JPH08310949A - アシルコエンザイムａ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 式（１）のピペリジン誘導体を有効成分とす
るアシルコエンザイムＡ：コレステロールアシルトラン
スフェラーゼ阻害剤、血中コレステロール低下剤及び動
脈硬化症予防治療剤。 【化１】 【効果】 ＡＣＡＴ阻害活性が強く、安全性も高いの
で、血中コレステロールを低下させ、コレステロールの
蓄積を抑制することからヒトの動脈硬化症の予防及び治
療剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は動脈硬化症の予防に有用
なアシルコエンザイムＡ：コレステロールアシルトラン
スフェラーゼ（以下ＡＣＡＴという）阻害剤及び血中コ
レステロール低下剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】食生活の欧米化に伴って、わが国におけ
る虚血性心疾患の発生頻度は著しく増加している。欧米
型の食生活によって上昇する血中のコレステロール値と
動脈硬化症の関係は、多くの疫学的研究で明らかにされ
てきた。すなわち、血清コレステロール値と虚血性心疾
患発生頻度との間には有意な相関があり、高コレステロ
ール血症を治療することが動脈硬化症、ひいては虚血性
心疾患を予防するといわれている。動脈硬化症は、血管
への脂質蓄積による内膜の肥厚が特徴的な病変である
が、近年粥状動脈硬化症の病巣に、マクロファージ由来
の細胞がコレステロールエステルを脂肪滴として貯蔵し
ている泡沫細胞が観察され、病変の進展に深く関わって
いると推定されている。

【０００３】一方、ＡＣＡＴは、コレステロールの脂肪
酸エステル化酵素であり、本酵素の阻害剤は動脈硬化の
治療薬として期待されている（Ｄｒａｇｏ Ｒ．ｅｔ
ａｌ．，Ｔｉｐｓ １９４，（１２），１９９１）。す
なわち、動脈硬化病変部位の血管壁ではＡＣＡＴ活性が
高くなっており、血管壁へコレステロールエステルが蓄
積していることが報告されている。従って、ＡＣＡＴ活
性抑制作用を有する物質を用いれば、コレステロールの
エステル化を阻害することができ、細胞に存在する遊離
コレステロールは高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）によって、
沈着部位から取り去られ、肝臓に運ばれて代謝されるの
で、病変部位でのコレステロールエステルの蓄積が抑制
され、直接的な抗動脈硬化作用を得ることができる。

【０００４】また、食事中に含まれるコレステロールは
小腸粘膜細胞においてＡＣＡＴによりエステル化された
後、カイロミクロンの成分として血流に放出される。よ
って、ＡＣＡＴ阻害剤を用いれば、食事中のコレステロ
ールの小腸上皮細胞での吸収を阻害することにより、血
中コレステロールを低下させることができるため、その
結果として、動脈硬化を抑制することができる。

【０００５】また、カイロミクロンによって肝臓まで運
ばれたコレステロールエステルはコレステロールエステ
ラーゼで遊離コレステロールに分解された後、肝臓で合
成された遊離コレステロールとともにＡＣＡＴによって
再度コレステロールエステルに変換され、超低比重リポ
蛋白（ＶＬＤＬ）に組み込まれて血中へと放出される。
よって、かかるＡＣＡＴ阻害剤によってコレステロール
のエステル化が阻止されれば、肝臓の遊離コレステロー
ル量が増加し、コレステロール合成系の抑制がかかると
共に、コレステロールの胆汁酸への変換の過程における
律速酵素である７α−水酸化酵素活性が亢進し、コレス
テロールの胆汁酸への異化排泄作用が高まる。

【０００６】このように、ＡＣＡＴ阻害剤を用いれば、
食事中のコレステロールの小腸からの吸収を阻害するこ
とにより、また、肝臓でのコレステロールの再エステル
化を抑制し、更にコレステロールの異化排泄促進作用に
より血中コレステロールを低下させることができ、動脈
硬化を予防又は治療することができる。

【０００７】このような背景からＡＣＡＴ阻害物質の探
索が行なわれており、微生物が産生するＡＣＡＴ阻害物
質がいくつか知られているが、これらの物質は作用及び
安全性の両面を考慮すると未だ満足できるものではなか
った。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
はＡＣＡＴ阻害活性が高く、安全性に問題がなく、血中
コレステロール低下剤、動脈硬化症予防治療剤として有
用な医薬を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】かかる実情において本発
明者らは、植物の成分中に、ＡＣＡＴ活性阻害作用を有
する活性成分の探索を続けた結果、コショウ科の植物の
胡椒（Ｐｉｐｅｒ ｎｉｇｒｕｍ Ｌ．）の未成熟果実
を乾燥した黒胡椒及び成熟果実の外果皮を除去して乾燥
した白胡椒、或いは未成熟果実を凍結乾燥した緑胡椒及
びコショウ科の植物のヒハツ（Ｐｉｐｅｒ ｌｏｎｇｕ
ｍ Ｌ．）のアルコール抽出エキスがＡＣＡＴ阻害作用
及びコレステロールエステル蓄積抑制作用を有し、医薬
として有用であることを見出した。そして更に該エキス
からＡＣＡＴ阻害活性を有する物質を単離、精製した結
果、その活性物質が後記式（１）で表されるピペリジン
誘導体であることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。

【００１０】すなわち、本発明は次式（１）

【００１１】

【化４】

【００１２】で表されるピペリジン誘導体を有効成分と
するアシルコエンザイムＡ：コレステロールアシルトラ
ンスフェラーゼ阻害剤を提供するものである。

【００１３】また、本発明は上記ピペリジン誘導体
（１）を有効成分とする血中コレステロール低下剤を提
供するものである。

【００１４】更にまた、本発明は上記ピペリジン誘導体
（１）を有効成分とする動脈硬化症予防治療剤を提供す
るものである。

【００１５】前記ピペリジン誘導体（１）には２個のエ
テニレン基に基づく４個の立体異性体が存在するが、こ
れらのいずれの立体異性体でも、またその混合物であっ
ても本発明に用いることができる。これらの異性体のう
ち、トランス−トランス型である化合物はピペリンとし
て知られており、シス−シス型である化合物はシャビシ
ンとして知られている。このうち、ピペリンが特に好ま
しい。

【００１６】本発明に用いられるピペリジン誘導体
（１）は、既知の方法により化学的に合成することもで
きるが、コショウ科に属する植物から抽出することもで
きる。

【００１７】ピペリジン誘導体（１）の抽出に用いる植
物としてはコショウ科に属する植物であれば特に制限さ
れないが、胡椒（Ｐｉｐｅｒｉｓ ｎｉｇｒｉ ｆｒｕ
ｃｔｕｓ）及びヒハツ（Ｐｉｐｅｒｉｓ ｌｏｎｇｉ
ｆｒｕｃｔｕｓ）が特に好ましい。

【００１８】かかる胡椒は東南アジア原産のツル性常緑
木本植物で、東南アジアや南米など各地で栽培されてい
る。茎は１０ｍほどにもなり、節ごとに根を出し他のも
のに巻き付き、葉は卵円形で濃緑色、なめらかな革質で
ある。花期は４〜１０月である。花序は穂状で垂れ下が
り花は黄緑色である。果実は球形で、雌雄異株である。
未成熟果実を凍結乾燥したのが緑胡椒、日干しにしたの
が黒胡椒、成熟果実の果皮を取り去って陰干しにしたの
が白胡椒である。胡椒は一般に胃腸を刺激してぜん動運
動を活発にし、発汗を促し、消化不良、下痢等に対する
民間薬として用いられる他、香辛料として主に西洋料理
に用いられ、健胃にも有効であるとされているが、ＡＣ
ＡＴ阻害作用については全く知られていない。

【００１９】これらの植物からピペリジン誘導体（１）
を採取するには、例えばまず、メタノールに代表される
アルコール等の極性有機溶媒で抽出し、得られた抽出液
を減圧濃縮する。次いで、その濃縮物をシリカゲルカラ
ム（内径５cm，長さ３０cm）に重層し、クロロホルム及
びメタノールの混合溶媒で溶出することによってＡＣＡ
Ｔ阻害活性成分の分画を行なうのが好ましい。更に、活
性画分を減圧乾固して粗活性物質を取得することができ
る。更に、これを分取薄層クロマトグラフィーによって
活性画分の精製を行なうことができる。

【００２０】本発明においては、ピペリジン誘導体
（１）を含有する限り、上記コショウ科植物のアルコー
ル抽出画分をそのまま使用してもよいし、更により精製
された画分を使用してもよい。

【００２１】ピペリジン誘導体は後記実施例に示すよう
に優れたＡＣＡＴ阻害作用及び細胞内へのコレステロー
ルエステル蓄積抑制作用を有するとともに食品由来であ
ることから安全性は極めて高いので、血中コレステロー
ル低下剤及び動脈硬化症予防治療剤として有用である。

【００２２】本発明の医薬は、ピペリジン誘導体（１）
を単独で或いは他の薬効成分（例えば、他の作用機序を
有する抗動脈硬化用薬）とともに、更に必要に応じて薬
学的に許容される担体とともに経口的又は注射等の非経
口的に投与されるが、経口的に投与されるのが好まし
い。

【００２３】経口的な製剤としては例えば錠剤、カプセ
ル剤、顆粒剤、粉末剤、トローチ剤、シロップ剤などが
挙げられる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤、トロ
ーチ剤などの固型の組成物においてはデンプン、ラクト
ース、カルボキシメチルセルロース、沈降炭酸カルシウ
ムなどの賦形剤；アラビアゴム、トラガントゴム、ゼラ
チン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース
などの結合剤；アルギン酸、コーンスターチなどの崩壊
剤；ステアリン酸マグネシウム、含水二酸化ケイ素、軽
質無水ケイ酸などの滑沢剤；サッカロースなどの甘味
剤；メントールなどのフレーバー剤などを含有させるこ
とができる。シロップ剤などの液状の組成物においては
ソルビトール、ゼラチン、メチルセルロース、植物油、
乳化剤のほか甘味剤、フレーバー剤、着色剤などを含有
させることができる。これら製剤中には１〜９５重量％
のピペリジン誘導体（１）を含有するのが望ましい。

【００２４】また、本発明の医薬の投与量は、症状、体
重、投与経路等によって異なるが、経口投与の場合ピペ
リジン誘導体（１）として成人１日あたり１０〜１，５
００mgを１〜数回に分けて投与するのが好ましい。

【００２５】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるもので
はない。

【００２６】製造例１ （１）５００ｇの緑胡椒を１０Ｌのメタノールを用いて
５日間室温で冷浸抽出した。抽出液を濾過した後、減圧
濃縮及び乾固して７７．１ｇの粗抽出物を得た。次にこ
の粗抽出物をシリカゲルカラム（内径５cm，長さ９０c
m）に重層し、クロロホルムで溶出する成分を全て溶出
させた後、クロロホルム：メタノール（９８：２）の溶
媒で抽出することによってＡＣＡＴ阻害活性成分の分画
を行なった。

【００２７】溶出した液を１５０mlずつ分取し、活性画
分を減圧乾固して粗活性物質１２．８ｇを取得した。次
に、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（５cmφ×６
０cm）に全粗抽出物を積層し、６００mlのクロロホルム
を溶出した後、９５％クロロホルム：メタノール、９０
％クロロホルム：メタノール及び８０％クロロホルム：
メタノールそれぞれ６００mlにて順次溶出することによ
りＡＣＡＴ阻害活性画分を回収した。得られた粗活性物
質は９．８ｇであった。

【００２８】この粗活性物質１０００mg中のＡＣＡＴ阻
害活性を示す成分は、更にクロロホルム：メタノール
（９８：２）を展開溶媒とした分取薄層クロマトグラフ
ィー（メルク社製：シリカゲル６０Ｆ₂₅₄ Ａｒｔ．５
７１７）によって精製を行なった。活性成分をＵＶ吸収
で確認後、該画分を掻き取り、シリカゲルからクロロホ
ルムで溶出後、濃縮することによって４８０mgの粗結晶
を得た。

【００２９】次に、この粗結晶物質の全量を高速液体ク
ロマトグラフィー（ウォーターズ社製システム６００
Ｅ）を用い、逆相Ｃ₁₈カラムを使用して、アセトニトリ
ル：水（５０：５０）の溶媒系により溶出分離した結
果、２８８mgの結晶を得た。最後に酢酸エチル中で再結
晶させることにより、若緑黄色の結晶１７０mgを得た。
その純度は高速液体クロマトグラフィーによる分析で９
５％以上であった。

【００３０】得られた結晶の理化学的性状は次の通りで
あった。

【表１】 （１）分子式：Ｃ₁₇Ｈ₁₉Ｏ₃Ｎ （２）分子量：２８５（マススペクトルによりｍ／ｚ２
８５（Ｍ⁺）が観察された。） （３）紫外線吸収スペクトル（エタノール中）：図１の
通り。 （４）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ中）：図２の通
り。 （５）溶媒に対する溶解性：メタノール、エタノール、
アセトニトリル、酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼン
に可溶、水に不溶。 （６）塩基性、酸性、中性の区別：中性 （７）物質の色、形状：若黄緑色、粉末 （８）プロトン核磁気共鳴スペクトル（重水素化ジメチ
ルスルホキシド中）：図３の通り。¹ H-NMR(DMSO-d₆, 400MHz, 37c)δ：1.46(4H,m), 1.57(2
H,q), 3.50(4H,m),6.02(2H,s), 6.65(1H,d), 6.84(1H,
d), 6.88(1H,d), 6.94(1H,q),6.97(1H,q), 7.15(1H,d),
7.20(1H,q)

【００３１】これらの理化学的性状により、この化合物
は下記化学構造を有するピペリンと同定した。

【００３２】

【化５】

【００３３】実施例１ （ラット由来ＡＣＡＴに対する阻害作用）ＡＣＡＴ活性
に対する影響は、ラット肝臓のミクロゾーム蛋白画分よ
り調製した粗酵素を用い、（¹⁴Ｃ）−オレオイルＣｏＡ
を基質に、内因性のコレステロールから（¹⁴Ｃ）−コレ
ステリルオレエートを生成させる反応をインビトロで行
なうことにより調べた。すなわち、培養上清を試料とす
るときの反応液組成は、２０μｌのミクロゾーム蛋白
（１．８３mg／ml）、２０μｌの（¹⁴Ｃ）−オレオイル
ＣｏＡ（５μＣｉ／ml、ＢＳＡ：９６nmol／ml）、９０
μｌの１００mMリン酸緩衝液（５mMのジチオスレイトー
ルを含む、pH７．４）、２０μｌの培養上清液、合計１
５０μｌからなる。一方、分画物を試料とする時の反応
液組成は、２０μｌのミクロゾーム蛋白（１．８３mg／
ml）、２０μｌの（¹⁴Ｃ）−オレオイルＣｏＡ（５μＣ
ｉ／ml、ＢＳＡ：９６nmol／ml）、１０６μｌの１００
mMリン酸緩衝液（５mMのジチオスレイトールを含む、pH
７．４）、４μｌのメタノール或いはジメチルスルホキ
シドに溶解した試料、合計１５０μｌからなる。

【００３４】なお、反応は３７℃で行ない、所定の反応
時間（通常１８分間）終了後、５．６５mlのクロロホル
ム：メタノール（２：１）を添加して反応を停止したの
ち、０．０４Ｎの塩酸水溶液０．９８ml及びキャリアー
としてコレステリルオレエートを加え、２０分間振盪機
で抽出したのち、１晩冷暗所に放置した。翌日、分離し
たクロロホルム下層全量を抜き取り、これを窒素気流下
に乾燥させ、残った上層にホルチの分配溶液下層５．６
５mlを加えて再度抽出した。これを１晩暗所に放置した
後、下層全量を抜き取り、先に乾固したクロロホルム下
層画分と合わせて乾固した。

【００３５】次に、これを２００μｌのクロロホルムに
溶解し、シリカゲル薄層クロマトグラフィーＧ６０プレ
ート（アルミニウムシート）に全量塗布した。これをジ
エチルエーテル：石油エーテル（１０：１９０）で１０
cm展開した後、オートラジオグラフィーを行ない、生成
した（¹⁴Ｃ）−コレステリルオレエートを確認した。次
にこの部分を切りとって、トルエン中で各試料共５分間
の液体シンチレーションカウンティングあるいはベータ
スコープ（ベータ・ジェン社製）によって３０分間放射
活性を測定した。本酵素を５０％阻害する濃度（Ｉ
Ｃ₅₀）を測定した結果、ピペリンのＩＣ₅₀値は１８μＭ
であった。

【００３６】実施例２ （マクロファージに対するコレステロールエステル蓄積
抑制作用）マクロファージに対するコレステロールエス
テル蓄積抑制作用は、マウスのマクロファージ樹立細胞
であるＪ７７４．１株を用いて行なった。

【００３７】内皮細胞や平滑筋細胞におけるＬＤＬの代
謝は細胞内の過剰の遊離コレステロールによって、ＬＤ
Ｌレセプターのダウンレギュレーションがかかるが、マ
クロファージにおいては変性ＬＤＬの取り込みは、スカ
ベンジャーレセプター経由による。この経路はレギュレ
ーションがかからないためコレステロールエステルが無
制限に蓄積してゆく。

【００３８】そこで、¹⁴Ｃでラベルしたコレステロール
とホスファチジルコリンからなるリポソームをマクロフ
ァージ細胞に取り込ませ、粗面小胞体に存在するＡＣＡ
Ｔに作用させることにより、該ピペリンが細胞内コレス
テロールエステルの蓄積を抑制するか否かを調べた。

【００３９】マクロファージ細胞を１０％牛胎児血清及
びペニシリン５０Ｕ／ml、ストレプトマイシン５０μｇ
／mlを加えたＲＰＭＩ １６４０培地（日水製薬社製）
にて、２日間、５％ＣＯ₂ の条件にてインキュベートし
た。次いで、トリプシン処理を行ない、ウェルの底面に
付着している細胞を剥がして細胞懸濁液とした後、細胞
を上記新鮮培地で洗浄し、２４穴のマルチプルウェルプ
レート（コーニング社製 ２５８２０−２４）に１ウェ
ル当たり２×１０⁶ 個／mlの細胞溶液７５０μｌを播種
した。３７℃、５％ＣＯ₂ の条件下で３７時間培養した
後に前記新鮮培地と交換し、更に８０μｇのコレステロ
ール（０．４μＣｉの（³Ｈ）−コレステロールを含
む）と１６０μｇのホスファチジルコリンを含んだ０．
３Ｍのグルコース溶液４０μｌ及び被検試料を溶解した
メタノール溶液１０μｌを添加して、１２時間培養し
た。これらの操作は無菌的に行なった。

【００４０】培養終了後、血清を含まないＲＰＭＩ １
６４０培地を使用して底面に付着している細胞を５回駒
込ピペットで洗浄した後、１mlのイソプロパノールを添
加して細胞内のコレステロール及び生成したコレステロ
ールエステルを抽出した。この抽出液をシリカゲル薄層
クロマトグラフィー（メルク社製 Ａｒｔ．５５５３）
に全量塗布し、ヘキサン：エーテル：ギ酸（８０：２
０：２）にて展開した後、オートラジオグラフィーを行
なった。次に、³Ｈでラベルされたコレステロールエス
テル及びコレステロール部分を切り取り、液体シンチレ
ーションカウンターにて放射活性を測定し、対照と比較
してコレステロールエステル蓄積抑制率を得た。その結
果ピペリンの５０％コレステロールエステル蓄積抑制濃
度（ＩＣ₅₀値）は７μＭであった。

【００４１】

【表２】製剤例１（錠剤） ピペリン ４０ｇ ラクトース ３６０ｇ ステアリン酸タルク ４０ｇ デンプン ６０ｇ

【００４２】以上を混合機で混和し、打錠して０．５ｇ
の錠剤１０００個を得た。

【００４３】

【発明の効果】本発明の有効成分はＡＣＡＴ阻害活性が
強く、安全性も高いので、血中コレステロールを低下さ
せ、コレステロールの蓄積を抑制することからヒトの動
脈硬化症の予防及び治療剤として有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】製造例１で得られた物質の紫外線吸収スペクト
ルを示す図である。

【図２】製造例１で得られた物質の赤外線吸収スペクト
ルを示す図である。

【図３】製造例１で得られた物質のプロトン核磁気共鳴
スペクトルを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 茶谷 貴子 東京都港区東新橋１−１−19 株式会社ヤ クルト本社内 (72)発明者 森 稚恵 東京都港区東新橋１−１−19 株式会社ヤ クルト本社内 (72)発明者 渡辺 常一 東京都港区東新橋１−１−19 株式会社ヤ クルト本社内 (72)発明者 横倉 輝男 東京都港区東新橋１−１−19 株式会社ヤ クルト本社内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（１） 【化１】 で表されるピペリジン誘導体を有効成分とするアシルコ
   エンザイムＡ：コレステロールアシルトランスフェラー
   ゼ阻害剤。
2. 【請求項２】 式（１） 【化２】 で表されるピペリジン誘導体を有効成分とする血中コレ
   ステロール低下剤。
3. 【請求項３】 式（１） 【化３】 で表されるピペリジン誘導体を有効成分とする動脈硬化
   症予防治療剤。