JPH0341965A - 酵素活性物質を含有するフィブリンゲル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の分野） この発明は、アイプリンからなる一定のサイズ（大きさ
）の細孔を有する炉材及び該炉材をフィブリノ−ダンか
ら製造する方法に関する。この発明はさらに、この発明
の炉材を使用するサイズ選゛択方法に関する。

（先行技術） フィブリノ−ダンを凝固酵素と接触せしめることによる
フィブリ／グルの形成は以前から知られている。このデ
ルに液を通過せしめた場合、グルの透過はだんだん困難
となり、場合によっては液の透過及び通過が急激に減少
し又は停止することが知られている。グルの内部構造は
極度に脆く、そしてｒル＃：ｌ：流路の網状構造とサイ
ズの異なる細孔から収ってむり、この細孔のサイズは液
又は液の混合物、特に固形粒子を含有する液の混合物に
高度に依存して変化しやすいと考えられている。

従って、このようなフィブリンダルは、粒子の大きさの
みに基いて成分を分離するためには使用できないと考え
られていた。

フィブリノ−ダンからのフィブリンの形成についての研
究においては、特にフィブリングルの流動特性に興味が
向けられてきた。例えば、シリカゲル、並びに寒天及び
ゼラチンダルを通過する流動特性は粘性流れであること
が以前から知られている。さらに、フィブリンダルを通
過する流れは調製中のイオ／強度及びフィブリノーゲン
濃度に依存することが報告されている。研究にむいて、
フィブリンダルの透過係数（Ｋ３）はポアズイユ（Ｐｏ
ｉｓｅｕｌｌｅ）の法則により次の式から決定される。

式中、ＱＦｉｒルを通過する流量（ａ３）であり、Ａは
ダルの表面積（ｃｍ”　）であり、ａｐは圧力差（ｄｙ
ｎｅ／７ｆｆ２）　（＝０．Ｉ　Ｎ／ｍ”　＝０．１　
Ｐａ）であり、ｔは時間（ｓｅｅ）であり、Ｌはグルの
長さ（ｃｎｌ）であり、そして、ｎは粘度（ｐｏｉｓｅ
　）（＝０．Ｉ　Ｐａ−５）テアル。さらニ、コゼニー
（Ｋｏｚｅｎｙ　）−カルマン（Ｃａｒｍａｎ　）は、
毛管系にむける粘性流れ又は層流にむいては、 次の関係式が適用されることを示し た。

は毛管の形状大きさにより定する係数、φは毛管が流れ
の方向となす向き（角度）、Ｃはグル中の液の部分であ
り、モしてｒは毛管の半径（ｔＭｌ）である。εは蛋白
質濃度とフィブリ／−りンの部分比容積（ｐｅｒＮａｌ
　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｖｏｌｕｏｍ　）から計算するこ
とができ、この部分比容積は０．７２である。

この明細書にむいて関連する型のグルについて、Ｋｏ及
びＣ６，φは計算することができない。理論的計算にむ
いて、毛管は円筒状であり、流れ方向に平行しており、
マドラス（Ｍｏｄｒａｇ　）等により提出された次の式
が与えられると仮定する。

従って、理論細孔サイズば２ｒである。有効細孔サイズ
は、そのサイズより小さい粒子は通過し、そのサイズよ
り大きい粒子は通過しない大きさを意味する。試験の結
果、凝固時間（Ｃｌｏｔｔｉｎｇｔｉｍｅ（この明細書
においてＣｔと称する）〕（〕スロンビンーフイブリ／
−グ／混合からのグル形成時間）はケ°ルを通過する流
量（Ｑ）に直線的に比例することが明らかにされている
。流量（Ｑ）は又、フィブリノ−ｒン濃度（Ｃ）に反比
例することが見出とれている。工＝ｏで且っＣｔ＝Ｏの
場合５Ｑ＝Ｏであり、式（１）は次の形をとる。

式中、ｋは−、イオン強度及びカルシウム濃度に依存す
る定数であり、さらにグル形成に使用した酵素に特異的
であり、そして、Ｃｔは凝固時間（秒）である。他の記
号は式（１）の場合と同一である。流量を（７）３／３
　で表現する・場合ｔは消去される。この式に従えば透
過係数には凝固時間Ｃｔに正比例し、そしてフィブリ７
−ｒン濃度に反比例する。

−を６〜１０の間で変え、イオン強度を０．０５〜０．
５の間で変え、カルシウムイオン濃度を０〜２０ｍＭの
間で変え、及び／又は酵素〔例えばスロンビン「パトロ
キソビン（Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ　）　Ｊ又は「アルビ
ン（Ａｒｖｉｎ　）　Ｊを溶液１　ｒｎｌ当り０．０１
〜１ＯＮＩＨ−単位（又は、他の酵素のこれに対応する
単位）の間で変え、そしてフィブリノ−ｒン濃度を０．
１〜４０９／ｌ、好ましくは１〜１０１／ｌの間で変え
ることにより、Ｋ３値〔式（１）に従って計算算したも
の〕が１０〜１０　、好ましくは１０−８〜１０−１１
であるケ０ルを調製することができる。式（３）に従っ
て計算すれば対応する平均半径は０．０３〜９μｍ１好
ましくは０．０９〜２．８μｍとなるであろう、ＦＸＩ
［ｌ（アミド基転移酵素）及びカルシウムイオンがアル
形成中に存在すれば、グル網目構造のサブユニット鎖間
に共有結合架橋が生ずるためケ０ルの安定性が増加する
であろう。

（発明の構成） 従って、この発明に従えば、このようなフィブリンアル
をＦ材として使用することができることを見出した。こ
の発明のＦ材は、部材がフィブリンにより構成され、そ
して、フィブリングルが、流動液体と接触する場合の変
形に対して該グルの少なくとも１つの面の形状を維持す
るための形状維持手段と関連していることを特徴とする
。

この発明のＰ材は実質上均一な細孔を有する。

このことは、細孔のサイズの標準偏差が１５係以下、好
ましくはｌ（１未満、そしである場合には５係未満であ
ることを意味する。

さらに、アルの細孔のサイ−ｅがグルの形成において使
用される凝固要因の関数であること、すなわち細孔のサ
イズはこの要因を変えることにより変化することが見出
された。そして、細孔のサイズは凝固時間に比例する。

この発明に従えば、グルが、成分を分離しようとする流
動している液媒体のごとき流動して（ρる媒体と接触し
た場合に生ずるかもしれないアルの変形に対して、ケ゛
ルの少なくとも１つの表面を維持するための手段を用い
れば、グルの形のフィブリンをＦ材として使用すること
ができることが見出された。さら゛に、全く驚くべきこ
とに、ケ０ルは実質上均一な細孔サイズを有してむり、
そして、これらの細孔のサイズｌｌ１ｒルの形成の際に
採用される方法要因を変えることによって容易に制御す
ることができることが見出された。

特に、グルをなんらかの方法により形状維持手段を用い
て安定化した場合、グルの構造が保存され、そしてその
中の均一な細孔は濾過媒体として理想的に機能すること
が見出された。

−数的に言って、グルば形状維持手段と共に使用する。

形状維持手段としては、細孔を有するシート部材のごと
き細孔を有する部材を使用することができ、モしてグル
Ｑ上部表面上に、又はそれと関連させて、そして好まし
くはアルに直接接触するように、又は接着剤もしくはグ
ラフトを介して接触するように配置するのが好ましい。

小孔を有する部材は、濾過すべき媒体がグルと接触する
場合に該グルの上部表面の形状及び構造を保芯するよう
に働くかも、グルは崩壊せず、従って、その均一な細孔
が維持され、理想的な濾過媒体として機能する。

形状維持手段として機能する小孔性部材は、シートの形
であることが好ましく、又ケ９ルの上部表面と実質上同
じ拡がりを有することが望ましいが実質上任意の大きさ
及び形を有することができる。

小孔性シート部材は、織物の形もしくは非織物の形、又
はメリヤス生地の形のごとき繊維状網目構造にすること
ができ、この繊維としては天然繊維又は合成繊維を使用
することができる。

小孔性シート部材の繊維が天然繊維である場合には、絹
、羊毛、綿、セルロース、麻、ノユート、又はこれらに
類するものから製造されたものを使用することができる
。

合成繊維としては、ナイロン、ポリエステル、ポリオレ
フィン、ビニルポリマーから製造された繊維、ポリアク
リロニトリルのごときアクリル憶維、ナイロン製のもの
を使用することができる。

繊維は、一般に１〜１０００μｍ、好ましくは１０〜２
０μｍの厚さを有するものを使用し、０．０１〜５鵡、
好ましくは０．０５〜１龍の開口部を構成するように相
互に配置する。小孔シートの繊維の間の開口の大きさは
特に臨界的ではなく、炉遇すべき媒体が通過できる程度
とする。繊維は可能な限りグルに接触又は密着せしめ、
炉遇すべき媒体と最初に接触するケ゛ルの表面の構造的
強度を最高に維持するようにするのが好！しい。

繊維性小孔部材を使用するかわりに、線材、例えば銅、
錫、亜鉛、アルミニウム、ガラス、硼素繊維、チタン、
鋼、ステンレフ、鋼等の線材を使用することができる。

線材は、繊維により供される機能と同様な機能を有し、
ケ０ルの少なくとも１つの表面、好ましくは上部表面又
は炉遇すべき混合物と最初に接触する表面に構造的強度
を与える。

線材間の隙間は、小孔性シート部材として機能する織物
性もしくは非織物性の繊維又はメリヤス生地の隙間と同
様の大きさとする。線材は篩、金網、又は膨張金網の形
にして使用することができ、モしてグルの少なくとも１
つの表面、好ましくは上部表面と同じ拡がりを有するこ
とが望豊しい。

グルは均一な細孔サイズを有し、ケ９ルが形成される方
法に従って、広範囲の均一の細孔、を有するコトカテき
る。フィブリンケ°ルの実質上均一な細孔は約０．００
３〜’１μｍ、さらに好すしくは０．００９〜ｏ、３μ
ｍの範囲の理論細孔サイズ又は直径を有することが好ま
しい。

クルば、フィブリノーゲンを酵素、特に凝固酵素と接触
せしめることにより形成する。フィブリフケ・ルの形成
に使用するのに特に好ましい酵素にはスロンビン、バト
ロキソビン、アルビン、エカリン（Ｅｃｃａｒｉｎ　）
、スタフィａコアグラーゼ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏａｇ
ｕｌａｇｃ　）、／’Ｐ　／＃　イ：／、トリプシン、
毛虫毒酵素等が含１れる。

ケ゛ル形成は一３℃〜５８℃の温度で行うことができる
が、−数的には室温において行う。温度範囲は０〜４０
℃とするのが好ましい。

カル／ウムイオ／の存在下でフィブリノ−ダンを酵素と
接触せしめることによりケ゛ルを形成するのが好ましい
。カルンウムイオ／の濃度は２０　ｍＭ以下とすること
ができる。カルシウムイオ／の存在はすべての場合に必
要なわけではない。凝固酵素としてスロ／ビンを使用す
る場合、カルシウムィオ、の不存在下でグルを形成する
ことができる。

グヤの形成にむいては、フィブリノ−ダンＩ当り０．１
〜１ｏ−５単位の酵素を使用するのが一般的であり、フ
ィブリノ−ダン単位重量当たり１０〜１ｏ−３単位の酵
素を使用するのが好ましい。

凝固時間が酵素とアイプリノーク゛ンの相対量、及ヒカ
ルシウムイオンの濃度の関数であるｒル形成に続いて、
グルを硬化せしめ、又は架橋剤と接触せしめることによ
りグルの構成成分間に架橋を形成するのが好ましい。好
ましい架橋剤には、スペリン酸イミドのごときビスイミ
デート、タルトリルノ（ｔ−アミ７カグロイルアチド）
のごときアチド、４．４−ジフルオロ−３，３′−ジニ
トロフェニルスルホン 物、グルタル・ノアルデヒド、ニトリ／（　ｎｉ　ｔｒ
ｅｎｅｓ　）、Ｎ　、　Ｎ’（、、４−アチドー２−二
トロフェニル）−ノスタミ／ノオキンド、ノ（Ｘ．１Ｏ
−フェナ／スロリノ）銅（ＩＩ）、ノチオビスー（スク
ンンイミ・ゾルプロピオ＊−））、Ｎ，Ｎ’−フェニレ
ンツマレイミド、及びポリエチレンイミド、並びに′他
の二官能化合物、特にイプンロンリジン、α−アミ７基
、アスｚＪ？ラギン基及びグルタミン酸のカルメキ°シ
ル基、そして蛋白質中のアミノ酸のヒドロキシル基（例
えばスレオニン及び七リン）と架橋を形成することが知
られているものが含まれる。

使用することができるビス−イミデートには、次の式、 （式中、ｎは３〜１５、特に３〜１０である。）で示さ
れる化合物が含寸れる。

使用することができるアチドには、次の式（式中、ｎは
１〜２０．特に１〜１５である。）で示される化合物が
含まれる。好ましいアチト°には鎖中に異原子、特に窒
素を含有するものが含まれる。さらに、ヒドロキン置換
アチドの使用も好ましい。

使用することができるアリールツノ１０ｒ／化物には、
単環、多環及び縮合環、並びに直接に又はメチレン橋も
しくはスルホ橋を介して結合している複数環を有するノ
ハログン化物が含まれる。ノ・ロケ°ン化物を構成する
／１０グンは弗素、塩素、又は臭素のいずれであっても
よい。化合物は、アミ／基、又はフスルフィドのごとき
不活性基又は官能基により置換されていてもよい。好渣
しい化合物には、官能基、例えばニトロ基がノ）ロケ°
ン置換基の１つと置き換えられているものが含まれる。

好ましい化合物には次の式、 ｏ２ で示される化合物が含まれる。特に好ｉしいものはグル
タルジアルデヒドである。

一般に架橋剤は０．００１重量俤〜８重量係の範囲、好
１しくは１〜１２０分間、グルの重量に対して１〜２嘩
使用する。架橋の形成は１０〜４０’Ｃ１Ｈ４Ｌ＜ば２
０〜２５℃の温度にむいて行う。

硬化構造又は架橋構造を得た後、グルを洗浄して異物を
除去する。

このような硬化型のグルは炉材として有用であり、いか
なる小孔性シート材料をも伴わないで使用することがで
きる。しかしながら、網、金網、又は他のシート材料の
とと、き形状維持装置上で、又はそれと関連寧せてグル
を形成し、そして形状維持手段と接触した状態で、硬化
剤又は架橋剤を用いて硬化せしめるのが好ましい。

ケ°ルは、小孔性シート又はこれに類するもののごとき
形状維持手段によってその上部表面及び下部表面を支持
し、それによりてケ゛ルを炉材として使用中その形状の
維持を確実にするのが好ましい。

さらに、この発明は、Ｑ、ＱＯ３〜１μｍの理論サイズ
を有する第１の物質を、前記のサイズより大きなサイズ
を有する第２の物質から分離する方法にむいて、前記第
１の物質と第２の物質の混合物を、実質上均一なサイズ
の細孔を有するケ°ル型のフィブリンから成り、流動す
る媒体と接触した場合に生ずるかもしれない変形に対し
て前記のグルの少なくとも１つの表面の形状を維持する
ための手段を有し、有効細孔サイズが前記第１の物質の
粒子のサイズより大きく前記第２の物質の粒子のサイズ
より小さい炉材を通過せしめることを特徴とする方法に
関する。グルの細孔は０．００９〜０．３μｍの理論サ
イズを有することが好ましい。

この発明の炉材は細菌とビールスの混合物からこれらを
分離するのに使用し得る点において重要である。細孔の
サイズを制御し、そして均一な細孔サイズを有するグル
を完成することができることが、この発明の炉材の重要
、且つ必須の特徴である。これらの炉材により、血液成
分の分離、血漿成分の分離、血液からの血小板の除去、
細胞と細胞片との分画、及び高分子量蛋白質凝集体の分
、離が可能である。さらに、ラテックス、シリカ、炭素
及び金属粒子のごとき種々の粒子をこの発明の炉材によ
り分離することができる。分離することができる成分に
は次の第１表に示すものが含まれる。

以下余白 第 表 フィブリンダル炉材はまず、他のグル炉材に比べて細孔
のサイズを所望の通りに変えることができるという利点
を有する。さらに、この発明の炉材は、ビールス粒子の
ごとき非常に小さい粒子を除去することができる細孔サ
イズにおいて、高い流速を供する。この観点から、この
発明のＦ材ハ、公知の膜炉材及びポリアクリルアミドゲ
ル炉材に比べて適当である。Ｐ材上に蛋白質を吸着しな
いことも他の炉材と比較した場合の利点である。

（具体的態様の説明） グル炉材を製造するためのこの発明の方法は、前記のご
とく、前もうて調整した凝固要因の下で、フィブリ／−
１’ン溶液を凝固酵素と混合し、こうして得た混合物を
炉材用の型に凝固せしめる。フィブリングルは、凝固中
に又は凝固の後で、グルより大きな強度を有し、好まし
くは製造しようとするグルの上部表面に適用され、そし
て好ましくはその上面及び下面の両方に適用された形状
維持手段により強化するの゛が便利である。

形状維持手段（補強網）は、フィブリノ−ダン混合物を
注入する（流し込む）型の中で底部及び好１しくはさら
に上部に適用する網の形をとるのが好ましい。この混合
物は網（小孔性材料）に浸透せしめ、例えば網から１０
μｍ〜５箇、好ましくは０．５〜２ＩＩＩＩ＋の所に表
面を有するようにすることが好ましい。網は、その網目
を例えば１０μｍ〜５瓢、好ましくは５０μｍ〜１鵡と
し、形状維持手段として使用する線材の直径を例えば０
．０１〜１、　Ｏｔｍ好ｔＬ＜は０．１〜０．５　ｍと
することができる。上記の金属線材のほかに、天然繊維
の線材及びグラスチックの線材を使用することもできる
。

炉材は又表面以外の場所にｉ？いて補強することもテキ
ル。炉材の全体を支持するプラスチック気泡材のごとき
気泡材料中に炉材を形成することもで場合には、１００
℃を越える温度に曝露すべきてなく、このような熱殺菌
によりケ°ル構造が破壊される可能性がある。従っ゛て
、炉材を生物学的方法に使用する場合には、炉材を初め
から無菌的に製造する必要がある。他方、ファクターＦ
ＸＩ［ｌ及びカル゛シウムイオンの存在下でｒル形成を
行うことにより、炉材を製造する間に炉材を硬化又は架
橋せしめることが可能であることが見出された。ファク
ターＦＸＩ　を存在せしめる場合、これを、フィブリノ
−ダンｌ当たり５０単位以上存在せしめるのが好ましい
。カルシウムは２０ｍＭ以上の濃度で存在せしめる。

前記の架橋剤のいずれか、特に、ジアルデヒド、そして
特にグルタルジアルデヒドのとと＜、Ｒが炭素原子数１
〜８個のアルケニル基であるＱＣ）（−Ｒ−ＣＨＯ・の
構造を有するものにより架橋を形式せしめることにより
さらに強度の大きい炉材を得ることができる。こうして
製造した炉材はオートクレーブ中で加熱処理し、そして
当然殺菌することができる。

凝固要因としては、１ず酵素濃度が例えばスロンビンに
ついて１００〜３０００　ＮＩＨ単位／ｌであり、そし
てフィブリ７−ｒン濃度は０．１〜７ｏ１１／ｌ　。

好１しくは１〜１０１／／ｌであり、この濃度を高める
とデルばより密になる。密なグルはより小さい細孔サイ
ズを有する。イオン強度を高くした場合も−が高い場合
と同様に密なケ°ルが生ずる。ｐＨ５，５〜１１、好ま
しくはＰＩ（６〜９、そしてイオン強度が０．０５〜Ｏ
１５であるケ０ル混合物を用いてグルを調製するのが好
ましい。０〜２０　ｍＭのカルシウムイオン濃度におい
て形成したグルは密である。

細孔のサイズは又、凝固を行った温度からも影響を受け
る。凝固温度を低くした場合には凝固時間が長くなり、
このために形成されたグルの細孔サイズはより大きくな
る。細孔サイズが犬きくなる結果より大きな流速が得ら
れる。

この発明のグルは、炉材として以外にも使用することが
できる。触媒的に活性な酵素又は触媒的に活性な金属の
ごとき触媒的に活性な物質を細孔内に配置して、モして
細孔の構造を触媒として使用することができる。従って
、炉材は、幾分は中に配置された触媒的に活性な物質の
ための触媒担体として機能する。ｍ孔の中に触媒的に活
性な薬剤を配置した場合、形式された構造を、触媒担体
の細孔を自由に通過するサイズの成分のみを転化するサ
イズ選択的触媒として使用することができる。グルの表
面に保持される物質は触媒的に転化されない。このよう
な炉材により、特に酵素が炉材内に共有結合的、イオン
結合的、又はその他の方法で固定された場合に、酵素的
転化を容易に行うことができる。グル構造が酵素の使用
により形成されるため、この発明の化学的成分の炉材は
酵素触媒として使用する酵素と親和性である。このため
、この発明の炉材は、それにその酵素的触媒に有効な適
当な酵素を含有せしめる場合には、次の酵素転化のいず
れにも使用しうる。すなわち、種々の酸化−還元酵素、
転移酵素、加水分解酵素、分解酵素、イン〆ラーゼ及び
リガーゼ（合成酵素）を含む反応である。ケ゛ル中の蛋
白質鎖を分解する能力を有する加水分解酵素は使用する
ことができない。

酵素又はその他の触媒゛成分を炉材内、すなわち炉材の
細孔内に配置するための方法は、酵素の性質に依存する
。公知の酵素固定剤を使用することにより酵素を配置し
、次にＰ剤を洗浄して余分な物質を除去するのが好まし
い。

さらに・反応性　　４１　Ｆｌｌ酸成分グルの細孔内に
配置することもできる。反応の際に、低分子量成分が遊
離し、そしてそれに続いてケ°ルから溶出するであろう
。このような反応形式の例として、七ノグイビールスと
反応せしめた後の白血球からのインターフェロンの製造
がある。この発明において示すごとく、これらの成分の
いずれをもグルの細孔内に配置することができる。

この発明及びこの発明を実施する方法をさらに詳細に説
明するために次の例を記載する。

例１ 方法及び材料 スエーデン・ストックホルム・ｌＭＣ０からフラクショ
ン！−４（７）を得た。凍結乾燥標品又は湿ペースト′
標品のいずれかは９７〜ｔ　ｏｏｓ炭固性でありた（分
光光度計分析）。０．３　Ｍ　ＮａＣｔ及び２幅蛋白質
の溶液を調製したＯこの溶液（５Ｑ＋ｙｔ）を０．３　
Ｍ　ＮａＣ１に対して４℃にて３時間、１時間毎に外液
（５１）を取り替えながら透析した。この透析溶液をさ
らに、脱気したｐＨ６，５〜８．２のトリス−イミダゾ
ール緩衝剤（８）で、蛋白質濃度が１．２〜５．０１／
／ｌになる筺で希釈した。最終希釈においてトリス及び
イミダゾールの各々の濃度は０．０２Ｍであった。必要
があれば、緩衝剤に塩化ナトリウムを含有せしめること
によりイオン強度を高めた。生成するかもしれない痕跡
量のグラスミンを阻害するだめに、トラシロール（Ｔｒ
ａｓｙｌｏｌ）（ドイツ国、バイヤー社製）を、すべて
の緩衝剤及び透析液中に、５ＫＩＦ２７ｍｌの濃度で加
え７１：。

ケ゛ル化実験において次の操作を行った。プラスチ、り
管中のフィブリノーゲン溶＊　３．６５　ｍｌに、Ｉ　
Ｍ　ＣａＣｔ２溶液を７０μｇ添加し、その直後に種々
ノ濃度のスロンビン又は・〈トロキン上ビン溶液ヲ加え
る。管を手早く２回逆転させ、そして酵素を添加して１
０秒間以内にデル容器又は分光光度計セルに移す。これ
以後の操作は別の項で記載する。

スロンビン　はとんどの実験にむいて、前記の方法（９
）のようにして調製したウシの標品を使用した。比活性
：１００〜２０ＯＮＩＨ単位／ｍ９゜高度に純化した（
比活性：約２０００　ＮＩＨ単位／■）ヒトースロンビ
ン００を用いて対照実験を複数回行った。

バトロキソビン　〔ボスロープス・マラジョエンシス（
Ｂｏｔｈｒｏｐｓ　ｍａｒａｊｏｅｎｓｉｓ　）由来〕
を１スイス国、バセル（Ｂａ５ｅｌ　）　、ペンタファ
ーム（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ　）社から入手した。

比活性：　１０００　ＡＴＵ／ｍ５７゜試薬　使用した
すべての試薬は分析銘柄である。

スロンビ／溶液を、カルシウムを含有じイオン強度が０
．１〜０．３であるｐＨ６，５〜８．２のトリスーイミ
グゾール緩衝液に加えて、最終濃度が０．０５〜２．５
ＮＩＨ単位／ｍｌとなるようにする。他の試験にむいて
は、パトロキソビンを０，２７〜３．６　ＢＵ／ｒｎｌ
使用してグル形成を行う。トリス及びイミダゾール塩の
濃度は各０．０２Ｍとし、そしてカルシウム塩の濃度も
０．０２Ｍとする。イオン強度の変更はＮ１ｒＣ１を加
えることにより行う。

ケ９ル形成はさらにカルシウムイオン濃度Ｏ〜２０ｍＭ
にむいても行う。カルシウムイオン濃度を低下せしめる
ことによりり°ルの不透明度が増加する。

スロンビンを使用し、そしてカルシウムイオンの非存在
下でグル形成を行う場合、凝固時間（Ｃｔ）は流速、従
って又に３と直線的に比例する。ケ０ル形成にパトロキ
ソビンを使用する場合、カルシウムイオンの非存在下で
のダルの安定性は満足できるものではなく、流速の測定
はより困難になる。

スロンビン又はバトロキソビンのごとき酵素ヲ添加した
後、溶液を手早く攪拌し、そして容器、例えば第１図（
、）に示すようなものに注入する０この容器はアクリル
系グラスチックでできており（ナイロン及びポリスチレ
ンのごとき他の材料を使用することもできる）、約１４
洞の直径と約２７−の高さを有する。プラスチ、り容器
は第１図（ａ）に示されてむ９、こ−の容器の下部は５
ｏｘｓｏμｍの網目サイズを有するナイロン炉材ででき
ている。

このＰ材はプラスチック製保護環により固定されている
。膜層、例えば「パラフィル記」　を下部に適用して、
液が容器から漏出するのを防止するのが好ましい。溶液
を容器に導入した直後に、縞目の大きさが１５０Ｘ１８
０μｍの絹製網を上端に適用し、そして保護環により固
定する。ケ°ル容器中の液面は、例えば網上１ｗＭに位
置せしめることができる。容器を、少なくとも２時間室
温にて、好ましくは振動のない場所に置き完全なグル形
成を行う。

この時間の後、下部から膜を除去し、そして容器をその
内容物のゲルと共に第１図（ｂ）のホルダーＡ中に置く
ＪルダーＢを容器ｌの上端に適用する。

ホルダーＢの上端及びホルダーＡのＴｉにはお口が存在
する。ホルダーＢに液体（緩噺液又は水）を満たし、そ
して、ゴムホースに連砧された管を装着したコ゛ム栓を
開口に再入する。フ゛ムホースを浸透溶液用容器に連続
し、この溶液を気泡を含まないようにゴムホースに涌た
す。容器（図に早してない）を、グルを通して適当な流
れが得られる高所に設置する。静水圧を、試験により４
〜４０×１０　’　ｄｙｎｅ　／ｃｒｎ２の範囲で変更
する。

グルの形成に使用するフィルリノーグンは、トランスア
ミダーゼであるファクターｘｍ　ヲ痕ｓ量含有している
。この酵素及びカルシウムイオンの存在下で、フィブリ
ングル分子単位の鏡開で共有結合による分子間架橋が形
成される。スロンビンはファクターχｍを活性化するた
め、上記の現象は特にスロンビンが存在する場合に生ず
る。

ドデシル硫酸ナトリウムの存在下にむける種々のグルか
ら回収したフィブリンの電気泳動的分析の結果、スロノ
ビンの存在下で、フィブリンのα−及びγ−鎖の完全な
架橋が生ずることが示された。パトロキソビンの存在下
では部分的な架橋が生ずる。ファクターＸ■の存在下で
形成される共有結合性架橋は、ケ゛ル構造の安定化に寄
与する。

グル容器の頂部に適用され、モしてグル網目構造と密着
する組線はグルの機械的強度のために非常に重要である
。この網又はグルの崩壊を防止するための他の手段が存
在しない場合、試験流通中にグルの中央部が崩壊し、ペ
ンド内部で円すい状に隆起して、グルが破壊される。

もちろん組線を他の網、例えば綿、ナイロン、鉄又は銅
の網で置き替えることができ、これらの網ば４０　Ｘ　
１０　ｄｙｎｅ／ｃｍ”　までの圧力にｉ？ｎでｙ’ル
構造を安定化する。

濁度測定 流通試験と並行して系の濁度を同一条件下で測定した。

これらの実験にむいて、反応混合物（フィプリノーク°
ンの項参照）を、記録分光光度計（ペックマン−アクタ
ＩＩＩ）のキュベツト（５ｍｌ）中に注入する。遅延期
間（ｌｏｇ−ｐｈａｓｅ　）の後、グル化に伴う濁度が
急激に上昇した（第８図）。

シグモイド曲線の最も急勾配の部分に接線を引いた。こ
の接線と時間軸との交点をグル化時間又は凝固時間（Ｃ
ｔ）と定義する。（Ｃｔは、グル容器中で視覚的に観察
される濁度増加時間と概ね同じである。）Ｃｔに加えて
、最高濁度（ＯＤ−ｍａｘ　）及び濁度増加速度（ＪＯ
Ｄ／ｍｉｎ　）も記録した。ケ°ル化の完結に必要な時
間は、濁度曲線から判断した。

この時間は高酵素濃度及び低酵素濃度においてそれぞれ
１〜２時間の範囲でありた。

フィブリノペグチド及び架橋の測定 反応混合物（フィブリノ−ダンの項参照）を複数の同様
の管の中で調製する。その内の１つを前記の濁度測定に
使用する。他の管には１ｍｌづつの反応混合物を収容す
る。後者の管における反応は、種々の時間にヒルジン（
ｈｉｒｕｄｉｎ　）　（２ＡＴＵ／ｍｊ　）及び同容量
の８Ｍ尿素を加えることにより停止する。この後、同容
量の冷エタ／−ルを添加することによりフィブリン（フ
ィブリノーケ０ン）を沈澱せしめる。混合物を２時間水
浴中に保持し、そしてその後、遠心力により沈殿を固め
、尿素に溶解し、そしてＳＤＳ　−Ｆ”ルミ気泳動に使
用する。上澄液は、ＦＰＡ、　ＦＰＢ及びＢβの放射免
疫測定（ＲＩＡ）に使用し、ｌ　５−４２′Ｉ′ｉ最近
開発されたクドリク（Ｋｕｄｒｙｋ　）等の方法を使用
して測定した。

粘度は、２５℃にむける水の場合に２９０秒の流れ時間
を有するウベローデ（Ｕｂｂｅｌｏｈｄｅ　）型の粘度
計により測定した。これを、標準（米国、Ｐａ％キャノ
ン・インスツルメントカン／４′ニー）に対して調整し
た。

密度は、５ｍｌのピクノメーターで測定した。

細孔の大きさ　膜の平均細孔の大きさの計算式α呻及び
アクリルアミドポリマーグルのそれ（４）を適用した。

式中、ｒは平均細孔半径（ｃ！１１）であり、εはケ。

ルの部分空隙率、すなわちり゛ル中の液体の部分容積で
ある。εば、フィブリノ−ダンの部分比容積が０．７２
α場であると仮定して蛋白質の濃度に基いて計算する。

この場合、εはグルの網目構造に水が結合していない場
合のグルの部分空隙率である。

しかしながら、溶液中のフィブリノ−ダンの水利の程度
は高＜、６！！／９蛋白質であると報告されている。こ
の水がケ゛ル網目構造によりｉ′ｆ−！？’ｇれている
と仮定して、発明者等はさらにこのような水和ケ°ルの
εを計算した。

拡散係数　ダル中の水の見かけ上の拡散係数を、次のチ
クノール（Ｔｉｃｋｎｏｒ　）ａυ及びホワイト（Ｗｈ
ｉｔｅ　）　（４）の式に従ってＫｓから計算した。

式中、Ｄは拡散係数（ｃ−”／５ｅｃ）であり、Ｒは気
体定数（ｅｒｇ／ｍｏｌｅ−ｄｅｇｒｅｅ　）であり、
Ｔは給体温度（Ｋ６）であり、モしてＶは透過物のモル
容積（ｃｒｎ”／ｍｏ　ｌｅ　）である。

イオン強度は、電解質のモル濃度を基礎にして計算した
。活性係数及びカルシウムが蛋白質と結合する程度は考
慮しなかった。

相関係数、勾配及び交点を計算するために最小自乗法解
析を使用した。図中のすべての線はこうして描写した。

結果 ダルの調製と安定性 周囲温度において調製したダル上で流過試験を行った。

平均温度ば２４±２℃であった。しかしながら、各実験
においで、温度の変化は２℃を越えなかった。予備実験
にむいて、この温度変化が系のＣｔ　に与える影響は無
視できることが示された。浸透実験においては、特にこ
とわらない限り流速は２５℃に補正した。

ダルの上端にむける組線はケ°ル構造を安定化せしめる
。組線の支持がない場合、適用される圧力（約７ＸＩＱ
３ｄｙｎｅ／の２）にむいて流れに降伏するであろう。

ダル網目構造がグラスチック容器の壁に密着しているの
で、降伏はダルの中央にむいてのみ生ずる。

カラム中の網は、ダルを収容しないカラムにおいて、液
の流速を有意に減少せしめない。このため発明者等は、
網がダルに接している場合、この網は流れに使用される
面積を制限しないものと考える。

流過試験を開始する前に、ケ゛ル網目構造に組み込まれ
るフィブリノ−ｒンの量を測定した。これは、カラム（
約４ｍ１）の空隙中の蛋白質含量を測定することにより
行った。フィブリノ−ｒンの消失係数を使用して分光光
度計的に測定した場合、蛋白質の量は、ケ゛ル化に使用
しｆｃ総蛋白質量の１〜３幅の範囲であった。必要と考
えられる場合には゛、ダルのフィブリン含量の計算にむ
いて非凝固蛋白質を考慮に入れた。

種々の浸透物のζデルの流速に与える影響を幾つかの実
験にむいて試験した。代表的な実験を第２表に示す。１
ず、ダルにイオン強度０９２１の緩衝液を浸透せしめろ
（実験り。浸透物を水に変えた場合（実験■）流速が上
昇した。これは、浸透物の粘度変化を基礎にして予想し
たものより大であった。最初の浸透物に変えた場合（実
験■）流速は低下したが完全には最初の値（実験１）に
戻らなかった。イオン強度０．３６の緩衝液をダルに浸
透せしめた場合（実験■）、２つの緩衝液の粘度の相異
に基いて予想されたのとほとんど同じわずかの低下が生
じた。浸透物を再度水に変えた場合（実験Ｖ）、ｍ速は
、最初に水に変えた場合（実験［１）とほとんど同じ値
にまで上昇した。この、浩果は、最終的なケ゛ル構造は
浸透物組成の穏和な変化には影＠されないが、イオン環
境の激しい変化によって変化が生じ、この変化は完全に
可逆的ではないであろうことを示唆している。

！２表 積々の浸透物にむけるフィブリンダルの流れ特性 ダル形成ニドリス−イミダゾール緩衝？ＦＥｐＨ７，４
、イオン強度０．２１、スロンビンＱ、　８　ＮＩＨ単
位／１ｎ／、温度２１℃、フィブリノ−ｒ／濃度２η／
　ｍｌ　。

浸　　透：２２〜２３．５℃ 実験　浸透物　流速（ｍＬ／ｈｒ）係 ｐＨ７，４゜ ■ ２０ ／２０．２１　　　３．１７７　　　１００３．７０８ １７ ■ ■ トリス−イミダゾール ｐｌ（７，４，／２０．２１ トリス−イミダゾール ｐＨ７，４／２０．３６ ２０ ３．３８５ ３．２７１ ３６４つ ０６ ０３ １５ フィブリングルを通過するフロー・ぞターン粘性流れ 流れがポアズイユの法則に従うか否かを試験するため、
ｐＨ７，４、イオン強度δ、２／、３種類の異なるスロ
ンビン濃度（０，１−０，８ＮＩＩ（単位／ｉ／）にむ
いて形成したグルについて、種々の圧力における流速を
測定した。これらのグルのに３の範囲は１０−８〜１０
−１０であった。浸透は、１つの実験においては上記と
同じ緩衝液を用いて行い、他の場合には水を用いて行っ
た。すべての場合において落下速度は、圧力の低下と共
に直線的に低下した１つのデルについて第３表に示すよ
うに、単位圧力当たりの流速は全圧力にはほとんど依存
しなかった。

第３表 圧力と流速との関係 ケ゛ル化：ＰＨ７，４、イオン強度０．２１、スロ／ビ
ン０．　Ｉ　ＮＩＨ単位／ｍｌ、温度２３．５℃、７（
ブリノーケ゛ン濃度２　ｍｙ　／　ｍｌ　。

浸透：Ｉ（２０，温度２３．５℃　Ｋ、　＝９　Ｘ　１
０−９圧　　力　　　　流速　　　流速／ｄｙｎｅ／ｃ
ｍ２５５３１　１００　　１１２８０　　　　２．０３
９４　　　１００５３１９　　９６２　１０．８１７　
　　２．０３３７　　　　９９．７５１２７　　９２．
７　　１０．４１８　　　２．０３２０　　　　９９．
６４８７４　　８８．１　　９Ｂ５９　　　２．０２２
８　　　　９９２４５７６　　８２．１　　９．１４８
　　　　１．９９９１　　　　９８０他のシリーズの実
験において、種々の粘度を有する浸透物について流速を
測定した。この実験にむいて使用したグルは、ｐＨ７，
４、イオン強度０．２１．４種類のフィブリノ−ダン濃
度において形成した。

グル形成の誘起剤としてスロ／ビン及びバトロキソビン
を使用した。４．５℃〜４０℃にむける４種類の温度に
むいて浸透を行った。

すべての場合において、浸透物の粘度の逆数と流速との
間に直線関係があった。これらの実験により、グルを通
過する流れは粘性流であることが示唆された。さらに、
レイノルズ数を計算し、そしてすべてのグルについて層
流域にあることを見出した。

拡散流 チクノール（Ｔｉｃｋｎｏｒ　）、Ｊ、　Ｐｌｙｓ、　
Ｃｈａｍ　　６２　ｚ１’４８３〜５（１９５８年）に
より、拡散係数（Ｄ）とジ、ンンン（Ｊｏｈｎｓｏｎ　
）及びバブ（Ｂａｂｂ　）　Ｃｈｅｍ。

Ｒａｖｓ、　５６　３８７〜４５３　（１９５６年）の
粘度との関係を考慮した場合、粘性流についての等式は
拡散流についての等式と同じ形をとることが示された。

ＫとＤの関係は式（３）で与えられる。浸透物として水
を使用した流れ実験において、発明者等は、２２〜２３
℃にむける水の見かけ上の拡散係数を計算した。密なケ
９ル（Ｋ、１０　　　）にわいてさえ、計算り一値は、
２５℃の水について報告されている自己拡散係数（２，
８Ｘ　１０　１Ｍ”／５ｅｓ）より６オーダー大であっ
た。このことは、フィブリングルを通過する流れは主と
して粘性流であるという上記の結論を支持している。

ケ°ル透過性と凝固時間（Ｃｔ） フィブリノーケ゛ンの凝固時間（Ｃｔ）と酵素濃度の間
に相ｒ！Ｊｌ関連が存在する。発明者等は、Ｃｔと最終
ケ゛ルの透過性との間め関係を探究した。従って、透過
性試験のためのグルを調製すると同時に、並行実験にむ
いてグル形成系のＣｔを濁度法（方法の項参照）により
測定した。

Ｐ）Ｉニ一定のフィブリ／−ダン濃度及びイオン強度ニ
ムいて、スロンビンーデル及びパトロキンビンーダルの
いずれにおける流速も、広範囲のＣｔ（１７〜５００秒
）にわたってケ°ル形成系のＣｔと直線的に関連してい
た。このことは第２図に例示した３種類の異なったｐ）
ｆ（６，５，７，４、及び８．２）について該当した。

いずれの−にむいても、スロンビンの曲線とパトロキソ
ビンの曲線の間に勾配の相異が存在した。

それぞれの声について、６個の異なるＣＬ値対流速の曲
線（各４実験点）の相関係数（ｒ）を計算した。平均ｒ
値及びその標準偏差（ＳＤ）は、ＰＨ６，５にオ！／ａ
テ０．９７０９±０．０１８４　、ｐ？１７．４にｋい
て０．９７２１±０．０３９４　、ｐＨ８，２に’９（
ｔｓて０．９５９９±０．０４３４であった。スロンビ
ンの曲線とパトロキソビンの曲線のｒ−値の間に有意差
がなかった。

イオン強度 他のシリーズ実験にむいて、グル形成系の蛋白質濃度を
一定とし、イオン強度を０．２１〜０，３１の範囲で変
えた。いずれのＰＨ（６，５，７，４，８，２）におい
ても、イオン強度を０．２から０．３に上昇せしめるこ
とにより、流速が概ね１オーダー低下した。このことは
スロンビンーダル及びバトロキンビンーケ９ルのいずれ
にも該当した〇 いずれの酵素濃度及び−にむいても、イオン強度の上昇
と共にＣｔが長くなった。しかしながら各イオン強度に
おいて、スロンビンーダル、及びノＳトロキソビンーク
９ルのいずれについても、Ｃｔと流速との間に直線関係
がありｆｃｅｐＨ７，４にわける結果を第４図に示す。

いずれのイオン強度にむいても、スロンビンの曲線の勾
配とバトロキソビンの曲線の勾配との間に相異が認めら
れた。

２種類のイオン強度にむいて、ｐｔ（とは関係なく、６
個の異るＣｔ値対流速の曲線（各４実験点）のｒ−値を
計算した。平゛均ｒ−値及びＳＤは、イオン強度０．２
１において０．９８５１±０．０２０８、イオン強度０
．２６にむいてＱ、９５１１±Ｑ、０４７０であった。

グルの透過性及びフィブリノ−ダン濃度発明者等は、一
連の実験にわいて、グル形成系における広範囲の蛋白質
濃度に適用されるＣｔと流速との関係を明らかにした。

この実験は、−７，４、イオン強度０．２１においての
み行った。所定の蛋白質濃度におけるＣｔを流速に対し
てプロットした場合、すべてのフィブリノ−ｒ／７！！
に度（１，５〜５．（１／Ｖ）にむいて、Ｍ３図（ｐＨ
７，４）に示したのと同様な直線関係が示された。スロ
ンビン及びノクトロキソビ／のいずれについてのプロッ
トも、凝固時間が小さくなるに従って原点近傍の交点に
集まった。第２図に示した実験の場合と同様に、パトロ
キソビンの勾配は、いずれの蛋白質濃度においても、ス
ロンビンの勾配より大であった。８個の異なるＣｔ対流
速の曲線（各８点）のｒ−値を計算した。平均ｒ−値及
びＳＤは、スロンビンについては０．９８００±０．０
１５７、バトロキソビンについてはＱ、９８３０±０．
０１８７であった。

第４表に、１シリーズの実験における異なる蛋白質及び
酵素濃度にむけるＣｔを示す。バトロキソビンの場合に
は、蛋白質濃度の増加ばＣｔに顕著な影響を与えない。

しかしながらスロ／ビンの場合には、フィブリノ−ダン
の濃度が増加するに従ってＣｔがわずかに長くなる。

次に、ケ０ル形成系にむける蛋白質濃度と流速との関係
を検討した。第５図に１シリーズの実験結果を示す。種
々の蛋白質濃度にｉ？いて、流速と蛋白質濃度の逆数と
の間に直線関係が存在することが明らかである。スロ／
ビンーダル及びバトロキソビ／−ケ゛ルの曲線は、蛋白
質濃度が増加するに従って原点近傍のほぼ共通の交点に
集まる。１５個の異なる１／Ｃ対死速の曲！（各４〜８
実験点）のｒ−値を計算した。平均ｒ−値及びＳＤは、
スロンビンについては０．９７３８±０．０３０８、パ
トロキソビ／については０．９７１１±０．０３５６で
あった。

第２図から、一定の静水圧における流速ｑと、を 種々の−におけるスロンビンーフィプリノーク０ン混合
物の凝固時間（Ｃｔ）とがいかに直接的比例関係にある
かが明らかである。系の凝固時間は、他は同一の条件下
で別々の試験にむいて分光光度計により測定する。４５
０　ｎｍ　における光学濃度（ＯＤ）を測定する。ケ９
ル形成において、溶液の濁度はＷ、３図に示すこと〈急
激に増加する一０曲線の最も急勾配の部分の接線が、凝
固時間（Ｃｔ）として示された距離において時間軸と交
わる。Ｃｔと流速ｑとの間に直線的関係があるので、Ｋ
も又Ｈｓ 式（１）に従ってＣｔと直線的に関連する。

第４図から、種々のイオン強度において形成されたグル
の流速が、グルの調製にむいて使用した酵素−フイブリ
ノーｒ／溶液のＣｔに直線的に関連することが明らかで
ある。さらに、イオン強度の変化が流速に最も大きな影
響を与えることが示される。

第５図から明らかな通り、流速ρはケ゛ル中のフイブリ
ン濃度（フィプリノーケ゛ン濃度）に逆比例する。従っ
て、式（１）に従えばに３も又フィブリノ−ダン濃度に
逆比例するのであろう。

流れは温度に依存し、式（１）に従えば、流れは透過溶
液の濃度に逆比例する。より高い温度にむいてＣｔが短
縮されるから、グル形成温度も又、酵素濃度の安定と同
様に重要である。このことは第６図（、）から明らかで
ある。しかしながら、第６図（ｂ）から明らかなごとく
、異なる温度において形成されたダルの流速は、関連温
度におけるＣｔと直線的比例関係にある。

第１図に概略示した方法により調製したカラムは小さい
寸法（１，２ｃｍ２Ｘ　２．６ｃｒｎ）を有する。これ
により、より大きな寸法のカラム（５（１）”　Ｘ　１
２ｃｒｎ）についても同様な量的結果が観察される。特
にことわらない限り小型のカラムを使用して試験を行う
。

例２ この試験には、米国；ダウケミカル社製の直径０．０８
５±０．００５５　（ＳＤ）μｍ　−０，１９８±０．
００３６　（ＳＤ）μｍ　　（Ｓ　Ｄは標準偏差を意味
する）の球形ラテックス粒子を使用した。ｐＨ７，４で
２種類のイオン強度にむいて形成した複数のダルを使用
した。試験において、Ｃｔは２３〜３１４秒の間で変化
した。円筒形の垂直毛管が存在するものと仮定して、式
（３）に従って各ダルの理論半径を計算した。

第７図に２つのシリーズの試験を示す。シリーズ］にむ
いてはダル形成中のイオン強度を０．２３とし、そして
シリーズＨにおいては０．２１とした。

ダルカラムは水で平衡化した。このあとで粒子懸濁液を
ケ０ルに適用した。シリーズＩｔ／ｌいては粒子の大き
さは０．０８５μｍであり、シリーズＨにおいては０１
９８μｍであった。粒子は、０１重Ｖ容量多の濃度で水
中にスラリー化し７？ｌ：ｏｔ＆出液の４５０ｎｍにお
ける濁度を測定した。ラテックス粒子がＦ材を通過すれ
ば、濁度値により確認することができる。

第７図にむいて、濁度を流出液の最高濁度の係で表わし
た。第７図から明らかなように、ダルの一定の理論細孔
サイズより上で流出液の濁度が増加する。細孔のサイズ
がさらに大きくなればさらに多くの粒子がケ９ル（Ｐ材
）を通過し、そしである細孔のサイズを越えれば一定量
の粒子がダルを透過する。不透過と完全透過の間の理論
細孔サイズの差が細孔と粒子の偏差の合計である。５０
％透過における細孔のサイズが細孔及び粒子の平均のサ
イズ−を表わす。細孔のサイズの総偏差が平均粒子サイ
ズ±３ＳＤの範囲にあれげダルの細孔サイズが均一であ
るとすることができる。

第７図において、粒子サイズの偏差（平均サイズ±３Ｓ
Ｄ）が５０係透過の水平な線で示されている。総偏差の
大部分が粒子の偏差によって説明できることが明らかで
ある。このことからダル中の細孔は確かに均一であると
結論付けることができる。さらに、第７図から理論平均
細孔サイズは、実際の有効粒子サイズに比べて約１オー
ダー（１０倍）大きいことが明らかである。従って、式
（３）による細孔サイズの計算によっては細孔サイズの
相対値が得られるのみである。

第７表 凝固時間　フィフＭＪノ；ダン （Ｃｔ）　（秒）濃度（１／ｌ　） 細孔の直径 （μｍ） 実験■ 実験■ ３ ８ ２４ １４ ０３ ２４ ０ ３ ０７ ２ ３７ ２．４５４ ２．２９１ ４５４ ２６０ ０７６ ０．２３ ・０．１７ ０．２３ ０．２１ １８ １．７４ ９８ ３．１７ ４．９９ ９８ ４０ ２．５５ ２．６４ ９９ ４．００ 例３ ンの通過 種々の蛋白質溶液を、例１に示した方法によりフィブリ
ンダルに適用上た。ケ９ルの形成は室温（２１〜２５℃
）にむいて行った。はとんどの場合、ケ０ル形成に使用
する緩衝液は透過に使用したものと同じ組成とした。濾
過試験も室温（２２〜２５℃）にむいて行った。特にこ
とわらない限りケ０ルの容積は１．４７ｍ”　Ｘ２．４
８ｃｒｎ＝３．６４）ｔ／とした。試験は異なる日に異
なるフィブリノ−ｒン標品を用いて行った。従って、異
なる試験の間で細孔サイズを比較することはできない。

第５表に、異なる多孔性フィブリンデルを通過する観点
から試験した蛋白質を示す。この表から、非常に大きな
分子量を有する蛋白質を含む蛋白質が小さい細孔サイズ
を有するグルにより済去されることが明らかである。高
分子多糖類（ブルーデキストラン）も蛋白質と同じ濾過
性を示す。表は溶出液中の蛋白質の回収率が高いことを
示してむり、このことから、少なくとも室温においては
ｒル網目構造と蛋白質との相互作用は小さいことが明ら
かである。

このことは、フィブリノ−ｆ７、フィブロネクチン（ｆ
ｉｂｒｏｎｅｅｔｉｎ　）及びファクター■複合体のご
とき蛋白質にも該当する。

例４ フィブリングルによる赤血球の濾過 例１に記載した方法によりフィブリングルを形成した。

グル形式条件は例３に示した通りである。

少量（０，２１７＋７）のヒト血液をグルカラムに適用
した。室温（２２〜２５℃）にむいて、例３に示した条
件下で連続濾過を行った。血球はフィブリングルを通過
しなかった。赤血球の直径（７〜８μｍ）はフィブリン
グルの有効細孔直径よりはるかに大きいから、上記の結
果は予想通りである。

例５人 フィブリングルによる血小板富化血漿の濾過凝固を防止
するためにクエン酸塩溶液に入れた血液を１２０Ｇで４
分間遠心分離することにより血小板富化血漿（ＰＲＰ　
）を調製した。これを、残存している赤血球を除去する
ために２００００で５分間遠心分離し、１０　ｍＭ濃度
のＥＤＴＡをＰＲＰに加え、Ｑ、５　ｍｌのＰＲＰを、
例１の方法により調製したフィブリングルカラムに適用
した。ｒル形成の条件は例３に示した通りであり、デ過
は例３に示した条件下で続けた。血小板の凝集及びグル
網目構造への固着を防止するために、ＥＤＴＡ（１０ｍ
Ｍ）をＰＲＰのみならずｐ遇すべき溶液にも加えた。フ
ィブリングルからの流出液中に血小板は含筐れていなか
った。血小板の直径は２〜４μｍであって、これはグル
の有効細孔サイズより相当大きいから、上記の結果は予
測した通りであろう 例５Ｂ ラットの肝細胞をポッターーエルペイム（Ｐｏｔｔｅｒ
　−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ　）のホモ・ゾナイザーによりホ
モジナイズした。細胞片の分離は、常法に従って種々の
濃度で行ったっミトコンドリアを、Ｎａ−ＥＤＴＡ　（
１０ｍＭ　）及びシュークロース（０，２５Ｍ）を含有
する緩衝溶液中に懸濁した。こうして調製した懸濁液Ｑ
、　３　ｍｌをψ１１１の方法により調製したフィブリ
ングルカラムに適用した。グル形成条件は第５表に示し
た通りであり、濾過を第５表に示した条件下で行った。

流出液中にミドフンドリアは認められなかった。ミドフ
ンドリアの直径は約０５μｍであり、り°ルの有効細孔
サイズより相当に大きいから、上記の結果は予想した通
りである。

例６ ルスの分離 七ンダイビールスは、ヒドリン／４’細胞の培養による
インターフェロンの製造に使用される、マウスに特異的
なビールスである。特に精製したビールス標品（６４０
血液凝集単位）を試験に使用した。０．２　ｍｌのビー
ルス懸濁液を、例１の方法により調製した３つのフィブ
リングルカラムのそれぞれに適用した。グル形成の条件
は第５表に記載した通りとし、濾過は第５表に示した条
件下で行った。カラム（１）からの流出液には血液凝集
活性は認められず、カラム（ＩＩ）からの流出液には５
０憾の血液凝集活性が認められ、そしてカラム（ＩＩＩ
）からの流出液には９５幅のビールス粒子の血液凝集活
性が認められた（第５表参照）。

濾過後、３つのカラムの上部の綱網を緩衝液〔ウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ　）を１喪含有する〕で洗浄し、そ
して洗液の血液凝固活性を測定した。

カラム（１）からの洗液中には１００優の血液凝固活性
が認められ、カラム■の洗液中には２５係の活性が認め
られ、そしてカラム■の洗液には活性が認められなかっ
た。

七ンダイビールスの粒子直径は約０．１５μｍであると
される。試験により、有効細孔半径が０．１５μｍより
大である場合にはビールス粒子はグルを通過する。他方
、グルの有効細孔半径が０．１５μｍ未満である場合に
は粒子は残留するであろう。

例フ イー・コリーは寸法が約０，８Ｘ１〜２μｍの長稈腸内
細菌である。カルシウムを含有せずイオン強度が０．２
１であるｐＨ７，４のトリス−イミダゾール緩衝液中イ
ー・コリーの懸濁液を調製し１例１を参照）。この懸濁
液は１０’〜１０８個／ｍｌの細菌を含有していた。４
５’ｍｌの懸濁液を例１に記載した方法により調製した
寸法５ｃｍ”Ｘ１１ｍのフィブリングルカラムに供給し
た。グル形成及び濾過の条件は第５表に示した通りであ
る。流速は３１ｍ／／ｈでありた。カラムからの流出液
の濁度測定にむいてグルを通過する細菌は認められなか
った。一定圧にむける流速は、出発時に比べて終点で低
下した。Ｋ、が変化しないと仮定して、流速の低下に対
応する表面の減少を式（１）に従って計算した。この計
算によれば、表面は５８％に減少していた。すなわち、
グルの上表面に細菌が堆積したためと予想される。グル
の上表面に配置された綱網を緩衝液で洗浄することによ
り、グルに適用した細菌の９９係が洗浄中に見出された
。

この試験により、イー・フリーは、この細菌の最小の直
径よりも相当に小さい細孔直径を有するケ９ルを通過で
きないことが示された。

例８ 製 前の例にむいて、フ”イブリンケ°ルの安定化構造とし
て、ゲルの上部及び下部に適用された絹、プラスチック
又は金属の網を使用した。同様の安定性は、フィブリン
グルを、例えばポリウレタン、ポリエステル又はこれら
と同様の任意の多孔性グラスチック材料のごとき多孔性
ダラスチ、り、好ましくは水に湿潤性のものに溶かし込
むことによっても得られる。

この例においては、小孔サイズがＯ，ｊ＋ｗのポリウレ
タンの発泡プラスチック〔レギレン（Ｒｅｇｉｌｅｎ）
４０ＡＧ）を使用した。これは、中に多孔性プラスチッ
クが導入された円筒プラスチック容器からなる。プラス
チックをアクリルグラスチックの環（高さ２　ｃｍ　＋
直径９の）に収容する。装置（容器）は上部と下部にそ
れぞれ開口を有する。１方の開口部を真空ポンプに連結
し、他方を閉じる。容器を真空ポンプにより真空にする
。この後、容器と真空ポンプを連結しているバルブを閉
める。フィブリノーケ９ンースロンビン溶液を、反対側
の開口部のバルブを通して容器内に満たす。この後バル
ブを閉め、そして容器を２時間置き、多孔性グラステッ
ク材料中のフィブリノ−ダン溶液を完全にフィブリング
ルに転化せしめる。スロンビンーフィプリノーダン混合
物の凝固要因を第６表に示す。

比較のため、例１に記載した方法によるダルも調製した
。第６表にはこの後者のに３値をも示しである。グル形
成が完結した後、容器を開き、フィブリングル（ｆラス
チック骨格を有する）を伴うグラスチックケーキを取り
出した。これを特別の濾過容器に移した。中にグラスチ
ック材料とダルヲ収容したフレームリングを濾過容器の
縁に２個の０リングにより密接に固定する。容器の上蓋
には、濾過すべき液の入口と、グル表面上の空気を排除
するための通気バルブを装置する。容器の下部には濾過
した液体を集めるための出口が存在する。

第６表に示す組成の緩衝液をデルを通して濾過した。式
（１）に従ってに、値を計算した。表から明らかなこと
く、グラスチックに溶かし込まれたケ０ルのに、値は例
１に従って調製しｆｃダルの場合と同じオーダーであっ
た。ダルケーキ中のグラスチック材料の部分比容積は０
．０３であり、このことはグラスチック網目構造による
流水に使用される面積の減少はわずかであることを意味
する。

例９ セルロースも又補強材（支持材料）として使用すること
ができる。この例にｂいては、フィブリングルの補強材
として多孔性セルロース化合物〔ウニへクスクロス（Ｗ
ｅｈｅｘ　ｃｌｏｔｈ　）　）を使用する。この材料は
０．２〜０．３　ｃｍの厚さを有する。約３ｃｒ１１の
半径の円形片をスロンビンーフィプリノーダン溶液で湿
潤する。これによりセルロース片は２倍の厚さに膨潤す
る。膨潤したセルロースの部分比容積は０．０４である
。約２〜４秒間の膨潤の後、セルロース片をブフナー漏
斗の濾過円板上に置く。セルロース片が漏斗の縁に密着
して固定する大きさとする。漏斗の開口部を・ぞラフイ
ルムで覆い、そして漏斗を２時間室温においてセルロー
スの細孔中でのフィブリン形成を完全にする。表５に示
した組成を有する緩衝液をグルを通してＦ遇する。セル
ロースに溶は込んだグルのに、値は補強材を伴わない対
照グルの場合と同じオーダーであった。

例１０ テ適用薄層フィブリンケ°ルの調製 この例において、下面にむいてのみ補強された薄層中の
フィブリフケ９ルが濾過のために使用できることを示す
。ｐＨ７，４のトリスーイミグゾール緩衝液中フィブリ
ノ−ｒン溶液約１０＋ｔをスロンビン溶液と混合する。

この混合物を、底を湿潤絹布で覆ったペトリカッグに注
入する。上部を蓋で覆い、２時間置いてケ°ル形成を完
結する。デル層の厚さを２ｍとする。ケ゛ルの凝固要因
を第６表に示す。この後ｐ材を漏斗に装置されたミリポ
ア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　）フィルターに配置する。漏
斗を緩衝液で満たし、そして流速を測定する。第６表か
ら明らかな通り、Ｋ　　ｊ’Ｌｉｉ、は、例１に従って
調製した対応するフィブリ／ケ゛ルのそれと囮じオーダ
ーである。しかしながら、このＦ材のＫ　値は時間の経
過と共に減少した。こればむそらく、流通の間にクール
の網目構造が圧縮されたためであろう。

例１１ ノアルデヒド処理によるグルの安定化 この例にむいては、例１，８、及び１ｏに従りて調製し
たダルを・ノアルデヒドによる処理で安定化することが
できることを示す。

Ａ６例１に従って調製したダルをまず水で平衡化し、そ
して、０．１５　Ｍ　ＮａＣ１中ｐＨ７，２００，０１
４Ｍ燐酸緩衝液（燐酸緩衝化食塩溶液ＰＢＡ　）で平衡
化する。２〜４カラム容量の１％グルタルアルデヒド溶
液を１０分間〜２時間、ダルを通して濾過する。この後
、グルを複数カラム容量のＰＢＳで洗浄し、そして水で
洗浄する。最後にカラムをトリスーイミタゾール緩衝液
で平衡化し、そして流速を測定する。ゲルタルクアルデ
ヒドで処理した後、Ｋ、値の変化はほとんどなかった。

流速を測定した後ダルを取り出し、１係のドアシル硫酸
すｈ　’Ｊウム（ＳＤＳ　）を含有する８Ｍの尿素で７
２時間処理する。そして、それ自体公知の方法によりケ
゛ルを１％ノチオスレイトールで処理する。ＳＤＳの存
在下にわけるポリアクリ°ルアミドヶ゛ル電気泳動によ
り、未安定化グルに比べて遊離フィブリン鎖（フィブリ
ノ−ｒン鎖）が存在しないことが示され、このことはグ
ルタルジアルデヒドがフィブリン構造の鎖単位を架橋し
たためであると説明することができる。

Ｂ１例に従って多孔性グラスチック中に調製したグルを
、まずカルシウムを含有しないトリス−イミダゾール緩
衝液で洗浄し、そして０．１５ＭＮａＣｔ中ｐＨ７，２
のＯ，０１４Ｍ燐酸緩衝液で平衡化する。そして、グル
ケーキに、１０分間にわｆｅりで２カラム容量の１俤グ
ルタルゾアルデヒド溶液を通過せしめる。次にグルケー
キを複数カラム容量のＰＢＳで洗浄し、そして次に水で
洗浄する。最後に、カラムをトリス−イミダゾール緩衝
液で平衡化し、そして流速を測定する。この結果を第６
表に示す。表から明らかな通り、Ｋ　値は、グルタルジ
アルデヒドで処理した後わずかに変化するのみであり、
例１に従りて調製したグルと同じオーダーである。次に
グルタルジアルデヒドで安定化したグルを１４気圧にむ
いて１２０℃で、２０分間オートクレーブ処理した。オ
ートクレーブ処理した後、再度、グルケーキを通過する
緩衝液の流速を試験した。第６表から明らかな通り、オ
ートクレーブ処理の流れ特性に与える影響はわずかであ
った。もしグル中にひび割れが生じていれば、デルを通
過する流速は急激に増加したはずである。

Ｃ１例１０に従って調製したフィブリ／グルをｓｏｏｍ
ｚの水を収容した容器に移し、拡散により緩衝液塩を除
去した。２時間後、グルを新しい水を収容した容器に移
した。２時間後、グルを、０、１５　Ｍ　ＮａＣＡ中ｐ
Ｈ７，２の燐酸緩衝液５００　ｍｌを収容した容器に移
し、そして１夜置いた。そして、グルを１幅のグルタル
ジアルデヒド５ｏＦｎｌを収容したｄ　）リフツブに移
した。２時間後、グルタルジアルデヒド溶液を新しい同
溶液と取り替えた。

さらに２時間後、グルを水を収容した容器に移し、そし
て前記の方法により洗浄した。水洗浄の後、グルをトリ
ス−イミダゾール緩衝液を収容した容器に移した。２時
間後、洗浄液を新しいものと交換し、そしてさらに１２
’時間後、グルを漏斗を伴うミリポアーフィルター担体
に移した。比較のため、グルタルジアルデヒドで処理し
なかった点を除き同様にして調製したグルについても流
速を測定した。取り出した直後、このグルを流速測定の
ためミリポアーフィルター容器に移した。第６表から明
らかな通り、流速測定の出発時にむいては、硬化処理し
た炉材を通る液の流速は硬化処理してない炉材を通る液
の流速に匹敵する。しかじなから測定期間の終点にむい
ては、安定化してない炉材のＫ　値は、硬化処理した炉
材の場合には生じない程大幅に低下した。流速測定の後
、炉材（炉材及びｐ材装置）を１４気圧にむいて、１２
０℃で２０分間オートクレーブにより殺菌した。熱処理
後流速測定を行った。Ｋ、値を第６表に示す。

安定化してない炉材にむいては流通しなかった。

他方、硬化した炉材はオートクレーブ処理の前後におい
て同じオーダーのに値を示した。

５ｍｌの七ノグイビールス懸燭液を硬化せしめたＥ材に
適用した。水の吸引により濾過を行った。

液体が炉材を通過した後、追加の緩衝液５ｍ／を炉材を
通過せしめた。これを２回繰返した。ｐ液を血液凝固活
性について試験した。考慮すべき血液凝固活性は認めら
れなかった。炉材の上部表面を緩衝液で複数回洗浄した
。洗液は乳白色であり、その血液凝固活性はビールス粒
子をほとんど１００係回収したことに相当した。

これらの例は、炉材が、グルタルジアルデヒドのととき
ジアルデヒドで安定化されたことを示している。

以下余白

【図面の簡単な説明】

第１図（、）はＦ材の成形について示し、第１図（ｂ）
は濾過のために配置した炉材を示し、第２図（、）及び
（ｂ）はそれぞれ、種々のＰＨにむいてスロンビン（、
）及びバトロキソビン（ｂ）を使用した場合における凝
固時間の関数としての流速のグラフを示し、第３図はス
ロンビンを添加した後の時間の関数としてのフィブリノ
ーケ゛ン溶液の濁度を示し、第４図（ａ）及び（ｂ）は
、それぞれスロンビン（ａ）及びバトロキソビン（ｂ）
の種々のイオン強度における凝固時間の関数としての流
速を示し、第５図（ａ）及び（ｂ）は、それぞれスロン
ビン（ｂ）及びパトロキソビン（ｂ）について、ケ０ル
形成系における蛋白質濃度と流速との関係を示すグラフ
であり、第６図（ａ）及び（ｂ）は、異る温度における
凝固時間の関数としての温度（ａ）及び流速（ｂ）を示
し、第７図ｉ−ｉ、細孔直径（μｍ）の関数としての流
出液の濁度（幅）を示し、そして、第８図（ａ）　、　
（ｂ）及び（ｃ）は、フィブリノ−ｒンの活性化と凝固
時間をグロットしたグラフ（グル化中における濁度及び
フィブリノペグチドの遊離）を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくとも１種類の触媒的に活性な酵素又は触媒的
   に活性な金属を含んで成るフィブリンゲル。 ２、少なくとも１種類の触媒的に活性な酵素又は触媒的
   に活性な金属を含んで成るフィブリンゲルであって、さ
   らに流動する媒体に接触した場合に該ゲルの少なくとも
   １つの表面の形状を維持する手段を含み、そして該ゲル
   が実質的に均一な細孔サイズを有する特許請求の範囲第
   １項に記載のフィブリンゲル。 ３、前記ゲルの少なくとも１つの表面の形状を維持する
   手段が該ゲルの少なくとも上面に配置されている特許請
   求の範囲第２項に記載のフィブリンゲル。 ４、前記ゲルの少なくとも上面の形状を維持する手段が
   有孔シート部材又は発泡体を含んで成る特許請求の範囲
   第３項に記載のフィブリンゲル。 ５、前記フィブリンゲルがそれ自体、多孔性プラスチッ
   ク材料中に配置されている特許請求の範囲第１項に記載
   のフィブリンゲル。 ６、前記フィブリンゲルがセルロースマトリクス中に配
   置されている特許請求の範囲第１項に記載のフィブリン
   ゲル。 ７、前記多孔性プラスチック材料が水に湿潤され得る多
   孔性プラスチックである特許請求の範囲第５項に記載の
   フィブリンゲル。 ８、前記多孔性プラスチック材料がポリウレタンである
   特許請求の範囲第７項に記載のフィブリンゲル。 ９、前記多孔性プラスチック材料がポリエステルである
   特許請求の範囲第７項に記載のフィブリンゲル。 １０、前記フィブリンゲルが０．００３〜１μｍの理論
   直径の実質的に均一な細孔を有する特許請求の範囲第１
   項に記載のフィブリンゲル。 １１、前記ゲルが０．００９〜０．３μｍの理論直径の
   細孔を有する特許請求の範囲第１０項に記載のフィブリ
   ンゲル。 １２、前記酵素が、酸化−還元酵素、トランスフェラー
   ゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガー
   ゼから成る群から選ばれ、ゲル中の蛋白質鎖を分解する
   能力を有しない酵素である、特許請求の範囲第１項に記
   載のフィブリンゲル。 １３、反応性細胞成分中に配置されているフィブリンゲ
   ル。 １４、前記フィブリンゲルが白血球を含有する特許請求
   の範囲第１３項に記載のフィブリンゲル。