UA77669C2 - Method for producing mixture of d-pantothenic acid and salts thereof - Google Patents

Description

Опис винаходу

Представлений винахід стосується удосконаленого способу одержання Ю-пантотенової кислоти та/або її солей 2 таїх використання як добавок при виробництві кормів для тварин.

Як вихідний продукт при біосинтезі коферменту А в організмі рослин і тварин широко використовується

О-пантотенат. На відміну від людей, що у достатній кількості одержують пантотенову кислоту з їжею, як у рослин, так і у тварин, часто спостерігається дефіцит в організмі ЮО-пантотенату. Можливість одержання

О-пантотенату представляє, таким чином, значний економічний інтерес, особливо при виробництві кормів для 710 тварин.

Традиційним способом одержання О-пантотенату є хімічний синтез з О-пантолактону та р-аланінату кальцію

ІОІйтаппе Епсусіоредіа ої Іпдивігіа! Спетівігу. б" еаййоп. ЕІесігопіс геїєазе. Каре! "Міатіпв", 19991). Для одержання ЮО-пантолактону необхідне дороге класичне розділення рацемату солі на діастереомери. Продуктом, одержуваним в результаті такого хімічного синтезу, є, головним чином, кальцієва сіль О-пантотенової кислоти -

О-пантотенат кальцію.

У порівнянні з хімічним синтезом перевага біотехнологічного способу одержання ОЮО-пантотенату з використанням мікроорганізмів полягає в селективності (енантіомерній чистоті) одержуваної ЮО-форми пантотенової кислоти, придатної для споживання вищими організмами. При цьому з технологічного процесу гор /Виключається дорога операція по розділенню рацемату, що є необхідною при хімічному синтезі продукту.

Відомо безліч способів ферментаційного одержання О-пантотенової кислоти з використанням мікроорганізмів, описаних, зокрема, у міжнародних заявках на патент (МО, 96/33283; УМО, 97/103401, патенті (05, 60134921, німецькій заявці на патент (ОЕ, 19846499), європейських заявках на патент (ЕР, 0590857; ЕР, 1001027; ЕР, 1006189; ЕР, 1006192; ЕР, 1006193). сч ре Так, у європейських заявках на патент (ЕР, 1006189; ЕР, 1001027) описується спосіб одержання пантотенату, при якому вміст О-пантотенової кислоти у ферментаційному розчині складає не більше г/л. Настільки низький (о) вміст О-пантотенової кислоти у ферментаційному розчині, що складає менше 10 мас. 95 по відношенню до вмісту твердої речовини, неприйнятний для промислового виробництва добавок до корму для тварин, що містять

О-пантотенову кислоту. Іншим недоліком існуючих у даний час способів є те, що виділення продукту з Фу ферментаційного середовища вимагає проведення безлічі дорогих технологічних процесів. Спосіб одержання даного продукту в промисловому масштабі поки невідомий. (Се)

У німецькій заявці на патент (ОЕ, 10016321) описується спосіб ферментаційного одержання добавок до с кормів, що містять ЮО-пантотенову кислоту. Істотний недолік цього способу полягає в тому, що, як і у вищезгаданих способах ферментаційного одержання О-пантотенової кислоти, для промислового виробництва - з необхідного продукту мікроорганізмові потрібне додання у ферментаційне середовище попередника пантотенової М кислоти В-аланіну.

Крім того, у патенті (05, 60134921 та міжнародній заявці на патент (МО, 96/332839| описується виділення

О-пантотенової кислоти з ферментаційного розчину шляхом відфільтровування нерозчинних компонентів (наприклад, клітинного матеріалу) з культурального середовища, адсорбції фільтрату на активованому вугіллі, « 20 наступного елюювання ЮО-пантотенової кислоти органічним розчинником, переважно метанолом, нейтралізації шо гідроксидом кальцію, та наступної кристалізації О-пантотенату кальцію. Істотними недоліками цього способу є с втрати дорогого продукту, що мають місце при кристалізації, а також використання органічних розчинників, що 1» важко відокремлюються від продукту і вимагають дорогої регенерації.

У європейській заявці на патент (ЕР, 0590857| описується спосіб ферментаційного одержання Ю-пантотенової кислоти, при якому культивування мікроорганізму вимагає додання у ферментаційне середовище В-аланіну. -1 що Ферментаційний розчин спочатку фільтрують для відокремлення клітинної маси, потім пропускають через колонку з катіонообмінною смолою, а на завершення через колонку з аніонообмінною смолою, відразу ж після цього -і нейтралізують гідроксидом кальцію, випарюють, змішують з активованим вугіллям, ще раз фільтрують і після бу додання метанолу та хлориду кальцію кристалізують. Отриманий продукт, що містить пантотенат кальцію, має у своєму складі, крім Ю-пантотенової кислоти у вигляді солей кальцію, також хлорид кальцію в молярному (о) співвідношенні 1:11. Для зниження вмісту хлориду кальцію потрібно проводити електродіаліз з подальшим с розпилювальним висушуванням. Недоліком цього способу Є необхідність проведення безлічі дорогих технологічних процесів і використання органічних розчинників, що знижує цінність даного методу, як з економічної, так і з екологічної точки зору.

Задача даного винаходу полягає у виробництві добавок до корму для тварин, що містять О-пантотенову кислоту та/або її солі, з використанням удосконаленого способу одержання ЮО-пантотенової кислоти та/або її (Ф) солей, що позбавлений недоліків вищезгаданих способів. При цьому з економічних розумінь найбільш бажаним є

Ге спосіб, при якому додання В-аланіну значно знижується або взагалі не потрібне. Крім того, бажане одержання

О-пантотенової кислоти у вигляді її двовалентних солей, насамперед, у вигляді солей лужноземельньх металів, во оскільки двовалентні солі пантотенової кислоти володіють меншою гігроскопічністю, ніж одновалентні солі, і при подальшому використанні, наприклад, як добавок при виробництві кормів для тварин, у меншому ступені піддаються аглютинації.

Ця задача найкращим чином вирішується в рамках представленого винаходу.

Об'єктом представленого винаходу є спосіб одержання ЮО-пантотенової кислоти та/або її солей, що відрізняється тим, що: б5 а) використовують, принаймні, один організм, що продукує Ю-пантотенову кислоту, в якому порушена регуляція біосинтезу пантотенової кислоти (рап) та/або ізолейцину/валіну (ім), та який у процесі ферментації в культуральному середовищі продукує, принаймні, 2г/л солі О-пантотенової кислоти, причому в культуральне середовище додають 0-20г/л вільного В-аланіну та/або солей В-аланіну;

Б) ферментаційний розчин, що містить О-пантотенат, під впливом електричного поля пропускають через одну або декілька іоноселективних мембран, в результаті чого низькомолекулярні іони видаляються з розчину, що містить О-пантотенат; с) рН розчину, що містить вільну ЮО-пантотенову кислоту, доданням кальцієвих та/або магнієвих основ доводять до значення 5-10, при цьому одержують розчин, що містить пантотенат кальцію та/або магнію, і 70 а) розчин, що містить пантотенат кальцію та/або магнію, піддають сушінню та/або формуванню.

В одному з варіантів заявленого в даному винаході способу на стадії с) або а) одержують або додають суспензію, що містить хлорид кальцію та/або магнію.

Ферментація на стадії а) заявленого в даному винаході способу здійснюється за відомою технологією в замкнутій культурі без підживлення, з одноразовим або багаторазовим підживленням, або в культурі з безперервним підживленням. При цьому для нейтралізації отриманої пантотенової кислоти використовують звичайну буферну систему, таку як, наприклад, фосфатний буфер з розчинами гідроксиду натрію, гідроксиду калію або аміаку.

В інших варіантах заявленого в даному винаході способу на стадії а) в результаті ферментації в культуральному середовищі одержують, принаймні, 1Ог/л, переважно, принаймні, 20г/л, особливо переважно, принаймні 40г/л, найбільш переважно, принаймні, боОг/л і особливо, принаймні, 7Ог/л солі О-пантотенової кислоти.

У рамках даного винаходу під терміном "продукувати" варто розуміти, що організм може синтезувати більші кількості Ю-пантотенової кислоти та/або її солей, ніж це потрібно для власного метаболізму. У кращому варіанті реалізації даного винаходу синтезована ЮО-пантотенова кислота та/або її солі не накопичуються всередині клітин, а в ідеальному випадку повністю надходять з організму в культуральне середовище. Таке с г5 виведення може здійснюватися активно або пасивно за відомими механізмами.

У рамках даного винаходу як організми, що продукують ЮО-пантотенову кислоту, використовують іо) мікроорганізми. До них відповідно до винаходу відносяться грибки, дріжджі та/або бактерії. Кращим відповідно до даного винаходу є використання грибків або дріжджів, таких як, наприклад, Засспаготусез або ЮОераготусев, переважно Засспаготусез сегемізіае. Кращим відповідно до даного винаходу є використання корінебактерій або Ге! зо ВасіПасеае. У рамках даного винаходу кращими є бактерії родів Согуперасіегішт, ЕвзсПегіспіа, Васіїйив,

Агпіпгорасіег, Вемірасіегіцт, Рвзецдотопаз, бЗаїЇтопейа, КіерзіеМа, Ргоїецв, Асіпеорасіег або ЕПігорішт. со

Особливо кращими є Согуперасіегішт дішатісит, Вгемірасіегішт Бгеме або Васійиз зибійв, В. Іспепіогтів, Ге

В. атуїоїїдцетасіеп5, В. сегеив, В. Іепітогрив, В. Іепійз, В. Піптив, В. рапіоїпепіїсиз, В. сігсціапе, В. соадціапз, В. тедайегішт, В. ритів5, В. (Пигіпдіепвіз, В. бБгемі5, В. віеагоїйепторнйиз та інші види в.

Васіййв групи 1, що характеризуються 165 РНК, або Асіїпит тусейарйв. Даний перелік служить лише для ї- пояснення і ніяк не обмежує представленого винаходу.

Крім того, об'єктом представленого винаходу є також генетично видозмінені організми, які використовуються для одержання добавок до корму для тварин, що містять вільну О-пантотенову кислоту та/або її солі відповідно до даного винаходу. Такі генетично видозмінені організми можуть бути отримані, наприклад, шляхом хімічного « Мутагенезу з наступною селекцією прийнятним методом "скринінга". Об'єктом представленого винаходу також є 7-3) с так звані "продукційні штами", придатні для одержання продукту в рамках представленого винаходу, та генетичні зміни метаболізму, що включають О-пантотенову )» кислоту, у тому числі зміни, що зачіпають процес виведення ЮО-пантотенової кислоти та/або її солей через клітинну мембрану. Цього можна досягати, наприклад, шляхом внесення змін у ключові моменти відповідних метаболічних шляхів використовуваного організму. -І Можливе також використання трансгенних організмів, отриманих за допомогою гомологічних та/або гетерологічних нуклеотидних послідовностей, необхідних для синтезу потрібного продукту. При цьому зміни, що

Ш- обумовлюють надлишкову експресію та/або порушення регуляції одного або декількох генів окремо та/або в

Ге» комбінації, можуть знаходитися в геномі та/або у векторі, що використовується.

Подібні трансгенні організми можуть містити додаткові копії та/або видозмінені гени із групи рапВ, рапс,

Ме, рапО, рапЕ та/або їх комбінації та/або навіть цілі експресійні блоки, такі, як оперон рапВСО. Крім того,

Ге) можуть зачіпатися також й інші метаболічні шляхи використовуваних організмів, наприклад, шлях біосинтезу ізолейцину-валіну, як це описано, зокрема в європейських заявках на патент (ЕР, 1006189; ЕР, 1006192; ЕР, 1006193; ЕР, 1001027). У результаті цього досягається збільшення концентрації відповідних попередників з ов розгалуженим ланцюгом, необхідних для біосинтезу пантотенової кислоти. Переважно це досягається за допомогою надлишкової експресії генів, що відповідають за цей метаболічний шлях, тобто мВ, йЙММ, їймС

Ф; та/або ЇМО. ка Крім того, у рамках даного винаходу передбачається можливість генетичних змін, що зачіпають аспартат-а-декарбоксилазу (рапО)), наприклад, за допомогою індукування надлишкової експресії та/або порушення бо регуляції відповідного гена в організмі, використовуваному для виробництва О-пантотенової кислоти.

Під терміном "порушення регуляції"! у рамках даного винаходу варто розуміти наступне: зміну або модифікацію, принаймні, одного гена, що кодує один з ферментів біосинтетичного метаболічного шляху, таким чином, що активність ферменту мікроорганізму змінюється або модифікується. Бажано, щоб, принаймні, один ген, що кодує один з ферментів біосинтетичного метаболічного шляху, був змінений таким чином, щоб генний продукт 65 утворювався більш інтенсивно або виявляв підвищену активність. Термін "метаболічний шлях з порушеною регуляцією" включає також біосинтетичний метаболічний шлях, в якому кілька генів, що кодують кілька ферментів, змінені або модифіковані таким чином, що активності декількох ферментів змінюються або модифікуються.

Можливі зміни або модифікації включають, але не обмежуються, наступні: видалення ендогенного промотору або регуляторних елементів; введення більш сильних промоторів, або декількох промоторів одночасно; видалення регуляторних послідовностей, що впливають на експресію генного продукту; зміну розташування гена усередині хромосоми; зміну послідовності ДНК поблизу гена або всередині нього, наприклад, сайтів зв'язування рибосом (КВ5); збільшення кількості копій гена в геномі або введення плазмід, що містять різну кількість копій даного гена; модифікацію білків (наприклад, регуляторних білків, супресорів, енхансерів, активаторів транскрипції, 7/0 тощо), Що беруть участь у процесах транскрипції гена та/або трансляції з утворенням відповідного генного продукту. Сюди відносяться також будь-які інші можливості порушення регуляції експресії гена, доступні для сучасної технології, такі як, наприклад, використання антисмислових олігонуклеотидів або блокування репресорних білків.

Порушення регуляції передбачає також зміни в області кодуючого гена, що приводять, наприклад, до усунення /5 Зворотного зв'язку в системі регуляції синтезу генного продукту, до підвищення або зниження специфічної активності генного продукту.

Крім того, у рамках даного винаходу переважними є такі генноінженерні зміни ферментів, що впливають на перетворення попередників пантотенової кислоти у відповідний продукт та/або пантотенової кислоти в кофермент

А. Прикладом генів, що кодують такі ферменти, є: аІзО, аміА, їмЕ, апеВ, соаА, соах і багато інших. Вказаний 2о перелік служить лише для пояснення і не призначений для обмеженням представленого винаходу.

Крім того, переважними є такі генноїнженерні зміни, що забезпечують накопичення в клітинах кофакторів (таких, як метилентетрагідрофолат, редокс еквіваленти та інші) в оптимальній для виробництва пантотенової кислоти концентрації.

У кращому варіанті виконання р-аланін повинен бути присутнім у клітинах у більш високій концентрації, ніж сч у генетично незмінених організмах, що дозволило б уникнути додання його в культуральне середовище, як це потрібно, наприклад, у європейській заявці на патент (ЕР, 0590857, А). Кращими є мікроорганізми з порушеною о регуляцією біосинтезу пантотенової кислоти (рап), та/або ізолейцину/валіну (їм), та/або аспартат-о-декарбоксилази (рапб). Крім того, кращим є також додаткова надлишкова експресія в мікроорганізмах кетопантоат-редуктази (рапЕ). (о)

Крім того, у рамках даного винаходу може бути кращим зниження активності або повне вимикання гена соаА с (наприклад, у різних видах Васіїїшв5), необхідного для синтезу коферменту А. Для цієї ферментативної функції

Васійне містить крім гена соаА інший ген (-соахХ). Активність цього гена соаХ або відповідного ферменту також «(0 може бути змінена, переважно знижена, або навіть цілком пригнічена, оскільки соаА сам по собі виявляє ще м достатню, хоча і знижену ферментативну активність, тобто ферментативна активність соаА губиться не цілком.

Крім надлишкової експресії різних генів кращими є також генетичні маніпуляції з промоторними ділянками цих - генів, що приводять до надлишкової експресії генного продукту.

В одному з варіантів здійснення представленого винаходу використовуються бактеріальні штами, описані в заявці (РСТ/О5, 00/25993), наприклад, Васійиз зиИбБійвз РА 824, та/або їх похідні В іншому варіанті « здійснення винаходу відповідно до заявленого в даному винаході способу використовується мікроорганізм ВасшШивз зибБійїв РА 668, описаний у заявці (05, 60/262995). Ці штами Васйив зибійїв РА 824 і РА 668 - с можуть бути отримані таким способом: у» Зі штаму Васіїйиз зибБійзв 168 (штам Магрига АТСС 6051), що володіє генотипом їгрС2 (Тгр'), шляхом трансдукції маркера Тгр' (з Васійив зибБійїв дикого типу МУ23) був отриманий штам РМ79. У штам РУ79 класичними генноіїнженерними методами, наприклад, описаними в |(Наплоса С. Кк. Сиціпд 5..М. МоіІесшаг Віоіодіса! Меййовавз бог Васіїнв. - Спіспевіег, Епдіапа: допп УМієу 8 Зопв, Ца., 1990) вносилися мутації лрапВ - і драпЕ 1. - Отриманий штам трансформували геномною ДНК штаму РА221 Васійиз зибійв (генотип Роврапвсо, ігроС2

Ф (Ттр7)) та геномною ДНК штаму РАЗОЗ Васі» зиБбійв (генотип РоврапЕ1). Отриманий штам РАЗ27 мав генотип

Ф 50 РоврапВсо, РоврапЕ 1 і був ауксотрофним по триптофану (Тгр"). При використанні штаму РАЗ27 Васіїнв зибніїв у 1Омл культури в середовищі ЗУМ (суміш 25г/л телячого інфузійного бульйону Осо, 5г/л дріжджового екстракту іЧе) Оіїсо, 5г/л глутамату натрію, 2,7г/л сульфату амонію розчиняють у воді для одержання 74О0мл розчину, автоклавують, після чого додають 200мл розчину ТМ фосфату калію, рН 7,0 ії бОмл 5095 стерильного розчину глюкози) з доданням 5г/л В-аланіну і 5 г/л А-кетоїзовалерату вдається досягти концентрації пантотенової кислоти 3,Ог/л (24год.). о Одержання штаму РА221 Васіїйиз зиБііз (генотип РоврапВвВСО, тр (Тр)

Класичними генноінженерними методами за допомогою послідовності оперона рапВвСО Е. сої |Мегкеї еї аї. // ю РЕМ Місгоріої. Гей - 1996. - 143. - Р. 247-252| з плазмідної бібліотеки Васіййе зибБійв оР275 був клонований оперон рапвСО Васіїшв. Для клонування використовували штам ВМ4062 Е. сої (Біг) та інформацію, 60 що оперон Васіїїи5 розташовується поруч з геном БігА. Оперон рапвСО вбудовували в плазміду, що реплікується в

Е. соїї. Для підвищення експресії оперона рапвСО промотор замінювали на сильний, конститутивний промотор фага Васійиз зибійв 5РО1 (Роб), а ділянку зв'язування рибосоми (-КВ5) перед геном рапВ на штучну ділянку зв'язування. Перед касетою Р зврапВвСсО у плазміду вбудовували фрагмент ДНК, розташований безпосередньо вище нативного гена рапВ у геномі Васіййв. Цю плазміду трансформували в штам КІ-1 Васіїйив зибБцЇв бо (отримана шляхом класичного мутагенезу похідна Васійиз зибійз 168 (штам Магригд АТСС 6051), генотип ігрС2

(Тр), і в результаті гомологічної рекомбінації нативний оперон ралВСО замінювали опероном роврапвоО.

Отриманий штам називався РА221 і мав генотип РоврапвВсоО, тр (Тгр/).

При використанні штаму РА221 Васіїив зибійз у 1Омл культури в середовищі ЗУУ з доданням 5г/л р-аланіну і Б5г/л А-кетоізовалерату вдалося досягти концентрації пантотенової кислоти 0,92г/л (24год.).

Одержання штаму РАЗОЗ Васіїїиз зи (генотип РоврапЕ1)

За допомогою послідовності гена рапЕ ЕЕ. соїї аналогічним чином клонували послідовність гена рапЕ

Васійнив. Виявилося, що в геномі Васійв зибБійїз присутні два гомологи гена рапЕ Е. сої, які одержали назви рапЕї і рапЕ2. При аналізі результатів делецій одного та іншого гена виявилося, що ген рапЕ1 70 відповідальний за виробництво 9095 пантотенової кислоти, у той час як делеція гена рапЕ2 не справляла значного ефекту на рівень виробництва пантотенової кислоти. У цьому випадку, як і при клонуванні оперона рапВвоСО, промотор був замінений на сильний конститутивний промотор Р»ов, а ділянка зв'язування рибосоми перед геном рапЕ1 штучною ділянкою зв'язування. Фрагмент Р обрапЕї1 клонували у вектор, що був сконструйований таким чином, щоб фрагмент РоврапЕ1 міг вбудовуватися у вихідний локус рапЕ1 у геномі Васіїйив зибійв. Отриманий 75 в результаті трансформації та гомологічної рекомбінації штам називався РАЗОЗ і мав генотип Р оврапЕ1. При використанні штаму РАЗОЗ Васійив зибБійїв у ТОмл культури в середовищі БУМ з доданням 5г/л В-аланіну і 5г/л

А-кетоізовалерату вдалося досягти концентрації пантотенової кислоти 1,66г/л (24год.).

Подальше конструювання штаму здійснювали шляхом трансформації РАЗ27 плазмідою, що містить оперон

РовімвМС та маркерний ген спектиноміцину. Оперон РовімвМС вбудовували в локус атуЕ, що було показано методом ПЛР. Отриманий штам одержав назву РАЗ40 (генотип РоврапВвоО, РоврапЕ!1, Р2біМВМС, зреск, грог (Ттв7).

При використанні штаму РАЗАО Васійиз зибійв у 1Омл культури в середовищі ЗМУ з доданням тільки 5г/л

В-аланіну вдалося досягти концентрації пантотенової кислоти З,бг/л (24год.), у 1Омл культури в середовищі ЗМУ з доданням 5г/л р-аланіну і бг/л у-кетоїзовалерату вдалося досягти концентрації пантотенової кислоти 4,1г/л с (2АгОД.). о

Потім у штам РАЗ40 вводили розрегульовану касету ЇМО. Для цього штам РАЗ4А0О трансформували плазмідою, що містить ген їмО під контролем промотору Ров зі штучною ділянкою зв'язування рибосоми КВ52. При цьому ген

РовімО в результаті гомологічної рекомбінації вбудовували у вихідний локус ЇМО. Отриманий штам РАЗ74 мав генотип РоврапВоО, РоврапЕ!1, РовімвмМс, Р2біїмоО, зреск і трС2 (Тгр). Ф

При використанні штаму РАЗ74 Васіїйиз зиИбБійїв у 1Омл культури в середовищі ЗМУ з доданням тільки (Се) ог/л р-аланіну вдалося досягти концентрації пантотенової кислоти 2,99г/л (24год.). с

Для одержання пантотенової кислоти за допомогою штаму РАЗ74 без добавки В-аланіну у штам РАЗ74 вносили додаткові копії гена рапо, що кодує аспартат-у-декарбоксилазу. Для цього штам РАЗ74 трансформували

Зв Ххромосомною ДНК штаму РА4О1. Шляхом селекції на тетрациклін був отриманий штам РАЗ77. Отриманий штам М.

РАЗ77 мав генотип Роврапвсо, РоврапЕ1, Ровімвме, Р»овіїмО, зресв, (еїк і троса (Тгр/).

При використанні штаму РАЗ77 Васійиз зибійз у 1Омл культури в середовищі 5МУ без додання попередника вдалося досягти концентрації пантотенової кислоти 1,31г/л (24год.). «

Одержання штаму РА4О1 Васіїїиз зи» (генотип РоврапО)

Ген рапО Васіїйнв вирій клонували з оперона ралВСО у вектор, що містить маркерний ген стійкості до ЩО с тетрацикліну. Перед геном рапО клонували промотор Роб та один з вищеописаних штучних сайтів зв'язування рибосоми. Шляхом обробки рестриктазами був отриманий фрагмент, що містить маркерний ген стійкості до і» тетрацикліну і ген РоврапО. Виділений фрагмент регулювали та трансформували у вищеописаний штам РА221.

При цьому фрагмент вбудовували в геном штаму РА211. Отриманий штам РА401 мав генотип Роврапвоо,

Роврапо, їекК і трС2 (Тр). -і При використанні штаму РА40О1 Васійиз зиБійв у лОмл культури в середовищі 5МУ з доданням -І Бг/л о-кетоїзовалерату вдалося досягти концентрації пантотенової кислоти 0,Зг/л (24год.). У ТОмл культури в середовищі 5МУ з доданням 5г/л Ю-пантотенової кислоти і 10г/л | -аспартату вдалося досягти концентрації

Ме, пантотенової кислоти 2,2г/л (24год..). б 20 Зі штаму РАЗ77 шляхом трансформації хромосомної ДНК штаму РЖМ79 був отриманий прототрофний по триптофану штам. Цей штам РА824 мав генотип РоврапвВсо, РоврапЕ1, РовімВМС, РовіїмО, зресвн, геї і Тгр". с При використанні штаму РА824 Васійиз зибійз у 1Омл культури в середовищі 5МУ без додання попередника вдалося досягти концентрації пантотенової кислоти 4,9г/л (48год.) (у порівнянні з РАЗ77: 3,бг/л за 48год.).

Одержання штаму РАббВ 29 Ген рапВ Васійив зибійз клонували з оперона рапВСО дикого типу та вставляли у вектор, що містить, крім

ГФ) гена стійкості до хлорамфеніколу, також послідовності локусу ург Васійив зибійів. юю Сильний конститутивний промотор Роб вбудовували перед 5 кінцем гена рапВ. Шляхом обробки рестриктазами був отриманий фрагмент, що містить ген РоврапВ, маркерний ген стійкості до хлорамфеніколу, а також послідовності ург Васіїйиз зибБЇв.. 60 Виділений фрагмент повторно лігували та трансформували в штам РА824. Отриманий штам одержав назву

РАббВ. Отриманий штам РАбб8 мав генотип РоврапВо0О, РоврапЕ!1, РовімВвВМе, РовіїмО, РоврапВ, зреск, їге(К, Стк та Тгр".

Були виділені дві колонії штаму РАбВ68, що одержали назви РАбб8-2А і РАбб8-24.

При використанні штаму РАбб8-2А Васіїйиз зиБійв у 17Омл культури в середовищі ЗМУ без додання бо попередника протягом 48год. вдалосяся досягти концентрації пантотенової кислоти 1,5г/л. У 1Омл культури з доданням 10г/л І -аспартату вдалося досягти концентрації пантотенової кислоти 5г/л.

При використанні штаму РАббБ8-24 Васіййз зирійв у 7Омл культури в середовищі ЗМУ без додання попередника протягом 48год. вдалося досягти концентрації пантотенової кислоти 1,8г/л. У 1Омл культури з доданням 10г/л | -аспартату вдалося досягти концентрації пантотенової кислоти 4,9г/л.

Детально конструювання цього штаму описане в заявці (05, 60/262995) та у заявці (РСТ/О5, 00/259931.

При використанні вищеописаного штаму РАЗ77 у процесі лімітованої по глюкозі ферментації в середовищі

ЗМУ, що має склад, г/л: 70 телячий інфузійний бульйон Оїсо 25; дріжджовий екстракт Ойсо 5; триптофан 5; глутамат натрію 5; (МНгд»ЗОА 2;

КНоРОд 10;

КонРОд 20;

Сасіо 01;

Мао, 1,0; цитрату натрію 1,0; гевОдхтНоО 0,01 і ТІмл/л розчину розчинених у воді (для одержання 1л) солей мікроелементів наступного складу, г:

МаоМодх2 ньо 0,15; с

НзвВОЗз 2,50; (о,

СоСіохбНоО 0,70; сСивОдхБНЬО 0,25;

МпсСіохаНоО 1,60; Ге») 7п8ОдхТНоО 0,30, со в об'ємі 10 л при безперервному додаванні розчину глюкози протягом Збгод. (48год.) вдалося досягти (Се) концентрації пантотенової кислоти у ферментаційному розчині 18-19г/л (22-25г/л).

При використанні штаму РА824, прототрофної по триптофану похідної штаму РАЗ77, у процесі лімітованої по - глюкозі ферментації в середовищі на дріжджовому екстракті, г/л: - дріжджовий екстракт Осо 10; глутамат натрію 5; (МНО»ЗОХ 8; ч

КН РО, 10; - с КоНРОд 20; з » Сасіо 0,1;

Мао 1,0; цитрату натрію 1,0; -І геводхТНоО 0,01, -і і 1мл/л вищеописаного сольового розчину мікроелементів) в об'ємі 10л при безперервному додаванні розчину о глюкози протягом Збгод., 48год. та 72год. вдалося досягти наступних значень концентрації пантотенової кислоти вд У ферментаційному розчині 20г/л, 28г/л і Збг/л. (о) Шляхом подальшої оптимізації середовища при використанні штаму РА824 у процесі лімітованої по глюкозі с ферментації в середовищі, що складалося 3, г/л: дріжджовий екстракт Ойсо 10; нітрозоаміну А (Сіцеві Іпіегпайопа! Стр, Егівіайю) 10; 59 глутамат натрію 10;

Ф) (МНадовОя 4; ко КНоРОд 10;

КонРОд 20; 6бо СасСіо 0,1;

Мао 1,0; цитрату натрію 1,0; гевоОдхТНоО 0,01, бо і 1мл/л вищеописаного сольового розчину мікроелементів) в об'ємі 10л при безперервному додаванні розчину глюкози протягом Збгод. (48год.) вдалося досягти наступних значень концентрації пантотенової кислоти у ферментаційному розчині З7г/л (48г/л).

Додаткового підвищення концентрації пантотенової кислоти у ферментаційному розчині можливо досягти

Шляхом подальшої оптимізації середовища, збільшення тривалості ферментації, удосконалення технологічних процедур та використовуваного штаму, а також за допомогою комбінації запропонованих заходів. Крім того, зазначені вище концентрації пантотенової кислоти можуть бути досягнуті за допомогою ферментації з використанням штамів, що є похідними від вищеописаного штаму РАЗ824. Ці похідні можуть бути отримані шляхом класичних методів розробки штамів, а також за допомогою генноінженерних маніпуляцій. Шляхом удосконалення 7/0 бередовища, штамів і технології ферментації можна досягти підвищення концентрації пантотенової кислоти у ферментаційному розчині до 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 і більше Убг/л.

Істотною перевагою заявленого в даному винаході способу є те, що ферментація протікає в культуральному середовищі, що, крім джерел вуглецю та азоту, як вихідні сполуки не містить інших попередників кінцевого продукту. Таким чином, біосинтез ЮО-пантотенової кислоти є незалежним від додання інших попередників. Під /5 такими попередниками в рамках даного винаходу варто розуміти такі речовини, як р-аланін, та/або І-аспартат, та/або І -валін, та/або у-кетоізовалерат, та/або їх комбінації.

У кращому варіанті заявленого в даному винаході способу ферментація здійснюється організмом, що продукує

О-пантотенову кислоту, в культуральному середовищі, що містить одне джерело вуглецю та одне джерело азоту, але без додання вільного р-аланіну та/або солей р-аланіну перед або в процесі ферментації. Тобто, для одержання ЮО-пантотенової кислоти в концентрації, принаймні, 1Ог/л культурального середовища, переважно, принаймні, 20г/л, особливо переважно, принаймні, 40г/л, найбільш переважно, принаймні, бОг/л і особливо, принаймні, 7Ог/л, відповідно до винаходу не потрібне додання вільного р-аланіну та/або солей р-аланіну.

Незалежність від додання попередника представляє собою важливу з економічної точки зору перевагу заявленого в даному винаході способу в порівнянні з відомими способами, оскільки більшість попередників є дуже дорогими. се

Проте у рамках даного винаходу не виключається додання р-аланіну та/або солей р-аланіну в культуральне о середовище, у такий спосіб вихід ЮО-пантотенової кислоти може бути додатково підвищений шляхом додання р-аланіну та/або солей р-аланіну. При цьому виходять з того, що, якщо всі необхідні попередники пантотенової кислоти наявні в достатній кількості і додаткове збільшення виробництва пантотенової кислоти обмежується лише активність гена рапО, то вихід О-пантотенової кислоти можна підвищити, наприклад, ще на о 5075, шляхом додання вільного р-аланіну та/або солей р-аланіну. В одному з кращих варіантів представленого «о винаходу для додаткового підвищення виходу Ю-пантотенової кислоти більше, ніж на 5095, у культуральне с середовище можна додавати до 20г/л вільного р-аланіну та/або солей р-аланіну. Кращим є додання в культуральне середовище приблизно 15г/л вільного р-аланіну та/або солей р-аланіну. в.

Прикладами прийнятних у рамках даного винаходу джерел вуглецю, що додаються в культуральне ча ферментаційне середовище з вищезгаданими мікроорганізмами, є цукри, такі, як гідролізати крохмалю (моно-, ди- та олігосахариди), переважно глюкоза або сахароза, а також бурякова або очеретяна цукрова патока, білки, білкові гідролізати, соєве борошно, кукурудзяний сік, жири, вільні жирні кислоти, клітини, отримані в результаті ферментаційних процесів, або їх гідролізати, а також дріжджовий екстракт. Вказаний перелік не може « розглядатися як обмеження представленого винаходу. шо с Крім того, кращий спосіб, заявлений у даному винаході, характеризується тим, що загальний вміст цукру в розчині до кінця ферментаційного процесу повинен бути, по можливості, зведений до мінімуму, оскільки інакше )» він в результаті склеювання утруднює наступне сушіння та/або формування ферментаційного розчину. Цього відповідно до даного винаходу можна досягти, продовжуючи ферментацію ще якийсь час після того, як джерело

Вуглецю буде вичерпано (при культивуванні в замкнутій культурі без підживлення), або після того, як -І припиниться подача джерела вуглецю (при протіканні процесу в культурі з однократним або багаторазовим підживленням), та/або відрегулювавши процес таким чином, щоб концентрація джерела вуглецю в кінці процесу ш- практично дорівнювала нулю (у культурі з однократним або багаторазовим підживленням або в культурі з

Ге» безперервним підживленням).

Цього відповідно до винаходу досягають за рахунок того, що після припинення подачі джерела вуглецю

Ме, (наприклад, цукрового розчину) ферментація продовжується доти, поки концентрація розчиненого кисню (ро 5)

Ге) не досягне, принаймні, 8095, переважно 9095 і особливо переважно 9595 від значення насичення у ферментаційному розчині.

Прикладами прийнятних відповідно до винаходу джерел азоту є аміак, сульфат амонію, сечовина, білки, білкові гідролізати або дріжджовий екстракт. Вказаний перелік не може розглядатися як обмеження представленого винаходу. іФ, Крім того, ферментаційне середовище містить мінеральні солі та/або мікроелементи, а також амінокислоти та ка вітаміни. Точний склад прийнятних ферментаційних середовищ добре відомі фахівцям у даній області.

Після інокуляції ферментаційного середовища прийнятним мікроорганізмом, що продукує Ю-пантотенову бо Кислоту (з відомою фахівцям концентрацією клітин), здійснюють культивування даного мікроорганізму при доданні, у разі необхідності, протиспінювальної присадки. При необхідності, відрегулювати значення рн середовища можна за допомогою різних неорганічних або органічних лугів або кислот, таких, як наприклад, гідроксид натрію, гідроксид калію, аміак, фосфорна кислота, сірчана кислота, соляна кислота, мурашина кислота, бурштинова кислота, лимонна кислота і т.д. 65 У залежності від використовуваної при ферментації буферної системи, що, як описано вище, може містити в собі такі компоненти як, гідроксид натрію, гідроксид калію, аміак, фосфорна кислота, сірчана кислота, соляна кислота, мурашина кислота, бурштинова кислота, лимонна кислота і т.д., О-пантотенова кислота, що утворюється у ферментаційному розчині, може знаходитися у вигляді відповідної солі (солей). Оскільки при цьому наявність одновалентних катіонів солей Ю-пантотенової кислоти є небажаною, відповідно до винаходу ферментаційний розчин піддають обробці методом електричного розділення на мембрані.

Таким чином, представлений винахід включає всі доступні методи електричного розділення на мембрані, такі як мембранний електроліз або електродіаліз. Вибір прийнятного методу залишається у компетенції фахівця в даній області. У рамках даного винаходу кращим є використання електродіалізу. При цьому використовуються як електродіаліз із застосуванням винятково монополярних мембран, так і електродіаліз із застосуванням моно- 70 та/або біполярних мембран. Найбільш переважними є методи електродіалізу при використанні винятково монополярних мембран, особливо електродіаліз з використанням селективних для одновалентних іонів монополярних мембран, так званих моноселективних мембран.

У принципі, для реалізації заявленого в даному винаході способу можуть використовуватися будь-як мембрани, що звичайно застосовуються при електродіалізі. Для проведення електродіалізу в рамках даного 7/5 винаходу переважно використовуються наявні в продажі іонообмінні мембрани.

Як аніонообмінні мембрани можуть використовуватися, наприклад, мембрани Меозеріа АМІ, АМ2, АМ3З, АМХ,

АМН, АРМ, виробництва ТоКиуата Согр. і АММ виробництва Азапі Сіазв.

Як катіонообмінні мембрани можуть використовуватися, наприклад, мембрани Меозеріа СМІ, СМ2, СМХ,

СМН, СМВ, Азайі СіІазз СМУ, а також Майоп 435 або 350 виробництва би Ропі де Метоигз.

Як моноселективна катіонообмінна мембрана може використовуватися, наприклад, мембрана Меозеріа СМ5.

Як моноселективні аніонообмінних мембран можуть використовуватися, наприклад, мембрани Меозеріа АС5 виробництва Токоуата Согр. або ЗеІтіоп АЗМ виробництва Азапйі Сіагзз іп Веїгасні.

Як матеріали для електрода можуть використовуватися нержавіюча сталь, нікель, благородні метали, наприклад, платина, та інші матеріали, відомі фахівцям у даній галузі. сч

При використанні монополярного електродіалізу в рамках даного винаходу як аніони, так і катіони з розчину, що містить ЮО-пантотенат, можуть під дією електричного поля мігрувати Через аніоно- або о); катіонообмінні мембрани в інший розчин (розчин концентрату, КОМ), і в результаті цього вони видаляються з розчину, що містить пантотенову кислоту (розчин дилюату, ОІ). Відповідно до винаходу з розчину, що містить пантотенову кислоту, переважно видаляються низькомолекулярні іони. Під низькомолекулярними іонами в рамках ду зо даного винаходу варто розуміти іони, що входять до складу культурального середовища та/або буферної системи, але є небажаними в кінцевому продукті. До них відносяться, зокрема, наступні іони: іони амонію, калію, со натрію, заліза, хлорид-іони, фосфат-іони або сульфат-іони. Ге

В іншому варіанті реалізації представленого винаходу здійснюється іонний обмін одновалентних катіонів, таких як іони натрію або амонію, на багатовалентні катіони, такі як іони кальцію. При цьому використовуються ї- катіонообмінні мембрани, що є селективними для одновалентних іонів. Так, наприклад, у першу камеру І вносять ї- розчин хлориду кальцію, а в другу камеру ІІ, відокремлену від камери І катіонообмінною мембраною, розчин

О-пантотенової кислоти, що містить одновалентні катіони. Потім у третю камеру ІїЇ через встановлену між камерою ІІ та камерою ІІЇ селективну для одновалентних іонів катіонообмінну мембрану, переносяться переважно одновалентні катіони.. Одночасно з камери | у камеру ПШ через встановлену між камерою | та камерою ЇЇ « аніонообмінну мембрану переносяться аніони, такі як хлорид-іони. Іони кальцію переносяться з камери | у шв с камеру ІІ через катіонообмінну мембрану. У такий спосіб безпосередньо утворюється Ю-пантотенат кальцію. При наявності солей слабких кислот, таких як, наприклад, пантотенова кислота, за допомогою подібної системи можна )» також одержувати вільну О-пантотенову кислоту, якщо замість розчину хлориду кальцію в камеру І внести водний розчин соляної кислоти.

При реалізації представленого винаходу можуть також використовуватися солі кальцію та/або магнію у -І вигляді неорганічних або органічних аніонів. Переважно в рамках даного винаходу використовуються хлорид, нітрат, гідроксид, форміат, ацетат, пропіонат, гліцинат та/або лактат кальцію та/або магнію.

Ш- В одному з варіантів здійснення представленого винаходу в процесі проведення біполярного електродіалізу

Ге» катіони переважно переносяться (при одночасному утворенні протонів у результаті дисоціації води в біполярній мембрані) з розчину, що містить О-пантотенат, через катіонообмінну мембрану в другий розчин і в такий спосіб

Ме. відокремлюються від розчину, що містить пантотенову кислоту. В другому розчині при взаємодії з

Ге) гідроксид-іонами, що утворюються в результаті дисоціації води в біполярній мембрані, перенесені катіони утворюють відповідні основи.

В іншому варіанті здійснення представленого винаходу в процесі проведення біполярного електродіалізу ов аніони переважно переносяться (при одночасному утворенні гідроксид-іонов у результаті дисоціації води в біполярній мембрані) з розчину, що містить О-пантотенат, через аніонообмінну мембрану в другий розчин, і в іФ, такий спосіб відокремлюються від розчину, що містить пантотенову кислоту. В другому розчині при взаємодії з ка протонами, що утворюються в результаті дисоціації води в біполярній мембрані, перенесені аніони утворюють відповідні кислоти. во Даний винахід передбачає також варіант здійснення, при якому в процесі проведення біполярного електродіалізу, з однієї сторони, аніони (при одночасному утворенні гідроксид-іонов у результаті дисоціації води в біполярній мембрані) переносяться з розчину, що містить О-пантотенат, через аніонообмінну мембрану в другий розчин, і в такий спосіб вони відокремлюються від розчину, що містить пантотенову кислоту, а з іншої сторони, катіони (при одночасному утворенні протонів у результаті дисоціації води в біполярній мембрані) 65 переносяться з розчину, що містить О-пантотенат, через катіонообмінну мембрану в третій розчин, і в такий спосіб вони відокремлюються від розчину, що містить пантотенову кислоту. В другому розчині при взаємодії з протонами, що утворилися в результаті дисоціації води в біполярній мембрані, перенесені аніони утворюють відповідні кислоти, а в третьому розчині при взаємодії з гідроксид-іонами, що утворюються в результаті дисоціації води в біполярній мембрані, перенесені катіони утворюють відповідні основи.

У рамках даного винаходу при реалізації представленого способу кращим є також, доведення, за допомогою кислот або основ, значення рН розчину, що містить ЮО-пантотенат, до ізоелектричного значення рН О-пантотенової кислоти. Завдяки цьому можна ще більше підвищити вихід вільної О-пантотенової кислоти і, відповідно, знизити втрати.

Використання монополярного електродіалізу є особливо кращим, оскільки в порівнянні з біполярним 70 електродіалізом він набагато дешевший.

Біполярний електродіаліз використовується переважно тоді, коли додавання кислот або основ для доведення значення рН не допускається або коли передбачається наступне використання кислот, що утворюються, або основ.

Усі варіанти електродіалізу, що використовуються в даному винаході, володіють тією перевагою, що вони не 7/5 приводять до появи стічних вод, що утворюються при регенерації іонообмінних смол.

Використання заявленого в даному винаході методу електричного розділення дозволяє переважно видаляти небажані низькомолекулярні іони (сторонні іони), такі як іони амонію, калію, натрію, заліза, хлорид-іони, фосфат-іони або сульфат-іони, з розчину, що містить О-пантотенат. В результаті утворюється переважно вільна

О-пантотенова кислота або потрібні солі, такі як О-пантотенат кальцію та/або магнію. Відповідно до даного 2о винаходу вміст у розчині одновалентних катіонів, переважно іонів амонію, калію та/або натрію, доводиться до концентрації, що є меншою або рівною г/кг.

Також можна істотно знизити вміст небажаних аніонів, таких, наприклад, як хлорид-іони, фосфат-іони або сульфат-іони, шляхом використання відповідної іонообмінної мембрани, переважно, аніонообмінної мембрани.

Отриманий у такий спосіб розчин, що містить вільну О-пантотенову кислоту відповідно до винаходу, шляхом сч ов додавання кальцієвих і/або магнієвих основ доводять до значення рН від З до 10. Кращими є значення рН від 5 до 10. Кращим є доведення рН розчину до значень 5-9, особливо переважно до значень 6-9 і особливо до значень іо) 6-8. У такий спосіб одержують розчин, що містить пантотенат кальцію і/або магнію. Переважно для нейтралізації в розчин додають гідроксид кальцію, карбонат кальцію, оксид кальцію, гідроксид магнію і/або основний карбонат магнію у вигляді твердої речовини і/або у вигляді водної суспензії. Ге! зо При цьому кращою відповідно до винаходу є нейтралізація розчину, що містить вільну О-пантотенову кислоту, за допомогою кальцієвих та/або магнієвих основ у вигляді водної суспензії. При використанні водної суспензії ісе) нейтралізація протікає без великих коливань значення рН та швидше, ніж при застосуванні відповідних Ге компонентів у вигляді твердої речовини.

Заявлений у даному винаході спосіб характеризується тим, що в розчин на стадії с) додають водну ї- суспензію, що містить 2-55 мас. 95, переважно 10-50 мас. 90. і особливо переважно 20-40 мас. 9о гідроксиду М кальцію.

Крім того, даний винахід включає спосіб, при якому в розчин на стадії с) додають водну суспензію, що містить 2-65 мас. 906, переважно 10-50 мас. 95 і особливо переважно 20-40 мас. 906 карбонату кальцію. В іншому варіанті здійснення представленого винаходу в розчин на стадії с) додають водну суспензію, що містить 2-60 « 70 мас. Фо, переважно 10-50 мас. 95 і особливо переважно 20-40 мас. 9о гідроксиду магнію. Даний винахід включає (75) с також спосіб, при якому в розчин на стадії с) додають водну суспензію, що містить 2-25 мас. 95, переважно 10-20 мас. 95 основного карбонату магнію. )» Сушіння та/або формування розчину або суспензії, що містять пантотенат кальцію та/або магнію, здійснюють відомими методами, наприклад, такими, як розпилювальне сушіння, розпилювальна грануляція, сушіння у

Ввихровому шарі, грануляція у вихровому шарі, сушіння в барабанній сушарці або термічне сушінні в обертовій -І сушарці (Шітапп'я Епсусіореадіа ої Іпацйвігіаї Спетівігу. б" еайоп. ЕІесігопіс геіеазе. Каріїєї "Огуіпд ої Зоїїа

Маїгегіа!в", - 1999). Температура газу на вході при конвекційному сушінні складає від 100 до 2802С, переважно від - 120 до 2102С. Температура газу на виході складає від 50 до 1802С, переважно від 60 до 15023. Для забезпечення (о) необхідного розподілу за розміром частинок, що визначає сполучні властивості продукту, дрібні частинки можуть

Фу 50 уловлюватися та повертатися назад. Крім того, великі грудки можуть бути подрібнені в порошок, а потім їх також повертають назад.

Ме, Перевагою представленого винаходу є скорочення при використанні представленого вище способу дорогих технологічних процесів, особливо відмова від використання органічних розчинників, при одночасному одержанні потрібного продукту, що володіє високою біологічною цінністю. Крім того, при використанні заявленого в даному винаході способу можна значно знизити кількість стічних вод, що утворюються. Це дає додаткову економію на о дорогих установках по переробці та утилізації відходів. Таким чином, спосіб, заявлений у даному винаході, володіє такою перевагою, що він є простішим, надійнішим, більш швидким, значно дешевшим і, відповідно, більш іме) економічним, ніж традиційний спосіб.

Це, проте, не виключає деяких варіацій заявленого в даному винаході способу. Зазначені на початку 60 технологічні стадії заявленого в даному винаході способу з а) до 4) можуть бути доповнені одним або декількома додатковими стадіями, що самі по собі відомі фахівцям у даній області. При цьому даний винахід містить у собі всі можливі комбінації цих додаткових (факультативних) технологічних стадій з (істотними) технологічними стадіями з а) до 4).

Так, розчини або суспензії, отримані на стадіях а)-с), можуть, наприклад, піддаватися знезаражуванню 65 шляхом нагрівання (стерилізації) або іншими методами, такими, наприклад, як пастеризація або стерильна фільтрація.

В інших варіантах заявленого в даному винаході способу перед сушінням та/або формуванням розчину або суспензії можливе додаткове проведення однієї або декількох процедур, включаючи лізис та/або пригнічення життєдіяльності клітин, та/або відокремлення клітинної маси від ферментаційного розчину, та/або додаткове

Внесення наповнювачів, та/або концентрування ферментаційного розчину, переважно шляхом дегідратації.

Таким чином, об'єктом представленого винаходу є також спосіб, при якому лізис та/або пригнічення життєдіяльності клітин проводять ще в ферментаційному розчині або відразу ж після відокремлення клітинної маси від ферментаційного розчину. Це можна здійснювати, зокрема, шляхом термічної обробки, переважно при температурі 80-20092С та/або кислотної обробки, переважно сірчаною або соляною кислотою, та/або 70 ферментативним способом, переважно за допомогою лізоциму.

В іншому варіанті здійснення представленого винаходу клітини ферментованих мікроорганізмів можуть бути шляхом фільтрації, сепарації (наприклад, центрифугування) та/або декантації вилучені з розчину або суспензії, що отримані на стадії стадіях а), 5) або с) заявленого в даному винаході способу. Можливо також пропускання розчину одержаного на стадіях а), 5) або с), шляхом накладання електричного поля, безпосередньо через одну 7/5 або декілька іоноселективних мембран без відокремлення мікроорганізмів, що містяться в розчині.

Отриманий в результаті мембранного електролізу або електродіалізу розчин можна відразу ж після нейтралізації піддавати випарюванню для підвищення його концентрації у відповідному випарнику, наприклад, тонкоплівковому випарнику або випарнику обертового типу. Такі випарники виробляються, зокрема, фірмами ІС (4800 Ацйпаподо Пухайм, Австрія), СЕА Сапліег (52303 Дюрен, Німеччина), Оіеззеї! (31103 Хільдесхайм, Німеччина) та Ріцоп (35274 Кірхайн, Німеччина).

Для поліпшення барвних властивостей кінцевого продукту можна використовувати додаткову стадію фільтрації, при якій в отримані за допомогою зазначеного способу розчин або суспензію додають деяку кількість активованого вугілля, після цього суспензію, що містить активоване вугілля, фільтрують. Отримані в процесі ферментації розчини можуть також пропускатися через тонкий шар активованого вугілля. Необхідні для цього с

Кількості активованого вугілля, що додається, складають менше 1 мас. 95 ферментаційного розчину і встановлюються на розсуд відповідного фахівця. о

Цей процес можна полегшити, якщо перед фільтрацією у відповідний розчин додати звичайний засіб для коагуляції (наприклад, Зедіриг СЕ 902 або Зедіриг СІ. 930 виробництва фірми ВА5Е АОС, І пдм/ідзпатеп).

В одному з кращих варіантів здійснення представленого винаходу ферментаційний розчин стерилізують Ге»! шляхом нагрівання, а потім шляхом центрифугування, фільтрації або декантації відокремлюють від клітинної маси. Після додання звичайного засобу для коагуляції з розрахунку 50-100Омг/кг, переважно 100-200мг/кг ее, ферментаційний розчин фільтрують через тонкий шар активованого вугілля та піску для одержання вільного від Ге) клітинної маси розчину з високим вмістом Ю-пантотенової кислоти. На завершення отриманий у такий спосіб розчин під впливом електричного поля пропускають через одну або декілька іоноселективних мембран. -

Подальше сушіння розчину або суспензії, що містять пантотенат кальцію та/або магнію, можна здійснювати, ча наприклад, шляхом розпилювального сушіння. Таке сушіння може протікати в прямотоковому, протитоковому або змішаному процесі. Для розпилення можуть використовуватися усі відомі розпилювачі, зокрема, відцентрові розпилювачі, розпилювачі з однокомпонентними або двокомпонентними насадками. Кращий температурний діапазон сушіння складає 150-2502С на вході в барабан і 70-1302С на виході з барабана. Сушіння також можна « проводити при більш високих або більш низьких температурах. Для максимального видалення залишкової вологи с можна додатково проводити сушіння у вихровому шарі.

Розпилювальне сушіння також можна проводити в сушарках типу Е5О (Ріціділеа Зргау Огуег) або 5ВО (Зргау і» Вей Огуег), вироблених фірмами Міго (Копенгаген, Данія) і АРМ-Аппуйго (Копенгаген, Данія), в яких реалізується комбінація розпилювального сушіння та сушіння у вихровому шарі.

При розпилювальному сушінні в сушарку можна додавати допоміжний засіб. Це дозволяє зменшити покриття - І стінок сушарки та поліпшити характер плину дрібнозернистого порошку. Як допоміжний засіб можуть -І використовуватися, зокрема, силікати, стеарати, фосфати та кукурудзяний крохмаль.

У принципі сушіння також може здійснюватися шляхом розпилення у вихровому шарі, при цьому сушіння

Ге») можна проводити як у безперервному, так і в переривчастому режимі. Подача розчину або суспензії може о 50 здійснюватися зверху (Торзргау), знизу (Войотгргау) або збоку (Зідезргау).

Об'єктом представленого винаходу є, крім того, склад, використовуваний як добавки та/або доповнення до (Че) корму тварин, при виробництві якого: а) використовують, принаймні, один організм, що продукує Ю-пантотенову кислоту, в якому порушена регуляція біосинтезу пантотенової кислоти-(рап) та/або ізолейцину/валіну-(Пу), та який в процесі ферментації

В культуральному середовищі виробляє, принаймні, 2г/л солі О-пантотенової кислоти, причому в культуральне о середовище додають 0-20г/л, переважно Ог/л, вільного р-аланіну та/або солей р-аланіну;

Б) ферментаційний розчин, що містить О-пантотенат, під впливом електричного поля пропускають через одну ко або декілька іоноселективних мембран, в результаті чого низькомолекулярні іони видаляються з розчину, що містить О-пантотенат; 60 с) рН розчину, що містить вільну Ю-пантотенову кислоту, доданням кальцієвих та/або магнієвих основ доводять до значення 3-10, при цьому одержують розчин, що містить пантотенат кальцію та/або магнію, і а) розчин, що містить пантотенат кальцію та/або магнію, піддають сушінню та/або формуванню.

В одному з варіантів представленого винаходу склад характеризується тим, що на стадії с) або 4) одержують або додають суспензію, що містить пантотенат кальцію і/або магнію. 65 Крім того, заявлений у даному винаході склад характеризується тим, що він містить солі О-пантотенової кислоти в концентрації, принаймні, 1-100 мас. 95, переважно, принаймні, 20-100 мас. 95 і особливо переважно,

принаймні, 50 мас. 95. Об'єктом представленого винаходу є склад, що містить солі О-пантотенової кислоти у вигляді двовалентних катіонів, переважно О-пантотенат кальцію та/або магнію. У рамках даного винаходу кращим є склад, що характеризується тим, що вміст в ньому солей Ю-пантотенової кислоти у вигляді одновалентних катіонів дорівнює або менше г/кг.

Відповідно до заявленого в даному винаході способу може бути отриманий Ю-пантотенат кальцію та/або магнію, що задовольняє вимогам, які пред'являються до добавок кормів для тварин. Ці вимоги передбачають, зокрема, порівняно високий вміст О-пантотенату та гарну переносимість відповідними тваринами, а також біологічну цінність у змісті "вітамінної дії" заявленого в даному винаході продукту. 70 Далі даний винахід більш докладно ілюструється на прикладах, що наводяться нижче, та які ніяким чином не можна розглядати як обмеження представленого винаходу:

Приклад 1:

У ферментатор об'ємом 14л, що оснащений мішалкою та аератором, заливають водне ферментаційне середовище наступного складу: й дріжджовий екстракт, г/л 10; глутамат натрію, г/л 5; сульфат амонію, г/л 8; протиспінювальний засіб, мл/л. 1. ! пОщ ! ! ,

Після стерилізації в середовище додатково додають наступні стерильні компоненти:

КНоРО,, г/л 10,0;

КоНРОХ, г/л 20,0; глюкоза, г/л 2,5; см хлорид кальцію, г/л 0,1; (о, хлорид магнію, г/л 1,0; цитрат натрію, г/л 01;

Гезодх7Ноо, г/л 0,1; Ге») сольовий розчин мікроелементів, мл/л. 1,0. с

Сольовий розчин мікроелементів готують розчиненням у воді для одержання Тл розчину, г: «о

МаоМодх2 него 0,15; -

НзВОз3 2,50; -

СоСіохбНоО 0,70; сСивОдхБНЬО 0,25;

МпсСіохаНоО 1,60; « 7п8ОдхТНоО 0,30. т но с Додавання мікроелементного сольового розчину здійснюють після його стерильної фільтрації. Вихідний об'єм

І» рідини складає 8,4л. Кількість вищевказаних компонентів визначається, виходячи з цього значення.

У цей розчин додають 16бОмл культури для інокуляції (20-10 в середовищі ЗМУ (середовище ЗМУ: розчинити в 740мл води, г: -і телячий інфузійний бульйон Оіїсо 25; -І дріжджовий екстракт Ойсо 5; глутамат натрію 5; (2) (МНАд»8О, 2, б 50 стерилізувати; додати 200мл стерильного 1М розчину КЯОНРО,) (рН 7) та бОмл стерильного 5095 розчину

Ме, глюкози (кінцевий об'єм 1л)) Васійи5 зибБійїз РА8Ф24 і проводять ферментацію при температурі 4390 при інтенсивному перемішуванні при швидкості аерації 12л/хв. Цей штам описаний у заявці |РСТ/О5, 00/259931.

Протягом 52год. у розчин додають бл стерильного водного розчину наступного складу:

ГФ! глюкоза, г/л 500,0; сульфат кальцію, г/л 0,6; їмо) сольовий розчин мікроелементів, мл/л 7,0. 60 Процес ферментації лімітується по глюкозі. У процесі ферментації значення рН розчину підтримують на рівні 7,2 шляхом додання 2595 аміачного розчину або, відповідно, 2595 розчину фосфорної кислоти. Аміак одночасно служить як джерело азоту для ферментаційного процесу. Положення регулятора встановлюють таким чином, щоб концентрація розчиненого кисню підтримувалася на рівні 3095 від значення насичення. Після припинення подачі джерела вуглецю ферментацію продовжують доти, поки концентрація розчиненого кисню (рО») не досягне 9590 65 від значення насичення. Після цього ферментацію зупиняють і мікроорганізм знищують шляхом нагрівання. Для цього ферментаційний розчин піддають стерилізації протягом бОхв. Ефективність стерилізації перевіряють методом висівання на чашку.

На завершення здійснюють відокремлення клітинної маси шляхом центрифугування. Після відокремлення клітинної маси концентрація ЮО-пантотенату складає (після 52год. ферментації) 24, 7г/л.

Аналогічним чином одержують ферментаційні розчини, в яких без добавки р-аланіну концентрація пантотенової кислоти складає 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65,70, 75, 80, 85 і більше 9Ог/л.

В отриманий ферментаційний розчин, який піддавали термічній стерилізації та центрифугуванню для видалення клітинної маси, додатково додають Ю-пантотенову кислоту та розчином сірчаної кислоті доводять до значення 2. Отриманий таким способом розчин або суспензію фільтрують через тонкий шар піску та активованого 70 Вугілля. Концентрація ЮО-пантотенової кислоти у фільтраті складає 67, 7г/л. 900г цього фільтрату обробляють електродіалізним способом: в електродіалізаторі (оснащеному мембранами аніоно- та катіонообмінників (типу Меозеріа АМХ ЗБ або СМХ 56 від Токоуата Согр.), ефективна поверхня якого складає 1,85дм2, та який містить 5 камер, фільтрат знесолюють при початковій густині потоку 29мА/см 2.

Протягом проведення експерименту після досягнення заданої граничної напруги 20М густина потоку поступово 75 зменшується. Температура становить від 332С до 402С. Як концентрат додають 0,595 (в/в) розчин хлориду натрію. Цей концентрат (КОНЦ) насичують видаленими з фільтрату (дилюату, ДИЛ) іонами (наприклад, іонами амонію, хлориду, заліза, калію, натрію або фосфату). В електролітичну камеру для промивання електродів додають 595 (в/в) розчин сульфату натрію. Підчас проведення експерименту при різних значеннях електропровідності розчину дилюату беруть та аналізують проби з камери, що містить дилюат. Результати аналізу представлені у наведеній нижче таблиці, вони показують, що протягом експерименту зазначені вище іони видаляють з дилюату, і таким чином його електропровідність зменшується. Маленькі одновалентні іони, наприклад, іони хлориду, видаляються швидше, ніж об'ємні багатовалентні іони, наприклад, іони фосфату.

Результати аналізу дилюату наведені в даній Таблиці 1. с о

Едяттвсм 00000677 озБолоовоовт ов оте 000 0001 ов 0002 Ф зо й

Ф щ зв м «

Значення рН всіх проб дилюату становить 2-3. 771г дилюату містить 76бг/л вільної пантотенової кислоти. - с Результати показують, що ферментативно одержаний розчин ЮО-пантотенової кислоти електролітичним способом можна успішно звільнити від непотрібних катіонів. Із одержаної знесоленої Ю-пантотенової кислоти і» можна одержати негігроскопічний порошок кальцій-О-пантотенат, як описано у прикладі 2.

Приклад 2

У ферментатор об'ємом 14л, оснащений мішалкою й аератором, заливають водне ферментаційне середовище -І наступного складу, г/л: - дріжджовий екстракт 10;

Ге») глутамат натрію 5; сульфат амонію 8; б й КНеРОд ВА; іЧе) КоНРОд 15.

Після стерилізації в середовище додатково додають наступні стерильні компоненти: глюкоза, г/л 2,5; іФ, хлорид кальцію, г/л 0,1; ке хлорид магнію, г/л 1,0; цитрат натрію, г/л 1,0; во Гезодх7Ноо, г/л 0,01; сольовий розчин мікроелементів, мл/л. 1,0.

Вихідний об'єм рідини складає 5,5л. Кількість вищевказаних компонентів визначають, виходячи з цього значення. 65 У цей розчин додають 55мл культури для інокуляції (00 -10 в середовищі УМ (середовище 5МУУ: розчинити в 740 мл води, г:

телячий інфузійний бульйон Оіїсо 25; дріжджовий екстракт Ойсо 5; глутамат натрію 5; (МНАд»8О4 2, стерилізувати; додати 200мл стерильного 1М розчину КЯОНРО,) (рН 7) та бОмл стерильного 5095 розчину глюкози (кінцевий об'єм 1л)) Васійиз зибБійїз РА824 і проводять ферментацію при температурі 4320 при 70 інтенсивному перемішуванні при швидкості аерації 12л/хв. Цей штам описаний у заявці |РСТ/О5, 00/259931.

Протягом 48год. у розчин додають бл стерильного водного розчину наступного складу: глюкоза, г/л 5БО,О; сульфат кальцію, г/л 0,6; сольовий розчин мікроелементів, мл/л 6,0.

Процес ферментації лімітують по глюкозі. У процесі ферментації значення рН розчину підтримують на рівні 7,2 шляхом додання 2595 аміачного розчину або, відповідно, 2595 розчину фосфорної кислоти. Аміак одночасно служить як джерело азоту для ферментаційного процесу. Положення регулятора встановлюють таким чином, щоб концентрація розчиненого кисню підтримувалася на рівні 3095 від значення насичення. Після припинення подачі джерела вуглецю ферментацію продовжують доти, поки концентрація розчиненого кисню (рО») не досягне 9590 від значення насичення. Після цього ферментацію зупиняють і мікроорганізм знищують шляхом нагрівання. Для цього ферментаційний розчин піддають стерилізації протягом ЗОхв. Ефективність стерилізації перевіряють методом висівання на чашку.

На завершення здійснюють відокремлення клітинної маси шляхом центрифугування. Після відокремлення с 725 клітинної маси концентрація О-пантотенату складає (після 48год. ферментації) 24, 1г/л. ге)

Аналогічним чином одержують ферментаційні розчини, в яких без добавки В-аланіну концентрація пантотенової кислоти складає 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 і більше 9Ог/л. 2817мл отриманого після ферментації розчину змішують з 1183мл розчину ЮО-пантотенової кислоти з концентрацією 178,9г/л і потім нейтралізують 2595 аміачним розчином. Потім розчин фільтрують через шар піску Ф та активованого вугілля. Концентрація О-пантотенової кислоти у фільтраті складає б7г/л, причому О-пантотенова «о кислота, головним чином, представлена у вигляді солей амонію.

Приблизно 720мл цього розчину піддають електродіалітичній обробці, як описано в прикладі 1: шо 550г отриманого дилюату (із густиною 1,017г/мл) доданням 3,5г 4095 суспензії гідроксиду кальцію доводять ч- до значення рН 7,5. В результаті одержують водний розчин Ю-пантотенату кальцію (551,03г із вмістом

Зо О-пантотенату кальцію 40,9г/л). -

Отриманий водний розчин О-пантотенату кальцію висушують у лабораторному осушувачі Га. Міго міні-типу.

Температура на вході складає приблизно 2002С, температура на виході 902С. Розпилення здійснюють з використанням двокомпонентної насадки під тиском 2бар. Як порошкоутворювальний засіб додають 5ірегпаї 22Е. « 20 Отриманий порошковий продукт має наступні характеристики, мас. 90: шо с вода 2,30; 1» О-пантотенат кальцію 46,10; амоній 0,60; калій 0,47; -1 35 натрій 1,10. -І Приклад З

Ф У ферментатор об'ємом 200л, оснащений мішалкою та аератором, поміщають:

Ф 20 5095 дріжджовий екстракт, г 800; глутамат натрію, г АЗ8;

Ме) соєве борошно, г 3200; сульфату амонію, г 640;

КНоРОу, г 800;

КоНРОХ, г 1600; гФ) протиспінювальна присадка ТедоК5, мл 50.

Компоненти розчиняють у 70л води і протягом ЗОхв. стерилізують при температурі 12126.

Потім додають розчини 1 та 2. 60 Розчин 1 готують шляхом розчину у 9л води і наступної стерилізації протягом Зохв., г:

Глюкози хНг20 1670;

Сасіх2нНоьО 10,2; бе МасіохвнНоО 170,7;

Розчин 2 готують в такий спосіб: до 800мл розчину стерильно відфільтрованого цитрату заліза, г/л: цитрат натрію 200;

ГРезОдх7НгО 2; додають 8Омл мікроелементного сольового розчину (стерильно відфільтрований). Для одержання Тл мікроелементного сольового розчину додають наступні компоненти, г:

МаоМодх2 нг 0,15;

НзВОЗ 2,5О;

СоСіохбНоО 0,70; сСивОдхБНЬО 0,25;

МпсСіохаНоО 1,60; 7п8ОдхТНоО 0,30.

У цей розчин додають 2л культури для інокуляції (00-10 в середовищі ЗМУ (середовище ЗМУ: розчинити в 740мл води, г: телячий інфузійний бульйон Оіїсо 25; дріжджовий екстракт Ойсо 5; глутамат натрію 5; (МНгО25О4 2, с о стерилізувати; додати 200мл стерильного 1М розчину К»НРО, (рН 7) і бОмл стерильного 5095 розчину глюкози (кінцевий об'єм 1л)) Васіййв5 з!иБійз РАбб8 і проводять ферментацію при температурі 439С та інтенсивному перемішуванні при швидкості аерації Зм/хв. Цей штам описаний у заявці (05, 60/262,995).

Протягом 48год. у розчин додають приблизно 10л стерильного водного розчину глюкози. Цей розчинготуютьв 9) такий спосіб: 9УОкг глюкози хНоО розчиняють у 55л води і протягом ЗОхв.. стерилізують. Після цього в розчин «о додають З0Омл мікроелементного сольового розчину (склад дивися вище), а також Зл розчину цитрату заліза (склад дивися вище). Після цього в розчин додають 1л стерильно відфільтрованого розчину СаСі»х2НьЬО, що має со концентрацію ЗоОг/л і 2л стерильно відфільтрованого розчину глутамату натрію 375г/л. ча

Процес ферментації лімітують по глюкозі. У процесі ферментації значення рН розчину підтримують на рівні

Зо 7,2 шляхом додання 2595 аміачного розчину або, відповідно, 2595 розчину фосфорної кислоти. Аміак одночасно в. служить як джерело азоту для ферментаційного процесу. Положення регулятора встановлюється таким чином, щоб концентрація розчиненого кисню підтримувалася на рівні 3095 від значення насичення. Утворення піни контролюють доданням у розчин відповідної кількості протиспінювальної присадки. Після припинення подачі « джерела вуглецю ферментація продовжується доти, поки концентрація розчиненого кисню (рО»о) не досягне 9590 від значення насичення. Після цього ферментація зупиняється. Відокремлення клітинної маси здійснюють шляхом - с сепарації в сепараторі тарілчастого типу. Клітини, що залишилися у надосадовій рідині, знищують шляхом )» термічної стерилізації. Концентрація ЮО-пантотенату складає (після 48год. ферментації) 13,7г/л. Після сепарації та стерилізації концентрація О-пантотенату складає 10,7г/л. Аналогічним чином одержують ферментаційні розчини, в яких без добавки В-аланіну концентрація пантотенової кислоти складає 15, 20, 25, 30, 35,40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 і більше 9бг/л. - ЗО000г приготовленого в такий спосіб ферментаційного розчину піддають наступній обробці: до двох третин -І розчину при температурі приблизно 109 додають еквівалентну за концентрацією багатовалентних аніонів кількість хлориду кальцію (4095 розчин); до третини розчину, що залишилася, відповідну еквівалентну кількість

Фо гідроксиду кальцію (у твердому вигляді). Розчини на ніч поміщають у холодильник і потім шляхом фільтрації під б 20 тиском (фільтр 5еїйї: 700) відокремлюють від осаду, що випав. Після цього розчини змішують і доданням ще 10г гідроксиду кальцію при температурі приблизно 102С змінюють рН розчину з кислого на лужне (рН 8,7) і піддають с відстоюванню. Осад, що випав, також відфільтровують.

Потім 1800г отриманого розчину при температурі 3523 піддають знесоленню в трьохкамерній електродіалізній комірці. При цьому ферментаційний розчин пропускають через одну з двох катіонообмінних мембран, що обмежують камеру продукту. З боку катода камера продукту відокремлена від камери концентрату (Ф) моноселективною катіонообмінною мембраною (ТоКиоуата Зода, СМ5), з боку анода камера продукту

ГФ відокремлена від камери хлориду кальцію катіонообмінною мембраною (Токиоуата БЗода, СМХ). Камери концентрату і хлориду кальцію відокремлені одна від одної аніонообмінною мембраною (Токиоуата Зода, АМХ). У во камеру концентрату додають 750г 0,595 розчину хлориду натрію, а в камеру хлориду кальцію 900г 3,0595 розчину хлориду кальцію. В електродній системі циркулює 0,1М розчин сульфату натрію. Процес проводять гальваностатично при щільності струму ЗОмА/см? в комірці, що складається з п'яти вищеописаних камер загальною площею мембранної поверхні 500см2 у замкнутому об'ємі. Критерієм припинення процесу було зниження провідності в камері хлориду кальцію до 4мс/см. Результати аналізу катіонного складу розчинів у б5 камері продукту і камері концентрату наведені в табл. 2.

Баовітіво Продуттовя 09010043 007 025 005.

Бавюттв Концентет т 10000002 000 00

При цьому зниження концентрації одновалентних іонів складає 5195 для натрію, 6695 для амонію і 6195 для калію. Середній вихід по струму складає 8295. Втрати Ю-пантотенової кислоти за рахунок попадання в дві сусідні камери складають 0,089о від загальної кількості речовини. Значення рН у камері продукту в процесі діалізу складає від 7 до 7,5, у камері концентрату і хлориду кальцію - приблизно 6. Загальний спад напруги в процесі 75 діалізу зі зменшенням провідності в камері хлориду кальцію збільшувався приблизно від 11 до 168.

Розчин, який піддавали такому електродіалізу, потім піддають розпилювальному сушінню для одержання кінцевого продукту. Це свідчить про те, що при відповідній попередній обробці можна використовувати електродіаліз у трьохкамерній комірці з моноселективними катіонообмінними мембранами для обміну одновалентних іонів на двовалентні катіони, з метою підвищення ефективності розпилювального сушіння

Кінцевого продукту.

Claims (1)

1. Формула винаходу с

   1. Спосіб одержання суміші ЮО-пантотенової кислоти і її солей, який передбачає а) використання принаймні одного мікроорганізму, що продукує ЮО-пантотенову кислоту, в якому порушена іо) регуляція біосинтезу пантотенової кислоти-(рап) та/або ізолейцину/валіну-(ім) та який у процесі ферментації в культуральному середовищі продукує принаймні 2 г/л солі О-пантотенової кислоти, при цьому в культуральне середовище не додають вільний р-аланін та/або солі в-аланіну, Ге! Б) ферментаційний розчин, що містить О-пантотенат, під впливом електричного поля пропускають через одну або декілька іоноселективних мембран, в результаті чого низькомолекулярні іони видаляються з розчину, що і-й містить ЮО-пантотенат, причому вміст в ньому солі О-пантотенової кислоти у вигляді одновалентних катіонів (Те) знижують до концентрації, що менше або дорівнює 1 г/кг, с) рН розчину, що містить вільну ЮО-пантотенову кислоту, доданням кальцієвих та/або магнієвих основ - доводять до значення 3-10, при цьому одержують розчин, що містить пантотенат кальцію та/або магнію, і - а) розчин, що містить пантотенат кальцію та/або магнію, піддають сушінню та/або формуванню.

   2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що як мікроорганізми, що продукують Ю-пантотенову кислоту, використовують бактерії, дріжджі або грибки.

   З. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що як мікроорганізм використовують бактерію з родини « Васіпасеае. -

   с 4. Спосіб за одним з пп. 1-3, який відрізняється тим, що використовують бактерію з роду ВасіМшв5, таку, що переважно належить до виду В. зибіїйз, В. Іспепіїогтіз або В. ату/оїіїдОетасіепв. )» 5. Спосіб за одним з пп. 1-4, який відрізняється тим, що на стадії а) вміст О-пантотенової кислоти та/або її солей у ферментативному розчині складає принаймні 10 г/л, переважно принаймні 20 г/л, особливо переважно принаймні 40 г/л і найбільш переважно принаймні 60 г/л культурального середовища. -І 6. Спосіб за одним з пп. 1-5, який відрізняється тим, що на стадії с) рН розчину доводять до значення 5-10.

   7. Спосіб за одним з пп. 1-6, який відрізняється тим, що на стадії с) рН розчину доводять до значення 5-9, 7 переважно 6-9 і особливо переважно 6-8. Ге») 8. Спосіб за одним з пп. 1-7, який відрізняється тим, що на стадії Б) використовують монополярні та/або біполярні іонообмінні мембрани.

   б 9. Спосіб за одним з пп. 1-8, який відрізняється тим, що на стадії Б) використовують монополярні іонообмінні Ге) мембрани.

   10. Спосіб за одним з пп. 1-9, який відрізняється тим, що на стадії Б) використовують моноселективні іонообмінні мембрани.

   11. Спосіб за одним з пп. 1-10, який відрізняється тим, що значення рН ферментаційного розчину, що містить О-пантотенову кислоту, перед обробкою на стадії 5) доводять до ізоелектричного значення рН ЮО-пантотенової о кислоти. ко 12. Спосіб за одним з пп. 1-11, який відрізняється тим, що на стадії б) густина струму через монополярні іонообмінні мембрани складає 1-100 мА/см2, переважно 10-80 мА/см? і особливо переважно 20-40 мА/см7. 60 13. Спосіб за одним з пп. 1-12, який відрізняється тим, що на стадії Б) густина струму Через біполярні іонообмінні мембрани складає 1-150 мА/см2, переважно 30-100 мА/см? і особливо переважно 70-90 мА/см?.

   14. Спосіб за одним з пп. 1-13, який відрізняється тим, що на стадії Б) вміст у розчині іонів амонію, калію та/або натрію знижують до концентрації, що менше або дорівнює 1 г/кг.

   15. Спосіб за одним з пп. 1-14, який відрізняється тим, що на стадії с) для нейтралізації в розчин додають 65 гідроксид кальцію, карбонат кальцію, оксид кальцію, гідроксид магнію та/або основний карбонат магнію у вигляді твердої речовини та/або у вигляді водної суспензії.

   16. Спосіб за одним з пп. 1-15, який відрізняється тим, що в розчин на стадії с) додають водну суспензію, що містить 2-55 мас. 95, переважно 10-50 мас. 95 і особливо переважно 20-40 мас. 95 гідроксиду кальцію.

   17. Спосіб за одним з пп. 1-16, який відрізняється тим, що в розчин на стадії с) додають водну суспензію, що містить 2-65 мас. 95, переважно 10-50 мас. 95 і особливо переважно 20-40 мас. 95 карбонату кальцію.

   18. Спосіб за одним з пп. 1-17, який відрізняється тим, що в розчин на стадії с) додають водну суспензію, що містить 2-60 мас. 95, переважно 10-50 мас. 905 і особливо переважно 20-40 мас. 95 гідроксиду магнію.

   19. Спосіб за одним з пп. 1-18, який відрізняється тим, що в розчин на стадії с) додають водну суспензію, що містить 2-25 мас. 956, переважно 10-20 мас. 9Уо основного карбонату магнію. 70 20. Спосіб за одним з пп. 1-19, який відрізняється тим, що на стадії с) або а) одержують або додають суспензію, що містить пантотенат кальцію та/або магнію.

   21. Спосіб за одним з пп. 1-20, який відрізняється тим, що одержують суміш, що містить солі О-пантотенової кислоти у вигляді двовалентних катіонів, переважно О-пантотенат кальцію і/або магнію.

   22. Спосіб за одним з пп. 1-21, який відрізняється тим, що одержують суміш, що містить солі О-пантотенової /5 Кислоти в концентрації принаймні 1-100 мас. 956, переважно принаймні 20-100 мас. 95 і особливо переважно принаймні 50 мас. 95.

   23. Склад, що одержується способом за одним з пп. 1-22, як добавка і/або доповнення до корму тварин. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних 2о Мікросхем", 2007, М 1, 15.01.2007. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. се (о) Ге) (Се) (Се) ча - З с 1» -І -І (е)) б 50 (Че) (Ф) ко бо б5