RS67894B1 - 5’-o-fenilacetiluridin i terapeutska upotreba - Google Patents

Description

[0001] Opis

[0003] STANJE TEHNIKE

[0005] Fenilacetat i njegov prekursor fenilbutirat imaju važne terapeutske primene, koristeći aktivnost fenilacetata kao sakupljača amonijaka za eliminaciju viška amonijaka u stanjima kao što su hepatična encefalopatija i genetski poremećaji azotnog ciklusa. Štaviše, dodatne aktivnosti fenilacetata kao molekularnog pratioca za ublažavanje pogrešnog savijanja proteina u endoplazmatskom retikulumu i kao inhibitora deacetilacije histona iskorišćene su za terapeutsku korist kod raznih drugih bolesti i modela bolesti.

[0006] U stanjima kao što je hepatična encefalopatija, višak amonijaka nije jedini faktor u patogenezi i progresiji bolesti, jer su takođe uključeni neuroinflamacija i smanjena mitohondrijalna funkcija. Pirimidinski nukleo-signal uridina ima široko antiinflamatorno dejstvo, kako sistemski tako i u mozgu, i pruža podršku ćelijama, uključujući neurone, sa oštećenim mitohondrijalnim transportom elektrona i oksidativnom fosforilacijom. Oralni 2’,3’,5’-tri-O-acetiluridin povećava plazma uridin efikasnije od samog oralnog uridina, delom zbog neželjenih efekata oralnog uridina koji ograničavaju dozu. Onlajn baza podataka Pubchem otkriva zapis o supstanci za SID 47237025. Američki patent 5585512A opisuje estre p-hidroksianilinskog senfa. Američki patent 9566257B2 opisuje kompozicije koje sadrže ornitin i fenilacetat ili fenilbutirat za lečenje hepatične encefalopatije. EP 3335735 opisuje metode primene i procene lekova za uklanjanje azota za lečenje hepatične encefalopatije.

[0008] KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

[0010] Predmetni pronalazak je definisan u nezavisnim zahtevima, a određene njegove opcionalne karakteristike su definisane u zavisnim zahtevima. Tehničke informacije navedene u nastavku mogu u nekim aspektima prevazići obim pronalaska, koji je definisan isključivo priloženim zahtevima. Dodatne tehničke informacije su date kako bi se stvarni pronalazak smestio u širi tehnički kontekst i kako bi se ilustrovali mogući povezani tehnički razvoji. Ukoliko se ovde koriste termini „pronalazak“, „primer“ i „realizacija“, ovi termini će se tumačiti na takav način da se zaštita ne proteže izvan obima zahteva. Bilo koje reference na metode lečenja ljudskog ili životinjskog tela hirurškim putem ili terapijom i dijagnostičkim metodama koje se primenjuju na ljudskom ili životinjskom telu ne treba tumačiti kao zahtevanje zaštite za takve metode kao takve, već ih umesto toga treba tumačiti kao upućivanje na proizvode, posebno supstance ili kompozicije za upotrebu u bilo kojoj od ovih metoda.

[0011] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje 5'-O-fenilacetiluridin. Ovaj pronalazak takođe daje jedinjenje ovog pronalaska za upotrebu u lečenju ili sprečavanju stanja izabranog iz grupe koja se sastoji od hepatične encefalopatije i genetskog poremećaja hepatičnog azotnog ciklusa. I daje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0012] Utvrđeno je da jedinjenje 5'-O-fenilacetiluridin (PAU), kada se primenjuje oralno, efikasnije povećava uridin u plazmi nego sam uridin. I da efikasnije isporuči fenilacetat u krvotok nego fenilbutirat, prekursor koji je favorizovan u odnosu na fenilacetat kao lek zbog neprijatnog mirisa fenilacetata, a koji je odobren od strane FDA za upotrebu kao sakupljač amonijaka.

[0014] KRATAK OPIS CRTEŽA

[0016]

[0018] SLIKA 1: Plazma uridin kod miševa nakon oralne primene 5'-fenilacetiluridina

[0019] SLIKA 2: Plazma uracil kod miševa nakon oralne primene 5'-fenilacetiluridina

[0020] SLIKA 3: Plazma uridin uracil kod miševa nakon oralne primene 5'-fenilacetiluridina

[0022] DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0024] Kako se ovde koristi, prelazni termin „koji obuhvata“ je otvorenog tipa. Patentni zahtev koji koristi ovaj termin može da sadrži elemente pored onih navedenih u tom patentnom zahtevu. Tako, na primer, zahtevi mogu da se odnose na režime lečenja koji takođe uključuju druga terapeutska sredstva ili terapeutske doze virusa koje nisu posebno navedene u njima, sve dok su prisutni navedeni elementi ili njihov ekvivalent.

[0026] Skraćenice:

[0028]

[0030] PAU ili 5’-PAU: 5’-O-fenilacetilurid, takođe poznat i kao 5’-fenilacetiluridin

[0031] PA: fenilacetat

[0032] PB: Fenilbutirat

[0033] NaPB: Natrijum fenilbutirat

[0034] DMF: Dimetilformamid

[0035] TLC: Tankoslojna hromatografija

[0036] DMSO: Dimetil sulfoksid

[0037] HPMC: Hidroksipropilmetil celuloza

[0038] LPS: Lipopolisaharid

[0039] TNF: Faktor nekroze tkiva

[0042]

[0045] Molekularna formula = C<17>H<18>N<2>O<7>

[0046] Težina formule = 362,33402

[0047] LogP = 0,51+/-0,61

[0049] Pored pružanja terapeutskih koristi koje proizilaze iz istovremene isporuke uridina i fenilacetata, postoje važni faktori bezbednosti koji se postižu upotrebom uridina u kombinaciji sa fenilacetatom, jer uridin može ublažiti metaboličke neravnoteže izazvane fenilacetatom ili njegovim prekursorom fenilbutrijatom.

[0050] U skladu sa jedinjenjem za upotrebu, upotrebom i farmaceutskom kompozicijom ovog pronalaska, svaki konvencionalni poremećaj koji karakteriše potencijal za korist koju fenilacetat i uridin pružaju sisarima može se lečiti ili sprečiti. Takvi uslovi se biraju na osnovu bilo koje od nekoliko poznatih aktivnosti i mehanizama delovanja fenilacetata ili njegovog prekursora fenilbutirata, kod kojih je takođe naznačena široka neuroprotektivna i zaštitna aktivnost tkiva koju daju terapijske doze uridina. U jednoj realizaciji, hepatična encefalopatija se leči 5'-fenilacetiluridinom, pri čemu fenilacetatni deo uklanja prekomerni amonijak u cirkulaciji i tkivu povezan sa ovim stanjem, a uridin pruža direktno neuroprotektivno dejstvo protiv neuroinflamacije i mitohondrijalne disfunkcije koje takođe karakterišu hepatičnu encefalopatiju. Hepatična encefalopatija u svim fazama težine, od akutne krize do minimalnih kliničkih simptoma, leči se 5'-fenilacetiluridinom. Za tešku hepatičnu encefalopatiju, doze fenilacetiluridina u rasponu od 1 do 9 grama po kvadratnom metru telesne površine primenjuju se jednom do tri puta dnevno, pri čemu se doza bira u zavisnosti od težine preopterećenja amonijakom kod određenog pacijenta.

[0051] Insuficijencija desne komore i remodeliranje plućne arterije kod plućne hipertenzije podrazumevaju patološko metaboličko remodeliranje koje pogađa srce i plućnu arteriju, sa prekomernom aerobnom glikolizom, slično Varburgovom efektu kod mnogih vrsta raka. Fenilacetat inhibira piruvat karboksilazu, delimično ublažavajući patološku aerobnu glikolizu. Štaviše, uridin poboljšava inotropiju u miokardu preopterećenom pritiskom. Stoga, kao pojedinačno sredstvo ili u kombinaciji sa uridin triacetatom za modulaciju odnosa uridin/fenilacetat, 5'-fenilacetiluridin pruža potpuniju zaštitu desne komore kod plućne hipertenzije nego bilo koje sredstvo pojedinačno; insuficijencija desne komore je glavni uzrok smrti kod ljudi sa primarnom plućnom hipertenzijom. Za lečenje plućne hipertenzije, doze 5'-fenilacetiluridina u rasponu od 1 do 5 grama po kvadratnom metru telesne površine primenjuju se jedan do tri puta dnevno.

[0052] U skladu sa ovim pronalaskom, jedinjenje se može davati bilo kom sisaru. U jednoj realizaciji sisar je ljudski subjekt. U skladu sa ovim pronalaskom, može se koristiti bilo koji konvencionalni način primene. Poželjno je da se jedinjenje daje oralno. Vešt lekar može titrirati dozu kako bi optimizovao dozu za određenog pacijenta. Tipično, jedinjenje se daje oralno kod ljudskog pacijenta u dozi od 1 do 5 grama po kvadratnom metru telesne površine. Obično se doza daje 1 do 3 puta dnevno.

[0053] PB se generalno primenjuje kod pacijenata kao natrijumova so (Bufenil<®>) u dozama od 5-25 g/na dan. Pošto natrijum čini 12% težine doze i stoga bi tretman sa 10 g/dan NaPB rezultirao unosom 1,2 g natrijuma. Preporučeni dnevni unos natrijuma je 2,3 g, a prekomerni unos natrijuma povezan je sa povećanom incidencom hipertenzije, infarkta miokarda i moždanog udara (Strazzullo, D’Elia et al.2009; Frieden and Briss 2010). Jedan od ciljeva ovog pronalaska je da se obezbedi biološki aktivni derivat PB u obliku koji ne dovodi do prekomernog unosa natrijuma. To se postiže estarskom vezom sa uridinom.

[0054] Smanjenje glutamina usled PB predstavlja dodatni metabolički kompromis kod sisara koji nemaju poremećaj ciklusa uree ili prekomerne nivoe amonijaka. Smanjenje zaliha glutamina i rezultirajući gubitak amonijaka mogu dovesti do smanjenja zaliha pirimidina (uridina i citidina) jer je za sintezu pirimidina potreban glutamin. Sinteza pirimidina može biti izmenjena nivoima glutamina ili proteina u ishrani (Monks, Chisena et al.

[0055] 1985; Nelson, Qureshi et al.1993; Zaharevitz, Grubb et al.1993). Upotreba derivata PB-srodnog uridin estarskom vezivnom za uridin obezbeđuje uridin i time sprečava iscrpljivanje uridina.

[0056] Pronalazak će se bolje razumeti pozivanjem na sledeće primere, koji ilustruju, ali ne ograničavaju ovde opisani pronalazak.

[0057] PRIMERI

[0058] PRIMER 1: Pripremanje 5’-O-Fenilacetiluridina

[0059] 1. Pripremanje 2’,3’-O-Ciklloheksilidenuridina

[0060]

[0063]

[0065] Uridin (50 g, 205 mmola) je rastvoren u bezvodnom DMF-u (250 ml) i dodata je katalitička količina paratoluensulfonske kiseline (1,8 grama) uz mešanje pod argonom na sobnoj temperaturi. Posle 20 minuta, dodato je 31 ml, ili 2,0 ekvivalenta, 1,1-dimetoksicikloheksana. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi pod argonom preko noći. Reakcija je proverena pomoću TLC (EtOAc, R<f>= 0,2) da li je završena, a zatim je dodato 250 mL metanola, a zatim je reakcija dva puta isparena. Sirova reakciona smeša je prečišćena fleš hromatografijom korišćenjem silika gela i etil acetata da bi se dobilo 33 grama željenog proizvoda (prinos 50%).

[0066] <1>H NMR (400 MHz, DMSO-d<6>) δ 1,34 - 1,69 (m, 10H), 3,55 (široki s, 2H) 4,03 - 4,05 (m, 1H), 4,73 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 4,86 - 4,88 (m, 1H), 5,06 (s, OH), 5,61 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 5,82 (dd, 1H, J = 2,6, 7,0 Hz), 7,76 - 7,80 (m, 1H), 11,35 (s, NH)

[0067] 2. Pripremanje 2’,3’-O-cikloheksiliden-5’-O-fenilacetiluridina

[0068]

[0071]

[0073] Pod argonom, 2’,3’-O-cikloheksilideneuridin (26,0 g, 84,4 mmola) je rastvoren u 250 ml bezvodnog CH<2>Cl<2>, dodato je 125 ml piridina i smeša je ohlađena na 0<0>C. Zatim je fenilacetil hlorid (16 ml, 1,2 ekvivalenta) kap po kap tokom 30 minuta. Reakciona smeša je mešana na 0<0>C tokom 4 sata i na sobnoj temperaturi još 4 sata. Završetak reakcije je potvrđen pomoću TLC (EtOAc, R<f>= 0,6). Reakcija je ugašena metanolom i isparena do suvoće. Ostatak je rastvoren u EtOAc (500 mL) i ispran sa 0,1 N HCl, 0,05 N HCl, vodom, zasićenim NaHCO<3>i konačno vodom. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom korišćenjem silika gela i 50% EtOAc/heksana da bi se dobilo 30 g željenog proizvoda (prinos 85%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d<6>) δ 1,33 - 1,69 (m, 10H), 3,69 (s, 2H), 4,19 - 4,24 (m, 3H), 4,73 - 4,74 (m, 1H), 4,88 (dd, 1H, J = 2,2, 6,6 Hz), 5,61 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 5,77 (d, 1H, J = 1,9 Hz), 7,24 - 7,32 (m, 5H), 7,60 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 11,42 (s, NH).

[0074] 3. Pripremanje 5'-O-fenilacetiluridina

[0075]

[0076]

[0079] 2’,3’-O-cikloheksiliden-5’-O-fenilacetiluridin (32,80 g, 77,1 mmol) je rastvoren u 300 ml smeše mravlje kiseline i vode u odnosu 1:1. Reakciona smeša je zagrejana na 65-70<0>C tokom 4 sata. razlikuje se od reakcione slike. TLC (etil acetat) je potvrdila potrošnju početnog materijala. Voda i mravlja kiselina su uklonjene isparavanjem pod vakuumom. Sirovi proizvod je rastvoren u vodi (250 ml) i dva puta isparen do suvoće.

[0080] Prečišćavanje fleš hromatografijom korišćenjem silika gela i etil acetata dalo je 15,1 grama (56%) željenog proizvoda. Pokušaji rekristalizacije proizvoda iz rastvarača etil acetat/heksan, etil etar/heksan, metanol/heksan, etanol/ heksan, etanol/ etil etar, aceton/heksan, etanol/ etil etar, metanol/etil etar bili su neuspešni. Analiza pomoću LC-MS je pokazala da 92% ukupne apsorbancije svetlosti na λ<230>odgovara proizvodu.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d<6>) δ 3,71 (ABq, 2H), 3,85 - 4,05 (m, 3H), 4,15 - 4,30 (m, 2H), 5,28 (d, OH, J = 5,1 Hz), 5,43 (d, OH, J = 6,5 Hz), 5,61 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 5,72 (d, 1H, J = 5,1 Hz), 7,24 - 7,31 (m, 5H), 7,46 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 11,35 (s, NH). Tačka topljenja 55 - 57<0>C

[0082] PRIMER 2: Farmakokinetika uridina i uracila u plazmi nakon oralne primene 5'-O-fenilacetiluridina (PAU)

[0084]

[0086] Hemikalija(e): HPMC (hidroksipropilmetil celuloza; SIGMA-Aldrich: kat. br. H3785, CAS 9004-65-3), 5'-O-fenilacetiluridin (PAU, lot 432-132)

[0088] Nosač:Vodeni rastvor HPMC (0,75%) je korišćen kao suspendujući nosač za oralnu primenu.

[0090] Formulacija za doziranje: PAU je dodat u 0,75% HPMC i homogenizovan da bi se eliminisale grudvice. Suspenzija je napravljena do željene zapremine i koncentracije i sonicirana da bi se sve male preostale grudvice razdvojile u fine čestice. Suspenzije su čuvane na 4°C do upotrebe. Suspenzije su korišćene u roku od 24 sata od pripreme.

[0091] Doziranje: Miševi su primili dozu od 587 mg/kg PAU (molarni ekvivalent 400 mg/kg uridina) putem soničnog sonoptričkog injekcije u količini od 0,02 ml/g telesne težine.

[0093] Životinje:Ženke CD-1 miševa.

[0094]

[0097]

[0100] Opšti početni raspored eksperimenta uključivao je davanje grupama od 6 miševa PAU putem sonde i uzimanje uzoraka krvi u nekoliko vremenskih tačaka nakon toga (3 miša su krvarila tokom 2 vremenske tačke (15 i 60 minuta), a još 3 miša su krvarila tokom preostale 2 vremenske tačke (30 i 120 minuta). Svaki eksperiment je uključivao vremensku tačku HPMC (samo nosač) sa 3 miša kako bi se utvrdila osnovna vrednost za uridin u krvi.

[0101]

[0104] Uzorci krvi su sakupljeni u epruvete za separaciju plazme, koje su centrifugirane odmah nakon sakupljanja krvi, a alikvoti plazme su zamrznuti za kasniju obradu. Plazma je kasnije deproteinizovana, a uridin i uracil su kvantifikovani tečnom hromatografijom korišćenjem UV apsorbančne detekcije i masene spektrometrije.

[0105] Dostava uridina u krvotok procenjena je praćenjem uridina u plazmi i zbira uridina i uracila [uridin uracil], jer je uracil prvi proizvod u enzimskoj razgradnji uridina. Miševi pretvaraju primenjeni uridin u uracil brže i ekstenzivnije nego ljudi, tako da uridin uracil pruža bolji indeks za prevođenje doziranja i farmakokinetike kod ljudi nego merenje samog uridina.

[0106] Koncentracije uridina, uracila i [uridina uracila] u plazmi nakon primene PAU prikazane su na slikama 1, 2 i 3, respektivno.

[0107] Takođe je procenjena isporuka fenilacetata u krvotok nakon oralne primene PAU. Natrijum fenilbutirat se koristi u kliničkoj praksi kao hvatač amonijaka kod hepatične encefalopatije ili genetskih poremećaja ciklusa azota, ili kao šaperon ili inhibitor histon deacetilaze. Pretežno se metaboliše u fenilacetat putem beta-oksidacije u jetri, a fenilacetat posreduje u terapeutskim koristima fenilbutirata. PAU je primenjen oralno u dozi ekvimolarnoj 200 mg/kg natrijum fenilbutirata. Ženke BALB/c miševa (n= 3-5 grupa) su dobijale testirana jedinjenja oralno i nakon 30 minuta su im retroorbitalno uzete krvi da bi se dobila plazma. Tabela koja sumira uporednu biodostupnost derivata PAU i natrijum fenilbutirata pokazuje maksimalnu koncentraciju (C<Max>) dobijenu u serumu nakon ekvimolarne oralne primene ovih jedinjenja kao indeks biodostupnosti. Ekvimolarna doza uridina korišćena je kao uporedna vrednost za efikasnost isporuke uridina u cirkulaciju oralnom primenom PAU.

[0109] Tabela 1. Plazmatske koncentracije uridina, PB i odgovarajućih metabolita nakon oralne primene natrijum fenilbutirata ili PAU

[0112]

[0115] Jedinice za koncentraciju u plazmi su mikromoli/litar (µM)

[0117] NaPB = natrijum fenilbutirat

[0118] PB = fenilbutirat

[0119] PA = fenilacetat

[0120] PAU = 5’-O-Fenilacetiluridin

[0122] Oralna PAU je bila znatno efikasnija od ekvimolarne doze oralnog natrijum fenilbutirata za povećanje koncentracije fenilacetata u plazmi, što je dovelo do >3 puta veće koncentracije fenilacetata u cirkulaciji 30 minuta nakon primene. Štaviše, PAU je povisio plazma uridin i uracil bolje nego ekvimolarna doza oralnog uridina.

[0124] PRIMER 3: Antiinflamatorni efekti 5'-O-fenilacetiluridina (PAU)

[0126] Injekcija lipopolisaharida (LPS), sastojka bakterijskog ćelijskog zida, korišćena je kao model upale. Upalna kaskada može dovesti do oštećenja ćelija i organa ako se ne kontroliše. Faktor nekroze tkiva α (TNFα) se snažno indukuje tokom upale, a slabljenje ovog odgovora može biti zaštitno kod brojnih bolesti, uključujući reumatoidni artritis, psorijazu, vaskulitis i Alchajmerovu bolest.

[0127] Ženke BALB/c miševa starih 41 nedelju (n = 7-8/grupa) tretirane su nosačem (0,75% HPMC) ili PAU peroralno, a 30 minuta kasnije primenjen je LPS (2,5 mg/kg i.p.). Jedan sat nakon LPS-a, miševi su žrtvovani i sakupljena je krv za merenje plazme TNFα.

[0129] T l 2: Ef k PA n l zm TNF m n z LP

[0132]

[0133] Označava p < 0,05 u poređenju sa kontrolnom grupom

nosača.

[0134] PAU pruža značajan antiinflamatorni efekat kod povišenja plazme izazvanog LPS-om TNFα.

Claims (11)

1. Patentni zahtevi

1. Jedinjenje, 5'-O-fenilacetiluridin.

2. Jedinjenje prema zahtevu 1 za upotrebu u lečenju ili sprečavanju stanja kod sisara, pri čemu je stanje izabrano iz grupe koja se sastoji od hepatične encefalopatije i genetskog poremećaja hepatičnog azotnog ciklusa.

3. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 2, gde se jedinjenje primenjuje oralno na sisara.

4. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 2, gde je sisarski subjekt ljudski subjekt.

5. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 4, gde se jedinjenje primenjuje oralno na ljudskom subjektu.

6. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 2, gde je stanje hepatična encefalopatija, i gde se jedinjenje primenjuje u dozi od 1 do 9 grama po kvadratnom metru telesne površine, primenjivano jednom, dva ili tri puta dnevno.

7. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 5, gde se jedinjenje primenjuje u dozi od 1 do 5 grama po kvadratnom metru telesne površine, primenjivano jednom, dva ili tri puta dnevno.

8. Farmaceutski sastav koji sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač i jedinjenje prema zahtevu 1 u količini efikasnoj za lečenje ili sprečavanje stanja kod sisara, pri čemu je stanje izabrano iz grupe koja se sastoji od hepatične encefalopatije i genetskog poremećaja hepatičnog azotnog ciklusa.

9. Farmaceutski sastav prema zahtevu 8, gde je farmaceutski sastav formulisan za oralnu primenu sisaru, poželjno gde je sisar ljudski subjekt.

10. Farmaceutski sastav prema zahtevu 9, gde je farmaceutski sastav formulisan za primenu jedinjenja u dozi od 1 do 5 grama po kvadratnom metru telesne površine, primenjeno jednom, dva ili tri puta dnevno.

11. Farmaceutski sastav prema zahtevu 8, gde je stanje hepatična encefalopatija, i gde je farmaceutski sastav formulisan za primenu jedinjenja u dozi od 1 do 9 grama po kvadratnom metru telesne površine, primenjeno jednom, dva ili tri puta dnevno.