RU2819002C1 - Левовращающий бициклический морфолин и его соль, способ его получения, его фармацевтическая композиция и применение - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области фармацевтической химии, а именно к левовращающему бициклическому морфолину или его фармацевтически приемлемой соли, отличающемуся тем, что структура левовращающего бициклического морфолина представлена соединением 5 и его фармацевтически приемлемая соль имеет структурную формулу (I), способу его получения, к его фармацевтической композиции и его применению при производстве лекарственных препаратов для предотвращения или лечения заболеваний печени. Технический результат изобретения заключается в получении левовращающего бициклического морфолина и его фармацевтически приемлемой соли, обладающих лучшей фармакологической активностью и фармакокинетическими свойствами с точки зрения противовоспалительного действия и защиты печени, чем рацемат и правовращающий морфолин и его соли. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 ил., 8 табл., 7 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к области фармацевтической химии, и оно конкретно относится к левовращающему бициклическому морфолину и его фармацевтически приемлемой соли, способу его получения, его фармацевтической композиции и его применению при производстве лекарственных препаратов для предотвращения или лечения заболеваний печени и других подобных заболеваний.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Заболевания печени представляют собой тип заболеваний, широко распространенных во всем мире, и Китай является страной, в которой наблюдается высокая частота возникновения заболеваний печени. В настоящее время в Китае имеется множество пациентов с поражениями и воспалениями печени, вызванными различными причинами, преимущественно, вирусным гепатитом. По статистике, прямые экономические потери в год от хронического гепатита (включая цирроз печени и рак печени, вызванный хроническим гепатитом на поздних стадиях) в Китае достигают 900 млрд юаней. На протяжении последних лет, также наблюдается тенденция к увеличению из года в год частоты возникновения заболеваний печени, вызванных приемом лекарств, алкогольного и неалкогольного жирового гепатоза и аутоиммунных заболеваний печени. Поиск безопасных и эффективных лекарственных средств для профилактики и лечения заболеваний печени всегда является чрезвычайно важной темой исследований для различных научно-исследовательских институтов и фармацевтических компаний по всему миру.

Бициклол представляет собой тип химических лекарственных средств первой линии для лечения гепатита в Китае, защищенный в Китае независимыми правами на объекты интеллектуальной собственности, который впервые был разработан Институтом фармакологии Китайской академии медицинских наук (Institute of Materia Medica Chinese Academy of Medical Science), и при применении в клинике он обладает рядом преимуществ, обусловленных высокой эффективностью по защите печени и ферментативной деградацией, определенной активностью против вируса гепатита, удобным способом введения без каких-либо значительных побочных реакций и широкой фармакологической активностью. Связанные с бициклолом научные достижения последовательно из года в год отмечаются множеством наград, в том числе "Награда за достижение в решении национальных ключевых задач в области науки и техники в девятой пятилетке" (2002 год), "Десять самых важных событий в китайской фармацевтической промышленности в 2002 году", Первая премия Пекинского научно-технического прогресса (2005 год), Вторая премия Национального научно-технического прогресса (2007 год) и другие подобные награды, а патентные права на соединение бициклол защищены в шестнадцати странах/регионах, например, в США, Европейском Союзе, Японии, Корее и других странах, и в регионе Тайвань, и он продается в такие страны как Украина. С того дня, когда на пресс-конференции, состоявшейся в Доме народных собраний в 2001 году, было объявлено о появлении бициклола на рынке фармацевтических препаратов, он принес для Китая огромную социальную и экономическую выгоду.

Однако бициклол имеет недостаточную биологическую растворимость в воде, вследствие чего он не обладает высокой биодоступностью. Исследователи из Института фармакологии Китайской академии медицинских наук (Institute of Materia Medica Chinese Academy of Medical Science) оптимизировали структуру бициклола и обнаружили, что бициклический морфолин и его соли обладают хорошей фармакологической активностью и фармакокинетическими свойствами (Wu Song, Sun Hua, et al., Bicyclol Derivative and Preparations and Applications Thereof, 201610922563.5). На основании предыдущих результатов, исследователи выделили рацемат бициклического морфолина и обнаружили, что левовращающий бициклический морфолин и его соли обладают лучшей фармакологической активностью и фармакокинетическими свойствами с точки зрения противовоспалительного действия и защиты печени, чем рацемат и правоврающий морфолин и его соли.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Технической задачей, решаемой в изобретении, является создание левовращающего бициклического морфолина и его фармацевтически приемлемой соли, способа его получения и применения при производстве лекарственных препаратов для предотвращения или лечения заболевания печени и других подобных заболеваний.

Для решения этой технической задачи, в изобретении предлагаются следующие технические решения.

В первом аспекте технического решения по изобретению, предлагается левовращающий бициклический морфолин со структурой, представленной как соединение 5, и его фармацевтически приемлемая соль, имеющая структура, представленную формулой (I):

.

В изобретении, фармацевтически приемлемая соль присоединения кислоты может быть получена из неорганических кислот и органических кислот. В изобретении, X выбирают из неорганических кислот и органических кислот, и неорганические кислоты выбирают из фтористоводородной кислоты, хлористоводородной кислоты, бромистоводородной кислоты, йодистоводородной кислоты, уксусной кислоты, серной кислоты и фосфорной кислоты; органические кислоты выбирают из уксусной кислоты, трифторуксусной кислоты, пропионовой кислоты, щавелевой кислоты, яблочной кислоты, малоновой кислоты, янтарной кислоты, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, лимонной кислоты, бензойной кислоты, коричной кислоты, миндальной кислоты, метансульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, п- толуолсульфоновой кислоты, салициловой кислоты, хинной кислоты, камфорной кислоты, камфорсульфоновой кислоты, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, пироглутаминовой кислоты, L-винной кислоты, L-дибензоилвинной кислоты, L-ди-п-метилбензоилвинной кислоты, L-диэтилтартрата, L-яблочной кислоты, L-камфорной кислоты, L-10-камфорсульфоновой кислоты, R-(-)-миндальной кислоты, L-хинной кислоты, L-аспарагиновой кислоты, L-глутаминовой кислоты, L-пироглутаминовой кислоты, D-винной кислоты, D-дибензоилвинной кислоты, D-ди-п-метилбензоилвинной кислоты, D-диэтилтартрата, D- яблочной кислоты, D-камфорной кислоты, D-10-камфорсульфоновой кислоты, S-(-)- миндальной кислоты, D-хинной кислоты, D-аспарагиновой кислоты, D-глутаминовой кислоты и D- пироглутаминовой кислоты, где отношение свободного основания к кислоте составляет необязательно 1:1, 2:1 или 3:1. В изобретении, предпочтительная структура представлена ниже:

.

Во втором аспекте технического решения по изобретению, предлагается способ получения левовращающего бициклического морфолина и его фармацевтически приемлемой соли по первому аспекту, который представлен ниже:

a) хлорирование гидроксильной группы бициклола с получением соединения 2;

b) реакция соединения 2 с морфолином с получением соединения 3;

c) образование соли путем реакции соединения 3 с хиральной кислотой Y, и проведение разделения в органическом растворителе с использованием различия растворимости соли с получением соли 4 в форме левоврающего энантиомера, при этом левоврающий энантиомер имеет энантиомерную чистоту (%e.e.) более чем 95,0%, где хиральную кислоту Y выбирают из L-винной кислоты, L-дибензоилвинной кислоты, L-ди-п-метилбензоилвинной кислоты, L-диэтилтартрата, L-яблочной кислоты, L-камфорной кислоты, L-10-камфорсульфоновой кислоты, R-(-)-миндальной кислоты, L-хинной кислоты, L-аспарагиновой кислоты, LL-пироглутаминовой кислоты, D-винной кислоты, D-дибензоилвинной кислоты, D-ди-п-метилбензоилвинной кислоты, D-диэтилтартрата, D- яблочной кислоты, D-камфорной кислоты, D-10-камфорсульфоновой кислоты, S-(-)-миндальной кислоты, D-хинной кислоты, D-аспарагиновой кислоты, D-глутаминовой кислоты, D- пироглутаминовой кислоты и производных указанных выше кислот, где отношение свободного основания к кислоте составляет необязательно 1:1, 2:1 или 3:1, органический растворитель выбирают из этилацетата, ацетона, метанола, этанола, изопропанола и смешанных растворителей;

d) перевод соли 4 в форму свободного амина путем реакции с основанием;

e) образование соли путем реакции свободной формы амина 5 с кислотой X с получением соединения формулы I.

В изобретении, определения для X являются такими же, как определения в первом аспекте технического решения по изобретению.

В третьем аспекте технического решения по изобретению, предлагается фармацевтическая композиция, включающая терапевтически и/или профилактически эффективное количество левовращающего бициклического морфолина и его фармацевтически приемлемой соли по первому аспекту настоящего изобретения, и, необязательно, один или более фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ.

Фармацевтическая композиция может быть приготовлена хорошо известными в данной области методами. Соединение по изобретению может быть объединено с одним или более фармацевтически приемлемыми твердыми или жидкими вспомогательными веществами и/или адъювантами для приготовления любой лекарственной формы, подходящей для применения в случае человека или животного. Соединение по изобретению обычно присутствует в фармацевтической композиции в количестве от 0,1 до 95% по массе.

Соединение по изобретению или содержащие его фармацевтические композиции могут быть введены в лекарственной форме с разовой дозой, и способы введения могут быть энтеральными или парентеральными, такими как пероральное введение, внутривенная инъекция, внутримышечная инъекция, подкожная инъекция, введение через носовую полость, введение через слизистую оболочку полости рта, внутриглазное введение, введение через легкие и дыхательные пути, введение через кожу, вагинальное введение, ректальное введение и другие подобные способы.

Лекарственная форма для введения может быть жидкой лекарственной формой, твердой лекарственной формой или полутвердой лекарственной формой. Жидкая лекарственная форма может представлять собой раствор (включая истинный раствор и коллоидный раствор), эмульсию (включая эмульсию типа масло-в-воде, типа вода-в-масле и комплексную эмульсию), суспензию, инъекцию (включая водную инъекцию, порошок для инъекций и инфузию), глазные капли, капли в нос, лосьон и линимент; твердая лекарственная форма может представлять собой таблетку (включая обычную таблетку, таблетку с энтеросолюбильным покрытием, буккальную таблетку, диспергируемую таблетку, жевательную таблетку, шипучую таблетку и таблетку, распадающуюся во рту), капсулу (включая твердую капсулу, мягкую капсулу и капсулу с энтеросолюбильным покрытием), гранулы, порошок, микросферы, матричные пилюли, суппозиторий, пленка, пластырь, аэрозоль (порошок), спрей и другие подобные формы; полутвердая лекарственная форма может представлять собой мазь, гель, пасту и другие подобные формы

Соединение по изобретению может быть приготовлено в обычной форме лекарственного препарата, а также в форме препарата с замедленным высвобождением, в форме препарата с контролируемым высвобождением, в форме препарата с направленной доставкой к ткани или органу-мишени и в форме различных систем введения микрочастиц.

Для того чтобы приготовить соединение по изобретению в форме таблетки, может быть использован целый ряд различных вспомогательных веществ, известных в фармацевтике, в том числе разбавители, связующие вещества, смачивающие вещества, разрыхлители, смазывающие вещества и сорастворители. Разбавители могут представлять собой крахмал, декстрин, сахарозу, глюкозу, лактозу, маннит, сорбит, ксилит, микрокристаллическую целлюлозу, сульфат кальция, гидрофосфат кальция, карбонат кальция и другие подобные вещества; смачивающие вещества могут представлять собой воду, этанол, изопропанол и другие подобные вещества; связующие вещества могут представлять собой крахмальную суспензию, декстрин, сиропы, пчелиный мед, раствор глюкозы, микрокристаллические целлюлозы, суспензию аравийской камеди, суспензию желатина, карбоксиметилцеллюлозу натрия, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, этилцеллюлозу, акриловую смолу, полимеры акриловой кислоты, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и другие подобные вещества; разрыхлители могут представлять собой сухой крахмал, микрокристаллическую целлюлозу, низкозамещенную гидроксипропилцеллюлозу, сшитый поливинилпирролидон, сшитую карбоксиметилцеллюлозу натрия, карбоксиметилкрахмал натрия, бикарбонат натрия и лимонную кислоту, эфир полиоксиэтилена сорбита и жирных кислот, додецилсульфат натрия и другие подобные вещества; смазывающие вещества и сорастворители могут представлять собой порошок талька, силикагель, стеарат, винную кислоту, жидкий парафин и полиэтиленгликоль.

Таблетки могут быть также приготовлены в форме таблеток, покрытых оболочкой, такой как таблетки с сахарным покрытием, таблетки с пленочным покрытием, таблетки с энтеросолюбильным покрытием или таблетки с двухслойным покрытием и многослойным покрытием.

Для того чтобы приготовить разовую дозу для введения в форме капсул, действующий ингредиент, соединение по изобретению, смешивают с разбавителем и сорастворителем, и полученную смесь непосредственно помещают в твердые капсулы или мягкие капсулы. Также, действующий ингредиент, соединение по изобретению, смешивают с разбавителем, связующим веществом и разрыхлителем для приготовления гранул или микросфер, и затем помещают в твердые капсулы или мягкие капсулы. Различные виды разбавителя, связующего вещества, смачивающего вещества, разрыхлителя и сорастворителя для приготовления таблеток соединения по изобретению могут быть также использованы для приготовления капсул соединения по изобретению.

Для того чтобы приготовить соединение по изобретению в форме инъекции, в качестве растворителя могут быть использованы вода, этанол, изопропанол, пропиленгликоль или их смеси, и могут быть добавлены соответствующие количества солюбилизаторов, сорастворителей, регуляторов pH и регуляторов осмотического давления, обычно используемых в фармацевтике; солюбилизаторы или сорастворители могут представлять собой полоксамер, лецитин, гидроксипропил-β-циклодекстрин и другие подобные вещества; регуляторы pH могут представлять собой фосфат, ацетат, хлористоводородную кислоту, гидроксид натрия и другие подобные вещества; регуляторы осмотического давления могут представлять собой хлорид натрия, маннит, глюкозу, фосфат, ацетат и другие подобные вещества. В случае приготовления лиофилизированного порошка для инъекции, могут быть добавлены маннит и глюкоза в качестве проппанта.

Кроме того, в лекарственную форму могут быть также добавлены окрашивающие вещества, консерванты, ароматизаторы или другие добавки, если это желательно.

Для достижения целей введения и усиления терапевтических эффектов, лекарственные средства или фармацевтические композиции по изобретению могут быть введены любыми известными способами введения.

Доза введения фармацевтических композиций, включающих соединение по изобретению, может изменяться в широком диапазоне в зависимости от природы и тяжести предотвращаемых или подвергаемых лечению заболеваний, индивидуального состояния пациентов или животных, способов введения и лекарственных форм. Обычно, подходящим диапазоном суточной дозы для соединений по изобретению является диапазон 0,001-5 мг/кг массы тела. Упомянутая выше доза может быть введена в форме разовой дозы или может быть разделена на несколько единиц дозы, в зависимости от клинического опыта лечащего врача и режима дозирования, включая использование других терапевтических средств.

Соединения или композиции по изобретению могут быть введены в форме монотерапии или в комбинации с другими терапевтическими или симптоматическими лекарственными средствами. В случае, когда соединение по изобретению проявляет синергетические эффекты при использовании с другими терапевтическими средствами, его доза должна быть скорректирована в соответствии с реальной ситуацией.

В четвертом аспекте технического решения по настоящему изобретению предлагается применение левовращающего бициклического морфолина и его фармацевтически приемлемой соли по первому аспекту и фармацевтической композиции по третьему аспекту при производстве лекарственных препаратов для предотвращения или лечения заболеваний печени. В изобретении, заболевания печени выбирают из заболеваний, связанных с повреждением печени, и гепатитов, в частности гепатита A, гепатита B, гепатита C, заболеваний печени, обусловленных действием лекарственного средства, алкогольных заболеваний печени, неалкогольных заболеваний печени, аутоиммунных заболеваний печени, фиброза печени, вызванного прогрессированием заболевания печени, цирроза печени и печеночной недостаточности.

ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Левовращающий бициклический морфолин и его фармацевтически приемлемая соль в изобретении проявляют более высокую фармакологическую активность, чем правовращающий энантиомер и рацемат в различных экспериментальных моделях повреждения печени на животных, со статистически значимым различием (P < 0,05). Кроме того, левовращающий бициклический морфолин и его фармацевтически приемлемая соль характеризуются улучшенными фармакокинетическими свойствами по сравнению с правоврающим энантиомером и рацематом.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1 представлены данные по снижающему воздействию IMM-H014 энантиомеров на повышение уровня лактатдегидрогеназы (LDH) в надосадочной жидкости культуры клеток, вызванного 4-ацетамидофенолом (n=3-4). **P < 0,01, при сравнении с контрольной группой с плацебо; ^#P < 0,05, при сравнении с моделируемой группой.

НАИЛУЧШИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В изобретении предлагается левовращающий бициклический морфолин и его фармацевтически приемлемая соль для лечения заболеваний печени, способ его получения, его фармацевтическая композиция и применение. Приведенные далее примеры дополнительно иллюстрируют изобретение, но никоим образом не ограничивают изобретение. Для специалистов в данной области является очевидным, что в отношении изобретения могут быть сделаны различные изменения и модификации без отклонения от сущности и объем изобретения.

Спектры ядерного магнитного резонанса предлагаемого в изобретении левовращающего бициклического морфолина и его соли регистрируют на ядерно-магнитном резонансном спектрометре Varian Mercury-500 с использованием тетраметилсилана (TMS) в качестве внутреннего стандарта, и масс-спектры регистрируют на масс-спектрометре ZAB-2F.

Пример 1. Получение левовращающего (-)IMM-H014

a. SOCl₂/DMF; b. TEA/CH₂Cl₂ или CH₃COCH₃; c. L-DBTA/EA; d. NaHCO₃/H₂O/EA; e. CH₃SO₃H/EA.

Соединение 1 (то есть бициклол, 5,1 г, 13,1 ммоля) загружали в трехгорлую колбу объемом 100 мл, снабженную магнитной мешалкой и термометром, затем добавляли 50 мл осушенного DMF, и полностью растворяли твердые вещества. После охлаждения реакционной системы до 0°С на ледяной бане, медленно добавляли по каплям SOCl₂ (4,5 мл, 61,8 ммоль), осуществляя при этом контроль, чтобы температура в системе не превышала 5°С. После добавления по каплям, реакционную смесь выдерживали на ледяной бане в течение 30 мин до тех пор, пока анализ методом тонкослойной хроматографии (TLC) не указывал на полную конверсию исходных материалов. Реакционную смесь выливали в приблизительно 100 г дробленного льда и интенсивно перемешивали с осаждением большого количества белых твердых веществ, которые фильтровали, и осадок на фильтре промывали небольшими количествами дистиллированной воды и эфира, и сушили путем отвода воды. Продукт сушили естественным путем на воздухе и взвешивали, получая суммарно 4,9 г белых твердых веществ (соединение 2), выход: 91,7%.

Морфолин (1,28 г, 14,7 ммоль) загружали в круглодонную колбу объемом 50 мл и затем добавляли 25 мл ацетона и 2,2 мл триэтиламина при перемешивании при комнатной температуре, затем добавляли соединение 2 (2,76 г, 6,8 ммоль). Проводили реакцию при комнатной температуре в течение 5 часов и дополнительно выдерживали реакционную смесь в течение ночи. Анализ методом TLC указывал на полную конверсию исходных материалов, и в системе образовались розовые нерастворимые вещества. После фильтрации, фильтрат отгоняли при пониженном давлении с удалением растворителя. Полученное желтое масло отделяли на вакуумной перегонной колонке (петролейный эфир:этилацетат=2:1), и продуктовые компоненты собирали, получая суммарно 3,1 г бесцветного масла (соединение 3), выход: 92,3%. MS-FAB [M+H]⁺=460,1.

Соединение 3 (3,0 г, 6,54 ммоль) взвешивали и растворяли в 45 мл этилацетата и добавляли L-дибензоилвинную кислоту (L-DBTA, 1,2 г, 3,27 ммоль). При комнатной температуре, смесь перемешивали с осаждением белых твердых веществ, и через 30 минут проводили фильтрацию для сбора твердых веществ, которые затем сушили при 60°С в течение 1 часа и затем взвешивали, получая суммарно 1,25 г белых твердых веществ (левовращающий бициклический морфолин:L-дибензоилвинная кислота=2:1), выход: 56,8%. Анализ методом хиральной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) показывал, что энантиомерная чистота (%e.e.) промежуточного соединения 4 составляла 98,0%, [α]₂₅= -130,4 (CH₂Cl₂).

Промежуточное соединение 4 (1,25 г) диспергировали в 25 мл этилацетата и промывали два раза 25 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия, и органическую фазу сушили над безводным сульфата натрия, фильтровали и концентрировали с получением бесцветного масла. Масло растворяли в 10 мл этилацетата и добавляли 120 мкл метансульфоновой кислоты. Проводили кристаллизацию при комнатной температуре при перемешивании. После проведения фильтрации, полученные твердые вещества перекристаллизовывали в 10 мл метанола с получением 0,7 г (-)IMM-H014 в виде белого твердого вещества, HPLC чистота >98,0%, [α]₂₅=-65,6 (CH₂Cl₂). ¹H ЯМР (500 МГц, хлороформ-d) δ 7,45 (с, 1H), 7,38 (с, 1H), 6,14 (с, 1H), 6,02 (с, 1H), 5,96 (д, J=8,9 Гц, 2H), 4,37 (дд, J=13,3, 4,0 Гц, 1H), 4,16 (т, J=12,0 Гц, 1H), 4,05 (д, J=19,7 Гц, 8H), 3,96-3,81 (м, 3H), 3,76 (с, 3H), 3,57 (д, J=11,8 Гц, 1H), 3,41 (д, J=12,5 Гц, 1H), 2,91 (с, 3H), 2,79-2,68 (м, 1H), 2,50 (д, J=11,3 Гц, 1H).

Сравнительный пример 1. Получение правоврающего энантиомера (+)IMM-H014

Дополнительно загружали соединение 3 (3,0 г, 6,54 ммоль) и растворяли в 45 мл этилацетата, и затем добавляли D-дибензоилвинную кислоту (1,2 г, 3,27 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре для осаждения белых твердых веществ, и через 30 минут твердые вещества собирали, сушили при 60°С в течение 1 часа и взвешивали с получением 1,2 г белых твердых веществ (правовращающий бициклический морфолин:D-дибензоилвинная кислота=2:1), выход: 54,5%. Анализ методом хиральной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) показывал, что энантиомерная чистота (%e.e.) промежуточного соединения 4 составляла 97,3%, [α]₂₅= +133,2 (CH₂Cl₂).

Промежуточное соединение (1,2 г) диспергировали в 25 мл этилацетата и промывали два раза 25 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия, и органическую фазу сушили над безводным сульфата натрия, фильтровали и концентрировали с получением бесцветного масла. Масло растворяли в 10 мл этилацетата и добавляли 120 мкл метансульфоновой кислоты. Проводили кристаллизацию при комнатной температуре при перемешивании. После проведения фильтрации, полученные твердые вещества перекристаллизовывали в 10 мл метанола с получением 0,6 г (+)IMM-H014, в виде белого твердого вещества, HPLC чистота >98,0%, [α]₂₅= -78,2 (CH₂Cl₂). ¹H ЯМР (500 МГц, хлороформ-d) δ 7,45 (с, 1H), 7,38 (с, 1H), 6,14 (с, 1H), 6,02 (с, 1H), 5,96 (д, J=8,9 Гц, 2H), 4,37 (дд, J=13,3, 4,0 Гц, 1H), 4,16 (т, J=12,0 Гц, 1H), 4,05 (д, J=19,7 Гц, 8H), 3,96-3,81 (м, 3H), 3,76 (с, 3H), 3,57 (д, J=11,8 Гц, 1H), 3,41 (д, J=12,5 Гц, 1H), 2,91 (с, 3H), 2,79-2,68 (м, 1H), 2,50 (д, J=11,3 Гц, 1H).

Фармакологические эксперименты

Пример эксперимента 1. Воздействие оптических энантиомеров IMM-H014 на острое иммунное поражение печени, вызванное конканавалином (ConA)

1. Метод создания модели острого иммунного повреждения печени у мышей, индуцированного с помощью ConA, и способ введения

Самцов мышей линии ICR категории SPF (свободных от специфической патогенной микрофлоры) (20-22 г) после акклиматизации случайным образом подразделяли на 5 групп: контрольную группу с плацебо, модельную группу с индуцированным с помощью ConA поражением печени, группу введения 200 мг/кг (+)IMM-H014, группу введения 200 группа мг/кг (-) IMM-H014 и группу введения 200 мг/кг (±) IMM-H014, по 10 мышей в каждой группе. В каждой группе введения проводили внутрижелудочное введение один раз в сутки, и суммарно проводили введение три раза. Контрольной группе с плацебо и модельной группе внутрижелудочно вводили одну и ту же дозу физиологического раствора. Через 2 часа после последнего введения, мышам в каждой группе, кроме контрольной группы с плацебо, вводили однократно 20 мг/кг ConA в хвостовую вену, и доза каждого введения составляла 10 мл/кг. Мышей содержали в условиях голодания, но с доступом к воде, в течение 16 часов, а затем животных ожидала дальнейшая обработка.

2. Определение биохимических показателей

Мышей обезглавливали и собирали кровь, образцы крови выдерживали при комнатной температуре в течение 2 часов и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 минут для отделения сыворотки. Содержание аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови определяли на полностью автоматическом биохимическом анализаторе.

3. Статистический анализ

Все данные были представлены как средняя величина±стандартное отклонение (±SD). Сравнения между группами проводили с использованием критерия Стьюдента, и значение P<0,05 указывало на наличие значимого различия.

4. Результаты эксперимента

4.1. Воздействия энантиомеров IMM-H014 на увеличение содержания биомаркера АЛТ в сыворотке крови, обусловленное повреждениями печени, вызванными с помощью ConA

Уровень АЛТ в сыворотке крови прямо и положительно коррелирует со степенью поражения печени и является общепризнанным сывороточным биомаркером повреждений печени. Результаты в таблице 1 показали, что введение ConA в дозе 20 мг/кг вызывало значительные повреждения печени у мышей, а уровни АЛТ в сыворотке значимо повышались по сравнению с контрольной группой (P<0,001). Введение как (+)IMM-H014, так и (-)IMM-H014, позволяло значимо снижать вызванные ConA повышения уровня АЛТ в сыворотке (P<0,001). Процент снижения АЛТ при воздействии энантиомеров IMM-H014 составлял 95,3% и 97,3%, соответственно, а содержания АЛТ снижались до уровня контрольной группы. Как (+)IMM-H014, так и (-)IMM-H014 продемонстрировали значительное защитное действие в отношении вызванных ConA иммунных повреждений печени, и активность (-)IMM-H014 была немного выше, чем активность (+)IMM-Н014. По сравнению с (±) IMM-H014 в той же дозе, снижающие воздействия (+) IMM-H014 и (-) IMM-H014 на вызванное ConA повышение уровней АЛТ в сыворотке мышей превосходили воздействия (±)IMM-H014 (который также проявлял значительную эффективность, а процент снижения АЛТ составлял 88,6%), при этом снижающие воздействия (-)IMM-H014 на АЛТ имели статистически значимое различие (P<0,05) по сравнению с воздействиями (±)IMM-H014.

Таблица 1. Снижающие воздействия энантиомеров IMM-H014 на ConA-индуцированные повышения АЛТ в сыворотке крови мышей (n=10)

Группа	Дозы (мг/кг)	АЛТ (Е/л)	Процент снижения содержания АЛТ (%)
Контрольная группа с плацебо	-	39,5±9,6	-
Модельная группа с ConA-индуцированным повреждением печени	-	937,5±529,2***	-
(+)IMM-H014	200	44,4±29,1###	95,3
(-)IMM-H014	200	25,6±17,4###&	97,3
(±)IMM-H014	200	107,0±108,7###	88,6

***P<0,001, при сравнении с контрольной группой с плацебо; ^###P<0,001, при сравнении с модельной группой; ^&P<0,05, при сравнении с (±)IMM-H014 группой.

4.2. Воздействия энантиомеров IMM-H014 на увеличение содержания биомаркера АСТ в сыворотке крови, обусловленное повреждениями печени, вызванными с помощью ConA

Повышение уровня АСТ в сыворотке крови также является одним из важных маркеров повреждений гепатоцитов, в частности, повреждений митохондрий гепатоцитов, и в случае повреждений митохондрий, уровень АСТ в сыворотке крови значительно повышается, отражая тем самым тяжесть поражения гепатоцитов. Результаты представлены в таблице 2. Введение ConA в дозе 20 мг/кг вызывало значительное повреждение митохондрий гепатоцитов мышей, и уровень АСТ в сыворотке статистически значимо повышался по сравнению с контрольной группой с плацебо (P<0,001). Все энантиомеры (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 и (±)IMM-H014 проявляли способность снижать повышения уровня АСТ в сыворотке крови, вызванные с помощью ConA. По сравнению с модельной группой, процент снижения АСТ в группах введения (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 и (±)IMM-H014 составлял 44,8%, 72,9% и 22,2%, соответственно, при этом группа (-)IMM-H014 характеризовалась статистически значимой разницей (P<0,01) по сравнению с модельной группой. Активность (+)IMM-H014 и (-)IMM-H014 по снижению АСТ превосходила активность (±)IMM-H014, а активность (-)IMM-H014 была оптимальной и характеризовалась статистически значимой разницей (P<0,05) по сравнению с группой (±)IMM-H014 при той же самой дозе.

Таблица 2. Снижающие воздействия энантиомеров IMM-H014 на ConA-индуцированные повышения АСТ в сыворотке крови мышей (n=10)

Группа	Доза (мг/кг)	АСТ (Е/л)	Процент снижения содержания АСТ (%)
Контрольная группа с плацебо	-	72,0±24,5	-
Модельная группа с ConA-индуцированным повреждением печени	-	931,7±489,2***	-
(+)IMM-H014	200	514,3±310,7	44,8
(-)IMM-H014	200	252,9±233,5##&	72,9
(±)IMM-H014	200	725,0±417,3	22,2

***P<0,001, при сравнении с контрольной группой с плацебо; ^##P<0,01, при сравнении с модельной группой; &P<0,05, при сравнении с (±)IMM-H014 группой.

4.3. Воздействия энантиомеров IMM-H014 на увеличение содержания биомаркера ЛДГ в сыворотке крови, обусловленное повреждениями печени, вызванными с помощью ConA

При повреждении печени, уровень ЛДГ в сыворотке также может отражать состояние и степень повреждения гепатоцитов. Результаты представлены в таблице 3. Введение ConA в дозе 20 мг/кг путем инъекции в хвостовую вену вызывало серьезные повреждения гепатоцитов, и уровень ЛДГ в сыворотке был статистически значимо повышен по сравнению с контрольной группой с плацебо (P<0,001). Введение (-)IMM-H014 позволяло значительно понижать повышенный уровень ЛДГ в сыворотке крови, вызванный с помощью ConA, и процент снижения ЛДГ составлял до 54,4%, что характеризовалось статистически значимым различием (P<0,01) по сравнению с модельной группой. Введение (+)IMM-H014 также оказывало снижающее действие на повышенный уровень ЛДГ в сыворотке, и процент снижения составлял 27,6%, что не имело статистически значимого различия по сравнению с модельной группой. Введение (±)IMM-H014 в указанной дозе оказывало лишь слабое снижающее действие на повышенный уровень ЛДГ, и процент снижения составлял 6,4%. Что касается снижения уровня ЛДГ, то активность (-)IMM-H014 по-прежнему превосходила активность у (+)IMM-H014 и (±)IMM-H014, и наблюдалось статистически значимое различие (P<0,05) между (-)IMM-H014 и (±)IMM-H014 при одной и той же дозе.

Таблица 3. Снижающие воздействия энантиомеров IMM-H014 на ConA-индуцированные повышения ЛДГ в сыворотке крови мышей (n=10)

Группа	Доза (мг/кг)	ЛДГ (Е/л)	Процент снижения содержания ЛДГ (%)
Контрольная группа с плацебо	-	1158,5±289,7	-
Модельная группа с ConA-индуцированным повреждением печени	-	3702,5±1221,0***	-
(+)IMM-H014	200	2680,0±1190,8	27,6
(-)IMM-H014	200	1690,0±929,3##&	54,4
(±)IMM-H014	200	3466,7±1772,4	6,4

***P<0,001, при сравнении с контрольной группой с плацебо; ^##P<0,01, при сравнении с модельной группой; &P<0,05, при сравнении с (±)IMM-H014 группой.

Пример эксперимента 2. Воздействия оптических энантиомеров IMM-H014 на вызванные этионином неалкогольные жировые гепатозы

1. Метод создания модели вызванного этионином неалкогольного жирового гепатоза и метод введения

Самцов мышей линии ICR категории SPF (свободных от специфической патогенной микрофлоры) (20-22 г) после акклиматизации случайным образом подразделяли на 5 групп: контрольную группу с плацебо, модельную группу с индуцированным с помощью этионина жировым гепатозом, группу введения 200 мг/кг (+)IMM-H014, группу введения 200 группа мг/кг (-) IMM-H014 и группу введения 200 мг/кг (±) IMM-H014, по 5 мышей в каждой группе. За три дня до создания модели, в каждой группе введения проводили внутрижелудочное введение один раз в сутки, и суммарно проводили введение три раза. Животным в контрольной группе с плацебо и в модельной группе внутрижелудочно вводили одну и ту же дозу физиологического раствора. Каждая вводимая доза составляла 10 мл/кг. Через один час после последнего введения, мышам в каждой группе внутрижелудочно вводили разовую дозу 250 мг/кг этионина. Вводимая доза составляла 20 мл/кг. Мышей содержали в условиях голодания, но с доступом к воде, в течение 24 часов, а затем животных ожидала дальнейшая обработка.

2. Определения содержаний триглицерида и холестерина в тканях печени

Мышей подвергали торакотомии для извлечения печени, которую промывали физиологическим раствором при 4°С. Часть тканей печени перерабатывали в 10% гомогенат ткани печени с помощью лизата и электрического гомогенизатора, после чего одну часть гомогената использовали для измерения в ней содержания триглицеридов и холестерина с помощью набора для определения триглицеридов и набора для определения холестерина, а другую часть гомогената подвергали анализу для определения содержания белков с помощью набора для количественного определения белка ВСА. Содержание триглицерида и холестерина в тканях печени подвергали коррекции с учетом содержания белка.

3. Статистический анализ

Путем использования пакета программ обработки статистических данных (SPSS), все данные были представлены как средняя величина±стандартное отклонение ( ±SD). Сравнения между группами проводили с использованием критерия Стьюдента, и значение P<0,05 указывало на наличие значимого различия.

4. Результаты эксперимента

4.1. Воздействия энантиомеров IMM-H014 на повышения содержания холестерина (TC) в ткани печени мышей, вызванные этионином

Этионин, в силу того, что он препятствует метаболизму метионина и дополнительно влияет на синтез аполипопротеина, может приводить к тому, что синтезируемые в гепатоцитах холестерин, триглицерид и другие подобные вещества не могут переноситься в кровь, что вызывает накопление липидов гепатоцитов, и в результате чего формируется модель безалкогольного жирового гепатоза печени, вызванного воздействием лекарственного средства. Результаты представлены в таблице 4. Этионин в дозе 250 мг/кг может вызывать статистически достоверное повышение (P<0,05) содержания холестерина в тканях печени по сравнению с контрольной группой с плацебо. Введение как (+) IMM-H014, так и (-) IMM-H014, позволяет снижать вызванное этионином накопление ТС в ткани печени, и процент снижения ТС при воздействии энантиомеров IMM-H014 (то есть (+) IMM-H014 и (-) IMM -H014) составлял 27,2% и 32,4%, соответственно, при этом группа (-)IMM-H014 имела статистически значимое различие (P<0,05) по сравнению с модельной группой. (±)IMM-H014 также оказывал статистически значимое ингибирующее действие на индуцированное этионином увеличение ТС в ткани печени, и оно имело статистически значимое различие (P<0,05) по сравнению с модельной группой. Активность (-) IMM-H014 была немного выше, чем активность (±) IMM-H014.

Таблица 4. Снижающие воздействия энантиомеров IMM-H014 на вызванное этионином накопление TC в ткани печени мышей (n=10)

Группа	Доза (мг/кг)	TC (ммоль/г белка)	Процент снижение TC (%)
Контрольная группа с плацебо	-	0,060±0,014	-
Модельная группа с этионин-индуцированным повреждением печени	-	0,089±0,019*	-
(+)IMM-H014	200	0,065±0,022	27,2
(-)IMM-H014	200	0,061±0,013#	32,4
(±)IMM-H014	200	0,063±0,013#	30,0

*P<0,05, при сравнении с контрольной группой с плацебо; ^#P<0,05, при сравнении с модельной группой.

4.2 Воздействия энантиомеров IMM-H014 на повышения содержания триглицерида (TG) в ткани печени мышей, вызванные этионином

Результаты представлены в таблице 5. Этионин в дозе 250 мг/кг вызывал статистически значимое повышение (P<0,05) содержания TG в тканях печени по сравнению с содержанием TG в контрольной группе с плацебо, с проявлением симптомов неалкогольного жирового гепатоза печени. Введение (-)IMM-H014 позволяло статистически значимо снижать накопления TG в тканях печени, вызванные этионином, и процент снижения TG составлял 39,0%, что имело статистически значимое различие (P<0,05) по сравнению с модельной группой. Введение (+)IMM-H014 характеризовалось слабыми снижающими воздействиями на повышенное содержание TG в тканях печени, вызванное этионином, составляя процент снижения только 7,1%.

Таблица 5. Снижающие воздействия энантиомеров IMM-H014 на вызванное этионином накопление TG в ткани печени мышей (n=10)

Группа	Доза (мг/кг)	TG (ммоль/г белка)	Процент снижение TG (%)
Контрольная группа с плацебо	-	0,152±0,0023	-
Модельная группа с этионин-индуцированным повреждением печени	-	0,253±0,078*	-
(+)IMM-H014	200	0,235±0,070	7,1
(-)IMM-H014	200	0,154±0,040#	39,0
(±)IMM-H014	200	0,110±0,005##	56,6

*P<0,05, при сравнении с контрольной группой с плацебо; ^#P<0,05, ^##P<0,01, при сравнении с модельной группой

Пример эксперимента 3. Воздействия оптических энантиомеров IMM-H014 на вызванные 4-ацетамидофенолом повреждения гепатоцитов

1. Культура клеток

Клетки линии рака печени HepG₂ человека хорошо сохраняют характеристики нормальных гепатоцитов человека, и их выращивали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (содержащей 100 Е/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) при условиях культивирования: 37°С, 5% CO₂ и максимальной влажности. Для дигерирования и пассажей использовали раствор, содержащий 0,25% трипсина и 0,02% EDTA.

2. Защитное действие энантиомеров IMM-H014 при повреждении гепатоцитов, вызываемом 4-ацетамидофенолом in vitro

Использовали метод MTT. Клетки HepG₂ инокулировали в 96-луночном планшете для культивирования клеток, и через 24 часа культивирования, добавляли в нетоксичной концентрации (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 и (±)IMM-H014, и в тоже время добавляли 4-ацетамидофенол (APAP, конечная концентрация 8 мM). Для проведения эксперимента формировали группу положительного контроля с бициклолом, контрольную группу с растворителем и модельную группу. Культивирование продолжали в течение 24 часов. Отбирали 100 мкл культурального раствора и центрифугировали, и затем проводили определение уровня LDH на полностью автоматическом биохимическом анализаторе с использованием набора для обнаружения LDH. Оставшийся культуральный раствор отбрасывали, и в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора MTT (0,5 мг/мл) для продолжения культивирования в течение 4 часов. Раствор MTT отбрасывали, и в каждую лунку добавляли 150 мкл DMSO. Смесь перемешивали с помощью вибратора, и измеряли величину поглощения (OD) при длине волны 570 нм в считывающем устройстве для микропланшетов. Степень выживаемости клеток (%)=(средняя величина OD в группе введения/ средняя величина OD в контрольной группе с растворителем) ×100%.

3. Статистический анализ

Данные были представлены как средняя величина±стандартное отклонение ( ±SD). Сравнения между группами проводили с использованием критерия Стьюдента, и значение P<0,05 указывало на наличие значимого различия

4. Результаты эксперимента

Проводили эксперимент по воздействия на клетки HepG₂ в течение 48 часов 10 мкМ (+)IMM-H014, 10 мкМ (-)IMM-H014 10 мкМ of the (±) IMM-H014 acted, и оказалось, что они не оказывали статистически значимого токсического действия на клетки, в каждом случае степень выживания клеток составляла 90%. Эту концентрацию использовали для исследования защитного действия при повреждении гепатоцитов, вызванным с помощью APAP. Результаты приведены в таблице 6, воздействие 8 мM APAP вызывало статистически значимое повреждение клеток HepG₂, и степень выживания клеток составляла только 38,33% (P<0,001) по сравнению с контрольной группой с плацебо. Введение (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 и (±)IMM-H014 в дозе 10 мкМ оказывало статистически значимое защитное действие при повреждении гепатоцитов человека, вызываемом APAP in vitro (P<0,05, P<0,001, P<0,01), и процент повышения выживаемости клеток составлял 41,4%, 74,8% и 32,1%, соответственно. Активность (-)IMM-H014 была относительно оптимальной, и она имела статистически значимое отличие по сравнению с группой (±) IMM-H014 при одной и той же дозе (P<0,05). Бициклол также позволял статистически значимо улучшать состояние поврежденных в результате воздействия APAP гепатоцитов (P<0,05).

Таблица 6. Воздействие энантиомеров IMM-H014 на степень выживаемости поврежденных в результате воздействия 4-ацетамидофенола гепатоцитов (n=3-4)

Группа	Концентрации (мкМ)	Средняя величина OD±SD	Степень выживаемости (%)	Увеличение степени выживаемости клеток (%)
Контрольная группа с плацебо	-	0,845±0,037	100,00	-
Модельная группа с APAP-вызванным повреждением гепатоцитов	-	0,343±0,029***	38,33	-
(+)IMM-H014	10	0,489±0,098#	54,58	42,4
(-)IMM-H014	10	0,600±0,054###&	67,01	74,8
(±)IMM-H014	10	0,453±0,032##	50,63	32,1
Бициклол	10	0,454±0,092#	50,67	32,2

***P<0,001, при сравнении с контрольной группой с плацебо; ^#P<0,05, ^##P<0,01, ^###P<0,001, при сравнении с модельной группой; ^&P<0,05, при сравнении с группой (±)IMM-H014.

LDH (молочная дегидрогеназа) является одним из важных ферментов клеточного энергетического метаболизма. При гибели клеток, клеточная мембрана разрывается, и LDH высвобождается из цитоплазмы, причем уровень LDH пропорционален степени повреждения клеток. Результаты представлены на фигуре 1. Проводили исследование по воздействию 8 мМ АРАР на клетки HepG2 в течение 24 часов, и было обнаружено, что уровень LDH в надосадочной жидкости клеточной культуры статистически достоверно повышался по сравнению с контрольной группой с плацебо (P<0,01), что также указывало на значительные повреждения гепатоцитов. Воздействия (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 и (±)IMM-H014 в дозе 10 мкМ позволяет снижать уровни LDH, при этом уровни LDH в случае использования (-)IMM-H014 и (±) IMM-H014 имели статистически значимые различия (P<0,05, P<0,05) по сравнению с модельной группой, а снижающее действие в случае группы (-)IMM-H014 было немного выше, чем у группы (± )IMM-H014 при той же дозе.

Пример эксперимента 4. Воздействия оптических энантиомеров IMM-H014 на вызванные тетрахлоридом углерода повреждения гепатоцитов

1. Культура клеток

Клетки линии рака печени HepG₂ человека хорошо сохраняют характеристики нормальных гепатоцитов человека, и их выращивали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (содержащей 100 Е/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) при условиях культивирования: 37°С, 5% CO₂ и максимальной влажности. Для дигерирования и пассажей использовали раствор, содержащий 0,25% трипсина и 0,02% EDTA

2. Защитное действие энантиомеров IMM-H014 при повреждении гепатоцитов, вызываемом тетрахлоридом углерода in vitro

Использовали метод MTT. Клетки HepG₂ инокулировали в 96-луночном планшете для культивирования клеток, и через 24 часа культивирования, добавляли в нетоксичной концентрации (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 и (±)IMM-H014, и в тоже время добавляли тетрахлорид углерода (CCl₄, конечная концентрация 0,6%). Для проведения эксперимента формировали группу положительного контроля с бициклолом, контрольную группу с растворителем и модельную группу. Воздействие на клетки продолжалось непрерывно в течение 24 часов. Культуральный раствор отбрасывали, и в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора MTT (0,5 мг/мл) для продолжения культивирования в течение 4 часов. Раствор MTT отбрасывали, и в каждую лунку добавляли 150 мкл DMSO. Смесь перемешивали с помощью вибратора, и измеряли величину поглощения (OD) при длине волны 570 нм в считывающем устройстве для микропланшетов. Степень выживаемости клеток (%)=(средняя величина OD в группе введения/ средняя величина OD в контрольной группе с растворителем) ×100%.

3. Статистический анализ

Данные были представлены как средняя величина±стандартное отклонение ( ±SD). Сравнения между группами проводили с использованием критерия Стьюдента, и значение P<0,05 указывало на наличие значимого различия.

4. Результаты эксперимента

Проводили эксперимент по воздействия на клетки HepG₂ в течение 48 часов 10 мкМ (+)IMM-H014, 10 мкМ (-)IMM-H014 10 мкМ of the (±) IMM-H014 acted, и оказалось, что они не оказывали статистически значимого токсического действия на клетки, в каждом случае степень выживания клеток составляла 90%. Эту концентрацию использовали для исследования защитного действия при повреждении гепатоцитов, вызванным с помощью CCl₄. Результаты приведены в таблице 7, воздействие 0,6% CCl₄ вызывало статистически значимое повреждение клеток HepG₂, и степень выживания клеток составляла 77,50% (P<0,001) по сравнению с контрольной группой с плацебо. Введение (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 и (±)IMM-H014 в дозе 10 мкМ оказывало статистически значимое защитное действие при повреждении гепатоцитов человека, вызываемом CCl₄ in vitro (P<0,05, P<0,01, P<0,01), и процент повышения выживаемости клеток составлял 12,59%, 34,66% и 18,74%, соответственно. По сравнению с (±)IMM-H014 при одной и той же дозе, (-)IMM-H014 имел более высокую активность при защите от повреждения гепатоцитов, вызванных CCl₄. Бициклол также позволял статистически значимо улучшать состояние поврежденных в результате воздействия CCl₄ гепатоцитов.

Таблица 7. Воздействие энантиомеров IMM-H014 на степень выживаемости поврежденных в результате воздействия тетрахлорида углерода гепатоцитов (n=3-4)

Группа	Концентрации (мкМ)	Средняя величина OD±SD	Степень выживаемости (%)	Увеличение степени выживаемости клеток (%)
Контрольная группа с плацебо	-	0,915±0,128	100,00	-
Модельная группа с CCl4 вызванным повреждением гепатоцитов	-	0,709±0,043**	77,50	-
(+)IMM-H014	10	0,799±0,014#	87,32	12,59
(-)IMM-H014	10	0,956±0,120##	104,44	34,66
(±)IMM-H014	10	0,843±0,050##	92,09	18,74
Бициклол	10	0,819±0,099#	89,47	15,36

**P<0,01, при сравнении с контрольной группой с плацебо; ^#P<0.05, ^##P<0,01, при сравнении с модельной группой.

Фармакокинетические исследования

Пример эксперимента 5

1. Цели проведения эксперимента

Самцам крыс линии SD внутрижелудочно вводили индивидуальный энантиомер и рацемат IMM-H014 с целью сравнения их фармакокинетических характеристик в организмах крыс.

2. Приборы и материалы для проведения эксперимента

2.1. Приборы для проведения эксперимента

Тройной тандемный квадрупольный хромато-масс-спектрометр Agilent 6470 (Agilent Technologies Inc.), электронные аналитические весы модели Mettler AG135, пипетка-пистолет, центрифуга TDL-5-A, мини-центрифуга SIGMA, нагнетатель азота и весы для взвешивания животных.

2.2. Материалы для проведения эксперимента

(+)IMM-H014, (-)IMM-H014, (±)IMM-H014; метанол (чистота для масс-спектрометрии, фирмы Fisher Scientific Inc., cat# 179097); ацетонитрил (чистота для масс-спектрометрии, фирмы Fisher Scientific Inc., cat# 177802); деионизированная вода (фирмы Hangzhou Wahaha Co.); муравьиная кислота (чистота для HPLC, ROE SCIENTIFIC INC, cat# 6F2941); этилацетат (чистота для масс-спектрометрии, фирмы Fisher Scientific Inc., cat# 166828); пробирки Эппендорфа объемом 1,5 мл.

2.3. Экспериментальные животные

36 самцов крыс линии SD (200±10 г) приобретали у компании Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Крыс содержали в несодержащей микробов комнате помещения для животных в Институте фармакологии Китайской академии медицинских наук (Institute of Materia Medica Chinese Academy of Medical Science) при освещении в течение 12 часов каждый день при температуре 23±2°С и при относительной влажности 55±5%. Экспериментальные животные имели свободный доступ к воде и корму, и через 2 недели периода акклиматизации, начинали проведение эксперимента. Исследование соответствовало требованиям, разработанным комиссией по этическим нормам проведения экспериментов над животными Института фармакологии Китайской академии медицинских наук.

3. Эксперименты над животными

3.1. Распределение животных по группам введения препаратов

36 самцов крыс линии SD случайным образом подразделяли на 6 групп, по 6 животных в каждой группе, включающих: группу внутрижелудочного введения (+)IMM-H014, группу внутрижелудочного введения (-)IMM-H014 и группу внутрижелудочного введения (±)IMM-H014. Вводимая доза составляла 50 мг/кг. Крысам не выдавали корм в течение 12 часов до начала введений, но они имели свободный доступ к питьевой воде.

3.2. Приготовление растворов для введения

100 мг исходного лекарственного средства IMM-H014 взвешивали и растворяли в 20 мл очищенной воды с получением раствора для введения 5 мг/мл, который вводили (1 мл/100 г) разовой дозой в соответствии с массами тел животных.

3.3. Сбор образцов плазмы

В моменты времени 0 часов до введений, и через 5 минут, 10 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 5 часов, 8 часов, 12 часов и 24 часа после введений, отбирали по 250 мкл крови из нижней крестцовой вены, помещали в пробирку Эппендорфа, содержащую 10 мкл гепарина натрия, и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 минут, и затем отбирали плазму крови и хранили в морозильнике при -80°С.

4. Метод анализа

4.1. Приготовление раствора

4.1.1. Приготовление исходных растворов

5 мг контрольного образца IMM-H014 взвешивали с высокой точностью и помещали в мерную колбу объемом 5 мл, и растворяли и разбавляли до требуемой концентрации метанолом с получением контрольного исходного раствора с концентрацией 1,0 мг/мл.

4.1.2. Приготовление рабочих растворов внутренних стандартов

5,0 мг контрольного образца карбамазепина взвешивали с большой точностью и помещали в мерную колбу объемом 5 мл, и растворяли и доводили до постоянного объема до требуемой концентрации метанолом с получением исходного раствора внутреннего стандарта с концентрацией 1,0 мг/мл. 50 мкл исходного раствора отбирали с высокой точностью пипеткой и помещали в мерную колбу объемом 10 мл, и растворяли и доводили до постоянного объема до требуемой концентрации метанолом с получением исходного раствора внутреннего стандарта с концентрацией 5,0 мкг/мл. 5,0 мл исходного концентрированного раствора внутреннего стандарта отбирали с высокой точностью пипеткой и помещали в мерную колбу объемом 50 мл, и растворяли и доводили до постоянного объема до требуемой концентрации метанолом с получением рабочего раствора внутреннего стандарта с концентрацией с 500 нг/мл.

4.1.3. Приготовление стандартных рабочих растворов с серией концентраций и стандартных растворов контроля качества

100 мкл исходного раствора 1,0 мг/мл IMM-H014 отбирали с высокой точностью пипеткой и помещали в мерную колбу объемом 10 мл, и разбавляли метанолом с получением раствора IMM-H014 с концентрацией 10 мкг/мл. Раствор последовательно разбавляли метанолом с получением серии стандартных растворов IMM-H014 с концентрациями 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 2000, 4000 и 5000 нг/мл.

Исходный раствор 1,0 мг/мл IMM-H014 отбирали с высокой точностью пипеткой и последовательно разбавляли метанолом с получением стандартных растворов для количественного контроля с концентрациями 5, 100 и 4000 нг/мл.

4.1.4. Приготовление матрицы образцов для построения калибровочной кривой и образцов для количественного контроля

50 мкл стандартных растворов с концентрациями 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 2000, 4000 и 5000 нг/мл, соответственно, отбирали с высокой точностью пипеткой и сушили в токе азота при 30°С, и добавляли 50 мкл контрольной плазмы крысы. После перемешивания смеси в течение 3 минут, получали матрицу образцов для построения калибровочной кривой.

50 мкл стандартных растворов с концентрацией 5, 100 и 4000 нг/мл, соответственно, отбирали с высокой точностью пипеткой и сушили в токе азота при 30°С, и добавляли 50 мкл контрольной плазмы крысы. После перемешивания смеси в течение 3 минут, получали образцы для контроля качества.

4.2 Подготовка образцов для анализа

50 мкл образца плазмы отбирали с высокой точностью пипеткой и затем добавляли 10 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта, все это помещали в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл. перемешивали в течение 30 секунд и добавляли 500 мкл этилацетата. Затем перемешивали в течение 5 минут, и после выдерживания в течение еще 10 минут при 4°С, проводили центрифугирование в течение 5 минут при 13000 об/мин. Отбирали надосадочную жидкость и сушили в токе азота N₂ при 30°С. Остаток повторно растворяли путем добавления 100 мкл исходной подвижной фазы и центрифугировали в течение 5 минут при 13000 об/мин, и надосадочную жидкость переносили в емкость для образцов для проведения измерений.

4.3. Условия проведения хроматографического анализа

Хроматографическая колонка: Agilent ZORBAX SB-C18 (2,1×100 мм, 3,5 мкм)

Подвижная фаза A: вода (0,1% муравьиная кислота, 1 мM ацетат аммония); подвижная фаза B: ацетонитрил (0,1% муравьиная кислота)

Температура колонки: 35°С; количество образца: 3 мкл

Элюирование: 0-2 мин: 40%-53% B; 2-3 мин: 53%-40% B

4.4. Условия проведения масс-спектрометрии

Источник ионов: электрораспылительная ионизация (ESI); режим детекции: положительные ионы; температура осушающих газов: 300°С; расход осушающих газов: газообразный азот, 11 л/мин; распыляющий газ: азот, 0,1 МПа; капиллярное напряжение: 4000 в; режим сканирования: мониторинг множественных реакций (MRM); ионные пары и относящиеся к ним параметры напряжения приведены ниже:

Соединение	Первичный ион (m/z)	Вторичный ион (m/z)	CE (электрон-вольт)	Фрагментор (вольт)	Полярность
IMM-H014	460,2	373,1	17	135	Положительный
IMM-H014	460,2	343,1	17	135	Положительный
Карбамазепин	237	194	18	120	Положительный

5. Обработка данных

Полученные после сбора образцов исходные данные подвергали обработке с использованием программного обеспечения MassHunter QQQ с получением данных по концентрации лекарственного средства в крови, затем рассчитывали фармакокинетические параметры с использованием программного обеспечения DAS, и, наконец, проводили статистическую проверку с использованием критерия Стьюдента, применяя программный продукт SPSS, при сравнении, существовали ли статистически значимые различия для лекарственных средств, имеющих одну и ту же оптическую активность, но в различных партиях, и для лекарственных средств, имеющих различную оптическую активность, при этом считали, что P<0,05 характеризует статистически значимые различия.

При исследовании внутрижелудочного введения 3 группам крыс линии SD индивидуальнгого энантиомера и рацемата IMM-H014, соответственно, изучали их фармакокинетические характеристики в организме крыс. Результаты этого исследования позволили сделать вывлод, что уровни воздействия in vivo внутрижелудочно введеных (-)IMM-H014 и (±)IMM-H014 превосходили уровни воздействия (+)IMM-H014.

Таблица 8. Усредненные фармакокинетические параметры (исключая резко отклоняющиеся значения) для каждой группы крыс

Параметр (параметры)	Размерность	(+)-IMM-H014	(-)-IMM-H014	(±)IMM-H014
AUC (0-t)	мкг/л•час	2876±1978*	5866±2979	5242±3447
AUC (0-∞)	мкг/л•час	2877±1977*	5892±3005	5268±3432
t1/2z	час	0,984±0,26	1,248±0,33	1,206±0,27
Tmax	час	0,334±0,19	0,30±0,18	0,209±0,15
CLz/F	л/час/кг	25,0±15,7	10,7±6,2	14,0±9,3
Cmax	мкг/л	2277±2001	3280±1579	3324±2307

*: (+)-IMM-H014, при сравнении с рацемическим IMM-H014, P<0,05

Claims (20)

1. Левовращающий бициклический морфолин или его фармацевтически приемлемая соль, отличающийся тем, что структура левовращающего бициклического морфолина представлена соединением 5, и его фармацевтически приемлемая соль имеет структурную формулу (I):

,

где X выбирают из неорганических кислот и органических кислот.

2. Левовращающий бициклический морфолин или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, отличающийся тем, что неорганические кислоты включают фтористоводородную кислоту, хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, йодистоводородную кислоту, уксусную кислоту, серную кислоту и фосфорную кислоту; органические кислоты включают уксусную кислоту, трифторуксусную кислоту, пропионовую кислоту, щавелевую кислоту, яблочную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, малеиновую кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, коричную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, п- толуолсульфоновую кислоту, салициловую кислоту, хинную кислоту, камфорную кислоту, камфорсульфоновую кислоту, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, пироглутаминовую кислоту.

3. Левовращающий бициклический морфолин или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, отличающийся тем, что органические кислоты выбирают из L-винной кислоты, L-дибензоилвинной кислоты, L-ди-п-метилбензоилвинной кислоты, L-диэтилтартрата, L-яблочной кислоты, L-камфорной кислоты, L-10-камфорсульфоновой кислоты, R-(-)-миндальной кислоты, L-хинной кислоты, L-аспарагиновой кислоты, L-глутаминовой кислоты, L-пироглутаминовой кислоты, D-винной кислоты, D-дибензоилвинной кислоты, D-ди-п-метилбензоилвинной кислоты, D-диэтилтартрата, D-яблочной кислоты, D-камфорной кислоты, D-10-камфорсульфоновой кислоты, S-(-)-миндальной кислоты, D-хинной кислоты, D-аспарагиновой кислоты, D-глутаминовой кислоты и D-пироглутаминовой кислоты.

4. Левовращающий бициклический морфолин или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, отличающийся тем, что его фармацевтически приемлемую соль выбирают из метансульфоната (-)-бициклического морфолина, имеющего следующую формулу:

.

5. Способ получения левовращающего бициклического морфолина или его фармацевтически приемлемой соли по любому одному из пп. 1-4, отличающийся тем, что он включает следующие стадии:

a) хлорирование гидроксильной группы бициклола с получением соединения 2;

b) реакция соединения 2 с морфолином с получением соединения 3;

c) образование соли путем реакции соединения 3 с хиральной кислотой Y и проведение разделения в органическом растворителе с использованием различия растворимости соли с получением левовращающей соли 4, где хиральную кислоту Y выбирают из L-винной кислоты, L-дибензоилвинной кислоты, L-ди-п-метилбензоилвинной кислоты, L-диэтилтартрата, L-яблочной кислоты, L-камфорной кислоты, L-10-камфорсульфоновой кислоты, R-(-)-миндальной кислоты, L-хинной кислоты, L-аспарагиновой кислоты, L-глутаминовой кислоты, L-пироглутаминовой кислоты, D-винной кислоты, D-дибензоилвинной кислоты, D-ди-п-метилбензоилвинной кислоты, D-диэтилтартрата, D-яблочной кислоты, D-камфорной кислоты, D-10-камфорсульфоновой кислоты, S-(-)-миндальной кислоты, D-хинной кислоты, D-аспарагиновой кислоты, D-глутаминовой кислоты, D-пироглутаминовой кислоты;

органический растворитель выбирают из этилацетата, ацетона, метанола, этанола и изопропанола и растворителей, полученных смешением упомянутых выше растворителей при различных соотношениях; величины энантиомерной чистоты %e.e. левовращающего энантиомера и правовращающего энантиомера составляют соответственно более чем 95%;

d) перевод соли 4 в форму свободного амина путем реакции с основанием;

e) образование соли путем реакции свободной формы амина 5 с кислотой X с получением соединения формулы I;

где определения для X являются такими же, как в любом одном из пп. 1-4.

6. Фармацевтическая композиция для предотвращения и/или лечения заболеваний печени, отличающаяся тем, что она включает терапевтически и/или профилактически эффективное количество левовращающего бициклического морфолина или его фармацевтически приемлемой соли по любому одному из пп. 1-4 и необязательно один или более фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ.

7. Применение левовращающего бициклического морфолина или его фармацевтически приемлемой соли по любому одному из пп. 1-4 или фармацевтической композиции по п. 6 в производстве лекарственных препаратов для предотвращения или лечения заболеваний печени.

8. Применение по п. 7, отличающееся тем, что заболевания печени включают заболевания, связанные с повреждением печени, и гепатиты.

9. Применение по п. 7, отличающееся тем, что заболевания печени выбирают из гепатита A, гепатита B, гепатита C, заболеваний печени, обусловленных действием лекарственного средства, алкогольных заболеваний печени, неалкогольных заболеваний печени, аутоиммунных заболеваний печени, фиброза печени, вызванного прогрессированием заболевания печени, цирроза печени и печеночной недостаточности.

Images