RU2157405C2 - Способ получения иммобилизованных ферментов с помощью реакции комплексообразования с молекулярным йодом и йодидом калия - Google Patents
Способ получения иммобилизованных ферментов с помощью реакции комплексообразования с молекулярным йодом и йодидом калия Download PDFInfo
- Publication number
- RU2157405C2 RU2157405C2 RU98122582A RU98122582A RU2157405C2 RU 2157405 C2 RU2157405 C2 RU 2157405C2 RU 98122582 A RU98122582 A RU 98122582A RU 98122582 A RU98122582 A RU 98122582A RU 2157405 C2 RU2157405 C2 RU 2157405C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- enzymes
- iodine
- molecular iodine
- potassium iodide
- immobilized enzymes
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 13
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 11
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Inorganic materials [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 title claims abstract 6
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 title abstract 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 title 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims abstract 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract 2
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims description 2
- FJWLWIRHZOHPIY-UHFFFAOYSA-N potassium;hydroiodide Chemical compound [K].I FJWLWIRHZOHPIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 abstract description 7
- 239000011630 iodine Substances 0.000 abstract description 7
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- HFBMWMNUJJDEQZ-UHFFFAOYSA-N acryloyl chloride Chemical compound ClC(=O)C=C HFBMWMNUJJDEQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004442 gravimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003641 microbiacidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57) Изобретение относится к биотехнологии, экспериментальной микробиологии. Может найти применение в медицине, при получении препаратов, в которых ферменты связаны с йодом, при создании биологических фильтров. Ферменты переводят в твердофазное состояние реакцией комплексообразования с молекулярным йодом и йодидом калия. Используют их водные растворы в качестве иммобилизующих агентов, которые остаются в составе твердофазных комплексов. Активность ферментов после иммобилизации составляет 70-87% от контроля, они сохраняют активность до 1 мес.
Description
Изобретение относится к бионеорганической химии, биотехнологии, фармакологии и экспериментальной микробиологии.
В связи с тем, что возбудители различных инфекций со временем приобретают резистентность к существующим лекарственным формам, вопрос о поисках эффективных препаратов для лечения и профилактики является одним из актуальных.
Наиболее оправданным с экологических позиций является применение способов борьбы с инфекцией, аналога которых существуют в природе. Применение натуральных ферментов в этом направлении оправдано.
Ферменты, такие как лизоцим, трипсин, ДНК-аза, широко применяются в медицинской практике и фармакологии. Один из способов повышения эффективности ферментов - их иммобилизация. Иммобилизации ферментов посвящен один из разделов биотехнологии.
Известен способ ковалентного присоединения ферментов к поверхности носителя (Березин И.В. и др. Иммобилизованные ферменты М., Высшая школа, 1987). Способ заключается в химической модификации фермента аналогом мономера, т.е. соединением, содержащим ненасыщенные связи. При последующей сополимеризации с мономером, молекула фермента формирует вокруг себя поверхность носителя, комплементарную собственной, ковалентно к ней присоединяясь.
Недостатком данного способа является применение тяжелых токсичных реагентов для модификации ферментов (например, хлорангидрида акриловой кислоты). Возможно ожидать появление аллергических реакций в случае медицинского применения.
В качестве прототипа нами избран способ модификации путем внутримолекулярного сшивания фермента бифункциональными реагентами (Березин И.В. и др. Иммобилизованные ферменты М., Высшая школа, 1987).
Однако существует ряд недостатков, которые снижают ценность метода внутримолекулярного сшивания ферментов для практических целей Среди них: эмпирический характер поиска оптимального сшивающего агента, применение для модификации реагентов - продуктов химического синтеза, которые могут вызвать негативный ответ в случае медицинского применения, возникает необходимость дополнительной очистки модифицированных ферментов и проведения аллергологических и токсикологических исследований. В случае ковалентной сшивки имеет место малая продолжительность работы активного центра фермента, что резко ограничивает возможности применения модифицированных ферментов.
Нами предлагается способ получения иммобилизованных ферментов с помощью реакции комплексообразования с полииодидами и молекулярным йодом, который базируется на химическом взаимодействии лизосомальных ферментов и галогенов, которое приводит к образованию твердофазных комплексов. В результате образуются белки, содержащие связанный йод. Технический результат достигается смешиванием предварительно приготовленных растворов ферментов (1 мг/мл) с раствором Люголя (1:3). Растворы компонентов реакции берутся в равных объемах - 1 мл. Реакция проводится при комнатной температуре. Оптимальное соотношение фермент: [I2] в реакции комплексообразования с полииодидами и молекулярным йодом определяется с помощью гравиметрического анализа. Комплексы являются стабильными в интервале pH 4-8,5.
В результате реакции комплексообразования ферменты, содержащие связанный йод, переходят из раствора в твердофазное состояние. Оно характеризуется образованием микрокомплексов (микрочастиц) размером до нескольких микрон (мкм), которые имеют огромную общую площадь поверхности активных центров ферментов, способных взаимодействовать с молекулами микробных субстратов, находящимися в окружающей среде.
Микрочастицы твердофазных ферментов имеют тенденцию к агломерации - укрупнению в макрокомплексы размером до нескольких десятков и сотен мкм.
Предлагаемый нами способ получения иммобилизованных ферментов с помощью реакции комплексообразования с полииодидами и молекулярным йодом имеет ряд преимуществ перед известными. Преимущество связано с близостью предлагаемого способа к природным механизмам обезвреживания микроорганизмов, функционирующим в лейкоцитах и макрофагах. Реакция комплексообразования с полииодидами и молекулярным йодом осуществляется даже, если ферменты связаны активными центрами с соответствующими субстратами - пептидогликаном, полипептидами, дезоксирибонуклеиновыми кислотами. Активные центры вышеуказанных ферментов при взаимодействии с пептидогликаном, полипептидами, дезоксирибонуклеиновыми кислотами образуют ван-дер-ваальсовы и водородные связи с каждой молекулой соответствующего микробного субстрата. Активные центры указанных ферментов, связанных с молекулярным йодом и полииодидами, сохраняют каталитическую активность и осуществляют гидролитические реакции биомолекул.
Способ получения иммобилизованных ферментов с помощью реакции комплексообразования с полииодидами и молекулярным йодом позволяет расширить возможности предлагаемой технологии за счет использования других лизосомальных антимикробных ферментов и других галогенов и галогенидов. Аналоги лизосомальных ферментов - трипсин, химотрипсин, ДНК-аза, РНК-аза производятся промышленностью из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Их субстрактный профиль сходен с лизосомальными ферментами. Лизоцим производится также для медицинских целей.
Использование галогенов в связанном с белками виде является предпочтительным с медицинской точки зрения. За счет связанного с ферментным белком йода достигается микробоцидность препаратов.
Преимуществом способа получения иммобилизованных ферментов с помощью реакции комплексообразования с полииодидами и молекулярным йодом является его несложность, доступность, относительная рентабельность. Все препараты выпускаются отечественными производителями и являются вполне доступными.
Очевидно, что способ практически не нуждается в дополнительных клинических испытаниях. По сути, любая обработка поврежденных тканей раствором йода или раствором Люголя в быту, в практике здравоохранения сопровождается формированием комплексов лизоцим-йод, ДНК-аза-йод, трипсин-йод и др. Образование таких комплексов имеет место, т.к. при повреждении соматических клеток выделяется большое количество внутриклеточных трипсиноподобных ферментов, нуклеаз, лизоцима и др. Этот феномен ранее не был обнаружен и не были оценены свойства этих комплексов.
Предлагаемый способ дает возможность получать препараты, в которых ферменты, используемые для связывания соответствующего субстрата, не фиксированы на поверхностях каких-либо специальных твердых носителей, являющихся инородными телами, причем ферменты, полученные в результате комплексообразования с галогенами, образуют твердофазные комплексы (конъюгаты) с огромной общей площадью поверхности, сохраняя при этом способность взаимодействовать с соответствующим субстратом практически всех видов микроорганизмов, формируя химические связи между ферментом и соответствующим субстратом, что является новым по сравнению с прототипом. Незафиксированность ферментов значительно расширяет возможности применения этих препаратов.
Способ получения иммобилизованных ферментов с помощью реакции комплексообразования с полииодидами и молекулярным йодом может иметь:
медицинское применение для создания препаратов связанного йода на основе природных веществ белкового происхождения;
техническое применение для создания биологических фильтров (очистные устройства).
медицинское применение для создания препаратов связанного йода на основе природных веществ белкового происхождения;
техническое применение для создания биологических фильтров (очистные устройства).
Предлагаемый способ получения иммобилизованных ферментов с помощью реакции комплексообразования с полииодидами и молекулярным йодом в случае медицинского применения может быть выполнен в двух вариантах, примеров.
Вариант 1.
Смешиваются равные объемы раствора соответствующего фермента (1 мг/мл) и раствора Люголя, взятых в разведении 1:3 (I2 - 0,1 г; KI - 0,2 г; H2Odest - 90 мл). Реакция проводится при комнатной температуре в течение 1-2 мин. Твердофазные комплексы фермент-йод выпадают в виде осадка. Отделение комплексов от не прореагировавших компонентов реакции проводятся фильтрованием или центрифугированием. Центрифугирование осуществляют при 5000 об/мин 3 минуты однократно. При повторном ресуспендировании-центрифугировании комплексы разукрупняются и/или растворяются.
Вариант 2.
Смотри вариант 1. После добавления раствора Люголя необходимо ввести в реакционную смесь 1,8% раствор FeCl3 в соотношении 1:20 (относительно объема раствора фермента). Очистка комплексов - смотри вариант 1. При использовании повторного ресуспендирования-центрифугирования комплексы остаются стабильными.
Активность ферментов после иммобилизации составляла 85-87% от уровня контроля при использовании варианта 1 и 70-80% - при использовании варианта 2. Ферменты сохраняли свою активность достаточно длительный срок - 1 месяц (максимальный срок наблюдения). В конце срока наблюдения активность ферментов соответственно составляла 78-80% и 65-70% от контроля.
Литература
1. Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов А.В., Мартинек В.В., Можаев В.В., Хмельницкий Ю. Л., Иммобилизованные ферменты. - М.: Высшая школа, 1987. 157 с.
1. Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов А.В., Мартинек В.В., Можаев В.В., Хмельницкий Ю. Л., Иммобилизованные ферменты. - М.: Высшая школа, 1987. 157 с.
Claims (1)
- Способ получения иммобилизованных ферментов с помощью реакции комплексообразования с молекулярным йодом и йодом калия, предусматривающий химическую модификацию лизосомальных ферментов иммобилизующими агентами, отличающийся тем, что ферменты переводят в твердофазное состояние иммобилизующими агентами, в качестве которых используют молекулярный йод и йодид калия в водном растворе, остающиеся в составе твердофазных комплексов.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU98122582A RU2157405C2 (ru) | 1998-12-11 | 1998-12-11 | Способ получения иммобилизованных ферментов с помощью реакции комплексообразования с молекулярным йодом и йодидом калия |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU98122582A RU2157405C2 (ru) | 1998-12-11 | 1998-12-11 | Способ получения иммобилизованных ферментов с помощью реакции комплексообразования с молекулярным йодом и йодидом калия |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU98122582A RU98122582A (ru) | 2000-09-10 |
| RU2157405C2 true RU2157405C2 (ru) | 2000-10-10 |
Family
ID=20213402
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU98122582A RU2157405C2 (ru) | 1998-12-11 | 1998-12-11 | Способ получения иммобилизованных ферментов с помощью реакции комплексообразования с молекулярным йодом и йодидом калия |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2157405C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012091534A1 (ru) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Республиканское Государственное Предприятие "Научный Центр Противоинфекционных Препаратов" Комитета Промышленности Министерства Индустрии И Новых Технологий Республики Казахстан" | Антибактериальный агент для лечения инфекционных заболеваний бактериальной природы |
-
1998
- 1998-12-11 RU RU98122582A patent/RU2157405C2/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Березин И.В. и др. Иммобилизованные ферменты. - М.: Высшая школа, 1987, с.157. Муронец В.И., Наградова Н.К. Иммобилизованные олигомерные ферменты. - М.: Наука, 1984, с.8-17. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012091534A1 (ru) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Республиканское Государственное Предприятие "Научный Центр Противоинфекционных Препаратов" Комитета Промышленности Министерства Индустрии И Новых Технологий Республики Казахстан" | Антибактериальный агент для лечения инфекционных заболеваний бактериальной природы |
| US10149890B2 (en) | 2010-12-30 | 2018-12-11 | “Scientific Center Of Anti-Infectious Drugs” Joint-Stock Company | Antibacterial agent for treating infectious diseases of bacterial origin |
| US10251939B2 (en) | 2010-12-30 | 2019-04-09 | “Scientific Center Of Anti-Infectious Drugs” Joint-Stock Company | Antibacterial agent for treating infectious diseases of bacterial origin |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Khan | Immobilized enzymes: a comprehensive review | |
| Hartmann | Ordered mesoporous materials for bioadsorption and biocatalysis | |
| Elnashar | Biomaterials and Nanobiotechnology | |
| Costa et al. | 17 Enzyme Immobilization in Biodegradable Polymers for Biomedical Applications | |
| Shen et al. | Catalytic formation of disulfide bonds in peptides by molecularly imprinted microgels at oil/water interfaces | |
| KR102660862B1 (ko) | 미세입자 | |
| EP0012751A1 (en) | Preparation of trichloro-s-triazine activated supports. | |
| JP4945876B2 (ja) | ハイモビリティーグループタンパクの吸着材および体液浄化カラム | |
| Komatsu | Protein-based smart microtubes and nanotubes as ultrasmall biomaterials | |
| Delgado et al. | A tunable hydrogel for encapsulation and controlled release of bioactive proteins | |
| Holyavka et al. | Various Options for Covalent Immobilization of Cysteine Proteases—Ficin, Papain, Bromelain | |
| RU2157405C2 (ru) | Способ получения иммобилизованных ферментов с помощью реакции комплексообразования с молекулярным йодом и йодидом калия | |
| SU1128601A1 (ru) | Урокиназа,иммобилизированна на фибриногене | |
| JPH05340948A (ja) | 鶏卵抗体固定化担体およびその固定化方法 | |
| JP2001522353A (ja) | ペプチドの活性化 | |
| RU2712690C1 (ru) | Способ получения препарата папаина в геле на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана | |
| JPH0757760B2 (ja) | 生体由来物質の固定化方法 | |
| RU2694883C1 (ru) | Способ ковалентной иммобилизации лизоцима для последующего применения иммобилизованного лизоцима для снижения бактериальной обсемененности биологических жидкостей | |
| RU2858466C1 (ru) | Способ получения гибридного препарата фицина и цистеината хитозана в виде густого раствора | |
| JPH05261281A (ja) | 生理活性物質固定化担体とその製法 | |
| JPH0634633A (ja) | 鶏卵抗体固定化担体およびその製造方法 | |
| EP0940144A1 (en) | Bioactive polymer product | |
| Wang et al. | Strategies for improving the functionality of an affinity bioreactor | |
| Hayashi | Polymer microspheres as carriers of the immobilized enzymes | |
| Holyavka et al. | Complexation of Papain with Particles of Chitosan and Сarboxymethyl Сhitosan, Obtained with or without Ascorbic Acid |