SE430218B - Filter och sett att framstella ett sadant - Google Patents

Description

:t s1o7a64-A d 2 _ dk . Ct . L . n sf 'c'"_. A-g .'_'"'"AP . t' (4) vari k är en konstant, som är beroende av pH, jonstyrka och ' K kalciumkoncentration och dessutom är karakteristisk för det enzym, som använts vid gelbildningen, och Ct är stelningstiden i sekunder. Övriga symboler är desamma som i ekvation (1). Ter~ men t bortfaller, när flödet uttryckes i cms/s. Enligt denna ekvation är sålunda permeabilitetskoefficienten, Ks, direkt proportionell mot stelningstiden Ct och omvänt proportionell mot fibrinogenkoncentrationen.

Genom att variera pH mellan 6 och 10, jonstyrkan mellan 0,05 och 0,5, kalcíumjonkoncentrationen mellan 0 och 20 mM och/ eller koncentrationen av enzym (t ex trombin, "Batroxobin" eller ,"Arvin") mellan 0,01 och 10 NIH-enheter (eller motsvarande en- heter av andra enzym] per ml lösning och fibrinogenkoncentra-1 tionen mellan 0,5 och 50, t ex upp till 40 g/1, företrädesvis mellan 1 och 10 g/l, kan man framställa geler med KS~värden [beräknade enligt ekvationen (117 mellan 10-7 och 10'12, t ex -8- -11 - 10 ekvationen (3), 0,03 f 9 um, företrädesvis-0,09 - 2,8 um, Om . Motsvarande medelradier blir, beräknade enligt FXIII (ett transamideringsenzym] och kalciumjoner är närvarande vid gelbildningen, ökas stabiliteten hos gelerna därigenom, att kovalenta tvärbindningar uppstår mellan kedjorna i gelgrund- _ massans underenheter.

Det har nu enligt uppfinningen visat sig, att dessa fibrin- geler kan användas såsom filterr Föreliggande filter känneteck- nas därav, att det är uppbyggt av fibrin, varvid porstorleken är en funktion av stelningsparametrarna, d v s porstorleken varieras genom ändring av stelningsparametrar. Porstorleken är härvid proportionell mot stelningstiden. Det är lämpligt, att mer hållfast material än fibrin utgör bärande delar åtminstone vid filtrets övre och undre yta. Det är även möjligt att göra filtret mer hållfast och värmebeständigt genom härdning.

Filterna enligt uppfinningen är betydelsefulla, eftersom det nu blir möjligt att avlägsna bakterier och virus från in- fusionslösningar av olika slag, inklusive blodplasma. Det är även möjligt att använda filterna för fraktionering av celler, cellfragment eller högmolekylära próteinaggregat.

Fibringelfilter har framför allt den fördelen framför andra gelfilter, att man efter önskan på ett enkelt sätt kan variera' 40 8107364-*4 porstorleken. Vidare tillåter föreliggande filter höga ström- ningshastigheter även vid sådana porstorlekar, som kan användas för avlägsnande av mycket små partiklar som exempelvis virus- partiklar. I detta avseende är föreliggande filter lämpligare än kända membranfilter och filter av polyakrylamidgeler. Från- varon av adsorption av protein på filterna är även en fördel jämfört med vissa andra filter.

Föreliggande sätt för framställning av gelfilter känneteckf nas därav, att en fibrinogenlösning med i förväg inställda stel- ningsparametrar blandas med ett koaguleringsenzym och att er- hållen blandning bringas att stelna i en för filtret avsedd form. Det är härvid lämpligt, att den bildade fibringelen under och efter stelnándet stödes av bärande delar av mer hållfast material än fibrin.

De bäranda delarna avzmer hållfast material bör åtminstone anbringas vid övre och undre ytan av det filter, som skall fram- ställas.

De bärande delarna (armeringsmedel) kan utgöras av nät, som anbringas nedtill och företrädesvis även upptill i den form, i vilken fibrinogenblandningen ihälles (gjutes). Denna blandning kan lämpligen genomtränga nätet,t ex ha sin yta 10 um - 5 mm, företrädesvis 0,5-2 mm, från nätet. Nätet kan ha en maskvidd av exempelvis 10 um - 5 mm, lämpligen 50 um - 1 mm, och tråddiametern kan exempelvis vara 0,01 - 1,0 mm, företrädesvis 0,1 - 0,5 mm.

Trådarna kan vara naturliga fibrer eller plastfibrer eller vara uppbyggda av sådana fibrer; man kan sålunda använda bomullsnät, silkenät och nylonnät, men även ett metalltrådsnät är användbart, såsom sådant av rostfritt stål. Filtret kan vara armerat även på andra ställen än vid ytorna. Det kan exempelvis vara uppbyggt på ett skummaterial, såsom skumplast, som kan stöda en del av eller hela filtret.

De beskrivna filterna kan ej värmesteriliseras, eftersom de förstöras vid uppvärmning till temperaturer över 100°C. För biologiska arbeten är det därför nödvändigt att redan från början framställa dem sterilt. Det har å andra sidan visat sig möjligt att under framställningen härda föreliggande filter genom att genomföra gelbildningen i närvaro av FXIII och kalcium. Ett ännu hâllfastare filter erhålles genom att filtret behandlas tillsammans med en dialdehyd, t ex en med formeln OHC-R-CHO vari R beteçknar en alkylengrupp med 1-8 kolatomer, såsom glutaraldehyd. Det på så sätt er- hållna filtret kan värmebehandlas och autoklaveras-och därigenom sterili- .SBïaS . 8:1 078614 - lr izo 40 Ii jonstyrka erhölls genom tillsats av NaCl, Stelníngsparametrarna är framför allt enzymkoncentrationen, t ex mellan 100 och 3000 NIH-enheter/l för trombin, och fibrino- genkoncentrationen, varvid ökade koncentrationer ger tätare gel (gel med mindre porstorlek). Ökad jonstyrka ger även tätare gel liksom högre pH. Minskade kalciumjonkoncentrationer mellan 20 och 0'mM ger-tätare geler. Stelningen är även temperaturberoende, så att sjunkande temperatur ger ökad stelningstid, d v S ökat flöde eller med andra ord större porstorlek.

Uppfinningen beskrives närmare under hänvisning till bifo- gade ritning, på vilken fig. la visar gjutningen av ett filter enligt uppfinningen och fig. 1b visar filtret anordnat för filtre- ring. Pig. 2a och fig. Zb visar grafer över flödet såsom funktion _av koagulationstiden vid olika pH med trombin resp. Batroxobín.

Fig. S visar fibrinogenlösningens (fibrinets) turbiditet såsom funktion av tiden efter tillsats av trombin. Pig. 4a och 4b visar flödet såsom funktion av koagulationstiden vid olika jonstyrkor för trombin resp. Batroxobin. Figfl Sa och 5b visar flödet såsom en funktion av reciproka fibrinogenkoncentrationen vid olika koa- guleringstider för trombin resp, Batroxobin. Pig. 6a och 6b visar temperaturen avsatt gentemot koaguleringstiden resp. flödet såsom funktion av koaguleringstiden vid olika temperaturer. Fig. 7 visar slutligen turbiditeten i effluenten (grumligheten i utflödet) i procent såsom funktion av pordiametern i um.

Exempel 1.

Framställning av gelkolonn.

*En lösning av fibrinogen i Tris-imidazolbuffert innehållande kalciumsalter med pH mellan 6,5 och 8,2 och jonstyrka mellan 0,1 och 0,3 försättes med en lösning av trombin, så att den slut- liga koncentrationen därav blir mellan 0,05 och 2,5 NIH-enheter per ml. I andra försök användes Batroxobin för åstadkommande av gelbíldning i en koncentration mellan 0,27 och 3,6 BU per ml.

Koncentrationen av "Tris" och imidazolsalter var vardera 0,02 M och koncentrationen av kalciumsalt var även 0,02 M. Variationen Geler framställdes även vid kalciumjonkoncentrationer mellan 0 och 20 mM. Med minskad kalciumjonkoncentration ökade gelernas täthet. När trombin användes för åstadkommande av gelbildningen, var stelningstiden, Ct, även i frånvaro av kalciumjoner, direkt proportionell mot flödeshastigheten och således även med K .

När "Batroxobin" användes för gelbildningen, blev gelernaš ._ .-__...._..T..-_f.__-__.:.---_-rv~_ ...... i __: O I _ l V, __.. x ü IQ U'l b! UI s 8107864-4 stabilitet i frånvaro av kalciumjoner otillfredsställande, vilket försvarade flödesmätningarna.

Efter tillsats av enzym, såsom trombin eller Batroxobin, blandas lösningen snabbt och hälles därefter i en kopp, t ex en sådan som visas i fig. 1a. Den är här utförd i akrylplast och har en inre diameter av cirka 14 mm och en höjd av cirka 27 mm.

Själva plastkoppen visas vid 1 och kqqæns nedre ände är försedd med ett nylonfilter 2 med maskvidden 80 x 80 um; detta filter är fastklämt med en plastring 3. Ett fílmskikt, t ex "Parafílm®", anbringas lämpligen vid den nedre änden, så att vätska förhind- ras från att läcka ut från koppen. Omedelbart efter det att lös- ningen införts i koppen, anbringas ett silkenät 4 med maskvidden 150 x 180 um vid övre änden och fastklämmes med en insänkt plast- ring 5. Vätskan i gelkoppen kan exempelvis stå cirka 1 mm över nätytan. Koppen får stå i rumstemperatur under minst 2 h för fullständig gelbildning. Efter denna tid avlägsnas filmen vid _nedre änden och koppen med innehåll av gelmassa anbringas i hålla- ren 6 enligt fig. 1b. En hållare 7 anbringas över_koppens 1 övre ände. I övre änden av hållaren 7 finnes en öppning liksom i und- tre änden av hållaren 6. Hållaren 7 fylles med vätska och en gummikork försedd med ett rör, vilket är förbundet med en gummi- slang isättes i öppningen. Gummislangen är förbunden med en be- hållare för permeationslösning, som utan luftbubblor får fylla gummislangen. Behållaren (icke visad på ritningen) placeras på sådan höjd att lämpligt flöde erhålles genom gelen. Det hydrosta- tiska trycket varierade vid olika försök mellan 4 och 40 x 103 dyn/cmz.

Det för framställning av gelerna använda fíbrinogenet inne- höll spårmängder av faktor XIII, som är en transamidas. I när- varo av detta enzym och kalciumjoner bildas kovalenta, intermole- kylära tvärbryggor mellan kedjor i fibringelens molekylenheter.

Detta är speciellt fallet när trombin finnes närvarande, eftersom trombin aktiverar faktor XIII.

Elektroforetisk analys av reducerat fibrin från olika geler i närvaro av natrium-dodecylsulfat visar att en fullständig tvär- bindning av fibrinets a- och Y-kedjor ägt rum i närvaro av trombin.

I närvaro av Batroxobin sker en partiellt tvärbindning. De kovalen- ta tvärbindningar, som bildas i närvaro av faktor XIII, bidrar till gelstrukturens stabilisering.

Av väsentlig betydelse för gelernas mekaniska stabilitet är ea1orvaara-a 6 TS 40 det silkenät, som anbríngats ovanpå gélkoppen och som ärïi intim kontakt med gelmassan. Utan detta näf;kommer gelmassan att för- störas under flödesförsöken, varvid gelen ger vika i den centrala delen och en konisk inbuktning uppstår. ' Silkenätet kan ersättas av andra nät, t ex av bomull, nylon, järn eller koppar, vilka även stabiliserar gelstrukturen vid tryck upp till 40 dyn/cmz.

Av fig. 2 framgår hur flödeshastigheten, Q, vid konstant hydrostatískt tryck är direkt proportíonellt mot trombin-fibrino- genb1andningens_koagulationstid, Ct, vid olika pH} Systemets koa- gulationstid bestämmes spektrofotometriskt i ett separat försök under i övrigt identiska förhållanden. Den optiska tätheten,OD, vid 450 nm bestämmes. Vid gelbildning ökar turbiliteten hos lös- ningen snabbt, såsom visas i fig. 3. Tangenten till den brantas- te delen av kurvan skär tidsaxeln på ett avstånd, som betecknas såsom koaguleringstid, Ct. Eftersom ett direkt samband föreligger mellan Ct och flödeshastigheten Q, har ävenledes KS direkt sam- band med Ct enligt ekvation 1; Av fig. 4 framgår_att flödeshastigheten för geler bildade vid olika jonstyrka alltid har direkt samband med Ct hos den enzym- fibrinogenlösníng, som användes för gelframställningen. För övrigt må påpekas den stora inverkan som en ändring av jonstyrkan har på flödeshastigheten. _ Såsom framgår av fig. 5, är flödeshastigheten Q omvänt pro- portionell mot fibrinkoncentrationen (fibrinogenkoncentrationen) i gelen. Enligt ekvation 1 blir således även KS omvänt propor- tionell mot fibrinogenkoncentrationen.

Plödet är beroende av temperaturen, eftersom enligt ekvation 1 flödetär mmänt>proportionelh:mot permeationslösningens viskositet.

Temperaturen vid gelbildningen är ävenledes av betydelse, efter- som vid konstant enzymkoncentration Ct minskar vid högre tempera- tur. Detta framgår av fig. 6a..Flödeshastigheten i geler som bil- dats vid olika temperaturer, kommer dock att vara direkt propor- tionell mot Ct vid respektive temperatur, såsom framgår av fig.6b.

De kolonner, som framställts på sätt som schematiskt åskåd- liggjorts under hänvisning till fig. 1, har små dimensioner (1,5 cmz x 2,6 cm). Kvalitativt likartade resultat har uppnåtts vid gelkolonner med större dimensioner (5 cmz x 12 cm). När intet annat angives, har den mindre typen av kolonn använts vid för- söken.- ~::|-1:4..~::I|n: . .: 40 1 marinen-a Exempel 2.

Standardisering av porstorlek med latexpartiklar av känd storlek Sfäriska latexpartiklar med diametrar mellan 0,085 1 0,0055 (SD) pm (SD = standardavvikelse) och 0,198 1 0,0036 (SD) pm från Dow Chemicals, USA användes vid försöken. Ett antal geler, bilda- de vid pH 7,4 och vid två olika jonstyrkor, användes i försöken.

I försöken varierade Ct från 23 s till 314 s. För varje gel be- räknades enligt ekvation 3 en teoretisk radie under antagandet att ett cylindriskt, vertikalt kapillärsystem förelåg. Pig. 7 visar två serier av försök. I serie I var jonstyrkan under gel- bildningen 0,23 och i serie II 0,21. Gelkolonnerna bringades i jämvikt med vatten. Därefter påfördes suspensioner av partiklar på gelerna. I serie I var partikelstorleken 0,085 um och i serie II 0,198 um. Partiklarna var uppslammade i vatten till en koncentra- tion av 0,1% (vikt/volym). Turbiditeten (450 nm) hos effluenten bestämdes. Med hjälp av turbilitetsvärdena kunde man sedan fast- ställa, om latexpartiklarna helt och hållet eller partiellt passerat genom filtret. I fig. 7 har turbiditeten uttryckts i procent av maximal turbiditet i effluenten. Såsom framgår av fig. 7 ökar turbiditeten hos effluenten vid en bestämd teoretisk porstorlek. Vid en ytterligare ökning av porstorleken kommer fler partiklar att passera genom gelen (filtret) och över en viss por- storlek är passagen konstant. Skillnaden i teoretisk porstorlek mellan ingen och fullständig passage utgör ett mått på summan av porernas och partiklarnas storleksvariation. Porstorleken vid 50% passage är ett uttryck för medelstorleken hos porer och partik- lar. Om den totala variationen i porstorlek faller inom området för medelpartikelstorleken i 3 SD kan man antaga att porstor-. leken i gelen är enhetlig. I fig. 7 har variationen i partikel- storlek (medelstorlek i 3 SD) visats med ett horisontalt streck vid 50% passage. Såsom framgår kan den totala variationen nästan fullständigt förklaras av partikelvariationen. Man kan härav draga slutsatsen, att porerna i gelerna är väsentligen enhetliga.

Av fig. 7 framgår även, att den teoretiska medelporstorleken är ungefär en storleksordning (1 tiopotens) större än verkliga par- tikelstorleken. Beräkning av porstorleken enligt ekvation 3 ger således endast portstorleken för relativa värden.

Exempel 3 Passage av proteiner och dextran genom fibringeler.

Olika proteinlösningar påfördes på fibringeler, som framställts 810786k'¿|_ ' 8 TO på det i exempel 1 beskrivna sättet. Gelbildningen genomfördes vid rumstemperatur (21-25°C). Bufferten, som användes vid gel- ibildningen, hade i de flesta fallen samma sammansättning som bufferten hos proteínlösningarna; fíltreringsförsöken skedde även vid rumstemperatur (22-25°C). Gelkroppens volym var, när g intet annat angíves 1,47 cmz X 2,48 cm = 3,65 ml. Försöken utfördes under olika dagar och med olika fibrinogenpreparat. Det går således därför icke att göra en jämförelse vad beträffar por- storleken mellan olika försök. Tabell 1 visar de proteiner, som provats med avseende på filtrerbarhet genom fibringeler med olika porositet. Av tabellen framgår sammanfattningsvis, att proteiner, inklusive sådana med mycket hög molekylvikt, filtreras genom geler med liten porstorlek. En högmolekylerär polysackarid ("Blue Dextran") visar samma filtreríngsegenskaper som proteiner- na. Tabellen visar att utbytet av proteiner í eeluaten är högt, varav framgår att åtmíntone vid rumstemperatur interaktionen mellan gelmassa och ett flertal proteiner torde vara liten. Detta gälleräven sådana proteiner som fibrinogen, fibronektin och kom- plexet av faktor VIII.

B-'ILB-'lfiföírfll .ae a.mm n Eu pp X Eu m.w mE>Ho> mcøccofioxfloonn .ÜÖUUESM >HU O .qO nouëäflw xmflowoou :øuoš áwüfifluwnmxoßmfi was wcfizšnfiflmz socow Eouøëæflw šfipxowwe :om .m :OÛSGÉ pwflco mowmcšpon Eopøëmflw Sïfiøhoøu som? .wmucoæmm E05 woman :oo É .Ewomcz .å w 85.8 än? 3 ß Sä å... EJ så 826 82. Nä fääsn E. .Vona -Éäø . _ A308 QQSEV 3 ß 3 o 086 ä _ .B o: m? »oëfi . 33.8 _ å -SEOE u. 03. ä... _ 288m , šä 88 o: vßäš ä. . a: ëè -E32 S- Säflä ommñ8 +~ 530: 8. al 55 ENJ QS QfiN m2 i., Pßwwšß E oacâë . -OSS C58 m 91. ä... S: 3 MQN _88 o.. +~8+ Sfim _ »Sås ä ooošæ -Éflfiw - SE: fimmflov . äë ooooš. .nå H âä S... S3 <2 ÉJ 88 o; töäš. E . -ocfißfi +~mu| mamman .w SQ å... âé SN äNá _32 io fioänß ä. - Éæä: Gäxïfiñov +NS + ...ska ß SK 56 3.» 03-8 åJYNñN Nam .á töäš. i - Éwš: IN! Qw w E: _. HE .

Ešcm 8 :ß E :Éwonm uu Emfiwäš wwæmu: >oum uwmmwzm uxwwwflïë >PS mß _ COMHGQEHOW .HOQOEGHD .fiofiomcflænfiw Eocow .ÉÜEPSQQ :wo .Hofiouogm >s wcfikflwüäï H .Emnšw +wwwmw%~flw.@ - _@-@-.»@ umq @w_Q H@w=«h@«~w~M«¥m 1:95 wmnø> ...Åxouzn :uo ._ Uday-HUS EOCm . ñ@_=_oU +N«u+ |@m pmpøpgfifiw .__ 3.; å; Ena S äNa - m. fzåš. ä .ä E... z ääåæwåæ . ._ ^~@~_@V ß =<_~ P~_= æ=_~ .ßm_ @<.« ~_m@ N_Q ___ Ha\_0»o; _ ...mmïov . _ . _? o«_ß .N_@ w°_~ @P @w_~ m_Qm ~_o HH + _ flw- -fi~=HwwflEm; _ fiß_=.oU . +~ _ Acqov w=~ . . H_ Qw_ß mmN_o m@_< mm_ «w~_o Q ~_o H ghwwwnß vw E; m._o >_ -fi>-flßv=@w . . ñm°PH=v +~ßU- __ _ .

H @<_ß _~_Q ==_m QN wß _ G _ mw u»@w«:@-H@ 1 N _xæ O .fifiou m <@=m 2 Eoïflwowvw n |>W IHÜ%.H ß ~ _ ~ . mmmN-Ow Ä +N UI |UEOMOQHE .1 . Qäwfim <:¶_: ~=\m=P»»v 52+. wo.. 1 »ouflu _ _ _ ^@w~HQv - _ . +~ øpaooß e oq N .N O Nq M »NN ww _ Q m m Q ppowänß Ha E: _ >_~ ~=~E=T_ . ~1\ Q,xm + mul acw: nu. nova _ ~-w@H~HflW -woflß www» mN-.N OV IMOM Mwfi NCNESS B .O<_~ -_= @@__ mm~ 00." Q ,_= -0Hoflm>@ .a_> @@«p~m>ß h.. 358V +Ndu + :\w:.v _ fifld _ _mw P o<_ß @~qo @m_« ovw @ß~_o ß_ß@ Nwo ~»@uH=@ HH @°_xm -«>uoa@: 6 _ N .in v. =_:._ . _» t.. _ _ ÜZÉHQ: rm ezflzm :Q la! fiøaoå »u Eßfišom opanp: ÉYÃ ußowwšfi .fioflo >oÉ 0 . wcflšwfifinfioo Ûw :oflpmoëaom .Houoërflo 4: nä ñwëhowv P 4Qmm 40 r, after-varslen Exempel 4, Filtrering av suspensioner av röda blodkroppar genom fibringeler. á Fibringeler framställdes på det i exempel 1 beskrivna sättet och betingelserna för gelbildningen framgår av exempel 3. En liten mängd (0,2 ml) humanblod påfördes på en gelkolonn. Fort- satt filtrering skedde vid rumstemperatur (22-25°C) under de betingelser, som framgår av exempel 3. Blodkropparna passerade icke genom fibringelen. Detta var väntat, eftersom diametern hos röda blodkroppar (7-8 um) är mycket större än den effektiva por- diametern i fibringelen.

Exempel 5.a.

Filtrering av trombocytrik plasma genom fibringeler.

Trombocytrik plasma framställdes genom centrifugering i 4 minuter av blod vid 1200 G, varvid blodet tappats i citratlös- ning för förhindrande av koagulering. Den centrifugerades vid 2000 G under 5 min för borttagande av resterande röda blodkroppar och till den trombocytrika plasman sattes Na.EDTA till en kon- centration av 10 mM. Av den trombocytrika plasman påfördes 0,5 ml på en fibringel, som framställts på det i exempel 1 beskrivna sättet. Betingelserna för gelbildningen framgår av exempel 3 och fortsatt filtrering skedde under de betingelser, som framgår av exempel 3. För förhindrande av aggregatbildning av trombocyterna samt deras vidhäftning vid gelmassan tillsattes EDTA (10 mM) icke endast till den trombocytrika plasman utan även till lösningen,- som filtrerades. Icke några trombocyter kunde påvisas i eluatet från fibringelen. Detta var väntat, eftersom trombocyternas dia- meter ligger mellan 2 och 4 um, vilket är avsevärt mer än gelens effektiva porstorlek.

Exempel 5b.

Separation av mitokondrier från levercellsfragment genom filtre- ring genom fibringeler.

Leverceller från råtta homogeniserades i en homogenisator enligt Potter-Elvehjem. Separation av cellfragment uppnâddes genom differentialcentrifügering på känt sätt. Mitokondrierna uppslammades i buffertlösning innehållande Na-EDTA (10 mN) och sackaros (0,25 M). 0,3 ml av erhållen suspension påfördes på en fibringel, som framställts på det i exempel 1 beskrivna sättet.

Betingelserna för gelbildningen framgår av tabell 1 och fortsatt filtrering skedde under de betingelser, som angivits i tabell 1. lcke några mitokondricr kunde påvisas i eluatet, vilket var väntat, 40 _es1o7aß4-4 4 , 12 eftersom deras diameter är ungefär 0,5 pm; så1edeS'av$evärt mer än gelens effektiva porstorlek.

I Bxempelie.

Separation av Sendai-virus genom filtrering genom fíbringeler.

Sendaívirus är ett musspecifikt virus, som användes för framställning av iinterferon i humana lymfocytkulturer. Ett partiellt renat viruspreparat_(64O hämagglutinationsenheter/ml) användes vid försöken.

I I 0,2 ml av virussuspensionen påfördes på var och en av tre' fibríngelskolonner, som framställts på det i exempel 1 beskrivna sättet. Betingelserna för gelbildningen framgår avtabell 1 och fortsatt filtrering skedde under de betingelser, som framgår av tabell 1. tionaktívitet påvisas; i eluatet från kolonn II påvisades 50% I eluatet från kolonn I kunde icke någon hämagglutina- hämagglutinatíonsaktivitet och i eluatet från kolonn III påvisa- des 95% av viruspartiklarnas hämagglutinationsaktivítet (se tabelllï). ii _Efter filtreringen sköljdes silkenätet i övre delen av de tre kolonnerna med buffertlösning (innehållande 1% oxserumalbumin, här benämnt BSA) och hämagglutinationsaktiviteten hos sköljvätskor- na analyserades. I sköljvätskan från kolonn I återfanns 100% av hämagglutinationsaktiviteten; i sköljvätskan från kolonn II åter- fanns 25% av aktiviteten och i sköljvätskan från kolonn III åter~ fanns icke någon aktivitet.

Sendaivirus partikeldiameter uppgives vara ungefär 0,15 um.

Försöken visar, att när gelens effektiva porradie är mer än 0,15 um, viruspartiklar passerar genom gelen. När gelens effektiva porradie är mindre än 0,15 pm, sker å andra sidan en retention av viruspartiklarna.

Exempel 7. 7 Senarering av Eschericia Colí (E.coli) genom filtrering genom fibríngel.

E. coli är en avlång tarmbakterie med de ungefärliga dimen- sionerna 0,8 X 1-2 pm. En suspension av E.coli i kalciumfri Tris-Imidazol-buffert med pH 7,4 och jonstyrka 0,21 bereddes (se exempel 1). Suspensionen innehöll mellan 107 och 108 bakte- rier/ml. 45 ml av suspensionen påfördes på en fibringelskolonn med dimensionerna S cmz X 11 cm, som framställts på det i exem- -pel 1 beskrivna sättet. Betíngelserna för gelbildningen och^ fíltreringen visas i tabell 1.' Flödeshastigheten var 31 ml/h. 40 13 ?1{w?8šš4?F# Icke några bakterier passerade genom gélen, bestämt genom tur- bilitetsmätningar på eluatet från kolonnen. Flödeshastigheten vid konstant tryck var vid slutet av försöket mindre än i början.

Under antagande av ett oförändrat Ks, kan man enligt ekvation 1 beräkna den mot minskningen i flöde motsvarande minskningen i yta. Enligt denna beräkning hade ytan minskat till 58%. Man skulle således kunna vänta sig, att bakterierna ansamlats på övre gelytan. Efter sköljning av silkenätet på gelens övre del med buttertlösning återfanns i sköljvätskan 99% av de påförda bakterierna.

Försöket visar att B. coli icke kan passera genom geler med en pordiameter som är avsevärt mindre än bakteriernas minsta diameter.

Exempel 8.

Framställning av geler med armering av porös plast.

I föregående exempel har nät av silke, plast eller metall anbríngade vid gelens överdel och underdel tjänstgjort som sta- biliserande struktur för fibringelerna. En motsvarande stabili- sering kan ävenledes åstadkommas därigenom, att man gjuter in fibringelen i en porös plast, t ex polyuretan, polyester eller något liknande poröst plastmaterial, företrädesvis ett sådant som vätes av vatten.

I detta exempel har en skumplast av polyuretan ("Regilen 40 AG") använts med porstorleken 0,4 mm. Gjutning av gelerna skedde i en speciell apparat. Denna bestod av en cylíndrisk plast- kammare, i vilken den porösa plasten införts; plasten var in- fattad i en ring av akrylplast (höjd 2 cm och diameter 9 cm).

Apparaten (kammaren) hade en öppning pà över- resp. undersidan.

Den ena öppningen anslöts till en vakuumpump och den andra öpp- ningen hölls stängd. Kammaren evakuerades med hjälp av vakuum- pumpen. Därefter stängdes en kran i ledningen som förband kam- maren med vakuumpumpen. Genom den andra öppningen fick en fibrino~ gen -trombinlösning hastigt fylla kammaren. Därefter stängdes även den nedre öppningen och kammaren fick stå under 2 h, för att fibrinogenlösningen i det porösa plastmaterialet fullständigt skulle omvandlas till en fibringel. Stelningsparametrarna för trombin-fibrinogenblandningen visas i tabell 2. Såsom jämförelse framställdes även en gel på det i exempel 1 beskrivna sättet.

I tabell 2 visas även KS-värdet för denna senare gel. Efter full- ständig gelbildning öppnades kammaren och plastkakan med fibrin- «..@....._._...- aula... ..-n-...ßfl- . . .. . _... a... f s1o7as#-4 ' 14 ZS 40 gel (inklusive infattning) uttogs¿ Den överfördes-till en spe- ciell filtrerkammare. Infattningsringen, i vilken plastmateríalet och gelen var infattade, slöt tätt mot filtrerkammarens kanter genom två O-ringar. Kammarens övre lock var försett med ett in- lopp för den vätska, som skulle filtreras, och en avluftnings- ventil för utsläppning av den luft, som fanns ovanför gelytan..

I kammarens nedre del fanns ett utlopp för uppsamlíng av den fil- trerade vätskan. En buffertlösning, vars sammansättning framgår av tabell 2, filtrerades genom gelkakan. KS-värdet beräknades' enligt ekvation 1 (tabell 2). Såsom framgår av tabellen är KS- värdet för gelen, som var ingjuten i plast, av samma storleks- ordning som för den enligt exempel 1 framställda gelen. Plast- materialets partialvolymitet i gelkakan är 0,03, så att plast- grundmassan endast till en ringa del minskar den för flödet till- gängliga ytan.

Exempel 9.

Framställning av geler i cellulosagrundmassa. I Även cellulosamateríal kan användas såsom armeringsmedel (stödjande substans). I detta exempel användes en porös cellulosa- -massa ("Wettexduk") såsom armeringsmedel för fibringelen; den hade en tjocklek av 0,2-0,3 cm. Cirkulära bitar med radien cirka 3 cm vättes med en trombin-fibrinogenlösning. Cellulosabítarna svällde härvid till ungefär dubbel tjocklek. Partialvolymiteten hos den svällda cellulosamassan var 0,04. Omedelbart efter vät- ningen, som tog cirka 2 - 4 s, anbringades bitarna på filterskívan på en Büchnertratt. Åtgärder vidtogs, så att bitarna slöt tätt mot trattens kanter. Trattens öppningar täcktes med "Parafilm" och tratten fick stå rumstemperatur under 2 h för att fullständig fibrinbildning skulle erhållas i cellulosans hålrum. Buffertlös- ningar, vilkas sammansättning framgår av tabell 2, filtrerades genom gelen. Ks-värdet för gelen, som var ingjuten í cellulosa, är av samma storleksordníng som för en kontrollgel, som framställts utan armeríngssubstans.

Exempel 10.

Framställning av fibringeler i tunna skikt för filtrering.

I detta exempel visas, att fibringeler i tunna skikt med armering endast på undersidan kan användas för filtrering. Cirka ml fibrinogenlösning i trisimidazolbuffert med pH 7,4 blanda- des med en trombinlösning. Blandningen hälldes därefter i en Petriskål, vars botten var täckt av en fuktig silkeduk¿ Skälen v 40 Ü 1% ' 31Û78-64'Å täcktes med lock och fick stå l 2 h för fullständfg gelbildning.

Gelskiktets,tjocklek var 2 mm. Stelningsparametrarna för gelen framgår av'tabe1l 2. Filtret fastsattes därefter i en "Nillipore"- filterhållare försedd med tratt. Tratten fylldes med buffertlös- ning och flödeshastigheten bestämdes. Såsom framgår av tabell Z är Ks-värdet av samma storleksordning som för en motsvarande fibringel, som framställts enligt exempel 1. Med tiden visade filtret sjunkande KS-värde, vilket sannolikt beror på samman- pressning av gelmassan under flödet.

Exempel 11. 0 Stabilisering av geler genom behandling med dialdehyd.

I detta exempel visas, att geler som framställts enligt exempel 1, 8 och 10 , kan stabiliseras genom behandling med en díaldehyd. _ A. En enligt exempel 1 framställd gel bríngades i jämvikt med 0,014 M fosfatbuffertlösning med pH 7,2 i 0,15 M NaCl (fos- fatbuffrad koksaltlösníng, PBS). 2-3 kolonnvolymer av en 1-procen- tig glutaraldehydlösning bringas därefter att passera genom gelen under loppet av 10 min - Z h. Gelen tvättades därefter med flera kolonnvolymer av PBS och sedan med vatten. Pelaren bringades slut- ligen i jämvikt med trisimidazolbuffert och flödesmätningar ut- fördes. Dessa visas i tabell 2. Såsom framgår av denna tabell är KS-värdet nästan oförändrat efter behandling med glutardialdehyd.

Efter flödesmätningarna uttogs gelen ur kolonnen och fördelades på 3 dygn i 8 M urea innehållande 1% natriumdodecylsulfat (SDS).

Gelen reducerades därefter med 1% ditiotreítol på i och för sig ' känt sätt. Polyakrylamidgelektrofores i närvaro av SDS visade i förhållande till icke stabiliserade geler frånvaro av fria fib- rinkedjor (fibrinogenkedjor), vilket kan tolkas såsom bevis för att glutardialdehyd tvärbundit fibrinstrukturens kedjeenheter.

B. En enligt exempel 8 i porös plast framställd gel tvätta- des först med kalciumfri trisimidazolbuffertlösning och bringa- des därefter i jämvikt med 0,014 M fosfatbuffertlösning med pH 7,2 i 0,15 M NaCl (PBS). Därefter bringades två kolonnvolymer av en 1-procentig glutardialdehydlösning att passera genom gel- kakan (kolonnen) under loppet av 10 min. Gelkakan tvättades därefter med flera kolonnvolymer av PBS och sedan med vatten.

Slutligen bringades pelaren i jämvikt med trisímidazolbuffert och flödcsmätningar utfördes. Dessa visas i tabell 2. Såsom framgår av tabellen är KS-värdet endast obetydligt förändrat efter be- v I U1 "zo '25 e1o7ae4-4 i handlingen med glutardialdehyd och är av samma storleksordning som för en jämförelsegel, som framställts enligt exempel 1. Den med glutardialdehyd stabiliserade gelen autoklaverades därefter vid 120°C under 20 minuter vid trycket 1,4 atm. Efter autoklave- ring prövades flödet av buffertlösning ånyo genom gelkakan. Så- som framgår av tabell 2 har autoklavering endast i ringa grad påverkat gelens flödesegenskaper. Vid bristningar i gelen för- väntas en drastisk ökning av flödet genom gelen.

C. En enligt exempel 10 framställd fibringel överfördes . till en bägare med 500 ml vatten.för borttagande av buffertsalter genom diffusion; Efter 2 h överfördes gelen till en bägare med en ny portion vatten. Efter 2 h överfördes gelen till en bägare med 500 ml fosfatbuffertlösning med pH 7,2 i 0,15 M NaCl (PBS) ioch fick stå över natten. Gelen överfördes sedan till en Petri- skål innehållande 50 ml 1-procentig glutaraldehyd. Efter 2 h ut- byttes härdningsvätskan mot en ny fiortion av samma härdningsvätska.

Efter ytterligare 2 h överfördes gelen till en bägare med vatten och tvättades på beskrivet sätt. Efter tvättning med vatten över- fördes gelen till en bägare med trisímidazolbuffertlösning. Efter Z h utbyttes tvättvätskan mot en ny portion och efter ytterligare 12 h överfördes gelen till en "Millípore"-filterhållare med tratt.

Såsom jämförelse utfördes flödesmätningar med en gel, som fram- ställts på samma sätt men som icke härdats med glutardialdehyd.

Denna gel överfördes direkt efter gjutningen till en "Millipore"- filterhållare för flödesmätning. Såsom framgår av tabell 2 var flödet genom det härdade filtret jämförbart med det genom det icke härdade filtret i början av flödesmätningen. I slutet av mätperioden hade emellertid Ks-värdet för det ostabiliserade filtret märkbart minskat, vilket icke var fallet för det härdade filtret. Efter flödesmätningen steriliserades filtren genom auto- klavering av filtret (och filtrerapparaten) vid 120°C under 20 min vid trycket 1,4 atm. Flödesmätningar utfördes efter värmebehand- lingen och KS-värdena visas i tabell 2. Såsom framgår av tabellen kunde icke något flöde påvisas genom det ostabiliserade filtret.

Det härdade filtret visade å andra sidan KS-värden av samma stor- leksordning såväl före som.efter autoklaveringen.

På det härdade filtret påfördes 5 ml av en suspension av Sendai-virus. Filtrering skedde med hjälp av vattensug. När vätskan hade passerat filtret, fick ytterligare 5 ml buffertlös- gning passera filtret. Detta upprepades två gånger. Piltratet 44 ~810"?861r~4 provades på hämagglutínationsaktívítet."Öbetydïíg'hämagg1ütina-' tionsaktívitet kunde påvisas. Píltrets översída sköljdes med flera portioner buffertlösning. Sköljvätskan var opalescent och dess hämagglutinatíonsaktivítet motsvarade ett utbyte av virus- partiklar som var nästan 100%. ' Dessa exempel visar att filtren kan stabiliseras med en di- aldehyd, såsom glutardíaldehyd. "18 a1 :Wasa-a Hhümnuflflåfi ON .NWHEfiWH-nu. H __ =_._ @~.o _@_.@ ca _@_.o __-@_x__._ oo_mN = __o__=o_ _ _«_wW@w o_x@@._ o___ _ __ __ __ _ .I _ I I Q s __ _ N . ~ _ __ __ _ _ mcflomfifi . :_ 1 . .Kn Ja [Ümwm ao ÉCQÜH .__ __ __ __ __ Û w. Aw __ |Üm.%:,~w¥%-J> Ü w _. 4 êqe _ -mumcwwwvwmm __ __ __ __ __. Û @ __ Inwwfiakgäzxf U _o~o.Q_ _ m=__ __ __ __ __ __ MQWÅU _ wPlO-.KQQM __ Iümfiflflvzïfl/ D _ _ ___°.=-__°.o_ _ +~@u+_ _@w=__@__ __ «._ @~.o «@w.m __ ___~.o-ow_.o o_x_.N-o._ o___ ___ _-____m===_ Q ___ ___°H__ _ = = _. _. _.. ___ Q __-o_x«_ _ oo<@N = __o__=o_ _ ___°.° _°Q.@_ +~«_+ ßm°_=_flMM>M n _ _ l l . . __ _ _ __ 0 ___ _ .__ °__.o»@__.o __-°_x@._ ___ omqm .__ _@m=__@__ __ _wwW.Q_ @_x__. 1 __o__=o __ __ __ __ _. W m... m __ w v* m. .5 _ _@~W.__ _ _ -Qm____@_w __ __ __ ._ __ .VP N mlO-.ufimm w ._| ._ U __«W.@_ _ . -. WWH» __ __ _. __ __ .vw w GIOFKON m l _. lømflävfilnr) D _@m~.o_ _ 1 +Nmu+ _m@__E=_w _ __ .___ _~.@ æ__.N ____ w_._ _@-o_x~_._ __ _@w=_____ w ._ oo N _ Qw w_ E: Nwü 5358 _ .mas :__ _ ___ .ucovïmfi Jo .Høfišmflø __ .xuäflw .Éowwzn nwuflm ä 9G. _ m:fl:_..fifisfioo :o_._.co_=._o__ N Agmmfi.

Claims (10)

mreflaseea-ra 19 PATENTKRAV

1. Filter med bestämd_§5?šïÉïTÉk, k ä n n e t ë“t k"n ä*ï därav, att det är uppbyggt av fibrin i gelform, varvid porstor- leken bringats att variera genom ändring av stelningsparametrar.

2. Filter enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att bärande delar av mer hállfast material än fibrín (armerings- medel) är anbringade åtminstone vid övre och undre ytan av filtret.

3. Filter enligt krav 1 eller Z, k ä n n e t e c k n a t därav, att fibrinet är härdat och mer halifasr.

4. Filter enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t därav, att härdningen åstadkommíts genom närvaro av FXIII och kalcium under gelbildningen.

5. Filter enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t därav, att härdningen åstadkommits genom behandling i närvaro av di- aldehyd efter gelbildningen.

6. Sätt att framställa ett filter av fibringel med bestämd porstorlek, k ä n n e t e c k n a t därav, att en fibrinogen- lösning med i förväg inställda stelningsparametrar blandas med ett koaguleringsenzym och att erhàllen blandning bringas att stelna i en för filtret avsedd form.

7. Sätt enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t _därav, att bärande delar av mer hállfast material än fibrin (armerings- medel) före gelbildningen anbringas åtminstone vid den avsedda övre och undre ytan av filtret.

8. Sätt enligt krav 6 eller 7, k ä n n e t e c k n a t därav, att fibrinet göres mer hâllfast genom härdning.

9. Att fibrinet härdas genom närvaro av FXIII och kalcium under gelbildningen. _

10. Sätt enligt krav 8, k ä n n e t e c k n a t därav, att härdningen genomföras genom behandling i närvaro av dialde- hyd.