RU2425383C1 - СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ C1r2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА - Google Patents

СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ C1r2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА Download PDF

Info

Publication number
RU2425383C1
RU2425383C1 RU2010115978/15A RU2010115978A RU2425383C1 RU 2425383 C1 RU2425383 C1 RU 2425383C1 RU 2010115978/15 A RU2010115978/15 A RU 2010115978/15A RU 2010115978 A RU2010115978 A RU 2010115978A RU 2425383 C1 RU2425383 C1 RU 2425383C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
component
human
subcomponents
functional activity
complement
Prior art date
Application number
RU2010115978/15A
Other languages
English (en)
Inventor
Леонид Васильевич Козлов (RU)
Леонид Васильевич Козлов
Анна Мироновна Бичучер (RU)
Анна Мироновна Бичучер
Наталья Вадимовна Гора (RU)
Наталья Вадимовна Гора
Original Assignee
Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека filed Critical Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Priority to RU2010115978/15A priority Critical patent/RU2425383C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2425383C1 publication Critical patent/RU2425383C1/ru

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицинской иммунологии и представляет собой способ определения функциональной активности субкомпонентов C1r2s2 первого компонента комплемента человека, предусматривающий сорбцию в лунках микропанели активатора классического пути комплемента, внесение раствора, содержащего сыворотку морской свинки и этилендиаминтетраацетат натрия, затем после инкубации и осушения планшета внесение анализируемой пробы, содержащей комплекс C1r2s2 комплемента человека с неизвестной активностью, и псевдоглобулиновой фракции сыворотки крови человека, получаемой диализом против дистиллированной воды, (R1), а также буферного раствора, содержащего ионы кальция и магния, проведение инкубации и после отмывки и осушения планшета внесение в лунки конъюгата фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрата этого фермента, проведение расчета активности субкомпонентов C1r2s2 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции, отличающийся тем, что в качестве активатора классического пути комплемента используют деринат, а также набор для определения функциональной активности субкомпонентов C1r2s2 первого компонента комплемента человека. Изобретение обеспечивает разработку способа определения функциональной активности комплекса Clr2s2 комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов. 2 н.п.ф-лы, 1 ил.

Description

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Субкомпоненты C1r и C1s, синтезируемые в организме в равных количествах и представляющие собой зимогены протеиназ, образуют прочный Ca-зависимый тетрамерный комплекс C1r2s2, связанный с субкомпонентом C1q также Ca-зависимым образом и формирующий с ним компонент C1. При связывании C1 с иммунным комплексом происходит активация протеиназ C1r и C1s. Активация этих ферментов - существенный этап инициации каскада активации комплемента по классическому пути, поэтому их функциональный дефицит может быть причиной различного рода патологических состояний организма.
Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Однако имеющиеся на сегодня методы иммуноферментного анализа белков комплемента позволяют определять лишь их содержание как антигена. Тем не менее наиболее информативным является оценка функциональной активности этих белков, которая и характеризует развитие патологического процесса. Известен способ определения функциональной активности компонентов C1r2s2 [1], который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета иммуноглобулина G, затем внесение в лунки микропланшета сыворотки морской свинки в присутствии этилендиаминтетраацетата натрия для сорбции на иммуноглобулине только субкомпонента C1q. После освобождения лунок микропланшета от жидкости и их промывки в лунки вносят буферный раствор с ионами кальция, анализируемые пробы, содержащие комплекс C1r2s2 с неизвестной активностью, и псевдоглобулиновую фракцию сыворотки человека (супернатант после осаждения эуглобулинов сыворотки диализом против дистиллированной воды при pH 5,5) в качестве источника компонентов С4, С2 и С3. При проведении инкубации для активации комплемента происходит ковалентное связывание C3b на сорбированном иммуноглобулине в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого комплекса C1r2s2. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С3 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3-фракции иммуноглобулинов G, конъюгированных с ферментом.
Недостатком этого способа является трудность получения иммунохимически чистых препаратов иммуноглобулина G человека и плохое сохранение активирующей способности при хранении.
Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность комплекса C1r2s2 комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата для использования в качестве активатора классического пути комплемента.
Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели аптечного препарата дерината, представляющего собой дезоксирибонуклеат натрия, хорошо сохраняемый в обычных условиях, затем внесение в лунки микропланшета сыворотки морской свинки в присутствии этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) для сорбции на деринате только субкомпонента C1q. После освобождения лунок микропланшета от жидкости и их промывки в лунки вносят буферный раствор с ионами кальция, анализируемые пробы, содержащие комплекс C1r2s2 с неизвестной активностью, и псевдоглобулиновую фракцию сыворотки человека (супернатант после осаждения эуглобулинов сыворотки диализом против дистиллированной воды при pH 5,5) в качестве источника компонентов С4, С2 и С3. При проведении инкубации для активации комплемента происходит ковалентное связывание C3b в лунках микропанели в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого комплекса C1r2s2. Количество связавшегося в результате активации компонента С3 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3-фракции иммуноглобулинов G, конъюгированных с ферментом. Тем самым достигается определение функциональной активности C1r2s2 иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа определения функциональной активности комплекса C1r2s2 комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов.
Пример 1. Определение функциональной активности субкомпонентов C1r2s2 первого компонента комплемента человека. Аптечный препарат дерината в 0,15 М NaCl в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°C. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, pH 7,4 (VBSE), содержащим 0,15 М NaCl, 50 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора VBSE и 1,25 мкл сыворотки морской свинки. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C и отмывки вероналовым буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Ca2+ и 0,5 мМ Mg2+ (VBS2*), в лунки микропанели вносят по 100 мкл раствора VBS2+, содержащего 15 мкл псевдоглобулиновой фракции сыворотки человека (супернатант после осаждения эуглобулинов сыворотки диализом против дистиллированной воды при pH 5,5 - реагент R1) и анализируемую пробу, содержащую комплекс C1r2s2 с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, двукратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, (ЗФР-Т) и осушения микропанели в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента С3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, отмывки ЗФР-Т и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера с ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 5-10 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Функциональную активность C1r2s2 рассчитывают по стандартной кривой (см. чертеж).
Пример 2. Набор для определения функциональной активности субкомпонентов C1r2s2 первого компонента комплемента человека содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом и C1q морской свинки, конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту С3 комплемента человека, реагент R1, субстратный буфер и стандарт с известной активностью C1r2s2.
Из приведенных на чертеже результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от активности C1r2s2 с коэффициентом корреляции R2=0,995, что позволяет достоверно определять функциональную активность C1r2s2 описанным способом с использованием описанного набора.
ЛИТЕРАТУРА
Козлов Л.В., Колесникова Е.А., Дьяков В.Л. Способ определения функциональной активности субкомпонентов C1r2s2 первого компонента комплемента человека. Патент РФ 2251698. Бюл. № 13. 10.05.2005.

Claims (2)

1. Способ определения функциональной активности субкомпонентов C1r2s2 первого компонента комплемента человека, предусматривающий сорбцию в лунках микропанели активатора классического пути комплемента, внесение раствора, содержащего сыворотку морской свинки и этилендиамин-тетраацетат натрия, затем после инкубации и осушения планшета внесение анализируемой пробы, содержащей комплекс C1r2s2 комплемента человека с неизвестной активностью, и псевдоглобулиновой фракции сыворотки крови человека, получаемой диализом против дистиллированной воды, (R1), а также буферного раствора, содержащего ионы кальция и магния, проведение инкубации и после отмывки и осушения планшета внесение в лунки конъюгата фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрата этого фермента, проведение расчета активности субкомпонентов C1r2s2 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции, отличающийся тем, что в качестве активатора классического пути комплемента используют деринат.
2. Набор для определения функциональной активности субкомпонентов C1r2s2 первого компонента комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом и C1q морской свинки, конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту С3 комплемента человека, реагент R1, субстратный буфер и стандарт с известной активностью C1r2s2.
RU2010115978/15A 2010-04-22 2010-04-22 СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ C1r2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА RU2425383C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2010115978/15A RU2425383C1 (ru) 2010-04-22 2010-04-22 СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ C1r2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2010115978/15A RU2425383C1 (ru) 2010-04-22 2010-04-22 СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ C1r2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2425383C1 true RU2425383C1 (ru) 2011-07-27

Family

ID=44753679

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2010115978/15A RU2425383C1 (ru) 2010-04-22 2010-04-22 СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ C1r2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2425383C1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2542399C1 (ru) * 2013-11-06 2015-02-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ определения интегральной функциональной активности компонента с1 комплемента человека

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2251698C1 (ru) * 2003-12-09 2005-05-10 Государственное учреждение "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Министерства здравоохранения Российской Федерации" СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ C1r2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2251698C1 (ru) * 2003-12-09 2005-05-10 Государственное учреждение "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Министерства здравоохранения Российской Федерации" СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ C1r2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
КОЗЛОВ Л.В., КРЫЛОВА Ю.И., ЧИХ В.П., МОЛЧАНОВА Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, С3, С4 и С5, Биоорганическая химия. 1982. т.8. № 5. С.652-659. Arlaud G.J. et. al., Structural biology of C1: dissection of a complex molecular machinery, Immunol Rev., 2001 Apr., 180, pp 136-45. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2542399C1 (ru) * 2013-11-06 2015-02-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ определения интегральной функциональной активности компонента с1 комплемента человека

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108445230B (zh) 基于纳米抗体的降钙素原化学发光检测试剂及检测方法
RU2417375C2 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека
CN101718779A (zh) 检测人血清铜蓝蛋白的免疫纳米金同步散射光谱试剂盒及其使用方法
RU2232991C1 (ru) Способ определения функциональной активности фактора d комплемента человека
US9146233B2 (en) Detecting molecular interactions by fluorescence resonance energy transfer on a solid-phase support
RU2380707C1 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации
RU2425383C1 (ru) СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ C1r2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА
RU2232992C1 (ru) Способ определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации
WO2011149272A9 (ko) 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 정성적 및 정량적 분석방법
RU2195662C1 (ru) Способ определения функциональной активности c1-ингибитора комплемента человека
RU2405042C1 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с2 комплемента человека
RU2376606C1 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с4 комплемента человека
RU2232993C1 (ru) Способ определения функциональной активности фактора b комплемента человека
RU2506594C1 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека
RU2376605C1 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека
RU2413224C1 (ru) СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА C1q КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА
RU2253118C1 (ru) Способ определения функциональной активности компонента c4 комплемента человека
RU2374650C1 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора в комплемента человека
RU2450275C1 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с9 комплемента человека по альтернативному пути
RU2195670C1 (ru) Способ определения функциональной активности компонента c2 комплемента человека
RU2235329C1 (ru) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ Clr2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА
RU2251698C1 (ru) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ C1r2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА
RU2251697C1 (ru) Способ определения функциональной активности компонента c3 комплемента человека по классическому пути активации
RU2495432C1 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с4 комплемента человека
RU2457491C1 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с9 комплемента человека по классическому пути

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20170423