RU2292397C2 - Способ получения смеси d-пантотеновой кислоты и ее солей и состав, полученный данным способом, в качестве кормовой добавки для животных - Google Patents
Способ получения смеси d-пантотеновой кислоты и ее солей и состав, полученный данным способом, в качестве кормовой добавки для животных Download PDFInfo
- Publication number
- RU2292397C2 RU2292397C2 RU2003128534/13A RU2003128534A RU2292397C2 RU 2292397 C2 RU2292397 C2 RU 2292397C2 RU 2003128534/13 A RU2003128534/13 A RU 2003128534/13A RU 2003128534 A RU2003128534 A RU 2003128534A RU 2292397 C2 RU2292397 C2 RU 2292397C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- pantothenic acid
- calcium
- salts
- fermentation
- Prior art date
Links
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title claims abstract description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 title claims abstract description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 title abstract description 14
- 238000009472 formulation Methods 0.000 title abstract 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 14
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 88
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 85
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 65
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 42
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 claims abstract description 29
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims abstract description 28
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 26
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims abstract description 21
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 18
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims abstract description 14
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 12
- 230000005684 electric field Effects 0.000 claims abstract description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims abstract description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 174
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims description 119
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 17
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 12
- ONSCBWDZUUNMMK-UBKPKTQASA-L magnesium;3-[[(2r)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoate Chemical compound [Mg+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O ONSCBWDZUUNMMK-UBKPKTQASA-L 0.000 claims description 12
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 10
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 claims description 10
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 10
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 239000003014 ion exchange membrane Substances 0.000 claims description 8
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 7
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- GHOKWGTUZJEAQD-SSDOTTSWSA-N 3-[[(2s)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical class OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-SSDOTTSWSA-N 0.000 claims description 4
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 claims description 4
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L magnesium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Mg+2] VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000000347 magnesium hydroxide Substances 0.000 claims description 4
- 229910001862 magnesium hydroxide Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 241001112741 Bacillaceae Species 0.000 claims description 2
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims description 2
- BRPQOXSCLDDYGP-UHFFFAOYSA-N calcium oxide Chemical compound [O-2].[Ca+2] BRPQOXSCLDDYGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000292 calcium oxide Substances 0.000 claims description 2
- ODINCKMPIJJUCX-UHFFFAOYSA-N calcium oxide Inorganic materials [Ca]=O ODINCKMPIJJUCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000894007 species Species 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 abstract description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 149
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 47
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 46
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 35
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 32
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 32
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 31
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 30
- 239000000047 product Substances 0.000 description 30
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 238000000909 electrodialysis Methods 0.000 description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 19
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 19
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 19
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- -1 alkaline earth metal salts Chemical class 0.000 description 14
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 14
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 13
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 13
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 13
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 13
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 13
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 13
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 13
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 11
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 11
- ZLHZLMOSPGACSZ-NSHDSACASA-N (6s)-2-nitro-6-[[4-(trifluoromethoxy)phenyl]methoxy]-6,7-dihydro-5h-imidazo[2,1-b][1,3]oxazine Chemical compound O([C@H]1CN2C=C(N=C2OC1)[N+](=O)[O-])CC1=CC=C(OC(F)(F)F)C=C1 ZLHZLMOSPGACSZ-NSHDSACASA-N 0.000 description 10
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 10
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 10
- 101150076071 panD gene Proteins 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 229940091250 magnesium supplement Drugs 0.000 description 9
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 9
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 9
- 101150079396 trpC2 gene Proteins 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 8
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 101150043028 ilvD gene Proteins 0.000 description 8
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 8
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 7
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 101150081585 panB gene Proteins 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 7
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C(=O)C(O)=O QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003011 anion exchange membrane Substances 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 6
- 101150105723 ilvD1 gene Proteins 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 6
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 5
- 101100242684 Mesorhizobium japonicum (strain LMG 29417 / CECT 9101 / MAFF 303099) panD1 gene Proteins 0.000 description 5
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 5
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 244000309466 calf Species 0.000 description 5
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 5
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 4
- 235000019730 animal feed additive Nutrition 0.000 description 4
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 101150048956 coaA gene Proteins 0.000 description 4
- 101150051152 coaX gene Proteins 0.000 description 4
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 101150028586 panE gene Proteins 0.000 description 4
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 101150061166 tetR gene Proteins 0.000 description 4
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 238000005276 aerator Methods 0.000 description 3
- 108010002447 aspartate-alpha-decarboxylase Proteins 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 3
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 3
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 3
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 3
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- SERHXTVXHNVDKA-BYPYZUCNSA-N (R)-pantolactone Chemical compound CC1(C)COC(=O)[C@@H]1O SERHXTVXHNVDKA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100028493 Haloferax volcanii (strain ATCC 29605 / DSM 3757 / JCM 8879 / NBRC 14742 / NCIMB 2012 / VKM B-1768 / DS2) pan2 gene Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 2
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 101150109763 coaW gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 2
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 2
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K iron(III) citrate Chemical compound [Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 2
- HNZZAEBYPPNVOF-DHYYHALDSA-N (2s)-2-amino-3-methylbutanoic acid;(2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O.CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O HNZZAEBYPPNVOF-DHYYHALDSA-N 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- QYNUQALWYRSVHF-ABLWVSNPSA-N 5,10-methylenetetrahydrofolic acid Chemical compound C1N2C=3C(=O)NC(N)=NC=3NCC2CN1C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 QYNUQALWYRSVHF-ABLWVSNPSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-M Aminoacetate Chemical compound NCC([O-])=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 description 1
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 description 1
- 241000193747 Bacillus firmus Species 0.000 description 1
- 241000193422 Bacillus lentus Species 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000149420 Bothrometopus brevis Species 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 240000001817 Cereus hexagonus Species 0.000 description 1
- 241000819038 Chichester Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 101100493587 Escherichia coli (strain K12) avtA gene Proteins 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000557 Nafion® Polymers 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001310335 Paenibacillus lentimorbus Species 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101100125907 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) ilvC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000193396 Virgibacillus pantothenticus Species 0.000 description 1
- 101100056949 Wolinella succinogenes (strain ATCC 29543 / DSM 1740 / LMG 7466 / NCTC 11488 / FDC 602W) ansA gene Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150050280 alsD gene Proteins 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 150000001449 anionic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 101150082095 ansB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- JPNZKPRONVOMLL-UHFFFAOYSA-N azane;octadecanoic acid Chemical class [NH4+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O JPNZKPRONVOMLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 235000020299 breve Nutrition 0.000 description 1
- 239000001527 calcium lactate Substances 0.000 description 1
- 235000011086 calcium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002401 calcium lactate Drugs 0.000 description 1
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 239000001175 calcium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011132 calcium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- QRTVQUYKMVAQBJ-UHFFFAOYSA-L calcium;3-aminopropanoate Chemical compound [Ca+2].NCCC([O-])=O.NCCC([O-])=O QRTVQUYKMVAQBJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000002706 hydrostatic effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 101150033780 ilvB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150090497 ilvC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150099953 ilvE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150077793 ilvH gene Proteins 0.000 description 1
- 101150060643 ilvN gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- OVGXLJDWSLQDRT-UHFFFAOYSA-L magnesium lactate Chemical compound [Mg+2].CC(O)C([O-])=O.CC(O)C([O-])=O OVGXLJDWSLQDRT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000626 magnesium lactate Substances 0.000 description 1
- 229960004658 magnesium lactate Drugs 0.000 description 1
- 235000015229 magnesium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- XKLJHFLUAHKGGU-UHFFFAOYSA-N nitrous amide Chemical compound ON=N XKLJHFLUAHKGGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 150000002891 organic anions Chemical class 0.000 description 1
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003975 potassium Drugs 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/12—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes by fermentation of natural products, e.g. of vegetable material, animal waste material or biomass
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/174—Vitamins
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Изобретение относится к пищевой промышленности. Смесь D-пантотеновой кислоты и ее солей получают культивированием микроорганизма, который продуцирует D-пантотеновую кислоту, в котором нарушена регуляция биосинтеза пантотеновой кислоты-(pan) и/или изолейцина/валина-(ilv), и который в процессе ферментации в культуральной среде производит, по меньшей мере, 2 г/л соли D-пантотеновой кислоты, причем в культуральную среду не добавляют свободный β-аланин и/или соли β-аланина, затем ферментационный раствор, содержащий D-пантотенат, под воздействием электрического поля пропускают через одну или несколько ионоселективных мембран, в результате чего низкомолекулярные ионы удаляются из содержащего D-пантотенат раствора, причем содержание в нем солей D-пантотеновой кислоты в виде одновалентных катионов снижают до концентрации меньше или равной 1 г/кг, рН раствора, содержащего свободную D-пантотеновою кислоту, добавлением кальциевых и/или магниевых оснований доводят до значения 3-10, при этом получают раствор, содержащий пантотенат кальция и/или магния, и раствор, содержащий пантотенат кальция и/или магния, подвергают сушке и/или формовке. Состав, полученный таким способом, используют в качестве кормовой добавки. Заявленное изобретение позволяет упростить процесс получения смеси пантотеновой кислоты и ее солей, а также снизить количество нежелательных примесей. 2 н. и 21 з.п. ф-лы, 1 табл.
Description
Представленное изобретение касается усовершенствованного способа получения D-пантотеновой кислоты и/или ее солей и их использования в качестве добавок при производстве кормов для животных.
В качестве исходного продукта при биосинтезе коэнзима А в организме растений и животных широко используется D-пантотенат. В отличие от людей, которые в достаточном количестве получают пантотеновую кислоту с пищей, как у растений, так и у животных часто наблюдается нехватка в организме D-пантотената. Возможность получения D-пантотената представляет, таким образом, значительный экономический интерес, в особенности при производстве корма для животных.
Традиционным способом получения D-пантотената является химический синтез из D-пантолактона и β-аланината кальция (Ulimann′s Encyctopedia of Industrial Chemistry, 6th edition, 1999, electronic release, Kapitel "Vitamins"). Для получения D-пантолактона требуется дорогостоящее, классическое разделение рацемата соли на диастереомеры. Продуктом, получаемым в результате такого химического синтеза, является главным образом кальциевая соль D-пантотеновой кислоты - D-пантотенат кальция.
По сравнению с химическим синтезом преимущество биотехнологического способа получения D-пантотената с использованием микроорганизмов заключается в селективности (энантиомерной чистоте) получаемой D-формы пантотеновой кислоты, пригодной для употребления высшими организмами. При этом из технологического процесса исключается дорогостоящая операция по разделению рацемата, которая требуется при химическом синтезе продукта.
Известно множество способов ферментационного получения D-пантотеновой кислоты с использованием микроорганизмов, описанных, в частности, в патенте США US 6,013,492, международных заявках на патент WO 96/33283, WO 97/10340, немецкой заявке на патент DE 19846499, европейских заявках на патент ЕР 0590857, ЕР 001027, ЕР 1006189, ЕР 1006192 и ЕР 1006193.
Так, в европейских заявках на патент ЕР 1 006 189 и ЕР 1001027 описывается способ получения пантотената, при котором содержание D-пантотеновой кислоты в ферментационном растворе составляет не более 1 г/л. Столь низкое содержание D-пантотеновой кислоты в ферментационном растворе, что составляет менее 10% мас. относительно содержания твердого вещества, непригодно для промышленного производства добавок к корму для животных, содержащих D-пантотеновую кислоту. Другим недостатком существующих в настоящее время способов является то, что выделение продукта из ферментационной среды требует проведение множества дорогостоящих технологических процессов. Способ получения данного продукта в промышленном масштабе пока неизвестен.
В немецкой заявке на патент DE 10016321 описывается способ ферментационного получения добавок к корму для животных, содержащих D-пантотеновую кислоту. Существенный недостаток этого способа заключается в том, что как и в вышеупомянутых способах ферментационного получения D-пантотеновой кислоты, для промышленного производства требуемого продукта микроорганизму требуется добавление в ферментационную среду предшественника пантотеновой кислоты β-аланина.
Кроме того, в патенте США US 6,013,492 и международной заявке на патент WO 96/332839 описывается выделение D-пантотеновой кислоты из ферментационного раствора путем отфильтровывания нерастворимых компонентов (например клеточного материала) из культуральной среды, адсорбирования фильтрата на активированном угле, последующего элюиования D-пантотеновой кислоты органическим растворителем, предпочтительно метанолом, нейтрализации гидроксидом кальция и затем кристаллизации D-пантотената кальция. Существенными недостатками этого способа являются потери ценного продукта, имеющие место при кристаллизации, а также использование органических растворителей, которые трудно отделяются от продукта и требуют дорогостоящей регенерации.
В европейской заявке на патент ЕР 0590857 описывается способ ферментационного получения D-пантотеновой кислоты, при котором культивирование микроорганизма требует добавления в ферментационную среду β-аланина. Ферментационный раствор сначала фильтруют для отделения клеточной массы, затем пропускают через колонку с катионообменной смолой и в завершение через колонку с анионообменной смолой, сразу же после чего нейтрализуется гидроксидом кальция, выпаривается, смешивается с активированным углем, еще раз фильтруется и после добавления, метанола и хлорида кальция кристаллизируется. Полученный продукт, содержащий пантотенат кальция имеет в своем составе помимо D-пантотеновой кислоты в виде солей кальция также хлорид кальция в молярном соотношении 1:1. Для снижения содержания хлорида кальция требуется электродиализ с последующей распылительной сушкой. Недостатком этого способа является необходимость проведения множества дорогостоящих технологических процессов и использования органических растворителей, что снижает ценность данного метода как с экономической, так и с экологической точки зрения.
Задача представленного изобретения заключается в производстве добавок к корму для животных, содержащих D-пантотеновую кислоту и/или ее соли, с использованием усовершенствованного способа получения D-пантотеновой кислоты и/или ее солей, лишенного недостатков вышеупомянутых способов. При этом из экономических соображений наиболее желательным является способ, при котором добавление β-аланина значительно снижается или вообще не требуется. Кроме того, желательно получение D-пантотеновой кислоты в виде ее двухвалентных солей, прежде всего, в виде солей щелочноземельных металлов, поскольку двухвалентные соли пантотеновой кислоты обладают меньшей гигроскопичностью, чем одновалентные соли, и при дальнейшем использовании, например, в качестве добавок при производстве кормов для животных, в меньшей степени подвержены агглютинации.
Эта задача предпочтительным образом решается в рамках представленного изобретения.
Объектом представленного изобретения является способ получения D-пантотеновой кислоты и/или ее солей, характеризующийся тем, что
а) используют, по меньшей мере, один организм, продуцирующий D-пантотеновую кислоту, в котором нарушена регуляция биосинтеза пантотеновой кислоты-(pan) и/или изолейцина/валина-(ilv), и который в процессе ферментации в культуральной среде производит, по меньшей мере, 2 г/л соли D-пантотеновой кислоты, причем в культуральную среду добавляют 0-20 г/л свободного β-аланина и/или солей β-аланина,
b) ферментационный раствор, содержащий D-пантотенат, под воздействием электрического поля пропускают через одну или несколько ионоселективных мембран, в результате чего низкомолекулярные ионы удаляются из содержащего D-пантотенат
c) раствора, содержащего свободную D-пантотеновою кислоту, добавлением кальциевых и/или магниевых оснований доводят до значений 5-10, при этом получают раствор, содержащий пантотенат кальция и/или магния, и
d) раствор, содержащий пантотенат кальция и/или магния, подвергают сушке и/или формовке.
В одном из вариантов заявленного в данном изобретении способа на стадии с) или d) получают или добавляют суспензию, содержащую пантотенат кальция и/или магния.
Ферментация на стадии а) заявленного в данном изобретении способа осуществляется по известной технологии в замкнутой культуре без подпитки, с однократной или многократной подпиткой либо в культуре с непрерывной подпиткой. При этом для нейтрализации полученной пантотеновой кислоты используется обычная буферная система, такая как, например, фосфатный буфер с растворами гидроксида натрия, гидроксида калия или аммиака.
В других вариантах заявленного в данном изобретении способа на стадии а) в результате ферментации в культуральной среде образуется, по меньшей мере, 10 г/л, предпочтительно, по меньшей мере, 20 г/л, особенно предпочтительно, по меньшей мере, 40 г/л, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 60 г/л и в особенности, по меньшей мере, 70 г/л соли D-пантотеновой кислоты.
В рамках данного изобретения под термином "продуцировать" следует понимать, что организм может синтезировать большие количества D-пантотеновой кислоты и/или ее солей, чем требуются для собственного метаболизма. В предпочтительном варианте реализации данного изобретения синтезируемая D-пантотеновая кислота и/или ее соли не накапливаются внутри клеток, но в идеале полностью поступают из организма в культуральную среду. Это выведение может осуществляться активно или пассивно по известным механизмам.
В рамках данного изобретения в качестве организмов, продуцирующих D-пантотеновую кислоту, используются микроорганизмы. К ним согласно изобретению относятся грибы, дрожжи и/или бактерии. Предпочтительным согласно данному изобретению является использование грибов или дрожжей, таких как, например, Saccharomyces или Debaromyces, предпочтительно Saccharaomyces cerevisiae. Предпочтительным согласно данному изобретению является использование бактерий coryneforme или Bacillaceae. В рамках данного изобретения предпочтительными являются такие бактерии, как Gattungen Corynebacterium, Escherichia, Bacillus, Arthrobacter, Bevibacterium, Pseudomonas, Salmonella, Klebsiella, Proteus, Acinetobacter или Rhizobium. Особенно предпочтительными являются Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium breve или Bacillus subtilis, B.licheniformis, B.amyloliquefaciens, B.cereus, B.lentimorbus, B.lentus, B.firmus, B.pantothenticus, B.circulans, B.coagulans, B.megaterium, B.pumilus, B.thuringiensis, B.brevis, B.stearothermophilus и другие виды Bacillus группы 1, характеризующиеся 16s РНК или Actinum mycetalis. Данное перечисление служит для целей пояснения и ни в коей мере не является ограничением представленного изобретения.
Кроме того, объектом представленного изобретения являются также генетически видоизмененные организмы, используемые для получения согласно данному изобретению добавок к корму для животных, содержащих свободную D-пантотеновою кислоту и/или ее соли. Такие генетически видоизмененные организмы могут быть получены, например, путем химического мутагенеза с последующей селекцией подходящим методом "скрининга". Объектом представленного изобретения также являются так называемые "продуцирующие штаммы", пригодные для получения продукта в рамках представленного изобретения и имеющие генетические изменения метаболизма D-пантотеновой кислоты, в том числе изменения, затрагивающие процесс выведения D-пантотеновой кислоты и/или ее солей через клеточную мембрану. Это может достигаться, например, путем внесения изменений в ключевых точках соответствующих метаболических путей используемого организма.
Возможно также использование трансгенных организмов, полученных с помощью гомологичных и/или гетерологичных нуклеотидных последовательностей, необходимых для синтеза нужного продукта. При этом изменения, обуславливающие избыточную экспрессию и/или нарушение регуляции одного или нескольких генов по отдельности и/или в комбинации, могут находиться в геноме и/или в используемом векторе.
Подобные трансгенные организмы предпочтительным образом могут содержать дополнительные копии и/или видоизмененные гены, из группы panB, panC, panD, paneE, и/или их комбинации, и/или даже целые экспрессионные блоки, такие как оперон panBCD. Кроме того, могут затрагиваться и другие метаболические пути используемых организмов, например, путь биосинтеза изолейцина-валина, как это описано, в частности в европейских заявках на патент ЕР 1006189, ЕР 1006192, ЕР 1006193 или ЕР 1001027. В результате этого достигается увеличение концентрации соответствующих предшественников с разветвленной цепью, требуемых для биосинтеза пантотеновой кислоты. Преимущественно это достигается посредством избыточной экспрессии генов, ответственных за этот метаболический путь т.е. ilvB, ilvN, ilvC и/или HvD.
Кроме того, в рамках данного изобретения предусматривается возможность генетических изменений, затрагивающих аспартат-α-декарбоксилазу (panD), например, посредством индуцирования избыточной экспрессии и/или нарушения регуляции соответствующего гена в организме, используемом для производства D-пантотеновой кислоты.
Под термином "нарушение регуляции" в рамках данного изобретения следует понимать следующее: изменение или модификация, по меньшей мере, одного гена, кодирующего один из ферментов биосинтетического метаболического пути, таким образом, что активность фермента внутри микроорганизма изменяется или модифицируется. Предпочтительно, что бы по меньшей мере один ген, кодирующий один из ферментов биосинтетического метаболического пути, был изменен таким образом, чтобы генный продукт образовывался более интенсивно или проявлял повышенную активность. Термин "метаболический путь с нарушенной регуляцией" включает в себя также биосинтетический метаболический путь, в котором несколько генов, кодирующих несколько ферментов, изменены или модифицированы таким образом, что активности нескольких ферментов изменяются или модифицируются.
Возможные изменения или модификации включают в себя, не ограничиваясь этим, следующее: удаление эндогенного промотора или регуляторных элементов; введение более сильных промоторов, индуцируемых промоторов или нескольких промоторов одновременно; удаление регуляторных последовательностей, влияющих на экспрессию генного продукта; изменение расположения гена внутри хромосомы; изменение последовательности ДНК вблизи гена или внутри него, например, участков связывания рибосом (RBS); увеличение количества копий гена в геноме или введение плазмид, содержащих различное количество копий данного гена; модификация белков (например, регуляторных белков, супрессоров, энхансеров, активаторов транскрипции, и тому подобных), участвующих в процессах транскрипции гена и/или транскляции с образованием соответствующего генного продукта. Сюда относятся также любые другие возможности нарушения регуляции экспрессии гена, доступные современной технологии, таки, например, как использование антисмысловых олигонуклеотидов, или блокирование репрессорных белков.
Нарушение регуляции предусматривает также изменения в кодирующей области гена, приводящие, например, к устранению обратной связи в системе регуляции синтеза генного продукта или к повышению или снижению специфической активности генного продукта.
Кроме того, в рамках данного изобретения преимущественными являются такие генноинженерные изменения ферментов, которые влияют на превращение предшественников пантотеновой кислоты в соответствующий продукт и/или пантотеновой кислоты в коэнзим А. Примером генов, кодирующих таких ферменты, являются: alsD, avtA, ilvE, ansB, coaA, coaX и многие другие. Данное перечисление служит для целей пояснения и ни в коей мере не является ограничением представленного изобретения.
Кроме того, преимущественными являются такие генноинженерные изменения, которые обеспечивают накопление в клетках кофакторов (таких как метилентетрагидрофолат, редокс эквиваленты и другие), в оптимальной для производства пантотеновой кислоты концентрации.
В предпочтительном варианте исполнения β-аланин должен присутствовать в клетках в более высокой концентрации, чем у генетически не видоизмененных организмов, что позволило бы избежать добавления его в культуральную среду, как это требуется, например, в европейской заявке на патент ЕР-А-0 590857. Предпочтительными являются микроорганизмы с нарушенной регуляцией биосинтеза пантотеновой кислоты-(pan) и/или изолейцина/валина-(ilv) и/или аспартат-α-декарбоксилазы (panD). Кроме того, предпочтительным является также дополнительная избыточная экспрессия в микроорганизмах кетопантоат-редуктазы (panE).
Кроме того, в рамках данного изобретения может быть предпочтительным, снижение активности или (например, в различных видах Bacillus) полное выключение гена соаА, необходимого для синтеза коэнзима А. Для этой ферментационной функции Bacillus содержит помимо гена соаА другой ген (=соаХ). Активность этого гена соаХ или соответствующего фермента также может быть изменена, предпочтительно снижена, или даже полностью подавлена, поскольку соаА сам по себе проявляет еще достаточную, хотя и сниженную ферментативную активность, т.е. ферментативная активность соаА теряется неполностью. Помимо избыточной экспрессии различных генов предпочтительными являются также генетические манипуляции с промоторными областями этих генов, которые приводят к избыточной экспрессии генного продукта.
В одном из вариантов осуществления представленного изобретения используются бактериальные штаммы, описанные в заявке PCT/US00/25993, например, Bacillus subtilis PA 824 и/или их производные. В другом варианте осуществления изобретения в соответствии с заявленным в данном изобретении способом используется микроорганизм Bacillus subtilis PA 668, описанный в заявке США серийный номер 60/262, 995. Эти штаммы Bacillus subtilis PA 824 и PA 668 могут быть получены следующим образом:
Исходя из штамма Bacillus subtilis 168 (штамм Marburg ATCC 6051), обладающего генотипом trpC2 (Trp-), путем трансдукции маркера Trp+ (из Bacillus subtilis дикого типа W23) был получен штамм PY79. В штамм PY79 классическими генноинженерными методами (например, описанными в литературе Harwood, C.R. и Cutting, S.M. (редакторы), Molecular Biological Methods for Bacillus (1990) John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, England) вносились мутации ΔpanB и ΔpanE1.
Полученный штамм трансформировался геномной ДНК штамма РА221 Bacillus subtilis (генотип P26panBCD, trpC2 (Trp-)) и геномной ДНК штамма РА303 Bacillus subtilis (генотип P26panE1). Полученный штамм РА327 имеет генотип P26panBCD, P26panE1 и является ауксотрофным по триптофану (Trp-). При использовании штамма РА327 Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY (смесь 25 г/л телячьего инфузионного бульона Difco, 5 г/л дрожжевого экстракта Difco, 5 г/л глутамата натрия, 2,7 г/л сульфата аммония растворяют в воде для получения 740 мл раствора, автоклавируют, после чего добавляют 200 мл раствора 1 М фосфата калия, рН 7,0 и 60 мл 50% стерильного раствора глюкозы) с добавлением 5 г/л β-аланина и 5 г/л α-кетоизовалерата удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 3,0 г/л (24 часа).
Получение штамма РА221 Bacillus subtilis (генотип P26panBCD, trpC2 (Trp-)) описывается в следующем разделе:
Классическими генноинженерными методами с помощью последовательности оперона panBCD E.coli (смотрите Merkel et al., FEMS Microbiol. Lett., 143, 1996:247-252), исходя из плазмидной библиотеки Bacillus subtilis GP275 был клонирован оперон panBCD Bacillus. Для клонирования использовался штамм ВМ4062 E.coli (birts) и информация, что оперон Bacillus располагается рядом с геном panA. Оперон panBCD вставлялся в реплицируемую в E.coli плазмиду. Для повышения экспрессии оперона panBCD промотор заменялся сильным, конститутивным промотором фага Bacillus subtilis SP01 (Р26), а участок связывания рибосом (=RBS) перед геном panB искусственным участком связывания. Перед блоком P26panBCD в плазмиде вставлялся фрагмент ДНК, расположенный непосредственно перед геном panB в нативном геноме Bacillus. Эта плазмида трансформировалась в штамм RL-1 Bacillus subtilis (полученное путем классического мутагенеза производное Bacillus subtilis 168 (штамм Marburg ATCC 6051), генотип trpC2 (Trp-)) и в результате гомологичной рекомбинации нативный оперон panBCD заменялся опероном p26panBCD. Полученный штамм называется РА221 и имеет генотип P26panBCD, trpC2 (Trp-).
При использовании штамма РА221 Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY с добавлением 5 г/л β-аланина и 5 г/л α-кетоизовалерата удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 0,92 г/л (24 часа).
Получение штамма РА303 Bacillus subtilis (генотип Р26раnЕ1) описывается в следующем разделе:
С помощью последовательности гена panE E.coli аналогичным образом клонировалась последовательность гена panE Bacillus. Оказалось, что в геноме Bacillus subtilis присутствует два гомолога гена panE E. coli, получившие названия panE1 и panE2. При анализе результатов делеций того и другого гена оказалось, что ген panE1 ответственен за производство 90% пантотеновой кислоты, тогда как делеция гена panE2 не оказывала значительного эффекта на уровень производства пантотеновой кислоты. Здесь также как и при клонировании оперона panBCD промотор был заменен сильным конститутивным промотором Р26, а участок связывания рибосом перед геном panE1 искусственным участком связывания. Фрагмент Р26раnЕ1 клонировался в вектор, который был сконструирован таким образом, что бы фрагмент Р26раnЕ1 мог встраиваться в исходный локус panE1 в геноме Bacillus subtilis. Полученный в результате трансформации и гомологичной рекомбинации штамм называется РА303 и имеет генотип P26panE1. При использовании штамма РА303 Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY с добавлением 5 г/л β-аланина и 5 г/л α-кетоизовалерата удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 1,66 г/л (24 часа).
Дальнейшее конструирование штамма осуществлялось путем трансформация РА327 плазмидой, содержащей оперон P26ilvBNC и маркерный ген спектиномицина. Оперон P26ilvBNC встраивался в локус amyE, что было показано методом ПЦР. Полученный штамм получил название РА340 (генотип P26panBCD, Р26раnЕ1, P26ilvBNC, specR, trpC2 (Trp-)).
При использовании штамма РА340 Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY с добавлением только 5 г/л β-аланина удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 3,6 г/л (24 часа), в 10 мл культуры в среде SVY с добавлением 5 г/л β-аланина и 5 г/л α-кетоизовалерата удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 4,1 г/л (24 часа).
Затем в штамм РА340 вводился нерегулируемый блок ilvD. Для этого в штамм РА340 трансформировалась плазмида, содержащая ген ilvD под контролем промотора Р26 с искусственным участком связывания рибосом RBS2. При этом ген P26ilvD в результате гомологичной рекомбинации встраивается в исходный локус ilvD. Полученный штамм РА374 имеет генотип P26panBCD, Р26раnЕ1, P26ilvBNC, P26ilvD, specR и trpC2 (Trp-).
При использовании штамма РА374 Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY с добавлением только 5 г/л β-аланина удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 2,99 г/л (24 часа).
Для продуцирования пантотеновой кислоты с помощью штамма РА374 без добавки β-аланина, в штамм РА374 вносились дополнительные копии гена panD, кодирующего аспартат-α-декарбоксилазу. Для этого в штамм РА374 трансформировалась хромосомная ДНК штамма РА401. Путем селекции на тетрациклине был получен штамм РА377. Полученный штамм РА377 имеет генотип P26panBCD, Р26раnЕ1, P26ilvBNC, P26ilvD, specR, tetR и trpC2 (Trp-).
При использовании штамма РА377 Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY без добавления предшественника удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 1,31 г/л (24 часа).
Получение штамма РА401 Bacillus subtilis (генотип P26panD) описывается в следующем разделе:
Ген panD Bacillus subtilis клонировался из оперона panBCD в вектор, содержащий маркерный ген устойчивости к тетрациклину. Перед геном panD клонировался промотор P26 и один из вышеописанных искусственных участков связывания рибосом. Путем обработки рестриктазами был получен фрагмент, содержащий маркерный ген устойчивости к тетрациклину и ген P26panD. Выделенный фрагмент религировался и трансформировался в вышеописанный штамм РА221. При этом фрагмент встраивался в геном штамма РА211. Полученный штамм РА401 имеет генотип P26panBCD, P26panD, tetR и trpC2 (Trp-).
При использовании штамма РА401 Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY с добавлением 5 г/л α-кетоизовалерата удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 0,3 г/л (24 часа). В 10 мл культуры в среде SVY с добавлением 5 г/л D-пантотеновой кислоты и 10 г/л L-аспартата удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 2,2 г/л (24 часа).
Исходя из штамма РА377, путем трансформации хромосомной ДНК штамма PY79 был получен прототрофный по триптофану штамм. Этот штамм РА824 имеет генотип P26panBCD P26panE1, P26ilvBNC, P26ilvD, specR, tetR и Trp+.
При использовании штамма РА824 Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY без добавления предшественника удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 4,9 г/л (48 часов) (по сравнению с РА377:3,6 г/л за 48 часов).
Получение штамма РА668 описывается в следующем разделе:
Ген panB Bacillus subtilis клонировался из оперона panBCD дикого типа и вставлялся в вектор, содержащий помимо гена устойчивости к хлорамфениколу также последовательности локуса vpr Bacillus subtilis.
Сильный конститутивный промотор Р26 вставлялся перед 5′ концом гена panB. Путем обработки рестриктазами был получен фрагмент, содержащий ген Р26panB, маркерный ген устойчивости к хлорамфениколу, а также последовательности vpr Bacillus subtilis. Выделенный фрагмент религировался и трансформировался в штамм РА824. Полученный штамм получил название РА668. Полученный штамм РА668 имеет генотип P26panBCD, Р26раnЕ1, P26ilvBNC, P26ilvD, Р26panB, specR, tetR, CmR and Trp+.
Были выделены две колонии штамма РА668, получившие названия РА668-2А и РА668-24.
При использовании штамма РА668-2А Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY без добавления предшественника в течение 48 часов удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 1,5 г/л. В 10 мл культуры с добавлением 10 г/л L-аспартата удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 5 г/л.
При использовании штамма РА668-24 Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY без добавления предшественника в течение 48 часов удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 1,8 г/л. В 10 мл культуры с добавлением 10 г/л L-аспартата удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 4,9 г/л.
Точная конструкция этого штамма описана в заявках США серийный номер 60/262,995 и PCT/US00/25993.
При использовании вышеописанного штамма РА377 в процессе лимитируемой по глюкозе ферментации в среде SVY (25 г/л телячьего инфузионного бульона Difco, 5 г/л дрожжевого экстракта Difco, 5 г/л триптофана, 5 г/л глутамата натрия, 2 г/л (NH4)2SO4, 10 г/л КН2PO4, 20 г/л К2HPO4, 0,1 г/л CaCl2, 1 г/л MgSO4, 1 г/л цитрата натрия, 0,01 г/л FeSO4 ×7Н2O и 1 мл/л микроэлементного солевого раствора следующего состава: 0,15 г Na2MoO4×2H2O, 2,5 г Н3ВО3, 0,7 г CoCl2×6H2O, 0,25 г CuSO4×5H2O, 1,6 г MnCl2×4H2O, 0,3 г ZnSO4×7Н2O, растворяют в воде для получения 1 литра раствора)) в объеме 10 л при непрерывном добавлении раствора глюкозы в течении 36 часов (48 часов) удается достичь концентрации пантотеновой кислоты в ферментационном растворе 18-19 г/л (22-25 г/л).
При использовании штамма РА824, прототрофного по триптофаку производного от штамма РА377, в процессе лимитируемой по глюкозе ферментации в среде на дрожжевом экстракте (10 г/л дрожжевого экстракта Difco, 5 г/л глутамата натрия, 8 г/л (NH4)2SO4, 10 г/л КН2PO4 20 г/л К2HPO4 0,1 г/л CaCl2, 1 г/л MgSO4, 1 г/л цитрата натрия, 0,01 г/л FeSO4×7Н2О и 1 мл/л вышеописанного микроэлементного солевого раствора) в объеме 10 л при непрерывном добавлении раствора глюкозы глюкозы в течении 36 ч, 48 ч и 72 ч удается достичь следующих значений концентрации пантотеновой кислоты в ферментационном растворе: 20 г/л, 28 г/л и 36 г/л.
Путем дальнейшей оптимизации среды при использовании штамма РА824 в процессе лимитируемой по глюкозе ферментации в среде, состоящей из 10 г/л дрожжевого экстракта Difco, 10 г/л нитрозоамина A (Quest International GmbH, Erftstadt), 10 г/л глутамата натрия, 4 г/л (NH4)2SO4, 10 г/л КН2PO4 20 г/л К2HPO4 0,1 г/л CaCl2, 1 г/л MgSO4, 1 г/л цитрата натрия, 0,01 г/л FeSO4×7Н2O и 1 мл/л вышеописанного микроэлементного солевого раствора, в объеме 10 л при непрерывном добавлении раствора глюкозы в течение 36 часов (48 часов) удается достичь концентрации пантотеновой кислоты в ферментационном растворе 37 г/л (48 г/л).
Дополнительное повышение концентрации пантотеновой кислоты в ферментационном растворе возможно путем дальнейшей оптимизации среды, увеличения продолжительности ферментации, усовершенствования технологических процедур и используемого штамма, а также посредством комбинации предложенных мер. Кроме того, указанные выше концентрации пантотеновой кислоты могут быть достигнуты посредством ферментации с использованием штаммов, являющихся производными вышеописанного штамма РА824. Этипроизводные могут быть получены путем классических методов разработки штаммов, а также с помочью генноинженерных манипуляций. Путем усовершенствования среды, штаммов и технологии ферментатации можно добиться повышения концентрации пантотеновой кислоты в ферментационном растворе до 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, и более 90 г/л.
Существенным преимуществом заявленного в данном изобретении способа является то, что ферментация протекает в культуральной среде, которая помимо источников углерода и азота в качестве исходных соединений не содержит других предшественников конечного продукта. Т.е. биосинтез D-пантотеновой кислоты является независимым от добавки других предшественников. Под такими предшественниками в рамках данного изобретения следует понимать такие вещества как, β-аланин и/или L-аспартат и/или L-валин и/или α-кетоизовалерат и/или их комбинации.
В предпочтительном варианте заявленного в данном изобретении способа ферментация осуществляется продуцирующим D-пантотеновую кислоту организмом, в культуральной среде, содержащей один источник углерода и один источник азота, но без добавления свободного β-аланина и/или солей β-аланина до или в процессе ферментации. То есть, для получения D-пантотеновой кислоты в концентрации, по меньшей мере, 10 г/л культуральной среды, предпочтительно, по меньшей мере, 20 г/л, особенно предпочтительно, по меньшей мере, 40 г/л, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 60 г/л и в особенности, по меньшей мере, 70 г/л, согласно изобретению не требуется добавление свободного β-аланина и/или солей β-аланина. Независимость от добавления предшественника представляет собой важное с экономической точки зрения преимущество заявленного в данном изобретении способа по сравнению с известными способами, поскольку большинство предшественников являются очень дорогостоящими.
Впрочем, в рамках данного изобретения не исключается добавление β-аланина и/или солей β-аланина в культуральную среду, таким образом выход D-пантотеновой кислоты может быть дополнительно увеличен путем добавления β-аланина и/или солей β-аланина. При этом исходят из того, что если все требуемые предшественники пантотеновой кислоты имеются в достаточном количестве, и дополнительное увеличение производства пантотеновой кислоты ограничивается лишь активность гена panD, то выход D-пантотеновой кислоты можно повысить, например, еще на 50%, путем добавления свободного β-аланина и/или солей β-аланина. В одном из предпочтительных вариантов представленного изобретения для дополнительного повышения выхода D-пантотеновой кислоты более чем на 50% в культуральную среду может добавляться до 20 г/л свободного β-аланина и/или солей β-аланина. Предпочтительным является добавление в культуральную среду примерно 15 г/л свободного β-аланина и/или солей β-аланина.
Примерами подходящих в рамках данного изобретения источников углерода, добавляемых в культурапьную ферментационную среду с вышеупомянутыми микроорганизмами, являются сахара, такие как крахмальные гидролизаты (моно-, ди-, и олигосахариды), предпочтительно глюкоза или сахароза, а также свекольная или тростниковая сахарная патока, белки, белковые гидролизаты, соевая мука, кукурузный сок, жиры, свободные жирные кислоты, клетки, полученные в результате ферментационных процессов, или их гидролизаты, а также дрожжевой экстракт. Данное перечисление не может рассматриваться в качестве ограничения представленного изобретения.
Кроме того, предпочтительный способ, заявленный в данном изобретении, характеризуется тем, что общее содержание сахара в растворе к концу ферментационного процесса должно быть по возможности сведено к минимуму, поскольку иначе он в результате склеивания затрудняет последующую сушку и/или формовку ферментационного раствора. Этого, согласно данному изобретению, можно добиться, продолжая ферментацию еще некоторое время после того, как источник углерода будет исчерпан (при культивировании в замкнутой культуре без подпитки), или после того, как прекратится подача источника углерода (при протекании процесса в культуре с однократной или многократной подпиткой), и/или отрегулировав процесс таким образом, чтобы концентрация источника углерода в конце процесса практически обращалась в нуль (в культуре с однократной или многократной подпиткой либо в культуре с непрерывной подпиткой).
Это, согласно изобретению, достигается тем, что после прекращения подачи источника углерода (например, сахарного раствора) ферментация продолжается до тех пор, пока концентрация растворенного кислорода (pO2) не достигнет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно 90% и особенно предпочтительно 95% от значения насыщения в ферментационном растворе.
Примерами подходящих согласно изобретению источников азота являются аммиак, сульфат аммония, мочевина, белки, белковые гидролизаты или дрожжевой экстракт. Данное перечисление не может рассматриваться в качестве ограничения представленного изобретения.
Кроме того, ферментационная среда содержит минеральные соли и/или микроэлементы, а также аминокислоты и витамины. Точные составы подходящих ферментационных сред хорошо известны специалистам в данной области.
После затравки ферментационной среды подходящим, продуцирующим D-пантотеновую кислоту микроорганизмом (с известными специалистам плотностями клеток) осуществляется, после добавления при необходимости противопенной присадки, культивирование данного микроорганизма. При необходимости отрегулировать значение рН среды можно при помощи различных неорганических или органических щелочей или кислот, таких, например, как гидроксид натрия, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота, серная кислота, соляная кислота, муравьиная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота и т.д.
В зависимости от используемой при ферментации буферной системы, которая, как описано выше, может включать в себя такие компоненты, как гидроксид натрия, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота, серная кислота, соляная кислота, муравьиная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота и т.д., образующаяся в ферментационном растворе D-пантотеновая кислота может находиться в виде соответствующей соли (солей). Поскольку при этом наличие одновалентных катионов солей D-пантотеновой кислоты представляется нежелательным, и предпочтительным является получение D-пантотеновой кислоты в виде ее кальциевых или магниевых солей, согласно изобретению ферментационный раствор подвергают обработке методом электрического разделения на мембране.
Таким образом, представленное изобретение включает в себя все доступные методы электрического разделения на мембране, такие как мембранный электролиз или электродиализ. Выбор подходящего метода предоставляется специалисту в данной области. В рамках данного изобретения предпочтительным является использование электродиализа. При этом используются как электродиализ с применением исключительно монополярных мембран, так и электродиализ с применением моно- и/или биполярных мембран. Наиболее предпочтительными представляются методы электродиализа с использованием исключительно монополярных мембран, особенно электродиализ с использованием селективных для одновалентных ионов монополярных мембран, так называемых моноселективных мембран.
В принципе, для реализации заявленного в данном изобретении способа могут использоваться любые мембраны, обычно применяемые при электродиализе. Для проведения электродиализа в рамках данного изобретения преимущественно используются имеющиеся в продаже ионообменные мембраны.
В качестве анионообменных мембран могут использоваться, например, мембраны Neosepta AMI, AM2, АМ3, АМХ, АМН, AFN, производства Tokuyama Corp. и AMV производства Asahi Glass.
В качестве катионообменных мембран могут использоваться, например, мембраны Neosepta СМ1, СМ2, СМХ, СМН, СМВ, Asahi Glass CMV, а также Nafion 435 или 350 производства Du Pont de Nemours.
В качестве моноселективной катионообменной мембраны может использоваться, например, мембрана Neosepta CMS.
В качестве моноселективных ионообменных мембран могут использоваться, например, мембраны Neosepta ACS производства Tokuyama Corp. или Selmion ASV производства Asahi Glass in Betracht.
В качестве материала для электрода могут использоваться нержавеющая сталь, никель, благородные металлы, например платина, и другие материалы, известные специалистам в данной области.
При использовании монополярного электродиализа в рамках данного изобретения как анионы, так и катионы из содержащего D-пантотенат раствора могут под действием электрического поля мигрировать через анионно- или катионообменные мембраны во второй раствор (раствор концентрата, KONZ) и, в результате удаляются из содержащего пантотеновую кислоту раствора (раствор дилюата, DIL). Преимущественно, согласно изобретению, из содержащего пантотеновую кислоту раствора удаляются низкомолекулярные ионы. Под низкомолекулярными ионами в рамках данного изобретения следует понимать ионы, входящие в состав культуральной среды и/или буферной системы, но являющиеся нежелательными в конечном продукте, к ним относятся, в частности, следующие ионы: ионы аммония, калия, натрия, железа, хлорид-ионы, фосфат-ионы или сульфат-ионы.
В другом варианте реализации представленного изобретения осуществляется ионный обмен одновалентных катионов, таких как ионы натрия или аммония, на многовалентные катионы, такие как ионы кальция. При этом используются катионообменные мембраны селективные для одновалентных ионов. Так, например, в первую камеру I помещается раствор хлорида кальция, а во вторую камеру II, отделенную от камеры I катионообменной мембраной, раствор D-пантотеновой кислоты, содержащий одновалентные катионы. Затем в третью камеру III через установленную между камерой II и камерой III, селективную для одновалентных ионов катионообменную мембрану, переносятся преимущественно одновалентные катионы. Одновременно из камеры I в камеру III через установленную между камерой I и камерой III анионообменную мембрану переносятся анионы, такие как хлорид-ионы. Ионы кальция переносятся из камеры I в камеру II через катионообменную мембрану. Таким образом, непосредственно образуется D-пантотенат кальция. При наличии солей слабых кислот, таких как, например, пантотеновая кислота, с помощью подобной системы можно также получать свободную D-пантотеновую кислоту, если вместо раствора хлорида кальция в камеру I поместить водный раствор соляной кислоты.
При реализации представленного изобретения могут также использоваться соли кальция и/или магния в виде неорганических или органических анионов. Преимущественно в рамках данного изобретения используются хлорид, нитрат, гидроксид, формиат, ацетат, пропионат, глицинат и/или лактат кальция и/или магния.
В одном из вариантов осуществления представленного изобретения в процессе проведения биполярного электродиализа преимущественно катионы переносятся (при одновременном образовании протонов в результате диссоциации воды в биполярной мембране) из содержащего D-пантотенат раствора через катионообменную мембрану во второй раствор и таким образом удаляются из содержащего пантотеновую кислоту раствора. Во втором растворе при взаимодействии с образовавшимися в результате диссоциации воды в биполярной мембране гидроксид-ионами перенесенные катионы образуют соответствующие основания.
В другом варианте осуществления представленного изобретения в процессе проведения биполярного электродиализа преимущественно анионы переносятся (при одновременном образовании гидроксид-ионов в результате диссоциации воды в биполярной мембране) из содержащего D-пантотенат раствора через анионообменную мембрану во второй раствор и таким образом удаляются из содержащего пантотеновую кислоту раствора. Во втором растворе при взаимодействии с образовавшимися в результате диссоциации воды в биполярной мембране протонами перенесенные анионы образуют соответствующие кислоты.
Данное изобретение предусматривает также вариант осуществления, при котором в процессе проведения биполярного электродиализа с одной стороны анионы (при одновременном образовании гидроксид-ионов в результате диссоциации воды в биполярной мембране) переносятся из содержащего D-пантотенат раствора через анионообменную мембрану во второй раствор и таким образом удаляются из содержащего пантотеновую кислоту раствора, а с другой стороны катионы (при одновременном образовании протонов в результате диссоциации воды в биполярной мембране), переносятся из содержащего D-пантотенат раствора через катионообменную мембрану в третий раствор и таким образом удаляются из содержащего пантотеновую кислоту раствора. Во втором растворе при взаимодействии с образовавшимися в результате диссоциации воды в биполярной мембране протонами перенесенные анионы образуют соответствующие кислоты, а в третьем растворе при взаимодействии с образовавшимися в результате диссоциации воды в биполярной мембране гидроксид-ионами перенесенные катионы образуют соответствующие основания.
В рамках данного изобретения при реализации представленного способа предпочтительным является также, доведение, с помощью кислот или оснований, значения рН содержащего D-пантотенат раствора до изоэлектрического значения рН D-пантотеновой кислоты. Благодаря этому можно еще больше повысить выход свободной D-пантотеновой кислоты и, соответственно, снизить потери.
Использование монополярного электродиализа является особенно предпочтительным, поскольку по сравнению с биполярным электродиализом он гораздо дешевле.
Биполярный электродиализ используется преимущественно тогда, когда добавление кислот или оснований для доведения значения рН не допускается, или когда предполагается последующее использование образующихся кислот или оснований.
Все варианты электродиализа, используемые в данном изобретении, обладают тем преимуществом, что они не приводят к появлению сточных вод, которые образуются при регенерации ионообменных смол.
Использование заявленного в данном изобретении метода электрического разделения позволяет преимущественно удалять нежелательные низкомолекулярные ионы (посторонние ионы), такие как ионы аммония, калия, натрия, железа, хлорид-ионы, фосфат-ионы или сульфат-ионы, из содержащего D-пантотенат раствора. В результате образуется преимущественно свободная D-пантотеновая кислота или нужные соли, такие как D-пантотенат кальция и/или магния. Согласно данному изобретению содержание в растворе одновалентных катионов, преимущественно ионов аммония, калия и/или натрия, доводится до концентрации меньше или равной 1 г/кг.
Также можно существенно снизить содержание нежелательных анионов, таких, например, как хлорид-ионы, фосфат-ионы или сульфат-ионы, путем использования соответствующей ионообменной мембраны, предпочтительно, анионообменной мембраны.
Полученный таким образом раствор, содержащий свободную D-пантотеновую кислоту согласно изобретению путем добавления кальциевых и/или магниевых оснований доводят до значения рН от 3 до 10. Предпочтительными являются значения рН от 5 до 10. Предпочтительным является доведение рН раствора до значений 5-9, особенно предпочтительно до значений 6-9 и в особенности до значений 6-8. Таким образом получают раствор, содержащий пантотенат кальция и/или магния. Предпочтительно для нейтрализации в раствор добавляют гидроксид кальция, карбонат кальция, оксид кальция, гидроксид магния и/или основной карбонат магния в виде твердого вещества и/или в виде водной суспензии.
При этом предпочтительным согласно изобретению является нейтрализация содержащего свободную D-пантотеновою кислоту раствора с помощью кальциевых и/или магниевых оснований в виде водной суспензии. При использовании водной суспензии нейтрализация протекает быстрее и без больших колебаний значения рН чем при использовании соответствующих компонентов в виде твердого вещества.
Заявленный в данном изобретении способ характеризуется тем, что в раствор на стадии с) добавляют водную суспензию, содержащую 2-55% мас., предпочтительно 10-50% мас. и особенно предпочтительно 20-40% мас. гидроксида кальция.
Кроме того, данное изобретение включает в себя способ, при котором в раствор на стадии с) добавляют водную суспензию, содержащую 2-65% мас., предпочтительно 10-50% мас. и особенно предпочтительно 20-40% мас. карбоната кальция. В другом варианте осуществления представленного изобретения в раствор на стадии с) добавляют водную суспензию, содержащую 2-60% мас., предпочтительно 10-50% мас. и особенно предпочтительно 20-40% мас. гидроксида магния. Данное изобретение включает в себя также способ, при котором в раствор на стадии с) добавляют водную суспензию, содержащую 2-25% мас., предпочтительно 10-20% мас. основного карбоната магния.
Сушка и/или формовка раствора или суспензии, содержащих пантотенат кальция и/или магния осуществляется известными методами, например, такими, как распылительная сушка, распылительная грануляция, сушка в вихревом слое, грануляция в вихревом слое, сушка в барабанной сушилке или термическая сушка во вращающейся сушилке (Ullmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th edition, 1999, электронная версия, Kapitel "Drying of Solid Materials"). Температура газа на входе при конвекционной сушке составляет от 100 до 280°С, предпочтительно от 120 до 210°С. Температура газа на выходе составляет от 50 до 180°С, предпочтительно от 60 до 150°С. Для обеспечения требуемого распределения по размеру частиц, которым определяются связующие свойства продукта, мелкие частицы могут улавливаться и возвращаться назад. Кроме того, крупные комки могут быть измельчены в порошок и затем также возвращены назад.
Преимуществом представленного изобретения является сокращение при использовании представленного выше способа дорогостоящих технологических процессов, в особенности отказ от использования органических растворителей, при одновременном получении нужного продукта, обладающего высокой биологической ценностью. Кроме того, при использовании заявленному в данном изобретении способа можно значительно снизить количество образующихся сточных вод. Это дает дополнительную экономию на дорогостоящих установках по переработке и утилизации отходов. Таким образом, способ, заявленный в данном изобретении, обладает тем преимуществом, что он проще, надежнее, быстрее, значительно дешевле и, соответственно, экономичнее, чем традиционный способ.
Это, однако, не исключает некоторых вариаций заявленного в данном изобретении способа. Указанные в начале технологические стадии заявленного в данном изобретении способа с а) по d), могут быть дополнены одним или несколькими дополнительными стадиями, которые сами по себе известны специалистам в данной области. При этом данное изобретение включает в себя все мыслимые комбинации этих дополнительных (факультативных) технологических стадий с (существенными) технологическими стадиями с а) по d).
Так, растворы, полученные на стадиях а)-с), могут, например, подвергнуться обеззараживанию путем нагревания (стерилизация) или другими методами, такими, например, как пастеризация или стерильная фильтрация.
В других вариантах заявленного в данном изобретении способа перед сушкой и/или формовкой раствора возможно дополнительное проведение одной или нескольких процедур, включая лизирование и/или подавление жизнедеятельности клеток и/или отделение клеточной массы от ферментационного раствора и/или дополнительная добавка наполнителей и/или концентрирование ферментационного раствора, предпочтительно путем дегидратации.
Таким образом, объектом представленного изобретения является также способ, при котором лизирование и/или подавление жизнедеятельности клеток проводится еще в ферментационном растворе или сразу же после отделения клеточной массы от ферментационного раствора. Это может осуществляться, в частности, путем термической обработки, предпочтительно при температуре 80-200°С и/или кислотной обработки, предпочтительно серной или соляной кислотой, и/или ферментативным способом, предпочтительно с помощью лизоцима.
В другом варианте осуществления представленного изобретения клетки ферментирующих микроорганизмов могут быть путем фильтрации, сепарации (например центрифугирования) и/или декантации удалены из раствора или суспензии, полученных на стадиях а), b) или с) заявленного в данном изобретении способа. Возможно также непосредственное пропускание раствора или суспензии, полученных на стадиях а), b) или с) без отделения содержащихся в нем микроорганизмов под воздействием электрического поля через одну или несколько ионоселективных мембран.
Полученный в результате мембранного электролиза или электродиализа раствор может сразу же после нейтрализации выпариваться для повышения его концентрации в соответствующем испарителе, например, тонкопленочном испарителе или испарителе вращающегося типа. Такие испарители производятся, в частности, фирмами GIG (4800 Attnang Пухайм, Австрия), GEA Canzler (52303 Дюрен, Германия), Diessel (31103 Хильдес-хайм, Германия) и Pitton (35274 Кирхайн, Германия).
Для улучшения красящих свойств конечного продукта, может использоваться дополнительная стадия фильтрации, при которой в полученные посредством указанного способа растворы добавляют некоторое количество активированного угля, после чего содержащая активированный уголь суспензию фильтруют. Полученные в процессе ферментации растворы могут также пропускаться через тонкий слой активированного угля. Требуемые для этого количества добавляемого активированного угля составляют менее 1% мас. ферментационного раствора и устанавливаются по усмотрению соответствующего специалиста.
Этот процесс можно облегчить, если перед фильтрацией в соответствующий раствор добавить обычное коагулирующее средство (например Sedipur CF 902 или Sedipur CL 930 производства фирмы BASF AG, Ludwigshafen).
В одном из предпочтительных вариантов осуществления представленного изобретения ферментационный раствор стерилизуют путем нагревания и затем путем центрифугирования, фильтрации или декантации отделяют от клеточной массы. После добавления обычного коагулирующего средства из расчета 50-1000 мг/кг, предпочтительно 100-200 мг/кг ферментационный раствор фильтруют через тонкий слой активированного угля и песка, для получения свободного от клеточной массы раствора с высоким содержанием D-пантотеновой кислоты. В завершение полученный таким образом раствор под воздействием электрического поля пропускают через одну или несколько ионоселективных мембран.
Последующая сушка раствора, содержащего пантотенат кальция и/или магния может осуществляться, например, путем распылительной сушки. Она может протекать в прямоточном, противоточном или смешанном процессе. Для распыления могут использоваться все известные распылители, в частности центробежные распылители, распылители с однокомпонентными или двухкомпонентными насадками. Предпочтительный температурный диапазон сушки составляет 150-250°С на входе в барабан и 70-130°С на выходе из барабана. Сушка также может проводиться при более высоких или более низких температурах. Для максимального удаления остаточной влаги может дополнительно проводиться сушка в вихревом слое.
Распылительная сушка также может проводиться в сушилках типа FSD (Fluidized Spray Dryer) или SBD (Spray Bed Dryer), производимых фирмами Niro (Копенгаген, Дания) и APV-Anhydro (Копенгаген, Дания), в которых реализуется комбинация распылительной сушки и сушки в вихревом слое. При распылительной сушке в сушилку может добавляться вспомогательное средство. Это позволяет уменьшить покрытие стенок сушилки и улучшить характер течения мелкозернистого порошка. В качестве вспомогательного средства могут использоваться, в частности, силикаты, стеараты, фосфаты и кукурузный крахмал.
В принципе сушка также может осуществляться путем распыления вихревом слое, причем протекать как в непрерывном, так и в прерывистом режиме. Подача раствора или суспензии может осуществляться сверху (Topspray), снизу (Bottomspray) или сбоку (Sidespray).
Объектом представленного изобретения является, кроме того, состав для использования в качестве добавок и/или дополнения к корму для животных, при производстве которого
a) используют, по меньшей мере, один организм, продуцирующий D-пантотеновую кислоту, в котором нарушена регуляция биосинтеза пантотеновой кислоты-(pan) и/или изолейцина/валина-(ilv), и который в процессе ферментации в культуральной среде производит, по меньшей мере, 2 г/л соли D-пантотеновой кислоты, причем в культуральную среду добавляют 0-20 г/л, предпочтительно 0 г/л, свободного β-аланина и/или солей β-алакина,
b) ферментационный раствор, содержащий D-пантотенат, под воздействием электрического поля пропускают через одну или несколько ионоселективных мембран, в результате чего низкомолекулярные ионы удаляются из содержащего D-пантотенат раствора
c) рН раствора, содержащего свободную D-пантотеновою кислоту, добавлением кальциевых и/или магниевых оснований доводят до значения 3-10, при этом получают раствор, содержащий пантотенат кальция и/или магния, и
d) раствор, содержащий пантотенат кальция и/или магния, подвергают сушке и/или формовке.
В одном из вариантов представленного изобретения состав характеризуется тем, что на стадии с) или d) получают или добавляют суспензию, содержащую пантотенат кальция и/или магния.
Кроме того, заявленный в данном изобретении состав характеризуется тем, что он содержит соли D-пантотеновой кислоты в концентрации, по меньшей мере, 1-100% мас., предпочтительно, по меньшей мере, 20-100% мас. и особенно предпочтительно, по меньшей мере, 50% мас. Объектом представленного изобретения является состав, содержащий соли D-пантотеновой кислоты в виде двухвалентных катионов, предпочтительно D-пантотенат кальция и/или магния. В рамках данного изобретения предпочтительным является состав, характеризующийся тем, что содержание в нем солей D-пантотеновой кислоты в виде одновалентных катионов составляет меньше или равно 1 г/кг.
Согласно заявленному в данном изобретении способу может быть получен D-пантотенат кальция и/или магния, удовлетворяющий требованиям, предъявляемым к добавкам кормов для животных. Эти требования предусматривают, в частности, сравнительно высокое содержание D-пантотената и хорошую переносимость соответствующими животными, а также биологическую ценность в смысле "витаминного действия" заявленного в данном изобретении продукта.
Далее данное изобретение более подробно иллюстрируется на приводимых ниже примерах, которые никоим образом не могут рассматриваться как ограничение представленного изобретения:
Пример 1:
В ферментатор емкостью 14 литров, снабженный мешалкой и аэратором, заливается водная ферментационная среда следующего состава:
| Исходные компоненты | Концентрация [г/л] |
| Дрожжевой экстракт | 10 |
| Глутамат натрия | 5 |
| Сульфат аммония | 8 |
| Противопенное средство | 1 мл/л |
После стерилизации в среду дополнительно добавляют следующие стерильные компоненты:
| Исходные компоненты | Концентрация [г/л] |
| KH2PO4 | 10 |
| К2HPO4 | 20 |
| Глюкоза | 2,5 |
| Хлорид кальция | 0,1 |
| Хлорид магния | 1 |
| Цитрат натрия | 0,1 |
| FeSO4×7Н2O | 0,1 |
| Микроэлементный солевой раствор | 1 мл |
Микроэлементный солевой раствор готовится следующим образом:
0,15 г Na2MoO4×2H2O, 2,5 г Н3ВО3, 0,7 г CoCl2×6Н2O, 0,25 г CuSO4×5Н2O, 1,6 г MnCl2×4H2O, 0,3 г ZnSO4×7Н2O растворяют в воде для получения 1 литра раствора. Добавление микроэлементного солевого раствора осуществляется после его стерильной фильтрации. Исходный объем жидкости составляет 8,4 л. Количество вышеуказанных компонентов определяется, исходя из этого значения.
В этот раствор добавляют 160 мл затравочной культуры (OD=10 в среде SVY (среда SVY: телячий инфузионный бульон Difco 25 г, дрожжевой экстракт Difco 5 г, глутамат натрия 5 г, (NH4)2SO4 2.7 г растворить в 740 мл воды, стерилизовать; добавить 200 мл стерильного 1 М раствора К2HPO4 (рН 7) и 60 мл стерильного 50% раствора глюкозы (конечный объем 1 л))) Bacillus subtilis PA824 и проводят ферментацию при температуре 43°С при интенсивном перемешивании при скорости аэрации 12 л/мин. Этот штамм описан в заявке PCT/US00/25993.
В течение 52 часов в раствор добавляют 6 л стерильного водного раствора следующего состава:
| Исходные компоненты | Концентрация [г/л] |
| Глюкоза | 500 |
| Сульфат кальция | 0,6 |
| Микроэлементный солевой раствор | 7 мл |
Процесс ферментации лимитируется по глюкозе. В процессе ферментации значение рН раствора поддерживается на уровне 7,2 путем добавления 25%-ного аммиачного раствора или, соответственно, 20%-ного раствора фосфорной кислоты. Аммиак одновременно служит в качестве источника азота для ферментационного процесса. Положение регулятора устанавливается таким образом, чтобы концентрация растворенного кислорода поддерживалась на уровне 30% от значения насыщения. После прекращения подачи источника углерода ферментация продолжается до тех пор, пока концентрация растворенного кислорода (pO2) не достигнет 95% от значения насыщения. После этого ферментация останавливается, и микроорганизм убивается путем нагревания. Для этого ферментационный раствор подвергается стерилизации в течении 60 минут. Эффективность стерилизации проверяется методом высевания на чашку.
В завершение осуществляется отделение клеточной массы путем центрифугирования. После отделения клеточной массы концентрация D-пантотената составляет (после 52 часов ферментации) 24,7 г/л.
Аналогичным образом получают ферментационные растворы, в которых без добавки β-аланина концентрация пантотеновой кислоты составляет 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 и более 90 г/л.
В полученный ферментационный раствор, подвергшийся термической стерилизации и отцентрифугированный для удаления клеточной массы, дополнительно добавляют D-пантотеновую кислоту и раствором серной кислоты доводят до значения порядка 2. Полученный таким образом раствор фильтруют через тонкий слой песка и активированного угля. Концентрация D-пантотеновой кислоты в этом растворе составляет 67,7 г/л.
900 мл этого фильтрата под действием гидростатического давления пропускают через 250 мл стеклянную колонку, заполненную примерно 100 мл ионообменной смолы Lewatit S 100 G1. Скорость расхода жидкости составляет примерно 20 мл/мин.
Фракции пропущенного через колонку раствора объемом по 100 мл собирались и анализировались на предмет значения рН, концентрации D-пантотената и содержания ионов аммония, кальция, калия, магния и натрия. В качестве примера ниже приводится таблица, в которой сведены результаты анализа для первых трех фракций.
| Проба | мл | рН Начало | рН Конец | Пантотенат (г/л) | NH4 + | Са2+ | K+ | Mg2+ | Na+ |
| Фильтрат | 7 | 70 | 0,76% | 0,11% | 0,20% | 0,003% | 0,031% | ||
| Фракция 1 | 100 | 4,5 | 1,5 | 1,2 | <1 ppm | <0,001% | <0,001% | <0,001% | 0,001% |
| Фракция 2 | 100 | 1,5 | 1,6 | 64 | 4 ppm | <0,001% | 0,001% | <0,001% | 0,003% |
| Фракция 3 | 100 | 1,6 | 2,5 | 68 | 19 ppm | 0,001% | 0,001% | <0,001% | 0,002% |
75 мл фракции 2, содержащей 4,8 г D-пантотената, добавлением при перемешивании твердого гидроксида кальция доводилось до значения рН 7. Полученный таким образом раствор или суспензию D-пантотената кальция высушивают путем выпаривания воды в ротационном выпаривателе с получением 8,98 г слегка коричневатого порошка, содержащего 57% D-пантотената кальция. Этот порошок не обладает склеивающими свойствами и обеспечивает высокое качество продукта.
Пример 2:
В ферментатор емкостью 14 литров, снабженный мешалкой и аэратором, заливается водная ферментационная среда следующего состава:
| Исходные компоненты | Концентрация [г/л] |
| Дрожжевой экстракт | 10 |
| Глутамат натрия | 5 |
| Сульфат аммония | 8 |
| КН2PO4 | 8.4 |
| К2HPO4 | 15 |
После стерилизации в среду дополнительно добавляют следующие стерильные компоненты:
| Исходные компоненты | Концентрация [г/л] |
| Глюкоза | 2,5 |
| Хлорид кальция | 0,1 |
| Хлорид магния | 1 |
| Цитрат натрия | 1 |
| FeSO4×7Н2O | 0,01 |
| Микроэлементный солевой раствор | 1 мл |
Микроэлементный солевой раствор готовится следующим образом:
0,15 г Na2MoO4×2H2O, 2,5 г Н3ВО3, 0,7 г CoCl2×6H2O, 0,25 г CuSO4×5H2O, 1,6 г MnCl2×4Н2O, 0,3 г ZnSO4×7Н2O растворяют в воде для получения 1 литра раствора. Добавление микроэлементного солевого раствора осуществляется после его стерильной фильтрации. Исходный объем жидкости составляет 5,5 л. Количество вышеуказанных компонентов определяется, исходя из этого значения.
В этот раствор добавляют 55 мл затравочной культуры (OD=10 в среде SVY (среда SVY: телячий инфузионный бульон Difco 25 г, дрожжевой экстракт Difco 5 г, глутамат натрия 5 г, (NH4)2SO4 2.7 г растворить в 740 мл воды, стерилизовать; добавить 200 мл стерильного 1 М раствора К2HPO4 (рН 7) и 60 мл стерильного 50% раствора глюкозы (конечный объем 1 л))) Bacillus subtilis PA824 и проводят ферментацию при температуре 43°С при интенсивном перемешивании при скорости аэрации 12 л/мин. Этот штамм описан в заявке PCT/US00/25993.
В течение 48 часов в раствор добавляют 6 л стерильного водного раствора следующего состава:
| Исходные компоненты | Концентрация [г/л] |
| Глюкоза | 550 |
| Хлорид кальция | 0,6 |
| Микроэлементный солевой раствор | 6 мл |
Процесс ферментации лимитируется по глюкозе. В процессе ферментации значение рН раствора поддерживается на уровне порядка 7,2 путем добавления 25%-ного аммиачного раствора или, соответственно, 25%-ного раствора фосфорной кислоты. Аммиак одновременно служит в качестве источника азота для ферментационного процесса. Положение регулятора устанавливается таким образом, чтобы концентрация растворенного кислорода поддерживалась на уровне 30% от значения насыщения. После прекращения подачи источника углерода ферментация продолжается до тех пор, пока концентрация растворенного кислорода (pO2) не достигнет 95% от значения насыщения. После этого ферментация останавливается, и микроорганизм убивается путем нагревания. Для этого ферментационный раствор подвергается стерилизации в течении 30 минут. Эффективность стерилизации проверяется методом высевания на чашку.
В завершение осуществляется отделение клеточной массы путем центрифугирования. После отделения клеточной массы концентрация D-пантотената составляет (после 48 часов ферментации) 24,1 г/л.
Аналогичным образом получают ферментационные растворы, в которых без добавки β-аланина концентрация пантотеновой кислоты составляет 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, и более 90 г/л.
2817 мл полученного после ферментации раствора смешивается с 1183 мл раствора D-пантотеновой кислоты концентрацией 178,9 г/л и затем нейтрализуется 25%-ным аммиачным раствором. Затем раствор фильтруют через слой песка и активированного угля. Концентрация D-пантотеновой кислоты в фильтрате составляет 67 г/л, причем D-пантотеновая кислота главным образом представлена в виде солей аммония.
Примерно 720 мл этого раствор подвергаю электродиалитической обработке, как описано в примере 1:
550 г полученного дилюата (с плотностью 1,017 г/мл) добавлением 3,5 г 40%-ной суспензии гидроксида кальция доводят до значения рН 7,5. В результате получают водный раствор D-пантотената кальция (551,03 г с содержанием D-пантотената кальция 40,9 г/л).
Полученный водный раствор D-пантотената кальция высушивают в лабораторном осушителе Fa. Niro мини-типа. Температура на входе составляет примерно 200°С, температура на выходе 90°С. Распыление осуществляется с использованием двухкомпонентной насадки под давлением 2 бар. В качестве порошкообразующего средства добавляется Sipernat 22F.
Полученный порошковый продукт имеет следующие характеристики (данные приведены в % масс.):
Содержание воды: 2,3%
D-пантотенат кальция: 46,1%
Аммоний: 0,60%
Калий: 0,47%
Натрий: 1,1%
Пример 3:
В ферментатор емкостью 200 литров, снабженный мешалкой и аэратором, помещают 800 г 50%-ного дрожжевого экстракта 438 г глутамата натрия, 3200 г соевой муки, 640 г сульфата аммония, 800 г КН2PO4, 1600 г K2HPO4 и 50 мл противопенной присадки TegoKS растворяют в 70 л воды и в течение 30 минут стерилизуют при температуре 121°С.
Затем добавляют раствор 1 и 2.
Раствор 1 готовится следующим образом: 1670 г глюкозы ×Н2O, 10,2 г CaCl2×2Н2O и 170,7 г MnCl2×6H2O растворяют в 9 л воды и в течение 30 минут стерилизуют.
Раствор 2 готовится следующим образом: к 800 мл раствора цитрата железа (200 г/л цитрата натрия, 2 г/л FeSO4×7H2O, стерильно отфильтрованный) добавляют 80 мл микроэлементного солевого раствора (0,15 г Na2MoO4×2H2O, 2,5 г Н3ВО3, 0,7 г CoCl2×6Н2O, 0,25 г CuSO4×5H2O, 1,6 г MnCl2×4H2О, 0,3 г ZnSO4×7Н2O растворяют в воде для получения 1 литра раствора, стерильно фильтруют).
В этот раствор добавляют 2 л затравочной культуры (OD=10 в среде SVY (среда SVY: телячий инфузионный бульон Difco 25 г, дрожжевой экстракт Difco 5 г, глутамат натрия 5 г, (NH4)2SO4 2.7 г растворить в 740 мл воды, стерилизовать; добавить 200 мл стерильного 1 М раствора К2HPO4 (рН 7) и 60 мл стерильного 50% раствора глюкозы (конечный объем 1 л))) Bacillus subtilis PA668 и проводят ферментацию при температуре 43°С при интенсивном перемешивании при скорости аэрации 3 м3/мин. Этот штамм описан в заявке США серийный номер 60/262, 995.
В течение 48 часов в раствор добавляют примерно 10 л стерильного водного раствора глюкозы. Этот раствор готовится следующим образом: 90 кг глюкозы ×Н2O растворяют в 55 л воды и в течение 30 минут стерилизуют. После этого в раствор добавляют 300 мл микроэлементного солевого раствора (состав смотрите выше), а также 3 л Цитрат железа раствор (состав смотрите выше). После этого в раствор добавляют 1 л стерильно отфильтрованного раствора CaCl2×2H2O с концентрацией 90 г/л и 2 л стерильно отфильтрованного раствора глутамата натрия 375 г/л.
Процесс ферментации лимитируется по глюкозе. В процессе ферментации значение рН раствора поддерживается на уровне 7,2 путем добавления 25%-ного аммиачного раствора или, соответственно, 25%-ного раствора фосфорной кислоты. Аммиак одновременно служит в качестве источника азота для ферментационного процесса. Положение регулятора устанавливается таким образом, чтобы концентрация растворенного кислорода поддерживалась на уровне 30% от значения насыщения. Образование пены контролируют добавлением в раствор соответствующего количества противопенной присадки. После прекращения подачи источника углерода ферментация продолжается до тех пор, пока концентрация растворенного кислорода (pO2) не достигнет 95% от значения насыщения. После этого ферментация останавливается. Отделение клеточной массы осуществляется путем сепарации в сепараторе тарельчатого типа. Оставшиеся клетки в надосадочной жидкости убиваются путем термической стерилизации. Концентрация D-пантотената составляет (после 48 часов ферментации) 13,7 г/л. После сепарации и стерилизации концентрация D-пантотената составляет 10,7 г/л. Аналогичным образом получают ферментационные растворы, в которых без добавки β-аланина концентрация пантотеновой кислоты составляет 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 и более 90 г/л.
3000 г приготовленного таким образом ферментационного раствора подвергают следующей обработке: к двум третям раствора при температуре примерно 10°С добавляют эквивалентное по концентрации многовалентных анионов количество хлорида кальция (40% раствор); к оставшейся трети раствора соответствующее эквивалентное количество гидроксида кальция (в твердом состоянии). Растворы на ночь помещают в холодильный шкаф и затем путем фильтрации под давлением (фильтр Seitz 700) отделяют от выпавшего осадка. После этого растворы смешивают и добавлением еще 10 г гидроксида кальция при температуре примерно 10°С смещают кислотность раствора в щелочную сторону (рН 8,7) и отстаивают. Выпавший осадок также отфильтровывают.
Затем 1800 г полученного раствора при температуре 35°С подвергают обессоливанию в трехкамерной электродиализной ячейке. При этом ферментационный раствор пропускается через одну из двух катионообменных мембран, ограничивающих камеру продукта. Со стороны катода камера продукта отделена от камеры концентрата моноселективной катионообменной мембраной (Tokuyama Soda, CMS), со стороны анода камера продукта отделена от камеры хлорида кальция катионообменной мембраной (Tokuyama Soda, CMX). Камеры концентрата и хлорида кальция отделены друг от друга анионообменной мембраной (Tokuyama Soda, AMX). В камеру концентрата добавляют 750 г 0,5%-ного раствора хлорида натрия, а в камеру хлорида кальция 900 г 3,05%-ного раствора хлорида кальция. В электродной системе циркулирует 0,1 молярный раствор сульфата натрия. Процесс проводили гальваностатически при плотности тока 30 мА/см2 в ячейке, состоящей из пяти вышеописанных камер общей площадью мембранной поверхности 500 см2 в замкнутом объеме. Критерием прекращения процесса являлось снижение проводимости в камере хлорида кальция до 4 мс/см. Результаты анализа катионного состава растворов в камере продукта и камере концентрата приводятся в следующей таблице.
| PTS [г/л] | Са2+ | Na+ | К+ | NH4 + | |
| 5329/01/82 Продукт t=0 ч | 9,27 | 0,24% | 0,15% | 0,65% | 0,24% |
| 5329/01/82 Продукт t=0,83 ч | 9,01 | 0,43% | 0,07% | 0,25% | 0,06% |
| 5329/01/82 Концентрат t=0 ч | 0,0 | 0,0% | 0,2% | 0,0% | 0,0% |
| 5329/01/82 Концентрат t=0,83 ч | 0,015 | 0,02% | 0,47% | 0,71% | 0,29% |
При этом снижение концентрации одновалентных ионов составляет 51% для натрия, 66% для аммония и 61% для калия. Средний выход по току составляет 82%. Потери D-пантотеновой кислоты за счет попадания в две соседние камеры составляет 0,08% от общего количества вещества. Значение рН в камере продукта в процессе диализа составляет от 7 до 7,5, в камере концентрата и хлорида кальция примерно 6. Общее падение напряжения в процессе диализа с уменьшением проводимости в камере хлорида кальция увеличивалось примерно от 11 до 16 В.
Подвергшийся такому электродиализу раствор затем подвергается распылительной сушке для получения конечного продукта. Это свидетельствует о том, что при соответствующей предварительной обработке можно использовать электродиализ в трехкамерной ячейке с моноселективными катионообменными мембранами для обмена одновалентных ионов на двухвалентные катионы с целью повышения эффективности распылительной сушки конечного продукта.
Claims (23)
1. Способ получения смеси D-пантотеновой кислоты и ее солей, заключающийся в том, что
a) используют, по меньшей мере, один микроорганизм, продуцирующий D-пантотеновую кислоту, в котором нарушена регуляция биосинтеза пантотеновой кислоты-(pan) и/или изолейцина/валина-(ilv) и который в процессе ферментации в культуральной среде производит, по меньшей мере, 2 г/л соли D-пантотеновой кислоты, причем в культуральную среду не добавляют свободный β-аланин и/или соли β-аланина,
b) ферментационный раствор, содержащий D-пантотенат, под воздействием электрического поля пропускают через одну или несколько ионоселективных мембран, в результате чего низкомолекулярные ионы удаляются из содержащего D-пантотенат раствора, причем содержание в нем солей D-пантотеновой кислоты в виде одновалентных катионов снижают до концентрации, меньшей или равной 1 г/кг,
c) рН раствора, содержащего свободную D-пантотеновою кислоту, добавлением кальциевых и/или магниевых оснований доводят до значения 3-10, при этом получают раствор, содержащий пантотенат кальция и/или магния, и
d) раствор, содержащий пантотенат кальция и/или магния, подвергают сушке и/или формовке.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве микроорганизмов, продуцирующих D-пантотеновую кислоту, используют бактерии, дрожжи или грибки.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма используют бактерию из семейства Bacillaceae.
4. Способ по одному из пп.1-3, отличающийся тем, что используют бактерию из рода Bacillus и предпочтительно принадлежащую к виду В.subtils, В.licheniformis или В.amyloliquefaciens.
5. Способ по одному из пп.1-4, отличающийся тем, что на стадии а) содержание D-пантотеновой кислоты и/или ее солей в ферментативном растворе составляет, по меньшей мере, 10 г/л, предпочтительно, по меньшей мере, 20 г/л, особенно предпочтительно, по меньшей мере, 40 г/л и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 60 г/л к объему культуральной среды.
6. Способ по одному из пп.1-5, отличающийся тем, что на стадии с) рН раствора доводят до значения 5-10.
7. Способ по одному из пп.1-6, отличающийся тем, что на стадии с) рН раствора доводят до значения 5-9, предпочтительно 6-9 и особенно предпочтительно 6-8.
8. Способ по одному из пп.1-7, отличающийся тем, что на стадии b) используют монополярные и/или биполярные ионообменные мембраны.
9. Способ по одному из пп.1-8, отличающийся тем, что на стадии b) используют монополярные ионообменные мембраны.
10. Способ по одному из пп.1-9, отличающийся тем, что на стадии b) используют моноселективные ионообменные мембраны.
11. Способ по одному из пп.1-10, отличающийся тем, что значение рН ферментационного раствора, содержащего D-пантотеновую кислоту, перед обработкой на стадии b) доводят до изоэлектрического значения рН D-пантотеновой кислоты.
12. Способ по одному из пп.1-11, отличающийся тем, что на стадии b) плотность тока через монополярные ионообменные мембраны составляет 1-100 мА/см2, предпочтительно 10-80 мА/см2 и особенно предпочтительно 20-40 мА/см2.
13. Способ по одному из пп.1-12, отличающийся тем, что на стадии b) плотность тока через биполярные ионообменные мембраны составляет 1-150 мА/см2, предпочтительно 30-100 мА/см2 и особенно предпочтительно 70-90 мА/см2.
14. Способ по одному из пп.1-13, отличающийся тем, что на стадии b) содержание в растворе ионов аммония, калия и/или натрия, снижают до концентрации меньше или равной 1 г/кг.
15. Способ по одному из пп.1-14, отличающийся тем, что на стадии с) для нейтрализации в раствор добавляют гидроксид кальция, карбонат кальция, оксид кальция, гидроксид магния и/или основной карбонат магния в виде твердого вещества и/или в виде водной суспензии.
16. Способ по одному из пп.1-15, отличающийся тем, что в раствор на стадии с) добавляют водную суспензию, содержащую 2-55 мас.%, предпочтительно 10-50 мас.% и особенно предпочтительно 20-40 мас.% гидроксида кальция.
17. Способ по одному из пп.1-16, отличающийся тем, что в раствор на стадии с) добавляют водную суспензию, содержащую 2-65 мас.%, предпочтительно 10-50 мас.% и особенно предпочтительно 20-40 мас.% карбоната кальция.
18. Способ по одному из пп.1-17, отличающийся тем, что в раствор на стадии с) добавляют водную суспензию, содержащую 2-60 мас.%, предпочтительно 10-50 мас.% и особенно предпочтительно 20-40 мас.% гидроксида магния.
19. Способ по одному из пп.1-18, отличающийся тем, что в раствор на стадии с) добавляют водную суспензию, содержащую 2-25 мас.%, предпочтительно 10-20 мас.% основного карбоната магния.
20. Способ по одному из пп.1-19, отличающийся тем, что на стадии с) или d) получают или добавляют суспензию, содержащую пантотенат кальция и/или магния.
21. Способ по одному из пп.1-20, отличающийся тем, что получают смесь, содержащую соли D-пантотеновой кислоты в виде двухвалентных катионов, предпочтительно, D-пантотенат кальция и/или магния.
22. Способ по одному из пп.1-21, отличающийся тем, что получают смесь, содержащую соли D-пантотеновой кислоты в концентрации, по меньшей мере, 50 мас.%.
23. Состав, получаемый способом по одному из пп.1-22, в качестве кормовой добавки для животных.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10108223.1 | 2001-02-21 | ||
| DE10108223A DE10108223A1 (de) | 2001-02-21 | 2001-02-21 | Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003128534A RU2003128534A (ru) | 2005-04-10 |
| RU2292397C2 true RU2292397C2 (ru) | 2007-01-27 |
Family
ID=7674921
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003128534/13A RU2292397C2 (ru) | 2001-02-21 | 2002-02-20 | Способ получения смеси d-пантотеновой кислоты и ее солей и состав, полученный данным способом, в качестве кормовой добавки для животных |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7824891B2 (ru) |
| EP (1) | EP1362118B1 (ru) |
| JP (1) | JP2004531236A (ru) |
| KR (1) | KR20030075204A (ru) |
| CN (1) | CN1294273C (ru) |
| AT (1) | ATE342372T1 (ru) |
| AU (1) | AU2002250978B2 (ru) |
| BR (1) | BR0207474A (ru) |
| CA (1) | CA2438949A1 (ru) |
| CZ (1) | CZ20032223A3 (ru) |
| DE (2) | DE10108223A1 (ru) |
| EE (1) | EE200300406A (ru) |
| ES (1) | ES2274967T3 (ru) |
| HU (1) | HUP0303304A3 (ru) |
| IL (1) | IL157496A0 (ru) |
| IN (1) | IN2003CH01315A (ru) |
| MX (1) | MX240870B (ru) |
| NO (1) | NO20033707L (ru) |
| PL (1) | PL363989A1 (ru) |
| RU (1) | RU2292397C2 (ru) |
| SK (1) | SK10452003A3 (ru) |
| UA (1) | UA77669C2 (ru) |
| WO (1) | WO2002066666A2 (ru) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10108225A1 (de) | 2001-02-21 | 2002-10-10 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln |
| DE10344200A1 (de) * | 2003-09-22 | 2005-05-04 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung eines D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement |
| ES2991621T3 (es) * | 2016-03-07 | 2024-12-04 | Glycom As | Separación de oligosacáridos de caldo de fermentación |
| MX2020002990A (es) * | 2017-09-19 | 2020-07-22 | Evogene Ltd | Genes y aislados bacterianos para conferir resistencia a insectos. |
| CN111621541B (zh) * | 2019-02-27 | 2025-10-31 | 广安摩珈生物科技有限公司 | 使用电渗析技术拆分光学异构体的方法 |
| CN116200320A (zh) * | 2022-12-30 | 2023-06-02 | 浙江工业大学 | 一种辅因子平衡的高产d-泛酸的基因工程菌、构建及应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2054415C1 (ru) * | 1994-03-02 | 1996-02-20 | Товарищество с ограниченной ответственностью "Пант" | Кетопантотенат кальция, обладающий ацетилирующей активностью d-пантотената кальция |
| US6013492A (en) * | 1995-04-21 | 2000-01-11 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Microbial process for producing calcium D-pantothenate |
| EP0590857B1 (en) * | 1992-09-25 | 2003-11-12 | Basf Aktiengesellschaft | Production of D-pantoic acid and D-pantothenic acid |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB562267A (en) * | 1941-08-08 | 1944-06-26 | Hoffmann La Roche | Process for the manufacture of a crystallised, non-hygroscopic calcium salt of d-pantothenic acid |
| EP0493060A3 (en) | 1990-12-25 | 1993-04-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Production method of d-pantothenic acid and plasmids and microorganisms thereof |
| RU2231552C2 (ru) | 1997-10-04 | 2004-06-27 | Форшунгсцентрум Юлих Гмбх | Способ микробиологического получения аминокислот семейства аспартатов и/или глутаматов и используемые в способе средства |
| AT407050B (de) | 1997-12-29 | 2000-11-27 | Chemie Linz Gmbh | Verfahren zur herstellung von l-asparaginsäure |
| US6110342A (en) * | 1998-07-21 | 2000-08-29 | Archer Daniels Midland Company | Process for production of amino acid hydrochloride and caustic via electrodialysis water splitting |
| DE19855313A1 (de) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure durch Verstärkung des panD-Gens in Mikroorganismen |
| PT1050219E (pt) * | 1999-05-05 | 2003-04-30 | Degussa | Aditivos alimentares para animais contendo acido d-pantotenico e/ou seus sais e processo para a sua preparacao |
| EP2163629B1 (en) * | 1999-09-21 | 2017-03-08 | Basf Se | Methods and microorganisms for production of panto-compounds |
| US8232081B2 (en) * | 1999-09-21 | 2012-07-31 | Basf Se | Methods and microorganisms for production of panto-compounds |
| FR2799754A1 (fr) * | 1999-10-18 | 2001-04-20 | Roquette Freres | Procede de separation et de purification d'acide lactique a partir d'un milieu de fermentation |
| DE10021515A1 (de) * | 2000-05-03 | 2001-11-08 | Degussa | Verfahren zur Herstellung von Erdalkalisalzen der D-Pantothensäure |
| BR0113399A (pt) * | 2000-09-20 | 2003-07-15 | Basf Ag | Processo para a preparação de um suplemento de ração animal, suplemento de ração animal, e, uso do mesmo |
| CN100529068C (zh) | 2001-01-19 | 2009-08-19 | 巴斯福股份公司 | 用于提高泛酸产量的微生物和方法 |
| KR20040004496A (ko) | 2001-01-19 | 2004-01-13 | 바스프 악티엔게젤샤프트 | 판토테네이트 생산의 증가 방법 |
-
2001
- 2001-02-21 DE DE10108223A patent/DE10108223A1/de not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-02-20 AU AU2002250978A patent/AU2002250978B2/en not_active Ceased
- 2002-02-20 SK SK1045-2003A patent/SK10452003A3/sk not_active Application Discontinuation
- 2002-02-20 DE DE50208413T patent/DE50208413D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-20 CA CA002438949A patent/CA2438949A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-20 CZ CZ20032223A patent/CZ20032223A3/cs unknown
- 2002-02-20 AT AT02719874T patent/ATE342372T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-02-20 WO PCT/EP2002/001766 patent/WO2002066666A2/de not_active Ceased
- 2002-02-20 KR KR20037010981A patent/KR20030075204A/ko not_active Ceased
- 2002-02-20 EP EP02719874A patent/EP1362118B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-20 EE EEP200300406A patent/EE200300406A/xx unknown
- 2002-02-20 CN CNB028053303A patent/CN1294273C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-20 ES ES02719874T patent/ES2274967T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-20 PL PL02363989A patent/PL363989A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-02-20 JP JP2002566370A patent/JP2004531236A/ja active Pending
- 2002-02-20 IL IL15749602A patent/IL157496A0/xx unknown
- 2002-02-20 US US10/468,610 patent/US7824891B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-20 BR BR0207474-5A patent/BR0207474A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-02-20 HU HU0303304A patent/HUP0303304A3/hu unknown
- 2002-02-20 RU RU2003128534/13A patent/RU2292397C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-02-20 MX MXPA03007383 patent/MX240870B/es active IP Right Grant
- 2002-02-20 UA UA2003098597A patent/UA77669C2/uk unknown
-
2003
- 2003-08-20 NO NO20033707A patent/NO20033707L/no not_active Application Discontinuation
- 2003-08-21 IN IN1315CH2003 patent/IN2003CH01315A/xx unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0590857B1 (en) * | 1992-09-25 | 2003-11-12 | Basf Aktiengesellschaft | Production of D-pantoic acid and D-pantothenic acid |
| RU2054415C1 (ru) * | 1994-03-02 | 1996-02-20 | Товарищество с ограниченной ответственностью "Пант" | Кетопантотенат кальция, обладающий ацетилирующей активностью d-пантотената кальция |
| US6013492A (en) * | 1995-04-21 | 2000-01-11 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Microbial process for producing calcium D-pantothenate |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20040072306A1 (en) | 2004-04-15 |
| IL157496A0 (en) | 2004-03-28 |
| SK10452003A3 (sk) | 2004-02-03 |
| WO2002066666A3 (de) | 2003-07-17 |
| NO20033707L (no) | 2003-10-20 |
| WO2002066666A2 (de) | 2002-08-29 |
| ES2274967T3 (es) | 2007-06-01 |
| HUP0303304A3 (en) | 2007-09-28 |
| HUP0303304A2 (hu) | 2004-01-28 |
| CA2438949A1 (en) | 2002-08-29 |
| CN1294273C (zh) | 2007-01-10 |
| RU2003128534A (ru) | 2005-04-10 |
| ATE342372T1 (de) | 2006-11-15 |
| MX240870B (es) | 2006-10-09 |
| DE50208413D1 (de) | 2006-11-23 |
| UA77669C2 (en) | 2007-01-15 |
| EE200300406A (et) | 2003-12-15 |
| EP1362118B1 (de) | 2006-10-11 |
| IN2003CH01315A (en) | 2005-11-25 |
| EP1362118A2 (de) | 2003-11-19 |
| US7824891B2 (en) | 2010-11-02 |
| DE10108223A1 (de) | 2002-10-10 |
| BR0207474A (pt) | 2004-03-02 |
| AU2002250978B2 (en) | 2007-03-01 |
| CZ20032223A3 (cs) | 2003-11-12 |
| CN1492935A (zh) | 2004-04-28 |
| PL363989A1 (en) | 2004-11-29 |
| NO20033707D0 (no) | 2003-08-20 |
| MXPA03007383A (es) | 2004-03-16 |
| JP2004531236A (ja) | 2004-10-14 |
| KR20030075204A (ko) | 2003-09-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2292397C2 (ru) | Способ получения смеси d-пантотеновой кислоты и ее солей и состав, полученный данным способом, в качестве кормовой добавки для животных | |
| US7611872B2 (en) | Method for the production of D-pantothenic acid and/or salts thereof via purification by nanofiltration as adjunct for animal feedstuffs | |
| US7781192B2 (en) | Method for producing D-pantothenic acid and/or a salt thereof via purification by cation exchange as additive for animal food | |
| CN100457917C (zh) | 制备作为动物饲料添加剂的d-泛酸和/或其盐的方法 | |
| KR20030038751A (ko) | Ｄ-판토텐산 또는 그의 염을 포함하는 동물 사료 보충물,그의 개선된 제조 방법 및 그의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090221 |