RU2407751C2

RU2407751C2 - Аналоги адренокортикотропного гормона и относящиеся к ним методы

Info

Publication number: RU2407751C2
Application number: RU2007119580/10A
Authority: RU
Inventors: Майлз Б. БРЕННАН (US); Майлз Б. БРЕННАН; Роберт М. ДОРЕС (US); Роберт М. ДОРЕС; Кэрри ХАСКЕЛЛ-ЛУВАНО (US); Кэрри ХАСКЕЛЛ-ЛУВАНО; Уте Х. ХОХГЕШВЕНДЕР (US); Уте Х. ХОХГЕШВЕНДЕР; Джессика И. КОСТА (NZ); Джессика И. КОСТА
Original assignee: Юниверсити Оф Денвер; Юниверсити Оф Флорида; Оклахома Медикал Рисерч Фаундейшн
Priority date: 2004-10-27
Filing date: 2005-10-27
Publication date: 2010-12-27
Also published as: CA2584221A1; KR20100102752A; JP2008518026A; US20100260681A1; NZ554559A; MX2007004676A; AU2005305157B2; JP2012067099A; US20070197774A1; CN101947310A; CN101189022A; EP2446894A2; SG156680A1; WO2006052468A3; US20060128620A1; WO2006052468A2; KR101058467B1; US20080207518A1; KR20120050440A; EP1814574A4

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано в медико-биологической промышленности. Предложен аналог адренокортикотропного гормона (АСТН), состоящий из 24 аминокислотных остатков и представляющий собой укороченный с С-конца природный пептид человека (hACTH 1-24), в котором последовательность Lys15-Lys16-Arg17-Arg18-Pro19 заменена последовательностью Lys15-Arg16-Ala17-Ala18-Trp19. Новая мутантная форма АСТН обладает такими свойствами, как (1) снижение секреции кортикостероида мембраной надпочечника в присутствии аналога АСТН в сравнении с немодифицированным АСТН; (2) снижение секреции кортикостероида мембраной надпочечника в присутствии эндогенного АСТН и (3) повышенная аффинность по связыванию с MC-2R при сниженной активации рецептора MC-2R в сравнении с вариантом связывания немодифицированного АСТН. Совокупность свойств, характеризующих аналог АСТН по изобретению, позволяет использовать его как непосредственно, так и в составе фармкомпозиции, для лечения АСТН-ассоциированных состояний, в частности при болезни Кушинга. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 ил., 5 табл.

Description

Информации о поддержке правительства США

Тема исследования, отраженная в настоящей заявке, была финансирована исследовательским грантом Национального Института Здоровья (National Institutes of Health) (номер гранта NIH: DK50870) и грантом Национального Фонда Науки (National Science Foundation) (номер гранта NSF IBN-0132210). Соответственно, правительство имеет определенные права на настоящее изобретение.

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США, номер No. 60/622436, «Композиции и способы лечения преждевременных родов, синдрома Кушинга и родственных расстройств» (Composition and Methods for the Treatment of Premature Labor, Cushing's Syndrome and Related Disordes»), поданной 27 октября 2004 года, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к соединениям-аналогам АСТН, а также к относящимся к ним фармацевтическим композициям и способам лечения.

Уровень техники

Кортикотропин, также известный как адренокортикотропный гормон (АСТН), представляет собой главный гормон, секретируемый гипофизом, и который, как считается, является медиатором в процессах создания множества жизненно важных ростовых стероидов, контролирующих рост и физиологические процессы. АСТН стимулирует кору надпочечника. Более конкретно, он стимулирует секрецию глюкокортикоидов, таких как кортизол, у человека (или кортикостерон у грызунов) и оказывает незначительное регулирующее воздействие на секрецию альдостерона, другого важного стероидного гормона коры надпочечника. АСТН связывается с рецептором адренокортикотропного гормона MC-2R, экспрессируемым в надпочечнике.

АСТН секретируется из передней доли гипофиза в ответ на кортикотропин-рилизинг гормон (CRH) гипотоламуса. В гипофизе АСТН продуцируется из крупной молекулы-предшественника опиомеланокортина (POMC), который расщепляется под действием специфических пептидаз. Эффекты АСТН на синтез стероидов могут включать повышение уровня холестеролэстеразы, транспорт холестерина в митохондриальную мембрану и через нее, связывание холестерина с P450SСС и, в этой связи, повышение продукции прегненолона (см., Nussey, S. and S. Whitehead, Endocrinology: An Integrated Approach, BIOS Scientific Publishers Ltd. (2001)). Последующая активность может включать индукцию стероидогенных ферментов и структурные изменения, которые характеризуются гиперваскуляризацией, клеточной гипертрофией и гиперплазией. Этот феномен особенно важен в тех случаях, когда избыток АСТН может нежелательно секретироваться в течение длительных периодов времени.

Стероидный глюкокортикоид продуцируется фасциально-ретикулярными клетками надпочечника в надпочечнике, который секретируется в ответ на повышение уровня в плазме адренокортикотропного гормона (АСТН). Глюкокортикоиды вовлекаются в метаболизм углеводов, белков и жиров и, как было показано, обладают противовоспалительными свойствами, и в стрессовых условиях подвергаются гиперсекреции. При избытке, как было показано, глюкокортикоиды повреждают гиппокамп, участок лимбической системы головного мозга, который важен для осуществления познавательных функций, таких как обучение и память (см., например, Sapolsky, R. M., Ann. N. Y. Acad. Sci. 746:294 (1994); и McEwen, B S., Ann. N. Y. Acad. Sci. 746:134 (1994)). Кроме того, было показано, что нейротоксичность глюкокортикоидов и их повреждающий потенциал в отношении нервных клеток является решающим фактором в развитии и старении нервных клеток, а также неврологических заболеваний, связанных с повреждением гиппокампа (см., например, deKloet, E. R., et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 746: 8 (1994)).

Кортикостероиды представляют собой стероидные гормоны, характеризующиеся структурным родством с холестерином. Указанные гормоны синтезируются в коре надпочечника и включают глюкокортикоиды (например, кортикостероиды), минералокортикоиды (например, альдостерон), а также слабые андрогены и эстрогены. Функции надпочечника, как и щитовидной железы, находятся под контролем гипоталамуса (HPT) и гипофиза (PIT). Когда уровни кортикостероидов (природного глюкокортикоида) падают ниже определенной точки, гипоталамус высвобождает CRH (кортикотропин-рилизинг гормон), который стимулирует высвобождение адренокортикотропного гормона (АСТН) из гипофиза. АСТН представляет собой тропный гормон, который стимулирует синтез и секрецию кортикостероидов (он оказывает минимальный эффект на синтез/секрецию альдостерона) и на рост надпочечника.

В настоящее время имеется потребность в соединениях, которые могли бы связываться с рецепторами АСТН и при этом оказывать сниженную активацию секреции кортикостероидов, например, для лечения АСТН-родственных состояний, включающих: синдром Кушинга, сниженный иммунитет, возникающий в результате гиперсекреции кортикостероида, и некоторых относящихся к надпочечнику состояний, которые вызывают преждевременные роды.

Синдром Кушинга представляет собой расстройство, возникающее в результате повышенной секреции кортикостероида надпочечником. Гиперфункция коры надпочечников может быть АСТН-зависимой или может быть независимой от регуляции АСТН, например, в случае продукции кортикостероида адренокортикальной аденомой или карциномой. Наиболее частой причиной синдрома Кушинга является избыточное образование АСТН гипофизом. В типичном случае повышенный уровень АСТН в кровотоке создается аденомой гипофиза (болезнь Кушинга), но иногда имеет другую этиологию. Синдром Кушинга, возникающий в результате образования АСТН в сайте, отличном от гипофиза, носит название эктопический синдром Кушинга. Примеры эктопических сайтов включают тимому, медуллярную карциному щитовидной железы, феохромоцитому, опухоли островковых клеток поджелудочной железы и овсяно-клеточную карциному легкого. Однако в подавляющем большинстве случаев этиология синдрома Кушинга у людей связана с аденомой гипофиза. Симптомы синдрома Кушинга включают повышение веса, центральное ожирение, гиперсекрецию стероидов, повышенную экскрецию кортизола с мочой, лунообразное лицо, слабость, усталость, боли в спине, головную боль, импотенцию, изменение ментального статуса, атрофию мышц и повышенную жажду и мочевыделение в сравнении с млекопитающими, не имеющими этого заболевания. Диагностика и лечение синдрома Кушинга все еще остаются проблемой для медицины (см., Oldfields, E. W., et. al., N. Engl. J. Med., 352: 897-905 (1991); Findling, J. W., et al., «Diagnosis and differential diagnosis of Cushing's syndrome», Endocrinol. Metab. Clin. North. Am., 30: 729-47 (2001); Orth, D. N., «Cushing's syndrome», N. Engl. J. Med., 332: 791-803 (1995)). В настоящее время отсутствует медицинские доступные стратегии лечения синдрома Кушинга. В специализированных центрах проводят хирургическую резекцию микроаденом гипофиза, секретирующих АСТН, что позволяет достичь общего уровня излечивания примерно в 70-80%, но в случае макроаденом уровень излечивания составляет лишь примерно 30%, а необходимая при этом обширная хирургическая резекция создает значительный риск для окружающей нормальной ткани гипофиза, приводящий к частичному или полному гипопитуитаризму примерно в 80% случаев (Simmons, N. E., et al., «Serum Cortisol response to transphenoidal surgery for Cushing's disease», J. Neurosurg., 95:1-8 (2001); Mampalam, T. J. et al., «Transsphenoidal microsurgery for Cushing's disease: A report of 216 cases», Ann. Intern. Med., 109: 487-93 (1988); и Trainer, P. J. et al., «Transsphenoidal resection in Cushing's disease: undetectable serum cortisol as the definition of successful treatment», Clin. Endocrinol., 38: 73-8 (1993)). Таким образом, имеется потребность в лечении синдрома Кушинга, когда источником АСТН является диссеминированная опухоль гипофиза или эктопический источник, которое было бы эффективным и не создавало риска для пациента.

Соединения, которые связываются с рецепторами АСТН, при сопутствующей сниженной активации секреции кортизола, могут также использоваться при воздействии по оси гипоталамус-гипофиз-надпочечник для инициации преждевременных родов. Преждевременные роды происходят примерно в 7-10% случаев и вносят определенный вклад в существенный процент перинатальной заболеваемости и смертности (McCormick, M. C., «The contribution of low birth weight to infant mortality and childhood morbidity», N Engl J Med., 312: 82-90 (1985)). Профилактика спонтанных абортов и преждевременных родов, а также пролонгированный период беременности у людей желательны по многим причинам. Беременность особенно желательно продлить для того, чтобы (i) повысить вероятность рождения живого ребенка, (ii) снизить частоту осложнений для здоровья, сопровождающих преждевременное рождение ребенка, и (iii) снизить период времени, в течение которого недоношенный ребенок, даже если он здоров, должен в связи с его размерами и жизнеспособностью получать особый интенсивный уход. Все указанные факторы: (i) рождение живого ребенка, (ii) здоровый ребенок и (iii) ребенок, который может вовремя покинуть больницу на попечение родителей, способствуют счастью и процветанию родителей и родственников. Эти факторы также имеют социальное значение, поскольку преждевременные роды несут большую социально-экономическую нагрузку, связанную с уходом за детьми, которые родились в результате очень ранних родов.

Сельское хозяйство и аквакультура становятся рентабельными, когда культивируемые организмы выращиваются с высокой плотностью популяции. Однако у млекопитающих, птиц и рыб такая плотность зачастую приводит к образованию стрессовых гормонов надпочечника с их вредными последствиями, включая ослабление иммунной функции и сниженный рост. Было бы также желательно иметь способ снижения уровней гормонов стресса надпочечника в таких и других состояниях, вызванных длительным стрессом и приводящих к нежелательным изменениям здоровья, например к сниженной иммунной функции и чувствительности к заболеваниям.

Различные композиции и способы могут использоваться для снижения уровня АСТН, например, через посредство определенных рецепторов для аргинин-вазопрессина (AVP). В патенте США No. 6 380 155, зарегистрированном 3 мая 2000 года, описывается использование некоторых композиций с антагонистом рецептора вазопрессина для регуляции высвобождения АСТН. Композиции для лечения АСТН-ассоциированных состояний, которые регулируют уровни АСТН, являются желательными, такие как композиции, которые могут связываться с рецепторами АСТН MC-2R, при снижении или устранении АСТН-индуцированной продукции кортикостероидов, с тем чтобы ослаблять нежелательные состояния, ассоциированные с повышенными уровнями АСТН.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предлагаются различные модифицированные пептиды на основе адренокортикотропного гормона (АСТН) («аналоги АСТН»), которые снижают или устраняют АСТН-индуцированную секрецию кортикостероида в сравнении с немодифицированным АСТН. Предпочтительно, аналоги АСТН также снижают секрецию кортикостероида из мембраны надпочечника в присутствии немодифицированного АСТН.

Соединения-аналоги АСТН предпочтительно включают по меньшей мере аминокислоты 1-24 из немодифицированного АСТН, при наличии замещения одной или нескольких аминокислот. Соединения-аналоги АСТН могут включать одно или несколько замещений аминокислот или усечений аминокислот в сравнении с немодифицированной последовательностью аминокислот человеческого АСТН. Немодифицированный человеческий АСТН представляет собой полипептид, включающий 39 остатков аминокислот в следующей последовательности: N-Ser¹-Tyr-Ser-Met-Glu⁵-His-Phe-Arg-Trp-Gly¹⁰-Lys-Pro-Val-Gly-Lys¹⁵-Lys-Arg-Arg-Pro-Val²⁰-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn²⁵-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu³⁰-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe³⁵-Pro-Leu-Glu-Phe³⁹-Ac (SEQ ID NO: 1), где N и Ac обозначают амино и карбокси концы молекулы соответственно. Аналоги АСТН могут также включать соединения, которые содержат пептид, имеющий одно или несколько замещений или модификаций в последовательности: N-Ser¹-Tyr-Ser-Met-Glu⁵-His-Phe-Arg-Trp-Gly¹⁰-Lys-Pro-Val-Gly-Lys¹⁵-Lys-Arg-Arg-Pro-Val²⁰-Lys-Val-Tyr-Pro-Ac (SEQ ID NO: 2), где N и Ac обозначают амино- и карбокси концы молекулы соответственно. Предпочтительные соединения-аналоги АСТН включают по меньшей мере остатки аминокислот 1-19 из hACTH или mACTH, более предпочтительно аминокислотные остатки 1-24 из hACTH или mACTH, при наличии замещения одной или нескольких аминокислот.

Соединения-аналоги АСТН включают соединения, содержащие последовательность АСТН SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, при наличии одной или нескольких структурных модификаций, которые приводят к достижению одной или более из числа указанных предпочтительных биологических функций аналогов АСТН: (1) снижение секреции кортикостероида мембраной надпочечника в присутствии аналога АСТН в сравнении с немодифицированным АСТН, (2) снижение секреции кортикостероида мембраной надпочечника в присутствии эндогенного АСТН и (3) повышенная аффинность по связыванию MC-2R при сниженной активации рецептора MC-2R в сравнении с немодифицированным АСТН. Примеры предпочтительных замещений аминокислот в АСТН, которые приводят к получению соединений-аналогов АСТН, включают одно или несколько из следующих замещений: (1) замещение одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях 1-13, которые сохраняют аминокислоты в положениях 6-9 и/или усиливают или сохраняют связывание с MC-2R, (2) замещение одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях 15-18, которое предотвращает или антагонизирует энзиматическое расщепление в этих позициях, (3) замещение одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях 15-18, так что аналог АСТН не будет включать соседствующие аминокислотные остатки с основными боковыми цепями в положениях 15-18, (4) замещение или усечение одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях 20-24, которое продлевает период полувыведения из сыворотки аналога АСТН, (5) замещение одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях 20-36, которое приводит к образованию аналога АСТН, обладающего способностью снижать секрецию кортикостероида мембраной надпочечника в присутствии аналога АСТН, в сравнении с немодифицированным АСТН пептидом, (6) замещение или предпочтительно усечение одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях 25-39, которое приводит к образованию соединений-аналогов АСТН, обладающих желательными свойствами по высвобождению, или (7) усечение аминокислотных остатков 25-39, в результате которого аминокислотный остаток в положении 24 образует карбокси конец молекулы.

Соединения-аналоги АСТН предпочтительно связываются с рецепторами АСТН, такими как рецептор меланокортина 2 (MC-2R) в мембране надпочечника. Предпочтительно, соединения-аналоги АСТН не активируют или слабо активируют клетки, экспрессирующие MC-2R, и ингибируют или снижают действие немодифицированных эндогенных АСТН.

В первом варианте осуществления настоящего изобретения различные соединения-аналоги АСТН могут включать одно или несколько замещений аминокислот или их усечение в сравнении с немодифицированной аминокислотной последовательностью человеческого АСТН. Например, композиция, включающая выделенный аналог пептида АСТН, может включать пептид SEQ ID NO: 2, при наличии по меньшей мере одного из следующих замещений аминокислот:

а) замещение остатка Pro в положении 19 в SEQ ID NO: 2 аминокислотой Trp; или

b) замещение одной или нескольких аминокислот остатками, выбранными из аминокислотных остатков 16-18 в SEQ ID NO: 2, так что аминокислотные остатки 16, 17 и 18 в аналоге АСТН не включают два соседствующих остатка аминокислот, выбранных из группы, состоящей из: Lys и Arg; и один или нескольких аминокислотных остатков, замещенных в положениях 16, 17 или 18 в SEQ ID NO: 2, выбирают из группы, состоящей из: Lys, Arg, Gln, Gly, Ala, Val, Leu, Ile и аналога аминокислоты, содержащей алкильную боковую цепь (такого как Nle). Необязательно аналог пептида АСТН может включать по меньшей мере один Ala, Gly или другую аминокислоту с алкильной боковой цепью (например, Val, Leu, Ile аминокислотный аналог, включающий алкильную боковую цепь, такой как Nle) и по меньшей мере один остаток Arg, замещенный по любым двум положениям аминокислот в положениях 15, 16, 17 или 18 в SEQ ID NO: 2. Аналог АСТН может необязательно состоять по существу из последовательности SEQ ID NO: 2, включающей следующие замещения аминокислот: остаток Pro в положении 19 в SEQ ID NO: 2 замещается аминокислотой Trp; аминокислота в положении 15 в SEQ ID NO: 2 выбирается из группы, состоящей из Lys, Ala и Gln; и аналог пептида АСТН может включать одно или несколько замещений аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 16-18 в SEQ ID NO: 2, так что аминокислотные остатки 16, 17 и 18 в аналоге АСТН не включают двух соседствующих аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из Lys и Arg. Предпочтительно, аналог пептида АСТН включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 по аминокислотным остаткам 6, 7, 8 и 9. Аналог пептида АСТН может также включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 по аминокислотным остаткам 15-19.

Первый вариант осуществления изобретения также включает аналоги АСТН, содержащие пептид SEQ ID NO: 1 с наличием по меньшей мере одного аминокислотного замещения, такого как замещение аминокислотного остатка в положении 9, 26, 30 или 36 в SEQ ID NO: 1. Аналог пептида АСТН может также включать пептид SEQ ID NO: 1 с наличием по меньшей мере одного из следующих замещений аминокислот:

а) замещение остатка Pro в положении 19 в SEQ ID NO: 1 аминокислотой Trp; или

b) замещение одной или нескольких аминокислот остатками, выбранными из аминокислотных остатков 16-18 в SEQ ID NO: 1, так что аминокислотные остатки 16, 17 и 18 в аналоге АСТН не включают двух соседствующих аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из: Lys и Arg; и один или несколько аминокислотных остатков, замещенных в положениях 16, 17 или 18 SEQ ID NO: 2, выбирают из группы, состоящей из: Lys, Arg, Gln, Gly, Ala, Val, Leu, Ile и Nle (или другого аминокислотного аналога с алкильной боковой цепью).

Другие предпочтительные аналоги пептидов АСТН включают модификации пептидов SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, так что аналог пептида АСТН включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 по аминокислотным остаткам 15-19. Аналоги пептидов АСТН также включают усечения по одному или нескольким пептидам, аналог АСТН также включат усечение по аминокислотным остаткам 25-39 в SEQ ID NO: 1. Аналоги пептидов АСТН с SEQ ID NO: 20 являются особенно предпочтительными.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения введение аналога пептида АСТН снижает АСТН-индуцированную продукцию кортикостерона мембраной надпочечника в тесте индукции кортикостероида в сыворотке in vitro по меньшей мере на 10% и предпочтительно до 100%, в сравнении с пептидом SEQ ID NO: 2. Например, во втором варианте аналоги АСТН представляют собой модифицированные пептиды АСТН, которые функционируют по снижению секреции кортикостероида мембраной надпочечника в присутствии аналога АСТН в сравнении с немодифицированным АСТН.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения введение аналога пептида АСТН в тесте на ингибирование кортикостероидов в сыворотке in vivo снижает АСТН-индуцированную секрецию кортикостероида по меньшей мере на 10%. В третьем варианте аналоги АСТН представляют собой модифицированные пептиды АСТН, которые функционируют по снижению секреции кортикостероида мембраной надпочечника в присутствии эндогенного АСТН.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются композиции, которые включают выделенный аналог пептида АСТН по SEQ ID NO: 2 с наличием по меньшей мере одного аминокислотного замещения, где указанный аналог пептида АСТН связывается с SEQ ID NO: 2 из мембраны надпочечников и вытесняет его. Связывание пептида может быть выявлено и измерено в тесте на конкурентное связывание с мембраной надпочечника в бессывороточной среде in vitro. Например, в четвертом варианте аналоги пептидов АСТН представляют собой модифицированные пептиды АСТН, которые функционируют по связыванию с рецепторами АСТН надпочечника, таким как рецептор MC-2R, предпочтительно с повышенной аффинностью по связыванию с MC-2R и со сниженной способностью к активации рецептора MC-2R в сравнении с немодифицированным АСТН. Предпочтительно, аналог пептида АСТН может связываться с пептидом SEQ ID NO: 2 из мембраны надпочечника и вытеснять его, где связывание пептида измеряют в тесте на конкурентное связывание в бессывороточной среде с мембраной надпочечника in vitro. Наиболее предпочтительно, аналог пептида АСТН связывается с MC-2R из мембраны надпочечника по меньшей мере с увеличенной в два раза аффинностью, чем пептид SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аналог пептида АСТН снижает АСТН-индуцированную продукцию кортикостерона мембраной надпочечника в тесте на ингибирование функции надпочечника в бессывороточной среде in vitro. Например, в пятом варианте осуществления изобретения соединения-аналоги АСТН могут снижать индукцию кортикостероида немодифицированным АСТН в эксплантатах ткани in vitro. Аналоги АСТН включают пептиды, которые снижают АСТН-индуцированную продукцию кортикостерона мембраной надпочечника в тесте на ингибирование надпочечника в бессывороточной среде in vitro.

В шестом варианте осуществления настоящего изобретения предлагаются аналоги АСТН с увеличенным периодом полувыведения из организма. Аналоги АСТН с увеличенным периодом полувыведения из организма могут быть идентифицированы как имеющие первую активностью, измеряемую по концентрации сывороточного кортикостероида, выявляемого in vivo, которая выше, чем вторая активность, измеряемая по бессывороточной концентрации кортикостероида, выявляемого по активности in vitro, где активность in vivo измеряют в рамках теста на ингибирование секреции кортикостероида надпочечником в сыворотке, в соответствии с примером 2, а активность in vitro определяют в тесте на ингибирование секреции кортикостероида мембраной надпочечника в бессывороточной среде in vitro, в соответствии с примером 4.

В седьмом варианте осуществления настоящего изобретения предлагаются способы скрининга аналогов АСТН, которые полезны по блокированию избытка АСТН, при поддержании тонуса надпочечника. Различные аналоги АСТН могут быть получены и введены пациенту для оценки индукции кортизона in vivo.

В восьмом варианте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим аналоги АСТН и их введение субъекту по способу, соответствующему лечению симптомов, связанных с АСТН-ассоциированным состоянием. Приведенные в настоящем описании аналоги АСТН могут включаться в состав фармацевтических композиций для лечения АСТН-ассоциированных состояний, таких как сверхэкспрессия АСТН у людей или животных. Рассматриваются также способы получения аналогов АСТН и основанных на них фармацевтических композиций, содержащих аналоги АСТН. Например, в одном аспекте предлагаются способы скрининга класса аналогов АСТН для соединений, используемых при блокировании избытка АСТН с поддержанием тонуса надпочечника.

Соединения-аналоги АСТН могут использоваться для лечения заболеваний, опосредованных уровнями АСТН, таких как состояния, отзывчивые на модуляцию рецепторов АСТН (таких как MC-2R). Описываются также соединения, используемые для регуляции секреции кортикостероида или уровня кортикостероида. Соединения-аналоги АСТН могут вводиться для лечения состояний, связанных с регуляцией уровня АСТН, например для снижения эффектов высоких уровней АСТН у пациентов, при поддержании функции надпочечника в состоянии тонуса. Композиции с аналогом АСТН используются, например, при лечении АСТН-ассоциированных состояний, таких как синдром Кушинга, ослабленный иммунитет, возникающий в результате гиперсекреции кортикостероида, инициация преждевременных родов (например, по оси гипоталамус-гипофиз-надпочечник) и родственные состояния. В одном аспекте получают различные аналоги АСТН и вводят пациенту для оценки индукции кортизона in vivo. В другом аспекте предлагаются способы лечения животных, такие как способы снижения гормонов стресса для улучшения состояния здоровья сельскохозяйственных и применяемых в аквакультуре видов, выращиваемых с высокой плотностью популяций.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На прилагаемых чертежах указано следующее.

На фиг.1 показан график, демонстрирующий уровни кортикостерона, измеряемые in vivo после инъекции различных соединений-аналогов АСТН, в сравнении с уровнем кортикостерона, измеряемым после введения немодифицированного АСТН.

На фиг.2 показан график, сравнивающий уровни кортикостерона in vivo, индуцированные введением немодифицированного АСТН, аналога АСТН в сочетании с немодифицированным АСТН, аналога АСТН с последующим отдельным введением немодифицированного АСТН и одного аналога АСТН.

На фиг.3 показан график, сравнивающий результаты конкурентного теста на связывание с рецепторами АСТН надпочечника для немодифицированного АСТН и соединения-аналога АСТН.

На фиг.4 показан график, сравнивающий уровни кортикостерона in vitro, индуцированные введением в изолированные мембрану надпочечника немодифицированного АСТН, аналога АСТН в сочетании с немодифицированным АСТН и одного аналога АСТН.

На фиг.5 показан график, сравнивающий активности in vivo и in vitro различных соединений-агонистов АСТН по индукции кортикостерона, в сравнении с активностью немодифицированного АСТН, принятого за стандарт (то есть 100%).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Если особо не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в описании, имеют общепринятые значения, известные специалистам в данной области, к которой относится настоящее изобретение. В случае несовпадения, настоящий документ, включая приведенные определения, будет определяющим. Предпочтительные способы и материалы описаны ниже, хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные приведенным в настоящем описании, могут использоваться в практике осуществления настоящего изобретения или при проведении тестов в соответствии с настоящим изобретением. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, процитированные в описании, включены в него полностью в качестве ссылок. Материалы, методы и примеры, приведенные в описании, являются лишь иллюстративными и не носят ограничивающий характер.

В контексте настоящего описания термин «немодифицированный адренокортикотропный гормон» («немодифицированный АСТН») обозначает пептидный гормон, продуцируемый передней долей гипофиза, который стимулирует кору надпочечника по секреции глюкокортикоидных гормонов, которые помогают клеткам синтезировать глюкозу в процессе глюконеогенеза, катаболизировать белки, мобилизовать свободные жирные кислоты и ингибировать воспаление при аллергических ответах. Одним таким гормоном является кортикостероид, которые регулирует метаболизм углеводов, жиров и белков.

Термин «кортикостероид» в контексте настоящего описания включает человеческий кортикостероид кортизон и кортикостероид грызунов - кортикостерон.

Термин «примерно», используемый применительно к количеству, включает вариации в приведенных количествах, которые эквивалентны цитируемому количеству, например количеству, которое несущественно отличается от приведенного количества для указанной цели или функции.

Номенклатура «P(x-y)» в контексте настоящего описания, где P обозначает наименование полипептида и х и у обозначают целые числа, относится к аминокислотной последовательности, состоящей из последовательности аминокислот от положения (х) до положения (у) полипептида, называемого «Р». Например, «hACTH(1-24)» относится к полипептиду из 24 последовательных аминокислот, состоящих из остатков 1-24 от амино конца человеческого пептида АСТН. Термин «mACTH» относится к мышиному АСТН. В частности, hACTH(1-24) и mACTH(1-24) представляют собой идентичные пептидные последовательности.

Номенклатура «aXb», где a и b представляют собой однобуквенные сокращения, принятые для аминокислот, и Х обозначает число, относится к замещению аминокислоты «a» в положении «Х» в немодифицированном пептиде АСТН аминокислотой «b». Например, выражение «(V26F, E30K)mACTH» относится к молекуле мышиного АСТН, состоящей из 39 аминокислот, которая была модифицирована путем замещения аминокислотой Phe аминокислоты Val в 26 положении на амино конце молекулы и замещения аминокислотой Lys аминокислоты Glu в положении 30 на амино конце молекулы. Аналогично, номенклатура «αβχX-Yδεφ», где α, β, χ, δ, ε и φ обозначают однобуквенные сокращения для аминокислот и X и Y обозначают числа, относится к замещению последовательных аминокислот «αβχ» в положениях X-Y аминокислотами «δεφ».

Соединения-аналоги АСТН включают соединения, содержащие последовательности АСТН, при наличии в них одной или нескольких структурных модификаций, которые обеспечивают одну или несколько указанных ниже предпочтительных биологических функций аналога АСТН: (1) снижение секреции кортикостероида мембраной надпочечника в присутствии аналога АСТН в сравнении с немодифицированным АСТН, (2) снижение секреции кортикостероида мембраной надпочечника в присутствии эндогенного АСТН, (3) повышенную аффинность по связыванию MC-2R при сниженной активации рецептора MC-2R в сравнении с немодифицированным АСТН. Считается, что соединения-аналоги АСТН действуют посредством связывания с рецептором меланокортина 2 (MC-2R), при слабой активации клеток, экспрессирующих MC-2R, и блокировании действия эндогенного АСТН на рецептор MC-2R.

Примеры предпочтительных замещений аминокислот в АСТН, которые приводят к образованию соединений-аналогов АСТН, обладающих одной или несколькими желательными функциями, включают: (1) замещение одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях 1-13, которые сохраняют аминокислоты в положениях 6-9 и/или усиливают или сохраняют связывание с MC-2R, (2) замещение одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях 15-18, которое предотвращает или антагонизирует энзиматическое расщепление по этим положениям, (3) замещение одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях 15-18, для которых не характерно соседствующее положение двухосновных аминокислот, (4) замещение или усечение одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях 20-24, которое приводит к увеличению периода полувыведения из сыворотки аналога АСТН, (5) замещение или предпочтительно усечение одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях 25-39, которое обеспечивает получение соединений-аналогов АСТН с желательными свойствами по высвобождению или (6) усечение аминокислотных остатков 25-39, в результате которого аминокислотный остаток в положении 24 образует карбокси конец молекулы.

СОЕДИНЕНИЯ-АНАЛОГИ АСТН

В первом варианте осуществления настоящего изобретения различные соединения-аналоги АСТН могут включать замещения или усечение одной или нескольких аминокислот в сравнении с немодифицированной аминокислотной последовательностью человеческого АСТН. Немодифицированный человеческий АСТН представляет собой пептид, который включает 39 аминокислотных остатков в следующей последовательности: N-Ser¹-Tyr-Ser-Met-Glu⁵-His-Phe-Arg-Trp-Gly¹⁰-Lys-Pro-Val-Gly-Lys¹⁵-Lys-Arg-Arg-Pro-Val²⁰-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn²⁵-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu³⁰-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe³⁵-Pro-Leu-Glu-Phe³⁹-Ac (SEQ ID NO. 1) («hACTH»), где N и Ac обозначают амино и карбокси концы молекулы соответственно. АСТН(1-24) консервируется, так что АСТН(1-24) найден у большинства хордовых, включая человеческие АСТН(1-24), и имеет следующую пептидную последовательность: N-Ser¹-Tyr-Ser-Met-Glu⁵-His-Phe-Arg-Trp-Gly¹⁰-Lys-Pro-Val-Gly-Lys¹⁵-Lys-Arg-Arg-Pro-Val²⁰-Lys-Val-Tyr-Pro-Ac (SEQ ID NO: 2) (а также идентичен на участке 1-24 мышиному АСТН («mACTH(1-24)»), где N и Ac обозначают амино- и карбокси концы молекулы соответственно.

Соединения-аналоги АСТН могут включать по меньшей мере аминокислотные остатки 1-19, более предпочтительно аминокислотные остатки 1-24 из hACTH (SEQ ID NO: 1), при наличии замещения одной или нескольких аминокислот. Предпочтительные соединения-аналоги АСТН включают SEQ ID NO: 2, модифицированную за счет замещения одной или нескольких аминокислот. Соединения-аналоги АСТН включают такие соединения, которые включают последовательности АСТН, при наличии одной или нескольких структурных модификаций, которые обеспечивают наличие одной или нескольких указанных ниже предпочтительных биологических функций аналога АСТН: (1) снижение секреции кортикостероида мембраной надпочечника в присутствии аналога АСТН в сравнении с немодифицированным АСТН, (2) снижение секреции кортикостероида мембраной надпочечника в присутствии эндогенного АСТН и (3) повышенную аффинность по связыванию с MC-2R при сниженной активации рецептора MC-2R в сравнении с немодифицированным АСТН.

Особенно предпочтительные соединения-аналоги АСТН содержат замещение одной или нескольких приведенных ниже аминокислот в сравнении с немодифицированной последовательностью человеческого АСТН: (1) замещение одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях 1-13, которые сохраняют аминокислоты в положениях 6-9, (2) замещение одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях 15-18, которое предотвращает или антагонизирует ферментативное расщепление по этим положениям, (3) замещение одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях 15-18, для которых не характерно соседствующее положение двуосновных аминокислот, (4) замещение или усечение одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях 20-24, которое приводит к увеличению периода полувыведения из сыворотки аналога АСТН и (5) замещение или предпочтительно усечение одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях 25-39, которое обеспечивает создание соединений-аналогов АСТН с увеличенным периодом полувыведения из сыворотки в сравнении с немодифицированным АСТН или в сравнении с другими соединениями-аналогами АСТН.

Аналог АСТН предпочтительно включает полипептид, описываемый приведенной ниже формулой (I):

(I) N-(AA^1-13)-(AA¹⁴)-(AA^15-18)-(AA¹⁹)-Ac,

где N- и Aс- указывают амино конец и карбокси конец полипептида соответственно, (AA^1-13)- указывает первую серию из тринадцати последовательных аминокислот или аминокислотных аналогов, (AA¹⁴)- указывает аминокислотный остаток, присоединенный к карбокси концу первой серии, (AA^15-18)- указывает вторую серию из четырех последовательных аминокислот, присоединенных к карбокси концу (AA¹⁴)-, (AA¹⁹)- обозначает аминокислотный остаток, присоединенный к карбокси концу второй серии.

Аналог АСТН формулы (I) предпочтительно также включает часть более крупной молекулы, присоединенную к карбокси концу (AA¹⁹)-Ас части. Аналог АСТН может также включать дополнительные аминокислоты, присоединенные к карбокси концу (Ас) молекулы формулы (I). Наиболее предпочтительно, аналоги АСТН включают в целом пять дополнительных аминокислот, присоединенных к Ас части молекулы формулы (I), и содержат в совокупности по меньшей мере 24 аминокислоты в составе аналога АСТН.

Аналоги АСТН могут включать аминокислотные последовательности немодифицированного АСТН, соответствующие формуле (I), предпочтительно включающие одно или несколько аминокислотных замещений. Дополнительные аминокислоты или аналоги аминокислот предпочтительно присоединяются к карбокси концу (AA¹⁹)- остатка молекулы формулы (I).

(AA^1-13)- часть молекулы формулы (I) обозначает последовательность из тринадцати аминокислот формулы (II):

(II) -AA¹-AA²-AA³-AA⁴-AA⁵-AA⁶-AA⁷-AA⁸-AA⁹-AA¹⁰-AA¹¹-AA¹²-AA¹³-,

которая представляет собой немодифицированную аминокислотную последовательность АСТН, описанную во втором ряду таблицы 1, при необязательном включении в нее одного или нескольких аминокислотных замещений, приведенных в третьем ряду в таблице 1. (AA^1-13)- часть немодифицированного человеческого АСТН имеет последовательность Ser-Тyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO. 3). Предпочтительно -AA⁶-AA⁷-AA⁸-AA⁹- часть молекулы формулы (II) имеет немодифицированную аминокислотную последовательность His-Phe-Arg-Trp (SEQ ID NO: 4), при необязательном наличии замещения одним или несколькими (D) аминокислотными аналогами.

В таблице 1 обозначение (D) относится к (D) энантиомеру указанных аминокислот: Nle относится к аминокислотному аналогу норлейцина или к другой аминокислоте с алкильной боковой цепью; Orn относится к орнитину или другой модифицированной аминокислоте со сходной боковой цепью; Dab относится к 2,4-диаминомасляной кислоте или аналогичной диаминокислоте; Dpr относится к 2,3-диаминопропионовой кислоте или другой диаминокислоте; (D) p-йод-Phe относится к стерической группе, такой как p-йод-модифицированной аминокислоте Phe; и (D)-I-naph-Ala относится к 1-наф-модифицированной аминокислоте (D)-Ala или к другой стерически модифицированной аминокислоте. Соединения-аналоги АСТН, которые включают замещения в немодифицированной части (AA^1-13) немодифицированного АСТН, предпочтительно включают один из необязательных аминокислотных остатков аналога АСТН, указанных под каждым конкретным остатком, приведенным в таблице 1. Например, немодифицированный АСТН содержит остаток Glu в положении AA⁵, который может быть необязательно замещен остатком (D)-Glu, Cys или Asp при образовании аналога АСТН. Аминокислотная последовательность формулы (II) может также включать одно или несколько аминокислотных замещений, соответствующих последовательностям, связывающимся с MC-2R, как описано Груби с соавт. (Hruby et al.) в патентах США NoNo. 4485039; 4457864; 4866038; 5731408; 5714576; 5049547; 4918055; 4649191 и 5674839, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок.

(AA¹⁴)-часть молекулы формулы (I) означает аминокислотный остаток, который представляет собой предпочтительно Gly или (D) Gly, хотя другие аминокислоты могут быть замещены в положении (AA¹⁴)-, которые сохраняют желательные биологические функции соединений-аналогов АСТН, такие как снижение секреции кортикостероида под действием аналога АСТН в сравнении с АСТН, снижение секреции кортикостероида эндогенным АСТН и/или связывания с MC-2R.

(AA^15-18)-часть молекулы формулы (I) обозначает последовательность из четырех аминокислот формулы (III):

(III) AA¹⁵-AA¹⁶-AA¹⁷-AA¹⁸-

(AA^15-18)-часть немодифицированного человеческого АСТН включает последовательность Lys-Lys-Arg-Arg (SEQ ID NO: 5), которая включает четыре соседствующих аминокислоты с основными боковыми цепями. Предпочтительно, соединения-аналоги АСТН включают замещение одного или нескольких аминокислотных остатков в формуле (III), которое предотвращает или противодействует ферментативному расщеплению в данных положениях. Кроме того, предпочтительные соединения-аналоги АСТН включают замещения одной или нескольких аминокислот в молекуле формулы (III), для которой не характерно наличие соседствующих аминокислот с основными боковыми цепями. AA¹⁵- и AA¹⁶- предпочтительно выбирают независимо друг от друга из группы, состоящей из: Lys, Ala, Gly и Val; AA¹⁷-AA¹⁸- предпочтительно выбирают из группы, состоящей из Arg, Ala, Gly и Vаl.

В одном аспекте одно или несколько аминокислотных замещений остатков AA¹⁶-AA¹⁷-АA¹⁸ в SEQ ID NO: 2 формулы (III) выбирают таким образом, что аминокислотные остатки 16, 17 и 18 в аналоге АСТН не включают двух соседствующих аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из Lys и Arg. Иными словами, в некоторых аналогах АСТН аминокислоты Lys и Arg не соседствуют друг с другом (то есть отсутствует ситуация, когда аргинин расположен рядом с лизином или наоборот) или друг с другом (то есть аргинин рядом с другим аргинином, или лизин рядом с другим лизином) в составе AA¹⁶-AA¹⁷-АA¹⁸ части пептидной последовательности. Вместо этого одна или несколько аминокислот в AA¹⁶-AA¹⁷-АA¹⁸- части замещаются любой аминокислотой или аналогом аминокислоты, отличными от Lys и Arg, что обеспечивает достижение приведенных ниже предпочтительных биологических функций аналога АСТН: (1) снижение секреции кортикостероида мембраной надпочечника в присутствии аналога АСТН в сравнении с немодифицированным АСТН, (2) снижение секреции кортикостероида мембраной надпочечника в присутствии эндогенного АСТН и (3) повышенную аффинность по связыванию с MC-2R при сниженной активации рецептора MC-2R в сравнении с немодифицированным АСТН. Например, соединения-аналоги АСТН могут включать остатки Ala, замещающие остатки в немодифицированном АСТН по одному или нескольким положениям в молекуле формулы (III). Соединения-аналоги АСТН могут включать замещение остатка в SEQ ID NO: 5 формулы (III) по Gly или другой аминокислоте с алкильной боковой цепью (например, Ala, Val, Leu, Ile или аналог аминокислоты, включающего боковую цепь, такой как Nle). Кроме того, предпочтительно, аналог АСТН может включать по меньшей мере один Ala и по меньшей мере один Arg остаток, замещающий любые две аминокислоты в положениях 15, 16, 17 или 18 в SEQ ID NO: 2. Необязательно замещения в аналоге АСТН по положениях 15, 16, 17 или 18 в SEQ ID NO: 2 образуют аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из Lys, Arg, Ala, Gly, Val, Leu, Ile, аналога аминокислоты, включающего алкильную боковую цепь, такого как Nle, Gln, Asn, Glu и Asp. Наиболее предпочтительно, аналоги АСТН включают аминокислотную последовательность формулы (III), выбранную из группы, состоящей из Lys-Arg-Ala-Ala- (SEQ ID NO: 6), Ala-Lys-Ala-Arg (SEQ ID NO: 7), Lys-Ala-Ala-Arg (SEQ ID NO: 8), Lys-Ala-Arg-Ala (SEQ ID NO: 9), Gln-Lys-Gln-Arg (SEQ ID NO: 10) и Ala-Ala-Ala-Ala- (SEQ ID NO: 11). Соединения-аналоги АСТН могут также включать замещение одного или нескольких аминокислотных остатков в положении 15, 16, 17 или 18 аминокислотой или аналогом аминокислоты, содержащими алкильную боковую цепь, включая Gly, Ala, Val, Leu, Ile или Nle. Аналоги АСТН включают другие аминокислоты, замещенные по одному или нескольким положениям в AA¹⁵-AA¹⁶-АA¹⁷-AA¹⁸, в которых сохраняется одна или несколько предпочтительных биологических функций аналога АСТН, таких как снижение секреции кортикостероида под действием аналога АСТН в сравнении с немодифицированным АСТН, снижение секреции кортикостероида эндогенным АСТН и/или связывание с MC-2R.

(AA¹⁹)- часть молекулы формулы (I) относится к аминокислотному остатку, который может представлять собой Pro, Trp или Ala, но предпочтительно Trp, Ala или другие аминокислоты, которые могут быть замещены по положению (AA¹⁹)- при сохранении одной или нескольких предпочтительных функций соединений-аналогов АСТН, таких как снижение секреции кортикостероида аналогом АСТН в сравнении с немодифицированным АСТН, снижение секреции кортикостероида эндогенным АСТН и/или связывание с MC-2R. Предпочтительно, соединения-аналоги АСТН содержат аминокислоту, отличную от пролина, замещающую положение (AA¹⁹)-. Более предпочтительно, аналоги АСТН включают вместо Pro аминокислоту Trp, замещающую положение (AA¹⁹)-. Немодифицированные пептидные последовательности АСТН, такие как hACTH и mACTH, включают остаток пролина в положении (AA¹⁹)-. Пролин имеет следующую химическую структуру:

Химическая структура пролина включает боковую цепь, которая формирует кольцевую структуру. Пролин часто встречается в конце альфа-спирали или в структурах типа цепей или петель. В отличие от других аминокислот, которые существуют практически исключительно в транс-форме полипептида, пролин может существовать в цис-конфигурации пептидов. Цис- и трасн-формы могут быть практически изоэнергетическими. Предпочтительно, (AA¹⁹)- представляет собой Trp в аналогах АСТН, включающих SEQ ID NO: 6-10 формулы (III), хотя также возможны соединения-аналоги АСТН, в которых (AA¹⁹)- представляет собой Pro.

Соответственно, особенно предпочтительные аналоги АСТН представляют собой модифицированные пептидные последовательности hACTH, mACTH или hACTH(1-24), в которых (AA¹⁴)-(AA^15-18)-(АA¹⁹)- выбирают из группы, состоящей из -Gly¹⁴-Lys¹⁵-Arg¹⁶-Ala¹⁷-Ala¹⁸-Trp¹⁹- (SEQ ID NO: 12); -Gly¹⁴-Ala¹⁵-Lys¹⁶-Ala¹⁷-Arg¹⁸-Pro¹⁹- (SEQ ID NO: 13); -Gly¹⁴-Lys¹⁵-Ala¹⁶-Ala¹⁷-Arg¹⁸-Pro¹⁹- (SEQ ID NO: 14); -Gly¹⁴-Lys¹⁵-Ala¹⁶-Arg¹⁷-Ala¹⁸-Pro¹⁹- (SEQ ID NO: 15); -Gly¹⁴-Gln¹⁵-Lys¹⁶-Gln¹⁷-Arg¹⁸-Pro¹⁹- (SEQ ID NO: 16) и -Gly¹⁴-Lys¹⁵-Arg¹⁶-Ala¹⁷-Ala¹⁸-Pro¹⁹- (SEQ ID NO: 17).

Аналог АСТН включает полипептид, описываемый формулой (IVa) или формулой (IVb):

(IVa) N-(AA^1-13)-(AA¹⁴)-(АA^15-18)-(AA¹⁹) (AA^20-24)-

(IVb) N-(AA^1-13)-(AA¹⁴)-(АA^15-18)-(AA¹⁹) (AA^20-24)-Ac,

где N- указывает N-концевую часть полипептида, Aс- указывает карбокси конец полипептида. Аналоги АСТН формулы (IVa) или формулы (IVb) включают N-(AA^1-13)-(AA¹⁴)-(АA^15-18)-(AA¹⁹)-, описанную выше применительно к формуле (I), и также включают (AA^20-24)- часть, присоединенную к карбокси концу аминокислотной последовательности формулы (I). (AA^20-24)- часть формулы (IVa) и формулы (IVb) обозначает последовательность из пяти аминокислот формулы (V):

(V) AA²⁰-AA²¹АA²²AA²³-AA²⁴-.

(AA^20-24)- часть немодифицированного человеческого АСТН включает последовательность Val-Lys-Val-Trp-Pro (SEQ ID NO: 18). Предпочтительно, соединения-аналоги АСТН включают замещение одного или нескольких аминокислотных остатков в формуле (V), которые увеличивают период полувыведения из сыворотки аналогов АСТН. Например, аналог АСТН может включать последовательность, соответствующую формуле (V): Ala-Ala-Ala-Ala-Ala- (SEQ ID NO: 19).

Особенно предпочтительный аналог АСТН формулы (IVa) включает последовательность hACTH(1-24), содержащую замещение в -Ala¹⁵-Ala¹⁶-Ala¹⁷-Ala¹⁸-части молекулы формулы (III) за счет SEQ ID NO: 6. Одно особенно предпочтительное соединение формулы (IVa) представляет собой аналог АСТН (KKRRP15-19KRAAW) mACTH(1-24), имеющий последовательность: N-Ser¹-Tyr-Ser-Met-Glu⁵-His-Phe-Arg-Trp-Gly¹⁰-Lys-Pro-Val-Gly-Lys¹⁵-Arg-Ala-Ala-Trp-Val²⁰-Lys-Val-Tyr-Pro-Ac (SEQ ID NO: 20), также обозначаемый как «AT814». Другие особенно предпочтительные соединения-аналоги АСТН состоят по существу из пептида SEQ ID NO: 2 с замещениями аланином или глютамином одного или нескольких аминокислотных остатков по положениям 15, 16, 17 или 18 и/или с замещением аминокислотных остатков по положениям 20, 21, 22, 23 или 24 аланином, например, как описано в работе Коста с соавт. (Costa, JL et al., «Mitational analysis of evolutionary concerved ACTH residues» Gen Comp Endocrinol. Mar; 136(1): 12-6 (2004)), которая включена в настоящее описание полностью в качестве ссылки.

В третьем аспекте первого варианта аналог АСТН включает полипептид, описываемый формулой (VIa) или формулой (VIb):

(VIa) N-(AA^1-13)-(AA¹⁴)-(АA^15-18)-(AA¹⁹) (AA^20-24)-(AA^25-39)-

(VIb) N-(AA^1-13)-(AA¹⁴)-(АA^15-18)-(AA¹⁹) (AA^20-24)-(AA^25-39)-Ac,

где N- указывает амино-концевую часть полипептида и Aс- указывают карбокси-конец полипептида. Аналоги АСТН формулы (IVa) или формулы (IVb) включают N-(AA^1-13)-(AA¹⁴)-(АA^15-18)-(AA¹⁹)-(AA^20-24)-, описанную выше применительно к формуле (IVa), а также включают (AA^25-39)- часть, присоединенную к карбокси-концу аминокислотной последовательности формулы (IVa). Формула (VIa) может необязательно включать дополнительные химические структуры, присоединенные к AA³⁹ остатку, где АА³⁹ остаток формирует карбокси-конец структур формулы (VIb). (AA^25-39)- часть формулы (VIa) и формулы (VIb) обозначает последовательность из пятнадцати аминокислот формулы (VII):

(VII) AA²⁵-AA²⁶-АA²⁷-AA²⁸-AA²⁹-AA³⁰-AA³¹AA³²-AA³³-AA³⁴-AA³⁵-AA³⁶-AA³⁷-AA³⁸-АА³⁹

(AA^25-39)- часть немодифицированного человеческого АСТН включает последовательность Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe (SEQ ID NO: 21). Предпочтительно, соединения-аналоги АСТН включают замещение одного или нескольких аминокислотных остатков в молекуле формуле (VII) или усечение по одному или нескольким аминокислотным остаткам на карбокси-конце молекулы формулы (VII), что обеспечивает получение соединений-аналогов АСТН с желательными пролонгированными свойствами по высвобождению. Например, аналог АСТН может включать последовательность, соответствующую формуле (VII), содержащую немодифицированную последовательность SEQ ID NO: 10, необязательно модифицированную за счет замещения Lys по положению AA³⁰ и/или замещения Arg по положению AA³⁶.

Варианты по замещению включают такие варианты, в которых по меньшей мере один остаток в аминокислотной последовательности был удален и другой остаток был встроен на его место. Такие замещения могут быть осуществлены в соответствии с приведенной ниже таблицей 2, когда желательно осуществить тонкую модуляцию характеристик белка. В таблице 2 показаны аминокислоты, которые могут замещать исходную аминокислоту в белке с достижением такого варианта замещения и которые рассматриваются в данной области как консервативное замещение. Соединения-аналоги АСТН включают соединения с одним или большим числом консервативных замещений, которые сохраняют одну или несколько приведенных ниже предпочтительных биологических функций аналогов АСТН: (1) снижение секреции кортикостероида мембраной надпочечника в присутствии аналога АСТН в сравнении с немодифицированным АСТН, (2) снижение секреции кортикостероида мембраной надпочечника в присутствии эндогенного АСТН, (3) повышенную аффинность по связыванию с MC-2R при сниженной активации рецептора MC-2R в сравнении с немодифицированным АСТН.

Таблица 2
Исходный остаток	Консервативное замещение
Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Ser Thr Trp Tyr Val	ser lys gln, his glu ser asn asp pro asn; gln leu; val ile; val arg; gln; glu leu; ile met; leu; tyr thr ser tyr trp; phe ile; leu

Существенное изменение функций в иммунологической картине осуществляют при выборе замещений, которые будут менее консервативными, чем замещения, показанные в таблице 2, например, за счет выбора остатков, которые отличаются более значительно по своему эффекту на сохранение: (а) структур полипептидного скелета в области замещения, например, в виде конформации листа или спирали; (b) заряда или гидрофобности молекулы в сайте-мишени; или (с) общего объема боковой цепи. Замещения, которые в целом рассматриваются как продуцирующие наибольшие изменения в белковых свойствах, представляют собой такие замещения, при которых: (а) гидрофильный остаток, например серильный или треонильный, замещают на (или посредством введения другого остатка) гидрофобный остаток, например лейцильный, изолейцильный, фенилаланильный, валильный или аланильный; (b) цистеин или пролин замещают на (или посредством введения другого остатка) другой остаток; (с) остаток, имеющий боковую цепь с положительным зарядом, например лизильный, аргинильный или гистидильный, замещают на (или посредством введения другого остатка) остаток с отрицательным зарядом, например на глутамильный или аспартильный; или (d) остаток с объемной боковой цепью, например фенилаланильный, замещают на (или посредством введения другого остатка) остаток, не имеющий боковой цепи, например на глицильный остаток.

Предпочтительные для аналога АСТН биологические функции в случае соединений-аналогов АСТН могут быть измерены любым подходящим способом, но предпочтительно их оценивают при проведении тестов, описанных ниже.

Соединения-аналоги АСТН со сниженной функцией АСТН

Во втором варианте осуществления настоящего изобретения аналоги АСТН представляют собой модифицированные пептиды АСТН, которые функционируют в направлении снижения секреции кортикостероида мембраной надпочечника в присутствии аналога АСТН в сравнении с немодифицированным АСТН. Структуру аналогов АСТН предпочтительно выбирают в соответствии с одной или несколькими приведенными выше структурными формулами. Соединения-аналоги АСТН могут характеризоваться сниженной АСТН-опосредованной секрецией кортикостерона в кровь, например, при измерении по снижению уровня кортикостероида в крови субъекта после введения аналога АСТН. Аналоги АСТН предпочтительно демонстрируют по меньшей мере 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% снижение уровней кортикостерона в сыворотке в сравнении со сравнимым введением немодифицированного пептида АСТН, по результатам измерения в тесте на индукцию кортикостероида в сыворотке in vivo.

Тест in vivo по индукции кортикостероидов в сыворотке позволяет измерить уровень кортикостероида или кортикостерона в сыворотке крови субъекта. Более конкретно, тест in vivo на индукцию кортикостероида в сыворотке включает следующие стадии: вначале мыши, в качестве субъекта, вводят агент, подавляющий эндогенную продукцию АСТН, такой как дексаметазон, вводимый внутрибрюшинной инъекцией; во-вторых, после некоторого периода ожидания, нужного для подавления продукции эндогенного АСТН (примерно 1,5-2,0 часа), указанной мыши вводят исследуемое соединение с использованием соответствующего метода, такого как внутрибрюшинная или подкожная инъекция; и в-третьих, после некоторого периода ожидания (например, в течение 1 часа) для достижения действия исследуемого инъецированного соединения у субъекта отбирают образец крови и определяют сывороточный уровень кортикостерона в рамках соответствующего способа, например, по методу конкурентного радиоиммуноанализа с использованием набора для РИА с ¹²⁵I (ICN, Costa Mesa, CA). В примере 1 подробно описан тест на мышах in vivo на индукцию кортикостероида в сыворотке.

Секрецию кортикостероида или кортикостерона, индуцированную in vivo c соединением-аналогом АСТН, сравнивают с уровнем секреции кортикостероида, продуцируемого немодифицированным соединением АСТН, путем измерения уровня кортикостероида в сыворотке после введения АСТН или аналога АСТН, в качестве исследуемых соединений. На фиг.1 показаны результаты теста in vivo на мышах на индукцию кортикостероида надпочечника при использовании mACTH(1-24) и различных аналогов АСТН, в качестве исследуемых соединений, в соответствии с методикой примера 1. Соединения-аналоги АСТН со сниженной функцией идентифицируют путем измерения уровня кортикостерона в рамках стандартного радиоиммуноанализа (РИА), проводимого в образцах крови, собранной через один час после введения mACTH(1-24) или соединения-аналога АСТН мышам после проведения супрессии дексаметазоном. На фиг.1 эффективность различных пептидов-аналогов АСТН выражается в виде процента индукции кортикостерона, где значение для мышиного АСТН принято за 100%. На графике 10 показан процент индукции кортикостерона 12 для АСТН и для девяти образцов 14 аналогов АСТН. Процент индукции кортикостерона 12 для соединений-аналогов АСТН в образцах 2-10 показан в виде процента концентрации сывороточного кортикостерона 20, измеренного для немодифицированного mACTH(1-24) в тесте in vivo на индукцию кортикостероида надпочечника в сыворотке. Структурные модификации и идентифицированное снижение процентного содержания в сыворотке для образцов 2-10 из фиг.1 показаны ниже в таблице 3.

Таблица 3
Образец	Метки по фиг.1	Структурная модификация	Процентное снижение уровня кортикостероида в сыворотке
2	20	(V26F, E30K)mACTH	18,3%
3	25	(P19W, K21E, Y23R)mACTH	36,5%
4	30	(E30K, P36R)mACTH	41,5%
5	35	(PVKVYP19-24AAAAA)mACTH	51%
6	40	(V26F, P36R)mACTH	59,3%
7	45	(P19W, K21E)mACTH	61,1%
8	50	(P19W, K21E, delY23)mACTH	76,0%
9	55	(P19W, K21A)mACTH	83,4%
10	60	(KKRRP15-19KRAAW)mACTH	100%

Снижение индукции кортикостерона, вызываемой эндогенным АСТН

В третьем варианте настоящего изобретения аналоги АСТН представляют собой модифицированные пептиды АСТН, которые функционируют в направлении снижения секреции кортикостероида мембраной надпочечника в присутствии эндогенного АСТН. При введении соединения-аналоги АСТН, до или вместе с АСТН, могут продуцировать 10-100% снижение уровней сывороточного кортикостероида. Предпочтительно, соединения-аналоги АСТН обеспечивают снижение сывороточных уровней кортикостероида, по данным определения в тесте in vivo ингибирования сывороточного кортикостероида, примерно на 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% в сравнении с введением одного АСТН, по результатам измерения в тесте in vivo ингибирования сывороточного кортикостероида, таком, например, как тест, описанный в примере 2. Репрезентативные соединения-аналоги АСТН, которые ингибируют продукцию гормона надпочечника, индуцируемую эндогенным АСТН, идентифицируют при проведении серии тестов in vivo по ингибированию кортикостероида в сыворотке. Аналоги АСТН могут вводиться сами по себе, до введения АСТН или одновременно с АСТН, в сочетании с ним.

Тест in vivo по ингибированию сывороточного кортикостероида позволяет определить уровень кортикостероида или кортикостерона в кровотоке у субъекта после введения соединения, обладающего первой указанной активностью по продуцированию кортикостероида, и исследуемого соединения. Соединение, обладающее биологической активностью по продуцированию кортикостероида, может быть любым соединением, в отношении которого известно, что оно приводит к выявляемому повышению продукции кортикостероида. Исследуемое соединение может вводиться до соединения, продуцирующего кортикостероид, в сочетании с соединением, продуцирующим кортикостероид, и/или после соединения, вызывающего продукцию кортикостероида. Соединение, продуцирующее кортикостероид, представляет собой предпочтительно АСТН. Но может также быть аналогом АСТН с известной биологической активностью в отношении продукции кортикостероида. При проведении серии тестов in vivo по ингибированию кортикостероида в сыворотке с использованием исследуемых соединений-аналогов АСТН, могут быть идентифицированы аналоги АСТН, которые ингибируют продукцию кортикостероида относительно используемого соединения, продуцирующего кортикостероид. Предпочтительно, аналоги АСТН, идентифицированные таким образом, ингибируют продукцию кортикостероида в присутствии эндогенного немодифицированного АСТН.

Тест in vivo по ингибированию кортикостероида в сыворотке может включать последовательное введение исследуемого соединения и соединения, продуцирующего кортикостероид, с соблюдением следующих стадий: вначале мыши, в качестве субъекта, вводят агент, подавляющий эндогенную продукцию АСТН, такой как дексаметазон, вводимый внутрибрюшинной инъекцией; во-вторых, после некоторого периода ожидания для достижения супрессии продукции эндогенного АСТН (примерно 1,5-2,0 часа), указанной мыши вводят исследуемое соединение с использованием соответствующего метода, такого как внутрибрюшинная инъекция; и в-третьих, после некоторого периода ожидания (например, в течение 1 часа) для достижения действия исследуемого инъецированного соединения мыши может быть введено соединение с активностью по продуцированию кортикостероида с использованием подходящего для этого способа, такого как внутрибрюшинная инъекция; и в-четвертых, после некоторого периода ожидания для проявления биологической активности обоих введенных соединений (например, в течение 1 часа) у субъекта отбирают образец крови и соответствующим методом определяют сывороточный уровень кортикостерона, например, в рамках конкурентного радиоиммуноанализа с использованием набора для РИА с ¹²⁵I (ICN, Costa Mesa, CA). Необязательно стадии 2 и 3 могут быть проведены в обратном порядке (вначале вводят соединение, продуцирующее кортикостероид, и затем вводят исследуемое соединение). Тест in vivo по ингибированию кортикостероида в сыворотке может также включать совместное введение исследуемого соединения и соединения, продуцирующего кортикостероид, с соблюдением следующих стадий: вначале мыши, в качестве субъекта, вводят агент, подавляющий эндогенную продукцию АСТН, такой как дексаметазон, вводимый внутрибрюшинной инъекцией; во-вторых, после некоторого периода ожидания для достижения супрессии продукции эндогенного АСТН (например, 1,5-2,0 часа) вводят совместно соединение, продуцирующее кортикостероид, и исследуемое соединение подходящим способом указанной мыши, например, путем внутрибрюшинной инъекции; и в третьих, после некоторого периода ожидания (например, в течение 1 часа) для проявления биологической активности обоих введенных соединений у субъекта отбирают образцы крови и определяют соответствующим методом уровень кортикостерона в сыворотке, например, в рамках метода конкурентного радиоиммуноанализа с использованием набора для РИА с ¹²⁵I (ICN, Costa Mesa, CA). В некоторых вариантах первая стадия в любом тесте in vivo по ингибированию сывороточного кортикостероида также может быть заменена определением исходного уровня эндогенного кортикостероида или кортикостерона у субъекта по процедуре стадии 4, вместо введения агента, подавляющего АСТН. В примере 2 подробно описан тест in vivo на мышах по ингибированию кортикостероида в сыворотке.

Проводят серию отдельных тестов in vivo по ингибированию кортикостероида в сыворотке для идентификации соединений-аналогов АСТН, которые ингибируют in vivo продукцию гормона надпочечника АСТН. Сывороточные уровни кортикостерона у мышей после супрессии дексаметазоном измеряют по процедуре примера 2 после введения (1) АСТН (соединения, продуцирующего кортикостероид), (2) аналога АСТН (исследуемого соединения) с последующим введением АСТН, (3) сочетания АСТН и аналога АСТН и (4) одного аналога АСТН. В таблице 4 показан уровень сывороточного кортикостероида, определенный у мышей в виде функции времени введения.

Таблица 4. Совместное введение АСТН и аналога АСТН
	Время
Образец	0 минут	90 минут	120 минут	180 минут
Носитель	Дексаметазон (вводят животным во всех группах)		Носитель	0±0 нг/мл
АСТН			mACTH(1-24)	500±76 нг/мл
АТ90-ACTH120		(KKRRP15-19KRAAW) mACTH(1-24)	mACTH(1-24)	175±27 нг/мл
(AT+ACTH)120			(KKRRP15-19KRAAW) mACTH(1-24) + mACTH(1-24)	51±8 нг/мл
AT			(KKRRP15-19KRAAW) mACTH(1-24)	7±7 нг/мл

В экспериментах, описанных в таблице 4, дексаметазон вначале вводят мышам в момент времени =0 в рамках пяти отдельных тестов in vivo по определению уровня сывороточного кортикостероида, как описано в примере 2. Функцию «носителя» выполняет жидкий носитель, который вводят через 120 минут после инъекции дексаметазона, при этом по результатам определения в образце крови, взятом через один час, не выявляется кортикостероид. В качестве показателя «АСТН» указывают АСТН, вводимый через 120 минут после инъекции дексаметазона, что приводит к достижению уровня 500±76 нг/мл кортикостерона, выявляемого в образце крови через один час. Показатели «АТ90-ACTH120», аналог АСТН (KKRRP15-19KRAAW)mACTH(1-24) относятся к введению указанных соединений через 1,5 часа после инъекции дексаметазона, АСTH(1-24) вводят через 30 минут и определяют сывороточный уровень кортикостерона, равный 175±27 нг/м, в образце крови, взятом через один час. Показатели «(AT+ACTH)120», аналог АСТН (KKRRP15-19KRAAW)mACTH(1-24) («AT814») относятся к введению их вместе с mACTH(1-24) через 120 минут после инъекции дексаметазона с последующим определением сывороточного уровня кортикостерона, равного 51±8 нг/м, в образце крови, взятом через один час. Показатель «AT» относится к введению аналога АСТН (KKRRP15-19KRAAW)mACTH через 120 минут после инъекции дексаметазона, что приводит к выявляемому незначительному уровню кортикостерона в сыворотке, равному 7±7 нг/м.

На фиг.2 показаны результаты, приведенные в таблице 2, в виде процента от уровней кортикостерона, определенного через 180 минут после инъекции дексаметазона, как описано в примере 2. На графике 100 показана процентная индукция кортикостерона 112 для АСТН и четырех образцов 114, как описано в таблице 2, где уровень кортикостерона, измеряемый при введении АСТН 120, принят за 100%. Показатель «АT90-ACTH120» 140 относится к введению аналога АСТН за 30 минут до введения АСТН, что приводит примерно к 65% снижению сывороточных уровней кортикостерона в образцах крови, взятых через один час после введения АСТН. Показатель «(AT+ACTH)120» 160 относится к конкурентному введению аналога АСТН вместе с АСТН, что приводит примерно к 90% снижению сывороточных уровней АСТН в образцах крови, взятых через один час. Как видно по данным показателя «АТ» 180, а также по образцу 10 из таблицы 1, введение одного аналога АСТН снова приводит к примерно 90-100% снижению сывороточных уровней кортикостерона в образцах крови, взятых через один час. Образец, содержащий только «носитель», не показан на фиг.2.

Тест по связыванию с рецептором АСТН надпочечника

В четвертом варианте осуществления настоящего изобретения аналоги АСТН представляют собой модифицированные АСТН пептиды, которые функционируют в направлении связывания с рецепторами АСТН надпочечника, такими как рецептор MC-2R, предпочтительно путем повышения аффинности по связыванию с MC-2R и при снижении активации рецептора MC-2R в сравнении с немодифицированным АСТН.

Предпочтительные соединения-аналоги АСТН связываются с мембранами надпочечников с большей аффинностью, чем эндогенные немодифицированные АСТН, и способны замещать немодифицированный АСТН в конкурентном бессывороточном тесте in vitro на связывание с мембраной надпочечника (пример 3). Уровень замещения соединениями-аналогами АСТН предпочтительно составляет по меньшей мере 20% от уровня связывания АСТН с препаратами мембран надпочечников, по данным конкурентного бессывороточного теста in vitro на связывание с мембраной надпочечника. Более предпочтительно, соединения-аналоги АСТН могут обладать повышенной в 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 раз аффинностью в отношении изолированной мембраны надпочечника в сравнении с немодифицированным АСТН.

Соединения-аналоги АСТН, которые связываются с мембраной надпочечника с более высокой аффинностью, чем эндогенные немодифицированные АСТН, и которые способны замещать немодифицированные АСТН, могут быть идентифицированы в рамках конкурентного бессывороточного теста in vitro на связывание с мембраной надпочечника (пример 3). На фиг.3 показаны результаты конкурентного бессывороточного теста in vitro на связывание с мембраной надпочечника, проведенного по методу примера 3, с использованием репрезентативного аналога АСТН - АТ814, включающего SEQ ID NO: 20 («АТ814»). На графике 200 показаны результаты измерения на гамма-счетчике препаратов мембран надпочечников для образца 212 (число импульсов в минуту, имп/мин), инкубированного с радиоактивным АСТН. Более высокий показатель имп/мин свидетельствует о наличии повышенных количеств радиоактивно меченого соединения. В колонке 210 показано фоновое значение для результатов измерения без добавления мембраны надпочечника. В колонке 220 показан уровень радиоактивно меченного немодифицированного mACTH(1-24), выявляемый после объединения изолированной мембраны надпочечника только с радиоактивно меченным mACTH(1-24) на 2 часа (в отсутствие конкурентного связывания). В столбцах 230, 240 и 250 показаны результаты анализа в тесте на конкурентное связывание применительно к связыванию не меченного радиоактивностью («холодного») mACTH(1-24), замещающего радиоактивно меченный mACTH(1-24) из изолированных мембран надпочечников (показанного в колонке 220), за счет конкурентного связывания с рецепторами, такими как MC-2R, на мембране надпочечника. Конкретно, в колонке 230 показано снижение уровня радиоактивно меченного mACTH(1-24), выявляемого после объединения радиоактивно меченных изолированных мембран надпочечников с 10 нМ «холодным» mACTH(1-24); в колонке 240 показано дополнительное снижение уровня радиоактивно меченного mACTH(1-24), связывающегося с радиоактивно меченными изолированными мембранами надпочечников после добавления 10 нМ «холодного» mACTH(1-24), и в колонке 250 показано дальнейшее снижение уровня радиоактивно меченного mACTH(1-24), присоединенного к радиоактивно меченными изолированным мембранам надпочечников после объединения препарата изолированных мембран надпочечников с 100 нМ «холодного» mACTH(1-24). Сниженные уровни радиоактивно меченного mACTH(1-24), выявляемые в виде повышения концентрации «холодного» mACTH(1-24), указывают на вытеснение радиоактивно меченного mACTH(1-24) «холодным» mACTH(1-24) из рецептора MC-2R.

Конкурентный бессывороточный тест in vitro на связывание с мембраной надпочечника повторяют с использованием «холодного» (не меченного радиоактивностью) аналога АСТН, АТ814, описываемого SEQ ID NO: 20, вместо mACTH(1-24). В колонках 235, 245 и 255 показаны результаты конкурентных тестов на связывание не меченного радиоактивностью АТ814, определяемые вытеснением радиоактивно меченного mACTH(1-24) из изолированных мембран надпочечников (показано в колонке 220) за счет конкурентного связывания «холодного» АТ814 в концентрациях 10 нМ (колонка 235), 100 нМ (колонка 245) и 1000 нМ (колонка 255). Сниженные уровни радиоактивно меченного АТ814, выявляемого в виде повышения концентрации «холодного» АТ814, указывает на замещение радиоактивно меченного mACTH(1-24) «холодным» АТ814. Конкретно, результаты, приведенные в графе 200, показывают, что АТ814 обладает повышенной аффинностью по связыванию с мембраной надпочечника, которая примерно от 3 до примерно 4 раз превышает соответствующую величину для радиоактивно меченного mACTH(1-24). Повышенная аффинность по связыванию АТ814 с мембраной надпочечника может быть показателем наличия более высокой аффинности по связыванию с рецептором MC-2R.

Анализ соединений-аналогов АСТН in vitro

В пятом варианте осуществления настоящего изобретения соединения-аналоги АСТН могут снижать индукцию кортикостерона немодифицированным АСТН в изолированной ткани in vitro. В случае объединения с изолированными мембранами надпочечников соединения-аналоги АСТН предпочтительно приводят к 10-100% снижению уровней кортикостероида в бессывороточных средах. Предпочтительно соединения-аналоги АСТН обеспечивают снижение сывороточных уровней кортикостероида, по результатам определения в бессывороточном тесте на ингибирование секреции кортикостероида мембраной надпочечников in vitro, примерно на 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% в сравнении с введением одного немодифицированного АСТН (пример 4). Репрезентативные соединения-аналоги АСТН, которые ингибируют образование гормона надпочечника, индуцируемое воздействием на изолированную мембрану надпочечника немодифицированного АСТН, идентифицируют при проведении серии бессывороточных тестов in vitro по ингибированию кортикостерона надпочечника, что предполагает прямое воздействие соединений-аналогов АСТН на продукцию кортикостерона надпочечника.

Проводят серию отдельных тестов в бессывороточной среде in vitro по ингибированию кортикостероида надпочечников для идентификации аналогов АСТН, которые ингибируют АСТН-индуцированную продукцию гормона надпочечника in vitro. Концентрацию кортикостерона определяют по процедуре примера 4 в бессывороточной культуральной среде, содержащей изолированные мембраны надпочечников и немодифицированный АСТН, аналог АСТН- АТ814 (SEQ ID NO: 20) или сочетание АСТН и АТ814, взятые в концентрации по 100 нг/мл, каждый. В таблице 3 показаны уровни кортикостероида, определенные в серии бессывороточных тестов in vitro на ингибирование кортикостерона надпочечника с использованием изолированных мембран надпочечников мыши. Уровни кортикостерона определяют, отбирая образцы через 2,0 часа после помещения мембран надпочечников в бессывороточную среду М199, и каждое значение кортикостерона, показанное в таблице 5, представляет собой среднее значение для пяти образцов.

Таблица 5. Объединенное введение АСТН и аналога АСТН
Образец	0 часов	0,5 часа	2,5 часа
Среда М199	Инкубируют ткань в бессывороточной среде М199 (вносят во все образцы)		278 мг/мл
ACTH		АСТН	600 мг/мл
AT-814		AT814	290 мг/мл
ACTH+AT814		АСТН+AT814	396 мг/мл

Результаты, показанные в таблице 5, получают, помещая изолированные клапаны надпочечников в бессывороточную среду М199 (Invitrogen) на 30 минут, как описано в примере 4. Показатель «среда М199» относится к варианту, когда мембрану надпочечника погружают в бессывороточную среду М199 на 2,0 часа после исходного 30-минутного периода (всего 2,5 часа в целом) до измерения уровня кортикостерона в клетках по методике стандартного радиоиммуноанализа РИА. Показатель «АСТН» относится к варианту, когда немодифицированный АСТН добавляют к среде М199, что приводит к достижению уровня кортикостерона примерно 600 мг/мл, выявляемого в культуральной среде через два часа. Показатель «АТ814» относится к варианту, когда аналог АСТН (KKRRP15-19KRAAW)mACTH(1-24) (SEQ ID NO: 20) добавляют к среде М199, что приводит к достижению уровня кортикостерона примерно 290 мг/мл, выявляемого в культуральной среде через два часа. Показатель «ACTH+AT-814» относится к варианту, когда 100 нг/мл аналога АСТН АТ814 (SEQ ID NO: 20) и 100 нг/мл немодифицированного АСТН добавляют вместе к среде М199, что приводит к достижению уровня кортикостерона примерно 396 мг/мл, выявляемого в культуральной среде через два часа. На фиг.4 приведен график 300, иллюстрирующий индукцию кортикостерона 302, по данным таблицы 3, в виде процента от количества АСТН 310, определенного в культуральной среде М199 для образца «АСТН» 310, образца «АТ814» 320 и образца «ACTH-AT-814» 330, как описано выше и в примере 4. Образец «среда М199» не показан на фиг.2. Что касается фиг.4, то добавление АТ814 к мембране надпочечника в бессывороточной среде М199 позволяет осуществить лишь незначительную индукцию кортикостерона, и добавление сочетания равных количеств аналога АСТН АТ814 и немодифицированного АСТН снижает индукцию кортикостерона примерно на 65% в сравнении с добавлением одного немодифицированного АСТН.

Анализ соединений-аналогов АСТН in vivo

Соединения-аналоги АСТН с увеличенным периодом полувыведения из сыворотки могут быть предпочтительными для использования в ряде направлений. Соединения-аналоги АСТН могут необязательно включать одно или несколько аминокислотных замещений или усечений, которые позволяют увеличить период полувыведения из сыворотки аналога АСТН в сравнении с немодифицированным АСТН или с другим аналогом АСТН. Например, соединения-аналоги АСТН могут включать одно или несколько аминокислотных замещений в положениях аминокислот 25-39 в немодифицированной последовательности АСТН, которая увеличивает период полувыведения из сыворотки соединения в сравнении с последовательностью АСТН. Предпочтительные соединения-аналоги АСТН характеризуются периодом полувыведения из сыворотки, который превышает данный показатель для немодифицированного АСТН. Период полувыведения АСТН из крови составляет менее чем примерно 20 минут. В этой связи особенно предпочтительные соединения-аналоги АСТН имеют период полувыведения из сыворотки, равный примерно 20, 30, 40 или 50 минут или выше.

В шестом варианте осуществления настоящего изобретения предлагаются аналоги АСТН с увеличенным периодом полувыведения из сыворотки. Аналоги АСТН с увеличенным периодом полувыведения могут быть идентифицированы как аналоги, обладающие первой активностью, определяемой по сывороточной концентрации кортикостероида, которая будет выше, чем вторая активность, определяемая по концентрации кортикостероида, выявляемой в тесте in vitro в бессывороточной среде, где активность in vivo определяют в рамках теста по ингибированию кортикостероида надпочечника в сыворотке, описанного в примере 1, и активность in vitro определяют в бессывороточном тесте in vitro на ингибирование кортикостероида надпочечника, описанном в примере 4.

Поскольку аминокислотные замещения в других положениях могут также увеличить период полувыведения из сыворотки аналогов АСТН в ряде случаев, то некоторые варианты настоящего изобретения относятся к способу увеличения периода полувыведения из сыворотки аналога АСТН за счет модификации одной или нескольких аминокислот в положениях 20-24 в молекуле АСТН, включая hACTH или mACTH. На фиг.5 показан график, сравнивающий активность in vivo (серые прямоугольники) и активность in vitro (белые прямоугольники) семи соединений-аналогов АСТН 410, 420, 430, 440, 450, 460 и 470. Для всех семи соединений-аналогов АСТН была определена активность in vivo с использованием методики примера 1 и определена активность in vitro с использованием методики примера 4. Результаты представлены в виде диаграммы, показывающей уровень индукции кортикостерона 402, определяемый как процент относительно соответствующего значения для последовательности mACTH (1-24) (SEQ ID NO: 2). Как видно на фиг.5, образец 460, обозначенный как «Ala19-24», относится к аналогу АСТН (AAAAA20-24VKVYP)АСТН(1-24), включающему замещение Ala остатков по каждой из аминокислот в положениях 19-24 в mACTH. Образец 460 демонстрирует увеличенный период полувыведения из сыворотки, измеряемый как показатель in vivo 462, относительно показателя активности in vitro 464, определяемой для данного соединения, который оказался примерно на 50% выше, чем активность in vitro немодифицированного mACTH. Кроме того, активность in vivo аналога АСТН 460 (AAAAA20-24VKVYP)ACTH(1-24) была выше относительно и mACTH, и других аналогов АСТН: 410, 420, 430, 440, 450 и 470. Приведенные результаты позволяют полагать, что аминокислотные остатки в положениях 20-24 могут играть соответствующую роль в определении периода полувыведения из сыворотки соединения-аналога АСТН. Соединения-аналоги АСТН, включающие одно или несколько аминокислотных замещений в положении 20-24 в АСТН, особенно предпочтительны для целей увеличения периода полувыведения из сыворотки относительно АСТН.

Желательно также, чтобы соединения-аналоги АСТН могли включать аминокислотные замещения, которые увеличивают период полувыведения из сыворотки без существенного повышения или, предпочтительно, при снижении индукции кортикостерона аналогом АСТН, по результатам измерения in vivo (пример 1) или in vitro (пример 4). Например, индукция кортикостерона в результате замещений положений 15-19 в аналогах АСТН 410, 420, 430, 440, 450 и 470 снижает и in vivo, и in vitro индукцию активности кортикостерона аналогами АСТН в сравнении с немодифицированным mACTH(1-24). В частности, аналог АСТН 410 представляет собой аналог АСТН (K15A, R17A)mACTH(1-24), который демонстрирует in vitro показатель активности 414, который выше, чем показатель его активности in vivo 412; аналог АСТН 420 представляет собой аналог АСТН (K16A, R17A)mACTH(1-24), который демонстрирует in vitro показатель активности 424, который выше, чем показатель его активность in vivo 422; аналог АСТН 430 представляет собой аналог АСТН (K15A, R18A)mACTH(1-24), который демонстрирует in vitro показатель активности 434, который выше, чем показатель его активности in vivo 432; аналог АСТН 440 представляет собой аналог АСТН (K15Q, R17Q)mACTH(1-24), который демонстрирует in vitro показатель активности 444, который выше, чем показатель его активности in vivo 442, и аналог АСТН 470 представляет собой аналог АСТН (P19W, K21A)mACTH(1-24), который демонстрирует in vitro показатель активности 474, который выше, чем показатель его активности in vivo.

Методы скрининга

В седьмом варианте осуществления изобретения используются методы скрининга аналогов АСТН, которые могут применяться для блокирования избытка АСТН, при поддержании тонуса надпочечника. Могут быть получены и введены пациенту различные аналоги АСТН для оценки индукции кортизона in vivo.

Специфичность распознавания молекулярной структуры для некоторых соединений (например, распознавание антигенов антителами), сопровождаемая образованием стабильного комплекса, может служить в качестве основы для аналитического иммунологического теста в растворе и для иммуносенсорного выявления на интерфейсах твердых поверхностей. Указанные аналитические методы могут представлять собой тесты по связыванию с лигандом, основанные на выявлении продуктов реакции связывания с лигандом между целевым продуктом (то есть соединением, которое связывается с рецепторами MC-2R) и высокоспецифичным реагентом по связыванию.

В некоторых случаях в тестах применяются альтернативные соединения, связывающие аналитические компоненты, такие как аптамеры, для анализа на основе связывания с лигандом с целью достижения особенно чувствительного скрининга. Аптамеры представляют собой одноцепочечные олигонуклеотидные последовательности ДНК или РНК со способностью распознавать различные молекулы-мишени с высокой аффинностью и специфичностью. Такие лиганд-связывающие олигонуклеотиды имитируют свойства антител в различных диагностических процедурах. Они складываются с образованием уникальных конфигураций, способных формировать сложные бороздки, указывающие место связывания целевых структур. Аптамеры идентифицируются в рамках процесса отбора in vitro, известного как систематическая эволюция лигандов, путем экспоненциального обогащения (SELEX). Аптамеры могут иметь преимущества в сравнении с антителами в плане легкости их осаждения на чувствительных поверхностях. Кроме того, в связи с высокой воспроизводимостью схем синтеза в любых количествах, несмотря на то, что константа аффинности у них всегда ниже, чем у антител, и стабильность указанных соединений также может создавать проблемы, они тем не менее могут быть особенно полезными для проведения скрининга в сложных биологических матрицах (например, при идентификации аналогов АСТН с замещенными аминокислотными остатками в АСТН-(15-19) и/или АСТН-(21), в тех положениях, которые является наиболее активными по связыванию с MC-2R).

Альтернативно, методики получения молекулярных отпечатков могут использоваться для скрининга соединений или они могут быть полезными в рамках тех процедур, действие которых затрагивает активность MC-2R. К ним относится методика, основанная на получении полимерных сорбентов, которые обладают селективной предрасположенностью к определенному веществу или к группе структурных аналогов. Проводят реакцию взаимодействия функциональных и сшитых мономеров пластических материалов, таких как метакрилаты и стиролы, с матричным лигандом с целью достижения низкоэнергетических взаимодействий. Впоследствии индуцируют полимеризацию. В ходе данного процесса интересующая молекула захватывается в полимер либо путем нековалентного связывания, либо по процедуре самосборки, или по схеме обратимого ковалентного связывания. После остановки процесса полимеризации матричную молекулу отмывают. Полученный отпечаток матрицы поддерживают в ригидном полимере, так чтобы она обладала стерической (размер, форма) и химической (особое объединение комплементарных фрагментов) памятью для матрицы. Молекулярно отпечатанный полимер (MIP) может связываться с матрицей (=аналитическим компонентом) со специфичностью, аналогичной таковой для случая взаимодействия антиген-антитело.

Кроме основных вариантов применения в системе твердофазной экстракции и хроматографии, полимеры, полученные по принципу молекулярных отпечатков, могут использоваться в качестве не биологических альтернатив антителам в тестах на конкурентное связывание. В процессе роста типичной биологической клетки углерод-содержащие компоненты, такие как глюкоза, захватываются и высвобождают кислые метаболические продукты, такие как молочная кислота. При микрофизиометрии такие изменения в виде скорости метаболизма регистрируются как изменения в уровне подкисления окружающей клетки среды (см., например, Raley-Susman, K. M. et al., «Effects of excitotoxin exposure on metabolic rate of primary hippocampal cultures: application of silicon microphysiometry to neurobiology», J Neurosci., 12(3): 773-780; Baxter, G. T. et al., «PKCε is involved in granulocyte-macrophage colony-stimulating factor signal transduction; evidence from microphysiometry and antisense oligonucleotide experiments», Biochemistry, 31: 19050-10954 (1992); Bouvier, C. et al., «Dopaminergic activity measured on D₁- and D₂- transfected fibroblasts by silicon microphysiometry», J. Recent. Res., 13(1-4): 559-571 (1993): и McConnell, H. M. et al., «The cytosensor microphysiometer: biological applications of silicon technology», Science, 257: 1906-1912 (1992)). Микрофизиометрия может использоваться для выявления молекул, которые оказывают воздействие на клетку. Такие молекулы включают нейротрансмиттеры, факторы роста, цитокины, рецепторы и т.п. Таким образом, метод микрофизиометрии может обеспечивать получение ценной информации об аналогах АСТН, которые воздействуют на активность рецептора MC-2R.

Синтетические комбинаторные библиотеки могут представлять собой источник разнообразных структур, используемых для крупномасштабного биохимического скрининга (см., например, Sastry, L. et al., «Screening combinatorial antibody libraries for catalytic acyl transfer reaction», Ciba Found Symp., 159: 145-155 (1991); Persson, M. A. A. et al., «Generation of diverse high-affinity monoclonal antibodies by repertoire cloning», Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 33: 2432-2436 (1991); и Houghten, R. A., «Generation and use of synthetic peptide combinatorial libraries for basic research and drug discovery», Nature, 354: 84-86 (1991)). Такие библиотеки получают путем объединения методов проведения реакций в растворе и методов твердо-фазной химии с последующим расщеплением твердой подложки для скрининга.

Методы разделения, такие как жидкостная хроматография, газовая хроматография и капиллярный электрофорез в сочетании с методами масс-спектрометрии или тандемной масс-спектрометрии, позволяют создать аналитические системы, пригодные для оценки структур молекул (см., например, Hsieh, S. et al., «Separation and identification of peptides in single neurons by microcolumn liquid chromatography-Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry and postsource decay analysis», Anal. Chem., 70(9): 1847-1852 (1998); Tretyakova, N.Y. et al., «Quantitative analysis of 1,3-butadene-induced DNA adducts in vivo and in vitro using liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry», J. Mass Spectrom., 33: 363-376 (1998); и Taylor, G. W. et al;., «Excursion in biomedical mass spectrometry», Br. J. Clin. Pharmacol., 41: 119-126 (1996)). Масс-спектрометрия особенно полезна с точки зрения получения информации о молекулярном весе соединения/молекулы. При сочетании с методами очистки и контролируемой фрагментации крупных молекул можно также получить информацию о последовательности.

Методы скрининга соединений-аналогов АСТН с целью идентификации соединений-аналогов АСТН, которые индуцируют сниженную секрецию кортикостероида мембраной надпочечника, чем идентифицированный АСТН с последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 1, могут включать стадию приведения в контакт мембраны надпочечников с аналогом АСТН. Методы скрининга соединений-аналогов АСТН для идентификации соединений со сниженной АСТН-индуцированной секрецией кортикостероида могут включать одну или несколько указанных ниже стадий:

a) получение первой мембраны надпочечника и второй мембраны надпочечника;

b) приведение в контакт первой мембраны надпочечника в первой композиции, включающей немодифицированный пептид, включающий немодифицированный пептид АСТН, и последующее измерение первой концентрации кортикостероида, секретированного первой мембраной надпочечника после контакта с немодифицированным пептидом АСТН;

c) приведение в контакт второй мембраны надпочечника со второй композицией, включающей аналог АСТН, и затем измерение второй концентрации кортикостероида, секретированного второй мембраной надпочечника после контакта с аналогом АСТН;

d) сравнение первой концентрации секретированного кортикостероида со второй концентрацией секретированного кортикостероида; и

e) определение, индуцирует ли второе соединение меньшую секрецию кортикостероида, чем первое соединение.

Немодифицированный пептид АСТН представляет собой предпочтительно пептид SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 1.

Первая мембрана надпочечника и вторая мембрана надпочечника могут быть введены в организм субъекта и концентрация кортикостероида может быть измерена в крови субъекта (тесты in vivo). Альтернативно, первая мембрана надпочечников и вторая мембрана надпочечников могут быть изолированы из субъекта, и концентрацию кортикостероида измеряют в бессывороточной среде (тесты in vitro). Скрининговые тесты, включающие стадии теста ингибирования in vivo или стадии теста на конкурентное связывание in vitro, также могут включать указанную ниже стадию, которую предпочтительно проводят либо вместо, либо после стадии (с) и перед стадией (d):

а. одновременное приведение в контакт первой мембраны надпочечника с первой композицией, включающей пептид АСТН, и второй композицией, включающей аналог АСТН, и затем измерение второй концентрации кортикостероида, секретированного второй мембраной надпочечника.

Скрининг-тесты также включают стадии проведения одного или нескольких других тестов, включающих тесты, описанные как тест на индукцию кортикостероида в сыворотке, тест на ингибирование кортикостероида в сыворотке, тест на связывание с мембраной надпочечника или тест в бессывороточной среде на ингибирование надпочечника. Стадии могут проводиться в любом порядке, если особо не указано иное.

Композиции с аналогом АСТН и их введение

Аналоги АСТН могут быть введены в состав фармацевтических композиций для лечения различных АСТН-ассоциированных состояний, включающих состояния, относящиеся к суперэкспрессии АСТН у пациентов.

Фразы «фармацевтически приемлемый» или «фармакологически приемлемый» относятся как синонимы к лигандам, материалам, композициям и/или дозированным формам, которые, в свете принятых медицинских представлений, являются приемлемыми для использований, предусматривающих контакт с тканями человека и животного без генерирования выраженной токсичности, раздражения, аллергического ответа или других проблем или осложнений, сопутствующих ситуациям с неприемлемым соотношением польза/риск.

Фраза «терапевтически эффективное количество» соединения, такого как аналог пептида АСТН, применительно к использованию в ходе лечения, относится к количеству полипептида или пептида в препарате, который, в случае его введения в составе желательной дозировки в курсе лечения (хордовым существам, таким как млекопитающее или рыба), приводит к облегчению симптомов, ослаблению патологического состояние или замедлению развития заболевания, при проведении оценки на основании клинически приемлемых стандартов для определенного расстройства или заболевания, подлежащего лечению или подлежащего воздействию с косметической целью, то есть характеризуется разумным соотношением польза/риск применительно к любому варианту медицинского применения.

Термин «лечить» или любое производное от этого термина (например, лечение, терапия) в контексте настоящего описания включает: (1) предупреждение заболевания или состояния, ассоциированного с высокими уровнями АСТН, которое могло бы развиться у пациента, предрасположенного к такому заболеванию или состоянию, но которое еще не было диагностировано как имеющее место; (2) подавление заболевания или состояния, ассоциированного с высокими уровнями АСТН, например остановка развития; или (3) облегчение заболевания или состояния, ассоциированного с высокими уровнями АСТН, например, по пути регрессии заболевания или состояния.

Термины «пациент» или «субъект» используются как синонимы в контексте настоящего описания для обозначения организма, предпочтительно хордового животного, такого как млекопитающее, рыба или птица, в отношении которого предлагается лечение в соответствии с настоящим изобретением. Виды млекопитающих, для которых может быть достигнут полезный эффект аналогов АСТН по настоящему изобретению, и способы их лечения, включают, без ограничения, пчел, шимпанзе, орангутанов, человека, обезьяну и домашних животных (например, комнатных животных), таких как собаки, кошки, мыши, крысы, морские свинки, хомяки. Соответствующие виды рыб включают лосося и другие виды, выращиваемые в аквакультуре.

Термин «АСТН-ассоциированное состояние» в контексте настоящего описания относится к состояниям, расстройствам, симптомам или заболеваниям, которые могут поддаваться лечению или которые отзываются на регуляцию АСТН-опосредованного кортикостероида или уровней кортикостероида, регуляцию АСТН-связывания с мембраной надпочечника или регуляцию рецептора АСТН, такого как MC-2R, включая некоторые состояния, ассоциированные с меланокортиновым рецептором.

Термин «состояние, ассоциированное с меланокортиновым рецептором» используется в контексте настоящего описания применительно к состояниям, расстройствам или заболеваниям, которые могут поддаваться лечению путем регуляции рецептора, который связывается с АСТН и/или путем снижения уровня кортикостероида у субъекта. АСТН-ассоциированное состояние может включать «состояния, ассоциированные с MC-2R», или состояния, расстройства или заболевания, которые могут поддаваться лечению путем регуляции рецептора MC-2R. Предпочтительно, состояния, ассоциированные с MC-2R, могут подвергаться лечению путем связывания рецептора MC-2R с аналогом АСТН, что приводит к снижению уровня секреции кортикостероида в сравнении с уровнем секреции кортикостероида под действием эндогенного АСТН.

Все стереоизомеры соединений, идентифицированных с использованием способов по настоящему изобретению, включая энантиомерные и диастереомерные формы, входят в объем настоящего изобретения. Индивидуальные стереоизомеры соединений по настоящему изобретению могут быть по существу свободны от других изомеров или могут представлять собой смешанные формы, например, в виде рацематов смеси со всеми другими стереоизомерами, или могут включать другие отдельно выбранные стереоизомеры. Хиральные центры соединений, идентифицированных по настоящему изобретению, могут иметь конфигурацию S или R, D или L, в соответствии с определением по рекомендациям IUPAC 1974.

В восьмом варианте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим аналоги АСТН, и к их введению субъекту в рамках способа, соответствующего лечению симптомов, связанных с АСТН-ассоциированным состоянием. Способ введения может быть выбран в соответствии с известными методиками. Аналоги АСТН могут использоваться как часть фармацевтической композиции, включающей фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции, включающие по меньшей мере один аналог АСТН согласно настоящему изобретению для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с повышенным уровнем АСТН, могут быть изготовлены, например, при использовании традиционных твердых или жидких носителей или разбавителей, а также фармацевтических добавок того типа, который подходит для способа желательного введения (например, эксципиентов, связующих, консервантов, стабилизаторов, флаворантов и т.п.), в соответствии с методиками, известными в области получения фармацевтических композиций.

Фармацевтические композиции, включающие аналоги АСТН, могут быть введены любыми приемлемыми способами. Например, композиции, включающие аналоги АСТН, могут быть введены подкожной, внутривенной, внутримышечной или интрацистернальной инъекцией или методами инфузии (например, в виде стерильных инъецируемых водных или неводных растворов или суспензий); назально, например, путем ингаляции аэрозолем; или местно, например, в форме крема или мази, а также в виде дозированных композиций, содержащих нетоксичные фармацевтически приемлемые носители или разбавители. Аналоги АСТН согласно настоящему изобретению могут быть введены, например, таким образом, что они образуют форму, подходящую для быстрого или пролонгированного высвобождения. Быстрое высвобождение или пролонгированное высвобождение могут быть достигнуты при использовании подходящих фармацевтических композиций, включающих аналоги АСТН согласно настоящему изобретению, или, особенно в случае пролонгированного высвобождения, при использовании соответствующих приспособлений, таких как подкожные имплантаты или осмотические насосы. Аналоги АСТН согласно настоящему изобретению могут также вводиться в виде липосом.

Фармацевтические композиции, включающие полипептиды-аналоги АСТН согласно настоящему изобретению, могут быть изготовлены согласно известным методам, в соответствии с которыми аналог АСТН объединяют с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем с получением смеси. Композиции, которые могут использоваться для профилактического и терапевтического лечения, включают одно или несколько соединений-аналогов АСТН и соответствующие для их введения устройства (такие как инъецируемая система носителей, устройства для интраназального или чрескожного введения).

Термин «носители» в контексте настоящего описания включает фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы, которые являются нетоксичными для клетки или субъекта, подвергающихся их воздействию в используемых дозировках и концентрациях. Фраза «фармацевтически приемлемый носитель» в контексте настоящего описания обозначает фармацевтически приемлемый материал, композицию или носитель, жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, растворитель или инкапсулирующий материал, включенные в систему переноса или систему транспортировки целевого химического компонента от одного органа или части тела к другому органу или части тела. Каждый носитель должен быть «приемлемым» в том смысле, что он должен быть совместим с другими ингредиентами композиции, не оказывать вредного воздействия на пациента и по существу не быть пирогенным. Некоторые примеры материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают: (1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; (2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; (3) целлюлозу и ее производные, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; (4) порошкообразный трагакант; (5) солод; (6) желатин; (7) тальк; (8) эксципиенты, такие как какао-масло и воски для суппозиториев; (9) масла, такие как арахисовое, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (10) гликоли, такие как пропиленгликоль; (11) полиолы, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; (12) сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; (13) агар; (14) забуферивающие агенты, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; (15) альгиновую кислоту; (16) апирогенную воду; (17) изотонический солевой раствор; (18) раствор Рингера; (19) этиловый спирт; (20) фосфатно-буферные растворы и (21) другие нетоксичные совместимые вещества, обычно применяемые в фармацевтических композициях. В некоторых вариантах фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению являются апирогенными, то есть они не вызывают существенного повышения температуры при их введении пациенту. Зачастую физиологически приемлемый носитель представляет собой водный забуференный по pH раствор. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и друге органические кислоты; антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные полипептиды (включающие менее 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты или производные аминокислот, такие как норлейцин или орнитин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включающие глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как ТВИН^ТМ, Плуроникс^ТМ (PLURONICS^ТМ) или ПЭГ. Каждый из носителей, используемых в сочетании с аналогом АСТН, может быть изготовлен традиционным способом. Однако, если используют спиртовый носитель, то аналог АСТН должен иметь вид мицеллы, липосомы или «обратимой» липосомы, с тем чтобы препятствовать денатурации аналога АСТН. Аналогично, когда аналог АСТН вводится в носитель и носитель нагревается или был нагрет, то такое введение должно быть осуществлено после охлаждения носителя, с тем чтобы избежать тепловой денатурации аналога АСТН. Носитель предпочтительно является стерильным. Один или несколько аналогов АСТН могут быть добавлены к указанным веществам в жидкой форме или в лиофильно высушенном состоянии так, что при контакте с жидкостью организма он будет солюбилизирован.

Если модифицированный аналог АСТН до или в процессе ввода объединяют с системой носителей, то указанный аналог АСТН может находиться в стабилизирующем буферном окружении для поддержания фармакологически приемлемого диапазона pH, такого как от примерно 4 до примерно 9,0, включая значения pH, такие как примерно 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, или любой другой интервал pH, отличающийся на величину 0,05 от указанных, или любой интервал, который представляет собой кратную единицу для показателя 0,05 в данном интервале, включая значение pH 5,2, 6,5, 7,4, 7,5 и 8,5. Терапевтические композиции, подходящие для хранения, получают путем смешивания аналога АСТН в качестве активного ингредиента, имеющего желательную степень чистоты, с необязательными физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Science 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофильно высушенных композиций или водных растворов. Стабилизирующий буфер должен позволять достижение оптимальной активности для аналога АСТН. Буфер может содержать восстановитель, такой как дитиотрейтол. Стабилизирующий буфер также может включать металл-хелатирующий реагент, такой как двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, или может также содержать фосфатный или цитрат-фосфатный буфер или любой другой буфер.

Эффективное количество соединения, используемого в соответствии с настоящим изобретением, может быть определено любым специалистом со средним уровнем знаний в данной области. Эффективные уровни дозы или количества одного или нескольких аналогов АСТН будут зависеть частично от того, как будут использоваться один или несколько указанных аналогов, терапевтически или профилактически, от длительности воздействия на реципиенты инфицирующих бактерий, от размера и веса индивидуума и от других факторов, известных лечащему врачу. Длительность использования композиции, содержащей аналог АСТН, также зависит от того, будет ли введение проводиться с профилактическими целями, где данное использование может быть ежечасным, ежедневным или еженедельным в течение короткого периода времени, или будет проводиться с терапевтическими целями, где может быть необходим более интенсивный режим использования композиции, так что применение может длиться в течение нескольких часов, дней или недель, и/или может осуществляться ежедневно или с какими-то интервалами времени в течение дня. Любая используемая дозированная форма должна обеспечивать поступление минимального числа единиц в течение минимального периода времени. Дозировки и желательные концентрации лекарственного компонента в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению могут варьировать в зависимости от предполагаемого конкретного использования. Например, в том случае, когда аналог АСТН согласно настоящему изобретению подлежит введению пациенту для лечения синдрома Кушинга или преждевременных родов, то примерное количества дозы в случае взрослого человека включают от 0,001 до 100 мг/кг веса тела активного соединения в день, которое может быть введено в виде одной дозы или в форме отдельных доз, например, от 1 до 4 раз в день. Следует понимать, что конкретный уровень дозирования и частота введения доз для каждого конкретного соединения может варьировать и будет зависеть от множества факторов, включающих активность конкретного используемого соединения, метаболической активности и длительности действия указанного соединения, от вида организма, возраста, веса тела, общего состояния здоровья, пола и пищевых привычек пациента, от способа и времени введения дозы, уровня выделения, наличия сочетания лекарственных препаратов и тяжести конкретного состояния.

Определение соответствующей дозировки или способов введения может осуществить любой врач со средним уровнем знаний в данной области. Результаты экспериментов на животных обеспечивают надежное руководство для определения эффективных доз при лечении людей. Межвидовые оценки эффективных доз могут быть осуществлены в соответствии с принципами, определенными Морденти и Шапелем (Mordenti J. and Chappell, W. «The use of interspecies scaling in toxicokinetics» In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96). Концентрация активных единиц аналогов АСТН, которые могут обеспечивать эффективное количество или дозу аналога АСТН, может составлять от примерно 10 единиц/мл до примерно 500000 единиц/мл, при введении в увлажненную или сырую среду носовых или ротовых путей, а также при местном введении, и может находиться в диапазоне от примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 единиц/мл до примерно 50000 единиц/мл. Репрезентативные значения, таким образом, включают примерно 200 единиц/мл, 300 единиц/мл, 500 единиц/мл, 1000 единиц/мл, 2500 единиц/мл, 5000 единиц/мл, 10000 единиц/мл, 20000 единиц/мл, 30000 единиц/мл, 40000 единиц/мл. Более конкретно, время экспозиции с введенными единицами активного аналога АСТН может оказывать воздействие на желательную концентрацию единиц активного аналога АСТН на мл. Композиции, используемые для введения in vivo, предпочтительно являются стерильными. Стерильность может быть легко достигнута путем фильтрования через стерильные фильтрующие мембраны, осуществляемого до или после лиофилизации и восстановления. Терапевтические композиции согласно настоящему изобретению в основном помещают в контейнер, имеющий стерильный порт доступа, например во флакон для внутривенного раствора, имеющий пробку, пробиваемую гиподермической иглой для инъекций.

Примеры фармацевтических композиций, содержащих аналоги АСТН, включают инъецируемые композиции, композиции, обеспечивающие пролонгированное высвобождение аналогов АСТН в течение желательного периода времени, композиции для внутрикожного введения, инъецируемый гель, покрытия, наносимые на имплантируемые медицинские устройства, мукоадгезивные композиции или композиции для назального введения или другие ингалируемые композиции.

В некоторых примерах аналоги АСТН могут вводиться путем внутримышечной или внутривенной инъекции. Например, аналоги АСТН могут вводиться внутримышечно, внутривенно, подкожно, субдермально, внутрикожно или при использовании сочетаний указанных способов.

Инъецируемые композиции предпочтительно включают приемлемый носитель и одно или несколько соединений-аналогов АСТН. Носитель может состоять из дистиллированной воды, солевого раствора, альбумина или любого их сочетания. В тех случаях, когда для введения используют внутримышечную инъекцию, может быть использована изотоническая композиция. В основном, вспомогательные вещества для поддержания изотоничности включают хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. В некоторых случаях используют изотонические растворы, такие как фосфатно-буферный раствор. Стабилизаторы включают желатин и альбумин. В некоторых случаях к композиции добавляют сосудосуживающий агент. Фармацевтические препараты поставляются стерильными и апирогенными. В основном, как было отмечено выше, внутривенная инъекция может представлять собой наиболее предпочтительный способ. Репрезентативные композиции для парентерального введения включают инъецируемые растворы или суспензии, которые могут содержать, например, подходящие нетоксичные парентерально приемлемые разбавители или растворители, такие как маннит, 1,3-бутандиол, вода, раствор Рингера, изотоничный раствор хлорида натрия или другие подходящие диспергирующие или смачивающие и суспендирующие агенты, включающие синтетические моно- или диглицериды и жирные кислоты, включая олеиновую кислоту. Глицерин или глицерол (1,2,3-пропантриол) представляет собой коммерчески приемлемый носитель для фармацевтического использования. Глицерин или глицерол может быть разбавлен стерильной водой для инъекций или раствором хлорида натрия для инъекций или другой фармацевтически приемлемой для инъекций водной жидкостью и использоваться в концентрациях от 0,1 до 100% (объем/объем), от 1,0 до 50% или примерно в 20% концентрации. ДМСО представляет собой апротонный растворитель, который может повышать проникновение многих местно наносимых лекарственных средств. ДМСО может быть разбавлен стерильной водой для инъекций или раствором хлорида натрия для инъекций или другой фармацевтически приемлемой водной жидкостью для инъекций и использоваться в концентрациях от 0,1 до 100% (объем/объем). Носитель также может включать раствор Рингера, буферный раствор и раствор декстрозы, особенно в том случае, когда используют внутривенное введение.

При внесении аналога АСТН в систему носителей, до этого момента или в процессе внесения, может быть желательно, чтобы аналоги АСТН находились в стабилизирующем буферном окружении для поддержания приемлемого диапазона pH. Стабилизирующий буфер должен обеспечивать оптимальную активность аналога АСТН. Буфер может также содержать восстановитель, такой как дитиотрейтол. Стабилизирующий буфер может включать металл-хелатирующий реагент, такой как двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, или может также содержать фосфатный или цитрат-фосфатный буфер. Буферы, входящие в состав носителя, могут служить для стабилизации среды для аналогов АСТН.

Носитель может необязательно содержать небольшие количества добавок, таких как вещества, которые повышают изотоничность и химическую стабильность. Такие материалы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как фосфат, цитрат, сукцинат, уксусная кислота и другие органические соли или их кислоты; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота; низкомолекулярные полипептиды (содержащие менее чем примерно 10 остатков), например, полиаргинин или трипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; глицин; аминокислоты, такие как глютаминовая кислота, аспарагиновая кислота, гистидин или аргинин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включающие целлюлозу или ее производные, глюкозу, маннозу, трегалозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; противоионы, такие как натрий; неионные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты, полоксамеры или полиэтиленгликиоль (ПЭГ); и/или фармацевтически приемлемые соли, например NaCl, KCl, MgCl₂, CaCl₂ и т.п.

Термин «фармацевтически приемлемые соли» относится к относительно нетоксичным неорганическим и органическим аддитивным солям органической кислоты на основе ингибиторов. Указанные соли могут быть получены in situ на конечном этапе выделения и очистки одного или нескольких ингибиторов или путем проведения отдельного взаимодействия очищенного одного или нескольких ингибиторов в их свободной основной форме с соответствующей органической или неорганической кислотой с последующим выделением полученной таким образом соли. Репрезентативные соли включают: гидробромидные, гидрохлоридные, сульфатные, бисульфатные, фосфатные, нитратные, ацетатные, валератные, олеатные, пальмитатные, стеаратные, лауратные, бензоатные, лактатные, фосфатные, тозилатные, цитратные, малеатные, фумаратные, сукцинатные, тартратные, нафтилатные, мезилатные, глюкогептонатные, лактобионатные и лаурилсульфонатные соли и т.п. (см., например, Berge et al., (1977) «Pharmaceutical Salts», J. Pharm. Sci. 66: 1-19). В других случаях ингибиторы, используемые в способах по настоящему изобретению, могут содержать одну или несколько кислых функциональных групп и, в этой связи, способных к формированию фармацевтически приемлемых солей с фармацевтически приемлемыми основаниями. Термин «фармацевтически приемлемые соли» в таких случаях относится к относительно нетоксичным неорганическим и органическим аддитивным солям основания на основе одного или нескольких ингибиторов. Указанные соли могут быть аналогично получены in situ на конечном этапе выделения и очистки одного или нескольких ингибиторов или путем проведения по отдельности взаимодействия одного или нескольких очищенных ингибиторов в их свободной кислой форме с соответствующим основанием, таким как гидроксид, карбонат или бикарбонат фармацевтически приемлемого катиона металла с аммиаком или с фармацевтически приемлемым органическим первичным, вторичным или третичным амином. Репрезентативные соли щелочных или щелочно-земельных металлов включают соли лития, натрия, калия, кальция, магния или алюминия и т.п. Репрезентативные органические амины, используемые для образования аддитивных солей основания, включают этиламин, диэтиламин, этилендиамин, этаноламин, диэтаноламин, пиперазин и т.п. (см., например, Berge et. al., supra).

Инъецируемые фармацевтические композиции c аналогами АСТН, могут необязательно включать другие терапевтические агенты, содержащие антимикробные агенты, противовоспалительные средства, противовирусные средства или местные анестетики. Местные анестетики включают тетракаин, гидрохлорид тетракаина, лидокаин, гидрохлорид лидокаина, диклонин, гидрохлорид диклонина, гидрохлорид диметизокина, дибукаин, дибукаина гидрохлорид, бутамбенпикрат и гидрохлорид прамоксина. Примерные концентрации местных анестетиков составляют от примерно 0,025% до примерно 5% от веса всей композиции. Анестетики, такие как бензокаин, могут также использоваться в предпочтительной концентрации от примерно 2 вес.% до примерно 25 вес.%.

Фармацевтические композиции могут также необязательно включать в разных количествах один или несколько дополнительных биологически активных агентов для подавления синтеза стероидных гормонов (например, ингибиторов ферментов, которые катализируют различные стадии синтеза стероидных гормонов), включая биологические агенты, описанные, например, в обзоре J. Steroid Biochem., vol.5, p. 501 (1974), где указанная группа включает следующие агенты: (а) производные дифенилметана, например, амфенон В (который подавляет синтез стероидных гормонов на стадиях 11-бета-, 17- и 21-гидроксилазы); (b) производные пиридина (серия SU-с), например, метирапон (который подавляет синтез стероидов на стадии 11-бета-гидроксилазы); (с) замещенные альфа,альфа-глютарамиды, например, аминоглютетимид (который препятствует синтезу прегненолона из холестерина за счет супрессии 20-альфа-гидроксилазы и С20,С22-лиазы); (d) стероидные вещества, например, трилостан (3-бета-замещенный стероид-3-бета-гидрокси-5-андростен-17-он), который подавляет 5,4-изомеразу 3-бета-дезоксистероидгидрогеназы (Steroids, vol. 32, p. 257); (е) стероиды семейства спиронолактонов, которые используются в качестве быстро диссоциирующих анти-минералокортикоидов (PNAS USA 71(4) p. 1431-1435 (1974)); (f) синтетический стероид, описанный как анти-минералокортикоид ZK91587, демонстрирующий специфические свойства связывания с MR почки (Z. Naturforsch., 45b, p. 711-715 (1990)) и MR гиппокампа типа I (Life Science, 59, p. 511-21 (1996)), но не с GR типа II. В этой связи может быть удобно использовать его в качестве инструмента при исследовании функции MR в тканях, содержащих обе рецепторные системы.

Аналоги АСТН могут быть необязательно введены вместе с биологически активными агентами, которые специфически подавляют взаимодействие глюкокортикоидных гормонов с рецепторами гормонов и включают: (а) мифепристон (11β,17β)-11-[4-(диметиламино)фенил]-17-гидрокси-17-(1-пропил)эстра-4,9-диен-3-он, который действует на рецепторы глюкокортикоидных гормонов с образованием комплекса, неспособного к инициации механизмов, ведущих к проявлению глюкокортикоидного эффекта (Annals of New-York Academy of Science, vol. 761, p. 296-310 (1995)); указанное соединение также известно как контрагестивный агент (RU38486 или RU486); (b) нестероидные вещества (J. Steroid Biochem., vol. p. 31, р. 481-492 (1988)), например, гидрохлорид дротаверина (производное изохинолин-1-(3,4-диэтоксибензилиден)-6,7-диэтокси-1,2,3,4-тетрагидризохинолин) или ацетилсалициловую кислоту (Moskovskava Meditsina, 1990, «Receptor mechanisms of the glucocorticoid effect» by V. P. Golikov). Антиглюкокортикоиды (например, мифепристон) используются в клинических условиях для лечения неоперабельных случаев синдрома Кушинга, не гипофизного генеза. В случае мифепрестона (с антипрогестероновым и антиглюкокортикоидным действием) могут потребоваться высокие дозы агента (до 800 мг в день). По сообщениям, при использовании стратегии системного введения для повышения активности и снижения перекрестной реакции и нежелательных побочных эффектов был достигнут впечатляющий прогресс в разработке новых антигормональных агентов с повышенной эффективностью и селективностью, особенно в направлении антиэстрогенового и антиэндрогенового действия.

Эффективные уровни доз или количеств аналога АСТН, подлежащего парентеральному введению, и длительность лечения определяются, в частности, тяжестью инфекции, весом пациента, длительностью воздействия инфицирующих бактерий на реципиента, тяжестью инфекции и множеством других факторов. Композиция может вводиться от одного до нескольких раз в день и может применяться в течение короткого или длительного периода времени. Дозировка может вводиться в течение ряда дней или недель. Любая используемая дозированная форма должна обеспечивать поступление минимального количества единиц за минимальный период времени. Считается, что концентрация активных единиц аналога АСТН, обеспечивающая эффективные количество или дозу аналога АСТН, может составлять от примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 единиц/мл до примерно 10000000 единиц/мл композиции, от примерно 1000 единиц/мл до примерно 10000000 и от примерно 10000 единиц/мл до примерно 10000000 единиц/мл. Количество активных единиц на мл и длительность времени воздействия зависит от природы инфекции и от того количества аналога АСТН, которое позволяет создавать используемый носитель. Следует напомнить, что аналог АСТН лучше всего работает в жидкой среде. В этой связи эффективность аналога АСТН частично связана с количеством влаги, захватываемой носителем. Концентрация аналога АСТН, применяемая для лечения, зависит от уровня бактерий в крови и от объема крови.

В том случае, когда практикуется введение аналога АСТН in vivo, нормальные уровни дозирования могут варьировать примерно от 10 нг/кг до 100 мг/кг на вес тела субъекта в день или примерно от 1 мкг/кг/день до 10 мг/кг/день, в зависимости от способа введения. Ниже приводится руководство по конкретным дозировкам и способам доставки, и, кроме того, такие руководства имеются в литературе. Ожидается, что различные композиции будут эффективны применительно к разным соединениям, равно как и для лечения разного рода расстройств, так что введение в один орган или одну ткань, может, например, вызвать необходимость доставки неким способом, отличным от способа, используемого для доставки в другой орган или в другую ткань.

Фармацевтические растворы, применяемые для инфузии или инъекции, могут быть получены обычным способом, например, при добавке консервантов, таких как п-гидроксибензоаты, или стабилизаторов, таких как соли щелочных металлов с этилендиаминтетрауксусной кислотой, которые затем могут быть перенесены в сосуды для инфузии, флаконы или ампулы для инъекций. Альтернативно, соединение для инъекции может быть лиофилизировано вместе с другими ингредиентами или без них, а также может быть солюбилизировано в буферном растворе или дистиллированной воде, как это будет приемлемо, в момент использования. В соответствии с настоящим изобретением, также могут использоваться неводные носители, такие как жирные масла, липосомы и этилолеат.

Дополнительно может быть использовано множество способов для облегчения транспорта аналога АСТН через клеточную мембрану. Аналог АСТН может переноситься в составе липосомы, в которую аналог АСТН может быть встроен с помощью известных методик. Аналогично, аналог АСТН может находиться в обратимой мицелле. Аналог АСТН также может быть подвергнут пэгилированию путем присоединения полиэтиленгликоля к неактивной части молекулы аналога АСТН. Альтернативно, для транспортировки аналога АСТН через клеточные мембраны могут использоваться гидрофобные молекулы. И наконец, может также использоваться гликозилирование аналога АСТН с целью снижения специфической интернализации рецепторов на клеточной мембране.

Для осуществления некоторых способов лечения могут быть особенно желательны материалы, обладающие способностью к контролируемому высвобождению. Аналог АСТН может быть объединен с системой носителей, такой как полимер, которая обеспечивает длительное высвобождение аналога АСТН в течение желательного периода времени. Кроме того, такие композиции могут быть включены в состав высокомолекулярных эксципиентов, таких как целлюлоза (авицель) или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Такие композиции могут также включать эксципиент для содействия адгезии на слизистой поверхности, такой как гидроксипропилцеллюлоза (ГПЦ), гидроксипропилметилцеллюлоза (ГПМЦ), натрий-карбоксиметилцелюлоза (Н-КМЦ), сополимер на основе малеинового ангидрида (например, Gantrez) и агенты, контролирующие высвобождение, такие как полиакриловый сополимер (например, Carbopol 934). Для легкости изготовления и последующего использования могут быть также добавлены замасливатели, средства, способствующие скольжению, вкусовые вещества, красители и стабилизаторы.

Соединения-аналоги АСТН могут быть объединены с композицией, содержащей носитель с пролонгированным высвобождением, как описано в патенте США No. 6893645, поданном 15 июля 2002 года и выданном 17 мая 2005 года (Loughman), который включен в настоящее описание в качестве ссылки. Другие примеры композиций с длительным или контролируемым высвобождением и способы, которые могут быть использованы применительно к аналогам АСТН, включают опубликованные заявки на патент США NoNo.: US2005/016927A1, поданная 18 августа 2004 года (Cheung et al.), US2003/0125528A1, поданная 27 сентября 2002 года (Hay et al.), US 2003/0211966A1, поданная 21 октября 2002 года (Kubek et al.), и US2003/0148938A1, поданная 7 ноября 2001 года (Sharma et al.) и US2003/0181361A1, поданная 31 марта 2003 года (Sharma et al.), описание которых приводится здесь в качестве ссылки. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения применяемая для лечения композиция с контролируемым высвобождением может включать полимер с контролируемым высвобождением и эффективное количество аналога АСТН. Полимер с контролируемым высвобождением может представлять собой набухающий в воде полимер, необязательно включающий желательный уровень сшивающих фрагментов. Полимер с контролируемым высвобождением может характеризоваться желательным уровнем водорастворимости или иметь лишь минимальный уровень растворимости в воде.

Приемлемые для использования полимерные загустители включают такие загустители, которые известны специалистам в данной области, например гидрофильные и водно-спиртовые желирующие агенты, часто используемые в косметической и фармацевтической промышленности. Указанный гидрофильный или гидроспиртовой желирующий агент может включать, например, «CARBOPOL®» (B. F. Goodrich, Cleveland, Ohio), «HYPAN®» (Kingston Technologies, Dayton, N. J.), «NATROSOL®» (Aqualon, Wilmington, Del.), «KLUCEL®» (Aqualon, Wilmington, Del.) или «STABILEZE®» (ISP Technologies, Waynе, N. J.). Желирующий агент может включать от примерно 0,2% до примерно 4% от веса композиции. Более конкретным примером диапазона весовой доли карбопола («CARBOPOL®») в композиции может быть диапазон от примерно 0,5 вес.% до примерно 2 вес.%, тогда как диапазон весовой доли «NATROSOL®» и «KLUCEL®» может составлять от примерно 0,5 вес.% до примерно 4 вес.%. Диапазон весовой доли «HYPAN®» и «STABILEZE®» в композиции может составлять от примерно 0,5 вес.% до примерно 4 вес.%.

Карбопол («CARBOPOL®») представляет собой один из многочисленных сшитых полимеров акриловой кислоты, которые объединены в одну группу с общим названием карбомеры. Указанные полимеры растворяются в воде и образуют прозрачный или слегка мутный гель при нейтрализации каустическим материалом, таким как гидроксид натрия, гидроксид калия, триэтаноламин или другие аминные основания. «KLUCEL®» представляет собой целлюлозный полимер, который диспергируется в воде и образует однородный гель при полной гидратации. Другие желирующие полимеры включают гидроксиэтилцелллозу, целлюлозную камедь, декадиеновый сшитый полимер MVE/MA, сополимер PVM/MA или их сочетания.

Консерванты также могут использоваться в рамках настоящего изобретения и могут составлять, например, от примерно 0,05 вес.% до 0,5 вес.% от всей композиции. Использование консервантов гарантирует, что если продукт загрязняется микробами, то такая композиция будет препятствовать росту микроорганизмов или снижать его. Некоторые консерванты, используемые в настоящем изобретении, включают метилпарабен, пропилпарабен, бутилпарабен, хлороксиленол, бензоат натрия, DMDM-гидантоин, 3-йод-2-пропилбутилкарбамат, сорбат калия, диглюконат хлоргексидина или их сочетания.

В том случае, когда желательно длительное высвобождение аналога АСТН при введении его в составе композиции, характеризующейся показателями высвобождения, пригодными для лечения того или иного заболевания или расстройства, требующего введение аналога АСТН, может рассматриваться вариант микроинкапсулирования аналога АСТН. Предпочтительные микроинкапсулированные композиции, подходящие для их применения в сочетании с аналогами АСТН, включают композиции, описанные в патенте США No. 6475507 (зарегистрирован 6 ноября 2000 года) (Pellet et al.) и в патенте США 6911218 (зарегистрирован 20 апреля 1999 года) (Ignatious et al.), которые, оба, полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. Микроинкапсулирование рекомбинантных белков с получением композиций, позволяющих длительное высвобождение, было успешно осуществлено с гормоном роста человека (rhGH), интерфероном-(rhIFN-), интерлейкином-2 и MN rgp120 (Johnson et al., Nat. Мed., 2:705-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology. 8: 755-758 (1990); Cleland «Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems» in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399 и патент США No. 5654010).

Носители, позволяющие осуществлять длительное или контролируемое высвобождение, могут представлять собой носители с «долгим» или «медленным» высвобождением (такие как, например, некоторые назальные спреи, полимеры или капсулы) и могут иметь сниженную концентрацию активных единиц на мл (аналога АСТН) или обеспечивать ее достижение, но в течение более длительного периода времени, тогда как носители для «краткосрочного» или «быстрого» высвобождения (такие как, например, раствор для полоскания горла) могут содержать высокие концентрации активных единиц на мл (аналога АСТН) или обеспечивать их достижение, но в течение более короткого периода времени. Показатели количества активных единиц на мл и длительности экспозиции зависят от природы инфекции, от того, каким должно быть лечение, профилактическим или терапевтическим, а также от других переменных. Так, число дозировок может зависеть от условий, в которых проводится терапия, и может варьировать от 1 до 4 раза в день или более, тогда как длительность может составлять от одного дня до нескольких недель. Инфекции могут возникать в коже и для применения в этих случаях могут быть также изготовлены композиции для местного применения с использованием известных носителей, таких как носители, описанные в патентах США №№ 6056954 и 6056955. Для контролирования высвобождения аналога АСТН могут также использоваться мицеллы и многослойные мицеллы.

В композициях, позволяющих достичь длительного высвобождения указанных белков, могут использоваться биопоглощаемый полимер, такой как сополимер молочной и гликолевой кислоты (PLGA), благодаря его биосовместимости и широкому диапазону свойств биодеградации. Продукты биодеградации PLGA, молочные и гликолевые кислоты, могут быстро выводиться из организма человека. Кроме того, способность к деградации данного полимера может быть откорректирована и составлять от нескольких месяцев до нескольких лет, в зависимости от его молекулярного веса и состава (Lewis, «Controlled release of bioactive agents from lactide/glucolide polymer», in: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drul: Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41).

В некоторых примерах терапевтическая композиция включает мукоадгезивную композицию для длительного высвобождения и аналог АСТН. Слизистая выстилка, как она описана, включает, например, верхние и нижние дыхательные пути, глаза, трансбуккальную полость, нос, прямую кишку, влагалище, зубо-десневой карман, кишечную полость и толстую кишку. Препарат Orahesive® от компании E. R. Squibb & Co представляет собой адгезив, который включает сочетание пектина, желатина и натрий-карбоксиметилцеллюлозы в липком углеводородном полимере для целей прилипания к слизистой ротовой полости. Однако такие физические смеси гидрофильных и гидрофобных компонентов постепенно выводятся. Тогда как гидрофильные и гидрофобные домены согласно настоящему описанию обеспечивают нерастворимый сополимер. В патенте США No. 4948580, также включенном в настоящее описание в качестве ссылки, описываются биоадгезивные пероральные системы доставки лекарственного средства. Данная композиция включает лиофильно высушенную полимерную смесь, образованную из смеси сополимера поли(метилвиниловый эфир/малеиновый ангидрид) и желатина, диспергированной в мазевой основе, такой как минеральное масло, содержащее диспергированный полиэтилен. В патенте США No. 5413792 (включенном в настоящее описание в качестве ссылки) раскрываются пастообразные препараты, включающие (А) пастообразное основание, содержащее полиорганосилоксан и водорастворимый полимерный материал, который может присутствовать в весовом соотношении от 3:6 до 6:3, (B) активный ингредиент. В патенте США No. 5554380 заявляется твердая или полутвердая биоадгезивная пероральная система доставки лекарственного вещества, включающая воду в масляной системе, содержащей по меньшей мере две фазы. Одна фаза включает от примерно 25 объемн.% до примерно 75 объемн.% внутренней гидрофильной фазы, а другая фаза включает от примерно 23 объемн.% до примерно 75 объемн.% внешней гидрофобной фазы, где внешняя гидрофобная фаза состоит из трех компонентов: (а) эмульгатор, (b) глицеридный сложный эфир и (c) воскообразный материал. В патенте США No. 5942243 описываются некоторые репрезентативные материалы, воздействующие на высвобождение, которые применяются для введения антибактериальных агентов, и указанный патент включен в настоящее описание в качестве ссылки. Дозированные формы композиций по настоящему изобретению могут быть получены традиционными способами.

Композиции, включающие аналог АСТН, могут вводиться с помощью назальных аэрозолей, назальных капель, назальных мазей, назальных промывок, назальных инъекций, назальных пакетиков, бронхиальных аэрозолей и ингаляторов. В том случае, когда один или несколько аналогов АСТН вводят непосредственно с использованием назальных аэрозолей, назальных капель, назальных мазей, назальных промывок, назальных инъекций, назальных пакетиков, бронхиальных аэрозолей, пероральных аэрозолей и ингаляторов, аналог АСТН может находиться в жидкой или гелевой среде, где жидкость выполняет функцию носителя. Сухой безводный вариант модифицированного аналога АСТН может вводиться с помощью ингалятора и бронхиального аэрозоля, хотя может также использоваться жидкая форма доставки. Назальный аэрозоль может представлять собой длительно действующий аэрозоль или аэрозоль с пролонгированным высвобождением и может быть изготовлен с использованием известных в данной области способов. Может также использоваться ингалянт, с тем чтобы аналог АСТН мог далеко пройти по бронхиальному тракту, вплоть до легких. Репрезентативные композиции для введения с помощью назального аэрозоля или ингаляции включают растворы в виде солевого раствора, которые могут содержать, например, консерванты на основе бензилового спирта или другие подходящие консерванты, усилители абсорбции для повышения биологической доступности и/или другие солюбилизирующие или диспергирующие агенты, известные в данной области.

Композиции для внутрикожной доставки аналога АСТН могут быть изготовлены с использованием носителя для доставки по меньшей мере одного аналога АСТН на кожу или через кожу. Способ нанесения аналога АСТН включает множество различных типов и сочетаний носителя, которые включают, без ограничения, водную жидкость, жидкость на основе спирта, водорастворимый гель, лосьон, мазь, неводную жидкую основу, основу из минерального масла, смесь минерального масла и вазелина, ланолин, липосомы, белковые носители, такие как сывороточный альбумин или желатин, порошкообразную целлюлозную основу и их сочетания. Способы доставки носителя, содержащего терапевтический агент, включают, без ограничения, использование мазка, аэрозоля, pАСТН с длительным высвобождением, импрегнированной салфетки и их сочетания. Аналог АСТН может также применяться путем нанесения на бандаж, либо непосредственно, либо в составе одного или нескольких носителей. Бандажи могут быть влажными или сухими, при этом аналог АСТН наносится в лиофилизированном виде на бандаж. Данный способ нанесения особенно эффективен для лечения кожной инфекции. Носители для местных композиций могут включать полутвердые и гелеобразные носители, которые включают полимерный загуститель, воду, консервант, активные сурфактанты или эмульгаторы, антиоксиданты, солнечные фильтры и растворитель или систему растворителей. В патенте США № 5863560 (Osbornе) описывается и обсуждается множество различных сочетаний носителей, которые могут использоваться в качестве добавки при нанесении лекарственного препарата на кожу. Другая композиция для местного введения включает локально наносимый носитель, такой как Plastibase (гелеобразное минеральное масло в сочетании с полиэтиленом).

В одном примере настоящее изобретение включает внутрикожную композицию, содержащую примерно от 0,5% до 10% карбомера и примерно от 5% до 10% фармацевтического препарата, который существует и в растворенном состоянии, и в форме микрочастиц. Растворенный фармацевтический компонент обладает способностью проходить через слой роговицы, тогда как фармацевтический компонент в форме микрочастиц таким свойством не обладает. Добавление раствора основания амина, раствора гидроксида калия или раствора гидроксида натрия представляет собой завершающий этап создания геля. Более конкретно, фармацевтический компонент может включать дапсон, антимикробный агент, обладающий противовоспалительными свойствами. Одним из примеров соотношения в препарате дапсона в форме микрочастиц к дапсону в растворенной форме является значение 5 или менее.

В другом примере настоящее изобретение включает примерно 1% карбомера, примерно 80-90% воды, примерно 10% этоксидигликоля, примерно 0,2% метилпарабена, примерно 0,3%-3,0% дапсона, включающего и дапсон в виде микрочастиц, и растворенный дапсон, и примерно 2% щелочного материала. Более конкретно, карбомер может включать карбопол 980 («CARBOPOL®980»), и щелочной материал может включать раствор гидроксида натрия.

Способы лечения

Соединения-аналоги АСТН могут использоваться для лечения множества АСТН-ассоциированных состояний. Способы лечения включают введение одного или нескольких соединений-аналогов АСТН для снижения уровня АСТН-индуцированной секреции гормона надпочечником, для ослаблении эффектов высоких уровней АСТН у пациентов или для блокирования избытка АСТН, при сопутствующем поддержании функции надпочечника в состоянии тонуса. Соединения-аналоги АСТН могут использоваться при лечении заболеваний, связанных с уровнями АСТН, таких как состояние, отзывчивое на модуляцию рецепторов АСТН (таких как MC-2R). Соединения-аналоги АСТН могут вводиться для лечения состояний, отзывчивых на регуляцию уровня АСТН, например, для снижения эффекта высоких уровней АСТН у пациентов, при поддержании функции надпочечника в состоянии тонуса.

Композиции с аналогом АСТН используются, например, при лечении АСТН-ассоциированных состояний, таких как синдром Кушинга, ослабленный иммунитет в результате гиперсекреции кортикостероида, инициация преждевременных родов (например, по оси гипоталамус-гипофиз-надпочечник) и родственные состояния. В одном аспекте получают различные аналоги АСТН и вводят пациенту для оценки индукции кортизона.

Соединения-аналоги АСТН могут вводиться для лечения АСТН-продуцирующих опухолей в гипофизе, в сочетании с магнитно-резонансной томографией высокого разрешения. Соединения-аналоги АСТН также могут вводиться при проведении предварительного отбора образцов из пещеристого синуса для установления наличия гиперсекреции гипофизарного АСТН, для пред-оперативного определения локализации опухоли гипофиза и ее латерализации (см., Oldfield, E. W. et al., «Petrosal sinus sampling with and without corticotrophin-releasing hormone for the differential diagnosis of Cushing's syndrome», N Engl J Med., 325: 897-905 (1991); и Findling, J. W. et al., Endocrinol Metab Clin North Am., 30: 729-47 (2001)). Несмотря на то, что 70% микроаденом гипофиза подвергается успешной резекции при использовании транссфеноидальной стратегии, хирургическое «излечивание» микроаденом достигается только у одной трети пациентов в специализированных центрах (Mampalam, T. J. et al., Ann Intern Med., 109: 487-93 (1988)).

Соединения-аналоги АСТН могут также вводиться при лечении опухоли в режиме сочетанного лечения гиперсекреции АСТН или в сочетании с облучением гипофиза для подавления роста опухоли и уровня гормонов. Эффекты облучения могут не проявляться в течение нескольких лет, и в конечном итоге они ассоциированы с повреждением гипофиза и его дисфункцией у большинства пациентов (Brada, M. et al., «The long-term efficacy of conservative surgery and radiotherapy in the control of pituitary adenomas», Clin Endocrinol., 38: 571-8 (1993)). Гиперкортицизм, развивающийся при гиперсекреции кортизола, может быть полностью разрешен путем адреналэктомии (хирургического удаления одного или обоих надпочечников), но данный подход не позволяет добиться подавления роста опухоли гипофиза и, кроме того, он также ассоциирован с другими сопутствующими заболеваниями (см., Trainer, P. et al., «Cushing's syndrome: Therapy directed at the adrenal glands», Endocrinol Metab Clin North Am., 23: 571-584 (1994)).

Соединения-аналоги АСТН могут вводиться в сочетании с такими методами терапии, как сочетанное введение с ципрогептадином, антисеротониновым агентом, используемым для подавления секреции АСТН, но итоговая эффективность такой терапии слабая и использование данного вида терапии было прекращено (Krieger, D. T. et al., «Cyproheptadine-induced remission of Cushing's disease», N Engl J Med. 293: 893-6 (1975)). Хотя противогрибковый препарат кетоконазол подавляет биосинтез кортизола в надпочечниках, этот препарат не подавляет роста опухоли гипофиза или секрецию АСТН, тогда как идиосинкразическое повреждение печени ограничивает его длительное использование (см, Sonino, N. et al., «The use of ketoconazole as an inhibitor of steroid production», N Engl J Med., 317: 812-8 (1987)).

Во время беременности CRH гормон может продуцироваться плацентой и фетальными мембранами в существенных количествах во время третьего триместра беременности (см, Frim, D. М. et al., «Characterization and gestational regulation of corticotrophin-releasing hormone messenger RNA in human placenta», J. Clin. Invest., 82: 287-292 (1988)), что может привести к повышению концентрации CRH гормона в периферической плазме матери, особенно после 30 недели беременности (см., Sasaki, A. et al., «Immunoreactive corticotrophin-releasing hormone in human plasma during pregnancy, labor and delivery», J Clin Endocrinol Metab., 64: 224-229 (1987)); и Goland, R. S. et al., «High levels of corticotrophin-releasing hormone immunoreactivity in maternal and fetal plasma during pregnancy», J Clin Endocrinol Metab., 63: 119-1204 (1986)). Последние исследования дают основания полагать, что плазменные уровни CRH гормона в материнском организме повышаются у женщин в случае преждевременных родов (см., Wolfe, C. D. A. et al., «Plasma corticotrophin releasing factor (CRF) in abnormal pregnancy», Br J Obstet Gyneacol., 95: 1003-1006 (1988)); Warren, W. B. et al., «Elevated maternal plasma corticotrophin-releasing hormone levels in pregnancies complicated by preterm labor», Am J Obstet Gynecol., 166: 1198-1207 (1992)); and McLean, M. et al., «A placental clock controlling the length of human pregnancy», Nat Med., 1: 460-463 (1995)) и снижаются в тех случаях, когда возможны запоздалые роды (McLean et al., supra).

Аналоги АСТН могут использоваться в сочетании с токолитическими препаратами или препаратами, предотвращающими развитие родов или задерживающими роды. Примеры токолитических препаратов включают ритодрин и тербуталин, которые представляют собой бета-симпатомиметики. Однако для достижения эффективности данные препараты должны быть в основном введены до полного начала родов, если их вводить после того, как роды начались, они характеризуются неопределенной эффективностью или безопасностью. Несмотря на то, что токолитические препараты иногда непрерывно вводят на низком уровне беременной женщине, обычно инфузией, в течение того периода времени в развитии беременности, когда имеется высокий риск, обычно примерно от двадцать восьмой до тридцать четвертой недели беременности (28-34 недель), эти препараты могут оказывать нежелательные побочные эффекты на функцию почек, дыхательную функцию, скорость сердечных сокращений и в целом на мышечный тонус организма. Чаще всего используют низкие дозировки, такие как примерно до 0,1 куб.см в час раствора 1 мг/куб.см Тербуталина. Эффективность указанных низких дозировок в плане предотвращения начала родов не всегда достаточна и ее трудно определить количественно. Соответственно, имеется потребность в новых видах лечения и способах воздействия на преждевременные роды. Более важно отметить, что необходимы новые виды лечения и способы воздействия на преждевременные роды, которые бы не сопровождались нежелательными побочными эффектами.

В одном варианте композиции с аналогом АСТН могут вводиться для снижения биосинтеза АСТН. Данный способ лечения может использоваться в сочетании с введением фармацевтических агентов или предпочтительно вместо таких фармацевтических агентов, как, например, метриапон. Предпочтительно, композиции с аналогом АСТН могут вводиться для лечения случаев болезни Кушинга, которая развивается во время беременности, например, как описано в литературе (J.R. Lindsay and L. K. Nieman (2005) «The Hypothalamatic-Pituitary-Adrenal Axis in Pregnancy: Challenges in Disease Detection and Treatment», Endocrine Reviews 26: 775-800)). Лечение данного состояния, обычно направленное на продление беременности или на подготовку к родам, может включать введение полипептида АСТН и/или метриапона, который, как было показано, хорошо переносится и не оказывает побочных эффектов на печеночную функцию матери или на развитие плода. Метриапон может быть введен пациентам для снижения биосинтеза АСТН. Композиции с аналогом АСТН особенно предпочтительны в тех случаях, когда причиной гиперсекреции кортикостероида, как считается, является повышенный уровень АСТН (преимущественно в результате развития опухоли гипофиза у таких женщин), которые вводят, например, как составную часть стратегии, направленной на снижение синтеза кортикостероидов.

В другом аспекте предлагаются способы лечения животных, такие как способы снижения стрессовых гормонов для достижения благоприятного эффекта на состояние здоровья сельскохозяйственных и аквакультурных видов животных, растущих в условиях высокой плотности популяции. Композиции, включающие одно или несколько соединений аналогов АСТН, могут вводиться в рамках способов, направленных на снижение стрессовых гормонов для достижения благоприятного эффекта на состояние здоровья сельскохозяйственных и аквакультурных видов животных, растущих в условиях высокой плотности популяции.

ПРИМЕРЫ

Приведенные ниже примеры даны с целью иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения. Для специалистов в данной области очевидно, что материалы и методики, приведенные в примерах, относятся к тем материалам и методикам, которые авторы изобретения рассматривают как подходящие для практики осуществления настоящего изобретения, и в этой связи могут рассматриваться как предпочтительные способы его осуществления. Однако специалистам в данной области понятно, в свете приведенного выше описания, что в его конкретные варианты могут быть введены многочисленные изменения с получением такого же или аналогичного результата, без отступления от принципов и области настоящего изобретения.

Пример 1. Тест по индукции сывороточного кортикостероида (in vivo)

Аналоги АСТН со сниженной АСТН-опосредованной секрецией кортикостероида в кровь могут быть идентифицированы в рамках теста по индукции сывороточного кортикостероида in vivo для измерения уровня кортикостероида крови после введения аналога АСТН.

Тест по индукции сывороточного кортикостероида in vivo проводят по приведенной ниже процедуре. Вначале проводят внутрибрюшинную инъекцию дексаметазона (0,4 мг/0,1 мл ФБР на мышь; Sigma, St. Louis, MO) двух-трехмесячным самцам мышей FVB/N из колонии мышей, выращиваемых в лабораториях авторов, по пять животных на группу, для супрессии у них эндогенной продукции АСТН (см., Hajos, GT et al., «Stidies of the potency of polypeptides with ACTH action by a new method based on continuous measurement of plasma corticosterone», Steroids Lipids Res 3: 225-228 (1972), Costa, IL, et al., «Mutational analysis of evolutionarily conserved ACTH residues», Gen Сomp Endocrinol, 136: 12-16 (2004), and Karpac, J, et al., «Development, Maintenance, and Function of the Adrenal Gland in Early Postnatal Pro-opiomelanocortin Null Mutant Mice», Endocrinology (2005), опубликованный до печати на сайте 24 февраля 2005 года, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок).

Далее, через девяносто-сто двадцать минут после супрессии дезаметазоном мышам инъецируют подкожно между лопатками либо немодифицированный mACTH(1-24), либо одно из нескольких соединений-аналогов пептида АСТН (1 мкг/0,1 мл ФБР/0,5% БСА), либо один только носитель (контроль) (1 мл ФБР/0,5% БСА). Вводят следующие соединения- аналоги пептида АСТН отдельным мышкам: 1 - мышиный ACTH1-24; 2 - V26F, E30K; 3 - P19W,K21E,Y23R; 4 - E30K,P36R; 5 - ALA19-24; 6 - V26F,P36R; 7 - P19W,K21E; 8 - P19W,K21А,delY23; 9 - P19W,K21А; 10 - KRRP16-19RAAW (AT814) (SEQ ID NO: 20).

В-третьих, через час отбирают кровь в течение периода времени, менее 1 минуты, из маленького разреза в хвосте, быстро замораживают полученную сыворотку и хранят до анализа при температуре -80°С. Сывороточный уровень кортикостерона определяют по методу конкурентного радиоиммуноанализа (набор для РИА с ¹²⁵I; ICN Costa Mesa, CA) в соответствии с рекомендациями производителя. Для каждого анализируемого образца используют один микролитр сыворотки. Образцы анализируют в двойном повторе. Описанные выше результаты для пептидов-аналогов АСТН представлены на графике фиг.1, которые демонстрируют активность в виде процентов от соответствующей активности АСТН. Указанные аналоги АСТН демонстрируют меньшую активность, чем нативный АСТН.

Пример 2. Тест на ингибирование сывороточного кортикостероида (in vivo)

Аналоги АСТН со сниженной АСТН-опосредованной секрецией кортикостероидов в крови могут быть идентифицированы при проведении анализа in vivo на ингибирование кортикостероида сыворотки, с целью определения их способности ингибировать продукцию гормона надпочечника, индуцированную немодифицированным АСТН. Уровень кортикостероида крови у субъектов определяют после введения исследуемого соединения-аналога АСТН в сочетании с соединением, обладающим кортикостероид-индуцирующей активностью, таким как АСТН или другой аналог АСТН. Исследуемое соединение-аналог АСТН может вводиться до, одновременно или после кортикостероид-продуцирующего соединения.

Тест in vivo на ингибирование сывороточного кортикостероида проводят по следующей методике. Исследуемые соединения-аналоги АСТН, такие как соединения, демонстрирующие низкую активность по результатам тестирования в рамках примера 1, исследуют на их способность ингибировать продукцию гормона надпочечника, индуцированную немодифицированным АСТН.

Во-первых, двух-трехмесячным самцам мышей FVB/N из колонии мышей, выращиваемых в лаборатории авторов, по пять животных на группу, инъецируют внутрибрюшинно дексаметазон (0,4 мг/0,1 мл ФБР на мышь; Sigma, St. Louis, MO) для подавления у них эндогенной продукции АСТН.

Во-вторых, через девяносто-сто двадцать минут животным инъецируют подкожно между лопатками дикий тип АСТН и/или исследуемые пептидные аналоги АСТН (1 мкг/0,1 мл ФБР/0,5% БСА) или один только носитель (0,1 мл ФБР/0,5% БСА).

В-третьих, через час отбирают кровь в течение периода времени, менее 1 минуты, из маленького разреза в хвосте, быстро замораживают полученную сыворотку и хранят до анализа при температуре -80°С. Сывороточный уровень кортикостерона определяют по методу конкурентного радиоиммуноанализа (набор для РИА с ¹²⁵I; ICN Costa Mesa, CA) в соответствии с рекомендациями производителя. Для каждого исследуемого образца используют один микролитр сыворотки. Образцы анализируют в двойном повторе.

На графике фиг.2 приведены результаты, полученные в соответствии с указанной выше методикой, для аналога АТ814 (SEQ ID NO: 20). Эффективность пептидов выражают в виде процента индукции кортикостерона, принимая эффективность нативного мышиного АСТН за 100%. Полученный таким образом результат индукции кортикостерона через 1 час после последней инъекции пептида указывает на то, что АТ814 снижает индукцию кортикостерона на 35% от соответствующего значения для АСТН дикого типа, в случае его применения за 30 минут до инъекции АСТН, и на 10% от значения, характерного для АСТН дикого типа, если его вводили одновременно с инъекцией АСТН.

Пример 3. Тест на связывание с мембраной надпочечника (in vitro)

Аналоги АСТН, обладающие способностью связываться с рецепторами надпочечника, могут быть идентифицированы при проведении теста на связывание с мембраной надпочечника in vitro. С этой целью может быть определено количество радиоактивно меченного исследуемого соединения-аналога АСТН, связывающееся с изолированной мембраной надпочечника, для идентификации аналогов АСТН с активностью по связыванию с рецептором надпочечника. Предпочтительно, данный тест проводят в бессывороточной среде (бессывороточный тест in vitro на связывание с мембраной надпочечника).

Аналоги АСТН со способностью связываться с рецепторами надпочечника с большей аффинностью, чем соединения с известной связывающей способностью в отношении надпочечника (предпочтительно АСТН) могут быть также идентифицированы при проведении конкурентного теста in vitro на связывание с надпочечниками, что позволяет измерить снижение количества радиоактивно меченного соединения, связавшегося с надпочечником (например, АСТН) при разных концентрациях не меченного радиоактивностью исследуемого соединения-аналога АСТН в среде, содержащей изолированную мембрану надпочечника. Снижение у радиоактивно меченного соединения, связывающегося с мембраной надпочечника, способности к такому связыванию с мембраной надпочечника может быть использовано для идентификации и характеристики связывающей активности исследуемых соединений-аналогов АСТН. В серии конкурентных тестов in vitro по связыванию с мембраной надпочечника снижение уровня связывания радиоактивно меченного АСТН измеряют при добавлении исследуемого соединения-аналога АСТН к среде с мембраной надпочечника.

Конкурентный бессывороточный тест in vitro по связыванию с мембраной надпочечника проводят по следующей методике. Вначале отбирают надпочечники у мышей, освобождают их от жира и разрезают на две части (см., Costa, JL, et al., «Mutational analysis of evolutionarily conserved ACTH residues», Gen Сomp Endocrinol, 136: 12-16 (2004), и Weber, MM, et al., «Postnatal overexpression of insulin-like growth factor II in transgenic mice is associated with adrenocortical hyperplasia and enhanced steroidogenesis», Endocrinology 140: 1537-1543 (1999), включенные в настоящее описание в качестве ссылок).

Во-вторых, каждую половинку надпочечника помещают в отдельную ячейку 4-ячеечной чашки, из расчета по одной чашке на мышь. Половинки надпочечников инкубируют в атмосфере 5% CO₂, при температуре 37°C в 0,5 мл бессывороточной среды (M199; Invitrogen) в течение 30 минут до уравновешивания.

В-третьих, половинки надпочечников подвергают мацерации или диссоциации по иному методу с использованием гомогенизатора Dounce с получением мембранной фракции. Фракцию подвергают ресуспендированию в подходящем буфере (Трис или HEPES). Затем добавляют радиоактивно меченный по ¹²⁵I АСТН (200 мл) и не меченное радиоактивностью исследуемое соединение (например, АСТН или аналог АСТН, такой как АТ814 (SEQ ID NO: 20)) к ресуспендированной мембранной фракции в количестве, обеспечивающем достижение общей концентрации исследуемого соединения 0 нМ, 10 нМ, 100 нМ и 1000 нМ; в контроли не добавляют пептиды. Мембранную фракцию восстанавливают и на гамма-счетчике определяют радиоактивный сигнал. Снижение радиоактивного сигнала, выявляемое после добавления не меченного радиоактивностью исследуемого соединения, может коррелировать со связывающей аффинностью разных исследуемых соединений. Снижение радиоактивного сигнала после добавления исследуемых соединений-аналогов пептида АСТН может указывать на их повышенную аффинность по связыванию с рецепторами АСТН надпочечника, такими как MС-2R, и на их способность замещать АСТН на рецепторе надпочечника MС-2R.

На фиг.3 показаны результаты, полученные в серии бессывороточных конкурентных тестов in vitro по связыванию с мембраной надпочечника.

Пример 4. Тест по ингибированию функции надпочечников (in vitro)

Аналоги АСТН, которые снижают или блокируют АСТН-опосредовнную секрецию кортикостероида из мембраны надпочечника, могут быть идентифицированы при проведении бессывороточного теста in vitro на ингибирование кортикостероида для определения их способности ингибировать продукцию гормона надпочечника, индуцированную немодифицированным АСТН. Уровень кортикостероида в бессывороточных средах определяют после добавления исследуемого соединения-аналога АСТН в сочетании с соединением с известной кортикостероид-индуцирующей активностью, таким как АСТН или другой аналог АСТН. Исследуемое соединение-аналог АСТН может быть добавлено до, одновременно или после кортикостероид-продуцирующего соединения.

Бесывороточный тест in vitro на ингибирование функции надпочечника проводят по приведенной ниже методике. Во-первых, отбирают от мышей надпочечники, освобождают их от жира и разрезают на две части (см., Costa, JL, et al., «Mutational analysis of evolutionarily conserved ACTH residues», Gen Сomp Endocrinol, 136: 12-16 (2004); и Weber, MM, et al., «Postnatal overexpression of insulin-like growth factor II in transgenic mice is associated with adrenocortical hyperplasia and enhanced steroidogenesis», Endocrinology 140: 1537-1543 (1999), включенные в настоящее описание в качестве ссылок).

Во-вторых, каждую половинку надпочечников помещают в отдельную ячейку 4-ячеечной чашки, из расчета по одной чашке на мышь. Половинки надпочечников инкубируют в атмосфере 5% CO₂, при температуре 37°C в 5 мл бессывороточной среды (M199; Invitrogen) в течение 30 минут, до уравновешивания.

В-третьих, отбирают среду и заменяют на 0,5 мл среды М199, содержащей АСТН, АТ814 или оба соединения, в концентрации по 100 нг/мл каждое; в контроли не добавляют пептиды.

В-четвертых, по прошествии 3 часов инкубации среду удаляют, объединяют все четыре половинки от каждой мыши и анализируют уровень кортикостерона по стандартным методикам РИА. Кортикостерон определяют по методу конкурентного радиоиммуноанализа (набор для РИА с ¹²⁵I; ICN Costa Mesa, CA) в соответствии с рекомендациями производителя. Для каждого анализируемого образца берут один микролитр сыворотки. Образцы анализируют в двойном повторе. На фиг.4 показаны полученные результаты.

Пример 5 (Предполагаемый). Применение в ветеринарии для лечения

При выращивании рыб возникает множество проблем, поскольку коммерческие интересы требуют повышения общего тоннажа при разведении рыбы, что создает проблемы, определяемые высокой плотностью популяции и распространением инфекции. В таких условиях рыбы пытаются противодействовать хроническим стрессовым воздействиям по оси гипоталамус-гипофиз-межпочечные взаимодействия (HPI). Тогда как повышение уровня кортикостероида обычно сопровождается определенным уровнем смертности, десенсибилизацией к действию кортикостероида, а далее устанавливается новое состояние гомеостаза применительно к имеющейся плотности популяции. Однако, к сожалению, такие циклы «корректировки», связанные с длительным повышением уровней кортикостероида, наоборот, снижают резистентность к инфекции.

HPI при выращивании рыб может модулироваться введением аналога АСТН с пролонгированным высвобождением согласно настоящему изобретению, например введением указанного аналога с длительным высвобождением из силастиновой капсулы, имплантированной таким рыбам. Такое забуферивание по оси HPI должно способствовать повышению выживаемости и ускорению набора веса у hACTHery рыб.

Рыбы с имплантированным аналогом АСТН согласно настоящему изобретению или только с одним аналогом АСТН могут подвергаться условиям окружающей среды, которые активируют ось HPI (например, высокая плотность популяции, сдвиги в значении pH, воздействие аммиака и нитратов). Двумя параметрами, которые могут быть проанализированы в этих условиях, являются уровень смертности и изменение веса. Такие параметры будут показывать, является ли данный аналог АСТН согласно настоящему изобретению эффективным по снижению уровня кортикостерона у рыб.

Claims

1. Аналог пептида адренокортикотропного гормона (АСТН), применяемый для лечения АСТН-ассоциированного состояния, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20.

2. Аналог пептида по п.1, отличающийся тем, что в бессывороточном конкурентном тесте in vitro на связывание аналог пептида с последовательностью SEQ ID NO:20 связывается с мембраной надпочечника и замещает пептид с последовательностью SEQ ID NO:2 из мембраны надпочечника.

3. Аналог пептида по п.2, отличающийся тем, что он связывается с MC-2R мембраны надпочечника с аффинностью, превышающей по меньшей в два раза аффинность пептида с последовательностью SEQ ID NO:2.

4. Аналог пептида по п.1, отличающийся тем, что в бессывороточном тесте in vitro на ингибирование функции надпочечника он снижает АСТН-индуцированную продукцию кортикостерона мембраной надпочечника.

5. Композиция для снижения уровня кортикостерона, включающая эффективное количество аналога пептида АСТН по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

6. Композиция по п.5, отличающаяся тем, что в тесте in vivo на ингибирование продуцирования сывороточного кортикостероида композиция снижает АСТН-индуцированную индукцию кортикостероида по меньшей мере на 10%.

7. Композиция по п.5, отличающаяся тем, что в тесте in vivo на индукцию сывороточного кортикостероида композиция снижает АСТН-индуцированную продукцию кортикостерона по меньшей мере на 10%.

8. Применение аналога пептида АСТН по п.1 для снижения уровня кортикостероидов у пациента, нуждающегося в этом.

9. Применение по п.8, где указанный пациент страдает от болезни Кушинга.

10. Применение композиции по п.5 для снижения уровня кортикостероидов у пациента, нуждающегося в этом.

11. Применение по п.10, где указанный пациент страдает от болезни Кушинга.