti brzine kao:

[0577]

[0580] i

[0581] Parametri kinetika vezivanja GP virusa ebole za prečišćeno mAt na GP protiv virusa ebole na 25°C i 37°C su prikazani na Tabelama 4A i 4B.

[0582] Tabela 4A: Kinetike vezivanja na 25°C

[0584]

[0586] (nastavak)

[0588]

[0589]

[0591] Tabela 4B Kinetike vezivanja na 37°C.

[0592]

[0593]

[0596] Rezultati

[0598] Kao što je prikazano u Tabelama 4A i 4B iznad, antitela se vezuju za GP virusa ebole sa K<D>sa vrednostima u opsegu od 934pM do 1890nM na 25°C i od 227pM do 2310nM na 37°C. Na pH 7.4, antitela pokazuju vrednosti disocijacije poluživota (t<1>/<2>) u opsegu od 3.0 minuta do više od 1155 minuta na 25°C i od 2.0 minuta do više od 1155 minuta na 37°C. Nije uočen gubitak vezivanja pri niskoj pH. Nekoliko antitela je pokazalo povećane vrednosti disocijacije poluživota (t<1>/<2>) na niskoj pH u odnosu na pH 7.4. Antitela sa 3-strukim ili većim povećanjima u vrednostima disocijacije poluživota (t<1>/<2>) na pH 5 i/ili pH 6 obuhvataju H1H17162P, H1H17177P, H1H17150P, H1H17151P, H1H17160P, H1H17161P, H1H17141P, H1H17139P, H1H17210P, H1H17203P, H1H17199P, H1M17348N , H1M17350N , H2aM17360N i H2aM17361N.

[0600] Primer 4: Dobijanje pseudočestica virusa ebole i studije neutralizacije

[0602] Pseudočestice virusa ebole (takođe pozante kao virusu slične čestice, ili VLPs) generisane su kotransfekcijom 293T ćelija sa smešom plazmidnih konstrukata koji eksprimiraju GP virusa ebole, HIV gag-pol, i HIV provirusni vektor koji kodira luciferazu svica. Supernatanti koji sadrže pseudočestice virusa ebole su sakupljene 48 sati nakon infekcije, izbistrene centrifugom, alikvotirane i zamrznute na -80°C. Kontrolne pseudočestice su dobijene supstituisanjem plazmida koji eksprimira GP virusa ebole sa plazmidom koji kodira glikoprotein vezikularnog virusa stomatitisa (VSVg).

[0604] Test neutralizacije zasnovan na pseudočestici ebole

[0606] Pseudočestice koje su dobijene kao što je gore opisano ispitane su u testovima neutralizacije. Specifično, razblaženja antitela su inkubirana sa pseudočesticama virusa ebole tokom 1h na sobnoj temperaturi. Huh7 ćelije su odlepljene pomoću 0.02M EDTA, isprane i inkubirane sa smešama antitelo/ pseudočestica tokom 72h. Efikasnost infekcije je kvantifikovana detekcijom luciferaze sa BrightGlo® testom luciferaze (Promega, San Luis Obispo, CA, USA) i očitana u Victor® X3 čitaču ploča (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) za svetlosnu proizvodnju.

[0607] Tabela 5: Zair 2014 VLP Neutralizacija

[0610]

[0613] Podaci koji su prikazani gore u Tabeli 5 pokazuju da 14 od 20 ovde prikazanih antitela protiv virusa ebole, upotrebom ovde opisanog eksperimentalnog dizajna, potentno neutrališu infektivnost sa IC<50>opsega od oko 10<-11>M do oko 10<-9>M.

[0615] Primer 5: Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) sa antitelima protiv virusa ebole

[0617] Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) testirana je sposobnošću antitela da signaliziraju putem reporter sistema zasnovanog na CD16 (Promega ADCC reporter bioassay core kit, San Luis Obispo, CA, USA). Ćelije 293 koje eksprimiraju GP virusa ebole su zasejane. Dan kasnije, dodata su razblažena antitela proizvedena u fuc-ćelijskim linijama (videti američki patent br.8409838) i efektorske ćelije (odnos efektora i cilja 1,5:1) i inkubirane preko noći. Aktivnost reportera je merena BioGlo® luciferaznim testom (Promega, San Luis Obispo, Kalifornija, SAD) i očitana u Victor® X3 čitaču ploča (Perkin Elmer, Voltam, Masačusets, SAD) za produkciju svetlosti.

[0618] Tabela 6: ADCC Rezultati

[0621]

[0624] Sposobnost antitela da posreduju u ADCC izračunata je na osnovu aktivnosti u poređenju sa izotipskom (negativnom) kontrolom. Bilo koja vrednost veća od 5 puta iznad negativne kontrole smatrana je pozitivnom. Podaci iznad u Tabeli 6 pokazuju da je 17 od 20 antitela protiv virusa ebole posredovalo u ADCC.

[0626] Primer 6: Unakrsna kompeticija okteta

[0628] [0232] Konkurencija vezivanja između monoklonskih antitela protiv GP virusa ebole, za koja je prethodno utvrđeno da se vezuju za GP virusa ebole, određena je korišćenjem bio-slojne interferometrije (BLI) u realnom vremenu, bez obeležavanja, na Octet HTX biosenzoru (ForteBio Corp., odeljenje Pall Life Sciences). Vezivanje relevantnih kontrola za rastvorljivi GP (sGP), GP1 ili GP2, mereno je u istom formatu testa, a njegov odgovor je oduzet od reagensa GP virusa ebole od interesa za svako testirano monoklonalno antitelo (mt). Čitav eksperiment je izveden na 25°C u puferu koji se sastojao od 0,01M HEPES pH 7,4, 0,15M NaCl, 3mM EDTA, 0,05%v/v surfaktanta P20, 1,0mg/mL BSA (Octet HBS-ET pufer) uz mućkanje ploče brzinom od 1000 o/min. Da bi se procenilo da li dva antitela mogu da budu u kompeticiji sa drugim za vezivanje za svoje odgovarajuće epitope na GP virusa ebole eksprimiranom sa C-terminalnom polihistidinskom oznakom (GP virusa ebole, Sino Biologicals Inc., takođe videti GenBankAHX24649.1 i SEQID NO: 314), približno ~1,0 nm GP virusa ebole je prvo zarobljeno na Octet biosenzorima obloženim anti-penta-His antitelom (Fortebio Inc, # 18-5079) potapanjem biosenzora na 3 minuta u bunariće koji sadrže 20 µg/mL rastvora GP virusa ebole. Biosenzori zarobljeni antigenom su zatim zasićeni prvim monoklonskim antitelom protiv GP virusa ebole (kasnije nazvanim mAt-1) potapanjem u bunariće koji sadrže 50 µg/mL rastvor mAt-1 na 5 minuta. Biosenzori su zatim potopljeni u bunariće koji sadrže rastvor od 50 µg/mL drugog monoklonskog antitela protiv virusa ebole GP (kasnije nazvanog mAt-2) tokom 3 minuta. Svi biosenzori su isprani u Octet HBS-ET puferu između svakog koraka eksperimenta. Odgovor vezivanja u realnom vremenu praćen je tokom eksperimenta i zabeležen je odgovor vezivanja na kraju svakog koraka. Upoređen je odgovor vezivanja mAt-2 za GP virusa ebole prethodno kompleksovan sa mAt-1 i određeno je kompetitivno/nekompetitivno ponašanje različitih monoklonskih antitela protiv GP virusa ebole koristeći prag inhibicije od 50%. Tabela 7 eksplicitno definiše odnose antitela koja su u kompeticiji u oba smera, nezavisno od redosleda vezivanja.

[0630] Kao što je prikazano u Tabeli 7, kolona sa leve strane prikazuje mAt1 antitela koja su uhvaćena pomoću AHC Octet biosenzora, a kolona sa desne strane prikazuje antitela (mAt2) koja su u unakrsnoj kompeticiji sa mAt1 antitelom.

[0632] Tabela 7: Unakrsna kompeticija antitela na GR virusa ebole za vezivanje sa GP virusa ebole

[0635]

[0636]

[0638] (nastavak)

[0639]

[0640]

[0642] (nastavak)

[0643]

[0644]

[0647] Primer 7: Sekvencijalno vezivanje H1H17203P, H1H17139P i H1H17161P za glikoprotein virusa ebole

[0649] Koristeći informacije dobijene iz eksperimenata unakrsne kompeticije, sprovedena je sekvencijalna studija vezivanja kako bi se utvrdilo da li su tri pojedinačna kandidatska antitela sposobna da se istovremeno vežu za rastvorljivi glikoprotein (GP) virusa ebole, čime se potvrđuje da su mesta vezivanja na GP virusa ebole nezavisna za svako monoklonsko antitelo. Ako je tako, ove informacije bi podržale upotrebu ovih antitela u terapijskom koktelu.

[0651] Shodno tome, eksperimenti sekvencijalnog vezivanja za tri monoklonska antitela protiv virusa ebole GP na GP virusa ebole, H1H17203P, H1H17139P i H1H17161P, testirani su na nezavisno i nekonkurentno vezivanje za GP virusa ebole. Ovaj eksperiment je sproveden korišćenjem interferometrije bio-sloja (BLI) u realnom vremenu, bez obeležavanja, na Octet RED biosenzoru (ForteBio Corp., odeljenje Pall Life Sciences). Čitav eksperiment je izveden na 25°C u puferu koji se sastojao od 0,01M HEPES pH 7,4, 0,15M NaCl, 3mM EDTA, 0,05%v/v surfaktanta P20, 1,0mg/mL BSA (Octet HBS-ET pufer) sa pločom koja se tresla brzinom od 1000 o/min. Da bi se procenilo da li su tri antitela sposobna da se istovremeno vežu za zarobljeni antigen GP virusa ebole eksprimiran sa C-terminalnom polihistidinskom oznakom (GP.his virusa ebole, Sino Biologicals), približno ~0,6 nm GP.h virusa ebole je prvo zarobljeno na Octet biosenzorima obloženim anti-penta-His antitelima (Fortebio Inc, # 18-5079) potapanjem biosenzora na 3 minuta u bunariće koji sadrže 20µg/mL rastvor GP.h virusa ebole. Biosenzori zarobljeni antigenom su zatim zasićeni prvim monoklonskim antitelom GP virusa ebole (kasnije nazvanim H1H17161P) potapanjem u bunariće koji sadrže 50µg/mL rastvor REGN H1H17161P tokom 5 minuta. Biosenzori su zatim potopljeni u bunariće koji su sadržali rastvor od 50 µg/mL drugog monoklonskog antitela protiv virusa ebole GP (kasnije nazvanog H1H17139P) tokom 5 minuta. Konačno, 50 µg/mL trećeg antitela (kasnije nazvanog H1H17161P) je ubrizgano tokom 5 minuta da bi se dostiglo zasićenje. Odgovor vezivanja u realnom vremenu je praćen tokom eksperimenta i zabeležen je odgovor vezivanja na kraju svakog koraka.

[0653] Rezultati

[0655] [0236] Tri kandidatska monoklonska antitela koja su testirana bila su sposobna da se istovremeno vežu za glikoprotein ebolavirusa, što ukazuje da svako antitelo nije ometalo mesto vezivanja na glikoproteinu ebolavirusa drugih testiranih antitela, što sugeriše da se svako od njih vezalo ili interagovalo sa različitim epitopima. Ovo podržava ulogu upotrebe ova tri antitela u terapijskom koktelu antitela.

[0657] Primer 8: Vezivanje antitela protiv ebole na različite sojeve virusa sličnih česticama (VLP)

[0659] Sprovedena je studija kako bi se utvrdilo da li će GP antitela protiv virusa ebole reagovati sa virusom sličnim česticama (VLP) koje sadrže GP iz drugih sojeva virusa ebole. U ovu studiju su uključene VLP koje sadrže GP iz Bundibugjo NC_014373, Obala Slonovače FJ217162, Sudan NC_006432, Zair.1995, Zair.2014AY354458 i negativna kontrola, VSV glikoprotein (VSVg). Studija je sprovedena korišćenjem "MesoScale Discovery" (MSD), tehnologije koja omogućava vezivanje/fiksaciju VLP soja ebole (koji ekspresuju glikoproteine ebole/površinske proteine virusa) za ugljeničnu površinu, nakon čega je sledio ELISA test vezivanja. Cilj je bio da se identifikuju profili vezivanja monoklonskih antitela u odnosu na različite sojeve ebole.

[0661] Test je sproveden na polipropilenskim mikropločama sa 96 bunarića tako što je prvo pripremljeno razblaženje 1:10 supernatanata iz različitih VLP-ova/bunariću (kao što je navedeno u sledećoj tabeli) i dodavanje razblaženja u PBS (50 µl/bunariću) i inkubiranje na 4°C preko noći.

[0663] Tečnost u bunarićima je odbačena, nakon čega je blokirana sa 150 µl/bunariću u PBS 2% BSA i inkubirana jedan sat na sobnoj temperaturi. Sadržaj svakog bunarića je zatim odbačen, a bunarići su isprani PBS-om koristeći AquaMax2000 perač ploča namenjen za MSD. Pedeset mikrolitara primarnog antitela je razblaženo u PBS 1% BSA i inkubirano na sobnoj temperaturi uz mućkanje srednjom brzinom (5). Sadržaj bunarića je zatim odbačen, a ploče su isprane PBS-om. Pedeset mikrolitara sulfo-TAG reagensa za detekciju (humani ili mišji Fc) u koncentraciji od 1 µg/ml u PBS 0,5% BSA dodato je u svaki bunarić i inkubirano na sobnoj temperaturi jedan sat uz mućkanje srednjom brzinom (5). Sadržaj bunarčića je odbačen, a ploče su isprane sa PBS 0,5% BSA. U svaki bunarić je dodato 150 µl 1X pufera za čitanje bez surfaktanta i ploče su očitane na SECTORImager6000 sa bar-koda.

[0665] Rezultati, koji su prikazani u Tabeli 8 ispod, pokazuju da se sva testirana antitela protiv virusa ebole vezuju za VLP-ove koji sadrže GP-ove iz Zaira 2014 i Zaira 1995. Određena od testiranih antitela vezuju se za VLP-ove koji sadrže GP-ove iz drugih sojeva virusa ebole, pored vezivanja za dva soja Zaira navedena u Tabeli 8. Konkretno, pored vezivanja za VLP-ove koji sadrže GP-ove iz Zaira 2014 i Zaira 1995, antitela protiv virusa ebole označena kao H1H17161P i H1H17162P vezuju se za VLP-ove koji sadrže GP-ove iz sojeva Sudan i Bundibuđo, dok se antitela protiv virusa ebole označena kao H2aM17356N i H1H17142P vezuju za sojeve Bundibuđo i Obale Slonovače.

[0667] Tabela 8: Unakrsna reaktivnost antitela protiv virusa ebole sa GP-ovima iz različitih sojeva virusa ebole

[0669]

[0670]

[0673] (nastavak)

[0675]

[0678] Primer 9. In vitro neutralizacija živog/infektivnog virusa ebole (EBOV)

[0680] [0241] Antitela označena kao H1H17203P, H1H17139P i H1H17161P analizirana su na njihovu sposobnost neutralizacije infektivnog EBOV u Vero ćelijama. Vero ćelije su zasejane na ploče sa 384 bunarića u DMEM-10% FBS i ostavljene su da rastu do približno 75% konfluencije na 37°C. H1H17203P, H1H17139P i H1H17161P su razblaženi kako je naznačeno. EBOV sojevi (Mayinga, Kikwit, Makona i Mayinga adaptirani zamorčićima) su odmrznuti i razblaženi na odgovarajući način do MOI između 0,01-0,1. Komercijalno dostupno anti-EBOV antitelo označeno kao KZ52 korišćeno je kao pozitivna kontrola. (Vidi Marujama, T. i dr., J Virol 73, 6024-6030 (1999). Antitela su inkubirana sa virusom 1 sat na 37°C. Smeša antitela/virusa je zatim dodata u prethodno zasejane ćelije i ploče su inkubirane na 37°C tokom 24 sata. Nakon perioda inkubacije, ploče su uklonjene iz inkubatora i inaktivirane potapanjem u 10% neutralni puferovani formalin, stavljene u termički zatvorenu kesu i čuvane na 4°C preko noći u BSL-4. Ploče su isprane 3 puta u 1X-PBS i ćelije su permeabilizovane na sobnoj temperaturi (RT) sa 25 µl 0,1% Triton X-100 u 1X-PBS tokom 15-20 minuta. Triton-X je odbačen, a ploče su blokirane sa 3,5% BSA u 1X-PBS tokom 1 sata na ST. Ploče su tretirane preko noći na 4°C sa primarnim antitelom protiv EBOV GP 4F3 (videti IBT BIOSERVICES za mišje monoklonsko antitelo protiv EBOV GP 4F3, kataloški broj 0201-020) razblaženo 1:1500 u 1X-PBS. Ploče su isprane u 1X-PBS tokom 10-15 minuta i ponovljeno dva puta. Ćelije su inkubirane 1 sat sa konjugovanim anti-mišjim sekundarnim antitelom Alexa-fluor-488. Sekundarno antitelo je odbačeno, a ploče su isprane u 1X-PBS tokom 10-15 minuta i ponovljeno dva puta. Ploče su inkubirane sa 25 µl/bunarčiću Hoehsta (1:50,000 u 1X-PBS) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su snimljene fluorescentnom mikroskopijom korišćenjem plavih i zelenih fluorescentnih kanala.

[0682] Rezultati

[0684] Rezultati, prikazani na Slici 1, pokazali su da je antitelo H1H17161P neutralisalo živi virus i bilo je snažnije od pozitivnog kontrolnog antitela KZ52, ali antitela označena kao H1H17203P i H1H17139P nisu delovala kao neutralizatori.

[0686] Primer 10: Vezivanje anti-ebola antitela za rastvorljivi GP (sGP)

[0688] Četvrti gen u EBOV genomu kodira dva jedinstvena proteina, nestrukturni, dimerni sekretovani glikoprotein, nazvan sGP, i trimerni, virion-pričvršćeni, glikoprotein omotača (GP). Ova dva GP dele prvih 295 aminokiselina, ali imaju jedinstvene C-terminuse. Da bi se utvrdilo da li se vodeća mAt iz Regeneron-a vezuju za sGP, interno je proizveden rekombinantni sGP.mmh protein (SEQ ID NO: 317). Biosenzor Octet HTX zasnovan na interferometriji korišćen je da bi se utvrdilo da li se monoklonska antitela H1H17203P, H1H17139P, H1H17161P mogu vezati za sGP.mmh protein ebole. Format testa je uključivao hvatanje H1H17203P, H1H17139P, H1H17161P na vrhove senzora protiv hFc, nakon čega je usledilo potapanje u 300 nM rastvore ebola GP.10xhis (SEQ ID NO: 318), sGP.mmh (SEQ ID NO: 317) ili hCNTFR (receptor cilijarnog neurotrofičnog faktora.mmh, koji je protein negativne kontrole). Svako mAt je hvatano na nivou između 0,94 i 1,36 nm.

[0690] Kao što je prikazano na slici 2, sva mAt su pokazala specifično vezivanje za ebola GP.10xhis i nevezivanje za protein negativne kontrole; dok je samo H1H17139 pokazao specifično vezivanje za ebola sGP.mmh. Ovo otkriće sugeriše da se vezujući epitop H1H17139 verovatno nalazi u zajedničkom regionu unutar prvih 295 aminokiselina i sGP i GP; dok druga monoklonska antitela verovatno prepoznaju samo C-terminus ebola GP.

[0692] Primer 11: Vezivanje dodatnih antitela protiv GP EBOV za ebola GP.h, ebola GP rastorljivi.mmh i hCNTFR.mmh

[0694] [0245] Dalja studija je sprovedena kako bi se odredile karakteristike vezivanja dodatnih ovde opisanih antitela protiv GP EBOV; posebno, studija je sprovedena kako bi se utvrdila sposobnost ovih dodatnih antitela da se vežu za rastvorljivi GP i GP. Ova studija je sprovedena korišćenjem bio-slojne interferometrije (BLI) u realnom vremenu, bez obeležavanja, na biosenzoru Oktet HTX (ForteBio Corp., A Division of Pall Life Sciences). Čitav eksperiment je izveden na 25°C u puferu koji se sastojao od 0,01M HEPES pH 7,4, 0,15M NaCl, 3mM EDTA, 0,05% v/v surfaktanta P20, 1,0 mg/mL BSA (Octet HBS-ET pufer) uz potresanje ploče brzinom od 1000 o/min. Da bi se procenilo da li su antitela sposobna da se vežu za ebola sGP ili druge ebola GP reagense, približno ~1,0nm anti-ebola GP mAt je zarobljeno na Octet biosenzorima obloženim anti-humanim Fc (Fortebio Inc, # 18-5064) antitelima potapanjem biosenzora na 3 minuta u bunariće koji sadrže 20µg/mL rastvora mAt. Biosenzori zarobljeni mAt testirani su na vezivanje za odabrane proteinske reagense potapanjem u bunariće koji sadrže 300nM rastvore ebola GP proteina ili irelevantne kontrole na 5 minuta. Svi biosenzori su isprani u Octet HBS-ET puferu između svakog koraka eksperimenta. Odgovor vezivanja u realnom vremenu je praćen tokom trajanja eksperimenta i zabeležen je odgovor vezivanja na kraju svakog koraka.

[0696] Rezultati

[0698] Kao što je prikazano u Tabeli 9, svaka vrednost ispod 0,10 nm utvrđena je kao antitelo koje se ne vezuje. Na osnovu dosadašnjih rezultata, sva testirana antitela osim jednog (H1H17360N) pokazala su vezivanje za EBOV GP pune dužine, a trinaest od dvadeset testiranih antitela pokazalo je vezivanje za rastvorljivi GP (sGP).

[0700] Tabela 9: Vezivanje antitela protiv GP-ebola za ebola GP.h., ebola GP rastvorljivi.mmh, i hCNTFR.mmh

[0702]

Claims

1. Patentni zahtevi

<1.>Farmaceutska kompozicija koja sadrži prvo izolovano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za virus ebole (EBOV), gde prvo izolovano monoklonsko antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26 varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR); dalje sadrži drugo izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se specifično vezuje za EBOV, pri čemu drugo izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HCVR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 66 i LCVR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 74;

i dalje sadrži treće izolovano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za EBOV, pri čemu treće izolovano monoklonsko antitelo sadrži HCVR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 146 i LCVR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 154;

gde HCVR od svakog prvog i trećeg izolovanih monoklonskih antitela je povezan sa konstantnim domenom humanog IgG1.

<2.>Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1 za upotrebu u postupku sprečavanja, lečenja ili ublažavanja najmanje jednog simptoma EBOV infekcije, ili smanjenja učestalosti ili težine najmanje jednog simptoma EBOV infekcije, pri čemu postupak obuhvata davanje navedene farmaceutske kompozicije subjektu kome je to potrebno, opciono gde:

(a) najmanje jedan simptom je izabran iz grupe koja se sastoji od groznice, glavobolje, umora, gubitka apetita, mijalgije, dijareje, povraćanja, bolova u stomaku, dehidracije i neobjašnjivog krvarenja; ili

(b) farmaceutska kompozicija se primenjuje profilaktički ili terapijski subjektu kome je to potrebno, kao što je subjekt koji pati od infekcije EBOV-a ili subjekt koji mu je izložen, ili u riziku od izlaganja EBOV-u, ili od sticanja infekcije EBOV-a, pri čemu je subjekt izabran iz grupe koja se sastoji od imunokompromitovane osobe, zdravstvenog radnika, osobe za koju se sumnja da je bila izložena osobi koja nosi virus ebole, osobe koja dolazi u fizički kontakt ili blisku fizičku blizinu sa zaraženom osobom, zaposlenog u bolnici, farmaceutskog istraživača, osoblja za održavanje odgovornog za čišćenje bolničke ustanove ili ustanove u kojoj je lečen pacijent oboleo od ebole, pojedinaca koji su posetili ili planiraju da posete područje ili zemlju za koju se zna ili se sumnja da ima epidemiju virusa ebole i čestog letača.

<3.>Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, pri čemu se navedena farmaceutska kompozicija primenjuje u kombinaciji sa drugim terapijskim sredstvom, opciono pri čemu je

drugo terapijsko sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od antivirusnog leka, antiinflamatornog leka (npr., kortikosteroida i nesteroidnih antiinflamatornih lekova), različitog antitela za EBOV, vakcine za EBOV, TKM ebole (male interferirajuće RNK koje ciljaju virusnu RNK polimerazu), brincidofovira (CMX-001), favipiravira (T-705), BCX-4430, AVI-7537

(antisens fosforodiamidatni morfolino oligomeri koji ciljaju gen VP24 virusa ebole) i interferona; i/ili

pri čemu se farmaceutska kompozicija primenjuje subkutano, intravenozno, intradermalno, intramuskularno, intranazalno ili oralno.

<4.>Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1 za upotrebu u postupku povećanja preživljavanja ili verovatnoće preživljavanja subjekta koji pati od infekcije EBOV-om, ili subjekta izloženog EBOV-u, ili u riziku od izlaganja ili sticanja EBOV-a, pri čemu metod obuhvata davanje navedenog farmaceutskog sastava subjektu kome je to potrebno, opciono gde:

(a) farmaceutska kompozicija se primenjuje profilaktički ili terapeutski subjektu kome je to potrebno; i/ili

(b) subjekt kome je to potrebno i koji je u riziku od izlaganja ili sticanja EBOV infekcije je izabran iz grupe koja se sastoji od imunokompromitovane osobe, zdravstvenog radnika, osobe za koju se sumnja da je bila izložena osobi koja nosi virus ebole, osobe koja dolazi u fizički kontakt ili blisku fizičku blizinu sa zaraženom osobom, zaposlenog u bolnici, farmaceutskog istraživača, osoblja za održavanje odgovornog za čišćenje bolničke ustanove ili ustanove u kojoj je lečen pacijent oboleo od ebole, pojedinaca koji su posetili ili planiraju da posete područje ili zemlju za koju se zna ili se sumnja da ima epidemiju virusa ebole i čestog letača; i/ili

(c) farmaceutska kompozicija se primenjuje u kombinaciji sa drugim terapijskim sredstvom, kao što je drugo terapijsko sredstvo koje je izabrano iz grupe koja se sastoji od antivirusnog leka, antiinflamatornog leka (npr. kortikosteroidi i nesteroidni antiinflamatorni lekovi), različitog antitela protiv EBOV, vakcine protiv EBOV, TKM Ebole (male interferirajuće RNK koje ciljaju virusnu RNK polimerazu), brincidofovira (CMX-001), favipiravira (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (antisens fosforodiamidatni morfolino oligomeri koji ciljaju gen VP24 virusa Ebole) i interferona; i/ili

(d) farmaceutska kompozicija se primenjuje subkutano, intravenozno, intradermalno, intramuskularno, intranazalno ili oralno.

<5.>Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1 za upotrebu u postupku neutralizacije infektivnog EBOV-a ili inhibiranja ulaska EBOV-a u ćeliju kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata davanje navedenog farmaceutskog sastava subjektu kome je to potrebno;

opciono gde:

(b) subjekt kome je to potrebno je izabran iz grupe koja se sastoji od imunokompromitovane osobe, zdravstvenog radnika, osobe za koju se sumnja da je bila izložena osobi koja nosi virus ebole, osobe koja dolazi u fizički kontakt ili blisku fizičku blizinu sa zaraženom osobom, zaposlenog u bolnici, farmaceutskog istraživača, osoblja za održavanje odgovornog za čišćenje bolničke ustanove ili ustanove u kojoj je lečen pacijent oboleo od ebole, pojedinaca

koji su posetili ili planiraju da posete područje ili zemlju za koju se zna ili se sumnja da ima epidemiju virusa ebole i čestog letača; i/ili

<6.>Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1, gde HCVR drugog izolovanog monoklonskog antitela je povezano sa konstantnim domenom humanog IgG1.