RS67792B1

RS67792B1 - Radio-obeležena anti-pd-l1 antitela za imuno-pet snimanje

Info

Publication number: RS67792B1
Application number: RS20260231A
Authority: RS
Inventors: Marcus Kelly; Dangshe Ma; William Olson; Gavin Thurston
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2016-12-01
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2026-03-31
Also published as: MX2019006448A; MA46952B1; EP3548515A1; JP7105235B2; ES3061799T3; SMT202600053T1; MX389083B; US20200345872A1; HRP20260291T1; EP4649966A3; MD3548515T2; PT3548515T; KR20190101975A; IL324632A; PH12019501146A1; US20260151521A1; US12053534B2; CL2019001483A1; WO2018102682A1; EP4649966A2

Description

[0001] Opis

[0003] OBLAST

[0005] Ovo otkriće se odnosi na radioobeležena anti-PD-L1 antitela i njihovu upotrebu u imuno-PET snimanju.

[0007] OSNOVA

[0009] [0002] Programirani ligand smrti 1 (PD-L1) (takođe nazvan B7-H1 ili CD274) je ligand proteinskog receptora od 290 aminokiselina koji se široko eksprimira i na limfoidnim i na nelimfoidnim tkivima kao što su CD4 i CD8 T-ćelije, ćelije makrofagne linije, periferna tkiva, kao i na tumorskim ćelijama i ćelijama zaraženim virusom (Dong et al 1999, Nature Med.). PD-L1 se vezuje za receptore PD-1 i B7-1 koji pripadaju porodici CD28/CTLA-4 (citotoksični T limfocitni antigen)/ICOS (inducibilni kostimulator) T-ćelijskih ko-inhibitornih receptora (Chen et al 2013, Nature Rev. Immunol. 13: 227-242) i smanjuje imuni odgovor inhibiranjem aktivacije T-ćelija. Vezivanje PD-L1 za PD-1 ili B7-1 dovodi do smanjene proliferacije T-ćelija i lučenja citokina, ugrožavajući humoralne i ćelijske imune odgovore kod bolesti kao što su kancer i virusna infekcija. Ekspresiju PD-L1 na tumorskim ćelijama i ćelijama zaraženim virusom koriste tumori i hronične virusne infekcije da bi izbegli imuni odgovor. PD-L1 se eksprimira na širokom spektru tumora, a studije na životinjskim modelima su pokazale da PD-L1 na tumorima inhibira aktivaciju T-ćelija i lizu tumorskih ćelija i može dovesti do povećane smrti tumor-specifičnih T-ćelija. Kod hroničnih virusnih infekcija, PD-L1 eksprimiran na ćelijama inficiranim virusom vezuje se za PD-1 na virus-specifičnim T-ćelijama i ove T-ćelije postaju „iscrpljene“ gubitkom efektorskih funkcija i proliferativnog kapaciteta (Freeman 2008, PNAS 105: 10275-10276). Sistem PD-1:PD-L1 takođe igra važnu ulogu u indukovanom razvoju T-regulatornih (Treg) ćelija i u održavanju funkcije Treg ćelija (Francisco et al 2010, Imunol. Rev. 236: 219-242). Blokiranje PD-L1 antagonistima, uključujući monoklonska antitela, proučavano je u lečenju kancera i hroničnih virusnih infekcija (Ribas 2012, NEJM 366: 2517-2519; Freeman 2008, PNAS 105: 10275-10276; Sheridan 2012, Nature Biotechnology 30: 729-730).

[0010] Imuno-pozitronska emisiona tomografija (PET) je dijagnostički alat za snimanje koji koristi monoklonska antitela obeležena pozitronskim emiterima, kombinujući ciljna svojstva antitela sa osetljivošću kamera pozitronske emisione tomografije. Videti, npr., Oncologist, 12: 1379 (2007)); Journal of Nuclear Medicine, 52(8): 1171 (2011)). Imuno-PET omogućava vizuelizaciju i kvantifikaciju akumulacije antigena i antitela in vivo i, kao takav, može poslužiti kao važan alat za dijagnostiku i komplementarnu terapiju. Na primer, imuno-PET može pomoći u odabiru potencijalnih pacijenata kandidata za određenu terapiju, kao i u praćenju lečenja. Den Li et al otkrivaju antitela protiv PD-L1 konjugovana sa 89Zr.

[0011] Pošto su se i PD1 i PD-L1 pojavili kao mete za imunoterapiju, potrebni su dijagnostički alati za anti-PD1 i/ili anti-PD-L1 terapiju, uključujući, inter alia, dijagnostičke alate koji omogućavaju otkrivanje odgovarajućih pacijenata kandidata za navedenu terapiju.

[0013] KRATAK REZIME

[0015] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje radioobeleženi konjugat antitela koji sadrži izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, a koji se vezuje za monomerni ligand humane programske smrti 1 (PD-L1), helatni deo i emiter pozitrona, gde:

[0017] (i) antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca, HCDR1, HCDR2 i HCDR3, i tri regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca, LCDR1, LCDR2 i LCDR3, gde HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 84; HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86; HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88; LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 92; LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 94; i LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 96; (ii) helatni deo sadrži desferioksamin; i

[0018] (iii) emiter pozitrona je<89>Zr.

[0020] Pronalazak takođe obezbeđuje postupke snimanja tkiva koje eksprimira PD-L1, pri čemu postupci obuhvataju primenu radioobeleženog konjugata anti-PD-L1 antitela pronalaska na tkivo; i vizuelizaciju ekspresije PD-L1 pozitronsko-emisionom tomografijom (PET).

[0021] U nekim aspektima, subjektu se daje doza od 5 mg, ili 10 mg, ili 20 mg, radioobeleženog konjugata anti-PD-L1 antitela.

[0022] Pronalazak takođe obezbeđuje inhibitor signalne ose PD-1/PD-L1 za upotrebu u postupku za lečenje tumora, gde je inhibitor signalne ose PD-1/PD-L1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, ili anti-PD-L1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu navedeni postupak obuhvata: (a) odabir pacijenta sa solidnim tumorom; (b) utvrđivanje da je solidni tumor PD-L1-pozitivan davanjem radioobeleženog konjugata antitela pronalaska subjektu; i snimanje lokalizacije radioobeleženog konjugata antitela u tumoru pomoću pozitronsko-emisione tomografije (PET), gde prisustvo radioobeleženog konjugata antitela u tumoru ukazuje da je tumor PD-L1-pozitivan; i (c) davanje jedne ili više doza inhibitora signalne ose PD-1/PD-L1 subjektu kome je to potrebno, a za koga je utvrđeno da ima PD-L1-pozitivan solidni tumor. Svako pozivanje na postupke lečenja ili dijagnoze koje se primenjuju na ljudskom ili životinjskom telu, uključujući postupke snimanja i praćenja efikasnosti antitumorske terapije, tumači se kao supstance i kompozicije za upotrebu u takvim postupcima.

[0023] Pronalazak obezbeđuje postupke za praćenje efikasnosti antitumorske terapije kod subjekta, pri čemu postupci obuhvataju davanje radioaktivno obeleženog konjugata pronalaska subjektu; i vizuelizaciju lokalizacije PD-L1 pomoću PET snimanja.

[0025] KRATAK OPIS SLIKA

[0027]

[0028] Slika 1 prikazuje SDS-PAGE i SEC nemodifikovanog anti-PD-L1 antitela i anti-PD-L1 DFO modifikovanog antitela.

[0029] Slika 2A i 2B prikazuju radio-SEC-HPLC nakon<89>Zr radioobeležavanje za Studiju 1.

[0030] Slika 3 prikazuje radio-SEC-HPLC DFO-konjugata (anti-PD-L1) nakon<89>Zr radioobeležavanja za Studiju 2.

[0031] Slika 4 prikazuje radio-SEC-HPLC SEC nakon<89>Zr radioobeležavanja Studija 3.

[0032] Slika 5 prikazuje UV280-SEC-HPLC hromatogram i radio-iTLC trag nakon<89>Zr radioobeležavanja za Studiju 1.

[0033] Slika 6A, 6B, 6C, i 6D prikazuju ekspresiju hPD-L1 pomoću ćelijskih linija tumora MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1<Tg>(Slika 6A), LOX-IMVI (Slika 6B), MDA-MB-231 (Slika 6C), i SK-Br-3 (Slika 6D) in vitro, kao što je opisano u Primeru 5 ovde.

[0034] Slika 7 pokazuje ekspresiju hPD-L1 pomoću MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1<Tg>i LOX-IMVI tumorske ćelije sa ili bez tretmana interferonom-gama in vitro u drugom eksperimentu, kao što je opisano u Primeru 5 ovde.

[0035] Slika 8 prikazuje hromatograme generisane SEC-HPLC analizom korišćenjem uzoraka iz radioimunokonjugatnih preparata<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitela konjugata za studije prikazane u A, B, D i E, i radioimunokonjugata za kontrolu izotipa<89>Zr-DFO-IgG4za studije prikazane u C i F. Hromatogrami za apsorbancu na 280 nm su prikazani u A-C, a radio-hromatogrami za intenzitet γ-emisije su prikazani u D-F. U A-C, takođe je detektovano eluiranje komponenti pufera. Ovi pikovi soli u puferu uzorka (vreme zadržavanja >25 min, zvezdica "*") su isključeni iz integracije površina pikova. Pikovi su označeni da bi se naznačili HMW (visoka molekulska težina) imunokonjugat („1“), monomerni imunokonjugat („2“), neinkorporisani<89>Zr („3“) i soli u puferu za uzorke; ;Skraćenice: mAU = milijedinice apsorbance; cps = broj impulsa u sekundi.;[0036] Slika 9 obezbeđuje ex vivo podatke o biodistribuciji za<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata u PD-1hu/hu-PD-L1hu/hu miševima. Šesnaest miševa (2 grupe od po 8 životinja) dobilo je jednu intravensku dozu od 50 µCi (1 mg/kg)<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata na dan 0 i žrtvovani su na dan 6 (crne kolone) ili na dan 10 (sive kolone) nakon doziranja. Krv, prikupljena putem srčane punkcije, i naznačena sakupljena tkiva su izmereni i određena je radioaktivnost. Vrednosti procenta ubrizgane doze po gramu (%ID/g) za pojedinačne uzorke prikupljene 6. ili 10. dana izračunate su u odnosu na radioaktivnost standardne doze iz ubrizganog materijala (<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugat) i težine pojedinačnih uzoraka. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ±SD.;[0038] DETALJAN OPIS;[0040] I. Definicije;[0042] Osim ako nije drugačije definisano ovde, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što ga obično shvata stručnjak u oblasti kojoj pripada otkriveni predmet.;[0043] [0012] Termin „PD-L1“ odnosi se na programirani ligand smrti 1, takođe poznat kao CD274 i B7H1. Aminokiselinska sekvenca PD-L1 pune dužine data je u GenBank pod pristupnim brojem NP_054862.1. Termin „PD-L1“ takođe uključuje proteinske varijante PD-L1. Termin „PD-L1“ uključuje rekombinantni PD-L1 ili njegov fragment. Termin takođe obuhvata PD-L1 ili njegov fragment povezan sa, na primer, histidinskim tagom, mišjim ili humanim Fc, ili signalnom sekvencom kao što je ROR1. Na primer, termin uključuje sekvence koje sadrže mišji Fc (mlgG2a) ili humani Fc (hlgG1) na C-terminusu, povezan sa aminokiselinskim ostacima 19-239 PD-L1 pune dužine (NP_054862.1). Proteinske varijante sadrže histidinski tag na C-terminusu, povezanu sa aminokiselinskim ostacima 19-239 NP_054862.1. Osim ako nije naznačeno da potiče od vrste koja nije humana, termin „PD-L1“ označava humani PD-L1. PD-L1 je protein od 290 aminokiselina sa ekstracelularnim domenima sličnim IgV i IgC (aminokiseline 19-239 pune dužine PD-L1), transmembranskim domenom i intracelularnim domenom od približno 30 aminokiselina. PD-L1 se konstitutivno eksprimira na mnogim ćelijama kao što su ćelije koje prikazuju antigen (npr., dendritske ćelije, makrofagi i B-ćelije) i na hematopoetskim i nehematopoetskim ćelijama (npr., vaskularne endotelne ćelije, pankreasna ostrvca i privilegovana imunološka mesta). PD-L1 se takođe eksprimira na širokom spektru tumora i ćelijama zaraženim virusom i komponenta je imunosupresivnog okruženja (Ribas 2012, NEJM 366: 2517-2519). PD-L1 se vezuje za jedan od dva T-ćelijska ko-inhibitora PD-1 i B7-1.;[0044] Termin „PD-1“ odnosi se na protein programirane smrti-1, ko-inhibitor T-ćelija, takođe poznat kao CD279. Aminokiselinska sekvenca PD-1 pune dužine data je u GenBank pod pristupnim brojem NP_005009.2. Termin takođe obuhvata PD-1 ili njegov fragment povezan sa, na primer, histidinskim tagom, mišjim ili humanim Fc, ili signalnom sekvencom kao što je ROR1. Na primer, termin uključuje sekvence koje sadrže mišji Fc (mlgG2a) ili humani Fc (hlgG1) na C-terminusu, povezan sa aminokiselinskim ostacima 25-170 NP_005009.2 sa C93S promenom. PD-1 je član CD28/CTLA-4/ICOS porodice ko-inhibitora T-ćelija. PD-1 je protein od 288 aminokiselina sa ekstracelularnim N-terminusnim domenom koji je sličan IgV, transmembranskim domenom i intracelularnim domenom koji sadrži inhibitorni motiv zasnovan na tirozinu imunoreceptora (ITIM) i motiv prekidača zasnovan na tirozinu imunoreceptora (ITSM) (Chattopadhyay et al 2009, Imunol. Rev.). PD-1 receptor ima dva liganda, PD-L1 i PD-L2.;[0045] Termin „B7-1“ odnosi se na antigen aktivacije T-limfocita, takođe poznat kao kostimulatorni faktor CD80. B7-1 je membranski receptor od 288 aminokiselina sa ekstracelularnim N-terminusnim domenom koji obuhvata IgV-slične (aminokiseline 37-138) i IgC-slične (aminokiseline 154-232) regione, transmembranski domen (aminokiseline 243-263) i C-terminusni intracelularni region (aminokiseline 263-288). Aminokiselinska sekvenca B7-1 pune dužine data je u GenBank kao pristupni broj NP_005182.1.;[0046] Kako se ovde koristi, termin „ko-inhibitor T-ćelija“ odnosi se na ligand i/ili receptor koji modulira imuni odgovor putem aktivacije ili supresije T-ćelija. Termin „ko-inhibitor T-ćelija“, takođe poznat kao molekul ko-signalnih T-ćelija, obuhvata, ali nije ograničen na, PD-1, protein gena 3 za aktivaciju limfocita (LAG-3, takođe poznat kao CD223), citotoksični antigen T-limfocita-4 (CTLA-4), atenuator B i T limfocita (BTLA), CD-28, 2B4, LY108, imunoglobulin T-ćelija i mucin-3 (TIM3), imunoreceptor T-ćelija sa imunoglobulinom i ITIM (TIGIT; takođe poznat kao VSIG9), receptor 1 sličan imunoglobulinu povezan sa leukocitima (LAIR1; takođe poznat kao CD305), inducibilni kostimulator T-ćelija (ICOS; takođe poznat kao CD278), B7-1 (CD80) i CD160.;[0047] Termin „antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na molekule imunoglobulina sastavljene od četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. (tj. „kompletni molekuli antitela“), kao i njihovi multimeri (npr. IgM) ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca („HCVR“ ili „V<H>“) i konstantni region teškog lanca (sastavljen od domena C<H>1, C<H>2 i C<H>3). Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca („LCVR ili „V<L>“) i konstantni region lakog lanca (C<L>). V<H>i V<L>regioni se mogu dalje podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazvane regioni koji određuju komplementarnost (CDR), ispresecane sa regionima koji su konzervativniji, nazvanim okvirni regioni (FR). Svaki V<H>i V<L>je sastavljen od tri CDR i četiri FR, raspoređenih od amino-terminusa do karboksi-terminusa sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. U određenim primerima izvođenja, FR antitela (ili njegovi fragmenti koji vezuju antigen) mogu biti identični sekvencama humane germinativne linije ili mogu biti prirodno ili veštački modifikovani. Konsenzusna sekvenca aminokiselina može se definisati na osnovu uporedne analize dva ili više CDR.;[0048] Takođe je moguća supstitucija jednog ili više CDR ostataka ili izostavljanje jednog ili više CDR. U naučnoj literaturi su opisana antitela u kojima se jedan ili dva CDR mogu izostaviti za vezivanje. Padlan et al (1995 FASEB J.9:133-139) analizirali su kontaktne regione između antitela i njihovih antigena, na osnovu objavljenih kristalnih struktura, i zaključili da samo oko jedna petina do jedna trećina CDR ostataka zapravo kontaktira antigen. Padlan je takođe pronašao mnoga antitela u kojima jedan ili dva CDR nisu imala aminokiseline u kontaktu sa antigenom (videti takođe, Vajdos et al 2002 J Mol Biol 320:415-428).;[0049] [0018] CDR ostaci koji ne kontaktiraju antigen mogu se identifikovati na osnovu prethodnih studija (na primer, ostaci H60-H65 u CDRH2 često nisu potrebni), iz regiona Kabat CDR koji se nalaze izvan Chothia CDR, molekularnim modeliranjem i/ili empirijski. Ako se CDR ili njegov(i) ostatak (ostaci) izostave, obično se supstituišu aminokiselinom koja zauzima odgovarajuću poziciju u drugoj sekvenci humanog antitela ili konsenzusom takvih sekvenci. Pozicije za supstituciju unutar CDR i aminokiseline za supstituciju takođe se mogu odabrati empirijski. Empirijske supstitucije mogu biti konzervativne ili nekonzervativne supstitucije.;[0050] [0019] Potpuno humana monoklonska antitela protiv PD-L1 opisana ovde mogu da sadrže jednu ili više supstitucija, insercija i/ili delecija aminokiselina u okviru i/ili CDR regiona varijabilnih domena teškog i lakog lanca u poređenju sa odgovarajućim sekvencama germinativne linije. Takve mutacije se mogu lako utvrditi poređenjem sekvenci aminokiselina opisanih ovde sa sekvencama germinativne linije dostupnim, na primer, iz javnih baza podataka sekvenci antitela. Ovo otkriće uključuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji su izvedeni iz bilo koje od sekvenci aminokiselina opisanih ovde, gde je jedna ili više aminokiselina unutar jedne ili više okvira i/ili CDR regiona mutirana u odgovarajući (odgovarajuće) ostatak (ostatke) sekvence germinativne linije iz koje je antitelo izvedeno, ili u odgovarajući (odgovarajuće) ostatak (ostatke) druge humane sekvence germinativne linije, ili u konzervativnu supstituciju aminokiselina odgovarajućeg (odgovarajućih) ostatka (ostataka) germinativne linije (takve promene sekvenci se ovde zajednički nazivaju „mutacije germinativne linije“). Prosečan stručnjak u ovoj oblasti, počevši od sekvenci varijabilnog regiona teškog i lakog lanca opisanih ovde, može lako da proizvede brojna antitela i fragmente koji vezuju antigen koji sadrže jednu ili više pojedinačnih mutacija germinativne linije ili njihovih kombinacija. U određenim aspektima ovog otkrića, svi ostaci okvira i/ili CDR unutar V<H>i/ili V<L>domeni se mutiraju nazad do ostataka koji se nalaze u originalnoj germinativnoj sekvenci iz koje je antitelo izvedeno. U drugim aspektima, samo određeni ostaci se mutiraju nazad do originalne germinativne sekvence, npr., samo mutirani ostaci pronađeni u prvih 8 aminokiselina FR1 ili u poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili samo mutirani ostaci pronađeni u CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim aspektima, jedan ili više ostataka okvira i/ili CDR su mutirani u odgovarajući (odgovarajuće) ostatak (ostatke) različite sekvence germinativne linije (tj. sekvenca germinativne linije koja se razlikuje od sekvence germinativne linije iz koje je antitelo prvobitno izvedeno). Dodatno, antitela ovog otkrića mogu sadržati bilo koju kombinaciju dve ili više mutacija germinativne linije unutar okvira i/ili CDR regiona, npr., gde su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene sekvence germinativne linije, dok su određeni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne sekvence germinativne linije zadržani ili su mutirani u odgovarajući ostatak druge sekvence germinativne linije. Jednom dobijena, antitela i fragmenti koji vezuju antigen i koji sadrže jednu ili više mutacija germinativne linije mogu se lako testirati na jedno ili više željenih svojstava, kao što su poboljšana specifičnost vezivanja, povećan afinitet vezivanja, poboljšana ili pojačana antagonistička ili agonistička biološka svojstva (u zavisnosti od slučaja), smanjena imunogenost itd. Antitela i fragmenti koji vezuju antigen dobijeni na ovaj opšti način obuhvaćeni su ovim otkrićem.;[0051] Ovo otkriće takođe uključuje potpuno humana monoklonska antitela protiv PD-L1 koja sadrže varijante bilo koje od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinske sekvence opisane ovde, koje imaju jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, ovo otkriće uključuje anti-PD-L1 antitela koja imaju HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinske sekvence sa, npr., 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje, itd. konzervativne supstitucije aminokiselina u odnosu na bilo koju od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci opisanih ovde.;[0052] Termin „humano antitelo“, kako se ovde koristi, treba da obuhvati antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz sekvenci humanih germinativnih imunoglobulina. Humana monoklonska antitela (mAb) iz ovog otkrića mogu da sadrže ostatke aminokiselina koje nisu kodirane sekvencama humanih germinativnih imunoglobulina (npr. mutacije uvedene slučajnom ili lokalno specifičnom mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR, a posebno u CDR3. Međutim, termin „humano antitelo“, kako se ovde koristi, nije namenjen da uključi mAb u kojima CDR sekvence potiču iz germinativne linije druge vrste sisara (npr., miš), su graftovane na humane FR sekvence.;[0053] [0022] Termin „multispecifični molekuli koji vezuju antigene“, kako se ovde koristi, odnosi se na bispecifične, trispecifične ili multispecifične molekule koji vezuju antigene i njihove fragmente koji vezuju antigene. Multispecifični molekuli koji vezuju antigene mogu biti specifični za različite epitope jednog ciljnog polipeptida ili mogu sadržati domene koji vezuju antigene specifične za epitope više od jednog ciljnog polipeptida. Multispecifični molekul koji vezuje antigene može biti jedan multifunkcionalni polipeptid ili može biti multimerni kompleks od dva ili više polipeptida koji su kovalentno ili nekovalentno povezani jedan sa drugim. Termin „multispecifični molekuli koji vezuju antigene“ uključuje antitela ovog otkrića koja mogu biti povezana sa ili koeksprimirana sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., drugi peptid ili protein. Na primer, antitelo ili njegov fragment može biti funkcionalno povezan (npr., hemijskim spajanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnim povezivanjem ili na drugi način) sa jednim ili više drugih molekularnih entiteta, kao što je protein ili njegov fragment, da bi se proizveo bispecifični ili multispecifični molekul koji vezuje antigen sa drugom specifičnošću vezivanja. Prema ovom otkriću, termin „multispecifični molekuli koji vezuju antigen“ takođe uključuje bispecifična, trispecifična ili multispecifična antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen. U određenim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića je funkcionalno povezano sa drugim antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen da bi se proizvelo bispecifično antitelo sa drugom specifičnošću vezivanja. Bispecifična i multispecifična antitela ovog otkrića su opisana na drugom mestu ovde.;[0054] Termin „specifično se vezuje“ ili „specifično se vezuje za“ ili slično, znači da antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen formira kompleks sa antigenom koji je relativno stabilan pod fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje može se okarakterisati ravnotežnom konstantom disocijacije od najmanje oko 1x10<-8>M ili manje (npr., manja K<D>označava čvršće vezivanje). Postupci za određivanje da li se dva molekula specifično vezuju dobro su poznati u struci i uključuju, na primer, ravnotežnu dijalizu, površinsku plazmonsku rezonancu i slično. Kao što je ovde opisano, antitela su identifikovana površinskom plazmonskom rezonancom, npr. BIACORE<™>, koja se specifično vezuju za PD-L1. Dodatno, multispecifična antitela koja se vezuju za jedan domen u PD-L1 i jedan ili više dodatnih antigena ili bispecifično koje se vezuje za dva različita regiona PD-L1 se ipak smatraju antitelima koja se „specifično vezuju“, kako se ovde koristi.;[0055] Termini „deo antitela koji vezuje antigen“, „fragment antitela koji vezuje antigen“ i slično, kako se ovde koriste, uključuju bilo koji prirodni, enzimski dostupan, sintetički ili genetski modifikovan polipeptid ili glikoprotein koji se specifično vezuje za antigen i formira kompleks. Termini „fragment antitela koji vezuje antigen“ ili „fragment antitela“, kako se ovde koriste, odnose se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost vezivanja za PD-L1.;[0056] „Izolovano antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo koje je u suštini slobodno od drugih antitela (Ab) koja imaju različite antigenske specifičnosti (npr., izolovano antitelo koje se specifično vezuje za PD-L1, ili njegov fragment, je u suštini bez antitela koja se specifično vezuju za antigene osim PD-L1.;[0057] Termin „površinska plazmonska rezonanca“, kako se ovde koristi, odnosi se na optički fenomen koji omogućava analizu biomolekulskih interakcija u realnom vremenu detekcijom promena u koncentracijama proteina unutar biosenzorske matrice, na primer korišćenjem BIACORE<™>sistema (Pharmacia Biosensor AB, Upsala, Sweden i Piscataway, N. J.).;[0058] Termin „K<D>“ kako se ovde koristi, odnosi se na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije antitelo-antigen.;[0059] [0028] Termin „epitop“ se odnosi na antigensku determinantu koja interaguje sa specifičnim mestom vezivanja antigena u varijabilnom regionu molekula antitela poznatom kao paratop. Jedan antigen može imati više od jednog epitopa. Stoga, različita antitela mogu se vezati za različite oblasti na antigenu i mogu imati različite biološke efekte. Termin „epitop“ se takođe odnosi na mesto na antigenu na koje reaguju B i/ili T ćelije. Takođe se odnosi na region antigena koji je vezan antitelom. Epitopi se mogu definisati kao strukturni ili funkcionalni. Funkcionalni epitopi su generalno podskup strukturnih epitopa i imaju one ostatke koji direktno doprinose afinitetu interakcije. Epitopi takođe mogu biti konformacioni, odnosno sastavljeni od nelinearnih aminokiselina. U određenim primerima izvođenja, epitopi mogu uključivati determinante koje su hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil grupe ili sulfonil grupe, i, u određenim primerima izvođenja, mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja.;[0060] Termin „suštinski identično“ ili „suštinski identičan“, kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, ukazuje da, kada je optimalno poravnata sa odgovarajućim nukleotidnim insercijama ili delecijama sa drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), postoji identičnost nukleotidne sekvence u najmanje oko 90%, a poželjnije najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% nukleotidnih baza, mereno bilo kojim dobro poznatim algoritmom za identičnost sekvence, kao što su FASTA, BLAST ili GAP.;[0061] [0030] Kada se primenjuje na polipeptide, termin „značajna sličnost“ ili „značajno sličan“ znači da dve peptidne sekvence, kada su optimalno poravnate, kao što je to slučaj sa programima GAP ili BESTFIT koristeći podrazumevane težinske vrednosti praznina, dele najmanje 90% identičnosti sekvence, još poželjnije najmanje 95%, 98% ili 99% identičnosti sekvence. Poželjno je da se pozicije ostataka, koje nisu identične, razlikuju konzervativnim supstitucijama aminokiselina. „Konzervativna supstitucija aminokiselina“ je ona u kojoj je ostatak aminokiseline supstituisan drugim ostatkom aminokiseline koji ima bočni lanac (R grupa) sa sličnim hemijskim svojstvima (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna supstitucija aminokiseline neće značajno promeniti funkcionalna svojstva proteina. U slučajevima kada se dve ili više sekvenci aminokiselina razlikuju jedna od druge konzervativnim supstitucijama, procenat ili stepen sličnosti može se podesiti naviše kako bi se korigovala konzervativna priroda supstitucije. Načini za izvođenje ovog podešavanja su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Videti, npr., Pirson (1994) Methods Mol. Biol.24: 307-331. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju 1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatične hidroksilne bočne lance: serin i treonin; 3) bočne lance koji sadrže amide: asparagin i glutamin; 4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin i triptofan; 5) bazne bočne lance: lizin, arginin i histidin; 6) kisele bočne lance: aspartat i glutamat, i 7) bočne lance koji sadrže sumpor: cistein i metionin. Poželjne konzervativne grupe supstitucije aminokiselina su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanintirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja promena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 logaritamskoj matrici verovatnoće objavljenoj u Gonnet et al. (1992) Science 256: 144345 „ umereno konzervativna“ zamena je svaka promena koja ima nenegativnu vrednost u PAM250 logaritamskoj matrici verovatnoće. Sličnost sekvenci za polipeptide se obično meri pomoću softvera za analizu sekvenci. Softver za analizu proteina upoređuje slične sekvence koristeći mere sličnosti dodeljene različitim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne supstitucije aminokiselina. Na primer, GCG softver sadrži programe kao što su GAP i BESTFIT koji se mogu koristiti sa podrazumevanim parametrima za određivanje homologije sekvence ili identičnosti sekvence između blisko srodnih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divljeg tipa i njegovog muteina. Videti, npr., GCG verzija 6.1. Polipeptidne sekvence se takođe mogu uporediti pomoću FASTA sa podrazumevanim ili preporučenim parametrima; program u GCG verziji 6.1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnanja i procenat identičnosti sekvenci regiona sa najboljim preklapanjem između sekvenci upita i pretrage (Pearson (2000) supra). Još jedan poželjan algoritam pri poređenju sekvence iz otkrića sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je računarski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, koristeći podrazumevane parametre. Videti, npr., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215: 403-410 i (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.;[0062] Pod izrazom „terapeutski efikasna količina“ podrazumeva se količina koja proizvodi željeni efekat zbog kojeg se primenjuje. Tačna količina će zavisiti od svrhe lečenja i moći će da je utvrdi stručnjak u ovoj oblasti korišćenjem poznatih tehnika (videti, na primer, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).;[0063] Kako se ovde koristi, termin „subjekat“ odnosi se na životinju, poželjno sisara, kojoj je potrebno ublažavanje, prevencija i/ili lečenje bolesti ili poremećaja kao što su hronična virusna infekcija, kancer ili autoimuna bolest.;[0065] II. Radioaktivno obeleženi imunokonjugati PD-L1 antitela za imuno-PET snimanje;[0067] Ovde su obezbeđeni radioobeleženi proteini koji vezuju antigen i vezuju se za ligand programirane smrti 1 (PD-L1). Ovde su obezbeđeni radioobeleženi proteini koji vezuju antigen, a koji sadrže protein koji vezuje antigen kovalentno povezan sa jednom ili više helatnih jedinica, koje su hemijske jedinice sposobne da heliraju emiter pozitrona.;[0068] U nekim primerima izvođenja, ovde su obezbeđeni proteini koji vezuju antigen i vezuju PD-L1 kako je definisano u patentnim zahtevima, pri čemu su navedeni proteini koji vezuju antigen i vezuju PD-L1 kovalentno vezani za jedan ili više delova koji imaju sledeću strukturu:;[0069] -L-Mz;[0070] gde je L helatni deo; M je emiter pozitrona; i z, nezavisno u svakom pojavljivanju, je 0 ili 1; i gde je barem jedno od z je 1.;[0071] U nekim primerima izvođenja, radioobeleženi protein koji vezuje antigen je jedinjenje Formule (I):;[0072] M-L-A-[L-M<Z>]<k>(I);[0073] A je protein koji se vezuje za PD-L1; L je helatni deo; M je emiter pozitrona; z je 0 ili 1; a k je ceo broj od 0-30. U nekim primerima izvođenja, k je 1.;[0074] U određenim primerima izvođenja, radioobeleženi protein koji vezuje antigen je jedinjenje formule (II):;[0075] A-[L-M]<k>(II);[0076] gde je A protein koji se vezuje za PD-L1; L je helatni deo; M je emiter pozitrona; i k je ceo broj od 1 do 30.;[0077] U nekim primerima izvođenja, ovde su obezbeđene kompozicije koje sadrže konjugat koji ima sledeću strukturu:;[0078] A-L<k>;[0079] gde je A protein koji se vezuje za PD-L1; L je helatni deo; i k je ceo broj od 1-30; gde je konjugat heliran sa pozitronskim emiterom u količini dovoljnoj da obezbedi specifičnu aktivnost pogodnu za kliničko PET snimanje.;[0080] Pogodni vezujući proteini, helatne jedinice i emiteri pozitrona dati su u nastavku.;[0082] A. Proteini koji vezuju PD-L1;[0084] Pogodni proteini koji se vezuju za PD-L1 su proteini koji se specifično vezuju za PD-L1, uključujući one opisane u američkoj patentnoj publikaciji br. US 2015-0203580 A1. Primeri anti-PD-L1 antitela ovog otkrića navedeni su u Tabeli 1 američke patentne publikacije br. US 2015-0203580 A1, takođe predstavljeno u nastavku.;[0085] Tabela 1: Identifikatori aminokiselinskih sekvenci;[0086] ;[0087] Tabela 1 prikazuje identifikatore aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog lanca (HCVR), varijabilnih regiona lakog lanca (LCVR), regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) i regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) primernih anti-PD-L1 antitela.;[0088] U nekim aspektima ovog otkrića, vezujući protein je antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz bilo koje od HCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1, ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa njom.;[0089] U nekim aspektima ovog otkrića, vezujući protein je antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji sadrži LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz bilo koje od LCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1, ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa njom.;[0090] U nekim aspektima ovog otkrića, vezujući protein je antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji sadrži par aminokiselinskih sekvenci HCVR i LCVR (HCVR/LCVR) koji sadrži bilo koju od HCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 uparenu sa bilo kojom od LCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1. Prema određenim aspektima ovog otkrića, ovo otkriće obezbeđuje antitela, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrže par aminokiselinskih sekvenci HCVR/LCVR sadržan u bilo kom od primernih anti-PD-L1 antitela navedenih u Tabeli 1. U određenim aspektima, par aminokiselinskih sekvenci HCVR/LCVR je izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/170, 186/194, 202/210, 218/226, 234/242, 250/258, 266/274, 282/274, 290/274, 298/274, 306/274, 314/274, 322/274, 330/274 i 338/274. U određenim aspektima, par aminokiselinskih sekvenci HCVR/LCVR je izabran iz jednog od SEQ ID NO: 82/90 (npr., H2M8314N), 162/170 (npr., H2M8718N), 306/274 (npr., H1H9364P2) i 314/274 (npr., H1H9373P2). U određenim drugim aspektima, par aminokiselinskih sekvenci HCVR/LCVR je izabran iz jednog od SEQ ID NO: 98/106 (npr., H2M8316N), 146/154 (npr., H2M8323N), 290/274 (npr., H1H9351P2) i 330/274 (npr., H1H9387P2).;[0091] U nekim aspektima ovog otkrića, vezujući protein je antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji sadrži CDR1 teškog lanca (HCDR1) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz bilo koje od HCDR1 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence.;[0092] U nekim aspektima ovog otkrića, vezujući protein je antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji sadrži CDR2 teškog lanca (HCDR2) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz bilo koje od HCDR2 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence.;[0093] U nekim aspektima ovog otkrića, vezujući protein je antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji sadrži CDR3 teškog lanca (HCDR3) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz bilo koje od HCDR3 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence.;[0094] U nekim aspektima ovog otkrića, vezujući protein je antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji sadrži CDR1 lakog lanca (LCDR1) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz bilo koje od LCDR1 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence.;[0095] U nekim aspektima ovog otkrića, vezujući protein je antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji sadrži CDR2 lakog lanca (LCDR2) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz bilo koje od LCDR2 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence.;[0096] U nekim aspektima ovog otkrića, vezujući protein je antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji sadrži CDR3 lakog lanca (LCDR3) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz bilo koje od LCDR3 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence.;[0097] [0049] U nekim aspektima ovog otkrića, vezujući protein je antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji sadrži par aminokiselinskih sekvenci HCDR3 i LCDR3 (HCDR3/LCDR3) koji sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci HCDR3 navedenih u Tabeli 1 uparenu sa bilo kojom od aminokiselinskih sekvenci LCDR3 navedenih u Tabeli 1. Prema određenim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje antitela, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrže par aminokiselinskih sekvenci HCDR3/LCDR3 sadržan u bilo kom od primernih anti-PD-L1 antitela navedenih u Tabeli 1. U određenim aspektima otkrića, par aminokiselinskih sekvenci HCDR3/LCDR3 je izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 88/96 (npr., H2M8314N), 168/176 (npr., H2M8718N), 312/280 (npr., H1H9364P2) i 320/280 (npr., H1H9373P2). U određenim drugim aspektima ovog otkrića, par aminokiselinskih sekvenci HCDR3/LCDR3 je izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 104/112 (npr., H2M8316N), 152/160 (npr., H2M8323N), 296/280 (npr., H1H9351P2) i 336/280 (npr., H1H9387P2).;[0098] U nekim aspektima ovog otkrića, vezujući protein je antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji sadrži skup od šest CDR (tj., HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) sadržanih u bilo kom od primernih anti-PD-L1 antitela navedenih u Tabeli 1. U određenim aspektima ovog otkrića, skup aminokiselinskih sekvenci HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 je izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 84-86-88-92-94-96 (npr., H2M8314N); 164-166-168-172-174-176 (npr., H2M8718N); 308-310-312-276-278-280 (npr., H1H9364P2); i 316-318-320-276-278-280 (npr., H1H9373P2). U određenim drugim aspektima ovog otkrića, skup aminokiselinskih sekvenci HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 je izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 100-102-104-108-110-112 (npr., H2M8316N); 148-150-152-156-158-160 (npr., H2M8323N); 292-294-296-276-278-280 (npr., H1H9351P2); i 332-334-336-276-278-280 (npr., H1H9387P2). U ovom pronalasku, antitelo sadrži skup sekvenci HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 SEQ ID NO: 84-86-88-92-94-96.;[0099] U nekim aspektima ovog otkrića, vezujući protein je antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji sadrži skup od šest CDR (tj. HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) sadržanih unutar para aminokiselinske sekvence HCVR/LCVR kako je definisano bilo kojim od primernih anti-PD-L1 antitela navedenih u Tabeli 1. Na primer, u nekim aspektima ovog otkrića, vezujući protein je antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji sadrži skup aminokiselinskih sekvenci HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 sadržan unutar para aminokiselinske sekvence HCVR/LCVR izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 82/90 (npr., H2M8314N), 98/106 (npr., H2M8316N), 146/154 (npr., H2M8323N), 162/170 (npr., H2M8718N), 290/274 (npr., H1H9351P2), 306/274 (npr., H1H9364P2), 314/274 (npr., H1H9373P2) i 330/274 (npr., H1H9387P2). Postupci i tehnike za identifikaciju CDR unutar HCVR i LCVR aminokiselinskih sekvenci su dobro poznati u struci i mogu se koristiti za identifikaciju CDR unutar navedenih HCVR i/ili LCVR aminokiselinskih sekvenci opisanih ovde. Primerne konvencije koje se mogu koristiti za identifikaciju granica CDR uključuju, npr., Kabat definicija, Chothia definicija i AbM definicija. Generalno govoreći, Kabat definicija se zasniva na varijabilnosti sekvence, Chothia definicija se zasniva na lokaciji strukturnih regiona petlji, a AbM definicija je kompromis između Kabat i Chothia pristupa. Vidi, npr., Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927‑948 (1997); i Martin et al., Proc. Natl.;[0100] Acad. Sci. USA 86:9268‑9272 (1989). Javne baze podataka su takođe dostupne za identifikaciju CDR sekvenci unutar antitela.;[0101] U nekim aspektima ovog otkrića, vezujući proteini su antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigene, a koji se takmiče za specifično vezivanje za PD-L1 sa antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigene, a koji obuhvata CDR HCVR i CDR LCVR, pri čemu HCVR i LCVR imaju aminokiselinske sekvence izabrane iz HCVR i LCVR sekvenci navedenih u Tabeli 1.;[0102] U nekim aspektima ovog otkrića, vezujući proteini su izolovana antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen i blokiraju vezivanje PD-L1 za PD-1 ili za B7-1. U nekim aspektima ovog otkrića, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen i blokira vezivanje PD-L1 za PD-1 ili za B7-1 može se vezati za isti epitop na PD-L1 kao PD-1/B7-1 ili se može vezati za drugi epitop na PD-L1 kao PD-1/B7-1. U određenim aspektima ovog otkrića, antitela ovog otkrića koja blokiraju vezivanje PD-L1 za PD-1 ili za B7-1 sadrže CDR HCVR koji imaju aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od HCVR sekvenci navedenih u Tabeli 1; i CDR LCVR koji imaju aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od LCVR sekvenci navedenih u Tabeli 1.;[0103] U alternativnim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigene koji ne blokiraju vezivanje PD-L1 za PD-1 ili za B7-1. U određenim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje izolovana antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigene koji se vezuju za PD-L1, pri čemu antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigene pojačavaju vezivanje PD-L1 za PD-1 ili za B7-1. U nekim aspektima, izolovana antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigene koji pojačavaju vezivanje PD-L1 za PD-1/B7-1 obuhvataju CDR HCVR, pri čemu HCVR ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18, 66, 114, 130, 202, 218, 266, 282, 298, 322 i 338; i CDR LCVR, gde LCVR ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 26, 74, 122, 138, 210, 226 i 274. U nekim aspektima ovog otkrića, izolovana antitela ili njihovi antigenvezujući fragmenti sadrže HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18/26 (npr., H2M8307N), 66/74 (npr., H2M8312N), 114/122 (npr., H2M8317N), 130/138 (npr., H2M8321N), 202/210 (npr., H1H9323P), 218/226 (npr., H1H9327P), 266/274 (npr., H1H9344P2), 282/274 (npr., H1H9345P2), 298/274 (npr., H1H9354P2), 322/274 (npr., H1H9382P2) i 338/274 (npr., H1H9396P2). U ovom pronalasku, izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen može da sadrži HCVR aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82; i LCVR aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 90.;[0104] U nekim aspektima ovog otkrića, vezujući proteini su antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigene, a koji se specifično vezuju za PD-L1 kod ljudi ili drugih vrsta. U određenim aspektima ovog otkrića, antitela se mogu vezati za humani PD-L1 i/ili za PD-L1 kod makaki majmuna.;[0105] U nekim aspektima ovog otkrića, vezujući proteini su antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, a koji se unakrsno takmiče za vezivanje za PD-L1 sa referentnim antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, a koji obuhvata CDR HCVR i CDR LCVR, pri čemu HCVR i LCVR imaju aminokiselinske sekvence izabrane iz HCVR i LCVR sekvenci navedenih u Tabeli 1.;[0106] U jednom aspektu ovog otkrića, vezujući protein je izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji ima jednu ili više sledećih karakteristika: (a) blokira vezivanje PD-L1 za PD-1 ili za B7-1; (b) specifično se vezuje za humani PD-L1 i/ili PD-L1 kod makaki majmuna; (c) inhibira proliferaciju T-ćelija u testu mešovite limfocitne reakcije (MLR); i (d) povećava sekreciju IL-2 i/ili interferona-gama u MLR testu.;[0107] U nekim aspektima ovog otkrića, vezujući protein je antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se može specifično vezati za PD-L1 na agonistički način, tj. pojačava ili stimuliše vezivanje i/ili aktivnost PD-L1; u drugim primerima izvođenja, antitelo se može specifično vezati za PD-L1 na antagonistički način, tj. blokira vezivanje PD-L1 za njegov receptor.;[0108] U određenim aspektima ovog otkrića, antitela ili fragmenti koji vezuju antigene su bispecifični, što obuhvata prvu specifičnost vezivanja za PD-L1 i drugu specifičnost vezivanja za drugi ciljni epitop. Drugi ciljni epitop može biti drugi epitop na PD-L1 ili na drugom proteinu, kao što je ko-inhibitor T-ćelija. U određenim aspektima, ciljni epitop može biti na drugoj ćeliji, uključujući npr. drugu T-ćeliju, B-ćeliju, tumorsku ćeliju, autoimunu ćeliju tkiva ili ćeliju zaraženu virusom.;[0109] U nekim aspektima ovog otkrića, antitela i fragmenti antitela koji vezuju antigen vezuju monomerni PD-L1 (npr., na 25°C ili na 37°C) sa K<D>manje od oko 318 pM mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr. korišćenjem formata analize kako je definisano u Primeru 3 američke patentne publikacije br. US 2015-0203580 A1, ili suštinski sličnim testom. U određenim aspektima ovog otkrića, antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen vezuju monomerni PD-L1 sa K<D>manjom od oko 300 pM, manjom od oko 250 pM, manjom od oko 150 pM, manjom od oko 100 pM ili manjom od oko 50 pM, mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr., koristeći format analize kako je definisano u Primeru 3 američke patentne publikacije br. US 2015-0203580 A1, ili suštinski sličnom testu.;[0110] U nekim aspektima ovog otkrića, antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen vezuju dimerni PD-L1 (npr., na 25°C ili na 37°C) sa K<D>manjom od oko 15 pM mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr., koristeći format analize kako je definisano u Primeru 3 američke patentne publikacije br. US 2015-0203580 A1 ili suštinski sličnom testu. U određenim aspektima ovog otkrića, antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen vezuju dimerni PD-L1 sa K<D>manjom od oko 12 pM, manjom od oko 10 pM, manjom od oko 8 pM ili manjom od oko 5 pM, mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr., koristeći format analize kako je definisano u Primeru 3 američke patentne publikacije br. US 2015-0203580 A1, ili suštinski sličnom testu.;[0111] U nekim aspektima ovog otkrića, antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen vezuju se za PD-L1 makaki majmuna (Macaca fascicularis) (npr., na 25°C ili na 37°C) sa K<D>manjom od oko 28 nM mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr., koristeći format analize kako je definisano u Primeru 3 američke patentne publikacije br. US 2015-0203580 A1. U određenim aspektima ovog otkrića, antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen vezuju PD-L1 kod makaki majmuna sa K<D>manjom od oko 25 nM, manjom od oko 20 nM, manjom od oko 15 nM, manjom od oko 10 nM ili manjom od oko 5 nM, mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr. korišćenjem formata analize kako je definisano u Primeru 3 američke patentne publikacije br. US 2015-0203580 A1, ili suštinski sličnom testu.;[0112] U nekim aspektima ovog otkrića, antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen vezuju PD-L1 sa disocijativnim poluživotom (t½) većim od oko 1 minuta, mereno površinskom plazmonskom rezonancom na 25°C ili 37°C, npr., koristeći format analize kako je definisano u Primeru 3 američke patentne publikacije br. US 2015-0203580 A1, ili suštinski sličnom testu. U određenim aspektima ovog otkrića, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen vezuju PD-L1 sa t½ većim od oko 5 minuta, većim od oko 10 minuta, većim od oko 30 minuta, većim od oko 50 minuta, većim od oko 60 minuta, većim od oko 70 minuta, većim od oko 80 minuta, većim od oko 90 minuta, većim od oko 100 minuta, većim od oko 200 minuta, većim od oko 300 minuta, većim od oko 400 minuta, većim od oko 500 minuta, većim od oko 600 minuta, većim od oko 700 minuta ili većim od oko 800 minuta, mereno površinskom plazmonskom rezonancom na 25°C ili 37°C, npr. korišćenjem formata testa kao što je definisano u Primeru 3 američke patentne publikacije br. US 2015-0203580 A1 (npr., format hvatanja mAb ili format hvatanja antigena), ili suštinski sličnim testom.;[0113] [0064] U nekim aspektima ovog otkrića, antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen blokiraju vezivanje PD-L1 za PD-1 sa IC<50>manjom od oko 770 pM, određeno imunološkim testom zasnovanim na ELISA testu, npr., kao što je prikazano u primeru 4 američke patentne publikacije br. US 2015-0203580 A1, ili suštinski sličnom testu. U nekim aspektima ovog otkrića, antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen blokiraju vezivanje PD-L1 za B7-1 sa IC<50>manjom od oko 10 nM, određeno imunološkim testom zasnovanim na ELISA testu, npr., kao što je prikazano u primeru 4 američke patentne publikacije br. US 2015-0203580 A1, ili suštinski sličnom testu. U nekim primerima izvođenja, antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen vezuju se za PD-L1 i pojačavaju vezivanje PD-L1 za PD-1 ili za B7-1.;[0114] U nekim aspektima ovog otkrića, antitela se vezuju za ekstracelularni domen PD-L1 ili za fragment tog domena. U nekim aspektima ovog otkrića, antitela se vezuju za više od jednog domena (unakrsno reaktivna antitela). U određenim aspektima ovog otkrića, antitela se vezuju za epitop koji se nalazi u ekstracelularnom domenu, a koji sadrži aminokiselinske ostatke 19-239 jedinjenja NP_054862.1.;[0115] U određenim aspektima ovog otkrića, antitela funkcionišu tako što blokiraju ili inhibiraju aktivnost vezivanja PD-1 ili vezivanja B7-1 povezanu sa PD-L1 vezivanjem za bilo koji drugi region ili fragment proteina pune dužine. U određenim primerima izvođenja, antitela ublažavaju ili moduliraju interakciju između PD-L1 i PD-1/B7-1.;[0116] U određenim aspektima ovog otkrića, antitela su bispecifična antitela. Bispecifična antitela mogu da se vežu za jedan epitop u jednom domenu, a takođe mogu da se vežu i za drugi epitop u drugom domenu PD-L1. U određenim aspektima ovog otkrića, bispecifična antitela vezuju dva različita epitopa u istom domenu. U jednom aspektu, multispecifični molekul koji vezuje antigen sadrži prvu specifičnost vezivanja za antigen, pri čemu prva specifičnost vezivanja obuhvata ekstracelularni domen ili njegov fragment PD-1; i drugu specifičnost vezivanja za antigen za drugi epitop PD-L1. U drugom aspektu, multispecifični molekul koji vezuje antigen sadrži prvu specifičnost vezivanja za antigen, pri čemu prva specifičnost vezivanja obuhvata ekstracelularni domen ili njegov fragment B7-1; i drugu specifičnost vezivanja za antigen za drugi epitop PD-L1.;[0117] [0068] U jednom aspektu, antitelo ili njegov fragment je potpuno humano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za PD-L1, pri čemu antitelo ili njegov fragment pokazuje jednu ili više sledećih karakteristika: (i) sadrži HCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 186, 202, 218, 234, 250, 258, 266, 274, 282, 290, 298, 306, 314, 322, 330 i 338, ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence; (ii) sadrži LCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 194, 210, 226, 242, 258 i 274, ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence; (iii) sadrži HCDR3 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 280, 288, 296, 304, 312, 320, 328, 336 i 344, ili njegovu suštinski sličnu identičnost koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence; i LCDR3 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 200, 216, 232, 248, 264 i 280, ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence; (iv) sadrži HCDR1 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 292, 300, 308, 316, 324, 332 i 340, ili njegovu suštinski sličnu identičnost koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence; HCDR2 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 294, 302, 310, 318, 326, 334 i 342, ili njegovu suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence; LCDR1 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 196, 212, 228, 244, 260 i 276, ili njegovu suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence; i LCDR2 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 198, 214, 230, 246, 262 i 278, ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence; (v) je multispecifični molekul koji vezuje antigen, a koji sadrži prvu specifičnost vezivanja za PD-L1 i drugu specifičnost vezivanja za antigen izabran iz grupe koja se sastoji od PD-L1, tumor specifičnog antigena, antigena virusno inficiranih ćelija i koinhibitora T-ćelija; (vi) vezuje se za humani PD-L1 sa K<D>od oko 4 pM do oko 645 nM; (vii) vezuje se za PD-L1 makaki majmuna sa K<D>od oko 70 pM do oko 400 nM; (viii) blokira ili pojačava vezivanje PD-L1 za PD-1 sa IC50 ≤ 770 pM; (ix) blokira ili pojačava vezivanje PD-L1 za B7-1 sa IC<50>≤ 10 nM; (x) blokira smanjenje regulacije T-ćelija izazvano PD-1 i/ili obnavlja signalizaciju T-ćelija u testu T-ćelija/APC luciferaze reportera; (xi) stimuliše proliferaciju i aktivnost T-ćelija u testu mešovite limfocitne reakcije (MLR); (xii) indukuje proizvodnju IL-2 i/ili IFNγ u MLR testu; i (xiii) suzbija rast tumora i povećava preživljavanje kod osoba sa kancerom.;[0118] U jednom aspektu, antitelo ili njegov fragment je potpuno humano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koje blokira vezivanje PD-L1 za PD-1 ili za B7-1, pri čemu antitelo ili njegov fragment pokazuje jednu ili više sledećih karakteristika: (i) sadrži HCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 82, 98, 146, 162, 290, 306, 314 i 330, ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence; (ii) sadrži LCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 90, 106, 154, 170 i 274, ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence; (iii) sadrži HCDR3 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 88, 104, 152, 168, 296, 312, 320 i 336, ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence; i LCDR3 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 96, 112, 160, 176 i 280, ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence; (iv) sadrži HCDR1 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 84, 100, 148, 164, 292, 308, 316 i 332, ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence; HCDR2 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 86, 102, 150, 166, 294, 310, 318 i 334, ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence; LCDR1 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 92, 108, 156, 172 i 276, ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence; i LCDR2 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 94, 110, 158, 174 i 278, ili suštinski sličnu sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence; (v) je multispecifični molekul koji vezuje antigen, a koji sadrži prvu specifičnost vezivanja za PD-L1 i drugu specifičnost vezivanja za antigen izabran iz grupe koja se sastoji od različitog epitopa PD-L1, tumor specifičnog antigena, antigena ćelije zaražene virusom i ko-inhibitora T-ćelija; (vi) vezuje se za humani PD-L1 sa K<D>≤ 10<-10>M; (vii) vezuje se za PD-L1 makaki majmuna sa K<D>≤ 10<-7>M; (viii) blokira vezivanje PD-L1 za PD-1 ili za B7-1; (ix) blokira smanjenje regulacije T-ćelija izazvano PD-1 i/ili obnavlja signalizaciju T-ćelija u testu T-ćelija/APC luciferaza reportera; (xi) stimuliše proliferaciju i aktivnost T-ćelija u testu mešovite limfocitne reakcije (MLR); (xii) indukuje proizvodnju IL-2 i/ili IFNγ u MLR testu; i (xiii) suzbija rast tumora i povećava preživljavanje kod osoba sa kancerom.;[0119] U određenim aspektima, anti-PD-L1 antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen vezuju se za epitop unutar bilo kog jednog ili više regiona navedenih u PD-L1, bilo u prirodnom obliku ili rekombinantno proizvedenih, ili za njegov fragment. U nekim aspektima, antitela prema ovom otkriću vezuju se za ekstracelularni region koji sadrži jednu ili više aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 19-239 PD-L1. U nekim aspektima, antitela prema ovom otkriću vezuju se za region koji sadrži jednu ili više aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1-221 PD-L1 makaki majmuna.;[0120] U određenim aspektima, antitela prema ovom otkriću, kao što je prikazano u Tabeli 1, interaguju sa najmanje jednom aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka u rasponu od oko pozicije 19 do oko pozicije 130 PD-L1; ili aminokiselinskih ostataka u rasponu od oko pozicije 130 do oko pozicije 153 PD-L1; ili aminokiselinskih ostataka u rasponu od oko pozicije 153 do oko pozicije 210 PD-L1; ili sa aminokiselinskim ostacima u rasponu od oko pozicije 210 do oko pozicije 239 PD-L1.;[0121] U nekim aspektima, anti-PD-L1 antitela se vezuju za isti epitop, ili deo epitopa, kao bilo koje od specifičnih primernih antitela opisanih ovde u Tabeli 1, ili antitelo koje ima CDR sekvence bilo kog od primernih antitela opisanih u Tabeli 1. Slično tome, pogodna antitela takođe uključuju anti-PD-L1 antitela koja se takmiče za vezivanje za PD-L1 ili PD-L1 fragment sa bilo kojim od specifičnih primernih antitela opisanih ovde u Tabeli 1, ili antitelo koje ima CDR sekvence bilo kog od primernih antitela opisanih u Tabeli 1. Na primer, pogodna antitela uključuju anti-PD-L1 antitela koja se unakrsno takmiče za vezivanje za PD-L1 sa jednim ili više antitela kao što je definisano u Primeru 6 ovde (npr., H2aM8309N, H1H9329P, H1H9336P, H2aM8314N, H2aM8316N, H2AM8718N, H1H9387P2, H1H9351P2, H1H9364P2, H1H9373P2 i H2aM8306N). Ovo otkriće takođe uključuje anti-PD-L1 antitela koja se unakrsno takmiče za vezivanje za PD-L1 sa jednim ili više antitela kao što je definisano u Primeru 6 američke patentne publikacije br. US 2015-0203580 A1 (npr., H1H9396P2, H2aM8317N, H2aM8321N, H1H9323P, H1H9382P2, H1H9344P2, H1H9345P2 i H1H9354P2).;[0122] [0073] Antitela i fragmenti koji vezuju antigen opisani ovde specifično se vezuju za PD-L1 i moduliraju interakciju PD-L1 sa PD-1 ili sa B7-1. Anti-PD-L1 antitela mogu se vezati za PD-L1 sa visokim afinitetom ili sa niskim afinitetom. U određenim aspektima, antitela su blokirajuća antitela gde se antitela vezuju za PD-L1 i blokiraju interakciju PD-L1 sa PD-1 ili sa B7-1. U nekim aspektima, blokirajuća antitela prema ovom otkriću blokiraju vezivanje PD-L1 za PD-1 ili za B7-1 i/ili stimulišu ili pojačavaju aktivaciju T-ćelija. U nekim aspektima, blokirajuća antitela su korisna za stimulisanje ili pojačavanje imunog odgovora i/ili za lečenje subjekta koji pati od kancera ili hronične virusne infekcije. Antitela, kada se primenjuju kod subjekta kome je to potrebno, mogu smanjiti hroničnu infekciju virusom kao što je HIV, LCMV ili HBV kod subjekta. Mogu se koristiti za inhibiciju rasta tumorskih ćelija kod subjekta. Mogu se koristiti sami ili kao dodatna terapija sa drugim terapijskim delovima ili modalitetima poznatim u struci za lečenje kancera ili virusne infekcije. U određenim aspektima, antitela protiv PD-L1 koja se vezuju za PD-L1 sa niskim afinitetom koriste se kao molekuli koji vezuju višestruko specifični antigen, gde se prva specifičnost vezivanja vezuje za PD-L1 sa niskim afinitetom, a druga specifičnost vezivanja se vezuje za antigen izabran iz grupe koja se sastoji od različitog epitopa PD-L1, ko-inhibitora T-ćelija kao što je PD-1, tumorskog specifičnog antigena i antigena specifičnog za inficiranu ćeliju.;[0123] U određenim aspektima, antitela ovog otkrića su agonistička antitela, pri čemu se antitela vezuju za PD-L1 i pojačavaju interakciju PD-L1 i PD-1/B7-1. U nekim aspektima, aktivirajuća antitela pojačavaju vezivanje PD-L1 za PD-1 ili za B7-1 i/ili inhibiraju ili suzbijaju aktivaciju T-ćelija. Aktivirajuća antitela ovog otkrića mogu biti korisna za inhibiranje imunog odgovora kod subjekta i/ili za lečenje autoimune bolesti.;[0124] U određenim aspektima, anti-PD-L1 antitela su multispecifični molekuli koji vezuju antigen, pri čemu sadrže prvu specifičnost vezivanja za PD-L1 i drugu specifičnost vezivanja za antigen izabran iz grupe koja se sastoji od različitog epitopa PD-L1, T-ćelijskog ko-inhibitora kao što je PD-1, tumorskog specifičnog antigena i antigena specifičnog za inficiranu ćeliju. U određenim aspektima, prva specifičnost vezivanja se vezuje za PD-L1 sa niskim afinitetom, npr., sa K<D>od 10<-8>M, 10<-7>M ili više.;[0125] Određena anti-PD-L1 antitela ovog otkrića su sposobna da se vežu za PD-L1 i neutrališu njegovu aktivnost, što je utvrđeno pomoću in vitro ili in vivo analize. Sposobnost antitela prema ovom otkriću da se vežu za PD-L1 i neutrališu njegovu aktivnost može se meriti korišćenjem bilo koje standardne postupke poznate stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući analize vezivanja ili analize aktivnosti, kao što je ovde opisano.;[0126] [0077] Neograničavajuće, primerni in vitro testovi za merenje aktivnosti vezivanja ilustrovani su u Primeru 3 američke patentne publikacije br. US 2015-0203580 A1. U primeru 3, afiniteti vezivanja i kinetičke konstante humanih anti-PD-L1 antitela za humani PD-L1 i PD-L1 kod makaki majmuna određeni su površinskom plazmonskom rezonancom, a merenja su sprovedena na T200 Biacore instrumentu. U primerima 4 i 5 američke patentne publikacije br. US 2015-0203580 A1, blokirajući testovi su korišćeni da bi se odredila sposobnost anti-PD-L1 antitela da blokiraju sposobnost vezivanja PD-1 ili B7-1 za PD-L1 in vitro. U primeru 6 američke patentne publikacije br. US 2015-0203580 A1, blokirajući testovi su korišćeni za određivanje unakrsne konkurencije između različitih anti-PD-L1 antitela. Primer 7 američke patentne publikacije br. US 2015-0203580 A1 opisuje vezivanje antitela za ćelije koje prekomerno eksprimiraju PD-L1. U primeru 8 od US 2015-0203580 A1, korišćen je luciferazni test da bi se odredila sposobnost anti-PD-L1 antitela da antagonizuju PD-1/PD-L1 signalizaciju u T-ćelijama.;[0127] Osim ako nije drugačije naznačeno, termin „antitelo“, kako se ovde koristi, treba shvatiti da obuhvata molekule antitela koji sadrže dva teška lanca imunoglobulina i dva laka lanca imunoglobulina (tj. „kompletni molekuli antitela“), kao i njihovi fragmenti koji vezuju antigen. Termini „deo antitela koji vezuje antigen“, „fragment antitela koji vezuje antigen“ i slično, kako se ovde koriste, uključuju bilo koji prirodni, enzimski dostupan, sintetički ili genetski modifikovani polipeptid ili glikoprotein koji se specifično vezuje za antigen i formira kompleks. Termini „fragment antitela koji vezuje antigen“ ili „fragment antitela“, kako se ovde koriste, odnose se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za PD-L1. Fragment antitela može da uključuje Fab fragment, F(ab')<2>fragment, Fv fragment, dAb fragment, fragment koji sadrži CDR ili izolovani CDR. U određenim primerima izvođenja, termin „fragment koji vezuje antigen“ odnosi se na polipeptid ili njegov fragment multispecifičnog molekula koji vezuje antigen. U takvim primerima izvođenja, termin „fragment koji vezuje antigen“ uključuje, npr., ekstracelularni domen PD-1 koji se specifično vezuje za PD-L1. Fragmenti antitela koji vezuju antigen mogu biti izvedeni, npr., iz kompletnih molekula antitela korišćenjem bilo kojih odgovarajućih standardnih tehnika kao što su proteolitička digestija ili tehnike rekombinantnog genetskog inženjeringa koje uključuju manipulaciju i ekspresiju DNK koja kodira varijabilne i (izborno) konstantne domene antitela. Takva DNK je poznata i/ili je lako dostupna od, npr., komercijalnih izvora, DNK biblioteke (uključujući, npr., biblioteke fag-antitelo), ili se može sintetizovati. DNK se može sekvencirati i manipulisati hemijski ili korišćenjem tehnika molekularne biologije, na primer, da bi se jedan ili više varijabilnih i/ili konstantnih domena rasporedio u odgovarajuću konfiguraciju, ili da bi se uveli kodoni, stvorili ostaci cisteina, modifikovale, dodale ili izbrisale aminokiseline itd.;[0128] [0079] Neograničavajući primeri fragmenata koji vezuju antigen uključuju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab')2 fragmente; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) jednolančane Fv (scFv) molekule; (vi) dAb fragmente; i (vii) minimalne jedinice za prepoznavanje koje se sastoje od aminokiselinskih ostataka koji imitiraju hipervarijabilni region antitela (npr., izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR) kao što je CDR3 peptid), ili ograničeni FR3-CDR3-FR4 peptid. Drugi inženjerski modifikovani molekuli, kao što su antitela specifična za domen, antitela sa jednim domenom, antitela sa obrisanim domenom, himerna antitela, antitela sa graftovanim CDR, diatela, triatela, tetratela, minitela, nanotela (npr. monovalentna nanotela, bivalentna nanotela itd.), mali modularni imunofarmaceutici (SMIP) i varijabilni IgNAR domeni ajkule, takođe su obuhvaćeni izrazom „fragment koji vezuje antigen“, kako se ovde koristi.;[0129] Fragment antitela koji vezuje antigen tipično će sadržati najmanje jedan varijabilni domen. Varijabilni domen može biti bilo koje veličine ili sastava aminokiselina i generalno će sadržati najmanje jedan CDR, koji je pored ili u okviru sa jednom ili više okvirnih sekvenci. U fragmentima koji vezuju antigen i koji imaju V<H>domen povezan sa V<L>domenom, V<H>i V<L>domeni mogu biti raspoređeni jedan u odnosu na drugi u bilo kom pogodnom rasporedu. Na primer, varijabilni region može biti dimeran i sadržati V<H>- V<H>, V<H>- V<L>ili V<L>- V<L>dimere. Alternativno, fragment antitela koji vezuje antigen može da sadrži monomerni V<H>ili V<L>domen.;[0130] U određenim aspektima ovog otkrića, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržati najmanje jedan varijabilni domen kovalentno povezan sa najmanje jednim konstantnim domenom. Neograničavajuće, primerne konfiguracije varijabilnih i konstantnih domena koje se mogu naći unutar fragmenta antitela koji vezuje antigen ovog otkrića uključuju: (i) V<H>-C<H>1; (ii) V<H>- C<H>2; (iii) V<H>-C<H>3; (iv) V<H>-C<H>1-C<H>2; (v) V<H>-C<H>1-C<H>2-C<H>3; (vi) V<H>-C<H>2-C<H>3; (vii) V<H>-C<L>; (viii) V<L>- C<H>1; (ix) V<L>-C<H>2; (x) V<L>-C<H>3; (xi) V<L>-C<H>1-C<H>2; (xii) V<L>-C<H>1-C<H>2-C<H>3; (xiii) V<L>-C<H>2-C<H>3; i (xiv) V<L>-C<L.>U bilo kojoj konfiguraciji varijabilnih i konstantnih domena, uključujući bilo koju od gore navedenih primernih konfiguracija, varijabilni i konstantni domeni mogu biti direktno povezani jedan sa drugim ili mogu biti povezani potpunim ili delimičnim zglobnim ili linker regionom. Zglobni region može se sastojati od najmanje 2 (npr., 5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiselina, što rezultuje fleksibilnom ili polufleksibilnom vezom između susednih varijabilnih i/ili konstantnih domena u jednom molekulu polipeptida. Dodatno, fragment antitela koje se vezuje za antigen ovog otkrića može da sadrži homodimer ili heterodimer (ili drugi multimer) bilo koje od konfiguracija varijabilnih i konstantnih domena navedenih prethodno u nekovalentnoj vezi jedna sa drugom i/ili sa jednim ili više monomernih V<H>ili V<L>domena (npr., disulfidnom vezom (vezama)).;[0131] [0082] Kao i kod kompletnih molekula antitela, fragmenti koji vezuju antigen mogu biti monospecifični ili multispecifični (npr., bispecifični). Multispecifični fragment antitela koji vezuje antigen tipično će obuhvatiti najmanje dva različita varijabilna domena, pri čemu je svaki varijabilni domen sposoban da se specifično veže za odvojeni antigen ili za drugi epitop na istom antigenu. Bilo koji format multispecifičnog antitela, uključujući primerne formate bispecifičnih antitela opisane ovde, može se prilagoditi za upotrebu u kontekstu fragmenta antitela koji vezuje antigen ovog otkrića korišćenjem rutinskih tehnika dostupnih u struci.;[0132] Anti-PD-L1 antitela i fragmenti antitela ovog otkrića obuhvataju proteine sa aminokiselinskim sekvencama koje se razlikuju od onih opisanih antitela, ali koje zadržavaju sposobnost vezivanja za PD-L1. Takve varijante antitela i fragmenata antitela sadrže jednu ili više adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina u poređenju sa matičnom sekvencom, ali pokazuju biološku aktivnost koja je u suštini ekvivalentna onoj opisanih antitela. Slično tome, DNK sekvence koje kodiraju antitela ovog otkrića obuhvataju sekvence koje sadrže jednu ili više adicija, delecija ili supstitucija nukleotida u poređenju sa otkrivenom sekvencom, ali koje kodiraju antitelo ili fragment antitela koji je u suštini bioekvivalentan antitelu ili fragmentu antitela ovog otkrića.;[0133] Dva proteina koja vezuju antigene, ili antitela, smatraju se bioekvivalentnim ako su, na primer, farmaceutski ekvivalenti ili farmaceutske alternative čija brzina i stepen apsorpcije ne pokazuju značajnu razliku kada se primenjuju u istoj molarnoj dozi pod sličnim eksperimentalnim uslovima, bilo kao jednokratna doza ili višestruke doze. Neka antitela će se smatrati ekvivalentima ili farmaceutskim alternativama ako su ekvivalentna u stepenu apsorpcije, ali ne i u brzini apsorpcije, a ipak se mogu smatrati bioekvivalentnim jer su takve razlike u brzini apsorpcije namerne i odražavaju se u označavanju, nisu neophodne za postizanje efikasnih koncentracija leka u telu pri, npr. hroničnoj upotrebi, i smatraju se medicinski beznačajnim za određeni lek koji se proučava.;[0134] U jednom primeru izvođenja, dva proteina koji vezuju antigene su bioekvivalentna ako ne postoje klinički značajne razlike u njihovoj bezbednosti, čistoći ili potenciji.;[0135] U jednom primeru izvođenja, dva proteina koji vezuju antigene su bioekvivalentna ako pacijent može biti prebačen jednom ili više puta sa referentnog proizvoda na biološki proizvod i obratno bez očekivanog povećanja rizika od neželjenih efekata, uključujući klinički značajnu promenu imunogenosti ili smanjenu efikasnost, u poređenju sa kontinuiranom terapijom bez takve promene.;[0136] U jednom primeru izvođenja, dva proteina koji vezuju antigene su bioekvivalentna ako oba deluju zajedničkim mehanizmom ili mehanizmima delovanja za stanje ili uslove upotrebe, u meri u kojoj su takvi mehanizmi poznati.;[0137] [0088] Bioekvivalentnost se može dokazati in vivo i/ili in vitro postupkom. Mere bioekvivalencije uključuju, npr., (a) jedan in vivo test na ljudima ili drugim sisarima, u kome se koncentracija antitela ili njegovih metabolita meri u krvi, plazmi, serumu ili drugoj biološkoj tečnosti kao funkcija vremena; (b) in vitro test koji je u korelaciji i dovoljno je prediktivan u odnosu na humane in vivo podatke o bioraspoloživosti; (c) in vivo test na ljudima ili drugim sisarima u kome se odgovarajući akutni farmakološki efekat antitela (ili njegove mete) meri kao funkcija vremena; i (g) u dobro kontrolisanom kliničkom ispitivanju koje utvrđuje bezbednost, efikasnost ili biodostupnost ili bioekvivalenciju antitela.;[0138] Bioekvivalentne varijante antitela ovog otkrića mogu se konstruisati, na primer, pravljenjem različitih supstitucija ostataka ili sekvenci ili brisanjem terminusnih ili unutrašnjih ostataka ili sekvenci koje nisu potrebne za biološku aktivnost. Na primer, ostaci cisteina koji nisu neophodni za biološku aktivnost mogu se obrisati ili zameniti drugim aminokiselinama kako bi se sprečilo formiranje nepotrebnih ili netačnih intramolekulskih disulfidnih mostova nakon renaturacije. U drugim kontekstima, bioekvivalentna antitela mogu uključivati varijante antitela koje sadrže promene aminokiselina, koje modifikuju karakteristike glikozilacije antitela, npr., mutacije koje eliminišu ili uklanjaju glikozilaciju.;[0139] Prema određenim primerima izvođenja ovog otkrića, anti-PD-L1 antitela sadrže Fc domen koji sadrži jednu ili više mutacija koje pojačavaju ili smanjuju vezivanje antitela za FcRn receptor, npr., pri kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH. Na primer, ovo otkriće uključuje anti-PD-L1 antitela koja sadrže mutaciju u C<H>2 ili C<H>3 region Fc domena, gde mutacija(e) povećava(ju) afinitet Fc domena prema FcRn u kiseloj sredini (npr., u endozomu gde se pH kreće od oko 5,5 do oko 6,0). Takve mutacije mogu dovesti do povećanja poluživota antitela u serumu kada se primeni na životinju. Neograničavajući primeri takvih Fc modifikacija uključuju, npr., modifikaciju na poziciji 250 (npr., E ili Q); 250 i 428 (npr., L ili F); 252 (npr., L/G/F/S ili T), 254 (npr., S ili T) i 256 (npr., S/R/Q/E/D ili T); ili modifikaciju na poziciji 428 i/ili 433 (npr., V/L/D/S/P/K ili K) i/ili 434 (npr., A, W, H, F ili Y [N434A, N434W, N434H, N434F ili N434Y]); ili modifikaciju na poziciji 250 i/ili 428; ili modifikaciju na poziciji 307 ili 308 (npr., 308F, V308F) i 434. U jednom primeru izvođenja, modifikacija obuhvata 428L (npr., M428L) i 434S (npr., N434S) modifikaciju; 428L, 259I (npr., V259I) i 308F (npr., V308F) modifikaciju; 433K (npr., H433K) i 434 (npr., 434Y) modifikaciju; 252, 254 i 256 (npr., modifikacija 252Y, 254T i 256E); modifikaciju 250Q i 428L (npr., T250Q i M428L); i modifikaciju 307 i/ili 308 (npr., 308F ili 308P). U još jednom primeru izvođenja, modifikacija obuhvata 265A (npr., D265A) i/ili 297A (npr., modifikacija N297A).;[0140] [0091] Na primer, ovo otkriće obuhvata anti-PD-L1 antitela koja sadrže Fc domen koji obuhvata jedan ili više parova ili grupa mutacija izabranih iz grupe koja se sastoji od: 250Q i 248L (npr., T250K i M248L); 252Y, 254T i 256E (npr., M252Y, S254T i T256E); 428L i 434S (npr., M428L i N434S); 257I i 311I (npr., P257I i Q311I); 257I i 434H (npr., P257I i N434H); 376V i 434H (npr., D376V i N434H); 307A, 380A i 434A (npr., T307A, E380A i N434A); i 433K i 434F (npr., H433K i N434F). U jednom primeru izvođenja, ovo otkriće uključuje anti-PD-L1 antitela koja sadrže Fc domen koji sadrži S108P mutaciju u zglobnom regionu IgG4 radi podsticanja stabilizacije dimera. Sve moguće kombinacije gore navedenih mutacija Fc domena i drugih mutacija unutar varijabilnih domena antitela opisanih ovde, razmatraju se u okviru ovog otkrića.;[0141] Ovo otkriće takođe uključuje anti-PD-L1 antitela koja sadrže himerni konstantni region teškog lanca (C<H>), gde himerni C<H>region obuhvata segmente izvedene iz C<H>regiona više od jednog izotipa imunoglobulina. Na primer, antitela prema ovom otkriću mogu da sadrže himerni C<H>region koji obuhvata deo ili ceo C<H>2 domen izveden iz molekula humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4, kombinovan sa delom ili celim C<H>3 domenom izvedenim iz molekula humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4. Prema određenim primerima izvođenja, antitela ovog otkrića sadrže himerni C<H>region koji ima himerni zglobni region. Na primer, himerni zglob može da sadrži aminokiselinsku sekvencu „gornjeg zgloba“ (aminokiselinski ostaci od pozicija 216 do 227 prema EU numerisanju) izvedeni iz zglobnog regiona humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4, kombinovani sa sekvencom „donjeg zgloba“ (aminokiselinski ostaci od pozicija 228 do 236 prema EU numerisanju) izvedenim iz zglobnog regiona humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4. Prema određenim primerima izvođenja, himerni zglobni region sadrži aminokiselinske ostatke izvedene iz gornjeg zgloba humanog IgG1 ili humanog IgG4 i aminokiselinske ostatke izvedene iz donjeg zgloba humanog IgG2. Antitelo koje sadrži himerni C<H>region kao što je ovde opisan može, u određenim primerima izvođenja, pokazivati modifikovane Fc efektorske funkcije bez negativnog uticaja na terapeutska ili farmakokinetička svojstva antitela. (Videti, npr., USSN.14/170,166, podneta 31. januara 2014).;[0143] B. Pozitronski emiteri i helatne jedinice;[0145] Pogodni pozitronski emiteri uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji formiraju stabilne komplekse sa helatnim delom i imaju fizičko vreme poluraspada pogodno za svrhe imuno-PET snimanja. Ilustrativni pozitronski emiteri uključuju, ali nisu ograničeni na,<89>Zr,<68>Ga,<64>Cu,<44>Sc, i<86>Y. Pogodni emiteri pozitrona takođe uključuju one koji se direktno vezuju sa proteinom koji vezuje PD-L1, uključujući, ali ne ograničavajući se na,<76>Br i<124>I, i one koje se uvode preko prostetične grupe, npr.<18>F. U pronalasku, emiter pozitrona je<89>Zr.;[0146] [0094] Helatne jedinice opisane ovde su hemijske jedinice koje su kovalentno vezane za protein koji vezuje PD-L1, npr., anti-PD-L1 antitelo i sadrže deo sposoban za helatiranje pozitronskog emitera, tj., sposoban da reaguje sa emiterom pozitrona i formira koordinisani helatni kompleks. Pogodni delovi uključuju one koji omogućavaju efikasno punjenje određenog metala i formiraju metal-helatorske komplekse koji su dovoljno stabilni in vivo za dijagnostičku upotrebu, npr., imuno-PET snimanje. Ilustrativni helatni delovi uključuju one koji minimizuju disocijaciju pozitronskog emitera i akumulaciju u mineralnoj kosti, proteinima plazme i/ili taloženju koštane srži do stepena pogodnog za dijagnostičku upotrebu.;[0147] Primeri helatnih jedinica uključuju, ali nisu ograničeni na, one koje formiraju stabilne komplekse sa emiterima pozitrona<89>Zr,<68>Ga,<64>Cu,<44>Sc, i/ili<86>Y. Ilustrativni helatni delovi uključuju, ali nisu ograničeni na, one opisane u Nature Protocols, 5(4): 739, 2010; Bioconjugate Chem., 26(12): 2579 (2015); Chem Commun (Camb), 51(12): 2301 (2015); Mol. Pharmaceutics, 12: 2142 (2015); Mol. Imaging Biol., 18: 344 (2015); Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 37:250 (2010); Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging (2016). doi:10.1007/s00259‑016‑3499-x; Bioconjugate Chem., 26(12): 2579 (2015); WO 2015/140212A1; i US 5,639,879.;[0148] Ilustrativni helatni delovi takođe uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji sadrže desferioksamin (DFO), 1,4,7,10-tetrasirćetnu kiselinu (DOTA), dietilentriaminpentasirćetnu kiselinu (DTPA), etilendiamintetrasirćetnu kiselinu (EDTA), (1,4,7,10-tetraazaciklododekan-1,4,7,10-tetra(metilen fosfonsku) kiselinu (DOTP), 1R, 4R, 7R, 10R)-□'□"□‴-tetrametil-1,4,7,10-tetraazaciklododekan-1,4,7,10-tetrasirćetnu kiselinu (DOTMA), 1,4,8,11-tetraazaciklotetradekan-1,4,8,11-tetrasirćetnu kiselinu (TETA), H<4>oktapa, H<6>fosfat, H<2>dedpa, H<5>dekapa, H<2>azapa, HOPO, DO2A, 1,4,7,10-Tetrakis(karbamoilmetil)-1,4,7,10-tetraazaciklododekan (DOTAM), 1,4,7-triazaciklononan-N,N',N"-trisirćetnu kiselinu (NOTA), 1,4,7,10-Tetrakis(karbamoilmetil)-1,4,7,10-tetraazaciklododekan (DOTAM), 1,4,8,11-tetraazabiciklo[6.6.2]heksadekan-4,11-dicetinsku kiselinu (CB-TE2A), 1,4,7,10-Tetraazaciklododekan (Ciklen), 1,4,8,11-Tetraazaciklotetradekan (Ciklam), oktadentatne helatore, helatore heksadentata, helatore na bazi fosfonata, makrociklične helatore, helatore koji sadrže makrociklične tereftalamidne ligande, bifunkcionalne helatore, helatore fuzarinina C i derivata fuzarinina C, triacetilfuzarinin C (TAFC), ferioksamin E (FOXE), ferioksamin B (FOXB), ferihrom A (FCHA) i slično. U ovom pronalasku, helatna grupa obuhvata desferioksamin.;[0149] [0097] U nekim primerima izvođenja, helatne jedinice su kovalentno vezane za antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen preko linker dela, koji kovalentno vezuje helatni deo helatne grupe za vezujući protein. U nekim primerima izvođenja, ove linker jedinice se formiraju reakcijom između reaktivne jedinice proteina koji vezuje PD-L1, npr. cisteina ili lizina antitela, i reaktivne jedinice koja je vezana za helator, uključujući, na primer, pizotiocijanatobenil grupu i reaktivne jedinice date u postupcima konjugacije u nastavku. Pored toga, takve linker jedinice izborno sadrže hemijske grupe koje se koriste u svrhu podešavanja polariteta, rastvorljivosti, steričkih interakcija, krutosti i/ili dužine između helatnog dela i proteina koji vezuje PD-L1.;[0151] C. Priprema radioobeleženih anti-PD-L1 konjugata;[0153] Radioobeleženi konjugati anti-PD-L1 proteina mogu se pripremiti (1) reakcijom proteina koji vezuje PD-L1, npr. antitela, sa molekulom koji sadrži helator emitera pozitrona i deo reaktivan sa željenim mestom konjugacije proteina koji vezuje PD-L1 i (2) ubacivanjem željenog emitera pozitrona.;[0154] Pogodna mesta za konjugaciju uključuju, ali nisu ograničena na, lizin i cistein, koji oba mogu biti, na primer, prirodni ili genetski modifikovani, i mogu biti, na primer, prisutni na teškom ili lakom lancu antitela. Mesta za konjugaciju cisteina uključuju, ali nisu ograničena na, ona dobijena mutacijom, insercijom ili redukcijom disulfidnih veza antitela. Postupci za pravljenje genetski modifikovanih antitela cisteinom uključuju, ali nisu ograničene na, one koje su opisane u WO2011/056983. Postupci konjugacije specifične za mesto takođe se mogu koristiti za usmeravanje reakcije konjugacije na specifična mesta antitela, postizanje poželjne stehiometrije i/ili postizanje poželjnih odnosa lek-antitelo (DAR). Takvi postupci konjugacije su poznati stručnjacima u ovoj oblasti i uključuju, ali nisu ograničeni na, inženjering cisteina i enzimske i hemo-enzimske postupke, uključujući, ali nisu ograničeni na, konjugaciju glutamina, konjugaciju Q295 i konjugaciju posredovanu transglutaminazom, kao i one opisane u J. Clin. Immunol., 36: 100 (2016)). Pogodni delovi koji reaguju na željeno mesto konjugacije generalno omogućavaju efikasno i lako spajanje proteina koji vezuje PD-L1, npr., antitelo i helator emitera pozitrona. Grupe koje reaguju na mesta lizina i cisteina uključuju elektrofilne grupe, koje su poznate stručnjacima iz ove oblasti. U određenim aspektima, kada je željeno mesto konjugacije lizin, reaktivna grupa je izotiocijanat, npr., p-izotiocijanatobenil grupa ili reaktivni estar. U određenim aspektima, kada je željeno mesto konjugacije cistein, reaktivni deo je maleimid.;[0155] [0100] Kada je helator desferioksamin (DFO), pogodne reaktivne grupe uključuju, ali nisu ograničene na, izotiocijantatobenzil grupu, n-hidroksisukcinimid estar, 2,3,5,6 tetrafluorfenol estar, n-sukcinimidil-S-acetiltioacetat i one opisane u BioMed Research International, Vol 2014, Article ID 203601. U određenim primerima izvođenja, protein koji vezuje PD-L1 je antitelo, a molekul koji sadrži helator pozitronskog emitera i deo reaktivan sa mestom konjugacije je pizotiocijantatobenzil-desferioksamin (p-SCN-Bn-DFO):;[0158] ;[0160] Punjenje pozitronskim emiterom se postiže inkubacijom konjugata helatora proteina koji vezuje PD-L1 sa pozitronskim emiterom tokom vremena dovoljnog da se omogući koordinacija pomenutog pozitronskog emitera sa helatorom, npr. izvođenjem postupaka opisanih u primerima datim ovde, ili suštinski sličnim postupkom.;[0162] D. Ilustrativni primeri konjugata;[0164] U ovom otkriću su uključeni radioobeleženi konjugati antitela koji sadrže antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji se vezuje za ligand 1 humane programirane smrti (PD-L1), helatni deo i emiter pozitrona.;[0165] U ovom pronalasku, helatna grupa obuhvata desferioksamin. U određenim primerima izvođenja, helatna grupa je p-izotiocijanatobenzil-desferioksamin.;[0166] U pronalasku, emiter pozitrona je<89>Zr.;[0167] U nekim primerima izvođenja, odnos helatne grupe i antitela konjugata je od 1 do 2.;[0168] U posebnom primeru izvođenja, helatna grupa je p-izotiocijanatobenzil-desferioksamin, a emiter pozitrona je<89>Zr. U drugom posebnom primeru izvođenja, helatna grupa je pizotiocijanatobenzil-desferioksamin, a emiter pozitrona je<89>Zr, a odnos helatne grupe i antitela u konjugatu je od 1 do 2.;[0169] U nekim primerima izvođenja, ovde su obezbeđeni proteini koji vezuju antigen i vezuju PD-L1, pri čemu su navedeni proteini koji vezuju antigen i vezuju PD-L1 kovalentno vezani za jedan ili više delova koji imaju sledeću strukturu:;[0170] -L-M<Z>;[0171] gde je L helatni deo; M je emiter pozitrona; i z, nezavisno u svakom pojavljivanju, je 0 ili 1; i gde najmanje jedno od z je 1. U određenim primerima izvođenja, radioobeleženi protein koji vezuje antigen je jedinjenje Formule (I):;[0172] M-L-A-[L-M<Z>]<k>(I);[0173] A je protein koji se vezuje za PD-L1; L je helatni deo; M je emiter pozitrona; z je 0 ili 1; a k je ceo broj od 0-30. U nekim primerima izvođenja, k je 1.;[0174] U nekim primerima izvođenja, L je:;[0177] ;[0179] U nekim primerima izvođenja, M je<89>Zr.;[0180] U nekim primerima izvođenja, k je ceo broj od 1 do 2. U nekim primerima izvođenja, k je 1.;[0181] U nekim primerima izvođenja, -L-M je;[0184] ;[0186] U ovom otkriću su takođe uključeni postupci sinteze radioobeleženih konjugata antitela koji obuhvataju dovođenje u kontakt jedinjenja Formule (III):;[0189] ;[0190] sa<89>Zr, gde je A antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen i vezuje PD-L1. U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) se sintetiše dovođenjem u kontakt antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen (kao što je definisano u patentnim zahtevima), koje vezuje PD-L1, sa p-SCN-Bn-DFO.;[0191] Ovde je takođe dat proizvod reakcije između jedinjenja Formule (III) sa<89>Zr.;[0192] Ovde su data jedinjenja Formule (III):;[0195] ;[0197] gde je A antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen i vezuje PD-L1, a k je ceo broj od 1 do 30. U nekim primerima izvođenja, k je 1 ili 2.;[0198] U nekim primerima izvođenja, ovde su date kompozicije koje sadrže konjugat koji ima sledeću strukturu:;[0199] A-L<k>;[0200] gde je A protein koji vezuje PD-L1; L je helatni deo; i k je ceo broj od 1-30; gde je konjugat heliran sa pozitronskim emiterom u količini dovoljnoj da obezbedi specifičnu aktivnost pogodnu za kliničko PET snimanje. U nekim primerima izvođenja, količina heliranog pozitronskog emitera je količina dovoljna da obezbedi specifičnu aktivnost od 1-3 mCi na 1-50 mg proteina koji vezuje PD-L1.;[0201] U nekim aspektima ovog otkrića, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen vezuje monomerni humani ligand programirane smrti 1 (PD-L1) sa ravnotežnom konstantom disocijacije vezivanja (K<D>) manjom od oko 310 pM mereno u testu površinske plazmonske rezonancije na 37°C.;[0202] U nekim aspektima ovog otkrića, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment vezuje monomerni humani PD-L1 sa K<D>manjom od oko 180 pM u testu površinske plazmonske rezonancije na 25°C.;[0203] U nekim aspektima ovog otkrića, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment vezuje dimerni humani PD-L1 sa K<D>manjom od oko 15 pM mereno u testu površinske plazmonske rezonancije na 37°C.;[0204] U nekim aspektima ovog otkrića, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji vezuje dimerni humani PD-L1 sa K<D>manjom od oko 8 pM u testu površinske plazmonske rezonancije na 25°C.;[0205] U nekim aspektima ovog otkrića, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen konkuriše za vezivanje za humani PD-L1 sa referentnim antitelom koje sadrži regione koji određuju komplementarnost (CDR) HCVR, pri čemu HCVR ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od HCVR sekvenci navedenih u Tabeli 1; i CDR LCVR, pri čemu LCVR ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od LCVR sekvenci navedenih u Tabeli 1. U nekim aspektima ovog otkrića, referentno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci kao što je navedeno u Tabeli 1. U nekim aspektima ovog otkrića, referentno antitelo sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 82/90, 98/106, 146/154, 162/170, 290/274, 306/274, 314/274 i 330/274.;[0206] U nekim aspektima ovog otkrića, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen pojačava vezivanje PD-L1 za jedan od PD-1 ili B7-1. U nekim aspektima ovog otkrića, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen blokira vezivanje PD-L1 za PD-1 i/ili B7-1. U nekim aspektima ovog otkrića, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ne povećava ili smanjuje vezivanje PD-L1 za njegove ligande.;[0207] U nekim aspektima ovog otkrića, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži regione koji određuju komplementarnost (CDR) HCVR, pri čemu HCVR ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18, 66, 114, 130, 202, 218, 266, 282, 298, 322 i 338; i CDR LCVR, gde LCVR ima aminokiselinsku sekvencu izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 26, 74, 122, 138, 210, 226 i 274. U određenim aspektima ovog otkrića, izolovano antitelo sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 114/122, 130/138, 202/210, 218/226, 266/274, 282/274, 298/274, 322/274 i 338/274.;[0208] U nekim aspektima ovog otkrića, antitelo je humano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen i specifično se vezuje za humani PD-L1, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od HCVR sekvenci navedenih u Tabeli 1.;[0209] [0124] U nekim aspektima ovog otkrića, antitelo je humano monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za humani PD-L1, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od LCVR sekvenci navedenih u Tabeli 1.;[0210] U nekim aspektima ovog otkrića, antitelo je humano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, koje se specifično vezuje za humani PD-L1, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži (a) HCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od HCVR sekvenci navedenih u Tabeli 1; i (b) LCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od LCVR sekvenci navedenih u Tabeli 1.;[0211] U nekim aspektima ovog otkrića, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (CDR) (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) sadržana unutar bilo koje od sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) navedenih u Tabeli 1; i tri CDR lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) sadržana unutar bilo koje od sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) navedenih u Tabeli 1.;[0212] U nekim aspektima ovog otkrića, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži:;[0214] (a) HCDR1 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 292, 300, 308, 316, 324, 332 i 340;;[0215] (b) HCDR2 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 294, 302, 310, 318, 326, 334 i 342;;[0216] (c) HCDR3 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 296, 304, 312, 320, 328, 336 i 344;;[0217] (d) LCDR1 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 196, 212, 228, 244, 260 i 276;;[0218] (e) LCDR2 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 198, 214, 230, 246, 262 i 278; i;[0219] (f) LCDR3 domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 200, 216, 232, 248, 264 i 280.;[0220] U nekim aspektima ovog otkrića, antitelo ili fragment koji vezuje antigen sadrži HCVR/LCVR par aminokiselinskih sekvenci izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 82/90, 98/106, 146/154, 162/170, 290/274, 306/274, 314/274 i 330/274;[0221] U nekim aspektima ovog otkrića, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži CDR HCVR, gde HCVR ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 34, 50, 82, 98, 146, 162, 178, 186, 234, 250, 290, 306, 314 i 330; i CDR LCVR, gde LCVR ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 10, 42, 58, 90, 106, 154, 170, 194, 242, 258 i 274.;[0223] E. Proizvodnja u velikim razmerama za proizvodnju konjugata antitela i helatora anti-PD-L1;[0225] U ovom otkriću su uključeni postupci proizvodnje u većim razmerama za proizvodnju anti-PD-L1 antitela konjugovanih sa helatorom. Konjugati anti-PD-L1 antitela i helatora su u obliku pogodnom za radioobeležavanje.;[0226] Dobri proizvodni procesi se poštuju u svim aspektima proizvodnje, uključujući održavanje sterilnog okruženja, primenu aseptičnih postupaka, vođenje evidencije o svim procesima i dokumentovanje kvaliteta, čistoće, jačine i identičnosti proizvoda, kao i svih odstupanja od njih.;[0227] Proces proizvodnje u proširenim razmerama je, u nekim aspektima, mnogo brži od procesa proizvodnje za istraživanje i razvoj. U nekim aspektima, proces proizvodnje u proširenim razmerama može trajati manje od 12 sati, ili manje od 10 sati, ili manje od 8 sati, ili manje od 6 sati, ili manje od 4 sata, ili manje od ili oko 2 sata.;[0228] U nekim aspektima, prvi korak obuhvata ultrafiltraciju i dijafiltraciju (UFDF), korišćenjem membrane od 30-50kDa, anti-PD-L1 antitela da bi se uklonili ekscipijenti, vrste koje ometaju konjugaciju i soli koje inhibiraju proces konjugacije. Primeri membranskih polimera uključuju polietarsulfon (PES), celulozni acetat (CA) i regenerisanu celulozu (RC). U ovom koraku, antitelo se puferuje u rastvoru neometajućeg pufera niske jonske jačine. pH vrednost pufera može biti između oko 4,5 do oko 6, ili oko 5 do oko 6, ili oko 5,3 do oko 5,7, ili oko 5,5. Puferski sistemi koji se ovde smatraju korisnim uključuju bilo koji puferski sistem kome nedostaje primarni amin. Primeri pufera uključuju acetatne, fosfatne ili citratne pufere. Pufer obezbeđuje stabilnost proteina tokom obrade pre konjugacije. Zapremina procesa može se dodatno smanjiti da bi se koncentrovalo antitelo, a zatim sterilno filtrirati.;[0229] Nakon prethodne konjugacije UFDF, koncentrovano i filtrirano antitelo može se preneti u sistem karbonatnog pufera bez amina. Sistem karbonatnog pufera može imati pH vrednost u opsegu od oko 8,5 do oko 9,6, ili od oko 9,0 do oko 9,6, ili od oko 9,2 do oko 9,4, ili od oko 9,4 do oko 9,6, ili pH vrednost od oko 9,4.;[0230] Helator, na primer, DFO, u rastvaraču se dodaje do ciljne koncentracije u puferski sistem koji sadrži antitelo, a dodatni rastvarač se može dodati u rastvor do željenog procenta. Helator se može dodati u molarnom višku antitela, na primer, 3,5-5:1 helator prema antitelu. Ukupna zapremina reakcije može biti do 5 L.;[0231] Temperatura reakcije i vreme reakcije su obrnuto proporcionalni. Na primer, ako je temperatura reakcije viša, vreme reakcije je kraće. Ako je temperatura reakcije niža, vreme reakcije je duže. Na primer, na temperaturi iznad oko 18°C, reakcija može trajati manje od 2 sata; na temperaturi ispod 18°C, reakcija može trajati duže od 2 sata.;[0232] Reakcija konjugacije može se prekinuti gašenjem, na primer, dodavanjem sirćetne kiseline.;[0233] U nekim aspektima, konjugacija antitela sa deferoksaminom se vrši da bi se proizveli DFO-mAb konjugati. U nekim aspektima, konjugacija antitela sa p-SCN-Bn-deferoksaminom se vrši da bi se proizveli DFO-mAb konjugati.;[0234] Primeri rastvarača za helator uključuju DMSO i DMA. Naknadni koraci UFDF koriste membrane, a membrana se bira na osnovu sistema rastvarača koji se koristi u koraku konjugacije. Na primer, DMA rastvara PES membrane, tako da se ova dva ne mogu koristiti u istom sistemu.;[0235] Karbonatni puferi nisu poželjni zbog stabilnosti konjugata tokom dugoročnog skladištenja. Stoga, kada se formiraju konjugati antitela i helatora, oni se mogu zameniti puferom izabranim posebno za dugoročno skladištenje i stabilnost. Primeri pufera uključuju citratne, acetatne, fosfatne, argininske i histidinske pufere. Dalji korak UFDF može se izvršiti da bi se uklonile preostale soli i obezbedila odgovarajuća koncentracija, nivo ekscipijenta i pH konjugovanog monoklonskog antitela. Dobijeni konjugati antitela i helatora mogu se sterilno filtrirati i čuvati za kasniju formulaciju.;[0237] III. Postupci korišćenja radioobeleženih imunokonjugata;[0239] [0141] U određenim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje dijagnostičke i terapeutske postupke upotrebe radioobeleženih konjugata antitela ovog otkrića. Svaku referencu na postupak lečenja ili dijagnoze koji se primenjuje na ljudskom ili životinjskom telu treba tumačiti kao supstance i kompozicije za upotrebu u takvim postupcima.;[0240] Prema jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje postupke za detekciju PD-L1 u tkivu, pri čemu postupci obuhvataju primenu ovde datog radioobeleženog konjugata antitela na tkivo; i vizuelizaciju ekspresije PD-L1 pomoću pozitronsko-emisione tomografije (PET). U određenim primerima izvođenja, tkivo sadrži ćelije ili ćelijske linije. U određenim primerima izvođenja, tkivo je prisutno kod subjekta, pri čemu je subjekt sisar. U određenim primerima izvođenja, subjekt je humani subjekt. U određenim primerima izvođenja, subjekt ima bolest ili poremećaj izabran iz grupe koja se sastoji od kancera, zarazne bolesti i inflamatorne bolesti. U jednom ostvarenju, subjekt ima kancer. U određenim primerima izvođenja, zarazna bolest je bakterijska ili virusna infekcija uzrokovana, na primer, virusom hepatitisa B (HBV), virusom hepatitisa C (HCV), virusom humane imunodeficijencije (HIV) i Mycobacterium tuberculosis.;[0241] Prema jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje postupke snimanja tkiva koje eksprimira PD-L1, koje obuhvataju primenu radioaktivno obeleženog konjugata antitela ovog otkrića na tkivo; i vizuelizaciju ekspresije PD-L1 pomoću pozitronsko-emisione tomografije (PET). U jednom primeru izvođenja, tkivo je obuhvaćeno tumorom. U jednom primeru izvođenja, tkivo je obuhvaćeno kulturom tumorskih ćelija ili ćelijskom linijom tumora. U jednom primeru izvođenja, tkivo je obuhvaćeno tumorskom lezijom kod subjekta.;[0242] Prema jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje postupke za merenje odgovora na terapiju, pri čemu se odgovor na terapiju meri merenjem upale. Postupke, prema ovom aspektu, obuhvataju davanje radioaktivno obeleženog konjugata antitela koji je ovde dat subjektu kome je to potrebno i vizuelizaciju ekspresije PD-L1 pomoću pozitronsko-emisione tomografije (PET). U određenim primerima izvođenja, upala je prisutna u tumoru kod subjekta. U određenim primerima izvođenja, povećanje ekspresije PD-L1 je u korelaciji sa povećanjem upale u tumoru.;[0243] Prema jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje postupke za određivanje da li je pacijent pogodan za antitumorsku terapiju koja obuhvata inhibitor PD-1/PD-L1 signalne ose, pri čemu postupci obuhvataju odabir pacijenta sa solidnim tumorom, primenu radioobeleženog konjugata antitela iz ovog otkrića i lokalizaciju primenjenog radioobeleženog konjugata antitela u tumoru pomoću PET snimanja, pri čemu prisustvo radioobeleženog konjugata antitela u tumoru identifikuje pacijenta kao pogodnog za antitumorsku terapiju koja obuhvata inhibitor PD-1/PD-L1 signalne ose.;[0244] [0146] Prema jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje postupke za identifikaciju kandidata za antitumorsku terapiju koja obuhvata inhibitor PD-1/PD-L1 signalne ose, pri čemu postupci obuhvataju odabir pacijenta sa solidnim tumorom, primenu radioobeleženog konjugata antitela iz ovog otkrića i lokalizaciju primenjenog radioobeleženog konjugata antitela u tumoru pomoću PET snimanja, pri čemu prisustvo radioobeleženog konjugata antitela u tumoru identifikuje pacijenta kao pogodnog za antitumorsku terapiju koja obuhvata inhibitor PD-1/PD-L1 signalne ose.;[0245] Prema jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje postupke za predviđanje odgovora pacijenta na antitumorsku terapiju koja sadrži inhibitor PD-1/PD-L1 signalne ose, pri čemu postupci obuhvataju odabir pacijenta sa solidnim tumorom, određivanje da li je tumor PD-L1-pozitivan, pri čemu se pozitivan odgovor pacijenta predviđa ako je tumor PD-L1-pozitivan. U određenim primerima izvođenja, tumor se utvrđuje kao pozitivan primenom radioobeleženog konjugata antitela ovog otkrića i lokalizacijom radioobeleženog konjugata antitela u tumoru pomoću PET snimanja, pri čemu prisustvo radioobeleženog konjugata antitela u tumoru ukazuje da je tumor PD-L1-pozitivan.;[0246] Prema jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje postupke za otkrivanje PD-L1-pozitivnog tumora kod subjekta. Postupci, prema ovom aspektu, obuhvataju odabir subjekta sa solidnim tumorom; davanje radioaktivno obeleženog konjugata antitela ovog otkrića subjektu; i određivanje lokalizacije radioaktivno obeleženog konjugata antitela pomoću PET snimanja, pri čemu prisustvo radioaktivno obeleženog konjugata antitela u tumoru ukazuje da je tumor PD-L1-pozitivan.;[0247] [0149] Kako se ovde koristi, izraz „subjekat kome je to potrebno“ označava humanog ili nehumanog sisara koji pokazuje jedan ili više simptoma ili indikacija kancera i/ili kome je dijagnostikovan kancer, uključujući solidni tumor i kome je potrebno lečenje istog. U mnogim primerima izvođenja, termin „subjekat“ može se naizmenično koristiti sa terminom „pacijent“. Na primer, humanom subjektu može se dijagnostikovati primarni ili metastatski tumor i/ili jedan ili više simptoma ili indikacija, uključujući, ali ne ograničavajući se na, neobjašnjiv gubitak težine, opštu slabost, uporni umor, gubitak apetita, groznicu, noćno znojenje, bol u kostima, otežano disanje, otečen stomak, bol/pritisak u grudima, uvećanje slezine i povišenje nivoa biomarkera povezanog sa kancerom (npr., CA125). Ekspresija obuhvata subjekte sa primarnim ili već uspostavljenim tumorima. U specifičnim primerima izvođenja, ekspresija obuhvata humane subjekte koji imaju i/ili im je potrebno lečenje solidnog tumora, npr., kancer debelog creva, kancer dojke, kancer pluća, kancer prostate, kancer kože, kancer jetre, kancer kostiju, kancer jajnika, kancer grlića materice, kancer pankreasa, kancer glave i vrata i kancer mozga. Termin obuhvata subjekte sa primarnim ili metastatskim tumorima (uznapredovali maligniteti). U određenim primerima izvođenja, izraz „subjekat kome je to potrebno“ obuhvata pacijente sa solidnim tumorom koji je rezistentan ili refraktoran na prethodnu terapiju ili je neadekvatno kontrolisan prethodnom terapijom (npr., lečenje antikancerogenim sredstvom). Na primer, izraz uključuje subjekte koji su prethodno lečeni jednom ili više linija terapije, kao što je lečenje hemoterapijom (npr., karboplatin ili docetaksel). U određenim primerima izvođenja, izraz „subjekat kome je to potrebno“ obuhvata pacijente sa solidnim tumorom koji je lečen jednom ili više linija prethodne terapije, ali koji je potom recidivirao ili metastazirao. U određenim primerima izvođenja, termin obuhvata subjekte koji imaju inflamatornu bolest ili poremećaj, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kancer, reumatoidni artritis, aterosklerozu, parodontitis, polensku groznicu, srčane bolesti, koronarnu arterijsku bolest, infektivne bolesti, bronhitis, dermatitis, meningitis, astmu, tuberkulozu, ulcerozni kolitis, Crohn-ovu bolest, inflamatornu bolest creva, hepatitis, sinusitis, psorijazu, alergiju, fibrozu, lupus, vaskulitis, ankilozni spondilitis, Graves-ovu bolest, celijakiju, fibromijalgiju i odbacivanje transplantata.;[0248] U određenim primerima izvođenja, postupci ovog otkrića se koriste kod subjekta sa solidnim tumorom. Termini „tumor“, „kancer“ i „malignitet“ se ovde koriste naizmenično. Kako se ovde koristi, termin „solidni tumor“ odnosi se na abnormalnu masu tkiva koja obično ne sadrži ciste ili tečna područja. Solidni tumori mogu biti benigni (nije kancer) ili maligni (kancer). Za potrebe ovog otkrića, termin „solidni tumor“ označava maligne solidne tumore. Termin obuhvata različite vrste solidnih tumora nazvanih po tipovima ćelija koje ih formiraju, odnosno sarkome, karcinome i limfome. U određenim primerima izvođenja, termin „solidni tumor“ obuhvata kancere uključujući, ali ne ograničavajući se na, kolorektalni kancer, kancer jajnika, kancer prostate, kancer dojke, kancer mozga, kancer grlića materice, kancer bešike, analni kancer, kancer materice, kancer debelog creva, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer pluća, kancer endometrijuma, kancer kostiju, kancer testisa, kancer kože, kancer bubrega, kancer želuca, kancer jednjaka, kancer glave i vrata, kancer pljuvačnih žlezda i mijelom.;[0249] Prema jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje postupke lečenja tumora kod subjekta. Postupci, prema ovom aspektu, obuhvataju odabir subjekta sa solidnim tumorom; utvrđivanje da je tumor PD-L1-pozitivan; i davanje jedne ili više doza inhibitora PD-1/PD-L1 signalne ose. U određenim primerima izvođenja, tumor se utvrđuje kao PD-L1-pozitivan davanjem radioobeleženog konjugata antitela ovog otkrića subjektu; i vizuelizaciju radioobeleženog konjugata antitela u tumoru pomoću PET snimanja, gde prisustvo radioobeleženog konjugata antitela u tumoru ukazuje da je tumor PD-L1-pozitivan.;[0250] [0152] Kako se ovde koriste, termini „lečiti“, „lečenje“ ili slično, znače ublažavanje simptoma, eliminisanje uzroka simptoma, bilo privremeno ili trajno, odlaganje ili inhibiranje rasta tumora, smanjenje broja tumorskih ćelija ili opterećenja tumorom, podsticanje regresije tumora, izazivanje smanjenja, nekroze i/ili nestanka tumora, sprečavanje ponovne pojave tumora, sprečavanje ili inhibiranje metastaza, inhibiranje rasta metastatskog tumora i/ili povećanje trajanja preživljavanja subjekta.;[0251] Prema jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje postupke za praćenje efikasnosti antitumorske terapije kod subjekta, pri čemu postupci obuhvataju odabir subjekta sa solidnim tumorom gde se subjekt leči antitumorskom terapijom; primenu radioaktivno obeleženog konjugata antitela ovog otkrića subjektu; snimanje lokalizacije primenjenog radioaktivno obeleženog konjugata u tumoru pomoću PET snimanja; i određivanje rasta tumora, pri čemu smanjenje od osnovne vrednosti radioaktivno obeleženog signala ukazuje na regresiju tumora i efikasnost antitumorske terapije. U određenim primerima izvođenja, antitumorska terapija obuhvata inhibitor PD-1/PD-L1 signalne ose (npr., anti-PD-1 antitelo).;[0252] U određenim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje postupke za procenu promena u inflamatornom stanju tumora, pri čemu postupci obuhvataju odabir subjekta sa solidnim tumorom gde se subjekt leči antitumorskom terapijom; davanje radioaktivno obeleženog konjugata antitela koji je ovde dat subjektu; i snimanje lokalizacije primenjenog radioaktivno obeleženog konjugata u tumoru pomoću PET snimanja, pri čemu povećanje od osnovne vrednosti radioaktivno obeleženog signala ukazuje na povećanje upale i efikasnosti antitumorske terapije. U određenim primerima izvođenja, antitumorska terapija obuhvata inhibitor PD-1/PD-L1 signalne ose (npr., anti-PD-1 antitelo).;[0253] Kako se ovde koristi, termin „početna vrednost“, u odnosu na ekspresiju PD-L1 u tumoru, označava numeričku vrednost apsorpcije radioobeleženog konjugata za subjekta pre ili u vreme primene doze antitumorske terapije. Apsorpcija radioobeleženog konjugata se određuje korišćenjem postupka poznatih u struci (videti, na primer, Oosting et al 2015, J. Nucl. Med.56: 63-69). U određenim primerima izvođenja, antitumorska terapija obuhvata inhibitor PD-1/PD-L1 signalne ose.;[0254] [0156] Da bi se utvrdilo da li postoji regresija tumora, apsorpcija radioobeleženog konjugata se kvantifikuje na početku i u jednoj ili više vremenskih tačaka nakon primene inhibitora signalne ose PD-1/PD-L1 (npr., anti-PD-1 antitelo). Na primer, apsorpcija primenjenog radioaktivno obeleženog konjugata antitela (npr., radioobeleženi konjugat anti-PD-L1 antitela) može se meriti 2. dana, 3. dana, 4. dana, 5. dana, 6. dana, 7. dana, 8. dana, 9. dana, 10. dana, 11. dana, 12. dana, 14. dana, 15. dana, 22. dana, 25. dana, 29. dana, 36. dana, 43. dana, 50. dana, 57. dana, 64. dana, 71. dana, 85. dana; ili na kraju 1. nedelje, 2. nedelje, 3. nedelje, 4. nedelje, 5. nedelje, 6. nedelje, 7. nedelje, 8. nedelje, 9. nedelje, 10. nedelje, 11. nedelje, 12. nedelje, 13. nedelje, 14. nedelje, 15. nedelje, 16. nedelje, 17. nedelje, 18. nedelje, 19. nedelje, 20. nedelje, 21. nedelje, 22. nedelje, 23. nedelje, 24. nedelje ili duže, nakon početnog tretmana inhibitorom PD-1/PD-L1 signalne ose (npr., anti-PD-1 antitelo). Razlika između vrednosti apsorpcije u određenom vremenskom trenutku nakon početka lečenja i vrednosti apsorpcije na početku se koristi da bi se utvrdilo da li je došlo do razlike u količini tumorskog tkiva (regresija ili progresija tumora). Na primer, smanjenje apsorpcije od početne vrednosti nakon lečenja sa najmanje jednom dozom inhibitora signalne ose PD-1/PD-L1 znači regresiju tumora i ukazuje na efikasnost antitumorske terapije.;[0255] U određenim primerima izvođenja, radioobeleženi konjugat antitela se primenjuje intravenski ili subkutano subjektu. U određenim primerima izvođenja, radioobeleženi konjugat antitela se primenjuje intratumoralno. Nakon primene, radioobeleženi konjugat antitela je lokalizovan u tumoru. Lokalizovani radioobeleženi konjugat antitela se snima PET snimanjem, a apsorpcija radioobeleženog konjugata antitela od strane tumora se meri postupcima poznatim u struci. U određenim primerima izvođenja, snimanje se vrši 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 dana nakon primene radioobeleženog konjugata. U određenim primerima izvođenja, snimanje se vrši istog dana nakon primene radioobeleženog konjugata antitela.;[0256] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen specifično se vezuje za PD-L1. U određenim aspektima, anti-PD-L1 antitelo sadrži CDR HCVR, gde HCVR ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 34, 50, 82, 98, 146, 162, 178, 186, 234, 250, 290, 306, 314 i 330; i CDR LCVR, gde LCVR ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 10, 42, 58, 90, 106, 154, 170, 194, 242, 258 i 274.;[0257] U određenim primerima izvođenja, inhibitor PD-1/PD-L1 signalne ose obuhvata antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za PD-1. U određenim primerima izvođenja, anti-PD-1 antitelo je izabrano iz grupe koja se sastoji od nivolumaba i pembrolizumaba. U određenim drugim primerima izvođenja, inhibitor PD-1/PD-L1 signalne ose obuhvata antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za PD-L1. U jednom primeru izvođenja, anti-PD-L1 antitelo je atezolizumab. U jednom primeru izvođenja, anti-PD-L1 antitelo obuhvata HCVR SEQ ID NO: 82 i LCVR SEQ ID NO: 90.;[0259] IV. Primeri;[0261] Određeni primeri izvođenja ovog otkrića ilustrovani su sledećim neograničavajućim primerima.;[0262] Primer 1: Generisanje humanih antitela na PD-L1;[0264] Humana antitela protiv PD-L1, uključujući ona navedena u Tabeli 1, pripremljena su i okarakterisana kao što je opisano u američkoj patentnoj publikaciji br. US 2015-0203580 A1. Ukratko, humana antitela na PD-L1 su generisana korišćenjem fragmenta PD-L1 koji je od oko 19 do 239 aminokiselina PD-L1 (Genbank pristupni broj NP_054862.1). Imunogen je primenjen direktno, sa adjuvansom za stimulaciju imunog odgovora, na mišji VELOCIMMUNE<®>koji sadrži DNK koja kodira varijabilne regione teškog i kapa lakog lanca humanog imunoglobulina. Imunološki odgovor antitela praćen je PD-L1-specifičnim imunološkim testom. Kada je postignut željeni imunološki odgovor, splenociti su sakupljeni i spojeni sa ćelijama mišjeg mijeloma kako bi se sačuvala njihova vitalnost i formirale hibridomske ćelijske linije. Hibridomske ćelijske linije su podvrgnute skriningu i odabrane da bi se identifikovale ćelijske linije koje proizvode PD-L1-specifična antitela. Koristeći ovu tehniku i imunogen opisan gore, nekoliko himernih antitela protiv PD-L1 (tj. dobijena su antitela koja poseduju humane varijabilne domene i mišje konstantne domene); primerna antitela generisana na ovaj način označena su kao H2M8306N, H2M8307N, H2M8309N, H2M8310N, H2M8312N, H2M8314N, H2M8316N, H2M8317N, H2M8321N, H2M8323N, H2M8718N, H2M8718N2 i H2M8719N.;[0265] Anti-PD-L1 antitela su takođe izolovana direktno iz antigen-pozitivnih B ćelija bez fuzije sa ćelijama mijeloma, kao što je opisano u U.S. 2007/0280945A1. Koristeći ovaj postupak, nekoliko potpuno humanih anti-PD-L1 antitela (tj. antitela koja poseduju humane varijabilne domene i humane konstantne domene) su dobijena; primerna antitela generisana na ovaj način su označena na sledeći način: H1H9323P, H1H9327P, H1H9329P, H1H9336P, H1H9344P2, H1H9345P2, H1H9351P2, H1H9354P2, H1H9364P2, H1H9373P2, H1H9382P2, H1H9387P2 i H1H9396P2.;[0267] Primer 2: Konjugacija anti-PD-L1 antitela H4H8314N sa p-SCN-Bn-DFO;[0269] Da bi se modifikovalo roditeljsko anti-PD-L1 antitelo, H4H8314N, i izotipsko kontrolno antitelo kako bi bili pogodni za imunoPET studije sa radioobeležavanjem, helator, p-SCN-bn-Deferoksamin (DFO; Macrocylics, kat. br.: B-705), je vezan za antitela.;[0270] [0164] Za modifikaciju, H4H8314N je prvo puferski zamenjen u PBS, pH 7,2 iz histidinskog pufera dijalizom na 4°C preko noći (Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette G2 10k MWCO; ThermoScientific), a zatim je pufer ponovo zamenjen korišćenjem PD-10 kolone (GE Healthcare, kat. br.: 17-0851-01) u pufer sastavljen od 50 mM karbonatnog pufera, 150 mM NaCl, pH 9,0 (pufer za konjugaciju). Da bi se odredila koncentracija nakon zamene pufera, uzorci su mereni na Nanodrop 2000 UV/VIS spektrometru (Thermo Scientific) koristeći koeficijent ekstinkcije od 1,46 g/L zasnovan na MacVector sekvenci (videti Tabelu 2). U polipropilenskoj epruveti od 15 mL, 773,9 µL H4H8314N (12,5 mg) je dodato u 1676,1 µL pufera za konjugaciju. U posebnoj bočici, 29,3 μL DMSO je dodato u 20,7 μL DFO. U koracima od jedne četvrtine, ovaj rastvor DFO je dodat u rastvor H1H8314N, svaki put nežno mešajući pipetiranjem gore-dole. Konačni rastvor je bio 5 mg/mL H4H8314N u puferu za konjugaciju, 2% DMSO sa 6-strukim viškom DFO mol-po-mol. Ovaj rastvor je ostavljen da se inkubira u vodenom kupatilu na 37°C bez dodatnog mešanja.;[0271] Nakon 30 minuta na 37°C, rastvor je odmah propušten kroz kolonu za odsoljavanje PD-10 (GE Healthcare, kat. br.: 17-0851-01), prethodno uravnoteženu puferom koji sadrži 250 mM NaAcO pri pH 5,4 (pufer za formulaciju). Konačni rastvor je sterilno filtriran preko špric filtera (Acrodisc 13 mm špric filter, Pall Corporation, kat. br.: 4602). Koncentracija i odnos DFO-antitela (DAR) su potom mereni UV/VIS spektroskopijom. Za merenje apsorbancije, antitelo konjugovano sa DFO je mereno u odnosu na pufer za formulaciju na 252 nm (A252), 280 nm (A280) i 600 nm (A600). Za izračunavanje, osnovni nivo je korigovan za svaku vrednost apsorbancije korišćenjem jednačine:;[0274] ;[0276] Konjugat antitela je testiran na agregaciju korišćenjem SEC hromatografije, sa 25 μg uzorka ubrizganog na kolonu Superdex 200 (GE Healthcare, kat. br. 17-5175-01) praćenu na 280 nm sa PBS mobilnom fazom (0,75 mL/min). Integritet antitela je procenjen pomoću SDS-PAGE 4-20% Tris/Gly pre-cast gela (Novex) sa 2 μg napunjenog uzorka. Gel je prikazan na slici 1. Koncentracija antitela, koncentracija konjugata i DAR su izračunati korišćenjem jednačina navedenih u nastavku:;[0278] Izračunavanje koncentracije antitela;[0281] Konc; ;[0283] Izračunavanje koncentracije konjugata;[0286] Konc konjugata (mg/mL); ;[0288] Izračunavanje DAR;[0289] ;[0291] Tabela 2: Molarni koeficijenti ekstinkcije i molekulska težina;[0293] ;[0296] Tabela 3: UV DAR, procenat agregata i koncentracija nakon vezivanja DFO;[0298] ;[0301] Primer 3:<89>Zr helacija monoklonskih antitela konjugovanih sa DFO;[0303] Za upotrebu u imunoPET in vivo studijama, DFO-konjugovano anti-PD-L1 antitelo, H4H8314N, i DFO-konjugovano izotipsko kontrolno antitelo su radioobeleženi sa<89>Zr.;[0304] DFO-konjugovano antitelo (250 ili 750 μg) je prvo dovedeno do 1,25 mg/mL u 1 M HEPES, pH 7,2. Recept za rastvor DFO-Ab konjugata za svaku studiju je naveden u Tabeli 4. Odvojeno, rastvor<89>Zr je pripremljen korišćenjem recepta za svaku odgovarajuću studiju prikazanu u Tabeli 5. Stok rastvor<89>Zr-oksalne kiseline je dobijen od PerkinElmer ili 3D Imaging. Ako je koncentracija radioaktivnosti osnovnog rastvora bila niska (videti Tabelu 5), izvršen je korak neutralizacije sa 1 M borata, pH 9,0. Konačna radioaktivnost rastvora je prvo potvrđena korišćenjem Capintec CRC-25R kalibratora doze (Capintec #520), zatim odmah kombinovana sa rastvorom DFO-Ab konjugata, nežno promešana (pipetiranjem gore-dole) i potom inkubirana 45 minuta na sobnoj temperaturi.;[0305] [0169] Nakon inkubacije, mali uzorak svake reakcione smeše je uzet za iTLC (instant tankoslojnu tečnu hromatografiju) kako bi se odredio prinos reakcije radioobeležavanja, a preostale reakcione smeše su prebačene u prethodno uravnotežene PD-10 kolone (Vendor) sa 250 mM natrijum acetata na pH 5,4 za gravitaciono odsoljavanje. Svaka PD-10 kolona je primala najviše 1,2 mL reakcione smeše (u suprotnom je korišćeno više kolona). Nakon što je sadržaj reakcije ušao u sloj kolone, dodato je 1,6 mL 250 mM natrijum acetata na pH 5,4 (pufer za formulaciju); deo koji je protekao je odbačen. Dodatnih 1,8 mL pufera za formulaciju je dodato u kolonu, a eluat je sakupljen iz svake kolone. Zatim je približno 500 µL svakog rastvora analizirano pomoću Nanodrop spektrofotometra (ThermoScientific). Konačna koncentracija antitela je izračunata korišćenjem odgovarajućeg koeficijenta ekstinkcije i apsorpcije na 280 nm pomoću jednačine:;[0307] Koncentracija u mg/mL = Apsorpcija na 280 nm Koeficijent ekstinkcije na 280 nm (nalazi se u Tabeli 6);[0309] Konačna masa izmerena u gramima je zabeležena u Tabeli 4. Radioaktivnost je zatim merena pomoću kalibratora doze i prikazana u Tabeli 5. Konačni materijal, zajedno sa materijalom pre tretmana na PD-10 koloni, je zatim analiziran pomoću iTLC. Za ovaj test, 1 μL svakog rastvora je dodato na iTLC-SG-Glass mikrofiber hromatografski papir impregniran silika gelom (Agilent Technologies, Cat # SG10001), razvijen u TLC komori sa 20 mM rastvorom pufera limunske kiseline. Konačni materijal je takođe analiziran pomoću SEC-HPLC sa UV 280 i radioizotopskim detektorom povezanim serijski (Agilent 1260 sa Lablogic Radio-TLC/HPLC detektorom, SCAN-RAM) koristeći Superdex 200 kolonu sa PBS mobilnom fazom pri brzini protoka od 0,75 mL/min. Radioaktivni marker je korišćen za određivanje radiohemijske čistoće upoređivanjem integracije proteinskog pika (~10 do 16 min) i pika slobodnog<89>Zr (~ 25 min). Monomerna čistoća je određena upoređivanjem integracije oligomernog pika (10 min do ~ 15 min) sa monomerom (~ 16 min).;[0310] Specifična aktivnost i rekuperacija proteina (%) svakog radioaktivno obeleženog konjugata određeni su korišćenjem sledećih jednačina:;[0311] a.;[0312] Masa konjugata u mg = koncentracija u mg/mL x masa rastvora u gramima;[0313] b.;[0314] Specifična aktivnost u mCi/mg = aktivnost vijalice u mCi masa rastvora u gramima c.;[0315] Rekuperacija proteina = početna masa konjugata (mg) masa konjugata u gramima;[0317] Konačno, izgled je zabeležen i upisan u Tabelu 7. I UV280 i iTLC markeri su urađeni na prečišćenom proizvodu.;[0318] [0173] Rezultati su objedinjeni u Tabeli 7. Radio-SEC-HPLC hromatogrami su prikazani na slikama 2-4. Primer UV280 HPLC SEC hromatograma i radio-iTLC je prikazan na Slici 5 za<89>Zr radioobeležavanje, Studija 1. UV280-HPLC SEC hromatogram potvrđuje visoko monomerni proizvod (99%). Radio-iTLC marker je obrađen binomnom funkcijom izravnavanja u 7 tačaka. Početna tačka i front rastvarača bili su približno 16 i 100 mm, respektivno. Nije primećen detektabilni<89>Zr preko 22 mm i potvrđuje radiohemijsku čistoću određenu radio-SEC-HPLC SEC postupkom na slici 2B.;[0320] Tabela 4. Priprema DFO-antitelo konjugata za radio-obeležavanje;[0323] ;[0325] * DAR je definisan kao odnos DFO i antitela

[0326] Tabela 5. Priprema<89>Zr reakcionog rastvora za radio-obeležavanje

[0328]

[0331] Tabela 6: Koeficijenti ekstinkcije za konjugovane lotove

[0334]

[0337] Tabela 7. Rezime<89>Zr obeleženih DFO-Ab konjugata za in vivo studije snimanja i biodistribucije

[0338]

[0341] Primer 4: Imunoreaktivnost

[0343] Imunoreaktivnost (IR) radioobeleženog anti-PD-L1 antitela i izotipskog kontrolnog antitela merena je na sledeći način. Za početne studije su korišćene MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>ćelije, a potom su u kasnijoj studiji korišćene i LOX-IMVI ćelije (videti detaljan opis ćelijskih linija u Primeru 5). U ovim testovima, 20 ng odgovarajućih<89>Zr obeleženih antitela je dodato u 15 x 10<6>MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>ili 30 x 10<6>LOX-IMVI ćelija u konačnoj zapremini od 1 mL. Uzorci su inkubirani 45 minuta uz kontinuirano mešanje pre nego što su 3 puta ispirani medijumom radi uklanjanja nevezanih antitela. Radioaktivnost testnih ćelijskih peleta je zatim brojana u automatskom gama brojaču (Wizard 2470, Perkin Elmer) u odnosu na 2 referentna standarda koji sadrže istih 20 ng antitela obeleženog<89>Zr. Procenat imunoreaktivnosti je određen za uzorke korišćenjem proseka standarda kao mere ukupne aktivnosti.

[0344] [0175] Kao što se vidi u Tabeli 8,<89>Zr obeleženo antitelo protiv PD-L1 zadržalo je imunoreaktivnost nakon konjugacije i radio-obeležavanja, sa %IR u rasponu od 88 do 98% u svim studijama. Specifičnost vezivanja je očigledna kod kontrolnih antitela koja imaju osnovni nivo %IR manji od 1%.

[0346] Tabela 8: Imunoreaktivnost<89>Zr helatiranih DFO-konjugata

[0348]

[0351] Primer 5: In vitro i ex vivo karakterizacija ekspresije humanog PD-L1 na ćelijskim linijama tumora

[0353] Nekoliko ćelijskih linija tumora je proučavano kako bi se procenio nivo ekspresije humanog PD-L1, sa ciljem detekcije humanog PD-L1 eksprimiranog endogeno u tumorima in vivo kod mužjaka NCr golih miševa (Taconic, Hudson NY) ili kod miševa koji su genetski modifikovani da budu homozigotni za ekspresiju ekstracelularnog domena humanog PD-L1 umesto ekstracelularnog domena mišjeg PD-L1 (PD-L1 HumIn miševi) 75% C57/BI6 / 25% 129 referentnog soja korišćenjem VelociGene<®>tehnologije (Valenzuela et al 2003, Nac. Biotech. 21: 652-659; Objava američke patentne prijave US2016/0157469).

[0354] [0177] Ćelijske linije korišćene u ovim studijama uključuju: 1) ćelijsku liniju MC38 mišjeg karcinoma debelog creva (dobijenu od NCI, Frederick, MD, Laboratorija za imunologiju i biologiju tumora), koja je interno genetski modifikovana da bi se nokautirao mišji PD-L1, ali da bi se prekomerno eksprimirao humani PD-L1 pune dužine i pileći ovalbumin pune dužine spojen sa eGFP, pa se ovde naziva MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>; 2) nekoliko ćelijskih linija humanih tumora: ćelijska linija humanog melanoma LOX-IMVI (endogena PD-L1 pozitivna linija, dobijena od NCI, Frederick, MD, Odeljenje za lečenje i dijagnozu kancera, Repozitorijum tumora), ćelijske linije humanog kancera dojke MDA-MB-231 (endogena PD-L1 pozitivna linija) i SK-Br-3 (PD-L1 negativna ćelijska linija) (obe dobijene od ATCC). U nekim slučajevima, humani PD-L1 je direktno procenjen bez ikakve indukcije in vitro; u nekim slučajevima, ekspresija humanog PD-L1 je procenjena preko noći tretmanom mišjim ili humanim IFNγ (100 ng/ml) (dobijenim od Peprotech); u nekim slučajevima, humani PD-L1 je procenjen ex vivo na enzimski disociranim tumorskim ćelijama ekstrahovanim iz golih miševa sa tumorom ili humanizovanih miševa. Sva površinska bojenja humanog PD-L1 su izvršena prema standardnom protokolu. Ukratko, tumorske ćelije su jednom isprane sa PBS, jednom ledeno hladnim puferom za bojenje, obojene komercijalno dostupnim fluorohromom direktno konjugovanim anti-humanim PD-L1 antitelom (eBioscience, klon MIH1) u puferu za bojenje tokom 30 minuta na ledu u mraku, a zatim ponovo isprane sa 2 mL PBS. Fiksirajuća boja eFluor506 je takođe uključena prema protokolu proizvođača (eBioscience, kat. br. 17-5983). Uzorci su prikupljeni na BD FACSCanto

IVD10 opremljen DIVA v8. Podaci su dalje analizirani pomoću FlowJo v10.0.6 ili novije verzije.

[0355] Ekspresija PD-L1 pomoću MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>ćelija pre implantacije i sedam dana nakon implantacije kod golih miševa prikazana je u Tabeli 9.

[0357] Tabela 9: Procenat humanih PD-L1 pozitivnih MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>ćelije pre implantacije i 7 dana nakon implantacije kod golih miševa

[0359]

[0362] Pre implantacije, velika većina MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>ćelija su bile pozitivne na humani PD-L1, u poređenju sa kontrolnim bojenjem izotipa. Sedam dana nakon implantacije kod golih miševa i nakon enzimske i mehaničke obrade za disocijaciju tumora, ~70% MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>ćelije su i dalje bile pozitivne na humani PD-L1.

[0363] Ekspresija PD-L1 pomoću MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>ćelija pre implantacije i četrnaest dana nakon implantacije kod humanizovanih miševa PD-L1 prikazana je u Tabeli 10.

[0364] Tabela 10: Procenat humanih PD-L1 pozitivnih MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>ćelije pre implantacije i 14 dana nakon implantacije kod humanizovanih miševa PD-L1

[0366]

[0369] Pre implantacije, velika većina MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>ćelija su bile pozitivne na humani PD-L1, u poređenju sa kontrolnim bojenjem izotipa. Četrnaest dana nakon implantacije kod dvostruko humanizovanih miševa PD-1/PD-L1 i nakon enzimske i mehaničke obrade za disocijaciju tumora; ~50% MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>ćelija je i dalje bilo pozitivno na humani PD-L1.

[0370] Ekspresija PD-L1 od strane višestrukih ćelijskih linija tumora in vitro je prikazano na slici 6. Da bi se procenilo koliko je uporediv nivo ekspresije PD-L1 kod ćelijske linije (MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>) dobijene inženjeringom i drugih ćelijskih linija humanih tumora (ćelije melanoma LOX-IMVI, ćelije kancera dojke MDA-MB-231 i ćelije kancera dojke SK-Br-3), izvršena je titracija doze bojenja anti-PD-L1 antitelima. Slika 6 ilustruje da je MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>imao najviši nivo ekspresije humanog PD-L1 (Slika 6A), a SK-Br-3 je imao najnižu ekspresiju bez detektabilnog PD-L1 (Slika 6D), dok je ekspresija PD-L1 pomoću LOX-IMVI i MDA-MB-231 bila umerena (oko 5 puta niža od MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>) (Slika 6B i 6C).

[0371] U drugom eksperimentu, dalje poređenje između LOX-IMVI i MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>je urađeno sa ili bez in vitro tretmana sa 100 ng/ml hIFNγ / mIFNγ preko noći, respektivno. Slika 7 ilustruje da je medijana intenziteta fluorescencije PD-L1 dostigla plato na ~150 nM anti-PD-L1 antitela korišćenog za bojenje. Na početku, ekspresija PD-L1 pomoću LOX-IMVI bila je umerena (oko 6-7 puta niža od MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1)<-/->hPD-L1<Tg>). Nakon tretmana sa mIFNγ, nije bilo promene u bojenju PD-L1 na MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>, dok je trostruko povećanje bojenja humanog PD-L1 primećeno u LOX-IMVI nakon tretmana sa hIFNγ.

[0372] Ekspresija PD-L1 ex vivo pomoću LOX-IMVI i MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>ćelija oko tri nedelje nakon implantacije kod golih miševa prikazana je u tabelama 11 i 12.

[0374] Tabela 11: Procenat PD-L1 pozitivnih LOX-IMVI i MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>ćelija ~3 nedelje nakon implantacije kod golih miševa

[0375]

[0378] Tabela 12: Srednja vrednost intenziteta fluorescencije PD-L1 pomoću LOX-IMVI i MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>ćelija ~3 nedelje nakon implantacije kod golih miševa

[0380]

[0383] Nakon enzimske i mehaničke obrade kako bi se omogućila disocijacija tumora, ćelije su obojene anti-PD-L1 antitelom (20 µg/mL). Nivo ekspresije PD-L1 na LOX-IMVI bio je oko 5 puta niži nego na MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1.<-/->hPD-L1<Tg>tumorskim ćelijama.

[0385] Primer 6: Selektivna lokalizacija radioobeleženog anti-PD-L1 antitela na hPD-L1 pozitivne tumore kod golih miševa

[0387] Da bi se utvrdila in vivo lokalizacija anti-PD-L1 antitela, konjugat DFO-antitela obeležen cirkonijumom-89 je intravenski primenjen golim miševima sa PD-L1 pozitivnim tumorima.

[0388] Tumorska linija korišćena za studiju bila je ćelijska linija mišjeg karcinoma debelog creva, označena kao MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1.<-/->hPD-L1<Tg>, koji je konstruisan da nokautira mišji PD-L1 iz divljeg tipa MC38, ali prekomerno eksprimira humani PD-L1 pune dužine i pileći ovalbumin pune dužine spojen sa eGFP. Za drugu studiju tumora sa endogenom ekspresijom humanog PD-L1, ćelijska linija humanog melanoma LOX-IMVI je korišćena za uspostavljanje tumora in vivo za naknadne studije lokalizacije anti-PD-L1 antitela.

[0389] Primer radioobeleženog anti-PD-L1 antitela korišćenog za ovu studiju bio je H1H8314N, koji obuhvata HCVR/LCVR SEQ ID NO: 82/90.

[0390] [0189] Za prvu studiju, 1 x 10<6>MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<T9>ćelije su implantirane subkutano u levi bok mužjaka NCr golih miševa starih 8-10 nedelja (Taconic, Hudson, NY). Za LOX-IMVI tumore, 1 x 10<6>ćelije su implantirane subkutano u levi bok mužjaka NCr golih miševa starih 8-10 nedelja. Kada su tumori dostigli prosečnu zapreminu od 50-150 mm<3>(~7 10. dan), miševi su nasumično podeljeni u grupe i dati su im doze<89>Zr obeleženog konjugata anti-PD-L1 DFO-antitela (H1H8314N) ili<89>Zr obeleženog kontrolnog nevezujućeg izotipskog kontrolnog DFO-antitelo konjugata. Goli miševi sa MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>tumori su primili 50 ± 1 uCi<89>Zr obeleženo antitelo sa dozom proteina ~0,6 mg/kg. U studiji koja je koristila miševe sa LOX-IMVI tumorima, miševi su primili 35 ± 1 μCi<89>Zr obeleženo antitelo sa konačnom dozom antitela od 0,3 ili 1 mg/kg.

[0391] PET snimanje lokalizacije antitela procenjeno je 6 dana nakon primene antitela. Za snimanje slika korišćen je Sofi Biosciences G8 PET/CT (Sofi Biosciences i Perkin Elmer). Instrument je prethodno kalibrisan za detekciju<89>Zr pre snimanja slike. Energetski prozor se kretao od 150 do 650 keV sa rekonstruisanom rezolucijom od 1,4 mm u centru vidnog polja. Miševi su podvrgnuti indukcionoj anesteziji upotrebom izoflurana i držani su pod kontinuiranim protokom izoflurana tokom snimanja. Statičke 10-minutne slike su snimljene pomoću softvera za snimanje G8, a zatim rekonstruisane korišćenjem unapred konfigurisanih podešavanja. Podaci slike su korigovani za parametre raspada i druge parametre. CT slike su snimljene nakon PET snimanja, a kasnije su koregistrovane sa PET slikama. Slike su pripremljene korišćenjem VivoQuant softvera za post-procesiranje (inviCRO Imaging Services).

[0392] Za biodistribuciju, miševi su eutanazirani u poslednjem trenutku (5-6 dana nakon doziranja) i krv je sakupljena putem srčane punkcije. Tumori i normalna tkiva su zatim izvađeni i stavljeni u epruvete za brojanje. Težina svakog uzorka je merena i zabeležena. Podaci o broju impulsa za<89>Zr u CPM su zatim sakupljeni merenjem uzoraka na automatskom gama brojaču (Wizard 2470, Perkin Elmer). Procentualno ubrizgana doza po gramu (%ID/g) je izračunata za svaki uzorak korišćenjem standarda pripremljenih od ubrizganog materijala.

[0393] Prosečan %ID/g za svako antitelo je prikazan u Tabeli 13.

[0395] Tabela 13: Prosečan %ID/g u analiziranim tkivima

[0397]

[0398]

[0401] Iz ovoga, jasno je da je visok unos u MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<T9>tumorima bio očigledan u odnosu na druga normalna tkiva, pri čemu je apsorpcija tumora od 55,3% ID/g bila značajno veća od sledeće najviše apsorpcije od 5,3% ID/g primećene u timusu. Apsorpcija tumora bila je 7,3 puta i 17,8 puta veća od aktivnosti u krvi i jetri, respektivno. Specifičnost apsorpcije anti-PD-L1 u tumoru (55,3% ID/g) bila je očigledna u poređenju sa značajno smanjenom apsorpcijom tumora od 3% primećenom za kontrolno antitelo nevezujućeg izotipa. Pilot PET snimanje izvedeno ovde pokazalo je jasnu lokalizaciju<89>Zr obeleženog konjugata DFO-antitela protiv PD-L1 sa MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<T9>tumorima. Malo referentnog signala je primećeno kod životinja 6. dana nakon doziranja. Za razliku od jasne lokalizacije tumora koja je bila očigledna korišćenjem anti-PD-L1 antitela, samo slaba referentna aktivnost je bila očigledna pri snimanju kontrolnog antitela u ovom modelu. Snimanje je jasno pokazalo visok, specifičan unos anti-PD-L1 antitela u humani PD-L1 pozitivan tumor, pokazujući lokalizaciju<89>Zr radioobeleženog anti-PD-L1 antitela na MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<T9>tumor kod golog miša NCr.

[0402] U drugoj studiji, procenjena je sposobnost anti-PD-L1 antitela da selektivno cilja tumore koji eksprimiraju endogene nivoe humanog PD-L1 antigena. Ovde su miševi sa humanim LOX-IMVI melanomskim tumorima primili<89>Zr antitelo obeleženo u dozama od 0,3 i 1 mg/kg. Ponovo su uzeti krv, tumor i tkiva 6. dana nakon injekcije i izračunat je %ID/g za uzorke. Prosečan %ID/g za svako antitelo je prikazan u Tabeli 14.

[0403] Tabela 14: Prosečan %ID/G u analiziranim tkivima iz druge studije (LOX-IMVI tumori)

[0405]

[0408] Pri nižoj dozi od 0,3 mg/kg, primećeno je jasno ciljanje tumora u odnosu na normalna tkiva, sa 20,6 % ID/g primećenim kod LOX-IMVI tumora. Kada su miševi primili veću dozu od 1 mg/kg, primećeno je smanjeno usvajanje tumora od 10,6 % ID/g u odnosu na nivo od 0,3 mg/kg. Ovo ukazuje na to da je veća doza proteina i moguće posledična veća frakcija neobeleženih antitela dovela do blokiranja tumorskog usvajanja<89>Zr obeleženog anti-PD-L1 antitela. U skladu sa ovim, PET snimanje sprovedeno neposredno pre studije biodistribucije takođe je pokazalo da je apsorpcija anti-PD-L1 antitela u dozi od 1 mg/kg bila približno ekvivalentna onom kod kontrolnog antitela. Pri nižoj dozi od 0,3 mg/kg, jasno povećanje lokalizacije tumora anti-PD-L1 antitela bilo je očigledno u odnosu na kontrolno antitelo. Generalno, PET slike i podaci o biodistribuciji pokazuju specifično ciljanje LOX-IMVI tumora u dozi od 0,3 mg/kg anti-PD-L1 antitela.

[0410] Primer 7: Selektivna lokalizacija radioobeleženog anti-PD-L1 antitela na hPD-L1 pozitivne tumore kod miševa

[0411] Ovaj primer opisuje in vivo lokalizaciju konjugata DFO-anti-PD-L1 antitela obeleženog cirkonijumom-89 kod miševa humanizovanih za PD-L1. Primer antitela korišćenog u ovom primeru bio je H1H8314N, koji obuhvata HCVR/LCVR SEQ ID NO: 82/90.

[0412] Miševi humanizovani za PD-L1 su dobijeni genetskim inženjeringom korišćenjem VelociGene<®>tehnologije (Valenzuela et al 2003, Nat. Biotechnol. 21: 652-659; Objava američke patentne prijave US2016/0157469).

[0413] Korišćena tumorska linija bila je ćelijska linija mišjeg karcinoma debelog creva, označena kao MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>, projektovana interno da eksprimira pileći ovalbumin pune dužine spojen sa eGFP i da nokautira mišji PD-L1 iz divljeg tipa MC38, ali da prekomerno eksprimira humani PD-L1 pune dužine.

[0414] 1x10<6>ćelija MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>je implantirano subkutano u levi bok mužjaka humanizovanih PD-L1 miševa. Kada su tumori dostigli prosečnu zapreminu od 50-150 mm<3>(~7. dan), miševi su nasumično podeljeni u grupe i date su im doze<89>Zr obeleženog konjugata anti-PD-L1 DFO-antitela ili<89>Zr obeleženog kontrolnog nevezujućeg izotipa konjugata DFO-antitela. Miševi su primili 50 ± 1 uCi<89>Zr obeleženog antitela sa konačnom dozom proteina od 1 ili 3 mg/kg.

[0415] PET snimanje lokalizacije antitela procenjeno je 6 dana nakon primene antitela. Za snimanje slika korišćen je Sofi Biosciences G8 PET/CT (Sofi Biosciences i Perkin Elmer). Instrument je prethodno kalibrisan za detekciju<89>Zr pre snimanja slike. Energetski prozor se kretao od 150 do 650 keV sa rekonstruisanom rezolucijom od 1,4 mm u centru vidnog polja. Miševi su podvrgnuti indukcionoj anesteziji upotrebom izoflurana i držani su pod kontinuiranim protokom izoflurana tokom snimanja. Statične 10-minutne slike su snimljene pomoću softvera za snimanje G8, a zatim rekonstruisane korišćenjem unapred konfigurisanih podešavanja. Podaci slike su korigovani za parametre raspada i druge parametre. CT slike su snimljene nakon PET snimanja, a kasnije su koregistrovane sa PET slikama. Slike su pripremljene korišćenjem VivoQuant softvera za post-procesiranje (inviCRO Imaging Services).

[0416] Za biodistribuciju, miševi su eutanazirani u poslednjem trenutku (5-6 dana nakon doziranja) i krv je sakupljena putem srčane punkcije. Tumori i normalna tkiva su zatim izvađeni i stavljeni u epruvete za brojanje impulsa. Težina svakog uzorka je merena i zabeležena. Podaci o broju impulsa za<89>Zr u CPM su zatim sakupljeni merenjem uzoraka na automatskom gama brojaču (Wizard 2470, Perkin Elmer). Procentualno ubrizgana doza po gramu (%ID/g) je izračunata za svaki uzorak korišćenjem standarda pripremljenih od ubrizganog materijala.

[0417] Rezultati

[0419] Humanizovani PD-L1 miševi sa MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>tumorima primili su<89>Zr obeleženi konjugat anti-PD-L1 DFO-antitela u konačnoj dozi antitela od 1 ili 3 mg/kg. Krv, tumor i tkiva su uzeti i mereni 6. dana nakon injekcije, a %ID/g za uzorke je izračunat na osnovu brojanja impulsa iz svakog uzorka. Prosečan %ID/g za doze od 1 i 3 mg/kg je prikazan u Tabeli 15 i Tabeli 16, respektivno.

[0421] Tabela 15: Prosečan %ID/g u analiziranim tkivima anti-PD-L1 antitela pri 1 mg/kg

[0423]

[0426] Na nivou doze od 1 mg/kg, jasno tumorsko ciljanje MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>tumora je očigledno sa %ID/g od 34,1% uprkos ekspresiji PD-L1 u normalnim tkivima kod ovih humanizovanih miševa. Pri ovoj dozi, izvesna lokalizacija<89>Zr obeleženog antitela protiv PD-L1 bila je primetna u slezini, gde je primećeno usvajanje antitela od 14,1 % ID/g. Takvo usvajanje se očekuje zbog normalne ekspresije humanog PD-L1 umesto ekspresije mišjeg PD-L1 humanog PD-L1 u slezini. Pri dozi antitela od 3 mg/kg, lokalizacija<89>Zr obeleženog konjugata DFO-anti-PD-L1 antitela u slezini je smanjena, jer je apsorpcija sada u proseku iznosila 9,7 %ID/g kod miševa koji su primili ovu dozu antitela (Tabela 16).

[0427] Tabela 16: Prosečan %ID/g u analiziranim tkivima anti-PD-L1 antitela pri 3 mg/kg

[0429]

[0432] Jasno ciljanje tumora je i dalje primećeno pri dozi od 3 mg/kg, sa prosečno 28,7 % ID/g koje su apsorbovali MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>tumori. Stoga, iako je smanjena lokalizacija normalnog tkiva bila očigledna pri snimanju doze od 3 mg/kg, jasna lokalizacija anti-PD-L1 obeleženog antitela na MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>tumorima ostala je jasna pri ovoj dozi. Generalno, ovi rezultati ukazuju da je jasno ciljanje MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1<-/->hPD-L1<Tg>tumora bilo moguće kod miševa koji eksprimiraju PD-L1 na regularnim mestima ekspresije normalnog tkiva.

[0433] Rezultati studija sprovedenih ovde jasno pokazuju da se anti-PD-L1 antitelo obeleženo sa<89>Zr može značajno i specifično lokalizovati na tumore. Može se zamisliti scenario u kojem se anti-PD-L1 antitelo koristi u selekciji pacijenata sa PD-L1 pozitivnim tumorima za naknadni tretman inhibitorima PD-1/PD-L1 signalne ose.

[0435] Primer 8: Proizvodni proces u povećanim razmerama za proizvodnju konjugata antitela DFO-anti-PD-L1

[0437] [0206] Ovaj primer detaljno opisuje proces proizvodnje u povećanim razmerama za pripremu anti-PD-L1 antitela kako bi bilo pogodno za radioobeležavanje vezivanjem p-SCN-bndeferoksamina (DFO) za anti-PD-L1 antitelo (mAb, H4H8314N) opisano ovde: (1) procesi ultrafiltracije i dijafiltracije (UFDF) pre konjugacije mAb uklanjaju ekscipijente koji inhibiraju proces konjugacije; (2) nakon UFDF pre konjugacije, vrši se konjugacija mAb sa p-SCN-Bndeferoksaminom da bi se dobili DFO-mAb konjugati; i (3) UFDF nakon konjugacije radi uklanjanja rezidualnih soli obezbeđuje odgovarajuću koncentraciju, nivo ekscipijenta i pH konjugovanog monoklonskog antitela. Dobijeni DFO-mAb konjugati se zatim obezbeđuju u puferovanom stanju sa poboljšanom stabilnošću za naknadnu formulaciju.

[0439] (1) Prekonjugaciona ultrafiltracija i dijafiltracija (UFDF)

[0441] 100 g anti-PD-L1 antitela je puferski zamenjeno u 5 mM acetatnom puferskom rastvoru sa pH vrednošću 5,50 korišćenjem Sius Prostream (TangenX Technology Corporation) membrane (membranski kapacitet ≤ 500 g/m²) da bi se uklonile preostale soli pre konjugacije. Zapremina procesa je smanjena da bi se antitelo dodatno koncentrovalo, zatim je antitelo sterilno filtrirano korišćenjem Sartopore 2 (Sartorius) membrane sa 0,45/0,2 µm (heterogeni PES dvoslojni) ili ekvivalentnom veličinom pora. Temperatura acetatnog pufera je održavana na ciljanoj temperaturi od 20±5°C. Rastvori su dobro izmešani.

[0443] (2) Konjugacija

[0445] Koncentrovano i filtrirano antitelo (20 g) je preneto u posudu za konjugaciju koja sadrži karbonatni puferski sistem bez amina (56 mM karbonat, 167 mM natrijum hlorid, pH 9,40), što je kao rezultat dalo zanemarljive nivoe rezidualnog acetata. DFO (25 mM p-SCN-Bndeferoksamin) je rastvoren u DMSO i dodat u posudu za konjugaciju, zajedno sa dodatnim DMSO tako da je DMSO bio prisutan u konačnoj količini od 5%. DFO je dodat u molarnom višku u odnosu 4,5:1 DFO prema mAb. Ukupna zapremina reakcije je bila jednaka 2,0 L. Puferski sistem je mešan tokom dodavanja reakcionih sastojaka i tokom vremena reakcije.

[0446] Temperatura reakcije je kontrolisana tokom određenog vremena korišćenjem jednačine koja povezuje temperaturu sa vremenom reakcije. U ovom slučaju, temperatura reakcije je održavana na 18°C tokom 120 minuta. Reakcija je prekinuta dodatkom 2M sirćetne kiseline (23 mL/L), što je dalo rastvor koji ima pH vrednost od 6.

[0448] (3) Post-konjugacioni UFDF

[0450] [0210] Nakon koraka konjugacije, ugašeni konjugacioni rastvor DFO-mAb je puferski zamenjen histidinskim puferom (10 mM histidin, pH 5,50 sa 0,0005% (tež/zapr) super rafinisanog polisorbata 80 dodatog kao zaštitno sredstvo protiv smicanja) da bi se uklonile preostale procesne soli, DMSO i nereagovani DFO. Nakon dijafiltracije, rastvor je zatim koncentrovan i potom formulisan. Histidinski pufer je odabran za dugoročno skladištenje proteina na -80°C. Ista Sius Prostream membrana pomenuta u koraku (1) je korišćena u poslednjem UFDF koraku. Dobijeni koncentrovani rastvor konjugata DFO-mAb je sterilno filtriran korišćenjem gore pomenutog Sartopore 2 filtera.

[0451] UV-DAR (cilj od 1,5) i određivanje koncentracije proteina je izvršeno kao što je opisano u Primeru 2.

[0453] Tabela 17. Molarni koeficijenti ekstinkcije i molekulska težina

[0455]

[0458] Primer 9: Predviđena izloženost celog tela i tkiva radioaktivnosti kod ljudi kojima se daje intravenska doza konjugata<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitela

[0460] Cilj sledećeg eksperimenta bio je da se proceni predviđena izloženost celog tela i tkiva radioaktivnosti kod ljudi usled intravenske (IV) doze konjugata<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitela. Primer anti-PD-L1 antitela korišćenog u radioobeleženom konjugatu bio je H4H8314N.

[0462] Karakterizacija radioimunokonjugata

[0464] Anti-PD-L1 imunokonjugat (DFO-Ab) i imunokonjugat za kontrolu izotipa (DFO-IgG4kontrolni uzorci) su radioobeleženi i prečišćeni za upotrebu u in vivo studijama snimanja i biodistribucije. SEC-HPLC analiza i MC38/mPD-L1<-/->/hPD-L1 (mišje MC38 ćelije adenokarcinoma debelog creva konstruisane da nokautiraju mišji PD-L1 i stabilno eksprimiraju humani PD-L1) ćelijski zasnovan in vitro test su izvedeni da bi se okarakterisali rezultujući radioimunokonjugati.

[0466] Monomerna i radiohemijska čistoća

[0468] SEC-HPLC korišćenjem UV i γ-emisionih detektora je izvršena radi procene monomerne i radiohemijske čistoće. Rezultati za radioimunokonjugatne preparate<89>Zr-DFOanti-PD-L1 antitelo konjugata i izotipskog kontrolnog radioimunokonjugata<89>Zr-DFO-IgG4prikazani su na slici 8.

[0469] Analiza hromatograma za apsorpciju na 280 nm je sprovedena da bi se procenile relativne količine proteina visoke molekulske težine (HMW) i monomernih proteina u radioimunokonjugatnim preparatima. Kao što je sumirano u Tabeli 18, monomerni pikovi (očitavanje monomerne čistoće) čine 99,6, 99,2 i 98,6%, respektivno, ukupne površine pikova proteina za preparate<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata i izotipa kontrole<89>Zr-DFO-IgG4; takođe su otkriveni niski nivoi HMW vrsta (0,4, 0,8 i 1,4%, respektivno). Vrste male molekulske težine (LMW) nisu primećene ni u jednom od testiranih uzoraka.

[0470] Analiza radio-hromatograma za γ-emisiju je izvršena da bi se procenila relativna količina<89>Zr ugrađena u radioimunokonjugate u poređenju sa neugrađenim<89>Zr (kao što je slobodan<89>Zr ili<89>Zr heliran sa slobodnim DFO-derivatima). Kao što je sumirano u Tabeli 18, pikovi za neinkorporisane<89>Zr čini ≤1,1% ukupne površine pika γ-emisije, dok kombinovani pikovi za radioobeležene monomerne i HMW vrste (očitavanje radiohemijske čistoće) čine 98,9, 99,5 i 99,5%, respektivno, ukupne površine pika γ-emisije za preparate<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata i izotipa kontrole<89>Zr-DFO-IgG4.

[0472] Tabela 18: Rezime SEC-HPLC podataka

[0474]

[0475]

[0478] Imunoreaktivnost

[0480] Imunoreaktivnost, mera procenta radioobeleženog, konjugovanog antitela koje je sposobno da se veže za svoj antigen, određena je inkubacijom<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata sa MC38/mPD-L1<-/->/hPD-L1 ćelijama. 2 testirane grupe<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata pokazale su imunoreaktivnost od 84,5 i 88,8% na MC38/mPD-L1<-/->/hPD-L1 ćelijama (Tabela 19). U pozadini, nespecifična imunoreaktivnost od 8,8% je primećena za izotipski kontrolni radioimunokonjugat.

[0482] Tabela 19: Imunoreaktivnost<89>Zr obeleženog anti-PD-L1 DFO-antitelo konjugata i kontrolnog izotipa<89>Zr-DFO-IgG4

[0484]

[0487] U zaključku, dve odvojene grupe<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata pokazale su visoku imunoreaktivnost, procenat monomera i radiohemijsku čistoću.

[0489] Biodistribucija<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 kod miševa

[0491] Ovim eksperimentom je procenjena biodistribucija radioimunokonjugata anti-humanog PD-L1,<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata, tokom vremena nakon primene jedne intravenske (IV) doze od 50 µCi (1 mg/kg) humanizovanim miševima PD-L1/PD-1 (PD-1hu/huPD-L1hu/Hu). Pošto se H4H8314N ne vezuje za mišji PD-L1, deo mišjeg PD-L1 gena koji kodira PD-L1 ektodomen je zamenjen odgovarajućom humanom sekvencom u PD-1hu/hu-PD-L1hu/Hu miševima. Kod ovog soja, ektodomen mišjeg PD-1 je bio slično humanizovan.

[0492] Ovi miševi nisu bili podvrgnuti imunološkom/inflamatornom izazovu i stoga se očekuje da imaju nestimulisane nivoe ekspresije PD-L1 na imunim ćelijama. Dve grupe od po 8 životinja su žrtvovane 6 dana (144 sata) ili 10 dana (240 sati) nakon doziranja, sakupljena je krv i sakupljena su sledeća tkiva: srce, pluća, jetra, slezina, bubrezi, želudac, tanko crevo, cekum, debelo crevo, kost (femur), timus, mišić, bešika i mozak. Procenat radioaktivnosti ukupne ubrizgane doze (%ID) lokalizovane u specifičnim tkivima ili krvi je određen i prijavljen kao prosečan %ID po gramu (%ID/g) tkiva. Pre žrtvovanja, imuno-PET/kompjuterizovane tomografske (CT) slike su snimljene 1, 24, 48, 72, 144, 192 (samo grupa od 10 dana) i 240 (samo grupa od 10 dana) sati nakon doziranja od istih životinja.

[0493] U odnosu na nivoe<89>Zr u krvi, apsorpcija<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata u specifičnim tkivima bila je zanemarljiva tokom 10-dnevnog perioda studije, što je procenjeno ex vivo analizom tkiva (Tabela 20 i Slika 9) i in vivo snimanjem. U poređenju sa krvlju (9,4±2,2% ID/g), sva sakupljena tkiva, sa izuzetkom slezine, pokazala su niže nivoe<89>Zr (≤6,7% ID/g) 6. dana nakon doziranja. Mali stepen ciljno posredovanog usvajanja<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata (10,2±1,9%lD/g) primećen je u slezini, što je u skladu sa ekspresijom PD-L1 na splenocitima, što je pokazano protočnom citometrijom. 10 dana nakon doziranja, nivoi<89>Zr u krvi su se smanjili 7,8 puta u odnosu na 6. dan nakon doziranja, što ukazuje na odgovor mišjih anti-humanih antitela (MAHA) koji utiče na nivoe<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata. Ovaj primećeni MAHA odgovor je verovatno posledica činjenice da se cilj, PD-L1, eksprimira na ćelijama koje prezentuju antigen (Francisco, 2010), što dovodi do prezentacije humanog antitela imunom sistemu miša i naknadnog formiranja MAHA. Paralelno, nivoi<89>Zr u jetri su bili 4,1 puta povećani 10. dana u poređenju sa 6. danom nakon doziranja, verovatno kao rezultat formiranja imunog kompleksa (IC) MAHA/<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata i naknadnog klirensa IC posredovanog jetrom (Rojko, 2014). Snimanje cele životinje in vivo PET nije otkrilo izraženo tkivno specifično usvajanje<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata izvan niskog signala za slezinu i MAHA-posredovane akumulacije u jetri opisane prethodno.

[0494] Ukratko, izraženo ciljno posredovano usvajanje<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata u specifičnim tkivima iznad nivoa<89>Zr u krvi nije primećeno tokom perioda od 6 dana kod PD-L1/PD-1-humanizovanih miševa kojima je primenjena jedna intravenska doza od 1 mg/kg (50 µCi)<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata, sa izuzetkom slezine, gde je primećen mali stepen ciljno posredovanog usvajanja, što je u skladu sa dokazanom ekspresijom PD-L1 na splenocitima. Podaci prikupljeni nakon 6. dana do kraja studije 10. dana nakon doziranja bili su pogođeni MAHA odgovorom.

[0495] Tabela 20: Prosečni podaci o biodistribuciji ex vivo

[0497]

[0500] Procene izloženosti celog tela i tkiva radioaktivnosti kod ljudi

[0502] U ovom eksperimentu korišćeni su PET/CT snimci za četiri PD-1/PD-L1-humanizovana mužjaka miševa i četiri PD-1/PD-L1-humanizovane ženke miševa snimljenih 1, 24, 48, 72, 144, 192 i 240 sati nakon jedne intravenske primene 50 µCi (1 mg/kg)<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata. Podaci dobijeni primenom ove klinički relevantne doze korišćeni su za izračunavanje procena izloženosti ljudi radioaktivnosti. Podaci o koncentraciji u tkivu određeni su analizom zapremine od interesa (VOI).

[0503] [0223] Za procenu dozimetrije zračenja, srednje vreme zadržavanja je određeno za sledeće regione: mozak, sadržaj želuca, sadržaj srca, bubrege, jetru, pluća, mišiće, crvenu koštanu srž, slezinu, sadržaj bešike i ostatak tela. Ove vrednosti srednjeg vremena zadržavanja su korišćene kao ulaz u softverski program OLINDA/EXM 1.1 za procenu srednjih apsorbovanih doza u tkivu i efektivne doze kod ljudi.

[0504] Procenjeno je da efikasna doza<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata za ljude je 0,513 mSv/MBq (milisiverta/megabekerel) kod odraslog muškarca i 0,622 mSv/MBq kod odrasle žene. Organi za koje se predviđa da će imati najveću apsorbovanu dozu kod ljudi bili su slezina i jetra. Procenjena apsorbovana doza u slezini bila je 0,856 mSv/MBq kod odraslog muškarca i 1,12 mSv/MBq kod odrasle žene. Procenjena apsorbovana doza u jetri bila je 0,764 mSv/MBq kod odraslog muškarca i 0,974 mSv/MBq kod odrasle žene.

[0505] Prosečne vrednosti procenta ubrizgane doze po ml (DC %ID/ml) korigovane za raspadanje za mužjake i ženke miševa (n = 4 mužjaka, n = 4 ženke) za svaki VOI sumirane su u Tabeli 21.

[0507] Tabela 21: Podaci o biodistribuciji

[0509]

[0510]

[0513] Procenjene vrednosti srednjeg vremena zadržavanja kod ljudi (MRT) date su u Tabeli 22 za svaki od izvornih organa. MRT u ostatku tela dobijen je oduzimanjem zbira svih vremena zadržavanja izvornih organa od recipročne vrednosti konstante raspada<89>Zr (Huang et al., Biodistribution, toxicity and radiation dosimetry studies of the serotonin transporter radioligand 4‑[18F]‑ADAM in rats and monkeys. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2010; 37: 545‑555). Ovo predstavlja konzervativnu procenu kumulativne radioaktivnosti tkiva.

[0515] Tabela 22: Prosečno vreme zadržavanja kod ljudi (h)

[0518]

[0519]

[0522] Procenjene apsorbovane doze tkiva za sve ciljne organe za OLINDA/EXM 1.1 fantome odraslih muškaraca i žena date su u Tabeli 23. Efektivna doza, koju je definisala Međunarodna komisija za radiološku zaštitu (ICRP) (International Commission on Radiological Protection.

[0523] 1990 Recommendations of the International Commission on Radiological Protection. ICRP Publication 60, Pergamon Press, New York, 1991) je veličina koja se izračunava množenjem apsorbovane doze za dati organ stohastičkim faktorom težine rizika i sabiranjem ponderisanih doza. Procenjene efektivne doze date su na kraju Tabele 23. Ove vrednosti predstavljaju konzervativnu procenu radioaktivnih apsorbovanih doza.

[0525] Tabela 23: Procenjene doze apsorbovane u humanom tkivu i efektivna doza

[0527]

[0528]

[0531] [0228] Procenjene doze apsorbovane u ljudskom tkivu i efektivna doza za ljude (Tabela 23) dobijene postupkom fizičkog raspada i bieksponencijalnog prilagođavanja bile su slične. Postupak fizičkog raspada je odabran da bi se dobio konačni skup procenjenih doza apsorbovanih u humanom tkivu i efektivne doze zbog očiglednog MAHA odgovora u ovom mišjem modelu. Stoga, procenjeno je da efektivna doza za ljude za<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugat je 0,513 mSv/MBq kod odraslog muškarca i 0,622 mSv/MBq kod odrasle žene. Organi za koje se predviđa da imaju najveću apsorbovanu dozu kod ljudi su slezina i jetra. Procenjena apsorbovana doza u slezini bila je 0,856 mSv/MBq kod odraslog muškarca i 1,12 mSv/MBq kod odrasle žene. Procenjena apsorbovana doza u jetri bila je 0,764 mSv/MBq kod odraslog muškarca i 0,974 mSv/MBq kod odrasle žene.

[0533] Primer 10: ImunoPET snimanje PD-L1 u tumorima korišćenjem<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata kod pacijenata sa uznapredovalim malignitetima grudnog koša

[0535] Primarni cilj ove studije je da se utvrdi bezbednost i podnošljivost<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata, u kome je anti-PD-L1 antitelo koje se koristi u radioobeleženom konjugatu H4H8314N. Sekundarni ciljevi studije su:

[0536] • Samo deo A studije: Da bi se utvrdila adekvatna masena doza<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata i optimalno vreme snimanja nakon infuzije, procenjeno snimanjem i vađenjem krvi nakon infuzije markera.

[0537] • Samo deo B studije: Da se utvrdi pouzdanost PET merenja pri testiranju/ponovnom testiranju, procenjena na dve odvojene infuzije markera pri optimalnoj masenoj dozi i vremenskom trenutku snimanja, kao što je određeno u delu A.

[0538] • Da bi se okarakterisao farmakokinetički (FK) profil<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 antitelo konjugata na osnovu koncentracije aktivnosti markera u plazmi.

[0540] Ovo je otvorena studija u dva dela, osmišljena da proceni bezbednost i podnošljivost<89>Zr-DFO-anti-PD-L1. Studija u delu A će utvrditi adekvatnu masenu dozu i dozu aktivnosti<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 i optimalno vreme snimanja nakon infuzije. Varijabilnost testa/ponovnog testa<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 će biti procenjen u delu B.

[0541] Svi pacijenti će proći procedure skrininga. Pacijenti koji ispunjavaju kriterijume podobnosti biće podvrgnuti<18>F-fluorodezoksiglukoza (<18>F-FDG) PET/kompjuterizovanoj tomografiji (CT) i dijagnostičkom CT skeniranju za procenu održivosti lezije, lokacije i dimenzija. Ovo skeniranje neće biti potrebno ako su dostupne slike odgovarajućeg kvaliteta koje su snimljene u roku od 28 dana od očekivane prve doze<89>Zr-DFO-anti-PD-L1.

[0542] Deo A

[0544] Planirano je da se tri kohorte sa uzastopnim dozama leče otvoreno sa<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 u dozi od 5 mg, 10 mg ili 20 mg.

[0545] Nakon infuzije sa<89>Zr-DFO-anti-PD-L1, pacijenti će biti podvrgnuti<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 PET/CT skeniranju 1. dana, 4. ± 1. dana i 7. ± 1. dana. Dodatna snimanja mogu se obaviti do 10. dana. Pacijenti će biti podvrgnuti bezbednosnim procenama i dati uzorke za hematologiju, biohemiju, testove imunološke bezbednosti, farmakokinetiku, analizu antitela na lekove i analizu biomarkera.

[0546] Pacijenti će nastaviti da se podvrgavaju bezbednosnim procenama, uključujući fizički pregled, vitalne znake i dokumentovanje neželjenih događaja (AE), do 21. dana nakon infuzije<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 markera.

[0547] Odluke o povećanju doze radi utvrđivanja adekvatne doze biće donete na osnovu podataka o bezbednosti i podnošljivosti i procene pozitivnosti imuno-pozitronske emisione tomografije (iPET) i koncentracije aktivnosti markera u plazmi, kao što je opisano u nastavku.

[0549] Dozne kohorte u delu A

[0551] Planirano je do 3 kohorte sa rastućom masenom dozom. Za svaku kohortu sa masenom dozom, početna 2 pacijenta će biti dozirana, sa minimalnim intervalom od 48 sati između doziranja svakog pacijenta. Nakon završetka PET/CT skeniranja 7. ± 1. dana za drugog pacijenta sa datom masenom dozom, biće pregledani svi dostupni snimci, koncentracija aktivnosti markera u plazmi, klinička dozimetrija i podaci o bezbednosti. Na osnovu ovog pregleda, biće doneta odluka o sledećem:

[0553] • Proširiti kohortu na 6 pacijenata, ako postoji pozitivnost na apsorpciju tumora/lokalizaciju tumora kod najmanje 1 pacijenta, kako je definisano odnosom tumora i krvi >1

[0555] • Prelazak na sledeću kohortu sa masenom dozom ako postoji neadekvatna apsorpcija tumora i koncentracija aktivnosti plazma markera, sa adekvatnim opsegom definisanim standardizovanom vrednošću apsorpcije krvi (SUV) od 1 do 5 u optimalnom vremenskom trenutku snimanja.

[0557] • Nastaviti sa sledećom kohortom masovne doze sa nižom masenom dozom, na osnovu neadekvatne apsorpcije tumora i adekvatne koncentracije aktivnosti plazma markera.

[0558] Ako je lokalizacija tumora neadekvatna kod najmanje 2 pacijenta na sva tri predložena nivoa masene doze, i utvrdi se da je to zbog niskog odnosa signal-šum na slici, doza aktivnosti će biti povećana do maksimalno 185 MBq radi daljeg proširenja prethodno testiranih kohorti masene doze.

[0560] Deo B

[0562] Studija Deo B će početi kada se obezbedi odgovarajuća doza<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 i optimalno vreme snimanja u delu A. Prvog dana dela B, pacijenti će primiti masenu dozu markera. Nakon primanja markera, pacijenti će biti podvrgnuti skeniranju u optimalno vreme kako je navedeno u delu A. Pacijenti u delu B će primiti drugu dozu markera i skeniranje nakon intervala između doza od 14 do 28 dana. Stvarno vreme druge doze markera nakon intervala biće određeno na osnovu rezultata iz dela A.

[0563] Pacijenti će biti podvrgnuti bezbednosnim procenama, uključujući fizički pregled, vitalne znake i dokumentovanje neželjenih događaja (AE) tokom i nakon poseta gde je primenjen<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 marker. Tokom ovih poseta, pacijenti će dati uzorke za farmakokinetske, hematološke, biohemijske i imunološke testove bezbednosti.

[0564] I za Deo A i za Deo B, pacijenti će nastaviti da se podvrgavaju bezbednosnim procenama, uključujući fizički pregled, praćenje vitalnih znakova i dokumentovanje neželjenih događaja, do 21 dan nakon poslednje infuzije<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 markera.

[0566] Trajanje studije

[0568] Za Deo A, pacijenti će imati period skrininga do 28 dana (4 nedelje) i period praćenja do 21 dan (približno 3 nedelje) nakon infuzije doze markera. Trajanje dela A studije je približno 7 nedelja, uključujući period skrininga.

[0569] Za Deo B, pacijenti će imati period skrininga do 28 dana (4 nedelje), interval između infuzija do 28 dana (4 nedelje) i period praćenja bezbednosti od 21 dana (3 nedelje) koji uključuje drugi period skeniranja. Ukupno trajanje studije za svakog pacijenta biće do 11 nedelja, uključujući period skrininga.

[0570] Kraj studije za ovu studiju je definisan kao poslednja poseta poslednjeg pacijenta.

[0571] [0244] Za deo A studije, planirana su 3 uzastopna nivoa doza, do 6 pacijenata po kohorti, sa planirane 3 kohorte, za ukupno do 18 pacijenata. Za deo B studije, biće uključeno do 10 pacijenata. Planirano je uključivanje najviše 28 pacijenata na jednom mestu studije za celu studiju.

[0573] Ciljna populacija pacijenata

[0575] Ciljna populacija će se sastojati od pacijenata starosti 18 godina ili starijih sa uznapredovalim malignitetima grudnog koša i PD-L 1 IHC skorom na dijagnostičkoj ili naknadnoj biopsiji od ≥1% (pozitivan PD-L1 IHC rezultat pomoću 22C3 PharmDx testa, Dako North America Inc.).

[0577] • Za Deo A, maligniteti grudnog koša biće ograničeni na NSCLC, adenokarcinom gastroezofagealnog prelaza i kancer želuca, sa PD-L1 skorom od ≥1% dobijenim sa IHC.

[0578] • Za Deo B, svi pacijenti sa uznapredovalim malignitetima grudnog koša i PD-L1 skorom od ≥1% dobijenim sa IHC biće podobni. Pacijenti takođe moraju imati stabilnu bolest prema RECIST 1.1 između dve najnovije studije snimanja.

[0580] Svi pacijenti kojima je potrebna terapija treba da budu na standardnoj terapiji.

[0582] Lečenje

[0584] <89>Zr-DFO-anti-PD-L1, radioimunokonjugat formiran kovalentnom konjugacijom bifunkcionalnog helatora (p-SCN-Bn-DFO) sa H4H8314N (anti-PD-L1 monoklonsko antitelo) i radioobeležavanjem ovog jedinjenja sa<89>Zr.<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 se isporučuje u vodenom puferovanom rastvoru.

[0585] Za deo A,<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 će se primenjivati intravenski prvog dana (početna vrednost). Za deo B,<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 će se primenjivati intravenski 1. dana i 7. ± 3. dana. Stvarno vreme druge doze u delu B biće određeno na osnovu rezultata u delu A.

[0586] <89>Zr-DFO-anti-PD-L1 marker će se primenjivati u dozi koja je znatno niža od procenjenih kumulativnih nivoa izloženosti kod ljudi na osnovu PK modela i niža od nivoa na kojima se trenutno dostupni anti-PD-1 agensi koriste za lečenje kancera. Ova studija će isključiti pacijente koji se trenutno leče anti-PD-L1 kako bi se izbegla konkurencija za metu.

[0588] Krajnje tačke

[0589] Primarni krajnji cilj u studiji je incidenca i težina neželjenih događaja koji su se pojavili tokom lečenja (TEAE) do 21. dana poslednje doze infuzije markera kod pacijenata sa malignitetima grudnog koša kojima je dozirano<89>Zr-DFO-anti-PD-L1.

[0590] Samo za Deo A, studija će utvrditi adekvatnu masenu dozu i dozu aktivnosti<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 i optimalno vreme snimanja nakon infuzije, a sledeće će biti određeno putem vađenja krvi i snimanja 1., 4. i 7. dana nakon infuzije markera:

[0591] • Standardizovana vrednost apsorpcije<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 u krvnom uzorku, sa naknadnim izračunavanjem odnosa tumora i krvi u vreme snimanja

[0592] • Klinička dozimetrija zasnovana na apsorbovanoj dozi i efektivnom zračenju tkiva, izračunato iz podataka PET snimanja i koncentracije aktivnosti markera u krvi

[0593] • Standardizovane vrednosti apsorpcije (SUV) u tumorskim regionima od interesa (ROl) • Maksimalni SUV (SUVmax) unutar tumorskih ROI

[0594] • Koncentracija aktivnosti plazma markera, izražena kao SUV, sa izračunavanjem površine ispod krive do 7. dana (AUC<0-7>)

[0596] Samo za Deo B, studija će utvrditi pouzdanost testa/ponovnog testa<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 PET merenja, a sledeće će biti određeno na osnovu merenja 2 odvojene infuzije markera pri adekvatnoj masenoj dozi i optimalnim vremenskim tačkama snimanja, kao što je određeno u delu A:

[0597] • SUV analiza krvnog fonda sa naknadnim izračunavanjem odnosa tumora i krvi • SUV u tumorskim ROI

[0598] • SUVmax unutar tumorskih ROI

[0599] • Biodistribucija<89>Zr-DFO-anti-PD-L1

[0601] Dobijeni podaci će biti pokazatelj bezbednosti i podnošljivosti<89>Zr-DFO-anti-PD-L1 kod ljudi.

Claims

1. Patentni zahtevi

1. Radioaktivno obeleženi konjugat antitela koji sadrži izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji vezuje monomerni ligand humane programirane smrti 1 (PD-L1), helatni deo i emiter pozitrona, gde:

(i) izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca, HCDR1, HCDR2 i HCDR3, i tri regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca, LCDR1, LCDR2 i LCDR3, gde HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 84; HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86; HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88; LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 92; LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 94; i LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 96;

(ii) helatni deo sadrži desferioksamin; i

(iii) emiter pozitrona je<89>Zr.

2. Radioaktivno obeleženi konjugat antitela prema patentnom zahtevu 1, gde:

pomenuto izolovano humano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment je kovalentno vezan za jedan ili više delova formule (A):

-L-M<Z>(A)

gde je L helatni deo; M je emiter pozitrona; i z, nezavisno u svakom pojavljivanju, je 0 ili 1, gde je barem jedno od z jednako 1; i gde je -L-M

gde je Zr emiter pozitrona<89>Zr.

3. Radioaktivno obeleženi konjugat antitela prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde je antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen kovalentno vezan za jedan, dva ili tri dela formule (A).

4. Radioaktivno obeleženi konjugat antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, gde izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ima jedno ili više svojstava izabranih iz grupe koja se sastoji od:

(a) vezuje monomerni PD-L1 sa konstantom ravnoteže disocijacije vezivanja (K<D>) manjom od oko 310 pM mereno u testu površinske plazmonske rezonancije na 37°C; (b) vezuje monomerni humani PD-L1 sa K<D>manjom od oko 180 pM u testu površinske plazmonske rezonancije na 25°C;

(c) vezuje dimerni humani PD-L1 sa K<D>manjom od oko 15 pM mereno u testu površinske plazmonske rezonancije na 37°C; i

(d) vezuje dimerni humani PD-L1 sa K<D>manjom od oko 8 pM u testu površinske plazmonske rezonancije na 25°C.

5. Radioaktivno obeleženi konjugat antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, gde izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) SEQ ID NO: 82; i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) SEQ ID NO: 90.

6. Radioaktivno obeleženi konjugat antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 za upotrebu u in vivo postupku snimanja tkiva koje eksprimira PD-L1, koji obuhvata primenu konjugata na tkivo; i vizuelizaciju ekspresije PD-L1 pozitronsko-emisionom tomografijom (PET).

7. Inhibitor PD-1/PD-L1 signalne ose za upotrebu u postupku lečenja kancera, pri čemu je inhibitor PD-1/PD-L1 signalne ose anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ili anti-PD-L1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen,

navedeni postupak obuhvata:

(a) odabir ispitanika sa kancerom;

(b) utvrđivanje da je kancer PD-L1-pozitivan primenom radioaktivno obeleženog konjugata antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 na subjekta; i

snimanje lokalizacije radioobeleženog konjugata antitela u kanceru pomoću pozitronsko-emisione tomografije (PET), pri čemu prisustvo radioobeleženog konjugata antitela u kanceru ukazuje da je kancer PD-L1-pozitivan; i

(c) davanje jedne ili više doza inhibitora PD-1/PD-L1 signalne ose subjektu kome je to potrebno, a za koga je utvrđeno da ima PD-L1-pozitivan kancer.

8. Inhibitor za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, pri čemu:

(i) subjektu se daje 0,1 - 10 mg/kg radioobeleženog konjugata antitela; i/ili

(ii) konjugat radioobeleženog antitela se primenjuje subkutano ili intravenski kod subjekta; i/ili

(iii) PET snimanje se vrši 2-7 dana nakon primene radioobeleženog konjugata antitela.

9. Inhibitor za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, pri čemu:

(i) korak (b) se sprovodi pre lečenja subjekta inhibitorom signalne ose PD-1/PD-L1; ili (ii) navedeni postupak dalje obuhvata:

(d) primenu radioaktivno obeleženog konjugata antitela nakon tretiranja subjekta sa najmanje jednom dozom inhibitora signalne ose PD-1/PD-L1; i (e) snimanje lokalizacije radioobeleženog konjugata antitela u kanceru pomoću PET snimanja, pri čemu smanjenje od početne vrednosti u području lokalizacije radioobeleženog konjugata antitela u kanceru ukazuje na regresiju kancera, izborno pri čemu se subjektu primenjuje radioobeleženi konjugat antitela 1-20 nedelja nakon primene inhibitora signalne ose PD-1/PD-L1.

10. Inhibitor za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 7-9, gde je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od kancera krvi, kancera mozga, kancera bubrežnih ćelija, kancera jajnika, kancera bešike, kancera prostate, kancera dojke, karcinoma ćelija jetre, kancera kostiju, kancera debelog creva, nesitnoćelijskog kancera pluća, karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata, kolorektalnog kancera, mezotelioma, B-ćelijskog limfoma i melanoma.

11. Inhibitor za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 7-10, gde je inhibitor PD-1/PD-L1 signalne ose anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.

12. Inhibitor za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, gde je anti-PD-1 antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od nivolumaba i pembrolizumaba.

13. Inhibitor za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 7-10, gde je inhibitor PD-1/PD-L1 signalne ose anti-PD-L1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.

14. Inhibitor za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, pri čemu:

(a) inhibitor je atezolizumab;

(b) inhibitor je anti-PD-L1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, koji sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (HCDR) u varijabilnom regionu teškog lanca (HCVR) SEQ ID NO: 82; i tri regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca (LCDR) u varijabilnom regionu lakog lanca (LCVR) SEQ ID NO: 90; ili

(c) inhibitor je anti-PD-L1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži tri HCDR (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) i tri LCDR (LCDR1, LCDR2 i LCDR3), gde HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 84; HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86; HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88; LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 92; LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 94; i LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 96.

15. Radioaktivno obeleženi konjugat antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 za upotrebu in vivo

postupku praćenja efikasnosti terapije protiv kancera, pri čemu postupak obuhvata:

(a) davanje radioobeleženog konjugata antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 subjektu kome je to potrebno; i

(b) snimanje lokalizacije primenjenog radioaktivno obeleženog konjugata antitela u kanceru pomoću PET snimanja; i

(c) određivanje rasta kancera, pri čemu smanjenje u odnosu na početnu vrednost u apsorpciji konjugata ili radioaktivno obeleženog signala ukazuje na regresiju kancera.