SE523013C2 - Nukleinsyra (IIP-10) som kodar för en IGF-1-receptorbindande polypeptid samt användning av nukleinsyran eller polypeptiden i en metod för detektion av proliferationspotentialen hos en cancercell eller för att identifiera ämnen som modulerar interaktionen mellan IIP-10 och IGF-1R - Google Patents

Description

523 013 2 human IGF- lR resulterade i ligandberoende förankrings-oberoende tillväxt av NIH 3T3 eller rått- l-fibroblaster och inokulering av dessa celler orsakade en snabb tu- mörbildning hos nakna möss (Kaleko et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990) 464-473; Pra- ger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 2181-2185). Transgena möss som överuttrycker IGF-II specifikt i bröstkörteln utvecklar bröstadenokarcinom (Bates et al., Br. J. Cancer 72 (1995) 1189-1193) och transgena möss som överuttrycker IGF- II under kontroll av en mer allmän promotor utvecklar ett förhöjt antal och brett spektrum av tumörtyper (Rogler et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 13779-13784). Ett exempel bland många för humana tumörer som överuttrycker IGF-I eller IGF-Il vid mycket hög frekvens (>80%) är småcelliga lungkarcinom (Quinn et al., J. Biol.

Chem. 271 (1996) 11477- 1 1483). Signalering genom IGF-systemet förefaller också att krävas för den transformerande aktiviteten hos vissa onkogener. Fetala ñbrob- laster med ett avbrott på IGF-IR-genen kan inte transformeras av SV40 T-antigenet, aktiverad Ha-ras, en kombination av båda (Sell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 11217-11221; Sell et al., Mol. Cell. Biol. 14 (1994) 3604-3612) och också E5- proteinet från bovint papilomvirus är inte heller längre transformerande (Morrione et al., J. Virol. 69 (1995) 5300-5303). lnterferens med IGF / lGF-lR-systemet visade sig också reversera den transforrnerade fenotypen och inhibera tumörtillväxt (Tro- jan et al., Science 259 (1993) 94-97; Kalebic et al., Cancer Res. 54 (1994) 5531- 5534; Prager et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 2182-2185; Resnicoff et al., Cancer Res. 54 (1994) 2218-2222; Resnícoff et al., Cancer Res. 54 (1994) 4848- 4850; Resnicoff et al., Cancer Res. 55 (1995) 2463-2469). Exempelvis utvecklade möss injicerade med adenokarcinomceller från råttprostata (PA-Ill) transfekterade med IGF-IR antisense-cDNA (729 bp) tumörer som var 90% mindre än kontroller eller förblev tumörfria efter 60 dagars observation (Burfeind et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 93 (1996) 7263-7268). IGF-lR-medierat skydd mot apoptos år oberoende av de-novo-genexpression och proteinsyntes. Således utövar IGF-l sannolikt dess anti-apoptotiska funktion via aktivering av förformade cytosoliska mediatorer.

Vissa signaleringssubstrat som binder till IGF-lR (texJRS-l, SHC, p85 PI3-kinas etc., för detaljer se nedan) har beskrivits. Emellertid är inga av dessa omvandlare unika för IGF- lR och skulle således kunna vara exklusivt ansvariga för de unika biologiska särdragen hos IGF-1R jämfört med den andra tyrosinkinasreceptorn in- nefattande insulinreceptorn. Detta indikerar att specifika mål för IGF-IR (eller åt- - ~ » - s. 523 015 i minstone IGF-receptor subfarniljen) skulle kunna föreligga som påverkar överlevnad och motverkar apoptos och således är huvudsakliga farmaceutiska mål för anti- cancerterapi.

Med användning av jäst två-hybridsystemet visade det sig att p85, den regulatoris- ka domänen hos fosfatidylinositol-S-kinas (PI3K) interagerar med IGF- lR (Lamothe, B., et al., FEBS Lett. 373 (1995) 51-55; Tartare-Decker, S., et al., Endocrinology 137 (1996) 1019-1024). Emellertid förefaller bindning av p85 också att förekomma i många andra tyrosinkinasreceptorer från så gott som alla familjer. En annan bind- ningspartner för IGF- lR som definieras genom två-hybridscreening är SHC som också binder till andra tyrosinkinaser såsom trk, met, EGF-R och insulinreceptorn (Tartare-Deckert, S., et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 23456-23460). lnsulinrecep- torsubstrat 1 (IRS-1) och insulinreceptorsubstrat 2 (IRS-2) befanns också interagera både med IGF-IR såväl som insulinreceptorn (Tartare-Deckert, S., et al., J. Biol.

Chem. 270 (1995) 23456-23460; He, W., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 11641- 11645; Dey, R.B., et al., Mol. Endocrinol. 10 (1996) 631-641). Grb 10 som interage- rar med IGF- 1R delar också många tyrosinkinaser som bindningspartner, t.ex. met, ínsulinreceptor, kit och abl (Dey, R.B., et al., Mol. Endocrinol. 10 (1996) 631-641; Morrione, A., et al., Cancer Res. 56 (1996) 3165-3167). Fosfatas PTPlD (syp) visar också en mycket kraftig bindningsförxnåga, dvs. binder till IGF-lR, ínsulinreceptor, met och andra (Rocchi, S., et al., Endocrinology 137 (1996) 4944-4952). Mer nyligen har mSH2-B och har beskrivits som bindare av IGF-IR, men interaktion ses också med andra tyrosinkinaser, t.ex. mSH2-B binder också till ret och insulinreceptom (Wang, J. och Riedel, H., J. Biol. Chem. 273 (1998) 3136-3139). Sammantaget re- presenterar de hittills beskrivna IGF- 1R bindningsproteinerna relativt ospecifika mål för terapeutiska tillvägagångssätt eller är i fallet med insulinreceptorsubstraten (IRS- 1, IRS-2) oumbärliga för insulindrivna aktiviteter.

Det är ett syfte för uppfinningen att tillhandahålla nya gener som kodar för bind- ningsproteiner till IGF- lR såväl som de motsvarande polypeptiderna som är grun- den för ny cancerterapi baserad på modulering (företrädesvis, inhibition) av inter- aktionen mellan IGF-IR och IIP:er enligt uppfinningen. n . > ~ e. uuu uuu u u uu uu u u u u uu uu u f u uu uu u u ou u u I u u uu I u uu uu u u uu u u u u u uuu uuu u u u uu uuu u uu u u u u u u u u u u u u u u u u u u u u u uu uu uu uu uu o u- 4 Uppfinningen innefattar företrädesvis en nukleinsyra som kodar för ett protein som binder till IGF- l-receptor (IIP- 10) vald från gruppen innefattande a) nukleinsyroma som visas i Sekv. ID nr. 5 eller en nukleinsyrasekvens som är komplementär därtill, b) nukleinsyror som hybridiserar under stringenta betingelser med en av nukle- insyrorna från a) som kodar för en polypeptid som visar att åtminstone 75% homologi med polypeptiden enligt Sekv. ID nr. 6 eller c) sekvenser som på grund av den genetiska kodens degenererade natur kodar för IIP-10-polypeptider som har aminosyrasekvensen enligt polypeptiderna som kodas av sekvensema enligt a) och b). cDNA för IIP-10 kodar för ett nytt protein av 226 aminosyror med en beräknad mo- lekylvikt på 25 697. IIP-lO är ett lysinrikt protein (11%). IIP-lO innehåller ett N- glykosyleringsstålle, flera N-myristoyleringsställen, Ck2 och PKC fosforyleringsstäl- len, ett tyrosinkinasfosforyleringsställe och en förmodad nukleär lokaliseringssigrial (Fig. 5). cDNA-sekvensen av IIP-lO visar 65% homologi med cDNA-sekvensen från Gallus Gallus tymocytprotein cthy28kD (EMBL åtkomstnr. GG34350). Aminosyra- sekvenserna för IIP-10 och cthy28kD visar 70% identitet. Nt 383 till nt 584 av IIP- lO cDNA är 94% identiska med ett partiellt cDNA beskrivet i WO 95/ 14772 (human gensignatur HUMGS06271; åtkomstnr. T24253). Genom immunofluorescens visar flagmârkt IIP- 10 både en cytoplasmisk och en nukleär lokalisation i NlH3T3-celler som överuttrycker IGF- 1-receptorn.Vidare visade jäst två-hybridanalys att IIP- 10 interagerar på fosforyleringsberoende sätt med IGF- l-receptorn. IIP- 10 interagerar inte med insulinreceptorn. Deletionsanalys av IIP- 10 visade att aminosyra 19 till aminosyra 226 år tillräckliga för bindning till IGF- 1-receptorn.

"Interaktion eller bindning mellan IIP-lO och IGF -1-receptorn" avser en specifik bindning av IIP-10-polypeptiden till IGF- l-receptorn men inte till kontrollproteiner såsom lamin i jäst två-hybridsystemet. Specifik bindning till IGF- 1-receptorn kan demonstreras med användning av glutation-S-transferas (GST)-IIP-fusionsproteiner som uttrycks i bakterier och IGF-l-receptorer som uttrycks i dåggdjursceller. Vida- re kan en association mellan ett Flag-märkt lIP-lO-fusionsprotein (jfr. Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176) och IGF- l-receptorn övervakas i dåggdjurscellsy- u u ~ . .- 523 013 »i 5 stem. För detta ändamål används eukaryota expressionsvektorer för att transfekte- ra respektive cDNA. Interaktion mellan proteinerna visualiseras genom sam- immun0precipitationsexperiment eller subcellulära lokalisationsstudíer med an- vändning av anti-Flag eller anti-IGF- 1-receptorantikroppar.

Vidare tillhandahåller uppfinningen prover och primrar för generna enligt uppfin- ningen såväl som nukleinsyror som kodar för antigena determinanter av genpro- dukterna enligt uppfinningen. Följaktligen innefattar föredragna utföringsforrner nukleinsyror med företrädesvis 10 till 50, eller mer föredraget 10 till 20 konsekutiva nukleotider av de beskrivna sekvenserna.

Termen "nukleinsyra" avser en polynukleotid som exempelvis kan vara ett DNA, RNA eller derivatiserat aktivt DNA eller RNA. DNA och rnRNA-molekyler föredras emellertid.

Termen "hybridiserar under stringenta betingelser" avser att två nukleinsyrafrag- ment har förmåga till hybridisering med varandra under standardhybridiseringsbe- tingelser som beskrivs i Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA.

Närmare bestämt avser "stringenta betingelser" som används här hybridisering i 5,0 x SSC, 5 x Denhardt, 7% SDS, 0,5 M fosfatbuffert pH 7,0, 10% dextransulfat och 100 ug/ ml laxsperma-DNA vid cirka 50-68°C, följt av två tvättsteg med l x SSC vid 68°C. Vidare kan temperaturen i tvättsteget ökas från låga stringensbetingelser vid rumsternperaturer, cirka 22°C, till höga stringensbetingelser vid cirka 68°C.

Vidare innefattar uppfinningen rekombinanta expressionsvektorer som är lämpliga för expression av lIP- 10, rekombinanta värdceller transfekterade med sådana ex- pressionsvektorer, såväl som ett förfarande för rekombinant produktion av ett pro- tein som kodas av lIP- IO-genen.

Uppfinningen innefattar dessutom syntetiska och rekombinanta polypeptider som kodas av nukleinsyrorna enligt uppfinningen och företrädesvis kodas av DNA- sekvensen som visas i Sekv. ID nr. 5 såväl som peptidomimetika baserade därpå. - . . - .- ' 523 013 u - u » -n 6 Sådana peptidornimetika har en hög affinitet för cellmembraner och tas snabbt och enkelt upp av cellerna. Peptidomimetika är företrädesvis föreningar som härstam- mar från peptider och proteiner och erhålls genom strukturell modifikation med användning av icke-naturliga aminosyror, konformationsbegränsningar, isosterisk placering, cyklisering etc. De är företrädesvis baserade på 24 eller färre, företrädes- vis 20 eller färre, aminosyror, varvid en bas av cirka 12 aminosyror föredras i syn- nerhet.

Polypeptiderna och peptidomimetika kan definieras genom deras motsvarande DNA-sekvenser och genom aminosyrasekvenserna härledda därur. Den isolerade IIP-polypeptíden kan förekomma i naturliga allela variationer som skiljer sig från individ till individ. Sådana variationer av aminosyrorna är vanligen aminosyrasub- stitutioner. Emellertid kan de också vara deletioner, insättningar eller additioner av aminosyror till den totala sekvensen som leder till biologiskt aktiva fragment. IIP- proteinet enligt uppfmningen - beroende, både med hänsyn till graden och typen, på cellen och celltypen i vilken det uttrycks - kan vara i glykosylerad eller icke- glykosylerad form. Polypeptider med tumorisid och /eller metastatisk aktivitet kan enkelt identifieras genom en tumörprogressionsinhibitions-analys med användning av karcinomceller som uttrycker polypeptider och mätning av proliferationskapaci- teten och apoptos i förhållande till karcinomceller som inte uttrycker nämnda poly- peptider.

"Polypeptid med IIP- lO-aktivitet eller IIP- 10" avser därför proteiner med mindre aminosyravariationer men med väsentligen samma aktivitet som IIP- 10. Väsentligen samma avser att aktiviteterna har samma biologiska egenskaper och polypeptider- na visar åtminstone 75% homologi (identitet) i aminosyrasekvenser med IIP- 10. Mer föredraget är aminosyrasekvenserna åtminstone 90% identiska. Homologi enligt uppfinningen kan bestämmas med hjälp av dataprograrrunen Gap eller BestFit (University of Wisconsin; Needleman och Wunsch, J. Biol. Chem. 48 (1970) 443- 453; Smith och Waterrnan, Adv. Appl. Math 2 (1981) 482-489).

Andra IIP:er enligt, och som används av, uppfinningen är i synnerhet: - - . . .~ 523 013 7 IIP-l Ett cDNA som kodar för ett IGF- 1-receptorinteragerande protein som betecknades IIP-1 (Sekv. ID nr. 1) isolerades. cDNA för IIP-1 kodar för ett nytt protein av 333 aminosyror med en beräknad molekylvikt av 35 727. IIP-l är ett glycinrikt protein (13%). IIP-l innehåller flera N-myristoyleringsställen, PKC och CkQ-fosforylerings- ställen och två förmodade nukleära lokalisationssignaler. En andra i isoform, IIP-1 (p26), av 236 aminosyrors längd med en beräknad molekylvikt av 26 071 identifie- rades som förmodligen bildades genom alternativ splitsning (Fig. 3). Båda isoformer binder till IGF- 1-receptorn. cDNA-sekvenser för IIP- 1 har rapporterats tidigare (Databas EMBL nr. AF0898 18 och AFO61263; DeVries, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 12340- 12345). Två överlappande cDNA-kloner (Fig. 4) identifierades som visar hög homo- logi med humant TIP-2 partiellt cDNA (GenBank åtkomstnr. AFO28824) (Rousset, R., et al., Oncogene 16 (1998) 643-654) och betecknades IIP-la och IIP-lb. IIP-la- cDNA:t motsvarar nt 1 17 till 751 av TIP-2. IIP- lb-cDNA:t visar förutom TIP-2- sekvenser (nt 1 till 106) ytterligare 5'-sekvenser som är homologa med sekvens Y2H35 av WO 97/27296 (nt 25 till 158).

IIP- la och IIP-lb har båda sekvensen som kodar för PDZ-domänen av TIP-2 (nt 156 till 410) som är en känd protein-proteinínteraktionsdomän (Ponting, C.P. et al., BioEssays 19 (1997) 469-479). Genom deletionsanalys bestämdes PDZ-domänen som den essentiella och tillräckliga IGF- l-receptorbindande domänen av IIP-1 (Fig. 4).

Ytterligare jäst två-hybridanalys visar att bindningen av IIP-1-proteinet till IGF- 1- receptorn är specifik för denna tyrosinkinasreceptor. Ingen interaktion sågs till in- sulinreceptorn eller Ros. Tyrosinkinasreceptorer av andra familjer interagerade inte med IIP-1 (t.ex. Met, Ret, Kit, Fms, Neu, EGF-receptor). Således är IIP-1 sannolikt det första interaktionsproteinet som visats vara specífikt för IGF-l- tyrosinkinasreceptorn. IIP- 1 binder också till den kinasinaktiva mutanten av IGF- l- receptorn. - - ~ » »- 523 013 8 IIP-2 IIP-2 identifierades som en ny bindare av den cytoplasmatiska delen IGF- 1- receptorn som motsvarar human APS (EMBL åtkomstnr. HSAB520). APS har tidiga- re isolerats i en jäst två-hybridscreen med användning av den onkogena c-kit- kinasdomånen som bete (Y okouchi, M., et al., Oncogene 15 (1998) 7-15). IIP-2 in- teragerar med IGF- l-receptorn på ett kinasberoende sätt. Bindning av IIP-2 obser- verades också till andra medlemmar av insulinreceptorfarniljen (insulinreceptor, Ros) men inte till en orelaterad tyrosinkinasreceptor (Met). Regionen av IIP-2 som befanns interagera med IGF- l-receptorn motsvarar human APS (nt 1126 till 1674, EMBL åtkomstnr. ABOO0520) innehåller SHZ-domänen av APS (nt 1249 till 1545).

IIP-3 IIP-3 isolerades som ett nytt IGF- 1-receptorinteragerande protein och år identiskt med PSM (GenBank åtkomstnr. AFO20526). PSM år känd som ett PH och SH2- domän innehållande signaltransduktionsproteiri som binder till den aktiverade in- sulinreceptom (Riedel, H., et al., J. Biochem. 122 (1997) 1105-1113). En variant av PSM har också beskrivits (Riedel, H., et al., J. Biochem. 122 (1997) 1105-11 13).

Bindning av IIP-3 till IGF- 1-receptom är beroende på tyrosylfosforylering av recep- tom.

En cDNA-klon som motsvarar nt 1862 till 2184 av den varianta formen av PSM identifierades. Den isolerade cDNA-klonen visade sig koda för IGF- 1- receptorbindningsregionen. SH2-domånen av PSM (nt 1864 till 2148, EMBL åt- komstnr. AF020526) kodas av sekvensen av IIP-3 partiella cDNA-klonen som isole- rades.

IIP-4 IIP-4 isolerades som ett nytt interagerande protein av den cytoplasmatiska domä- nen av IGF-1-receptorn. IIP-4 motsvarar p59fyn, ett src-liknande tyrosinkinas (EMBL åtkomstnr. MMU70324 och humant fyn EM_HUM1:HS66H 14) (Cooke, M.P. och Perlmutter, RM., New Biol. 1 (1989) 66-74). IIP-4 binder på ett kinasberoende sätt till IGF- l-receptorn och till flera andra tyrosinkinasreceptorer såsom insulinre- ceptorn och Met. Regionen av IIP-4 som interagerar med IGF- l-receptorn (nt 665 till 1044) innehåller SH2-domänen av p59fyn (EMBL åtkomstnr. U70324). o . - ~ .- ~ . ~ . .- S23 013 IIP-5 IIP-5 isolerades som ett nytt IGF-1-receptorinteragerande protein. IIP-5 visar en hög homologi med zinkfingerproteinet Zfp38 (EMBL åtkomstnr. MMZFPTA) och är åt- minstone 80% homolog med den motsvarande humana genen. Zfp-38 är känd som en transkriptionsfaktor (Chowdhury, K., et al., Mech. Dev. 39 (1992) 129- 142). IIP-5 interagerar exklusivt med den aktiverade och fosforylerade IGF- l-receptorn men inte med en kinasinaktiv mutant. Förutom bindning av IIP-5 till IGF- 1-receptorn observerades interaktion av IIP-5 med tyrosinreceptorer av insulinreceptorfamiljen (insulinreceptor, Ros). IIP-5 binder inte till den mer avlägset besläktade tyrosinki- nasreceptorn Met.

En cDNA-klon som binder till IGF-l-receptorn som kodar för nt 756 till 1194 av Zfp38 (EMBL åtkomstnnMMZFPTA) och innehåller det första zinkfingret (nt 1075 till 1158) isolerades. Denna domän är tillräcklig för bindning till den aktiverade IGF-1-receptorn.

IIP-6 IIP-6 identifierades som ett nytt IGF- l-receptorinteragerande protein. IIP-6 visar ringa likhet med zinkfingerdomänen av Zfp29 (EMBL åtkomstnr. MMZFP29). Zfp29 består av en N-terminal transkriptionsaktiveringsdomän och 14 C-terrninala Cys2His2-zinkfingrar (Denny, P., och Ashworth, A., Gene 106 (1991) 221-227).

Bindning av IIP-6 till IGF-1-receptorn beror på fosforylering av IGF-l-receptorkinas.

IIP-6 binder också till insulinreceptorn men interagerar inte med Met. Regionen av IIP-6 som befunnits interagera med IGF-1-receptorn (Sekv. ID nr. 3, Sekv. ID nr. 4) innehåller två zinkñngerdomäner av Cys2His2-typ.

IIP-7 IIP-7 isolerades som ett nytt IGF-1-receptorinteragerande protein som motsvarar Pax-ß (EMBL åtkomstnr. MMPAXBR och humant Pax3 EM-HUM2:S69369]. Pax-S känt som ett DNA-bindande protein som uttrycks under tidig embryogenes (Goul- ding, M.D., et al., EMBO J. 10 (1991) 1135-1147). IIP-7 binder på ett fosforylerings- beroende sätt till IGF-l-receptorn. IIP-7 interagerar också med insulinreceptorn och Met. En partiell IIP-7-cDNA-klon visade sig klona för den IGF-l-receptorbindande - . - - .- 523 013 10 domänen av Pax3 (nt 815 till 1 199, EMBL åtkomstnr. MMPAXSR). Denna region innehåller den Pax3-parade domänoktapeptiden (nt 853 till 876) och homeodomä- nen (nt 952 till 1134) av parad typ.

IIP-8 IIP-8 kodar för fullängds-cDNA av Grb7 (EMBL åtkomstnr. MMGRB7P, humant Grb7 EM_HUMl:AB008789). Grb7, en pH-domän och en SHS-domän som innehål- ler signaltransduktionprotein, publicerades först som ett IGF-1-receptorbindande protein (Margolis, B.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 8894-8898). IIP-8 interagerar inte med den kinasinaktiva mutanten av IGF- l-receptorn. Bindning av IIP-8 till flera andra tyrosinkinasreceptorer (t.ex. insulinreceptor, Ros och Met) ob- serverades också.

IIP-9 IIP-9 identifierades som ett nytt IGF-1-receptorinteraktionsprotein. IIP-9 är identisk med nck-beta (EMBL åtkomstnr. AFO43260). Nck är ett cytoplasmiskt signaltrans- duktionsprotein bestående av SI-I2- och SH3-domäner (Lehmann, J .M., et al., Nuc- leic Acids Res. 18 (1990) 1048). IIP-9 interagerar med IGF-1-receptorn på ett fosfo- ryleringsberoende sätt. Nck binder till den region av IGF- l-receptom som ligger in- till membranet. Förutom bindning av IIP-9 till IGF- 1-receptom, sågs också interak- tion med insulinreceptom men inte med Ros eller Met.

Ett föredraget mål för uppfmningen är polypeptider som är homologa, och mer före- draget, polypeptider som är väsentligen identiska med polypeptiderna enligt Sekv.

ID nr. 6 (IIP-10). Homologi kan undersökas med användning av FastA-algoritmen beskriven av Pearson, W.R., Methods in Enzymology 183 (1990) 63-68, Academic Press, San Diego, US. Med "väsentligen identisk" avses en aminosyrasekvens som endast skiljer sig med konservativa aminosyrasubstitutioner, t.ex. substitutioner av en aminosyra istället för en annan av samma klass (t.ex. valin istället för glycin, arginin istället för lysin, etc.) eller genom eller flera icke-konservativa aminosyra- substitutioner, deletioner eller insättningar belägna vid positioner av aminosyrase- kvensen som inte förstör polypeptidens biologiska funktion. Detta innefattar sub- stitution av alternativa kovalenta peptídbindningar i polypeptiden. Med "polypeptid" avses godtycklig kedja av aminosyror oberoende av längd eller posttranslationell .... .- . . » . .n 523 013 ll modifikation (t.ex. glykosylering eller fosforylering) och kan användas utbytbart med termen "protein".

Enligt uppfmningen avser "biologiskt aktivt fragment" ett fragment som kan utöva en fysiologisk effekt på det naturligt förekommande fullängdsproteinet (t.ex. bind- ning till dess biologiska substrat, orsakande av ett antigent svar etc.).

Uppfinningen innefattar också fragment av polypeptiden enligt uppfinningen som är antigena. Termen "antigen" som används här avser fragment av proteinet som kan inducera ett specifikt immunogent svar, t.ex. ett immunogent svar som ger an- tikroppar vilka specifikt binder till proteinet enligt uppfinningen. Fragmenten är företrädesvis åtminstone 8 aminosyror och företrädesvis upp till 25 aminosyror långa. I en föredragen utföringsform innefattar fragrnenten domänen som är ansva- rig för bindning av IIP:ema till IGF- l-receptorn (dvs. PDZ-domänen av IIP-1). Med "domän" avses den region av aminosyror i ett protein som är direkt inblandade i interaktionen med dess bindningspartner. PDZ-domäner är cirka 90 rester upprep- ningar som finns i ett antal proteiner som är inblandade i jon-, kanal och receptor- klusterbildning och länkning av receptorer till effektorenzymer. Sådana PDZ be- skrivs i allmänhet av Cabral, J.H., et al., Nature 382 (1996) 649-652.

Uppfinningen innefattar vidare en metod för att producera ett protein enligt uppfin- ningen vars expression eller aktivering är korrelerad med tumörproliferation, genom att uttrycka ett exogent DNA i prokaiyota eller eukaryota värdceller och att isolera det önskade proteinet eller att uttrycka det exogena DNA:t in vivo för farmaceutiska ändamål, varvid proteinet företrädesvis kodas av en DNA-sekvens som kodar för IIP- 10, företrädesvis DNA-sekvensen som visas i Sekv. ID nr. 5.

Polypeptidema enligt uppfinningen kan också produceras rekombinant eller synte- tiskt. Icke-glykosylerad IIP-10-polypeptid erhålls när den produceras rekombinant i prokaryoter. Med hjälp av nukleinsyrasekvenser som tillhandahålls av uppfinning- en är det möjligt att söka efter IIP-10-genen eller dess varianter i genomer från godtyckliga önskade celler (t.ex. förutom humana celler, också i celler från andra däggdjur) för att identifiera dessa och isolera den önskade genen som kodar för IIP- lO-proteinet. Sådana förfaranden och lärnpliga hybridiseringsbetingelser (se också .... .q . - o » ..- 523 013 12 ovan, "stringenta betinge1ser") är kända för fackmannen på teknikområdet och har t.ex. beskrivits av Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nevv York, USA och Harnes, B.D., Higgins, S.G., Nucleic acid hybridisation - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England. I detta fall används vanligen standard protokollen som beskrivs i dessa publiceringar för experimenten.

Användning av rekombinant DNA-teknologi möjliggör produktion av flera aktiva IIP- 10-derivat. Sådana derivat kan t.ex. modifieras i individuella eller flera aminosyror genom substitution, deletion eller addition. Derivatiseringen kan exempelvis utföras genom siteriktad mutagenes. Sådana variationer kan enkelt utföras av fackrnannen på teknikområdet (J. Sambrook, B.D. Hames, loc. cit.). Det behöver endast säker- ställas med hjälp av nedan angivna tumörcellstillväxtinhibitionsanalys att de ka- raktäristiska egenskaperna hos IIP- 10 bevaras.

Med hjälp av sådana nukleinsyror som kodar för ett IIP-10-protein, kan proteinet enligt uppfinningen erhållas på ett reproducerbart sätt och i stora mängder. För expression i prokaryota eller eukaryota organismer, såsom prokaryota värdceller eller eukaryota värdceller, integreras nukleinsyran i lärnpliga expressionsvektorer, enligt metoder som är kända för fackmannen på teknikområdet. En sådan expres- sionsvektor innehåller företrädesvis en reglerbar/inducerbar promotor. Dessa re- kombinanta vektorer introduceras därefter för expression i lärnpliga vårdceller så- som t.ex. E. coli som en prokaryot värdcell eller Saccharomyces cerevisiae, terato- karcinomcellinje PA-1 sc 9117 (Büttner et al., Mol. Cell. Bio. 11 (1991) 3573-3583), insektsceller, CHO- eller COS-celler såsom eukaryota värdceller och de transforme- rade eller transducerade värdcellerna odlas under betingelser som möjliggör expres- sion av den heterologa genen. lsoleringen av proteinet kan utföras enligt kända metoder från värdcellen eller från kultursupernatanten från värdcellen. Sådana metoder beskrivs t.ex. av Ausubel I., Frederick M., Current Protocols in Mol. Biol. (1992), John Wiley Sn Sons, New York. Dessutom kan reaktivering av proteinet vara nödvändig om den inte finns i löslig form i cellkulturen.

Därför avser uppfinningen vidare en IIP-polypeptid som är en produkt från prokary- ot eller eukaryot expression av ett exogent DNA. nnnn n. . - o u nu 523 013 13 Proteinet kan isoleras från cellerna eller kultursupernatanten och renas genom kromatografiska medel, företrädesvis genom jonbytarkromatografi, affinitets- kromatografi och / eller omvänd fas HPLC.

IIP- 10 kan renas efter rekombinant produktion genom affinitetskromatografi med användning av kända proteinreningstekniker, innefattande immunoprecipitation, gelfiltrering, jonbytarkromatografi, kromatofokusering, isoelektrisk fokusering, se- lektiv precipitation,elektrofores och liknande.

Diagnostiska metoder: Uppfinningen innefattar vidare en metod för att detektera en nukleinsyrarnolekyl som kodar för en IIP-gen, innefattande att inkubera ett prov (t.ex. kroppsvätskor såsom blod, cellysat) med en nukleinsyramolekyl enligt uppfinningen och att be- stämma hybridisering under stringenta betingelser av nukleinsyramolekylen till en målnukleinsyramolekyl för bestämning av närvaron av en nukleinsyramolekyl som är nämnda IIP-gen och därför en metod för identifiering av IGF- lR-aktivering eller inhibition i däggdjursceller eller kroppsvåtskor.

Följaktligen innefattar uppfinningen också en metod för detektion av proliferations- potentialen hos en tumörcell innefattande a) att inkubera ett prov av kroppsvåtska från en patient som har cancer, ett prov av cancerceller, eller ett prov av ett cellextrakt eller en cellkultursupernatant från cancercellerna, varvid provet innehåller nukleinsyror med en nukleinsyr- aprobe som är selekterad från gruppen bestående av (i) nukleinsyror som visas i Sekv. ID nr. 1, 3 eller 5 eller en nukleirisyra som är komplementär därtill och (ii) nukleinsyror som hybridiserar under stringenta betingelser med en av nukleinsyrorna från (i) och ---- n» ø ~ . - oo 523 013 14 b) att detektera hybridísering med hjälp av en ytterligare bindningspartner för nukleinsyran från provet och / eller nukleinsyraproben eller genom röntgenra- diografi.

Hybridisering mellan proben och nukleinsyrorna från provet indikerar närvaro av RNA från sådana proteiner. Dessa metoder är kända för fackmannen på teknikom- rådet och har t.ex. beskrivits i WO 89/ 06698, EP-A 0 200 362, USP 2915082, EP- A 0 063 879, EP-A 0 173 251, EP-A O 128 018.

I en föredragen utföringsform av uppfinningen amplifieras den kodande nukleinsy- ran i provet före testet, t.ex. med hjälp av den kända PCR-tekniken. Vanligen an- vänds en derivatiserad (märkt) nukleinsyraprobe inom ramarna för nukleinsyradia- gnostik. Denna probe förs i kontakt med ett denaturerat DNA eller RNA från provet som är bundet till en bärare och i denna process väljs temperaturen, jonstyrkan, pH och andra buffertbetingelser - beroende på längden och sammansättningen av nukleinsyraproben och den resulterande smälttemperaturen av den förväntade hy- briden - så att det märkta DNA:t eller RNA:t kan binda till homologt DNA eller RNA (hybridisering se även Wahl, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 3683- 3687). Lämpliga bärare är membran eller bärarmaterial baserade på nitrocellulosa (t.ex. Schleicher och Schüll, BA 85, Amersham Hybond, C.), förstärkt eller bundet nitrocellulosa i pulverforrn eller nylonmembran derivatiserat med olika funktionella grupper (t.ex. nitrogrupper) (t.ex. Schleicher och Schüll, Nytran; NEN, Gene Screen; Amersham l-lybond M.; Pall Biodyne).

Hybridiserande DNA eller RNA detekteras därefter genom inkubering av bäraren med en antikropp eller antikroppsfragment efter noggrann tvättning och mättning för att förhindra ospecifik bindning. Antikroppen eller antikroppsfragmentet är rik- tat mot substansen som införlivats under derivatisering in i nukleinsyraproben.

Antikroppen är i sin tur märkt. Emellertid är det också möjligt att använda direkt märkt DNA. Efter inkubering med antikropparna tvättas den igen i syfte att endast detektera specifikt bundna antikroppskonjugat. Bestärnningen utförs därefter enligt kända metoder med hjälp av markören på antikroppen eller antikroppsfragmentet.

Detektionen av expressionen kan utföras såsom t.ex.: a .... nu 523 013 -r - . | | .o 15 - in situ-hybridisering med fixerade hela celler, med fixerade vävnadsutstryk och isolerade metafaskromosomer, - kolonihybridisering (celler) och plackhybridisering (fager och virus), - Southern-hybridisering (DNA-detektion), - Northern-hybridisering (RNA-detektion), - serumanalys (t.ex. celltypanalys av celler i serum genom slot-blot-analys), ~ efter amplífiering (t.ex. PCR-teknik).

Företrädesvis inkuberas nukleinsyraproben med nukleinsyran i provet och hybridi- seríng detekteras valfritt med hjälp av en ytterligare bindningspartner för nuklein- syran i provet och /eller nukleinsyraproben.

Nukleinsyrorna enligt uppfinningen är således värdefulla prognostiska markörer vid diagnos av den metastatiska och progressionspotentialen hos tumörceller från en patient.

Screening fór antagonister och agonister av llPzer eller inhibitorer Enligt uppfinningen kan antagonister av IIP- 10 eller irihíbitorer för expression av IIP (t.ex. antisensenukleinsyror) användas för att inhibera tumörprogression och ge upphov till massiv apoptos av tumörceller in vivo, företrädesvis genom somatisk genterapi.

Följaktligen avser föreliggande uppfinning också metoder för screening av potenti- ella terapeutiska medel för cancer, diabetes, neurodegenerativa rubbningar, ben- sjukdomar, metoder för behandling av sjukdom och cellinjer och djurmodeller som år användbara för screening och utvärdering av potentiellt användbara terapier för sådan sjukdom. Därför är ett annat syfte för uppfinningen metoder för att identifie- ra föreningar som är användbara vid behandling av ovan nämnda och besläktade sjukdomar. Dessa metoder innefattar metoder för att modulera expression av poly- peptiderna enligt uppfinningen, metoder för att identifiera föreningar som selektivt kan binda till proteinerna enligt uppfinningen och metoder för att identifiera före- ningar som kan modulera aktiviteten hos nämnda polypeptider. Dessa metoder kan - . . u .- 523 o13 16 utföras in vitro och in vivo och kan använda de transformerade cellinjerna och transgena djurrnodellerna enligt uppfinningen.

En antagonist av IIP:er eller en inhibitor av IIP definieras som en substans eller fö- rening som inhiberar interaktionen mellan IGF- lR och IIP, företrädesvis IIP- 10.

Följaktligen minskar de biologiska aktiviteterna av IGF- IR i närvaro av en sådan förening. I allmänhet innefattar screeningsprocedurer för IIP-antagonister att föra kandidatsubstanser i kontakt med IIP-bärande värdceller under betingelser som är gynnsamma för bindning och mätning av graden av minskande receptormedierad signaler-ing (i fallet med en antagonist]. En sådan antagoníst är användbar som ett farmaceutiskt medel för användning vid tumörterapi. För behandling av diabetes, neurala sjukdomar eller bensjukdomar, krävs stimulering av den signalerande vä- gen, dvs. screening för agonister är användbart.

IIP-aktivering kan mätas på flera sätt. Vanligen är aktiveringen uppenbar genom en förändring i cellfysiologi såsom en ökning eller minskning i tillväxthastighet eller genom en förändring i differentieringstillståndet eller genom en förändring i cell- metabolismen som kan detekteras i standardcellanalyser, t.ex. MTT- eller XTT- analyser (Roche Diagnostics GmbH, Tyskland).

Nukleinsyrorna och proteinerna enligt uppfmningen kan därför också användas för att identifiera och utforma läkemedel som interferar med interaktionerna av IGF- lR och IIP:er. Exempelvis kan ett läkemedel som interagerar med ett av proteinema företrädesvis binda till detta istället för att tillåta bindning till dess naturliga mot- part. Godtyckligt läkemedel som binder till IGF-l-receptorn och, därigenom, för- hindrar bindning av en IIP, eller vice versa, binder till en IIP och därigenom förhind- rar bindning av IGF- l-receptorn. I båda fallen, moduleras signaltransduktion av IGF- l-receptorsystemet (företrädesvis inhiberas). Screening av läkemedel för denna förmåga ger genom att upprätta en kompetitiv analys (analys som är standard på teknikområdet) mellan testföreningen och interaktionen av IIP och IGF-l-receptorn och med användning av renat protein eller fragment med samma egenskaper som bindningspartnerna. - . . . .a .. u 1.; u-.z I__*'..", . . - o o. ~ v u. , ~ . n -~ ~ , .- n. . .. _ _ . : . . . . .... .. . . . . 17 Proteinet enligt uppfmningen är lämpligt för användning i en analysprocedur för identifiering av föreningar som modulerar aktiviteten hos proteiner enligt uppfin- ningen. Modulering av aktiviteten som beskrivs hår innefattar inhibition eller akti- vering av proteinet och innefattar direkt eller indirekt påverkan av den normala re- gleringen av proteinaktiviteten. Föreningar som modulerar proteinaktiviteten inne- fattar agonister, antagonister och föreningar som direkt eller indirekt påverkar re- gleringen av aktiviteten hos proteinet enligt uppfinningen. Proteinet enligt uppfin- ningen kan erhållas från både nativa och rekombinanta källor för användning i en analysprocedur för att identifiera modulatorer. I allmänhet kommer en analyspro- cedur för att identifiera modulatorer att innehålla IGF-receptorn, ett protein enligt föreliggande uppfinning och en testförening eller prov som innehåller en förmodad modulator av nämnda proteinaktivitet. Testföreningarna eller proven kan testas di- rekt på, t.ex. renat protein enligt uppfinningen, oberoende om det är nativt eller re- kombinant, subcellulära fraktioner av celler som producerar proteinet, oberoende om de är nativa eller rekombinanta, och/ eller hela celler som uttrycker proteinet, oberoende om de är nativa eller rekombinanta. Testföreningen eller provet kan till- sättas till proteinet enligt uppfinningen i närvaro eller frånvaro av kända modulato- rer för nämnda protein. Den modulerande aktiviteten hos testföreningen eller provet kan bestämmas genom t.ex. arialysering av förmågan hos testföreningen eller provet att binda till proteinet, aktivera proteinet, inhibera dess aktivitet, inhibera eller för- höja bindningen av andra föreningar till proteinet, modifiera receptorreglering eller att modifiera intracellulär aktivitet. ldentifieringen av modulatorer för proteinaktivitet är användbar vid behandling av sjukdomstillstånd innefattande proteinaktivitet. Andra föreningar kan vara använd- bara för att stimulera eller inhibera aktiviteten hos proteinet enligt uppfmningen.

Sådana föreningar kan användas vid behandling av sjukdomar i vilka aktivering eller inaktivering av proteinet enligt uppfinningen resulterar i antingen cellulär pro- liferation, celldöd, icke-proliferation, induktion av cellulära neoplasmiska transfor- mationer eller metastatisk tumörtillväxt och kan således användas vid förebyggande och/ eller behandling av cancrar såsom t.ex. prostata- och bröstcancer. Isolering och rening av en DNA-molekyl enligt föreliggande uppfinning kan vara användbart för att fastställa våvnadsdistributionen för proteinet såväl som för att upprätta ett 523 013 ¿::==¿::¿ .~'_:= 18 förfarande för att identifiera föreningar som modulerar aktiviteten hos proteinet och /eller dess expression.

Följaktligen är en ytterligare utföringsform av uppfinningen en metod för att scree- na en förening som inhiberar interaktionen mellan IGF- lR och IIP-l eller IIP- 10, innefattande a) att kombinera IGF~ lR och IIP- 1- eller IIP-10-polypeptid med en lösning inne- hållande en kandidatförening så att IGF-lR och IIP- 1- eller IIP-10-polypeptiden har förmåga att bilda ett komplex, och b) att bestämma mängden komplex i förhållande till den förutbestämda nivån av bindning i frånvaro av kandidatföreningen och därur utvärdera förmågan hos kandidatföreningen att inhibera bindning av IGF- 1R till IIP- 1- eller IIP- 10- polypeptid.

En sådan screeningsanalys utförs företrädesvis som en ELISA-analys varvid IGF- lR eller IIP-1 eller IIP- 10 är bundet på en fast fas.

En ytterligare utföringsform av uppfinningen är en metod för produktion av ett te- rapeutiskt medel för behandling av karcinom hos en patient, innefattande att kom- binera en terapeutiskt effektiv mängd av en förening som inhiberar interaktionen mellan IGF- lR och IIP i biokemiska och / eller cellulära analyser till en grad av åt- minstone 50%. Biokemiska analyser är företrädesvis ELISA-baserade analyser eller homogena analyser. I fallet med ELlSA-systemet används antikroppar specifika för de två bindningspartnerna för detektion av komplexen. I fallet med den homogena analysen är åtminstone en bindningspartner märkt med fluoroforer vilket möjliggör analys av komplexen. Cellulära analyser är företrädesvis analyser där tumörceller eller celler transfekterade med expressionskonstruktioner av IGF- IR och respektive bindningsproteiner behandlas med eller utan läkemedel varefter komplexbildning mellan de två komponenterna därefter analyseras med användning av standardcell- analyser. . ; - . .- u u n. nu e u u. .'°_ g . . s n. n _ I ~. .~ f ~ _ , .. ~ v, . I v - . 1 v z: 2,: . u . . ..- ° u -~ -II . . a - f. u 19 En föredragen utföringsform av uppfinningen är en metod för produktion av ett te- rapeutiskt medel för behandling av karcinom hos en patient, innefattande att kom- binera en farmaceutiskt accepterbar bärare med en terapeutiskt effektiv mängd av en förening som inhiberar interaktionen mellan IGF- IR och IIP-1 eller IIP- 10 i en cellulär analys, varvid i den cellulära analysen tumörceller eller celler transfektera- de med expressionskonstniktioner av IGF- lR och av respektive IIP behandlas med föreningen, och komplexbildning mellan IGF-IR och respektive IIP analyseras, var- vid graden av komplexbildning i fallet med inhibition inte överskrider 50% i förhål- lande till 100% för komplexbildning utan föreningen i samma cellulära analys.

En ytterligare utföringsforrn av uppfinningen är en metod för att behandla en pati- ent som har karcinom med en terapeutiskt effektiv mängd av en förening som inhi- berar interaktionen mellan IGF- lR och IIP-l eller IIP-10 i en cellulär analys, varvid i den cellulära analysen tumörceller eller celler transfekterade med expressionskon- struktionerna av IGF-IR och av respektive IIP behandlas med föreningen, och kom- plexbildning mellan IGF- IR och respektive IIP analyseras, varvid graden av kom- plexbildning i fallet med inhibition inte överskrider 50% i förhållande till 100% för komplexbildning utan föreningen i samma cellulåra analys.

En ytterligare utföringsform av uppfinningen är en antikropp mot IIP-1 eller IIP- 10 enligt uppfinningen.

Antikroppar bildades från humana, mus- eller råttpolypeptider. Antikroppar som specifikt känner igen IIP-l eller IIP- 10 innefattas i uppfmningen. Sådana antikrop- par tas fram med användning av irnmunologiska standardtekniker. Antikropparna kan vara polyklonala eller monoklonala eller kan produceras rekombinant såsom för en humaniserad antikropp. Ett antíkroppsfragment som bibehåller förmåga att interagera med IIP-l eller IIP- 10 tillhandahålls också. Ett sådant fragment kan pro- duceras genom proteolytisk klyvning av en fullångdsantíkropp eller produceras ge- nom rekombinanta DNA-procedurer. Antikroppar enligt uppfmningen är användba- ra i diagnostiska och terapeutiska tillämpningar. De anvånds för att detektera och kvantifiera IIP- 1 eller IIP- 10 i biologiska prov, i synnerhet vävnadsprov och kropps- vätskor. De används också för att modulera aktiviteten av IIP- 1 eller lIP-IO genom att verka som en agonist eller som en antagonist. . . . _ _ . . .. -. -- -1 _ _ _ , .. - . v» o. I " ' ~.~ o -. . .~~ .4- .an . ~ e " . . u- a . . . u o ~ I ° " _ ,, .. ~ . . ~ .- I O I I Û' ' 20 Följande exempel, referenser, sekvenslistning och ritning tillhandahålls för att un- derlätta förståelsen av föreliggande uppfinning, vars verkliga omfång anges i de bi- fogade kraven. Det är underförstått att modifikationer kan göras i procedurerna som anges utan att avvika från uppfinningens idé.

Figgrbeskrivning Fig. l Domänstruktur för jäst två-hybrid beten som användes för att screena cDNA-bibliotek för cytoblasmatiska bindningsproteiner av IGF-IR- receptorn. LexA-DNA-bindningsdomänen fuserades till den cytoplasmiska (cp) domänen (nt 2923 till 4154) av vildtyp-IGF-l-recptorn (a) eller den ki- nasinaktiva mutanten (K/A-mutation vid as 1003) (b) (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) 2503-2512; Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173- 176). Nukleotid- och arninosyrasekvensen för två olika linkers insatta mel- lan LexA-DNA-bindningsdomänen och receptordomänen visas nedan. Il (vt IGF-l-receptor) och Kl (kinasinaktiv mutant IGF- l-receptor) konstruktioner innehåller en ytterligare prolin och glycin jämfört med 12- och K2- konstruktionema.

Fig. 2 Modifikation av jäst två-hybrid LexA/IGF-l-receptorbeteskonstruk-tionen. a) Schematisk illustration av det cytoplasmatiska bindningsstället för IGF- 1-recpeptorn. d-subenheterna av IGF- l-receptorn är bundna till B- kedjorna via disulñdbindningar. Den cytoplasmatiska delen av ß-kedjan innehåller bindningsstållen för substrat intill membranet och den C- terminala domänen. b) Domånstruktur av två-hybrid betet som endast innehåller IGF- 1- receptorbindiiingsställena intill membranet. Domånen intill membranet av IGF-l-receptorn (nt 2923 till 3051) (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) (2503-2512) fuserades till kinasdomänen av ptrrnet (nt 3456 till 4229) (GenBank åtkomstnr. HSU 19348). c) Dornänstruktur för två-hybridbetet innehållande endast de C-terminala IGF- 1-receptorbindande ställena. Den C-terminala domänen av IGF-l- receptorn (nt 3823 till 4149) (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) (2503- 523 013 . . n o u 21 2512) fuserades till kinasdomånen av trpmet (nt 3456 till 4229) (Gen- Bank åtkomstnr. HSU 19348).

Fig. 3 Isoformer av IIP- l. a) Beskrivning av cDNA-sekvensema för IIP-l och IIP-1 (p26). Nukleotider- na år numrerade ovanför. Det potentiella translationsinitieringsstället inuti IIP-l cDNA är vid position 63. Det första ATG som potentiellt translationsinitieringsställe i den alternativa splitsningsvarianten IIP-1 (p26) är vid position 353. Båda cDNA innehåller stoppkodoner vid posi- tion 1062. b) Dornänstruktur för IIP-l och IIP-1 (p26). Aminosyrapositionerna anges ovanför. I jämförelse med IIP-1 (p26) innehåller IIP-1 ytterligare 97 arni- nosyror vid N-terminalen. Båda isoformerna av IIP-1 innehåller en PDZ- domän som spänner över en region mellan aminosyrorna 129 och 2 13.

Fig. 4 Beskrivning av IGF- l-receptorbindande domän av IIP- 1.

Fullängds-IIP- 1, dess partiella cDNA-kloner (IIP- la och IIP- lb) och dele- tionsmutanter (IIP- la/mu 1, IIP- la/mu2, IIP- la/ mu3, IIP- lb / mu 1) under- söktes för interaktion med IGF-l-receptorn i jäst två-hybridsystemet. J åst- celler samtransfekterades med en LexA IGF- 1-receptorfusionskons-truktion och en aktiveringsplasmid som kodar för IIP-1 eller de olika IIP-l- mutanterna fuserade till VPló aktiveringsdomänen. Interaktion mellan IIP- l eller dess mutanter och IGF- l-receptorn analyserades genom att övervaka tillväxt av jästtransfektanter utplattade på histidindeñcientmedium och in- kuberade under öd vid 30°C (diameter av jästkolonier: +++,> 1 mm på 2d, ++,> 1 mm på 4d; +, > l mm på 6d; -, ingen detekterad tillväxt). PDZ- domänen kan definieras som essentiell och tillräcklig för att mediera inter- aktionerna med IGF- l-receptorn. Nukleotidpositioner med hänsyn till fullångds-IIP-l anges ovanför.

Fig. 5 Proteinsekvensmotiv av IIP- lO.

Aminosyrasekvensen för IIP- lO analyserades med användning av datapro- grammet "Motifs" som letar för proteinmotiv genom att avsöka proteinse- S23 013 22 kvenser för regelbundna expressionsmönster beskrivna i PROSITE- uppslagsverket.

Sekv. ID nr. 1 Nukleotidsekvens för IIP-1 (cDNA).

Sekv. ID nr. 2 Förväntad aminosyrakevens för IIP-1.

Sekv. ID nr. 3 Nukleotidsekvens för IIP-6 partiell cDNA-klon.

Sekv. ID nr. 4 Härledd aminosyraskekvens för IIP-6 partiell cDNA-klon. Cystein- och histídinrester av de två CysgHisg-zinkfmgerdomänerna är ami- nosyrorna 72, 75, 88, 92, 100, 103, 116 och 120.

Sekv. ID nr. Nukelotidsekvens för IIP-10 (dCNA).

Sekv. ID nr. Härledd aminosyrasekvens för IIP- 10.

Sekv. ID nr. Primer TIP2c-s.

Sekv. ID nr. 8 Primer TIP2b-r.

Sekv. ID nr. 9 Primer Hcthy-s.

Sekv. ID nr. 10 Primer Hcthy-r.

EXEMPEL 1 Isolering och karaktärisering av IGF-IR bindningsproteiner Jäst två-hybridsystemet (Fileds, S. och Song, O., Nature 340 (1989) 245-246) an- vändes för att isolera okända cytosoliska IGF- 1-receptorbindningsproteiner. För screening användes en modifierad version av jäst två-hybridsystemet som möjliggör interkedjetyrosylfosforylering av receptorerna ijâst.

J äst två-hybridbetesplasrriiden (BTM116-cpIGF-1-receptor) konstruerades genom att fusera den cytoplasmatiska domänen av ß-subenheten hos IGF- l-receptorn (nt 2923 till 4154) (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) (2503-2512) till LexA DNA- bindningsdomänen som bildar dimerer och härmar situationen för den aktiverade vildtypreceptorn (jf. Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176). Genom att in- föra en prolin-glycinspacer mellan LexA DNA-bindande domänen och receptordo- . . . u »- . . - . .a n __ .. ..- .N a - . . . .

I". . 0 a ~ I j: : : z a u o ß i '_ . . . - . - - _ _ _ _ . . . . ..- =~,. a.. un. . a u n _ _ , . . c ' _ - _ . . n o ß- '*__ __ ,, » . - ~ .n - ~ . . - 23 månen ökade förmågan hos betet att binda kända substrat för IGF- 1-receptorn märkbart i jämförelse med andra spaceraminosyror (Fig. l).

Alternativt konstruerades ett bete innehållande endast regionen intill membranet eller den C-terminala regionen av lGF- l-receptorn (nt 2923 till 3051 eller nt 3823 till 4146) (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) (2503-2512) fuserade till kinasdomä- nen av en icke-relaterad, mycket potentiell tyrosinkinasreceptor. Här användes ki- nasdomånen av tprmet (nt3456 till 4229) (GenBank åtkomstnr. HSU 19348) (Fig. 2).

På detta sätt är det möjligt att beskriva regionerna av IGF-1-receptom som medie- rar bindning till nedströms belägna effektorer.

IGF-l-receptorbetesplasmiden användes för att screena aktíveringsdomân-CDNA- bibliotek (t.ex. VPl6- eller Gal4-baseradr aktiveringsdomäner) (if. Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176). Betes- och bytes (prey) -plasmiderna samtrans- fekterades i Saccharomyces cerevisiae-stam L40 innehållande HIS3- och lacZ- reportergen. Biblioteksplasmider isolerades från jästkolonier som växte på histidin- deficientmedium, sekvenserades och återinfördes i jäststam L40. Genom sam- transfekteringsexperiment med olika testbeten, dvs. BTM l lö-plasmid som kodar för en kinasinaktiv mutant av IGF- l-receptorn (L1033A) eller den cytoplasmatiska domänen av tyrosinkinasreceptorn av insulinreceptorfamiljen (insulinreceptor, Ros) och av icke-relaterade tyrosinkinasreceptorfamiljer (Met, EGF-receptor, Kit, Fms, Neu) utvärderades speciñciteten för de förrnodade bete-byte-interaktionerna. Flera cDNA identifierades som kodar för tidigare okända IGF- l-receptorinteragerande proteiner (IIP:er). Vidare fann man bindningsdomäner av kända substrat för lGF- 1- receptorn såsom den C-terminala SH2-domänen av p85PI3K och SH2-domänen av Grb 10. Resultaten visas i Tabell l. . - - » .- 523 o1si ---- .n 24 TABELL l IIP Wt IGF- lR mu IGF- lR IR Ros Met IIP- l + + - - - IIP-2 + - + + - IIP-3 + - + + + IIP-4 + - + eb + lIP-S + - + + - IIP-6 + - + eb - IIP-7 + - + eb + IIP-8 + - + + + IIP-9 + - + - - IIP- 10 + - - eb eb Beskrivning av bindningsspecificiteten för llPzerna med hänsyn till olika tyrosinki- nasreceptorer i jäst tvä-hybridsystemet. J ästceller saxntransfekterades med en LexA-fusionskonstruktion som kodar för de olika tyrosinkinasreceptorerna och en aktiveringsplasmid som kodar för de olika lIP:erna fuserade till VP16 aktiverings- domänen. Interaktion mellan IIP:erna och de olika tyrosinkinasreceptorerna analy- serades genom att man övervakade tillväxten av jästtransfektanter utplattade på histidindeficientmedium och inkuberade under 3d vid 30°C (vt IGF-IR, kinasaktív IGF-1-receptor; mu IGF- IR, kinasinaktiv mutant IGF-l-receptor; IR, insulinrecep- tor; Ros tyrosinkinasreceptor; Met, Met tyrosinkinasreceptor, +, tillväxt av jäst- transfektanter inom 3 dagar större än 1 mm i diameter; -, ingen detekterad tillväxt; eb, ej bestämt.

EXEMPEL 2 Analyssystem: A) In vitro/ biokemiska analyser: ELlSA-baserad/ homogen analys IGF- IR och bindningsproteinerna (IlP:erna) uttrycks med eller utan T ag-enzymer i E.coli eller eukaryota och renas till homogenitet. Interaktion av IGF- lR och respek- tive bindningsproteiner analyseras i närvaro eller frånvaro av läkemedel. Föreningar > n - . .. ._ -- Ill O Q li 'Û 4 n I I O _ :n- . . , . o :z z z 2 , . . . kr , .. -j :I ._ -.. . -. - --~ ... ... _ _ . . . - . _ . - __ g 1 : '.' .. .. .. .. -- -° 25 som antingen inhiberar eller befrämjar bindning av IGF- lR och respektive bind- ningsproteiner selekteras. I fallet med ELISA-systemet används antikroppar som år specifika för de två bindningspartnerna för detektion av komplexen. I fallet med den homogena analysen märks åtminstone en bindningspartner med fluoroforer som möjliggör anlays av komplexen. Alternativt används anti-Tag-antikroppar för att fastställa intreraktion.

B) Cellulära analyser: Tumörceller eller celler transfekterade med expressionskonstruktioner av IGF- IR och respektive bindningsproteiner behandlas med eller utan läkemedel och kom- plexbildning mellan de två komponenterna analyseras därefter med användning av standardanalyser.

EXEMPEL 3 cDNA-kloning av IIP-1 och IIP-IO (och RT-PCR-analys) Nukleotidsekvensen för fullängds-IIP-l alignerades med användning av databasin- formation (EST s) och sekvenser för de partiella cDNA-klonerna av IIP-1 (IIP- la, IIP- lb). cDNA som klonar för fullängds-IIP-1 utfördes genom RT PCR på total RNA iso- lerat från en MCFUDR-bröstcellinje. PT PCR med två oligonukleotidprimrar: TIP2c-s (Sekv. ID nr. 7) och TlP2b-r (Sekv. ID nr. 8) resulterade i arnplifiering av två DNA- fragment av 1,0 kb (IIP- 1) och 0,7 kb (IIP-1(p26)).

Nukleotidsekvensen för fu11ängds-IIP- 10 alignerades med användning av databas- information (ESTs) och sekvensen för den partiella cDNA-klonen av IIP- 10. cDNA- kloning av IIP- 10 utfördes på total-RNA isolerat från colon-cancercellinjen SW480.

RT PCR med två oligonukleotidprirnrar: Hcthy-s (Sekv. ID nr. 9) och Hcthy-r (Sekv.

ID nr. 10) resulterade i arnplifiering av ett cDNA-fragment av 676 bp (IIP-10).

DNA-sekvensering utfördes med användning av dideoxynukleotid- kedjetermineringsmetoden på ABI 373A-sekvenserare med användning av Ampli Taq® FS Dideoxyterminatorkítet (Perkin Elmer, Foster City, CA). Jämförelse av cDNA och de härledda proteinsekvenserna utfördes med användning av Advanced I Ditt O' .Û n. au.: O. .°'_ f", ,° Q - . z: 2 u u n _ . n . . . . . - - :_ 2,1 . . . . »- .s- --- u ~ ~ _ _ _ . . n ~ . i. o v 0 “_.' '__ ._ .. - . . Q .n . . . . 26 Blast Search (Altschul, S.F., et al., J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410; Altschul, S.F., et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997) 3389-3402).

EXEMPEL 4 Western blot-analys av IIP-1 och IIP-10 Totala cellysat framställdes i en buffert innehållande 50 mM Tirs pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxykolsyra, 0, 1% SDS och 1 mM EDTA pH och klarordes genom centrifugering under 15 minuter vid 4°C. Supernatantens proteinkoncentra- tion mättes med användning av Micro BCA Protein Assay Kit (Pierce Chamical Co., Rockford, IL) enligt tillverkarens manual. IGF-1-receptorer immunoprecipiterades med användning av anti-IGF- l-receptor-antikroppar (Santa Cruz). Proteiner frak- tionerades genom SDS-PAGE och överfördes elektroforetiskt till nitrocellulosfilter.

Nitrocellulosafilter förinkuberades med 10% (vikt / volym) fettfritt mjölkpulver i 20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,2% TWeen-20. Bindning av en mus-monoklonal antikropp riktad mot flagepitopen detekterades genom pepparrotsperoxidasmärkt get-anti-mus IgG antiserum (Biorad, München, Tyskland) och visualiserades med användning av ett förhöjt chemoluniscens-detektionssystem ECLTM (Amersham, Braunschweig, Tyskland).

EXEMPEL 5 Över-expression av IIP-1 till IIP-10 i däggdjursceller genom liposom- medierad transfektion cDNA för IIP-1 till -10 klonades i NotI-stâllet av pBAT-flag eller pcDNA3flag (Weid- ner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176; Behrens, J., et al., Nature 382 (1996) 638-642; Behrens, J., et al., Science 280 (1998) 596-599). NIH3T3-celler eller andra mottagarceller transfekterades med pcDNAflagIIP-l till - 10 eller alternativt med pBATflag IIP-1 till -10 med användning av FuGENEö (Roche Biochemícals) som transfektionsmedel. Celler selekterades i 0,4 mg / ml G4 18. Enskilda kloner plocka- des och analyserades för expression av IIP- 1 till - 10 och karaktäriserades funktio- nellt med hänsyn till proliferation. . n ~ . -n ' nn hc an. u... c :_". .°', , . a - a ß n 0 l 0 O l ' q I I ' , . . . - . - ~ j: I, , . - . . .u :w u. u. - - ~ _ .. . . . ~ . - -~ . . n n o fl .I _. __ ,, - . - - .- . . u v I * 27 Northern blöt-analys Northern blots med humana och murina mRNA från flera vävnader köptes från Clontech (Palo Alto, CA, US). En cDNA-probe som spänner över IIP- 10 nt343-nt676 av kodningsregionen märktes med DIG-dUTP med användning av PCR DIG märk- ningsmixen (Roche Diagnostics GmbH, Tyskland). En digoxygeninmärkt aktin-RNA- probe köptes från Roche Diagnostics GmbH, Tyskland. Hybridisering utfördes med användning av DIG EasyHyb hybridiseringslösningen (Roche Diagnostics GmbH, Tyskland). IIP- 10 mRNA detekterades med DIG-specifika antikroppar konjugerade till alkaliskt fosfatas och CSPD-substratet (Roche Diagnostics GmbH, Tyskland).

EXEMPEL 6 Detektion av mRNA i cancerceller I syfte att detektera huruvida proteiner uttrycks i cancerceller som kodas av nuk- leinsyror vilka hybridiserar med Sekv. ID nr. 1 eller Sekv. ID nr. 5 eller den kom- plementära sekvensen och följaktligen huruvida mRNA är närvarande, är det möj- ligt att å ena sidan utföra etablerade metoder för nukleinsyrahybridísering såsom Northern-hybridisering, in situ-hybridiseríng, dot- eller slot-hybridisering och dia- gnostiska tekniker härledda från dessa (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B.D., Higgins, S.G., Nucleic acid hybridisation - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England; WO 89 /06698; EP-A O 200 362; EP-A 0 063 879; EP-A 0 173 251; EP-A 0 128 018). Å andra sidan är det möjligt att använda metoder från den breda repertoaren av amplifieringstekniker med användning av specifika primrar (PRC Protocols - A Guide to Methods and Applications (1990), publ. M.A. Innis, D.H. Gelfand, J .J . Sninsky, T.J. White, Academic Press Inc.; PCR - A Practical Approach (1991), publ. MJ. McPherson, P. Quirke, G.R. Tay- lor, IRL Press).

RNAzt för detta isoleras från cancervävnaden genom metoden enligt Chomcs- zynski och Sacchi, Anal. Biochem. 162 (1987) 156-159. 20 pg total-RNA separe- rades på en 1,2% agarosformaldehydgel och överfördes på nylonmembran (Amersharn, Braunschweig, Tyskland) genom standardrnetoder (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Labora- ~ o a . »n 523 013 28 tory Press, New York, USA). DNA-sekvensen Sekv. ID nr. 1 eller Sekv. ID nr. 5 märktes radioaktivt som prober (Feinberg, A.P. och Vogelstein, B., Anal. Bio- chem. 137 (1984) 266-267). Hybridiseringen utfördes vid 68°C i 5 x SSC, 5 x Denhardt, 7% SDS / 0,5 M fosfatbuffert pH 7,0, 10% dextransulfat och 100 pg laxsperma-DNA. Därefter tvättades membranen två gånger under l timme var- dera i 1 x SSC vid 68°C och exponerades därefter för röntgenfilm.

EXEMPEL 7 Procedur fór identifiering av modulatorer av aktiviteten hos proteinet en- ligt uppfinningen Expressíonsvektorn enligt Exempel 5 (antingen för IIP-1 eller IIP-10 10 pg/ 106 celler) överförs till NIH3T3-celler genom standardmetoder kända på tekníkom- rådet (Sambrook et al). Celler som har tagit upp vektorn identifieras genom de- ras förmåga att växa i närvaro av selektion eller under selektiva betingelser (0,4 mg/ ml G4l8). Celler som uttrycker DNA som kodar för IlP producerar RNA som detekteras genom Northern blot-analys såsom beskrivits i Exempel 5. Alterna- tivt identifieras som uttrycker proteinet genom identifiering av proteinet genom Western blot-analys med användning av antikropparna beskrivna i Exempel 4.

Celler som uttrycker proteinet från expressionsvektorn kommer att uppvisa en föränrad morfologi och /eller förhöjda tillväxtegenskaper.

Celler som uttrycker protein och uppvisar en eller flera av de förändrade egen- skaperna beskrivna ovan odlas med och utan en förmodad modulatorförening.

Genom screening av kemiska och naturliga bibliotek, kan sådana föreningar identifieras med användning av cellulåra analyser med hög genommatning som övervakar celltillväxt (cellproliferationsanalyser vilka såsom kromogena substrat använder tetrazoliumsalterna WST- 1, MTT eller XTT eller en celldödsdetektion ELISA med användning av bromodesoxyuridin (BrdU); jf. Boehringer Mannheim GmbH, Apoptosis and Cell Proliferation, 2:a utgåvan, 1998, sidorna 70-84).

Modulatorföreningen kommer att ge upphov till en ökning eller en minskning i det cellulära svaret på llP-proteinaktivitet och kommer antingen att vara en aktivator eller en inhibitor av IGF- l-receptorfunktion. .... n» - - u Q »- 523 013 29 Alternativt tillsätts förmodade modulatorer till kulturer av tumörceller varvid celler- na uppvisar en förändrad morfologi och/ eller uppvisar minskade eller förhöjda till- växtegenskaper. En förmodad modulatorförening tillsätts till cellerna med och utan IlP-protein och ett cellulärt svar mäts genom direkt observation av cellernas morfologiska egenskaper och/ eller sä övervakas cellerna med avseende på tillväxt- egenskaper. Modulatorföreningen kommer att ge upphov till en ökning eller minsk- ning i det cellulära svaret på IIP-protein och kommer antingen att vara en aktivator eller en inhibitor av IGF- l-receptoraktivitet. a » o . u. ~ 523 013 30 REFERENSLI STA Altschul, 3.13., et al., I. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410 Altschul, S.F., et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997) 3389-3402 Ausubel 1., Frederick M., Current Protocols in Mol. Biol. (1992), Iohn Wiley and Sons, New York Bates et al., Br. I. Cancer 72 (1995) 1189-1193 Behrens, I., et al., Nature 382 (1996) 638-642 Behrens, I., et al., Science 280 (1998) 596-599 Boehringer Mannheim GmbH, Apoptosis and Cell Proliferation, 2nd edition, 1998, pp. 70-84 Burfeind et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 7263-7268 Büttner et al., Mol. Cell. Biol. 11 (1991) 3573-3583 Cabral, IH., et al., Nature 382 (1996) 649-652 Chomcszynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162 (1987) 156-159 Chowdhury, K., et al., Mech. Dev. 39 (1992) 129-142 Cooke, M.P., and Perlmutter, RM., New Biol. 1 (1989) 66-74 Database EMBL Nos. AFO89818 and A13061263 Denny, P., and Ashworth, A., Gene 106 (1991) 221-227 DeVries, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 12340- 12345 Dey, R.B., et al., Mol. Endocrinol. 10 (1996) 631-641 EP-A 0 063 879 EP-A 0128018 EP-A 0 173 251 EP-A 0 200 362 Feinberg, A.P., and Vogelstein, B., Anal. Biochem. 137 (1984) 266-267 Fields, S., and Song, O., Nature 340 (1989) 245-246 Goulding, M.D., et al., EMBO I. 10 (1991) 1135-1147 Hames, BD., Higgins, SG., Nucleic acid hybridisation - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England Harrington et al., EMBO I. 13 (1994) 3286-3295 He, \V., et al., BiOl. Chem. 271 (1996) 11641- 1 1645 Kalebic et al., Cancer Res. 54 (1994) 5531-5534 Kaleko et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990) 464-473 Lamothe, B., et al., FEBS Lett. 373 (1995) 51-55 Lehmann, I.M., et al., Nucleic Acids Res. 18 (1990) 10481 Margolis, BL., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1E192)8S9<1-8898 a ~ - . a» 523 013 i 31 Morrione et al., I. Virol. 69 (1995) 5300-5303 Morrione, A., et al., Cancer Res. 56 (1996) 3165-3167 Needleman and Wunsch, I. Biol. Chem. 48 (1970) 443-453 PCR - A Practical Approach (1991), publ. M.]. McPherson, P. Quirke, GR. Taylor, IRL Press Pearson, W.R., Methods in Enzymology 183 (1990) 63-68, Academic Press, San Diego, US Ponting, C.P., et al., BioEssays 19 (1997) 469-479 Prager et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 2181-2185 PRC Protocols - A Guide to Methods and Applications (1990), publ. MA. lnnis, DH.

Gelfand, I.I. Sninsky, T.I. White, Academic Press Inc.

Quinn et al., I. Biol. Chem. 271 (1996) 11477-11483 Resnicoffet al., Cancer Res. 54 (1994) 2218-2222 Resnicoff et al., Cancer Res. 54 (1994) 4848-4850 Resnicoff et al., Cancer Res. 55 (1995) 2463-2469 Resnicoffet al., Cancer Res. 55 (1995) 3739-3741 Riedel, H., et al., I. Biochem. 122 (1997) 1105-1113 Rocchi, S., et al., Endocrinology 137 (1996) 4944-4952 Rogler et al., I. Biol. Chem. 269 (1994) 13779-13784 Rousset, R., et al., Oncogene 16 (1998) 643-654 Sambrook et al., Molecu1ar Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA Sell et al., Cancer Res. 55 (1995) 303-305 Sell et al., Mol. Cell. Biol. 14 (1994) 3604-3612 Sell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 11217-11221 Singleton et al., Cancer Res. 56 (1996) 4522-4529 smnh and warefman, Aav. Appl. Mafh. 2 (1981) 482-489 Tartare-Decker, S., et al., Endocrinology 137 (1996) 1019-1024 Tartare-Deckert, S., et al., I. Biol. Chem. 270 (1995) 23456-23460 Trojan et al., Science 259 (1993) 94-97 Ullrich, A., et al., EMBO I. 5 (1986) 2503-2512 USP 2915082 Wahl, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 3683-3687 Wang, I., and Riedel, H., I. Biol. Chem. 273 (1998) 3136-3139 Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176 VVO 97/27296 . . . | .- 523 013. 32 WO 89/06698 WO 95/14772 Yokouchi, M., et al., Oncogene 15 (1998) 7-15 . » ~ ~ u» 523 o1sr :- 33 SEKVENSUSTNHWB <110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG <120> kodar för dessa och användning därav <140> <14l> <160> 10 <210> 1 <2l1> 1707 <212> DNA <2l3> HOmO <400> 1 gaaacccaca tcatgccgct ctgagccagg cggggnnccc tccacaccca aggagctgta gcaccctgaa aggacttcat aggatgcact tcaaggaggg ccattaacgg agctgecccg tgatcagcca gagggaccct tcgaagagaa acacggagct tggccgaggc acgtctsggg tgcgatgatg cccgagcctc gccaggcccc 999CCCCC99 9999a999aC gccaaactgg ctagtttcct taatgccctc tgacacgagt cccatccctg aatttgctgt <210> 2 <211> 333 <212> PRT FaH20273 EP98122992.5 1998- 12-03 PatentIn Ver. 2. sapiens ggaggcaacc 999aCt99Q9 CC9C99a999 ccaaatgggc gctggcccat tggcaagatc cacccacaaa cttcgcccac cgggctcacc cagcgtgatc gcagagcctg aggccgtacc gcgttcagcg gcggctccga ggccattgag ggcagccacc cctggacgaa cgccattggg acccgggcgc cagcctgagc ctgccccgct cccccctgtg cagccaaatt tccctctgtc 9aC9Ca999a acccctcctg ctgctgtgaa gcccagagca cttgaacata acactagttt cggcggaaaa CC999C9C99 ttncnccccc ggcagtccca gccgaggcct gtggacatgg 9t9aa9999C atcacggaca gaccacatcc ctgggctgcc ttcacgctga ggtggccgcc tcccggggcc aaggtggatg atggtggagc C99Ct999ï9 gacgccaagg aacctggtgg ctagctcagc ccactcggta ccctgttccc 999C99CCëC tccctggggc atacagggga agaggagccc ccccgcaacc 99a999a999 aagaatc agatcttctg aggcgccccc 999a9CCa99 ctcccccagc ctggccgcat tccgcctgcc acaagctcct agcgcaagga ëC9999CC99 acctcatcag ggcactacga agctcacgga ctggctctgg ccgccacggt acctgctgga tggâaaagga actttgcctt tcggccgcta gggcccccag agcccaagga Ccatcccctc cacctacctc ccccgcctcc cttgggttct gagggttgtc cctccctgtg tcctccccac a999aC9at9 IGF- l-receptorinteragerande proteiner (llPzer), gener som gtgaccccac tctagtggaa gcctctgggc cctgcggccc cgagggcttc aactgccgag 999999CCë9 99C99a99t9 ctacgccttc C9t999C9aC QQCQÉCCCQQ gcctcgcaag cccacaactg 99a99aïCt9 gagtcacatg caaaaggaac ccctgacgag ctaggactgc cagggacact Cgatggtgag cctggttccc agctgggtca accactttcc 9ïfiï99999t cttcccccca gagcctgtta Ctcccatctc 9C99裏ÉKï n.. n ttctcgctgc aafigaggagg 99a99fi999C cgcctcgtgt accaacgtca gtgatgttct atcgggctgg ttcaagtcgg atcaagcgca atgatcgagg ctgctcaagg gccttcgaca ggcactggcc ccctctgcct ggtatcaggg ccggatgagc ttcgtctttg ccccggaccc gacgtcagga 999a99t999 agtctggccg ggcacaggga accatcagct catgaccttc gcaaacgcaa cctccgcatt tccttccagg tttgtatctg 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 ,<_,\-, <213 > Homo sapiens <400> 2 Met 1 Asn Gly PIO Ala 65 Glu Val Leu Gly Leu 145 Lys Met Glu LEU Ser 225 Gly PIO Glu Glu Pro Glu Pro Pro SO His Leu Met Gly Gln 130 Thr Glu Ile Val Lys 210 Ala Thr Ser Sêï Leu 290 Leu Glu Leu 35 Pro Gly Tyr Phe Gly 115 Arg Ile Gly Gnlu Ala 195 Leu Gly Leu Ala Tyr 275 Gly Gly Ala 20 Gly Pro Ser Gly Cys 100 Gln Lys Thr Ser Ala 180 Arg Thr Gly Arg Phe 260 MCE Lys Leu 5 Glu Gly Ala PIO Lys 85 Thr Ile Glu Asp Val 165 Ile Leu Glu Arg Leu 245 Glu Gly Asp 523 Gly Pro Gly Leu Thr 70 Ile Leu Gly Val Asn 150 Ile Asn Leu Pro Pro 230 Arg Glu Ile Lys 39 Arg Gly Gly Arg S5 Gly Ala Asn Leu Glu 135 Gly Asp Gly Lys Arg 215 Gly Ser Lys Arg Arg 2 95 013 Arg Arg Ser 40 Pro Arg Glu Thr Glu 120 Val Ala His Gln Glu 200 Lys S81” Arg Ala Asp 280 Asn Lys Gly 25 Gly Arg Ile Ala His 105 Asp Phe Gly Ile SGI' 185 Leu Ala Gly Gly Ile 265 Thr Pro Lys 10 Gly Xaa Leu Glu Phe 90 Lys Phe Lys Tyr His 170 LSU Pro Phe Pro Pro 250 Glu Glu Asp Ala Leu Pro Val Gly 75 Arg Val Ile Ser Ala 155 Leu LEU.

Arg Asp Gln 235 Ala Lys Pro Gly Gln Phe 60 Phe Leu Asp Phe Glu 140 Phe Ile Gly Gly Met 220 Leu Thr Val Leu y- Glu Leu 300 Pro Val Met 45 His Thr Pro Met Ala 125 Asp Ile Ser Cys Arg 205 Ile Gly Val Asp Ala 285 Ala Leu Gly 30 Gly Thr Asn Thr Asp 110 His Ala Lys Val Arg 190 Thr Ser Thr Glu Asp 270 Thr Glu Val 15 Glu Xaa Gln Val Ala 95 Lys Val LGU Arg Gly 175 His Phe Gln Gly Asp 255 Leu Me t Ala Glu PID Xaa Leu Lys 80 Glu Leu Lys Gly Ile 160 Asp Tyr Thr Arg Arg 240 Leu Leu Val Leu 523 013 *~ 25' Asp Glu Arg Leu Gly Asp Phe Ala Phe Pro Asp Glu Phe Val Phe Asp 310 305 315 Val Trp Gly Ala Ile Gly Asp Ala Lys Val Gly Arg Tyr 325 <2l0> 3 <2ll> 380 <2l2> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gccgaggaag gagaaggggc taaaccttgg acacctcggg aggatcatgg gcaggagagc ccaaagacaa ggcagaaagt cactgcccaa tcaagcccag agacagatga gaagcttttt aatacctcca acctgagaac gcaccagcgg tccgagtgtg gcaagagttt ctcccggagc ctggaagana agcactctga <2l0> 4 <2ll> 126 <2l2> PRT <2l3> Homo sapiens <400> 4 Ala Glu Glu Gly Glu Gly Ala Lys l S Asp Ser Gln Ile Thr Pro Arg Glu 20 Ala Gly Leu His Gly Thr His Pro 35 40 Ala Gln Ala Gly Gly Pro Gly Asp SO 55 Thr Asp Glu Lys Leu Phe Ile Cys 65 70 Asn Thr Ser Asn Leu Arg Thr His 85 Pro Tyr Met Cys Ser Glu Cys Gly 100 Arg Ile Arg His Glu Arg Ile His 115 120 <2l0> 5 <211> 678 <2l2> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 330 agagtggatg ctgttggcag 9CC99a99CC atatgtgcgc atccacactg tccaaccgca Pro Trp 10 Arg Asp His 25 Gly Pro Lys Thr Pro Met Leu Ala Gln Cys 75 Gln Arg Ile 90 Lys Ser Phe 105 Leu Glu Xaa gctcaaagga ggctccacgg ccggggatcc agtgtggcaa gcgagaagcc tccggcacga Val Asp Gly Gln Glu Ser 30 Gln 45 Arg Lys Phe 60 Ser Ser Gly Lys Thr His Thr Gly Ser 110 Ser Arg His Ser 125 320 ttctcagatc aacgcatcca catgcttttt aaccttcaac ctacatgtgt gcgcatccac Ser 15 Lys Leu Leu Val Thr Pro Glu Phe Asn 80 Glu 95 Lys Ser Asn 60 120 180 240 300 360 380 atgtcgagac aaacgcacca cagaagactt tcagagccag aaagcacagc ttccttagag ccaggcatcg gagaaaaaca gtggatgtac tatcatcaag cagagattat gaaaaggaac <210> 6 <2ll> 225 <212> PRT <2l3> HOmO <400> 6 Met Ser I Arg Gly Leu Ser Ala Val 35 Lys Leu 50 Cys Lys Ser Leu 65 Arg Lys Ala Gln Gln Ala Arg Phe His 115 Tyr Ile Val 130 Lys Pro His 145 Tyr Val Asp Val Glu Leu Lys Met 195 Lys Asn cccggaagag aaactgagaa cagccactaa agagccgcct ccaaacagac ccatgaagct caggactcat atccccatta agtttgttcg ctcacaaagc caatccagcc caagttaa sapíens Pro Arg 5 Gly 20 Lys Glu Asp Asn Leu Glu Lys Pro Lys 85 Asn Phe 100 Ser Asn Glu Ala Asp Pro Lys Arg Ser Ser Gly 70 Gln Leu Cys Tyr Ser 523 30 9CC99CC999 ctcaggtgag aaactgtttg agagaaaggt aacatgctgg gggagaagaa gaagatcgtg tgacccatct gatgatgaaa tactggtggc cctgacccag Arg Leu Thr Lys Pro 40 Asn Ser His 55 Val Asp Thr Thr Arg Ala Glu 120 Lys Pro 135 Asp Ser Lys 150 Gln Phe 165 Ser 180 Tyr Val Leu Val His Phe " Arg Met Gln Ala 0131 acttctggtt gcattagcta aagaatctaa gtagatgtga gatggtgttc gccttcttct aaagaggctt agcaaagagg cgtttcattc cccttaaaaa gaagagtttg Ala Gly Thr 10 Thr 25 Glu Asn Gln Lys Thr Trp Leu Met Val Phe 75 Lys Cys Trp 90 Asp Met 105 Lys Leu Pro Gly Ile His Thr Gln Glu Asn 155 Asp Met Lys 170 Arg Lys Leu cagacaaggg aagtggagga gcagccactg agttcagcat gtaactacca accatagcaa acccagacca acaaccctaa ccctggctga atatggttct atcttgcttt Ser Gly Ser Gly Ala 45 Ser Lys Ser 60 Ser Ile Gly Val Gly Glu Ala Gly 125 Phe 140 Glu Pro Lys Phe Ile Th I Û W t) r- f) v* UIQ Ser Glu 30 Thr Glu Glu Arg Glu 110 Leu Lys Trp Pro actatcagga ctccaaccct gctgatgaag tgaggatctc ggctcggaac ctgcaaagag cacacagttt gtggtccatg gctcaaatcc cttcactcgc gagcctggag Asp 15 Lys Ala Leu Lys Asn Glu Pro Leu 80 Asp Asn 95 Tyr Ala Phe Met Asn Asn Met 160 Ser Leu Ala 175 -ro Lv; Pro Le: 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 678 3 'i i 111 :E EE :: :.:: ' :°' :°°. , . . . . . . . . . . . . . . - .- 3? Thr Gln Glu Glu Phe Asp Phe Val Leu Ser Leu Glu Glu Lys Glu Pro 210 215 220 Ser 225 <21o> 7 <211> 18 <2l2> DNA <213> Arnñckfllsekvens <220> <22 3 > Beskrivning av artificiell sekvens: primer TIP2c-s <400> 7 gaaacccaca ggaggcaa <2l0> 8 <211> 18 <2l2> DNA < 2 1 3 > Artiñciell sekvens <220> <2 23 > Beskrivning av artificiell sekvens: primer TIP2b-r <400> 8 ggtcatcatc gcagggtc <210> 9 <211> 33 <2l2> DNA < 2 1 3 > Artificiell sekvens <220> <223 > Beskrivning av axtificiell sekvens: primer Hcthy-s <400> 9 agcttgcggc cgcagatgtc gagaccccgg aag <210> 10 <21l> 40 <2l2> DNA < 2 1 3 > Artiiiciell sekvens <220> <22 3 > Beskrivning av artiñciell sekvens: primer Hcthy-r <400> 10 agcttgcggc cgcgaattct taacttggtt ccttttcctc

Claims (1)

1. 523 013 . 35” PATENTKRAV Nukleinsyra (IIP- 10) som kodar för ett protein som binder till IGF- l-receptorn vald från gruppen innefattande a) nukleinsyroma som visas i Sekv. ID nr. 5 eller en nukleinsyrasekvens som år komplementår med denna, b) nukleinsyror som hybridiserar under stringenta betingelser med någon av nukleinsyrorna från a) som kodar för en polypeptid som visar homologi med polypeptiden enligt Sekv. ID nr. 6, eller c) sekvenser som på grund av den genetiska kodens degenererade natur kodar för IIP-10-polypeptider som har aminosyrasekvensen enligt polypeptiderna som kodas av sekvenserna enligt a) och b). Nukleinsyra enligt krav l, vari nukleinsyran har en sekvens i enlighet med Sekv. ID nr. 5. Nukleinsyra enligt krav 1, vari hybridiseringen utförs i 5,0 x SSC, 5 x Denhardt, 7% SDS, 0,5 M fosfatbuffert pH 7,0, 10% dextransulfat och 100 pg / ml laxsperma-DNA vid cirka 50°C till 68°C, följt av två tvättsteg med l x SSC vid 68°C. Rekombinant expressionsvektor som är lämplig för expression av en nukleinsyramolekyl enligt krav l. Vårdcell transformerad med en nukleinsyra enligt krav 1 till 3. Rekombinant polypeptid som binder till IGF-1-receptorn som kodas av en nukleinsyra enligt krav 1 till 3. Metod för produktion av ett protein som binder till IGF-l-receptorn, genom att uttrycka ett exogent DNA i prokaryota eller eukaryota vårdceller och att isolera det önskade proteinet, varvid proteinet kodas av DNA-sekvensen som visas i Sekv. ID nr. 5 eller en nukleinsyra som hybridiserar under stríngenta 10. ll. ø ~ a | . - | a n u n .- 523 013 ' s? | . ; n .n betingelser med en nukleinsyra komplementär med nukleinsyran som visas i Sekv. ID nr. 5. Metod för detektion av proliferationspotentialen hos en cancercell innefattande a) att inkubera ett prov av kroppsvätska från en patient som har cancer, av tumörceller, eller av ett cellextrakt eller en cellkultursupernatant från tumörcellerna, varvid provet innehåller nukleinsyror med en nukleinsyraprobe som år selekterad från gruppen bestående av (i) nukleinsyra som visas i Sekv. ID nr. 5 eller en nukleinsyra som är komplementär med denna och (ii) nukleinsyror som kodar för ett protein som binder till IGF-l receptorn och som hybridiserar under stringenta betingelser med en av nukleinsyrorna från (i) och b) att detektera hybridisering med hjälp av en ytterligare bindningspartner för nukleinsyran från provet och/ eller nukleinsyraproben. Metod enligt krav (8), vari hybridiseringen utförs åtminstone med nukleinsyrafragmentet av Sekv. ID nr. 5 eller det komplementåra fragmentet. Metod enligt krav (8 eller 9), vari nukleinsyran som skall detekteras amplifieras före detektíon. Metod för att screena en förening som inhiberar interaktionen mellan IGF- IR och ett protein som kodas av en nukleinsyra enligt patentkrav 1 (IIP- 10), innefattande a) att kombinera IGF- lR och IIP-polypeptiden med en lösning innehållande en kandidatförening så att IGF- lR och IIP-polypeptiden har förmåga att bilda ett komplex, och b) att bestämma mängden komplex i förhållande till den förutbestämda nivån av bindning i frånvaro av kandidatföreningen och därur utvärdera förmågan hos föreningen att inhibera bindning av IGF- lR till IIP- polypeptiden.