SE501428C2 - Fluorescensdetektor jämte bäranordning för utbytbar provkuvett vid en fluorescensdetektor - Google Patents

Description

30 35 501 428 2 kan erhållas p.g.a. effektivt utnyttjande av ljuset, dels även att färgfilter i de flesta fall kan användas om dessa utformas på lämpligt sätt.

Ett annat syfte är att åstadkomma en enkel och praktisk utbytesmöjlighet för kuvetter resp. prov, monterade i ut- bytbara kassetter.

Dessa och andra syften uppnås enligt uppfinningen genom en fluorescensdetektor som uppvisar de i nedanstående patentkrav 1 resp. patentkrav 12 angivna särdragen.

Det är ett särskilt utmärkande drag för en utföringsform av uppfinningen att de använda filtren är utskurna plattor av filtermaterial, vilka samtidigt fullgör två olika funktioner, nämligen filterfunktionen och en funktion av ljusledare. Man uppnår därmëfl både en god filterverkan genom lång väglängd genom filtren och en förmånlig kollimering trots att inga linser behövs. Dock kan filterverkan också anordnas genom särskilda filter i strålgångarna.

När det gäller bäranordningen eller kassetten enligt krav 11, är ett utmärkande drag att man utnyttjar ett innerhörn i detektorn, i form av en yta där fluorescensexciterande ljus utkommer mot en kuvett eller motsvarande, och en i förhållan- de till den förstnämnda ytan avvinklad yta, genom vilken fluorescensljus upptages för detektion, varvid kuvetten eller motsvarande är eftergivligt upptagen i kassetten och vid kassettens montering kommer att pressas in mot de båda ytorna till ett helt reproducibelt läge.

Liksom vid kända fluorescensdetektorer användes en provkuvett bestående av ett tunt rör av genomskinligt material, före- trädesvis av kvarts, genom vilket den undersökta vätskan strömmar. Det är fördelaktigt om kvartsröret är monterat så att det anligger emot de båda filtrens kortsidor. Särskilt om röret med vederbörliga anslutningar är monterat i en utbytbar kassett är det förmånligt om i kassetten finns eftergivliga medel, som när kassetten är monterad eftergivligt pressar 10 15 20 25 30 35 501 428 3 rörets yttre mantelyta mot de båda filtrens kortsidor, vilka företrädesvis är monterade i en hållare med ett innerhörn med 90 graders vinkel.

Uppfinningen skall nu närmare förklaras genom hänvisning till icke begränsande utföringsexempel och med hänvisning till bifogade figurer.

Fig. 1 visar i genomskärningsvy en fluorescensdetektor enligt uppfinningens principer, utan monterat prov.

Fig. 2 visar i förstoring ett provläge med ett kvartsrör i tvärsnitt samt strålningstillförande och fluorescensstrål- ningsinsamlande optiska element till de delar de är nära provet.

Fig. 3 visar en kassett med ett eftergivligt monterat kvarts- rör för prgv. _ Fig. 4 visar i längsgenomskärning ett kvartsrör för prov.

Fig. 5 visar ett elektriskt kretsschema över en fotodiod med förförstärkare.

Fig. 6 visar en variant av den i Fig. 1 visade utförings- formen, där en normaliseringsanordning av tvåstråletyp är anordnad.

I Fig. 1 visas ett utförande av fluorescensdetektorn enligt ett utföringsexempel, i dubbel naturlig storlek. I en hållare 1 av massiv svart plast är monterade i rät vinkel mot varan- dra en första ljusledare 2, tillika UV-genomsläppande filter, och en andra ljusledare 3, tillika fluorescensljusgenomsläp- pande filter, och de båda ljusledarna möts med sina ena ändar till ett innerhörn. En lampa 4 är monterad vid den första ljusledarens bortre kortände, medan en detektorenhet 7 sitter vid den andra ljusledarens bortre kortände. Dessa båda fil- ter, vilka har rätblocksform, är stelt fästade i hållaren 1, med ljustätande svart härdplast 6 (företrädesvis silikongum- mi) omgivande de mötande ändarna, så att endast deras kortsi- doytor är fria. Ljusledaren/filtret 2 utsticker vid sin mot lampan 4 vända ände något ifrån hållaren l, och en del av det utstickande partiet insticker i lamphuset. Lampan 4 sitter i ett lamphus (ej visat) och är där ventilerad av en fläkt, 10 15 20 25 30 35 501 428 4 vars kylning även är verksam mot den del av filtret som ut- sticker ur hållaren 1. Därmed uppnås att föga värme ledes fram mot provet. Eventuellt finns bakom lampan 4 en reflektor 5. Detektorn 7 är företrädesvis en fotodiod, vars känsliga yta är lagd mot kortsidan till ljusledaren 3 under mellan- komst av ett plastfilter, som eliminerar eventuell trans- mitterad UV-strålning som lyckats ta sig igenom filterverkan av ljusledaren 3.

I Fig. 2 visas i 35 ggr förstoring schematiskt hörnet mellan de båda ljusledarna 2 och 3, jämte ett däri insatt kvartsrör 10, varigenom ett vätskeprov kan föras eller förvaras. Fluo- rescensalstrande exoitationsstrålning inkommer enligt pilen mot röret och alstrar däri, beroende på om vätskan i röret fluorescerar, en fluorescensstrålning. En del av denna fluo- rescensstrålnipg utträder från röret in i ljusledaren 3 för att där filtreras för att eliminera sådan UV-strålning som genom spridning, reflexion eller refraktion avletts åt detta håll. Själva röret 10 bör vara fritt från fluorescens, varför det normalt är av kvarts.

För att öka intensiteten kan röret 10 vara delvis försett med reflekterande beläggning på utsidan, företrädesvis av alumi- nium. I Fig. 2 visas den föredragna förläggningen av de re- flekterande beläggningarna 20 och 21, täckande vardera 76 grader, med ett mellanrum 22 om 40 grader. Dessa värden är, som man förstår, inte alldeles kritiska. Viktigt är dock att det finns ett mellanrum i ett fält kring läget för bissektri- sen 23 mellan pupillytorna till ljusledarna 2 och 3, för att förhindra att excitationsstrålningen i större omfattning riktas mot utgångspupillen via reflexion.

Strålningsgeometrin har därmed visats i ett tvärsnitt. Detta tvärsnitt är representativt för den geometri som råder över en viss längd av röret 10, vilken avsevärt överstiger de av Fig. 1 och 2 framgående tvärsnittsdimensionerna. I dessa tvärsnittsfigurer visas sålunda snitt genom tjockleken av ljusledarna/filtren 2 och 3, vilka har formen av avlånga 10 15 20 25 30 35 501 428 5 plattor med sin största utsträckning och sin minsta utsträck- ning visade i Fig. 1.

Det må framhållas att ehuru man normalt föredrar att använda cylindriska rör, det också är möjligt att använda kuvetter och rör av annan form, när detta förefaller praktiskt av något skäl. Sålunda framstår som uppenbart att ett rör med kvadratiskt tvärsnitt väl kan inpassas i sama optiska sys- tem .

Röret 10 monteras alltså i skärningspunkten för de optiska ljusledarna 2 och 3, så som framgår av Fig. 2. Enligt det föredragna utföringsexemplet är röret 10 utbytbart monterat i en kassett, såsom via böjliga, fjädrande stålrör ll i en kassett 12 enligt Fig. 3. Hållaren 1 enligt Fig.* 1 är till- sammans mgg ett kylt lamphus på icke visat sätt monterade i ett hölje, som har en öppning för att skjutlådsvis insätta kassetten 12. Kassetten 12 fästes efter inskjutning medelst en skruv 14. Röret l0 inkommer då snett underifrån mot inner- hörnet i Fig. 1 och hålles fjädrande i kontakt genom de böjliga rören ll av rostfritt stål.

Fig. 4 visar hur röret 10 är under tätning fästat vid stål- rören 11. Rören ll är därvid utkragade till nära passning mot rörets 10 inneryta, och ett rör 41 av plastiskt-elastiskt material, t.ex. FEP, är påträtt, åtföljt av en hålad propp.

Proppen 42 skjuter röret 41 till deformation och tätning i mellanrummet mellan rörets 10 inneryta och stålrörets ll utsida och är belastad med en fjäder 43, spänd med en ytter- ligare hålad propp 44, som hålles på plats under spänning av tryckfjädern 43 därigenom att röret 11 givits en bockning.

Som framgår av Fig. 3, är rören ll sedan krökta så att röret 10 hålles fritt, mellan anslutningar 13, som tillåter för- bindelse med en vätskekälla, t.ex. en kromatografisk kolonn.

Om ett kvartsrör andvänds, är det lämpligt att på en sida motsatt anliggningssidan av röret anordna en förstärkande balk, som förenar rören 11 vid skarvarna. 10 15 20 25 35 501 428 6 Som ljuskälla användes i detta fall en halogenlampa 4, som är monterad i en jigg S0 med en platta 51 försedd med ett hål 52 för reproducibel montering. Ett elektriskt anslutningsdon 52 har anslutninar 53 för strömtillförsel. Vid det beskrivna ex- emplet användes en lampa för 12 V, 20 W (mod. Q20 G4), med glödtråden monterad parallell med det första filtrets 2 inträdesyta och med rörets 10 riktning.

Det har visat sig att det för normala behov är tillräckligt att anordna stabiliserad likspänning för försörjning av lampan med energi, dvs. man erhåller därmed en god långtids- stabilitet över en försöksperiod inklusive eventuell kalibre- ring. Som kommer att framgå nedan, finns emellertid även möjlighet att monitorisera intensiteten medelst en tvåstråle- anordning. V ¶ Som detektor användes lämpligen en fotodiod, vilket är för- månligt med hänsyn till att den över ett stort dynamiskt intervall (4-5 tiopotenser) uppvisar god linearitet. Som schematiskt visas i Fig. 5, ledes den av ljuskvanta alstrade strömmen genom ett högresistivt motstånd (10 Gohm), och den erhållna signalen förstärkes i en förförstärkare. Motståndet och förstärkaren ligger väl skärmade alldeles nära fotodio- den. Den förstärkta signalen ledes företrädesvis till en spänning/frekvensomvandlare, som är lämplig med hänsyn till att det rör sig om relativt långsamma förlopp. Som diod användes en fotodiod. Vid ett uppbyggt exempel användes en fotodiod av fabrikat Hamamatsu med modellbeteckningen S 2387- l6R.

Beträffande de kombinerade ljusledarna och filtren tillverkas de lämpligen genom att skära strimlor av kommersiellt till- gängliga filterskivor av glas, som oftast går att erhålla som kvadratiska skivor med en tjocklek av t.ex. l mm. En bredd av omkring 10 mm är lämplig, och längden bör vara väsentligt större än tjockleken, särskilt för UV-filtret, som bör vara minst 10 ggr, helst minst 50 ggr längre än tjockleken, medan intagsfiltret bör vara minst 6 ggr, helst minst 10 ggr längre än tjockleken. De utskurna filterstrimlorna slipas på de 10 15 20 25 30 35 501 428 7 skurna kanterna och poleras, utan särskilda optiska tolerans- krav. Lämpliga filter kan ha passband, UV-filtret någonstans mellan 300 och 380 nm, det andra filtret mellan 400 och 500 nm, ehuru speciella krav kan tillfredsställas genom särskild anpassning av filtren. Filtrens lämpligaste längd bestämmes med hänsyn till vilken filtersort som användes.

Vid ett konstruerat exempel på en fluorescensdetektor an- vändes som kvartsrör ett rör med 1, 5 mm ytterdiameter, 1,1 mm innerdiameter. Tjockleken på de använda filterglasen var 1 mm. UV-filtret, av fabrikat Schott, typ UG5 (passband 310-350 nm), hade dimensionerna 49x6x1 mm. Det andra filtret, också från Schott, typ BG 39 (passband 410-480 nm), hade dimensio- nerna 12x6x1 mm. Vid detektoränden kompletterades detta med ett litet för UV ogenomsläppligt plastfilter (otransparent under 390 nm, typ KV 389 från Schott).

T Jämförelser har gjorts med på marknaden kommersiellt till- gängliga fluorescensdetektorer. Med en belyst cellvolym av 5,7 gl befanns detektionsgränsen för standardsubstansen kininsulfat vara 0,010 pg/pl (med detektionsgränsen definie- rad som en signalnivå uppgående till dubbla bakgrundsbruset).

Därmed är känsligheten väsentligen i jämnhöjd med vad som enligt tillgängliga datablad anges uppnås med de bästa av de provade allmänt tillgängliga instrumenten på marknaden.

Det har som redan nämnts visat sig att det för belysningen i allmänhet är tillräckligt att använda ett enkelstrålesystem i enlighet med vad som redan beskrivits. Själva känsligheten är ju mycket god. Om man emellertid dessutom ställer särskilt höga krav på mätningens stabilitet och reproducibilitet, kan ett referenssystem för mätning av den från lampan utsända strålningen anordnas, t.ex. enligt Pig. 6, där gemensamma detaljer erhållit lika referenssiffror. I ljusledaren 2 har borrats ett hål 60, vilket upptar en liten del (mindre än 10- 15 %) av dess bredd. I detta hål har placerats, t.ex. genom ingjutning, en plugg av fluorescerande material som, då det träffas av den genom ljusledaren ledda strålningen, utsänder fluorescensstrålning, vilken till en del uppfångas av en 10 15 20 25 30 501 428 8 ljusledare 3b och ledes till en referensfotodiod 7b, som sålunda detekterar en signal som är ett mått på excitations- strålningen. Följande fördelar kan därmed uppnås: - Genom att en del av den ljusstrålning som passerar mot mätkuvetten tages ut som referens uppnås att såväl mätljus som referensljus tages från sama del av ljuskällan och i sama riktning.

- Genom att referensstrålningen passerat genom en väsentlig längd av ljusledaren 2 uppnås, om denna har filtrerande verkan, att referensstrålen då den träffar referenspluggen har ungefär samma spektrala samansättning som den excita- tionsstrålning som träffar provet. Därtill kommer att av pluggen alstrad fluorescensstrålning, om ljusledaren 2 är filtrerande, genom pluggens placering kommer att absorberas innan den kan nå fram till provet, varför bakgrunden knappast påverkas.

- Referenspluggen kan väljas av ett fluorescerande material som har fluorescensegenskaper liknande dem som uppvisas av prov man önskar analysera.

- Genom att fotodioderna 7 och 7b placerats nära intill varandra och med liknande mekanisk montering uppnås flera fördelar, t.ex. att fotodioderna kan elektriskt anslutas till samma kretskort, på vilket de två förstärkarna appliceras, samt att båda fotodioderna lätt kan hållas vid samma tempera- tur.

Pluggen kan även ersättas med en i 45 grader ställd spegel, ett totalreflekterande prisma eller någon spridande anord- ning, för att uppsända en del av excitationsstrålningen genom ljusledaren 3b. Härvid är egenskapen enligt den sista punkten inte aktuell, och ljusledaren 3b måste i så fall även till- verkas av ett material som släpper igenom excitationsstrål- ningen.

Claims (13)

10 15 20 25 30 35 501 428 Patentkrav

1. Fluorescensdetektor för mätning av fluorescens i en vätska upptagen i ett rör, och innefattande en ljuskälla för be- strålning av vätskan med en fluorescensalstrande strålning, ett filter för genomsläppning av alstrad fluorescensstrålning från vätskan och en detektor för av filtret genomsläppt fluorescensstrålning och avgivning av en elektrisk, mot fluorescensstrålningen svarande signal, k ä n n e t e c k- n a d a v a) en mellan ljuskällan (4) och röret (10) anordnad första ljusledare (2), som har en långsträckt, avplattad form med en kortsida motsvarande ett belysningsområde av röret (10), en tjocklek svarande till rörets grovlek och en längd av minst 10 gångeïrtjockleken, varvid ena kortsidan är belyst av ljuskällan (4) och andra kortsidan är förläggbar nära intill röret (10), i kombination med en första filterverkan genom- släpplig för ultraviolett ljusstrålning men ej i våglängdsom- råden för fluorescensstrålning, b) en mellan röret och detektorn anordnad, för genomsläppning av fluorescensstrålning avpassad andra ljusledare (3), som har en långsträckt, avplattad form med en kortsida motsvaran- de ett detektionsområde av röret, varvid belysningsområdet och detektionsområdet av röret åtminstone delvis sammanfaller i rörets längdriktning, en tjocklek svarande till rörets tjocklek och en längd av minst 6 gånger tjockleken, och kombinerad med en andra filterverkan, c) vilka ljusledare är anordnade med sina längdriktningar i inbördes tvärriktningar, företrädesvis i rät inbördes vinkel, och sina mot röret vända kortsidor avslutade tangerande eller nära tangerande rörets yttersida.

2. Fluorescensdetektor enligt krav 1, k ä n n e t a c k n a d av att ljusledarnas filterverkningar är anordnade genom att ljusledarna är tillverkade av filtermaterial. 10 '15 20 25 UI Ö 35 5[~)1 428 10

3. Fluorescensdetektor enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av medel för eftergivligt pressande av röret mot filtrens nämnda kortsidor.

4. Fluorescensdetektor enligt något av föregående krav k ä n- n e t e c k n a d kassett (Fig. 3). av att röret är monterat i en utbytbar

5. Fluorescensdetektor enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a d av att till- och frånledningsrör (ll) av metall med utkragade ändar (20) är instuckna i rörets båda ändar, åtföljda av på de instuckna metallrören påträdda rörstycken (21) av defor- merbart plastmaterial, samt av hårdare, i röret (10) intrång- da proppstycken (22), som är fjädrande pressade mot de på- trädda rörstyckena (21).

6. Fluoresäensdetektor enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av att den första filterverkan har ett passband mellan 310- 350 nm och den andra filterverkan ett passband mellan 410-480 nm.

7. Fluorescensfilter enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a d av att den andra filterverkan är kombinerad med ett UV-filter av plastmaterial.

8. Fluorescensdetektor enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av att ljuskällan är en halogenlampa (4) i kvartshölje.

9. Fluorescensdetektor enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av att detektorn (7) är en fotodiod.

10. Fluorescensdetektor enligt krav l, k ä n n e t e c k n a d av att röret är delvis på utsidan belagt med ett reflekte- rande skikt (12), som frilägger rörets yta vid ett område kring bissektrisen mellan de båda ytor av filtren som är närmast röret. _

11. ll. Fluorescensdetektor enligt krav 2, k ä n n e t e c k- n a d av att ett referenssystem är anordnat, innefattande en 10 15 20 501 428 ll i den första ljusledaren på avstånd från röret är insatt ett fluorescerande referensprov, mot vilket är riktad en tredje ljusledare, vid vars motsatta ände är anordnad en intensi- tetsmonitoriserande andra detektor.

12. Bäranordning för uppbärande av en utbytbar provkuvett vid en fluorescensdetektor, k ä n n e t 0 c k n a d av medel (14) för inpassning av bäranordningen och dess fästande till fluorescensdetektorn i ett bestämt monteringsläge, varvid provkuvetten (10) är upphängd vid bäranordningen via efter- givliga till- och frånledningar (11), för att vid omonterad kassett intaga ett första läge, för att, efter den nämnda inpassningen av bäranordningen i fluorescensdetektorn, av i fluorescensdetektorn befintliga stödytor pressas från det första läget till ett andra, i förhållande till fluorescens- detektorn och dess stödytor välbestämt reproducibelt mätläge. Y

13. Bäranordning enligt krav 12, k ä n n e t o c k n a d av att den av kvartsglas gjorda kuvetten (10) är förstärkande stödd mellan till- och frånledningarna (11) av en balk (45) som förenar dessa på en sida av kuvetten (10) s om vetter ifrån fluorescensdetektorns nämnda stödytor.