SE407985B - Forfarande vid fotometrisk analys av koagulationsfaktorer - Google Patents

Description

~ veoozoa-så 10 15 20 'I ._ met är faktor Vlla tillsammans med vävnadstromboplastín aktivatorn för faktor X. « 7 Av ritningen framgår att vid aktivering av faktor XII (sanno- likt genom kontakt med exempelvis kollagen) övergår denna till fak- tor XIIa, som påverkar faktor XI, som då övergår i aktiv form (Xla).

Faktorn Xla påverkar faktorn IX (antihämofili B-faktor) och denna Faktorn IXa tillsammans med kalciumjoner, fosfolipid och faktorn VIII (anti- hämofili A-faktor) påverkar faktor X, som aktiveras till faktor Xa.

Denna faktor Xa påverkar faktorn II (protrombin) tillsammans med- övergår då i närvaro av kalciumjoner till faktorn IXa. kalciumjoner, fosfolipid och faktor Y, så att denna övergår i akti- verad form till faktor IIa (trombín), som i sin tur bringar fibrino- gen att övergå till fíbrin.

Om nu en faktor saknas i blodet brytes hela reaktionsföljden - och fibrinbildning uteblir eller sker endast långsamt eller i ringa utsträckning.

I de vanligaste koagulationsanalyserna använder man den tid som koagelbíldníngen fordrar som ett mått på aktiviteten av en el- ler flera av de faktorer, som deltar ü reaktionerna.

På senare tid har kromogena pepoidsubstrat i allt större om- fattning börjat användas för analys av koagulationsfaktorer i blod.

Efter aktivering av koagulationssystemet, vilket kan ske på olika sätt, kan man nu i många fall bestämma halten av en koagulations- faktor genom tillsättning av ett kromogent substrat, som är speci- fikt för faktorn ifråga, till ett blod- eller plasmaprov, i vilket koagulationskedjan har aktiverats. Den aktiverade koagulationsfak-_ torn har förmåga att digerera substratet, som i regel är en peptídyl- p-nitroanilid. Härvid frigöres p-nitfoanilin, som kan bestämmas spektrofotometriskt. ningen störande under den spektrofotometriska analysen.

Vid bestämningar av denna typ är fibrinbild-, Enligt föreliggande uppfinning undvikes angiven olägenhet.

Föreliggande förfarande kännetecknas av att till analyslösníngen sättes ett fíbrinlösande medel, som utgöres av karbamid eller en guanidin. Tillsatsen sker i något stadium under analysen ochi lämpligaste stadium kan man lätt fastställa genom för-försök för varje speciell analys. Medlet tillsättes i sådan mängd, att den ifrågavarande koagulationsfaktorns enzymatiska aktivitet väsent- ligen icke påverkas. . L Uppfinníngen beskrives närmare i följande exempel. 101 15 20 25 35 40 ' vandlas protrombin i plasma till trombin. 7800304-3 3 Exempel 1. Bestämning av halten protrombin i plasma En reagensblandning innehållande aktiverad faktor X (FXa), faktor V, fosfolipíd och kalciumjoner ("Ampoule P", IMCO, Stockholm) försättes med urea (karbamid) till en koncentration av 0,75 M. 1, 2 resp 5 pl plasma tillsättes till 1 ml av denna reagensblandning och den erhållna blandningen får stå vid 37°C under 2 min. 1 ml trisbuffert med pH 8,2 innehållande 0,75 M urea tillsättes jämte 0,2 ml 4 mM syntetiskt substrat, D-fenylalanyl-pipekolyl-L-arginin-p-nitroanílid ("S-2238", Kabi AB, Stockholm).' Av trombin frigjort p-nitroanilin bestämmes sedan spektrofotometriskt vid 405 nm. Ökningen i absorption per Härvid om- tidsenhet är direkt proportionell mot protrombinkoncentrationen i plasma (fig 1).

Exempel 2. Bestämning av faktor VIII i plasma _ Protrombin i ett plasmaprov aktiveras på känt sätt (se svenska patentskriften 7609456-4) och bildat trombin bestämmes med ett syn- tetiskt substrat.

(IMCO, Stockholm) försättes med 1, S resp 10 pl plasma. Provet in- kuberas i 120 s vid 37°C. Därefter tillsättes 1 ml trisbuffert innehållande 0,75 M urea och 0,2 ml 25 mM syntetiskt substrat, D-fenylalanyl-pipekolyl-L-arginin-p-nitroanilid ("S-2238", Kabi AB, Stockholm). i exempel 1. Denna ökning är korrelerad till plasmaprovets halt av faktor VIII.

I båda de visade exemplen har trombinsubstrat använts. vis kan man även i exempel 2 använda ett substrat för faktor Xa, t ex bensyl-isoleucinyl-glutaminyl({-OR)-glutaminyl-arginin-p- nitroanilid (R = 50 % H; 50 % CH3) ("S-2222", Kabi AB, Stockholm). Även i detta fall är det viktigt att genom tillsats av urea hindra 150 pl av en reagensblandning för faktor VIII Ukningen av absorptionen bestämmes på samma sätt som uppkomsten av fibrintràdar i provlösníngen.

Urea har vid försök visat sig lämpligast. Urea kan i beroende av den koagulationsfaktor som bestäms tillsättas i koncentrationer mellan 0,25 och 2 M. vering av vissa enzym.

Vid högre koncentrationer än 2 M sker inakti- Vid koncentrationer under 0,25 M kan fibrin- bildning ej fullständigt förhindras.

Exempel 3 a) 150 pl protrombinreagens (se exempel 1) försättes med 10 pl normal plasma. Efter en inkubationstid om 2 min tillsättes 1,0 ml 0,15 M trisbuffert med pH 8,2 och 200 pl 0,75 mM substrat, D-fenyl- alanyl-pipekolyl-L-arginin-p-nitroanilid ("S-2238", Kabi AB, Givet-' e 780030lf-3 4 Stockholm). Efter en ytterligare inkubatíonstid om 1 min avbrytes reaktionen med 150 pl ättíksyra och lösningens absorption bestämmes vid 405 nM. Extinktíonen är 0,300. Lösningen innehåller suspen- derat fibrín. b) Försöket enligt a) upprepas med den skillnaden, att protrombín- reagens som trisbuffert innehåller 0,1 M rešp 0,15 M guanidínium- hydroklorid. Extinktíonen blir i detta fall 0,240. Ingen fibrín- bildning har skett i detta fall. ---_-__----_---

Claims (2)

78003014 '-3 5 Patentkrav

1. Förfarande vid analys av koagulationsfaktorer, varvid halten av en koagulatíonsfaktor bestämmes fotometrískt genom till- sats av ett kromogent substrat, sedan koagulatíonssystemet aktive- rats under bildning av fibrin, k ä n n e t e c'k n a t därav, att till systemet sättes ett fíbrinlösande medel, som utgöres av karb- amíd eller en guanidín.

2. -Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t där- av, att det fibrínlösande medlet användes i en koncentration av 0,25-Z M. -__-_- - _ - - ~ - - _ __ ANFÖRDA PUBLIKATIONER: