SK12682000A3 - Proteíny interagujúce s kaspázou-8, izolovaná dna, vektor obsahujúci dna sekvenciu, eukaryotická a prokaryotická bunka, spôsob ich výroby a ich použitie - Google Patents

Proteíny interagujúce s kaspázou-8, izolovaná dna, vektor obsahujúci dna sekvenciu, eukaryotická a prokaryotická bunka, spôsob ich výroby a ich použitie Download PDF

Info

Publication number
SK12682000A3
SK12682000A3 SK1268-2000A SK12682000A SK12682000A3 SK 12682000 A3 SK12682000 A3 SK 12682000A3 SK 12682000 A SK12682000 A SK 12682000A SK 12682000 A3 SK12682000 A3 SK 12682000A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
caspase
protein
cell
leu
interacting
Prior art date
Application number
SK1268-2000A
Other languages
English (en)
Inventor
David Wallach
Marcus Schuchmann
Tanya Goncharov
Original Assignee
Yeda Research And Development Company Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from IL12772198A external-priority patent/IL127721A0/xx
Application filed by Yeda Research And Development Company Limited filed Critical Yeda Research And Development Company Limited
Publication of SK12682000A3 publication Critical patent/SK12682000A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C12N9/6475—Interleukin 1-beta convertase-like enzymes (3.4.22.10; 3.4.22.36; 3.4.22.63)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01033—N-Acetylglucosamine deacetylase (3.5.1.33)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/06—Methods of screening libraries by measuring effects on living organisms, tissues or cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)

Description

Oblasť techniky
Predložený vynález sa vo všeobecnosti týka oblasti cysteínových proteáz. Konkrétnejšie sa vynález týka proteínov, ktoré interagujú s kaspázou-8 (MACH) a/alebo modulujú jej funkciu v dráhach bunkovej smrti (alebo apoptózy), ktoré sú sprostredkované CD95 (Fas/Apo-1) alebo CD120a (p55-TNF receptor).
Predložený vynález sa týka najmä proteínov, ktoré interagujú priamo alebo nepriamo s kaspázou-8/MACH. Vynález sa týka aj prípravy a použitia proteínov interagujúcich s kaspázou-8/MACH.
Doterajší stav techniky
Tumorový nekrotický faktor (TNF-α) a lymfotoxín (TNF-β) (tu používaná skratka TNF sa týka tak TNF-α, ako aj TNF-β) sú multifunkčné pro-zápalové cytokíny vytvárané najmä mononukleárnymi fagocytmi, ktoré majú mnoho účinkov na bunky (Wallach, D. (1986) v Interferón 7 (lon Gresser vyd.) str. 83 až 122, Academic Press, London; a Beutler a Cerami (1987)). Tak TNF-α, ako aj TNF-β iniciujú svoje účinky väzbou na špecifické bunkové receptory. Niektoré účinky sú pravdepodobne pre organizmus výhodné: môžu napríklad zničiť nádorové bunky alebo bunky infikované vírusom a môžu zvýšiť antibakteriálne účinky granulocytov. Týmto spôsobom sa TNF podieľa na obrane organizmu proti nádorom a infekčným činidlám a na zotavení sa z poranenia. Takže TNF je možné použiť ako protinádorové činidlo, pri ktorého aplikácii sa viaže na svoje receptory na povrchu nádorových buniek, a tým spúšťa deje vedúce ku smrti nádorovej bunky. TNF môže byť použitý aj ako antiinfekčné činidlo.
Avšak tak TNF-α, ako aj TNF-β majú aj škodlivé účinky. Je dokázané, že nadprodukcia TNF-α môže hrať hlavnú patogenickú úlohu pri niekoľkých
-2ochoreniach. Je napríklad známe, že hlavnými príčinami septického šoku sú účinky TNF-α, primárne na vaskulatúru (Tracey a ďalší, 1986). Pri niektorých ochoreniach môže TNF zapríčiniť nadmernú stratu hmotnosti (kachexia) potlačením účinkov adipocytov a spôsobením anorexie, a preto sa TNF-α nazýva kachektín. Je tiež opísaný ako mediátor poškodenia tkanív pri reumatických ochoreniach (Beutler a Cerami, 1987) a ako hlavný mediátor poškodenia pozorvaného pri reakciách odmietnutia štepu hostiteľom (Piquet a ďalší, 1987). Navyše je známe, že TNF sa podieľa na zápalových procesoch a na mnohých ďalších ochoreniach.
Dva odlišné, nezávisle exprimované receptory, p55 (CD 120a) a p75 (CD120b), TNF-Rs, ktoré špecificky viažu TNF-α a TNF-β, iniciujú a/alebo sprostredkúvajú vyššie uvedené biologické účinky TNF. Tieto dva receptory majú štruktúrne nepodobné vnútrobunkové domény, čo naznačuje, že prenášajú signál odlišne (pozri Hohmann a ďalší, 1989; Engelmann a ďalší, 1990; Brockhaus a ďalší, 1990; Loetscher a ďalší, 1990; Schall a ďalší, 1990; Nophar a ďalší, 1990; Smith a ďalší, 1990; a Holler a ďalší, 1990). Avšak ešte vždy je potrebné odhaliť bunkové mechanizmy, napríklad rôzne proteíny a možné iné faktory, ktoré sú zahrnuté vo vnútrobunkovej signalizácii prostredníctvom CD120a a CD120b. Je to vnútrobunková signalizácia, ktorá zvyčajne nastáva po naviazaní sa ligandu, tzn. TNF (a alebo β) na receptor, čím sa začína kaskáda reakcií, ktorej konečným výsledkom je pozorovaná odpoveď bunky na TNF.
Čo sa týka vyššie uvedeného účinku TNF, vo väčšine buniek študovaných z tohto hľadiska bol tento účinok spustený najmä prostredníctvom CD120a. Protilátky proti extracelulárnej doméne (ligand viažuca doména) CD 120a môžu sami spustiť cytocídny účinok (pozri EP 412486), ktorý koreluje s účinnosťou receptora krížovo prepojeného protilátkami, čo je považované za prvý krok generovania vnútrobunkového signálneho procesu. Navyše, mutačné štúdie (Brakebusch a ďalší, 1992; Tartaglia a ďalší, 1993) ukázali, že biologická funkcia CD120a závisí od integrity vnútrobunkovej domény, a v súlade s tým bolo navrhnuté, že iniciácia vnútrobunkovej signalizácie vedúca k cytocídnemu účinku TNF nastáva ako dôsledok asociácie dvoch alebo viacerých domén CD120a. Navyše TNF (a a β) sa
-3vyskytuje ako homotrimér, a ako taký je navrhnutý ako faktor, ktorý indukuje vnútrobunkovú signalizáciu prostredníctvom CD120a tak, že je schopný viazať sa na a prepájať sa s molekulami receptora, tzn. spôsobovať receptorovú agragáciu.
Ďalším členom TNF/NGF superrodiny receptorov je FAS/APO1 receptor (CD95), ktorý bol označený ako FAS antigén, pričom ide o bunkový povrchový proteín exprimovaný v rôznych tkanivách, ktorý je homologický s množstvom bunkových povrchových receptorov vrátane TNF-R a NGF-R. CD95 sprostredkúva bunkovú smrť vo forme apoptózy (Itoh a ďalší, 1991) a zdá sa, že slúži ako negatívny selektor autoreaktívnych T buniek, tzn. počas dozrievania T buniek CD95 spôsobuje apoptickú smrť T buniek, ktoré rozoznávajú vlastné antigény. Zistilo sa tiež, že mutácie v CD95 géne (Ιρή spôsobujú poruchu lymfoproliferácie u myší, ktorá sa podobá ľudskému autoimunitnému ochoreniu - systémovému lupus erytematosus (SLE) (Watanabe-Fukunaga a ďalší, 1992). Zdá sa, že ligandom pre CD95 je molekula spojená s bunkovým povrchom, ktorú, okrem iných nesú zabíjačské T bunky (alebo cytotoxické T lymfocyty- CTLs). Takže, keď sa takéto CTLs dostanú do kontaktu s bunkami nesúcimi CD95, sú schopné indukovať apoptickú bunkovú smrť buniek nesúcich CD95. Navyše bola pripravená monoklonálna protilátka, ktorá je špecifická pre CD95, a táto protilátka je schopná indukovať apoptickú bunkovú smrť v bunkách nesúcich CD95, vrátane myšacích buniek transformovaných cDNA, ktorá kóduje ľudský CD95 (Itoh a ďalší, 1991).
Zatiaľ čo cytotoxické účinky lymfocytov sú sprostredkované interakciou lymfocytmi produkovaného ligandu s vo veľkom množstve sa vyskytujúcim bunkovým povrchovým receptorom CD95, ktorý má schopnosť spustiť bunkovú smrť, zistilo sa tiež, že rôzne iné normálne bunky okrem T lymfocytov exprimujú na svojom povrchu CD95 a môžu byť usmrtené spustením tohto receptora. Existuje určité podozrenie, že nekontrolovaná indukcia takéhoto smrtiaceho procesu sa podieľa na poškodení tkanív pri určitých ochoreniach, napríklad na deštrukcii pečeňových buniek pri akútnej hepatitíde. Z toho vyplýva, že zistenie spôsobov, ktorými by sa zabránilo cytotoxickej aktivite CD95, môže mať terapeutický potenciál.
Naopak, keďže sa tiež zistilo, že určité malígne bunky a bunky infikované HIV nesú na svojom povrchu CD95, môžu byť protilátky proti CD95 alebo CD95
-4ligand použité na spustenie CD95 sprostredkovaných účinkov v týchto bunkách, a tým môžu poskytnúť prostriedok na zničenie takýchto malígnych buniek alebo buniek infikovaných HIV (pozri Itoh a ďalší, 1991). Takže terapeutický potenciál môže mať aj nájdenie ešte ďalších spôsobov na zosilnenie cytotoxického účinku CD95.
Dlho bola pociťovaná potreba poskytnúť spôsob modulácie bunkovej odpovede na TNF (a alebo β) a CD95 ligand. Napríklad vo vyššie uvedených patologických situáciách, kedy je TNF alebo CD95 ligand nadexprimovaný, je želateľné inhibovať cytocídne účinky indukované TNF alebo CD95, zatiaľ čo v iných situáciách, napríklad pri aplikáciách na hojenie rán, je želateľné posilniť TNF účinok, alebo v prípade CD95, v nádorových bunkách alebo bunkách infikovaných HIV je želateľné posilniť CD95 sprostredkovaný účinok.
Použilo sa množstvo prístupov (pozri napríklad európske prihlášky č. EP 186833, EP 308378, EP 398327 a EP 412486) na regulovanie ničivých účinkov TNF prostredníctvom inhibovania viazania sa TNF na jeho receptory použitím antiTNF protilátok alebo použitím rozpustných TNF receptorov (v podstate to boli rozpustné extraceluláme domény receptorov), ktoré konkurovali viazaniu sa TNF na TNF-Rs naviazané na povrch. Navyše, vychádzajúc zo skutočnosti, že TNF viazanie sa na jeho receptory je potrebné pre TNF-indukované bunkové účinky, prihlasovatelia použili prístupy (pozri napríklad EO 568925) na modulovanie TNF účinku modulovaním aktivity TNF-Rs.
Napríklad, EP 568925 sa týka spôsobu modulovania prenosu signálu a/alebo štiepenia v TNF-Rs, ktorým môžu peptidy alebo iné molekuly interagovať buď so samotným receptorom, alebo s efektorovými proteínmi interagujúcimi s receptorom, a tak modulovať normálnu funkciu TNF-Rs. V EP 568925 je opísaná konštrukcia a charakterizácia rôznych mutantných foriem CD120a, ktoré majú mutácie v extracelulárnej, transmembránovej a vnútrobunkovej doméne. Týmto spôsobom sa identifikovali oblasti vo vyššie uvedených doménach CD120a, ktoré sú nevyhnutné pre fungovanie receptora, tzn. pre väzbu ligandu (TNF) a následný prenos signálu a pre vnútrobunkovú signalizáciu, ktorej konečným výsledkom je TNF účinok pozorovaný na bunkách. Ďalej uvedený dokument opisuje množstvo postupov na
-5izoláciu a identifikáciu proteínov, peptidov alebo iných faktorov, ktoré sú schopné viazať sa na rôzne oblasti vyššie uvedených domén CD120a, pričom tieto proteíny, peptidy a iné faktory sa môžu podieľať na regulácii alebo modulovaní aktivity TNFRs. V EPO 568925 je uvedené aj množstvo postupov na izolovanie a klonovanie DNA sekvencii kódujúcich takéto proteíny a peptidy; na konštrukciu expresných vektorov na produkciu týchto proteínov a peptidov; a na prípravu protilátok alebo ich fragmentov, ktoré interagujú s CD120a alebo s vyššie uvedenými proteínmi a peptidmi, ktoré sa viažu na rôzne oblasti CD120a. Avšak EP 568925 nešpecifikuje konkrétne proteíny a peptidy, ktoré sa viažu na vnútrobunkové domény TNF-Rs (napr. CD95), ani neopisuje kvasinkový dvojhybridný postup na izoláciu a identifikáciu takých proteínov alebo peptidov, ktoré sa viažu na vnútrobunkové domény TNF-Rs. Podobne, EP 568925 neopisuje proteíny alebo peptidy, ktoré sú schopné viazať sa na vnútrobunkovú doménu CD95.
Takže, keď je potrebné inhibovať účinok TNF alebo CD95 Ugandu, bolo by želateľné znížiť aktivitu TNF-Rs alebo CD95 na bunkovom povrchu, zatiaľ čo zvýšenie aktivity TNF-Rs alebo CD95 by bolo želateľné, keď je potrebný zosilnený účinok TNF alebo CD95 ligandu. Za týmto účelom boli sekvenované promótory CD 120a a CD 120b, analyzovali sa a našlo sa množstvo kľúčových motívov, ktoré sú špecifické pre rôzne transkripčné regulačné faktory, takže expresia týchto TNFRs môže byť kontrolovaná na ich promótorovej úrovni, tzn. je možné inhibovať transkripciu z promótorov, za účelom poklesu množstva receptorov, a zosilniť transkripciu z promótorov, za účelom zvýšenia množstva receptorov (EP 606869 a WO 9531206).
Hoci je známe, že receptory pre tumorový nekrotický faktor (TNF) a štruktúrne príbuzný receptor CD95 spúšťajú po stimulácii ligandami produkovanými leukocytmi deštrukčné aktivity v bunkách, ktoré môžu viesť ich usmrteniu, je mechanizmus tohto spustenia ešte stále málo pochopený. Z mutačných štúdií vyplýva, že CD95 a CD120a prenos cytotoxického signálu zahŕňa rôzne oblasti vo vnútri ich vnútrobunkových domén (Brakebusch a ďalší, 1992; Tartaglia a ďalší, 1993; Itoh a Nagata, 1993). Tieto oblasti (smrtiace domény) majú podobné sekvencie. Smrtiace domény tak CD95, ako aj CD120a majú tendenciu spájať sa
-6sami so sebou. Je zrejmé, že toto vzájomné spájanie podporuje agregovanie receptorov, ktoré je potrebné na iniciovanie prenosu signálu (pozri Song a ďalší, 1994; Wallach a ďalší, 1994; Boldin a ďalší, 1995), a výsledkom vysokých úrovní receptorovej expresie môže byť spustenie ligand-závislého prenosu signálu (Boldin a ďalší, 1995).
Niektoré cytotoxické účinky lymfocytov sú sprostredkované interakciou ligandu produkovaného lymfocytmi s CD95, ktorý je vo veľkom množstve sa vyskytujúcim bunkovým povrchovým receptorom so schopnosťou spustiť bunkovú smrť (pozri aj Nagata a Goldstein, 1995); a bunková smrť mononukleárnymi fagocytmi zahŕňa pár ligand-receptor, konkrétne TNF a jeho receptor CD120a, ktorý je štruktúrne príbuzný s párom CD95 a jeho ligand (pozri aj Vandenabeele a ďalší,
1995) . Podobne ako iné účinky indukované receptorom, indukcia bunkovej smrti TNF receptormi a CD95 nastáva prostredníctvom série proteín-proteín interakcií, ktoré vedú od väzby ligandu na receptor, k eventuálnej aktivácii enzymatických efektorových funkcií, pričom v prípade štúdií boli odhalené neenzymatické proteínproteín interakcie, ktoré iniciujú prenos signálu pre bunkovú smrť; naviazanie trimérnych TNF alebo CD95 ligandových molekúl na receptory, čo sú výsledné interakcie ich vnútrobunkových domén (Brakebusch a ďalší, 1992; Tartaglia a ďalší, 1993; Itoh a Nagata, 1993), ktoré sú zosilnené náchylnosťou motívov smrtiacich domén navzájom asociovať (Boldin a ďalší, 1995a) a indukované väzbou dvoch cytoplazmatických proteínov (ktoré sa môžu viazať aj navzájom) na receptorové vnútrobunkové domény - MORT-1 (alebo FADD) na CD95 (Boldin a ďalší, 1995b; Chinnaiyan a ďalší, 1995; Kischkel a ďlaší, 1995) a TRADD na CD120a (Hsu a ďalší, 1995; Hsu a ďalší, 1996). Kvasinkovým dvojhybridným skríningovým postupom sa identifikovali tri proteíny, ktoré sa viažu na vnútrobunkovú doménu CD95 a CD 120a v oblasti smrtiacej domény podieľajúcej sa na indukcii bunkovej smrti prostredníctvom receptorov cez hetero-asociovanie homologických oblastí, a ktoré sú tiež schopné nezávisle spustiť bunkovú smrť. Jedným z nich je proteín MORT-1 (Boldin a ďalší, 1995b), tiež známy ako FADD (Chinnaiyan a ďalší, 1995), ktorý sa špecificky viaže na CD95. Druhý, TRADD (pozri aj Hsu a ďalší, 1995,
1996) sa viaže na CD120a, a tretí, RIP (pozri aj Stanger a ďalší, 1995) sa viaže tak
-7 na CD95, ako aj CD120a. Okrem toho, že sa viažu na CD95 a CD120a, sú tieto proteíny schopné aj viazať sa navzájom, čo poskytuje funkčnú krížovú komunikáciu medzi CD95 a CD120a. Tieto väzby sa uskutočňujú prostredníctvom konzervatívneho sekvenčného motívu, smrtiaceho doménového modulu, ktorý je spoločný pre receptory a ich asociované proteíny. Navyše, hoci kvasinkový dvojhybridný test ukázal, že MORT-1 sa spontánne viaže na CD95, v cicavčích bunkách sa táto väzba uskutočňuje len po stimulácii receptora, čo naznačuje, že MORT-1 sa podieľa na úvodných dejoch CD95 signalizácie. MORT-1 neobsahuje žiadny sekvenčný motív, pre ktorý by bola typická enzymatická aktivita, takže sa zdá, že jeho schopnosť spustiť bunkovú smrť nezahŕňa vnútorný účinok samotného MORT1, ale skôr aktiváciu nejakého iného proteínu (proteínov), ktorý sa viaže na MORT1, a účinkuje v signalizačnej kaskáde následne. Ukázalo sa, že bunková expresia MORT-1 mutantov, ktorým chýba N-koncová časť molekuly, blokuje cytotoxickú indukciu sprostredkovanú CD95 alebo CD120a (Hsu a ďalší, 1996; Chinnaiyan a ďalší, 1996), z čoho vyplýva, že N-koncová časť prenáša signál pre cytocídny účinok oboch receptorov prostredníctvom proteín-proteín interakcií.
Súčasné štúdie odhalili skupinu cytoplazmatických tiolových proteáz, ktoré sú štruktúrne príbuzné s proteázou CED3 Caenorhabditis elegans a s cicavčím interleukín-1 konvertujúcim enzýmom (ICE), ktoré sú aktívne na začiatku rôznych fyziologických procesov bunkovej smrti (zhrnuté v Kumar, 1995 a Henkart, 1996). Existovali aj určité indikácie, že proteáza (proteázy) tejto rodiny sa môžu zúčastňovať na bunkovej cytotoxicite, ktorá je indukovaná prostredníctvom CD95 a TNF-Rs. Zistilo sa, že špecifické peptidové inhibítory proteáz a dva vírusom kódované proteíny, ktoré blokujú ich funkciu, proteín kravských kiahní crmA a Baculovirus proteín p35, poskytujú bunke ochranu proti tejto bunkovej cytotoxicite (Enari a ďalší, 1995; Los a ďalší, 1995; Tewari a ďalší, 1995; Xue a ďalší, 1995; Beidler a ďlaší, 1995). Krátko po stimulácii CD95 alebo TNF-Rs bolo možné demonštrovať rýchle štiepenie určitých špecifických bunkových proteínov, ktoré bolo zjavne sprostredkované proteázou (proteázami) CED3/ICE rodiny.
V súčasnosti bola izolovaná, klonovaná a charakterizovaná jedna takáto proteáza a jej rôzne izoformy (vrátane inhibičných izoforiem), ktorá je známa ako
-8MACH (teraz kaspáza-8), čo je MORT-1 viažuci proteín, ktorý slúži na moduláciu účinku MORT-1, a tým účinku CD95 a CD120a, a ktorý môže pracovať aj nezávisle od MORT-1. V spoločne vlastnených izraelských prihláškach vynálezov č. IL114615, 114986, 115319, 116588 a 117932, ktoré sú paralelne v konaní, ako aj v korešpondujúcej PCT prihláške č. PCT/US96/10521 a v súčasnej publikácii pôvodcov predloženého vynálezu (Boldin a ďalší, 1996), ktorých kompletný opis je tu zahrnutý týmito citáciami, sú opísané aj jej možné použitia. Pôvodcovia predloženého vynálezu (nepublikované) a iní (Fernandes-Alnemri a ďalší, 1996; Srinivasula a ďalší, 1996) v súčasnosti izolovali a charakterizovali aj inú takúto proteázu a jej izoformy (vrátane inhibičných izoforiem), označenú ako Mch4 (nazývanú aj kaspáza-10). Kaspáza-10 je tiež MORT-1 viažuci proteín, ktorý slúži na moduláciu účinku MORT-1, a tým pravdepodobne aj účinkov CD95 a CD120a, a ktorý môže pracovať aj nezávisle od MORT-1. Takže podrobnosti týkajúce sa všetkých aspektov, znakov, charakteristík a použitia kaspázy-10 sú uvedené vo vyššie uvedených publikáciách, ktoré sú tú komplet zahrnuté ich citovaním.
Treba poznamenať, že kaspáza-8 a kaspáza-10, ktoré majú podobné prodomény (pozri Boldin a ďalší, 1996; Muzio a ďalší, 1996; Fernandes-Alnemri a ďalší, 1996; Vincent a Dixit, 1997) interagujú cez svoje prodomény s MORT-1, pričom táto interakcia sa uskutočňuje cez motív smrtiacej domény alebo smrtiacu efektorovú doménu, DED, ktorá sa nachádza v N-koncovej časti MORT-1 a je dvojmo prítomná v kaspáze-8 a kaspáze-10 (pozri Boldin a ďalší, 1995b; Chinnalyan a ďalší, 1995).
Takéto proteázy, teraz známe ako kaspázy (cysteín aspartát-špecifické proteinázy) sú rastúcou rodinou cysteínových proteáz, ktoré majú niekoľko spoločných znakov. Zistilo sa, že väčšina kaspáz participuje na iniciácii a vykonávaní programovanej bunkovej smrti alebo apoptózy, zatiaľ čo je zrejmé, že iné sa podieľajú na produkcii prozápalových cytokínov (Nicholson DW a ďalší, 1997, Salvesen GS a ďalší, 1997, Cohen GM, 1997). Syntetizujú sa ako katalytický neaktívne prekurzory a vo všeobecnosti sa aktivujú štiepením za špecifickými vnútornými asparágovými zvyškami, ktoré sa nachádzajú v interdoménových spojovníkoch. Štiepne miesta kaspáz sú definované tetrapeptidovými sekvenciami
-9(X-X-X-D) a štiepenie nastáva vždy za kyselinou asparágovou. Výsledkom je, že určité zrelé aktívne kaspázy môžu spracovať a aktivizovať svoje vlastné, ako aj iné neaktívne prekurzory (Fernandes-Alnemri T a ďalší, 1996, Srinivasula SM a ďalší, 1996).
Aktivácia procesu programovanej bunkovej smrti je vo všeobecnosti špecifická a zahŕňa postupné spracovanie zostupného radu kaspáz nazývaných vykonávacie kaspázy prostredníctvom predtým pôsobiacich kaspáz, nazývaných iniciátorové kaspázy. Funkčná charakterizácia týchto dvoch tried kaspáz je aj odrazom ich štruktúry. V skutočnosti iniciátorové kaspázy obsahujú dlhšie prodoménové oblasti v porovnaní s vykonávacími kaspázami (Salvesen GS a ďalší, 1997, Cohen GM, 1997). Dlhá prodoména umožňuje iniciátorovým alebo apikálnym kaspázam, aby boli aktivované spustením smrtiacich receptorov TNF receptorovej rodiny. Po trimerizácii smrtiacich receptorov, ktorá je indukovaná Iigandom, sa iniciátorové kaspázy zhromaždia prostredníctvom ich dlhej N-koncovej prodomény, aby interagovali so špecifickými adaptorovými molekulami, čím sa vytvorí smrtiaci indukčný signalizačný komplex (Cohen GM 1997, Kischkel FC a ďalší, 1995). Napríklad, kaspáza-8/MACH a pravdepodobne kaspáza-10, ktoré obsahujú dve smrtiace efektorové domény (DED) alebo FADD domény, sa zhromažďujú do receptorového komplexu prostredníctvom adaptorových molekúl FADD/MORT-1, zatiaľ čo kaspáza-2 sa zhromažďuje prostredníctvom CRADD/RAIDD a RIP (Nagata S a ďalší, 1997, MacFarlane M a ďalší, 1997, Ahmad M a ďalší, 1997, Duan H a ďalší, 1997). Kvôli trimérnej povahe aktivovaného receptorového komplexu je pravdepodobne potrebné, aby sa do vzájomnej tesnej blízkosti dostali najmenej dve kaspázové molekuly, čo vedie ku ich aktivácii autokatalytickým spracovaním (Yang a ďalší, 1998, Muzio a ďalší 1998).
Kaspázy sa syntetizujú ako proenzýmy pozostávajúce z troch hlavných podjednotiek, N-koncovej prodomény a dvoch podjednotiek, ktoré sú niekedy oddelené spojovníkovým peptidom. Dve podjednotky sú označené ako dlhá alebo podjednotka 1 obsahujúca aktívne enzymatické miesto a krátka alebo podjednotka 2. Na úplnú aktiváciu enzýmu sa štiepi prodoména a subdomény. Dve poštiepené podjednotky vytvárajú heterodimér, ktorého dlhá doména je odvodená
-10od N-konca, a krátka podjednotka je odvodená od C-koncovej oblasti kaspázového prekurzora. Na základe odvodenej trojrozmernej štruktúry kaspázy-3 sa zdá, že Ckoniec dlhej domény, ako aj N-koniec krátkej subdomény musia byť uvoľnené a Ckoniec krátkej podjednotky sa musí dostať do tesnej blízkosti N-konca dlhej podjednotky, ak sa má získať správne poskladaný a aktívny enzým (Rotonda a ďalší 1996, Mittl a ďalší, 1997, Srinivasula a ďalší 1998).
/V-acetylglukózamín-6-fosfátdeacetyláza je vnútrobunkový enzým, o ktorom je známe, že sa podieľa na vnútrobunkovom metabolizme glukózamínu. Fragment genómovej DNA obsahujúci A/-acetylglukózamín-6-fosfátdeacetylázu bol klonovaný z baktérie produkujúcej chitinázu, Vibrio cholerae (Yamano a ďalší, Biosci Biotechnol Biochem. 61, str. 1349-53, 1997).
Známy je aj nagA gén kódujúci E. coli /V-acetylglukózamín-6-fosfátdeacetylázu (pozri napr. Peri a ďalší, január 1990, 68(1), str. 123-137). Doteraz nebolo publikované, že by bola klonovaná a sekvenovaná ľudská /V-acetylglukózamín-6-fosfátdeacetyláza.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je proteín interagujúci s kaspázou-8 alebo jeho izoformu, alelický variant, fragment, funkčný analóg, mutant alebo derivát, ktorý je schopný interagovať s podjednotkou 1 a/alebo podjednotkou 2 kaspázy-8.
Vynález ďalej poskytuje ľudskú A/-acetylglukózamín-6-fosfátdeacetylázu alebo jej izoformu, alelický variant, fragment, funkčný analóg, mutant alebo derivát.
Ďalej vynález poskytuje proteín, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 2, 3, 5B alebo 6.
Vynález poskytuje aj proteín, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu proteínu Tip-60 s výnimkou aminokyselín 94 až 145.
Rozsah vynálezu zahŕňa aj proteín, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu kódovanú klonmi P27, P70, P79, L7, L12, M26, B4, B17, J40, B13, B37, B33 alebo P74 a jej zostrihové varianty P16 a P43, ako budú opísané nižšie.
-11 Vynález poskytuje aj vyššie opísaný proteín, ktorý je poštiepený s kaspázou8 in vitro alebo in vivo.
Vynález poskytuje aj izolovanú DNA sekvenciu, ktorá kóduje proteín podľa vynálezu. Do rozsahu spadá DNA sekvencia uvedená na obrázku 2 a obrázku 3. Do rozsahu vynálezu spadá aj izolovaná DNA, ktorá je schopná hybridizovať s uvedenou DNA sekvenciu za stredne prísnych podmienok.
Vynález poskytuje aj vektor, ktorý obsahuje DNA sekvenciu definovanú vyššie.
Vynález ďalej poskytuje eukaryotickú alebo prokaryotickú hostiteľskú bunku, ktorá obsahuje vektor podľa vynálezu.
Vynález poskytuje aj spôsob výroby proteinu interagujúceho s kaspázou-8 alebo jeho izoformy, alelického variantu, fragmentu, funkčného analógu, mutantu alebo derivátu podľa vynálezu, ktorý zahŕňa rast hostiteľskej bunky podľa vynálezu v podmienkach, ktoré umožňujú výrobu uvedeného proteinu, uskutočnenie posttranslačných modifikácií, ak je to nevyhnutné na získanie proteinu alebo jeho izoformy, alelického variantu, fragmentu, funkčného analógu alebo mutantu alebo derivátu a izoláciu proteinu alebo jeho izoformy, alelického variantu, fragmentu, funkčného analógu alebo mutantu alebo derivátu.
Vynález poskytuje aj spôsob, v ktorom je bunkou prokaryotická bunka.
Vynález ďalej poskytuje spôsob, v ktorom je bunkou eukaryotická bunka.
Vynález poskytuje aj spôsob, v ktorom je bunkou cicavčia, hmyzia alebo kvasinková bunka.
Vynález poskytuje aj spôsob, v ktorom je bunkou HeLa alebo 293 T HEK bunka.
Vynález poskytuje aj spôsob, v ktorom je ako promótor použitý CMV promótor.
Ďalej vynález poskytuje peptid interagujúci s kaspázou-8, ktorý obsahuje najmenej 4 po sebe idúce aminokyseliny proteinu podľa vynálezu.
Do rozsahu vynálezu spadá aj derivát uvedeného peptidu. Rozsah vynálezu ďalej zahŕňa peptidový derivát, ktorý je schopný vytvoriť kovalentnú väzbu s kaspázou-8, keď sa uvedie do kontaktu s kaspázou-8.
-12Vynález poskytuje aj ribozým špecifický pre nukleotidovú sekvenciu, ktorá korešponduje s DNA sekvenciou podľa vynálezu.
Vynález ďalej poskytuje antisense oligonukleotid, ktorý obsahuje najmenej 9 nukleotidov sekvencie zodpovedajúcej DNA sekvencii podľa vynálezu.
Vynález poskytuje aj protilátku nasmerovanú na epitop proteínu podľa vynálezu.
Vynález poskytuje aj imunologický test na detekciu proteínu, ktorý interaguje s kaspázou-8, ktorý zahŕňa protilátku podľa vynálezu.
Vynález ďalej poskytuje imunologický test na detekciu kaspázy-8, ktorý zahŕňa peptid podľa vynálezu.
Vynález poskytuje aj imunologický test na detekciu kaspázy-8, ktorý zahŕňa proteín podľa vynálezu.
Vynález ďalej poskytuje spôsob identifikácie proteínov interagujúcich s kaspázou-8, ktorý zahŕňa nasledujúce kroky:
a) poskytnutie kvasinkovej bunky, ktorá má reporterový gén spojený s promótorom zahŕňajúcim DNA sekvenčný motív;
b) expresiu p20 podjednotky kaspázy-8 v kvasinkovej bunke;
c) expresiu fúzovaného proteínu obsahujúceho DNA väzobnú doménu a p10 a/alebo p20 podjednotku kaspázy-8, v ktorom je DNA väzobná doména schopná viazať sa na DNA sekvenčný motív, v kvasinkovej bunke;
d) voliteľne expresiu nefúzovanej p10 alebo p20 podjednotky kaspázy-8 v kvasinkovej bunke;
e) transformáciu kultúry kvasinkových buniek knižnicou pozostávajúcou z expresného vektora, ktorý riadi expresiu fúzovaného proteínu, ktorý obsahuje cDNA knižnicu a transkripčný aktivátor;
f) vyhľadávanie kvasinkových buniek, v ktorých je aktivovaný reporterový gén, v kultúre transformovaných kvasinkových buniek, a
g) izoláciu kvasinkovej bunky z kroku f) a ďalšia izolácia proteínu interagujúceho s kaspázou-8, ktorý je exprimovaný vo svojom záchytnom vektore.
Vynález poskytuje aj proteín interagujúci s kaspázou-8, jeho izoformu, alelický variant, fragment, funkčný analóg, mutant alebo derivát, ako aj ribozým,
- 13antisense oligonukleotid alebo protilátku na použitie na modulovanie aktivity kaspázy-8.
Vynález poskytuje aj proteín interagujúci s kaspázou-8, jeho izoformu, alelický variant, fragment, funkčný analóg, mutant alebo derivát, ako aj ribozým, antisense oligonukleotid alebo protilátku na použitie na modulovanie účinkov sprostredkovaných TNF receptorom alebo Fas.
Vynález poskytuje aj proteín interagujúci s kaspázou-8, jeho izoformu, alelický variant, fragment, funkčný analóg, mutant alebo derivát, ako aj ribozým, antisense oligonukleotid alebo protilátku na použitie na modulovanie apoptózy.
Vynález poskytuje aj proteín interagujúci s kaspázou-8, jeho izoformu, alelický variant, fragment, funkčný analóg, mutant alebo derivát, ako aj ribozým, antisense oligonukleotid alebo protilátku na použitie ako liečivo.
Vynález poskytuje aj proteín interagujúci s kaspázou-8, jeho izoformu, alelický variant, fragment, funkčný analóg, mutant alebo derivát, ako aj ribozým, antisense oligonukleotid alebo protilátku na použitie ako liečivo na liečbu sklerózy multiplex s primárnou oligodendrogliopatiou, autoimunitnej uveoretinitídy, cukrovky, lupusu, autoimunitnej myokarditídy I, chronickej hepatitídy sprostredkovanej HCV, chronickej gastritídy napr. gastritídy typu A, zmiešanej konektívnej tkanivovej choroby (MCTD), Crohnovej choroby alebo vredovej kolitídy.
Vynález poskytuje aj oligonukleotid vytvárajúci triplex, ktorý je schopný viazať sa na sekvenciu bohatú na purín v promótorovej oblasti génu interagujúceho s kaspázou-8. Oligonukleotid vytvárajúci triplex môže obsahovať chemické modifikácie, ako napríklad internukleozidové fosfátové väzby modifikované s katiónom /V,/V-dietyl-etyléndiamínom, uridínom, benzo[g]-chinazolín-2,4-dión(1 H,3H)-diónovým alebo benzo[f]-chinazolín-2,4-dión-(1F/,3H)-diónovým zvyškom namiesto tymidínových zvyškov. Oligonukleotid vytvárajúci triplex môže byť ešte kovalentne spojený s chemickými zlúčeninami, ktoré majú afinitu ku DNA, výhodne takými činidlami, ktoré sa môžu interkalovať do DNA, ako napríklad akridín a psoralén.
Výraz “interagovanie použitý v kontexte tohto opisu, ktorý sa týka interakcie proteínu podľa vynálezu s kaspázou-8, zahŕňa priame formy interakcie, ako
-14viazanie, štiepenie, a nepriamu interakciu, napríklad prostredníctvom adaptorových proteínov. Prípadným výsledkom interakcie môže byť modulácia signálu sprostredkovaného kaspázou-8.
Výraz “viazanie” v kontexte tejto prihlášky, keď sa vzťahuje na viazanie sa proteínov interagujúcich s kaspázou-8, sa týka fýzikálnej asociácie proteínu interagujúceho s kaspázou-8 a kaspázy-8. Túto fýzikálnu asociáciu je možné merať v imunologických testoch, ako napríklad teste ELISA alebo RIA, v dvojhybridnom teste, v imunoprecipitačných testoch alebo v testoch založených na separácii podľa veľkosti, ako napríklad nedenaturačnou akrylamidovou gólovou elektroforézou alebo veľkostnou vylučovacou gélovou chromatografiou zmesi kaspázy-8 alebo jej podjednotky a proteínu podľa vynálezu. Keď sa použije dvojhybridný test, je zrejmé že kaspáza-8 alebo jej podjednotka je exprimovaná ako DNA aktivačná doménová fúzia a proteín interagujúci s kaspázou-8 je exprimovaný ako DNA viažuca doménová fúzia alebo vice verša.
Výraz “dvojhybridný test” sa týka dvojhybridného testu, v ktorom je možné merať proteín-proteín interakcie zavedením expresného vektora, kódujúceho fúziu prvého proteínu a DNA viažucej domény, a druhého expresného vektora, kódujúceho fúziu druhého proteínu s DNA aktivačnou doménou, do kvasinkových buniek. Kvasinkové bunky musia obsahovať najmenej jeden reporterový gén riadený promótorom, ktorý obsahuje DNA sekvenčný motív, ktorý je rozoznávaný DNA väzobnou doménou. Zvyčajne sú použité dva reporterové gény, napr. histidín syntetáza a β-galaktozidáza. To umožňuje vylúčiť falošne pozitívne výsledky, ktoré môžu byť výsledkom mutácie. Pôvodcovia predloženého vynálezu modifikovali a zlepšili túto techniku na použitie na skríning, izoláciu a testovanie proteínov, ktoré sprostredkúvajú TNF-R a Fas signály, pozri napr. WO 97/03998 a tam uvedené citácie. Dvojhybridný test závisí na lokalizácii oboch fúzovaných proteínov v bunkovom jadre.
Tu používaný výraz “dvojhybridný test” ďalej zahŕňa modifikáciu dvojhybridnej techniky, v ktorom sú použité bunkové rastové signalizačné proteíny, ako ras a sos (Broder a ďalší, Curr Biol 1998, 8 str. 1121-4, Aronheim a ďalší, Nucleic Acids Res 1997, 25 str. 3373-4 a tam uvedené citácie). Aby boli funkčné, musia sa
-15tieto proteíny premiestniť do bunkovej membrány. To sa dosiahne expresiou bunkového rastového signalizačného proteínu ako fúzovaného proteínu s prvým proteínom a expresiou bunkového membránového lokalizačného signálu, ako napríklad myristilačnej signálnej sekvencie, vo forme fúzie s druhým proteínom. Interakcia medzi prvým a druhým proteínom premiestni bunkový rastový signálny proteín do bunkovej membrány a tým spustí bunkový rast. Na ďalšie štúdium sú potom vyberané agresívne rastúce bunky. Tento systém sa líši od vyššie opísaného dvojhybridného systému, pretože nezávisí na lokalizácii oboch hybridov v bunkovom jadre.
Výraz “návnada” označuje proteín vo vyššie uvedenom dvojhybridnom teste, ktorý je exprimovaný ako fúzovaný proteín s DNA väzobnou doménou.
Výraz “úlovok” označuje proteín vo vyššie uvedenom dvojhybridnom teste, ktorý je exprimovaný ako fúzia s DNA aktivačnou doménou.
Neuvádza sa tu množstvo spôsobov z oblasti molekulárnej biológie, keďže sú dobre známe pre priemerného odborníka v oblasti. Takéto spôsoby zahŕňajú miestne špecifickú mutagenézu, PCR klonovanie, prehľadávanie fágových knižníc použitím oligonukleotidových alebo cDNA sond, expresiu cDNAs, analýzu rekombinantných proteínov, transformáciu bakteriálnych a kvasinkových buniek, transfekciu cicavčích buniek a podobne. Učebnicami, ktoré opisujú takého spôsoby sú napr. Sambrook a ďalší, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; ISBN: 0879693096, 1989, Current Protocols in Molecular Biology od F. M. Ausubel, ISBN:047150338X, 1988 a Short Protocols in Molecular Biology od F.M. Ausubel a ďalší, 3. vyd. John Wíley & Sons; ISBN: 0471137812, 1995. Tieto publikácie sú tu kompletne zahrnuté prostredníctvom ich citácie.
Na identifikáciu proteínov interagujúcich skaspázou-8 a potenciálnych substrátov je možné použiť dvojhybridnú skríningovú metódu, dvojhybridný alebo trojhybridný systém.
V spôsobe podľa vynálezu je použitý dvojhybridný systém, ktorý je v podstate rovnaký ako je systém opísaný v Fields a Song (Náture 340, str. 245, 1989). Výhodné je zaobstarať si jednotlivé vektory, kvasinkové kmene a knižnice od
-16Clontech (Palo Alto, USA) ako zložky Matchmaker dvojhybridného systému (č. PT1265-1).
Výhodné uskutočnenie kvasinkového dvojhybridného systému, ako je používaný v spôsobe podľa vynálezu, bolo opísané v Boldin a ďalší, Celí 85, str. 803-15, 1996. Kvasinkový dvojhybridný systém bol podrobne opísaný v US patente 5580736, Brent a ďalší. Tieto publikácie sú tu kompletne zahrnuté ich citovaním.
Trojhybridný systém je používaný v podstate rovnako ako je opísané vTirode a ďalší, J. Biol. Chem. 272, str. 22995-9, 1997. Na detekciu proteínov interagujúcich s kaspázou-8 podľa vynálezu je potrebné, aby boli dve podjednotky kaspázy-8 exprimované nezávisle. Za týmto účelom sú dve podjednotky kaspázy-8 výhodne exprimované oddelene pod kontrolou odlišných promótorov. Vo výhodnom uskutočnení je p10 podjednotka kaspázy-8 (serín 375 až kyselina asparágová 479) exprimovaná pod kontrolou slabého promótora pracujúceho v kvasinkách, v jednom čítacom rámci s DNA viažucou doménou. Výhodne je slabým promótorom kvasinkový ADH promótor a DNA viažucim proteínom je DNA viažuca doména kvasinkového transkripčného aktivátora Gal-4 alebo bakteriálneho LexA proteínu. ADH promótor a Gal4 DNA väzobná doména sa nachádzajú napríklad v pGBD, ktorý je komerčne dostupný od Clontech, Palo alto, USA. Avšak pre priemerného odborníka v oblasti je zrejmé, že je možné použiť aj iné promótory, pokiaľ sú funkčné v kvasinkových bunkách. Z rovnakého dôvodu je možné použiť aj iné DNA väzobné domény, pokiaľ tieto DNA väzobné domény nemajú transkripčnú aktivačnú funkciu.
Dlhá, aktívna p20 podjednotka kaspázy-8 (serín 217 až kyselina asparágová 374) je exprimovaná ako nefúzovaný proteín pod kontrolou inducibilného promótora, ktorý je funkčný v kvasinkových bunkách. Výhodne je možné použiť Met25 metionínom represibilný promótor, ktorý je opísaný vo vyššie citovanom Tirode a ďalší. Použitie inducibilného promótora uľahčuje detekciu p10-p20 komplexu imunoprecipitáciou a polyakrylamidovou gélovou elektroforézou. Inducibilný promótor má ďalšie výhody v tom, že umožňuje expresiu proteínu, ktorý môže byť toxický pre kvasinkové bunky v kvasinkách, pretože existuje možnosť obmedziť dobu expresie potenciálne toxického proteinu.
- 17Proteíny, ktoré majú byť prehľadávané spôsobom podľa vynálezu sú výhodne vo forme cDNA knižnice. Avšak môžu byť použité aj genómové knižnice alebo kombinačné knižnice. Knižnica sa naklonuje na C-koniec transkripčnej aktivačnej domény funkčnej v kvasinkách. Výhodne je použitá transkripčná aktivačná doména kvasinkového Gal-4 proteínu, avšak je možné použiť aj veľké množstvo iných transkripčných aktivátorov. Výhodne je na klonovanie knižnice používaný vektor pGAD GH, dostupný od Clontech.
Kvasinkový kmeň používaný na skríning musí obsahovať selekčný marker, ako napríklad histidínsyntetázu, pod kontrolou promótora, ktorý obsahuje DNA sekvenciu, na ktorú sa špecificky viaže vyššie uvedená DNA väzobná doména. Výhodne obsahujú kvasinkové bunky aj reporterový gén pod kontrolou promótora, ktorý obsahuje DNA sekvenciu, na ktorú sa špecificky viaže vyššie uvedená DNA väzobná doména. Na skríning hybridov s Gal-4 väzobnou doménou je možné použiť kvasinkový kmeň HF7c dostupný od Clontech; a keď je použitá lexA DNA väzobná doména je možné použiť kmeň L40.
Po transformácii sa kvasinkové bunky kultivujú v podmienkach, ktoré sú selektívne pre aktívne vysievanie na médiá bez určitých aminokyselín, a to do takých podmienok, ktoré sú potrebné pre stabilitu plazmidov, ktoré sa do nich zaviedli.
Médium je selektívne pre kvasinkové bunky, v ktorých je aktivovaný gén pre vyššie uvedený selekčný marker. Výhodne je selekčným markerom gén pre histidínsyntetázu. Kvasinkové bunky, ktoré exprimujú tento gén, môžu byť vybrané na kultiváciu v médiu bez histidínu. Výhodou tohto systému je možnosť pridať inhibítor histidínsyntetázy, 3-aminotriazol, do rastového média. Takže je možné inhibovať rast kvasinkových buniek, v ktorých sa exprimuje malé množstvo histidínsyntetázy, čo je spôsobené prepúšťaním promótora obsahujúceho sekvenciu, na ktorú sa špecificky viaže vyššie uvedená DNA väzobná doména. V niektorých klonoch môže slabá, nešpecifická interakcia medzi podjednotkou p10 a/alebo p20 kaspázy-8 a uvedeným klonom spôsobiť falošnú aktiváciu uvedeného promótora. Takže zvýšením koncentrácie inhibítora v médiu použitom na selekciu
-18interagujúcich klonov je možné vybrať len klony, ktoré interagujú určitou minimálnou silou. Koncentrácia 3-aminotriazolu je výhodne 7,5 mM.
Klony identifikované prostredníctvom ich schopnosti rásť v médiu bez histidínu sa ďalej analyzujú kvantifikáciou aktivity ich reporterového génu. Ako reporterový gén sa výhodne používa lacZ gén. Kvantifikácia lacZ aktivity sa výhodne uskutočňuje v kvapalnej kultúre, ako je opísané v Boldin a ďalší, J. Biol. Chem.270, 7795-8, 1995.
Vyššie opísaná skríningová metóda sa môže uskutočňovať podobne použitím dvojhybridného testu. Základným rozdielom je, že podjednotky kaspázy-8 sú exprimované ako jeden peptidový reťazec, ktorý je fúzovaným proteínom s vyššie uvedenou DNA viažucou doménou. Ako je opísané nižšie, p20 podjednotka je mutovaná v svojom aktívnom mieste (cysteín 360-serín 360).
Výhodne je p10 podjednotka oddelená od p20 podjednotky spojovníkom, ktorý je výhodne dlhý 10 až 50 aminokyselín. Výhodne obsahuje spojovník malé aminokyseliny bez náboja, ako glycin, serín, treonín, alanín a valín. Výhodnejšie obsahuje spojovník serínové a glycínové zvyšky. Najvýhodnejšie je pomer medzi glycínovými a serínovými zvyškami v spojovníku približne 3:1 až 4:1.
Získanie klonov použitím dvojhybridného systému s vyššie opísanou kaspázou-8 ako návnadou je podobné s vyššie opísaným použitím trojhybridného systému, s tou výnimkou, že v skutočnosti nie je možné jednoducho rozlíšiť klony, ktoré sa viažu len na jednu z podjednotiek, od klonov, ktoré sa viažu na obe, alebo od podjednotiek, ktoré vyžadujú pre viazanie komplex oboch podjednotiek. Avšak ktorýkoľvek kloň nájdený dvojhybridnou metódou je možné jednoducho testovať z hľadiska väzby na dve podjednotky stanovením lacZ aktivity dvojitých transformantov, tzn., kvasinkových buniek, ktoré sú transformované novo identifikovaným klonom a buď p10, alebo p20 podjednotkou kaspázy-8, pričom daná podjednotka je fúzovaná s DNA viažucou doménou. Väzbu na komplex p10 a p20 podjednotky je možné tiež jednoducho stanoviť, a to determináciou lacZ aktivity trojitých transformantov, v ktorých je jedna z podjednotiek kaspázy-8 exprimovaná ako fúzovaný proteín s DNA väzobnou doménou a druhá podjednotka je exprimovaná ako nefúzovaný proteín. Je zrejmé, že vyššie opísaný trojhybridný
-19systém je tiež užitočný na stanovenie väzobných charakteristík klonov nájdených dvojhybridným systémom, keďže v ňom použitý inducibilný promótor umožňuje rýchlu identifikáciu klonov, ktoré interagujú len s p10 podjednotkou alebo s p10-p20 komplexom podjednotiek.
Klony, ktoré sú schopné rásť v médiu bez histidínu a majú lacZ aktivitu, sa potom vyberú na ďalšie štúdium. Najprv sú proteíny kódované týmito klonmi testované z hľadiska ich schopnosti viazať sa na nerelevantné proteíny, ako napríklad lamín. Vo všeobecnosti sa lamín-viažuce klony vyraďujú.
Klony, o ktorých sa zistí, že špecificky interagujú s kaspázou-8, sa potom ďalej analyzujú. To sa uskutočňuje tak s čiastočnými klonmi získanými priamo vyššie uvedenými skríningovými postupmi, ako aj s klonmi s úplnou dĺžkou, ktoré sa získavajú na základe sekvencie uvedených čiastočných klonov. Na získanie klonov s úplnou dĺžkou sa získava sekvencia čiastočného klonu extrakciou DNA uvedeného klonu z kvasinkových buniek spôsobmi, ktoré sú známe pre priemerného odborníka v oblasti. DNA sa potom transformuje do baktérií, aby sa získali veľké množstvá purifikovanej DNA, ktorá môže byť použitá na sekvenovanie. Alternatívne je možné za účelom sekvenovania, vystrihnúť inzert z vektora, ktorý je výhodne vyššie uvedený pGBD vektor, použitím enzýmov a je možné klonovať ho do iného vektora, ako napríklad pBluescript dostupného od Stratagene. Sekvenovanie sa uskutočňuje reťazcovým terminačným spôsobom, výhodne použitím enzýmu sekvenázy 2, ktorý je dostupný v sekvenčnom kite od United States Biochemicals.
Takto získaná sekvencia sa potom môže vložiť do databázového rešeržného programu a je možné identifikovať prekrývajúce sa sekvencie prostredníctvom prehľadávania počítačom. Používané programy sú známe priemernému odborníkovi v oblasti a zahŕňajú napr. GCG (genetická komputerová skupina) paket. Výhodne sa používa rešeržné vybavenie ako Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) dostupné na EMBL serveri (napr. http://dove.emblheidelberg.de/Blast2/). Blastn príkaz je možné použiť na prieskum nukleotidových sekvencií, ktoré sa prekrývajú alebo sú podobné s identifikovaným klonom.
-20Proteín identifikovaný spôsobom podľa vynálezu je poskytnutý ako fúzovaný proteín s DNA viažucou doménou. Preto je potrebné, aby bol známy čítací rámec, v ktorom má byť nukleová kyselina translatovaná, keďže musí byť v čítacom rámci s kódujúcou sekvenciou DNA viažucej domény. DNA sekvencia klonu identifikovaného podľa vynálezu sa tak môže jednoznačne translatovať do aminokyselinovej sekvencie. Potom sa môže použiť Blastp program dostupný na vyššie uvedenom EMBL serveri na identifikáciu prekrývajúcich sa proteínových sekvencií alebo na identifikáciu podobných proteínov.
Alternatívne alebo okrem vyššie uvedených spôsobov prieskumu databáz, je možné prehľadávať knižnicu, ako napríklad genomickú alebo cDNA knižnicu, aby sa identifikovali úplné klony. Takéte skríningové metódy sú opísané vo vyššie uvedených publikáciách Sambrook a ďalší a Ausubel a ďalší. Alternatívne alebo zároveň je možné použiť klonovacie techniky založené na PCR, akou je napríklad rýchla amplifikácia cDNA koncov (5' a 3' RAČE, Graham a ďalší, Biochem Biophys Res Commun 177, str. 8-16, 1991 a tam uvedené citácie).
Čiastočné klony identifikované v skríň ing ovom teste podľa vynálezu alebo klony s úplnou dĺžkou získané akoukoľvek z vyššie uvedených metód sa ďalej skúmajú. To sa uskutočňuje napr. testovaním citlivosti týchto klonov na proteolytické štiepenie s aktívnou kaspázou-8. Tento test sa môže uskutočňovať in vivo. Za týmto účelom sa transfekuje cicavčia bunková línia expresným vektorom, ktorý produkuje proteín klonovaný klonom, ktorý sa má testovať, a expresným vektorom kódujúcim druhý proteín, ktorého expresia bude indukovať aktivitu kaspázy-8. Tieto expresné vektory výhodne obsahujú silný promótor na expresiu klonu a duhého proteinu, ako napríklad promótor Rous sarkómového vírusu (RVS, Yamamoto a ďalší, Celí 22, str. 787-97, 1980), myeloproliferatívneho sarkómového vírusu (MPSV, Artelt P a ďalší, Gene 68, str. 213-9, 1988), cytomegalovírusu (CMV, Thomsen a ďalší, PNAS 81, str. 659-63, 1984) alebo podobné promótory vírusového alebo bunkového pôvodu.
Druhý proteín, ktorého expresia indukuje aktivitu kaspázy-8, je vybraný zo skupiny zahŕňajúcej Fas-vnútrobunkovú doménu, CD120a vnútrobunkovú doménu, Mort-1, kaspázu-8 alebo ekvivalentný proteín, ktorý je schopný indukovať aktivitu
-21 kaspázy-8. Alternatívne je možné indukovať aktivitu kaspázy-8 v bunkách pôsobením TNF alebo CD95-ligandu. Experimenty, ktoré podrobne opisujú možný mechanizmus a ďalšie technické podrobnosti tohto typu testu sa nachádzajú vo vyššie uvedenej publikácii Boldin a ďalší, Celí 1996.
Po zavedení vyššie opísaného expresného vektora, ktorý kóduje druhý proteín a proteín, ktorý má byť testovaný, do cicavčej bunky, kultivuje sa kultúra počas doby, ktorá je dostatočná na umožnenie expresie proteínov, aktiváciu alebo expresiu kaspázy-8 a na poštiepenie testovaného proteínu. Uvedená doba trvá zvyčajne 4 až 72 hodín, výhodne 16 až 30 hodín, najvýhodnejšie 20 až 24 hodín. Za účelom stanovenia rozsahu štiepenia sa pripraví celkový bunkový lyzát. Alternatívne je možné purifikovať cieľový proteín použitím anti-príveskových protilátok alebo nikel-nitriltrioctovou kyselinovou chromatografiou, pre ktorú sú reakčné činidlá a podrobné protokoly dostupné od Qiagen GmbH, Hilden, Nemecko. Imunoprecipitačná technika je opísaná vo vyššie uvedenej publikácii Boldin a ďalší, Celí, 1996. Reakčné činidlá a inštrukcie na imunoprecipitáciu sú dostupné od Boehringer Mannheim, Mannheim, Nemecko, vo forme kitu.
Celý bunkový lyzát purifikovaného proteínu sa potom rozdelí podľa veľkosti SDS polyakrylamidovou gélovou elektroforézou.
Testovaný proteín alebo jeho fragmenty s príveskami je potom možné vizualizovať western blot technikou použitím anti-príveskových protilátok. Výhodným príveskom je histidínový prívesok v kombinácii s anti-polyhistidínovou protilátkou. Avšak je možné použiť aj iné kombinácie príveskovej sekvencie a voči nej špecifickej protilátky, pokiaľ protilátka ostáva špecifická voči príveskovej sekvencie, tzn. nerozoznáva iné proteíny, v celkovom bunkovom lyzáte. Špecificita štiepenia sa môže overiť kontrolnými reakciami, v ktorých sa pridáva špecifický kaspázový inhibítor ku cicavčej bunkovej kultúre. Výhodný inhibítor je vybraný z zVAD-fmk, zDEVD-fmk, zlETD-fmk (pozri Keppler-Hafkerneyer a ďalší, Biochemistry 37, str. 16934-42, 1998). Výhodnejším inhibítorom je zVAD-fmk. Inými inhibítormi, ktoré je možné použiť, sú proteíny ako Bclx alebo p35 proteín, ktoré účinkujú ako bunkové inhibitory kaspáz. Inhibícia štiepenia, keď sú takéto proteíny koexprimované v tomto teste, indikuje, že štiepenie je špecifické pre kaspázy.
-22Druhým testom na testovanie toho, či je testovaný proteín štiepený kaspázou-8, je in vitro test, v ktorom je rekombinantné produkovaná kaspáza-8 použitá v enzymatickej reakcii spolu so značeným testovaným proteínom. Testovaný proteín je možné vyrobiť, ako bolo opísané vyššie, klonovaním jeho kódujúcej sekvencie do expresného vektora obsahujúceho silný promótor a jeho transfekciou do cicavčej bunky. Výhodne má testovaný proteín prívesok, ako bolo opísané vyššie, aby mohol byť purifikovaný z cicavčieho bunkového extraktu antipríveskovými protilátkami alebo inými činidlami, ktoré sú schopné špecificky sa viazať na príveskovú sekvenciu. Alternatívne je možné vyrábať testovaný proteín in vitro použitím in vitro translačného systému. Technika in vitro translácie je pre priemerného odborníka v oblasti dobre známou, a reakčné činidlá a podrobné protokoly sú dostupné napríklad od Stratagene, La Jolla, USA.
Alternatívne je možné testovaný proteín označiť napr. použitím rádioizotopu. Výhodne, keď sa použije značenie izotopom, je testovaný proteín exprimovaný in vitro a počas in vitro translačnej reakcie sa pridáva izotopicky značená aminokyselina spolu s neznačenou aminokyselinou. Výhodným izotopom je S35. Výhodne je značenou aminokyselinou S35-metionín a pomer medzi značenou a neznačenou aminokyselinou je 1:1 až približne 1:1000.
Rekombinantné produkovaný testovaný proteín a rekombinantné produkovaný aktívny enzým kaspáza-8 sa potom spoja vo vhodnom tlmivom roztoku a počas doby, ktorá postačuje na to, aby nastalo štiepenie. Výhodný tlmivý roztok a iné výhodné parametre testu sú opísané vo vyššie uvedenej publikácii Boldin a ďalší, Celí 1996. Výhodná doba je medzi 10 minútami a niekoľkými hodinami, výhodne medzi 30 minútami a jednou hodinou.
Potom, ako sa umožní štiepenie, rozdelí sa reakčná zmes podľa veľkosti SDS polyakrylamidovou elektroforézou. Ak bolo použité izotopové značenie, je možné vysušiť gén a izotop detegovať prostredníctvom fotografického filmu alebo fosfoimagingom (Fuji) Testovaný proteín má prívesok a môže byť detegovaný použitím protilátok špecifických pre prívesok Western blotom.
Objavenie sa ďalších pásov s nízkou molekulovou hmotnosťou v reakčnej zmesi, do ktorej bol pridaný proteín kaspázy-8, v porovnaní s kontrolnou reakčnou
-23zmesou bez kaspázy-8, indikuje štiepenie testovaného proteínu kaspázou-8. Navyše veľkosť pásov s nízkou molekulovou hmotnosťou indikuje približné umiestnenie štiepneho miesta.
Predložený vynález sa týka DNA sekvencie kódujúcej proteíny interagujúce s kaspázou-8.
Navyše sa predložený vynález ďalej týka DNA sekvencií, ktoré kódujú biologicky aktívnu izoformu, alelický variant, fragment, funkčný analóg, mutant alebo derivát proteínu interagujúceho s kaspázou-8, a proteínu, izoformy, alelického variantu, fragmentu, funkčného analógu, mutantu alebo derivátu, ktoré sú kódované týmito sekvenciami. Príprava takýchto analógov, fragmentov, mutantov a derivátov je štandardným postupom (pozri napríklad Sambrook a ďalší, 1989), v ktorom je v DNA sekvenciách kódujúcich proteín interagujúci s kaspázou-8, jeden alebo viacero kodónov deletovaných, pridaných alebo substituovaných, aby sa získali analógy, ktoré obsahujú najmenej jednu zmenu aminokyselinového zvyšku v porovnaní s prirodzeným proteínom.
Okrem vyššie uvedených DNA sekvencií podľa vynálezu, ktoré kódujú proteín interagujúci s kaspázou-8, jeho izoformu, alelický variant, fragment, funkčný analóg, mutant alebo derivát, do rozsahu vynálezu spadajú aj DNA sekvencie, ktoré sú schopné hybridizovať s cDNA sekvenciou odvodenou od kódujúcej oblasti prirodzeného proteínu interagujúceho s kaspázou-8, pričom takáto hybridizácia sa uskutočňuje v stredne prísnych podmienkach, a hybridizovateľné DNA sekvencie kódujú biologicky aktívny proteín interagujúci s kaspázou-8. Takže tieto hybridizovateľné DNA sekvencie zahŕňajú DNA sekvencie, ktoré majú relatívne vysokú homológiu s cDNA sekvenciou pre prirodzený proteín interagujúci s kaspázou-8, a predstavujú teda sekvencie podobné proteínu interagujúcemu s kaspázou-8, ktoré môžu byť napríklad prirodzené derivovanými sekvenciami kódujúcimi rôzne izoformy proteínu interagujúceho s kaspázou-8 alebo prirodzene sa vyskytujúce sekvencie kódujúcich proteínov, ktoré patria do skupiny sekvencií podobných proteínu interagujúcemu s kaspázou-8, ktoré kódujú proteín majúci aktivitu proteínu interagujúceho s kaspázou-8. Navyše tieto sekvencie môžu zahŕňať napríklad aj synteticky vyrábané sekvencie, ktoré sa prirodzene
-24nevyskytujú, a ktoré sú podobné s cDNA sekvencou prirodzeného proteínu interagujúceho s kaspázou-8, ale obsahujú množstvo želateľných modifikácií. Takže takéto syntetické sekvencie zahŕňajú všetky možné sekvencie kódujúce analógy, fragmenty a deriváty proteínu interagujúceho s kaspázou-8, ktoré všetky majú aktivitu proteínu interagujúceho s kaspázou-8.
Prísnosť podmienok je funkciou použitej teploty v hybridizačnom experimente, molarity monovalentných katiónov a percentuálneho zastúpenia formamidu v hybridizačnom roztoku. Na stanovenie stupňa prísnosti daných podmienok je najprv použitý vzťah podľa Meinkotha a ďalších (1984) na stanovenie stability hybridov, ktoré sú na 100 % zhodné, pričom sa stanovuje teplota topenia Tm DNA-DNA hybridu:
Tm = 81,5 °C + 16,6 (LogM) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L, kde M je molarita monovalentných katiónov, %GC je percentuálny podiel G a C nukleotidov v DNA, % form je percenutálny podiel formamidu v hybridizačnom roztoku a L je dĺžka hybridu v bázových pároch. Pre každý 1 °C, o ktorý je Tm znížená oproti hodnote vypočítanej pre 100% zhodný hybrid, sa zvyšuje množstvo povolených nespárovaných báz o približne 1%. Takže ak je hodnota Tm použitej v danom hybridizačnom experimente pri uvedených koncentráciách soli a formamidu o 10 °C nižšia ako hodnota Tm vypočítanej pre 100% hybrid podľa Meinkothovej rovnice, nastane hybridizácia až do približne 10% nespárovaných báz.
Stredne prísne podmienky sú také podmienky, pri ktorých je hodnota Tm nie viac ako o 20 °C nižšia ako Tm, ktorá by existovala pri perfektnom duplexe s cieľovou sekvenciou, buď podľa výpočtov použitím vyššie uvedeného vzorca, alebo skutočne odmeranej. Bez toho, aby uvedené skutočnosti boli obmedzujúce, stredne prísne podmienky (o 15 až 20 °C nižšia hodnota ako vypočítaná alebo odmeraná Tm hybridu) využívajú premývací roztok 2xSSC (štandardný fýziologický roztok-citrát) a 0,5% SDS (dodecylsulfát sodný) pri príslušnej teplote pod vypočítanou Tm hybridu. Konečná prísnosť podmienok primárne závisí na premývacích podmienkach, najmä ak sú použité také hybridizačné podmienky, ktoré umožňujú formovanie menej stabilných hybridov spolu so stabilnými hybridmi. V prísnejších premývacích
-25podmienkach sa potom odstránia menej stabilné hybridy. Bežné hybridizačné podmienky, ktoré môžu byť použité so stredne prísnymi premývacimi podmienkami opísanými vyššie, sú hybridizácia v roztoku 6 x SSC (alebo 6 x SSPE (štandardný fyziologický roztok-fosfát-EDTA)), 5 x Denhardtovo reakčné činidlo, 0,5% SDS, 100 pg/ml denaturátov, fragmentovaná losocia spermatická DNA, pri teplote približne o 20 °C až 25 °C nižšej ako Tm. Ak sú použité zmiešané sondy, je výhodné použiť tetrametylamóniumchlorid (TMAC) namiesto SSC (Ausubel, 1987,1999).
Na získanie rôznych vyššie uvedených prirodzene sa vyskytujúcich sekvencií podobných proteínu interagujúcemu s kaspázou-8 je možné použiť štandardné postupy vyhľadávania a izolácie prirodzene odvodených DNA alebo RNA vzoriek z rôznych tkanív použitím cDNA prirodzeného proteínu interagujúceho s kaspázou-8 alebo jej časti ako sondy (pozri napríklad štandardné postupy uvedené v Sambrook a ďalší, 1989).
Vynález sa týka proteínu interagujúceho s kaspázou-8, ktorý je možné identifikovať vyššie opísaným skríningovým testom. Vynález sa týka aj polypeptidu alebo proteínu, ktorý v podstate zodpovedá proteínu interagujúcemu s kaspázou-8. Výraz v podstate zodpovedá zahŕňa nie len proteín interagujúci s kaspázou-8, ale aj polypeptidy alebo proteíny, ktoré sú jeho analógmi.
Analógmi, ktoré v podstate zodpovedajú proteínu interagujúcemu s kaspázou-8, sú také polypeptidy, v ktorých je jedna alebo viacero aminokyselín v aminokyselinovej sekvencii proteínu interagujúceho s kaspázou-8 nahradená inou aminokyselinou, je deletovaná a/alebo vložená, s tou podmienkou, že výsledný proteín vykazuje v podstate rovnaký alebo vyšší biologický účinok ako proteín interagujúci s kaspázou-8, ktorému zodpovedá.
Ak majú takéto izoformy v podstate zodpovedať proteínu interagujúcemu s kaspázou-8, sú vo všeobecnosti zmeny v sekvencii proteínov interagujúcich s kaspázou-8 malé. Hoci počet zmien môže byť vyšší ako desať, výhodne počet zmien nie je vyšší ako desať, výhodnejšie nie je vyšší ako päť a najvýhodnejšie nie je vyšší ako tri. Hoci môže byť použitá akákoľvek technika na nájdenie potenciálnych biologicky účinných proteínov, ktoré v podstate zodpovedajú
-26proteínom interagujúcim s kaspázou-8, jednou takouto technikou je použitie bežných mutagenizačných technika na DNA kódujúcu proteín, ktorých výsledkom je niekoľko modifikácií. Proteiny exprimované v takýchto klonoch sa potom môžu skrínovať z hľadiska ich scchopnosti viazať kaspázu-8 a modulovať účinok kaspázy-8 vo vyššie uvedených modulačných/sprostredkovacích vnútrobunkových dráhach.
Konzervatívne zmeny sú také zmeny, od ktorých by sa nedalo očakávať, že zmenia účinok proteinu a zvyčajne sa skrínujú prvé, keďže sa od nich nedá očakávať, že by podstatne menili veľkosť, náboj alebo konfiguráciu proteinu, a teda sa nedá očakávať, že by menili jeho biologické vlastnosti. Konzervatívne substitúcie v proteínoch interagujúcich s kaspázou-8 zahŕňajú analóg, v ktorom je najmenej jeden aminokyselinový zvyšok v polypeptide konzervatívne nahradený odlišnou aminokyselinou. Takéto substitúcie sa výhodne uskutočňujú v súlade s nasledujúcim zoznamom uvedeným v tabuľke IA, pričom tieto substitúcie je možné stanoviť rutinným experimentovaním tak, aby sa získali modifikované štruktúrne a funkčné vlastnosti syntetizovanej polypeptidovej molekuly, a aby sa zároveň zachoval biologický účinok charakteristický pre proteín interagujúci s kaspázou-8.
Tabuľka IA Pôvodný zvyšok
Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Gin
Glu
Gly
His lle
Lys
Príkladná substitúcia
Gly; Ser
Lys
Gin; His
Glu
Ser
Asn
Asp
Ala; Pro Asn; Gin Leu; Val Arg; Gin; Glu
Met Leu; Tyr; lle
Phe Met; Leu; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp; Phe
Val lle; Leu
Alternatívne, inou skupinou substitúcií v proteíne interagujúcom s kaspázou8 sú substitúcie, pri ktorých je najmenej jeden aminokyselinový zvyšok v poiypeptide nahradený odlišným zvyškom podľa nasledujúcej tabuľky IB. Typy substitúcií, ktoré je možné uskutočniť v poiypeptide, sa môžu zakladať na analýze frekvencií aminokyselinových zmien medzi homológnymi proteinmi odlišných druhov, ako napríklad na analýze prezentovenej v Tabuľke 1-2 v publikácii Schulz a ďalší, G.E., Principles of Protein Structure Springer-Verlag, New York, NY, 1998, a na obrázkoch 3 až 9 v publikácii Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA 1983. Na základe takýchto analýz sú tu definované konzervatívne substitúcie ako výmeny v rámci jednej z nasledujúcich piatich skupín:
Tabuľka IB
1. Malé, alifatické, nepoláme alebo slabo polárne zvyšky: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);
2. Polárne, záporne nabité zvyšky a ich amidy: Asp, Asn, Glu, Gin;
3. Polárne, kladne nabité zvyšky: His, Arg, Lys;
4. Veľké, alifatické, nepoláme zvyšky: Met, Leu, lle, Val (Cys); a
5. Veľké, aromatické zvyšky: Phe, Tyr, Trp.
Tri aminokyselinové zvyšky, ktoré sú vyššie uvedené v zátvorkách, majú v proteínovej architektúre špeciálnu úlohu. Gly je jediným zvyškom, ktorý nemá žiadny bočný reťazec a teda zavádza do reťazca flexibilitu. To však má tendenciu posilňovať vytvorenie inej ako α-závitnicovej sekundárnej štruktúry. Pro, kvôli svojej
-28nezvyčajnej geometrii, tesne stláča reťazec, a vo všeobecnosti má tendenciu napomáhať vytvoreniu štruktúr podobných β-skladanému listu, hoci v niektorých prípadoch môže byť Cys schopný podieľať sa na vytvorení disulfidovej väzby, ktorá je dôležitá pre poskladanie proteínu. Treba poznamenať, že podľa vyššie uvedenej publikácie Schulz a ďalší by sa skupiny 1 a 2 zlúčili. Treba tiež poznamenať, že vďaka svojmu potenciálu vytvárať vodíkové väzby je Tyr významne príbuzný so Ser a Thr, atď.
Konzervatívne aminokyselinové substitúcie podľa predloženého vynálezu, napríklad vyššie uvedené substitúcie, sú v oblasti známe, a očakáva sa od nich, že zachovávajú biologické a štruktúrne vlastnosti polypeptidu po aminokyselinovej substitúcií. Väčšina delécií a substitúcií podľa predloženého vynálezu je takých, že nespôsobujú radikálne zmeny vlastností proteínovej alebo polypeptidovej molekuly. Vlastnosti sú definované tak ako zmeny v sekundárnej štruktúre, napr. a-helix alebo β-skladaný list, ako aj zmeny biologického účinku, napr. väzba na kaspázu-8 a/alebo sprostredkovanie účinku kaspázy-8 na bunkovú smrť.
Príklady produkcie aminokyselinových substitúcií v p rote í n och, ktoré môžu byť použité na získanie analógov proteínov interagujúcich s kaspázou-8 na použitie podľa vynálezu, zahŕňajú akékoľvek známe spôsobové kroky, ako je uvedené napríklad v US patente RE 33653, 4959314, 4588585 a 4737462, Mark a ďalší; 5116943 Koths a ďalší, 4965195 Namen a ďalší, 4879111 Chong a ďalší, a 5017691 Lee a ďalší; a lyzín substituované proteíny uvedené v US patente č. 4904584 (Shaw a ďalší).
Do rozsahu vynálezu spadajú okrem vyššie uvedených substitúcií, ktoré by nemali významne meniť účinok proteínu interagujúceho s kaspázou-8, aj konzervatívne substitúcie alebo menej konzervatívne a náhodnejšie zmeny, ktoré vedú ku zvýšeniu biologického účinku analógov proteínov interagujúcich s kaspázou-8.
Pre priemerného odborníka v oblasti je zrejmé, že keď sa má stanoviť presný účinok substitúcie alebo delécie, bude sa ich účinok stanovovať rutinným väzobným
-29testom a testom bunkovej smrti. Skríning využívajúci takýto štandardný test nezahŕňa nadmerné experimentovanie.
Prijateľnými analógmi interagujúcimi s kaspázou-8 sú analógy, ktoré si zachovávajú aspoň schopnosť interagovať s kaspázou-8 a tým sprostredkovať účinok kaspázy-8 vo vnútrobunkových dráhach, alebo modulovať účinok samotnej kaspázy-8. Takýmto spôsobom je možné vytvoriť analógy, ktoré majú takzvaný dominantný negatívny účinok, konkrétne analógy, ktoré sú chybné buď pri viazaní na kaspázu-8, alebo v následnej signalizačnej alebo inej aktivite, ktorá nasleduje po takomto naviazaní sa. Takéto analógy môžu byť použité napríklad na inhibíciu cytotoxického účinku kaspázy-8 alebo na jeho zvýšenie, v závislosti na tom, či je želateľné zvýšiť bunkovú smrť alebo bunkové prežívanie, a v závislosti na tom, ktorý z týchto účinkov je prevažne modulovaný interakciou medzi proteínom interagujúcim s kaspázou-8 a kaspázou-8 (pozri vyššie) a to tak, že tieto analógy súťažia s prirodzeným proteínom interagujúcim s kaspázou-8 pri väzbe alebo interakcii s kaspázou-8.
Na genetickej úrovni sa tieto analógy vo všeobecnosti pripravujú miestneriadenou mutagenézou nukleotidov v DNA kódujúcej proteín interagujúci s kaspázou-8, čím sa vytvorí DNA kódujúca analóg, a potom syntézou DNA a expresiou polypeptidu v rekombinantnej bunkovej kultúre. Tieto analógy typicky vykazujú rovnaký alebo zvýšený kvalitatívny biologický účinok v porovnaní s prirodzene sa vyskytujúcim proteínom, Ausubel a ďalší, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 19871995; Sambrook a ďalší, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Príprava proteínu interagujúceho s kaspázou-8 podľa vynálezu alebo alternatívnej nukleotidovej sekvencie kódujúcej rovnaký polypeptid, ktorá sa však líši od prirodzenej sekvencie kvôli známej degenerácii genetického kódu, sa môže dosiahnuť miestne-špecifickou mutagenéhou DNA, ktorá kóduje skôr pripravený analóg alebo prirodzenú verziu proteínu interagujúceho s kaspázou-8. Miestne špecifická mutagenéza umožňuje produkciu analógov prostredníctvom použitia špecifických oligonukleotidových sekvencií, ktoré kódujú DNA sekvenciu s
-30požadovanou mutáciou, ako aj dostatočné množstvo priľahlých nukleotidov, čím je poskytnutá primerová sekvencia s dostatočnou veľkosťou a sekvenčnou komplexitou na vytvorenie stabilného duplexu na oboch stranách delečnej spojky, ktorá sa má preklenúť. Typickým výhodným primerom je primer s dĺžkou 20 až 25 nukleotidov, pričom má 5 až 10 komplementujúcich nukleotidov na oboch stranách sekvencie, ktorá sa má meniť. Vo všeobecnosti je technika miestne-špecifickej mutagenézy v oblasti dobre známa, čo je ilustrované napríklad v publikácii Adelman a ďalší, DNA 2:183 (1983), ktorej opis je tu zahrnutý touto citáciou.
Ako bude zrejmé, miestne špecifická mutagenizačná technika typicky využíva fágový vektor, ktorý existuje tak v jednovláknovej, ako aj v dvojvláknovej forme. Typické vektory užitočné na miestne-riadenú mutagenézu zahŕňajú vektory ako M13 fág, napríklad ako je opísané v Messing a ďalší, Third Cleveland Symposium on Macromoleculs and Recombinant DNA, vyd. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), pričom opis tejto publikácie je tu zahrnutý jej citáciou. Tieto fágy sú jednoducho komerčne dostupné a pre priemerného odborníka v oblasti je ich použitie dobre známe. Na získanie jednovláknovej DNA môžu byť alternatívne použité plazmidové vektory, ktoré obsahujú počiatok replikácie jednovláknového fága (Veira a ďalší, Meth. Enzymol. 153:3,1987).
Vo všeobecnosti sa tu opísaná miestne-riadená mutagenéza uskutočňuje tak, že sa najprv získa jednovláknový vektor, ktorý v rámci svojej sekvencie obsahuje DNA sekvenciu, ktorá kóduje relevantný polypeptid. Oligonukleotidový primer nesúci požadovanú mutovanú sekvenciu sa pripravuje synteticky, automatizovanou DNA/oligonukleotidovou syntézou. Tento primer sa potom aneluje s jednovlákovým vektorom obsahujúcim proteín kódujúcu sekveniu a reakčná zmes sa ošetrí s DNA-polymerizačnými enzýmami, ako E.coli polymerázovým I Klenowovým fragmentom, aby sa skompletizovala syntéza vlákna, ktoré nesie mutáciu. Tento heteroduplexový vektor sa potom použije na transfomáciu príslušných buniek, ako napríklad E. coli JM101 buniek, a vyberú sa klony, ktoré obsahujú rekombinantné vektory nesúce mutovanú sekvenciu.
Po výbere takéhoto klonu je možné vybrať mutovanú sekvenciu proteínu interagujúceho s kaspázou-8 a umiestniť ju do vhodného vektora, vo všeobecnosti
-31 do transferového alebo expresného vektora takého typu, ktorý môže vyť použitý na transfekciu príslušného hostiteľa.
Z toho vyplýva, že gén alebo nukleovú kyselinu kódujúcu proteín interagujúci s kaspázou-8 je možné tiež detekovať, získať a/alebo modifikovať in vitro, in situ a/alebo in vivo, použitím známych DNA alebo RNA amplifikačných techník, ako napríklad PCR a chemickej oligonukleotidovej syntézy. PCR umožňuje amplifikáciu (zvýšenie počtu) špecifických DNA sekvencií opakovanými DNA polymerizačnými reakciami. Táto reakcia sa môže použiť ako náhrada klonovania; všetko čo je potrebné, je znalosť sekvencie nukleovej kyseliny. Aby sa uskutočnila PCR, sú navrhnuté primery, ktoré sú komplementárne so študovanou sekvenciou. Tieto primery sa potom generujú automatizovanou DNA syntézou. Pretože primery je možné navrhnúť tak, aby hybridizovali s ktoroukoľvek časťou génu, je možné vytvoriť také podmienky, aby boli tolerované nepresnosti pri komplementárnom párovaní báz. Ampiifikácia týchto nespárovaných oblastí môže viesť ku syntéze mutovaného produktu, čoho výsledkom je generovanie peptidu s novými vlastnosťami (tzn. miestne riadená mutagenéza). Pozri aj napr. Ausubel, vyššie, kapitola 16. Ako východiskový materiál na syntézu extracelulárnej domény prolaktínového receptora bez klonovania môže byť použitá RNA, ktorá vznikne spojením DNA (cDNA) syntézy použitím reverznej transkriptázy, a PCR.
Navyše, PCR primery môžu byť navrhnuté tak, aby obsahovali nové reštrikčné miesta alebo iné znaky, ako napríklad terminačné kodóny na koncoch génového segmentu, ktorý sa má amplifikovať. Toto umiestnenie reštrikčných miest na 5' a 3' konci amplifikovanej génovej sekvencie umožňuje, aby boli génové segmenty kódujúce proteín interagujúci s kaspázou-8 alebo jeho fragment navrhnuté na ligáciu s inými sekvenciami a/alebo do klonovacích miest vektorov.
PCR a iné spôsoby amplifikácie RNA a/alebo DNA sú v oblasti dobre známe a môžu byť použité podľa predloženého vynálezu bez nadmerného experimentovania, na základe tu uvedeného opisu a návodu. Známe spôsoby DNA alebo RNA amplifikácie zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na, polymerázovú reťazovú rekaciu (PCR) a príbuzné amplifikačné spôsoby (pozri napr. US patenty č. 4683195, 4683202, 4800159, 4965188 Mullis a ďalší; 4795699 a 4921794 Tábor a ďalší;
-325142033 Innis; 5122464 Wilson a ďalší; 5091310 Innis; 5066584 Gyllensten a ďalší; 4889818 Gelfand a ďlaší; 4994310 Silver a ďalší; 4766067 Biswas; 4656134 Ringold; a Innis a ďalší, vyd. PCR Protocols: A Guide to Method and Applications) a RNA sprostredkované amplifikácie, ktoré využívajú anti-sense RNA voči cieľovej sekvencii ako templát pre syntézu dvojvláknovej DNA (US patent č. 5130238 Malek a ďalší, s komerčným názvom NASBA); imuno-PCR, ktorá kombinuje použitie DNA amplifikácie s protilátkovým značením (Ružička a ďalší, Science 260: 487 (1993); Sano a ďalší, Science 258:120 (1992); Sano a ďalší, Biotechniques 9:1378 (1991), pričom obsah všetkých citovaných publikácií a patentov je zahrnutý do tohto opisu.
Analogickým spôsobom, ako bolo uvedené vyššie vo vzťahu k analógom proteínu interagujúcemu s kaspázou-8, je možné pripraviť biologicky účinné fragmenty proteínov interagujúcich s kaspázou-8 (napr. fragmenty ktoréhokoľvek z proteínov interagujúcich s kaspázou-8 alebo jeho izoforiem). Vhodnými fragmentárni proteínu interagujúceho s kaspázou-8 sú tie, ktoré si zachovávajú schopnosti proteínu interagujúceho s kaspázou-8, a ktoré môžu priamo alebo nepriamo sprostredkovať biologický účinok kaspázy-8 alebo iných proteínov asociovaných s kaspázou-8. Z toho vyplýva, že je možné pripraviť fragmenty proteínu interagujúceho s kaspázou-8, ktoré majú dominantný negatívny alebo dominantný pozitívny účinok, ako bolo poznamenané vyššie, vo vzťahu ku analógom. Je potrebné uviesť, že tieto fragmenty predstavujú špeciálnu triedu analógov podľa vynálezu, konkrétne sú to definované časti proteínov interagujúcich s kaspázou-8, ktoré sú odvodené od úplnej sekvencie proteínu interagujúceho s kaspázou-8 (napr. od ktoréhokoľvek proteínu interagujúceho s kaspázou-8 alebo od jeho izoformy), pričom každá takáto časť alebo fragment má ktorýkoľvek z vyššie uvedených požadovaných účinkov. Takýmto fragmentom môže byť napr. peptid.
Podobne, je možné pripraviť deriváty štandardnými modifikáciami bočných skupín jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov proteínu interagujúceho s kaspázou-8, jeho analógov alebo fragmentov, alebo konjugáciou proteínu interagujúceho s kaspázou-8, jeho analógov alebo fragmentov, s inou molekulou, napríklad s protilátkou, enzýmom, receptorom, atď, ako je v oblasti dobre známe. Z toho vyplýva, že tu použitý výraz derivát pokrýva deriváty, ktoré
-33môžu byť pripravené z funkčných skupín vyskytujúcich sa ako bočné reťazce zvyškov alebo N- alebo C-koncové skupiny, prostriedkami známymi v oblasti, a sú zahrnuté v tomto vynáleze. Deriváty môžu mať chemické časti, ako uhľovodíkové alebo fosfátové zvyšky, s tou podmienkou, že frakcia má rovnaký alebo vyšší biologický účinok ako proteíny interagujúce s kaspázou-8.
Deriváty môžu zahŕňať napríklad alifatické estery karboxylových skupín, amidy karboxylových skupín vzniknuté reakciou s amoniakom alebo s primárnym alebo sekundárnym amínom, /V-acyl deriváty alebo voľné amino skupiny aminokyselinových zvyškov tvorené s acylovými časťami (napr. alkanoylové alebo karbocyklické aroylové skupiny) alebo O-acyl deriváty voľnej hydroxylovej skupiny (napríklad O-acylové deriváty serylových alebo treonylových zvyškov) vytvorené acylovými časťami.
Výraz deriváty zahŕňa len tie deriváty, ktoré nezamieňajú jednu aminokyselinu za inú, z dvadsiatich prirodzene sa vyskytujúcich aminokyselín.
Ako je opísané vyššie, na stanovenie toho, či je proteín interagujúci s kaspázou-8 štiepený kaspázou-8, je možné použiť test štiepenia. Rozdelenie poštiepených fragmentov podľa veľkosti poskytuje približnú indikáciu umiestnenia štiepneho miesta.
Štiepne miesto sa môže podrobnejšie určiť prostredníctvom prípravy delečných mutantov testovaného proteínu a testovaním každého delečného mutantu z hľadiska jeho náchylnosti na štiepenie kaspázou-8, ako bolo opísané vyššie. Delečné mutanty je možné skonštruovať PCR klonovaním požadovaných fragmentov testovaného proteínu, použitím DNA sekvencie klonu kódujúcej testovaný proteín ako templátu. PCR amplifikované fragmenty sa potom môžu klonovať do expresných vektorov, ktoré obsahujú ATG štartovací kodón a výhodne Kozák sekvenciu (Kozák, M, Nucleic Acids Res. str. 12, 857-72, 1984). Ďalšie detaily o exprimovaní proteínov je možné nájsť vo vyššie uvedenej informácii od Qiagen, ktorá sa týka proteínov s his-príveskom, ale aj proteínovej expresie vo všeobecnosti. Ďalšou citáciou pre proteínovú expresiu je vyššie-uvedená publikácia Current Protocols, a konkrétne kapitola 16.
-34Štiepne miesto testovaného proteínu je teda možné definovať prípravou ich rôznych delečných mutantov a stanovením najmenšieho delečného mutantu, ktorý je štiepený kaspázou-8.
Iný spôsob identifikácie štiepneho miesta využíva peptidy, ktoré sú generované podľa predpokladanej proteínovej sekvencie testovaného klonu. Peptidy sa môžu syntetizovať chemicky, ako je podrobne uvedené napr. v Bodanszky a Bodanszky, The practice of peptide synthesis, Springer, New York, ISBN 0-387-13471-9, a Bodanszky, The principles of peptide synthesis, Springer, New York, ISBN 0-387-12359-4. Bežná peptidová syntéza je ďalej dostupná od niekoľkých komerčných spoločností, napr. SynPep Corp., Dublin, CA USA, a California Peptide Research, Inc., Napa, CA, USA. Peptidy je tiež možné vyrábať, buď ako fúzované s inými proteínmi, alebo nefúzované, expresiou rekombinantnej DNA, ktorá ich kóduje, ako je podrobne opísané vo vyššie uvedenej publikácii Current Protocols v kapitole 16.
Aby sa použili peptidy na mapovanie štiepneho miesta testovaného proteínu, rozdelí sa predpokladaná aminokyselinová sekvencia uvedeného proteínu do oblastí a syntetizuje sa peptid zodpovedajúci každej oblasti. Navyše sa syntetizujú peptidy, ktoré zahŕňajú približne polovicu aminokyselín jednej oblasti a kontinuálne obsahujú ďalšiu približne polovicu aminokyselín priamo susediacej oblasti, aby sa prekryla hranica medzi dvoma oblasťami. Oblasti obsahujú 5 až 100 aminokyselín, výhodne 9 až 40 aminokyselín a najvýhodnejšie 20 až 30 aminokyselín. Celá sada peptidov sa potom testuje, ako je opísané vyššie, z hľadiska prístupnosti štiepeniu kaspázou-8. Pripravené peptidy môžu byť čisté a vo veľkých množstvách. Po štiepnej reakcii sa preto môžu priamo analyzovať SDS polyakrylamidovou gélovou elektroforézou a UV detekciou alebo vizualizáciou farbením, napr. použitím Comassie blue. Alternatívne sa môžu peptidy kvôli jednoduchšej vizualizácii farbiť napr. izotopickým koncovým značením (pozri napr. Shevchenko A a ďalší Rapid Commun Mass Spectrom. 11, str. 1015-24, 1997).
Po ukončení vyššie opísaného peptidového skríningu je možné peptid, o ktorom sa zisti, že obsahuje štiepne miesto pre kaspázu-8, podrobnejšie študovať
-35opakovaním rovnakej techniky, ale vybraním menších oblastí zo sekvencie identifikovaného peptidu.
Skutočné štiepne miesto peptidov by malo byť v súlade s kaspázovou štiepnou sekvenciou XXXD (pozri Boldin a ďalší, Celí 1996 a Nicholson a ďalší, Killer caspases, Trends in Biochem Sci. 22, 299-306, 1997). Podiel každej aminokyseliny v peptide je možné zhodnotiť prípravou peptidov, ktoré sú mutované v jednej aminokyseline a ich testovaním z hľadiska náchylnosti na štiepenie s kaspázou-8. Aminokyselina, ktorá má byť mutovaná, je výhodne zamenená aminokyselinou vybranou zo skupiny nabitých nepolárnych aminokyselín (pozri Lehninger, Biochemistry, Worth, NY, 1979, kapitola 4), najvýhodnejšie je vybraná z glycínu alebo alanínu.
Mutáciou kritických aminokyselín je možné generovať peptidy, ktoré viažu kaspázu-8, ale nie sú ňou štiepené. Viazanie sa môže testovať veľkostným rozdelením komplexov peptid-kaspáza-8 v nedenaturačných podmienkach použitím akrylamidovej gélovej elektroforézy.
Ďalej je možné skonštruovať modifikované peptidy, ktoré sú schopné reagovať s aktívnym cysteínom kaspázy-8, tým, že sa kovalentne viažu na uvedený cysteín. Ako je zrejmé pre priemerného odborníka v danej oblasti techniky, na tento účel je možné použiť reakčné činidlá, ktoré reagujú s tiolovými skupinami. Takéto reakčné činidlá sa môžu viazať reverzibilným spôsobom. Reakčné činidlá obsahujúce tiolovú skupinu môžu napríklad reagovať s SH skupinou aktívneho cysteínu kaspázy-8. Vytvorená S-S väzba sa môže štiepiť redukciou, napríklad, vo fyziologických podmienkach v cytoplazme alebo použitím reakčného činidla, ktoré redukuje S-S skupiny, ako ditiotreitolu (DTT). Reakčné činidlá, ktoré reagujú s tiolovými skupinami sa môžu aj ireverzibilné viazať na kaspázu-8. Takéto reakčné činidlá je možné jednoducho nájsť medzi prepájačmi schopnými reagovať s tiolovými skupinami, ktoré sú známe v oblasti, ako je opísané napr. na str. 0-90 a na nasledujúcich stranách v publikácii PIERCE Life Sciences catalog (PIERCE, Rockford, IL, USA).
Vhodnými skupinami, ktoré reagujú s tiolovými skupinami sú napríklad pyridylditiové, jódacetamidové alebo maleimidové skupiny. Tieto skupiny sa môžu
-36pripojiť na peptid prostredníctvom spojovníkov, ktoré obsahujú voliteľne nenasýtené alifatické uhľovodíkové reťazce, -0-, -S-, -NH- alebo aromatické skupiny. Spojovníky môžu byť voliteľne substituované.
V oblasti je známe, že tiolové reaktívne skupiny môžu byť pripojené na peptidy prostredníctvom chemickej syntézy; funkčné skupiny peptidu môžu reagovať s vhodnými funkčnými skupinami tiol-reaktívnej skupinovej spojovníkovej molekuly. Napríklad lyzínový zvyšok, ktorý sa nachádza v peptidovej sekvencii alebo je pridaný za účelom vytvorenia funkčnej skupiny, ktorou je v prípade lyzínu εamino skupina, môže reagovať s heterobifunkčným prepájačom, akým je napríklad W-y-maleimidobutyryloxy-sukcinimidester, na vytvorenie peptidu, v ktorom je uvedená lyzínová ε-aminoskupina zreagovaná s W-hydroxysukcinimidoskupinou prepájača, zatiaľ čo maleimidoskupina prepájača ostáva nezreagovaná a môže, pri kontakte s cysteínom kaspázy-8, ku ktorému dochádza, keď sa peptid špecificky viaže na kaspázu-8, reagovať s tiolovou skupinou cysteínu a tým inaktivovať uvedenú kaspázu-8.
Poloha vo vnútri peptidu, ktorá sa používa na reagovanie peptidu s tiolreaktívnym činidlom, môže byť vybraná tak, aby bola blízko aminokyseliny (zvyčajne kyseliny asparágovej), kde nastáva štiepenie kaspázou-8. Spojovník, ktorým sa tiolová reaktívna skupina viaže na peptid môže byť rôzny z hľadiska jeho dĺžky, prítomnosti polárnych skupín, ako napríklad hydroxyskupiny, nabitých skupín, ako napríklad nitro- a sulfoskupín, a aromatických skupín, ako napríklad fenylénových a fenylových zvyškov. Tieto odchýlky v štruktúre spojovníka umožnia generovanie reakčného činidla, ktoré obsahuje peptid a naň kovalentne naviazané tio-reaktívne činidlo, ktoré sa bude špecificky viazať na kaspázu-8 a bude účinne reagovať s tiolovou skupinou jej aktívneho cysteínu.
Testovaný proteín alebo jeho peptidový fragment sa môže ďalej charakterizovať zavedením uvedeného proteínu alebo peptidu do cicavčej bunky a meraním účinku reakčných činidiel indukujúcich apoptózu na bunku.
Expresia proteínu alebo peptidu v cicavčej bunke sa môže uskutočňovať zavedením DNA, ktorá kóduje testovaný proteín, do vektora obsahujúceho
-37promótor, voliteľne intrónovú sekvenciu a zostrihové donorové/akceptorové signály, a ďalej voliteľne obsahuje terminačnú sekvenciu. Tieto techniky sú vo všeobecnosti opísané vo vyššie uvedenej publikácii Current Protocols, v kapitole 16.
Vyššie uvedené promótorové, intrónové a terminačné sekvencie sú funkčné v cicavčích bunkách. Promótorom je výhodne silný promótor, ako napríklad vyššie uvedený RSV, CMV alebo MPSV promótor. Promótorom môže byť aj SV40 skorý promótor (Everett a ďalší, Nucleic Acids Res. 11, str. 2447-64, 1983, a tam uvedené citácie) alebo bunkový promótor ako β-aktínový promótor alebo ELF-1 promótor (Tokushige a ďalší, J Virol Methods. 64, str. 73-80, 1997). Použitý môže byť aj hybridný promótor, ako napríklad hybrid medzi lac operátorom a ľudským ELF-1 a promótorom, ako je opísané v Edamatsu a ďalší (Gene 187, str. 289-94,
1997), CMV-β aktínový hybridný promótor opísaný v Akagi a ďalší, Kidney Int. 51, str. 1265-9, 1997) alebo hybrid medzi ŕeŕ operátorovými sekvenciami a CMV promótorom (Furth a ďalší, PNAS 91, str. 9302-6, 1994 a tam uvedené citácie).
Intrónové sekvencie môžu byť začlenené ako kompletné sekvencie, tzn. vrátane zostrihových donorových a akceptorových miest, môžu byť začlenené do kódujúcej sekvencie proteinu, ktorý sa má exprimovať, v prípade, že zavedenie takýchto intrónových sekvencii môže posilniť stabilitu RNA a tak zvýšiť produkciu požadovaného proteinu. Hoci principiálne môžu byť vhodné intrónové sekvencie vybrané z ktoréhokoľvek génu obsahujúceho intróny, výhodnými intrónovými sekvenciami sú β-aktínový intrón, SV40 intrón a p55 TNF receptorový intrón.
Intrónová sekvenia môže obsahovať zosilňovacie elementy, ktoré môžu zosilniť transkripciu z vyššie uvedených promótorov.
Intrónové sekvencie často obsahujú aj transkripčné alebo translačné riadiace sekvencie, ktoré zabezpečujú tkanivovo špecifickú expresiu. Preto je takéto intrónové sekvencie výhodné použiť, keď je želateľné exprimovanie proteinu podľa vynálezu tkanivovo-špecifickým spôsobom. Príkladom intrónu, ktorý obsahuje tkanivovo-špecifické zosilňujúce elementy, je erytroidný špecifický zosilňovač, ktorý sa nachádza v intróne 8 ľudského génu pre 5-aminolevulinát syntézu 2 (Surinya a
-38ďalší J Biol Chem. 273, str. 16798-809, 1998). Diskusia princípu zosilňovania proteínovej produkcie použitím intrónových sekvencií, spolu s príkladmi intrónových sekvencií je uvedená v Huang a ďalší Nucleic Acids Res. 18, str. 937-47,1990.
Na 3' koniec DNA kódujúcej proteín, ktorý sa má exprimovať, je možné pridať transkripčné terminačné sekvencie a polyadenylačné signály. Takéto sekvencie je možné nájsť v mnohých, alebo aj vo väčšine génov. Výhodne je použitý SV40 polyadenylačný signál (Schek a ďalší, Mol Celí Biol, str. 5386-93, 1992, a tam uvedené citácie).
Výhodným vektorom na expresiu proteinu v cicavčích bunkách je pcDNAHis vektor (Invitrogen), ktorý obsahuje CMV promótor na riadenie expresie génu kódujúceho požadovaný proteín. Iné vektory, ktoré môžu byť použité zahŕňajú pCDNA3 alebo pMPSVEH vektory. Tieto vektory obsahujú CMV, respektíve MPSV promótory.
Po použití rekombinantnej expresie testovaného proteinu je možné tento proteín zhodnotiť z hľadiska jeho účinku na apoptický signál, ktorý je sprostredkovaný kaspázou-8. Za týmto účelom je možné indukovať apoptózu buď nadexpresiou apoptického indukčného proteinu, akým je napríklad CD120a vnútrobunková doména, CD95 vnútrobunková doména, Mort-1 proteín, kaspáza-8 alebo ich ekvivalenty; alebo aktiváciou apoptického signálu spustením CD120, CD95, TRAMP/DR3 alebo ekvivalentného receptora. Aktivácia receptora sa môže dosiahnuť buď kontaktom receptorov s ligandom alebo prepojením receptorov s protilátkami, výhodne polygonálnymi protilátkami (pozri Engelmann a ďalší, J. Biol. Chem. 265, str. 14497-504, 1990).
Hoci vo všeobecnosti spustenie receptoru podobného CD120a vyžaduje pridanie inhibitora proteínovej syntézy, akým je napríklad cykloheximid, na dosiahnutie silného signálu pre apoptózu nie je potrebná nadexpresia receptorových vnútrobunkových domén alebo proteínov podieľajúcich sa na prenose apoptického signálu (pozri Boidin a ďalší, Celí 85, str. 803, 1996). Detekcia apoptózy, inkubačného času a iných podrobností a paramentrov je pre tento test opísaná vo vyššie uvedenej publikácii Boidin a ďalší.
-39Bunková smrť v bunkách exprimujúcich testovaný proteín v porovnaní s bunkami, ktoré ho neexprimujú sa môže zhodnotiť množstvom metód, napríklad spôsobmi založenými na DNA fragmentácii alebo na detekcii antigénov a epitopov špecifických pre apoptózu. Reakčné činidlá a protokoly na detekciu apoptózy sú vo forme kitu dostupné od vyššie spomenutej firmy Boehringer Mannheim a od iných spoločností.
Bunková smrť sa môže stanoviť aj zhodnotením morfologického vzhľadu buniek. Apoptická bunková smrť sa vyznačuje vlnitou bunkovou membránou a zmršťovaním sa buniek, bez toho, aby prebehla lýza buniek.
Výhodne sa v cicavčej bunke exprímuje reporterový gén, aby sa poskytol marker úspešnej transfekcie. Keďže výsledkom samotného procesu transfekcie je určitá bunková smrť, vrátane bunkovej smrti buniek, ktoré neboli transfekované, je výhodné hodnotiť len tie bunky, ktoré transfekované boli. Na tento účel je výhodným reportérovým génom lacZ gén, ktorý je možné jednoducho detekovať inkubovaním transfekovaných buniek s Xgal alebo podobným reakčným činidlom, ktorý indikuje aktívnu β-galaktozidázu. Avšak je možné použiť akýkoľvek iný známy reporterový gén, výhodne gén, ktorého produkty je možné jednoducho detekovať použitím jednoduchej farebnej reakcie, ktorej výsledok sa dá zhodnotiť použitím mikroskopu. Na priamu detekciu môže byť použitý napríklad zelený fluorescenčný proteín, bez toho, aby bola potrebná farebná reakcia. Tento reporterový gén vyžaduje použitie fluorescenčného mikroskopu.
Takže berúc do úvahy len bunky, ktoré boli transfekované, tzn. exprimujú reporterový gén, a počítajúc percento buniek, ktoré vykazujú apoptickú morfológiu, je možné zhodnotiť účinok konkrétneho transfekovaného klonu a proteínu, ktorý exprímuje, na apoptózu.
Cicavčími bunkami sú výhodne HeLa alebo ľudské embryonálne obličkové (HEK) 293-T bunky. Transfekcia sa výhodne uskutočňuje spôsobom využívajúcim fosforečnan vápenatý, ako je opísané vo vyššie uvedenej publikácii Current Protocols. Morfológia buniek sa zhodnocuje jednu až 150 hodín po transfekcii, výhodne 4 až 35 hodín a najvýhodnejšie 20 hodín po transfekcii.
-40Generovanie protilátok
Polyklonálne protilátky sa môžu generovať v králikoch, kurčatách, myšiach, potkanoch, ovciach alebo podobných cicavcoch. Na generovanie protilátok proti proteínu alebo peptidu podľa vynálezu sa vytvorí proteín alebo peptid, ako je opísané vyššie, rekombinantnou DNA technológiou v cicavčích bunkách. Proteín sa môže produkovať aj v bakteriálnych alebo hmyzích bunkách, ako je podrobne opísané vo vyššie uvedenej publikácii Current Protocols, kapitola 16.
Proteín alebo peptid sa purifikuje z buniek, v ktorých je produkovaný. Proteínové purifikačné spôsoby sú pre priemerného odborníka v oblasti známe a podrobne sú uvedené napríklad vo vyššie uvedenej publikácii Current Protocols in Molecuiar Biology, kapitola 16 a v Current Protocols in Protein Science, Wiley and Sons Inc., kapitoly 5 a 6. Výhodne sa proteín môže produkovať ako fúzovaný s druhým proteínom, ako napríklad glutatión-S-transferázou aiebo podobne alebo so sekvenčným príveskom, ako napríklad histidínovou príveskovou sekvenciou. Použitie fúzovaných proteínov alebo proteínov s príveskom zjednodušuje purifikačné postupy, ako je podrobne uvedené vo vyššie uvedenej publikácii Current Protocols in Molecuiar Biology, kapitola 16 a v inštrukciách Qiagen hispríveskového proteínového a purifikačného kitu.
Ak je proteín alebo peptid exprimovaný vo forme fúzovaného proteínu, je želateľné, aby sa fúzovaný partner odštiepil pred použitím proteínu na generovanie protilátok, aby sa zabránilo generovaniu protilátok proti fúzovanému partnerovi. Odštiepenie fúzovaných partnerov a izolácia požadovaného proteínu je opísaná vo vyššie uvedenej publikácii Current Protocols in Molecuiar Biology, kapitola 16. Vektory, protokoly a reakčné činidlá na expresiu a purifikáciu rekombinantných proteínov fúzovaných s maltóza-viažucim proteínom sú dostupné aj komerčne.
Keď sa produkuje peptid podľa vynálezu, môže byť želateľné neodstraňovať fúzovaného partnera, keďže fúzovaný proteín môže stimulovať tvorbu protilátok proti peptidu. Vo všeobecnosti bude táto úvaha releventná pri generovaní protilátok proti peptidom, ktorých dĺžka je menšia ako 50 aminokyselín.
Ako bolo uvedené podrobnejšie vyššie, peptidy môžu byť syntetizované aj chemickými metódami známymi v oblasti chémie.
-41 Generovanie polyklonálnych protilátok proti proteínom je opísané v kapitole 2 publikácie Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons Inc. Generovanie protilátok proti peptidom môže vyžadovať niektoré zmeny v protokole, pretože peptidy sú vo všeobecnosti menej antigénne ako proteíny. Generovanie polyklonálnych protilátok proti peptidom je opísané vo vyššie uvedenej publikácii Current Protocols in Immunology, kapitola 9.
Monoklonálne protilátky je možné pripraviť z B buniek odobratých zo sleziny alebo lymfatických uzlín imunizovaných zvierat, najmä potkanov alebo myší, fúziou s nesmrteľnými B bunkami v podmienkach, ktoré zvýhodňujú rast hybridných buniek. Na fúziu hlodavčích B buniek je výhodná bunková línia Ag-8.
Technika generovania monoklonálnych protilátok je opísaná v mnohých článkoch a učebniciach, ako napríklad vo vyššie uvedenej publikácii Current Protocols in Immunology, kapitola 2. V kapitole 9 je opísaná imunizácia zvierat peptidmi. Bunky sleziny alebo lymfatických uzlín týchto zvierat môžu byť použité rovnakým spôsobom ako bunky sleziny a lymfatických uzlín zvierat imunizovaných proteínom, na generovanie monoklonálnych protilátok, ako je opísané v kapitole 2 tejto publikácie.
Techniky používané na generovanie monoklonálnych protilátok sú podrobnejšie opísané v Kohler a Milstein, Náture 256, 495-497 a v US patente č. 4376110.
V US patente č. 5840479 je opísaná príprava protilátok z génovej banky ľudských protilátok, v ktorých sú ich hypervariabilné oblasti nahradené náhodnými sekvenciami. Takéto protilátky sú výhodné, ak je zložité imunizovať zviera daným peptidom alebo proteínom. Niektoré štruktúry sú slabo imunogénne a môžu takými ostať aj napriek pridaniu adjuvans a spojeniu s inými proteínmi vo fúzovaných konštruktoch. Protilátky opísané v US 5840479 sú výhodné aj keď je želateľné použiť protilátky so štruktúrou podobnou ľudským protilátkam, napríklad ak je želateľné, aby mali protilátky nízku imunogénnosť u ľudí.
Po identifikácii vhodnej protilátky môže byť potrebné zmeniť jej vlastnosti. Napríklad chimérna protilátka môže dosiahnuť vyšší výťažok pri jej produkcii. Chimérne protilátky, v ktorých sú konštantné oblasti nahradené konštantnými
-42oblasťami ľudských protilátok, sú želateľné, ak sú potrebné protilátky s nízkou imunogénnosťou u ľudí. Generovanie chimérnych protilátok je opísané v množstve publikácií, ako Cabilly a ďalší, PNAS 81, str. 3273, 1984, Morrison a ďalší, PNAS 81, 6851, 1984, Boulianne a ďalší, Náture 312, str. 643, 1984, EP 125023, EP171496, EP173494, EP184187, WO86/01533, WO87/02671, a Harlow a Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring harbor Laboratory, 1988.
Iným typom protilátky je anti-idiotypová protilátka. Anti-idiotypová (anti-ld) protilátka je protilátka, ktorá rozoznáva unikátne determinanty, ktoré sú vo všeobecnosti asociované s antigén-viažucim miestom protilátky. Id protilátka sa môže pripraviť imunizáciou zvieraťa rovnakého druhu a genetického typu (napr. myšacieho kmeňa) ako zdroja mAb, voči ktorej sa má pripraviť anti-ld. Imunizované zviera bude rozoznávať a odpovedať voči idiotypovým determinantám imunizačnej protilátky produkciou protilátky proti týmto idiotypovým determinantám (anti-ld protilátky). Pozri napríklad US patent č. 4699880, ktorý je tu celý zahrnutý jeho citáciou.
Anti-ld protilátka môže byť použitá aj ako imunogén na indukciu imunitnej odpovede ešte inom zvierati, na produkciu takzvanej ani-anti-ld protilátky. Anti-antiId protilátka môže byť epitopicky identická s pôvodnou mAb, ktorá indukovala antild. Takže použitím protilátok voči idiotypovým determinantám mAb je možné identifikovať iné klony, ktoré exprimujú protilátky s identickou špecifitou.
Z toho vyplýva, že mAbs generované proti proteínu interagujúcemu s kaspázou-8, jeho analógom, fragmentom alebo derivátom podľa vynálezu môžu byť použité na indukciu anti-ld protilátok vo vhodných zvieratách, ako napríklad BALB/c myšiach. Slezinové bunky z takto imunizovaných myší sa použijú na tvorbu anti-ld hybridómov, ktoré budú vylučovať anti-ld mAbs. Ďalej je možné anti-ld mAbs spojiť s nosičom, ako napríklad pijavicovým hemocyanínom (KLH) a použiť ich na imunizáciu ďalších BALB/c myší. Séra z týchto myší budú obsahovať anti-anti-ld protilátky, ktoré budú schopné viazať sa na pôvodnú mAb špecifickú pre epitop vyššie uvedeného proteínu interagujúceho s kaspázou-8, jeho analógov, fragmentov a derivátov.
-43Anti-ld mAbs tak majú svoje vlastné idiotypové epitopy alebo idiotopy, ktoré sú štruktúrne podobné s hodnoteným epitopom.
Výraz protilátka zahŕňa aj intaktné molekuly, ako aj ich fragmetny, ako napríklad Fab a F(ab')2, ktoré sú schopné viazať antigén. Fab a F(ab')2 fragmentom chýba Fc fragment intaktnej protilátky, rýchlejšie sa strácajú z obehu a môžu sa menej nešpecifický tkanivovo viazať ako intaktná protilátka (Wahl a ďalší, J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)).
Je zrejmé, že Fab a F(ab')2 a iné fragmenty protilátok užitočných podľa predloženého vynálezu môžu byť použité na detekciu a kvantifikáciu proteínu interagujúceho s kaspázou-8 v súlade s tu opísanými spôsobmi pre intaktné protilátkové molekuly. Takéto fragmenty sa typicky produkujú proteolytickým štiepením, použitím enzýmov, ako papaínu (na vytvorenie Fab fragmentov) alebo pepsínu (na vytvorenie F(ab')2 fragmentov).
Protilátka je označená ako schopná viazať' molekulu, ak je schopná špecificky reagovať s molekulou, a tým dochádza k väzbe molekuly a protilátky. Výraz epitop znamená tú časť ktorejkoľvek molekuly, ktorá môže byť viazaná protilátkou, ktorá je schopná byť rozoznávaná touto protilátkou. Epitopy alebo antigénové determinanty zvyčajne pozostávajú z chemicky aktívnych povrchových zoskupení molekúl, ako napríklad aminokyselinových alebo sacharidových bočných reťazcov, a majú špecifické trojrozmerné štruktúrne vlastnosti, ako aj špecifické nábojové charakteristiky.
Protilátky, vrátane fragmentov protilátok, užitočné podľa vynálezu, môžu byť použité na kvantitatívnu alebo kvalitatívnu detekciu proteínu interagujúceho s kaspázou-8 vo vzorke alebo na detekciu prítomnosti buniek, ktoré exprimujú proteín interagujúci s kaspázou-8 podľa vynálezu. To sa môže uskutočniť imunofluorescenčnými technikami využitím fluorescenčné značenej protilátky (pozri nižšie) spolu so svetelným mikroskopom, prietokovou cytometriou alebo fluorometrickou detekciou.
Protilátky (alebo ich fragmenty) užitočné podľa vynálezu, môžu byť využité histologický, ako napríklad v imunofluorescenčnej alebo imunoelektrónovej mikroskopii, na in situ detekciu proteínu interagujúceho s kaspázou-8 podľa
-44predloženého vynálezu. In situ detekcia sa môže uskutočňovať odobratím histologickej vzorky od pacienta a použitím značenej protilátky podľa vynálezu pre takúto vzorku. Protilátka (alebo fragment) sa výhodne poskytuje náterom alebo naliatím značenej protilátky (alebo fragmentu) na biologickú vzorku. Použitím takéhoto postupu je možné stanoviť nie len prítomnosť proteínu interagujúceho s kaspázou-8, ale aj jeho distribúciu v skúmanom tkanive. Pre priemerného odborníka v oblasti je zrejmé, že použitím predloženého vynálezu je možné modifikovať široký rozsah histologických metód na dosiahnutie in situ detekcie.
Takéto testy pre proteín interagujúci s kaspázou-8 podľa vynálezu typicky zahŕňajú inkubovanie biologickej vzorky, ako napríklad biologickej tekutiny, tkanivového extraktu, čerstvo izolovaných buniek ako lymfocytov alebo leukocytov, alebo buniek, ktoré boli inkubované v tkanivovej kultúre, v prítomnosti detekovateľne značenej protilátky, ktorá je schopná identifikovať proteín interagujúci sa kaspázou-8, a detekovanie protilátky ktoroukoľvek z množstva techník, ktoré sú v oblasti dobre známe.
Biologická vzorka sa môže ošetriť podkladom na tuhej fáze alebo nosičom, ako je nitrocelulóza, alebo iným tuhým podkladom alebo nosičom, ktorý je schopný imobilizovať bunky, bunkové častice alebo rozpustné proteíny. Podklad alebo nosič sa potom môže premyť vhodnými tlmivými roztokmi, a následne ošetriť detekovateľne značenou protilátkou podľa vynálezu, ako bolo uvedené vyššie. Tuhý fázový podklad alebo nosič sa potom môže premyť s tlmivým roztokom druhý raz, aby sa odstránila nenaviazaná protilátka. Bežnými prostriedkami je potom možné detekovať množstvo naviazanej značky na tuhom podklade alebo nosiči.
Výrazy podklad na tuhej fáze, nosič na tuhej fáze, tuhý nosič, podklad alebo nosič znamenajú akýkoľvek podklad alebo nosič, ktorý je schopný viazať antigén alebo protilátky. Dobre známe podklady alebo nosiče zahŕňajú sklo, polystyrén, polypropylén, polyetylén, dextrán, nylonové amylázy, prirodzené alebo modifikované celulózy, polyakrylamidy, gabro a magnetit. Pre účely vynálezu môže byť nosič buď do určitej miery rozpustný, alebo nerozpustný. Podkladový materiál môže mať v skutočnosti akúkoľvek možnú štruktúrnu konfiguráciu, pokiaľ je pripojená molekula schopná viazať antigén alebo protilátku. Takže konfigurácia
-45podkladu alebo nosiča môže byť sférická, ako napríklad guľovitá, valcovitá, ako napríklad vo vnútri skúmavky alebo na vonkajšom povrchu tyčinky. Alternatívne môže byť povrch rovný, ako napríklad platňa, testovací pásik, a pod. Výhodné podklady alebo nosiče zahŕňajú polystyrénové guľôčky. Priemerný odborník v oblasti bude vedieť vybrať iné vhodné nosiče na viazanie protilátky alebo antigénu, alebo bude schopný nájsť ich použitím rutinného experimentovania.
Väzobný účinok daného množstva protilátky podľa vynálezu ako je uvedená vyššie, môže byť stanovený dobre známymi spôsobmi. Priemerný odborník v oblasti bude schopný stanoviť funkčné a optimálne testovacie podmienky pre každé stanovenie využitím rutinného experimentovania.
Do testovacej reakcie je možné pridať aj iné kroky, ako napríklad premývanie, miešanie, trepanie, filtrovanie a podobne, ak je to zvykom alebo nevyhnutné v konkrétnej situácii.
Jedným zo spôsobov, v ktorých môže byť protilátka podľa vynálezu detekovateľne značená, je pripojenie protilátky ku enzýmu a a jej použitie v enzýmovom imunologickom teste (EIA). Tento enzým, keď sa neskôr vystaví vhodnému substrátu, bude reagovať so substrátom takým spôsobom, že sa vytvorí chemická zlúčenina, ktorú je možné detekovať napríklad spektrofotometricky, fluorometricky alebo vizuálnymi prostriedkami. Enzýmy, ktoré môžu byť použité na detekovateľné značenie protilátky zahŕňajú, ale nie sú limitované na, malát dehydrogenázu, stafýlokokovú nukleázu, δ-5-steroid izomerázu, kvasinkovú alkohol dehydrogenázu, α-glycerofosfát dehydrogenázu, triózofosfát izomerázu, chrenovú peroxidáczu, alkalickú fosfatázu, asparaginázu, glukóza oxidázu, β-galaktozidázu, ribonukleázu, ureázu, katalázu, glukózo-6-fosfát dehydrogenázu, glukoamylázu a acetylcholín esterázu. Detekcia sa môže uskutočňovať kolorimetrickými metódami, ktoré využívajú chromogénny substrát pre enzým. Detekcia sa môže uskutočňovať aj vizuálnym porovnaním enzymatickej reakcie substrátu v porovaní s podobne pripravenými štandardami.
Detekcia sa môže uskutočňovať použitím ktoréhokoľvek z rôznych iných imunologických testov. Napríklad rádioaktívnym značením protilátok alebo
-46fragmentov protilátok je možné detekovať R-PTPázu prostredníctvom použitia rádioimunologického testu (RIA). Dobrý opis RIA je možné nájsť v Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, od Work, T.S. a ďalší, North Holland Publishing Company, NY (1978), najmä v časti s názvom An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques od Chard, T., pričom publikácia je do tohto opisu zahrnutá jej citáciou. Rádioaktívny izotop je možné detekovať prostredníctvom použitia g snímača alebo scintilačného snímača alebo autorádiografie.
Je možné značiť protilátku podľa predloženého vynálezu aj fluorescenčnou zlúčeninou. Keď sa fluorescenčné značená protilátka vystaví svetlu so správnou vlnovou dĺžkou, je možné detekovať jej prítomnosť na základe fluorescencie. Medzi najbežnejšie používané flurescenčné značiace zlúčeniny patria fluoresceín izotiokyanát, rodamín, fykoerytrín, pykocyanín, alofykocyanín, o-ftaldehyd a fluorescamín.
Protilátku je možné detekovateľne značiť aj použitím fluorescenciu emitujúcich kovov ako 152E alebo iných kovov lantanoidovej série. Tieto kovy je možné pripojiť na protilátku použitím takých kovových chelatačných skupín, ako je kyselina dietyléntriamínpentaoctová (ETPA).
Protilátku je možné detekovateľne značiť aj pripojením protilátky na chemiluminiscenčnú zlúčeninu. Prítomnosť protilátky s chemiluminiscenčným príveskom sa potom determinuje detekovaním prítomnosti luminiscencie, ktorá vzniká počas chemickej reakcie. Príkladmi výnimočne užitočných chemiluminiscenčne značených zlúčenín sú luminol, izoluminol, teromatický akridínium ester, imidazol, akridíniová soľ a oxalát esteru.
Podobne je možné na značenie protilátky podľa predloženého vynálezu použiť bioluminiscenčnú zlúčeninu. Bioluminiscencia je typom chemiluminiscencie, ktorá sa nachádza v biologických systémoch, v ktorých katalytický proteín zvyšuje účinnosť chemiluminiscenčnej reakcie. Prítomnosť bioluminiscenčného proteínu sa determinuje detekciou prítomnosti luminiscencie. Dôležitými bioluminiscenčnými zlúčeninami na účely značenia sú luciferín, iuciferáza a aequorín.
-47Molekula protilátky podľa predloženého vynálezu sa môže upraviť na použitie v imunometrickom teste, tiež známom ako dvojstranný alebo sendvičový test. V typickom imunometrickom teste sa určité množstvo neznačenej protilátky (alebo fragmentu protilátky) naviaže na tuhý podklad alebo nosič a pridá sa určité množstvo detekovateľne značenej rozpustnej protilátky na umožnenie detekcie a/alebo kvantifikácie ternárneho komplexu, ktorý sa vytvorí medzi protilátkou na tuhej fáze, antigénom a značenou protilátkou.
Typické a výhodné imunometrické testy zahŕňajú priame testy, v ktorých sa protilátka naviazaná na tuhú fázu najprv skontaktuje so vzorkou, ktorá má byť testovaná, na extrahovanie antigénu zo vzorky vytvorením binárneho tuhého komplexu protilátka-antigén. Po vhodnej inkubačnej dobe sa tuhý podklad alebo nosič premyje, aby sa odstránil zvyšok kvapalnej vzorky, vrátane nezreagovaného antigénu, ak sa tam nejaký nachádza, a potom sa uvedie do kontaktu s roztokom obsahujúcim neznáme množstvo značenej protilátky (ktorá funguje ako reporterová molekula). Po druhej inkubačnej dobe na umožnenie toho, aby značená protilátka vytvorila komplex s antigénom naviazaným na tuhý podklad alebo nosič prostredníctvom neznačenej protilátky, sa tuhý podklad alebo nosič premyje druhý raz, aby sa odstránila nezreagovaná značená protilátka.
V inom type sendvičového testu, ktorý tiež môže byť užitočný s antigénmi podľa predloženého vynálezu, sú použité takzvané simultánne a reverzné testy. Simultánny test zahŕňa jediný inkubačný krok, v ktorom sa zároveň ku testovanej vzorke pridáva tak protilátka naviazaná na tuhý podklad alebo nosič, ako aj značená protilátka. Po ukončení inkubovania sa tuhý podklad alebo nosič premyje, aby sa odstránili zvyšky kvapalnej vzorky a značenej protilátky mimo komplexu. Prítomnosť značenej protilátky asociovanej s tuhým podkladom alebo nosičom sa potom stanovuje ako by išlo o bežný priamy sendvičový test.
V reverznom teste sa využíva postupné pridávanie najprv roztoku značenej protilátky do kvapalnej vzorky, a potom, po vhodnej inkubačnej dobe, nasleduje pridanie neznačenej protilátky naviazanej na tuhý podklad alebo nosič. Po druhej inkubácii sa tuhá fáza premyje bežným spôsobom, aby sa zbavila zvyšku testovanej vzorky a roztoku nezreagovanej značenej protilátky. Determinácia značenej
-48protilátky asociovanej s tuhým podkladom alebo nosičom sa potom uskutočňuje ako v simultánnom a priamom teste.
Imunologické testy
Vytvorenie imunologických testov, ako RIA alebo ELISA, bolo opísané v mnohých článkoch, učebniciach a iných publikáciách. Pozri WO 97/03998, str. 48, riadok 4 až str. 52, riadok 27. Imunologické testy podľa vynálezu môžu byť dvoch typov: Po prvé, imunologické testy využívajúce imobilizovaný proteín interagujúci s kaspázou-8 alebo ekvivalentný peptid na kvantifikáciu kaspázy-8. Po druhé, imunologické testy využívajúce imobilizované protilátky nasmerované proti epitopu proteínu interagujúcemu s kaspázou-8, ktoré môžu byť využité na kvantifikáciu proteínov interagujúcich s kaspázou-8.
Takéto testy môžu nájsť využitie v diagnostike, kde môže byť potrebné zhodnotiť hladinu kaspázy-8 a iných proteínov zahrnutých v apoptických dráhach, pri mnohých poruchách alebo syndrómoch, pri ktorých je možné, že sa na nich podieľajú tieto dráhy.
Nukleové kyseliny
Očakáva sa, že klony získané skríningom podľa vynálezu sú parciálne klony. Získanie celých klonov, ak je to potrebné, bolo podrobne opísané vyššie. DNA sekvencia kompletného klonu a parciálneho klonu nájdeného v skríningu podľa vynálezu môže nájsť rôzne uplatnenia.
Napríklad, na manipuláciu expresie proteínu interagujúceho s kaspázou-8 môže byť želateľné vytvoriť antisense RNA v bunke. Za týmto účelom sa kompletná alebo čiastočná cDNA kódujúca proteín interagujúci s kaspázou-8 zavedie do expresného vektora, ktorý obsahuje promótor, ktorý bol opísaný vyššie. 3' koniec cDNA sa tak začlení vedľa 3' konca promótora, pričom 5' koniec cDNA je od 5' konca promótora oddelený uvedenou cDNA. Pri expresii cDNA v bunke sa tak produkuje antisense RNA, ktorá nie je schopná kódovať proteín. Prítomnosť antisense RNA v bunke znižuje expresiu bunkovej (genomickej) kópie génu interagujúceho s kaspázou-8.
-49Na produkciu antisense RNA môže byť použitá úplná cDNA. Alternatívne je možné použiť jej fragment, ktorý je výhodne dlhý približne 9 až 2000 nukleotidov, výhodnejšie 15 až 500 nukleotidov a najvýhodnejšie 30 až 150 nukleotidov.
Fragment výhodne zodpovedá oblasti vo vnútri 5' polovice cDNA, výhodnejšie 5' oblasť zahŕňa 5' netranslatovanú oblasť a/alebo prvú exónovú oblasť a najvýhodnejšie obsahuje ATG translačné štartovacie miesto. Alternatívne fragment môže zodpovedať len DNA sekvencií 5' netranslatovanej oblasti.
Syntetický oligonukleotid môže byť použitý ako antisense oligonukleotid. Oligonukleotidom je výhodne DNA oligonukleotid. Dĺžka antisense oligonukleotidu je výhodne medzi 9 a 150, výhodnejšie medzi 12 a 60 a najvýhodnejšie medzi 15 a 50 nukleotidov, pričom oblasť pokrytá antisense oligonukleotidom zahŕňa výhodne 3' netranslatovanú oblasť cDNA, výhodnejšie zahŕňa polyadenylačný signál alebo translačný stop kodón alebo oba.
Mechanizmus účinku antisense RNA a súčasný stav v oblasti použitia antisense nástrojov je zhrnutý v Kumar a ďalší, Microbiol Mol Biol Rev. 62, str. 1415-1434, 1998. Použitie antisense oligonukleotidov na inhibíciu BMP receptorovej syntézy bolo opísané v Yeh a ďalší J Bone Miner Res. 13, str. 1870-9, 1998. Použitie antisense oligonukleotidov na inhibíciu syntézy génu draselného kanála závislého na napätí Kv1.4 bolo opísané v Meiri a ďalší, PNAS 95, str. 15037-15042, 1998. Použitie antisense oligonukleotidov na inhibíciu syntézy Bcl-x bolo opísané v Kondo a ďalší, Oncogene 17, str. 2585-91,1998.
Terapeutické použitie antisense liečiv je diskutované v Stix v Sci Am. 279, str. 46, 50, 1998, Flanagan, Cancer Metastasis Rev 17, str. 169-76, 1998, Guinot a Temsamani, Pathol Biol (Paris) 46, str. 347-54, 1998 a tam uvedené citácie.
Vo všeobecnosti sa pri navrhovaní antisense oligonukleotidov používajú modifikácie oligonukleotidov, ktoré posilňujú požadované vlastnosti. Napríklad, sú použité fosforotioátové väzby namiesto fosfoesterových väzieb, ktoré sa prirodzene vyskytujú v DNA, najmä preto, že takéto fosforotioátové oligonukleotidy sú menej náchylné na degradáciu bunkovými enzýmami. Peng a ďalší uvádzajú, že neželateľné in vivo vedľajšie účinky fosforotioátových oligonukleotidov je možné redukovať použitím zmiešanej fosfoesterovej-fosforotioátovej kostry. Výhodne sú
-50použité 2'-metoxyribonukleotidové modifikácie pri 60% oligonukleotidu. Takto modifikované oligonukleotidy sú schopné vyvolať antisense účinok porovnateľný s účinkom pozorovaným pri fosforotioátových oligonukleotidoch. Peng a ďalší ďalej uvádzajú, že oligonukleotidové analógy, ktoré nie sú schopné podporiť ribonukleázovú H aktivitu, sú inaktívne.
Preto má výhodný antisense oligonukleotid podľa vynálezu zmiešanú fosfodiesterovú-fosforotioátovú kostru. Najvýhodnejšie sú použité 2'-metoxy-ribonukleotidové modifikácie v približne 30 až 80%, výhodnejšie v približne 60% oligonukleotidu.
Do antisense oligonukleotidu je možné zaviesť ďalšie modifikácie. Napríklad, oligonukleotidová molekula môže byť spojená so skupinou obsahujúcou voliteľne čiastočne nenasýtený alifatický uhľovodíkový reťazec a jednu alebo viacero polárnych alebo nabitých skupín, ako sú karboxylová skupina, esterová skupina a alkoholová skupina. Alternatívne môžu byť oligonukleotidy spojené s peptidovými štruktúrami, ktorými sú výhodne membranotropné peptidy. Takto modifikované oligonukleotidy jednoduchšie prechádzajú membránami, čo je kritické pre ich funkciu, a tento fakt teda môže značne zvýšiť ich aktivitu. Membránová permeabilita je želateľná najmä pri antisense liečivách, ktoré majú dosiahnuť mozog. Oligonukleotidy spojené s palmitylom boli opísané v Gerster a ďalší Anál Biochem. 262, str. 177-84, 1998. Oligonukleotidy spojené s geraniolom boli opísané v Shoji a ďalší, J Drug Target 5, str. 261-73, 1998. Oligonukleotidy spojené s peptidmi, napr. membranotropnými peptidmi a ich príprava boli opísané v Soukchareun a ďalší, Bioconjug Chem 9, str. 466-75, 1998. Modifikácie antisense molekúl alebo iných liečiv, ktoré smerujú molekulu do určitých buniek a zosilňujú príjem oligonukleotidu uvedenými bunkami sú opísané v Wang, J Controlled Release 53, str. 39-48,1998.
Ribozýmy
Ak je daná známa mRNA sekvencia génu, je možné navrhnúť ribozýmy, ktoré sú RNA molekulami, ktoré špecificky viažu a štiepia uvedenú mRNA sekvenciu (pozri napr. Chen a ďalší, Ann. NY Acad. Sci. 660, 271-3, 1992, Zhao a Pick, Náture 365, str. 448, 1993, Shore a ďalší, Oncogen 8, 3183, 1993, Joseph a
-51 Búrke, J. Biol. Chem. 268, 24515, 1993, Shimayama a ďalší, Nucleic Acids Symp Ser 29, str. 177, 1993, Cantor a ďalší, PNAS 90, str. 10932, 1993).
Z toho vyplýva, že je možné navrhnúť ribozým kódujúcu RNA sekvenciu, ktorá štiepi mRNA proteínu interagujúceho s kaspázou-8 podľa vynálezu. Miesto štiepenia je výhodne umiestnené v kódujúcej oblasti alebo v 5' netranslatovanej oblasti, výhodnejšie v 5' časti kódujúcej oblasti blízko AUG translačného štartovacieho kodónu.
DNA kódujúca ribozým podľa vynálezu môže byť zavedená do buniek prijatím DNA, prijatím modifikovanej DNA (pozri modifikácie oligonukleotidov a proteínov, ktorých výsledkom je posilnená membránová permeabilita, ako boli opísané vyššie) alebo génovým transferom sprostredkovaným vírusovým vektorom, ako bude podrobne opísané nižšie.
Zavedenie proteínov alebo petidov interagujúcich s kaspázou-8 a DNA do buniek
Predložený vynález poskytuje proteíny interagujúce s kaspázou-8, od nich odvodené peptidy, antisense DNA molekuly a oligonukleotidy. Terapeutické alebo výskumné použitie týchto nástrojov vyžaduje ich zavedenie do buniek živého organizmu. Na tento účel je želateľné zlepšiť membránovú permeabilitu peptidov, proteínov a oligonukleotidov. Spôsoby zlepšenia membránovej permeability oligonukleotidov boli diskutované vyššie. Rovnaký princíp, konkrétne vytvorenie derivátov s lipofilnými štruktúrami, môže byť použitý aj pri vytváraní peptidov a proteínov s posilnenou membránovou permeabilitou. Do sekvencie peptidu alebo proteínu je možné napríklad pridať sekvenciu známeho membranotropného peptidu, ako bolo uvedené vyššie. Navyše, je možné vytvoriť deriváty peptidu alebo proteínu s čiastočne lipofilnými štruktúrami, ako napríklad vyššie uvedenými uhľovodíkovými reťazcami, ktoré sú substituované najmenej jednou polárnou alebo nabitou skupinou. Lauroylové deriváty peptidov boli opísané napríklad v Muranishi a ďalší, Pharm. Research 8, 649, 1991. Ďalšie modifikácie peptidov a proteínov zahŕňajú oxidáciu metionínových zvyškov a tým vytvorenie sulfoxidových skupín, ako je opísané v Zacharia a ďalší, Eur. J. Pharmacol. 203, str. 353, 1991. Zacharia a spol. opisujú aj peptid alebo deriváty, kde je relatívne hydrofóbna peptidová väzba
-52nahradená jej ketometylénovým izoesterom (COCH2). Tieto a iné modifikácie známe priemernému odborníkovi v oblasti proteínovej a peptidovej chémie zosilňujú membránovú permeabilitu.
iným spôsobom na zosilnenie membránovej permeability je použite receptorov, ako napríklad vírusových receptorov, na bunkových povrchoch, aby sa indukoval príjem peptidu alebo proteínu bunkou. Tento mechanizmus je často využívaný vírusmi, ktoré sa špecificky viažu na určité bunkové povrchové molekuly. Po naviazaní prijíma bunka vírus do svojho vnútorného prostredia. Bunková povrchová molekula sa nazýva vírusový receptor. Napríklad integrínové molekuly CAR a AdV boli opísané ako vírusové receptory pre Adenovírus, pozri Hemrni a ďalší, Hum Gene Ther 9, str. 2363-73, 1998, a tam uvedené citácie. CD4, GPR1, GPR15 a STRL33 molekuly boli identifikované ako receptory/koreceptory pre HIV, pozri Edinger a ďalší, Virology. 249, str. 367-78,1998 a tam uvedené citácie.
Takže konjugovanie peptidov, proteínov alebo oligonukleotidov s molekulami, o ktorých je známe, že sa viažu na bunkové povrchové receptory, bude zosilňovať membránovú permeabilitu uvedených peptidov, proteínov alebo oligonukleotidov. Príkladmi vhodných skupín na vytvorenie konjugátov sú sacharidy, vitamíny, hormóny, cytokíny, transferín, azialoglykoproteín a podobné molekuly. Low a ďalší, US patent č. 5108921 opisuje použitie týchto molekúl na posilnenie membránovej permeability peptidov, proteínov a oligonukleottidov a prípravu uvedených konjugátov.
Low a spol. ďalej uvádza, že molekuly ako foiát alebo biotín môžu byť použité na nasmerovanie konjugátu do mnohých buniek v organizme, kvôli nadmernej a nešpecifickej expresii receptorov pre tieto molekuly.
Vyššie uvedené použitie povrchových proteínov na posilnenie membránovej permeability peptidu, proteínu alebo oligonukleotidu podľa vynálezu môže byť využité aj na nasmerovanie peptidu, proteínu alebo oligonukleotidu podľa vynálezu do určitých bunkových typov alebo tkanív. Ak sú napríklad cieľom nádorové bunky, je výhodné použiť bunkový povrchový proteín, ktorý sa v nadbytku exprimuje na povrchu týchto buniek. Príkladmi sú folátový receptor, mucínové antigény MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B a MUC7, glykoproteínové antigény KSA,
-53karcinoembryonálny antigén, membránový antigén špecifický pre prostatu (PSMA), HER-2/neu a ľudský chorionový gonadotropín-β. Vo vyššie uvedenej publikácii Wang a ďalší, 1998, je opísané použitie folátu pre cieľové nádorové bunky a Zhang a ďalší Clin Cancer Res 4, str. 2669-76, 1998, opisuje relatívne zastúpenie každého z ďalších vyššie uvedených antigénov v rôznych typoch nádorových a v normálnych buniek.
Proteín, peptid alebo oligonukleotid podľa vynálezu môže byť teda, použitím vyššie opísaných konjugačných techník, nasmerovaný do určitého požadovaného bunkového typu. Ak je napríklad želateľné posilniť apoptózu v bunkách lymfocytovej línie, je možné nasmerovať proteín alebo peptid podľa vynálezu pozitívne modulujúci kaspázu-8 do takýchto buniek napríklad použitím MHC molekúl triedy II, ktoré sa exprímujú na týchto bunkách. To je možné dosiahnuť pripojením protilátky alebo jej antigén-viažuceho miesta, nasmerovaného proti konštantnej oblasti MHC molekuly triedy II, ku proteínu alebo peptidu podľa vynálezu. Ďalej bolo opísané množstvo bunkových povrchových receptorov pre rôzne cytokíny a iné bunkové komunikačné molekuly, a mnohé z týchto molekúl sú exprimované viac alebo menej tkanivovo- alebo bunkovo obmedzeným spôsobom. Takže, keď je želateľné dostať sa do podskupiny T buniek, je možné na produkciu konjugátu podľa vynálezu použiť CD4 T bunkovú povrchovú molekulu. CD4-väzobné molekuly sú poskytované HIV vírusom, ktorého povrchový antigén gp42 je schopný špecificky sa viazať na CD4 molekulu. Apoptózu posilňujúci proteín alebo peptid podľa vynálezu interagujúci s kaspázou-8 môže byť použitý na výhodné zacielenie do Tbuniek na liečbu pacientov, ktorí trpia autoimunitnými reakciami na základe T buniek, ako napríklad pacientov s lupus erytematodes.
Vírus-sprostredkované bunkové zacielenie
Proteíny, peptidy a antisense sekvencie podľa vynálezu je možné zaviesť do buniek použitím vírusového vektora. Použitie vakcinačného vektora na tento účel je podrobne opísané vo vyššie uvedenej publikácii Current Protocols in Molecular Biology, kapitola 16. Použitie adenovírusových vektorov bolo opísané napr. v Teoh a ďalší, Blood 92, str. 4591-4601, 1998, Narumi a ďalší, Am J Respir Celí Mol Biol
-5419, str. 936-941, 1998, Pederson a ďalší J Gastrointest Surg 2, str. 283-91, 1998, Guang-Lin a ďalší, Transplant Proc 30, str. 2923-4, 1998 a tam uvedené citácie, Nishida a ďalší, Špine 23, str. 2437-42, 1998, Schwarzenberger a ďalší, J Immunol 161, str. 6383-9, 1998, a Cao a ďalší, J Immunol 161, str. 6238-44, 1998. Retrovírusový prenos antisense sekvencii bol opísaný v Daniel a ďalší, J Biomed Sci. 5, str. 383-94, 1998.
Keď sa použijú vírusy ako vektory, sú vo všeobecnosti použité vírusové povrchové proteíny na nasmerovanie vírusu. Keďže mnohé vírusy, ako napríklad vyššie uvedené adenovírusy, sú dosť nešpecifické z hľadiska ich bunkového tropizmu, môže byť želateľné dodať ďalšiu špecificitu použitím promótora špecifického pre bunkový typ alebo tkanivo. Griscelli a ďalší, Hum Gene Ther. 9, str. 1919-28,1998 opisuje použite promótora ľahkého reťazca 2 komorovo-špecifického srdcového myozínu na srdcovo-špeciľické nasmerovanie génu, ktorého prenos je sprostredkovaný adenovírusom.
Alternatívne je možné navrhnúť vírusový vektor tak, aby exprimoval na svojom povrchu ďalší proteín alebo povrchový proteín vírusového vektora môže byť zamenený tak, aby obsahoval požadovanú peptidovú sekvenciu. Vírusový vektor tak môže byť navrhnutý na expresiu jedného alebo viacerých ďalších epitopov, ktoré môžu byť použité na nasmerovanie uvedeného vírusového vektora. Na nasmerovanie vírusového vektora podľa vynálezu môžu byť použité napríklad cytokínové epitopy, peptidy viažuce MHC triedy II alebo epitopy odvodené od návratových molekúl.
Aplikácie vyššie opísaných nástrojov
Proteíny podľa vynálezu interagujúce s kaspázou-8 špecificky interagujú s podjednotkami kaspázy-8, ktoré sa podieľajú na proteolytickej aktivite kaspázy-8. Hoci želaním pôvodcov nie je viazať sa na teóriu, veria, že proteíny podľa vynálezu interagujúce s kaspázou-8 sú downstream následnými elementárni signalizačnej dráhy zahŕňajúcej kaspázu-8. Zdá sa, že predchádzajúce upstream činidlá sa viažu cez prodoménu kaspázy-8, ktorá sprostredkúva proteín-proteín interakciu. Zdá sa, že značná vzájomná krížová komunikácia s množstvom činidiel zahrnutých
-55v apoptickej odpovedi môže byť sprostredkovaná proteín-proteín interakciami, ktoré zahŕňajú smrtiacu efektorovú doménu (DED) a príbuzné domény, ako napríklad domény umiestnené v prodoméne kaspázy-8. Na rozdiel od týchto proteínov môžu proteíny podľa predloženého vynálezu interagujúce s kaspázou-8 patriť medzi priamych vykonávateľov procesov bunkovej smrti. Napríklad Tip-60, jeden s proteínov podľa vynálezu interagujúcich s kaspázou-8 je histón deacetylázový enzým. Proteín sa preto môže priamo podieľať na zmene chromatínovej štruktúry.
Interakcia proteínov podľa vynálezu s kaspázou-8 má niekoľko možných konsekvencií: prvou je modulácia účinku kaspázy-8. To je tu demonštrované v in vivo teste, kde J2 kloň podľa vynálezu inhibuje apoptózu sprostredkovanú kaspázou-8.
Druhou je, že proteín interagujúci s kaspázou-8 zvyšuje účinok kaspázy-8 zabránením degradácii kaspázy-8 alebo znižuje jej aktivitu tým, že účinkuje ako inhibítor.
Treťou je, že je možné modulovať účinok proteínu interagujúceho s kaspázou-8. To je tu demonštrované schopnosťou kaspázy-8 štiepiť proteíny interagujúce s kaspázou-8. Je pravdepodobné, že niektoré z týchto proteínov sú štiepením inaktivované. Avšak je tiež možné, že účinok proteínov sa mení, že sú indukované nové aktivity, alebo že proteín interagujúci s kaspázou-8 sa aktivuje štiepením, tak ako samotné kaspázy.
Z toho vyplýva, že proteíny, peptidy a oligonukleotidy podľa vynálezu interagujúce s kaspázou-8 a protilátky podľa vynálezu sú užitočné na moduláciu účinku kaspázy-8. Utlmovanie kaspázy-8 je želateľné v situáciách, v ktorých nastáva nadmerná bunková smrť apoptózou. Napríklad pri skleróze multiplex s primárnou oligodendrogliopatiou, autoimunitnej uveoretinitíde, cukrovke, lupuse, autoimunitnej myokarditíde, pri akútnom zlyhaní pečene bez ohľadu na etiológiu, pri chronickej hepatitíde sprostredkovanej HCV, chronickej gastritíde napr. gastritíde typu A, zmiešanej konektívnej tkanivovej chorobe (MCTD), Crohnovej chorobe a pri vredovej kolitíde, sa predpokladá, že deštrukcia telesného tkaniva je spôsobená apoptickými signálmi. Preto môže byť pre pacientov trpiacich na tieto ochorenia
-56užitočné stlmiť účinok kaspázy-8 v tých bunkách, ktoré sú ničené apoptickou bunkovou smrťou.
Napríklad pri vyššie uvedenej oligodendropatii je želateľné inhibovať aktivitu kaspázy-8 v oligodendrocytoch. V oligodendrocytoch a v rôznych iných mozgových bunkách, ale nie v iných tkanivách tela, sa exprimuje bunkový povrchový receptor spojený s G-proteínom pre kyselinu fosfolipidlyzofosfatidovú. Takže peptid alebo proteín podľa vynálezu je cielený do týchto buniek. To sa dá dosiahnuť buď spojením peptidu alebo proteínu a kyseliny fosfolipidlyzofosfatidovej, alebo zavedením sekvencie protilátky, ktorá špecificky rozoznáva uvedený receptor pre fosfolipidlyzofosfatidovú kyselinu do vírusového vektora, tak, že sa uvedený vírusový vektor špecificky viaže na receptor kyseliny fosfolipidlyzofosfatidovej.
Podobne, je možné nasmerovať peptidy alebo proteíny podľa vynálezu nasmerované do iných bunkových typov, ktoré sa podieľajú na iných vyššie uvedených ochoreniach, kde sa ukázalo, že nadmerná apoptická bunková smrť sprostredkúva pozorované poškodenie tkaniva.
Aj antisense RNA, antisense oligonukleotid a ribozým podľa vynálezu môžu byť podobne nasmerované do vyššie uvedených oligodendrocytov alebo do buniek zodpovedajúcich iným ochoreniam. V takom prípade sa inhibuje expresia proteínov interagujúcich s kaspázou-8 a nie expresia samotnej kaspázy-8. Inhibícia expresie množstva proteínov interagujúcich s kaspázou-8 môže znížiť apoptický účinok kaspázy-8. Avšak zníženie expresie určitých proteínov interagujúcich s kaspázou-8 môže v skutočnosti zvýšiť účinok kaspázy-8, keďže určité proteíny interagujúce s kaspázou-8 sú schopné slúžiť ako negatívny regulátor aktivity kaspázy-8. Preto je najprv potrebné testovať účinok použitia antisense oligonukleotidov a antisense RNA a ribozýmov napr. vo vyššie opísanom in vivo teste, predtým, ako sa takéto činidlá budú brať do úvahy ako liečivá.
Na druhej strane existujú určité situácie, v ktorých je želateľné zvýšiť účinok kaspázy-8. To môže byť v prípade ochorení uvedených vyššie, napríklad pri systémovom lupus erytematodes. Avšak odlišné sú typy buniek, ktoré majú byť zasiahnuté. Pri lupuse môže napríklad populácia T buniek obsahovať autoreaktívne bunky, ktoré neboli zničené v týmuse. Preto je potrebné nasmerovať činidlo podľa
-57vynálezu zvyšujúce účinok kaspázy-8 do T buniek. Je výhodné nasmerovať činidlo zvyšujúce účinok kaspázy-8 do autoreaktívnych T buniek. Pri niektorých chorobách, ako napríklad skleróza multiplex, sa predpokladá, že určité klony T buniek hrajú kritickú úlohu pri vývoji tejto choroby. Preto môže byť činidlo podľa vynálezu, ktoré zvyšuje účinok kaspázy-8 nasmerované do takýchto buniek použitím jednej alebo viacerých protilátok, ktoré sú špecifický nasmerované na variabilnú oblasť T bunkového receptora autoreaktívnych klonov T buniek, na nasmerovanie činidla podľa vynálezu, ktoré zvyšuje aktivitu kaspázy-8, čo môže byť proteín alebo peptid podľa vynálezu interagujúci sa kaspázou-8.
Vzhľadom na vyššie uvedené zahŕňa predložený vynález farmaceutické prípravky, ktoré obsahujú účinnú látku zahŕňajúcu jeden alebo viacero proteínov alebo peptidov interagujúcich s kaspázou-8, protilátku, ribozým, antisense RNA alebo antisense oligonukleotid podľa vynálezu.
Vynález ďalej zahŕňa farmaceutický prostriedok obsahujúci vírusový vektor, ktorý je schopný infikovať cicavčie bunky, pričom uvedený vektor obsahuje operačne napojený promótor a DNA sekvenciu podľa vynálezu, ktorá kóduje proteín alebo peptid interagujúci s kaspázou-8, ribozým, antisense RNA, antisense oligonukleotid alebo protilátku podľa vynálezu. Vírusový vektor môže voliteľne obsahovať kódujúcu sekvenciu operačne spojenú s promótorom, ktorá kóduje peptid alebo proteín umiestnený na povrchu vírusu, a ktorý je schopný viazať sa na povrchový proteín cicavčej bunky. Povrchovým proteínom je výhodne proteín, ktorý umožňuje príjem vírusového vektora, a výhodne sa exprimuje tkanivovo alebo bunkovo špecifickým spôsobom tak, aby bolo umožnené nasmerovanie vektora.
Proteín interagujúci s kaspázou-8, jeho analógy, fragmenty alebo deriváty môžu byť použité aj na izoláciu, identifikáciu a klonovanie iných proteínov rovnakej triedy, to znamená proteínov, ktoré viažu kaspázu-8 alebo funkčne príbuzné proteázy alebo proteíny, ktoré sa podieľajú na procese vnútrobunkovej signalizácie. Na túto aplikáciu je možné použiť vyššie uvedený kvasinkový dvojhybridný systém alebo môže byť použitý v súčasnosti vyvinutý systém využívajúci neprísnu Southern hybridizáciu a následne PCR klonovanie (Wilks a ďalší, 1989). V publikácii Wilks a ďalší je opísaná identifikácia a klonovanie dvoch
-58pravdepodobných proteín-tyrozín kináz aplikáciou neprísnej Southernovej hybridizácie a následným klonovaním prostredníctvom PCR na základe známej sekvencie kinázového motívu, ktorý je zahrnutý v kinázovej sekvenii. Tento prístup môže byť použitý, podľa predloženého vynálezu, použitím sekvencie proteinu interagujúceho s kaspázou-8 na identifikáciu a klonovanie proteínov príbuzných s proteínmi interagujúcimi s kaspázou-8.
Iným prístupom využívajúcim proteín interagujúci s kaspázou-8, jeho analógy, fragmenty alebo deriváty podľa vynálezu je ich použitie v spôsoboch afinitnej chromatografie na izoláciu a identifikáciu iných proteínov alebo faktorov, na ktoré sú schopné sa viazať, napr. iných proteínov alebo faktorov, ktoré sa podieľajú na procese vnútrobunkovej signalizácie. Pri tejto aplikácii môžu byť proteín interagujúci s kaspázou-8, jeho analógy, fragmenty alebo deriváty podľa predloženého vynálezu jednotlivo pripojené na matrice pre afinitnú chromatografiu a potom sa môžu uviesť do kontaktu s bunkovými extraktami alebo izolovanými proteínmi alebo faktormi, o ktorých sa predpokladá, že sa podieľajú na procese vnútrobunkovej signalizácie. Po afinitnej chromatografii je možné ďalšie proteíny alebo faktory, ktoré sa viažu na proteín interagujúci s kaspázou-8 alebo na jeho analógy, fragmenty alebo deriváty podľa vynálezu, eluovať, izolovať a charakterizovať.
Ako bolo uvedené vyššie, proteín interagujúci s kaspázou-8, jeho analógy, fragmenty alebo deriváty podľa vynálezu môžu byť použité aj ako imunogény (antigény) na produkciu špecifických protilátok voči nim. Tieto protilátky môžu byť tiež použité na účely purifikácie proteinu interagujúceho s kaspázou-8 (napr. ľudskej /\/-acetyl-glukózamín-6-fosfátdeacetylázy alebo ktorejkoľvek z jej izoforiem) buď z bunkových extraktov alebo z transformovaných bunkových línií produkujúcich proteín interagujúci s kaspázou-8 alebo jeho analógy alebo fragmenty. Navyše, tieto protilátky môžu byť použité na diagnostické účely, na identifikáciu porúch týkajúcich sa abnormálneho fungovania FAS-R alebo TNF systému sprostredkovaného kaspázou-8. Takže ak by sa tieto poruchy týkali nesprávnej funkcie vnútrobunkového signalizačného systému, v ktorom je zahrnutá kaspáza-8
-59alebo proteín interagujúci s kaspázou-8, taktéto protilátky by slúžili ako dôležitý diagnostický nástroj.
Treba poznamenať, že izolácia, identifikácia a charakterizácia proteínu interagujúceho s kaspázou-8 podľa vynálezu sa môže uskutočňovať použitím ktoréhokoľvek z dobre známych štandardných skríningových postupov. Napríklad jeden z takýchto skríningových postupov je nižšie opísaný kvasinkový dvojhybridný postup, ktorý bol použitý na identifikáciu kaspázy-8 (pozri Stanger a ďalší, 1995) a následne rôznych proteínov interagujúcich s kaspázou-8 podľa vynálezu (okrem rôznych iných nových proteínov podľa vyššie a nižšie uvedených prihlášok vynálezov, ktoré sú spoločne vlastnené a paralelne v konaní). Podobne, ako je uvedené vyššie a nižšie, je možné využiť iné postupy, ako afinitnú chromatografiu, DNA hybridizačné postupy, atď., ako je v oblasti dobre známe, na izoláciu, identifikáciu a charakterizáciu proteínu interagujúceho s kaspázou-8 podľa vynálezu alebo na izoláciu, identifikáciu a charakterizáciu ďalších proteínov, faktorov, receptorov atď, ktoré sú schopné viazať sa na proteíny podľa vynálezu interagujúce s kaspázou-8.
Stručný prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1 znázorňuje schematické vyobrazenie jednoreťazcového konštruktu kaspázy-8, ktorý je používaný ako návnada v dvojhybridnom skríningu opísanom v príklade 1 B.
Obrázok 2 znázorňuje predbežnú čiastočnú nukleotidovú (sekv. č. 1) a odvodenú aminokyselinovú sekvenciu (sekv. č. 2) klonu 32, ktorý kóduje proteín interagujúci s kaspázou-8, ako bol získaný z cDNA klonu.
Obrázok 3 znázorňuje pravdepodobnú úplnú sekvenciu nukleotidov (sekv. č. 3) a odvodenú aminokyselinovú sekvenciu (sekv. č. 4) ľudskej /V-acetylglukózamín6-fosfátdeacetylázy, ktorá pozostáva z 5' predĺženia klonu J2, EST klonu AA460869 a exónového záchytného klonu L48741.
Obrázok 4A znázorňuje funkčnú aktivitu klonu J2 vyjadrenú ako percento apoptických buniek po transfekcii HEK-293T buniek buď so samotným p55 TNF
-60receptorom (označeným ako p55 TNFR), alebo s p55TNF receptorom spolu s p35, bakulovírusovým inhibítorom kaspáz (p55 + p 35) alebo s klonom J2 (p55 + J2) alebo s p55 TN F receptorom spolu s neštiepiteľným mutantom J2 (označený ako J*), ktorý obsahuje Asp na Glu substitúciu v polohe 346 na obrázku 3 (p55 + J2*). Tento mutant nie je možné štiepiť ani in vitro, ani in vivo.
Obrázok 4B znázorňuje percento apoptických HeLa buniek, samotných alebo po transfekcii s p35 alebo J2 alebo J2* ošetrených s TNF a cykloheximidom.
Obrázok 5A znázorňuje 1725 kódujúcich bázových párov na 5' konci klonu P74 (sekv. č. 5).
Obrázok 5B znázorňuje 574-aminokyselinovú sekvenciu odvodenú od sekvencie klonu P74 podľa obrázku 5A (sekv. č. 6).
Obrázok 6 znázorňuje 1428 aminokyselín (sekv. č. 7) otvoreného čítacieho rámca odvodeného od odvodenej aminokyselinovej sekvencie PAC klonu s poradovým číslom RPC15-1057120.
Obrázok 7 znázorňuje zosúladenie 574 aminokyselín otvoreného čítacieho rámca odvodeného od odvodenej aminokyselinovej sekvencie p74 (označené ako klonované) v porovnaní s 1428 aminokyselinami otvoreného čítacieho rámca odvodeného od odvodenej aminokyselinovej sekvencie PAC klonu RPC15-1057120 (označené ako odvodené).
Obrázok 8 znázorňuje zosúladenie 574 aminokyselín otvoreného čítacieho rámca odvodenej aminokyselinovej sekvencie PAC klonu RPC15-1057120 (horná sekvencia) (sekv. č. 8) so sekvenciou históndeacetylázy A (spodná sekvencia, Genebank poradové číslo NP-006028.1) (sekv. č. 9).
Obrázok 9A znázorňuje autorádiografiu Bid proteínu a proteínov kódovaných cDNA klonmi J2 alebo p16 alebo P43 alebo P70 alebo P74 alebo P79, produkovaných v retikulocytovom lyzáte v prítomnosti 35S metionínu, ktoré sú oddelené na SDS PAGE géli.
Obrázok 9B znázorňuje autorádiografiu Bid proteínu a proteínov kódovaných cDNA klonmi J2 alebo p16 alebo P43 alebo P70 alebo P74 alebo P79, produkovaných ako bolo opísané pri obrázku 9A, ktoré boli analyzované z hľadiska väzby na kaspázu-8 exprimovanú v baktériách ako fúzovaný proteín jej dvoch
-61 pod jednotiek fúzovaných na GST. Na ľavej strane gélu je znázornená poloha markerov molekulovej hmotnosti.
Obrázok 10 znázorňuje výsledky štiepenia proteinu, kódovaného čiastočnou cDNA P43 klonu, kaspázou-8 alebo kaspázou-10 alebo kaspázou-3 alebo kaspázou-9 alebo mutantami kaspázy-3 alebo kaspázy-9 alebo kaspázy-10. Použité objemy celkového bakteriálneho lyzátu rekombinantných kaspáz exprimovaných v E. coli sú označené v relatívnych jednotkách (RU). Na ľavej strane gélu je vyznačená poloha markerov molekulovej hmotnosti. Sledované proteiny sú označené hviezdičkou, pričom plná šípka označuje kompletný P43 a nevyplnená šípka označuje poštiepené produkty.
Obrázok 11 znázorňuje funkčnú aktivitu proteínov kódovaných cDNA klonmi, ktoré boli identifikované prostredníctvom dvojhybridného skríningu, ktorá je vyjadrená ako percento apoptických buniek po kotransfekcii HEK-293T buniek s p55 TNF receptorom a so zeleným fluorescenčným proteínom (označeným ako PC) bez alebo s cDNA inzertami klonov J2 alebo P16 alebo P27 alebo P43 alebo P79 alebo P74 alebo P70.
Obrázok 12 znázorňuje apoptickú inhibičnú aktivitu divého typu neštiepiteľného mutantu Tip60 v HEK-293T bunkách kotransfekovaných s p55 TNF receptorom a so zeleným fluorescenčným proteínom, ako aj účinok A32-Tip60, ktorému chýba prvých 32 N-koncových aminokyselín. Kontrolné bunky boli transfekované samotným pCGN vektorom.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1A
Dvojhybridný skríning na identifikáciu proteínov interagujúcich s kaspázou-8
Na vyhľadávanie proteínov interagujúcich s kaspázou-8 a jej potenciálnych substrátov bol použitý modifikovaný kvasinkový dvojhybridný systém označený ako kvasinkový trojhybridný systém (Tirode F a ďalší, 1997). Jednotlivé vektory,
-62kvasinkové kmene a knižnice, ktoré sa použili, boli získané od Clontech (Palo Alto, USA), ako zložky Matchmaker dvojhybridného systému (PT1265-1).
Dve podjednotky kaspázy-8 sa exprimovali oddelene pod kontrolou rôznych promótorov. Krátka p10 podjednotka (serín 375 až kyselina asparágová 479) sa klonovala do vektora pGBT9 (Clontech) v jednom čítacom rámci s DNA viažucou doménou kvasinkového Gal4 proteínu (aminokyseliny 1 až 147, číslovanie sekvencie je v súlade s Laughon a ďalší, Molecular and Cellular Biology, 4, 260267, 1984). Dlhá, aktívna, p20 podjednotka (serín 217 až kyselina asparágová 374) bola mutovaná v polohe 360, tzn. cytozín nachádzajúci sa v tejto polohe sa zamenil za serín (C360S), čím sa inaktivovala proteázová aktivita enzýmu. Mutovaná C360S p20 podjednotka sa exprimovala ako nefúzovaný proteín pod kontrolou Met25 promótora, ktorý je pozitívne regulovaný médiom bez metionínu (Sangsoda, Mol Gen Genet. 200, str. 407-14, 1985). Možnosť kontrolovať aktivitu prmótora riadiaceho expresiu p20 podjednotky nastavením koncentrácie metionínu v kvasinkovom bunkovom rastovom médiu umožňuje 1) použitie toxických proteínových podjednotiek ako návnady, a 2) kontrolu závislosti proteín-proteín interakcie na treťom partnerovi, tzn. p20 podjednotke. P10 a p20 exprimujúce jednotky môžu byť umiestnené na rôznych vektorov. Môžu byť umiestnené aj na rovnakom vektore. V tomto príklade bol použitý modifikovaný pGBT9 vektor pGBT93H (pozri vyššie Tirode a ďalší). P20 podjednotka sa výhodne exprimuje ako fúzovaný proteín s jadrovým lokalizačným signálom.
Pri expresii bez metionínu sa dve podjednotky v kvasinkovej bunke navzájom spájajú. Spájanie dvoch podjednotiek bolo demonštrované spoločnou imunoprecipitáciou a Western blotom.
cDNA knižnica B buniek klonovaná do pGAD GH vektora (Durfee a ďalší, Genes Dev 7, 555-569) bola darom od Dr. S. Elledgeho. Vektor obsahuje Gal4 aktivačnú doménu (aminokyseliny 768 až 881). Táto Gal4 aktivačná doména, keď je fúzovaná s Gal4 DNA-viažucou doménou, postačuje na indukciu podstatnej transkripčnej aktivity Gal4 génu, pozri Ma a Ptashne, Celí, 48, 847-853 (1987).
GAL upstream aktivačné miesto (UAS.sub.G) ako je opísané v Keegan a ďalší (1986) vyššie, sa nachádza v oblasti pred reportérovým génom (/acZ) a
-63génom umožňujúcim selekciu (His) v kvasinkovom kmeni HF7c, získanom od Clontech.
Kultúra HF7c sa transformovala vyššie uvedenými plazmidmi, ktoré obsahujú kaspázu-8 a transformované kvasinkové bunky sa vybrali prostredníctvom rastu v selekčnom médiu ako je opísané v Clontech kvasinkových protokoloch, tzn. v médiu bez tryptofánu, leucínu, metionínu, tyrozínu. Voliteľne sa pridal homoserín v množstve 80 mg/l.
Kultúra uvedených transformantov sa potom ďalej transformovala s vektorom obsahujúcim knižnicu B buniek, a následne sa vysiala na platne s vyššie uvedeným médiom bez histidínu (selekčné médium).
Voliteľne sa do selekčného média doplnil 3-aminotriazol, ktorý je inhibítorom enzýmu histamín syntetázy. Pridanie inhibítora slúži na kontrolu prepúšťania promótora, ktorý riadi his gén v kvasinkových bunkách, ktoré neobsahujú proteíny interagujúce s kaspázou-8. V niektorých prípadoch môže slabá, nešpecifická interakcia viesť ku falošnej transkripcii z Gal4-UAG-his promótora, ktorá vedie ku kvasinkovým klonom rastúcim v selekčnom médiu.
Transformanty rastúce v selekčnom médiu sa vybrali a izolovali sa z nich DNA plazmidy. DNA sa potom transformovala do HB101 baktérií, ktoré umožňujú selekciu na médiu bez leucínu.
Po raste baktérií a extrakcii a purifikácií ich plazmidovej DNA sa plazmidová DNA transformovala do SFY526 kvasinkových buniek. Potom sa testovala lacZ aktivita SFY526 transformantov tak, že sa vysiali na platne so selekčným médiom obsahujúcim histidín a Xgal. Kvasinkové kolónie sa potom liftovali použitím Whatman 3MM č. 50 filtračného papiera (opis liftingu kolónií sa nachádza vyššie v Sambrook a ďalší) a umiestnili sa na približne 20 sekúnd na hliníkovú fóliu, preniesli sa na približne 25 sekúnd do kvapalného dusíka, aby sa zmrazili kvasinkové bunky, vystavili sa na približne 1 minútu laboratórnej teplote, aby sa kvasinkové bunky rozmrazili, a umiestnili sa na petriho misku na Whatmann 3MM č. 1 filtračný papier, ktorý bol predtým nasiaknutý Z tlmivým roztokom (β-galaktozidázový reakčný tlmivý roztok, pozri napr. Clontech protocols, Sambrook a ďalší, alebo vyššie uvedená
-64publikácia Current Protocols in Molecular Biology), ktorý obsahoval Xgal a βmerkaptoetanol. Objavenie sa modrej farby v kolóniách indikuje aktívnu βgalaktozidázu. Proteíny interagujúce s kaspázou-8 zvyčajne vyvíjajú v tomto teste modrú farbu v časovom rozsahu jednej minúty až cez noc, výhodne za 5 minút až 3 hodiny a najvýhodnejšie za 5 minút až jednu hodinu. Alternatívne bola kvantifikovaná β-galaktozidázová aktivita prostredníctvom kvapalnej kultúry v médiu obsahujúcom Xgal, odstránením buniek centrifugáciou a meraním absorbancie média použitím spektrofotometra.
Klony cDNA, ktoré sa identifikovali vo vyššie uvedenom skríningovom postupe sa potom ďalej testovali z hľadiska ich interakcie s inými proteínmi. To sa uskutočnilo transformovaním testovaných klonov spolu s nerelevantným proteínom exprimovaným ako fúzia s DNA aktivačnou doménou v pGAD GH vektore.
Dvojité transformanty, ktoré boli schopné rásť v médiu bez histidínu alebo vykazovali lacZ aktivitu, indikovali, že knižnicové klony sa naviazali nešpecifický.
Ako nerelevantné proteíny sa použili proteíny známe ako lepkavé, tzn. proteíny, ktoré nešpecifický interagujú s inými proteínmi, ako aj iné nepríbuzné proteíny. Proteíny boli napríklad testované z hľadiska viazania sa na lamín, RIP, RAIDD, TRAF2 a M0RT1. Vo všeobecnosti boli proteíny viažuce lamín vylúčené.
Vyššie uvedený trojhybridný test sa uskutočňoval aj s p10 podjednotkou kaspázy-8 fúzovanou na lexA DNA viažucu doménu. Výhodným vektorom je pLexA vektor dostupný od Clontech. Keď sa použije lexA ako DNA viažuca doména, mal by byť použitý kvasinkový kmeň L40 alebo jeho ekvivalent.
Vyššie opísanou skríningovou metódou sa identifikovali proteíny interagujúce s kaspázou-8 a ďalej sa analyzovali použitím in vivo a in vitro štiepiacimi testami a testami na prenos signálu, ako bude podrobnejšie opísané nižšie.
Príklad 1B
Modifikácia návnady pre dvojhybridný skríning na identifikáciu proteínov interagujúcich s kaspázou-8
-65Modifikovaná návnada kaspázy-8 bola použitá na ďalšie vyhľadávanie proteínov interagujúcich s kaspázou-8 kvasinkovým dvojhybridným systémom (Fields a Song, 1989). Kaspáza-8 sa exprimovala z návnadového vektora pGBT9 (Clontech) ako jednoreťazcový proteín. Aby sa vytvoril návnadový proteín, ktorý by sa podobal konformácii aktívnej kaspázy, odstránila sa prodoména a malá podjednotka 2 (od serínu 375 po kyselinu asparágovú 479) sa fúzovala na Gal4 DNA väzobnú doménu. C-koniec malej podjednotky sa oddelil od N-konca veľkej podjednotky 1 (od serínu 217 po kyselinu asparágovú 374) 16-aminokyselinovým glycín-serínovým spojovníkom (GGGGSGGGGSGGGGSG). Dve podjednotky aktívnej kaspázy sa tak odvodzujú od spontánneho poskladania jednej molekuly. Cysteín aktívneho miesta podjednotky 1 sa mutoval na serín (sub 1 C360S). Ukázalo sa, že nadexpresia tejto jednoreťazcovej kaspázy-8 je funkčne podobná nadexpresii divého typu kaspázy-8, čo sa stanovilo jej schopnosťou indukovať apoptózu HEK 293-T buniek, keď sa nadmerne exprimuje z pcDNAHis vektora ako kaspáza-8. Aktivitu jednoreťazcovej kaspázy-8 je možné blokovať koexpresiou s p35, čo je kaspázový inhibítor.
Dvojhybridný skríning sa uskutočňoval ako bolo opísané vyššie, s tou výnimkou, že vyššie opísaná jednoreťazcová kaspáza-8 sa exprimovala z pGBT9 vektora (Clontech).
Príklad 2
Identifikácia proteínov interagujúcich s kaspázou-8
Použitím modifikovaného dvojhybridného skríningu opísaného v príklade 1A sa identifikovalo niekoľko klonov kódujúcich proteíny špecificky viažuce kaspázu-8. Špecificita viazania sa klonov sa potvrdila v dvojhybridnom teste v kvasinkách v prípade, že sa nedetekovalo žiadne viazanie sa na kontrolné proteíny. Vybrané cDNA klony sa izolovali a sekvenovali a nukleotidová sekvencia sa porovnala so sekvenciami nájdenými v Genbank ako je opísané nižšie.
-66Príklad 2.1
Zistilo sa, že kloň Ľ1 obsahuje čiastočnú cDNA sekvenciu zhodnú s aminokyselinami 690 až 750 proteínu Stat 1. Stat 1 sa identifikoval ako transkripčný faktor, ktorý sa viaže na interferónom stimulovaní responzívny element (ISRE) a na gama aktivovaný sekvenčný (GAS) element (ako zhrnutie pozri Iffic SN, 1998). V súčasnosti sa ukázalo, že Stat 1 sa podieľa na regulácii stálej hladiny kaspázy (Kuiner a ďalší 1997) a slúži ako in vitro substrát pre kaspázu-3 (King P a ďalší
1998). Predpokladá sa, že Stat 1 hrá úlohu v regulácii samotnej apoptickej odpovede.
Príklad 2.2
Zistilo sa, že L7 kóduje cDNA, ktorá sa skoro úplne zhoduje s C-koncovou časťou EST klonu nájdeného v Genbank, ktorému nebola priradená žiadna funkcia (prístupové číslo AA608733).
Príklad 2.3
Zistilo sa, že kloň L20 je zhodný s aminokyselinami 104 až 420 NEFA (prístupové číslo 462693). NEFA je nový proteín, ktorý obsahuje základnú aminokyselinovú pravdepodobnú DNA väzobnú doménu s potenciálnym jadrovým smerovacím signálom, dve oblasti s motívom závitnica-slučka-závitnica, súhlasné EF-ručné motívy, oblasť bohatú na kyslé aminokyseliny medzi EF-ručnými motívmi a motív leucínového zipsu (Barnikol-Watanabe a ďalší, 1994). Zistilo sa tiež, že NEFA je vápnik viažuci proteín, a nachádza sa tak v cytoplazme, ako aj na bunkovom povrchu, a je možné ho detegovať aj v kultivačnom médiu. NEFA patrí do nukleoviažucej podrodiny. Avšak biologická úloha NEFA ešte nebola objasnená. Kloň L20 sa štiepi kaspázou-8 tak in vitro, ako aj in vivo.
-67Príklad 2.4
Zistilo sa, že kloň L12 kóduje čiastočnú cDNA, ktorá sa takmer úplne zhoduje s ľudským EST klonom nájdeným v databáze (prístupové číslo M62097). Kloň L12 sa štiepi in vitro kaspázou-8, ako bolo dokázané in vitro proteázovým testom. V stručnosti, in vitro syntetizovaný 35S značený proteín sa inkuboval 30 až 60 minút v proteázovom tlmivom roztoku v prítomnosti bakteriálne produkovanej kaspázy-8. Proteíný a ich fragmenty sa oddelili na SDS-PAGE a výsledky sa vizualizovali autorádiograficky alebo fosfoimagingom.
Príklad 2.5
Zistilo sa, že kloň L5 kóduje cDNA, ktorá je zhodná s Tip60 proteínom (prístupové číslo 3024755). Tip60 (Tat interaktívny proteín, 60 kDa) bol najprv opísaný ako bunkový proteín interagujúci s HIV-Tat transaktivátorom (Kamine a ďalší, Virology 216, 357-366, 1996) a neskôr sa ukázalo, že má histón acetyltransferázovú aktivitu (Yamamoto a Horikoshi, 1997). Okrem jeho schopnosti zosilniť Tat sprostredkovanú aktiváciu HIV promótora, ostáva ešte identifikovať biologickú úlohu Tip60.
V dvojhybridnom kvasinkovom teste sa zistilo, že L5 sa viaže na samotnú podjednotku 2 kaspázy-8, ako aj na komplex p10-p20. Kloň L5 sa štiepil in vitro kaspázou-8 v in vitro proteázovom teste, ktorý bol opísaný v príklade 2.4. Tip60 sa štiepil aj na kaspáze závislým spôsobom pri koexpresii spolu s p55 TNF receptorom v HeLa a HEK 293-T bunkách. Tiež sa štiepil v HeLa bunkách po ošetrení s TNF aj bez prítomnosti inhibítorov proteínovej syntézy. V stručnosti, proteín sa klonoval do pcDNAHis vektora (Invitrogen) a exprimoval sa v HEK 293-T alebo HeLa bunkách spolu s proteínom indukujúcim apoptózu (napr. p55TNF-R alebo kaspáza-8). Dvadsať hodín po transfekcii sa bunky zozbierali a kompletný bunkový lyzát 0,5 až 1x106 buniek sa naniesol na SDS-PAGE a následne sa aplikoval Western Blot s anti poly-His protilátkami (Sigma). Výsledky boli vizualizované prostredníctvom ECL. Izolovalo sa niekoľko cDNA klonov kódujúcich inzerty zhodujúce sa s Tip60
-68proteínom. Zistilo sa, že všetkým klonom, vrátane klonu divého typu s úplnou dĺžkou Tip60, chýba segment od aminokyseliny 94 (prolín) po aminokyselinu 145 (treonín). Táto sekcia proteínu nie je časťou acetylázového aktívneho miesta a nie je považovaná za esenciálnu pre funkciu proteínu. Zistilo sa, že mutant Tip-60, v ktorom sú zvyšky kyseliny asparágovej v polohách 200 a 203 nahradené alanínovými zvyškami, nie je štiepiteľný.
Príklad 2.6
Zistilo sa, že kloň M26 kóduje čiastočnú cDNA, ktorá sa skoro úplne zhoduje s ľudským EST klonom nájedným v Genbank (prístupové číslo C18037). V dvojhybridnom kvasinkovom teste sa zistilo, že kloň M26 sa viaže na samotnú podjednotku 2 kaspázy-8.
Príklad 3
Izolácia proteínov interagujúcich s kaspázou-8
Použitím dvojhybridného skríningu opísaného v príklade 1B sa identifikovalo niekoľko ďalších klonov kódujúcich špecifické proteíny viažuce kaspázu-8. Vybrané cDNA klony sa izolovali a sekvenovali a nukleotidová sekvencia sa porovnala s nukleotidovou sekvenciou nájdenou v Genbank ako je opísané nižšie.
Prehľadávala sa knižnica B-buniek (Durfee T a ďalší, 1993) a knižnica Jurkat T-buniek. Tabuľka 2 uvádza počiatočnú charakterizáciu prvej skupiny klonov.
-69Tabuľka 2
Klon/klony Časť/homológ Zdroj lacZ (SFY) Dĺžka inzertu Štiepenie
niekoľko NEFA všetky bunky + 650-110 in vivo/ in vitro
B33 Nukleobindín Ipr-bunky + 2000 in vivo/ in vitro
B4.2 KIAA0615 samčí mozog +++ 3000 in vitro
B8.1 EST00156 +++ 1500 in vivo/ in vitro
B11 Fosfoetanolam transfere ’ncytidylyl iza +++ in vitro
B17.1 H23509 mozog mlád’aťa ++ 1200
B13.1 Ribonukleoziddifosfát reduktáza EBV +++ 700 in vitro
B22 Cyklofilín A + 700
B27 gbAA936350 + 2700 in vivo/ in vitro
B37.1 EBV EBV ++++ 1400
J2 AA746639 ľudský ++++ 600 in vivo/ in vitro
J40 KIAA0419 samčí mozog ++ 2300 in vitro
in vivo·. 293-T a/alebo HeLa bunky
Čiastočné klony kódujúce časti NEFA, ako aj kloň B8.1 sa izolovali aj kvasinkovým dvojhybridným spôsobom opísaným v príklade 1A.
Príklad 3.1
Klony B4 (prístupové číslo 3327044), B17 (prístupové číslo H23509), B27 (prístupové číslo AA936350) a J40 (prístupové číslo 2887413) kódujú cDNA inzerty homologické s terminálnym koncom príslušných EST.
-70Príklad 3.2
Kloň B11 kóduje cDNA inzert homologický s C-terminálnym koncom CTPfosfoenolamíncytidylyltransferázy (ET, prístupové číslo D84307). ET je enzým podieľajúci sa na metabolizme fosfolipidov a katalyzuje konverziu fosfoetanolamínu na CDP-etanolamín (Nakashima a ďalší 1997). Kloň B11 sa štiepil in vitro kaspázou-8, ako bolo demonštrované v teste opísanom vo vyššie uvedenom príklade 2.4.
Príklad 3.3
Klony B13 a B37 kódujú cDNA inzert homologický s C-terminálnym koncom klonu, ktorý kóduje časť EBV genómu (prístupové číslo V01555).
Príklad 3.4
Kloň B22 kóduje cDNA inzert homologický s C-terminálnym koncom Tbunkového cyklofilínu (prístupové číslo Y00052). T-bunkový cyklofilín bol identifikovaný ako vnútrobunkový receptor pre cyklosporín A a FK506 a má vlastnú peptidylprolyl-c/s-ŕrans-izomerázovú aktivitu (Haendler B a ďalší, 1987).
Príklad 3.5
Kloň B33 kóduje cDNA inzert homologický s C-koncom nukleobindínu (prístupové číslo 2506255). Nukleobindín je sekretovaný proteín, ktorý viaže DNA a Ca2+, ktorý je veľmi podobný s NEFA proteínom opísaným v príklade 3.3. Nukleobindín bol pôvodne opísaný ako 55 kDa proteín, ktorý posilňuje produkciu anti DNA protilátky v kultúrach autoimunitných /pr myších slezinových buniek (Miura K a ďalší, 1992). Kloň B33 sa štiepil kaspázou-8 tak in vitro, ako aj in vivo, ako bolo demonštrované vo vyššie opísaných testoch v príkladoch 2.4 a 2.5.
-71 Príklad 3.6
Kloň J2 obsahuje inzert s dĺžkou 600 bázových párov, ktorý kóduje čiastočnú proteínovú sekvenciu, z ktorej vzniká približne 20 kDa polypeptid, keď sa exprimuje in vitro v bezbunkovom systéme, ako aj v bunkách. Polypeptid kódovaný klonom J2 sa štiepi in vitro kaspázou-8 a in vivo v HEK 293-T a HeLa bunkách pri koespresii s p55TNF-R alebo kaspázou-8 vo vyššie uvedených testoch uvedených v príkladoch
2.4 a 2.5.
Nukleotidová a odvodená aminokyselinová sekvencia klonu J2 je uvedená na obrázku 2.
Porovnanie 5' konca klonu J2 získaného PCR so sekvenciami publikovanými v databáze odhalilo homológiu klonu J2 a ľudského EST (prístupové číslo AA460869), ktorý zodpovedá pravdepodobnej ľudskej /\/-acetylglukózamín-6-fosfát deacetyláze, ako aj s ďalším klonom (L48741), a umožnilo zostavenie pravdepodobnej kompletnej sekvencie ľudskej /\/-acetylglukózamín-6-fosfát deacetylázy, ktorá je uvedená na obrázku 3.
Príklad 4
Funkčná charakterizácia klonu J2
Počiatočná funkčná charakterizácia klonu J2 odhalila, že má inhibičný účinok na apoptózu v HEK 293-T a HeLa bunkách indukovanú kaspázou-8 a ľudským p55TNF-R. Expresia J2 potláča/odďaľuje apoptózu HEK 293-T buniek kotransfekovaných s p55 TNF receptorom alebo HeLa buniek ošetrených TNF a cykloheximidom na 25 až 50 %, ako je ilustrované na obrázku 3. Kvantifikácia apoptických buniek sa uskutočňovala stanovením podielu buniek exprimujúcich βgalaktozidázu, ktoré vykazujú apoptickú morfológiu 20 hodín po transfekcii uvedených konštruktov. Údaje sú uvedené ako priemerné percento modrých buniek vykazujúcich známky apoptózy ako frakcia celkového množstva modrých buniek (približne 500 buniek na vzorku). Alternatívne bol ako marker použitý zelený
-72fluorescenčný proteín a detekcia sa uskutočňovala fluorescenčnou konfokálnou mikroskopiou.
Príklad 5
Klonovanie proteínov interagujúcich s kaspázou-8
Ľudská placentová cDNA knižnica exprimovaná z pACT2 vektora (dostupná od Clontech, Palo Atlo, USA) sa skrínovala dvojhybridnou skríningovou metódou použitím návnady opísanej v príklade 1B vyššie. Použitím skríningu sa identifikovalo niekoľko klonov kódujúcich špecifické proteíny viažuce kaspázu-8. Ďalej boli študované klony P16, P27, P43, P70, P74 a P79.
Sekvenovaním cDNA inzertov cDNA klonov P43, P16 a P74 sa zistilo, že zdieľajú určité homologické sekvencie. Kloň P74 mal najdlhší inzert s dĺžkou približne 3000 bp, a zdá sa, že kóduje proteín s odvodeným čítacím rámcom s dĺžkou 574 aminokyselín a s predpokladanou molekulovou hmotnosťou približne 68 až 70 kDa. Sekvencie troch vyššie uvedených cDNA inzertov sa porovnali so sekvenciami nachádzajúcimi sa vo verejných databázach. Zistilo sa, že cDNA inzerty klonov P43, P16 a P74 majú určitú homológiu so sekvenciou dvoch EST klonov nájdených v Genbank (W04418 a N64095). Zdá sa, že sekvencia všetkých troch cDNA inzertov predstavuje 3' konce rôznych zostrihových izoforiem rovnakého proteínu. Porovnanie sekvencií troch cDNA inzertov potvrdilo otvorený čítací rámec s dĺžkou 574 aminokyselín vo vnútri sekvencie P74 (znázornené na obrázku 5). Podobná sekvencia sa našla aj vo vnútri genomického klonu identifikovaného v inej verejnej databáze (RPCI5-1057120; Roswel Park Cancer Inštitúte Human PAC library), ktorý sa nachádza na ľudskom chromozóme 12q31. Otvorený čítací rámec odvodený od sekvencie tohto PAC klonu mal dĺžku 1428 aminokyselín (znázornené na obrázku 6) a obsahoval vyššie uvedený čítací rámec s dĺžkou 574 aminokyselín. Obrázok 7 znázorňuje porovnanie sekvencie otvoreného čítacieho rámca odvodenej aminokyselinovej sekvencie cDNA inzertu klonu P74 (označená klonovaná) s otvoreným čítacím rámcom odvodenej sekvencie PAC klonu (označená odvodená).
-73Z porovnania odvodenej aminokyselinovej sekvencie klonu P74 so sekvenciou odvodenou od PAC klonu s úplnou dĺžkou je zrejmé, že proteín s úplnou dĺžkou zodpovedajúci P74 je dlhší na 5' konci a je možné, že začína prvým alebo jedným z prvých metionínov sekvencie PAC znázornenej na obrázku 6.
Zistilo sa tiež, že sekvencia klonu P74 vykazuje významnú homológiu s vysoko homologickou oblasťou myších a ľudských histón deacetyláz, oblasťou, ktorá by mohla byť doménou obsahujúcou histón deacetylázové enzymatické aktívne miesto, z čoho vyplýva, že proteín kódovaný P74 môže mať funkciu týchto proteínov. Sekvencia oblasti medzi 163 a 1716 bp čiastočnej cDNA klonu P74 vykazuje približne 80% homológiu s histón deacetylázou A (prístupové číslo NP_006028). Sekvencia v oblasti medzi 385 a 1707 bp čiastočnej cDNA klonu P74 vykazuje homológiu so sekvenciou histón deacetylázy 5 (prístupové číslo NP_005465). Sekvencia v oblasti medzi 418 a 1629 bp čiastočného cDNA klonu P74 vykazuje homológiu so sekveciou histón deacetylázy mHDA1 (prístupové číslo AAD09834) a sekvencia v oblasti medzi 424 a 1551 bp čiastočnej cDNA klonu P74 vykazuje homológiu so sekvenciou histón deacetylázy 6 (prístupové číslo NP_006035). Porovnanie aminokyselinovej sekvencie úplného proteínu odvodenej od PAC sekvencie so sekvenciou histón deacetylázy A (Genebank prístupové číslo NP-006028.1) je znázornená na obrázku 8.
Príklad 6
Funkčná charakterizácia proteínov interagujúcich s kaspázou-8
A) Proteíny kódované cDNA klonmi J2 alebo P16 alebo P43 alebo P70 alebo P74 alebo P79, ktoré boli identifikované v dvojhybridnom skríningu, sa exprimovali v retikulocytových lyzátoch v prítomnosti 35S metionínu v TnT T7 Coupled Retyculocyte Lysate System (dodaný od Promega, č. kat. L4610) a rozdelili sa na SDSPAGE géli (pozri obrázok 9A). Rovnaké množstvá proteínov exprimovaných v retikulocytových lyzátoch sa analyzovali z hľadiska viazania sa na fúzovaný proteín z dvoch podjednotiek kaspázy-8 GST-S2-S1 (C360S) podľa vyššie uvedeného príkladu 1B, a GST, ktorý je exprimovaný v baktériách. Po prečistení hodinovým
-74inkubovaním pri 4 °C len s GST guľôčkami sa Tnt produkované proteíny precipitovali s kaspáza-8 GST-S2-S1 fúzovaným proteínom pripojeným na GST guľôčky hodinovým inkubovaním pri 4 °C s GST guľôčkami, GST precipitáty sa premyli a proteíny viažuce kaspázu-8 sa oddelili od guľôčok povarením v SDSobsahujúcej vzorke tlmivého roztoku a rozdelili sa prostredníctvom SDS-PAGE. Proteíny schopné viazať sa na konštrukt kaspázy-8 sa tak mohli vizualizovať autorádiograficky. Ukázalo sa, že proteín kódovaný klonom P74 sa špecificky in vitro viaže na kaspázu-8 (pozri obrázok 9B) v porovnaní s väzbou GST-S2-S1 (C360S) na Bid, čo je známy proximálny substrát kaspázy-8 vo Fas apoptickej signalizačnej dráhe. Na obrázku sú kompletné proteíny produkované v retikulocytovom lyzáte označené hviezdičkami.
V dvojhybridných testoch opísaných vyššie v príklade 1A sa zistilo, že proteín kódovaný P74 sa viaže na fúzovaný proteín kódovaný dvoma podjednotkami kaspázy-8, a neviaže sa na samostatne exprimovanú malú podjednotku kaspázy-8. Na rozdiel od iných proteínov uvedených vo vyššie uvedených príkladoch, ako napríklad Tip60, ktoré sa viažu na malú S2 podjednotku kaspázy-8, keď je exprimovaná samostatne (údaje nie sú uvededné).
B) Proteín kódovaný P43 cDNA sa exprimoval in vitro v retikulocytových lyzátoch v prítomnosti 35S metionínu použitím TNT T7 Coupled Reticulocyte Lysate System, a štiepili sa s rekombinantnou prirodzenou alebo mutantnou kaspázou-3 alebo kaspázou-9 alebo kaspázou-10, ktoré boli exprimované v E. coli ako fúzované proteíny obsahujúce histidínový prívesok a podjednotku 2 a podjednotku 1 (S2-S1). Kaspáza-8 sa exprimovala ako fúzovaný proteín, podjednotka-1podjednotka-2(S1-S2)-histidínový prívesok. V proteázovom teste sa použili 1 a 4 objemy celkového bakteriálneho lyzátu, definované ako 1 alebo 4 relatívne jednotky (RU) (obrázok 10). V stručnosti, in vitro syntetizované 35S značené proteíny sa inkubovali 30 minút v proteázovou tlmivom roztoku pri 37 °C v prítomnosti bakteriálne produkovanej kaspázy-8. Proteíny a ich fragmenty sa oddelili na SDSPAGE a výsledky sa vizualizovali autorádiograficky alebo fosfoimagingom. Z
-75výsledkov vyplýva, že proteín kódovaný P43 cDNA použitý ako substrát sa účinne štiepi kaspázou-8, slabo sa štiepi kaspázou-10 a neštiepi sa s kaspázou-3, ani s kaspázou-9 (obrázok 10). Takže sa zdá, že proteín je špecifickým substrátom pre kaspázu-8.
C) Za účelom analyzovania účinku novo klonovaných proteínov na apoptickú bunkovú smrť indukovanú TNF receptorovou signalizačnou dráhov, sa vybrané cDNA klonovali do pcDNA 3.1/His C expresných vektorov (dostupné od Invitrogen) a prechodne sa kotransfekovali s p55 TNFR receptorom exprimovaným v pcDNA3 vektore (Invitrogen) a so zeleným fluorescenčným proteínom (GFP) exprimovaným z pEGFPCI expresného vektora (Clontech), do HEK-293-T buniek. Tip60 cDNA a Δ32-Τΐρ60 bez prvých 32 N-koncových aminokyselín sa klonovali do pCGN vektora (opísané v M. Tanaka a W. Herr, Celí 60, 375-386, 1990), v ktorom sa hemaglutinín (HA) prívesok fúzoval na N-terminálny koniec cDNA a použilo sa rovnaké experimentálne nastavenie.
Po 24 hodinách sa transfekované bunky skúmali pod fluorescenčným mikroskopom a bunková smrť sa hodnotila stanovením počtu buniek vykazujúcich apoptickú morfológiu vzhľadom na celkovú populáciu fluorescenčných buniek. Zistilo sa, že P74 proteín nadexprimovaný z čiastočnej cDNA klonovanej do pcDNA-His vektora chráni HEK-293-T a HeLa bunky od smrti indukovanej nadexpresiou p55 TNF receptora (obrázok 11) alebo nadexpresiou dvoch fúzovaných podjednotiek kaspázy-8 (údaje nie sú uvedené). Zistilo sa, že divý typ Tip60 a neštiepiteľný Tip60 mutant, v ktorom sú zvyšky kyseliny asparágovej v polohách 200 a 203 nahradené alanínovými zvyškami, chráni HEK-293-T bunky pred smrťou indukovanou nadexpresiou p55 TNF receptora (obrázok 12), zatiaľ čo Δ32-Τΐρ60, ktorému chýba prvých 32 N-koncových aminokyselín, nevykazuje tento ochranný účinok.
Po úplnom opise tohto vynálezu je pre priemerného odborníka v oblasti zrejmé, že to isté je možné uskutočniť v rámci širokého rozsahu ekvivalentných
-76parametrov, koncentrácií a podmienok bez toho, aby sa prekročil rámec vynálezu a bez nadmerného experimentovania.
Hoci tento vynález bol opísaný v spojitosti s jeho konkrétnymi uskutočneniami, bude zrejmé, že sú možné ďalšie modifikácie. Úmyslom tejto prihlášky je pokryť akékoľvek varianty, použitia alebo adaptácie vo všeobecnosti sledujúce princípy vynálezu a to vrátane odbočení od predloženého opisu, ktoré spadajú do známej alebo zvyčajnej praxe oblasti, do ktorej patrí vynález, a ktoré môžu byť aplikované na základe znakov vyplývajúcich s pripojených nárokov.
Všetky tu citované publikácie, vrátane časopisových článkov alebo abstraktov, publikovaných alebo korešpondujúcich US alebo zahraničných prihlášok vynálezu, vydaných US alebo zahraničných patentov alebo akékoľvek iné citácie sú tu zahrnuté ako celok prostredníctvom ich spomenutia, vrátane všetkých údajov, tabuliek, obrázkov a textov, ktoré sú v nich prezentované. Navyše sú tu komplet zahrnuté obsahy citácií v uvedených publikáciách.
Odvolanie sa na známe spôsobové kroky, bežné spôsobové kroky, známe metódy alebo bežné metódy, nemá byť v žiadnom prípade brané ako skutočnosť, že nejaký aspekt, opis alebo uskutočnenie predloženého vynálezu je nárokované, opísané alebo navrhnuté v relevantnej oblasti.
Vyššie uvedený opis špecifických uskutočnení kompletne odhalí všeobecnú povahu vynálezu a pre priemerného odborníka v oblasti je možné aplikovaním znalostí z oblasti (zahŕňajúc obsah uvedených citácií) jednoducho modifikovať a/alebo adaptovať ho pre rôzne aplikácie konkrétnych uskutočnení, bez nadmerného experimentovania a bez vybočenia zo všeobecného konceptu podľa predloženého vynálezu. Preto sú takéto adaptácie a modifikácie považované za spadajúce do rozsahu ekvivalentov opísaných uskutočnení na základe tu uvedeného opisu a návodu.
Treba poznamenať, že tu uvedená frazeológia a terminológia plní funkciu opisu a nie limitácie, takže terminológia a frazeológia predloženého opisu má byť interpretovaná priemerným odborníkom v oblasti vo vzťahu k tu uvedenému opisu a návodu, v kombinovaní so znalosťami priemerného odborníka v oblasti.
-ΊΊ Literatúra
Ahmad M a ďalší, Cancer Res 1997; 57(4):615-9
Bamikol-Watanabe S. a ďalší, Biol Chem Hoppe Seyler 1994; 375(8):497-512
Cohen OM, Biochem J 1997; 326 (Pt1). 1-16
Duan H a ďalší, Náture 1997; 385(6611):86-9
Durfee T a ďalší, Genes Dev 1993; 7(4)..SSS-69
Femandes-Alnemri T a ďalší, ProcNatlAcadSci USA 1996; 93(15):7464-9
Fields S, Song O, Náture 1989; 340(6230):245-6
Haendler B a ďalší, EMBO J 1987; 6(4):947-50
Ihle JN, Celí 1996; 84(3):331-4
Kamine J. a ďalší Virol 1996; 216(2):357-66
King P a ďalší, J Biol Chem 1998; 273(15):8699-704
Kischkel FC a ďalší, EMBO J 1995; 14(22); 5579-88
Kurnar A a ďalší, Science 1997; 278(5343):1630-2
Quelle FWa ďalší, J Biol Chem 1995; 270(35):20775-80
MacFarlane M a ďalší, J Biol Chem 1997; 272(41):25417-20
Mittl PR a ďalší, J Biol Chem 1997; 272(10):6539-47
Miura K a ďalší, Biochem Biophys Res Commun 1992; 187(1):375-80
Muzio M a ďalší, J Biol Chem 1998; 273(5):2926-30
Nagata S a ďalší, Celí 1997; 88(3):355-65
Nakashima A a ďalší, J Biol Chem 1997; 272(14):9567-72
Nicholson DWa ďalší, Trend Biochem Sci 1997; 22(8):299-306
Rotonda J a ďalší, Nat Struct Biol 1996; 3(7):619-25
Salvesen GS a ďalší, Celí 1997; 91(4):443-6
Srinivasula SM a ďalší, ProcNatlAcadSci USA 1996; 93(25):14486-91
Srinivasula SM a ďalší, J Biol Chem 1998; 273(17):10107-11
Thornberry NA a ďalší, J Biol Chem 1997; 272(29):17907-11
Tirode F a ďalší, J Biol Chem 1997; 272(37):22995-9
Yamamoto T a ďalší, J Biol Chem 1997; 272(49):30595-8
Yang X a ďalší, Mol Celí 1998; 1(2):319-25
-78Zoznam sekvencii <110> WALLACH, Dávid
SCHUCHMANN, Marcus
GONCHAROV, Tanya
Yeda Research and Development Co. Ltd.
<120> Proteín enetragujúci s kaspázou-8 <130> Kaspáza-8 <140>
<141 >
<150> 132105 <151> 1999-09-28 <150> 127721 <151> 1998-12-24 <160> 9 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211 >447 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cggcacgagg ggtctgacgg gcatgccagg acgctgagtg aggttcagca ctggagaaga actcecttca ctaggcagtg gcctgggcaa cctacgtggc tggcccacga gcagcatagc tgaagtcggc gtaaggggac cgtccaggcc acaaggacct cggccggcac acgctgggac agcaggaagt ggaagtggac 60 aggtgagcgc cctgacccac tgggtcccag gtcccagccc 120 cccccccaga gcctgccctc tctgctctca aggcaccaag 180 cccaatgaac gtctgtgtcc gggcacttcc tgcaggccac 240 cttgaaggct gcatccttgc accccgccca gttgctgggg 300 cttgactttg gtgctgacgc agacttcgtg gtgctcgacg 360 acctacatct cgggtgagct ggtgtggcag gcggacgcag 420 cggctga 447 <210>2 <211> 148 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Arg His Glu Gly Leu Gly Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Gin Gin Glu 15 10 15
Val Glu Val Asp 20 Gly Leu Thr Ala Tyr 25 Val Ala Gly Glu Arg 30 Pro Asp
Pro Leu Gly 35 Pro Arg Ser Gin Pro 40 Ala Cys Gin Val Ala 45 His Asp Pro
Pro Arg 50 Ala Cys Pro Leu Cys 55 Ser Gin Gly Thr Lys 60 Thr Leu Ser Gly
Ser 65 íle Ala Pro Met Asn 70 Val Cys Val Arg Ala 75 Leu Pro Ala Gly His 80
Arg Phe Ser Met Lys 85 Ser Ala Leu Lys Ala 90 Ala Ser Leu His Pro 95 Ala
Gin Leu Leu Gly 100 Leu Glu Lys Ser Lys 105 Gly Thr Leu Thr Leu 110 Val Leu
Thr Gin Thr 115 Ser Trp Cys Ser Thr 120 Thr Pro Phe Thr Ser 125 Arg Pro Pro
Thr Ser Arg Val Ser 130 Lys Asp Leu Gly 145 <210>3 <211> 1513 <212> DNA <213> Homo sapiens Trp Cys 135 Gly Arg Arg Thr Gin 140 Leu Gly Ser Asp
<400> 3 ggcgcggctc cgctctcggc tggggttcgt cactgggcgc gggatttgge cgccgcgggg 60 ctccggagcc gctcgctccc gacacggctc acgatgcgcg gcgacagggc cggcgggggc 120 cccgtgctcc agttcactaa ctgccggatc ctgcgcggag ggaaactgct cagggaggat 180 ctgtgggtgc gcggaggccg catcttggac ccagagaagc tgttctttga ggagcggcgc 240 gtggccgacg agcggcggga ctgcgggggc cgcatcttgg ctcccggatt catcgacgtg 300 cagatcaacc gtggatttgg tgttgacttc tctcaagcca cggaggacgt gggttcgggg 360 gttgccctcg tggcccggag gatcctgtcg cacggcgtca cctccttctg ccccaccctg 420 gtcacttccc caccggaggc ttatcacaag gttgttcctc agatccctgt gaagagtggt 480 ggtccccatg gggcaggggt cctcgggctg cacctggagg gccccttcat cagccgggag 540 aagcggggcg cgcaccccga ggcccacctc cgctccttcg aggccgatgc cttccaggac 600 ttgctggcca cctacgggcc cctggacaat gtccgcatcg tgacgctggc cccagagttg 660 ggccgtagcc acgaagtgat ccgggcgctg acggcccgtg gcatctgcgt gtccctaggg 720 cactcagtgg ctgacctgcg ggcggcagag gatgctgtgt ggagcggagc caccttcatc 780 acccacctct tcaacgccat gctgcctttc caccaccgcg acccaggcat cgtggggctc 840 ctgaccagcg accggctgcc cgcaggccgc tgcatcttct atgggatgat tgcagatggc 900 acgcacacca accccgccgc cctgcggatc gcccaccgtg cccatcccca ggggctggtg 960 ctggtcaccg atgccatccc tgccttgggc ctgggcaacg gccggcacac gctgggacag 1020 caggaagtgg aagtggacgg tctgacggoc tacgtggcag gtgagcgccc tgacccactg 1080 ggtcccaggt cccagcccgc atgccaggtg gcccacgacc cccccagagc ctgccctctc 1140 tgctctcaag gcaccaagac gctgagtggc agcatagccc caatgaacgt ctgtgtccgg 1200 cacttcctgc aggccacagg ctgcagcatg gagtcggccc tggaggctgc atccctgcac 1260 cccgcccagt tgctggggct ggagaagagt aaggggaccc tggactttgg tgctgacgca 1320 gacttcgtgg tgctcgacga ctcccttcac gtccaggcca cctacatctc gggtgagctg 1380
-80gtgtggcagg cggacgcagc taggcagtga caaggacctc ggctgagagg acacctggcc 1440 gcagcgggat gccatcaggg ccgggtggtt ggggagctgg tctccaggga gtgagtcggg 1500 agccctgctg gat 1513 <210>4 <211> 502 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Gly 1 Ala Ala Pro Leu 5 Ser Ala Gly Val Arg 10 His Trp Ala Arg Asp 15 Leu
Ala Ala Ala Gly 20 Leu Arg Ser Arg Ser 25 Leu Pro Thr Arg Leu 30 Thr Met
Arg Gly Asp 35 Arg Ala Gly Gly Gly 40 Pro Val Leu Gin Phe 45 Thr Asn Cys
Arg íle 50 Leu Arg Gly Gly Lys 55 Leu Leu Arg Glu Asp 60 Leu Trp Val Arg
Gly 65 Gly Arg íle Leu Asp 70 Pro Glu Lys Leu Phe 75 Phe Glu Glu Arg Arg 80
Val Ala Asp Glu Arg 85 Arg Asp Cys Gly Gly 90 Arg íle Leu Ala Pro 95 Gly
Phe íle Asp Val 100 Gin íle Asn Arg Gly 105 Phe Gly Val Asp Phe 110 Ser Gin
Ala Thr Glu 115 Asp Val Gly Ser Gly 120 Val Ala Leu Val Ala 125 Arg Arg íle
Leu Ser 130 His Gly Val Thr Ser 135 Phe Cys Pro Thr Leu 140 Val Thr Ser Pro
Pro 145 Glu Ala Tyr His Lys 150 Val Val Pro Gin íle 155 Pro Val Lys Ser Gly 160
Gly Pro His Gly Ala 165 Gly Val Leu Gly Leu 170 His Leu Glu Gly Pro 175 Phe
íle Ser Arg Glu 180 Lys Arg Gly Ala His 185 Pro Glu Ala His Leu 190 Arg Ser
Phe Glu Ala 195 Asp Ala Phe Gin Asp 200 Leu Leu Ala Thr Tyr 205 Gly Pro Leu
Asp Asn 210 Val Arg íle Val Thr 215 Leu Ala Pro Glu Leu 220 Gly Arg Ser His
Glu Val íle Arg Ala Leu Thr Ala Arg Gly Ila Cys Val Ser Leu Gly 225 230 235 240
His Ser Val Ala Asp 245 Leu Arg Ala Ala Glu 250 Asp Ala Val Trp Ser 255 Gly
Ala Thr Phe íle 260 Thr His Leu Phe Asn 265 Ala Met Leu Pro Phe 270 His His
Arg Asp Pro 275 Gly íle Val Gly Leu 280 Leu Thr Ser Asp Arg 285 Leu Pro Ala
Gly Arg 290 Cys íle Phe Tyr Gly 295 Met íle Ala Asp Gly 300 Thr His Thr Asn
Pro 305 Ala Ala Leu Arg íle 310 Ala His Arg Ala His 315 Pro Gin Gly Leu Val 320
Leu Val Thr Asp Ala 325 íle Pro Ala Leu Gly 330 Leu Gly Asn Gly Arg 335 His
Thr Leu Gly Gin 340 Gin Glu Val Glu Val 345 Asp Gly Leu Thr Ala 350 Tyr Val
Ala Gly Glu 355 Arg Pro Asp Pro Leu 360 Gly Pro Arg Ser Gin 365 Pro Ala Cys
Gin Val 370 Ala His Asp Pro Pro 375 Arg Ala Cys Pro Leu 380 Cys Ser Gin Gly
Thr 385 Lys Thr Leu Ser Gly 390 Ser íle Ala Pro Met 395 Asn Val Cys Val Arg 400
His Phe Leu Gin Ala 405 Thr Gly Cys Ser Met 410 Glu Ser Ala Leu Glu 415 Ala
Ala Ser Leu His 420 Pro Ala Gin Leu Leu 425 Gly Leu Glu Lys Ser 430 Lys Gly
Thr Leu Asp 435 Phe Gly Ala Asp Ala 440 Asp Phe Val Val Leu 445 Asp Asp Ser
Leu His 450 Val Gin Ala Thr Tyr 455 íle Ser Gly Glu Leu 460 Val Trp Gin Ala
Asp 465 Ala Ala Arg Gin Gin 470 Gly Pro Arg Leu Arg 475 Gly His Leu Ala Ala 480
Ala Gly Cys His Gin 485 Gly Arg Val Val Gly 490 Glu Leu Val Ser Arg 495 Glu
Val Gly Ser Pro 500 Ala Gly
<210>5
<211> 1725 <212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
-82gagcagctca aaactcacgt ccaggtgatc aagaggtcag ccaagccgag tgagaagccc 60 cggctgcggc agataccctc ggctgaagac ctggagacag atggcggggg accgggccag 120 gtggtggacg atggcctgga gcacagggag ctgggccatg ggcagcctga ggccagaggc 180 cccgctcctc tccagcagca ccctcaggtg ttgctctggg aacagcagcg actggctggg 240 cggctccccc ggggcagcac cggggacact gtgctgcttc ctctggccca gggtgggcac 300 cggcctctgt cccgggctca gtcttcccca gccgcacctg cctcactgtc agccccagag 360 cctgccagcc aggcccgagt cctctccagc tcagagaccc ctgccaggac cctgcccttc 420 accacagggc tgatctatga ctcggtcatg ctgaagcacc agtgctcctg cggtgacaac 480 agcaggcacc cggagcacgc cggccgcatc cagagcatct ggtcccggct gcaggagcgg 540 gggctccgga gccagtgtga gtgtctccga ggccggaagg cctccctgga agagctgcag 600 tcggtccact ctgagcggca cgtgctcctc tacggcacca acccgctcag ccgcctcaaa 660 ctggacaacg ggaagctggc agggctcctg gcacagcgga tgtttgtgat gctgccctgt 720 ggtggggttg gggtggacac tgacaccatc tggaatgagc ttcattcctc caatgcagcc 780 cgctgggccg ctggcagtgt cactgacctc gccttcaaag tggcttctcg tgagctaaag 840 aatggtttcg ctgtggtgcg gcccccagga caccatgcag atcattcaac agccatgggc 900 ttctgettct tcaactcagt ggccatcgcc tgccggcagc tgcaacagca gagcaaggcc 960 agcaagatcc tcattgtaga ctgggacgtg caccatggca acggcaccca gcaaaecttc 1020 taccaagacc ccagtgtgct ctacatctcc ctgcatcgcc atgacgacgg caacttcttc 1080 ccagggagtg gggctgtgga tgaggtaggg gctggcagcg gtgagggctt caatgtcaat 1140 gtggcctggg ctggaggtct ggaccccccc atgggggatc ctgagtacct ggctgctttc 1200 aggatagtcg tgatgcccat cgcccgagag ttctctccag acctagtcct ggtgtctgct 1260 ggatttgatg ctgctgaggg tcacccggcc ccactgggtg gctaccatgt ttctgccaaa 1320 tgttttggat acatgacgca gcaactgatg aacctggcag gaggcgcagt ggtgctggcc 1380 ttggagggtg gccatgacct cacagccatc tgtgacgcct ctgaggcctg tgtggctgct 1440 cttctgggta acagggtgga tcccctttca gaagaaggct ggaaacagaa acccaacctc 1500 aattccatcc gctctctgga ggccgtgatc cgggtgcaca gtaaatactg gggctgcatg 1560 cagcgcctgg cctcctgtcc agactcctgg gtgcctagag tgccaggggc tgacaaagaa 1620 gaagtggagg cagtaaecgc actggcgtcc ctctctgtgg gcatcctggc tgaagatagg 1680 ccctcggagc agctggtgga ggaggaagaa cctatgaatc tctaa 1725 <210>6 <211 >574 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>6
Glu 1 Gin Leu Lys Thr 5 His Val Gin Val íle 10 Lys Arg Ser Ala Lys 15 Pro
Ser Glu Lys Pro 20 Arg Leu Arg Gin íle 25 Pro Ser Ala Glu Asp 30 Leu Glu
Thr Asp Gly 35 Gly Gly Pro Gly Gin Val 40 Val Asp Asp Gly 45 Leu Glu His
Arg Glu 50 Leu Gly His Gly Gin 55 Pro Glu Ala Arg Gly 60 Pro Ala Pro Leu
Gin 65 Gin His Pro Gin Val 70 Leu Leu Trp Glu Gin 75 Gin Arg Leu Ala Gly 80
Arg Leu Pro Arg Gly 85 Ser Thr Gly Asp Thr 90 Val Leu Leu Pro Leu 95 Ala
Gin Gly Gly His 100 Arg Pro Leu Ser Arg 105 Ala Gin Ser Ser Pro 110 Ala Ala
Pro Ala Ser 115 Leu Ser Ala Pro Glu 120 Pro Ala Ser Gin Ala 125 Arg Val Leu
Ser Ser 130 Ser Glu Thr Pro Ala 135 Arg Thr Leu Pro Phe 140 Thr Thr Gly Leu
íle 145 Tyr Asp Ser Val Met 150 Leu Lys His Gin Cys 155 Ser Cys Gly Asp Asn 160
Ser Arg His Pro Glu 165 His Ala Gly Arg íle 170 Gin Ser íle Trp Ser 175 Arg
Leu Gin Glu Arg 180 Gly Leu Arg Ser Gin 185 Cys Glu Cys Leu Arg 190 Gly Arg
Lys Ala Ser 195 Leu Glu Glu Leu Gin 200 Ser Val His Ser Glu 205 Arg His Val
Leu Leu 210 Tyr Gly Thr Asn Pro 215 Leu Ser Arg Leu Lys 220 Leu Asp Asn Gly
Lys 225 Leu Ala Gly Leu Leu 230 Ala Gin Arg Met Phe 235 Val Met Leu Pro Cys 240
Gly Gly Val Gly Val 245 Asp Thr Asp Thr íle 250 Trp Asn Glu Leu His 255 Ser
Ser Asn Ala Ala 260 Arg Trp Ala Ala Gly 265 Ser Val Thr Asp Leu 270 Ala Phe
Lys Val Ala 275 Ser Arg Glu Leu Lys 280 Asn Gly Phe Ala Val 285 Val Arg Pro
Pro Gly 290 His His Ala Asp His 295 Ser Thr Ala Met Gly 300 Phe Cys Phe Phe
Asn 305 Ser Val Ala íle Ala 310 Cys Arg Gin Leu Gin 315 Gin Gin Ser Lys Ala 320
Ser Lys íle Leu íle 325 Val Asp Trp Asp Val 330 His His Gly Asn Gly 335 Thr
Gin Gin Thr Phe 340 Tyr Gin Asp Pro Ser 345 Val Leu Tyr íle Ser 350 Leu His
Arg His Asp 355 Asp Gly Asn Phe Phe 360 Pro Gly Ser Gly Ala 365 Val Asp Glu
Val Gly 370 Ala Gly Ser Gly Glu 375 Gly Phe Asn Val Asn 380 Val Ala Trp Ala
Gly 385 Gly Leu Asp Pro Pro 390 Met Gly Asp Pro Glu 395 Tyr Leu Ala Ala Phe 400
Arg íle Val Val Met 405 Pro íle Ala Arg Glu 410 Phe Ser Pro Asp Leu 415 Val
Leu Val Ser Ala 420 Gly Phe Asp Ala Ala 425 Glu Gly His Pro Ala 430 Pro Leu
Gly Gly Tyr His Val Ser Ala Lys Cys Phe Gly Tyr Met Thr Gin Gin
435 440 445
Leu Met Asn Leu Ala Gly Gly Ala Val Val Leu Ala Leu Glu Gly Gly
450 455 460
His Asp Leu Thr Ala lle Cys Asp Ala Ser Glu Ala Cys Val Ala Ala
465 470 475 480
Leu Leu Gly Asn Arg Val Asp Pro Leu Ser Glu Glu Gly Trp Lys Gin
485 490 495
Lys Pro Asn Leu Asn Ser lle Arg Ser Leu Glu Ala Val lle Arg Val
500 505 510
His Ser Lys Tyr Trp Gly Cys Met Gin Arg Leu Ala Ser Cys Pro Asp
515 520 525
Ser Trp Val Pro Arg Val Pro Gly Ala Asp Lys Glu Glu Val Glu Ala
530 535 540
Val Thr Ala Leu Ala Ser Leu Ser Val Gly lle Leu Ala Glu Asp Arg
545 550 555 560
Pro Ser Glu Gin Leu Val Glu Glu Glu Glu Pro Met Asn Leu
565 570 <210>7 <211> 1428 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7
Met Phe Ala Arg Ser Ala Gly Leu Cys Phe Pro Trp Val Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser His Gly Gly 20 Asp Ala Glu Glu Val 25 Leu Ala Gin His Pro 30 Thr Pro
Thr Gly Arg 35 Gly Ala Glu Arg Arg 40 Pro Arg Pro Pro Asp 45 Ser Ser Ala
Glu Gly 50 Asp Pro Gly Met Leu 55 Lys Pro Cys Gly Cys 60 Val Pro Ser Pro
Gin 65 Lys Val Ala Leu Lys 70 Val Gly Ala Pro Phe 75 Cys Thr Cys Gly Cys 80
Phe Gin Arg Phe His 85 Leu Pro Lys Ala Cys 90 Pro Gly Gin Gin Gly 95 Ser
Pro Glu Ser Ala 100 Arg Pro Arg Asn Arg 105 Gin Pro Tyr Ala Thr 110 Gin Asn
-85Gly Pro Ala 115
Cys His Gly 130
Val Glu Val 145
Leu Arg Gly
Asp Ser Lys
Ser Val Ser 195
Tyr Cys Ser 210
Pro Gly Pro 225
Pro Val Glu
Gin Arg Leu
Ser Val Glu 275
Thr Leu Ser 290
Gin Ser Gin 305
Pro Gin Leu
Gin Glu Gin
Ser Lys Glu 355
Pro Ala Ala 370
Gin Lys Leu 385
Arg Thr Val
Pro Cys Ser
Pro Arg Pro Gin Val 120
Tyr íle Cys Phe Leu 135
Gly Trp Gly Gly Asp 150
Ala Val Tyr Asn Ser 165
Pro Asp íle Leu Arg 180
Leu Ser Thr Asp Gly 200
Pro Thr Gly Ala Gly 215
Gin Pro Gin Pro Mat 230
Pro Pro Pro Glu Pro 245
His His His Leu Phe 260
Pro Met Arg Val Lys 280
Leu Val Pro Ser Leu 295
Ser Ser Thr Pro Cys 310
Ser Met Asp Thr Pro 325
Glu Leu Arg Gin Leu 340
Val Ala Thr Pro Ala 360
Ala Cys Val Ala Cys 375
Ala Glu Val íle Leu 390
His Pro Asn Ser Pro 405
Gly Gin Cys Pro Cys 420
Leu Pro Gly
Phe Asp Ser
Thr Gly Ser 155
Arg Met Trp 170
Leu Gin Asn 185
Thr Gin Val
Cys Pro Arg
Pro Ala Phe
Asp Leu Arg 235
Thr Leu Leu 250
Leu Ala Gly 265
Met Glu Leu
Pro Phe Leu 315
Met Pro Glu 330
Leu His Lys 345
Gin Pro Ser
Ala Val Ala
Lys Lys Gin 395
Gly íle Pro 410
Ser Val Pro 425
Ser Ser Ser Arg Cys 125
Ser Gin Thr Ala Glu 140
Gin Leu Arg Pro Leu 160
Asp Ser Gin Lys Glu 175
Thr Gin Leu Phe His 190
Ser Pro Gly Ala His 205
Pro Cys Ala Asp Thr 220
Val Gly Gin Arg Pro 240
Ala Leu Gin Arg Pro 255
Leu Gin Gin Gin Arg 270
Pro Ala Cys Gly Ala 285
Ser íle Pro Arg His 300
Gly Cys Arg Pro Cys 320
Leu Gin Val Gly Pro 335
Asp Lys Ser Lys Arg 350
Pro Thr Ser Gin Val 365
Ser Ser Val Val Lys 380
Gin Ala Ala Leu Glu 400
Tyr Arg Ser Gin Gly 415
Thr Pro Leu Lys Gin 430
Pro Trp His 435 Ser Phe Cys Arg Thr 440 Leu Glu Pro Leu Glu 445 Thr Glu Gly
Ala Thr 450 Arg Ser Met Leu Ser 455 Ser Phe Leu Pro Pro 460 Val Pro Ser Leu
Pro 465 Ser Asp Pro Pro Glu 470 His Phe Pro Leu Arg 475 Lys Thr Val Ser Glu 480
Pro Asn Leu Lys Leu 485 Arg Tyr Lys Pro Lys 490 Lys Ser Leu Glu Arg Arg 495
Lys Asn Pro Leu 500 Leu Arg Lys Glu Ser 505 Ala Pro Pro Ser Leu 510 Arg Arg
Arg Pro Ala 515 Glu Thr Leu Gly Asp 520 Ser Ser Pro Ser Ser 525 Ser Ser Thr
Pro Ala 530 Ser Gly Cys Ser Ser 535 Pro Asn Asp Ser Glu 540 His Gly Pro Asn
Pro 545 íle Leu Gly Ser Glu 550 Ala Leu Leu Gly Gin 555 Arg Leu Arg Leu Gin 560
Glu Thr Ser Val Ala 565 Pro Phe Ala Leu Pro 570 Thr Val Ser Leu Leu 575 Pro
Ala íle Thr Leu 580 Gly Leu Pro Ala Pro 585 Ala Arg Ala Asp Ser 590 Asp Arg
Arg Thr His 595 Pro Thr Leu Gly Pro 600 Arg Gly Pro íle Leu 605 Gly Ser Pro
His Thr 610 Pro Leu Phe Leu Pro 615 His Gly Leu Glu Pro 620 Glu Ala Gly Gly
Thr 625 Leu Pro Ser Arg Leu 630 Gin Pro íle Leu Leu 635 Leu Asp Pro Ser Gly 640
Ser His Ala Pro Leu 645 Leu Thr Val Pro Gly 650 Leu Gly Pro Leu Pro 655 Phe
His Phe Ala Gin 660 Ser Leu Met Thr Thr 665 Glu Arg Leu Ser Gly 670 Ser Gly
Leu His Trp 675 Pro Leu Ser Arg Thr 680 Arg Ser Glu Pro Leu 685 Pro Pro Ser
Ala Thr 690 Ala Pro Pro Pro Pro 695 Gly Pro Met Gin Pro 700 Arg Leu Glu Gin
Leu 705 Lys Thr His Val Gin 710 Val íle Lys Arg Ser 715 Ala Lys Pro Ser Glu 720
Lys Pro Arg Leu Arg 725 Gin íle Pro Ser Ala 730 Glu Asp Leu Glu Thr 735 Asp
Gly Gly Gly Pro 740 Gly Gin Val Val Asp 745 Asp Gly Leu Glu His 750 Arg Glu
Leu Gly His Gly Gin Pro Glu Ala Arg Gly Pro Ala Pro Leu Gin Gin
755 760 765
His Pro Gin 770 Val Leu Leu Trp Glu 775 Gin Gin Arg Leu Ala 780 Gly Arg Leu
Pro 785 Arg Gly Ser Thr Gly 790 Asp Thr Val Leu Leu Pro Leu 795 Ala Gin Gly 800
Gly His Arg Pro Leu 805 Ser Arg Ala Gin Ser Ser Pro Ala 810 Ala Pro Ala 815
Ser Leu Ser Ala Pro 820 Glu Pro Ala Ser Gin Ala Arg Val 825 Leu 830 Ser Ser
Ser Glu Thr 835 Pro Ala Arg Thr Leu 840 Pro Phe Thr Thr Gly 845 Leu íle Tyr
Asp Ser Val 850 Met Leu Lys His Gin 855 Cys Ser Cys Gly Asp 860 Asn Ser Arg
His 865 Pro Glu His Ala Gly 870 Arg íle Gin Ser íle Trp Ser 875 Arg Leu Gin 880
Glu Arg Gly Leu Arg 885 Ser Gin Cys Glu Cys Leu Arg Gly 890 Arg Lys Ala 895
Ser Leu Glu Glu Leu 900 Gin Ser Val His Ser Glu Arg His 905 Val 910 Leu Leu
Tyr Gly Thr 915 Asn Pro Leu Ser Arg 920 Leu Lys Leu Asp Asn 925 Gly Lys Leu
Ala Gly Leu 930 Leu Ala Gin Arg Met 935 Phe Val Met Leu Pro 940 Cys Gly Gly
Val 945 Gly Pro Leu Ala Thr 950 Leu Ser Ala Phe Leu Ala Ser 955 Leu Ala Pro 960
Thr Val Pro Gin Gly 965 Leu Ser Arg Val Ser Trp Gly Leu 970 Lys Pro Pro 975
Pro Gly Pro Asn Pro 980 Lys Ser Arg Pro Ala Pro Cys Pro 985 Trp 990 Gly Pro
Gly Arg Gly 995 Val Gly Thr Thr Pro 1000 Leu Gly Pro Gly Ser 1005 Cys Val Lys
Pro Trp Met 1010 Met Arg Ala Leu Thr 1015 Leu Ala Pro Gin Val 1020 Asp Thr Asp
Thr íle Trp 1025 Asn Glu Leu 1030 His Ser Ser Asn Ala Ala Arg 1035 Trp Ala Ala 1040
Gly Ser Val Thr Asp Leu Ala Phe Lys Val Ala Ser Arg Glu Leu Lys
1045 1050 1055
Asn Gly Phe Ala Val Val Arg Pro Pro Gly His His Ala Asp His Ser 1060 1065 1070
Thr Ala Met 1075 Gly Phe Cys Phe Phe 1080 Asn Ser Val Ala íle Ala 1085 Cys Arg
Gin Leu Gin 1090 Gin Gin Ser Lys Ala 1095 Ser Lys íle Leu íle Val 1100 Asp Trp
Asp Val His 1105 His Gly Asn Gly Thr 1110 Gin Gin Thr Phe Tyr Gin 1115 Asp Pro 1120
Ser Val Leu Tyr íle Ser Leu His Arg His Asp Asp Gly Asn Phe Phe
1125 1130 1135
Pro Gly Ser Gly Ala Val Asp Glu Val Gly Ala Gly Ser Gly Glu Gly
1140 1145 1150
Phe Asn Val 1155 Asn Val Ala Trp Ala 1160 Gly Gly Leu Asp Pro Pro 1165 Met Gly
Asp Pro Glu 1170 Tyr Leu Ala Ala Phe 1175 Arg íle Val Val Met Pro 1180 íle Ala
Arg Glu Phe 1185 Ser Pro Asp Leu Val 1190 Leu Val Ser Ala Gly Phe 1195 Asp Ala 1200
Ala Glu Gly His Pro Ala Pro Leu Gly Gly Tyr His Val Ser Ala Lys
1205 1210 L215
Cys Phe Gly Tyr Met Thr Gin Gin Leu Met Asn Leu Ala Gly Gly Ala
1220 1225 1230
Val Val Leu 1235 Ala Leu Glu Gly Gly 1240 His Asp Leu Thr Ala íle 1245 Cys Asp
Ala Ser Glu 1250 Ala Cys Val Ala Ala 1255 Leu Leu Gly Asn Arg Val 1260 Asp Pro
Leu Ser Glu 1265 Glu Gly Trp Lys Gin 1270 Lys Pro Asn Leu Asn Ala 1275 íle Arg 1280
Ser Leu Glu Ala Val íle Arg Val His Ser Lys Cys Gly Asp Gly Thr
1285 1290 1295
Leu Ala Glu Leu Arg Leu Lys Asp Leu Gly Gly Thr Leu Pro His Arg
1300 1305 1310
Gly Gin íle 1315 Leu Gly Phe Arg Cys 1320 Gin Pro Gly Asp Leu Leu 1325 Leu Val
Trp Ser Lys 1330 íle Pro Val Ser Asp 1335 Pro Gly Ser Asn Gly Glu 1340 His Pro
Pro Val Arg 1345 Gly Tyr Pro Leu Ser 1350 Pro Pro Asp Gly Ala Ser 1355 Arg Ala 1360
Tyr Gin Thr Val Ala Pro Gin Gly Lys Tyr Trp Gly Cys Met Gin Arg
1365 1370 1375
Leu Ala Ser Cys Pro Asp Ser Trp Val Pro Arg Val Pro Gly Ala Asp 1380 1385 1390
-89Lys Glu Glu Val Glu Ala Val Thr Ala Leu Ala Ser Leu Ser Val Gly 1395 1400 1405 íle Leu Ala Glu Asp Arg Pro Ser Glu Gin Leu Val Glu Glu Glu Glu 1410 1415 1420
Pro Met Asn Leu
1425 <210>8 <211> 1200 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 8
Pro 1 Gin Pro Gin Pro 5 Met Asp Leu Arg Val 10 Gly Gin Arg Pro Pro 15 Val
Glu Pro Pro Pro 20 Glu Pro Thr Leu Leu 25 Ala Leu Gin Arg Pro 30 Gin Arg
Leu His His 35 His Leu Phe Leu Ala 40 Gly Leu Gin Gin Gin 45 Arg Ser Val
Glu Pro 50 Met Arg Val Lys Met 55 Glu Leu Pro Ala Cys 60 Gly Ala Thr Leu
Ser 65 Leu Val Pro Ser Leu 70 Pro Ala Phe Ser íle 75 Pro Arg His Gin Ser 80
Gin Ser Ser Thr Pro 85 Cys Pro Phe Leu Gly 90 Cys Arg Pro Cys Pro 95 Gin
Leu Ser Met Asp 100 Thr Pro Met Pro Glu 105 Leu Gin Val Gly Pro 110 Gin Glu
Gin Glu Leu 115 Arg Gin Leu Leu His 120 Lys Asp Lys Ser Lys 125 Arg Ser Lys
Glu Val 130 Ala Thr Pro Ala Gin 135 Pro Ser Pro Thr Ser 140 Gin Val Pro Ala
Ala 145 Ala Cys Val Ala Cys 150 Ala Val Ala Ser Ser 155 Val Val Lys Gin Lys 160
Leu Ala Glu Val íle 165 Leu Lys Lys Gin Gin 170 Ala Ala Leu Glu Arg 175 Thr
Val His Pro Asn 180 Ser Pro Gly íle Pro 185 Tyr Arg Ser Gin Gly 190 Pro Cys
Ser Gly Gin 195 Cys Pro Cys Ser Val 200 Pro Thr Pro Leu Lys 205 Gin Pro Trp
His Ser 210 Phe Cys Arg Thr Leu 215 Glu Pro Leu Glu Thr 220 Glu Gly Ala Thr
-90Arg Ser Met Leu Ser Ser Phe Leu Pro Pro Val 225 230 235
Asp Pro Pro Glu His Phe Pro Leu Arg Lys Thr 245 250
Leu Lys Leu Arg Tyr Lys Pro Lys Lys Ser Leu 260 265
Pro Leu Leu Arg Lys Glu Ser Ala Pro Pro Ser 275 280
Ala Glu Thr Leu Gly Asp Ser Ser Pro Ser Ser 290 295
Ser Gly Cys Ser Ser Pro Asn Asp Ser Glu His 305 310 315
Leu Gly Ser Glu Ala Leu Leu Gly Gin Arg Leu 325 330
Ser Val Ala Pro Phe Ala Leu Pro Thr Val Ser 340 345
Thr Leu Gly Leu Pro Ala Pro Ala Arg Ala Asp 355 360
His Pro Thr Leu Gly Pro Arg Gly Pro íle Leu 370 375
Pro Leu Phe Leu Pro His Gly Leu Glu Pro Glu 385 390 395
Pro Ser Arg Leu Gin Pro íle Leu Leu Leu Asp 405 410
Ala Pro Leu Leu Thr Val Pro Gly Leu Gly Pro 420 425
Ala Gin Ser Leu Met Thr Thr Glu Arg Leu Ser 435 440
Trp Pro Leu Ser Arg Thr Arg Ser Glu Pro Leu 450 455
Ala Pro Pro Pro Pro Gly Pro Met Gin Pro Arg 465 470 475
Thr His Val Gin Val íle Lys Arg Ser Ala Lys 485 490
Arg Leu Arg Gin íle Pro Ser Ala Glu Asp Leu 500 505
Gly Pro Gly Gin Val Val Asp Asp Gly Leu Glu 515 520
His Gly Gin Pro Glu Ala Arg Gly Pro Ala Pro 530 535
Pro Ser Leu Pro Ser 240
Val Ser Glu Pro Asn 255
Glu Arg Arg Lys Asn 270
Leu Arg Arg Arg Pro 285
Ser Ser Thr Pro Ala 300
Gly Pro Asn Pro íle 320
Arg Leu Gin Glu Thr 335
Leu Leu Pro Ala íle 350
Ser Asp Arg Arg Thr 365
Gly Ser Pro His Thr 380
Ala Gly Gly Thr Leu 400
Pro Ser Gly Ser His 415
Leu Pro Phe His Phe 430
Gly Ser Gly Leu His 445
Pro Pro Ser Ala Thr 460
Leu Glu Gin Leu Lys 480
Pro Ser Glu Lys Pro 495
Glu Thr Asp Gly Gly 510
His Arg Glu Leu Gly 525
Leu Gin Gin His Pro 540
-91 Gin Val Leu Leu Trp Glu Gin 545 550
Gly Ser Thr Gly Asp Thr Val 565
Arg Pro Leu Ser Arg Ala Gin 580
Ser Ala Pro Glu Pro Ala Ser 595
Thr Pro Ala Arg Thr Leu Pro 610 615
Val Met Leu Lys His Gin Cys 625 630
Glu His Ala Gly Arg íle Gin 645
Gly Leu Arg Ser Gin Cys Glu 660
Glu Glu Leu Gin Ser Val His 675
Thr Asn Pro Leu Ser Arg Leu 690 695
Leu Leu Ala Gin Arg Met Phe 705 710
Pro Leu Ala Thr Leu Ser Ala 725
Pro Gin Gly Leu Ser Arg Val 740
Pro Asn Pro Lys Ser Arg Pro 755
Gly Val Gly Thr Thr Pro Leu 770 775
Met Met Arg Ala Leu Thr Leu 785 790
Trp Asn Glu Leu His Ser Ser 805
Val Thr Asp Leu Ala Phe Lys 820
Phe Ala Val Val Arg Pro Pro 835
Met Gly Phe Cys Phe Phe Asn 850 855
Gin Arg Leu Ala 555 Gly Arg Leu Pro Arg 560
Leu Leu Pro 570 Leu Ala Gin Gly Gly 575 His
Ser Ser 585 Pro Ala Ala Pro Ala 590 Ser Leu
Gin 600 Ala Arg Val Leu Ser 605 Ser Ser Glu
Phe Thr Thr Gly Leu 620 íle Tyr Asp Ser
Ser Cys Gly Asp 635 Asn Ser Arg His Pro 640
Ser íle Trp 650 Ser Arg Leu Gin Glu 655 Arg
Cys Leu 665 Arg Gly Arg Lys Ala 670 Ser Leu
Ser 680 Glu Arg His Val Leu 685 Leu Tyr Gly
Lys Leu Asp Asn Gly 700 Lys Leu Ala Gly
Val Met Leu Pro 715 Cys Gly Gly Val Gly 720
Phe Leu Ala 730 Ser Leu Ala Pro Thr 735 Val
Ser Trp 745 Gly Leu Lys Pro Pro 750 Pro Gly
Ala 760 Pro Cys Pro Trp Gly 765 Pro Gly Arg
Gly Pro Gly Ser Cys 780 Val Lys Pro Trp
Ala Pro Gin Val 795 Asp Thr Asp Thr íle 800
Asn Ala Ala 810 Arg Trp Ala Ala Gly 815 Ser
Val Ala 825 Ser Arg Glu Leu Lys 830 Asn Gly
Gly 840 His His Ala Asp His 845 Ser Thr Ala
Ser Val Ala íle Ala Cys Arg Gin Leu
860
Gin Gin Gin Ser Lys Ala 870 Ser Lys Zle Leu íle Val Asp Trp Asp Val
865 875 880
His His Gly Asn Gly Thr 885 Gin Gin Thr Phe Tyr 890 Gin Asp Pro Ser Val 895
Leu Tyr íle Ser Leu His 900 Arg His Asp 905 Asp Gly Asn Phe Phe Pro Gly 910
Ser Gly Ala Val Asp Glu 915 Val Gly 920 Ala Gly Ser Gly Glu Gly Phe Asn 925
Val Asn 930 Val Ala Trp Ala Gly Gly 935 Leu Asp Pro Pro Met Gly Asp Pro 940
Glu Tyr 945 Leu Ala Ala Phe 950 Arg íle Val Val Met 955 Pro íle Ala Arg Glu 960
Phe Ser Pro Asp Leu Val 965 Leu Val Ser Ala Gly 970 Phe Asp Ala Ala Glu 975
Gly Hxs Pro Ala Pro Leu 980 Gly Gly Tyr 985 His Val Ser Ala Lys Cys Phe 990
Gly Tyr Met Thr Gin Gin 995 Leu Met 1000 Asn Leu Ala Gly Gly Ala Val Val 1005
Leu Ala 1010 Leu Glu Gly Gly His Asp 1015 Leu Thr Ala íle Cys Asp Ala Ser 1020
Glu Ala 1025 Cys Val Ala Ala 1030 Leu Leu Gly Asn Arg 1035 Val Asp Pro Leu Ser 1040
Glu Glu Gly Trp Lys Gin 1045 Lys Pro Asn Leu Asn 1050 Ala íle Arg Ser Leu 1055
Glu Ala Val íle Arg Val 1060 His Ser Lys 1065 Cys Gly Asp Gly Thr Leu Ala 1070
Glu Leu Arg Leu Lys Asp 1075 Leu Gly 1080 Gly Thr Leu Pro His Arg Gly Gin 1085
íle Leu 1090 Gly Phe Arg Cys Gin Pro 1095 Gly Asp Leu Leu Leu Val Trp Ser 1100
Lys íle 1105 Pro Val Ser Asp 1110 Pro Gly Ser Asn Gly 1115 Glu His Pro Pro Val 1120
Arg Gly Tyr Pro Leu Ser 1125 Pro Pro Asp Gly Ala 1130 Ser Arg Ala Tyr Gin 1135
Thr Val Ala Pro Gin Gly 1140 Lys Tyr Trp 1145 Gly Cys Met Gin Arg Leu Ala 1150
Ser Cys Pro Asp Ser Trp Val Pro Arg Val Pro Gly Ala Asp Lys Glu
1155 1160 1165
Glu Val Glu Ala Val Thr Ala Leu Ala Ser Leu Ser Val Gly íle Leu 1170 1175 1180
-93Ala Glu Asp Arg Pro Ser Glu Gin Leu Val Glu Glu Glu Glu Pro Met 1185 1190 1195 1200 <210> 9 <211> 1041 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 9
Pro 1 Ser Ala Val Pro 5 Met Asp Leu Arg Leu 10 Asp His Gin Phe Ser 15 Leu
Pro Val Ala Glu 20 Pro Ala Leu Arg Glu 25 Gin Gin Leu Gin Gin 30 Glu Leu
Leu Ala Leu 35 Lys Gin Lys Gin Gin 40 íle Gin Arg Gin íle 45 Leu íle Ala
Glu Phe 50 Gin Arg Gin His Glu 55 Gin Leu Ser Arg Gin 60 His Glu Ala Gin
Leu 65 His Glu His íle Lys 70 Gin Gin Gin Glu Met 75 Leu Ala Met Lys His 80
Gin Gin Glu Leu Leu 85 Glu His Gin Arg Lys 90 Leu Glu Arg His Arg 95 Gin
Glu Gin Glu Leu 100 Glu Lys Gin His Arg 105 Glu Gin Lys Leu Gin 110 Gin Leu
Lys Asn Lys 115 Glu Lys Gly Lys Glu 120 Ser Ala Val Ala Ser 125 Thr Glu Val
Lys Met 130 Lys Leu Gin Glu Phe 135 Val Leu Asn Lys Lys 140 Lys Ala Leu Ala
His 145 Arg Asn Leu Asn His 150 Cys íle Ser Ser Asp 155 Pro Arg Tyr Trp Tyr 160
Gly Lys Thr Gin His 165 Ser Ser Leu Asp Gin 170 Ser Ser Pro Pro Gin 175 Ser
Gly Val Ser Thr 180 Ser Tyr Asn His Pro 185 Val Leu Gly Met Tyr 190 Asp Ala
Lys Asp Asp 195 Phe Pro Leu Arg Lys 200 Thr Ala Ser Glu Pro 205 Asn Leu Lys
Leu Arg 210 Ser Arg Leu Lys Gin 215 Lys Val Ala Glu Arg Arg 220 Ser Ser Pro
Leu 225 Leu Arg Arg Lys Asp 230 Gly Pro Val Val Thr 235 Ala Leu Lys Lys Arg 240
-94Pro Leu Asp Val Thr Asp 245
Pro Ser Ser Pro Asn Asn 260 íle Ala Pro Ala Val Pro 275
Arg Leu Val Ala Arg Glu 290
Ser Pro Ser Leu Pro Asn 305 310
Ser Ala Gly Thr Ala Gly 325
Ala Leu Gin Gin Arg Leu 340
Tyr Leu Ser Thr Ser Pro 355
Pro Leu Leu Gin His Met 370
Pro Leu Val Thr Gly Leu 385 390
Val Gly Ala Asp Arg Val 405
Arg Pro Leu Gly Arg Thr 420
Ala Leu Gin His Leu Val 435
Lys His Lys Gin Gin Phe 450 íle Pro Lys Pro Ser Glu 465 470
Glu Thr Glu Glu Glu Leu 485
Tyr Leu Asp Arg Leu Pro 500
Val Gin Val Lys Gin Glu 515
Pro Pro Arg Glu Val Glu 530
Leu Leu Phe Arg Gin Gin 545 550
Ser Ala Cys Ser Ser 250
Ser Ser Gly Ser Val 265
Ser íle Pro Ala Glu 280
Gly Ser Ala Ala Pro 295 íle Thr Leu Gly Leu 315
Gin Gin Asp Thr Glu 330
Ser Leu Phe Pro Gly 345
Leu Glu Arg Asp Gly 360
Val Leu Leu Glu Gin 375
Gly Ala Leu Pro Leu 395
Ser Pro Ser íle His 410
Gin Ser Ala Pro Leu 425 íle Gin Gin Gin His 440
Gin Gin Gin Gin Leu 455
Pro Ala Arg Gin Pro 475
Arg Glu His Gin Ala 490
Gly Gin Lys Glu Ala 505
Pro íle Glu Ser Asp 520
Pro Gly Gin Arg Gin 535
Ala Leu Leu Leu Glu 555
Ala Pro Gly Ser Gly 255
Ser Ala Glu Asn Gly 270
Thr Ser Leu Ala His 285
Leu Pro Leu Tyr Thr 300
Pro Ala Thr Gly Pro 320
Arg Leu Thr Leu Pro 335
Thr His Leu Thr Pro 350
Gly Ala Ala His Ser 365
Pro Pro Ala Gin Ala 380
His Ala Gin Ser Leu 400
Lys Leu Arg Gin His 415
Pro Gin Asn Ala Gin 430
Gin Gin Phe Leu Glu 445
Gin Met Asn Lys íle 460
Glu Ser His Pro Glu 480
Leu Leu Asp Glu Pro 495
His Ala Gin Ala Gly 510
Glu Glu Glu Ala Glu 525
Pro Ser Glu Gin Glu 540
Gin Gin Arg íle His 560
-95Gln Leu Arg Asn Tyr 565
Ser Phe Gly Gly His 580
Ser Ala Thr Phe Pro 595
Phe Thr Thr Gly Leu 610
Thr Cys Gly Ser Ser 625
Ser íle Trp Ser Arg 645
Cys íle Arg Gly Arg 660
Ser Glu Ala His Thr 675
Lys Leu Asp Ser Lys 690
Arg Leu Pro Cys Gly 705
Glu Val His Ser Ala 725
Glu Leu Val Phe Lys 740
Val Val Arg Pro Pro 755
Phe Cys Tyr Phe Asn 770
Arg Leu Ser Val Ser 785
Gly Asn Gly Thr Gin 805
Met Ser Leu His Arg 820
Ala Pro Asp Glu Val 835
Met Ala Phe Thr Gly 850
Gin Ala Ser Met Glu 570 Ala Ala Gly íle Pro 575 Val
Arg Pro Leu Ser 585 Arg Ala Gin Ser Ser 590 Pro Ala
Val Ser Val 600 Gin Glu Pro Pro Thr 605 Lys Pro Arg
Val Tyr 615 Asp Thr Leu Met Leu 620 Lys His Gin Cys
Ser 630 Ser His Pro Glu His 635 Ala Gly Arg íle Gin 640
Leu Gin Glu Thr Gly 650 Leu Arg Gly Lys Cys 655 Glu
Lys Ala Thr Leu 665 Glu Glu Leu Gin Thr 670 Val His
Leu Leu Tyr 680 Gly Thr Asn Pro Leu 685 Asn Arg Gin
Lys Leu 695 Leu Gly Ser Leu Ala 700 Ser Val Phe Val
Gly 710 Val Gly Val Asp Ser 715 Asp Thr íle Trp Asn 720
Gly Ala Ala Arg Leu 730 Ala Val Gly Cys Val 735 Val
Val Ala Thr Gly 745 Glu Leu Lys Asn Gly 750 Phe Ala
Gly His His 760 Ala Glu Glu Ser Thr 765 Pro Met Gly
Ser Val 775 Ala Val Ala Ala Lys 780 Leu Leu Gin Gin
Lys 790 íle Leu íle Val Asp 795 Trp Asp Val His His 800
Gin Ala Phe Tyr Ser 810 Asp Pro Ser Val Leu 815 Tyr
Tyr Asp Asp Gly 825 Asn Phe Phe Pro Gly 830 Ser Gly
Gly Thr Gly 840 Pro Gly Val Gly Phe 845 Asn Val Asn
Gly Leu 855 Asp Pro Pro Met Gly 860 Asp Ala Glu Tyr
Leu Ala Ala Phe Arg Thr Val Val Met Pro íle Ala Ser Glu Phe Ala 865 870 875 880
Pro Asp Val Val Leu Val 885 Ser Ser Gly Phe Asp Ala Val Glu Gly His
890 895
Pro Thr Pro Leu Gly Gly Tyr Asn Leu Ser Ala Arg Cys Phe Gly Tyr
900 905 910
Leu Thr Lys Gin Leu Met Gly Leu Ala Gly Gly Arg íle Val Leu Ala
915 920 925
Leu Glu Gly Gly His Asp Leu Thr Ala íle Cys Asp Ala Ser Glu Ala
930 935 940
Cys Val Ser Ala Leu Leu Gly Asn Glu Leu Asp Pro Leu Pro Glu Lys
945 950 955 960
Val Leu Gin Gin Arg Pro Asn Ala Asn Ala Val Arg Ser Met Glu Lys
965 970 975
Val Met Glu íle His Ser Lys Tyr Trp Arg Cys Leu Gin Arg Thr Thr
980 985 990
Ser Thr Ala Gly Arg Ser Leu íle Glu Ala Gin Thr Cys Glu Asn Glu
995 1000 1005
Glu Ala Glu Thr Val Thr Ala Met Ala Ser Leu Ser Val Gly Val Lys
1010 1015 1020
Pro Ala Glu Lys Arg Pro Asp Glu Glu Pro Met Glu Glu Glu Pro Pro
1025 1030 1035 1040
Leu
Tl/ 42.6£-ζοοο

Claims (1)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Proteín interagujúci s kaspázou-8 alebo jeho izoforma, alelický variant, fragment, funkčný analóg, mutant alebo derivát, ktoré sú schopné interagovať s podjednotkou 1 a/alebo podjednotkou 2 kaspázy-8.
    2. Proteín podľa nároku 1, ktorým je ľudská /\/-acetylglukózamín-6-fosfát deacetyláza, jej izoforma, alelický variant, fragment, funkčný analóg, mutant alebo derivát.
    3. Proteín podľa nároku 1, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázku 2, obrázku 3, obrázku 5B alebo obrázku 6.
    4. Proteín podľa nároku 1, ktorý je kódovaný klonom p74 alebo jeho zostrihový variant.
    5. Proteín podľa nároku 4, ktorým je zostrihový variant vybraný z klonov p16 a p43.
    6. Proteín podľa nároku 1, ktorý je kódovaný klonom p27, p70 alebo p79.
    7. Proteín podľa nároku 1, ktorý zahŕňa aminokyselinovú sekvenciu Tip-60 proteinu okrem aminokyselín 94 až 145.
    8. Proteín podľa nároku 1, ktorý je kódovaný klonom L7, L12, M26, B4, B17, J40, B13, B37 alebo B33.
    9. Proteín podľa nároku 1, ktorý je in vitro štiepený kaspázou-8.
    10. Proteín podľa nároku 1, ktorý je in vivo štiepený kaspázou-8.
    -9811. Izolovaná DNA sekvencia kódovaná proteínom podľa nároku 1.
    12. Izolovaná DNA sekvencia kódovaná proteínom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 10.
    13. Izolovaná DNA sekvencia, ktorá zahŕňa DNA sekvenciu znázornenú na obrázku 2.
    14. Izolovaná DNA sekvencia, ktorá zahŕňa DNA sekvenciu znázornenú na obrázku 3.
    15. Izolovaná DNA sekvencia, ktorá zahŕňa DNA sekvenciu znázornenú na obrázku 5A.
    16. Izolovaná DNA sekvencia, ktorá je schopná hybridizovať s DNA sekvenciou podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 14 za stredne prísnych podmienok.
    17. Vektor, ktorý obsahuje DNA sekvenciu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 16.
    18. Eukaryotická alebo prokaryotická hostiteľská bunka, ktorá obsahuje vektor podľa nároku 17.
    19. Spôsob výroby proteínu, izoformy, alelického variantu, fragmentu, funkčného analógu, mutantu alebo derivátu proteínu interagujúceho s kaspázou-8 podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa pestovanie hostiteľskej bunky podľa nároku 18 v podmienkach, ktoré umožňujú produkciu proteínu, uskutočňovanie post-translačných modifikácií, ktoré sú nevyhnutné na získanie proteínu, izoformy, alelického variantu, fragmentu, funkčného analógu, mutantu
    -99alebo derivátu, a izoláciu proteínu, izoformy, alelického variantu, fragmentu, funkčného analógu, mutantu alebo derivátu.
    20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa t ý m , že bunkou je prokaryotická bunka.
    21. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že bunkou je eukaryotická bunka.
    22. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že bunkou je cicavčia, hmyzia alebo kvasinková bunka.
    23. Spôsob podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že bunkou je HeLa alebo 293 T HEK bunka.
    24. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že ako promótor je použitý ľudský CMV promótor.
    25. Peptid interagujúci s kaspázou-8, ktorý obsahuje najmenej 4 po sebe idúce aminokyseliny proteínu podľa nároku 1.
    26. Derivát peptidu podľa nároku 23.
    27. Peptidový derivát podľa nároku 26, ktorý je schopný vytvoriť kovalentnú väzbu s kaspázou-8 pri kontakte s kaspázou-8.
    28. Ribozým špecifický pre nukleotidovú sekvenciu, ktorá zodpovedá DNA sekvencií podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 16.
    29. Antisense oligonukleotid, ktorý obsahuje najmenej 9 nukleotidov sekvencie zodpovedajúcej DNA sekvencií podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 16.
    -100 30. Protilátka nasmerovaná proti epitopu proteínu podľa nároku 1.
    31. Imunologický test na detekciu proteínu interagujúceho s kaspázou-8, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa protilátku podľa nároku 30 ako reakčné činidlo.
    32. Imunologický test na detekciu kaspázy-8, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa peptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 25 až 27.
    33. Imunologický test na detekciu kaspázy-8, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10.
    34. Spôsob identifikácie proteínov interagujúcich s kaspázou-8, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky:
    a) poskytnutie kvasinkovej bunky, ktorá má reporterový gén napojený na promótor zahŕňajúci DNA sekvenčný motív;
    b) exprimovanie p20 podjednotky kaspázy-8 v kvasinkovej bunke;
    c) exprimovanie fúzovaného proteínu obsahujúceho DNA viažucu doménu a p10 a/alebo p20 podjednotku kaspázy-8, pričom DNA viažuca doména je schopná viazať sa na uvedený DNA sekvenčný motív, v kvasinkovej bunke;
    d) voliteľne, exprimovanie nefúzovanej podjednotky p10 alebo p20 kaspázy-8 v kvasinkovej bunke;
    e) transformovanie kultúry kvasinkovej bunky knižnicou pozostávajúcou z expresného vektora riadiaceho expresiu fúzovaného proteínu, ktorý obsahuje cDNA knižnicu a transkripčný aktivátor;
    f) skríning kultúry transformovaných kvasinkových buniek z hľadiska kvasinkových buniek, v ktorých je aktivovaný reporterový gén, a
    g) izoláciu kvasinkovej bunky z kroku f) a ďalej izoláciu proteínu interagujúceho s kaspázou-8, ktorý sa exprimuje v jeho zachytávačom vektore.
    - 101 35. Proteín interagujúci s kaspázou-8, izoforma, alelický variant, fragment, funkčný analóg, mutant alebo derivát podľa nároku 1 alebo ribozým podľa nároku 28 alebo antisense oligonukleotid podľa nároku 29 alebo protilátka podľa nároku 30 na použitie na moduláciu účinku kaspázy-8.
    36. Proteín interagujúci s kaspázou-8, izoforma, alelický variant, fragment, funkčný analóg, mutant alebo derivát podľa nároku 1 alebo ribozým podľa nároku 28 alebo antisense oligonukleotid podľa nároku 29 alebo protilátka podľa nároku 30 na použitie na moduláciu účinkov sprostredkovaných TNF-receptorom alebo Fas.
    37. Proteín interagujúci s kaspázou-8, izoforma, alelický variant, fragment, funkčný analóg, mutant alebo derivát podľa nároku 1 alebo ribozým podľa nároku 28 alebo antisense oligonukleotid podľa nároku 29 alebo protilátka podľa nároku 30 na použitie na moduláciu apoptózy.
    38. Proteín interagujúci s kaspázou-8, izoforma, alelický variant, fragment, funkčný analóg, mutant alebo derivát podľa nároku 1 alebo ribozým podľa nároku 28 alebo antisense oligonukleotid podľa nároku 29 alebo protilátka podľa nároku 30 na použitie ako liečivo.
    39. Proteín interagujúci s kaspázou-8, izoforma, alelický variant, fragment, funkčný analóg, mutant alebo derivát podľa nároku 1 alebo ribozým podľa nároku 28 alebo antisense oligonukleotid podľa nároku 29 alebo protilátka podľa nároku 30 na použitie ako liečivo na liečbu sklerózy multiplex s primárnou oligodendrogliopatiou, autoimunitnej uveoretinitídy, cukrovky, lupusu, autoimunitnej myokarditídy I, chronickej hepatitídy sprostredkovanej HCV, chronickej gastritídy napr. gastritídy typu A, zmiešanej konektívnej tkanivovej choroby (MCTD), Crohnovej choroby alebo vredovej kolitídy.
    -102 40. Použitie proteínu interagujúceho s kaspázou-8, izoformy, aleiického variantu, fragmentu, funkčného analógu, mutantu alebo derivátu podľa nároku 1 na izoláciu, identifikáciu a klonovanie iného proteínu rovnakej triedy.
    120/-20 Od
    1/19
    Gal4DNA3D sub-2 spojovník sub-1(C360S)
    S375 D479 S217 0374
    •fcrS,' Α;» -X .C-, vfSrŕ-ir -•L , *\z\> :\/\z <s /s z
SK1268-2000A 1998-12-24 1999-12-23 Proteíny interagujúce s kaspázou-8, izolovaná dna, vektor obsahujúci dna sekvenciu, eukaryotická a prokaryotická bunka, spôsob ich výroby a ich použitie SK12682000A3 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL12772198A IL127721A0 (en) 1998-12-24 1998-12-24 Caspase-8 interacting proteins
IL13210599A IL132105A0 (en) 1998-12-24 1999-09-28 Caspase-8 interacting proteins
PCT/IL1999/000698 WO2000039160A2 (en) 1998-12-24 1999-12-23 Caspase-8 interacting proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK12682000A3 true SK12682000A3 (sk) 2001-03-12

Family

ID=26323761

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1268-2000A SK12682000A3 (sk) 1998-12-24 1999-12-23 Proteíny interagujúce s kaspázou-8, izolovaná dna, vektor obsahujúci dna sekvenciu, eukaryotická a prokaryotická bunka, spôsob ich výroby a ich použitie

Country Status (19)

Country Link
US (3) US6762283B1 (sk)
EP (1) EP1058691A1 (sk)
JP (1) JP2002536965A (sk)
KR (2) KR100646075B1 (sk)
CN (2) CN1223608C (sk)
AR (1) AR029321A1 (sk)
AU (1) AU780585B2 (sk)
BG (2) BG65375B1 (sk)
BR (1) BR9909252A (sk)
CA (1) CA2321672A1 (sk)
EA (2) EA005853B1 (sk)
EE (1) EE200000487A (sk)
HU (1) HUP0100671A3 (sk)
IL (3) IL132105A0 (sk)
NO (1) NO20004167L (sk)
NZ (1) NZ506477A (sk)
PL (1) PL350181A1 (sk)
SK (1) SK12682000A3 (sk)
WO (1) WO2000039160A2 (sk)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA04002103A (es) * 2001-09-04 2004-06-07 Yeda Res & Dev Una proteina de union a caspasa-8, su preparacion y uso.
US20040072770A1 (en) * 2002-07-03 2004-04-15 Besterman Jeffrey M. Methods for specifically inhibiting histone deacetylase-7 and 8
IL158599A0 (en) * 2003-10-26 2004-05-12 Yeda Res & Dev Methods of modulating hematopoiesis
CN101702906B (zh) * 2007-02-23 2014-02-12 耶达研究及发展有限公司 用于抑制金属蛋白活性的抗体和含有所述抗体的药物组合物
WO2010006177A2 (en) * 2008-07-10 2010-01-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Muc1, caspase-8,and ded-containing proteins
EP3620521B1 (en) * 2014-09-04 2024-05-29 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Globin gene therapy for treating hemoglobinopathies
CN104694485A (zh) * 2015-02-13 2015-06-10 广西壮族自治区兽医研究所 Z-ietd-fmk在提高prrsv体外培养滴度方面的应用及其方法
CN106146665B (zh) * 2016-08-31 2019-08-09 中国农业科学院植物保护研究所 一种用于制备针对甜菜夜蛾caspase-5大亚基的抗体的方法
CN110430897B (zh) * 2017-03-16 2021-01-22 免疫功坊股份有限公司 接合单元及包含接合单元的分子构建体

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL73883A (en) * 1984-12-20 1990-12-23 Yeda Res & Dev Monoclonal antibodies against tnf-alpha,hybridomas producing them and method for the purification of tnf-alpha
IL83878A (en) * 1987-09-13 1995-07-31 Yeda Res & Dev Soluble protein corresponding to tnf inhibitory protein its preparation and pharmaceutical compositions containing it
IL94039A (en) * 1989-08-06 2006-09-05 Yeda Res & Dev Antibodies to tbp - 1 and their use
JPH0625292A (ja) * 1990-10-31 1994-02-01 Mitsui Toatsu Chem Inc タンパク質及びその遺伝子
US6582908B2 (en) * 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
AU3665893A (en) * 1992-02-12 1993-09-03 United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The Sequences characteristic of human gene transcription product
US5364503A (en) 1992-02-20 1994-11-15 Macmillan Bloedel Limited Nitric oxide treatment for ozone bleaching
IL101769A (en) * 1992-05-03 2007-02-11 Yeda Res & Dev Modulation of TNF receptor action
IL104355A (en) * 1993-01-10 2006-08-20 Yeda Res & Dev Tnf receptor promoter
IL109633A (en) * 1994-05-11 2005-05-17 Yeda Res & Dev Tnf receptor promoter
JP2002514903A (ja) * 1996-06-17 2002-05-21 ジンザイム コーポレイション 新規のヒト第１６染色体遺伝子、組成物、それを作製および使用する方法
US6242569B1 (en) * 1997-02-05 2001-06-05 Tularik, Inc. Regulators of apoptosis
EP1080203A2 (en) * 1998-05-29 2001-03-07 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human hydrolase homologs: n-terminal asparagine amidohydrolase, glycosyl hydrolase, glucohydrolase, biotinidase, and n-acetylglucosamine 6-p deacetylase
US6326354B1 (en) * 1998-08-19 2001-12-04 Washington University Modulation of apoptosis with bid
EP1131425A2 (en) * 1998-11-18 2001-09-12 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Inflammation-associated genes
EP1002900A1 (de) 1998-11-18 2000-05-24 SP Beton GmbH &amp; Co. KG Verkehrsflächen-Bodenbelag mit Bodenbelagelementen aus Kunststeinmaterial

Also Published As

Publication number Publication date
EE200000487A (et) 2002-02-15
EA005853B1 (ru) 2005-06-30
US20080139476A1 (en) 2008-06-12
US7339047B2 (en) 2008-03-04
CN1223608C (zh) 2005-10-19
HUP0100671A3 (en) 2006-04-28
AR029321A1 (es) 2003-06-25
US20040229260A1 (en) 2004-11-18
KR100646074B1 (ko) 2006-11-13
BG109904A (bg) 2008-01-31
WO2000039160A3 (sk) 2001-08-23
IL132105A0 (en) 2001-03-19
JP2002536965A (ja) 2002-11-05
IL138025A (en) 2007-08-19
HUP0100671A2 (hu) 2001-06-28
AU780585B2 (en) 2005-04-07
BG104707A (en) 2001-04-30
BR9909252A (pt) 2000-11-28
CN1603342A (zh) 2005-04-06
IL178921A0 (en) 2007-03-08
KR100646075B1 (ko) 2006-11-15
EP1058691A1 (en) 2000-12-13
NO20004167L (no) 2000-10-19
KR20060090770A (ko) 2006-08-16
EA007273B1 (ru) 2006-08-25
WO2000039160A2 (en) 2000-07-06
KR20010041250A (ko) 2001-05-15
BG65375B1 (bg) 2008-04-30
PL350181A1 (en) 2002-11-18
CA2321672A1 (en) 2000-07-06
CN1298411A (zh) 2001-06-06
HK1037197A1 (en) 2002-02-01
AU1795000A (en) 2000-07-31
EA200000875A1 (ru) 2001-10-22
NO20004167D0 (no) 2000-08-21
NZ506477A (en) 2003-08-29
US6762283B1 (en) 2004-07-13
EA200401390A1 (ru) 2005-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20080139476A1 (en) Caspase-8 interacting proteins
EP0813419B1 (en) Modulators of regulatory proteins
US20080254028A1 (en) Caspase-8 binding protein, its preparation and use
US7101675B2 (en) Modulators of regulatory proteins
IL109632A (en) Modulators of the function of tnf receptors
SK117599A3 (en) Dna sequence, a vector containing it, a host cell, isoform of g1 protein, method for producing isoform of g1 protein, pharmaceutical composition containing it and its use
AU2004240157B2 (en) Caspase-8 interacting proteins
CZ20003098A3 (cs) Proteiny interagující s kaspázou-8
MXPA00008260A (en) Caspase-8 interactingproteins
US7108999B1 (en) Modulators of the function of FAS/AP01 receptors
AU5133296A (en) Modulators of regulatory proteins
AU2002324325A1 (en) A caspase- 8 binding protein, its preparation and use
IL112692A (en) ANTIBODIES TO PROTEIN WHICH BINDS TO Fas-R
AU5834599A (en) Modulators of regulatory proteins

Legal Events

Date Code Title Description
FB9A Suspension of patent application procedure