SE444687B - Polypeptider med formaga att inducera differentiering av bade th-1?72+-t-lymfocyter och bu-1?72+ b-lymfocyter - Google Patents

Description

- c 10 15 20 25 30 35 7812614-1 2 stamceller med ett ursprung i hemopdetiska vävnader, Goldstein et al., The Human Thymus, Heínemann, London, 1969. Lymfocyter differentieras i tymus och avges därifrån som mogna tymusavledda celler, kallade T-celler, som cirkulerar till blodet, lymfan, mjälten och lymfkörtlarna. Induceringen av stamcelldifferentie- ring i tymus synes förmedlas genom sekretioner av epitelialcel- lerna i tymus. V Det har varit känt någon tid att tymus haft samband med immunitetsegenskaperna i kroppen och stort intresse har därför É visats de substanser som-isolerats från tymus. I detta samman- ¿ hang har under de senaste åren ett relativt stort antal artiklar publicerats baserade på vetenskapligt arbete som avser material som finns närvarande i tymus från nötkreatur. Ett antal artiklar som avser forskningen inom detta område kan exempelvis påträffas enligt följande: The Lancet, juli 20, 1968, sid 119-122; Triangle,. volym II, nr 1, sid 7-lä, 1972; Annals of the~New York Academy of Sciences, volym 183, sid 230-2HO, 1971; och Clinical and Experimental Immunology, volym 4, nr 2, sid 181-189, 1969; Nature, volym 247, sid 11-lä, 1974; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, volym 71, sid 1U7H-1A78, l97Å; Cell, volym 5, sid 361-365 och 367-370, 1975; Lancet, volym 2, sid 256-259, 1975; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, volym 72, sid 11-15, 1975; Biochemistry, volym lfl, sid 22lH-2218, 1974; Nature, volym 255, sid N23-NZH, 1975.

En andra klass av lymfocyter med immunfunktion är B-1ymfo- cyter eller B-celler. Dessa differentieras i bursa Fabricii hos fåglar och i ett ännu ej identifierat organ hos däggdjur. T-ce1- ler och B-celler samverkar i många immunitetshänseenden. Detta framgår t ex av artiklar i Science, 193, 319 (23 juli 1976) och Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, volym XLI, 5 (1977).

Ett nonapeptidmaterial har nyligen isolerats från grisse- rum av J. F. Bach et al. och identifierats som "facteur thymique serique" (FTS). Isoleringen av detta material och dess struktur. beskrives i C. R. Acad. Sc. Paris, s 283 (29 november 1976), serie D-1605 och Nature 266, 55 (3 mars 1977). Strukturen av denna nonapeptid har identifierats som GLX-ALA-LYS-SER-GLN-GLY- GLY-SER-ASN, vari "GLX" betecknar antingen glutamin eller pyro- Det material vari GLX är glutamin eller pyroglu- I dessa artiklar visar Bach att åzwzffiln. _. . glutaminsyra. taminsyra har syntetiserats. _ ...vi waí-...sfiq-fvff-fl-.fw-”M 10 f Yö1Zb14“1 * 3 nonapeptiden FTS selektivt differentierar T-celler (och ej B-cel- ler) genom användning av en E-rosettanalys. Bach drog därför slutsatsen att materialet var ett tymiskt hormon. en mer noggrann undersökning av aktiviteten av denna nonapeptid visat att FTS differentierade både T-celler och B-celler och där- för hade en aktivitet som mer liknade ubikitin än tymopoeitin, Brand, Gilmor och Goldstein, Natur, 259, 597 (1977).

Det har nu visat sig att ett syntetiserat U-aminosyrapoly- peptidsegment av denna FTS-nonapeptid har många av de egenskaper av nonapeptiden som beskrives i ovanstående publikationer.

Ett syfte med föreliggande uppfinning är följaktligen att åstadkomma nya polypeptidsegment och polypeptider som är biolo- giskt betydelsefulla.

Ytterligare ett syfte med.uppfinningen är att åstadkomma nya polypeptidsegment och polypeptider som har förmåga att indu- cera differentiering av både T-lymfocyter och B-lymfocyter och därför är mycket användbara i immunsystemet hos människor och djur.

Ytterligare ett syfte med uppfinningen är att åstadkomma metoder för syntetisering av nya polypeptidsegment och polypepti- der enligt uppfinningen- _ Andra syften och fördelar med uppfinningen framgår av föl- jande beskrivning.

Enligt uppfinningen erhålles ett nytt biologiskt aktivt polypeptidsegment med följande aminosyrasekvens: -ALA-LYS-SER-GLN-.

Den biologiska aktiviteten av detta polypeptidsegment bibehålles i allmänhet vid substitution av antingen en eller båda av: 1) L-alanyl i ställning 1; och 2) L-seryl i ställning 5 med en naturlig eller icke-naturlig aminosyrarest. substituerade polypeptidsegment är påfallande kraftiga.

Nyligen har Vissa av dessa Termi- tnal substitution av föreliggande polypeptidsegment ger föreliggan- de polypeptider.

Här visas också ett förfarande för framställning av poly- peptidsegmenten och polypeptiderna enligt uppfinningen genom pep- tidsyntes i fast fas, liksom terapeutiska kompositioner som inne- håller polypeptiderna och sätt att administrera dessa till människor och djur för att åstadkomma en biologisk verkan.

Såsom angivits ovan avser föreliggande uppfinning nya po- lypeptidsegment och polypeptider med terapeutiskt värde inom oli- 10 15 20 25 30 55 /v1zo14=1 M ka områden, och sätt att använda dessa under utnyttjande av polu- peptiderna enligt uppfinningen, och sätt att tillverka dessa.

Enligt en väsentlig utföringsform av uppfinningen erhålles ett biologiskt aktivt polypeptidsegment som har följande aminosy- rasekvens: I. -ALA-LYS-SER-GLN-.

Eftersom den biologiska aktiviteten av detta polypeptidsegment i allmänhet bevaras då en naturlig eller icke-naturlig aminosyra- rest får ersätta antingen den ena eller båda av: l) alanyl i ställning 1; och 2) seryl i ställning 3, omfattar denna utfö- ringsform av uppfinningen vidare biologiskt aktiva polypeptidseg- ment med följande aminosyrasekvens: IA. -X-LYS-Y-GLN- vari X och Y vardera kan väljas bland den grupp som består av na- turliga och icke-naturliga a-aminokarboxylsyra (i det följande “aminosyra“)-rester. Även om det är troligt att den stora majori- teten av sådana substitutioner i grupperna X och Y tillåter en bevarad biologisk aktivitet, är det möjligt att vissa naturliga eller icke-naturliga aminosyrarester kommer att påverka vikningen av molekylen (vilket kommer att diskuteras mer utförligt nedan) och härigenom väsentligen eliminera den biologiska aktiviteten.

Sådana aktivitetsförstörande substituenter omfattas ej av förelig- gande uppfinning. Mera i detalj betecknar X sarkosyl, L-alanyl eller D-alanyl, Y betecknar seryl, sarkosyl- 2-metyl-alanyl eller D-alanyl.

Om en speciell substitution möjliggör att den biologis- ka aktiviteten av polypeptiden bevaras kan lätt fastställas+gen0m test av dess differentiering av Th-l+ T~lymf0GyC@P °°h BU'l B-lymfocyter i den kycklinginduktionsanalys som beskrivas nedan.

Föreningar som är speciellt aktiva i koncentrationer av ng/ml (cirka l ng/ml eller mindre) vid denna analys anses vara biolo- giskt aktiva. ' En lista på naturliga aminosyror finns i många handböcker, t ex R. T. Morrison och R. N. Boyd» "0P8aniC Ch?miStry"* Allyn and Bacøn, 1959, kapitel 33. Förutom de naturliga aminosyrorna (vilka är de som påträffas i proteiner), finns det Också ett antal 7812614-1 5 så kallade "icke-naturliga" aminosyror som ej har påträffats i proteiner även om de ibland förekommer i naturen som metaboliska mellanprodukter eller liknande. Dessa icke-naturliga aminosyror kan vara D-isomerer som motsvarar de optiskt aktiva (L-formen) naturliga aminosyrorna eller också kan de vara helt olika kemiska föreningar såsom sarkosin (N-metylglycin) eller 2-metylalanin som angivits ovan. Listor på sådana icke-naturliga aminosyror finns också i många referensarbeten. V Det polypeptidsegment som anges i ovanstående utförings- form med formeln IA måste dessutom innehålla terminala substituen- ter på 4-aminosyrasekvensen för att föreliggande polypeptider ~ skall erhållas. Dessa terminala substituenter får ej väsentligt påverka den biologiska aktiviteten av det aktiva 4-aminosyraseg- mentet, mätt som förmågan att inducera differentiering av Th-l+ T-lymfocyter och Bu-l+ B-lymfocyter i nedan beskrivna kyckling- induktionsanalys. Föreliggande polypeptider kan beskrivas med den allmänna formeln: II. R-X-LYS-Y-GLN-R' A vari X och Y har ovan angiven betydelse och R och R' betecknar substituenter på den terminala aminogruppen respektive på den terminala karboxylgruppen av peptidsegmentet, som, såsom angivits ovan, ej väsentligt påverkar den biologiska aktiviteten av det aktiva aminosyrasegmentet. Eftersom det aktiva tetrapeptidseg- mentet finns i en längre sekvens i det naturligt förekommande material som isolerats av Bach år det klart att de terminala amino- och karboxylsyragrupperna ej är väsentliga för den biolo- giska aktiviteten av tetrapeptidsegmentet, vilket år fallet för à vissa polypeptider. Föreliggande uppfinning omfattar därför ej» : endast de tetrapeptidsegment som är substituerade med H respek- tive OH, utan också de som är terminalt substituerade med en eller flera andra funktionella grupper som ej väsentligen påver- Å kar den här beskrivna biologiska aktiviteten. Det skall dock i märkas att den nonapeptid som beskrivits av Bach et al. speci- fikt är utesluten från omfattningen av föreliggande uppfinning.

Härav framgår att dessa funktionella grupper omfattar en å É sådan normal substitution som acylering på den fria aminogruppen ” ' och amidering av en fri karboxylsyragrupp, liksom substitution av andra aminosyror och polypeptider. I dessa hänseenden synes polypeptidsegmenten enligt uppfinningen vara mycket ovanliga då de uppvisar samma biologiska aktivitet som den naturliga nonapep- . ~- »r- KH 10 20 25 50 7812614-1 tid varav det aktiva tetrapeptidsegmentet utgör en del. Man tror därför att aktivitetskraven på molekylen åstadkommes genom dess Härvid stereokemi, dvs den speciella "vikníngen" av molekylen. bör märkas att polypeptidbindningarna ej är stela utan flexibla, och polypeptider kan förekomma i plan form, som spiraler och lik- nande. Detta medför att hela molekylen är flexibel och kan "vi- kas" på ett antal sätt. Vid föreliggande uppfinning har det visat sig att de nya.tetrapeptidsegmenten troligen "vikes" på ett lik- nande sätt som motsvarande tetrapeptidsegment i den naturliga no- napeptiden genom att samma biologiska egenskaper uppvisas. Av detta skäl kan tetrapeptidsegmenten vara terminalt substituerade med olika funktionella grupper under förutsättning att substituen- terna ej väsentligen påverkar den biologiska aktiviteten eller inverkar på molekylens naturliga "vikning". A Molekylens förmåga att bevara sin biologiska och naturliga vikning framgår klart av det faktum att tetrapeptidsegmenten en- ligt uppfinningen uppvisar samma biologiska egenskaper som den na- turliga 9-aminosyra-peptid som beskrivits som FTS av J. F. Bach i ovan angivna artiklar. I denna nonapeptid kan en tetrapeptid- Ã sekvens enligt uppfinningen identifieras i molekylen men endast i kombination med de andra aminosyror som beskrivits där. Efter- som tetrapeptidsegmenten enligt uppfinningen ger samma biologiska aktivitet som nonapeptiden FTS är det klart att aminosyrorna och peptidkedjorna som är substituerade på de terminala aminosyrares- terna av tetrapeptidsegmentet ej påverkar dess biologiska egen- skaper.

R och R' i formel II betecknar alltså en substituent som ej väsentligen påverkar den biologiska aktiviteten av det aktiva segmentet. R och R' betecknar någon av följande substituenter: li .Ål i väte os i NH 2 M* Såsom påpekats ovan kan R emellertid också vara neutrala aminosyragrupper. Som exempel kan nämnas: 7812614-1 B H~GLN H-SAR En föredragen utföringsform av uppfinningen är den vari X betecknar L-alanyl, Y betecknar L-seryl, R betecknar väte och R' betecknar OH. Denna föredragna utföringsform kan kemiskt be~ tecknas på följande sätt: V H2N-çH-CONH-CH-CONH-çH-CONH-CH-COOH I I cH¿ (cH2)u cnz NH2 OH CONH2 H- ALA» Lys- saa- GLN-on Å En andra föredragen utföríngsform är den vari X och Y vardera be- \.Fi tecknar en grupp som utgöres av sarkosyl eller D-alanyl eller Y betecknar 2-metyl-alanyl, företrädesvis betecknar X sarkosyl, Y sarkosyl eller D-alanyl, R väte och R' NH2.

Uppfinningen omfattar även farmaceutiskt godtagbara salter av polypeptiderna. Som syror som kan bilda salter med polypep- tiderna kan nämnas oorganiska syror såsom saltsyra, bromvätesyra, perklorsyra, salpetersyra, tiocyansyra, svavelsyra, fosforsyra etc. och organiska syror såsom myrsyra, ättíksyra, propionsyra, glykolsyra, mjölksyra, pyrodruvsyra, oxalsyra, malonsyra, bärn- stenssyra, maleinsyra, fumarsyra, antranilsyra, kanelsyra, nafta- lensulfonsyra eller sulfanilsyra.

I hela denna ansökning identifieras aminosyrakomponenterna i peptiden med förkortningar. Dessa förkortningar anges i det följande. D-aminosyror anges genom att "D" placeras före förkort- ningen, t ex betecknas D-alanin med "D-ALA".

Aminosvra Förkortad beteckning L-alanin ALA Lfserín SER L-glutamin GLN L-lysin LYS L-valin Val Sarkosin SAR 2-metylalanin 2-Me-ALA 10 15 20 Sk 35 7812614-1 Polypeptiderna enligt uppfinningen är U-aminosyra-peptider (och substituerade derivat därav) som har visat sig uppvisa lik- nande egenskaper som den 9-aminosyrapolypeptid FTS som isolerats ur grisblod såsom beskrivits i ovan refererade artiklar av Bach et al. Peptiderna enligt uppfinningen kännetecknas speciellt av sin förmåga att inducera differentiering av T-moderceller liksom B-moderceller. Vissa av föreliggande polypeptider är aktiva iden så låg koncentration som ett pikogram (pg)/ml vid den kyoklingin- duktionsanalys som beskrives nedan. I Det har visat sig att polypeptiderna enligt uppfinningen inducerar differentiering av immunocyt-moderceller in vitro på samma sätt som de nonapeptider som beskrivits av Bach. Polypep- tiderna enligt föreliggande uppfinning har således visat sig indu- cera differentiering av både T-moderceller, mätt genom bildande » av tymiskt differentieringsantigen Th-l, samt B-moderceller, mätt genom bildande av differentieringsantigen Bu-l. Uttryckt på ett annat sätt har föreliggande polypeptider förmåga att inducera differentiering av både Th-l+ T-lymfocyter och Bu-1* B-lymfocyter.

Det har också visat sig att föreliggande polypeptider ökar förmågan av produktion in vivo av cytotoxiska lymfocyter vid sti- Administration av föreliggande produktion av cyto- vitro-analys av cel- cytotoxiska lymfocy- mulering med allogena antígener. pølypeptider till t ex råttor ger således en toxiska lymfocytprekursorer mätt genom en in ler från råttmjälte. Eftersom alstringen av ter direkt svarar mot graden av ymprejektion vid en allogenyymp vs värdreaktion, utgör ovanstående resultat ett ytterligare stöd för den immunologiska användbarheten av föreliggande polypeptider.

För att förklara betydelsen av de differentierande biolo- giska egenskaperna av polypeptiderna enligt uppfinningen bör mär- kas att funktionen av tymus i förhållande till immuniteten all- mänt kan anges som produktion av tymusavledda celler eller lymfo- cyter, som benämnes T-celler. T-celler utgör en stor del av samt- liga cirkulerande små lymfocyter. T-cellerna har immunologisk specificitet och är direkt inblandade i cellförmedlade immunsvar (såsom homoymp-svar), som effektorceller. T-celler avsöndrar emellertid ej humorala antikroppar. Dessa antikroppar utsöndras 10 15 20 25 BO 55 7812614-'1 av celler (benämnda B-celler) härledda direkt från benmärgen obe- roende av inflytande från tymus._ För många antigen kräver emel- lertid B-celler närvaro av lämpligt reaktiva T-celler innan de kan producera antikroppar. Mekanismen hos denna cellsamverkan är ännu ej helt klarlagd.

Härav framgår att tymus är nödvändig för utvecklande av cellulär immunitet och många humorala antíkroppssvar och påverkar dessa system genom inducering, inuti tymus, av differentiering av hemopokniska stamceller till T-celler. Detta induktiva infly- tande förmedlas genom sekretioner från epitelialcellerna i tymus, dvs tymiska hormoner. 'A För att förstå funktionen av tymus och cellsystemet av lymfocyter och cirkulationen av lymfocyter i kroppen bör det vi- dare påpekas att stamceller uppstår i benmärgen och när tymus via blodströmmen. Inuti tymus blir stamcellerna differentierade till immunologiskt kompetenta T-celler, som migrerar till blodströmmen och, tillsammans med B-celler, cirkulerar mellan vävnader, lymf- kärl och blodströmmen.

De celler i kroppen som utsöndrar antikroppar (B-celler) utvecklas också från hemopdkmiska stamceller, men deras differen- I fåglar sker differentieringen Hos dägg- tiering bestämmes ej av tymus. i ett organ analogt med tymus, kallat bursa Fabriciáu. djur har något ekvivalent organ ej påträffats och man tror att dessa cellerudifferentierar inuti benmärgen. De benämnes följ- aktligen benmärgshärledda celler eller B-celler. De fysiologiska substanser som dikterar denna differentiering är fullständigt okända.

Såsom påpekats ovan är polypeptiderna enligt föreliggande uppfinning terapeutiskt användbara för behandling av människor och djur. Eftersom de nya polypeptiderna har förmågan att indu- cera differentiering av lymfopohfiáska stamceller som härstammar från hemopmetisk vävnad till både tymushärledda lymfocyter (T-celler) och immunokompetenta B-celler som kan ingripa i krop- pens immunsvar, anses produkterna enligt föreliggande uppfinning ha en multipel terapeutisk användning.

Eftersom föreningarna har 7à12e14-1 10 förmågan att utföra vissa av de angivna funktionerna hos tymus, kan de i första hand användas inom olika tymiska funktions- och immunitetsområden.. Ett primärt användningsområde är behandling av DiGeorge-syndromet, ett tillstånd där det föreligger en med- född avsaknad av tymus. Injektion av en av föreliggande polypep- tider, såsom anges närmare i det följande, övervinner denna brist.

Ett annat tillämpningsområde är agammaglobulinemi, som beror på en defekt i det troliga B-cell-differentierande hormonet i kroppen.

Injektion av en av föreliggande polypeptider övervinner denna brist. Eftersom föreliggande polypeptider är extremt aktiva i låga koncentrationer är de användbara för att öka denkkollektiva immuniteten hos kroppen genomaatt de ökar terapeutisk stimulering av cellulär immunitet och humoral immunitet och därigenom är de användbara för behandling av sjukdomar som omfattar kroniska in- fektioner in vivo, såsom fungala eller mykoplasmainfektioner, tuberkulos, spetälska, akuta och kroniska virusinfektioner och liknande. Föreliggande peptider anses vidare vara användbara i varje område där cellulär eller humoral immunitet är en utväg och speciellt då det finns brister i immuniteten såsom vid det DiGeorge-syndrom som angivits ovan. På grund av polypeptidernas egenskaper är de vidare användbara in vitro för att inducera ut- vecklingen av ytantigener av T-celler, för att inducera utveck- lingen av den funktionella kapaciteten att uppnå mottaglighet för mitogener och antigener, och cellsamverkan vad gäller att öka förmågan hos B-celler att producera antikroppar. De är användba- ra in vitro för induktion av utvecklingen av B-celler mätt genom utvecklingen av ytreceptorer för komplement. Föreliggande pepti- der är också användbara för att inhibera en okontrollerad DP01ÜïflÉtí0n av lymfocyter som kan påverkas av ubikitin (US-PS N 002 602).

En viktig egenskap hos föreliggande polypeptider är deras förmåga in vivo att återupprätta celler med egenskaperna hos T-celler och också deras förmåga in vivo att återupprätta celler med egenskar perna hos B-celler. De är därför användbara för behandling av relativa eller absoluta B-cellbrister liksom relativa eller abso- luta T-cellbrister, vare sig dessa brister beror på brister i den vävnad som differentierar B-celler respektive tymus eller har någon annan onsædnIw~.

Ytterligare en viktig egenskap av polypeptider enligt uppfinningen är att de är höggradigt aktiva i mycket låga kon- v centrationer. Det har således visat sig att polypeptiderna 1 all- 10 15 20 25 30 35 H0 7812614-1 ll mänhet är aktiva i koncentrationer av cirka l ng/ml, under det att vissa överraskande kraftiga polypeptider (H-SAR-LYS-D-ALA-GLN- NH2 och H-SAR-LYS-SAR-GLN-NH2) är aktiva i koncentrationer varie- rande från cirka 0,1 pg/ml. Bäraren kan vara någon väl känd bära- re för detta ändamål inklusive normala salinlösningar, lämpligen med ett proteinspädningsmedel såsom serumalbumin från nötkreatur för att förhindra adsorptionsförluster till glaset vid dessa låga koncentrationer. Polypeptiderna enligt uppfinningen år i allmän- het aktiva i ett område över cirka l pg/kg kroppsvikt, under det att vissa mycket kraftiga polypeptider är aktiva från cirka l ng/kg kroppsvikt. För behandling av DiGeorge-syndrom kan poly- peptiderna administreras i en mängd av cirka l till cirka 100 pg/kg kroppsvikt, under det att de mycket kraftiga polypepti- derna kan administreras i en mängd av cirka l till 100 ng/kg I allmänhet kan samma dosmängdsområde användas för Ovanståen- kroppsvikt. behandling av andra angivna tillstånd eller sjukdomar. de gäller vid parenteral administration, men det bör också märkas att oral administration år möjlig i dosområden som i allmänhet är cirka 100 till 1000 gånger större än för injektion.

Polypeptiderna enligt uppfinningen framställdes på liknan- de sätt som beskrivits av Merrifield i Journal of American Chemical Society, 85, pp 2lH9-2l5U, 1965. Syntesen omfattade en stegvis addition av skyddade aminosyror till en växande peptid- kedja som genom kovalenta bindningar var bunden till en fast harts- partikel. Genom detta förfarande kunde reagens och biprodukter avlägsnas genom filtrering och omkristallisation av mellanproduk- ter kunde elimineras. Grundidên i denna metod år en vidhäftning av den C-terminala aminosyran i kedjan till en fast polymer genom en kovalent bindning och addition av efterföljande aminosyror en i taget stegvis tills den önskade sekvensen är ihopsatt. Pepti- den avlägsnas slutligen från den fasta bäraren och skyddsgrupper- na avlägsnas. Denna metod ger en växande peptidkedja fästad till en fullständigt olöslig fast partikel så att den föreligger i en bekväm form för filtrering och rentvättning från reagens och bi- produkter. V I Aminosyrorna kan fästas till varje lämplig polymer som en- ; bart måste kunna separeras från reagens som ej reagerat på ett lätt sätt. Polymeren kan vara olöslig i använda lösningsmedel eller vara löslig i vissa lösningsmedel och olöslig i andra.

Polymeren bör ha en stabil fysikalisk form som möjliggör en lätt "um-iF 10 15 20 25 30 35 '"' I 7812614-1 l2 filtrering. Den måste innehålla en funktionell grupp vartill den första skyddade aminosyran fast kan bindas genom en kovalent bind- ning. Olika olösliga polymerer som är lämpliga för detta ändamål är sådana som cellulosa, polyvinylalkohol, polymetakrylat och sul- V fonerad polystyren men vid syntesen enligt uppfinningen användes allmänt en klormetylerad sampolymer av styren och divinylbensen.

Polymerer som är lösliga i organiska lösningsmedel och olösliga i vattenhaltiga lösningsmedel kan också användas. En sådan poly- mer är en polyeten/glykol med en molekylvikt av cirka 20 000, som är löslig i metylenklorid men olöslig i vatten. Användningen av denna polymer vid peptidsyntes beskrives i F. Bayer och M. Mutter, Nature»257, 512 (1972) och däri angivna referenser.

De olika funktionella grupperna i aminosyran som var akti- va, men som ej skulle delta i reaktionerna, skyddades med konven- tionella skyddsgrupper som användes inom polypeptidtekniken under hela reaktionen. Den funktionella gruppen på lysin skyddades så- ledes med skyddsgrupper som kunde avlägsnas då sekvensen var fullständig utan att ogynnsamt påverka den färdiga polypeptidpro- dukten. Vid syntesen användes fluorescamin för att bestämma om kopplingen var fullständig genom en indikering av positiv fluo- rescens (se Felix et al., Analyt. Biochem., 52, 577, 1973). Om en fullständig koppling ej indikerades upprepades kopplingen med samma skyddade aminosyra innan skyddet avlägsnades.

Den C-terminala aminosyran kan vara fästad till polymeren på ett antal olika väl kända sätt. Sammanfattningar av metoder för vidhäftning tilf halometylharts anges i Horiki et al., Chem Letters, pp 165-168 (1978) och Gisin, Helv. Chim. Acta, 56, 1476 (1973) Samt däri angivna referenser.

Förfarandet omfattade allmänt en första förestring av L-glutamin, med skyddade aminogrupper, till hartset i absolut al- kohol som innehöll en amin. Det kopplade aminosyrahartset filtre- radesdärefter, tvättades med alkohol och vatten och torkades.

Skyddsgruppen på a-aminogruppen i glutaminaminosyran (t ex V t-BOC, dvs t-butyloxikarbonyl) avlägsnades därefter. Det erhåll- na kopplade aminosyrahartset, med en fri aminogrupp, bringades ä därefter att reagera med en skyddad L-serin, lämpligen a-t-BOC- Ä O-bensyl-L-serin för att koppla L-serin. Reaktionerna upprepades därefter med skyddad L-lysin och L-alanin tills en fullständig molekyl framställts.« Reaktionsföljden utfördes enligt följande; ,._._.

U. 7812614-1 13v harts L a-Rl-Gln~OH Q-Rlécin-narcs I q-aminoskyddsgrupp { avlägsnas V H-Gln-harts R 2 § I I -R -L-Ser-OH el” q-Rl-Ser-Gln-harts c-aminoskyddsgrupp R avlägsnas 12V H-Ser-Gln~harts ' R ; IB ¿ Q-Rl-Lys-OH R. R” » 15 x2 -Rl~Lys-Ser-Gln-harts u-aminoskyddsgrupp avlägsnas R. 15 É2 0 H-Lys-Ser-Gln-harts I V L Q-al-Ala-ou É3 V32 a-Rl-Ala-Lys-sår-cin-hafva g alla skyddsgrupper och hartset iavlägsnas v H-Ala-Lys-Ser-Gln-OH I ovanstående reaktionsföljd betecknar Rl en skyddsgrupp för a-aminogruppen och R2 och R5 betecknar skyddsgrupper för de reaktiva sidokedjorna i L-serin respektive L~lysin, som ej på- verkas eller avlägsnas då Rl avlägsnas för att möjliggöra en fortsatt reaktion.

I ovanstående pentapeptidharts betecknar ut- trycket Rl lämpligen en sådan skyddsgrupp som t-butyloxikarbonyl, R2 betecknar bensyi _ och H3 betecknar substituerad bensyloxikarbonyl (t ex 2,6-diklor- Å bensyloxikarbonyll. ovan såsom varande användbara vid förfarandet. V Efter det att den slutliga mellanprodukten framställts spjälkades peptidhartset för att avlägsna skyddsgrupperna Rl, R2 och RB därpå och hartset. eller substituerad bensyl (t ex H-klorbensyl) I: _ Hartset är något av de harts som angivits Skyddsgrupperna avlägsnades på något 10 15 20 25 55 :op 7812614-1 lä konventionellt sätt, t ex genom behandling med vattenfritt fluor- väte, och den erhållna fria peptiden återvanns därefter.

Såsom påpekats ovan är det vid utförande av förfarandet nödvändigt att skydda eller blockera aminogrupperna för att kontrollera.reaktionen och erhålla önskade produkter. Lämpliga aminoskyddsgrupper som kan användas omfattar saltbildning för skydd av starkt basiska aminogrupper, eller uretanskyddssubstitut såsom p-metoxibensyloxikarbonyl och t-butyloxikarbonyl. Det är lämpligt att använda t-butyloxikarbonyl (BOC) eller t-amyloxikar- bonyl (AOC) för att skydda a-aminogruppen i aminosyror som reage- rar i karboxyländen av molekylen, eftersom BOC och AOC (t-amyl- ^oxikarbonyl) skyddsgrupper lätt kan avlägsnas efter en sådan reak- tion och före efterföljande steg (vari en sådan u-aminogrupp själv reagerar) genom en relativt mild inverkan av syror (t ex trifluo- roättiksyra), vilken behandling ej på annat sätt påverkar grupper som användes för att skydda andra reaktiva sidokedjor. Det bör således märkas att a-aminogrupper kan skyddas genom reaktion med varje material som kan skydda aminogrupperna för efterföljande reaktion(er) men som senare kan avlägsnas under betingelser som ej på annat sätt påverkar molekylen. Exempel på sådana material är organiska karboxylsyraderivat som acylerar aminogruppen.

I allmänhet kan varje aminogrupp skyddas genom reaktion med en förening som innehåller en gruppering med formeln: O u Ru-o-c- vari RM betecknar en gruppering som förhindrar aminogruppen från att delta i efterföljande kopplingsreaktioner och som kan avlägs- nas utan att molekylen förstöres. Ru betecknar således en rak eller grenad alkylgrupp som kan vara omättad, lämpligen med l~lO kolatomer, och företrädesvis substituerad med halo eller cyano; aryl, lämpligen med 6-15 kol; cykloalkyl, lämpligen med 5-8 kol- atomer; aralkyl, lämpligen med 7-18 kolatomer; alkaryl, lämpli- gen med 7-l8 kolatomer; eller en heterocyklisk grupp, t ex iso- nikotinyl. Aryl-, aralkyl- och alkarylgrupperna kan också vara ytterligare substituerade såsom med en eller flera alkylgrupper med l till cirka 4 kolatomer. Föredragna grupper för R omfattar t-butyl, t-amyl, tolyl, xylyl och bensyl. Mycket föredragna spe- cifika aminoskyddsgrupper omfattar bensyloxikarbonyl; substitue- rad bensyloxikarbonyl, vari fenylringen är substituerad med en eller flera halogener, t ex Cl eller Br; nitro; lågalkoxi, t ex 10 20 30 35 NO 15 781-2614-1 metoxi; lågalkyl; t-butyloxikarbonyl; t-amyloxikarbonyl; cyklo- hexyloxikarbonyl; vinyloxikarbonyl; adamantyloxikarbonyl; bife- nylisopropoxikarbonyl och liknande. Andra skyddsgrupper som kan användas omfattar isonikotinyloxikarbonyl, ftalyl, p-tolylsulfo- nyl, formyl och liknande. ' A Vid utförande av det allmänna förfarandet enligt uppfin- ningen uppbygges peptiden genom reaktion mellan den fria u-amino- gruppen och en förening med skyddade aminogrupper. För reaktion eller koppling aktiveras en förening som skall_angripas vid sin karboxylgrupp så att karboxylgruppen sedan kan reagera med den fria a-aminogruppen på den fästade peptidkedjan. För att åstad- komma aktivering kan karboxylgruppen överföras till någon reak- tiv grupp såsom en ester, anhydrid, azid, syraklorid eller lik- nande. Alternativt kan ett lämpligt kopplingsreagens tillsättes under reaktionen. Lämpliga kopplingsreagens beskrives t ex i Bodanszky et al., - Peptide Synthesis, Interscience, andra uppl., 1976, kapitel 5, omfattande karbodiimider (t ex dicyklokarbodi- imid), karbonyldiimidizol och liknande.

Det bör också märkas att under dessa reaktioner aminosyra-~ grupperna innehåller både aminogrupper och karboxylgrupper och vanligen reagerar en gruppering under det att den andra är skyd- dad. Före kopplingssteget avlägsnas skyddsgruppen på a- eller den terminala aminogruppen av den angripna peptiden under beting- elser som ej väsentligt påverkar andra skyddsgrupper, t ex grup- pen på epsilon-amino i lysinmolekylen. Ett föredraget förfarande för att utföra detta steg är mild acidolys, såsom reaktion vid rumstemperatur med trifluoråttiksyra. A Ovan beskrivna förfarandesteg ger såsom framgår en tetra- peptid med formeln III: III. H-ALA-LYS-SER~GLN-OH Denna tetrapeptid innehåller ett tetrapeptidsegment en- ligt uppfinningen som är nödvändigt för biologisk aktivitet.

Antingen en av eller båda av L-alanyl och L-seryl kan ersättas med en naturlig eller icke-naturlig aminosyrarest genom att i ovanstående syntesschema antingen en av eller båda av alanin y och serin ersättas med en lämpligt skyddad naturlig eller icke- J naturlig aminosyra, varvid erhålles en tetrapeptid med följande formel: IIIA. H-X-LYS-Y-GLN-OH vari X och Y har ovan angiven betydelse. Den substituerade tet- 10 15 20 R.) x:- 50 35 HO 7812614-1 16 b rapeptiden med formeln II, vari de terminala aminosyragrupperna kan vara ytterligare substituerade såsom angivits ovan, kan där- efter framställas genom reaktion mellan tetrapeptiden med formeln (IIIA) eller den skyddade peptidhartsutgångsföreningen med lämp- liga reagens för framställning av önskade derivat. .Reaktioner av fförestring, amidering och liknande Vidare kan andra amino- denna typ såsom acylering, är naturligtvis väl kända inom tekniken. syror, dvs aminosyragrupper som ej inverkar på den biologiska ak- tiviteten av tetrapeptidsekvensen, adderas till någon av ändarna av peptidkedjan genom samma reaktionsföljd enligt vilken själva tetrapeptiden syntetiserades. 'Vidare kan en ersättning av ala- nin och/eller serin åstadkommas genom användning av den önskade substituenten (lämpligt skyddad) i stället för alanin eller serin i föregående reaktionsföljd vid vilken den icke-substituerade tetrapeptiden syntetiserades. Även om tekniken med fast fas enligt Merrifield använts för att framställa föreliggande polypeptider är det klart att klassisk teknik som t ex beskrivits av M. Bodanszky och M. A.

Ondetti i Peptide Synthesis, Interscience, 1966 också kan använ- das. ' I Med avseende på nonapeptiderna, som beskrives enligt Bach, utlär den senare att stället för biologisk aktivitet är på den C” terminala delen, vilket är fullständigt i motsats till föreliggan- de uppfinning. Dessutom är vissa påfallande starka peptider enligt föreliggande uppfinning aktiva i koncentrationer mycket lägre än PTS-nonapeptiden själv. Detta resultat är totalt oväntat och kan på intet sätt förutsägas. Det användbara doseringsomårdet för FTS beskrives vara från 0,0001 till cirka 1,0 mg/kg kroppsvikt (0,1 pg/kg - 1,0 mg/kg). I motsats visade sig de påfallande starka pep- tiderna enligt föreliggande uppfinning att vara aktiva från cirka 1 ng/kg kroppsvikt, 100 gånger mindre än det lägre värdet hos om- rådet som ges i spalt 9 i Bach's amerikanska patentskrift N 1H8 886 (som beskriver samma föremål som Nature-publikationen). I detta sammanhang är det självklart att den syntetiska framställningen av föreliggande U-ledade peptid, Ovillkorligen är fördelaktig jämfört med att utnyttja ett grisserum, såsom det som beskrives av Bach (dvs syntetisk framställning av en förening möjliggör att en ren så väl som betryggad tillförsel tillhandahålles, jämfört med den orena och osäkra tillförsel, när ett material måste erhållas från ett djur). Om Bach's nonapeptid skulle syntetiseras, skulle det det dessutom kosta åtskilligt mer är föreliggande tetrapeptid. 10 20 BO 55 7812614-1 Identiteten och renheten hos föreliggande peptider bestäm- des enligt sådana väl kända metoder som tunnskiktskromatografi, elektrofores, aminosyraanalys och liknande.

Uppfinningen åskådliggöres närmare genom följande exempel, vari delar avser viktdelar om ej annat anges.

Exempel I För framställning av en polypeptid enligt uppfinningen in- handlades följande material: q~BOC-L-glutamin-o-nitrofenyl-ester a-BOC-E-2-klor-bensyloxikarbonyl-L-lysin a-BOC-0-bensyl-L-serin a~BOC-L-alanin.

I dessa reagens betecknar BOC t-butyloxikarbonyl. av "Sequenal"-kvalitet för aminosyrasekvensbestämning, dicyklo- hexylkarbodiimid, fluorescamin och hartset inköptes också i han- deln. Det använda hartset varaett polystyrendivinylbensenharts med en storlek av 200-H00 mesh som innehöll l*% divinylbensen och 0,75 mM klorid per g harts.

För framställning av polypeptiden förestrades 2 mmol a~BOC-L-glutamin till 2-mmol klormetylerat harts i absolut alko- hol som innehöll l mM trietylamin i 2H timmar vid 80°C. Den er- hållna aminoeyrahartsestern filtrerades, tvättadesumed absolut alkohol och torkades. Därefter kopplades de andra d-BOC-aminosy- rorna på liknande sätt till den från skyddsgruppen befriade u-aminogruppen i peptidhartset i korrekt sekvens så att polypep- tiden enligt uppfinningen erhölls under användning av ekvivalenta mängder dicyklohexylkarbodiimid. Efter varje kopplingsreaktion testades en portion av hartset med fluorescamin och om en positiv fluorescens kunde påvisas ansågs kopplingen vara ofullständig och upprepades med samma skyddade aminosyra. Som ett resultat av dessa kopplingsreaktioner framställdes tetrapeptid-hartset som mellanprodukt.

Detta peptid-harts spjälkades och skyddsgrupperna avlägs- nades i en Kel-F-spjälkningsapparat (Peninsula Laboratories, Inc.) med hjälp av vattenfritt fluorväte vid 0°C i 60 minuter med 1,2 ml anisol per g peptidharts som scavenger. Peptidblandningen tvätta- des med vattenfri eter och extraherades med vattenhaltig syra.

Extraktet lyofiliserades och peptiden kromatograferades på P-6 Bio-Gel i 1 N ättiksyra. Den erhållna polypeptiden bestämdes vara 9N % ren och ha följande sammansättning: Reagens 10 20 }0 NO H~ALA-LYS-SER-GLN-OH För identifiering utfördes tunnskiktskromatografi och elektrofores enligt följande. A Tunnskiktskromatografi utfördes på ett 30 ug pbov_på sili- kagel (Brinkman Silikagel'med fluorescerande indikator, 20 X 20 cm, tjocklek 0,1 mm) med följande elueringsmedel: Rfšz n-butanol:pyridinzättiksyra:vatten; 30:l5:3:l2 Rf : etylacetat:pyridinzättiksyrazvatteng 5:5:l:3 Rfšz etylacetat:n-butanolzättiksyrazvatteng l:l:l:l Elektrofores utfördes på ett 100 ug prov på whatman papper 3 mm (ll,5 x 56,5 cm) med hjälp av en pyridin-acetatbuffertlös- ning med pH 5,6 och en spänning av 1000 V i 1 timme.

Spray-reagens både för tunnskiktskromatografi och elektro- Afores var Pauly och ninhydrin. _Följande resultat erhölls: Rfl = orörlig, Rfz = orörlig och Rfj = 0,336. Elektrofores gav en förflyttning av 9,U cm mot katoden.

Exempel II För att bestämma aktiviteten och egenskaperna av den tetrapeptidprodukt som framställts i exempel I användes följande kyoklinginduktionsanalys. Denna analys finns mer detaljerat be- skriven i Brand et al., Science, 193, 319-321 (25 juli, 1976) och däri angivna referenser. g Benmärg från nykläckta kycklingar valdes som en källa för inducerbara celler på grund av dess avsaknad av ett större antal Bu-li eller Th-l+ celler. Polade celler från lårben och tibio- tarsus på fem nykläckta kycklingar av stammen SC (Hy-linjen) frak- tionerades genom ultracentrifugering på en femskikts diskontinuer- lig gradient av serumalbumin.frân nötkreatur (BSA). Celler från de två lättaste skikten slogs samman, tvättades och suspenderades för inkubering vid en koncentration av 5 x 106 celler/ml med en lämplig koncentration av testpolypeptiden i RPMI 1630 medium komp- letterat med 15 mM hepes, 5 % gammaglobulinfritt fetafii kalvserum, deoxiribonukleas (14 till 18 enheter/ml), heparin (5 enheter/ml), penicillin (100 enheter/ml) och streptomycin (100 ug/ml). Kont- roller inkuberades med BSA (1 ug/ml) eller enbart medium. Efter inkubationen testades cellerna i cytotoxicitetsanalysen med hjälp av kyckling Cl och marsvin C2 till C9 komplementfraktioner som be- skrivits i referensartikeln. Mängden Bu-1* eller Th-l+ celler i varje skikt beräknades som ett cytotoxicitetsindex, 100 (a-b)/a, 10 15 nß 19 7812614-1 vari a och b betecknar den procentuella mängden livsdugliga cel- ler i komplementkontrollen respektive testpreparatet. Den pro- centuella mängden celler som inducerades erhölls genom subtrak- ' tion av genomsnittliga värden vid kontrollinkubationerna utan in- duktionsmedel (vanligen l till 5 %) från desamma för testinduktio- nerna.

Speficiteten av effekten av testpolypeptiden och dess lik- het med ubikitin visades genom inhibering av induktion av Bu-l+ B-celler och Th-l+ T~celler av testpolypeptiden vid tillsats av ubikitin vid en koncentration av l00 pg/ml. Denna höga dos ubi- kitin inaktiverar ubikitin-receptorerna och förhindrar därigenom induktion av celler av något medel som verkar genom dessa recep- torer. I Som ett resultat av denna analys visade det sig att tetra- peptiden enligt exempel I uppvisade en biologisk aktivitet lik- nande densamma för ubikitin vad gäller induktion av differentie- ring av både Th-l+ och Bu-1* B-lymfocyter i ng/ml-koncentrationer.

Exempel III A. Analysen enligt exempel II upprepades varvid som test- polypeptid användes en av följande: H-GLN-ALA-LYS-SER-GLN-OH H-SAR-ALA-LYS-SER-GLN-OH I varje fall kunde en biologisk aktivitet liknande densamma för ubikitin iakttas.

B. Analysen enligt exempel II upprepades, varvid som test- polypeptid användes en av följande: H-SAR-LYS-D-ALA-GLN-NH2 H-SAR-LYS-SAR-GLN-NH2 H~D-ALA-LYS-D-ALA-GLN~NH2 V I samtliga fall kunde man iaktta en biologisk aktivitet liknande densamma för ubikitin. För den första av dessa polypeptider iakt- togs denna aktivitet i ett koncentrationsområde från cirka 1 pg/ml till cirka 100 pg/ml. tet vid en så låg koncentration som 0,1 pg/ml.

Exempel IV-VI Med hjälp av ovan beskriven reaktionsteknik för framställ- ning av substituerade polypeptider framställdes polypeptider med följande formel: För den andra polypeptiden iakttogs aktivi~A 7812614-1 20 R-X-LYS-Y-GLN-R' Dessa peptidamider framställdes på ett benshydrylaminharts genom syntes i fast fas på känt sätt.

Exempel ß Ä X _ 5: IV H SAR D-ALA NH2 IVA H SAR SAR NH2 V H D-ALA D-ALA NH2 /VA H D-ALA SAR NH2 VI 'Hr SAR 2-Me-ALA NH2 VIA H SAR SAR OH . De polypeptider som framställts i exemplen IV-VI bibehål- 5 ler den biologiska aktivitet som beskrivits här för det aktiva polypeptidsegmentet. A D För identifiering utfördes tunnskiktskromatografi och elektrofores på följande sätt.

Tunnskiktskromatografi utfördes på 20 ng Prov på tilika- 10 gel (kiselgel, 5 x 20 cm) med hjälp av n-butanol:ättiksyra:etyl- acetat:vatten i förhållandet l:l:l:l som elueringsmedel (Rfl) och på cellulosa 606U (Eastman, 20 x 20 cm) med hjälp av n-butanol:~ pyridin:ättiksyra:vatten i förhållandet l5:l0:}:l2 som eluerings- medel (Rr2). 15 Elektrofores utfördes med 50 g prov på Whatman papper nr 3 (5,7 x 55 cm) med hjälp av en pyridin-acetatbuffertlösning med pH 5,6 och en spänning av 1000 V i l timme. Föreningarna nig- rerar mot katoden. ' Spray-reagens för både tunnskiktskromatografi-och elektro- =20 fores var Pauly och ninhydrin.

Följande resultat erhölls (både Rf-värden och elektrofores anges relativt H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH): l 2 Elektrofores Exempel ɧ_ Éf_ migratïÉÉ""__"FÉEHet IV 0,UN 0,68 2,07 98 % IVA 0,88 0,60 1,78 98 % V 0,56 0,71 2,10 98 % Enligt den tunnskiktskromatografi och det elektroforesför- farande som finns beskrivet i exempel I erhölls fåljande resultat ' l 25 för föreningen enligt exempel VI: Rf = 0,155, Rf - orörliß» Rfå = 0,265 och elektroforesmigrationen är 13,1 cm mot katoden.

Exempel VII Tetrapeptidharts med skyddad LYS och SER som framställts W; 10 Li 7812614-'1 21 enligt exemplen I och VIA acyleras genom reaktion med ättiksyra- anhydrid under acetyleringsbetingelser, varefter skyddsgrupperna och hartset avlägsnas för framställning av följande acylerade de- rivat: CH5CO-ALA-LYS-SER-GLN-OH CH3CO-SAR-LYS-SAR-GLN-OH Exempel VIII - Skyddade tetrapeptidharts som framställts enligt exemplen I och VIA omestras från hartset genom reaktion med natriummetoxid i metylalkohol under omestringsbetingelser, varefter skyddsgrup- perna avlägsnas, för framställning av förestrade derivat med föl- jande formler: H-ALA-LYS~SER-GLN-OCH3 H-SAR-LYS~SAR~GLN-OCH3.

Exemgel IX De skyddade acetylerade tetrapeptidharts som framställts enligt exempel VII bringas att reagera med ammoniak i dimetylforma- mid under amideringsbetingelser, varefter skyddsgrupperna avlägs- nas, för framställning av följande peptidamider: CHBCO-ALA-LYS-SER-GLN-NH2 CH3CO-SAR-LYS-SAR-GLN-NH2 Exemgel X-XI Under användning av ovan beskriven reaktionsteknik för för- längning av en polypeptidkedja framställes följande polypeptider som innehåller den aktiva aminosyrasekvensen men som är substi- tuerade vid de terminala amino- och karboxylsyragrupperna R och R' för framställning av polypeptider med formeln: I R-ALA-Lys-san-GLN-R' xom är substituerade genom de aminosyror som anges i följande -abell: Exemgel 3 gl X H-GLN OH XI H-SAR OH De polypeptidderivat som framställts i exemplen IV-XI bibehåller den biologiska aktivitet som beskrivits ovan för det aktiva polypeptidsegmentet.

Tunnskiktskromatografi och elektrofores enligt exempel I av föreningen enligt exemplen X och XI ger följande resultat: 10 20 BO 55 7812614-1 _22 1 2 elektrofores- R R 3 migration ÉÄÉERÉÄ _É_ fm Rf mot katoden X orörlig orörlig 0,303 7,u cm XI orörlig orörlig 8,3 Cm 0,186 _ExemEel XXVII För att ytterligare illustrera användbarheten av förelig- gande polypeptider beskriver detta exempel en mikrokulturanalys för uppskattning av förekomsten av cytotoxiska lymfocyter som producerats vid stimulering av allogena antigener. Förekomsten av cytotoxiska prekursorer i kontrolldjur och djur som injicerats med olika koncentraticner av läkemedlet jämfördes enligt en be- gränsande spädningsanalys.

Material och metoder Mšââ Inbreed C57 BL/6J (honor, 8 veckor) erhölls från Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine. 0 Inbreed DBA/2J (hanar eller honor) erhölls likaså från Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine. A ' Msála rosfacbuffraa saiin (Pas), RPM: 16uo, fatala xaivsérum (Pos) - (partinummer R776l16), N-2-hydroxietylpiperazin-N'-2-etansul- sonsyra (HEPES) buffert erhölls från Gibo, Grand Islands; 2-merkaptoetanol erhölls från Eastman Kodak, Rochester, N.Y.

Celler tvättades med PBS och odlades í RPMI som innehöll 10 % scs, 10 mm nsvßs buffert och 5 x 1o'5M 2-merkapcoecanoi.

Läkemedelsbehandling Försöksdjuren (C57 BL/6J) injicerades (i.v. eller i.p.) med olika koncencracioner av H-SAR-Lys-SAR~cLN-NH2 <1akemea1ec; identifikationsnummer GOH0) i en mängd av 0,2 ml 2N timmar in- nan de dödades för försöken.

Cellgregarat Cellsuspensioner från mjältar från C57;BL/6J möss eller DBA/2J möss framställdes genom sönderhackning av organet och press- ning därav genom ett trådnät (60 gauge) med kolven till en 5 cm5 spruta ned i en falcon petri-skål (falcon 3002, 15x60 mm).

Cellsuspensionerna. fick stå vid rumstemperatur i l0 minuter så att de stora vävnadsbitarna fick sedimentera. -Cellsuspen- sionerna överfördes därefter till 15 ml Corning centrifugrör n (Corning 25310) och centrifugerades i 10 minuter vid 1500 varv/~ 10 20 25 50 35 7812614-1 25 Samtliga cellsuspensioner Efter den tred- min i en Beckmen TJ-6 centrifug. tvättades minst tre ytterligare gånger med PBS. je tvättningen resuspenderades svarscellerna (C57 BL/6J) i od- lingsmedium och räknades i en Coulter-räknare. *DBA/2J (stimu- latorceller) resuspenderades i RPMI till 107 celler/ml. 30 ug mitomycin C sattes till varje ml av DBA/2J mjältecellerna och blandningarna inkuberades vid 3700 i 30 minuter. Efter behand- ling med mitomycin C tvättades mjältecellerna tre gånger med PBS för avlägsnande av ett eventuellt överskott av mitomycin C.

DBA-cellerna resuspenderades därefter i odlingsmediet och räk- nades i Coulter-räknaren.

Blandade lymfocytkulturer (MLC) MLC sattes upp i mikrotiterbrickor (Linbro Chemicals, New Haven, Conn., IS-MVC-96). Varje bricka innehöll 96 V~bottnade fördjup- ningar. De yttre fördjupningar som omgav plattans kant användes ej för cellodling utan fylldes med PBS för att undvika avdunst- ning från odlingsfördjupningarna. 60 prov sattes upp i varje V-bottnad bricka. Vanligen innehöll varje bricka tre koncentra- tioner av svarsceller (20 av varje) och en stimulatorcellkon- centration. Svarscellerna suspenderades vanligen till en kon- centration av 7,5 x 105, 5 x 105 och 2,5 x 105 per ml och 0,1 ml sattes till varje fördjupning. De använda stimulatorcellkon- centrationerna var 10 , 2,5 x 106, 5 x 106 sattes 0,1 ml till varje fördjupning. Samma stimulatorcell- koncentration användes till hela plattan. En kontrollplatta som endast innehöll svarsceller utan stimulatorceller uppsattes också för en uppskattning av en bakgrundsstimulering som kan tillskrivas mediet. Cellerna odlades i sex dagar vid 37°C i en fuktig inkubator som innehöll 5 Z C02. per ml, också här Målceller De målceller som användes i den cytotoxiska analysen var en DBA mastocytoma cell-linje P815. Cell-linjen bevarades genom rutinpassage genom DBA/2J möss. 5 x.l08 P8l5 celler användes till varje passage och tumörcellerna från bärarnas peritoneal- håla användes fyra till fem dagar efter passagen. Tumörce1ler~ na från peritonealhålan tvättades tre gånger med PBS och märktes därefter med Crsl i en koncentration av 100 uci per 107 celler.

Märkningen gjordes i 1 timme vid 37°C i en fuktig inkubator.

De märkta målcellerna tvättades därefter tre gånger med PBS för att avlägsna ett eventuellt överskott av märkningen. 10 20 25 BO 35 'Poisson. 7812614-1 Ä Cytotoxisk analys Efter sex dagars odling avlägsnades-0,1 ml medium från varje fördjupning utan att cellpelletten rubbades. Med hjälp av en automatisk mikropipett (MLA-pipett) pipetterades därefter 100 ul målceller, innehållande 2,5 x lOu Crsl-märkta målceller ned i varje fördjupning, varvid cellpelletten resuspenderades V under förfarandet (en ny pipettspets måste användas för varje fördjupning). Mikrotiterbrickorna centrifugerades därefter vid rumstemperatur vid 1000 varv/min i 7 minuter i Sorvall GLC-2B. Brickorna inkuberades därefter i 4 timmar vid 3?°C. 100 ul överstående vätska togs därefter bort till gamma-räkne- rör (Amershen 196271). Rören räknades därefter i en Beckmen gamma-räknare (Beckmen 310). Rören räknades vanligen i l minut.

Bestämning av förekomsten av prekursorer till cytotoxiska lymfocyter (CLP) Den begränsande spädningsanalysen är en allt eller intet svars- analys som kan beskrivas genom sannolikhetsfördelning enligt Sannolikheten för ett nej-svar ges av uttrycket av nollzte ordningen Po=e_6N där 6 = förekomsten av CLP och N = antalet lymfocyter per fördjupning. En avsättning av lo- garitmen av förhållandet mellan icke-svarande kulturer mot cell- dosen skulle således ge en rät linje med en lutning av -6, fö- rekomsten eller frekvensen av CLP.

I exemplet togs medelvärdet av bakgrundsfrigöringen av krom (spontan frigöring) från 20 fördjupningar som bara innehöll svarsceller (C57 BL/6J) utan stimulatorceller. Testfördjup~ ningarna värderades som positiva om räknevärdet var större än det genomsnittliga spontana värdet med mer än 2,07 standardav- vikelser (P< 0,05). Den spontana lysen varierade vanligen från Q till l5 % av de totala räknevärden som fanns i målcellerna.

Enligt Poisson-ekvationen Po=e_ N är då Po=e-1 = 0,57 (m0fiSV&* rar 37 % icke-svarande kulturer), 6 = l/N, således är det in- verterade värdet avantalet svarande celler motsvarande-37 % icke- svarande kulturer CLP-frekvensen. Vanligen infördes antalet celler per fördjupning och motsvarande värde för procentuell mängd icke-svarande f» i datorn som beräknade den bästa re- gressionslinjen genom dessa punkter och antalet celler per för- djupning motsvarande 57 % icke-svarande kulturer, varvid det inverterade värdet därav utgör frekvensen av CLP. _ 7812614-1 25 Resultat.

Förekomsten av cytotoxiska lymfocytprekursorer för varje sti- mulatorcellkoncentration avsattes som en funktion av läkemedels- dosen. Som jämförelse beräknades också den genomsnittliga och standarddeviationen för 20 likadana prov. De tre stimulatorcell- koncentrationer som användes var 105 (Suboptimal stimulering), 2,5 x 105 (optimal stimulering) och 5 x 105 (överoptimal stimu- lering). Det visade sig att testläkemedlet gynnade produktion av cytotoxiska lymfocytprekursorer vid en koncentration från cirka l pg/mus till cirka 100 ng/mus (ekvivalent med cirka 50 pg/kg till cirka 5 ng/kg kroppsvikt) i närvaro av subopti- mala stimulatorcellkoncentrationer. Försöksläkemedlet fungerar därför som en immunoregulator vid dessa koncentrationer varige- nom det cellulära immunsvaret hos de behandlade mössen ökas.

Uppfinningen har här beskrivits under hänvisning till vis- sa föredragna utföringsformer, men i den mån uppenbara variatio- ner framstår för fackmannen omfattas också dessa av uppfinningen.

Claims (3)

...,. 7s12614~1 % Patentkrav

1. Polypeptid med förmågan att inducera díffcrentiering av både Th~1+ T-lymfocyter och Bu-1+ B-lymfocyter, k ä n n e - t e c k n a d av följande sekvens: R-X-LYS~Y-GLN~R' vari R' betecknar OH eller NH2, X betecknar sarkosyl, L-alanyl eller D~alanyl, Y betecknar seryl, sarkosyl, 2~metyl-alanyl eller D-alanyl och R betecknar H, H-GLN eller

2. Polypeptid enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av följande sekvens: H-ALA-LYS-SER-GLN-OH samt farmaceutískt godtagbara salter därav.

3. Polypeptid enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av följande sekvens: H~SAR~LYS-D~ALA-GLN-NH2