RU2296560C2 - Суппозитории для иммунопрофилактики вирусных инфекций - Google Patents
Суппозитории для иммунопрофилактики вирусных инфекций Download PDFInfo
- Publication number
- RU2296560C2 RU2296560C2 RU2004126059/15A RU2004126059A RU2296560C2 RU 2296560 C2 RU2296560 C2 RU 2296560C2 RU 2004126059/15 A RU2004126059/15 A RU 2004126059/15A RU 2004126059 A RU2004126059 A RU 2004126059A RU 2296560 C2 RU2296560 C2 RU 2296560C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- salmonella
- suppository
- suppositories
- recombinant
- Prior art date
Links
- 239000000829 suppository Substances 0.000 title claims abstract description 76
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 title claims abstract description 12
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims abstract description 41
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 34
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims abstract description 28
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000008162 cooking oil Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 19
- FGRBYDKOBBBPOI-UHFFFAOYSA-N 10,10-dioxo-2-[4-(N-phenylanilino)phenyl]thioxanthen-9-one Chemical compound O=C1c2ccccc2S(=O)(=O)c2ccc(cc12)-c1ccc(cc1)N(c1ccccc1)c1ccccc1 FGRBYDKOBBBPOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 9
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 5
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 claims description 4
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 claims description 4
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 claims description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 2
- 244000299461 Theobroma cacao Species 0.000 claims 1
- 235000005764 Theobroma cacao ssp. cacao Nutrition 0.000 claims 1
- 235000005767 Theobroma cacao ssp. sphaerocarpum Nutrition 0.000 claims 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 claims 1
- 235000001046 cacaotero Nutrition 0.000 claims 1
- 235000014541 cooking fats Nutrition 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 abstract description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 abstract 1
- 235000009470 Theobroma cacao Nutrition 0.000 abstract 1
- 244000240602 cacao Species 0.000 abstract 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 62
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 47
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 26
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 24
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 22
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 20
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 19
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 16
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 15
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 14
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 9
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 8
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 7
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 7
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 241000702625 Mink enteritis virus Species 0.000 description 6
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 5
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 5
- 229940033330 HIV vaccine Drugs 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 3
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 3
- 235000000891 standard diet Nutrition 0.000 description 3
- TVEXGJYMHHTVKP-UHFFFAOYSA-N 6-oxabicyclo[3.2.1]oct-3-en-7-one Chemical compound C1C2C(=O)OC1C=CC2 TVEXGJYMHHTVKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 2
- 229940095399 enema Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000004306 orthophenyl phenol Substances 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 208000036649 Dysbacteriosis Diseases 0.000 description 1
- 208000027244 Dysbiosis Diseases 0.000 description 1
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241000588772 Morganella morganii Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- JVZLSYQQOQEQOO-UHFFFAOYSA-N P(=O)(O)(O)O.NNC1=CC=C(C2=CC=C(NN)C=C2)C=C1 Chemical compound P(=O)(O)(O)O.NNC1=CC=C(C2=CC=C(NN)C=C2)C=C1 JVZLSYQQOQEQOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229940124857 Salmonella typhi vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000019802 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Natural products NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 108010030694 avidin-horseradish peroxidase complex Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000007140 dysbiosis Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 238000012768 mass vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 108010089520 pol Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000006215 rectal suppository Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и медицине, а именно к созданию живых вакцин для ректального введения против вирусных инфекций на основе аттенуированных рекомбинантных штаммов сальмонелл, несущих протективные вирусные антигены. Суппозитории для иммунопрофилактики вирусных инфекций содержат компоненты в следующем соотношении на одну свечу массой 2,0 г, мас.%: суспензия клеток рекомбинантных аттенуированных штаммов Salmonella, трансформированных pGEX-2T-TBI, pcDNA-TCI или рКНВс, несущих гены протективных вирусных антигенов, и вмешанных в суппозиторную основу в количестве 106-109 живых клеток - 1%; жировая основа - 94% и эмульгатор Т-2 - 5%. При этом в качестве жировой основы может быть использован твердый кулинарный жир (94%), или гидролизованное хлопковое масло (94%) или смесь кулинарного жира "Фритюрный" (60%), масла какао (24%) и твердого парафина (10%). Применение суппозиториев позволяет индуцировать специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ к соответствующему вирусному антигену. 3 з.п. ф-лы, 8 табл., 3 ил.
Description
Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и медицине, конкретно к созданию методами генной инженерии живых вакцин против вирусных инфекций на основе аттенуированных рекомбинантных штаммов сальмонелл, несущих протективные вирусные антигены, в виде суппозиториев.
В настоящее время в мире происходит стремительное распространение ряда вирусных инфекций, перерастающих в эпидемии; это - СПИД, вызываемый вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), гепатит В, гепатит С и др. Все эти патогены высоко контагиозны, вирулентны и обладают антигенной изменчивостью.
Так как в арсенале медицины на сегодняшний день не имеется достаточно эффективных способов лечения такого рода вирусных инфекционных заболеваний, единственной мерой предотвращения развития инфекций является массовая вакцинация населения.
Главный недостаток существующих вакцин заключается в том, что они способны индуцировать только системный иммунитет. Очевидно, что эффективная противовирусная вакцина должна обеспечивать как системный, так и местный иммунитет слизистой, в области "входных ворот" инфекции.
Среди новых перспективных разработок вирусных вакцин в последнее время предпочтение отдается созданию мукозальных вакцин, т.е. препаратов, вводимых на слизистые оболочки. Такие вакцины имеют ряд преимуществ: введение без шприца, например перорально или интранозально; обеспечивается индукция не только системного, но и местного иммунитета, что крайне важно для заболеваний, передающихся половым путем. Главные проблемы создания мукозальных вакцин на основе инактивированных антигенов связаны с тем, что отдельные вирусные белки плохо проникают в клетки слизистой оболочки или деградируют в желудке или кишечнике.
Одним из наиболее перспективных векторов доставки мукозальных вакцин являются не патогенные для человека аттенуированные штаммы сальмонелл [1, 2].
Интерес к живым клеткам сальмонелл как к носителю иммуногенных эпитопов инфекционных агентов обусловлен тем, что аттенуированные штаммы этой бактерии способны инвазировать слизистую и некоторое время жить в клетках лимфоидной ткани организма млекопитающих. Клетка-вектор, являясь естественным депо и адъювантом для антигена, представляет его в максимально иммуногенной форме, увеличивает время персистенции и способствует накоплению антигена в иммунокомпетентных клетках.
Известен ряд работ, в которых показано, что рекомбинантные аттенуированные сальмонеллы, продуцирующие антигены ВИЧ, индуцируют высокий системный (гуморальный и клеточный) иммунитет и секреторный иммунитет. Примером могут служить рекомбинантные аттенуированные штаммы Salmonella enteritidis Е-23 ВМС120 [3] и Salmonella typhimurium Т-10 ВМС 160 [4], первый из которых обеспечивает синтез белка gp 120 ВИЧ в клетках млекопитающих, а второй - другого белка-иммуногена ВИЧ - gp 160. Известна живая вакцина против ВИЧ на основе аттенуированного штамма Salmonella typhimurium SL-3261 для перорального введения, которая в качестве иммуногенов несет белок обратной транскриптазы и трансактивирующий белок ВИЧ [5]. В описанных работах в качестве антигена используется лишь один или два из фрагментов белков gp 120 или gp 160 или pol, что явно недостаточно для создания эффективной вакцины, поскольку считается, что эффективная вакцина против ВИЧ должна включать эпитопы не только из белка env, но также gag и pol [6].
Известен рекомбинантный аттенуированный штамм бактерий Salmonella enteritidis E-23/pGEX-2T-TBI, способный продуцировать искусственный белок TBI, содержащий девять Т- и В- клеточных эпитопов ВИЧ, в клетках млекопитающих [7]. Известен также рекомбинантный аттенуированный штамм бактерий Salmonella typhimurium SL 7202 pGEX-TBI, способный продуцировать искусственный белок TBI [8].
Известен рекомбинантный аттенуированный штамм бактерий Salmonella enteritidis E-23/pcDNA-TCI [9], способный продуцировать искусственный белок TCI, содержащий множественные (более восьмидесяти) цитотоксические Т-клеточные эпитопы ВИЧ-1, в клетках млекопитающих.
Все описанные штаммы при введении животным индуцируют выраженный специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ к ВИЧ и могут быть использованы для конструирования живой ДНК-вакцины против ВИЧ.
Активно идет разработка подходов к созданию живых вакцин и против гепатита В на основе аттенуированных штаммов сальмонелл. В настоящее время проходит клинические испытания вакцина на основе рекомбинантной сальмонеллы, продуцирующей HBcAg-preS2 [10]. Однако, при иммунизации добровольцев данным рекомбинантным штаммом сальмонеллы, ответ на preS2 был отмечен только у одного из 13 испытуемых. Одной из причин такого слабого иммунного ответа является тот факт, что рreS2-область является минорной антигенной детерминантой, тогда как главный нейтрализующий эпитоп содержится в HBsAg.
Известны кандидатные вакцинные штаммы бактерий, сконструированые путем введения плазмид, кодирующих антигены вируса гепатита В HbsAg и HbcAg в виде химерных белков, в реципиентные аттенуированные штаммы Salmonella typhimurium Т-10 и Salmonella typhimurium SL 7207 [11, 12]. При иммунизации мышей полученными конструкциями перорально и перректально (водной суспензией клеток рекомбинантных штаммов в виде клизмы) обнаружены специфические анти- HbsAg и анти-HbcAg IgG в сыворотке крови животных и специфические анти-вирусные IgA в слизистой кишечника, а также показано формирование Т-клеточного ответа на антигены вируса гепатита В.
Известно, что из водных растворов, введенных в прямую кишку в виде клизмы, лекарственные вещества всасываются очень быстро. Однако часть из них выводится обратно вместе с раствором, поэтому общее количество всосавшегося из лекарства вещества невелико. Эффективность всасывания лекарства значительно возрастает при использовании суппозиторной формы. Кроме того, используя суппозиторные формы лекарственных препаратов можно обеспечить быструю и массированную или постепенную доставку лекарственного вещества в кровоток [13].
Преимущество мукозальных вакцин в виде суппозиториев заключается в том, что они могут обеспечивать безболезненность, простоту введения и способствовать белее стабильной и длительной индукции местного иммунитета, поскольку, размножаясь в организме хозяина, вакцинный штамм стимулирует длительную выработку антител с развитием резистентности у входных ворот инфекции. Кроме того, при данном подходе не требуется дорогостоящая стадия очистки антигена.
В связи с вышеизложенным представляется целесообразным разработать подходы к созданию вакцин против вирусных инфекционных агентов на основе живых клеток рекомбинантных аттенуированных сальмонелл в виде суппозиториев.
Имеются сведения о разработках вакцинных препаратов в виде суппозиториев на основе инактивированных микроорганизмов. Такого рода вакцина против урогенитальных инфекций, состоящая из инактивированных бактерий, которые происходят из культур штаммов уропатогенных бактерий видов Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Proteus morganii и Streptococcus faecalis, и полиэтиленгликолевой основы суппозитория, описана в патенте РФ №2224542, выданном американской фирме Протеин Экспресс [14]. При этом суппозиторная форма вакцин способствует равномерному распределению клеток микроорганизмов в лекарственной форме и обеспечивает стабильность активной субстанции в течение длительного времени.
В медицинской практике созданы и используются суппозитории, содержащие живые микроорганизмы. Это суппозитории, содержащие микроорганизмы нормофлоры человека, которые применяются при лечении дисбактериозов, воспалительных процессов дистальных отделов кишечника и полости влагалища [15, 16, 17]. Препараты суппозиториев содержат микробную массу живых бифидобактерий или лактобактерий в количестве 103-108 клеток на одну дозу [17] либо сухую лиофилизованную биомассу микроорганизмов [16] и фармацевтически приемлемые добавки. В России производятся свечи Ацилакт, Бифидин, Лактобактерин (производство ОАО "Биохиммаш"), которые представляют собой микробную массу живых микроорганизмов, высушенную в среде культивирования с добавлением сахарозо-желатино-молочной среды и сформированную в медицинские суппозитории.
Однако в литературе не описаны препараты суппозиториев, содержащие живые клетки рекомбинантных микроорганизмов, несущих протективные вирусные антигены, предназначенные для вакцинопрофилактики вирусных инфекций.
Технической задачей изобретения является разработка эффективного препарата для иммунопрофилактики вирусных инфекций (противовирусных вакцин) на основе живых рекомбинантных штаммов Salmonella в виде суппозитория.
Поставленная задача решается путем разработки технологии получения и состава суппозиториев для ректального введения, содержащих аттенуированную живую культуру клеток рекомбинантных штаммов сальмонелл, несущих гены протективных вирусных антигенов, вмешанных в суппозиторную основу.
Ректальный путь открывает возможность введения в организм лекарственных веществ, разрушающихся в желудке или кишечнике. А для аттенуированных сальмонелл физиологичной является среда с рН 6,8-7,2, таким образом, среда прямой кишки в минимальной степени будет влиять на проявление биологической активности вакцинного штамма.
Для решения поставленной задачи изучена динамика накопления биомасс сальмонелл, несущих протективные антигены ВИЧ и гепатита В, - Salmonella enteritidis E-23/ pGEX-2Т-TBI, Salmonella enteritidis E-23/pcDNA-TCI, Salmonella typhimurium T-10/pKHBc в процессе ферментации. Показано, что активное деление клеток продолжается до ОП=2,0. При этом плазмиды стабильно сохраняются в штаммах. После культивирования титр клеток сальмонелл в культуральной жидкости должен быть не ниже 106.
В процессе изготовления ДНК-вакцины в виде суппозиториев, содержащих живые клетки рекомбинантных штаммов сальмонелл, изучено влияние основы и температуры введения нативной биомассы в суппозиторную основу на жизнеспособность клеток. Показано, что вид основы и природа вспомогательных веществ оказывает существенное влияние на жизнеспособность клеток суппозиториев. Из данных, приведенных в Таблице 1, видно, что наилучшую жизнеспособность клеток обеспечивает использование гидрофобных (жировых) основ. В основе гидрофильного типа отсутствуют жизнеспособные клетки. Основы №2 и №6 обладают плохой текучестью. Введение в основу в качестве вспомогательного вещества Твина-80 действует губительно на жизнеспособность клеток сальмонелл в суппозиториях. При изготовлении суппозиториев наблюдается отсутствие жизнеспособных клеток при введении клеток в суппозиторную основу при температуре 50°С. Сохраняется же жизнеспособность при внесении клеток в основу при температуре до 45°С.
В одной дозе препарата (одной суппозитории массой 2 г) содержится 1·106-1·109 живых клеток Salmonella enteritidis E-23/pGEX-2T-TBI или Salmonella enteritidis Е-23/рсВМА-ТС1 или Salmonella typhimurium Т-10/HBc.
Согласно проведенным исследованиям суппозитории готовят на жировой основе, например с использованием кулинарного жира "Фритюрный" или гидролизованного хлопкового масла (ГХМ), или смеси твердого кулинарного жира, масла какао с добавлением твердого нефтяного парафина и эмульгатора Т-2 путем выливания в суппозиторные формы расплавленной массы, содержащей культуры клеток сальмонелл. Оптимальной температурой введения биомассы в суппозиторную основу является температура 39 - 45°С.
Суппозитории для иммунопрофилактики вирусных инфекций содержат компоненты в следующем соотношении на одну свечу массой 2 г, мас.%:
суспензию клеток рекомбинантного аттенуированного штамма Salmonella, несущего гены протективного вирусного антигена, в количестве 106-109 живых клеток - 1%; жировую основу - 94% и эмульгатор Т-2 - 5%. При этом в качестве жировой основы может быть использован твердый кулинарный жир (94%), или гидролизованное хлопковое масло (94%), или смесь кулинарного жира "Фритюрный" (60%), масла какао (24%) и твердого нефтяного парафина (10%).
В процессе изготовления вакцины в виде суппозиториев, содержащих клетки рекомбинантных сальмонелл, возникает проблема хранения в течение длительного времени, стандартизации и стабильности биомассы. Необходимым условием является то, что клетки рекомбинантной сальмонеллы должны быть в состоянии активного деления, т.е. в фазе логарифмического роста. Решением этой проблемы является лиофилизация биомассы.
На жизнеспособность микроорганизмов в процессе лиофилизации оказывает существенное влияние состав защитной среды. В экспериментах использовались следующие защитные среды: сахарозо-желатиновая (СЖ), молочно-глюкозная (МГ), сахарозно-желатиновая с тиомочевиной (СЖТ). Образцы биомассы рекомбинантных штаммов Salmonella, лиофилизованные с различными защитными средами, охарактеризованы по жизнеспособности и стабильности. Данные приведены в Таблице 2.
| Таблица 2 | ||||||
| Жизнеспособность и стабильность биомассы рекомбинантных штаммов Salmonella, лиофилизованной с различными защитными средами | ||||||
| Наименование биомассы. Защитные среды. | 1 месяц | 3 месяца | 6 месяцев | |||
| Жизнеспособность | Стабильность | Жизнеспособность | Стабильность | Жизнеспособность | Стабильность | |
| Sal.ent. E23 DNA-TCI Среда СЖ | 4,0·109 | 100% | 2,1·109 | 100% | 2,0·108 | 100% |
| Sal.ent. E23 DNA-TCI Среда МГ | 4,0·109 | 100% | 3,3·108 | 100% | 2,7·108 | 100% |
| Sal.ent. E23 DNA-TCI Среда СЖТ | 1,8·109 | 100% | 6,0·108 | 100% | 5,8·108 | 100% |
| Sal.ent. E23 рКНВс Среда СЖ | 4,3·109 | 100% | 4,7·109 | 100% | 4,0·109 | 100% |
| Sal.ent. E23 рКНВс Среда МГ | 5,3·109 | 100% | 4,8·109 | 100% | 3,5·109 | 100% |
| Sal.ent. E23 рКНВс Среда СЖТ | 4,0·109 | 100% | 3,5·109 | 100% | 7,8·108 | 100% |
Приведенные в Таблице 2 данные показывают, что лиофилизованная биомасса рекомбинантных сальмонелл хранится без потери клетками жизнеспособности и стабильности в течение 6 месяцев, однако при процессе лиофилизации предпочтительнее использовать среды СЖ или МГ.
Более того, показано, что суппозитории, изготовленные с использованием лиофилизованной биомассы, могут храниться в течение 6 месяцев при t 4-8 С°, при этом клетки не теряют жизнеспособности и стабильности штамма (см. Таблицу 3).
| Таблица 3 | ||||||
| Изучение стабильности и жизнеспособности лиофилизованных клеток рекомбинантных штаммов Salmonella в суппозиториях | ||||||
| Наименование биомассы. Защитные среды. | 1 месяц | 3 месяца | 6 месяцев | |||
| Жизнеспособность | Стабильность | Жизнеспособность | Стабильность | Жизнеспособность | Стабильность | |
| Sal.ent. E23 DNA-TCI Среда МГ | 8,0·106 | 100% | 1,0·106 | 100% | 1,2·106 | 100% |
| Sal.ent. E23 рКНВс Среда МГ | 3,5·108 | 100% | 2,7·107 | 100% | 1,5·107 | 100% |
В ходе доклинических исследований на мышах и морских свинках показано формирование иммунитета против заражения ВИЧ и гепатита В путем образования в организме животных специфических антител и формирования клона клеток памяти. Максимальное увеличение титра антител достигается на 28 сутки и сохраняется в течение недели при однократной иммунизации. При двукратной иммунизации, проведенной на 28 сутки после первой, максимальный титр антител регистрируется на 42-56 сутки. В проведенных доклинических испытаниях, выполненных в соответствии с Правилами проведения государственных испытаний и регистрации новых медицинских иммунобиологических препаратов (СП 3.3.2.561-96), показано отсутствие выраженных отклонений в состоянии жизненно важных органов, гематологических, морфологических показателях, отсутствие аллергизирующей активности, что свидетельствует о безвредности и хорошей переносимости вакцин.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими изображениями.
Фиг.1. Анализ системного гуморального ответа к очищенному вирусу ВИЧ-1 сывороток мышей, иммунизированных штаммом Salmonella enteritidis E-23/pcDNA-TCI по данным ИФА.
Фиг.2. Анализ системного гуморального ответа к очищенному белку TCI сывороток мышей, иммунизированных штаммом Salmonella enteritidis E-23/pcDNA-TCI по данным ИФА.
Фиг.3 Иммуноферментный анализ к HBcAg сывороток мышей, иммунизированных суппозиториями, содержащими Salmonella typhimurium T10 рКНВс.
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.
Пример 1. Культивирование рекомбинантных штаммов сальмонелл. Культивирование рекомбинантных штаммов Salmonella enteritidis E-23/pGEX-2T-TBI или Salmonella enteritidis E-23/pcDNA-TCI или Salmonella typhimurium T-10/pKHBc проводят на среде ЕВ с ампициллином. Перед культивированием проводят трансформацию клеток сальмонелл путем электропорации. Для этого "ночную" культуру Salmonella enteritidis E-23 или Salmonella typhimurium T-10 разводят в соотношении 1: 100 L-бульоном и подращивают в среде LB без ампициллина на качалке при температуре (37±2)°С до оптической плотности Д550=0,2. Клеточную суспензию охлаждают во льду 20 мин и центрифугируют 2 мин при 6000 об/мин. После отмывки водой осадок клеток ресуспендируют в 40 мкл 10%-го раствора глицерина, вносят 1 мкл плазмидной ДНК pGEX-2T-TBI или pcDNA-TCI или рКНВс, инкубируют во льду 2 мин и проводят электрополяцию с использованием прибора "ЭкюБио" ЛТД. Время импульса 4 сек, напряжение 2500 В. После электрополяции в эту же кювету добавляют 300 мкл L-бульона и инкубируют 1 ч при температуре (37±2)°С. Полученные трансформанты высевают на плотную среду L- агар с ампициллином и выращивают в течение суток при температуре (37±2)°С. После проверки на наличие плазмиды проведенные клоны штамма-продуцента культивируют на среде LB с ампициллином на термостатированной качалке при температуре (37±2)°С с частотой вращения 200 об/мин. Выращивание продолжается 3-4 ч до достижения оптической плотности Д550=2,0. После культивирования в культуральной жидкости определяют титр клеток, который не должен быть ниже 106. Центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин отделяют биомассу клеток рекомбинантных сальмонелл, которую используют для приготовления суппозиториев.
Пример 2. Приготовление суппозитория Сал-ВИЧ "Б", содержащего живые клетки аттенуированного рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E-23/pGEX-2T-TBI.
Компоненты основы суппозитория в виде навесок (кулинарный жир "Фритюрный" - 300,0±1,0 г, эмульгатор Т2 - 25,0±0,1 г, масло какао - 120,0±0,1 г и парафин - 50,0±0,1 г) количественно переносят в стакан вместимостью 1 л, который помещают на водяную баню, нагретую до 75°С, и выдерживают до полного расплавления смеси. Стакан с расплавленной основой помещают в смеситель-гомогенизатор и перемешивают при 200 об/мин до получения однородной массы. Основу охлаждают при постоянном перемешивании до температуры (39±1)°С. Биомассу клеток Salmonella enteritidis E-23/pGEX-2T-TBI соединяют с 5 мл стерильной очищенной воды и ресуспендируют до получения однородной суспензии, которую вводят в охлажденную суппозиторную основу, тщательно перемешивая до получения однородной массы. Суппозиторную массу выливают в подготовленные формы и охлаждают при температуре минус (15±2)°С в течение 60 мин.
Пример 3. Приготовление суппозитория Сал-ВИЧ "Д", содержащего живые клетки аттенуированного рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E-23/pcDNA-TCI.
Компоненты основы суппозитория в виде навесок (твердый кулинарный жир - 470,0±1,0 г и эмульгатор Т2 - 25,0±0,1 г) количественно переносят в стакан вместимостью 1 л, который помещают на водяную баню, нагретую до 55°С, и выдерживают до полного расплавления смеси. Стакан с расплавленной основой помещают в смеситель-гомогенизатор и перемешивают при 200 об/мин до получения однородной массы. Основу охлаждают при постоянном перемешивании до температуры (39±1)°С. Биомассу клеток Salmonella enteritidis Е-23/pcDNA-TCI соединяют с 5 мл стерильной очищенной воды и ресуспендируют до получения однородной суспензии, которую вводят в охлажденную суппозиторную основу, тщательно перемешивая до получения однородной массы. Суппозиторную массу выливают в подготовленные формы и охлаждают при температуре минус (15±2)°С в течение 60 мин.
Пример 4. Определение жизнеспособных клеток в суппозиториях.
Одну суппозиторию весом 2,0 г, содержащую клетки аттенуированного штамма Salmonella enteritidis Е-23 со встроенной плазмидой pcDNA-TCI или pGEX-2T-TB, размягчают при 37°С в фосфатном буфере до однородного состояния и готовят 10-ти кратные разведения суспензии. Из растворов 6-го, 7-го и 8-го разведении делают высевы по 100 мкл на чашках Петри с L-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина, и термостатируют сутки при 37°С. По истечении времени проводят визуально подсчет количества колоний на чашках. Количество жизнеспособных колоний рекомбинантных сальмонелл в суппозитории (X) находят по формуле:
где: X - количество жизнеспособных колоний;
N - количество колоний;
10p - номер разведения;
Vp - объем высеваемого разведения, мкл; (100 мкл).
Количество жизнеспособных колоний в суппозитории после подсчета составляет от 106 до 109.
Пример 5. Определение токсичности препаратов суппозиториев.
Суппозитории весом 100 мг, содержащие от 106 до 109 клеток Salmonella enteritidis Е-23/pGEX-2T-TBI или Salmonella enteritidis Е-23/pcDNA-TCI вводят не менее чем 5 морским свинкам (весом 250-350 г), однократно в прямую кишку на глубину 0,5-1 см и фиксируют в течение 2-3 мин. В течение первых суток и на протяжении 7 суток после введения суппозиториев проводят ежедневное визуальное обследование животных, оценивая их внешний вид, подвижность, измеряют массу тела. В течение всего периода наблюдения ни одно животное не погибло, визуально регистрируемых признаков интоксикации и снижения массы тела животных не наблюдалось. Таким образом, предложенный препарат не токсичен и безвреден.
Пример 6. Определение специфической активности суппозиториев, содержащих Salmonella enteritidis E-23/pcDNA-TCI
Иммунизация. Для иммунизации используют мышей линии BALB/c, весом 12-15 грамм, которые были получены из вивария ГНЦ ВБ "Вектор". Животные содержались на стандартном рационе.
Иммунизацию животных суппозиториями проводят однократно, перректально (один суппозиторий содержит 108 клеток S. enteritidis E-23/pcDNA-TCI). Забор крови производят на 0, 7, 14, 21, 28, 35 сутки после введения сальмонелл.
Иммуноферментный анализ. Специфичность образующихся антител в сыворотках мышей анализируют с помощью ИФА. Для выявления антител против ВИЧ-1 используют очищенный инактивированный вирус ВИЧ-1 и очищенный белок TCI. В каждом эксперименте берут образцы крови от трех животных. После получения сыворотки образцы смешивают, после чего определяют титр специфических антител. Титр определяют как превышение титра сывороток мышей, иммунизированных суппозиториями, содержащими S. enteritidis E-23/pcDNA-TCI над титром сывороток мышей, иммунизированных суппозиториями с исходным штаммом S.enteritidis E-23. На каждую точку делают два повтора. Результаты представлены на фиг.1, 2. Начиная с третьей недели после иммунизации мышей суппозиториями S. enteritidis E-23/pcDNA-TCI обнаруживается продукция IgG к ВИЧ-1, причем продукция антител остается на высоком уровне на протяжении всего срока наблюдения.
Определение количества CTL лимфоцитов на основе реакции ELISPOT
При постановке реакции ELISPOT на первом этапе проводят сорбцию анти-INF-γ MAT с концентрацией 5 мкг/мл на лунку 96-луночного планшета ImmunoSpot M200. После инкубации в течение 12 ч при 4°С каждую лунку дважды промывают раствором PBS и блокируют средой RPMI 1640, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку, в течение 2 ч. В качестве клеток-эффекторов используют спленоциты иммунизированных животных в концентрации 106 мл. Для стимуляции продукции INF-γ суспензией клеток используют белок TCI (1 мкг/мл) и два пептида: N15 (DRVIEVVQGAYRAIR), N16 (KQIINMWQEVGKAMYA), для оценки неспецифической продукции используют пептид ЕНЕС (отрицательный контроль). Клетки культивируют в присутствии 5% СО2 при 37°С в течение 24 ч. INF-γ-секретирующие клетки визуализируют, используя 0,5 мкг/мл биотинилированнных анти- INF-γ антитела и 0,25 мкг/мл конъюгата Avidin-HRP. Окрашивание производят добавлением субстратов для пероксидазы (4-хлор-1-нафтол, диаминобензидин фосфат). Реакцию останавливают удалением реагентов, лунки промывают 3 раза дистиллированной водой. Подсчет количества INF-γ-продуцирующих клеток осуществляют с помощью микроскопа. Результаты экспериментов сведены в Таблицу 4.
| Таблица 4 Результаты оценки цитотоксических Т-лимфоцитов животных, иммунизированных суппозиториями, содержащими S. enteritidis E-23/pcDNA-TCI в ELISPOT |
||||
| Антиген | Срок от начала иммунизации (сут) / количество INF-гамма-продуцирующих клеток | |||
| 7 | 10 | 14 | 21 | |
| TCI | 120 | 230 | 150 | 143 |
| Р15 | 110 | 220 | 128 | 125 |
| Р16 | 107 | 217 | 129 | 127 |
| ЕНЕС | 10 | 7 | 5 | 4 |
Пример 7. Оценка вируснейтрализующей активности сывороток.
Вируснейтрализующую активность сывороток определяют методом учета ингибирования репродукции вируса ВИЧ-1 по снижению его инфекционного титра. Для этого используют перевиваемые лимфобластоидные клетки человека МТ-4. Клетки культивируют в концентрации 3,0-5,0×105 клеток в 1 мл среды RPMI 1640 с 10% сыворотки эмбрионов коров, 100 мкг/мл гентамицина. В реакции вируснейтрализации используют штамм ВИЧ-1899A (тип Х4, субтип В), полученный из коллекции штаммов вирусов иммунодефицита человека НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Множественность заражения составляет 100 ТЦД50. Сыворотки инактивируют на водяной бане при температуре 56°С в течение 30 мин. В лунки пластиковой 96-луночной панели («Costar», США) вносят по 50 мкл следующих разведении сывороток: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280, т.д. и добавляют 50 мкл суспензии вируса. Смесь инкубируют в течении 1 ч при 37°С. После инкубации вносят по 100 мкл взвеси чувствительных клеток МТ-4 в количестве 90-100×103 кл/лунку.
Панель инкубируют при 37°С в атмосфере с 5% СО2 и 98% влажности в течение 5-7 суток до момента учета результатов. В качестве контролей используют: «контроль вируса» - вирус с добавлением среды без сыворотки, «контроль клеток» - клетки в питательной среде, «контроль цитотоксичности сывороток» - клетки + сыворотки. Учет результатов проводят на 5-7 день после начала эксперимента. Ингибирование репродукции вируса оценивают по снижению его инфекционного титра, который определяют по ТЦД50 (50% тканевая цитопатическая доза). Данные по определению нейтрализующих титров антител в сыворотках крови иммунных животных сведены в Таблицу 5.
| Таблица 5 Нейтрализующая активность сывороток |
||||
| Срок от начала иммунизации (сут) и | ||||
| группы животных | Титры нейтрализующих антител | |||
| 0 | 7 | 14 | 21 | |
| Сыворотка мышей, иммунизированных | 0 | 1:20 | 1:80 | 1:640 |
| суппозиториями S. Enteritidis E-231 | ||||
| pcDNA-TCI | ||||
| Сыворотка мышей, иммунизированных | 0 | 0 | 0 | 0 |
| суппозиториями S. Enteritidis E-23 | ||||
Данные, представленные в Таблице 5, свидетельствуют о том, что образующиеся после введения суппозиториев S. enteritidis E-231 pcDNA-TCI антитела обладают вируснейтрализующей активностью.
Таким образом, суппозитории, содержащие Salmonella enteritidis E-23/pcDNA-TCI при введении животным индуцирует выраженный специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ к ВИЧ-1. Предложенные суппозитории могут быть использованы в качестве живой ДНК- вакцины против ВИЧ-1.
Пример 8. Определение специфической активности суппозиториев, содержащих Salmonella typhimurium T10 рКНВс.
Иммунизация. Для иммунизации используют мышей линии BALB/c, весом 12-15 грамм, полученных из вивария ГНЦ ВБ "Вектор". Животные содержались на стандартном рационе.
Иммунизацию мышей проводят введением суппозиториев перректально, двукратно с интервалом 3 недели. Доза S. typhimurium Т10 рКНВс составляет 107 клеток на суппозиторий. Забор крови производят через 14, 21, 28, 36 и 44 дней после первого введения сальмонелл.
Иммуноферментный анализ. Специфичность образующихся антител в сыворотках мышей анализируют с помощью ИФА. Для выявления антител против HBcAg используют очищенный рекомбинантный HBcAg. В каждом эксперименте берут образцы от трех животных. Эти образцы смешивают, после чего определяют титр специфических антител. Титр определяют как превышение титра сывороток мышей, иммунизированных суппозиториями, содержащими Salmonella typhimurium T10 рКНВс, над титром сывороток мышей, иммунизированных суппозитории с исходным штаммом Salmonella typhimurium T10. На каждую точку делают два повтора. Результаты представлены на фиг.3.
Реакция бласттрансформации. Реакцию бласттрансформации спленоцитов проводят через 81 день после первого введения сальмонелл по ранее описанной методике [18]. В качестве специфического антигена используют HBcAg, в качестве неспецифического антигена - вирус энтерита норки. В лунку планшета вносят по 100 мкл каждого компонента. Концентрация антигенов равна 2 мкг/мл. В качестве митогена используют конканавалин А (производства "Sigma", США) в концентрации 5 мкг/мл. Клетки, стимулированные антигенами, инкубируют в течение 78 ч. За 18 ч до окончания срока инкубации вносят 3H-тимидин (Санкт-Петербург) в дозе 2 мкКи на лунку. Клеточный ответ оценивают по показателю индекса стимуляции, который характеризует отношение пролиферации спленоцитов, индуцированных специфическими антигенами к спонтанной пролиферации спленоцитов (Таблица 6). Формирование клона спленоцитов, сенсибилизированных к HBcAg, регистрируется в группе животных, иммунизированных суппозиториями с S. typhimurium T10/pKHBc. Индекс стимуляции в группе S. typhimurium T10/pKHBc достоверно превосходит таковой как в контрольной группе S. typhimurium Т10, так и при стимуляции спленоцитов гетерологичным антигеном - вирусом энтерита норок. Способность спленоцитов отвечать на стимуляцию HBcAg на 81-й день от начала иммунизации S. typhimurium T10/pKHBc свидетельствует о формировании специфической клеточной памяти.
| Таблица 6 | |||
| Пролиферативная активность спленоцитов мышей, иммунизированных суппозиториями, несущими рекомбинантные сальмонеллы (индекс стимуляции) на 81 день после начала иммунизации | |||
| Антиген | Антиген | Митоген | |
| Группа животных | HbcAg | Вирус энтерита норки | Конканавалин А |
| S. typhimurium Т-10 | 1,0 | 0,9 | 7,4 |
| S. typhimurium Т-10/рКНВс | 3,3 | 1,0 | 7,5 |
Приведенные данные свидетельствуют о том, что суппозитории, содержащие Salmonella typhimurium T10/pKHBc, при введении животным индуцируют выраженный специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ к HBcAg. Предложенные суппозитории могут быть использованы в качестве живой вакцины против гепатита В.
Пример 9. Приготовление суппозитория из лиофилизированной биомассы аттенуированного рекомбинантного штамма Salmonella typhimurium T-10/pKHBc.
Компоненты основы суппозиториев в виде навесок подготавливают, как описано в Примерах 2 или 3. Стакан с расплавленной основой помещают в смеситель-гомогенизатор и перемешивают при 200 об/мин до получения однородной массы. Основу охлаждают при постоянном перемешивании до температуры (39±1)°С. Флаконы (2-3 флакона) с лиофилизированной биомассой Salmonella typhimurium T-10/pKHBc (титр жизнеспособных клеток должен быть 109-1011 КОЕ/мл) вскрывают в асептических условиях и тщательно растирают таблетки до получения сыпучего порошка без комочков. Таким образом, впервые получены суппозитории для иммунопрофилактики вирусных инфекций, содержащие живые аттенуированые рекомбинантные штаммы сальмонелл, несущие протективные вирусные антигены, индуцирующие при введении животным выраженный специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ к соответствующему вирусному антигену, которые могут быть использованы в качестве живых противовирусных вакцинных препаратов.
Пример 10. Определение специфической активности суппозиториев, содержащих Salmonella enteriditis E23/pGEX-2T-TBI.
Рекомбинантный штамм Salmonella enteriditis E23/pGEX-2T-TBI продуцирует полиэпитопный белок gst-TBI, состоящий из В- и Т-клеточных эпитопов ВИЧ-1 [8].
Иммунизация. Для иммунизации используют мышей линии BALB/c, весом 12-15 грамм, полученных из вивария ГНЦ ВБ "Вектор". Животные содержались на стандартном рационе.
Иммунизацию мышей проводят введением суппозиториев перректально. Доза Salmonella enteriditis E23/pGEX-2T-TBI составляет 109 клеток на суппозиторий. В качестве положительного контроля животных иммунизируют белком gst-TBI с ПАФ (полный адъювант Фрейнда) внутримышечно однократно. Забор крови производят через 2, 6 и 12 недель после введения сальмонелл.
Иммуноферментный анализ. Специфичность образующихся антител в сыворотках мышей анализируют с помощью ИФА. Для выявления антител против ВИЧ-1 используют очищенный рекомбинантный белок gst-TBI и лизат ВИЧ-1899А (тип Х4, субтип В), полученный из коллекции штаммов вирусов иммунодефицита человека НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН. В каждом эксперименте берут образцы от трех животных. Эти образцы смешивают, после чего определяют титр специфических антител. На каждую точку делают два повтора. Результаты представлены в таблице 7.
| Таблица 7 Развитие ВИЧ-специфического гуморального иммунного ответа у мышей, иммунизированных клетками рекомбинантной сальмонеллы, продуцирующих TBI |
||||||
| Группа | 2-я неделя титр | 6-я неделя титр анти-TBI | 12-я неделя титр анти-TBI | |||
| Анти -TBI | Анти-ВИЧ-1 | анти-TBI | анти-ВИЧ-1 | анти-TBI | Анти-ВИЧ-1 | |
| Белок gst-TBI | 1:600 | 1:300 | 1:3650 | 1:1200 | 1:2150 | 1:600 |
| S. enteriditis E23/ pGEX-2T-TBI rectal | 1:300 | 1:100 | 1:1450 | 1:600 | 1:800 | 1:400 |
| S. enteriditis E23 rectal (contr) | 1:100 | 1:50 | 1:50 | 1:50 | 1:50 | 1:50 |
Реакция бласттрансформации. Реакцию бласттрансформации спленоцитов проводят через 6 недель после введения сальмонелл по ранее описанной методике [18]. В качестве специфического антигена используют gst-TBI и лизат ВИЧ-1 в качестве неспецифического антигена - вирус энтерита норки. В лунку планшета вносят по 100 мкл каждого компонента. Концентрация антигенов равна 2 мкг/мл. В качестве митогена используют конканавалин А (производства "Sigma", США) в концентрации 5 мкг/мл. Клетки, стимулированные антигенами, инкубируют в течение 78 ч. За 18 ч до окончания срока инкубации вносят 3H-тимидин (Санкт-Петербург) в дозе 2 мкКи на лунку. Клеточный ответ оценивают по показателю индекса стимуляции, который характеризует отношение пролиферации спленоцитов, индуцированных специфическими антигенами, к спонтанной пролиферации спленоцитов (Таблица 8). Формирование клона спленоцитов, сенсибилизированных к gst-TBI, регистрируется в группе животных, иммунизированных суппозиториями с S. enteriditis E23/pGEX-2T-TBI. Индекс стимуляции в группе S. enteriditis E23/pGEX-2T-TBI достоверно превосходит таковой как в контрольной группе S. typhimurium 7207, так и при стимуляции спленоцитов гетерологичным антигеном - вирусом энтерита норок. Способность спленоцитов отвечать на стимуляцию gst-TBI на 6 неделе от начала иммунизации с S. enteriditis E23/pGEX-2T-TBI свидетельствует о формировании специфической клеточной памяти.
| Таблица 8 | ||||
| Индукция Т-клеточного ответа. Индекс стимуляции | ||||
| Группа животных, иммунизированных рекомбинантной сальмонеллой | Лизат ВИЧ-1 | gst-TBI | антиген вируса энтерита норок | ConA |
| S. enteriditis E23/pGEX-2T- TBI rectal | 3,4 | 3,5 | 1,1 | 7,9 |
| S. enteriditis E23 rectal(contr) | 1,1 | 1,2 | 1,2 | 7,9 |
Примечание. В каждом эксперименте брали клетки от 3-х животных. Погрешность определения индекса стимуляции не более 0,1.
Приведенные данные свидетельствуют о том, что суппозитории, содержащие с S. enteriditis E23/pGEX-2T-TBI, при введении животным индуцируют выраженный ВИЧ-1 специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ.
Пример 11. Приготовление суппозитория Сал-ВИЧ "Д", содержащего живые клетки аттенуированного рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis Е-23/pcDNA-TCI.
Компоненты основы суппозитория в виде навесок (гидролизованное хлопковое масло (ГХМ) - 425,0±1,0 г и эмульгатор Т2 - 25,0±0,1 г) количественно переносят в стакан вместимостью 1 л, который помещают на водяную баню, нагретую до 55°С, и выдерживают до полного расплавления смеси. Стакан с расплавленной основой помещают в смеситель-гомогенизатор и перемешивают при 200 об/мин до получения однородной массы. Основу охлаждают при постоянном перемешивании до температуры (39±1)°С. Биомассу клеток Salmonella enteritidis E-23/pcDNA-TCI вводят в охлажденную суппозиторную основу порциями при перемешивании, суспендируют до получения однородной суспензии. Суппозиторную массу выливают в подготовленные формы и охлаждают при температуре минус (15±2)°С в течение 60 мин. Количество жизнеспособных колоний в суппозитории после подсчета составляет от 1,1×106 до 4×108.
Таким образом, впервые получены суппозитории для иммунопрофилактики вирусных инфекций, содержащие живые аттенуированые рекомбинантные штаммы сальмонелл, несущие протективные вирусные антигены, индуцирующие при введении животным выраженный специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ к соответствующему вирусному антигену, которые могут быть использованы в качестве живых противовирусных вакцинных препаратов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Международная заявка WO №98/48026, кл. С12N 15/74, опубл. 1998 г.
2. Международная заявка WO №0014240, кл. С12N 15/31, опубл. 2000 г.
3. Патент РФ №2192277, кл. А61К 39/12, опубл. БИ №31 за 2002 г.
4. Патент РФ №2192886, кл. А61К 39/19, опубл. БИ №32 за 2002 г.
5. Патент РФ №2223784, кл. А61К 39/385, опубл. БИ №4 за 2004 г.
6. Eroshkin A.M., Karginova E.A., Gileva I.P. et al. Design of four-helical protein as a candidate for HIV vaccine. // Protein Engeneering-1995 - 8 - p.167-173.
7. Некрасова Н.А., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Ильичев А.А., Карпенко Л.И. Исследование системного и мукозального иммунного ответа при иммунизации мышей кандидатной ВИЧ-1 вакциной. // Сибирский медицинский журнал. - 2004. - Т.19. - С.60-62.
8. Карпенко Л.И., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Порываева В.А., Лебедев Л.Р., Веремейко Т.А., Некрасова Н.А., Климов Н.А., Козлов А.П., Ильичев А.А. Конструирование и исследование антигенных свойств рекомбинантного штамма сальмонеллы, продуцирующей белок TBI. // Вопросы вирусологии - 2002 - N.2 - С.25-28.
9. Заявка на патент РФ №2003111095/13 от 17.04.2003 г. "Рекомбинантная плазмидная ДНК pcDNA-TCI, обеспечивающая экспрессию искусственного гена TCI в клетках эукариот, и рекомбинантный аттенуированный штамм бактерий Salmonella enteritidis E-23/pcDNA-TCI как кандидат для конструирования живой ДНК-вакцины против ВИЧ".
10. Nardelli-Haeftiger D., Kraehenduhl J.P, et al. Oral and rectal immunization of adult female volunteers with a recombinant attenuated Salmonella typhi vaccine strain. Infect. Immun. - 1996 - v.64 - p.5219-5224.
11. Патент РФ №2216590, кл. С12N 1/21, опубл. БИ №32 за 2003 г.
12. Карпенко Л.И., Игнатьев Г.М., Кожина Е.М. и др. Получение и исследование рекомбинантных штаммов Salmonella typhimurium SL 7207, продуцирующих HbcAg HbcAg-HBs. Вопросы вирусологии - 2000 - №2 - с.43-46.
13. Gregg M.R., Jack D.B., Smith S.R., Kendall M.J. The pharmacokinetics ofoxprenolol following oral and rectal dosing-a comparison of delivery systems and routes of administration. // J Clin Pharm Ther. 1987 Apr; 12 (2): 91-9.
14. Патент РФ №2224542, кл. А61К 39/116, опубл. БИ №6 за 2004 г.
15. Патент РФ №2185842, кл. А61К 35/74, опубл. БИ №21 за 2002 г.
16. Патент РФ №2228738, кл. А61К 9/02, опубл. БИ №15 за 2004 г.
17. Патент РФ №2073520, кл. А61К 35/74, опубл. БИ №5 за 1997 г.
18. Хоробрых В.В., Пронин А.В., Киркин А.Ф., Санин А.В. Методы постановки реакции бласттрансформации в микромодификации // Иммунология. - 1983. - N3. - С.76-79.
Claims (4)
1. Суппозитории для иммунопрофилактики вирусных инфекций, содержащие аттенуированную живую культуру клеток рекомбинантных штаммов Salmonella, трансформированных pGEX-2T-TBI, pcDNA-TCI или рКНВс, несущих гены протективных вирусных антигенов, гидрофобную суппозиторную основу и эмульгатор Т2 при следующем соотношении компонентов на одну свечу массой 2 г, мас.%:
2. Суппозитории по п.1, отличающиеся тем, что в качестве аттенуированной живой культуры клеток рекомбинантных штаммов сальмонелл содержат лиофилизованную биомассу рекомбинантных микроорганизмов.
3. Суппозитории по п.1, отличающиеся тем, что в качестве гидрофобной суппозиторной основы содержат твердый кулинарный жир (ТКЖ) или гидролизованное хлопковое масло (ГХМ) при следующем соотношении компонентов, мас.%:
4. Суппозитории по п.1, отличающиеся тем, что в качестве гидрофобной основы содержат смесь кулинарного жира "Фритюрный", масло какао и твердый парафин при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004126059/15A RU2296560C2 (ru) | 2004-08-25 | 2004-08-25 | Суппозитории для иммунопрофилактики вирусных инфекций |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004126059/15A RU2296560C2 (ru) | 2004-08-25 | 2004-08-25 | Суппозитории для иммунопрофилактики вирусных инфекций |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004126059A RU2004126059A (ru) | 2006-02-10 |
| RU2296560C2 true RU2296560C2 (ru) | 2007-04-10 |
Family
ID=36049666
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004126059/15A RU2296560C2 (ru) | 2004-08-25 | 2004-08-25 | Суппозитории для иммунопрофилактики вирусных инфекций |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2296560C2 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2429854C2 (ru) * | 2009-11-13 | 2011-09-27 | Элли Николаевна Каплина | Деринат-суппозитории для использования в медицинской практике |
| RU2601621C2 (ru) * | 2015-03-18 | 2016-11-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Фармацевтический завод иммунных лекарственных средств" | Натрия дезоксирибонуклеата суппозитории, ректальные и вагинальные |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000014240A2 (en) * | 1998-09-04 | 2000-03-16 | Creatogen Aktiengesellschaft | Attenuated salmonella sp12 mutants as antigen carriers |
| RU2192277C1 (ru) * | 2001-08-24 | 2002-11-10 | Автономная некоммерческая организация Биомедицинский центр | Штамм бактерий salmonella enteriditis e-23 bmc120 для иммунизации против вируса иммунодефицита человека |
| RU2192886C1 (ru) * | 2001-08-24 | 2002-11-20 | Автономная некоммерческая организация Биомедицинский центр | Штамм бактерий salmonella typhimurium т-10 вмс160 для иммунизации против вируса иммунодефицита человека |
| RU2201212C1 (ru) * | 2002-03-28 | 2003-03-27 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Суппозитории "генферон", обладающие иммуномодулирующим, противовирусным, противобактериальным, регенерирующим, репаративным, мембрано- и гепатопротекторным действием |
-
2004
- 2004-08-25 RU RU2004126059/15A patent/RU2296560C2/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000014240A2 (en) * | 1998-09-04 | 2000-03-16 | Creatogen Aktiengesellschaft | Attenuated salmonella sp12 mutants as antigen carriers |
| RU2192277C1 (ru) * | 2001-08-24 | 2002-11-10 | Автономная некоммерческая организация Биомедицинский центр | Штамм бактерий salmonella enteriditis e-23 bmc120 для иммунизации против вируса иммунодефицита человека |
| RU2192886C1 (ru) * | 2001-08-24 | 2002-11-20 | Автономная некоммерческая организация Биомедицинский центр | Штамм бактерий salmonella typhimurium т-10 вмс160 для иммунизации против вируса иммунодефицита человека |
| RU2201212C1 (ru) * | 2002-03-28 | 2003-03-27 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Суппозитории "генферон", обладающие иммуномодулирующим, противовирусным, противобактериальным, регенерирующим, репаративным, мембрано- и гепатопротекторным действием |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| . * |
| NARDELLI-HAEFLIGER D. et al. Oral and rectal immunization of adult female volunteers with a recombinant attenuated Salmonella typhi vaccine strain. Infect. Immun. 1996, Dec., 64 (12), p.5219-5224. * |
| ДОНИН М. В. и др. Возможность использования аттенуировынных рекомбинантных штаммов Salmonella enteriditis, продуцирующих НВс-антиген, как ректальной вакцины в эксперименте. Вестник Российской академии медицинских наук. 2004, №6, с.13-15. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2429854C2 (ru) * | 2009-11-13 | 2011-09-27 | Элли Николаевна Каплина | Деринат-суппозитории для использования в медицинской практике |
| RU2601621C2 (ru) * | 2015-03-18 | 2016-11-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Фармацевтический завод иммунных лекарственных средств" | Натрия дезоксирибонуклеата суппозитории, ректальные и вагинальные |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2004126059A (ru) | 2006-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20010024650A (ko) | ＲｐｏＳ 양성 표현형을 가진 면역원성 약독화 박테리아를포함하는 재조합 백신 | |
| BRPI0807828B1 (pt) | Composição compreendendo leveduras e usos das mesmas, bem como método para o crescimento de leveduras e kit para o cultivo de leveduras | |
| MXPA00011075A (es) | Mutantes atenuados de salmonella que constitutivamente expresan el antigeno vi.. | |
| CN101638661A (zh) | 新城疫病毒hn基因和f基因重组乳酸菌的构建 | |
| CA2829678C (en) | Method for the production of protein complexes and vaccine compositions comprising the same | |
| JP2002502827A (ja) | ヒト免疫不全ウイルスに対する生ワクチン | |
| RU2185191C1 (ru) | Способ получения антигенного препарата haemophilus influenzae типа b (hib) | |
| SU997599A3 (ru) | Способ получени гетеровакцины дл лечени синдрома трихомонада | |
| CN113354742A (zh) | 一种布鲁氏杆菌基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN115814070A (zh) | 一种副嗜血杆菌病疫苗及其制备方法和应用 | |
| RU2753410C2 (ru) | Способ получения анатоксин-вакцины против эшерихиоза животных | |
| RU2301680C1 (ru) | Вакцина ассоциированная против стрептококкоза и энтерококковой инфекции нутрий | |
| RU2766549C1 (ru) | Способ профилактики эшерихиоза у поросят | |
| RU2764600C1 (ru) | Вакцина против эшерихиоза телят и поросят | |
| US20250276055A1 (en) | Visco-elastic Solid Formulation for Oral Delivery of a Biologically Active Agent | |
| RU2814593C1 (ru) | Способ профилактики эшерихиоза у поросят | |
| RU2813771C1 (ru) | Способ профилактики эшерихиоза у телят | |
| RU2521651C1 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ, Moraxella bovoculi "СХ-Ч6 N-ДЕП" ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМОВ И ВАКЦИН ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО КЕРАТОКОНЪЮКТИВИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА | |
| RU2406531C1 (ru) | Вакцина ассоциированная против стрептококкоза, псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий | |
| US20230173053A1 (en) | Lyophilized Live Bordetella Vaccines | |
| US20100086566A1 (en) | Hiv administration protocols | |
| EA029938B1 (ru) | Вакцина против мыта лошадей | |
| SU1202109A1 (ru) | Штамм @ @ РА-7,используемый дл получени анатоксина | |
| RU2389505C1 (ru) | Вакцина ассоциированная против псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий | |
| CN121518338A (zh) | 一株猪源f型多杀性巴氏杆菌及其作为疫苗菌株的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |