RS67932B1

RS67932B1 - Proizvodnja degareliksa

Info

Publication number: RS67932B1
Application number: RS20260387A
Authority: RS
Inventors: Grégoire Schwach; Anders Nilsson; Boeving Tine Elisabeth Gottschalk; Jon Holbech Rasmussen; Birgitta Mörnstam; Anders Tsirk; Ulf Annby; Jens Fomsgaard
Original assignee: Ferring Bv
Priority date: 2012-06-01
Filing date: 2013-05-31
Publication date: 2026-04-30
Also published as: US20210077564A1; WO2013178788A3; EP4512390B1; US11510962B2; LT2854831T; FI2854831T3; US10172906B2; JO3586B1; EP4512390C0; PH12014502682B1; AR092840A1; ES3037194T3; HK1209046A1; EP4512389B1; HRP20260500T1; DE25151068T1; EP4385517A2; US10765721B2; BR112014029495A2; ES2988481T3

Description

[0001] Opis

[0003] Tehnička oblast

[0005] Predmetni pronalazak se odnosi na liofilizovani gotov lek degareliksa.

[0007] Dosadašnje stanje tehnike

[0009] Karcinom prostate je vodeći uzrok morbiditeta i mortaliteta kod muškaraca u industrijalizovanom svetu. Degareliks, poznat i kao FE200486, jeste antagonist receptora gonadotropin-oslobađajućeg hormona (GnRH) treće generacije (GnRH blokator) koji je razvijen i odobren za pacijente sa karcinomom prostate kojima je potrebna terapija androgene ablacije (Doehn et al., Drugs 2006, vol. 9, No. 8, pp. 565-571; WO 09846634). Degareliks deluje putem neposredne i kompetitivne blokade GnRH receptora u hipofizi i, poput drugih GnRH antagonista, ne izaziva početnu stimulaciju produkcije luteinizirajućeg hormona putem osovine hipotalamus-hipofiza-gonade, te stoga ne izaziva skok testosterona ili kliničko razbuktavanje (Van Poppel, Cancer Management and Research, 2010:239-52; Van Poppel et al., Urology, 2008, 71(6), 1001-1006); James, E.F. et al., Drugs, 2009, 69(14), 1967-1976).

[0011] Degareliks je sintetički linearni dekapeptid koji sadrži sedam neprirodnih aminokiselina, od kojih su pet D-aminokiseline. On ima deset hiralnih centara u osnovnom lancu dekapeptida. Aminokiselinski ostatak na poziciji 5 u sekvenci ima dodatni hiralni centar u supstituciji bočnog lanca, što daje ukupno jedanaest hiralnih centara. Njegov CAS registarski broj je 214766-78-6 (za slobodnu bazu) i komercijalno je dostupan pod zaštićenim imenom Firmagon<™>. Aktivna supstanca je hemijski označena kao D-alaninamid, N-acetil-3-(2-naftalenil)-D-alanil-4-hloro-D-fenilalanil-3-(3-piridinil)-D-alanil-L-seril-4-[[[(4S)-heksahidro-2,6-diokso-4-pirimidinil]karbonil]amino]-L-fenilalanil-4-[(aminokarbonil)amino]-D-fenilalanil-L-leucil-N6-(1-metiletil)-L-lizil-L-prolil- i predstavljena je hemijskom strukturom u nastavku (u daljem tekstu takođe navedena kao formula I):

[0012]

[0015] Struktura degareliksa se takođe može predstaviti kao:

[0017] Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH<2>

[0019] gde je Ac acetil, 2Nal je 2-naftilalanin, 4Cpa je 4-hlorofenilalanin, 3Pal je 3-piridilalanin, Ser je serin, 4Aph je 4-hlorofenilalanin, Hor je hidroorotil, Cbm je karbamoil, Leu je leucin, Lys(iPr) je N6-izopropillizin, Pro je prolin i Ala je alanin.

[0021] Za potrebe opisivanja ovog pronalaska, svakoj aminokiselini u degareliksu biće dodeljena skraćena oznaka kako sledi:

[0023] AA<1>je D-2Nal, AA<2>je D-4Cpa, AA<3>je D-3Pal, AA<4>je Ser, AA<5>je 4Aph(L-Hor), AA<6>je D- Aph(Cbm), AA<7>je Leu, AA<8>je Lys(iPr), AA<9>je Pro i AA<10>je D-Ala.

[0025] Prema tome, degareliks se može predstaviti kao Ac-AA<1>-AA<10>-NH<2>.

[0027] Degareliks je prethodno pripreman korišćenjem metodologije sinteze peptida na čvrstoj fazi (SPPS) sa Boc-zaštitom, kao što je objavljeno u WO 98/46634 i Jiang et al., J. Med. Chem.

[0028] 2001, 44, 453-467.

[0030] WO2010/12835 i WO2011/066386 opisuju pripremu degareliksa korišćenjem Fmoc strategije. WO2012/055905 i WO2012/055903 opisuju sinteze degareliksa u tečnoj fazi.

[0031] CN10204889A se odnosi na injekciju liofilizovanog praška degareliks acetata. Američki patent br. 2005/282731 A1 se odnosi na farmaceutske oblike primene sa kontinuiranim oslobađanjem koji obuhvataju najmanje jedan farmakološki aktivan peptid.

[0033] WO 2011/004260 A2 se odnosi na kompozicije koje obuhvataju degareliks za lečenje benigne hiperplazije prostate (BPH).

[0035] WO 2010/125468 A1se odnosi na kompoziciju za lečenje karcinoma prostate.

[0037] Sažetak pronalaska

[0039] Pronalazak je definisan u priloženim nezavisnim patentnim zahtevima, na koje se sada upućuje. Opciona obeležja pronalaska definisana su u zavisnim patentnim zahtevima. Aspekti, otelotvorenja ili primeri koji potpadaju izvan obima priloženih nezavisnih patentnih zahteva nisu deo pronalaska i uključeni su isključivo u ilustrativne ili objašnjavajuće svrhe.

[0041] U prvom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje liofilizovanu aktivnu supstancu degareliksa koja se sastoji od degareliksa, 4,5 do 10,0% (w/w) sadržaja sirćetne kiseline i 10% (w/w) ili manje vode, i nečistoća usled procesa proizvodnje, ako ih ima.

[0043] Fizičkohemijska karakterizacija degareliksa pokazala je da ovaj dekapeptid ima sposobnost samoudruživanja i da na kraju formira gelove u vodenom rastvoru. Samoagregacija omogućava ovom jedinjenju da izgradi depo in situ kada se ubrizga supkutano ili intramuskularno. Pokazano je da depo degareliksa obezbeđuje kontinuirano oslobađanje aktivne supstance tokom više meseci, u zavisnosti od doziranja. Trenutno se lek primenjuje u dozama od 120 mg (40 mg/ml) za prvu injekciju i od 80 mg (20 mg/ml) za kontinuirano oslobađanje tokom mesec dana.

[0045] [0015] Pronalazači predmetnog pronalaska su iznenađujuće otkrili da se viskoznost, a samim tim i svojstva kontinuiranog oslobađanja i bioraspoloživost rekonstituisanog gotovog leka, mogu kontrolisati putem prerade sirovog peptida (npr. dobijenog Fmoc strategijom, sintezom u tečnoj fazi ili drugim putem) u aktivnu supstancu. Viskoznost povezana sa aktivnom supstancom iznenađujuće korelira sa viskoznošću povezanom sa gotovim lekom, čak i nakon daljeg rekonstituisanja i liofilizacije. Viskoznost gotovog leka mora se kontrolisati u opsegu do 15 mPas, poželjno u opsegu od 2 do 12 mPas, kako bi se postiglo željeno formiranje depoa, a time i kontinuirano oslobađanje. Predmetni pronalazak obezbeđuje procese koji omogućavaju proizvodnju gotovih lekova koji pokazuju ovu viskoznost, određenu nakon rekonstitucije rastvaračem za rekonstituciju pri koncentraciji od 20 mg degareliksa po ml rastvarača za rekonstituciju.

[0047] U trećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju liofilizovanog gotovog leka degareliksa, pri čemu se liofilizovani gotov lek degareliksa dobija liofilizacijom smeše degareliksa i manitola koja sadrži liofilizovanu aktivnu supstancu degareliksa rastvorenu u vodi i manitolu.

[0049] Poželjno, liofilizovana aktivna supstanca degareliksa dobija se postupkom koji obuhvata korak deagregacije sirćetnom kiselinom, pri čemu se korak deagregacije sprovodi uz jedan ili više, poželjno sve, od sledećih uslova:

[0051] • Konačna koncentracija sirćetne kiseline: 6 - 40 %, poželjno 15 - 35 % (v/v)

[0053] • Temperatura 0 do 35 °C, poželjno 2 do 30 ° C, najpoželjnije 5 do 15 °C

[0055] • Koncentracija degareliksa (slobodna baza) 5 - 35 g/l, poželjno 10 - 20 g/l

[0057] • Vreme 1 - 15 sati.

[0059] Poželjno, liofilizovana aktivna supstanca degareliksa dobija se postupkom koji obuhvata sledeće korake:

[0061] a. odobijanje sirovog degareliksa sintezom peptida u tečnoj fazi (LPPS) ili sintezom peptida na čvrstoj fazi (SPPS),

[0063] b. prečišćavanje sirovog degareliksa radi dobijanja prečišćenog rastvora degareliksa čistoće od najmanje 95%,

[0065] c. koncentrisanje prečišćenog rastvora degareliksa radi dobijanja agregiranog degareliksa, d. deagregaciju agregiranog degareliksa sirćetnom kiselinom, i

[0067] e. liofilizaciju deagregiranog degareliksa radi dobijanja liofilizovane aktivne supstance degareliksa.

[0069] Poželjno, koncentracija sirćetne kiseline na kraju koraka deagregacije je u opsegu od 6 do 40% (v/v).

[0071] Poželjno, liofilizovani gotov lek degareliksa, nakon rekonstitucije vodom za injekcije za rekonstituciju u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml, pokazuje viskoznost do 15 mPas, pri čemu se viskoznost meri pomoću rotacionog viskozimetra opremljenog mernim sistemom konus-ploča sa D=60 mm i 1°, pri čemu se brzina smicanja povećava od 0 do 500 s-1 u 20 koraka, korišćenjem stepenastog programa rotacije sa kontrolisanom brzinom pri konstantnoj temperaturi od 20 ± 0,2°C.

[0073] Poželjno, liofilizovani gotov lek degareliksa, nakon rekonstitucije vodom za injekcije za rekonstituciju, pokazuje viskoznost u opsegu od 2 do 12 mPas, pri čemu se viskoznost meri pomoću rotacionog viskozimetra opremljenog mernim sistemom konus-ploča sa D=60 mm i 1°, pri čemu se brzina smicanja povećava od 0 do 500 s-1 u 20 koraka, korišćenjem stepenastog programa rotacije sa kontrolisanom brzinom pri konstantnoj temperaturi od 20 ± 0,2°C.

[0075] Poželjno, količina od 80 mg ili 120 mg liofilizovanog gotovog leka degareliksa se dalje puni u bočicu.

[0077] Poželjno, liofilizovani gotov lek degareliksa je za primenu od 120 mg (40 mg/ml) za prvu injekciju.

[0079] Poželjno, liofilizovani gotov lek degareliksa je za primenu od 80 mg (20 mg/ml) za kontinuirano oslobađanje tokom mesec dana.

[0081] Ovim obelodanjivanjem obezbeđuje se postupak za kontrolisanje viskoznosti proizvoda degareliksa tako da ne bude veća od 15 mPas, poželjno u opsegu od 2 do 12 mPas, kako je određeno nakon rekonstitucije vodom za injekcije u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml, koji obuhvata sledeće korake:

[0082] 1. Obezbeđivanje liofilizovane aktivne supstance degareliksa koja pokazuje viskoznost do 3,2 mPas, određenu nakon rastvaranja u vodi koja sadrži manitol (2,5% w/V) u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml;

[0084] 2. Rastvaranje liofilizovane aktivne supstance degareliksa u vodi koja sadrži manitol radi dobijanja vodenog rastvora mešavine degareliksa i manitola;

[0086] 3. Liofilizaciju vodene mešavine degareliksa i manitola radi dobijanja gotovog leka degareliksa.

[0088] Ovim obelodanjivanjem obezbeđuje se postupak za proizvodnju liofilizovanog proizvoda degareliksa koji pokazuje viskoznost do 15 mPas, poželjno u opsegu od 2 do 12 mPas, kako je određeno nakon rekonstitucije vodom za injekcije u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml, koji obuhvata sledeće korake:

[0090] 1. Obezbeđivanje liofilizovane aktivne supstance degareliksa koja pokazuje viskoznost do 3,2 mPas, određenu nakon rastvaranja u vodi koja sadrži manitol (2,5% w/V) u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml;

[0092] 2. Rastvaranje liofilizovane aktivne supstance degareliksa u vodi koja sadrži manitol radi dobijanja vodene mešavine degareliksa i manitola; i

[0094] 3. Liofilizaciju vodene mešavine degareliksa i manitola radi dobijanja gotovog leka degareliksa.

[0096] Ovim obelodanjivanjem obezbeđuje se postupak za proizvodnju gotovog leka degareliksa koji obuhvata liofilizovani gotov lek degareliksa i tečnost za rekonstituciju (rastvarač za rekonstituciju) koji, nakon rekonstitucije navedenom tečnošću u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml, pokazuje viskoznost do 15 mPas, poželjno u opsegu od 2 do 12 mPas, koji obuhvata sledeće korake:

[0098] 1. Rastvaranje liofilizovane aktivne supstance degareliksa u vodenom rastvoru koji sadrži manitol radi dobijanja mešavine degareliksa i manitola;

[0099] 2. Liofilizaciju mešavine degareliksa i manitola radi dobijanja gotovog leka degareliksa,

[0101] pri čemu se sredstvo za smanjenje viskoznosti dodaje u mešavinu degareliksa i manitola pre liofilizacije.

[0103] Ovim obelodanjivanjem takođe se obezbeđuje liofilizovana aktivna supstanca degareliksa koja, nakon rastvaranja u vodi koja sadrži 2,5 tež.% manitola u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml, pokazuje viskoznost do 3,2 mPas, kao i postupci za dobijanje ove liofilizovane aktivne supstance degareliksa.

[0105] Štaviše, predmetni pronalazak obezbeđuje gotov lek degareliksa koji obuhvata liofilizovani gotov lek degareliksa i tečnost za rekonstituciju koji, nakon rekonstitucije navedenom tečnošću za rekonstituciju u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml, pokazuje viskoznost do 15 mPas, poželjno u opsegu od 2 do 12 mPas, i sadrži agens za smanjenje viskoznosti u količini od 0,001 do 5 mg/ml.

[0107] Slike

[0109]

[0111] Slika 1 prikazuje odnos između viskoznosti aktivne supstance i viskoznosti gotovog leka.

[0113] Slike 2 i 3 prikazuju odnos između dinamičke viskoznosti suspenzije za doziranje degareliksa (20 mg/ml) i koncentracija degareliksa u plazmi (pacov) 3. dana (slika 2) i 28. dana (slika 3).

[0115] Detaljan opis pronalaska

[0117] Postupci za proizvodnju liofilizovanog proizvoda degareliksa, kako prema prvom tako i prema drugom aspektu, počinju sa aktivnom supstancom degareliksa koja će biti detaljnije opisana.

[0119] Aktivna supstanca degareliksa

[0120] Dekapeptid degareliks može se pripremiti sintezom peptida na čvrstoj fazi, kao što je obelodanjeno u WO98/46634, WO2010/12835 i WO2011/066386, ili sintezom peptida u tečnoj fazi, kao što je obelodanjeno u WO2012/055905 ili WO2012/055903. Ova sinteza peptida daje sirovi degareliks koji se dalje prečišćava, a zatim liofilizuje kako bi se dobio liofilizovani proizvod koji se sastoji od degareliksa, sirćetne kiseline, zaostale količine vode i manjih količina nečistoća usled procesa proizvodnje, ako ih ima. Ovaj proizvod se u predmetnom pronalazku naziva aktivna supstanca degareliksa ili samo aktivna supstanca. Aktivna supstanca degareliksa se poželjno sastoji od degareliksa, 4,5 do 10 tež.% sirćetne kiseline (w/w) i do 10 tež.% vode (w/w).

[0122] Proizvodnja aktivne supstance se može podeliti na prvi korak (A) obezbeđivanje prečišćenog degareliksa u rastvoru, i drugi korak (B) obezbeđivanje aktivne supstance degareliksa.

[0124] Korak (A): Prečišćavanje

[0126] Korak (A) obuhvata prečišćavanje sirovog degareliksa u jednom ili više koraka, poželjno dva koraka, nakon čega opciono sledi korak koncentrisanja na koloni i/ili korak zamene soli.

[0128] Sirovi degareliks, dobijen putem LPPS ili SPPS, prvo se podvrgava prečišćavanju. Prečišćavanje se poželjno izvodi nanošenjem rastvora peptida dobijenog putem SPPS ili LPPS na kolonu sa materijalom sa reverznim fazama, koja je poželjno prethodno uravnotežena puferom. Ovaj prvi korak prečišćavanja poželjno obezbeđuje čistoću od najmanje 95%, određenu putem HPLC.

[0130] U poželjnom otelotvorenju, hromatografija na koloni sa reverznim fazama se ponavlja radi dobijanja proizvoda čistoće od najmanje 97,5%, određene putem HPLC.

[0132] U naročito poželjnom otelotvorenju, prečišćeni rastvor degareliksa čistoće od najmanje 95%, poželjno najmanje 97,5%, podvrgava se daljem koraku hromatografije na koloni radi prethodnog koncentrisanja rastvora degareliksa i/ili radi zamene soli (naročito ako se sirćetna kiselina koristi za podešavanje pH vrednosti eluenata u poslednjem koraku prečišćavanja).

[0133] Ovaj korak prethodnog koncentrisanja i/ili zamene soli se takođe poželjno izvodi na koloni sa reverznim fazama: Prečišćeni rastvor degareliksa se razblažuje vodom (poželjno 1,5 do 2,5 puta) i nanosi na kolonu, koja je prethodno uravnotežena puferom. Kolona se poželjno prvo ispira etanolom (niska koncentracija, uglavnom ispod 20%) i vodenim rastvorom amonijum-acetata, a zatim etanolom (niska koncentracija, uglavnom ispod 20%)/sirćetnom kiselinom/vodom. Kolona se zatim eluira, npr. etanolom (visoka koncentracija, uglavnom 20 do 60%)/sirćetnom kiselinom/vodom, kako bi se dobio koncentrisaniji rastvor degareliksa u poređenju sa rastvorima nakon koraka prečišćavanja. Postupak nije ograničen na etanol kao organski modifikator u eluentu. Mogu se koristiti i drugi rastvarači kao što je acetonitril.

[0135] Korak (A) obezbeđuje prečišćeni degareliks u rastvoru.

[0137] Korak (B)

[0139] Naknadna obrada prečišćenog degareliksa u rastvoru radi dobijanja aktivne supstance degareliksa može se sprovesti na različite načine. U nastavku su ilustrovana četiri poželjna načina (koraci (B1), (B2), (B3) i (B4)).

[0141] Korak (B1): Koncentrisanje - Deagregacija - Liofilizacija

[0143] Prečišćeni degareliks u rastvoru se prvo podvrgava koraku koncentrisanja u kojem se etanol ili drugi organski modifikator, kao što je acetonitril, uklanja isparavanjem. Ovaj korak se poželjno izvodi na rotacionom vakuum uparivaču. Poželjna maksimalna temperatura tokom isparavanja je 40 °C. Dobijeni visoko koncentrisani, viskozni proizvod degareliksa (agregirani proizvod koji je obično u obliku gela) se zatim tretira sirćetnom kiselinom (korak deagregacije), poželjno filtrira i liofilizuje.

[0145] Korak deagregacije je važan za kontrolisanje viskoznosti aktivne supstance. Stoga se korak deagregacije poželjno sprovodi uz jedan ili više, najpoželjnije sve, od sledećih uslova:

[0147] • Konačna koncentracija sirćetne kiseline: 6 - 40 %, poželjno 15 - 35 % (v/v)

[0149] • Temperatura 0 do 35 °C, poželjno 2 do 30 ° C, najpoželjnije 5 do 15 °C

[0150] • Koncentracija degareliksa (slobodna baza) 5 - 35 g/l, poželjno 10 - 20 g/l

[0152] • Vreme 1 - 15 sati

[0154] Unutar ovih granica, pogodne kombinacije parametara procesa mogu se pronaći jednostavnim eksperimentisanjem.

[0156] Korak liofilizacije se poželjno izvodi pri debljini leda od 1,2 do 2,4 cm i vremenu sekundarnog sušenja od 1 do 17 sati. Temperatura sekundarnog sušenja je obično oko 20 °C (15 do 25 °C).

[0158] U poželjnom otelotvorenju, korak (B1) na taj način obezbeđuje liofilizovanu aktivnu supstancu koja pokazuje viskoznost manju od 3,2 mPas, poželjno između 1,15 i 2 mPas (određenu nakon rastvaranja količine od 20 mg slobodne baze degareliksa u 1 ml vode, koja sadrži 2,5% (w/V) manitola). Postupak za merenje viskoznosti opisan je u eksperimentalnom delu. Aktivna supstanca koja ispunjava ovaj uslov viskoznosti dalje se naziva aktivna supstanca (1), dok se aktivna supstanca koja ne ispunjava ovaj uslov viskoznosti dalje naziva aktivna supstanca (2). Aktivna supstanca (2) ima poželjnu viskoznost od 3,2 do 15 mPas, nakon rastvaranja količine od 20 mg u 1 ml vode. Aktivna supstanca (2) može čak biti nalik gelu, u stanju značajno većem od 3,2 mPas, iako se njena viskoznost ne može precizno izmeriti.

[0160] U tom pogledu, napominje se da se „nakon rastvaranja količine od 20 mg u 1 ml vode” odnosi isključivo na uslove za merenje viskoznosti i ne znači da je aktivna supstanca prisutna u rastvoru od 20 mg/ml. Najpoželjnije je da je aktivna supstanca prisutna u liofilizovanom obliku.

[0162] Aktivna supstanca, naročito aktivna supstanca (1), poželjno se dalje karakteriše sadržajem sirćetne kiseline od 4,5 do 10,0% (w/w) i/ili sadržajem vode od 10% ili manje (w/w). Dodatno, aktivna supstanca, naročito aktivna supstanca (1), poželjno pokazuje optičku gustinu od 0,10 AU ili manju (pri koncentraciji od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml u 2,5% manitolu (aq)). Postupak za merenje optičke gustine opisan je u eksperimentalnom delu.

[0164] Stoga se ovim obelodanjivanjem obezbeđuje postupak za proizvodnju aktivne supstance degareliksa (1), koji obuhvata sledeće korake:

[0165] a. Prečišćavanje degareliksa dobijenog sintezom peptida u tečnoj ili čvrstoj fazi radi dobijanja rastvora degareliksa čistoće od najmanje 95%;

[0167] b. Isparavanje rastvarača radi koncentrisanja rastvora degareliksa kako bi se dobio agregirani degareliks;

[0169] c. Deagregaciju agregiranog degareliksa sirćetnom kiselinom; i

[0171] d. Liofilizaciju deagregiranog degareliksa radi dobijanja aktivne supstance degareliksa.

[0173] Ovim obelodanjivanjem obezbeđuje se postupak za modulisanje viskoznosti degareliksa, tako da nakon liofilizacije i rekonstitucije vodom, viskoznost rastvora degareliksa od 20 mg/ml u 2,5% w/V manitola ne bude veća od 15 mPas, koji obuhvata:

[0175] tretiranje agregiranog degareliksa sirćetnom kiselinom; i

[0177] liofilizaciju mešavine degareliksa i sirćetne kiseline.

[0179] U određenim otelotvorenjima, uslovi za dodavanje sirćetne kiseline i liofilizaciju su kao što je gore opisano. U posebnim otelotvorenjima, sadržaj sirćetne kiseline nakon liofilizacije je 4,5 do 10,0% (w/w).

[0181] Korak (B2): Koncentrisanje na koloni - Liofilizacija

[0183] [0051] Rastvor degareliksa dobijen u koraku A (poželjno nakon postupka prečišćavanja u jednom ili dva koraka, npr. bez prethodnog koncentrisanja/zamene soli) nanosi se na hromatografsku kolonu, vrši se jonska izmena i kolona se ispira (pere) razblaženom sirćetnom kiselinom (oko 1%). Degareliks se eluira sa kolone korišćenjem vodene sirćetne kiseline pri koncentraciji AcOH od 20 do 50 tež.%, poželjno 23 do 37 tež.%, poželjno 23 do 27 tež.%, poželjno 27 do 37 tež.%, poželjno 33 do 37 tež.%, poželjno 35 tež.%, a zatim se opciono razblažuje do odgovarajuće koncentracije AcOH i filtrira. Zatim se rastvor degareliksa u AcOH/vodi liofilizuje. Stacionarna faza u koloni može biti različitih tipova. Stacionarna faza može sadržati funkcionalne grupe kao što su ugljovodonici (alifatični i aromatični), alkoholi, nitrili, grupe sa odgovarajućim kiselinsko-baznim svojstvima i grupe za jonsku izmenu, ali nije ograničena na ove tipove grupa. Ovaj postupak obezbeđuje aktivnu supstancu, poželjno aktivnu supstancu (1).

[0185] Stoga se ovim obelodanjivanjem takođe obezbeđuje postupak za proizvodnju aktivne supstance degareliksa, koji obuhvata sledeće korake:

[0187] a. Prečišćavanje degareliksa dobijenog sintezom peptida u tečnoj ili čvrstoj fazi radi dobijanja rastvora degareliksa čistoće od najmanje 95%;

[0189] b. Nanošenje rastvora degareliksa na hromatografsku kolonu;

[0191] c. Eluiranje degareliksa sa kolone sirćetnom kiselinom radi dobijanja eluiranog degareliksa;

[0193] d. Liofilizaciju eluiranog degareliksa radi dobijanja aktivne supstance degareliksa.

[0195] Korak (B3): Izolacija putem liofilizacije-rekonstitucije u AcOH/vodi-liofilizacije

[0197] Prečišćeni degareliks u rastvoru dobijen nakon koraka A se izoluje putem liofilizacije; dobijeni liofilizovani proizvod se rastvara pri koncentraciji između 10 i 20 g/L u 2% sirćetnoj kiselini, i ponovo liofilizuje kako bi se dobila aktivna supstanca degareliksa (1).

[0199] Korak (B4): Sušenje raspršivanjem (nije u skladu sa predmetnim pronalaskom)

[0201] Prečišćeni degareliks u rastvoru (EtOH/voda koja sadrži AcOH ili ACN/voda koja sadrži AcOH dobijena nakon koraka A, ili kao što je opisano u koraku B1 osim liofilizacije, ili B2 osim liofilizacije) izoluje se putem sušenja raspršivanjem kako bi se dobila aktivna supstanca degareliksa (1).

[0203] U poželjnom otelotvorenju, prečišćeni rastvor degareliksa dobijen u koraku A direktno se podvrgava postupku sušenja raspršivanjem. Koncentracija AcOH u navedenom vodenom rastvoru degareliksa koji se podvrgava sušenju raspršivanjem podešava se na 6 do 40% (v/v), poželjno 15 do 35% (v/v).

[0204] Nakon što je opisan postupak proizvodnje aktivne supstance, sada ćemo opisati proizvodnju gotovog leka degareliksa. Liofilizovani gotov lek degareliksa obuhvata aktivnu supstancu degareliksa i manitol, tj. obuhvata (i poželjno se sastoji od) degareliksa, sirćetne kiseline, manitola, preostale količine vode i manjih količina nečistoća usled procesa proizvodnje, ako ih ima.

[0206] Postupak proizvodnje A gotovog leka degareliksa

[0208] Postupak proizvodnje A je gorepomenut, tj. postupak za proizvodnju gotovog leka degareliksa koji, nakon rekonstitucije vodom za injekcije u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml, pokazuje viskoznost do 15 mPas, poželjno u opsegu od 2 do 12 mPas, koji obuhvata sledeće korake:

[0210] a. Obezbeđivanje liofilizovane aktivne supstance degareliksa, poželjno aktivne supstance degareliksa (1);

[0212] b. Rastvaranje liofilizovane aktivne supstance degareliksa u vodi koja sadrži manitol radi dobijanja vodene mešavine degareliksa i manitola;

[0214] c. Liofilizaciju vodene mešavine degareliksa i manitola radi dobijanja gotovog leka degareliksa.

[0216] U predmetnom pronalazku i obelodanjivanju, „nakon rekonstitucije vodom za injekcije u količini od 20 mg/ml” odnosi se na uslove za merenje viskoznosti i ne znači da je gotov lek prisutan u rastvoru od 20 mg/ml. Najpoželjnije, gotov lek je prisutan u liofilizovanom obliku, opciono u kombinaciji sa tečnošću za rekonstituciju. Poželjne količine po bočici su u opsegu od 60 do 300 mg (kao što su 120 mg, 80 mg i 240 mg). Alternativno, on se može obezbediti kao rekonstituisani gotov lek, sa poželjnim koncentracijama u opsegu od 2 do 100 mg/ml, poželjno 10 do 70 mg/ml (kao što su 40 mg/ml, 20 mg/ml i 60 mg/ml).

[0218] Korak b se takođe može nazvati korakom formulisanja. U poželjnom otelotvorenju, filtracija i punjenje bočica se izvode nakon formulisanja, a pre sušenja zamrzavanjem, tako da čitav poželjni postupak proizvodnje A obuhvata sledeće korake:

[0219] • Formulisanje radi dobijanja nefiltriranog gotovog leka u rasutom stanju

[0221] • Filtraciju (sterilnu)

[0223] • Punjenje bočica

[0225] • Sušenje zamrzavanjem/liofilizaciju

[0227] Formulisanje radi dobijanja gotovog leka u rasutom stanju

[0229] Aktivna supstanca se podvrgava koraku formulisanja, koji se generalno izvodi na sledeći način:

[0231] Za proizvodnju nefiltriranog gotovog proizvoda u rasutom stanju, aktivna supstanca i manitol rastvaraju se u vodi (čista voda; uglavnom Milli-Q voda), svako u količinama od 10-60 g, na 1000 g veličine serije. Tipične količine su 20 do 50 g aktivne supstance (kao sadržaj slobodne baze degareliksa određen putem HPLC) i 10 do 50 g manitola na 1000 g. Stvarna količina zavisi od finalne koncentracije degareliksa u gotovom leku i zapremine tečnosti za rekonstituciju (poželjno je da se manitol dodaje tako da se nakon rekonstitucije dobije izotonični rastvor sa osmolalnošću od 300 mOsm /-30 mOsm).

[0233] Za proizvodnju, voda (obično oko 80% od ukupne količine vode) se dodaje u posudu za formulisanje. Manitol se dodaje i rastvara mešanjem. Zatim se aktivna supstanca dodaje u mešani rastvor manitola, a formulisani proizvod u rasutom stanju (serija) dovodi se do svoje finalne težine dodavanjem preostale vode. Ovo formulisanje se izvodi na način kojim se izbegava značajno povećanje viskoznosti. Viskoznost gotovog proizvoda u rasutom stanju stoga poželjno ostaje ispod 5 mPas, poželjno ispod 3,2 mPas tokom koraka spravljanja (viskoznost određena nakon filtracije po rastvaranju u količini od 20 mg u 1 ml 2,5% (w/V) vodenog rastvora manitola). Ovo se može postići kvašenjem peptida pri visokoj brzini mešanja tokom relativno kratkog vremenskog perioda (do 30 minuta), a zatim rastvaranjem peptida pri smanjenoj brzini mešanja kako bi se izbeglo penušanje i agregacija (uglavnom tokom 30 do 90 minuta). Temperatura se obično održava u opsegu od 6 - 15 °C. Mešalica je poželjno ona koja obezbeđuje turbulentno mešanje bez vrtloga.

[0234] Filtracija

[0236] Gotov proizvod u rasutom stanju se zatim poželjno sterilno filtrira, npr. kroz dva filtera stepena sterilizacije postavljena u seriji, vršenjem pritiska azotom na formulisanu kompoziciju u rasutom stanju.

[0238] Punjenje

[0240] Sterilisane bočice se pune filtriranim gotovim proizvodom u rasutom stanju i poluzatvaraju (položaj za liofilizaciju) u aseptičnim uslovima.

[0242] Sušenje zamrzavanjem

[0244] Liofilizator se poželjno steriliše parom pre upotrebe. Bočice se postavljaju na police liofilizatora. Naknadni postupak sušenja zamrzavanjem poželjno obuhvata korake zamrzavanja, glavnog sušenja (sublimacija) i sekundarnog sušenja. Poželjni uslovi su sledeći:

[0246] Postupak sušenja zamrzavanjem poželjno obuhvata, ili se čak sastoji od, tri glavna koraka, tj. zamrzavanja, glavnog sušenja (sublimacija) i sekundarnog sušenja.

[0248] • Zamrzavanje

[0250] Bočice se pune na hlađene police održavane na 2 do 10 °C, kao što je 5 °C.

[0252] Police se hlade sa npr.5 °C na -30 do -40 °C, kao što je -35 °C. Temperatura polica se održava na npr. -35 °C tokom najmanje dva sata kako bi se osiguralo potpuno zamrzavanje cele serije pre početka primarnog sušenja.

[0254] • Glavno sušenje (sublimacija)

[0256] Glavno sušenje se izvodi smanjenjem pritiska u komori (poželjno na 0,100 mbar ili manje) i povećanjem temperature polica (poželjno na 10 do 20 °C, kao što je 17 °C).

[0257] Vreme glavnog sušenja traje najmanje 15 sati.

[0259] • Sekundarno sušenje

[0261] Nakon završetka postupka primarnog sušenja, pritisak u komori se smanjuje (poželjno na 0,01 mbar ili manje) i temperatura polica se povećava (poželjno na 20 do 30 °C, kao što je 25 °C). Sekundarno sušenje se tipično završava u roku od 7 sati.

[0263] Liofilizovani gotov lek se zatim obeležava i pakuje i kombinuje sa odgovarajućom količinom tečnosti za rekonstituciju.

[0265] Tečnost za rekonstituciju se bira u zavisnosti od viskoznosti aktivne supstance. Ako se aktivna supstanca (1) koristi kao polazni materijal za postupak proizvodnje A, tj. liofilizovana aktivna supstanca koja pokazuje viskoznost manju od 3,2 mPas, poželjno između 1,15 i 2 mPas (nakon rastvaranja u količini od 20 mg u 1 ml 2,5 (w/v)% vodenog rastvora manitola), dobijeni liofilizovani gotov lek se poželjno kombinuje sa vodom za injekcije kao tečnošću za rekonstituciju. Ako se liofilizovani gotov lek rekonstituiše vodom za injekcije, viskoznost je generalno u opsegu od 2 do 15 mPas (izmerena nakon rastvaranja 20 mg degareliksa (slobodna baza) u 1 ml vode za injekcije). Za gotov lek sa viskoznošću u ovom opsegu utvrđeno je da obezbeđuje dovoljno depo oslobađanje degareliksa in vivo.

[0267] Postupak proizvodnje B gotovog leka degareliksa (nije u skladu sa predmetnim pronalaskom)

[0269] Postupak proizvodnje B je postupak za proizvodnju gotovog leka degareliksa koji obuhvata liofilizovani gotov lek degareliksa i tečnost za rekonstituciju (tečnost za rekonstituciju) koji, nakon rekonstitucije navedenom tečnošću u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml, pokazuje viskoznost do 15 mPas, poželjno u opsegu od 2 do 12 mPas, koji obuhvata sledeće korake:

[0271] a. Rastvaranje liofilizovane aktivne supstance degareliksa u vodenom rastvoru koji sadrži manitol radi dobijanja mešavine degareliksa i manitola;

[0273] b. Liofilizaciju mešavine degareliksa i manitola radi dobijanja gotovog leka degareliksa, pri čemu se sredstvo za smanjenje viskoznosti dodaje u mešavinu degareliksa i manitola pre liofilizacije.

[0275] Korak a se takođe može nazvati korakom formulisanja. U poželjnom otelotvorenju, filtracija i punjenje bočica se izvode nakon formulisanja, a pre sušenja zamrzavanjem, tako da čitav poželjni postupak proizvodnje B obuhvata sledeće korake:

[0277] • Formulisanje radi dobijanja nefiltriranog gotovog leka u rasutom stanju

[0279] • Filtraciju (sterilnu)

[0281] • Punjenje bočica

[0283] • Sušenje zamrzavanjem/liofilizaciju

[0285] Postupak proizvodnje B je identičan postupku proizvodnje A, uz izuzetak da se u koraku formulisanja pre liofilizacije dodaje sredstvo za smanjenje viskoznosti, poželjno nejonski surfaktant. Nejonski surfaktant se poželjno dodaje u količini od 0,0003 do 1,5 mg/ml u balk rastvor, što odgovara količini od 0,001 do 5 mg/ml, još poželjnije 0,1 do 1 mg/ml, u rekonstituisanom gotovom leku (npr. kada se rekonstituiše do koncentracije degareliksa od 60 mg slobodne baze degareliksa/ml). Poželjni nejonski surfaktanti su oni sa linearnim alkil lancem koji ima najmanje 8 atoma ugljenika (poželjno bez dvostrukih veza) i ugljenohidratnim delom. Naročito su poželjni oni koji su odobreni za potkožne injekcije, kao što je Tween 20 (Polisorbat 20). Drugi pogodni nejonski surfaktanti uključuju tokoferil-polietilen-glikol-1000-sukcinat (TPGS) i ostale Tween surfaktante.

[0287] [0075] Kao polazni materijal za postupak proizvodnje B poželjno se koristi aktivna supstanca (2), tj. liofilizovana aktivna supstanca koja pokazuje viskoznost od najmanje 3,2 mPas (po rastvaranju količine od 20 mg slobodne baze degareliksa u 1 ml 2,5 tež.% vodenog rastvora manitola). Dobijeni liofilizovani gotov lek se tipično kombinuje sa vodom za injekcije kao tečnošću za rekonstituciju. Ako se liofilizovani gotov lek rekonstituiše vodom za injekcije, viskoznost je generalno u opsegu od 2 do 15 mPas (izmerena nakon rastvaranja 20 mg slobodne baze degareliksa u 1 ml vode za injekcije). Za gotov lek sa viskoznošću u ovom opsegu utvrđeno je da obezbeđuje dovoljno formiranje depoa za odloženo oslobađanje degareliksa in vivo.

[0289] Postupak proizvodnje B je naročito poželjno za proizvode degareliksa koji imaju relativno visoku koncentraciju degareliksa nakon rekonstitucije, kao što je 50 mg slobodne baze degareliksa/ml ili više, npr.60 mg slobodne baze degareliksa/ml (240 mg gotovog leka).

[0291] Novi gotov lek degareliksa (nije u skladu sa predmetnim pronalaskom)

[0293] Postupak proizvodnje B obezbeđuje novi gotov lek degareliksa koji se razlikuje od poznatih gotovih lekova po tome što rekonstituisani gotov lek sadrži sredstvo za smanjenje viskoznosti. Sredstvo za smanjenje viskoznosti je ono koje se koristi u koraku B, poželjno nejonski surfaktant.

[0295] Ovim obelodanjivanjem se stoga obezbeđuje gotov lek degareliksa koji obuhvata liofilizovani gotov lek degareliksa i tečnost za rekonstituciju koji, nakon rekonstitucije navedenom tečnošću u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml, pokazuje viskoznost do 15 mPas, poželjno u opsegu od 2 do 12 mPas, i sadrži sredstvo za smanjenje viskoznosti u količini od 0,001 do 5 mg/ml, poželjno 0,1 do 1 mg/ml.

[0297] Eksperimentalni deo

[0299] Primer 1: Prečišćavanje, deagregacija i liofilizacija

[0301] Sirovi degareliks je sintetisan kao što je opisano u WO2012/055905 A1, do koraka 12 u primeru 5. Korak 13, kako je obelodanjen u WO2012/055905 A1, zamenjen je sledećim koracima. Ukratko, postupak prečišćavanja sirove aktivne supstance degareliksa, dobijene nakon poslednjeg koraka deprotekcije, sastoji se od tri preparativna koraka hromatografije sa reverznim fazama (RPC), pri čemu je treći RPC korak prvenstveno korak odsoljavanja.

[0303] Korak 13 (korak prečišćavanja):

[0305] [0080] Rastvor sirovog degareliksa iz koraka 12 u WO2012/055905A1 nanet je na kolonu napunjenu materijalom sa reverznim fazama, prethodno uravnoteženu puferom (90% od 0,12% TFA i 10% od EtOH). Opterećenje: ≤30 g/L zapremine kolone. Kolona je isprana i eluirana gradijentom: Pufer (EtOH 29% do 50 i 0,12% TFA (aq) 71% do 50%). Dobijene frakcije su analizirane i sakupljene na takav način da je čistoća glavnog sakupljenog udela ispunila kriterijum prihvatljivosti za kontrolu procesa.

[0307] Kada je eluacija proverena HPLC metodom, čistoća je bila ≥ 95%.

[0309] Korak 14 (korak prečišćavanja):

[0311] Glavni sakupljeni udeo dobijen u koraku 13 razblažen je dva puta vodom i nanet na kolonu napunjenu materijalom sa reverznim fazama, prethodno uravnoteženu puferom (90% od 1% AcOH i 10% od EtOH). Opterećenje: ≤ 25 g/L zapremine kolone. Kolona je prvo isprana prvim puferom (10% od EtOH i 90% od 0,5 mol/L AcONH4), a zatim drugim puferom (90% od 1% AcOH i 10% od EtOH).

[0313] Kolona je zatim eluirana mešavinom pufera i etanola (76% od 1% AcOH i 24% od EtOH). Dobijene frakcije su analizirane i sakupljene na takav način da je čistoća u glavnom sakupljenom udelu ispunila kriterijume prihvatljivosti za kontrolu procesa.

[0315] Kada je eluacija proverena „HPLC metodom”, čistoća je bila ≥ 97,5%.

[0317] Korak 15 (prethodno koncentrisanje/zamena soli):

[0319] Glavni sakupljeni udeo dobijen u koraku 14 razblažen je dva puta vodom i nanet na kolonu napunjenu materijalom sa reverznim fazama, prethodno uravnoteženu puferom (90% od 1% AcOH i 10% od EtOH). Opterećenje: ≤ 18 g/L zapremine kolone. Kolona je prvo isprana prvim puferom (10% od EtOH i 90% od 0,5 mol/L AcONH4), a zatim drugim puferom (90% od 1% AcOH i 10% od EtOH). Kolona je zatim eluirana mešavinom pufera i etanola (50% od 1% AcOH i 50% od EtOH).

[0321] Kao alternativa, degareliks se može eluirati rastvorom AcOH/MeCN/voda, kao što je 12% AcOH i 22% MeCN u vodi.

[0323] Korak 16 (koncentrisanje - deagregacija - liofilizacija):

[0324] Pre liofilizacije, sakupljeni udeo rastvora čistog degareliksa iz koraka 15 koncentrisan je na temperaturi ispod 40 °C. AVodeni rastvor sirćetne kiseline i voda dodati su u koncentrisani rastvor kako bi se dobila koncentracija ispod 15 g/l i koncentracija sirćetne kiseline od 30%. Ovaj rastvor je zatim filtriran i liofilizovan radi dobijanja aktivne supstance degareliksa.

[0326]

[0329] Rezultati

[0331] Viskoznost aktivne supstance dobijene ovim redosledom koraka bila je ispod 2,5 mPas, određena pri koncentraciji od 20 mg/ml u 2,5% (w/V) rastvoru manitola.

[0333] Primer 2: Postupak merenja viskoznosti za aktivnu supstancu i gotov lek

[0335] Određivanje viskoznosti rastvora aktivne supstance i gotovog leka zasnovano je na važećem izdanju Ph. Eur. i USP korišćenjem rotacionog viskozimetra opremljenog mernim sistemom konus-ploča sa D = 60 mm i 1°. Brzina smicanja se povećava od 0 do 500 s-1 u 20 koraka, korišćenjem programa koraka rotacije sa kontrolisanom brzinom (CR) pri konstantnoj temperaturi od 20 ± 0,2 °C, uz obezbeđivanje da sistem dostigne ravnotežu pre nego što se viskoznost zabeleži pri brzini smicanja od 500 s<-1>.

[0337] Primer 3: Postupak merenja optičke gustine za aktivnu supstancu i gotov lek

[0339] Oprema i materijali

[0341]

[0343] • UV spektrofotometar

[0344] • Kivete koje propuštaju UV svetlost, putanje 10 mm

[0346] • Poklopci za kivete

[0348] • Voda za injekcije (koristi se za rekonstituciju gotovog leka degareliksa i u referentnoj ćeliji)

[0350] Izvođenje analize

[0352] Između rekonstitucije i merenja, rekonstituisani uzorci se moraju čuvati na 22 °C ± 1 °C.

[0354] Bočica sa aktivnom supstancom se rekonstituiše 2,5% vodenim rastvorom manitola u vodi (w/V). Bočica gotovog leka se rekonstituiše vodom za injekcije. Rastvarač se dozira u bočicu i bočica se vrti dok rekonstitucija ne bude potpuna ili se koristi vorteks mešalica tokom nekoliko sekundi. Tečnost treba da izgleda bistro i ne smeju biti vidljivi nerastvoreni prašak ili čestice. Bočicu držati uspravno i ne mućkati. Uzorak se meri na 350 nm, 120 minuta nakon dodavanja rastvarača.

[0356] Četiri minuta pre merenja, uzorak se mora homogenizovati nežnim okretanjem kivete pet puta napred-nazad za približno 180 stepeni. Odlaganje od četiri minuta omogućava svim mehurićima vazduha da se rasprše pre očitavanja.

[0358] Odlaganje od četiri minuta omogućava svim mehurićima vazduha da se rasprše pre očitavanja.

[0360] Primer 4: Sušenje raspršivanjem (nije u skladu sa predmetnim pronalaskom)

[0362] Priprema napajanja

[0364] [0095] Pri pripremi napajanja, izmerena količina degareliksa, prikazana u tabeli ispod, rastvorena je korišćenjem magnetne mešalice. Različiti rastvori za napajanje, W-IV i A-I do A III, pripremljeni su dodavanjem Milli-Q vode ili čiste glacijalne sirćetne kiseline (99,9%) na sledeći način:

[0366] a. Serija W-IV: odgovarajuća zapremina vode dodata je izmerenoj količini degareliksa.

[0368] b. Serije A-I do A-III: za svaki eksperiment, rastvori sirćetne kiseline pripremljeni su razblaživanjem 99,0% glacijalne sirćetne kiseline Milli-Q vodom, čime su dobijeni rastvori od 30, 5 i 2 procenta, u koje je dodata izmerena količina degareliksa.

[0370] Pre svih postupaka sušenja raspršivanjem, rekonstituisani peptid je profiltriran u merni sud kroz filter 0,20 µm Sartoriuos Ministar.

[0372] Sušenje raspršivanjem

[0374] Pre sušenja raspršivanjem, podešeni su ulazna temperatura i brzina napajanja. Crevo pumpe je postavljeno u rastvor za napajanje i započeto je sušenje. Kada je sušenje završeno, ulazna temperatura je ostavljena da padne na 700 °C pre nego što su ciklon i sabirna posuda demontirani radi sakupljanja praha. Prah je sakupljen četkicama u Petri šolje, koje su izmerene pre i nakon sakupljanja radi određivanja prinosa.

[0376] Pregled podešavanja primenjenih za sušenje raspršivanjem

[0378]

[0381]

[0382]

[0385] Viskoznost rekonstituisanog degareliksa osušenog raspršivanjem iz rastvora sirćetne kiseline četiri različite koncentracije (A-I do A-III) u poređenju sa jednom serijom degareliksa osušenog raspršivanjem iz vode (W-IV)

[0387]

[0389]

[0392] Primer 5: Koncentrisanje na koloni - Liofilizacija

[0394] Sakupljeni udeo iz koraka 14 primera 1 razblažen je vodom i nanet na kolonu napunjenu materijalom sa reverznim fazama. Nakon ispiranja kolone 1% vodenim rastvorom AcOH, degareliks je eluiran 35% vodenim rastvorom AcOH. Frakcije su podešene tako da sadrže 35 g degareliksa/l, 27% AcOH (uzorak 1) i 15 g degareliksa/l, 30% AcOH (uzorak 2). Podešene frakcije su osušene zamrzavanjem i analizirane. Rezultati: videti tabelu ispod:

[0396]

[0397]

[0399] Primer 6: Proizvodnja aktivne supstance degareliksa i studije deagregacije

[0400] ∘ Materijali

[0401] Studije deagregacije prečišćene, sirove aktivne supstance

[0402]

[0403] - Sirovi, prečišćeni degareliks je isporučen u koncentraciji od 57,4 mg/ml

[0404] - Sirćetna kiselina 100% je isporučena od strane proizvođača Merck

[0405] - Oprema za deagregaciju:

[0406] • Posuda za formulisanje: staklena posuda sa dvostrukim zidom od 300 ml • Blue Cap boce, 50 ili 100 ml

[0407] • Magnet

[0408] • Magnetna mešalica

[0409] - Primarna ambalaža:

[0410] • Bezbojne 20R staklene bočice. Bočice su oprane i osušene u komori za zagrevanje.

[0411] • 20 mm zatvarači za sušenje zamrzavanjem tipa I prema Ph. Eur / USP 20 mm Flip-Off zatvarači

[0412] Proizvodnja gotovih lekova korišćenjem deagregiranih aktivnih supstanci

[0413]

[0414] - Korišćene su dve eksperimentalne aktivne supstance. Kao kontrola, korišćena je komercijalna aktivna supstanca.

[0415] - Manitol: D (-) manitol (PF-05-0232)

[0416] - Primarna ambalaža:

[0417] • Bezbojne 10R staklene bočice (prema DIN ISO 8362). Bočice su oprane i osušene u komori za zagrevanje.

[0418] • 20 mm zatvarači za sušenje zamrzavanjem tipa I prema Ph. Eur / USP (tip 1319, guma W4416/50/siva, The West Company)

[0419] • 20 mm Flip-Off zatvarači (The West Company)

[0420] ∘ Metode

[0421] Eksperimenti deagregacije korišćenjem osnovnog rastvora aktivne supstance

[0422]

[0423] Temperatura tokom eksperimenata:

[0424] Tokom studija deagregacije temperatura je bila podešena na 5, 20, 25 ili 35 °C.

[0425] Koncentracija aktivne supstance degareliksa u osnovnim rastvorima tokom eksperimenata: Koncentracija aktivne supstance degareliksa bila je 5, 15, 25 ili 35 mg/ml.

[0426] Koncentracija sirćetne kiseline tokom eksperimenata:

[0427] Koncentracija sirćetne kiseline je 13, 15, 18, 20, 22, 26, 30, 35 ili 40%.

[0428] Analize izvršene tokom eksperimenata:

[0429] Viskoznost: Uzeti ~1,2 ml u T = 1, 60, 120 i 240 min.

[0430] Ako se u raspored bolje uklapa uzimanje uzorka u drugoj vremenskoj tački, to se može učiniti pod uslovom da se tačno vreme upiše u zapisnik o formulisanju. Međutim, tačku uzorkovanja u T=1 min treba zadržati.

[0431] Optička gustina (OD): Uzorak (~1 ml) treba uzeti na kraju svakog eksperimenta radi merenja finalne optičke gustine.

[0432] Protokol eksperimenta deagregacije, ukupna zapremina 20 ili 69 ml:

[0433] 1. Izmeriti potrebnu količinu osnovnog rastvora u čašu. Uravnotežiti na željenu temperaturu

[0434] 2. Izmeriti potrebnu količinu sirćetne kiseline (100%) u čašu

[0435] 3. Pomešati sirćetnu kiselinu (100%) sa 3 ili 10 ml milli-Q vode i uravnotežiti na željenu temperaturu

[0436] 4. Pomešati osnovni rastvor degareliksa sa rastvorom sirćetne kiseline/milli-Q vode

[0437] 5. Dopuniti milli-Q vodom do 20 ili 69 ml

[0438] 6. Temeljno promešati

[0439] 7. Uzeti uzorke za viskoznost i optičku gustinu kao što je gore opisano. Zabeležiti izgled rastvora tokom eksperimenta

[0440] Podešavanja za deagregaciju dva osnovna rastvora degareliksa od 69 ml:

[0441] Koncentracija aktivne supstance degareliksa 25 mg/ml u oba eksperimenta.

[0442] Sirćetna kiselina: 10% ili 13%

[0443] Temperatura: 5°C

[0444] Punjenje dve ispitne deagregirane aktivne supstance (69 ml) u bočice i sušenje zamrzavanjem:

[0445] Deagregirani rastvori su odmah napunjeni u 20R bočice. U svaku bočicu je napunjeno 5 ml. Bočice i mešavina u rasutom stanju treba da se drže na hladnom tokom punjenja (poželjno između 5-10°C). Čim su bočice napunjene, postavljene su u liofilizator i program je pokrenut.

[0446] Nakon sušenja zamrzavanjem i zatvaranja bočica, bočice su čuvane u liofilizatoru na 5 °C do pražnjenja.

[0447] Dve liofilizovane aktivne supstance podvrgnute su sledećim analizama:

[0448] Viskoznost je merena na uzorcima od 20 mg/ml slobodne baze

[0449] Optička gustina je merena na uzorcima od 20 mg/ml

[0450] Sadržaj degareliksa

[0451] Sadržaj acetata

[0452] ∘ Rezulati

[0453]

[0454] Temp. Konc. Konc. Viskoznost pri 500 mPa*s Optička gustina Vreme (ºC) degareliksa AcOH (%) Vreme = 240 min = 240 min

[0457]

[0460] Primer 7: Proizvodnja gotovog leka bez sredstva za smanjenje viskoznosti

[0462] Formulisanje serija gotovog leka laboratorijskih razmera korišćenjem dve deagregirane aktivne supstance

[0464] Pomoćne supstance navedene ispod u tabeli 1 koriste se u svim eksperimentima formulisanja.

[0467]

[0468] Oprema za formulisanje:

[0469]

[0470] Posuda za formulisanje: staklena posuda sa dvostrukim zidom od 300 ml

[0471] Blue Cap boce, 100 ml

[0472] Magnet

[0473] Magnetna mešalica

[0474] Primarna ambalaža:

[0475]

[0476] • Bezbojne 10R staklene bočice. Bočice su oprane i osušene u komori za zagrevanje.

[0477] • 20 mm zatvarači za sušenje zamrzavanjem tipa I

[0478] • 20 mm Flip-Off zatvarači

[0479] Opis studije

[0480] Rastvori degareliksa u rasutom stanju koji sadrže 20 mg/g degareliksa i 25 mg/g manitola spravljaju se korišćenjem različitih serija aktivne supstance i različitih podešavanja temperature.

[0481] Viskoznosti rastvora u rasutom stanju mere se tokom/nakon spravljanja u dva navrata (nakon rastvaranja i u t = 120 minuta).

[0482] Sastav u rasutom stanju:

[0483] Veličina serije i kompozicija dva rastvora u rasutom stanju prikazani su u tabeli 2. Tabela 1: Veličina serije i kompozicija rastvora u rasutom stanju

[0484] Veličina serije (g) 50

[0486]

[0488] Eksperimentalni plan:

[0489] Parametri formulisanja navedeni su ispod u tabeli 2.

[0490] Tabela 2: Parametri formulisanja

[0492]

[0494] Formulisanje:

[0495] Formulisanje se izvodi sa mešalicom postavljenom u centru. Pre početka eksperimenata treba fiksirati centralni položaj.

[0496] 1. Izmeriti potrebne sastojke

[0497] • 40 g Milli-Q vode u posudu za formulisanje.

[0498] • 1,25 g manitola u odgovarajuću posudu.

[0499] • Izmeriti tačnu količinu aktivne supstance degareliksa (videti tabelu 2) u odgovarajuću posudu.

[0501] • Izmeriti preostalu količinu Milli-Q vode u odgovarajuću posudu.

[0503] ovezati posudu za formulisanje sa dvostrukim zidom koja sadrži Milli-Q vodu na cirkulacioni hladnjak. Povezati drugu posudu sa dvostrukim zidom u seriji. Posuda koja sadrži ostatak vode stavlja se u drugu posudu sa duplim zidom kako bi se uravnotežila na odgovarajuću temperaturu pre dodavanja u rasuti materijal (korak 9).

[0505] ažljivo postaviti magnet za mešanje u posudu za formulisanje. Podesiti brzinu mešanja na 50 o/min korišćenjem tahometra.

[0507] odesiti hladnjak na odgovarajuću temperaturu, pokrenuti mešanje i dodati manitol u posudu za formulisanje. Mešati dok se manitol ne rastvori.

[0509] staviti sistem da se uravnoteži na podešenu temperaturu.

[0511] meriti temperaturu u rastvoru manitola.

[0513] kloniti mešalicu. Pokrenuti tajmer i odmah dodati aktivnu supstancu. Zatim ponovo umetnuti mešalicu.

[0515] t = 5 minuta dodati ostatak Milli-Q vode, ravnomerno po površini aktivne supstance korišćenjem staklene Pasterove pipete.

[0517] ada ostane samo nekoliko grudvica, isprati aktivnu supstancu sa zidova posude medijumom za rastvaranje.

[0519] Kada se aktivna supstanca potpuno rastvori, zabeležiti vreme i izmeriti temperaturu. Uzorkovati za merenje viskoznosti rastvora u rasutom stanju.

[0521] Nastaviti eksperiment do t = 120 minuta. Uzorkovati za merenje viskoznosti rastvora u rasutom stanju.

[0522] Filtracija

[0524] Rastvori u rasutom stanju neće se filtrirati jer se očekuje da će najmanje jedna od serija biti visoko agregirana, a samim tim i veoma teška za filtriranje. Takođe, serije se neće koristiti u svrhe gde je potrebna sterilnost.

[0526] Punjenje

[0528] Napuniti 6,40 g rastvora u rasutom stanju u bočice od 10R. Bočice i mešavina u rasutom stanju treba da se drže na hladnom tokom punjenja (poželjno između 5-10°C). Čim se bočice napune, treba ih postaviti u liofilizator i pokrenuti program. Od svakog rastvora u rasutom stanju treba da se dobije približno 6-7 bočica.

[0530] ∘ Rezulati

[0532] 18 različitih serija aktivne supstance, sa različitim viskoznostima kao što je navedeno u tabeli ispod, obrađeno je na gore opisan način. Viskoznost odgovarajućih gotovih lekova određena je na sledeći način:

[0535]

[0536] Serija Viskoznost AS (20 mg/ml) mPas Viskoznost GL (20 mg/ml) mPas

[0539]

[0542] Ovi rezultati su grafički ilustrovani na slici 1. Slika 1 prikazuje korelaciju između viskoznosti aktivne supstance i viskoznosti gotovog leka.

[0544] Primer 8: Proizvodnja gotovog leka sa sredstvom za smanjenje viskoznosti (nije u skladu sa predmetnim pronalaskom)

[0546] Eksperiment 1: Ispitivani surfaktanti (rekonstitucija pomoću rastvora vode za injekcije/surfaktanta)

[0548] Postupak:

[0550]

[0552] • Serija degareliksa je rekonstituisana korišćenjem vode za injekcije (kao kontrola) i korišćenjem vode za injekcije koja sadrži surfaktante. Bočice su rekonstituisane do 60 mg/ml degareliksa. Serija gotovog leka korišćena za ove eksperimente imala je viskoznost rastvora u rasutom stanju od oko 3,8 mPas.

[0554] • TPGS i Tween 20 su pripremljeni u rastvorima koji sadrže 1 mg/ml (0,1% rastvori).

[0556] • OD (apsorbancija) je merena na 350 nm.

[0557] • Apsorbancija je zabeležena nakon 30 min, 60 min, 120 min i 24 sata.

[0559] Rezultat:

[0561] I TPCG i Tween 20 su smanjili optičku gustinu na nivo ispod kontrole.

[0563] Eksperiment 2: Rekonstitucija bočica degareliksa sa [WFI Tween 20] ne menja in-vitro profil oslobađanja (IVD test) pri 40 mg/ml degareliksa

[0565] Ispitane koncentracije Tween 20:

[0567] 1 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,25 mg/ml;

[0569] Kontrola: WFI

[0571] Rezultati: Dodavanjem Tween 20 ne menjaju se in-vitro profili oslobađanja.

[0573] Primer 9: Viskoznost gotovog leka i bioraspoloživost

[0575] Sažetak

[0577] Multivarijantna analiza podataka sprovedena je na skupu podataka od n=38 serija gotovih lekova degareliksa, uključujući in vivo farmakokinetičke podatke (model na pacovima).

[0579] Uspostavljena je veza između fizičko-hemijskih karakteristika i in vivo farmakokinetike na modelu pacova. Studija je otkrila da se viskoznost rekonstituisanog proizvoda degareliksa pojavljuje kao istaknut i jedini parametar sa određenom sposobnošću predviđanja in vivo performansi depoa.

[0581] ∘ Uvod

[0582] Gotov lek degarelika se proizvodi kao liofilizovani proizvod koji sadrži manitol. Proizvodi se koriste kao ispitivani lekovi u kliničkim studijama. Proizvedeno je nekoliko formulacija koje sadrže različite količine degareliksa po bočici, i to 10 mg, 20 mg, 40 mg, 88 mg, 128 mg, 120 mg (40 mg/ml), 180 mg (60 mg/ml) i 240 mg (60 mg/ml) i različite odnose degareliksa/manitola.

[0584] ∘ Materijali

[0586] Proizvedeno je približno 40 različitih serija degareliksa sa različitim serijama supstance degareliksa i formulacijama. Standardna koncentracija degareliksa u rastvoru u rasutom stanju je 20 g/l, osim ako nije drugačije navedeno.

[0588] ∘ Metode

[0590] ▪ Fizičko-hemijske metode

[0592] Različite metode za karakterizaciju agregacije odabrane su iz multivarijantne analize podataka. Prikupljeni su podaci iz n=38 serija. Međutim, manje populacije su korišćene za neke metode koje su primenjene samo kod određenih formulacija (npr. merenja na 40 mg/ml nisu vršena kod formulacije od 20 mg).

[0594] ▪ Biološki test na pacovima

[0596] Korišćen je standardizovani test na pacovima koji se sastoji u praćenju farmakokinetičkog profila degareliksa tokom 28 dana. Kako bi se izbegla lokalna neželjena dejstva, pacovima je davan degareliks kao suspenzija od 20 mg/ml sa zapreminom injekcije od 100 µl. Korišćene su grupe od n=8 pacova, pri čemu su svi tretirani rekonstituisanom suspenzijom poreklom iz jedne bočice. Koncentracije u plazmi su prvobitno merene nakon 2 sata, 1 dana, 7 dana i 28 dana, a parcijalna AUC je izračunata kao AUC 0-7 dana i AUC 7-28 dana. Dizajn je zatim promenjen tako što je merenje koncentracije u plazmi (Cp) nakon 2 sata izostavljeno i zamenjeno sa Cp-3 dana. Isto tako, AUC 0-7 dana je zamenjena sa AUC 1-7 dana. Ovo objašnjava diskontinuitete u veličinama populacije nekih od in vivo varijabli.

[0598] ▪ Multivarijantna analiza podataka

[0599] GS obzirom na veličinu skupa podataka, primenjen je pristup multivarijantne analize podataka (PCA i PLS) softverom Simca-P, verzija 10 (Umetrics AB, SE-Umeå). Podaci su obrađeni kao i ranije, uključujući soft block skaliranje (koren četvrtog stepena), skaliranje na jediničnu varijansu (UV) i centriranje. Podaci o zamućenosti su logaritamski transformisani radi poboljšanja distribucije podataka. In vivo Cp podaci su takođe logaritamski transformisani radi stabilizacije varijanse.

[0601] Odnos između fizičko-hemijskih svojstava gotovog leka i performansi in vivo na modelu pacova

[0603] ▪ Odnos između fizio-hemijskih svojstava i performansi in vivo

[0605] Prvi model je izračunat na osnovu 2 komponente. Kvalitet prilagođavanja (R2=0,58) bio je relativno nizak s obzirom na visoku varijabilnost bioloških podataka (20-30%), ali je kvalitet predvidljivosti (Q2=0,35) bio zadovoljavajući (R2-Q2 treba da bude u opsegu od 0,2 do 0,3). Iz dijagrama raspršenja opterećenja (nije prikazan) moglo se videti da varijable kao što su mutnoća merena pri 20 mg/ml i sadržaj acetata nisu bile uticajne.

[0607] Stoga je generisan novi model isključivanjem ove 3 varijable (2 varijable mutnoće merene pri 20 mg/ml i acetat), zasnovan na 2 značajne komponente, što je dovelo do sličnog opisa podataka (R2=0,53), ali poboljšane predvidljivosti (Q2=0,42). Najbolje objašnjene i predviđene varijable kod pacova bile su koncentracije u plazmi nakon 3 dana i 28 dana (Cp-3d, Cp-28d), i površina ispod krive između 1. i 7. dana (AUC 1-7d).

[0609] Dijagram pregleda koeficijenata ukazao je na to da su veći uticaj imali podaci o viskoznosti redom pri 20 mg/ml, a zatim pri 40 mg/ml, koji su svi značajni na nivou poverenja od 0,95 za svaku biološku varijablu. Specifična površina i mutnoća su očigledno imale manji uticaj i nisu bile značajne, čak ni na nivou poverenja od 0,90.

[0611] Odnos između dinamičke viskoznosti merene pri 20 mg/ml i najbolje prilagođenih bioloških varijabli prikazan je na slikama 2 i 3.

[0613] • Zaključak

[0614] Uspostavljen je čvrst odnos (R2=0,53) između viskoznosti pripremljenog proizvoda i in vivo performansi ispitanih na modelu pacova. U oba slučaja, veća viskoznost je dovela do smanjenog oslobađanja iz depoa. Ostale fizičko-hemijske varijable nisu bile relevantne, sa izuzetkom sadržaja acetata za in vitro rastvaranje. Prema tome, viskoznost pripremljenog proizvoda degareliksa izgleda da je primarni parametar sa određenom sposobnošću predviđanja in vitro oslobađanja i in vivo performansi depoa.

Claims

1. Patentni zahtevi

1. Liofilizovana aktivna supstanca degareliksa koja se sastoji od degareliksa, 4,5 do 10,0% (w/w) sadržaja sirćetne kiseline i 10% (w/w) ili manje vode, i nečistoća usled procesa proizvodnje, ako ih ima.

2. Postupak za proizvodnju liofilizovanog gotovog leka degareliksa, pri čemu se liofilizovani gotov lek degareliksa dobija liofilizacijom smeše degareliksa i manitola koja sadrži liofilizovanu aktivnu supstancu degareliksa iz zahteva 1 rastvorenu u vodi i manitolu.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 2, pri čemu se liofilizovana aktivna supstanca degareliksa dobija postupkom koji obuhvata korak deagregacije sirćetnom kiselinom, pri čemu se korak deagregacije sprovodi uz jedan ili više, poželjno sve, od sledećih uslova:

• Konačna koncentracija sirćetne kiseline: 6 - 40 %, poželjno 15 - 35 % (v/v)

• Temperatura 0 do 35 °C, poželjno 2 do 30 ° C, najpoželjnije 5 do 15 °C

• Koncentracija degareliksa (slobodna baza) 5 - 35 g/l, poželjno 10 - 20 g/l

• Vreme 1 - 15 sati.

4. Postupak prema patentnom zahtevu 2 ili 3, pri čemu se liofilizovana aktivna supstanca degareliksa dobija postupkom koji obuhvata sledeće korake:

a. dobijanje sirovog degareliksa sintezom peptida u tečnoj fazi (LPPS) ili sintezom peptida na čvrstoj fazi (SPPS),

b. prečišćavanje sirovog degareliksa radi dobijanja prečišćenog rastvora degareliksa čistoće od najmanje 95%,

c. koncentrisanje prečišćenog rastvora degareliksa radi dobijanja agregiranog degareliksa, d. deagregaciju agregiranog degareliksa sirćetnom kiselinom, i

e. liofilizaciju deagregiranog degareliksa radi dobijanja liofilizovane aktivne supstance degareliksa.

5. Postupak prema patentnim zahtevima 2 do 4, pri čemu je koncentracija sirćetne kiseline na kraju koraka deagregacije u opsegu od 6 do 40% (v/v).

6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 5, pri čemu liofilizovani gotov lek degareliksa, nakon rekonstitucije vodom za injekcije za rekonstituciju u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml, pokazuje viskoznost do 15 mPas, pri čemu se viskoznost meri pomoću rotacionog viskozimetra opremljenog mernim sistemom konus-ploča sa D=60 mm i 1°, pri čemu se brzina smicanja povećava od 0 do 500 s-1 u 20 koraka, korišćenjem stepenastog programa rotacije sa kontrolisanom brzinom pri konstantnoj temperaturi od 20 ± 0,2°C.

7. Postupak prema patentnom zahtevu 6, pri čemu liofilizovani gotov lek degareliksa, nakon rekonstitucije vodom za injekcije za rekonstituciju, pokazuje viskoznost u opsegu od 2 do 12 mPas, pri čemu se viskoznost meri pomoću rotacionog viskozimetra opremljenog mernim sistemom konus-ploča sa D=60 mm i 1°, pri čemu se brzina smicanja povećava od 0 do 500 s-1 u 20 koraka, korišćenjem stepenastog programa rotacije sa kontrolisanom brzinom pri konstantnoj temperaturi od 20 ± 0,2°C.

8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 7, pri čemu se količina od 80 mg ili 120 mg liofilizovanog gotovog leka degareliksa dalje puni u bočicu.

9. Postupak prema patentnom zahtevu 8, pri čemu je liofilizovani gotov lek degareliksa za primenu od 120 mg (40 mg/ml) za prvu injekciju.

10. Postupak prema patentnom zahtevu 8, pri čemu je liofilizovani gotov lek degareliksa za primenu od 80 mg (20 mg/ml) za kontinuirano oslobađanje tokom mesec dana.