SE426844B - Sett att rena urokinas ur en ra urokinashaltig losning med en starkt sur katjonbytare uppvisande sulfonsyragrupper - Google Patents
Sett att rena urokinas ur en ra urokinashaltig losning med en starkt sur katjonbytare uppvisande sulfonsyragrupperInfo
- Publication number
- SE426844B SE426844B SE7806509A SE7806509A SE426844B SE 426844 B SE426844 B SE 426844B SE 7806509 A SE7806509 A SE 7806509A SE 7806509 A SE7806509 A SE 7806509A SE 426844 B SE426844 B SE 426844B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- urokinase
- solution
- crude
- containing solution
- urea
- Prior art date
Links
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 title claims abstract description 64
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 title claims abstract description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 title claims description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract 2
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-N sulfonic acid Chemical group OS(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 25
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 claims abstract description 4
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 3
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 6
- -1 sulfoethyl Chemical group 0.000 claims description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 3
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 claims description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 5
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 4
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 4
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007930 Oxalis acetosella Species 0.000 description 1
- 235000008098 Oxalis acetosella Nutrition 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 238000001139 pH measurement Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
7806509-1 sura katjonbytarhartser eller svagt alkaliska anjonbytar- hartser eller gelfiltreringsmedel, såsom tvärbunden dextran.
Ingen av dessa metoder är emellertid helt tillfredsställande beträffande utbyte och renhet hos produkten och man har för- sökt få fram lämpligare metoder.
Omfattande studier efter en lämpligare metod att rena urokinas har lett fram till att när karbamid sättes till en rå urokinashaltig lösning i sådan mängd att slutkoncentratio- nen av karbamid i lösningen ligger mellan 3-8 M och den re- sulterande lösningen därefter bringas i kontakt med en starkt sur-katjonbytare uppvisande sulfonsyragrupper och överfördtill NHn+-typ, adsorberas urokinas specifikt på denna jonbytare med följd 'att man får en påtaglig sänkning i mängden icke adsorberad urokinas i jämförelse med när ingen karbamid sättes till den råa urokinashaltiga lösningen, så att man vid eluering av adsorberad urokinas med en alkalisk lösning eller annan saltlösning kan erhålla renad-urokinas med i .huvudsak konstant och högre specifik aktivitet med högre utbyte oavsett renhet hos den råa urokinaslösningen. Upp- finningen baserar sig på denna upptäckt.
De starkt sura katjonbytarna uppvisande sulfonsyra- grupper som används i samband med uppfinningen är av den typ, som framställes genom att införa sulfonsyragrupper i ett syn- tetiskt harts uppvisande en tredimensionell nätverksstruktur, såsom polystyrenharts elle fenol-formalinharts, t.ex.
"Dowex SOW", "Amberliteê IR-120B", "CG-IEC" m.fl. till- verkade av Bohm och Haas Company och "Duolite(:)C-20" till- verkad av Diamond Shamrock Company eller typen framställd genom att införa en sulfoetyl- eller sulfopropylgrupp ii cellulosa eller tvärbunden dextran, t.ex. "SE-cellulose" tillverkad av Serva Entwicklungslabor eller "SP-Sephadex(â% tillverkad av Pharmacia Fine Chemicals. Alla dessa är till- gängliga på marknaden.
Sättet enligt uppfinningen kan genomföras på följande sätt. En rå urokinashaltig lösning inställes på pH 4-9, före- trädesvis 6-8, och försättes med karbamid så att slutkoncentra- tionen av karbamid i lösningen ligger mellan 3-8 M, varefter lösningen behandlas med en starkt sur katjonbytare uppvisande sulfonsyragrupper och överförd till NHu+-typ för adsorptíon 227806509-1 av urokinas specifikt på denna katjonbytare. Denna behandling kan åstadkommas antingen satsvis eller med användning av kolonn. Överförandet av katjonbytaren till NH4+-typ kan åstad- kommas på konventionellt sätt, dvs genom behandling med ammoniumkloridlösning av katjonbytaren av H+-typ och sedan man fått bekräftat att samtliga H+-joner ersatts med NHu+-joner genom pH-mätningar tvättas jonbytaren med destillerat vatten.
Den önskade pH-justeringen av den råa urokinashaltiga lösningen kan åstadkommas med användning av en buffertlösning, såsom fosfatbuffertlösning. Den urokinasadsorberade katjonbytaren tvättas med vatten eller en lågkoncentrerad saltlösning för avlägsnande av större delen föroreningar inkluderande karbamíd annan än urokinas. Därefter kan på jonbytaren adsorberad uro- kinas lätt elueras med en alkalisk lösning eller en högkoncent- rerad saltlösning eller en kombination därav. Utspädda vatten- lösningar av ammoniak eller en buffertlösning med pH l0-12 kan användas som alkalisk lösning för detta ändamål och en ammoníumkloridlösning eller liknande kan användas som salt- lösning. Det är också möjligt att använda en alkalisk lösning med pH 8-12 innehållande ett salt, såsom ammoniumklorid.
En jämförelse mellan det fall då karbamid sattes till en rå urokínashaltig lösning i enlighet med föreliggande upp- finning och det fall då ingen karbamid tillsattes är visad nedan som referensexempel. I detta exempel användes "Dowex<:) SOW x 8" som starkt sur katjonbytare uppvisande sulfonsyra- grupper och urokinasaktiviteten uppmättes enligt Ploug's fibrinplattemetod (Ploug et al: Biochim. Biophys. Acta, vol. 23, sid. 278, 1957).
Referensexempel Till Ä ml av en lösning innehållande ll 900 IU (inter- national unit) rå urokinas med en specifik aktivitet av 820 IU/mg protein, som dialyserats i förväg mot O,lM fosfat- buffertlösning med pH 6,5 och innehållande 0,lM natrium- klorid, sattes 1,2 g eller 2,0 g karbamid. Dessutom iordning- ställdes samma lösning som ovan men utan något innehåll av karbamid. Båda lösningarna fick passera genom en kolonn packad med 5 ml “Dowex 50W x 8" (200-1100 mesh) överföra till NHu+-typ för adsorption av urokinas. Därefter tvättades kolonnen med 25 ml destillerat vatten och urokinas eluerades 5806565211" med 3 ml Hßig ammoniaklösning i vatten. Egenskaperna hos den sålunda erhållna urokinasen framgår av nedanstående tabell 1.
Tabell 1 Tillsatt Icke-adsorberad Eluerad urokinas karbamid urokinas Specifik Återställd aktivitet aktivitet (s) (m III/ms (m 0 20,3 8 990 66,0 1,2 6,1 15 500 8150 2,0 4,6 17 1oo 711,3 g Resultaten av detta referensexempel visar tydligt den framträdande effekten av en tillsats av karbamid i enlighet med uppfinningen när det gäller att minska mängden icke- adsorberad urokinas och.öka den specifika aktiviteten lik- som utbytet av eluerad urokinas.
Uppfinningen belyses ytterligare nedan i anslutning till utföringsexempel. _ _ 26,3 g karbamid sattes successivt till EÄ ml av en lös- ning innehållande 31k 000 IU rå urokinas med en specifik aktivitet av l 080 IU/mg protein, som hade dialyserats i förväg mot fosfatbuffertlösning med pH 6,5 och innehållande 0,lM natriumklorid och den resulterande lösningen fick -sedan passera genom en k%lïnn (diameter 2,8 cm och höjden 25 cm) packad med “Dowex EOW x 8" (200-400 mesh) överförd till NH¿+-typ för adsorption av urokinas. Efter tvättning av kolonnen med 900 ml destillerat vatten matades 160 ml Ußig ammoniaklösning i vatten genom kolonnen för eluering av uroki- nas och fraktionen uppvisade urokinasaktivitet utvanns. På så sätt erhållen urokinas hade en total aktivitet av 235 000 IU och en specifik aktivitet av 18 200 IU/mg protein och hade renats 16,9-faldigt i förhållande till den råa urokinasen.
Aktiviteten hade till 7fi,8% återställts. 6 Exempel 2 87,8 g karbamid sattes till 180 ml av en lösning inne- hållande 298 000 IU av en rå urokinaslösning med en specifik aktivitet av 560 IU/mg protein, som hade dialyserats i förväg] som i exempel 1, och deniresulterande lösningen matades genom en košïnn (diameter 2,8 cm och höjd 25 cm) packad med "Dowex sow x 8" (zoo-uoo mean) överföra till NHu*- typen för adsorption av urokinas. Efter tvättning av kolon- nen med 900 ml destillerat vatten eluerades urokinas med 160 ml üßig vattenlösning av ammoniak och fraktionen upp- visande urokinasaktivitet utvanns. Sålunda erhållen urokinas hade en total aktivitet av 239 000 IU och en spe- cifik aktivitet av l7 000 IU/mg protein och hade renats 30,h-faldigt i förhållande till den råa urokinasen. Aktivi- teten hade till 80,2% återställts.
Ovan erhållna resultat visar att även vid användning av rå urokinas med ca halva den specifika aktiviteten av den som användes i exempel l är möjligt att återvinna renad urokinas med i huvudsak samma grad av hög specifik aktivi- tet som erhölls 1 exempel 1.
Exempel 3 g 0 53,6 g karbamid sattes till 110 ml av en lösning inne- hållande lü0 000 IU rå urokinas med en specifik aktivitet av 660 IU/mg protein, som hade dialyserats i förväg som i exempel 1, och den resulterande lösningen matades genom en kolonn (diameter 2,8 cm och höjd 25 cm) av “Duolite C-20" överförd till NHR*-typen för adsorption av urokinas. Efter tvättning av kolonnen med 750 ml destillerat vatten eluerades urokinas med 150 ml Híig vattenlösning av ammoniak och fraktionen upp- visande urokinasaktivitet utvanns. Sålunda erhållen urokinas hade en total aktivitet av 96 600 IU och en specifik aktivitet av 13 600 IU/mg protein och hade renats 20,6-faldigt i för- hållande till den råa urokinasen. Aktiviteten hade återställts till 69,o%. _ 786550991
Claims (3)
1. Patentkravi l. Sätt att rena urokinas genom behandling av en rå urokínashaltig lösning med en starkt sur katjonbytare upp- visande sulfonsyragrupper och överförd till NHR*-typ för adsorption av urokinas och efterföljande eluering av adsor- berad urokinas ur jonbytaren, k ä n n e t e c k n a t av att karbamid sättes till den råa urokinashaltiga lösningen i sådan mängd att den slutliga molkoncentrationen karbamid i lösningen ligger mellan 3-8 M. i
2. Sätt enligt krav l, k ä n n e-t e c k n a t av att den råa urokinashaltíga lösningen håller ett pH inom området 4-9. 3. satternigtkravl,kännetecknas av att katjonbytaren är ett polystyrenharts eller fenol-formalin- harts uppvisande sulfonsyragrupper eller cellulosa eller tvärbunden dextran uppvisande sulfoetyl- eller sulfopropyl- grupper. ii ii ásóßsog-A Sammanfattning Ett sätt att rena urokinas genom behandling av en rå urokinashaltig lösning med ett starkt surt katjonbytarharts med sulfonsyragrupper och överförd till NHu+-typ för adsorp- tion av urokinas på katjonbytaren och efterföljande eluering av urokínas ur jonbytaren, varvid den råa urokinashaltiga lösningen dessförinnan försatts med karbamid i sådan mängd att slutkoncentratíonen av karbamid i lösningen är mellan
3. -8 M. Härigenom kan man erhålla renad urokinas med í huvud- sak konstant och hög specifik aktivitet ur en rå urokínas- haltig lösning med högt utbyte oavsett renhet på den råa urokínaslösningen. ,-_. _- ..-.._...__.... __...._.___.._ _. __ _, _ ,_ ___-__,
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP50052659A JPS50150710A (sv) | 1974-05-07 | 1975-05-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE7806509L SE7806509L (sv) | 1978-12-04 |
| SE426844B true SE426844B (sv) | 1983-02-14 |
Family
ID=12920978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE7806509A SE426844B (sv) | 1975-05-02 | 1978-06-02 | Sett att rena urokinas ur en ra urokinashaltig losning med en starkt sur katjonbytare uppvisande sulfonsyragrupper |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SE (1) | SE426844B (sv) |
-
1978
- 1978-06-02 SE SE7806509A patent/SE426844B/sv unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE7806509L (sv) | 1978-12-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH06316593A (ja) | 蛋白質の精製方法 | |
| JP3438735B2 (ja) | 上清ｉｖ、特にｉｖ−４またはコーンフラクションｖまたはそれと類似の上清または画分からヒトアルブミンを単離する方法 | |
| US3897309A (en) | Process for removing pyrogenic material from aqueous solutions | |
| US4189350A (en) | Process for purifying urokinase | |
| US4169764A (en) | Process for production of urokinase | |
| JPS6261592A (ja) | 塩基性アミノ酸の分離方法 | |
| DE2551966A1 (de) | Verfahren zum reinigen von urokinase | |
| US3140281A (en) | Process for the preparation of codehydrogenase i (diphosphopyridine nucleotide) of high purity from yeast | |
| Plaut et al. | A method for the purification of nicotinamide mononucleotide | |
| US3126324A (en) | Catalase compositions | |
| ZA854962B (en) | A process for producing corrosion inhibiting particles | |
| US3371081A (en) | Process for the purification of cytochrome c | |
| US3153049A (en) | Recovery of pyrrolidone carboxylic acid from weakly basic anion exchanger eluates | |
| GB1118669A (en) | Purification of adenosine triphosphate | |
| JPH07100718B2 (ja) | アビジンの製造方法 | |
| SU482934A3 (ru) | Способ очистки калликреина | |
| GB883549A (en) | Improvements in and relating to the purification of antihaemophilic globulin | |
| JPS62292750A (ja) | アルギニンの分離精製法 | |
| PL85201B1 (sv) | ||
| US3639467A (en) | Method of recovering glutamic acid from a fermentation broth | |
| JPS62246573A (ja) | ピロロキノリンキノンの精製方法 | |
| Thompson et al. | Preparation of Nα-acetylornithine | |
| GB880573A (en) | Process for the manufacture of the tetrahydrate or salts of cocarboxylase | |
| JPS637560B2 (sv) | ||
| JPS5820191A (ja) | ウロキナ−ゼの製造方法 |