ES2694018T3

ES2694018T3 - Composiciones y métodos para el tratamiento y el diagnóstico del cáncer

Info

Publication number: ES2694018T3
Application number: ES15178099.6T
Authority: ES
Inventors: Austin Gurney
Original assignee: Oncomed Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Mereo Biopharma 5 Inc
Priority date: 2007-07-02
Filing date: 2008-07-02
Publication date: 2018-12-17
Anticipated expiration: 2028-07-02
Also published as: US9717794B2; JP2010532169A; JP2016187356A; ES2553169T3; DK2173379T3; PT2173379E; US20150165024A1; EP2173379B1; EP3009148A1; EP3424529A1; US20130115206A1; US20130336970A1; US8883736B2; US8158758B2; EP2173379A2; EP2173379B2; WO2009005809A2; US20090191205A1; EP3009148B1; US20170296658A1

Abstract

Una molécula de inmunoglobulina aislada que se une específicamente a un dominio extracelular de una proteína humana de receptor acoplado a proteína G que contiene repeticiones ricas en leucina (LGR), o a una proteína Respondina (RSPO) humana y que es capaz de inhibir el crecimiento de un tumor sólido alterando la unión de una proteína RSPO humana a una proteína LGR humana; en donde la unión específica de la molécula de inmunoglobulina es a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno dentro de una región variable de la molécula de inmunoglobulina; y en donde la molécula de inmunoglobulina es monoclonal; y en donde la proteína LGR es LGR4, LGR5 o LGR6.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones y metodos para el tratamiento y el diagnostico del cancer Antecedentes de la invencion Campo de la invencion

La presente divulgacion se refiere al campo de la oncologla y proporciona composiciones y metodos que son novedosos para el diagnostico y el tratamiento del cancer. En particular, la divulgacion proporciona los medios y los metodos para caracterizar, estudiar, diagnosticar, proporcionar un pronostico y tratar canceres que comprenden celulas madre de cancer de tumor solido.

Antecedentes de la tecnica

El cancer es una de las causas principales de muerte en el mundo desarrollado, dando lugar a mas de 500.000 muertes al ano solo en los Estados Unidos. Cada ano, a mas de un millon de personas se le diagnostica un cancer en los Estados Unidos, y en general se estima que mas de 1 de 3 personas desarrollaran alguna forma de cancer durante su vida. Aunque hay mas de 200 tipos diferentes de cancer, cuatro de ellos, cancer de mama, de pulmon, colorrectal y de prostata, representan mas de la mitad de todos los casos nuevos (Jemal et al., 2003, Cancer J. Clin. 53: 5-26).

El cancer de mama es el cancer mas habitual en mujeres, con una estimacion del 12 % de las mujeres en situacion de riesgo de desarrollar la enfermedad durante su vida. Aunque los Indices de mortalidad han disminuido debido a la deteccion precoz y a mejoras de los tratamientos, el cancer de mama continua siendo una causa principal de muerte en las mujeres de mediada edad. Ademas, el cancer de mama metastasico sigue siendo una enfermedad incurable. En la presentacion, la mayorla de los pacientes con cancer de mama metastasico tiene solo de uno a dos sistemas organicos afectados, pero a medida que avanza la enfermedad, normalmente comienzan a implicarse multiples sitios. Los sitios de implicacion metastasica mas habituales son las recurrencias locorregionales en la piel y en los tejidos blandos de la pared toracica, as! como en las axilas y en las areas supraclaviculares. El sitio mas habitual de la metastasis distante es el hueso (30 - 40 % de metastasis distante), seguido de los pulmones y el hlgado. Y aunque solo aproximadamente el 1-5 % de las mujeres con cancer de mama recien diagnosticado, tienen metastasis distante en el momento del diagnostico, aproximadamente el 50 % de los pacientes con enfermedad local reinciden a la larga con metastasis a los cinco anos. En la actualidad, la supervivencia media de la manifestacion de la metastasis distante es de aproximadamente tres anos.

Los metodos actuales para el diagnostico y estadificacion del cancer de mama incluyen el sistema de tumor-nodulo- metastasis (TNM) que se basa en el tamano del tumor, en la presencia del tumor en los nodulos linfaticos y en la presencia de metastasis distante como se describe en el American Joint Committee on Cancer: AJCC Cancer Staging Manual. Philadelphia, Pa.: Lippincott-Raven Publishers, 5a ed., 1997, pags. 171-180, y en Harris, J R: “Staging of breast carcinoma” in Harris, J. R., Hellman, S., Henderson, I. C., Kinne D. W. (eds.): Breast Diseases. Philadelphia, Lippincott, 1991. Estos parametros se usan para proporcionar un diagnostico y seleccionar una terapia apropiada. El aspecto morfologico del tumor tambien puede evaluarse, pero dado que los tumores con similar aspecto histopatologico pueden presentar una variabilidad cllnica significativa, esta estrategia tiene serias limitaciones. Finalmente, se han usado ensayos para marcadores de superficie celular para separar determinados tipos de tumores en subclases. Por ejemplo, un factor que se considera en el pronostico y en el tratamiento del cancer de mama es la presencia del receptor de estrogenos (RE) ya que normalmente los canceres de mama positivos al RE, en comparacion con los tumores negativos al RE, responden mas facilmente a terapias hormonales, tales como inhibidores de tamoxifeno o aromatasa. Incluso aunque estos analisis sean utiles, solo son parcialmente predictivos del comportamiento cllnico de los tumores de mama, y en los canceres de mama se presenta una gran diversidad fenotlpica que no detectan ni tratan las herramientas de diagnostico y las terapias actuales.

En palses desarrollados el cancer de prostata es el cancer mas habitual en hombres, representado un valor estimado de un 33 % de todos los nuevos casos de cancer en los Estados Unidos, y es la segunda causa mas frecuente de muerte (Jemal et al., 2003, CA Cancer J. Clin. 53: 5-26). Desde que se introdujo el analisis de sangre del antlgeno protatico especlfico (APE), la deteccion precoz del cancer de prostata ha mejorado drasticamente los Indices de supervivencia, y el Indice de supervivencia de cinco anos para pacientes con canceres de prostata en estadio local y regional en el momento del diagnostico, casi alcanza el 100 %. Incluso mas de la mitad de los pacientes desarrollara eventualmente enfermedad metastasica o localmente avanzada (Muthuramalingam et al., 2004, Clin. Oncol. 16: 505-16).

Actualmente, la prostatectomia radical y la radioterapia proporcionan tratamientos curativos para la mayorla de los tumores de prostata localizados. Sin embargo, las opciones terapeuticas estan muy limitadas en casos avanzados. Para la enfermedad metastasica, la ablacion androgenica con la hormona liberadora de hormona luteinizante (HLHH) agonista, sola o en combinacion con anti-androgenos, es el tratamiento de referencia. Aun a pesar del bloqueo de androgenos maximo, la enfermedad casi siempre progresa desarrollando en gran parte enfermedad

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independiente de androgenos. Hasta ahora, no hay ningun tratamiento uniformemente aceptado para el cancer de prostata hormono-refractario y normalmente se utiliza en reglmenes quimioterapeuticos (Muthuramalingam et al., 2004, Clin. Oncol. 16: 505-16; Trojan et al., 2005, Anticancer Res. 25: 551-61).

El cancer de pulmon es el cancer mas comun en todo el mundo y es el tercer cancer mas habitualmente diagnosticado en los Estados Unidos y, con mucho, la causa mas frecuente de muerte por cancer (Spiro et al., 2002, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166: 1166-96; Jemal et al., 2003, CA Cancer J. Clin. 53: 5-26). Se piensa que el tabaquismo es responsable del 87 % estimado de todos los canceres de pulmon por lo que es la enfermedad prevenible mas mortal. El cancer de pulmon se divide en dos tipos principales, que representan mas del 90 % de todos los canceres de pulmon: cancer pulmonar microcltico (CPM) y cancer pulmonar no microcltico (CPNM). El CPM representa el 15-20 % de los casos y se caracteriza por su origen en general en las vlas respiratorias centrales y por su composicion histologica de laminas de pequenas celulas con poco citoplasma. El CPM es mas agresivo que el CPNM, desarrollandose rapidamente y metastatizando de manera temprana y frecuente. El CPNM representa el 80-85 % de todas las clases y en funcion de la histologla se divide adicionalmente en tres subtipos principales: adenocarcinoma, carcinoma de celulas escamosas (carcinoma epidermoide) y carcinoma indiferenciado de celulas grandes.

Normalmente el cancer de pulmon se presenta tarde en su curso, y por tanto, despues del diagnostico, tiene una supervivencia media de tan solo 6-12 meses y un Indice de supervivencia global de 5 anos de tan solo el 5-10 %. Aunque la cirugla ofrece la mejor oportunidad de cura, tan solo una minima parte de los pacientes con cancer de pulmon reune los requisitos, dependiendo la mayorla de ellos de la quimioterapia y de la radioterapia. A pesar de los intentos realizados para manipular la duracion y la intensidad de la dosis de estas terapias, los Indices de supervivencia han aumentado poco en los ultimos 15 anos (Spiro et al., 2002, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166: 1166-96).

El cancer colorrectal es el tercer cancer mas habitual y la cuarta causa mas frecuente de muerte por cancer en todo el mundo (Weitz et al., 2005, Lancet 365: 153-65). Aproximadamente el 5-10 % de todos los canceres colorrectales son hereditarios siendo una de las formas principales la poliposis adenomatosa familiar (PAF), una enfermedad dominante autosomica en la que aproximadamente el 80 % de los individuos afectados contienen una mutacion en la linea germinal en el gen de la poliposis colica adenomatosa (PCA). El carcinoma colorrectal tiene tendencia a invadir localmente por crecimiento circunferencial y en cualquier parte por diseminacion linfatica, hematogena, transperitoneal y perineural. El sitio mas habitual de implicacion extralinfatica es el higado, siendo los pulmones los organos extra-abdominales mas frecuentemente afectados. Otros sitios de diseminacion hematogena incluyen los huesos, rinones, glandulas adrenales y cerebro.

El sistema de estadificacion actual del cancer colorrectal se basa en el grado de penetracion tumoral a traves de la pared intestinal y en la presencia o en la ausencia de implicacion nodular. Este sistema de estadificacion se define mediante las tres clasificaciones principales de Duke: enfermedad de Duke A, confinada a las capas submucosas del colon o del recto; enfermedad de Duke B con tumores que invaden a traves de la propria muscularis y que pueden penetrar la pared del colon o del recto; y enfermedad de Duke C que incluye cualquier grado de invasion de la pared intestinal con metastasis de los nodulos linfaticos regionales. Aunque la reseccion quirurgica es sumamente eficaz para los canceres colorrectales de estadio temprano, proporcionando indices de curacion del 95 % en pacientes con enfermedad de Duke A, el indice se reduce al 75 % en pacientes con enfermedad de Duke B y la presencia de ganglios linfaticos positivos en la enfermedad de Duke C predice una probabilidad de recurrencia del 60 % al cabo de cinco anos. El tratamiento de los pacientes con enfermedad de Duke C con un ciclo de quimioterapia postquirurgico, reduce el Indice de recurrencia al 40-50 % y actualmente es la norma terapeutica para estos pacientes.

Los carcinomas epiteliales de cabeza y cuello se originan en las superficies mucosas en la zona de cabeza y cuello y normalmente son, en origen, celulas escamosas. Esta categorla incluye tumores de los senos paranasales, la cavidad oral y la nasofaringe, orofaringe, hipofaringe y laringe.

El numero anual de nuevos casos de canceres de cabeza y cuello en los Estados Unidos es de aproximadamente 40.000 casos por ano, representando aproximadamente el 5 por ciento de las neoplasias en adultos. Los canceres de cabeza y cuello son mas habituales en algunos otros palses, y la frecuencia a nivel mundial probablemente supera el medio millon de casos anuales. En Norteamerica y en Europa normalmente los tumores se originan en la cavidad oral, orofaringe o laringe, mientras que el cancer nasofarlngeo es mas habitual en los palses mediterraneos y en el Extremo Oriente.

Los modos de terapia tradicionales (radioterapia, quimioterapia y hormonoterapia), aunque son utiles, se han visto limitados por la aparicion de celulas cancerosas resistentes al tratamiento. Claramente, se necesitan nuevas estrategias para identificar dianas para el tratamiento del cancer de cabeza y cuello y generalmente para el tratamiento del cancer.

El cancer se produce por una mala regulacion de los mecanismos que controlan el desarrollo y el mantenimiento de tejidos normales y se piensa cada vez mas que las celulas madre desempenan una funcion principal (Beachy et al.,

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2004, Nature 432: 324). Durante el desarrollo normal de los animales, las celulas de los tejidos mas importantes proceden de celulas precursoras normales, denominadas celulas madre (Morrison et al., 1997, Cell 88: 287-98; Morrison et al., 1997, Curr. Opin. Immunol. 9: 216-21; Morrison et al., 1995, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 11: 35-71). Las celulas madre son celulas que: (1) tienen una amplia capacidad proliferativa; 2) pueden realizar divisiones celulares asimetricas para generar uno o mas tipos de descendencia con posibilidad proliferativa y/o de desarrollo reducidos y 3) pueden realizar divisiones celulares simetricas para su autorrenovacion o automantenimiento. El ejemplo mas conocido de renovacion de celulas adultas mediante la diferenciacion de celulas madre, es el sistema hematopoyetico, en el que celulas precursoras inmaduras desde el punto de vista del crecimiento (celulas progenitoras y celulas madre hematopoyeticas) responden a senales moleculares para formar los diversos tipos de celulas sangulneas y linfoides. Otras celulas, incluyendo las celulas del intestino, del sistema ductal mamario, y de la piel, se estan recargando constantemente de una pequena poblacion de celulas madre en cada tejido y recientes estudios sugieren que la mayor parte de otros tejidos adultos, incluyendo el cerebro, tambien albergan celulas madre.

Los tumores solidos se componen de poblaciones de celulas heterogeneas. Por ejemplo, los canceres de mama son una mezcla de celulas cancerosas y celulas normales, incluyendo celulas mesenquimales (estromales), celulas inflamatorias y celulas endoteliales. Los modelos clasicos de cancer sostienen que todas las poblaciones de celulas cancerosas fenotlpicamente distintas, tienen la capacidad de proliferar y generar un nuevo tumor. En el modelo clasico, la heterogeneidad de las celulas tumorales se debe a factores ambientales, as! como a continuas mutaciones que se producen en celulas cancerosas, dando como resultado una poblacion diversa de celulas tumorigenicas. Este modelo se basa en la idea de que todas las poblaciones de celulas tumorales tendrlan algun grado de potencial tumorigenico. (Pandis et al., 1998, Genes, Chromosomes & Cancer 12: 122-129; Kuukasjrvi et al., 1997, Cancer Res. 57: 1597-1604; Bonsing et al., 1993, Cancer 71: 382-391; Bonsing et al., 2000, Genes Chromosomes & Cancer 82: 173-183; Beerman H et al., 1991, Cytometry. 12: 147-54; Aubele M y Werner M, 1999, Analyt. Cell. Path. 19: 53; Shen L et al., 2000, Cancer Res. 60: 3884).

Un modelo alternativo para la heterogeneidad observada de las celulas de tumor solido, es que los tumores solidos son el resultado de una “celula madre de tumor solido” (o “celula madre cancerosa” de un tumor solido) que posteriormente experimenta un desarrollo caotico a traves de rondas de division celular tanto simetrica como asimetrica. En este modelo de celula madre, los tumores solidos contienen un subconjunto distinto y limitado (posiblemente incluso inusual) de celulas que comparten propiedades con “celulas madre” normales ya que proliferan ampliamente y dan lugar eficazmente a celulas madre tanto de tumor solido adicionales (autorrenovacion) como a la mayorla de celulas tumorales de un tumor solido que carecen de potencial tumorigenico. De hecho, mutaciones dentro de una poblacion longeva de celulas madre pueden iniciar la formacion de celulas madre cancerosas que son la base del crecimiento y mantenimiento de tumores y cuya presencia contribuye al fracaso de las estrategias terapeuticas actuales.

La naturaleza de las celulas madre del cancer se revelo primero en el cancer de sangre, leucemia mieloide aguda (LMA) (Lapidot et al., 1994, Nature 17: 645-8). Mas recientemente se ha demostrado que los tumores de mama humanos neoplasicos albergan de manera similar una pequena poblacion diferente de celulas madre cancerosas enriquecida por su capacidad para formar tumores en ratones inmunodeficientes. Se encontro que la poblacion celular ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin tenia un enriquecimiento de 50 veces mas de celulas tumorigenicas en comparacion con las celulas tumorales no fraccionadas (Al-Hajj et al., 2003, PNAS 100: 3983-8). Ademas, en los canceres de colon tambien hay una poblacion similar. La capacidad de aislar de antemano las celulas cancerosas tumorigenicas ha permitido realizar investigaciones precisas sobre las rutas biologicas crlticas que son la base de la tumorigenidad en estas celulas y por tanto prometen el desarrollo de mejores ensayos de diagnostico y terapias para los pacientes con cancer. Es hacia este proposito y hacia los restantes propositos descritos en el presente documento hacia los que se dirige esta invencion.

Breve resumen de la invencion

La invencion es como se define en las reivindicaciones.

La presente divulgacion se refiere a composiciones y a metodos del campo de la oncologla. En particular, la presente invencion se basa, en parte, en el descubrimiento de que una protelna LGR (receptor acoplado a protelna G, que contiene repeticiones ricas en leucina), tal como LGR5 (receptor 5 acoplado a protelna G, que contiene repeticiones ricas en leucina) es una protelna que se sobreexpresa en celulas madre de cancer de tumor solido, y por tanto es un marcador de celula madre cancerosa util en la caracterizacion, estudio, diagnostico y tratamiento del cancer. Adicionalmente la presente invencion identifica una interaccion entre la R-espondina RSPO1 y el LGR5 como una ruta alternativa para la activacion de la senalizacion de la beta catenina, lo que sugiere que el bloqueo funcional de LGR5 que puede inhibir el crecimiento tumoral. Las interacciones entre LGR5 y cada una de las proteinas RSPO adicionales, RSPO2, RSPO3 y RSPO4 tambien se han identificado ahora.

Asi pues, en determinadas realizaciones, la presente divulgacion proporciona biomoleculas que alteran la senalizacion funcional mediante una proteina LGR incluyendo, en determinadas realizaciones, moleculas que inhiben la interaccion entre la R-espondina (RSPO) y una proteina LGR tal como LGR5. En determinas

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realizaciones, las biomoleculas son anticuerpos. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, las biomoleculas pueden ser anticuerpos que se unen especlficamente a al menos una protelna RSPO humana o anticuerpos que se unen especlficamente al dominio extracelular de al menos una protelna LGR humana. En determinadas realizaciones, la presente invencion proporciona anticuerpos que se unen especlficamente a al menos una protelna RSPO humana (por ejemplo, una, dos, tres o cuatro protelnas RSPO humanas) e inhiben el crecimiento de un tumor solido que comprende celulas madre de tumor solido. En determinadas realizaciones, la al menos una protelna RSPO es RSPO1. En determinadas realizaciones, la presente invencion proporciona anticuerpos que se unen especlficamente a un dominio extracelular de una protelna LGR humana e inhiben el crecimiento de celulas tumorales. En determinadas realizaciones, la protelna LGR es LGR5. En determinadas realizaciones, la presente divulgacion proporciona un receptor de protelna LGR soluble que inhibe el crecimiento de celulas tumorales. En determinadas realizaciones, el receptor de protelna LGR soluble es un receptor LGR5 soluble.

La presente divulgacion tambien proporciona metodos de tratamiento del cancer que comprende celulas madre cancerosas. En determinadas realizaciones, el metodo de tratamiento del cancer comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo que se une especlficamente a al menos una protelna RSPO humana. En determinadas realizaciones, la al menos una protelna RSPO es RSPO1. En determinadas realizaciones, el metodo de tratamiento del cancer comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo que se une especlficamente a un dominio extracelular de una protelna LGR. En determinadas realizaciones, la protelna LGR es LGR5. En determinadas realizaciones, el metodo de tratamiento del cancer comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un receptor de protelna LGR soluble (por ejemplo asociado a membrana, no transmembrana). En determinadas realizaciones, el receptor de protelna LGR soluble es un receptor LGR5 soluble.

La presente divulgacion tambien proporciona un metodo de tratamiento del cancer en un ser humano y/o de inhibicion del crecimiento de un tumor en un ser humano que comprende administrar al ser humano una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente que (a) altere la union de una protelna RSPO humana con una protelna LGR humana y/o (b) altere la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO. En algunas realizaciones, el agente es un anticuerpo. En determinadas realizaciones, el agente se une a una protelna RSPO humana. En determinadas realizaciones, el agente se une a una protelna LGR humana. En determinadas realizaciones, el agente es un anticuerpo que se une especlficamente a al menos una protelna RSPO humana. En determinadas realizaciones alternativas, el agente es un anticuerpo que se une especlficamente a dos o mas protelnas RSPO humanas. En determinadas realizaciones alternativas, el agente es un anticuerpo que se une especlficamente al domino extracelular de al menos una protelna LGR humana. En determinadas realizaciones alternativas, el agente es un anticuerpo que se une especlficamente al dominio extracelular de dos o mas protelnas LGR humanas. En determinadas realizaciones, el agente es un receptor soluble que comprende el domino extracelular de una protelna LGR humana. En determinadas realizaciones, la protelna LGR es LGR5. En determinadas realizaciones, el cancer o el tumor comprende celulas madre cancerosas.

Asimismo, la presente divulgacion proporciona un metodo de inhibicion de la senalizacion de la beta catenina en una celula tumoral, que comprende poner en contacto la celula tumoral con un agente que (a) altere la union de una protelna RSPO humana con una protelna LGR y/o (b) altere la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO. En determinadas realizaciones, el agente se une a una protelna RSPO humana. En determinadas realizaciones, el agente se une a una protelna LGR humana. En determinadas realizaciones alternativas, el agente es un anticuerpo que se une especlficamente a al menos una protelna RSPO humana. En determinadas realizaciones alternativas, el agente es un anticuerpo que se une especlficamente a dos o mas protelnas RSPO humanas. En determinadas realizaciones alternativas, el agente es un anticuerpo que se une especlficamente al domino extracelular de al menos una protelna LGR humana. En determinadas realizaciones alternativas, el agente es un anticuerpo que se une especlficamente al dominio extracelular de dos o mas protelnas LGR humanas. En determinadas realizaciones alternativas, el agente es un receptor soluble que comprende el dominio extracelular de una protelna LGR humana. En determinadas realizaciones, la protelna LGR es LGR5. En determinadas realizaciones, el metodo es un metodo in vitro. En determinadas realizaciones, el metodo es un metodo in vivo.

Adicionalmente la presente invencion proporciona anticuerpos que se unen a un dominio extracelular de una protelna LGR o LGR6 humana y que pueden inhibir el crecimiento de un tumor solido (por ejemplo, un tumor solido que comprende celulas madre de tumor solido) a traves de (a) la alteracion de la union de una protelna RSPO humana con una protelna LGR humana; (b) la alteracion de la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO, y/o (c) la inhibicion de la senalizacion de la beta catenina. La presente invencion tambien proporciona anticuerpos que (a) se unen a un dominio extracelular de una protelna LGR4, LGR5 o LGR6 humana; (b) alteran la union de una protelna RSPO humana con una protelna LGR humana; (c) alteran la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO; (d) inhiben la senalizacion de la beta catenina; y/o (e) pueden inhibir el crecimiento de un tumor solido (por ejemplo, un tumor solido que comprende celulas madre de tumor solido). En determinadas realizaciones, la protelna RSPO humana es RSPO1. En algunas realizaciones alternativas, la protelna RSPO humana es RSPO2, RSPO3 o RSPO4. Adicionalmente se proporcionan llneas celulares que producen los anticuerpos y composiciones que comprenden los anticuerpos. Tambien se proporcionan metodos para el uso de cantidades terapeuticamente eficaces de composiciones que comprenden los anticuerpos para el tratamiento del cancer, que incluyen, pero sin limitacion, la inhibicion del crecimiento de un tumor. Tambien se proporcionan metodos para el uso de los

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anticuerpos in vivo o in vitro, para inhibir la senalizacion de la beta catenina.

Adicionalmente, la presente divulgacion tambien proporciona anticuerpos que se unen a una protelna RSPO humana y que pueden inhibir el crecimiento de un tumor solido (por ejemplo, un tumor solido que comprende celulas madre de tumor solido) a traves de (a) la alteracion de la union de una protelna RSPO humana con una protelna LGR4, LGR5 o LGR6 humana; (b) la alteracion de la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO, y/o (c) la inhibicion de la senalizacion de la beta catenina. Como alternativa, la presente invencion tambien proporciona anticuerpos que (a) se unen a una protelna RSPO humana; (b) alteran la union de una protelna RSPO humana con una protelna LGR4, LGR5 o LGR6 humana; (c) alteran la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO; (d) inhiben la senalizacion de la beta catenina y/o (e) pueden inhibir el crecimiento de un tumor solido (por ejemplo, un tumor solido que comprende celulas madre de tumor solido). En determinadas realizaciones, los anticuerpos se unen especlficamente a una protelna RSPO humana. En determinadas realizaciones la protelna RSPO humana es RSPO1. En algunas realizaciones alternativas, la protelna RSPO humana es RSPO2, RSPO3 o RSPO4. En determinadas realizaciones, la protelna LGR humana es LGR5. Tambien se proporcionan llneas celulares que producen los anticuerpos y las composiciones que comprenden los anticuerpos. Adicionalmente se proporcionan metodos para el uso de cantidades terapeuticamente eficaces de composiciones que comprenden los anticuerpos para el tratamiento del cancer incluyendo, pero sin limitacion, la inhibicion del crecimiento de un tumor. Tambien se proporcionan metodos para el uso de los anticuerpos, in vivo o in vitro, para inhibir la senalizacion de la beta catenina.

La divulgacion proporciona adicionalmente un anticuerpo anti-LGR5 monoclonal, 88M1, producido por una llnea de celulas de hibridoma que tiene el numero de deposito FTA-9341 en la ATCC. Tambien se proporcionan anticuerpos que se unen especlficamente a LGR5 y que comprenden (a) una region variable de cadena pesada y/o una region variable de cadena ligera que tienen una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 95 % con la region variable de cadena pesada y/o con la region variable de cadena ligera (respectivamente) de 88M1; (b) las CDR de cadena pesada y/o cadena ligera de 88M1; (c) se unen a un epltopo que puede unirse a 88M1; y/o (d) compiten con 88M1 en un ensayo de union competitiva. Tambien se proporcionan llneas celulares que producen los anticuerpos (incluyendo, pero sin limitacion, la llnea celular de hibridoma que tiene el numero de deposito FTA-9341 en la ATCC) y las composiciones que comprenden los anticuerpos. Adicionalmente se proporcionan metodos para el uso de cantidades terapeuticamente eficaces de composiciones que comprenden los anticuerpos para el tratamiento del cancer, incluyendo, pero sin limitacion, la inhibicion del crecimiento de un tumor. Tambien se proporcionan metodos para el uso de los anticuerpos, in vivo o in vitro, para inhibir la senalizacion de la beta catenina.

La presente divulgacion proporciona adicionalmente metodos de identificacion y/o de aislamiento de celulas madre cancerosas (por ejemplo, basandose en la expresion de LGR5), de cribado de agentes anticancerosos y de cribado de pacientes para el tratamiento idoneo con los agentes descritos en el presente documento.

Cuando se describen aspectos o realizaciones de la invencion en terminos de un grupo de Markush u otros grupos de alternativas, la presente invencion no solo incluye todo el grupo indicado como un conjunto, sino tambien cada miembro del grupo individualmente y todos los posibles subgrupos del grupo principal, y tambien el grupo principal sin uno o mas de los miembros del grupo. La presente invencion tambien contempla la exclusion expllcita de uno o mas de cualquiera de los miembros del grupo en la invencion reivindicada.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1. LGR5 se sobreexpresa en celulas madre de cancer de tumor solido. Mediante FACS se separaron celulas de tumores de colon humano que contenla celulas madre cancerosas, en una fraccion “TG” tumorigenica (barras de la derecha) y en una fraccion “NTG” no tumorigenica (barras de la izquierda). Se aislo ARNm de estas fracciones y se generaron datos de micromatriz. LGR5 demostro expresion de ARNm mas alta en la fraccion TG de celulas madre cancerosas de tres tumores de colon humano independientes (barra de la derecha de cada conjunto).

Figura 2. LGR5 se sobreexpresa en tumores epiteliales humanos. Se muestran datos de micromatriz de la expresion de ARNm de LGR5 de una gran cantidad de tumores humanos en comparacion con muestras tisulares de tejidos humanos normales. El nivel de expresion de LGR5 en muestras de pacientes individuales se indica mediante llneas discontinuas verticales en el eje horizontal de cada tipo de tejido. LGR5 se sobreexpresa en la mayorla de las muestras tumorales con respecto a la expresion en el tejido normal correspondiente.

Figura 3. LGR6 muestra expresion alterada en tumores epiteliales humanos. Se muestran datos de micromatriz de la expresion de ARNm de LGR6 de una gran cantidad de tumores humanos en comparacion con muestras tisulares de tejidos humanos normales. El nivel de expresion de LGR6 en muestras de pacientes individuales se indica mediante llneas discontinuas verticales en el eje horizontal de cada tipo de tejido. La expresion de LGR6 muestra expresion alterada en muchas muestras de tumor con respecto a la expresion en el tejido normal correspondiente.

Figura 4. RSPO1 activa la senalizacion de la beta catenina. La actividad luciferasa (eje y) de un indicador de luciferasa, 8xTCF, se midio despues de exposition a RSPO1-Fc a la concentration indicada (eje x). RSPO1-Fc indujo la actividad luciferasa del promotor sensible a la beta catenina de una manera dependiente de la dosis. Figura 5. LGR5 (LGR5-Fc) soluble inhibe la induction de la senalizacion de la beta catenina mediante RSPO1.

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La actividad luciferasa (eje y) de celulas transfectadas con un indicador de luciferasa 8xTCF se midio en respuesta a la exposicion al medio de control (cuadrados, sin RSPO) o a RSPO1-Fc en combinacion con concentraciones en aumento de LGR5 soluble (rombos, RSPO 2,5 ug).

Figura 6. LGR5 Soluble, pero no FZD10 soluble, inhibe la induccion sinergica de la senalizacion de la beta catenina mediante RSPO1 y Wnt3A. A) LGR5 soluble inhibe la induccion sinergica de la senalizacion de la beta catenina mediante RSPO1 y Wnt3A. La actividad Luciferasa (eje y) de celulas transfectadas con un indicador de luciferasa 8xTCF se midio en respuesta a la exposicion al medio de control (rombos, LCM); RSPO1 y LCM (cuadrados, RSPO + LCM); Wnt3A (triangulos) y RSPO1 mas Wnt3A (cruces). Concentraciones en aumento de LGR5 soluble (eje x) redujeron la induccion sinergica de la actividad luciferasa por RSPO1 y Wnt3A. B) FZD10 soluble no inhibe la induccion sinergica de la senalizacion de la beta catenina por RSPO1 y Wnt3A. La actividad luciferasa (eje y) de celulas transfectadas con un indicador de luciferasa 8xTCF se midio en respuesta a la exposicion al medio de control (rombos, LCM); RSPO1 y LCM (cuadrados, RSPO + LCM); Wnt3A (triangulos); y RSPO1 mas Wnt3A (cruces). Concentraciones en aumento de LGR5 (eje x) redujeron la induccion sinergica de la actividad luciferasa por RSPO1 y Wnt3A.

Figura 7. RSPO1 activa la senalizacion de la beta catenina a traves de la Union a LGR5. A) Celulas HEK 293 transfectadas de modo transitorio con RSPO1-CD4TM y GFP se incubaron con LGR5-Fc, LRP6FL-Fc, LRP6E1- 2-Fc o FZD1-10-Fc como se indica. Los analisis FACS basados en GFP (eje x) y la union a la protelna de fusion Fc (eje y) demostraron union entre RSPO1 y LGR5 (parte superior izquierda). RSPO1 solo se unio debilmente a LRP6 y no pudo interaccionar con ninguna FZD. B) Celulas HEK 293 transfectadas de manera transitoria con FLAG-LGR5-CD4TM y GFP se incubaron en presencia de heparina con (por duplicado) RSPO1-Fc (parte superior), FZD8-Fc (parte central) o un anticuerpo FLAG como control positivo (parte inferior). Los analisis FACS basados en GFP (eje x) y la union a la protelna de fusion Fc (eje y) demostraron union entre RSPO1 y LGR5 pero no con FZD8. C) Todos los miembros de la familia RSPO pudieron unirse a LGR5. Celulas HEK 293 transfectadas de modo transitorio con FLAG-LGR5-CD4TM y GFP se incubaron en presencia de heparina con RSPO1-Fc, RSPO2-Fc, RSPO3-Fc, RSPO4-Fc, FZD8-Fc, o con un anticuerpo FlAg, como control positivo, como se indica. Los analisis FACS basados en GFP (eje x) y la union a la protelna de fusion Fc (eje y) demostraron union entre cada miembro de la familia RSPO y LGR5 como se indica mediante la senal FACS dentro del cuadrante en recuadro en el lado superior derecho de cada grafica FACS.

Figura 8. Identificacion de los mAb (anticuerpos monoclonales) contra LGR5. Celulas HEK 293 transfectadas de manera transitoria con FLAG-LGR5-CD4TM y GFP se incubaron con un anticuerpo irrelevante como anticuerpo negativo (control IgG1) o con un anticuerpo anti FLAG como control positivo para la expresion de LGR5, o los mAb contra LGR5 (88M1, 88M5), seguido de incubacion con reactivo anti-mAb secundario fluorescente conjugado con PE (ficoeritrina). Despues, las muestras se realizaron mediante citometrla de flujo. Se descubrio que 88M1 y 88M5 presentaban union especlfica a LGR5.

Figura 9. identificacion del mAb que inhibe la union de RSPO a LGR5. Celulas HEK 293 transfectadas de modo transitorio con FLAG-LGR5-CD4TM y GFP. La union de la protelna de fusion RSPO1-Fc con celulas transfectadas se detecto por incubacion con anti-Fc humano conjugado con PE. El impacto del anticuerpo anti- LGR5, 88M1, sobre la union con RSPO se evaluo por incubacion de las celulas con 88M1 como se indica y con analisis de citometrla de flujo. El experimento muestra que 88M1 reduce la union de RSPO1 con LGR5.

Descripcion detallada de la invencion

La presente divulgacion proporciona composiciones y metodos para caracterizar, estudiar, diagnosticar y tratar el cancer. En particular, la presente divulgacion proporciona la protelna LGR5 como un marcador de celulas madre de cancer de tumor solido e identifica una nueva interaccion entre LGR5 y una protelna RSPO, RSPO1, (as! como RSPO2, RSPO3, y RSPO4) como una ruta alternativa para la activacion de la senalizacion de la beta catenina. La manipulacion de esta ruta de senalizacion de LGR5, incluyendo la alteration de la senalizacion funcional de LGR5, proporciona nuevas composiciones y metodos novedosos para el tratamiento del cancer.

La presente invencion se basa en parte en el descubrimiento de celulas madre de tumor solido (tambien denominadas celulas madre cancerosas o celulas madre cancerosas de tumor solido) como un subconjunto distinto y limitado de celulas dentro de la poblacion celular heterogenea de tumores solidos establecidos. Estas celulas madre cancerosas comparten las propiedades de las celulas madre normales ya que proliferan ampliamente y dan lugar eficazmente a celulas madre tanto de tumor solido adicionales (autorrenovacion) como a la mayorla de celulas tumorales de un tumor solido que carecen de potencial tumorigenico. La identificacion de celulas madre cancerosas se basa en 1) su expresion de un patron exclusivo de receptores de superficie celular usados para aislarlas de la mayorla de las celulas tumorales no tumorigenicas y 2) sus propiedades de autorrenovacion y proliferation, evaluadas en modelos animales de xenoinjerto.

En determinadas realizaciones, la divulgacion proporciona de este modo un metodo para direccionar de modo selectivo agentes diagnosticos o terapeuticos contra celulas madre cancerosas. En determinadas realizaciones, la divulgacion tambien proporciona un agente, tal como una biomolecula, que se dirige selectivamente a celulas madre cancerosas (por ejemplo, se dirige a uno de los marcadores de cancer de celulas madre de cancer de colon desvelados en el presente documento). En determinadas realizaciones, el marcador de cancer de celulas madre dirigido es parte de una ruta de autorrenovacion o de supervivencia celular. En determinadas realizaciones, la presente divulgacion proporciona metodos para cribar agentes anticancerosos; para el ensayo de terapias

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anticancerosas; para el desarrollo de farmacos que se dirigen a nuevas rutas; para la identificacion de nuevas dianas terapeuticas contra el cancer; para la identificacion y diagnostico de celulas neoplasicas en especlmenes patologicos; para el ensayo y evaluacion de la sensibilidad de farmacos contra celulas madre de tumor solido; para la medicion de factores especlficos que predicen la sensibilidad de farmacos; y para la cribado de pacientes (por ejemplo, como un adyuvante para mamografla).

En la solicitud de patente PCT WO 02/12447, publicada por el Regents of the University of Michigan y en la solicitud de patente PCT, PCT/USO2/39191, del Regents of the University of Michigan se ofrece una orientacion adicional con respecto a celulas madre cancerosas.

La presente divulgacion identifica la expresion de celulas madre cancerosas ya que comprenden niveles elevados de LGR5 (receptor 5 acoplado a protelna G que contiene repeticiones ricas en leucina) en comparacion con celulas tumorales no tumorigenicas. LGR5 es un miembro de una pequena familia de protelnas huerfanas de siete dominios transmembrana con dominios extracelulares relativamente grandes que incluye LGR4, LGR5 y LGR6.

La presente invencion tambien identifica una interaccion entre RSPO1 y LGR5 que activa una ruta de senalizacion alternativa de la beta catenina. Las R-espondinas (RSPO) son una familia de cuatro protelnas pequenas secretadas que se ha reconocido recientemente que estimulan a la beta catenina de una manera similar a la senalizacion de Wnt. Cabe destacar, que las protelnas Wnt y RSPO muestran profundo sinergismo. Recientemente se ha sugerido que la activacion de la beta catenina mediante RSPO esta mediada a traves de miembros de la familia de receptores Frizzled y de la familia de correceptores LRP5, 6 (Nam et al., 2006, JBC 281: 13247-57). La presente invencion identifica a LGR5 como un receptor para RSPO.

Desde hace tiempo a la ruta de senalizacion Wnt se la ha implicado con cancer debido a la presencia de mutaciones que activan la ruta en determinados tumores (por ejemplo mutaciones en el gen de la PCA (poliposis colica adenomatosa) en cancer de colon y por la capacidad que tienen determinadas WNT para dirigirse al cancer cuando se expresan como transgenes constitutivos o despues de insercion retroviral (por ejemplo, el modelo de tumor de mama Wnt1). Sin embargo, sorprendentemente, resulta diflcil conseguir pruebas reales de que las propias protelnas Wnt se dirigen a cualquier tumor humano espontaneo.

La presente invencion identifica una ruta alternativa mediante protelnas RSPO y protelnas LGR que pueden dar lugar a la activacion de la beta catenina en celulas tumorales. Sin cenirse a la teorla, el modelo sugiere que los miembros de la familia de receptores LGR pueden actuar como un “reostato” que regula el nivel de la beta catenina en respuesta a Wnt debido al profundo sinergismo observado demostrado por la R-espondina y la Wnt en la induccion de la beta catenina. Dado que los tumores exhiben niveles notablemente elevados de LGR5, estos pueden demostrar en consecuencia beta catenina elevada en presencia de niveles “normales” de protelnas Wnt.

Basandose en parte en estos descubrimientos, la presente divulgacion proporciona, en determinadas realizaciones, agentes que alteran la union de al menos una protelna RSPO humana con al menos una protelna LGR (por ejemplo, LGR5). En determinadas realizaciones, los agentes alteran la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO. En realizaciones adicionales, los agentes inhiben el crecimiento tumoral, incluyendo el crecimiento de tumores solidos que comprenden celulas madre cancerosas. En algunas realizaciones, los agentes son anticuerpos que se unen especlficamente a al menos una protelna RSPO o inhiben al menos una protelna LGR. En algunas realizaciones, los agentes son anticuerpos que se unen especlficamente a dos o mas protelnas RSPO o que se unen a dos o mas protelnas LGR. Adicionalmente se proporcionan composiciones que comprenden estos agentes y su uso en el tratamiento de canceres (especialmente, pero sin limitacion, los que implican celulas madre cancerosas).

Definiciones

Para facilitar un entendimiento de la presente invencion, a continuacion se definen diversos terminos y frases:

Un “anticuerpo” es una molecula de inmunoglobulina que reconoce una diana y se une especlficamente a ella, tal como una protelna, un polipeptido, un peptido, un carbohidrato, un polinucleotido, un llpido, etc., a traves de al menos un sitio de reconocimiento de antlgeno dentro de la region variable de la molecula de inmunoglobulina. De la forma en la que se usa en el presente documento, el termino se usa en el mas amplio sentido e incluye anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpo (tales como fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv), mutantes de Fv monocatenario (scFv, single chain Fv), anticuerpos multiespeclficos tales como anticuerpos biespeclficos generados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, protelnas de fusion que comprenden una parte de anticuerpo y cualquier otra molecula de inmunoglobulina modificada que comprenda un sitio de reconocimiento de antlgeno siempre que los anticuerpos muestren la actividad biologica deseada. Un anticuerpo puede ser cualquiera de las cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, o subclases (isotipos) de las mismas (por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2), basandose en la identidad de sus dominios constantes de las cadena pesadas denominadas alfa, beta, epsilon, gamma y mu, respectivamente. Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen estructuras subunitarias diferentes y bien conocidas y configuraciones tridimensionales. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos desnudos o pueden conjugarse con otras moleculas, tales como toxinas, radioisotopos, etc.

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De la forma en la que se usa en el presente documento, la expresion “fragmentos de anticuerpo” se refiere a una parte de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitacion, anticuerpos lineales; moleculas de anticuerpos monocatenarios; peptidos Fc o Fc', fragmentos Fab y Fab' y anticuerpos multiespeclficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

De la forma en la que se usa en el presente documento, formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son anticuerpos quimericos que contienen secuencias mlnimas, o que no contienen secuencias, procedentes de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una region hipervariable del receptor se reemplazan por restos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como un raton, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad, y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la region marco (FR, framework) conservada Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por restos no humanos correspondientes. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan generalmente para refinar adicionalmente el rendimiento de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos de al menos uno y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los restos FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado tambien puede comprender al menos una parte de una region constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. En la Patente de Estados Unidos 5.225.539 de Winter et al., se describen ejemplos de metodos usados para generar anticuerpos humanizados.

La expresion “anticuerpo humano”, de la forma en la que se usa en el presente documento, significa un anticuerpo producido por un ser humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoacidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano fabricado utilizando cualquiera de las tecnicas conocidas en la materia. Esta definicion de un anticuerpo humano incluye anticuerpos intactos o de longitud completa, sus fragmentos y/o anticuerpos que comprenden al menos un polipeptido de cadena pesada y/o ligera humana tal como, por ejemplo, un anticuerpo que comprende polipeptidos de cadena pesada humana y cadena ligera murina.

Los “anticuerpos hlbridos” son moleculas de inmunoglobulina en las que los pares de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos con diferentes regiones determinantes antigenicas se ensamblan entre si de tal manera que dos epltopos diferentes o dos antlgenos diferentes pueden reconocerse y unirse mediante el tetramero resultante.

La expresion “anticuerpos quimericos” se refiere a anticuerpos en los que la secuencia de aminoacidos de la molecula de inmunoglobulina procede de dos o mas especies. Normalmente, la region variable de las cadenas tanto ligera como pesada corresponde a la region variable de los anticuerpos procedentes de una especie de mamlfero (por ejemplo raton, rata, conejo, etc.) con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas aunque las regiones constantes sean homologas a las secuencias en los anticuerpos procedentes de otro (normalmente ser humano) para evitar suscitar una respuesta inmunitaria en esa especie.

El termino “epltopo” o la expresion “determinante antigenico” se usan indistintamente en el presente documento y se refieren la parte de un antlgeno que puede reconocer un anticuerpo particular y con la que puede unirse. Cuando el antlgeno es un polipeptido, los epltopos pueden formarse a partir de aminoacidos tanto contiguos como no contiguos yuxtapuestos mediante un plegamiento terciario de una protelna. Generalmente, los epltopos formados a partir de aminoacidos contiguos se conservan despues de la desnaturalizacion de la protelna, mientras que los formados mediante un plegamiento terciario se pierden despues de dicha desnaturalizacion. Generalmente, un epltopo incluye al menos 3, y mas normalmente, al menos 5 u 8-10 aminoacidos en una conformation espacial unica. Un determinante antigenico puede competir con el antlgeno intacto (es decir, el inmunogeno “usado para suscitar la respuesta inmunitaria) por la union con el anticuerpo.

Que un anticuerpo se “una especlficamente con” o que muestre “union especlfica hacia” un epltopo significa que el anticuerpo reacciona o se asocia mas frecuentemente, mas rapidamente, durante mas tiempo y/o con mayor afinidad, con el epltopo que con sustancias alternativas. De la forma en la que se usa en el presente documento, la expresion “se une especlficamente” significa que un anticuerpo se une a una protelna con una Kd de al menos aproximadamente 0,1 mM, al menos aproximadamente 1 pM, al menos aproximadamente 0,1 pM o mas, o 0,01 pM o mas. Se entiende que un anticuerpo o fraction de union, que se une especlficamente a una primera diana, puede unirse especlficamente o no a una segunda diana. Como tal, la “union especlfica” no requiere necesariamente (aunque pueda incluir) union exclusiva, es decir union a una sola diana. Generalmente, aunque no necesariamente, cuando se hace alusion a una union significa una union especlfica.

De la forma en la que se utiliza en el presente documento, cuando las expresiones “union no especlfica” y “union de fondo” se usan en referencia a la interaction de un anticuerpo y una protelna o un peptido, se refieren a una interaction que no depende de la presencia de una estructura particular (es decir, el anticuerpo se une a protelnas en general en lugar de a una estructura particular, tal como un epltopo).

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De la forma en la que se utiliza en el presente documento, la expresion “dominio de union a receptor” se refiere a cualquier ligando nativo para un receptor, incluyendo moleculas de adhesion celular, o cualquier region o derivado de dicho ligando nativo que conserve al menos una capacidad de union al receptor cualitativa de un ligando nativo correspondiente.

De la forma en la que se utiliza en el presente documento, la expresion “quimera de inmunoadhesina-anticuerpo” comprende una molecula que combina al menos un dominio de union de un anticuerpo con al menos una inmunoadhesina. Como ejemplos se incluyen, pero sin limitacion, las quimeras CD4-IgG biespeclficas descritas en Berg et al, PNAS (USA) 88: 4723-4727 (1991) y en Charnow et al, J. Immunol., 153: 4268 (1994).

El termino “enriquecido(a)”, como se indica cuando se hace referencia a una poblacion de celulas enriquecida, puede definirse fenotlpicamente en funcion del numero de celulas aumentado que tiene un marcador particular (por ejemplo, como se muestra en la Tabla 1) en un conjunto de celulas fraccionadas en comparacion con el numero de celulas que tiene el marcador en el conjunto de celulas no fraccionadas. Sin embargo, el termino “enriquecido(a)” puede definirse funcionalmente mediante una funcion tumorigenica como el numero de celulas mlnimo que forma tumores a una frecuencia de dilucion limitante en ratones de ensayo. Por ejemplo, si 500 celulas madre tumorales forman tumores en el 63 % de los animales de ensayo, pero se necesitan 5000 celulas tumorales no fraccionadas para formar los tumores en el 63 % de los animales de ensayo, entonces la poblacion de celulas madre de tumor solido esta 10 veces mas enriquecida con actividad tumorigenica. Los marcadores de cancer de celulas madre de la presente divulgacion pueden utilizarse para generar poblaciones de celulas madre enriquecidas. En algunas realizaciones, la poblacion de celulas madre esta enriquecida al menos 1,4 veces con respecto a las celulas tumorales no fraccionadas. En otras realizaciones, la poblacion de celulas madre esta enriquecida de 2 a 4 veces mas con respecto a las celulas tumorales no fraccionadas. En realizaciones adicionales, la poblacion de celulas madre esta 20 veces mas enriquecida con respecto a celulas tumorales no fraccionadas.

En lo que respecta a celulas, el termino “aislado”, se refiere a una celula que se retira de su medio natural (tal como en un tumor solido) y que se alsla o se separa, y que esta libre de al menos aproximadamente un 30 %, 50 %, 75 % o aproximadamente un 90 % de otras celulas con las que esta presente de manera natural, pero que carece del marcador basandose en lo cual se aislaron las celulas. Los marcadores de cancer de celulas madre de la presente divulgacion pueden utilizarse para generar poblaciones aisladas de celulas madre cancerosas.

De la forma en la que se usa en el presente documento, los terminos “cancer” y “canceroso” se refieren a o describen la afeccion fisiologica en mamlferos en los que una poblacion de celulas se caracteriza por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de canceres incluyen, pero sin limitacion, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos mas particulares de dichos canceres incluyen cancer de celulas escamosas, cancer pulmonar microcltico, cancer pulmonar no microcltico, adenocarcinoma pulmonar, carcinoma escamoso de pulmon, cancer de peritoneo, cancer hepatocelular, cancer gastrointestinal, cancer pancreatico, glioblastoma, cancer de cuello uterino, cancer de ovario, cancer de hlgado, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, cancer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glandulas salivares, cancer de rinon, cancer de hlgado, cancer de prostata, cancer de vulva, cancer tiroideo, carcinoma hepatico y diversos tipos de cancer de cabeza y cuello.

“Metastasis” de la forma en la que se usa en el presente documento se refiere al proceso mediante el cual un cancer se disemina o se transfiere desde el lugar de origen a otras regiones del organismo con el desarrollo de una lesion cancerosa similar en el nuevo lugar. Una celula “metastasica” o “metastatizante” es una que pierde contactos adhesivos con celulas contiguas y migra a traves de la corriente sangulnea o la linfa desde el lugar primario de la enfermedad invadiendo estructuras corporales contiguas.

De la forma en la que se usa en el presente documento, el termino “sujeto” se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamlfero), incluyendo, pero sin limitacion, seres humanos, primates no humanos, roedores y similares, que sera el receptor de un tratamiento particular. Normalmente, los terminos “sujeto” y “paciente” se usan indistintamente en el presente documento en referencia a un sujeto humano.

De la forma en la que se usa en el presente documento, la expresion “sujeto que se sospecha que tiene cancer” se refiere a un sujeto que presenta uno o mas slntomas indicativos de un cancer (por ejemplo, un bulto o una masa perceptible) o un sujeto en el que se esta cribando un supuesto cancer (por ejemplo, durante un reconocimiento medico rutinario). Un sujeto que se sospecha que tiene cancer tambien puede tener uno o mas factores de riesgo. Un sujeto que se sospecha que tiene cancer generalmente no se ha sometido a cribado para detectar cancer. Sin embargo, un “sujeto que se sospecha que tiene cancer” se trata de un individuo que ha recibido un diagnostico inicial pero cuyo estadio de cancer aun se desconoce. La expresion tambien incluye personas que alguna vez tuvieron un cancer (por ejemplo, un individuo en remision).

De la forma en la que se usa en el presente documento, la expresion “sujeto en riesgo de padecer cancer” se refiere a un sujeto con uno o mas factores de riesgo para desarrollar un cancer especlfico. Los factores de riesgo incluyen, pero sin limitacion, el sexo, la edad, la predisposicion genetica, la exposicion ambiental, los episodios anteriores de cancer, las enfermedades preexistentes no cancerosas y el modo de vida.

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De la forma en la que se usa en el presente documento, la expresion “caracterizar cancer en un sujeto” se refiere a la identificacion de una o mas propiedades de una muestra de cancer en un sujeto, incluyendo pero sin limitacion, la presencia de tejido benigno, precanceroso o canceroso, el estadio del cancer, y el pronostico del sujeto. Los canceres pueden caracterizarse a traves de la identificacion de la expresion de uno o mas genes marcadores de cancer, incluyendo pero sin limitacion, los marcadores de cancer desvelados en el presente documento.

Las expresiones “celula madre cancerosa”, “celula madre tumoral”, o “celula madre de tumor solido” se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una poblacion de celulas de un tumor solido que: (1) tienen una amplia capacidad proliferativa; (2) pueden realizar division celular asimetrica para generar uno o mas tipos de descendencia diferenciada con potencial proliferativo o evolutivo reducido; (3) pueden realizar division celular simetrica para la autorrenovacion o automantenimiento; y (4) pueden formar tumores palpables despues de un trasplante en serie en un modelo de xenoinjerto. Las propiedades de capacidad proliferativa y division celular asimetrica y simetrica potenciada de las “celulas madre cancerosas”, “celulas madre tumorales” o “celulas madre de tumor solido” confiere a las celulas madre cancerosas la capacidad de formar tumores palpables despues de un trasplante en serie en un raton inmunocomprometido en comparacion con la mayorla de celulas tumorales que no generan tumores. Las celulas madre cancerosas experimentan autorrenovacion frente a diferenciacion de una manera caotica para formar tumores con tipos de celulas anomalos que con el tiempo pueden cambiar a medida que se producen mutaciones. Las celulas madre de tumor solido de la presente divulgacion se diferencian de la “llnea de celula madre cancerosa” proporcionada en la Patente de Estados Unidos N° 6.004.528. En esa patente, la “llnea de celula madre cancerosa” se define como un tipo de celula progenitora de lento desarrollo que en si misma tiene pocas mutaciones pero que experimenta divisiones celulares simetricas en lugar de asimetricas como resultado de cambios tumorigenicos que se producen en el medio celular. Esta hipotesis de “llnea de celula madre cancerosa” propone por tanto que las celulas tumorales sumamente mutadas, que proliferan rapidamente, surgen principalmente como resultado de un entorno anomalo, lo que produce la acumulacion de celulas madre relativamente normales y despues sufren mutaciones que pueden hacer que se conviertan en celulas tumorales. La Patente de Estados Unidos N° 6.004.528 propone que dicho modelo puede utilizarse para mejorar el diagnostico del cancer. El modelo de celulas madre de tumor solido es fundamentalmente diferente al modelo de la “llnea de celula madre cancerosa” y como resultado presenta utilidades que no ofrece el modelo de la “llnea madre cancerosa”. En primer lugar, las celulas madre de tumor solido no estan “exentas de mutacion”. La llnea de celula madre cancerosa “exenta de mutacion” descrita en la Patente de Estados Unidos N° 6.004.528 puede considerarse como una lesion precancerosa, aunque las celulas madre de tumor solido descritas en esta divulgacion son celulas cancerosas que en si mismas contienen las mutaciones que son responsables de la tumorigenesis. Es decir, las celulas madre de tumor solido (“celulas madre cancerosas”) de la divulgacion se incluirlan entre las celulas sumamente mutadas que se diferencian de las de la “llnea de celulas madre cancerosas” en la Patente de Estados Unidos N° 6.004.528. En segundo lugar, las mutaciones geneticas que dan lugar a cancer pueden ser mayormente intrlnsecas dentro de las celulas madre de tumor solido as! como lo son en su entorno. El modelo de celula madre de tumor solido predice que las celulas madre de tumor solido aisladas pueden originar tumores adicionales despues de un trasplante (explicando de este modo la metastasis) mientras que el modelo de “llnea de celula madre cancerosa” predice que las celulas de la “llnea de celula madre cancerosa” trasplantada no podrla originar un nuevo tumor, ya que era su entorno anomalo el que era tumorigenico. De hecho, la capacidad para trasplantar celulas madre de tumor solido humano aisladas fenotlpicamente (en un entorno que es muy diferente al del entorno de un tumor normal), en la que aun forma nuevos tumores, diferencia la presente divulgacion del modelo de “llnea de celula madre cancerosa”. En tercer lugar, las celulas madre de tumor solido probablemente se dividen de forma tanto asimetrica como asimetrica, de tal manera que la division celular simetrica no es una propiedad estricta. En cuarto lugar, las celulas madre de tumor solido pueden dividirse de un modo rapido o lento, dependiendo de muchas variables, de tal manera que un Indice de proliferation lento no es una caracterlstica definitoria.

De la forma en la que se usa en el presente documento “tumorigenico” se refiere a las caracterlsticas funcionales de una celula madre de tumor solido que incluye las propiedades de autorrenovacion (dando lugar a celulas madre cancerosas tumorigenicas adicionales) y proliferacion para generar todas las demas celulas tumorales (dando lugar a celulas tumorales diferenciadas y por tanto no tumorigenicas) que permiten que las celulas madre de tumor solido formen un tumor. Estas propiedades de autorrenovacion y proliferacion para generar otras celulas tumorales confieren a las celulas madre cancerosas de la presente divulgacion la capacidad de formar tumores palpables despues de un trasplante en serie en un raton inmunocomprometido en comparacion con la mayorla de las celulas tumorales que no pueden formar tumores despues de un trasplante en serie. Las celulas tumorales, es decir, celulas tumorales no tumorigenicas, pueden formar un tumor despues del trasplante en un raton inmunocomprometido un numero de veces limitado (por ejemplo de una a dos veces) despues de obtener las celulas tumorales de un tumor solido.

De la forma en la que se usa en el presente documento, las expresiones “uno o mas marcadores de cancer de celulas madre”, “uno o mas marcadores de celula madre cancerosas”, “uno o mas marcadores de celulas madre tumorales” o “uno o mas marcadores de celulas madre de tumor solido” se refieren a uno o mas genes o a una protelna, polipeptido, o peptido expresado por el gen o los genes cuyo nivel de expresion, en solitario o en combination con otros genes, se correlaciona con la presencia de celulas cancerosas tumorigenicas en comparacion con las no tumorigenicas. La correlation puede relacionarse con una expresion aumentada o disminuida del gen (por ejemplo, niveles aumentados o disminuidos de ARNm o del peptido codificado por el gen).

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De la forma en la que se usa en el presente documento, las expresiones “celulas tumorales no fraccionadas”, “celulas tumorales previamente clasificadas”, “celulas tumorales a granel” y sus equivalentes gramaticales se usan indistintamente para referirse a una poblacion de celulas tumorales aislada de una muestra de un paciente (por ejemplo una biopsia de un tumor o un derrame pleural) que no se ha segregado, o fraccionado, basandose en la expresion del marcador de superficie celular.

De la forma en la que se usa en el presente documento, las expresiones “celulas tumorales no-ESA+CD44+”, “no- ESA+44+”, “celulas tumorales no tumorigenicas clasificadas”, “celulas no madre” y sus equivalentes gramaticales se usan indistintamente para referirse a una poblacion de tumores de la que se han segregado, o retirado, celulas madre cancerosas ESA+CD44+, basandose en la expresion del marcador de superficie celular.

De la forma en la que se usa en el presente documento, la frase “expresion genica” se refiere al proceso de convertir la informacion genetica codificada en un gen en ARN (por ejemplo, ARNm, ARNr, ARNt, o ARNsn) a traves de la “transcripcion” del gen (por ejemplo, mediante la accion enzimatica de una ARN polimerasa) y para genes que codifican protelnas, en protelnas a traves de la “traduccion” de ARNm. La expresion genica puede regularse en muchas fases en el proceso. “Regulacion positiva” o “activacion” se refiere a regulacion que aumenta la produccion de los productos de expresion genica (por ejemplo, ARN o protelna), mientras que “regulacion negativa” o “represion” se refiere a regulacion que disminuye la produccion. Las moleculas (por ejemplo, factores de transcripcion) que intervienen en la regulacion positiva o en la regulacion negativa a menudo reciben el nombre de “activadores” y “represores”, respectivamente.

Las expresiones “niveles altos”, “niveles aumentados”, “expresion alta”, “expresion aumentada”, “niveles elevados” o “expresion regulada de manera positiva” en lo que respecta a la expresion genica, de la forma en la que se usa en el presente documento de manera indistinta, se refiere a la expresion de un gen en una celula o poblacion de celulas, particularmente en una celula madre cancerosa o poblacion de celulas madre cancerosas, a niveles mas altos que los de la expresion de ese gen en una segunda celula o poblacion de celulas, por ejemplo, celulas tumorales de colon no fraccionadas o celulas tumorales de colon no-ESA+44+. La expresion “niveles elevados” de expresion genica, se refiere a la expresion de un gen en una celula madre cancerosa o poblacion de celulas madre cancerosas a niveles dos veces mas elevados, o mayores, que los niveles de expresion del mismo gen en celulas tumorales de colon no fraccionadas o en celulas tumorales de colon no-ESA+44+. “Niveles elevados” de expresion genica tambien refiere a la expresion de un gen en una celula madre cancerosa o poblacion de celulas madre cancerosas a niveles seis veces mas elevados, o mayores, que los niveles de expresion del mismo gen en celulas tumorales de colon no fraccionadas o en celulas tumorales de colon no-ESA+44+. Los “niveles elevados” de expresion genica pueden determinarse detectando cantidades aumentadas de un polinucleotido (ARNm, ADNc, etc.) en celulas madre cancerosas en comparacion con celulas tumorales de colon no fraccionadas o celulas tumorales de colon no- ESA+44+ mediante, por ejemplo, RT-PCR cuantitativa o analisis de micromatriz. Como alternativa, los “niveles elevados” de expresion genica pueden determinarse detectando cantidades aumentadas de una protelna en celulas madre cancerosas en comparacion con celulas tumorales de colon no fraccionadas o celulas tumorales de colon no- ESA+44+ mediante, por ejemplo, ELISA, transferencia de Western e inmunofluorescencia cuantitativa.

La expresion “niveles no detectables” o “perdida de expresion” con respecto a la expresion genica, de la forma en la que se usa en el presente documento, se refiere a la expresion de un gen en una celula o poblacion de celulas, particularmente en una celula madre cancerosa o poblacion de celulas madre cancerosas, a niveles que no pueden diferenciarse de los del fondo utilizando tecnicas convencionales, de tal manera que no se identifica la expresion. Los “niveles no detectables” de la expresion genica pueden determinarse por no poder detectar niveles de un polinucleotido (ARNm, ADNc, etc.) en celulas madre cancerosas por encima de los del fondo, por ejemplo, mediante RT-PCR cuantitativa o analisis de micromatriz. Como alternativa los “niveles no detectables” de expresion genica pueden determinarse por no poder detectar niveles de una protelna en celulas madre cancerosas por encima de los del fondo mediante, por ejemplo ELISA, transferencia de Western o inmunofluorescencia cuantitativa.

De la forma en la que se usa en el presente documento, las expresiones “bajos niveles”, “niveles disminuidos”, “baja expresion”, “expresion reducida” o “expresion disminuida” en lo que respecta a la expresion genica, de la forma en la que se usa en el presente documento indistintamente, se refiere a la expresion de un gen en una celula o poblacion de celulas, particularmente en una celula madre cancerosa o poblacion de celulas madre cancerosas, a niveles mas bajos que los de la expresion de ese gen en una segunda celula o poblacion de celulas, por ejemplo, celulas tumorales de colon no fraccionadas o celulas tumorales de colon no-ESA+44+. “Bajos niveles” de expresion genica se refiere a la expresion de un gen en una celula madre cancerosa o poblacion de celulas madre cancerosas a niveles de: 1) la mitad o por debajo de los niveles de expresion del mismo gen en celulas tumorales de colon no fraccionadas o en celulas tumorales de colon no-ESA+44+ y 2) el llmite de deteccion inferior utilizando tecnicas convencionales. Los “niveles bajos” de expresion genica pueden determinarse detectando su disminucion a cantidades apenas no detectables de un polinucleotido (ARNm, ADNc, etc.) en celulas madre cancerosas en comparacion con las celulas tumorales de colon no fraccionadas o celulas tumorales de colon no-ESA+44+ mediante, por ejemplo, RT-PCR cuantitativa o analisis de micromatriz. Como alternativa, los “bajos niveles” de expresion genica pueden determinarse detectando su disminucion a cantidades apenas no detectables de una protelna en celulas madre cancerosas en comparacion con las celulas tumorales de colon no fraccionados o celulas tumorales de colon no-ESA+44+, por ejemplo, mediante ELISA, transferencia de Western o inmunofluorescencia

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cuantitativa.

De la forma en la que se usa en el presente documento, la expresion “un reactivo que detecta especlficamente niveles de expresion” se refiere a reactivos utilizados para detectar la expresion de uno o mas genes (por ejemplo, incluyendo, pero sin limitation, los marcadores de cancer de la presente divulgation). Los ejemplos de reactivos adecuados incluyen, pero sin limitacion, sondas de acido nucleico que pueden hibridarse especlficamente con el gen de interes, aptameros, cebadores de PCR que pueden amplificar especlficamente el gen de interes y anticuerpos que pueden unirse especlficamente a protelnas expresadas por el gen de interes. En la description y en los ejemplos indicados a continuation pueden encontrarse otros ejemplos no limitantes.

De la forma en la que se usa en el presente documento, la expresion “detectar una expresion disminuida o aumentada con respecto a un control no canceroso” se refiere a medir el nivel de expresion de un gen (por ejemplo, el nivel de ARN, o protelna) en relation con el nivel en una muestra de control no cancerosa. La expresion genica puede medirse utilizando cualquier metodo adecuado, incluyendo, pero sin limitacion, los descritos en el presente documento.

De la forma en la que se usa en el presente documento, las expresiones “proporcionar un diagnostico” o information de diagnostico” se refieren a cualquier informacion que se sea util para determinar si un paciente tiene una enfermedad o afeccion y/o para clasificar la enfermedad o afeccion en una categorla fenotlpica o en cualquier categorla que tenga significado con respecto al pronostico de o probablemente respuesta al tratamiento (bien al tratamiento en general o a cualquier tratamiento en particular) de la enfermedad o afeccion. De manera similar, diagnosis se refiere a proporcionar cualquier tipo de informacion de diagnostico, incluyendo, pero sin limitacion, si es probable que un sujeto tenga una afeccion (tal como un tumor), informacion relacionada con la naturaleza o clasificacion de un tumor, como por ejemplo un tumor de alto riesgo o un tumor de bajo riesgo, informacion relacionada con el pronostico y/o informacion util para seleccionar un tratamiento apropiado. La selection del tratamiento puede incluir la election de un agente quimioterapeutico particular u otra modalidad de tratamiento tal como cirugla o radiation o una eleccion sobre si suministrar terapia o retirarla.

De la forma en la que se usa en el presente documento, las expresiones “proporcionar un pronostico”, “informacion de pronostico” o “informacion predictiva” se refieren a proporcionar informacion en lo que se refiere al impacto de la presencia de cancer (por ejemplo, como se determina mediante los metodos de diagnostico de la presente divulgacion) en la salud futura del sujeto (por ejemplo, morbilidad o mortalidad previstas, la probabilidad de tener cancer, y el riesgo de metastasis).

De la forma en la que se usa en el presente documento, la expresion “tejido tumoral postquirurgico” se refiere a tejido canceroso (por ejemplo, tejido de biopsia) que se le ha extirpado a un sujeto (por ejemplo, durante cirugla).

De la forma en la que se usa en el presente documento, la expresion “sujeto al que se le diagnostica un cancer” se refiere a un sujeto analizado y en el que ha encontrado que tiene celulas cancerosas. El cancer puede diagnosticarse utilizando cualquier metodo adecuado, incluyendo pero sin limitacion, biopsia, rayos x, analisis de sangre y los metodos de diagnostico de la presente divulgacion.

De la forma en la que se usa en el presente documento, las expresiones “tejido de biopsia”, “muestra de un paciente”, “muestra de tumor” y “muestra de cancer” se refiere a una muestra de celulas, tejidos o fluidos que se extrae de un sujeto con la finalidad de determinar si la muestra contiene tejido canceroso, incluyendo celulas madre cancerosas o de determinar el perfil de expresion genica de ese tejido canceroso. En algunas realizaciones, el tejido de biopsia o fluido se obtiene ante la sospecha que el sujeto tiene cancer. El tejido de biopsia o fluido se examina despues para detectar la presencia o ausencia de cancer, de celulas madre cancerosas y/o detectar la expresion de la firma genica de celulas madre cancerosas.

De la forma en la que se usa en el presente documento, la expresion “sistema de transferencia de genes” se refiere a cualquier medio para transferir una composition que comprenda una secuencia de acidos nucleicos a una celula o a un tejido. Por ejemplo, los sistemas de transferencia de genes incluyen, pero sin limitacion, vectores (por ejemplo, sistemas de transferencia retrovirales, adenovirales, virus adenoasociados y otros basados en acidos nucleicos), microinyeccion de acido nucleico desnudo, sistemas de transferencia basados en pollmeros (por ejemplo, sistemas basados en partlculas metalicas y en liposomas), inyeccion biollstica y similares. De la forma en la que se usa en el presente documento, la expresion “sistema de transferencia genica viral” se refiere a sistemas de transferencia genica que comprenden elementos virales (por ejemplo, virus intactos, virus modificados y componentes virales tales como acidos nucleico o protelnas) para facilitar la transferencia de la muestra a una celula o a un tejido que se desee. De la forma en la que se usa en el presente documento, la expresion “sistema de transferencia genica adenoviral” se refiere a sistemas de transferencia genica que comprenden virus intactos o alterados que pertenecen a la familia Adenoviridae.

De la forma en la que se usa en el presente documento, la expresion “secuencias diana de recombination especlfica de sitio” se refiere a secuencias de acidos nucleicos que proporcionan secuencias de reconocimiento para los factores de recombinacion y el lugar donde se produce la recombinacion.

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De la forma en la que se usa en el presente documento, la expresion “molecula de acido nucleico” se refiere a cualquier molecula que contenga acido nucleico, incluyendo, pero sin limitacion, ADN o ARN. La expresion abarca secuencias que incluyen cualquiera de los analogos de base conocidos de ADN y ARN tales como, pero sin limitacion, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aciridinil-citosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboxi-metilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-iso-penteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetil-guanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiamino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonil-metiluracilo, 5- metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, metilester del acido uracil- 5-oxiacetico, acido uracil-5-oxiacetico, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2- tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2- tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metilester del acido N-uracil-5-oxiacetico, acido uracil-5-oxiacetico, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6- diaminopurina.

El termino “gen” se refiere a una secuencia de acidos nucleicos (por ejemplo, ADN) que comprende secuencias codificantes necesarias para la production de un polipeptido, precursor, o ARN (por ejemplo, ARNr, ARNt). El polipeptido puede codificarse por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier parte de la secuencia codificante, siempre que conserve la actividad o las propiedades funcionales (por ejemplo, actividad enzimatica, union a ligando, transduction de senal, inmunogenicidad, etc.) deseadas de la longitud completa o fragmento. El termino tambien incluye la region codificante de un gen estructural y las secuencias localizadas adyacentes a la region codificante en ambos extremos 5' y 3' para una distancia de al menos 1 kb o mas en cualquier extremo, de tal manera que el gen se corresponde con la longitud del ARNm de longitud completa. Las secuencias localizadas en position 5' de la region codificante y presentes en el ARNm se denominan secuencias 5' no traducidas. Las secuencias localizadas en posicion 3' o cadena abajo de la region codificante y presentes en el ARNm se denominan secuencias 3' no traducidas. El termino “gen” incluye formas tanto genomicas como de ADNc de un gen. Una forma genomica o clon de un gen contiene la region codificante interrumpida con secuencias no codificantes denominadas “intrones” o “regiones intervinientes” o “secuencias intervinientes”. Los intrones son segmentos de un gen que se transcribe en ARN nuclear (ARNnh); los intrones pueden contener elementos reguladores tales como potenciadores. Los intrones se retiran o se “cortan y empalman” del transcrito nuclear o primario; por lo tanto los intrones no estan presentes en el ARN mensajero (ARNm). El ARNm actua durante la traduction para especificar la secuencia u ordenar los aminoacidos en un polipeptido incipiente.

De la forma en la que se usa en el presente documento, la expresion “gen heterologo” se refiere a un gen que no esta en su entorno natural. Por ejemplo, un gen heterologo incluye un gen de una especie introducido en otra especie. Un gen heterologo tambien incluye un gen nativo para un organismo que se ha alterado de alguna manera (por ejemplo, mutado, anadido en copias multiples, ligado a secuencias reguladoras no nativas, etc.). Los genes heterologos se diferencian de los genes endogenos en que las secuencias genicas heterologas generalmente se unen a secuencias de ADN que no se encuentran naturalmente asociadas con las secuencias genicas en el cromosoma o que estan asociadas con partes del cromosoma con las que no se encuentran en la naturaleza (por ejemplo, genes expresados en loci en los que el gen no se expresa normalmente).

De la forma en la que se usa en el presente documento, la frase “expresion genica” se refiere al proceso de convertir en ARN (por ejemplo, ARNm, ARNr, ARNt o ARNsn) la information genetica codificada en un gen, a traves de la “transcription” del gen (por ejemplo, mediante la action enzimatica de una ARN polimerasa), y para genes que codifican protelnas, en protelnas a traves de la “traduccion” de ARNm. La expresion genica puede regularse a diversas fases en el proceso. Una “regulation positiva” o “activation” se refiere a la regulation que aumenta la produccion de los productos de expresion genica (por ejemplo, ARN o protelna), mientras que una “regulacion negativa” o “represion” se refieren a regulacion que disminuye la produccion. Las moleculas (por ejemplo, factores de transcripcion) que intervienen en la regulacion positiva o negativa con frecuencia se denominan “activadores” y “represores”, respectivamente.

Ademas de contener intrones, las formas genomicas de un gen tambien pueden incluir secuencias localizadas tanto en el extremo 5' como en el 3' de las secuencias que estan presentes en el transcrito de ARN. Estas secuencias se denominan secuencias o regiones “flanqueantes” (estas secuencias flanqueantes se localizan en posicion 5' o 3' de las secuencias no traducidas presentes en el transcrito de ARNm). La region flanqueante 5' puede contener secuencias reguladoras tales como promotores y potenciadores que controlan la transcripcion del gen o ejercen influencia sobre la misma. La region flanqueante 3' puede contener secuencias que dirijan la termination de la transcripcion, la escision postranscripcional y la poliadenilacion.

La expresion “ARNip” se refiera a ARN de interferencia corto. En algunas realizaciones, los ARNip comprenden un duplex, o una region bicatenaria, de aproximadamente 18-25 nucleotidos de longitud, con frecuencia los ARNip contienen de aproximadamente dos a cuatro nucleotidos no emparejados en el extremo 3' de cada cadena. Al menos una cadena del duplex o region bicatenaria de un ARNip es sustancialmente homologa a o sustancialmente complementaria a una molecula de ARN diana. La cadena complementaria con una molecula de ARN diana es la “cadena antisentido”, la cadena homologa a la molecula de ARN diana es la “cadena en sentido”, y tambien es complementaria a la cadena antisentido del ARNip. Los ARNip tambien pueden contener secuencias adicionales; como ejemplos no limitantes de dichas secuencias se incluyen secuencias de union, o bucles, as! como estructuras

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en tallo y otras estructuras plegadas. Los ARNip parecen actuar como productos intermedios clave en el desencadenamiento de la interferencia del ARN en invertebrados y en vertebrados, y en el desencadenamiento de la degradacion de ARN especlfica de secuencia durante el silenciamiento genico postranscripcional en plantas.

La expresion “interferencia de ARN” o “ARNi” se refiere al silenciamiento o disminucion de la expresion genica mediante los ARNip. Se trata del proceso de silenciamiento genico postranscripcional, especlfico de secuencia, en animales y plantas, iniciado por el ARNip que es homologo en su region duplex a la secuencia del gen silenciado. El gen puede ser endogeno o exogeno para el organismo, presente integrado en un cromosoma o presente en un vector de transfeccion que no esta integrado en el genoma. La expresion del gen se inhibe bien completamente o parcialmente. Tambien puede considerarse que el ARNi inhibe la funcion de un ARN diana; la funcion del ARN diana puede ser completa o parcial.

De la forma en la que se usa en el presente documento, las expresiones “molecula de acido nucleico codificante”, “secuencia de ADN codificante” y “ADN codificante” se refieren al orden o secuencia de desoxirribonucleotidos a lo largo de una cadena de acido desoxirribonucleico. El orden de estos desoxirribonucleicos determina el orden de aminoacidos a lo largo de la cadena polipeptldica (protelna). Por tanto la secuencia de ADN codifica la secuencia de aminoacidos.

De la forma en la que se usa en el presente documento, las expresiones “un oligonucleotido que tiene una secuencia de nucleotidos que codifica un gen” y “un polinucleotido que tiene una secuencia de nucleotidos que codifica a un gen”, significa una secuencia de acidos nucleicos que comprende la region codificante de un gen o, en otras palabras, la secuencia de acidos nucleicos que codifica un producto genico. La region codificante puede estar presente en forma de ADNc, ADN genomico, ADN o ARNc. Cuando esta presente en forma de ADN, el oligonucleotido o polinucleotido puede ser mono- (es decir, LA cadena en sentido) o bicatenario. Los elementos de control adecuados, tales como potenciadores/promotores, uniones de corte y empalme, senales de poliadenilacion, etc. pueden colocarse en estrecha proximidad a la region codificante del gen si se requiere para permitir el inicio adecuado de la transcripcion y/o el procesamiento correcto del transcrito de ARN primario. Como alternativa, la region codificante utilizada en los vectores de expresion de la presente divulgacion puede contener potenciadores/promotores endogenos, uniones de corte y empalme, secuencias intervinientes, senales de poliadenilacion, etc. o una combinacion de elementos de control, tanto endogenos como exogenos.

De la forma en la que se usa en el presente documento el termino “parte”, cuando si indica en referencia a una secuencia de nucleotidos (como en “una parte de una secuencia de nucleotidos determinada”) se refiere a fragmentos de esa secuencia. El tamano de los fragmentos puede variar de cuatro nucleotidos a toda la secuencia de nucleotidos menos un nucleotido (10 nucleotidos, 20, 30, 40, 50, 100, 200, etc.).

Las frases “se hibrida”, “se hibrida selectivamente” o “se hibrida especlficamente” se refiere a la union o a la formacion de duplex de una molecula unicamente con una secuencia de nucleotidos particular en condiciones de hibridacion rigurosas cuando esa secuencia esta presente en una mezcla compleja (por ejemplo, una biblioteca de moleculas de ADN o ARN). Vease, por ejemplo, Andersen (1998) Nucleic Acid Hybridization Springer-Verlag; Ross (ed. 1997) Nucleic Acid Hybridization Wiley.

La frase “condiciones de hibridacion rigurosas” se refiere a condiciones en las que una sonda se hibridara con su secuencia diana, normalmente en una mezcla compleja de acido nucleico, pero no con otras secuencias. Las condiciones rigurosas son dependientes de secuencia y seran diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias mas largas se hibridan especlficamente a temperaturas mas altas. Una amplia orientacion con respecto a la hibridacion de acidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993). Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5-10 °C menores que el punto de fusion termico (Tf) para la secuencia especlfica a una fuerza ionica definida. La Tf es la temperatura (bajo una fuerza ionica, un pH y una concentracion de acido nucleico definidas) a la cual el 50 % de las sondas complementarias con la diana, se hibridan con la secuencia diana en el equilibrio (dado que las secuencias diana estan presentes en exceso, a la Tf, el 50 % de las sondas estan ocupadas en el equilibrio). Las condiciones rigurosas seran aquellas en las que la concentracion salina de iones de sodio sea menor de aproximadamente 1,0 M, normalmente una concentracion de iones de sodio (u otras sales) de aproximadamente 0,01 a 1,0 M a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura sea de al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleotidos) y de al menos de aproximadamente 60 °C, para sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleotidos). Tambien pueden obtenerse condiciones rigurosas con la adicion de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para una hibridacion de alta rigurosidad, una senal positiva es de al menos dos veces el fondo, o diez veces la hibridacion del fondo. Como ejemplos de condiciones de hibridacion rigurosas o de alta rigurosidad se incluyen: formamida al 50 %, 5x SSC, y SdS al 1 % incubado a 42 °C o 5x SSC a SDS al 1 % incubado a 65 °C, con un lavado en 0,2x SSC y SDS al 0,1 % a 65 °C. Para la PCR, es tlpica una temperatura de aproximadamente 36 °C para una amplificacion de baja rigurosidad, aunque las temperaturas de hibridacion pueden variar de aproximadamente 72 °C a aproximadamente 48 °C dependiendo de la longitud del cebador. Para una amplificacion de PCR a alta rigurosidad, es tlpica una temperatura de aproximadamente 62 °C, aunque las temperaturas de hibridacion de alta rigurosidad pueden variar de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 65 °C, dependiendo de

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la longitud y de la especificidad del cebador. Las condiciones de ciclo tlpicas para amplificaciones de rigurosidad tanto baja como alta incluyen una fase de desnaturalizacion de aproximadamente 90 °C a 95 °C durante 30-120 segundos, una fase de hibridacion que dura 30-120 segundos y una fase de extension de aproximadamente 72 °C durante 1-2 minutos.

Las expresiones “en combinacion operativa”, “en orden operativo” y “unido operativamente”, de la forma en la que se usa en el presente documento, se refieren a la union de secuencias de acidos nucleicos de tal manera que se produzca una molecula de acido nucleico que pueda dirigir la traduccion de un gen determinado y/o la slntesis de una molecula proteica deseada. Las expresiones tambien se refieren a la union de secuencias de aminoacidos de tal manera que se produzca una protelna funcional.

Cuando el termino “aislado” se usa en relacion a un acido nucleico, como en “un oligonucleotido aislado” o “polinucleotido aislado”, se refiere a una secuencia de acidos nucleicos que esta identificada y separada de al menos un componente o contaminante con el cual esta normalmente asociada en su fuente natural. El acido nucleico aislado esta por tanto presente en una forma o configuracion que es diferente de la que se encuentra en la naturaleza. Por el contrario, los acidos nucleicos no aislados, tales como acidos nucleicos de ADN y ARN se encuentran en el estado en el que existen en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de ADN determinada (por ejemplo, un gen) se encuentra en el cromosoma de la celula hospedadora cerca de genes adyacentes; las secuencias de ARN, tales como una secuencia de ARNm especlfica que codifica una protelna especlfica, se encuentra en la celula como una mezcla con numerosos otros ARNm que codifican una multitud de protelnas. Sin embargo, el acido nucleico aislado que codifica una protelna determinada incluye, a modo de ejemplo, dicho acido nucleico en celulas que normalmente expresan la protelna determinada en la que el acido nucleico esta en una localization cromosomica diferente de la de las celulas naturales, o de otra manera flanqueado por una secuencia de acidos nucleicos diferente de la encontrada en la naturaleza. El acido nucleico, oligonucleotido o polinucleotido aislado puede estar presente en forma mono o bicatenaria. Cuando un acido nucleico, oligonucleotido o polinucleotido aislado se utiliza para expresar una protelna, el oligonucleotido o polinucleotido contendra como mlnimo la cadena en sentido o codificante (es decir, el oligonucleotido o polinucleotido puede ser monocatenario), pero puede contener tanto la cadena en sentido como la antisentido (es decir, el oligonucleotido o polinucleotido puede ser bicatenario).

De manera similar, en determinadas realizaciones, cuando el termino “aislado” se usa en relacion a un polipeptido, como en “un polipeptido aislado” o “un anticuerpo aislado”, se refiere a un polipeptido (o anticuerpo) que esta separado de al menos un componente o contaminante con el cual esta normalmente asociado en su fuente natural. Los anticuerpos aislados u otros polipeptidos aislados estan por tanto presentes en una forma o configuracion que es diferente de esa en la se encuentra en la naturaleza. En determinadas realizaciones, un polipeptido aislado (por ejemplo, un anticuerpo) es sustancialmente puro.

De la forma en la que se usa en el presente documento, “sustancialmente puro” se refiere a material que tiene una pureza (es decir, esta libre de contaminantes) de al menos 50 %, preferentemente tiene una pureza de al menos 90 %, mas preferentemente tiene una pureza de al menos 95 %, aun mas preferentemente tiene una pureza de al menos 98 %, o mas preferentemente tiene una pureza de al menos 99 %.

Una “secuencia de aminoacidos” y terminos tales como “polipeptido”, “protelna” o “peptido” no significan limitar la secuencia de aminoacidos a la secuencia de aminoacidos completa, nativa, asociada con la molecula de protelna indicada.

La expresion “protelna nativa” se usa en el presente documento para indicar que una protelna no contiene restos de aminoacidos codificados por secuencias vectoriales; es decir, la secuencia nativa contiene solamente aquellos aminoacidos encontrados en la protelna como se producen en la naturaleza. Una protelna nativa puede producirse de manera recombinante o puede aislarse de una fuente de origen natural.

De la forma en la que se usa en el presente documento, el termino “parte” cuando se indica en referencia a una protelna (como en “una parte de una protelna determinada”) se refiere a fragmentos de esa protelna. El tamano de los fragmentos puede variar de cuatro restos de aminoacido a la secuencia de aminoacidos completa menos un aminoacido.

La expresion “transferencia de Southern”, se refiere al analisis de ADN en geles de agarosa o acrilamida para fraccionar el ADN de acuerdo con el tamano, seguido de la transferencia del ADN del gel a un soporte solido, tal como una membrana de nitrocelulosa o de nylon. Despues, el ADN inmovilizado se criba con una sonda marcada para detectar especies de ADN complementarias a la sonda usada. El ADN puede escindirse con enzimas de restriction antes de realizar la electroforesis. Despues de la electroforesis, el ADN puede despurinizarse parcialmente y desnaturalizarse antes o durante la transferencia al soporte solido. Las transferencias de Southern son herramientas estandar que utilizan los biologos en biologla molecular (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, paginas 9.31-9.58 [1989]).

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La expresion “transferencia de Northern”, de la forma en la que se usa en el presente documento, se refiere al analisis de ARN por electroforesis de ARN en geles de agarosa para fraccionar el ARN de acuerdo con el tamano seguido por la transferencia del ARN del gel a un soporte solido, tal como una membrana de nitrocelulosa o de nylon. Despues, el ARN inmovilizado se criba con una sonda marcada para detectar especies de ARN complementarias a la sonda usada. Las transferencias de Northern son herramientas estandar que utilizan los biologos en biologla molecular (J. Sambrook, et al., citado anteriormente, pags. 7.39-7.52 [1989]).

El termino “transferencia de Western” se refiere al analisis de una o mas protelnas (o polipeptidos) inmovilizados sobre un soporte tal como una membrana de nitrocelulosa. Las protelnas se procesan en geles de acrilamida para separar las protelnas, seguido de la transferencia de la protelna del gel a un soporte solido, tal como una membrana de nitrocelulosa o de nylon. Despues, las protelnas inmunizadas se exponen a anticuerpos con reactividad contra un antlgeno de interes. La union de los anticuerpos puede detectarse mediante diversos metodos, entre los que se incluye el uso de anticuerpo radiomarcados.

El termino “transgen” de la forma en la que se usa en el presente documento, se refiere a un gen exogeno que se coloca en un organismo, por ejemplo, mediante la introduccion del gen exogeno en huevos recien fertilizados o embriones tempranos. La expresion “gen exogeno” se refiere a cualquier acido nucleico (por ejemplo, secuencia genica) que se introduce en el genoma de un animal mediante manipulaciones experimentales y puede incluir secuencias genicas encontradas en ese animal siempre que el gen introducido no resida en el mismo lugar en el cual reside el gen de origen natural.

De la forma en la que se usa en el presente documento, el termino “vector” se usa en referencia a moleculas de acido nucleico que transfieren uno o mas segmentos de ADN de una celula a otra. El termino “vehlculo” se utiliza algunas veces indistintamente con el de “vector”. A menudo los vectores proceden de plasmidos, bacteriofagos o de virus de plantas o animales.

La frase “vector de expresion” de la forma en la que se usa en el presente documento se refiere a una molecula de ADN recombinante que contiene una secuencia codificante deseada y secuencias de acidos nucleicos apropiadas necesarias para la expresion de la secuencia codificante unida operativamente en un organismo hospedador particular. Las secuencias de acidos nucleicos necesarias para la expresion en procariotas normalmente incluyen un promotor, un operador (opcional) y un sitio de union a ribosoma, con frecuencia junto con otras secuencias. Se sabe que las secuencias eucariotas utilizan promotores, potenciadores y senales de terminacion y de poliadenilacion.

De la forma en la que se usa en el presente documento la expresion “in vitro" se refiere a un entorno artificial y a procesos o reacciones que se producen dentro de un entorno artificial. Los entornos in vitro pueden consistir, pero sin limitacion, en tubos de ensayo y cultivos celulares. La expresion “in vivo" se refiere al entorno natural (por ejemplo, un animal o una celula) y a procesos o reacciones que se producen dentro de un entorno natural.

Las expresiones “compuesto de ensayo” y “compuesto candidato” se refieren a cualquier entidad qulmica, farmaceutica, farmaco y similar que sea un candidato para su uso en el tratamiento o en la prevencion de una enfermedad, dolencia, indisposicion o trastorno de la funcion corporal (por ejemplo cancer). Los compuestos de ensayo comprenden compuestos terapeuticos tanto potenciales como conocidos. Se puede determinar que un compuesto de ensayo es terapeutico mediante cribado utilizando los metodos de cribado de la presente divulgacion. En algunas realizaciones de la presente divulgacion, los compuestos de ensayo incluyen compuestos antisentido.

De la forma en la que se usa en el presente documento, el termino “muestra” se usa en su sentido mas amplio. En un sentido, significa que incluye un especimen o un cultivo obtenido de cualquier fuente, as! como de muestras biologicas y ambientales. Las muestras biologicas pueden obtenerse de animales (incluyendo seres humanos) e incluir fluidos, solidos, tejidos y gases. Las muestras biologicas incluyen productos sangulneos, tales como plasma, suero y similares. Las muestras ambientales incluyen material ambiental tal como materia de superficie, suelo, agua, cristales y muestras industriales. Sin embargo, dichos ejemplos no deben considerarse como limitantes de los tipos de muestras que pueden aplicarse a la presente divulgacion.

Por “union especlfica” o “union unica” se entiende cuando un agente se une solamente a un ligando, receptor o antlgeno particular. Por “union selectiva” se entiende cuando un agente se une preferentemente a un ligando, receptor o antlgeno sobre otros con una magnitud de aproximadamente dos veces o mayor, de aproximadamente cinco veces o mayor, de aproximadamente ocho veces o mayor o de aproximadamente diez veces o mayor.

De la forma en la que se usa en el presente documento, “aproximadamente” se refiere a mas o menos un 1 % del numero indicado. Por ejemplo, “aproximadamente 10 %” indica un intervalo del 9 % al 11 %.

Se dice que dos secuencias de polinucleotidos o de polipeptidos son “identicas” o tienen “identidad” si la secuencia de nucleotidos o de aminoacidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para obtener una correspondencia maxima como se describe mas adelante. La comparacion entre dos secuencias generalmente se realiza comparando las secuencias sobre una ventana de comparacion para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia.

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En algunas realizaciones, el “porcentaje de identidad” se determina comparando dos secuencias optimamente alineadas sobre una ventana de comparacion de al menos 20 posiciones, en la que la parte de la secuencia de polinucleotidos o polipeptidos en la ventana de comparacion puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) de un 20 por ciento o menor, normalmente de un 5 a un 10 por ciento o de un 10 a un 12 por ciento, en comparacion con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones o deleciones) para el alineamiento optimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el numero de posiciones en las que se producen bases de aminoacidos identicas o restos de aminoacidos identicos en ambas secuencias, para obtener el numero de posiciones coincidentes, dividiendo el numero de posiciones coincidentes entre el numero total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamano de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. En algunas realizaciones, la ventana de comparacion puede ser mas pequena (por ejemplo, de 7 o 10 aminoacidos).

El alineamiento optimo de secuencias para realizar la comparacion puede realizarse con el programa Megalign del juego de programacion bioinformatica de Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, Wis.), utilizando parametros determinados. Como alternativa, el % de identidad (de aminoacidos) puede obtenerse utilizando uno de los programas BLAST o BLAST-2 disponibles al publico. El programa informatico WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). El porcentaje de identidad de secuencia (de aminoacidos) tambien puede determinarse utilizando el programa de comparacion de secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). El programa BLAST se basa en el metodo de alineamiento de Karlin y Altschul. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268 (1990) y se comenta en Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877 (1993); y Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997).

En determinadas realizaciones, terminos tales como “tratamiento” o “tratando” o “tratar” se refieren tanto a 1) mediciones terapeuticas que curan, reducen, aminoran los slntomas de, y/o detienen la progresion de, una afeccion patologica diagnosticada o un trastorno diagnosticado y 2) mediciones profilacticas o preventivas que impiden o retrasan el desarrollo de una afeccion patologica diagnosticada o de un trastorno diagnosticado. Por tanto, las personas que necesitan tratamiento son personas que ya tienen el trastorno; que son propensas a tener el trastorno; las que pueden haber tenido el trastorno y en las que el trastorno puede recurrir; y aquellas personas en las que se previene el trastorno. En determinadas realizaciones, un sujeto se “trata” satisfactoriamente si el paciente muestra uno o mas de lo siguiente: una reduccion del numero de o ausencia completa de celulas cancerosas; una reduccion del tamano del tumor; inhibicion de o una ausencia de infiltracion de celulas cancerosas en organos perifericos incluyendo la propagacion del cancer a tejidos blandos y huesos; inhibicion de o ausencia de metastasis tumoral; inhibicion o ausencia de crecimiento tumoral; alivio de uno o mas slntomas asociados con el cancer especlfico; morbilidad y/o mortalidad reducidas; mejora de la calidad de vida; una reduccion en el numero de o ausencia completa de celulas madre cancerosas; una disminucion en la proporcion de celulas madre cancerosas en un tumor solido (con respecto a celulas en el tumor que no son celulas madre cancerosas); inhibir la proliferacion de celulas madre cancerosas y un retraso en o una ausencia de recidiva.

En determinadas realizaciones, la expresion “cantidad terapeuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un anticuerpo, polipeptido, polinucleotido, molecula organica pequena u otro farmaco eficaz para “tratar” una enfermedad o un trastorno en un sujeto. En el caso de cancer, la cantidad terapeuticamente eficaz del farmaco puede, en determinadas realizaciones, reducir el numero de celulas cancerosas; reducir el numero de celulas madre cancerosas; reducir la proporcion de celulas madre cancerosas en un tumor solido (con respecto a celulas tumorales que no son celulas madre cancerosas); reducir el tamano del tumor; inhibir o detener la infiltracion de celulas cancerosas en organos perifericos; inhibir y/o detener la metastasis tumoral; inhibir y detener el crecimiento tumoral; aliviar hasta cierto punto uno o mas de los slntomas asociados con el cancer; inhibir la proliferacion de celulas madre cancerosas; o ser el resultado de una combinacion de dichos efectos sobre las celula cancerosas.

Las expresiones “inhibir” e “inhibicion” se usan indistintamente en el presente documento con “alterar” y “alteracion”.

Marcadores de cancer de celulas madre de tumor solido

La presente divulgacion proporciona marcadores cuya expresion esta diferencialmente expresada en celulas madre de cancer de colon en comparacion con celulas tumorales de colon no fraccionadas o celulas tumorales de colon no- ESA+44+. Dichos marcadores encuentran uso en el diagnostico y el tratamiento (por ejemplo, direccionamiento terapeutico) de diversos canceres, entre ellos cancer de mama y de colon. En determinadas realizaciones, el marcador de celulas madre de tumor solido es LGR5.

En algunas realizaciones, la presente divulgacion proporciona metodos para la deteccion de la expresion de marcadores de cancer de celulas madre (por ejemplo, marcadores de cancer de celulas madre de cancer de mama). En algunas realizaciones, la expresion se mide directamente (por ejemplo a nivel de ARN o protelna). En algunas realizaciones, la expresion se detecta en muestras tisulares (por ejemplo, tejido de biopsia). En otras realizaciones, la expresion se detecta en fluidos corporales (por ejemplo, incluyendo, pero sin limitacion, plasma, suero, sangre entera, moco y orina). La presente divulgacion proporciona adicionalmente paneles y kits para la deteccion de

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marcadores. En algunas realizaciones, la presencia de un marcador de cancer de celulas madre se usa para proporcionar un pronostico en un sujeto. La informacion proporcionada tambien se usa para dirigir el ciclo del tratamiento. Por ejemplo, si se encuentra que un sujeto tiene un marcador indicativo de una celula madre de tumor solido, pueden comenzarse terapias adicionales (por ejemplo, terapia hormonal o radioterapia) en un punto inicial cuando probablemente es mas eficaz (por ejemplo, antes de la metastasis). Ademas, si se encuentra que un sujeto tiene un tumor que no responde a la terapia hormonal, el gasto y la inconveniencia de dicha terapia pueden evitarse.

La presente divulgacion no se limita a los marcadores descritos anteriormente. Puede utilizarse cualquier marcador adecuado que se correlacione con cancer o con la progresion de cancer. Tambien se contemplan marcadores adicionales dentro del ambito de la presente divulgacion. Puede utilizarse cualquier metodo adecuado para identificar y caracterizar marcadores de cancer adecuados para su uso en los metodos de la presente divulgacion, entre los que se incluyen, pero sin limitacion, los descritos en el ejemplo 1 ilustrativo mas adelante. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los marcadores identificados como que se regulan positiva o negativamente en celulas madre de tumor solido que utilizan los metodos de micromatriz de expresion genica de la presente divulgacion se caracterizan adicionalmente utilizando micromatriz de tejidos, inmunohistoqulmica, analisis de transferencia de Northern, inhibicion de ARNip o ARN antisentido, analisis de mutacion, investigacion de la expresion con resultados cllnicos, as! como otros metodos desvelados en el presente documento.

En algunas realizaciones, la presente divulgacion proporciona un panel para el analisis de una pluralidad de marcadores. El panel permite el analisis simultaneo de marcadores multiples que se correlacionan con carcinogenesis y/o metastasis. Dependiendo del sujeto, pueden analizarse paneles solos o en combinacion para proporcionar el mejor diagnostico y pronostico posible. Para su inclusion en un panel los marcadores se seleccionan cribando su valor predictivo utilizando cualquier metodo adecuado, incluyendo, pero sin limitacion, los metodos descritos mas adelante en los ejemplos ilustrativos.

1. Deteccion de ARN

En algunas realizaciones, la deteccion de marcadores de cancer de celulas madre de tumor solido se efectua midiendo la expresion del ARNm correspondiente en una muestra tisular (por ejemplo, tejido de cancer de mama). La expresion de ARNm puede medirse mediante cualquier metodo adecuado, incluyendo pero sin limitacion, los metodos desvelados mas adelante.

En algunas realizaciones, el ARN se detecta mediante analisis de transferencia de Northern. El analisis de transferencia de Northern implica la separation de ARN y la hibridacion de una sonda complementaria marcada.

En otras realizaciones mas, el ARN (o ADNc correspondiente) se detecta por hibridacion con una sonda oligonucleotldica. Se dispone de varios ensayos de hibridacion que utilizan diversas tecnologlas para la hibridacion y deteccion. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se utiliza el ensayo TaqMan (PE Biosystems, Foster City, CA; Veanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos 5.962.233 y 5.538.848). El ensayo se realiza durante una reaction PCR. El ensayo TaqMan aprovecha la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa de AMPLITAQ GOLD. En la reaccion PCR se incluye una sonda que consiste en un oligonucleotido con un colorante indicador en la position 5' (por ejemplo un colorante fluorescente) y un colorante desactivador en la position 3'. Durante la PCR, si la sonda esta unida a su diana, la actividad nucleolltica 5'-3' de la polimerasa AMPLlTAQ GOLD escinde la sonda entre el colorante indicador y el desactivador. La separacion del colorante indicador del colorante desactivador produce un aumento de fluorescencia. La senal se acumula con cada ciclo de PCR y puede monitorizarse con un fluorlmetro.

En otras realizaciones mas, se usa la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) para detectar la expresion de ARN. En la RT-PCR, el ARN se convierte enzimaticamente en ADN complementario o “ADNc” utilizando una enzima transcriptasa inversa. Despues, el ADNc se utiliza como un molde para una reaccion PCR. Los productos de la PCR pueden detectarse mediante cualquier metodo adecuado, incluyendo pero sin limitacion, electroforesis en gel y tincion con un tinte especlfico de ADN o hibridacion con una sonda marcada. En algunas realizaciones, se utiliza la PCR cuantitativa con transcriptasa inversa con el metodo de mezclas estandarizadas de moldes competitivos descrito en las Patentes de Estados Unidos 5.639.606, 5.643.765 y 5.876.978.

2. Deteccion de protelnas

En otras realizaciones, la expresion genica de marcadores de cancer de celulas madre, tal como LGR5, se detecta midiendo la expresion de la protelna o del polipeptido correspondiente. La expresion de la protelna puede detectarse mediante cualquier metodo adecuado. En algunas realizaciones, las protelnas se detectan por inmunohistoqulmica. En otras realizaciones, las protelnas se detectan mediante su union a un anticuerpo suscitado contra la protelna. La generation de anticuerpos se describe mas adelante.

La union de anticuerpos se detecta mediante tecnicas conocidas en la materia (por ejemplo, radioinmunoensayo, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo “sandwich”, ensayos inmunorradiometricos, reacciones de precipitation con difusion en gel, ensayos de inmunodifusion, inmunoensayos

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in situ (por ejemplo, utilizando oro coloidal, marcadores enzimaticos o radioisotopos, por ejemplo), transferencias de Western, reacciones de precipitacion, ensayos de aglutinacion (por ejemplo, ensayos de aglutinacion en gel, ensayos de hemaglutinacion, etc.), ensayos de fijacion al complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos con protelna A, y ensayos de inmunoelectroforesis, etc.

En una realizacion, la union del anticuerpo se detecta detectando un marcador en el anticuerpo primario. En otra realizacion, el anticuerpo primario se detecta detectando la union de un anticuerpo secundario o reactivo con el anticuerpo primario. En una realizacion adicional, el anticuerpo secundario esta marcado. Se conocen muchos metodos en la tecnica para detectar la union en un inmunoensayo y se encuentran dentro del ambito de la presente divulgacion.

En algunas realizaciones, se utiliza un ensayo de deteccion automatico. Los metodos para la automatizacion de inmunoensayos incluyen los descritos en las Patentes de Estados Unidos 5.885.530, 4.981.785, 6.159.750 y 5.358.691. En algunas realizaciones, los analisis y presentacion de resultados tambien son automaticos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se utiliza un programa informatico que genera un pronostico basandose en la presencia o en la ausencia de una serie de protelnas correspondientes a marcadores de cancer.

En otras realizaciones, se utiliza el inmunoensayo descrito en las Patentes de Estados Unidos 5.599.677 y 5.672.480.

3. Tecnologla de micromatrices de ADNc

Las micromatrices de ADNc consisten en ADNc multiples (normalmente miles de ellos) diferentes aplicados puntualmente (normalmente utilizando un dispositivo robotico de aplicacion puntual) sobre lugares conocidos en un soporte solido, tal como un portaobjetos de vidrio de microscopio. Los ADNc se obtienen normalmente por amplificacion mediante PCR de insertos de bibliotecas de plasmidos utilizando cebadores complementarios con la parte estructural del vector del plasmido o con el propio gen para genes en los que se desconoce la secuencia. Los productos de la PCR adecuados para la production de micromatrices generalmente tienen una longitud entre 0,5 y 2,5 kb. Pueden seleccionarse ADNc de longitud completa, marcadores de secuencia expresada (EST) o los ADNc seleccionados al azar de una biblioteca de interes. Los EST son ADNc parcialmente secuenciados, como se describe, por ejemplo, en Hillier, et al., 1996, 6: 807-828. Aunque algunos de estos EST corresponden a genes conocidos, frecuentemente se dispone de muy poca information, o de ninguna, con respecto a cualquier EST particular, excepto para una pequena cantidad de secuencias 3' y/o 5' y, posiblemente, el tejido de origen del ARNm del cual procede el EST. Como apreciara un experto habitual en la tecnica, en general los ADNc contienen suficiente informacion de secuencia para identificar exclusivamente un gen dentro del genoma humano. Ademas, en general, los ADNc son de suficiente longitud para hibridarse, selectivamente, especlficamente o exclusivamente, con el ADNc obtenido del ARNm procedente de un solo gen en las condiciones de hibridacion del experimento.

En un experimento de micromatriz tlpico, una micromatriz se hibrida con poblaciones de ARN, ADN o ADNc diferencialmente marcadas procedentes de dos muestras diferentes. Mas habitualmente el ARN (bien ARN total o poli A+ ARN) se alsla de celulas o tejidos de interes y se realiza la transcription inversa para producir ADNc. El marcaje se realiza habitualmente durante la transcripcion inversa incorporando un nucleotido marcado en la mezcla de reaction. Aunque pueden utilizarse diversos marcadores, mas habitualmente se conjuga el nucleotido con los colorantes fluorescentes Cy3 o Cy5. Por ejemplo, pueden utilizarse Cy5-dUTP y Cy3-dUTP. El ADNc procedente de una muestra (que representa, por ejemplo, un tipo de celula, un tipo de tejido o una condition de crecimiento particular) se marca con un fluoroforo mientras que el ADNc procedente de una segunda muestra (que representa, por ejemplo un tejido de celula, un tipo de tejido o una condicion de crecimiento diferente) se marca con el segundo fluoroforo. Similares cantidades de material marcado de las dos muestras se cohibridan en la micromatriz. En el caso de un experimento de micromatriz en el que las muestras se marcan con Cy5 (que emite fluorescencia roja) y Cy3 (que emite fluorescencia verde), los datos primarios (obtenidos escaneando la micromatriz utilizando un detector capaz de detectar cuantitativamente la intensidad de fluorescencia) son proporciones de intensidad de fluorescencia (roja/verde, R/V). Estas proporciones representan las concentraciones relativas de las moleculas de ADNc que se hibridan con los ADNc representados en la micromatriz y por tanto reflejan los niveles de expresion relativa del ARNm correspondientes a cada ADNc/gen representado en la micromatriz.

Cada experimento de micromatriz puede proporcionar decenas de miles de puntos de datos, representando cada uno de ellos la expresion relativa de un gen particular en las dos muestras. La organization apropiada y los analisis de los datos es de importancia clave, y se han desarrollado diversos programas informaticos que incorporan herramientas estadlsticas convencionales que facilitan los analisis de los datos. Una base para la organizacion de los datos de expresion genica es reunir grupos genes con patrones de expresion similares entre si. En Eisen et al., 1998, PNAS 95: 14863-14868 se describe un metodo para realizar analisis de grupos jerarquicos y mostrar los datos procedentes de experimentos de micromatriz. Como se describe en el presente documento, la agrupacion puede combinarse con una representation grafica de los datos primarios en los que cada punto de datos se representa con un color que representa de modo cuantitativo y cualitativo el punto del dato. Convirtiendo los datos de una gran tabla de numeros, en un formato visual, este proceso facilita un analisis intuitivo de los datos. Puede encontrarse informacion y detalles adicionales con respecto a las herramientas matematicas y/o a la propia estrategia de

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agrupamiento, por ejemplo, en Sokal y Sneath, Principles of numerical taxonomy, xvi, 359, W. H. Freeman, San Francisco, 1963; Hartigan, Clustering algorithms, xiii, 351, Wiley, Nueva York, 1975; Paull et al., 1989, J. Natl. Cancer Inst. 81: 1088-92; Weinstein et al. 1992, Science 258: 447-51; van Osdol et al., 1994, J. Natl. Cancer Inst. 86: 1853-9; y Weinstein et al., 1997, Science, 275: 343-9.

En los ejemplos se encuentran detalles adicionales de los metodos experimentales usados en la presente divulgacion. En la Patente de Estados Unidos N° 5.807.522 se encuentra informacion adicional que describe los metodos para fabricar y utilizar micromatrices. Para la construccion de componentes informaticos de micromatriz (por ejemplo, robots disenados para la fabricacion de micromatrices y escaneres) utilizando partes disponibles en el comercio, pueden encontrarse instrucciones en la pagina web
http://cmgm.stanford.edu/pbr- own/ y en Cheung et al., 1999, Nat. Genet. Supplement 21: 15-19.

Otros comentarios sobre tecnologla de micromatriz y protocolos para preparar muestras y realizar experimentos de micromatriz se encuentran, por ejemplo, en matrices de ADN para analisis de expresion genica, Methods Enzymol, 303: 179-205, 1999; monitorizacion de expresion basada en fluorescencia utilizandomicromatrices, Methods Enzymol, 306: 3-18, 1999; y M. Schena (ed.), Mictromatrices de ADN: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, RU, 1999. En la pagina web
http://cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/arrayerHTML/ArrayerDocs.html, se encuentran descripciones de como usar un robot disenado para la fabricacion de micromatrices y el programa informatico asociado.

4. Analisis de datos

En algunas realizaciones, se utiliza un programa de analisis basado en ordenador para traducir los datos no procesados generados por el ensayo de deteccion (por ejemplo, la presencia, ausencia o cantidad de uno o mas marcadores determinados) en datos de valor predictivo para un medico. El medico puede acceder a los datos predictivos utilizando cualquier medio adecuado. Por tanto, en algunas realizaciones, la presente divulgacion proporciona el beneficio adicional de que no es necesario que el medico, que probablemente no esta formado en genetica o biologla molecular, entienda los datos no procesados. Los datos se presentan directamente al medico en su forma mas util. El medico despues puede utilizar inmediatamente la informacion para optimizar el cuidado del sujeto.

La presente divulgacion contempla cualquier metodo capaz de recibir, procesar y transmitir la informacion a y desde los laboratorios que realizan los ensayos; proporcionando la informacion datos del personal medico y los sujetos. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la presente divulgacion, se obtiene una muestra (por ejemplo, una biopsia o un suero o una muestra de orina) de un sujeto y se somete a un servicio de perfilado (por ejemplo, un laboratorio cllnico en una instalacion medica, industrias de perfilado genomico etc.), localizado en cualquier parte del mundo (por ejemplo, en un pals diferente al del pals en donde reside el sujeto o donde se utiliza finalmente la informacion) para generar datos sin procesar. Cuando la muestra comprende un tejido u otra muestra biologica, el sujeto puede acudir a un centro medico para que se obtenga la muestra y se envle al centro de perfilado, o los sujetos pueden recoger la muestra ellos mismos y enviarla directamente a un centro de perfilado. Cuando la muestra comprende informacion biologica previamente determinada, el sujeto puede enviar directamente la informacion al servicio de perfilado (por ejemplo, una tarjeta de informacion que contiene la informacion puede escanearse mediante un ordenador y los datos trasmitirse a un ordenador del centro de perfilado utilizando un sistema de comunicacion electronico). Una vez recibido por el servicio de perfilado, la muestra se procesa y se produce un perfil (por ejemplo, datos de expresion) especlfico para la informacion de diagnostico o de pronostico deseada para el sujeto.

Despues se preparan los datos de perfil en un formato adecuado para la interpretacion por el medico tratante. Por ejemplo, en lugar de proporcionar datos de expresion no procesados, el formato preparado puede representar un diagnostico o una evaluation del riesgo para el sujeto, junto con recomendaciones para opciones de tratamiento particulares. Los datos pueden presentarse al medico mediante cualquier metodo adecuado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el servicio de perfilado genera un informe que puede imprimir el medico (por ejemplo, en un centro de atencion) o presentarse al medico en un monitor de ordenador.

En algunas realizaciones, la informacion se analiza primero en el punto de atencion o en una instalacion regional. Despues, los datos no procesados se envlan a una instalacion de procesamiento central para un analisis posterior y/o para convertir los datos no procesados en informacion util para el medico o el paciente. La instalacion de procesamiento central proporciona la ventaja de privacidad (todos los datos se almacenan en una instalacion central con protocolos de seguridad uniformes), velocidad y uniformidad de analisis de los datos. La instalacion de procesamiento central puede controlar despues el destino de los datos despues del tratamiento del sujeto. Por ejemplo, utilizando un sistema de comunicacion electronico, la instalacion central puede proporcionar datos al medico, al sujeto o a los investigadores.

En algunas realizaciones, el sujeto puede acceder directamente a los datos utilizando el sistema de comunicacion electronico. El sujeto puede seleccionar intervention adicional o consejo basandose en los resultados. En algunas realizaciones, los datos se utilizan para el uso en investigation. Por ejemplo, los datos pueden utilizarse para optimizar adicionalmente la inclusion o elimination de marcadores como indicadores utiles de una afeccion o fase de

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enfermedad en particular.

5. Kits

En otras realizaciones adicionales, la presente divulgacion proporciona kits para la deteccion y caracterizacion de canceres, o para modular la actividad de un peptido expresado por uno o mas marcadores de celulas madre cancerosas, tales como LGR5. En algunas realizaciones, los kits contienen anticuerpos especlficos para un marcador de cancer, ademas de reactivos de deteccion y tampones. En otras realizaciones, los kits contienen reactivos especlficos para la deteccion de ARNm o ADNc (por ejemplo, sondas o cebadores oligonucleotldicos). En algunas realizaciones, los kits contienen todos los componentes necesarios y/o suficientes para realizar un ensayo de deteccion, incluyendo todos los controles, direcciones para realizar los ensayos y cualquier programa informatico necesario para el analisis y presentacion de resultados.

Otra realizacion de la presente divulgacion comprende un kit para analizar la presencia de polinucleotidos o protelnas, por ejemplo en una muestra de tejido o en un fluido corporal, de una firma genetica de celula madre de tumor solido, tal como la firma de la alfa catenina. El kit puede comprender, por ejemplo, un anticuerpo para la deteccion de un polipeptido o una sonda para la deteccion de un polinucleotido. Ademas, el kit puede comprender una muestra de referencia o de control; instrucciones para el procesamiento de muestras, la realizacion del ensayo y la interpretacion de los resultados; y tampones y otros reactivos necesarios para realizar el ensayo. En determinadas realizaciones, el kit comprende un panel de anticuerpos para detectar la expresion de una o mas de las protelnas codificadas por los genes de la firma de la alfa-catenina. En otras realizaciones, el kit comprende pares de cebadores para detectar la expresion de uno o mas de los genes de la firma genetica de celulas madre de tumor solido. En otras realizaciones, el kit comprende una matriz de ADNc o de oligonucleotidos para detectar la expresion de uno o mas de los genes de la firma genetica de celulas madre de tumor solido.

6. Formation de imagenes in vivo

En algunas realizaciones, se utilizan tecnicas de formacion de imagenes in vivo para visualizar la expresion de marcadores de cancer en un animal (por ejemplo, un ser humano o un mamlfero no humano). Por ejemplo, en algunas realizaciones, el ARNm o protelna marcadora de cancer se marca utilizando un anticuerpo marcado especlfico para el marcador de cancer. Un anticuerpo unido y marcado especlficamente puede detectarse en un individuo utilizando un metodo de formacion de imagenes in vivo, incluyendo, pero sin limitation, la formacion de imagenes de radionuclidos, la tomografla de emision de positrones, la tomografla axial computarizada, rayos X o el metodo de formacion de imagenes por resonancia magnetica, deteccion de fluorescencia y deteccion de quimioluminiscencia. Mas adelante se describen metodos para generar anticuerpos contra los marcadores de cancer de la presente divulgacion.

Los metodos de formacion de imagenes in vivo de la presente divulgacion son utiles en el diagnostico de canceres que expresan los marcadores de cancer de celulas madre de tumores solidos de la presente divulgacion (por ejemplo, en cancer de mama). La formacion de imagenes in vivo se utiliza para visualizar la presencia de un marcador indicativo del cancer. Dichas tecnicas permiten el diagnostico sin el uso de una biopsia desagradable. Los metodos de formacion de imagenes in vivo de la presente divulgacion tambien son utiles para proporcionar pronosticos a los pacientes de cancer. Por ejemplo, puede detectarse la presencia de un marcador indicativo de celulas madre cancerosas. Los metodos de formacion de imagenes in vivo de la presente divulgacion pueden utilizare adicionalmente para detectar canceres metastasicos en otras partes del cuerpo.

En algunas realizaciones, los reactivos (por ejemplo, anticuerpos) especlficos para los marcadores de cancer de la presente divulgacion se marcan con fluorescencia. Los anticuerpos marcados se introducen en un sujeto (por ejemplo, por via oral o parenteral). Los anticuerpos marcados con fluorescencia se detectan utilizando cualquier metodo adecuado (por ejemplo, utilizando el aparato descrito en la Patente de Estados Unidos 6.198.107).

En otras realizaciones, los anticuerpos se marcan con radiactividad. El uso de anticuerpos para el diagnostico in vivo es muy conocido en la tecnica. Sumerdon et al., (Nucl. Med. Biol 17: 247-254 [1990] han descrito un quelante de anticuerpo optimizado para la formacion de imagenes radioinmunoescintograficas de tumores utilizando Indio-111 como marcador. Griffin et al., (J Clin Onc 9: 631-640 [1991]) han descrito el uso de este agente en la deteccion de tumores en pacientes que se sospecha que tienen cancer colorrectal recurrente. En la tecnica se conoce el uso de agentes similares con iones paramagneticos como marcadores para la formacion de imagenes de resonancia magnetica (Lauffer, Magnetic Resonance in Medicine 22: 339-342 [1991]). El marcador utilizado dependera de la modalidad de formacion de imagenes seleccionada. Los marcadores radiactivos tales como Indio-111, Tecnecio- 99m, o Yodo-131 pueden utilizarse para escaneres planos o tomografla computarizada de emision de un solo positron (SPECT). Tambien pueden utilizarse marcadores que emiten positrones tales como Fluor-19 para tomografla de emision de positrones (PET). En el caso de la MRI, pueden utilizarse iones paramagneticos tales como Gadolinio (III) o Manganeso (II).

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Se dispone de metales radiactivos con semividas que varlan de 1 hora a 3,5 dlas para la conjugacion con anticuerpos tales como escandio-47 (3,5 dlas), galio-67 (2,8 dlas), galio-68 (68 minutos), tecnecio-99m (6 horas) e indio-111 (3,2 dlas), de los cuales el galio-67, el tecnecio-99m y el indio-111 son preferibles para la formacion de imagenes con camaras gamma, siendo preferible el galio-68 para la tomografla de emision de positrones.

Un metodo util de marcaje de anticuerpos con dichos radiometales es mediante un agente quelante bifuncional tal como el acido dietilentriaminopentaacetico (DTPA), como se describe, por ejemplo, por Khaw et al. (Science 209: 295 [1980]) para In-111 y Tc-99m, y por Scheinberg et al. (Science 215: 1511 [1982]). Tambien pueden utilizarse otros agentes quelantes, pero el 1-(p-carboximetoxibencil)EDTA y el anhldrido carboxicarbonico de DTPA son ventajosos debido a que su uso permite la conjugacion sin afectar sustancialmente a la inmunorreactividad del anticuerpo.

Otro metodo para el acoplamiento de DPTA a protelnas es mediante el uso de anhldrido clclico de DTPA, como describen Hnatowich et al. (Int. J. Appl. Radiat. Isot. 33: 327 [1982]) para marcar albumina con In-111, pero que puede adaptarse para marcar anticuerpos. Un metodo adecuado de marcaje de anticuerpos con Tc-99m que no utiliza quelacion con DPTA es el metodo de pre-estanado de Crockford et al., (Patente de Estados Unidos N° 4.323.546).

Un metodo para marcar inmunoglobulinas con Tc-99m es el descrito por Wong et al. (Int. J. Appl. Radiat. Isot., 29: 251 [1978]) para protelnas plasmaticas, y recientemente aplicado de manera satisfactoria por Wong et al. (J. Nucl. Med., 23: 229 [1981]) para anticuerpos marcados.

En el caso de radiometales conjugados con el anticuerpo especlfico, probablemente es deseable introducir una proporcion de radiomarcador tan alta como sea posible en la molecula de anticuerpo sin destruir su inmunoespecificidad. Una mejora adicional puede conseguirse efectuando el radiomarcado en presencia del marcador de cancer de celulas madre especlfico de la presente divulgacion para garantizar que se protege el sitio de union a antlgeno del anticuerpo.

En otras realizaciones adicionales, se utiliza la formacion de imagenes biofotonica in vivo (Xenogen, Almeda, CA) para la formacion de imagenes in vivo. Esta formacion de imagenes in vivo en tiempo real utiliza luciferasa. El gen de la luciferasa se incorpora en las celulas, microorganismos y animales (por ejemplo, como una protelna de fusion con un marcador de cancer de la presente divulgacion). Cuando esta activo, conduce a una reaccion que emite luz. Para capturar la imagen y analizarla se utiliza una camara CCD y un programa informatico.

Agentes terapeuticos

La presente divulgacion proporciona diversos agentes terapeuticos. En algunas realizaciones, los agentes se unen a al menos una protelna RSPO humana. En realizaciones alternativas, los agentes se unen a dos o mas protelnas RSPO humanas. En determinadas realizaciones alternativas, los agentes se unen a al menos una protelna LGR humana. En realizaciones alternativas, los agentes se unen a dos o mas protelnas LGR humanas. En algunas realizaciones, los agentes alteran (parcial o completamente) la union de al menos una protelna RSPO (por ejemplo, RSPO1, RsPo2, RSPO3 y/o RSPO4) a al menos una protelna LGR (por ejemplo, LGR4, LGR5 y/o LgR6). En determinadas realizaciones, los agentes alteran la senalizacion de LGR activada por RSPO, tal como la senalizacion de LGR5. En determinadas realizaciones, los agentes alteran la senalizacion de la beta catenina.

En determinadas realizaciones, el agente terapeutico es una biomolecula. En determinadas realizaciones, el agente terapeutico o biomolecula es un anticuerpo, tal como un anticuerpo que se une a al menos una protelna RSPO o a al menos una protelna LGR. Por tanto, el agente terapeutico o biomolecula puede ser un anticuerpo que se une especlficamente a LGR5. En determinadas realizaciones alternativas, el agente terapeutico o biomolecula es un anticuerpo que se une especlficamente a LGR4 o LGR6. En determinadas realizaciones, el agente terapeutico o biomolecula es un anticuerpo que se une especlficamente a RSPO1, RSPO2, RSPO3 y/o RSPO4.

En determinadas realizaciones, el agente terapeutico o biomolecula es un receptor LGR soluble (por ejemplo, un receptor LGR5). Por ejemplo, en algunas realizaciones, el agente terapeutico es una protelna de fusion que comprende un fragmento del receptor LGR5 y/o la porcion Fc de un anticuerpo.

En determinadas realizaciones alternativas, el agente terapeutico es un oligonucleotido antisentido, una molecula de ARNip o una ribozima.

En algunas realizaciones, la presente divulgacion proporciona terapias para el cancer (por ejemplo, cancer de mama). En algunas realizaciones, las terapias se dirigen a marcadores de cancer.

La presente divulgacion proporciona un anticuerpo que se une especlficamente a al menos una protelna LGR humana. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une especlficamente a al menos una protelna LGR humana selecciona del grupo que consiste en LGR4, LGR5 y LGR6. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une especlficamente a LGR5. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une especlficamente a dos o mas

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protelnas LGR humanas seleccionas del grupo que consiste en LGR4, LGR5 y LGR6. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une especlficamente a al menos una protelna LGR humana, tambien altera la union de al menos una protelna RSPO (por ejemplo, RSPO1, RSPO2, RSPO3 y/o RSPO4) a al menos una protelna LGR humana (por ejemplo, LGR5). En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une especlficamente a al menos una protelna LGR humana se caracteriza por una capacidad para alterar la activacion de la senalizacion de LGR mediante RSPO y/o una capacidad de alterar la senalizacion de la beta catenina. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une especlficamente a al menos una protelna LGR humana se caracteriza por la capacidad de inhibir el crecimiento tumoral, tal como el crecimiento de un tumor solido que comprende celulas madre de tumores solidos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el anticuerpo que se une especlficamente a al menos una protelna LGR humana, altera o inhibe la union de RSPO a LGR, e inhibe el crecimiento tumoral. En determinadas realizaciones alternativas, el anticuerpo que se une especlficamente a al menos una protelna LGR tambien altera la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO e inhibe el crecimiento tumoral. En determinadas realizaciones alternativas, el anticuerpo que se une especlficamente a al menos una protelna LGR tambien altera la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO y/o la senalizacion de la beta catenina e inhibe el crecimiento tumoral. (En determinadas realizaciones, la inhibicion del crecimiento tumoral proporcionada por un anticuerpo puede, pero no necesariamente, ser el resultado de la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO. En determinadas realizaciones, la inhibicion del crecimiento tumoral proporcionada por un anticuerpo puede, pero no necesariamente, ser el resultado de la inhibicion de la union de una protelna RSPO a una protelna LGR).

La presente invencion proporciona un anticuerpo que se une especlficamente a al menos una protelna RSPO humana seleccionada del grupo que consiste en RSPO1, RSPO2, RSPO3 y RSPO4. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une especlficamente a dos o mas protelnas RSPO humanas seleccionas del grupo que consiste en RSPO1, RSPO2, RSPO3 y RSPO4. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une especlficamente a RSPO1. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une especlficamente a al menos una protelna RSPO, tambien es capaz de alterar la union de al menos una protelna RSPO (por ejemplo, RSPO1, RSPO2, RSPO3 y/o RSPO4) a al menos una protelna LGR humana (por ejemplo LGR5). En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une especlficamente a al menos una protelna RSPo humana se caracteriza por una capacidad para alterar la activacion por RSPO de la senalizacion de LGR y/o una capacidad para alterar la senalizacion de la beta catenina. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une especlficamente a al menos una protelna RSPO humana se caracteriza por la capacidad de inhibir el crecimiento tumoral, tal como el crecimiento de un tumor solido que comprende celulas madre de tumor solido. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el anticuerpo que se une especlficamente a al menos una protelna RSPO humana altera o inhibe la union de RSPO a LGR, e inhibe el crecimiento tumoral. En determinadas realizaciones alternativas, el anticuerpo que se une especlficamente a al menos una protelna RSPO, tambien altera la activacion de la senalizacion de lGr por RSPO e inhibe el crecimiento tumoral. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une especlficamente a al menos una protelna RSPO, altera la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO y/o la senalizacion de la beta catenina e inhibe el crecimiento tumoral.

En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-LGR o anti-RSPO (u otro agente) que altera la union de una protelna RSPO con una protelna LGR, altera al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, o al menos aproximadamente un 90 % de la union de la protelna RSPO con una protelna LGR en un ensayo in vitro o in vivo.

Igualmente, en determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-LGR o anti-RSPO (u otro agente) que altera (a) la activacion por RSPO de la senalizacion de LGR y/o (b) la senalizacion de la beta catenina, altera al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, o al menos aproximadamente un 90 % de la senalizacion en un ensayo in vitro o in vivo.

La presente invencion proporciona, en determinadas realizaciones, un anticuerpo aislado que se une especlficamente a una protelna R-espondina (RSPO) humana e inhibe el crecimiento de un tumor solido que comprende celulas madre de tumores solidos. En determinadas realizaciones, la RSPO humana es RSPO1. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano.

En determinadas realizaciones, la presente invencion proporciona un anticuerpo aislado que se une especlficamente a una protelna RSPO humana y altera la activacion de la senalizacion de LGR5 por RSPO. En determinadas realizaciones, la RSPO es RSPO1. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano.

En determinadas realizaciones, la presente invencion proporciona un anticuerpo aislado que se une especlficamente a un dominio extracelular de una protelna LGR humana e inhibe el crecimiento de un tumor solido que comprende celulas madre de tumor solido. En determinadas realizaciones, el dominio extracelular comprende los aminoacidos 22-564 de la LGR5 humana (SEC ID N°: 1). En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano.

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En determinadas realizaciones, la presente invencion proporciona un anticuerpo aislado que se une especlficamente a un dominio extracelular de una protelna LGR humana y altera la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO. En determinadas realizaciones, el dominio extracelular comprende los aminoacidos 22-564 de la LGR5 humana (SEC ID N°: 1). En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano.

La invencion proporciona adicionalmente un anticuerpo monoclonal anti-LGR5 88M1. El anticuerpo monoclonal 88M1 se produce por una llnea celular de hibridoma depositada en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Blvd, Manassas, Virginia, 20110, Estados Unidos, el 31 de julio de 2008, de acuerdo con el Tratado de Budapest, con el numero de deposito ATCC PTA-9342. Tambien se proporcionan anticuerpos que se unen especlficamente a LGR5 humano y (a) comprenden una region variable de cadena pesada que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 95 % (por ejemplo, una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 98 % o aproximadamente 100 %) con la region variable de cadena pesada de 88M1; (b) comprenden una region variable de cadena pesada que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 95 % (por ejemplo, una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 98 % o aproximadamente 100 %) con la region variable de cadena ligera de 88M1; (c) comprenden las CDR de cadena pesada de 88M1; (d) comprenden las CDR de cadena ligera de 88M1; (e) se unen a un epltopo capaz de unirse a 88M1 y/o (f) compiten con 88M1 en un ensayo de union competitiva. Tambien se proporcionan llneas celulares productoras de los anticuerpos (incluyendo, pero sin limitacion, la llnea celular de hibridoma que tiene el numero de deposito PTA-9342 de la ATCC) y composiciones que comprenden los anticuerpos. Tambien se proporcionan polinucleotidos que codifican la region variable de cadena ligera y/o la region variable de cadena pesada de los anticuerpos monoclonales, y vectores y celulas que comprenden los polinucleotidos.

Pueden utilizarse ensayos de competicion para determinar si dos anticuerpos se unen al mismo epltopo reconociendo epltopos identicos o estericamente solapantes. Puede utilizarse cualquier metodo conocido en la tecnica para determinar la union competitiva (tal como, por ejemplo, los inmunoensayos descritos en cualquier parte del presente documento).

En determinadas realizaciones, la presente divulgacion proporciona un receptor soluble que comprende un dominio extracelular de una protelna LGR humana que inhibe el crecimiento de un tumor solido que comprende celulas madre de tumor solido. En determinadas realizaciones, el dominio extracelular comprende los aminoacidos 22-564 de la LGR5 humana (SEC ID N°: 1). En determinadas realizaciones, el dominio extracelular de la LGR5 humana esta unido en fase con una secuencia de protelna que no es LGR. En determinadas realizaciones, la protelna que no es LGR es Fc humana.

En determinadas realizaciones, la presente divulgacion proporciona un receptor soluble que comprende un dominio extracelular de una protelna LGR humana que altera la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO. En determinadas realizaciones, el dominio extracelular comprende los aminoacidos 22-564 de la LGR5 humana (SEC ID N°: 1). En determinadas realizaciones, el dominio extracelular de la LGR5 humana esta unido en fase con una secuencia de protelna que no es LGR. En determinadas realizaciones, la protelna que no es LGR es Fc humana.

Los ensayos in vitro e in vivo para cribar agentes terapeuticos candidatos que tienen la capacidad de unirse especlficamente a una protelna RSPO o LGR particular se conocen bien en la tecnica. Los inmunoensayos que pueden utilizarse para evaluar la union por anticuerpos incluyen, por ejemplo, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que utilizan tecnicas tales como transferencias de Western, radioinmunoensayo, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo “sandwich”, ensayos de inmunoprecipitacion, reacciones con precipitina, reacciones de precipitina con difusion en gel, ensayos de inmunodifusion, ensayos de aglutinacion, ensayos de fijacion al complemento, ensayos inmunorradiometricos, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos con protelna A. El uso de analisis FACS para determinar la union especlfica a una protelna RSPO o LGR diana se perfila en un ejemplo especlfico, el Ejemplo 3, mas adelante.

Ademas, la afinidad de union de un anticuerpo con una protelna LGR o RSPO y la velocidad de disociacion de la interaccion del anticuerpo con LGR o RSPO puede determinarse mediante ensayos de union competitiva. Un ejemplo de un ensayo de union competitiva es un radioinmunoensayo que comprende la incubacion de la protelna LGR o RSPO marcada con el anticuerpo de interes en presencia de cantidades crecientes de protelna LGR o RSPO no marcada, y la deteccion del anticuerpo unido a la protelna LGR o RSPO marcada. Despues puede determinarse la afinidad del anticuerpo por la protelna LGR o RSPO y las velocidades de disociacion a partir de los datos mediante analisis de representacion de Scatchard. Tambien puede determinarse la competicion con un anticuerpo secundario (por ejemplo, 88M1) utilizando radioinmunoensayos. Por ejemplo, la protelna LGR o RSPO se incuba con el anticuerpo de interes conjugado con un compuesto marcado en presencia de cantidades en aumento de un anticuerpo secundario no marcado. Como alternativa, puede determinarse la afinidad de union de un anticuerpo a una protelna LGR o RSPO y las velocidades de asociacion y disociacion de la interaccion del anticuerpo-LGR o anticuerpo-RSPO mediante resonancia de plasmon superficial, tal como BIAcore. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-LGR pueden dirigirse a y acumularse en la membrana de una celula que exprese LGR.

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Mas adelante, en la seccion titulada “cribado de Farmacos” se describen ensayos conocidos adicionales para evaluar la union u otra interaccion de un agente terapeutico candidato (incluyendo aquellos que no sean anticuerpos) con una protelna tal como una protelna LGR o RSPO.

De forma similar, tambien son muy conocidos en la tecnica ensayos adecuados para determinar si un agente terapeutico candidato (tal como un anticuerpo anti-LGR o anti-RSPO puede bloquear la union de una protelna RSPO con una protelna LGR. Se describen ejemplos de dichos ensayos de union competitiva en otras partes del presente documento. Un ejemplo del uso de un ensayo de union competitiva basado en FACS para determinar la capacidad de un anticuerpo contra LGR5 para al menos bloquear parcialmente la union de RSPO1 con LGR5 se proporciona en un ejemplo especlfico, el Ejemplo 3, mas adelante.

Ademas, tambien se conocen en la tecnica ensayos para determinar si un agente terapeutico candidato particular es capaz de alterar la activacion por RSPO de la senalizacion de LGR (por ejemplo, senalizacion de LGR5) y/o es capaz de alterar la senalizacion de la beta catenina. Por ejemplo, pueden utilizarse ensayos que emplean el uso de genes indicadores unidos operativamente a un promotor sensible a beta catenina para medir el nivel de senalizacion de la beta catenina en presencia de un anticuerpo anti-RSPO o anti-LGR. Veanse, por ejemplo, los ensayos de luciferasa descritos en el ejemplo especlfico, Ejemplo 2, mas adelante.

Los ensayos in vitro e in vivo para cribar en agentes terapeuticos candidatos que se dirigen a una protelna RSPO o LGR la eficacia anticancerosa y/o antitumoral de celulas madre seran obvios para un experto en la materia. Mas adelante, en la seccion titulada “Cribado de Farmacos” y en el ejemplo especlfico, Ejemplo 4, mostrado mas adelante, se proporcionan ensayos a modo de ejemplo conocidos en la tecnica. Ademas se ofrecen orientaciones adicionales con respecto a la evaluacion de la eficacia antitumoral y anticancerosa de celulas madre proporcionadas en la Publication de Patente Internacional N° WO 08/042236, Publication de Patente de Estados Unidos N° US 2007/0117751 y en la Publicacion de Patente de Estados Unidos N° US 2008/0131434.

Anticuerpos (Incluyendo fragmentos de anticuerpo)

Como se ha descrito anteriormente, en determinadas realizaciones, los agentes terapeuticos son anticuerpos, tales como anticuerpos contra una protelna LGR humana o una protelna RSPO humana. Ademas, la presente invention proporciona anticuerpos utiles para otras finalidades, tales como finalidades de diagnostico o cribado. En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento (incluyendo, pero sin limitation, anticuerpos terapeuticos) se alslan. En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento son sustancialmente puros.

En algunas realizaciones, los anticuerpos (tanto para su uso en terapia como para otros propositos) son anticuerpos monoclonales. En determinadas realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos quimericos, humanizados o humanos. Adicionalmente, la divulgation proporciona anticuerpos biespeclficos. En determinadas realizaciones, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos Fab.

En determinadas realizaciones, la presente invencion proporciona anticuerpos aislados contra un marcador de celulas madre de cancer (por ejemplo, LGR5). El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal que reconoce especlficamente el marcador de celula madre de cancer de colon descrito. En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, que se unen especlficamente a un polipeptido marcador de celula madre de cancer de colon descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, son anticuerpos quimericos o humanizados que se unen especlficamente al dominio extracelular de un polipeptido marcador de celula madre de cancer de colon descrito en el presente documento. En otras realizaciones, los anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, son anticuerpos humanos que se unen especlficamente al dominio extracelular de un polipeptido marcador de celula madre de cancer de colon descrito en el presente documento.

Los anticuerpos contra un marcador de celula madre de cancer encuentran utilidad en los metodos experimentales, de diagnostico y terapeuticos descritos en el presente documento. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente invencion se utilizan para detectar la expresion de una protelna marcadora de celula madre de cancer de colon en muestras biologicas tales como, por ejemplo, una biopsia de tejido de un paciente, una muestra de derrame pleural o de sangre. Las biopsias de tejidos pueden seccionarse y las protelnas pueden detectarse utilizando, por ejemplo, inmunofluorescencia o inmunohistoqulmica. Como alternativa, se alslan celulas individuales de una muestra, y la expresion de las protelnas se detecta en celulas fijas o vivas mediante analisis FACS. Ademas, los anticuerpos pueden utilizarse en matrices de protelnas para detectar la expresion de un marcador de celula madre de cancer de colon, por ejemplo, en celulas tumorales, en lisados celulares o en otras muestras de protelna. En otras realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgacion se utilizan para inhibir el crecimiento de celulas tumorales poniendo en contacto los anticuerpos con celulas tumorales en ensayos basados en celulas in vitro o en modelos animales in vivo. En otras realizaciones adicionales, los anticuerpos se utilizan para tratar cancer en un paciente humano administrando una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo contra un marcador de celula madre de cancer de colon.

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Los anticuerpos policlonales pueden prepararse mediante cualquier metodo conocido. Pueden crearse anticuerpos policlonales inmunizando a un animal (por ejemplo, un conejo, una rata, un raton, un burro, etc.) mediante inyecciones multiples subcutaneas o intraperitoneales del antlgeno relevante (un fragmento peptldico purificado, una protelna recombinante de longitud completa, una protelna de fusion, etc.) opcionalmente conjugado con hemocianina de lapa americana (KLH), seroalbumina, etc. diluido en solucion salina esteril y combinado con un adyuvante (por ejemplo, Adyuvante de Freund Completo o Incompleto) para formar una emulsion estable. Despues, el anticuerpo policlonal se recupera de la sangre, de llquido ascltico y similar de un animal inmunizado de esta manera. La sangre recogida se aglutina, y el suero se decanta, se depura por centrifugacion y se ensaya con respecto a la titulacion de anticuerpos. Los anticuerpos policlonales pueden purificarse del suero o del llquido ascltico de acuerdo con metodos convencionales en la tecnica incluyendo cromatografla de afinidad, cromatografla de intercambio ionico, electroforesis en gel, dialisis, etc.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando metodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495. Utilizando el metodo del hibridoma, un raton, un hamster u otro animal hospedador apropiado se inmuniza como se describe anteriormente para suscitar la produccion por linfocitos de anticuerpos que se uniran especlficamente a un antlgeno inmunizante. Como alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Despues de la inmunizacion, los linfocitos se alslan y se fusionan con una llnea de celulas de mieloma adecuada utilizando, por ejemplo, polietilenglicol, para formar celulas de hibridoma que despues pueden seleccionarse de linfocitos no fusionados y celulas de mieloma. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales dirigidos especialmente contra un antlgeno seleccionado como se determina mediante inmunoprecipitacion, inmunotransferencia o mediante un ensayo de union in vitro tal como radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) pueden despues propagarse bien en cultivo in vitro utilizando metodos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) o bien in vivo como tumores asclticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales pueden despues purificarse del medio de cultivo o del llquido ascltico como se describe para los anticuerpos policlonales anteriores.

Como alternativa, los anticuerpos monoclonales tambien pueden prepararse utilizando metodos de ADN recombinante como se describe en la Patente de Estados Unidos 4.816.567. Los polinucleotidos que codifican un anticuerpo monoclonal se alslan, tal como a partir de celulas B maduras o de celulas de hibridoma, tal como mediante RT-PCR utilizando cebadores oligonucleotldicos que amplifican especlficamente los genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, y su secuencia se determina utilizando procedimientos convencionales. Los polinucleotidos aislados que codifican las cadenas pesada y ligera se clonan despues en vectores de expresion adecuados, que cuando se introducen por transfeccion en celulas hospedadoras, tales como celulas de E. coli, celulas COS de simio, celulas de ovario de hamster chino (CHO) o celulas de mieloma de otra manera no producen protelna de inmunoglobulina, generan anticuerpos monoclonales por las celulas hospedadoras. Ademas, pueden aislarse anticuerpos monoclonales recombinantes o fragmentos de los mismos de las especies deseadas a partir de bibliotecas de presentation de fagos como se describe (McCafferty et al., 1990, Nature, 348: 552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352: 624-628; y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222: 581-597).

El polinucleotido (o polinucleotidos) que codifica un anticuerpo monoclonal puede modificarse adicionalmente de diversas maneras utilizando tecnologla de ADN recombinante para generar anticuerpos alternativos. En una realization, los dominios constantes de las cadenas ligera y pesada de, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de raton pueden sustituirse 1) por aquellas regiones de, por ejemplo, un anticuerpo humano para generar un anticuerpo quimerico o 2) por un polipeptido no humano para generar un anticuerpo de fusion. En otras realizaciones, las regiones constantes se truncan o retiran para generar el fragmento de anticuerpo deseado de un anticuerpo monoclonal. Ademas, puede usarse mutagenesis de alta densidad o dirigida de la region variable para optimizar especlficamente la afinidad, etc. de un anticuerpo monoclonal.

En algunas realizaciones de la presente invention, el anticuerpo monoclonal contra un marcador de celula madre de cancer de colon es un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos que contienen secuencias mlnimas de anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) dentro de las regiones variables. Dichos anticuerpos se utilizan terapeuticamente para reducir la antigenicidad y respuestas HAMA (anticuerpo humano anti- raton) cuando se administran a un sujeto humano. En la practica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos con muy pocas o ninguna secuencia no humana. Un anticuerpo humano es un anticuerpo producido por un ser humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoacidos correspondiente a un anticuerpo producido por un ser humano.

Los anticuerpos humanizados pueden producirse utilizando varias tecnicas conocidas en este campo. Un anticuerpo puede humanizarse sustituyendo la CDR de un anticuerpo humano con la de un anticuerpo no humano (por ejemplo, de raton, de rata, de conejo, de hamster, etc.) que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas (Jones et al., 1986, Nature, 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239: 1534-1536). El anticuerpo humanizado puede modificarse adicionalmente mediante la sustitucion de un resto adicional bien en la region marco conservada Fv y/o dentro de los restos no humanos reemplazados para refinar y optimizar la especificidad, afinidad y/o capacidad de los anticuerpos.

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Los anticuerpos humanos pueden prepararse directamente utilizando diversas tecnicas conocidas en este campo. Pueden generarse linfocitos B humanos inmortalizados inmunizados in vitro o aislados de un individuo inmunizado que producen un anticuerpo dirigido contra un antlgeno diana (vease, por ejemplo Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1): 86-95; y la Patente de Estados Unidos 5.750.373). Ademas, el anticuerpo humano puede seleccionarse de una biblioteca de fagos, donde esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14: 309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, 95: 6157-6162; Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227: 381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222: 581). Los anticuerpos humanizados tambien pueden prepararse en ratones transgenicos que contienen loci de inmunoglobulina humana que son capaces, despues de la inmunizacion, de producir el repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de la produccion de inmunoglobulina endogena. Esta estrategia se describe en las Patentes de Estados Unidos 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016.

La presente invencion tambien incluye anticuerpos biespeclficos que reconocen especlficamente un marcador de celula madre de cancer de colon. Los anticuerpos biespeclficos son anticuerpos que son capaces de reconocer especlficamente y unirse a al menos dos epltopos diferentes. Los epltopos diferentes pueden estar dentro de la misma molecula (por ejemplo, el mismo polipeptido marcador de celula madre de cancer de colon) o en diferentes moleculas de tal forma que, por ejemplo, los anticuerpos pueden reconocer especlficamente y unirse a un marcador de celula madre de cancer de colon as! como, por ejemplo 1) a una molecula efectora en un leucocito tal como un receptor de celulas T (por ejemplo CD3) o receptor Fc (por ejemplo CD64, CD32 o CD16) o 2) un agente citotoxico como se describe con detalle mas adelante. Los anticuerpos biespeclficos pueden ser anticuerpos intactos o fragmentos de anticuerpo. Las tecnicas para fabricar anticuerpos biespeclficos son comunes en la materia (Millstein et al., 1983, Nature 305: 537-539; Brennan et al., 1985, Science 229: 81; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol. 121: 120; Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10: 3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175: 217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152: 5368; y Patente de Estados Unidos 5.731.168).

En determinadas realizaciones de la invencion, puede ser deseable utilizar un fragmento de anticuerpo en lugar de un anticuerpo intacto, por ejemplo, para aumentar la penetracion del tumor. Para la produccion de los fragmentos de anticuerpos se conocen diversas tecnicas. Tradicionalmente, estos fragmentos son el resultado de la digestion proteolltica de anticuerpos intactos (por ejemplo, Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 y Brennan et al., 1985, Science, 229: 81). Sin embargo, estos fragmentos se producen normalmente ahora directamente por celulas hospedadoras recombinantes como se ha descrito anteriormente. Por tanto, los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y scFv todos ellos pueden expresarse en y secretarse de E. coli u otras celulas hospedadoras, permitiendo de esta manera la produccion de grandes cantidades de estos fragmentos. Como alternativa, dichos fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las fagotecas de anticuerpo indicadas anteriormente. El fragmento de anticuerpo tambien puede ser anticuerpos lineales como se describe en la Patente de Estados Unidos 5.641.870, por ejemplo, y pueden ser monoespeclficos o biespeclficos. Seran obvias otras tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpos.

Puede ser deseable adicionalmente, especialmente en el caso de fragmentos de anticuerpos, modificar un anticuerpo para aumentar su semivida en suero. Esto puede realizarse, por ejemplo, incorporando un epltopo de union a receptor de salvamento en el fragmento de anticuerpo por mutacion de la region apropiada en el fragmento de anticuerpo o incorporando el epltopo en una etiqueta peptldica que despues se fusiona con el fragmento de anticuerpo en un extremo o en el centro (por ejemplo por slntesis de ADN o peptldica).

La presente divulgacion tambien incluye variantes y equivalentes que son sustancialmente homologos a los anticuerpos quimericos, humanizados y humanos, o fragmentos de anticuerpo de los mismos, expuestos en el presente documento. Estos pueden contener, por ejemplo, mutaciones de sustituciones conservativas, es decir, la sustitucion de uno o mas aminoacidos por aminoacidos similares. Por ejemplo, una sustitucion conservativa se refiere a la sustitucion de un aminoacido por otro dentro de la misma clase general tal como, por ejemplo, un aminoacido acido por otro aminoacido acido, un aminoacido basico por otro aminoacido basico o un aminoacido neutro por otro aminoacido neutro. Lo que se entiende por sustitucion de aminoacidos conservativa es bien conocido en la tecnica.

La invencion tambien se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotoxico. Los agentes citotoxicos incluyen agentes quimioterapeuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, o sus fragmentos), isotopos radiactivos (es decir, un radioconjugado), etc. Los agentes quimioterapeuticos utiles en la generacion de dichos inmunoconjugados incluyen, por ejemplo, metotrexato, adriamicina, doxorrubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes. Las toxinas enzimaticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden utilizarse incluyen la cadena de la difteria A, fragmentos activos sin union de la toxina difterica, cadena de exotoxina A, cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa sarcina, protelnas de Aleurites fordii, protelnas diantina, protelnas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Se dispone de diversos radionuclidos para la produccion de anticuerpos

J 212 131 131 00 186 1 1 1

radioconjugados incluyendo Bi, I, In, Y y Re. Los conjugados del anticuerpo y agente citotoxico se

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preparan utilizando diversos agentes de acoplamiento de protelna bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2- piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (tales como dimetil adipimidato HCL), esteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehldos (tales como glutaraldehldo), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p- diazonio-benzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolien 2,6-diisocianato) y compuestos de fluor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Tambien pueden utilizarse conjugados de un anticuerpo y una o mas toxinas de molecula pequena, tales como caliqueamicina, maitansinoides, un tricoteno, y CC1065 y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina.

En algunas realizaciones el anticuerpo de la invention contiene regiones Fc humanas que se modifican para potenciar la funcion efectora, por ejemplo, citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). Esto puede realizarse introduciendo una o mas sustituciones de aminoacidos en una region Fc del anticuerpo. Por ejemplo, puede introducirse uno o mas restos de cistelna en la region Fc para permitir la formation de enlaces disulfuro intercatenarios en esta region para mejorar la destruction celular mediada por complemento y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (Caron et al., 1992, J. Exp Med. 176: 1191-1195; Shopes, 1992, Immunol. 148: 2918-2922). Tambien pueden prepararse anticuerpos homodimericos con actividad antitumoral potenciada utilizando reticulantes heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., 1993, Cancer Research 53: 2560-2565. Como alternativa, puede obtenerse por ingenierla genetica un anticuerpo que tenga regiones Fc dobles (Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230).

En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona anticuerpos que se dirigen a tumores que expresan un marcador de cancer de celula madre de la presente divulgation. Puede utilizarse cualquier anticuerpo adecuado (por ejemplo, monoclonal, policlonal o sintetico) en los metodos terapeuticos desvelados en el presente documento. En algunas realizaciones, los anticuerpos utilizados para la terapia contra el cancer son anticuerpos humanizados. En la tecnica se conocen bien metodos para humanizar anticuerpos (veanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 6.180.370, 5.585.089, 6.054.297 y 5.565.332).

En algunas realizaciones, los anticuerpos terapeuticos comprenden un anticuerpo generado contra un marcador de cancer de celula madre de la presente divulgacion, donde el anticuerpo esta conjugado con un agente citotoxico. En dichas realizaciones, se genera un agente terapeutico especlfico de tumor que no se dirige a celulas normales reduciendose de este modo muchos de los efectos secundarios perjudiciales de la quimioterapia tradicional. Para determinadas aplicaciones, se contempla que los agentes terapeuticos sean agentes farmacologicos que serviran como agentes utiles para la union a anticuerpos, particularmente agentes citotoxicos o anticelulares de otra manera que tienen la capacidad de destruir o suprimir el crecimiento o la division celular de celulas endoteliales. La presente divulgacion contempla el uso de cualquier agente farmacologico que pueda conjugarse con un anticuerpo y suministrarse en forma activa. Los agentes anticelulares a modo de ejemplo incluyen agentes quimioterapeuticos, radioisotopos y citotoxinas. Los anticuerpos terapeuticos de la presente invencion pueden incluir diversas fracciones citotoxicas, incluyendo pero sin limitation isotopos radiactivos (por ejemplo, yodo-131, yodo-123, tecnecio-99m, indio-111, renio-188, renio-186, galio-67, cobre-67, itrio-90, yodo-125 o astatina-211), hormonas tales como una hormona esteroidea, antimetabolitos tales como citosinas (por ejemplo, arabinosido, fluorouracilo, metotrexato o aminopterina; una antraciclina; mitomicina C), alcaloides de la vinca (por ejemplo, demecolcina; etoposido; mitramicina), y agente alquilante antitumoral tal como clorambucilo o melfalan. Otras realizaciones pueden incluir agentes tales como un coagulante, una citocina, factor de crecimiento, endotoxina bacteriana o la fraction de llpido A de una endotoxina bacteriana. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los agentes terapeuticos incluiran toxinas procedentes de plantas, hongos o bacterias, tales como una toxina de cadena A, una protelna inactivadora de ribosoma, a-sarcina, aspergilina, restrictocina, una ribonucleasa, toxina difterica o exototoxina de pseudomonas, por mencionar solo algunos ejemplos. En algunas realizaciones, se utiliza la cadena A de ricina desglucosilada.

En cualquier caso, se propone que agentes tales como estos puedan, si se desea, conjugarse satisfactoriamente con un anticuerpo, de una manera que permita su direccionamiento, internalization, liberation o presentation a los componentes sangulneos en el lugar de las celulas tumorales diana como se requiere utilizando tecnologla de conjugation conocida (vease, por ejemplo, Ghose et al., Methods Enzymol., 93: 280 [1983]).

Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presente divulgacion proporciona inmunotoxinas dirigidas a un marcador de cancer de celula madre de la presente divulgacion. Las inmunotoxinas son conjugados de un agente de direccionamiento especlfico, normalmente un anticuerpo o fragmento dirigido a tumor, con un agente citotoxico, tal como la fraccion de toxina. El agente de direccionamiento se dirige a la toxina y por lo tanto destruye selectivamente celulas que llevan el antlgeno diana. En algunas realizaciones, los anticuerpos terapeuticos emplean reticuladores que proporcionan una estabilidad in vivo elevada (Thorpe et al., Cancer Res., 48: 6396 [1988]).

En otras realizaciones, particularmente las que implican el tratamiento de tumores solidos, se disenan anticuerpos que tengan un efecto citotoxico o anticelular de otra manera contra la vasculatura tumoral suprimiendo el crecimiento o la division celular de las celulas endoteliales vasculares. Este ataque pretende conducir a un colapso vascular localizado en tumor, privando a las celulas tumorales, particularmente a aquellas celulas tumorales distales a la vasculatura de oxlgeno y nutrientes, que conduce finalmente a la muerte celular y a la necrosis tumoral.

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En algunas realizaciones, los agentes terapeuticos basados en anticuerpos se formulan como composiciones farmaceuticas como se describe mas adelante. En algunas realizaciones, la administracion de una composicion de anticuerpo de la presente invencion da como resultado una disminucion medible en el cancer (por ejemplo, una disminucion o eliminacion del tumor).

La divulgacion tambien proporciona kits y artlculos de fabricacion que comprenden uno o mas anticuerpos. En determinadas realizaciones, los kits comprenden al menos dos anticuerpos. En determinadas realizaciones, los kits comprenden al menos dos anticuerpos que se unen especlficamente a una protelna RSPO humana o una protelna LGR humana.

Cribado de farmacos

En algunas realizaciones, la presente divulgacion proporciona ensayos de cribado de farmacos (por ejemplo para cribar farmacos contra el cancer). En determinadas realizaciones, los metodos de cribado de la presente divulgacion utilizan marcadores de cancer de celulas madre identificados utilizando los metodos de la presente divulgacion. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presente divulgacion proporciona metodos de cribado de un compuesto que altera (por ejemplo aumenta o disminuye) la expresion de genes marcadores de cancer de celulas madre. En algunas realizaciones, los compuestos candidatos son agentes antisentido o agentes ARNip (por ejemplo, oligonucleotidos) dirigidos contra marcadores de cancer. En otras realizaciones, los compuestos candidatos son anticuerpos que se unen especlficamente a un marcador de cancer de celula madre de la presente divulgacion. En determinadas realizaciones, las bibliotecas de compuestos de moleculas pequenas se criban utilizando los metodos descritos en el presente documento.

En un metodo de cribado, se evaluan compuestos candidatos con respecto a su capacidad para alterar la expresion del marcador de cancer de la celula madre poniendo en contacto un compuesto con una celula que expresa un marcador de cancer de celula madre y despues ensayando el efecto de los compuestos candidatos sobre la expresion. En algunas realizaciones, el efecto de los compuestos candidatos sobre la expresion de un gen marcador de cancer se ensaya detectando el nivel del ARNm de marcador de cancer expresado por la celula. La expresion del ARNm puede detectarse mediante cualquier metodo adecuado. En otras realizaciones, el efecto de los compuestos candidatos sobre la expresion de genes marcadores de cancer se ensaya midiendo el nivel de polipeptido codificado por los marcadores de cancer. El nivel del polipeptido expresado puede medirse utilizando cualquier metodo adecuado incluyendo, pero sin limitacion, los desvelados en el presente documento. En algunas realizaciones, se detectan otros cambios en la biologla celular (por ejemplo, la apoptosis).

Especlficamente, la presente divulgacion proporciona metodos de cribado para identificar moduladores, es decir compuestos o agentes candidatos o de ensayo (por ejemplo, protelnas, peptidos, peptidomimeticos, peptoides, moleculas pequenas u otros farmacos) que se unen a, o alteran la serialization o funcion asociada con los marcadores de cancer de la presente divulgacion, tienen un efecto inhibidor (o estimulador) por ejemplo sobre la expresion del marcador de cancer de celula madre o la actividad de marcadores de cancer, o tienen un efecto estimulador o inhibidor sobre, por ejemplo, la expresion o actividad de un sustrato de marcador de cancer. Los compuestos as! identificados pueden utilizarse para modular la actividad de productos genicos diana (por ejemplo, genes marcadores de cancer de celula madre) bien directamente o indirectamente en un protocolo terapeutico, para elaborar la funcion biologica del producto genico diana o para identificar compuestos que alteran las interacciones normales de genes diana. Los compuestos que inhiben la actividad o expresion de marcadores de cancer son utiles en el tratamiento de trastornos proliferativos, por ejemplo, cancer, particularmente cancer metastasico, o en la eliminacion o control de celulas madre tumorales para prevenir o reducir el riesgo de cancer.

En una realization, la divulgacion proporciona ensayos para cribar compuestos candidatos o de ensayo que son sustratos de protelnas o polipeptidos marcadores de cancer o una parte biologicamente activa de los mismos. En otra realizacion, la divulgacion proporciona ensayos para cribar compuestos candidatos o de ensayo que se unen a o modulan la actividad de una protelna o polipeptido marcador de cancer o una parte biologicamente activa de los mismos.

Los compuestos de ensayo de la presente divulgacion pueden obtenerse utilizando cualquiera de las numerosas estrategias en metodos de biblioteca combinatoria conocidos en la tecnica, incluyendo bibliotecas biologicas; bibliotecas de peptoides (bibliotecas de moleculas que tienen las funcionalidades de peptidos, pero con una nueva estructura no peptldica, que son resistentes a degradation enzimatica pero que, sin embargo, permanecen bioactivas; vease, por ejemplo, Zuckennann et al., J. Med. Chem. 37: 2678-85 [1994]); bibliotecas de fase en solution o en fase solida paralelas espacialmente dirigibles; metodos de bibliotecas sinteticas que requieren la desconvolucion; el metodo de biblioteca “una perla un compuesto”; y metodos de bibliotecas sinteticas que utilizan selection de cromatografla por afinidad. La biblioteca biologica y las estrategias de bibliotecas peptoides se prefieren para su uso con bibliotecas peptldicas, mientras que las otras cuatro estrategias son aplicables a bibliotecas de compuestos de molecula pequena u oligomeros peptldicos o no peptldicos (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145).

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En la tecnica pueden encontrarse ejemplos de metodos para la slntesis de bibliotecas moleculares, por ejemplo en: DeWitt et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909 [1993]; Erb et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 91: 11422 [1994]; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37: 2678 [1994]; Cho et al., Science 261: 1303 [1993]; Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33.2059 [1994]; Carell et al, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061 [1994]; y Gallop et al., J. Med. Chem. 37: 1233 [1994].

Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse en solucion (por ejemplo, Houghten, Biotechniques 13: 412-421 [1992]), o en perlas (Lam, Nature 354: 82-84 [1991]), microplacas (Fodor, Nature 364: 555-556 [1993]), bacterias o esporas (Patente de Estados Unidos N° 5.223.409), plasmidos (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 18651869 [1992]) o en fagos (Scott y Smith, Science 249: 386-390 [1990]; Devlin Science 249: 404-406 [1990]; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382 [1990]; Felici, J. Mol. Biol. 222: 301 [1991]).

En una realizacion, un ensayo es un ensayo basado en celulas en el que una celula que expresa una protelna marcadora de cancer de celula madre o una parte biologicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de ensayo, y se determina la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad del marcador del cancer. La determination de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad del marcador de cancer de celula madre puede realizarse controlando, por ejemplo cambios en la actividad enzimatica. La celula puede, por ejemplo, ser de origen mamlfero.

Tambien puede evaluarse la capacidad del compuesto de ensayo para modular la union del marcador de cancer con un compuesto, por ejemplo, un sustrato marcador de cancer de celula madre. Esto puede realizarse, por ejemplo, acoplando el compuesto, por ejemplo, el sustrato, con un radioisotopo o marcador enzimatico de tal manera que la union del compuesto, por ejemplo, el sustrato, con un marcador de cancer puede determinarse detectando el compuesto marcado, por ejemplo el sustrato, en un complejo.

Como alternativa, el marcador de cancer de celula madre se acopla con un radioisotopo o un marcador enzimatico para controlar la capacidad de un compuesto de ensayo para modular la union del marcador de cancer a un sustrato de marcadores de cancer en un complejo. Por ejemplo, los compuestos (por ejemplo, sustratos) pueden marcarse con 125I, 35S 14C o 3H, bien directa o indirectamente, y el radioisotopo puede detectarse por recuento directo de radioemision o por recuento de centelleo. Como alternativa, los compuestos pueden marcarse enzimaticamente por ejemplo con peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina o luciferasa y el marcador enzimatico puede detectarse por determinacion de conversion de un sustrato apropiado en producto.

Puede evaluarse la capacidad de un compuesto (por ejemplo, un sustrato marcador de cancer de celula madre) para interaccionar con un marcador de cancer de celula madre con o sin el marcaje de cualquiera de los elementos que intervienen. Por ejemplo, puede utilizarse un microfisiometro para detectar la interaction de un compuesto con un marcador de cancer sin el marcaje del compuesto ni del marcador de cancer (McConnell et al. Science 257: 19061912 [1992]). En la manera en la que se utiliza en el presente documento, un “microfisiometro” (por ejemplo, Citodetector) es un instrumento analltico que mide la tasa a la cual la celula acidifica su entorno utilizando un sensor potenciometrico dirigible por luz (LAPS). Los cambios en esta tasa de acidification pueden utilizarse como un indicador de la interaccion entre un compuesto y marcadores de cancer.

En otra realizacion adicional, se proporciona un ensayo sin celulas en el que una protelna marcadora de cancer o parte biologicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de ensayo y se evalua la capacidad del compuesto de ensayo para unirse a la protelna marcadora de cancer de celula madre o parte biologicamente activa de la misma. Las partes biologicamente activas de las protelnas de marcadores de cancer a utilizar en los ensayos de la presente divulgation incluyen fragmentos que participan en interacciones con sustratos u otras protelnas, por ejemplo, fragmentos con altas puntuaciones de probabilidad de superficie.

Los ensayos acelulares implican la preparation de una mezcla de reaction de la protelna del gen diana y el compuesto de ensayo en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que los dos componentes interaccionen y se unan, formando as! un complejo que puede retirarse y/o detectarse.

La interaccion entre dos moleculas tambien puede detectarse, por ejemplo, utilizando transferencia de energla fluorescente (FRET) (vease, por ejemplo, Lakowicz et al., Patente de Estados Unidos N° 5.631.169; Stavrianopoulos et al., Patente de Estados Unidos N° 4.968.103). Un marcador de fluoroforo se selecciona de tal manera que la energla de fluorescencia emitida por una primera molecula donante se absorba por un marcador fluorescente en una segunda molecula aceptora, que a su vez puede emitir fluorescencia debido a la energla absorbida.

Como alternativa, la molecula de protelna “donante” puede utilizar simplemente la energla fluorescente natural de restos de triptofano. Se seleccionan marcadores que emitan diferentes longitudes de onda de luz, de tal forma que el marcador de la molecula “aceptora” pueda diferenciarse de la del donante. Dado que la eficiencia de la transferencia de energla entre los marcadores esta relacionada con la distancia que separa las moleculas, puede evaluarse la relation espacial entre las moleculas. En una situation en la que se produce union entre las moleculas, la emision fluorescente del marcador de la molecula “aceptora” en el ensayo debe ser maxima. Un acontecimiento de union FRET puede medirse convenientemente a traves de medios de detection fluorometricos convencionales bien

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conocidos en la tecnica (por ejemplo, utilizando un fluorlmetro).

En otra realizacion, la determinacion de la capacidad de la protelna marcadora de cancer de celula madre para unirse a una molecula diana puede realizarse utilizando analisis de interaccion biomolecular en tiempo real (BIA) (vease, por ejemplo Sjolander y Urbaniczky, Anal. Chem. 63: 2338-2345 [1991] y Szabo et al. Curr. Opin. struct. Biol. 5: 699-705 [1995]). La “resonancia de plasmon superficial” o “BIA” detecta interacciones biespeclficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los elementos que interaccionan (por ejemplo BIAcore). Los cambios en la masa en la superficie de union (indicativo de un acontecimiento de union) dan como resultado alteraciones del Indice de refraccion de la luz cerca de la superficie (el fenomeno optico de la resonancia de plasmon superficial (SPR)) dando como resultado una senal detectable que puede utilizarse como una indicacion de reacciones en tiempo real entre las moleculas biologicas.

En una realizacion, el producto genico diana o sustancia de ensayo se ancla sobre una fase solida. Los complejos de producto genico diana/compuesto de ensayo anclados en la fase solida pueden detectarse al final de la reaccion. El producto genico diana puede anclarse sobre una superficie solida y el compuesto de ensayo (que no esta anclado) puede marcarse, directa o indirectamente, con marcadores detectables analizados en el presente documento.

Puede ser deseable inmovilizar marcadores de cancer de celulas madre, un anticuerpo marcador anticancer o su molecula diana para facilitar la separacion de las formas que estan formando complejo de las que no estan formando complejo de una o las dos protelnas, as! como para acomodar la automatization del ensayo. La union de un compuesto de ensayo con una protelna marcadora de cancer de celula madre, o la interaccion de una protelna marcadora de cancer con una molecula diana en presencia y en ausencia de un compuesto candidato, puede realizarse en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Los ejemplos de dichos recipientes incluyen placas de microtitulacion, tubos de ensayo y tubos de microcentrlfuga. En una realizacion, puede proporcionarse una protelna de fusion que anade un dominio que permite que una o las dos protelnas se unan a una matriz. Por ejemplo, las protelnas de fusion del marcador de cancer glutation-S-transferasa o las protelnas de fusion glutation-S- transferasa/diana pueden adsorberse sobre perlas de glutation Sepharose (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulacion derivatizadas con glutation, que despues se combinan con el compuesto de ensayo o con el compuesto de ensayo y la protelna diana no adsorbida o la protelna marcadora de cancer, y la mezcla se incuba en condiciones conductoras para la formation de complejos (por ejemplo, en condiciones fisiologicas de sal y pH). Despues de la incubation, las perlas o los pocillos de placas de microtitulacion se lavan para retirar cualquiera de los componentes no unidos, la matriz se inmoviliza en el caso de perlas, y el complejo se determina directa o indirectamente, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente.

Como alternativa, los complejos pueden disociarse de la matriz y el nivel de union o de actividad de los marcadores de cancer puede determinarse utilizando tecnicas convencionales. Otras tecnicas para inmovilizar protelnas marcadoras de cancer o una molecula diana sobre matrices incluyen el uso de conjugation de biotina y estreptavidina. La protelna marcadora de cancer biotinilada o las moleculas diana pueden prepararse a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) utilizando tecnicas conocidas en este campo (por ejemplo el kit de biotinilacion, Pierce Chemicals, Rockford, IL) e inmovilizarse en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical).

Para realizar el ensayo, el componente no inmovilizado se anade a la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Despues de completar la reaccion, se retiran los componentes que no han reaccionado (por ejemplo mediante lavado) en condiciones tales que cualquiera de los complejos formados permanezca inmovilizado sobre el soporte solido. La detection de los complejos anclados en la superficie solida puede realizarse de diversas maneras. Cuando el componente no movilizado se ha marcado previamente, la deteccion del marcador inmovilizado sobre la superficie indica que se han formado los complejos. Cuando el componente no inmovilizado previamente no esta marcado previamente, puede utilizarse un marcador indirecto para detectar complejos anclados en la superficie; por ejemplo, utilizando un anticuerpo marcado especlfico para el componente inmovilizado (el anticuerpo, a su vez, puede marcarse directamente o marcarse indirectamente, por ejemplo, con un anticuerpo anti-IgG marcado).

Este ensayo se realiza utilizando anticuerpos reactivos con protelnas marcadoras de cancer de celula madre o moleculas diana pero que no interfieren con la union de las protelnas marcadoras de cancer de celula madre con su molecula diana. Dichos anticuerpos pueden derivatizarse en los pocillos de la placa y las protelnas marcadoras de cancer o diana no unidas pueden quedar atrapadas en los pocillos por conjugacion con anticuerpo. Los metodos para detectar dichos complejos, ademas de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados en GST, incluyen inmunodeteccion de complejos utilizando anticuerpos reactivos con la protelna marcadora de cancer o la molecula diana, as! como ensayos ligados a enzimas que se basan en la deteccion de una actividad enzimatica asociada con la protelna marcadora de cancer o la molecula diana.

Como alternativa, pueden realizarse ensayos sin celulas en una fase llquida. En dicho ensayo, los productos de reaccion se separan de los componentes que no han reaccionado, mediante diversas tecnicas convencionales, incluyendo, pero sin limitation: centrifugation diferencial (vease, por ejemplo, Rivas y Minton, Trends Biochem Sci 18: 284-7 [1993]); cromatografla (cromatografla de filtration con gel, cromatografla de intercambio ionico);

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electroforesis (vease, por ejemplo Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: Nueva York.); e inmunoprecipitacion (vease, por ejemplo Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: Nueva York). Dichas resinas y tecnicas cromatograficas son conocidas (vease por ejemplo Heegaard J. Mol. Recognit 11: 141-8 [1998]; Hageand Tweed J. Chromatogr. Biomed. Sci. App1 699: 499-525 [1997]). Ademas, tambien puede utilizarse convenientemente la transferencia de energla fluorescente, como se describe en el presente documento, para detectar la union sin purificacion adicional del complejo de la solucion.

El ensayo puede incluir poner en contacto la protelna marcadora de cancer de celula madre o la parte biologicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une al marcador de cancer para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una protelna marcadora de cancer, donde la determinacion de la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una protelna marcadora de cancer incluye la determinacion de la capacidad del compuesto de ensayo para unirse preferentemente a marcadores de cancer o partes biologicamente activas de los mismos o modular la actividad de una molecula diana, en comparacion con el compuesto conocido.

En la medida en que los marcadores de cancer de celula madre pueden interaccionar in vivo con una o mas macromoleculas celulares o extracelulares, tales como protelnas, son utiles inhibidores de dicha interaccion. Puede utilizarse un ensayo homogeneo para identificar inhibidores.

Por ejemplo, se prepara un complejo previamente formado del producto genico diana y el companero de union celular o extracelular interactivo de tal manera que se marque el producto genico diana o su companero de union, pero la senal generada por el marcador se inactive debido a la formacion del complejo (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 4.109.496 que utiliza esta estrategia para inmunoensayos). La adicion de una sustancia de ensayo que compite con y desplaza una de la especie del complejo previamente formado dara como resultado la generacion de una senal por encima del efecto de fondo. De esta manera, pueden identificarse sustancias de ensayo que alteran la interaccion del companero de union-producto genico diana. Como alternativa, las protelnas de marcadores de cancer pueden utilizarse como una “protelna cebo” en un ensayo de dos hlbridos o un ensayo de tres hlbridos (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.283.317; Zervos et al., Cell 72: 223-232 [1993]; Madura et al., J. Biol. Chem. 268.12046-12054 [1993]; Bartel et al., Biotechniques 14: 920-924 [1993]; Iwabuchi et al., Oncogene 8: 1693-1696 [1993]; y Brent, documento WO 94/10300), para identificar otras protelnas que se unen a, o interaccionan con, marcadores de cancer (“protelnas de union a marcadores de cancer” o “pu-marcador de cancer”) y que estan implicadas en la actividad marcadora de cancer. Dichas PU-marcador de cancer pueden ser activadoras o inhibidoras de senales por las protelnas marcadoras de cancer o dianas, tales como, por ejemplo, elementos cadena abajo de una ruta de senalizacion mediada por marcadores de cancer.

Tambien puede identificarse moduladores de la expresion de marcadores de cancer. Por ejemplo, una celula o una mezcla acelular se ponen en contacto con un compuesto candidato y se evalua la expresion de un ARNm o protelna marcadora de cancer con respecto al nivel de expresion del ARNm o protelna marcadora de cancer de celula madre en ausencia del compuesto candidato. Cuando la expresion de un ARNm o protelna marcadora de cancer es mayor en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un estimulador de la expresion de un ARNm o una protelna marcadora de cancer. Como alternativa, cuando la expresion de un ARNm o protelna marcadora de cancer es menor (es decir, menor con significado estadlstico) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un inhibidor del ARNm o de la protelna marcadora de cancer. El nivel de expresion del ARNm o la protelna marcadora de cancer puede determinarse por metodos descritos en el presente documento para detectar ARNm o protelna marcadora de cancer.

Un agente de modulation puede identificarse utilizando un ensayo basado en celulas o acelular, y la capacidad del agente para modular la actividad de una protelna marcadora de cancer puede confirmarse in vivo, por ejemplo, en un animal tal como un modelo animal para una enfermedad (por ejemplo, una animal con cancer de prostata o cancer de prostata metastasico; o en un animal que lleva un xenoinjerto de un cancer de prostata de un animal (por ejemplo un ser humano) o celulas de un cancer resultante de metastasis de un cancer de prostata (por ejemplo, contra un ganglio linfatico, hueso o hlgado), o celulas de una llnea celular de cancer de prostata.

La presente divulgation tambien se refiere a nuevos agentes identificados por los ensayos de cribado descritos anteriormente (vease, por ejemplo mas adelante la description de terapias contra el cancer). Por consiguiente, se encuentra dentro del ambito de la presente divulgacion el uso adicional de un agente identificado como se describe en el presente documento (por ejemplo, un agente modulador de marcador de cancer, una molecula de acido nucleico marcadora de cancer antisentido, una molecula de ARNit, un anticuerpo especlfico de marcador de cancer, o un companero de union de marcador de cancer) en un modelo animal apropiado (tal como los descritos en el presente documento) para determinar la eficacia, toxicidad, efectos secundarios o mecanismo de action del tratamiento con dicho agente. Ademas, los nuevos agentes identificados mediante los ensayos de cribado anteriormente mencionados pueden utilizarse, por ejemplo, para los tratamientos descritos anteriormente (por ejemplo, para tratar a un paciente humano que tiene cancer).

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En determinadas realizaciones, la presente divulgacion proporciona metodos para cribar farmacos candidatos, incluyendo, pero sin limitacion, anticuerpos, con respecto a su capacidad para (a) unirse especlficamente a una protelna RSPO humana o una protelna LGR humana; (b) alterar la union entre una protelna RSPO humana y una protelna LGR humana y/o (c) alterar la activacion por RSPO de la senalizacion de LGR.

Composiciones farmaceuticas y metodos

La presente divulgacion tambien proporciona composiciones farmaceuticas (por ejemplo, que comprenden una molecula pequena, una molecula antisentido, un anticuerpo o ARNip que, por ejemplo, se dirige a los marcadores de cancer de celulas madre de la presente divulgacion). Por tanto, se proporcionan composiciones farmaceuticas que comprenden uno o mas de los agentes terapeuticos descritos en el presente documento, tales como los anticuerpos que se dirigen a las protelnas LGR o RSPO. En determinadas realizaciones, las composiciones farmaceuticas que comprenden uno o mas agentes terapeuticos descritos en el presente documento comprenden adicionalmente un transportador farmaceuticamente aceptable.

Las composiciones farmaceuticas de la presente invention pueden administrarse de diversas maneras dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistemico y dependiendo de la zona a tratar. La administration puede ser topica (incluyendo oftalmica y a las membranas mucosas, incluyendo el suministro vaginal y rectal), pulmonar (por ejemplo, por inhalation o insuflacion de polvos o aerosoles, incluyendo mediante nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidermica y transdermica), oral o parenteral. La administracion parenteral incluye inyeccion o infusion intravenosa, intraarterial, subcutanea, intraperitoneal o intramuscular o infusion; o administracion intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular.

Las composiciones farmaceuticas y las formulaciones para administracion topica pueden incluir parches transdermicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizaciones, llquidos y polvos. Pueden ser necesarios o convenientes transportadores farmaceuticos convencionales, acuosos, en polvo o bases oleaginosas, espesantes y similares.

Las composiciones y formulaciones para administracion oral incluyen polvos o granulos, suspensiones o soluciones en medios acuosos o no acuosos, capsulas, sobrecitos o comprimidos. Pueden ser convenientes espesantes, agentes saporlferos, diluyentes, emulsionantes, ayudantes de dispersion o aglutinantes.

Las composiciones y formulaciones para administracion parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas esteriles que tambien contienen tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados, tales como, pero sin limitacion, potenciadores de penetration, compuestos transportadores y otros transportadores o excipientes farmaceuticamente aceptables.

Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones pueden generarse a partir de diversos componentes que incluyen, pero sin limitacion, llquidos previamente formados, solidos auto emulsionantes y semisolidos auto emulsionantes.

Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion, que pueden presentarse convenientemente en forma farmaceutica unitaria individual, pueden prepararse de acuerdo con tecnicas convencionales bien conocidas en la industria farmaceutica. Dichas tecnicas incluyen la etapa de asociar los principios activos con el transportador (transportadores) o excipiente (o excipientes) farmaceutico. En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e Intima los principios activos con transportadores llquidos o transportadores solidos finamente divididos o ambos, y despues, si fuera necesario, dando forma al producto.

Las composiciones de la presente invencion pueden formularse en cualquiera de las muchas formas farmaceuticas posibles, tales como, pero sin limitacion, comprimidos, capsulas, jarabes llquidos, geles suaves, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente invencion tambien pueden formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener adicionalmente sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension, incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa sodica, sorbitol y/o dextrano. La suspension tambien puede contener estabilizantes.

En una realization de la presente invencion las composiciones farmaceuticas pueden formularse y usarse como espumas. Las espumas farmaceuticas incluyen formulaciones tales como, pero sin limitacion, emulsiones, microemulsiones, cremas, gelatinas y liposomas. Aunque basicamente son similares en su naturaleza, estas formulaciones varlan en los componentes y consistencia del producto final.

Los agentes que potencian la captation de oligonucleotidos a nivel celular tambien pueden anadirse a las composiciones farmaceuticas y a otras composiciones de la presente invencion. Por ejemplo, llpidos cationicos, tales como lipofectina (Patente de Estados Unidos N° 5.705.188), derivados de glicerol cationico y moleculas policationicas, tales como polilisina (documento WO 97/30731), tambien potencian la captacion celular de los oligonucleotidos.

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Las composiciones de la presente invencion pueden contener adicionalmente otros componentes asociados convencionalmente encontrados en las composiciones farmaceuticas. Por tanto, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales adicionales compatibles farmaceuticamente activos, tales como, por ejemplo, antiprurlticos, astringentes, anestesicos locales o agentes antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales utiles para formular flsicamente diversas formas farmaceuticas de las composiciones de la presente invencion, tales como colorantes, agentes saporlferos, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes y estabilizantes. Sin embargo, cuando dichos materiales se anaden, no deben interferir indebidamente con las actividades biologicas de los componentes de las composiciones de la presente invencion. Las formulaciones pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales, para influir en la presion osmotica, tampones, colorantes, soporlferos y/o sustancias aromaticas y similares que no interaccionan perjudicialmente con el acido nucleico (o acidos nucleicos) de la formulacion.

La presente divulgacion proporciona una composicion farmaceutica que comprende (a) uno o mas de los agentes terapeuticos descritos en el presente documento y (b) un segundo agente anticanceroso. En determinadas realizaciones, el segundo agente anticanceroso es un agente quimioterapeutico. Determinadas realizaciones de la divulgacion proporcionan composiciones farmaceuticas que contienen (a) uno o mas compuestos que modulan la actividad de un marcador de cancer de celulas madre (por ejemplo, un anticuerpo, una molecula pequena, un ARNip, una molecula antisentido, etc.) y (b) uno o mas agentes quimioterapeuticos distintos.

Los ejemplos de dichos agentes quimioterapeuticos incluyen, pero sin limitation, farmacos contra el cancer, tales como daunorrubicina, dactinomicina, doxorrubicina, bleomicina, mitomicina, mostaza de nitrogeno, clorambucilo, melfalan, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina (CA), 5-fluorouracilo (5-FU), floxuridina (5- FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, vincristina, vinblastina, etoposido, teniposido, cisplatino y dietilstilbestrol (DES). En determinadas realizaciones, el agente quimoterapeutico es irinotecan o paclitaxel. Los farmacos antiinflamatorios, incluyendo, pero sin limitacion, farmacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, y grupos antivirales, incluyendo pero sin limitacion ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, tambien pueden combinarse en las composiciones de la invencion. Otros agentes quimioterapeuticos tambien se encuentran dentro del ambito de la presente divulgacion.

Dos o mas compuestos combinados pueden usarse conjunta o secuencialmente.

La dosificacion depende de la gravedad y respuesta de la patologla a tratar, durando el ciclo del tratamiento de varios dlas a varios meses, o hasta que se efectue una curacion o una disminucion de la patologla (por ejemplo, una reduction del tamano del tumor). Las pautas de dosificacion optimas pueden calcularse a partir de mediciones de la acumulacion de farmacos en el organismo del paciente. El medico administrador puede determinar facilmente las posologlas optimas, las metodologlas de dosificacion y las tasas de repetition. Las pautas optimas pueden variar dependiendo de la fuerza relativa de los oligonucleotidos individuales, y generalmente pueden calcularse basandose en los valores de CE50 que se encuentra que son eficaces en modelos animales in vitro e in vivo o en base a los ejemplos descritos en el presente documento. En general, la pauta es de 0,01 mg a 100 g por kg de peso corporal, y puede darse una o mas veces al dla, a la semana, al mes o al ano. El medico tratante puede estimar las tasas de repeticion para la dosificacion basandose en los tiempos de residencia medidos y en las concentraciones del farmaco en los tejidos o fluidos corporales. Despues de un tratamiento satisfactorio, puede ser conveniente tener al sujeto bajo terapia de mantenimiento para impedir la recurrencia de la patologla, en la que el oligonucleotido se administra a dosis de mantenimiento, que varlan de 0,01 mg a 100 g por kg por peso corporal, de una o mas veces al dla a una vez cada 20 anos.

La divulgacion proporciona metodos de tratamiento de cancer que comprenden administrar a un sujeto (por ejemplo, un ser humano), uno o mas de los agentes terapeuticos descritos en el presente documento. En determinas realizaciones, el cancer implica celulas madre cancerosas. En determinas realizaciones, el cancer tratado es cancer de mama o cancer de colon.

En algunas realizaciones, el sujeto tratado con los metodos descritos en el presente documento tiene un tumor solido. En algunas realizaciones, el sujeto tratado con los metodos descritos en el presente documento ha tenido un tumor solido que se ha extirpado. En determinadas realizaciones, el tumor comprende celulas madre de tumor solido. En determinadas realizaciones, el tumor es un tumor que sobreexpresa LGR5 (con respecto a celulas normales del mismo tipo de tejido). En determinadas realizaciones, el tumor no sobreexpresa de manera significativa una protelna Wnt con respecto al tejido normal, y por tanto, el tumor presenta expresion normal de Wnt. En algunas realizaciones alternativas, el tumor sobreexpresa al menos una protelna Wnt.

En determinadas realizaciones, antes de la administration del agente terapeutico, se examina al sujeto que tiene un tumor para identificar si el tumor sobreexpresa LGR5 o si comprende celulas madre cancerosas que sobreexpresan LGR5.

La divulgacion proporciona un metodo de tratamiento de cancer o de inhibition del crecimiento de un tumor en un ser humano, que comprende administrar al ser humano de una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente que

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(a) altera la union de una protelna R-espondina (RSPO) humana y un receptor acoplado a protelna G que contiene repeticiones ricas en leucina (LGR); y/o (b) altera la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO.

La divulgacion tambien proporciona un metodo de tratamiento de cancer o de inhibicion del crecimiento tumoral inhibiendo la senalizacion de la beta catenina en una celula tumoral, que comprende poner en contacto dicha celula tumoral con un agente que (a) altera la union de una protelna R-espondina (RSPO) humana y un receptor acoplado a protelna G que contiene repeticiones ricas en leucina humana (LGR); y/o (b) altera la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO. En determinadas realizaciones, el metodo es un metodo in vivo. En realizaciones alternativas, el metodo es un metodo in vitro.

En determinadas realizaciones, la presente divulgacion proporciona un metodo de tratamiento de cancer (por ejemplo, un cancer que comprende celulas madre cancerosas), comprendiendo el metodo administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo que se une especlficamente a una protelna R-espondina (RSPO) humana. En determinadas realizaciones, la protelna RSPO humana es RSPO1. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En determinadas realizaciones, la presente divulgacion proporciona un metodo para inhibir el crecimiento tumoral, comprendiendo el metodo administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo que se une especlficamente a una protelna R-espondina (RSPO) humana. En determinadas realizaciones, la protelna RSPO humana es RSPO1. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En determinadas realizaciones, el tumor es un tumor que comprende celulas madre de tumor solido. En determinadas realizaciones, el anticuerpo altera la union de la protelna RSPO humana con una protelna LGR humana. En determinadas realizaciones alternativas, el anticuerpo altera la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO y/o altera la senalizacion de la beta catenina.

En determinadas realizaciones, la presente divulgacion proporciona un metodo de tratamiento del cancer que comprende celulas madre de cancer, comprendiendo el metodo administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo que se une especlficamente a un dominio extracelular de una protelna LGR humana. En determinadas realizaciones, el dominio extracelular comprende los aminoacidos 22-564 de la LGR5 humana (SEC ID N°: 1). En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano.

En determinadas realizaciones, la presente divulgacion proporciona un metodo para inhibir el crecimiento tumoral, comprendiendo el metodo administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo que se une especlficamente a una protelna LGR humana. En determinadas realizaciones, la protelna LGR humana es LGR5. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En determinadas realizaciones, el tumor es un tumor que comprende celulas madre de tumor solido. En determinadas realizaciones, el anticuerpo altera la union de una protelna RSPO humana con la protelna LGR humana. En determinadas realizaciones alternativas, el anticuerpo altera la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO y/o altera la senalizacion de la beta catenina.

En determinadas realizaciones, la presente divulgacion proporciona un metodo de tratamiento de cancer que comprende celulas madre de cancer, comprendiendo el metodo administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un receptor soluble que comprende un dominio extracelular de la LGR5 humana. En determinadas realizaciones, el domino extracelular comprende los aminoacidos 22-564 de la LGR5 humana (SEC ID N°: 1). En determinadas realizaciones, el dominio extracelular de la LGR5 humana esta unido en fase a una secuencia de protelna no-LGR. En determinadas realizaciones, la protelna no-LGR es un Fc humano.

La divulgacion proporciona adicionalmente metodos para inhibir la proliferacion de celulas madre cancerosas y/o disminuir el numero o la proporcion de celulas madre cancerosas en un sujeto que comprende administrar al sujeto uno o mas de los agentes terapeuticos descritos en el presente documento, incluyendo, pero sin limitacion, anticuerpos anti-LGR y anti-RSPO.

En determinadas realizaciones, los metodos comprenden la administracion de un agente terapeutico a un sujeto que comprende adicionalmente la administracion de un segundo agente anticanceroso al sujeto. El agente terapeutico y el segundo agente anticanceroso pueden administrarse al mismo tiempo (simultaneamente) o a diferentes tiempos (por ejemplo, secuencialmente). En determinadas realizaciones, los dos agentes se administran al sujeto como parte de la misma composition. En determinadas realizaciones, el agente terapeutico se administra al sujeto en una composition, mientras que el segundo agente anticanceroso se administra al sujeto en una segunda composicion.

En determinadas realizaciones, los sujetos son mamlferos. En determinadas realizaciones, los sujetos a los cuales se administran los agentes terapeuticos son seres humanos.

La presente divulgacion proporciona adicionalmente kits y artlculos de fabrication que comprenden tanto un agente terapeutico descrito en el presente documento, as! como un segundo agente anticanceroso. En determinadas realizaciones el segundo agente anticanceroso es un agente quimioterapeutico.

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Animales transgenicos que expresan genes marcadores de cancer

La presente divulgacion contempla la generacion de animales transgenicos que comprenden un gen marcador de cancer exogeno de la presente divulgacion o mutantes y variantes de los mismos (por ejemplo, truncamientos o polimorfismos de un solo nucleotido) o knock-outs (genosuprimidos) de los mismos. En algunas realizaciones, el animal transgenico presenta un fenotipo alterado (por ejemplo la presencia aumentada o disminuida de marcadores) en comparacion con animales de tipo silvestre (no mutados). Los metodos para analizar la presencia o ausencia de dichos fenotipos incluyen, pero sin limitacion, los desvelados en el presente documento. En algunas realizaciones, los animales transgenicos presentan adicionalmente un crecimiento aumentado o disminuido de tumores o indicios de cancer.

Los animales transgenicos de la presente divulgacion encuentran uso en cribado de farmacos (por ejemplo, terapia contra el cancer). En algunas realizaciones, los compuestos de ensayo (por ejemplo, un farmaco que se sospecha que es util para tratar el cancer) y los compuestos de control (por ejemplo, un placebo) se administran a los animales transgenicos y a los animales de control y se evaluan los efectos.

Los animales transgenicos pueden generarse mediante diversos metodos. En algunas realizaciones, se usan celulas embrionarias en varias fases de desarrollo para introducir transgenes para la produccion de animales transgenicos. Dependiendo de la fase de desarrollo de la celula embrionaria se usan diferentes metodos. El cigoto es la mejor diana para la microinyeccion. En el raton, el pronucleo del macho alcanza un tamano de aproximadamente 20 micras de diametro lo que permite realizar una inyeccion reproducible de 1-2 picolitros (pl) de solucion de ADN. El uso de cigotos como una diana para la transferencia genica tiene la ventaja principal de que en la mayorla de los casos el ADN inyectado se incorporara en el genoma del hospedador antes de la primera escision (Brinster et al.,

1985, PNAS 82: 4438-4442). Como consecuencia, todas las celulas del animal no humano transgenico llevaran el transgen incorporado. Esto tambien se reflejara en general, en la transmision eficaz del transgen a la descendencia del fundador ya que el 50 % de las celulas germinales llevaran el transgen. La Patente de Estados Unidos N° 4.873.191 describe un metodo para la microinyeccion de cigotos.

En otras realizaciones, para introducir transgenes en un animal no humano se usa infeccion retroviral. En algunas realizaciones, el vector retroviral se utiliza para transfectar oocitos inyectando el vector retroviral en el espacio perivitelino del oocito (Patente de Estados Unidos N° 6.080.912).

En otras realizaciones, el embrion no humano en desarrollo puede cultivarse in vitro en la fase de blastocisto. Durante este tiempo, los blastomeros pueden ser dianas para la inyeccion retroviral (Janenich, 1976, PNAS 73: 1260). La infeccion eficaz de los blastomeros se obtiene por tratamiento enzimatico para retirar la zona pelucida (Hogan et al., in Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. [1986]). El sistema de vector viral usado para introducir el transgen es normalmente un retrovirus con replicacion defectuosa que lleva el transgen (Jahner et al., 1985, PNAS 82: 6927). La transfeccion se obtiene de un modo sencillo y eficaz cultivando los blastomeros en una monocapa de celulas productoras de virus (Stewart, et al., 1987, EMBO J., 6: 383).

Como alternativa, la infeccion puede realizarse en una fase tardla. El virus o las celulas productoras de virus, pueden inyectarse en el blastocele (Jahner et al., 1982, Nature 298: 623). La mayorla de los fundadores seran mosaicos para el transgen dado que la incorporacion solo se produce en un subconjunto de celulas que forma el animal transgenico. Ademas, el fundador puede contener diversas inserciones retrovirales del transgen en diferentes posiciones en el genoma que generalmente se segregaran en la descendencia. Ademas, tambien es posible introducir transgenes en la llnea germinal, aunque con baja eficiencia, por infeccion retroviral intrauterina del embrion a la mitad de la gestacion (Jahner et al., citado anteriormente [1982]). Medios adicionales del uso de retrovirus o vectores retrovirales para crear animales transgenicos conocidos en la tecnica implican la microinyeccion de partlculas retrovirales o celulas tratadas con mitomicina C que producen retrovirus en el espacio perivitelino de huevos fertilizados o embriones tempranos (Solicitud Internacional PCT WO 90/08832 [1990], y Haskell y Bowen, 1995, Mol. Reprod. Dev., 40: 386).

En otras realizaciones, el transgen se introduce en celulas madre embrionarias y las celulas madre transfectadas se utilizan para formar un embrion. Las celulas ME se obtienen cultivando embriones preimplantados in vitro en condiciones apropiadas (Evans et al., 1981, Nature 292: 154; Bradley et al., 1984, Nature 309: 255; Gossler et al.,

1986, PNAS 83: 9065; y Robertson et al., 1986, Nature 322: 445). Los transgenes pueden introducirse eficazmente en las celulas ME mediante transfeccion de ADN mediante diversos metodos conocidos en la tecnica incluyendo co- precipitacion con fosfato de calcio, fusion de protoplastos o esferoplastos, lipofeccion y transfeccion mediada con DEAE dextrano. Los transgenes tambien pueden introducirse en celulas ME mediante transduccion mediada por retrovirus o por microinyeccion. Dichas celulas ME transfectadas pueden despues colonizar un embrion tras su introduccion en el blastocele de un embrion en fase blastocisto y contribuir a la llnea germinal del animal quimerico resultante (para una revision, vease, Jaenisch, Science, 1988, 240: 1468). Antes de la introduccion de las celulas ME transfectadas en el blastocele, las celulas ME transfectadas pueden someterse a diversos protocolos de seleccion para enriquecer celulas ME que tienen integrado el transgen suponiendo que el transgen proporcione un medio para dicha seleccion. Como alternativa, puede usarse la reaccion en cadena de la polimerasa para cribar las

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celulas ME que tengan integrado el transgen. Esta tecnica obvia la necesidad del crecimiento de las celulas ME transfectadas en condiciones selectivas apropiadas antes de transferir en el blastocele.

En otras realizaciones mas, se utiliza la recombinacion homologa para funcionar como genes knock-out o crear mutantes de delecion (por ejemplo, mutantes de truncamiento). En la Patente de Estados Unidos N° 5.614.396 se describen metodos de recombinacion homologa.

EXPERIMENTOS

Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar y adicionalmente ilustrar diversas realizaciones y aspectos de la presente invencion y no deben considerarse como limitantes del alcance de la misma.

Ejemplo 1

LGR5 se sobreexpresa en celulas madre cancerosas en relacion con celulas tumorales no tumorigenicas

Recientemente se ha demostrado que los tumores de mama humanos neoplasicos albergan una pequena poblacion, distinta, de celulas madre cancerosas, que estan enriquecidas por la capacidad para formar tumores en ratones inmunodeficientes. Se descubrio que una poblacion de celulas ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin- estaba 50 veces enriquecida para celulas tumorales de mama tumorigenicas en comparacion con las celulas tumorales no fraccionadas (Al-Hajj et al., 2003, PNAS 100: 3983-8). Una poblacion similar de celulas madre cancerosas ESA+ CD44+ se ha identificado en canceres de colon (Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 11/591.019). Un analisis de micromatriz de celulas madre cancerosas tumorigenicas seleccionadas por FACS en comparacion con celulas tumorales no tumorigenicas ha revelado diversos marcadores de celulas madre cancerosas regulados positivamente en celulas madre cancerosas en relacion con celulas tumorales no tumorigenicas (Solicitudes de Patente de Estados Unidos Nos 10/864.207 y 11/050.282).

Estos datos de micromatriz tambien revelaron que LGR5 se sobreexpresaba en celulas madre de cancer de colon en comparacion con celulas tumorales no tumorigenicas (Fig. 1). Se aislaron celulas madre de cancer de colon tumorigenicas (TG) de celulas tumorales en conjunto basandose en los marcadores de superficie celular usando FACS. Especlficamente, las celulas se contaron, se lavaron dos veces con HBSS que contenla suero de ternero termoinactivado (HICS) al 2 % y HEPES 25 mM y se resuspendieron a 106 celulas por 100 ul. Las celulas tumorales se incubaron con anticuerpos de rata anti-CD3, CD4, CD8, Ter119, Mac1 y Gr1 de raton conjugados con una perla magnetica y se procesaron sobre una columna magnetica para retirar las celulas hematopoyeticas de raton. Despues, las celulas tumorales se incubaron con un anticuerpo de cabra anti-rata conjugado con Cy5.5-PE y con el colorante de viabilidad, yoduro de propidio, para detectar y retirar las restantes celulas hematopoyeticas de raton y las celulas muertas, respectivamente. Despues de bloquear, las celulas se incubaron adicionalmente con anticuerpos conjugados con fluorescencia contra celulas H-2Kd de raton, ESA (Miltenyi Biotec; Auburn, CA) y CD44 (Bioscience, San Diego, CA) humanos, para retirar celulas de raton y seleccionar positivamente celulas tumorales humanas que expresaban ESA y CD44. Se realizo citometrla de flujo en un FACSAria (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) con el uso de perfiles de dispersion lateral y de dispersion directa para seleccionar celulas sencillas. Primero, se excluyeron celulas positivas a yoduro de propidio y Cy5.5-PE+ y se aislo una fraccion de celulas ESA+44+ independientemente de una fraccion de celulas tumorales no-ESA+44+.

Para identificar marcadores para celulas madre de cancer de colon frente a celulas tumorales no tumorigenicas se utilizo analisis de micromatriz. Se aislo ARN total de celulas madre cancerosas tumorigenicas separadas por FACS y celulas de tumor solido no tumorigenicas usando RNasy (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se prepararon sondas para analisis de micromatriz y se hibridaron con microplacas genicas HG-U133 de Affymetrix de acuerdo con los protocolos de Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, CA). Las matrices se escanearon con un microscopio confocal laser ion-argon y la intensidad de cada conjunto de sondas en la matriz se evaluo con un programa informatico de Affymetrix Microarray Version 4.0 de acuerdo con los procedimientos de Affymetrix. Los analisis de micromatriz de tres canceres de colon diferentes (C4, C6 y C9) revelaron la sobreexpresion de LGR5 en celulas madre de tumor solido tumorigenicas en comparacion con celulas de tumor solido no tumorigenicas (Fig. 1).

Los analisis de micromatriz usando ARNm aislado de tumores y correspondiente tejido normal de una gran cantidad de pacientes humanos (GeneLogic BioExpress Datasuite) revelaron adicionalmente expresion aumentada de LGR5 as! como LGR6 en tumores humanos de origen epitelial. La expresion de LGR5 en muestras de pacientes individuales de una amplia serie de tumores epiteliales se comparo con la expresion en epitelios de organos normales. LGR5 en la microplaca HG-U133_Plus_2, fragmentolD(MicroplacalD) 244395(51), mostro expresion aumentada en la mayorla de los tumores pero especialmente en tumores de colon, hlgado, ovario y pulmon (Fig. 2). De manera similar, LGR6 sobre la microplaca HG-U133_Plus_2, fragmentolD(MicroplacalD) 258288(51), mostro expresion alterada en la mayorla de los tumores epiteliales (Fig. 3).

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Ejemplo 2

RSPO1 activa la serialization de la beta catenina mediante LGR5

Este ejemplo describe la activation de la senalizacion de la beta catenina por RSPO1 mediante LGR5.

En determinadas realizaciones, un ensayo con el indicador de luciferasa 8xTCF demostro que la RSPO1 activaba la expresion de un promotor sensible a la beta catenina. Se genero una construction RSPO1-Fc usando tecnicas convencionales de ADN recombinante. Especlficamente, la RSPO1 humana de longitud completa, se ligo en fase con la Fc humana y la protelna RSPO1-Fc recombinante se expreso en celulas de insecto usando baculovirus. Despues, la RSPO1-Fc recombinante se purifico del medio de insecto acondicionado usando cromatografla con protelna A. Celulas HEK 293 transfectadas de manera estable con un indicador de luciferasa 8xTCF se expusieron a RSPO1-Fc a concentraciones en aumento gradualmente, durante un total de doce horas. Las celulas indicadoras mostraron una actividad luciferasa mas grande en respuesta a concentraciones en aumento de RSPO 1 (Fig. 4).

Se evaluo el efecto de la LGR5 soluble sobre la activacion de RSPO1 del promotor sensible a la beta catenina 8xTCF (Fig. 5). Se genero una construccion de LGR5-Fc soluble usando tecnicas convencionales de ADN recombinante. Especlficamente, los aminoacidos 1 a 564 de la LGR5 humana se ligaron en fase con la Fc humana y la LGR5-Fc recombinante se expreso en celulas de insecto usando baculovirus. La escision de la secuencia senal de LGR5 dio como resultado una protelna de fusion madura LGR5-Fc que contenla los aminoacidos 22-564 de LGR5. Las celulas HEK 293 transfectadas de manera estable con una construccion indicadora de luciferasa 8xTCF se cultivaron en placas de 96 pocillos y se expusieron a cualquiera de: medio de control; RSPO1-Fc 2,5 ug; o RSPO1-Fc en combination con concentraciones en aumento de LGR5-Fc soluble durante 24 horas. La LGR5 soluble inhibio la activacion de RSPO1 de la actividad luciferasa mediante el promotor sensible a la beta catenina.

La LGR5 soluble tambien inhibe especlficamente la activacion sinergica de la senalizacion de la beta catenina por RSPO1 y Wnt3B. Se cultivaron celulas HEK 293 transfectadas de manera estable con una construccion indicadora de luciferasa 8xTCF en placas de 96 pocillos y se expusieron a cualquiera de: medio de control (LCM, medio acondicionado de celulas L); RSPO1-Fc 2,5 ug en LCM; Wnt3A (Wnt 3A que contenla medio acondicionado de celulas L); o una combinacion de RSPO1-Fc y Wnt3A junto con concentraciones en aumento de LGR5-Fc soluble (Fig. 6A) o FZD10-Fc soluble (Fig. 6B) durante 24 horas. La RSPO1 y Wnt3A actuaban sinergicamente activando la actividad luciferasa del promotor de la beta catenina y la LGR5 soluble inhibla esta activacion (Fig. 6A). Por otro lado, la FZD10 soluble no tenia ningun efecto (Fig. 6B).

Para determinar el mecanismo mediante el cual la RSPO1 activa la senalizacion de la beta catenina, se uso analisis FACS para evaluar la union entre RSPO1 y LGR5. En determinadas realizaciones, se determino la union entre la LGR5 soluble y la RSPO1 de superficie celular. La proteina RSPO1 de superficie celular se genero ligando la RSPO1 humana de longitud completa con el dominio transmembrana de CD4 usando tecnicas convencionales de ADN recombinante (RSPO1-CD4TM). Las celulas HEK 293 se transfectaron de manera transitoria con RSPO1- CD4TM y GFP. Despues de 48 horas, las celulas se suspendieron en PBS enfriado con hielo que contenia FCS al 2 % y despues se incubaron en hielo en presencia de LGR5-Fc, LRP6-ECD-Fc (que contenia el dominio extracelular de la LRP6 humana fusionado a un dominio Fc), LRP6E1-2-Fc (que contenia los aminoacidos 1-629 de la LRP6 humana fusionado a un dominio Fc), o de diversas construcciones de FZD-Fc, incluyendo FZD1-10. Las celulas transfectadas con RSPO1 interaccionaron con LGR5 pero no interaccionaron con ninguna de las construcciones de FZD (Fig. 7A). Solamente se detecto una interaction debil entre RSPO1 y el correceptor WNT LRP6.

En determinadas realizaciones, se determino la union entre la RSPO1 soluble y la LGR5 de superficie celular. Se genero una proteina LGR5 de superficie celular variante ligando los aminoacidos 22-564 de LGR5 a una etiqueta FLAG N terminal y al dominio transmembrana de CD4 usando tecnicas convencionales de ADN recombinante (FLAG-LGR5-CD4TM). Celulas HEK 293 se transfectaron de manera transitoria con FLAG-LGR5-CD4TM y GFP. Despues de 48 horas, las celulas se suspendieron en PBS enfriado con hielo que contenia FCS al 2 % y heparina y despues se incubaron en hielo en presencia de RSPO1-Fc, FZD8-Fc o un anticuerpo FLAG como control positivo. La RSPO1 soluble interacciona con celulas transfectadas con LGR5 pero la FZD8 no lo hizo (Fig. 7B).

Para determinar si otros miembros de la familia RSPO tambien podian unirse a LGR5 se realizaron estudios adicionales examinando la interaccion de cada miembro de la familia RSPO con LGR5. Celulas HEK 293 se trasfectaron de manera transitoria con FLAG-LGR5-CD4TM y GFP. Despues de 48 horas, las celulas se suspendieron en PBS enfriado con hielo que contenia heparina FCS al 2 % y despues se incubaron en hielo en presencia de RSPO1-Fc, RSPO2-Fc, RSPO3-Fc, RSPO4-Fc, FZD8-Fc, como se indica (Fig. 7C) o con un anticuerpo FLAG como un control positivo. Cada miembro de la familia RSPO interacciono con las celulas transfectadas con LGR5.

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Ejemplo 3

Generation de anticuerpos anti-RSPOl o anti-LGR5

El ejemplo 2 identifica una ruta alternativa a la activation de la beta catenina mediante RSPO1 y LGR5. Por lo tanto, el bloqueo de la interaction entre las protelnas RSPO y LGR podrla alterar la sobreactivacion de la serialization de la beta catenina asociada con la tumorigenicidad. En determinadas realizaciones, los anticuerpos contra una protelna RSPO actuan como un agente terapeutico contra el cancer alterando la senalizacion de LGR. En determinadas realizaciones, los anticuerpos contra RSPO1 alteran la interaction entre RSPO1 y LGR5. En determinadas realizaciones, los anticuerpos contra una protelna LGR actuan como un agente terapeutico contra el cancer alterando la senalizacion de LGR. En determinadas realizaciones, los anticuerpos contra LGR5 alteran la interaction entre RSPO1 y LGR5.

Este ejemplo describe la generation de anticuerpos contra RSPO1 y LGR5. Para generar anticuerpos contra RSPO2, RSPO3, RSPO4, LGR4 y LGR6 se usaron tecnicas similares.

Production de antlgenos

En determinadas realizaciones, como antlgenos para la production de anticuerpos, se generaron fragmentos de protelna, parciales o de longitud completa, recombinantes, de la RSPO1 humana o un dominio extracelular de la LGR5 humana. Para aislar los polinucleotidos que codifican la RSPO1 o la LGR5 se uso tecnologla de ADN recombinante convencional. Estos polinucleotidos se ligaron despues en fase con la secuencia de etiqueta de protelna, incluyendo, por ejemplo, una Fc humana, una etiqueta de histidina, una etiqueta FLAG u otra etiqueta de protelna adecuada y se clonaron en un vector plasmldico de transferencia para la expresion mediada por baculovirus en celulas de insecto. Despues, se usaron protocolos de transfection, infection y cultivo celular convencionales para producir celulas de insecto recombinantes que expresaban los correspondientes polipeptidos RSPO1 y LGR5 (O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)). La protelna antigenica se purifico de los lisados de celulas de insecto usando cromatografla de afinidad. La protelna antigenica purificada se dializo frente a PBS (pH=7), se concentro a aproximadamente 1 mg/ml, y se esterilizo por filtration en preparaciones para la inmunizacion.

Inmunizacion

Usando tecnicas convencionales, se inmunizaron ratones (n=3) con la protelna antigenica RSPO1 o LGR5 purificada (Antibody Solutions; Mountain View, CA). La sangre de ratones individuales se cribo aproximadamente 70 dlas despues de la inmunizacion inicial para el reconocimiento antigenico usando analisis ELISA y FACS. Se seleccionaron los dos animales que tenlan las titulaciones mas elevadas para el refuerzo antigenico final despues de lo cual se aislaron esplenocitos para la production de hibridomas. Las celulas de hibridoma se sembraron a 1 celula por pocillo en placas de 96 pocillos y el sobrenadante de cada pocillo se cribo mediante analisis ELISA y FACS frente a la protelna antigenica. Se seleccionaron diversos hibridomas con alta titulacion de anticuerpos y se aumentaron a escala en un cultivo en matraz estatico. Los anticuerpos se purificaron del sobrenadante del hibridomas usando cromatografla de agarosa con protelna G o protelna A y los anticuerpos se ensayaron por FACS para separar las celulas que expresaban RSPO 1 o LGR5.

Analisis FACS

Para seleccionar anticuerpos monoclonales producidos por clones de hibridoma que reconocen la protelna LGR5 de superficie celular nativa o la RSPO1 nativa, se usaron analisis FACS. En un ejemplo, para facilitar la cribado de celulas por FACS, se conjugaron, un anticuerpo IgG1k de raton de control de isotipo, un anti-RSPO1 y anticuerpos monoclonales anti-LGR5, con Alexa Fluor™ 647 (AF647) usando el kit de Invitrogen N° A-20186. Las celulas HEK 293 se cotransfectaron transitoriamente con vectores de expresion que codificaban una construction RSPO1 o LGR5 asociada a celulas y GFP. Despues de 24 a 48 horas de transfection las celulas se recogieron en suspension y se incubaron en hielo con anticuerpos anti-RSPO1 o anti-LGR5 en comparacion con los anticuerpos IgG1 de control para detectar la union de fondo del anticuerpo. Las celulas se lavaron y despues se separaron por FACS para identificar la union de los anticuerpos a las RSPO1 o LGR5 expresadas en superficie, respectivamente.

En un experimento, se seleccionaron anticuerpos monoclonales producidos por clones de hibridoma que reconocen la protelna LGR5 de superficie celular nativa usando analisis FACs. Se cotransfectaron celulas HEK 293 de manera transitoria con vectores de expresion que codificaban una construction de LGR5 asociada a celulas (FLAG-LGR5- CD4TM) y a GFP. Despues de 24 a 48 horas de transfection, las celulas se recogieron en suspension y se incubaron en hielo co un anticuerpo irrelevante como un control negativo (control IgG1) o con un anticuerpo antiFLAG como control positivo para la expresion de LGR5 o con los mAb contra LGR5 (88M1, 88M5), seguido de incubation con reactivo secundario anti-mAb fluorescente conjugado con PE. Las celulas se lavaron y despues se separaron por FACS para identificar la union de los anticuerpos a la LGR5 expresada en la superficie, respectivamente. De esta manera se identificaron anticuerpos contra LGR5 (Figura 8). Se encontro que los anticuerpos monoclonales, 88M1 y 88M5, presentaban union especlfica a LGR5. Ademas, puede usarse analisis

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FACS para seleccionar anticuerpos que alteran la interaccion entre una protelna RSPO y una protelna LGR (por ejemplo LGR5). Por ejemplo, se puede medir la union de una RSPO a LGR5 mediante citometrla de flujo en presencia o en ausencia de un anticuerpo contra RSPO o LGR5.

Como se muestra (Figura 9), el anticuerpo monoclonal 88M1 se identifico como un anticuerpo anti-LGR5 que inhibe la union de RSPO a LGR5. Se transfectaron celulas HEK 293 de manera transitoria con FLAG-LGR5-CD4TM y GFP. La union de la protelna de fusion RSPO1-Fc con celulas transfectadas se detecto por incubacion con anti Fc humano conjugado con PE. El impacto del anticuerpo anti LGR5, 88M1, sobre la union de RSPO1-Fc se evaluo mediante incubacion de las celulas transfectadas con 88M1 como se indica y analisis con citometrla de flujo. El experimento muestra que el anticuerpo 88M1 redujo la union de RSPO1-Fc a lGR5 en las celulas transfectadas.

Anticuerpos quimericos

Despues de identificar anticuerpos monoclonales que reconocen especlficamente cualquiera de RSPO1 y LGR5, estos anticuerpos se modificaron para superar la respuesta inmunitaria de anticuerpos humanos anti raton (HAMA, Human Anti-mouse Antibodies) cuando se usan anticuerpos de roedores como agentes terapeuticos. Las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal seleccionado, se aislaron de celulas de hibridoma mediante RT-PCR y se ligaron en fase con las regiones constantes de la cadena pesada y cadena ligera kappa de la IgG1, respectivamente, en vectores de expresion de mamlferos. Como alternativa, se uso un vector de expresion de Ig humana, tal como TCAE 5.3, que contenla los genes de la region constante de cadena ligera kappa y de cadena pesada de la IgG1 humana en el mismo plasmido (Preston et al., 1998, Infection & Immunity 66: 4137-42). Los vectores de expresion que codifican las cadenas pesada y ligera quimericas se cotransfectaron despues en celulas de ovario de hamster Chino (CHO) para la produccion de anticuerpos quimericos. Se comparo la inmunorreactividad y la afinidad de los anticuerpos quimericos con la de los anticuerpos murinos parentales por ELISA y FACS.

Anticuerpos humanizados

Dado que los agentes terapeuticos de anticuerpos quimericos son todavla frecuentemente antigenicos, la produccion de una respuesta inmunitaria de anticuerpos humanos anti quimericos (HACA, Human Anti-chimeric Antibodies) contra RSPO1 o LGR5 puede requerir una humanizacion adicional. Para generar los anticuerpos humanizados las tres secuencias hipervariables cortas, o regiones determinantes de complementariedad (cDr), de los dominios variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo quimerico, descritos anteriormente, se modificaron por ingenierla genetica usando tecnologla de ADN recombinante en la region marco conservada del dominio variable de las secuencias de cadena ligera y pesada humana respectivamente y despues se clonaron en un vector de expresion de mamlfero para la expresion en celulas CHO. Se comparo la inmunorreactividad y afinidad de los anticuerpos humanizados con la de los anticuerpos quimericos parentales por ELISA y FACS. Adicionalmente, puede usarse mutagenesis dirigida o de alta densidad de la region variable para optimizar la especificidad, afinidad, etc. del anticuerpo humanizado.

Anticuerpos humanos

En realizaciones alternativas, los anticuerpos humanos que reconocen especlficamente la protelna RSPO1 o un dominio extracelular de LGR5 se alslan usando tecnologla de presentacion de fagos. Se cribo una biblioteca de anticuerpos sinteticos que contenla los dominios variables del anticuerpo humano (MorphoSys, Munich, Alemania) para el reconocimiento especlfico y de alta afinidad de un antlgeno descrito anteriormente. Los casetes de la CDR en la biblioteca se intercambiaron especlficamente mediante sitios de restriccion flanqueantes unicos para la optimizacion de los anticuerpos. Despues, las regiones variables humanas optimizadas se clonaron en un vector de expresion de Ig que contenla la cadena ligera kappa y la cadena pesada de la IgG1 humana para la expresion de anticuerpos humanos en celulas CHO.

Ejemplo 4

Prevencion in vivo del crecimiento tumoral direccionando RSPO1 y LGR5

Este ejemplo describe el uso de biomoleculas que se dirigen a RSPO1 y LGR5 para efectuar el crecimiento de celulas tumorales in vivo. En determinadas realizaciones, se usan anticuerpos contra RSPO1 para inhibir el crecimiento de celulas tumorales in vivo. En determinadas realizaciones, se usan anticuerpos contra RSPO1 para inhibir el crecimiento de celulas tumorales in vivo. En determinadas realizaciones, se usa un receptor de LGR5 soluble para inhibir el crecimiento de celulas tumorales in vivo. Similares tecnicas se usan con biomoleculas que se dirigen RSPO2, RSPO3, RSPO4, LGR4 y LGR6.

Las celulas tumorales de muestras de pacientes en las que se han realizado pases como un xenoinjerto en ratones se prepararon para inyeccion en animales experimentales. El tejido tumoral se extirpo en condiciones esteriles, se corto en pequenos trozos, se trituro completamente usando cuchillas esteriles y se obtuvieron suspensiones unicelulares por digestion enzimatica y alteracion mecanica. Los trozos tumorales resultantes se mezclaron con

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colagenasa III ultrapura en medio de cultivo (200-250 unidades de colagenasa por ml) y se incubaron a 37 °C durante 3-4 horas pipeteando hacia arriba y hacia abajo a traves de una pipeta de 10 ml cada 15-20 minutos. Las celulas digeridas se filtraron a traves de una malla de nylon de 42 ul, se lavaron con RPMI/FBS al 20 % y se lavaron dos veces con HBSS. Las celulas tumorales disociadas se inyectaron despues en ratones NOD/SCID a las 6-8 semanas para suscitar el crecimiento tumoral. En determinadas realizaciones, se inyectaron celulas de tumor mamario a una densidad de 50.000 celulas en 100 ul en el panlculo adiposo mamario derecho (n=10) junto con el implante de un granulo de estrogeno. En determinadas realizaciones, se inyectaron celulas tumorales de colon a una densidad de 50.000 celulas en 100 ul en la region del flanco del costado derecho (n=10).

En realizaciones alternativas, primero se separaron celulas tumorales disociadas en celulas tumorigenicas y no tumorogenicas basandose en marcadores de superficie celular antes de la inyeccion en animales experimentales. Especlficamente, se lavaron celulas tumorales disociadas, como se ha descrito anteriormente, dos veces con HBSS que contenla suero de ternero termoinactivado (HICS) al 2 % y se resuspendieron a 106 celulas por 100 ul. Se anadieron anticuerpos y las celulas se incubaron durante 20 minutos en hielo seguido de dos lavados con HBSS/HICS al 2 %. Los anticuerpos incluyen anti-ESA (Biomeda, Foster City, CA), anti-CD44, anti-CD24 y marcadores Lineage anti-CD2, -CD3, -CD10,-CD16, -CD18, -CD31, -CD64 y -CD140b (en su conjunto denominados Lin; PharMingen, San Jose, CA). Los anticuerpos se conjugaron directamente con fluorocromos para seleccionar de manera positiva o negativa celulas que expresaban estos marcadores. Las celulas de raton se eliminaron seleccionando contra celulas H2Kd+, y las celulas muertas se eliminaron usando el colorante de viabilidad 7AAD. Se realizo citometrla de flujo en un FACSVantage (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Se usaron perfiles de dispersion lateral y directa para eliminar cumulos celulares. Despues, las celulas ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin tumorigenicas se inyectaron por via subcutanea en ratones NOD/SCID para suscitar el crecimiento tumoral.

En determinadas realizaciones, se dejo que los tumores creciesen a aproximadamente 75 mm2 antes de comenzar el tratamiento. En determinadas realizaciones, el tratamiento comenzo dos dlas despues de las inyecciones celulares. En determinadas realizaciones, cada animal inyectado recibe 10 mg/kg de anticuerpos anti RSPO1 o control por via intraperitoneal (i.p.). En determinadas realizaciones, cada animal inyectado recibe 10 mg/kg de un anticuerpo anti LGR5 (por ejemplo, 88M1) o un anticuerpo de control. Los animales reciben el tratamiento con anticuerpos dos veces a la semana durante un total de 6 a 8 semanas, y el tamano del tumor se evalua dos veces por semana. Se espera que, en comparacion con los animales inyectados con control, los animales tratados con cualquiera de los anticuerpos anti-RSPO1 o anti-LGR5 muestren un crecimiento de celulas tumorales significativamente reducido. En determinadas realizaciones, cada animal inyectado recibe 10 mg/kg de una protelna LGR5 soluble (por ejemplo LGR5-Fc). Los animales reciben tratamiento con protelna LGR5-Fc dos veces por semana durante un total de 6 a 8 semanas, y el tamano tumoral se evalua dos veces por semana. Se espera que, en comparacion con los animales inyectados con control, los animales tratados con la protelna LGR5 muestren un crecimiento de celulas tumorales significativamente reducido.

Ejemplo 5

Tratamiento de canceres humanos alterando la senalizacion de LGR5

Este ejemplo describe metodos para el tratamiento del cancer en pacientes humanos usando biomoleculas que alteran la senalizacion de LGR5 funcional. En determinadas realizaciones, para inhibir el crecimiento de un tumor solido que comprende celulas madre de tumor solido se usan anticuerpos contra RSPO1. En determinadas realizaciones, se usan anticuerpos contra LGR5 se usan para inhibir el crecimiento de un tumor solido que comprende celulas madre de tumor solido. En determinadas realizaciones, se usa un receptor de LGR5 soluble para inhibir el crecimiento de un tumor solido que comprende celulas madre de tumor solido. Se usan tecnicas similares con biomoleculas que se dirigen a RSPO2, RSPo3, RSPO4, LGR4 y LGR6.

En determinadas realizaciones, la presencia de la expresion de un marcador de celulas madre cancerosas, se determina primero a partir de una biopsia tumoral. Las celulas tumorales de una biopsia de un paciente al que se ha diagnosticado cancer se extraen en condiciones esteriles. En determinadas realizaciones, la biopsia de tejido se congela fresca en nitrogeno llquido, embebida en O.C.T., y se corta en un criostato en secciones de 10 um en portaobjetos de vidrio. En determinadas realizaciones, la biopsia de tejido se fija en formalina, se embebe en parafina y se corta en un microtomo en una seccion de 10 um en portaobjetos de vidrio. Las secciones se incuban con los anticuerpos contra un marcador de celulas madre cancerosas tal como LGR5 para detectar la expresion de las protelnas. En determinadas realizaciones, la presencia de las celulas madre cancerosas, se determina por FACS. Las muestras de biopsia de tejido se cortan en pequenos trozos, se trocean completamente usando cuchillas esteriles y las celulas se someten a digestion enzimatica y a alteracion mecanica para obtener una suspension unicelular. Las celulas tumorales disociadas se incuban despues con anticuerpos anti-ESA y -CD44 y la presencia de celulas madre tumorales se determina mediante citometrla de flujo.

Los pacientes con cancer cuyos tumores se diagnostican ya que expresan un marcador de celulas madre cancerosas se tratan con una molecula que altera la senalizacion de LGR5 funcional. En determinadas realizaciones, la molecula comprende anticuerpos anti-RSPO1. En determinadas realizaciones, la molecula comprende anticuerpos anti-LGR5. Los anticuerpos monoclonales humanizados o humanos anti-RSPO1 o LGR5

generados como se describe anteriormente se purifican y se formulan con un transportador farmaceutico adecuado en PBS para inyeccion. En determinadas realizaciones, la molecula comprende una protelna LGR5 soluble. Los pacientes se tratan una vez a la semana durante al menos 10 semanas, pero en determinados casos una vez a la semana durante al menos 14 semanas. Cada administration debe ser una dosis farmaceuticamente eficaz de 5 aproximadamente 2 a aproximadamente 100 mg/ml y en determinados casos entre aproximadamente 5 a aproximadamente 40 mg/ml. El tratamiento puede administrarse antes, simultaneamente con, o despues de, reglmenes de radioterapia o quimioterapia usando uno o mas agentes quimioterapeuticos, tales como oxaliplatino, fluorouracilo, leucovorina o estreptozocina. Se supervisa a los pacientes para determinar si dicho tratamiento ha dado como resultado una respuesta antitumoral, por ejemplo, basandose en la regresion del tumor, reduction de las 10 incidencias de nuevos tumores, disminucion de la expresion antigenica tumoral, numeros disminucion de celulas madre cancerosas, u otros medios para evaluar el pronostico de la enfermedad.

Secuencias

15 ECD de LGR5 aminoacidos 22-564 (SEC ID N°: 1)

GSSPRSGVLLRGCPTHCHCEPDGRMLLRVDCSDLGLSELPSNLSVFTSYLDLSMNNISQLLPNPLPSLRFL EELRLAGNALTYIPKGAFTGLYSLKVLMLQNNQLRHVPTEALQNLRSLQSLRLDANHISYVPPSCFSGLHS LRHLWLDDNALTEI PVQAFRSLSAIiQAMTLALNKIHH IPDYAFGNLS S LWLHLHNNRIHSLGKKCFDGLH

sletldlnynnldefptairtlsnlkelgfhsnnirsipekafvgnpslitihfydnpiofvgrsafqhlf

ELRTLTLNGASQITEFPDLTGTANLESLTLTGAQISSLPQTVCNQLPNLQVLDLSYNLLEDLPSFSVCQKI QKIDLRHNBIYEIKVDTFQQLLSLRSLNLAWNKIAIIHPNAFSTLPSLIKLDLSSNLLSSFPITGLHGLTR LKLTGNHALOS LI SSENFPELKVIEMPYAYQCCAFGVCENAYKISNQWNKGDNSSMDDLHKKDAGMFQAQE ERDLEDFLLDFE EDLKALHS VQCS PS PGPFK PC EHLLDGWLIRIGV

Secuencia de ADN de RSPO1 humana (SEC ID N°: 2):

20

ATGCGGCTTGGG CTGTGTGTGGTGGC CCTGGTT CT GAG CTGGACGCACC TCACCAT C AGC

AGCCGGGGGATCAAGGGGAAAAGGCAGAGGCGGATCAGTGCCGAGGGGAGCCAGGCCTGT

GCCAAAGGCTGTGAGCTCTGCTCTGAAGTCAACGGCTGCCTCAAGTGCTCACCCAAGCTG

TTCATCCTGCTGGAGAGGAACGACATCGGCCAGGTGGGCGTCTGCTTGCCGTCCTGCCCA

CCTGGATACTTCGACGCCCGCAACCCCGACATGAACAAGTGCATCAAATGCAAGATCGAG

CACTGTGAGGCCTGCTTCAGCCATAACTTCTGCACCAAGTGTAAGGAGGGCTTGTACCTG

CACAAGGGCCGCTGCTATCCAGCTTGTCCCGAGGGCTCCTCAGCTGCCAATGGCACCATG

GAGTGCAGTAGTCCTGCGCAATGTGAAATGAGCGAGTGGTCTCCGTGGGGGCCCTGCTCC

aagaagcagcagctctgtggtttccggaggggctccgaggagcggacacgcagggtgcta

catgcccctgtgggggaccatgctgcctgctctgacaccaaggagacccggaggtgcaca

GTGAGGAGAGTGCCGTGTCCTGAGGGGCAGAAGAGGAGGAAGGGAGGCCAGGGCCGGCGG

GAGAATGCCAACAGGAACCTGGCCAGGAAGGAGAGCAAGGAGGCGGGTGCTGGCTCTCGA

AGACGCAAGGGGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAAGGGACAGTGGGGCCACTCACATCTGCA

GGGCCTGCCTAG

MRLGLCWALVLSWTHLTISSRGIKGKRQRRIS AEGSQACAKGCELCS EVNGCLKCS PKL FILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYL HKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVL HAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCPEGQKRRKGGQGRRENANRNLARKESKEAGAGSR RRKGQQQQQQQGTVGPLTSAG PA 5

Secuencia de ADN de la RSP02 humana (SEC ID N°: 4):

ATGCAGTTTCGCCTTTTCTCCTTTGCCCTCATCATTCTGAACTGCATGGATTACAGCCAC

TGCCAAGGCAACCGATGGAGACGCAGTAAGCGAGCTAGTTATGTATCAAATCCCATTTGC

AAGGGTTGTTTGTCTTGTTCAAAGGACAATGGGTGTAGCCGATGTCAACAGAAGTTGTTC

TTCTTCCTTCGAAGAGAAGGGATGCGCCAGTATGGAGAGTGCCTGCATTCCTGCCCATCC

GGGTACTATGGACACCGAGCCCCAGATATGAACAGATGTGCAAGATGCAGAATAGAAAAC

TGTGATTCTTGCTTTAGCAAAGACTTTTGTACCAAGTGCAAAGTAGGCTTTTATTTGCAT

AGAGGCCGTTGCTTTGATGAATGTCCAGATGGTTTTGCACCATTAGAAGAAACCATGGAA

TGTGTGGAAGGATGTGAAGTTGGTCATTGGAGCGAATGGGGAACTTGTAGCAGAAATAAT

CGCACATGTGGATTTAAATGGGGTCTGGAAACCAGAACACGGCAAATTGTTAAAAAGCCA

GTGAAAGACACAATACCGTGTCCAACCATTGCTGAATCCAGGAGATGCAAGATGACAATG

AGGCATTGTCCAGGAGGGAAGAGAACACCAAAGGCGAAGGAGAAGAGGAACAAGAAAAAG

AAAAGGAAGCTGATAGAAAGGGCCCAGGAGCAACACAGCGTCTTCCTAGCTACAGACAGA

GCTAACCAATAA

10 Secuencia de la proteina RSPO2 humana (SEC ID N°: 5):

MQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLF FFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLH RGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKP VKDTIPCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKEKRNKKKKRKLIERAQEQHSVFLATDR ANQ

ATGCACTTGCGACTGATTTCTTGGCTTTTTATCATTTTGAACTTTATGGAATACATCGGC AGCCAAAACGCCTCCCGGGGAAGGCGCCAGCGAAGAATGCATCCTAACGTTAGTCAAGGC TGCCAAGGAGGCTGTGCAACATGCTCAGATTACAATGGATGTTTGTCATGTAAGCCCAGA CTATTTTTTGCTCTGGAAAGAATTGGCATGAAGCAGATTGGAGTATGTCTCTCTTCATGT CCAAGTGGATATTATGGAACTCGATATCCAGATATAAATAAGTGTACAAAATGCAAAGCT GACTGTGATACCTGTTTCAACAAAAATTTCTGCACAAAATGTAAAAGTGGATTTTACTTA CACCTTGGAAAGTGCCTTGACAATTGCCCAGAAGGGTTGGAAGCCAACAACCATACTATG GAGTGTGTCAGTATTGTGCACTGTGAGGTCAGTGAATGGAATCCTTGGAGTCCATGCACG AAGAAGGGAAAAACATGTGGCTTCAAAAGAGGGACTGAAACACGGGTCCGAGAAATAATA CAGCATCCTTCAGCAAAGGGTAACCTGTGTCCCCCAACAAATGAGACAAGAAAGTGTACA GTGCAAAGGAAGAAGTGTCAGAAGGGAGAACGAGGAAAAAAAGGAAGGGAGAGGAAAAGA AAAAAACCTAATAAAGGAGAAAGTAAAGAAGCAATACCTGACAGCAAAAGTCTGGAATCC AGCAAAGAAATCCCAGAGCAACGAGAAAACAAACAGCAGCAGAAGAAGCGAAAAGTCCAA GATAAACAGAAATCGGTATCAGTCAGCACTGTACACTAG 5 Secuencia de la protefna RSPO3 humana (SEC ID N°: 7):

MHLRLISWLF11LNFMEYIGSQNAS RGRRQRRM H PNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPR LFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYL HLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREII QHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAIPDSKSLES S KEIPEQRENKQQQKKRKVQDKQKSVSVSTVH

Secuencia de ADN de la RSPO4 humana (SEC ID N°: 8):

10

ATGCGGGCGCCACTCTGCCTGCTCCTGCTCGTCGCCCACGCCGTGGACATGCTCGCCCTG AACCGAAGGAAGAAGCAAGTGGGCACTGGCCTGGGGGGCAACTGCACAGGCTGTATCATC TGCTCAGAGGAGAACGGCTGTTCCACCTGCCAGCAGAGGCTCTTCCTGTTCATCCGCCGG GAAGGCATCCGCCAGTACGGCAAGTGCCTGCACGACTGTCCCCCTGGGTACTTCGGCATC CGCGGCCAGGAGGTCAACAGGTGCAAAAAATGTGGGGCCACTTGTGAGAGCTGCTTCAGC CAGGACTTCTGCATCCGGTGCAAGAGGCAGTTTTACTTGTACAAGGGGAAGTGTCTGCCC ACCTGCCCGCCGGGCACTTTGGCCCACCAGAACACACGGGAGTGCCAGGGGGAGTGTGAA CTGGGTCCCTGGGGCGGCTGGAGCCCCTGCACACACAATGGAAAGACCTGCGGCTCGGCT TGGGGCCTGGAGAGCCGGGTACGAGAGGCTGGCCGGGCTGGGCATGAGGAGGCAGCCACC TGCCAGGTGCTTTCTGAGTCAAGGAAATGTCCCATCCAGAGGCCCTGCCCAGGAGAGAGG AGCCCCGGCCAGAAG AAGGGCAGG AAGGAC CGGCGC C CACGCAAGGACAGGAAG CTGGAC CGCAGGCTGGACGTGAGGCCGCGCCAGCCCGGCCTGCAGCCCTGA

MRAPLCLLLLVAHAVDMLALNRRKKQVGTGLGGNCTGCIICSEENGCSTCQQRLFLFIRR EGIRQYGKCLHDCPPGYFGIRGQEVNRCKKCGATCESCFSQDFCIRCKRQFYLYKGKCLP TCPPGTLAHQNTRECQGECELGPWGGWSPCTHNGKTCGSAWGLESRVREAGRAGHEEAAT CQVLSESRKCPIQRPCPGERSPGQKKGRKDRRPRKDRKLDRRLDVRPRQPGLQP

5 Secuencia de la proteina LGR4 humana (NM_18490; SEC ID N°: 10):

MPGPLGLLCFLALGLLGSAGPSGAAPPLCAAPCSCDGDRRVDCS GKGLTAVPEGLSAFTQALDISMNNITQLPEDAFKNFPFLEELQLAGNDLSFIHPKALS GLKELKVLTLQNNQLKTVPSEAIRGLSALQSLRLDANHITSVPEDSFEGLVQLRHLWL DDNSLTEVPVHPLSNLPTLQALTLALNKISSIPDFAFTNLSSLVVLHLHNNKIRSLSQ HCFDGLDNLETLDLNYNNLGEFPQAIKALPSLKELGFHSNSISVIPDGAFDGNPLLRT IHLYDNPLSFVGNSAFHNLSDLHSLVIRGASMVQQFPNLTGTVHLESLTLTGTKISSI PNNLCQEQKMLRTLDLSYNNIRDLPSFNGCHALEEISLQRNQIYQIKEGTFQGLISLR ILDLSRNLIHEIHSRAFATLGPITNLDVSFNELTSFPTEGLNGLNQLKLVGNFKLKEA LAAKDFVNLRSLSVPYAYQCCAFWGCDSYANLNTEDNSLQDHSVAQEKGTADAANVTS TLENEEHSQIIIHCTPSTGAFKPCEYLLGSWMIRLTVWFIFLVALFFNLLVILTTFAS CTSLPSSKLFIGLISVSNLFMGIYTGILTFLDAVSWGRFAEFGIWWETGSGCKVAGFL AVFSSESAIFLLMLATVERSLSAKDIMKNGKSNHLKQFRVAALLAFLGATVAGCFPLF HRGEYSASPLCLPFPTGETPSLGFTVTLVLLNSLAFLLMAVIYTKIiYCNLEKEDLSEN SQSSMIKHVAWLIFTNCIFFCPVAFFSFAPLITAISISPEIMKSVTLIFFPLPACLNP VLYVFFNPKFKEDWKLLKRRVTKKSGSVSVSISSQGGCLEQDFYYDCGMYSHLQGNLT VCDCCES FLLTKPVS CKHLIKSHSCPAIAVASCQRPEGYWSDCGTQSAHSDYADEEDS FVSDSSDQVQACGRACFYQSRGFPLVRYAYNLPRVKD Secuencia de la proteina LGR6 humana (BC047905; SEC ID N°: 11):

10

MGRPRLTLVCQVSI11S ARDLS MNNLTELQ PGL FHHLRFLEELR

LSGNHLSHIPGQAFSGL YSLKILMLQNNQLGGIPAEALWEL P S LQS LRLDANLISLVP

ERSFEGLSSLRHLWLDDNALTEIPVRALNNLPALQAMTLALNRISHIPDYAFQNLTSL

WLHLHNNRIQHLGTHSFEGLHNLETLDLNYNKLQEFPVAIRTLGRLQELGFHNNNIK

AIPEKAFMGNPLLQTIHFYDNPIQFVGRSAFQYLPKLHTLSLNGAMDIQEFPDLKGTT

SLEILTLTRAGIRLLPSGMCQQLPRLRVLELSHNQIEELPSLHRCQKLEEIGLQHNRI

WEIGADTFSQLSS LQALDLSWNAIRSIHPEAFSTLHSLVKLDLTDNQLTTLPLAGLGG

LMHLKLKGNLALSQAFSKDSFPKLRILEVPYAYQCCPYGMCASFFKASGQWEAEDLHL

DDE E SS KRPLGLLARQAENHYDQDLDE LQLEMEDSKPH PSVQCS PT PGPFKPCEYLFE SWGIRLAVWAIVLLS VLCNGLVLLTVFAGGPVPLP PVKFWGAIAGANTLTGISCGLL ASVDALTFGQFSEYGARWETGLGCRATGFLAVLGSEASVLLLTLAAVQCSVSVSCVRA YGKSPSLGSVRAGVLGCLA1AGLAAALPLASVGEYGASPLCLPYAPPEGQPAALGFTV ALVMMNSFCFLWAGAYIKLYCDLPRGDFEAVWDCAMVRHVAWLIFADGLLYCPVAFL SFASMLGLFPVTPEAVKSVLLWLPLPACLNPLLYLLFNPHFRDDLRRLRPRAGDSGP LAYAAAGELEKSSCDSTQALVAFSDVDLILEASEAGRPPGLETYGFPSVTLISCQQPG APRLEGSHCVEPEGNHFGNPQPSMDGELLLRAEGSTPAGGGLSGGGGFQPSGLAFASH V

Secuencia de ADN de la LGR5 humana (SEC ID N°: 12):

ATGGACACCTCCCGGCTCGGTGTGCTCCTGTCCTTGCCTGTGCTGCTGCAGCTGGCGACC GGGGGCAGCTCTCCCAGGTCTGGTGTGTTGCTGAGGGGCTGCCCCACACACTGTCATTGC GAGCCCGACGGCAGGATGTTGCTCAGGGTGGACTGCTCCGACCTGGGGCTCTCGGAGCTG CCTTCCAACCTCAGCGTCTTCACCTCCTACCTAGACCTCAGTATGAACAACATCAGTCAG CTGCTCCCGAATCCCCTGCCCAGTCTCCGCTTCCTGGAGGAGTTACGTCTTGCGGGAAAC GCTCTGACATACATTCCCAAGGGAGCATTCACTGGCCTTTACAGTCTTAAAGTTCTTATG CTGCAGAATAATCAGCTAAGACACGTACCCACAGAAGCTCTGCAGAATTTGCGAAGCCTT CAATCCCTGCGTCTGGATGCTAACCACATCAGCTATGTGCCCCCAAGCTGTTTCAGTGGC CTGCATTCCCTGAGGCACCTGTGGCTGGATGACAATGCGTTAACAGAAATCCCCGTCCAG GCTTTTAGAAGTTTATCGGCATTGCAAGCCATGACCTTGGCCCTGAACAAAATACACCAC ATACCAGACTATGCCTTTGGAAACCTCTCCAGCTTGGTAGTTCTACATCTCCATAACAAT AGAATCCACTCCCTGGGAAAGAAATGCTTTGATGGGCTCCACAGCCTAGAGACTTTAGAT TTAAATTACAATAACCTTGATGAATTCCCCACTGCAATTAGGACACTCTCCAACCTTAAA GAACTAGGATTTCATAGCAACAATATCAGGTCGATACCTGAGAAAGCATTTGTAGGCAAC CCTTCTCTTATTACAATACATTTCTATGACAATCCCATCCAATTTGTTGGGAGATCTGCT TTTCAAC ATTT AC CTG AACT AAG AACACTGACT C TG AATGGTGC CT CACAAATAACTG AA TTTCCTGATTTAACTGGAACTGCAAACCTGGAGAGTCTGACTTTAACTGGAGCACAGATC TCATCTCTTCCTCAAACCGTCTGCAATCAGTTACCTAATCTCCAAGTGCTAGATCTGTCT TACAACCTATTAGAAGATTTACCCAGTTTTTCAGTCTGCCAAAAGCTTCAGAAAATTGAC CTAAGACATAATGAAATCTACGAAATTAAAGTTGACACTTTCCAGCAGTTGCTTAGCCTC CGATCGCTGAATTTGGCTTGGAACAAAATTGCTATTATTCACCCCAATGCATTTTCCACT TTGCCATCCCTAATAAAGCTGGACCTATCGTCCAACCTCCTGTCGTCTTTTCCTATAACT GGGTTACATGGTTTAACTCACTTAAAATTAACAGGAAATCATGCCTTACAGAGCTTGATA TCATCTGAAAACTTTCCAGAACTCAAGGTTATAGAAATGCCTTATGCTTACCAGTGCTGT 5 GCATTTGGAGTGTGTGAGAATGCCTATAAGATTTCTAATCAATGGAATAAAGGTGACAAC

AGCAGTATGGACGACCTTCATAAGAAAGATGCTGGAATGTTTCAGGCTCAAGATGAACGT GACCTTGAAGATTTCCTGCTTGACTTTGAGGAAGACCTGAAAGCCCTTCATTCAGTGCAG TGTTCACCTTCCCCAGGCCCCTTCAAACCCTGTGAACACCTGCTTGATGGCTGGCTGATC AGAATTGGAGTGTGGACCATAGCAGTTCTGGCACTTACTTGTAATGCTTTGGTGACTTCA ACAGTTTTCAGATCCCCTCTGTACATTTCCCCCATTAAACTGTTAATTGGGGTCATCGCA GCAGTGAACATGCTCACGGGAGTCTCCAGTGCCGTGCTGGCTGGTGTGGATGCGTTCACT TTTGGCAGCTTTGCACGACATGGTGCCTGGTGGGAGAATGGGGTTGGTTGCCATGTCATT GGTTTTTTGTCCATTTTTGCTTCAGAATCATCTGTTTTCCTGCTTACTCTGGCAGCCCTG GAGCGTGGGTTCTCTGTGAAATATTCTGCAAAATTTGAAACGAAAGCTCCATTTTCTAGC CTGAAAGTAATCATTTTGCTCTGTGCCCTGCTGGCCTTGACCATGGCCGCAGTTCCCCTG CTGGGTGGCAGCAAGTATGGCGCCTCCCCTCTCTGCCTGCCTTTGCCTTTTGGGGAGCCC AGCACCATGGGCTACATGGTCGCTCTCATCTTGCTCAATTCCCTTTGCTTCCTCATGATG ACCATTGCCTACACCAAGCTCTACTGCAATTTGGACAAGGGAGACCTGGAGAATATTTGG GACTGCTCTATGGTAAAACACATTGCCCTGTTGCTCTTCACCAACTGCATCCTAAACTGC CCTGTGGCTTTCTTGTCCTTCTCCTCTTTAATAAACCTTACATTTATCAGTCCTGAAGTA ATTAAGTTTATCCTTCTGGTGGTAGTCCCACTTCCTGCATGTCTCAATCCCCTTCTCTAC ATCTTGTTCAATCCTCACTTTAAGGAGGATCTGGTGAGCCTGAGAAAGCAAACCTACGTC TGGACAAGATCAAAACACCCAAGCTTGATGTCAATTAACTCTGATGATGTCGAAAAACAG TCCTGTGACTCAACTCAAGCCTTGGTAACCTTTACCAGCTCCAGCATCACTTATGACCTG CCTCCCAGTTCCGTGCCATCACCAGCTTATCCAGTGACTGAGAGCTGCCATCTTTCCTCT GTGGCATTTGTCCCATGTCTCTAA Secuencia de la proteina LGR5 humana (SEC ID N°: 13):

MDTSRLGVLLSLPVLLQLATGGS S PRSGVLLRGCPTHCHCE PDGRMLLRVDCSDLGLSEL PSNLSVFTSYLDLSMNNISQLLPNPLPSLRFLEELRLAGNALTYIPKGAFTGLYSLKVLM LQNNQLRHVPTEALQNLRSLQSLRLDANHIS YVPPSCFSGLHSLRHLWLDDNALTEIPVQ AFRSLSALQAMTLALNKIHHIPDYAFGNLSSLWLHLHNNRIHSLGKKCFDGLHSLETLD LNYNNLDEFPTAIRTLSNLKELGFHSNNIRSIPEKAFVGNPSLITIHFYDNPIQFVGRSA FQHLPELRTLTLNGASQITEFPDLTGTANLESLTLTGAQISSLPQTVCNQLPNLQVLDLS YNLLEDL PS FS VCQKLQKIDLRHNEI YE IKVDTFQQLLS LRS LNLAWNKIAIIH PNAFST LPSLIKLDLSSNLLSSFPITGLHGLTHLKLTGNHALQSLISSENFPELKVIEMPYAYQCC AFGVCENAYKISNQWNKGDNSSMDDLHKKDAGMFQAQDERDLEDFLLDFEEDLKALHSVQ CSPSPGPFKPCEHLLDGWLIRIGVWTIAVLALTCNALVTSTVFRSPLYISPIKLLIGVIA AVNMLTGVSSAVLAGVDAFTFGSFARHGAWWENGVGCHVIGFLSIFASES SVFLLTLAAL ERGFSVKYSAKFETKAPFSSLKVIILLCALLALTMAAVPLLGGSKYGASPLCLPLPFGEP 5 STMGYMVALILLNSLCFLMMTIAYTKLYCNLDKGDLENIWDCSMVKHIALLLFTNCILNC

PVAFLSPSSLINLTFISPEVIKFILLVWPLPACLNPLLYILFNPHFKEDLVSLRKQTYV

WTRSKHPSLMSINSDDVEKQSCDSTQALVTFTSSSITYDLPPSSVPSPAYPVTESCHLSS

VAFVPCL

Secuencia de ADN de LGR5-Fc (SEC ID N°: 14):

ATGGACACCTCCCGGCTCGGTGTGCTCCTGTCCTTGCCTGTGCTGCTGCAGCTGGCGACC GGGGGCAGCTCTCCCAGGTCTGGTGTGTTGCTGAGGGGCTGCCCCACACACTGTCATTGC GAGCCCGACGGCAGGATGTTGCTCAGGGTGGACTGCTCCGACCTGGGGCTCTCGGAGCTG CCTTCCAACCTCAGCGTCTTCACCTCCTACCTAGACCTCAGTATGAACAACATCAGTCAG CTGCTCCCGAATCCCCTGCCCAGTCTCCGCTTCCTGGAGGAGTTACGTCTTGCGGGAAAC GCTCTGACATACATTCCCAAGGGAGCATTCACTGGCCTTTACAGTCTTAAAGTTCTTATG CTGCAGAATAATCAGCTAAGACACGTACCCACAGAAGCTCTGCAGAATTTGCGAAGCCTT CAATCCCTGCGTCTGGATGCTAACCACATCAGCTATGTGCCCCCAAGCTGTTTCAGTGGC CTGCATTC CCTGAGGCACCTGTGG C TGGATGACAATGCGTTAACAGAAATC CCCGTCCAG GCTTTTAGAAGTTTATCGGCATTGCAAGCCATGACCTTGGCCCTGAACAAAATACACCAC ATACCAGACTATGCCTTTGGAAACCTCTCCAGCTTGGTAGTTCTACATCTCCATAACAAT AGAATCCACTCCCTGGGAAAGAAATGCTTTGATGGGOTCCACAGCCTAGAGACTTTAGAT TTAAATTACAATAACCTTGATGAATTCCCCACTGCAATTAGGACACTCTCCAACCTTAAA GAACTAGGATTTCATAGCAACAATATCAGGTCGATACCTGAGAAAGCATTTGTAGGCAAC CCTTCTCTTATTACAATACATTTCTATGACAATCCCATCCAATTTGTTGGGAGATCTGCT TTTCAACATTTACCTGAACTAAGAACACTGACTCTGAATGGTGCCTCACAAATAACTGAA

tttcctgatttaactggaactgcaaacctggagagtctgactttaactggagcacagatc TCATCTCTTCCTCAAACCGTCTGCAATCAGTTACCTAATCTCCAAGTGCTAGATCTGTCT TACAACCTATTAGAAGATTTACCCAGTTTTTCAGTCTGCCAAAAGCTTCAGAAAATTGAC CTAAGACATAATGAAATCTACGAAATTAAAGTTGACACTTTCCAGCAGTTGCTTAGCCTC CGATCGCTGAATTTGGCTTGGAACAAAATTGCTATTATTCACCCCAATGCATTTTCCACT TTGCCATCCCTAATAAAGCTGGACCTATCGTCCAACCTCCTGTCGTCTTTTCCTATAACT GGGTTACATGGTTTAACTCACTTAAAATTAACAGGAAATCATGCCTTACAGAGCTTGATA TCATCTGAAAACTTTCCAGAACTCAAGGTTATAGAAATGCCTTATGCTTACCAGTGCTGT GCATTTGGAGTGTGTGAGAATGCCTATAAGATTTCTAATCAATGGAATAAAGGTGACAAC AGCAGTATGGACGACCTTCATAAGAAAGATGCTGGAATGTTTCAGGCTCAAGATGAACGT GACCTTGAAGATTTCCTGCTTGACTTTGAGGAAGACCTGAAAGCCCTTCATTCAGTGCAG TGTTCACCTTCCCCAGGCCCCTTCAAACCCTGTGAACACCTGCTTGATGGCTGGCTGATC AGAATTGGAGTGGGGCGCGCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAA CTCCTGGGGGGACOGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC 5 TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC

AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAG GAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGG CTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTAT CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAC AAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Secuencia de la proteina LGR5-Fc (SEC ID N°: 15):

MDTSRLGVLLSLPVLLQLATGGSSPRSGVLLRGCPTHCHCEPDGRMLLRVDCSDLGLSEL PSNLS VFTS YLDLSMNNISQLLPNPLPSLRFLEELRLAGNALTYIPKGAFTGL Y SLKVLM LQNNQLRHVPTEALQNLRSLQSLRLDANHISYVPPSCFSGLHSLRHLWLDDNALTEIPVQ AFRSLSALQAMTLALNKIHHIPDYAFGNLSSLWLHLHNNRIHSLGKKCFDGLHSLETLD LNYNNLDEFPTAIRTLSNLKELGFHSNNIRSIPEKAFVGNPSLITIHFYDNPIQFVGRSA FQHLPELRTLTLNGASQITEFPDLTGTANLESLTLTGAQISSLPQTVCNQLPNLQVLDLS YNLLEDLPS FS VCQKLQKIDLRHNEI YE IKVDTFQQLLSLRSLNLAWNKIAIIHPNAFST LPSLIKLDLSSNLLSSFPITGLHGLTHLKLTGNHALQSLISSENFPELKVIEMPYAYQCC AFGVCENAYKISNQWNKGDNS SMDDLHKKDAGM FQAQDERDLEDFLLDFEBDLKALHSVQ CSPSPGPFKPCEHLL.DGWL.IRIGVGRADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH 5 NHYTQKSLSLS PGK

Secuencia de ADN de RSPO1-Fc (SEC ID N°: 16):

ATGCGGCTTGGGCTGTGTGTGGTGGCCCTGGTTCTGAGCTGGACGCACCTCACCATCAGC

AGCCGGGGGATCAAGGGGAAAAGGCAGAGGCGGATCAGTGCCGAGGGGAGCCAGGCCTGT

GCCAAAGGCTGTGAGCTCTGCTCTGAAGTCAACGGCTGCCTCAAGTGCTCACCCAAGCTG

TTCATCCTGCTGGAGAGGAACGACATCCGCCAGGTGGGCGTCTGCTTGCCGTCCTGCCCA

CCTGGATACTTCGACGCCCGCAACCCCGACATGAACAAGTGCATCAAATGCAAGATCGAG

CACTGTGAGGCCTGCTTCAGCCATAACTTCTGCACCAAGTGTAAGGAGGGCTTGTACCTG

CACAAGGGCCGCTGCTATCCAGCTTGTCCCGAGGGCTCCTCAGCTGCCAATGGCACCATG

GAGTGCAGTAGTCCTGCGCAATGTGAAATGAGCGAGTGGTCTCCGTGGGGGCCCTGCTCC

AAGAAGCAGCAGCTCTGTGGTTTCCGGAGGGGCTCCGAGGAGCGGACACGCAGGGTGCTA

CATGCCCCTGTGGGGGACCATGCTGCCTGCTCTGACACCAAGGAGACCCGGAGGTGCACA

GTGAGGAGAGTGCCGTGTCCTGAGGGGCAGAAGAGGAGGAAGGGAGGCCAGGGCCGGCGG

GAGAATGCCAACAGGAACCTGGCCAGGAAGGAGAGCAAGGAGGCGGGTGCTGGCTCTCGA

AGACGCAAGGGGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAAGGGACAGTGGGGCCACTCACATCTGCA

GGGCCTGCCGGGCGCGCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTC

CTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC

CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG

TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG

CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTG

AATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAA

Accatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcc

CGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCC

AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG

CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAG

AGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC

CACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

Secuencia de la proteina RSPO1-Fc (SEC ID N°: 17):

MRLGLCWALVLSWTHLTISSRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCS PKL FI LLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGL YL HKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVL HAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCPEGQKRRKGGQGRRENANRNLARKESKEAGAGSR RRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPAGRADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPBVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKAL PAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN KYTQKSLSLSPGK

Secuencia de ADN de RSPO2-Fc (SEC ID N°: 18):

ATGCAGTTTCGCCTTTTCTCCTTTGCCOTCATCATTCTGAACTGCATGGATTACAGCCAC

TGCCAAGGCAACCGATGGAGACGCAGTAAGCGAGCTAGTTATGTATCAAATCCCATTTGC

AAGGGTTGTTTGTCTTGTTCAAAGGACAATGGGTGTAGCCGATGTCAACAGAAGTTGTTC

TTCTTCCTTCGAAGAGAAGGGATGCGCCAGTATGGAGAGTGCCTGCATTCCTGCCCATCC

GGGTACTATGGACACCGAGCCCCAGATATGAACAGATGTGCAAGATGCAGAATAGAAAAC

TGTGATTCTTGCTTTAGCAAAGACTTTTGTACCAAGTGCAAAGTAGGCTTTTATTTGCAT

AGAGGCCGTTGCTTTGATGAATGTCCAGATGGTTTTGCACCATTAGAAGAAACCATGGAA

TGTGTGGAAGGATGTGAAGTTGGTCATTGGAGCGAATGGGGAACTTGTAGCAGAAATAAT

CGCACATGTGGATTTAAATGGGGTCTGGAAACCAGAACACGGCAAATTGTTAAAAAGCCA

GTGAAAGACACAATACTGTGTCCAACCATTGCTGAATCCAGGAGATGCAAGATGACAATG

AGGCATTGTCCAGGAGGGAAGAGAACACCAAAGGCGAAGGAGAAGAGGAACAAGAAAAAG

AAAAGGAAGCTGATAGAAAGGGCCCAGGAGCAACACAGCGTCTTCCTAGCTACAGACAGA

GCTAACCAAGGGCGCGCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTC

CTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC

CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG

TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG

CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTG

AATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAA

ACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC

CGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCC

AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG

CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAG

AGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC

CACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

Secuencia de la protefna RSPO2-Fc (SEC ID N°: 19):

MQFRLFS FALX ILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLF FFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLH RGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKP VKDTILCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKEKRNKKKKRKLIERAQEQHS VFLATDR ANQGRADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Secuencia de ADN de RSPO3-Fc (SEC ID N°: 20):

ATGCACTTGCGACTGATTTCTTGGCTTTTTATCATTTTGAACTTTATGGAATACATCGGC

AGCCAAAACGCCTCCCGGGGAAGGCGCCAGCGAAGAATGCATCCTAACGTTAGTCAAGGC

TGCCAAGGAGGCTGTGCAACATGCTCAGATTACAATGGATGTTTGTCATGTAAGCCCAGA

CTATTTTTTGCTCTGGAAAGAATTGGCATGAAGCAGATTGGAGTATGTCTCTCTTCATGT

CCAAGTGGATATTATGGAACTCGATATCCAGATATAAATAAGTGTACAAAATGCAAAGCT

GACTGTGATACCTGTTTCAACAAAAATTTCTGCACAAAATGTAAAAGTGGATTTTACTTA

CACCTTGGAAAGTGCCTTGACAATTGCCCAGAAGGGTTGGAAGCCAACAACCATACTATG

GAGTGTGTCAGTATTGTGCACTGTGAGGTCAGTGAATGGAATCCTTGGAGTCCATGCACG AAGAAGGGAAAAACATGTGGCTTCAAAAGAGGGACTGAAACACGGGTCCGAGAAATAATA CAGCATCCTTCAGCAAAGGGTAACCTGTGTCCCCCAACAAATGAGACAAGAAAGTGTACA GTGCAAAGGAAGAAGTGTCAGAAGGGAGAACGAGGAAAAAAAGGAAGGGAGAGGAAAAGA AAAAAAC CT AATAAAGG AGAAAGTAAAG AAG C AATACCTG ACAGCAAAAGT CTGGAAT CC AGCAAAGAAATCCCAGAGCAACGAGAAAACAAACAGCAGCAGAAGAAGCGAAAAGTCCAA GATAAACAGAAATCGGTATCAGTCAGCACTGTACACGGGCGCGCCGACAAAACTCACACA TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCA AAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGAC GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC CTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCG GGTAAATGA

Secuencia de la proteina RSPO3-Fc (SEC ID N°: 21):

MHLRLISWLFIILNFMEYIGSQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPR LFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYL HLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREII QHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAIPDSKSLES SKEIPEQRENKQQQKKRKVQDKQKSVSVSTVHGRADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC 5 SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Secuencia de ADN de RSPO4-Fc (SEC ID N°: 22):

ATGCGGGCGCCACTCTGCCTGCTCCTGCTCGTCGCCCACGCCGTGGACATGCTCGCCCTG

AACCGAAGGAAGAAGCAAGTGGGCACTGGCCTGGGGGGCAACTGCACAGGCTGTATCATC

TGCTCAGAGGAGAACGGCTGTTCCACCTGCCAGCAGAGGCTCTTCCTGTTCATCCGCCGG

GAAGGCATCCGCCAGTACGGCAAGTGCCTGCACGACTGTCCCCCTGGGTACTTCGGCATC

CGCGGCCAGGAGGTCAACAGGTGCAAAAAATGTGGGGCCACTTGTGAGAGCTGCTTCAGC CAGGACTTCTGCATCCGGTGCAAGAGGCAGTTTTACTTGTACAAGGGGAAGTGTCTGCCC ACCTGCCCGCCGGGCACTTTGGCCCACCAGAACACACGGGAGTGCCAGGGGGAGTGTGAA CTGGGTCCCTGGGGCGGCTGGAGCCCCTGCACACACAATGGAAAGACCTGCGGCTCGGCT TGGGGCCTGGAGAGCCGGGTACGAGAGGCTGGCCGGGCTGGGCATGAGGAGGCAGCCACC TGCCAGGTGCTTTCTGAGTCAAGGAAATGTCCCATCCAGAGGCCCTGCCCAGGAGAGAGG AGCCCCGGCCAGAAGAAGGGCAGGAAGGACCGGCGCCCACGCAAGGACAGGAAGCTGGAC CGCAGGCTGGACGTGAGGCCGCGCCAGCCCGGCCTGCAGCCCGGGCGCGCCGACAAAACT CACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTC CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTG GTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTC TCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC CGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTG TCTCCGGGTAAATGA Secuencia de ADN de RSPO4-Fc (SEC ID N°: 23):

MRAPLCLLLLVAHAVDMLALNRRKKQVGTGLGGNCTGCIICSEENGCSTCQQRLFLFIRR EGIRQYGKCLHDCP PGYFGIRGQEVNRCKKCGATCESCFSQDFCIRCKRQFYLYKGKCLP TC PPGTLAHQNTRECQGECELGPWGGWS PCTHNGKTCGSAWGLESRVREAGRAGHEEAAT CQVLSESRKCPIQRPCPGERSPGQKKGRKDRRPRKDRKLDRRLDVRPRQPGLQPGRADKT HTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHBDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGS 5 FFLYSKLTVDKSRWQQGtJVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

LISTADO DE SECUENCIAS 10 <110> Oncomed Pharmaceuticals, Inc.

<120> Composiciones y metodos para el tratamiento y el diagnostico del cancer

<130> NRS/FP7076151 15

<140>

<141>

<150> 08779934.2 <151>

<150> PCT/US2008/008210 5 <151>

<150> 60/947.611 <151>

10 <160> 23

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

15 <211 > 543

<212> PRT <213> Artificial <220>

20 <223> ECD (dominio extracelular) que comprende los aminoacidos 22-564 de la protelna LGR5 sintetica

<400> 1

imagen1

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

1. Una molecula de inmunoglobulina aislada que se une especlficamente a un dominio extracelular de una protelna humana de receptor acoplado a protelna G que contiene repeticiones ricas en leucina (LGR), o a una protelna R- espondina (RSPO) humana y que es capaz de inhibir el crecimiento de un tumor solido alterando la union de una protelna RSPO humana a una protelna LGR humana;

en donde la union especlfica de la molecula de inmunoglobulina es a traves de al menos un sitio de reconocimiento de antlgeno dentro de una region variable de la molecula de inmunoglobulina; y en donde la molecula de inmunoglobulina es monoclonal; y en donde la protelna LGR es LGR4, LGR5 o LGR6.
2. Una molecula de inmunoglobulina aislada que se une especlficamente a un dominio extracelular de al menos una protelna humana de receptor acoplado a protelna G que contiene repeticiones ricas en leucina (LGR), o a al menos a una protelna R-espondina (RSPO) humana;

en donde la molecula de inmunoglobulina es capaz de inhibir la senalizacion de la beta-catenina en una celula tumoral; y

en donde la molecula de inmunoglobulina altera la union de una protelna RSPO humana a una protelna LGR humana y/o altera la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO y;

en donde la union especlfica de la molecula de inmunoglobulina es a traves de al menos un sitio de reconocimiento de antlgeno dentro de una region variable de la molecula de inmunoglobulina; y en donde la molecula de inmunoglobulina es monoclonal; y en donde la protelna LGR es LGR4, LGR5 o LGR6.
3. Una molecula de inmunoglobulina aislada segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde la protelna LGR es LGR5.
4. Una molecula de inmunoglobulina aislada segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el dominio extracelular comprende los aminoacidos 22-564 de la LGR5 humana (SEQ ID NO: 1).
5. Una molecula de inmunoglobulina aislada segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la protelna RSPO humana es RSPO1, RSPO2, RSPO3 o RSPO4.
6. Una molecula de inmunoglobulina aislada segun la reivindicacion 5, en donde la protelna RSPO humana es RSPO3.
7. Una molecula de inmunoglobulina aislada segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la molecula de inmunoglobulina es: (a) quimerica; (b) humanizada; o (c) humana.
8. Una molecula de inmunoglobulina aislada segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la molecula de inmunoglobulina es: (a) una molecula de inmunoglobulina biespeclfica; o (b) un fragmento de molecula de inmunoglobulina.
9. Una llnea celular que produce la molecula de inmunoglobulina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Una composicion farmaceutica que comprende la molecula de inmunoglobulina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un vehlculo farmaceuticamente aceptable y opcionalmente una segunda molecula de inmunoglobulina contra el cancer.
11. Una molecula de inmunoglobulina aislada para su uso en terapia;

en donde la molecula de inmunoglobulina aislada se une especlficamente a un dominio extracelular de una protelna humana de receptor acoplado a protelna G que contiene repeticiones ricas en leucina (LGR), o a una protelna R- espondina (RSPO) humana;

y en donde la union especlfica de la molecula de inmunoglobulina es a traves de al menos un sitio de reconocimiento de antlgeno dentro de una region variable de la molecula de inmunoglobulina; y en donde la protelna LGR es LGR4, LGR5 o LGR6.
12. Una molecula de inmunoglobulina aislada para uso en terapia;

en donde la molecula de inmunoglobulina aislada se une especlficamente a un dominio extracelular de al menos una protelna humana de receptor acoplado a protelna G que contiene repeticiones ricas en leucina (LGR), o a al menos a una protelna R-espondina (RSPO) humana; y en donde la molecula de inmunoglobulina es capaz de inhibir la senalizacion de beta-catenina en una celula tumoral; y en donde la molecula de inmunoglobulina altera la union de una protelna RSPO humana a una protelna LGR humana y/o altera la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO; y en donde la union especifica de la molecula de inmunoglobulina es a traves de al menos un sitio de reconocimiento de antlgeno dentro de una region variable de la molecula de inmunoglobulina; y en donde la protelna LGR es LGR4, LGR5 o LGR6.

5

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13. La molecula de inmunoglobulina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la composicion farmaceutica de la reivindicacion 10, para su uso en terapia.
14. Una molecula de inmunoglobulina aislada para su uso en el tratamiento del cancer;

en donde la molecula de inmunoglobulina aislada se une especlficamente a un dominio extracelular de una protelna humana de receptor acoplado a protelna G que contiene repeticiones ricas en leucina (LGR), o a una protelna R- espondina (RSPO) humana y es capaz de inhibir el crecimiento de un tumor solido alterando la union de una protelna RSPO humana a una protelna LGR humana;

y en donde la union especlfica de la molecula de inmunoglobulina es a traves de al menos un sitio de reconocimiento de antlgeno dentro de una region variable de la molecula de inmunoglobulina; y en donde la protelna LGR es LGR4, LGR5 o LGR6.
15. Una molecula de inmunoglobulina aislada para su uso en el tratamiento del cancer;

en donde la molecula de inmunoglobulina aislada se une especlficamente a un dominio extracelular de al menos una protelna humana de receptor acoplado a protelna G que contiene repeticiones ricas en leucina (LGR) o al menos a una protelna R-espondina (RSPO) humana; y en donde la molecula de inmunoglobulina es capaz de inhibir la senalizacion de beta-catenina en una celula tumoral; y en donde la molecula de inmunoglobulina altera la union de una protelna RSPO humana a una protelna LGR humana y/o altera la activacion de la senalizacion de LGR por RSPO; y en donde la union especifica de la molecula de inmunoglobulina es a traves de al menos un sitio de reconocimiento de antlgeno dentro de una region variable de la molecula de inmunoglobulina; y en donde la protelna LGR es LGR4, LGR5 o LGR6.
16. La molecula de inmunoglobulina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la composicion farmaceutica de la reivindicacion 10, para su uso en el tratamiento del cancer.
17. La molecula de inmunoglobulina o la composicion farmaceutica para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde el cancer o el tumor son un cancer o un tumor de colon, de mama, de pulmon o de pancreas.
18. La molecula de inmunoglobulina o la composicion farmaceutica para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde el cancer o el tumor sobreexpresan LGR5.
19. La molecula de inmunoglobulina o la composicion farmaceutica para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en donde el tratamiento comprende ademas administrar una cantidad eficaz de un segundo agente contra el cancer.
20. La molecula de inmunoglobulina o la composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 19, en donde el segundo agente contra el cancer es un agente quimioterapeutico seleccionado de daunorrubicina, dactinomicina, doxorrubicina, bleomicina, mitomicina, mostaza nitrogenada, clorambucilo, melfalan, ciclofosfamida, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina (CA), 5-fluorouracilo (5-FU), floxuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, vincristina, vinblastina, etoposido, teniposido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES), irinotecan o paclitaxel.
21. Un metodo in vitro para inhibir la senalizacion de la beta-catenina en una celula tumoral, que comprende poner en contacto dicha celula tumoral con una cantidad eficaz de una molecula de inmunoglobulina aislada como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

Serial de micromatriz

imagen1

Normal

Tumor

imagen2

imagen3

—h F-iBmetriHEiH—i-------*

H tHWH-i FiiJ S i 8 f \ I
1 . - - ;

...: anffUIVlQ&jHH HH' H •} I—I

~~m~\------------------

Normal —t- Tumor .

Mama_t. maligno

Colon_normal

Cdlon_t. maligno_primario

Rin6n_t. maligna

Higado_normal

^loitnitra —i—

• rv. ;•<. . * * ' ■ r <

t miJiaiHiitisJiiH i til

Higad&_t. maligna

Ov£rio_norma^

Ov^rio^t. maligno_primari(S

•Panc!reas_normal

Prosfrata_normaL

Prostat^_t. maligna

_t. maligno

Actividad luciferasa

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

Union a la protefna de fusion Fc

imagen8

imagen9

Union

Rspo.1

v, • -

\x:r;

,7 •’

Rspo2

imagen10

Rspo3 Rspo4

imagen11

Expresion de LGR5

hFZDB

imagen12

Flag

M

7-i# U*/

•

Union mAb

88M1 88M5 ctFlag {-)

imagen13

imagen14