JPS5820191A - ウロキナ−ゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、人尿また社これに由来する粗製つｐキナーゼ
水溶液、および腎細胞の組織培養液から吸着剤に吸着さ
れたウロキナーゼを安定な状態で収率よく溶出液へ溶離
させる方法に関する。

ウロキナーゼは人尿および腎細胞の組織培養液中に微量
に存在する酵素であシ、人血漿中に含まれるプラスミノ
ーゲンを賦活化してフィブリン溶解能を有するプラスミ
ンを生成する機能がある。

この故にウロキナーゼは人尿等から捕集して精製され、
各種血栓症や心筋硬塞症等の治療に広く臨′床使用され
ている。のみならず、最近においては制癌剤の薬効を向
上せしめることが知られている。

しかも、ウロキナーゼは人間の尿または腎細胞の組織培
養液からの抽出精製物であるところから抗原性含有さな
いため、抗原抗体反応による副作用がなく広く賞月され
ている。

ところで、ウロキナーゼを含有せる溶液からウロキナー
ゼを製造する方法としては、シリカゲル、硫酸バリウム
、カオリン、ゼオライ將イソウ土、ケイ酸アルミン酸マ
グネシウム、ハイドロキシアメタイト、等の吸着剤管用
いて吸着して精製する方法が知られている。しかし、こ
れら吸着剤を用いる方法では、多量のウロキナーゼが吸
着剤の内部に入り、通常の溶出条件では溶出率が著しく
低くなる。またこれらの吸着剤からのウロキナーゼの溶
出にあたっては、アンモニア水が用いられているが、こ
の場合ｐＨが著しく高く、つ胃キナーゼの安定性が悪く
なり、これに伴って収率が低下するのみならず、ウロキ
ナーゼ以外の不純物も共に溶出される欠点がある。

本発明者らは、かかる欠点を克服すべく、吸着剤に吸着
されたウロキナーゼを温和な条件のもとに高収率に溶離
させる方法について研究した結果、ウロキナーゼを吸着
した吸着剤に非イオン性界面活性剤を接触せしめること
Ｋよシ高純度のつ四キナーゼが高収率で溶離することを
見出し友。

本発明は上記知見に基づいて完成されたものであり、ウ
ロキナーゼを吸着した吸着剤に、非イオン性界面活性剤
全接触させてウロキナーゼを溶離することを特徴とする
ウロキナーゼの製造方法である。

本発明における出発原料であるウロキナーゼを吸着した
吸着剤は、ウロキナーゼを吸着剤に吸着したものであれ
ばよい。

従って、ウロキナーゼを吸着させるための吸着剤は、ウ
ロキナーゼを吸着し得るものであればいずれでもよく、
具体的には水酸化アルミニウムゲル、硫酸バリウム、硫
酸マグネシウム、珪藻土、ベントナイト、酸性白土、ハ
イドロキシアパタイト、リン酸カルシウムグル、ガラス
ピーズ、アルミン１酸マグネシウム化合物などの吸着剤
、弱酸性乃至中酸性イオン交換樹脂、弱酸性乃至強酸性
イオン交換セルロース、弱識性イオン交換セファデック
ス、弱酸性イオン交換アガ四−ス、およびカルボキシル
基を導入したセルロース系素材、弱塩基性イオン交換樹
脂、弱塩基性イオン交換セルロース、弱塩基性イオン交
換上７アデツクス、弱塩基性イオン交換アガロースなど
のイオン交換体、アガロース、ポリアクリルニトリル系
樹脂粉末、および繊維色素固定化吸着体などのその他の
吸着剤等がその例としてあげられる。

本発明の方法は、ウロキナーゼを吸着している吸着剤に
溶離剤としての非イオン性界面活性剤を接触させてウロ
キナーゼを溶離することによって実施される。

溶離の際のｐＨは中性〜アルカリ性、具体的に社たとえ
はｐＨ７〜ｌＯである０非イオン性界面活性剤としては
、好ましくはポリオキシエチレン系のものがもちいられ
、具体的にはソルビタンモノアルキルエステル型（たと
えは各種のＴｗｅｅｎ’）、アルキルエステル型（たと
えば各種のＴｒｉｔｏ−ｎ■）、アルキルエステル型（
たとえば各種のポリエチレングリコール）、ポリオキシ
エチレンポリオキシプロピレン共重合体（たとえば各種
のＰ−１ｕｒｏｎｉｅ■）等が例示される０ 非イオン性界面活性剤は、通常その水溶液の形で用いら
れ、その濃度は、一般に０．０１〜１０％（Ｗ／マ）、
好ましくはＯ，１〜５チ（Ｗ／マ）である。これは、ラ
ウリルトリメチルアンモニウムなどの陽イオン性界面活
性剤を用いてウロキナーゼを溶離する際、α５−以上の
濃度では蛋白の特にウロキナーゼの不可逆的変性を招く
ので好まし。

くないとする日本特許出願公告５５−２０６７５号公報
の記載とは大きく異なるところである。

この際、ウロキナーゼの溶離効果を高めるために塩濃度
’ｉ　０．１　Ｍ〜２Ｍ、特に１Ｍ前後に調整するとよ
り効果的である０ここで使用される塩としては、たとえ
ば食塩、塩化マグネシウム、塩化カリウムなどの中性塩
が好ましい。

ウロキナーゼの溶出液は常法により脱塩、濃縮、高度精
製の処理を行い、医薬品として使用できるウロキナーゼ
を得る０ 本発明によるときはウロキナーゼを吸着した吸着剤から
ウロキナーゼを溶離させる際、非イオン界面活性剤全添
加した溶出液を使用するから、ウロキナーゼを安定な状
態で収率よく溶離させることができ、ウロキナーゼの回
収率が向上しかつ作業中での活性の損失を抑制できるこ
とになシ、工業的規模におけるウロキナーゼの製法とし
て極めて有利である。

次に実施例金挙げて本発明を具体的に説明する０実施例
１ ａｌの健康人より集めた１０Ｇｔの新鮮銀ｔ’ｐＩ（９
，５にして生じた沈澱を除き、上清ｔ−６Ｎの塩酸でｐ
Ｈ７，０に調整した。予め希塩酸に懸濁したベントナイ
）２００Ａｌｔ−準備し、これを新鮮銀の上清に投入し
てウロキナーゼを吸着させた００１５モル硫酸アンモニ
ア溶液に終濃度で２％ｗ／マのポリオキシエチレン・ポ
リオキシプロピレン共重合体（商品名：プルロニック）
を添加し７’ｈｐＨ７，５の溶出液ｓｔｔｍ整し、ウロ
キナーゼを吸着したベントナイトをこの溶出液に浸漬し
てクロキナー（ｔ−溶離させた０この溶離液を６Ｎの硫
酸で中和して硫安を６０−飽和とした０次に飽和液を４
℃で１夜放置した後、遠心によシ沈＃を集め、この沈ｍ
ｕ−１ｏｏｍの蒸留水にとかして４℃の水で透析し、透
析液を凍結乾燥して精製つ四キナーゼを得た。このよう
にして得たつｐキナーゼの原料尿性った場合は回収率２
５チ、比活性６００国際単位／〜を示した０ 実施例２ 多数の健康人よシ集めた１００ｔの新鮮銀ｋｐＨ９，５
にして生じた沈澱を除き、上清を６Ｎの塩酸でｐＨ７，
０に調整した。予め希塩酸に懸濁したベントナイト２０
０　＃ｔ−準備し、これを新鮮銀の上清に投入してウロ
キナーゼをベントナイトに吸着させた。１モルの塩化ナ
トリウム溶液に終濃度で２％Ｗ　／　Ｖのポリオキシエ
チレンポリオキシプロピレンプルツク重合体を添加した
ｐＨ８，０の溶出液３ｔｆ調整し、ウロキナーゼを吸着
したベントナイトをこの溶出液に浸漬してウロキナーゼ
を溶離させた。

この溶離液を６Ｎの硫酸で中和して硫安を６０゜チ飽和
とした。次に飽和液を４℃で１夜放置した後、遠心によ
〕沈澱を集め、この沈澱ｔ−１００ｍ１の蒸留水に溶解
してウロキナーゼ溶液とする。このつｐキナーゼ溶液を
イオン交換クロマトグラフィー、または、ゲルろ過等に
よってさらに精製して、注射薬として適合する高純度（
比活性７０，０００国際単位／ダ）のクロキナーゼを得
ることが出来る。

実施例３ 実施例１の方法で部分精製した５００万国除単位のｍｙ
タウロナーゼ溶液（ａｏ　ｏ　ｏ国際単位／■）をｐＨ
７，０，０，００５Ｍのリン酸緩衝液に対し、プイスキ
ング製透析チューブを介して透析させる。

１００メツシユの東芝社製研磨用ガ２スビーズ４ＫＰを
、ｐ）ｉ７．０．０．００５Ｍのリン酸緩衝液で平衡化
しておき、これをカラムに充填する。このカラムに透析
された粗製ウロキナーゼ溶液を流下させると、夾雑物は
通過してつｐキナーゼがガラ、スビーズに吸着される。

その後ｐＨ９，０，０，１Ｍの塩化ナトリウムでガラス
ピーズに付着した夾雑物を溶出させる。

次に２　’４　ｗ　／　ｖのポリオキシエチレンポリグ
ルピレンブロック重合体を含むＩＭの塩化ナトリウム溶
液、ＰＨ９ｔ−用いてウロキナーゼを溶出する。

得られたウロキナーゼ溶液は、出発原料（尿）中のウロ
キナーゼの８７５Ｇｔ含み、その純度は５ｏ、　ｏ　ｏ
　ｏ国際単位／ダ以上であった。

ノ 実施例４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　、
イ　・人尿よシ抽出し、部分精製した３０万国際単位の
粗製ウロキナーゼ溶液（１５，０００国際単位／りをｐ
Ｈ７，５，０，０７２５Ｍのリン酸緩衝液に対してプイ
スキング製透析チューブを介して透析させる。

で平衡化し、これをカラムに充填する。このカラムに透
析済みウロキナーゼ溶液を流下させると、ウロキナーゼ
は吸着され、夾雑物は通過する。その後、平衡化緩衝液
を充分流下し、できるだけ夾雑物を除去する。

次に、Ｚ％　（Ｗ／マ）のポリオキシエチレン・ポリオ
キシブ四ピレンブロック重合体を含むｐＨ９の１．５Ｍ
塩塩化カリウム溶液用用て、ウロキナーゼ會溶出する。

得られたウロキナーゼ溶液は、出発原料中のウロキナー
ゼの８８−を含み、その純度はｓｏ、ｏ。

０国際率位／智以上であった。

実施例５ 人尿より抽出し、電気伝導度を４〜５　ｍ　ｍｈａ／ｍ
／２５℃に調整した粗ウロキナーゼ溶液５０−（亀５０
０国際単国際率ｓ比活性３５０国際単位／ダ蛋白）に、
１５Ｍ量の塩化ナトリウムを溶解し、ｐＨを６．８に調
整した。

２５ｄ（力２ム体積）のフェニルオクチル・セファロー
ズをカラムに充填し、０．０５Ｍリン酸塩溶液に３．５
Ｍ量の塩化ナトリウムを溶解し、ｐＨを６．８に調整し
た液管通過させ平衡化した。

これに先に調整したつｐキナーゼ溶液を通過させウロキ
ナーゼを吸着させたのち、平衡化溶液で洗浄した。

その後、１％（マ／マ）のポリオキシエチレン系ソルビ
タン脂肪酸エステル型の非イオン性界面活性剤（商品名
、Ｔｗｅｅｎ■８のを含むｐＨ８の溶液を通過させつｐ
キナーゼを溶出した。

溶出液よプ界面活性剤全除去し、弱酸性カチオン交換体
によシ精製したところ、比活性ｓｏ、ｏｏ。

国際単位７ｗ９蛋白のウロキナーゼが回収率８０チで得
られた。

実施例６ 人尿より抽出し、電気伝導度４〜５　ｍ　ｍｈＶ−７２
５℃に調整した部分精製粗ウロキナーゼ溶液１００ｄ（
２０，０００国際国際率ｄ、比活性７．０００国際単位
／ＩＩｖ蛋白）に対し、２．０Ｍ量の塩化カリウムを添
加し、ｐＨを６．８に調整した。

８０ｍ（カラム体積）のオクチル・アガロース管カラム
に充填し、０．０５Ｍリン酸塩溶液に２．０Ｍ量の塩化
カリウムを溶解し、ｐＨ’（Ｈ６，８に調整した溶液を
通過させ平衡化した。

これに先に１ｉｌｌｎしたウロキナーゼ溶液を通過させ
ウロキナーゼを吸着させたのち、平衡化溶液で洗浄した
。

その後、２％（マ／マ）のポリエチレングリコール系ア
ルキルエーテル型の非イオン性界面活性剤（商品名、Ｔ
ｒｉｔｏｎ■Ｘ−１００）ｉ含むｐＨ８の溶液を通過さ
せウロキナーゼを溶出した０溶出液よシ界面活性剤を除
去し、６０，０００国国際単位／ダ蛋白の精製ウロキナ
ーゼを８４−の回収率で得た。

実施例７ 実施例６の粗ウロキナーゼ溶液１００ｄＫ２．ＯＭ量の
塩化カリウムを溶解し、１）Ｈ？６．８に調整した。

８０ｔ７（カラム体積）のオクチルセファローズをカラ
ムに充填し、０．０５Ｍのリン酸塩溶液に２０Ｍ量の塩
化カリウムを溶解し、ｐＨ’ｉ６．８に調整した溶液を
通過させ平衡化した。

これに先に調整し九ウロキナーゼ溶液を通過させウロキ
ナーゼを吸着させたのち、平衡化溶液で洗浄した。

その後、２％　（ｖｒ／マ）のポリオキシエチレン系エ
ーテル型の非イオン性界面活性剤（分子量へｐｏｏ〜ｉ
１．ｏ、、０・０，０）を含むｐＨ９の溶液を通過させ
、ウロキナーゼを溶出した。

溶出液より界面活性剤を除去し、比活性７２．。

００国国際率／ダ蛋白の精製ウロキナーゼ’ｉ９．１チ
の回収率で得た。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ウロキナーゼｔ−吸着した吸着剤に非イオン性界
   面活性剤管接触させてウロキナーゼを溶離することｔ−
   特徴とするつ四キナーゼの製造方法。
2. （２）非イオン性界面活性剤ｔ−′！ｉｌ！触させるに
   際して、 ■　非イオン性界藺活性剤ｔαＯ１〜１ｏｓ（Ｗ／マ）
   の水溶液として用いることおよび ■　塩濃に’を中性の無機塩にて０．１〜２Ｍとするこ
   とｔ−特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載のウロ
   キナーゼの製造方法。