JPH0625292A - タンパク質及びその遺伝子 - Google Patents
タンパク質及びその遺伝子Info
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- JPH0625292A JPH0625292A JP34930691A JP34930691A JPH0625292A JP H0625292 A JPH0625292 A JP H0625292A JP 34930691 A JP34930691 A JP 34930691A JP 34930691 A JP34930691 A JP 34930691A JP H0625292 A JPH0625292 A JP H0625292A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 抗ＤＮＡ抗体産生を増強する因子であるタン
パク質の分離・精製そして同定及びその遺伝子をクロー
ニングし、その構造を明らかにし、当該遺伝子を組み替
えた大腸菌等が該増強因子タンパク質を発現させると共
に、これに対する抗体を得ること 【構成】 生体組織・細胞が自己免疫疾患動物又は自己
免疫疾患でない動物の組織・細胞であって、抗ＤＮＡ抗
体産生を増強し、且つＤＮＡと結合するタンパク質及び
その製造方法並びに当該タンパク質に対する抗体及びそ
の調整製造方法
パク質の分離・精製そして同定及びその遺伝子をクロー
ニングし、その構造を明らかにし、当該遺伝子を組み替
えた大腸菌等が該増強因子タンパク質を発現させると共
に、これに対する抗体を得ること 【構成】 生体組織・細胞が自己免疫疾患動物又は自己
免疫疾患でない動物の組織・細胞であって、抗ＤＮＡ抗
体産生を増強し、且つＤＮＡと結合するタンパク質及び
その製造方法並びに当該タンパク質に対する抗体及びそ
の調整製造方法
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト、動物等生体に由
来する、ＤＮＡ等核酸類と結合する活性を持つタンパク
質及びその遺伝子、又それらを調製・製造する方法に関
する。
来する、ＤＮＡ等核酸類と結合する活性を持つタンパク
質及びその遺伝子、又それらを調製・製造する方法に関
する。
【０００２】更に本発明は、細胞のＤＮＡ等核酸類の産
生異常、ＤＮＡ等核酸類に対する抗体の産生異常、細胞
死に伴うＤＮＡ等核酸類の漏出等々の現象を伴うヒト及
び動物の各種疾患、即ちリウマチ、自己免疫疾患、免疫
不全症、各種感染症、遺伝子疾患、代謝性疾患、癌等の
診断及び治療に有用な前記タンパク質に対する抗体及び
その製造方法に関する。
生異常、ＤＮＡ等核酸類に対する抗体の産生異常、細胞
死に伴うＤＮＡ等核酸類の漏出等々の現象を伴うヒト及
び動物の各種疾患、即ちリウマチ、自己免疫疾患、免疫
不全症、各種感染症、遺伝子疾患、代謝性疾患、癌等の
診断及び治療に有用な前記タンパク質に対する抗体及び
その製造方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】自己免疫疾患等の病態、病因を明らかに
し、その診断・治療法の研究を行うため、自己免疫病マ
ウス等の疾患モデル動物が重用されている。
し、その診断・治療法の研究を行うため、自己免疫病マ
ウス等の疾患モデル動物が重用されている。
【０００４】例えばＮＺＢマウス、ＮＺＢ／ＷＦ１マウ
ス、ＭＲＬ／ｌマウス、ＭＲＬ／ｎマウス、ＢＸＳＢマ
ウス等は全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ
ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏ ｓｕｓ，ＳＬＥ）
のモデル動物とされて、広く研究の対象となっている。
ス、ＭＲＬ／ｌマウス、ＭＲＬ／ｎマウス、ＢＸＳＢマ
ウス等は全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ
ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏ ｓｕｓ，ＳＬＥ）
のモデル動物とされて、広く研究の対象となっている。
【０００５】ＭＲＬ／ｌマウスは１０週齢頃から著明な
リンパ節腫脹をきたし、ＳＬＥに特徴的な抗二本鎖（ｄ
ｓ）ＤＮＡ抗体等、抗ＤＮＡ抗体を中心とする自己抗体
の異常産生が見られ、高頻度に腎炎を発症する。
リンパ節腫脹をきたし、ＳＬＥに特徴的な抗二本鎖（ｄ
ｓ）ＤＮＡ抗体等、抗ＤＮＡ抗体を中心とする自己抗体
の異常産生が見られ、高頻度に腎炎を発症する。
【０００６】Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅらは、ＭＲＬ／ｌマ
ウスの産生するこれらの自己抗体は、腫脹したリンパ節
中に存在するＴ細胞の産生する抗原特異的ヘルパー因子
（Ｌ−ＢＣＤＦ）によるとの報告を行った（Ｐｒｕｄ’
ｈｏｍｍｅ，Ｇ．Ｔ．ｅｔａｌ：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．，１５７，７３０，１９８３）。
ウスの産生するこれらの自己抗体は、腫脹したリンパ節
中に存在するＴ細胞の産生する抗原特異的ヘルパー因子
（Ｌ−ＢＣＤＦ）によるとの報告を行った（Ｐｒｕｄ’
ｈｏｍｍｅ，Ｇ．Ｔ．ｅｔａｌ：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．，１５７，７３０，１９８３）。
【０００７】これを機にＬ−ＢＣＤＦの分子的解明のた
め、多くの研究グループがＬ−ＢＣＤＦ産生Ｔ細胞株の
樹立を試みたが、Ｔ細胞のみにその産生の源を求めたグ
ループは、すべてＬ−ＢＣＤＦ様分化因子産生株の樹立
には成功していない。
め、多くの研究グループがＬ−ＢＣＤＦ産生Ｔ細胞株の
樹立を試みたが、Ｔ細胞のみにその産生の源を求めたグ
ループは、すべてＬ−ＢＣＤＦ様分化因子産生株の樹立
には成功していない。
【０００８】本発明者らは、先に独自にＭＲＬ／ｌマウ
スの腫脹リンパ節全細胞集団から、抗ＤＮＡ抗体産生を
増強する因子を産生・放出するリンパ系株化細胞ＫＭＬ
１細胞を樹立し、特許出願した（特開昭６２−８７０９
０）。
スの腫脹リンパ節全細胞集団から、抗ＤＮＡ抗体産生を
増強する因子を産生・放出するリンパ系株化細胞ＫＭＬ
１細胞を樹立し、特許出願した（特開昭６２−８７０９
０）。
【０００９】そしてＫＭＬ１細胞由来のＫＭＬ１−７細
胞をＳＬＥ病態の晩期発症モデルＭＲＬ／ｎマウスに移
植することによって、早期発症モデルＭＲＬ／ｌマウス
と同程度の抗ｄｓＤＮＡ抗体の増強産生を行わしめるこ
と、そしていずれのモデルでも早期にＳＬＥ病態を発症
することを明らかにした（Ｋａｎａｉ，Ｙ．ｅｔ ａ
ｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２４，４９，１９９
０）。
胞をＳＬＥ病態の晩期発症モデルＭＲＬ／ｎマウスに移
植することによって、早期発症モデルＭＲＬ／ｌマウス
と同程度の抗ｄｓＤＮＡ抗体の増強産生を行わしめるこ
と、そしていずれのモデルでも早期にＳＬＥ病態を発症
することを明らかにした（Ｋａｎａｉ，Ｙ．ｅｔ ａ
ｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２４，４９，１９９
０）。
【００１０】他方、遺伝子ＤＮＡに結合し、遺伝情報の
発現を調節、制御するＤＮＡ結合タンパク質が知られて
きた（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．Ｊ．＆ Ｔｊｉａｎ，
Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５，１３７，１９８９及び
Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．Ｆ．＆ＭｃＫｎｉｇｉｔｈ，Ｓ．
Ｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８，７
９９，１９８９）。
発現を調節、制御するＤＮＡ結合タンパク質が知られて
きた（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．Ｊ．＆ Ｔｊｉａｎ，
Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５，１３７，１９８９及び
Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．Ｆ．＆ＭｃＫｎｉｇｉｔｈ，Ｓ．
Ｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８，７
９９，１９８９）。
【００１１】又，細胞の死、細胞死に於けるＤＮＡ等核
酸の漏出の現象も知られてきた（ａｐｏｐｔｏｓｉ
ｓ）。この場合、細胞から放出されるＤＮＡは、ヌクレ
オソームを単位とする約１２０塩基対の倍数の大きさを
しており、それはＳＬＥ患者血液中に見られるＤＮＡの
性質と一致している（Ｗｙｌｌｉｅ，Ａ．Ｈ．ｅｔ ａ
ｌ，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４２，６７，１９８４及び
Ｂｅｌｌ，Ｄ．Ａ．ｅｔａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．，８５，１４８７，１９９０）。
酸の漏出の現象も知られてきた（ａｐｏｐｔｏｓｉ
ｓ）。この場合、細胞から放出されるＤＮＡは、ヌクレ
オソームを単位とする約１２０塩基対の倍数の大きさを
しており、それはＳＬＥ患者血液中に見られるＤＮＡの
性質と一致している（Ｗｙｌｌｉｅ，Ａ．Ｈ．ｅｔ ａ
ｌ，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４２，６７，１９８４及び
Ｂｅｌｌ，Ｄ．Ａ．ｅｔａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．，８５，１４８７，１９９０）。
【００１２】又繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）に
おいて、細胞は１回分裂するとＤＮＡは１０００ヌクレ
オチドずつ短くなってゆくとの報告もある（Ｈａｒｌｅ
ｙ，Ｃ．Ｂ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４５，４５
８，１９９０）。
おいて、細胞は１回分裂するとＤＮＡは１０００ヌクレ
オチドずつ短くなってゆくとの報告もある（Ｈａｒｌｅ
ｙ，Ｃ．Ｂ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４５，４５
８，１９９０）。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】上記のようなＤＮＡに
関連する種々の知見を考えて、本発明者らは、自己免疫
疾患ＭＲＬ／ｌマウス由来のＫＭＬ１−７細胞が産生・
放出する抗ＤＮＡ抗体産生を増強する因子（以下、「増
強因子」という）は、生体で産生される過剰、あるいは
当座用をなさないＤＮＡと反応し、免疫機構を借りた何
らかの処理を行う機能、役割を持つ物質ではないかと想
到し、インターフェロン類が繊維芽細胞のみならずリン
パ系細胞からも産生されるのと同様に、増強因子は単に
リンパ系細胞のみならず、普遍的に他の臓器の細胞から
も産生される物質ではないかと推定した。
関連する種々の知見を考えて、本発明者らは、自己免疫
疾患ＭＲＬ／ｌマウス由来のＫＭＬ１−７細胞が産生・
放出する抗ＤＮＡ抗体産生を増強する因子（以下、「増
強因子」という）は、生体で産生される過剰、あるいは
当座用をなさないＤＮＡと反応し、免疫機構を借りた何
らかの処理を行う機能、役割を持つ物質ではないかと想
到し、インターフェロン類が繊維芽細胞のみならずリン
パ系細胞からも産生されるのと同様に、増強因子は単に
リンパ系細胞のみならず、普遍的に他の臓器の細胞から
も産生される物質ではないかと推定した。
【００１４】そこで、まずは該増強因子タンパク質の分
離・精製そして同定及びその遺伝子をクローニングし、
その構造を明らかにすること、さらに該遺伝子を組み換
えた大腸菌等が該増強因子タンパク質を発現させること
が本発明の課題であると考えた。
離・精製そして同定及びその遺伝子をクローニングし、
その構造を明らかにすること、さらに該遺伝子を組み換
えた大腸菌等が該増強因子タンパク質を発現させること
が本発明の課題であると考えた。
【００１５】そして、増強因子を高度に精製すべく鋭意
研究を進めた結果、高純度の増強因子を得ることのでき
る方法、及びそのアミノ酸配列の部分構造を決定できる
手法を確立するに至り、得られたアミノ酸配列に対応す
る合成オリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＰＣＲ
によってＫＭＬ１−７細胞のｃＤＮＡを鋳型にしてＤＮ
Ａプローブを作製した。
研究を進めた結果、高純度の増強因子を得ることのでき
る方法、及びそのアミノ酸配列の部分構造を決定できる
手法を確立するに至り、得られたアミノ酸配列に対応す
る合成オリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＰＣＲ
によってＫＭＬ１−７細胞のｃＤＮＡを鋳型にしてＤＮ
Ａプローブを作製した。
【００１６】そして、ＫＭＬ１−７細胞より作製したｃ
ＤＮＡライブラリーから、本ＤＮＡプローブを用いてプ
ラークハイブリダイゼーションを行うことによって、陽
性クローンを選別し、該増強因子をコードするＤＮＡ断
片を含む全長２．２Ｋ塩基のｃＤＮＡを得、更にＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＭ１３＋にリクローニングして、
ＤＮＡのシークエンシングを行った。ついで、得られた
全長２．２Ｋ塩基のｃＤＮＡを適当な発現ベクターを用
いて大腸菌等に組み換え、天然の本増強因子と同等以上
の活性を有する増強因子タンパク質を発現させることに
成功した。また本増強因子タンパク質を動物に免疫し、
抗体の作製にも到達した。
ＤＮＡライブラリーから、本ＤＮＡプローブを用いてプ
ラークハイブリダイゼーションを行うことによって、陽
性クローンを選別し、該増強因子をコードするＤＮＡ断
片を含む全長２．２Ｋ塩基のｃＤＮＡを得、更にＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＭ１３＋にリクローニングして、
ＤＮＡのシークエンシングを行った。ついで、得られた
全長２．２Ｋ塩基のｃＤＮＡを適当な発現ベクターを用
いて大腸菌等に組み換え、天然の本増強因子と同等以上
の活性を有する増強因子タンパク質を発現させることに
成功した。また本増強因子タンパク質を動物に免疫し、
抗体の作製にも到達した。
【００１７】又、ＭＲＬ／ｌマウスのリンパ系細胞以外
の正常マウスの他の臓器においても、増強因子が発現し
ていることを本発明者らは見出し、ゲノムＤＮＡから上
記ｃＤＮＡをプローブにして遺伝子をクローニングする
ことにも成功した。
の正常マウスの他の臓器においても、増強因子が発現し
ていることを本発明者らは見出し、ゲノムＤＮＡから上
記ｃＤＮＡをプローブにして遺伝子をクローニングする
ことにも成功した。
【００１８】更に、ヒト褐色細胞種（Ｐｈｅｏｃｈｒｏ
ｍｏｃｙｔｏｍａ）ｃＤＮＡライブラリーから、ＭＲＬ
／ｌマウスよりクローニングした増強因子タンパク質遺
伝子を含むＤＮＡ断片をプローブとして用いて、ヒト型
の増強因子遺伝子をクローニングし、これら増強因子タ
ンパク質がＤＮＡ結合タンパク質であることを明らかに
し、本発明を完成した。
ｍｏｃｙｔｏｍａ）ｃＤＮＡライブラリーから、ＭＲＬ
／ｌマウスよりクローニングした増強因子タンパク質遺
伝子を含むＤＮＡ断片をプローブとして用いて、ヒト型
の増強因子遺伝子をクローニングし、これら増強因子タ
ンパク質がＤＮＡ結合タンパク質であることを明らかに
し、本発明を完成した。
【００１９】本発明の第１の目的は、ＭＲＬ／ｌマウス
ＫＭＬ１−７細胞が産生する抗ＤＮＡ抗体産生を増強す
る増強因子を分離・精製する技術及び増強因子をコード
する遺伝子のクローニングに必要な技術を提供すること
にある。
ＫＭＬ１−７細胞が産生する抗ＤＮＡ抗体産生を増強す
る増強因子を分離・精製する技術及び増強因子をコード
する遺伝子のクローニングに必要な技術を提供すること
にある。
【００２０】本発明の第２の目的は、ＭＲＬ／ｌマウス
ＫＭＬ１−７細胞の増強因子のアミノ酸配列及び増強因
子遺伝子のＤＮＡ塩基配列を明らかにし、増強因子遺伝
子を構成するＤＮＡあるいはその一部断片ＤＮＡをプロ
ーブとして、ＭＲＬ／ｌマウスの各種臓器、更に他の自
己免疫疾患マウス、自己免疫疾患動物、正常動物、健常
人、ＳＬＥ、混合性結合繊維病（ＭＣＴＤ）、強皮症
（ＳＤ）等膠原病等々の自己免疫疾患患者の免疫担当細
胞を有する組織、リンパ系細胞、及び各種臓器、血液、
体液中の増強因子ないし増強因子様物質をコードする遺
伝子を検出、取得できる方法を提供することにある。
ＫＭＬ１−７細胞の増強因子のアミノ酸配列及び増強因
子遺伝子のＤＮＡ塩基配列を明らかにし、増強因子遺伝
子を構成するＤＮＡあるいはその一部断片ＤＮＡをプロ
ーブとして、ＭＲＬ／ｌマウスの各種臓器、更に他の自
己免疫疾患マウス、自己免疫疾患動物、正常動物、健常
人、ＳＬＥ、混合性結合繊維病（ＭＣＴＤ）、強皮症
（ＳＤ）等膠原病等々の自己免疫疾患患者の免疫担当細
胞を有する組織、リンパ系細胞、及び各種臓器、血液、
体液中の増強因子ないし増強因子様物質をコードする遺
伝子を検出、取得できる方法を提供することにある。
【００２１】本発明の第３の目的は、各種動物の本増強
因子あるいは本増強因子様因子、たとえばマウス増強因
子、マウス増強因子様因子、ラット増強因子、ヒト増強
因子、ヒト増強因子様因子をコードする遺伝子を各種細
胞、微生物等で発現させて、増強因子ないし増強因子様
因子を量的に生産する方法を提供することにある。
因子あるいは本増強因子様因子、たとえばマウス増強因
子、マウス増強因子様因子、ラット増強因子、ヒト増強
因子、ヒト増強因子様因子をコードする遺伝子を各種細
胞、微生物等で発現させて、増強因子ないし増強因子様
因子を量的に生産する方法を提供することにある。
【００２２】本発明の第４の目的は、増強因子ないし増
強因子様因子に対するポリクローナル抗体、モノクロー
ナル抗体を調製する方法を提供することにある。
強因子様因子に対するポリクローナル抗体、モノクロー
ナル抗体を調製する方法を提供することにある。
【００２３】本発明の第５の目的は、マウス等動物、ヒ
トの増強因子、増強因子様因子を用いた、生体中の増強
因子、増強因子様因子に対する抗体を測定する方法また
マウス等動物、ヒトの増強因子、増強因子様因子に対す
る抗体を用いた増強因子、増強因子様因子の検出方法、
測定方法、及びマウス等動物、ヒトの増強因子遺伝子、
増強因子様因子遺伝子を用いた各種疾患の診断、治療の
ために必要な技術を提供することにある。
トの増強因子、増強因子様因子を用いた、生体中の増強
因子、増強因子様因子に対する抗体を測定する方法また
マウス等動物、ヒトの増強因子、増強因子様因子に対す
る抗体を用いた増強因子、増強因子様因子の検出方法、
測定方法、及びマウス等動物、ヒトの増強因子遺伝子、
増強因子様因子遺伝子を用いた各種疾患の診断、治療の
ために必要な技術を提供することにある。
【００２４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記第１
の目的の達成のために、まず抗ＤＮＡ ＩｇＧ抗体産生
増強因子（増強因子）の分離、精製を企てるべく大量の
ＫＭＬ１−７細胞を培養した。
の目的の達成のために、まず抗ＤＮＡ ＩｇＧ抗体産生
増強因子（増強因子）の分離、精製を企てるべく大量の
ＫＭＬ１−７細胞を培養した。
【００２５】ＫＭＬ１−７細胞を完全培地下、フラスコ
内でコンフルエントになるまで培養し、しかる後に、よ
り容量の大きなフラスコ内で培養を続け、その後ＫＭＬ
１−７細胞を遠心操作等で集め、ハイメディウム６０６
等の無血清培地に浮遊させた。細胞濃度は０．５〜５×
１０７／ｍｌがよく、好適には１〜３×１０７／ｍｌが
よい。
内でコンフルエントになるまで培養し、しかる後に、よ
り容量の大きなフラスコ内で培養を続け、その後ＫＭＬ
１−７細胞を遠心操作等で集め、ハイメディウム６０６
等の無血清培地に浮遊させた。細胞濃度は０．５〜５×
１０７／ｍｌがよく、好適には１〜３×１０７／ｍｌが
よい。
【００２６】ついで、大型フラスコに本細胞を入れ、前
記の細胞濃度で炭酸ガス培養器内で２〜５日間、好まし
くは３日間培養を行った。その後、たとえば３０００回
転、１５分遠心により培養上清を集め、直ちにセリンプ
ロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦを０．５ｍＭになるように加
えた。
記の細胞濃度で炭酸ガス培養器内で２〜５日間、好まし
くは３日間培養を行った。その後、たとえば３０００回
転、１５分遠心により培養上清を集め、直ちにセリンプ
ロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦを０．５ｍＭになるように加
えた。
【００２７】しかる後、ステリベックスフィルター等で
ろ過し、続いてＰＭ−１０等の限外ろ過膜で２００〜２
５０倍に濃縮した。培養上清を集めた時と同様に、遠
心、無菌ろ過を行い、この段階で各フラスコの培養上清
を集め、１０〜２０ｌを１バッチとして、その後の精製
行程に進んだ。
ろ過し、続いてＰＭ−１０等の限外ろ過膜で２００〜２
５０倍に濃縮した。培養上清を集めた時と同様に、遠
心、無菌ろ過を行い、この段階で各フラスコの培養上清
を集め、１０〜２０ｌを１バッチとして、その後の精製
行程に進んだ。
【００２８】即ち、後に実施例１において詳述するよう
に、増強因子含有該培養上清をＤＥＡＥ−セファデック
スＡ−５０等の陰イオン交換樹脂へ吸着させ、然る後に
ＮａＣｌ等の塩を加えた緩衝液で、担体に吸着した増強
因子をバッチ式にあるいはカラム操作で溶出した。又、
ＡｃＡ５４カラム等の分子篩でゲルろ過も行った。
に、増強因子含有該培養上清をＤＥＡＥ−セファデック
スＡ−５０等の陰イオン交換樹脂へ吸着させ、然る後に
ＮａＣｌ等の塩を加えた緩衝液で、担体に吸着した増強
因子をバッチ式にあるいはカラム操作で溶出した。又、
ＡｃＡ５４カラム等の分子篩でゲルろ過も行った。
【００２９】更に、ヘパリン等を担持したアフィニティ
カラムを用いて精製を進め、最後にＰｈｅｎｙｌ ５Ｐ
ＷＲＰ等の逆相カラムを用いたＨＰＬＣで増強因子を精
製、単離することができた。精製の程度は１２００〜１
５００倍であった。
カラムを用いて精製を進め、最後にＰｈｅｎｙｌ ５Ｐ
ＷＲＰ等の逆相カラムを用いたＨＰＬＣで増強因子を精
製、単離することができた。精製の程度は１２００〜１
５００倍であった。
【００３０】このような方法及び当業者の利用し得る類
似の方法を用いて、精製、分離した本増強因子をＳＤＳ
加ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）にて分析し、その純度を銀染色等で調べた。
似の方法を用いて、精製、分離した本増強因子をＳＤＳ
加ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）にて分析し、その純度を銀染色等で調べた。
【００３１】又、増強因子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、
得られた単一ピークをＰｈａｓｔＧｅｌ等にかけ等電点
を調べた。
得られた単一ピークをＰｈａｓｔＧｅｌ等にかけ等電点
を調べた。
【００３２】増強因子の各精製過程ごとに、精製標品を
ＭＲＬ／ｌマウスの脾細胞浮遊液に加え４日間培養し、
上清中の抗ＤＮＡ抗体産生量を測定することにより、及
び該精製標品をｓｓ ＤＮＡでプライムした正常Ｂａｌ
ｂ／ｃマウス脾細胞浮遊液に加え、５〜７日間培養し、
ｓｓ ＤＮＡをコートしたＳＲＢＣをターゲットとした
プラークフォーミング細胞（ＰＦＣ）を算定することに
より、そのタンパク質重量あたりの比活性上昇を調べ
た。
ＭＲＬ／ｌマウスの脾細胞浮遊液に加え４日間培養し、
上清中の抗ＤＮＡ抗体産生量を測定することにより、及
び該精製標品をｓｓ ＤＮＡでプライムした正常Ｂａｌ
ｂ／ｃマウス脾細胞浮遊液に加え、５〜７日間培養し、
ｓｓ ＤＮＡをコートしたＳＲＢＣをターゲットとした
プラークフォーミング細胞（ＰＦＣ）を算定することに
より、そのタンパク質重量あたりの比活性上昇を調べ
た。
【００３３】図１に示すように抗ＤＮＡ抗体価は、加え
た無血清培地培養上清の容量に依存して上昇した。増強
因子を得るために、５％牛胎児血清−Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ
［ＤＭＥＭ］でＫＭＬ１−７細胞を培養した場合、増強
因子が４０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で抗ＤＮＡ抗体を抑制
する傾向があるのに対して、無血清培地で得た増強因子
は、なお抗ＤＮＡ ＩｇＧ抗体価を上昇せしめる活性が
あることから、無血清培地はＫＭＬ１−７細胞の大量培
養による増強因子の単離精製に好適であることがわか
る。
た無血清培地培養上清の容量に依存して上昇した。増強
因子を得るために、５％牛胎児血清−Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ
［ＤＭＥＭ］でＫＭＬ１−７細胞を培養した場合、増強
因子が４０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で抗ＤＮＡ抗体を抑制
する傾向があるのに対して、無血清培地で得た増強因子
は、なお抗ＤＮＡ ＩｇＧ抗体価を上昇せしめる活性が
あることから、無血清培地はＫＭＬ１−７細胞の大量培
養による増強因子の単離精製に好適であることがわか
る。
【００３４】ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０に増強
因子を吸着させる際、最初は０．３Ｍ Ｎａｃｌ含有緩
衝液でバッチ式に溶出を行うのが好ましい。
因子を吸着させる際、最初は０．３Ｍ Ｎａｃｌ含有緩
衝液でバッチ式に溶出を行うのが好ましい。
【００３５】しかる後、ＡｃＡ５４カラム等に増強因子
をチャージし、ゲルろ過し、各画分の増強活性をＰＦＣ
で調べると、図２に示すように、増強因子は約３０ＫＤ
ａの分子量を示した。
をチャージし、ゲルろ過し、各画分の増強活性をＰＦＣ
で調べると、図２に示すように、増強因子は約３０ＫＤ
ａの分子量を示した。
【００３６】ついでＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０
カラムにかけ、増強因子を更に精製する際、第３図に示
すように増強因子は０．２〜０．３Ｍ ＮａＣｌの塩濃
度で溶出されることがわかる。
カラムにかけ、増強因子を更に精製する際、第３図に示
すように増強因子は０．２〜０．３Ｍ ＮａＣｌの塩濃
度で溶出されることがわかる。
【００３７】増強因子画分を含むそれ以降の溶出画分に
は、Ａ２６０の吸収が多いことから、増強因子がある種
の核酸（ＤＮＡ）と複合体を形成している可能性が示唆
される。
は、Ａ２６０の吸収が多いことから、増強因子がある種
の核酸（ＤＮＡ）と複合体を形成している可能性が示唆
される。
【００３８】増強因子を含む画分を更に濃縮、透祈した
後、ヘパリンセファロースカラムにチャージしたが、全
Ａ２８０単位はカラムに吸着せず、通過した。
後、ヘパリンセファロースカラムにチャージしたが、全
Ａ２８０単位はカラムに吸着せず、通過した。
【００３９】このことは、増強因子が糖タンパク質でな
いことを示唆するものと考えられる。次に、この活性画
分をＰｈｅｎｙｌ ５ＰＷＲＰにインジェクトし、ＨＰ
ＬＣを行い、第４図に示すように約５０％のアセトニト
リルで溶出される単一の鋭いピークを得ることができ
た。図４に示すようにＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、本増強因
子は約５５ＫＤａの単一分子（ｐ５５タンパク質）であ
ることが示された。又、等電点（ＰＩ）はＰｈａｓｔ
Ｇｅｌで５．８であることがわかった。前記のようにＡ
ｃＡ５４カラムでの本増強因子の溶出位置から、第２図
に示すように本増強因子は見かけ上約３０ＫＤａの分子
量であったが、前述及び後述するように本増強因子がＤ
ＮＡと結合することによって、本来の分子量約５５ＫＤ
ａの位置とは異なる所に溶出されたと考えられる。以上
の精製過程をまとめて下記表に示す。
いことを示唆するものと考えられる。次に、この活性画
分をＰｈｅｎｙｌ ５ＰＷＲＰにインジェクトし、ＨＰ
ＬＣを行い、第４図に示すように約５０％のアセトニト
リルで溶出される単一の鋭いピークを得ることができ
た。図４に示すようにＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、本増強因
子は約５５ＫＤａの単一分子（ｐ５５タンパク質）であ
ることが示された。又、等電点（ＰＩ）はＰｈａｓｔ
Ｇｅｌで５．８であることがわかった。前記のようにＡ
ｃＡ５４カラムでの本増強因子の溶出位置から、第２図
に示すように本増強因子は見かけ上約３０ＫＤａの分子
量であったが、前述及び後述するように本増強因子がＤ
ＮＡと結合することによって、本来の分子量約５５ＫＤ
ａの位置とは異なる所に溶出されたと考えられる。以上
の精製過程をまとめて下記表に示す。
【００４０】
【００４１】ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗ＤＮＡ抗体を選択的
に上昇させる本増強因子は単純タンパク質（ｐ５５）で
あり、その全アミノ酸配列を決定した。本タンパク質
は、Ｎ末端がブロックされていることがわかったので、
リジルエンドペプチダーゼによって得られたペプチドか
ら、その部分的一次構造を決定するステップを踏んだ。
この部分一次構造から考えられるＤＮＡを化学合成し、
これをプローブとして、それとハイブリダイズするＫＭ
Ｌ１−７細胞由来のｃＤＮＡクローンの単離を行った。
に上昇させる本増強因子は単純タンパク質（ｐ５５）で
あり、その全アミノ酸配列を決定した。本タンパク質
は、Ｎ末端がブロックされていることがわかったので、
リジルエンドペプチダーゼによって得られたペプチドか
ら、その部分的一次構造を決定するステップを踏んだ。
この部分一次構造から考えられるＤＮＡを化学合成し、
これをプローブとして、それとハイブリダイズするＫＭ
Ｌ１−７細胞由来のｃＤＮＡクローンの単離を行った。
【００４２】即ち、ＨＰＬＣを用いて精製し、更に乾燥
させたタンパク質標品を８Ｍ尿素に溶解し、ついでトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）緩衝液を加え、しかる後Ａｃ
ｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉ即ち、
リジルエンドペプチダーゼで一夜分解後、その分解物を
Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｃｋ ＲＰ−８カラムを用いてＨＰ
ＬＣにより分離した。
させたタンパク質標品を８Ｍ尿素に溶解し、ついでトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）緩衝液を加え、しかる後Ａｃ
ｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉ即ち、
リジルエンドペプチダーゼで一夜分解後、その分解物を
Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｃｋ ＲＰ−８カラムを用いてＨＰ
ＬＣにより分離した。
【００４３】得られた２つのペプチド断片について、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ４７０Ａ ｏｎ−ｌ
ｉｎｅ １２０Ａ ＰＴＨアミノ酸アナライザーでアミ
ノ酸配列を決定した。
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ４７０Ａ ｏｎ−ｌ
ｉｎｅ １２０Ａ ＰＴＨアミノ酸アナライザーでアミ
ノ酸配列を決定した。
【００４４】ペプチド断片１はＱＦＥＨＬＤＰＱＮＱＥ
ＴＦＥＡＩＤＬＥＬ、ペプチド断片２はＬＳＱＥＬＤＦ
ＶＳＨＮＶＲＴＫであった。
ＴＦＥＡＩＤＬＥＬ、ペプチド断片２はＬＳＱＥＬＤＦ
ＶＳＨＮＶＲＴＫであった。
【００４５】この２０アミノ酸残基からなるペプチド断
片１について、その両端に位置する７アミノ酸（ＱＦＥ
ＨＬＤＰ及びＥＡＩＤＬＥＬ）をコートできる２０塩基
からなる２種類のプライマー（Ｎ及びＣ）を合成した。
片１について、その両端に位置する７アミノ酸（ＱＦＥ
ＨＬＤＰ及びＥＡＩＤＬＥＬ）をコートできる２０塩基
からなる２種類のプライマー（Ｎ及びＣ）を合成した。
【００４６】これらは、 である。上記の２種の塩基配列において、（）内は２つ
の塩基の何れか一方を示し、たとえば（ＡＧ）、（Ｔ
Ｃ）等はそれぞれＡ又はＧ、Ｔ又はＣであることを示
す。
の塩基の何れか一方を示し、たとえば（ＡＧ）、（Ｔ
Ｃ）等はそれぞれＡ又はＧ、Ｔ又はＣであることを示
す。
【００４７】ＫＭＬ１−７細胞より調製したｍＲＮＡよ
り逆転写酵素でｃＤＮＡを作製し、そのｃＤＮＡを鋳型
としてプライマーＮ及びＣを用いてＰＣＲ法にて増幅し
た。アクリルアミドゲルで分離後、６０塩基近傍を分取
し、再びＰＣＲ法で増幅させた。ポリヌクレオチドキナ
ーゼと［γ−３２ｐ］ＡＴＰで末端を標識し、アクリル
アミドゲルで分離し、５９塩基対の部分を単離した。再
再度ＰＣＲ法で５９塩基対の部分を増幅させた。
り逆転写酵素でｃＤＮＡを作製し、そのｃＤＮＡを鋳型
としてプライマーＮ及びＣを用いてＰＣＲ法にて増幅し
た。アクリルアミドゲルで分離後、６０塩基近傍を分取
し、再びＰＣＲ法で増幅させた。ポリヌクレオチドキナ
ーゼと［γ−３２ｐ］ＡＴＰで末端を標識し、アクリル
アミドゲルで分離し、５９塩基対の部分を単離した。再
再度ＰＣＲ法で５９塩基対の部分を増幅させた。
【００４８】尚、プライマーとしては、プライマーとし
ての機能を損なわない範囲で、これらのプライマーの塩
基配列の一部を変換した塩基配列、若干の塩基を増減さ
せた塩基配列、あるいはそれらの組み合わせからなる塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドも本発明に含まれ
る。
ての機能を損なわない範囲で、これらのプライマーの塩
基配列の一部を変換した塩基配列、若干の塩基を増減さ
せた塩基配列、あるいはそれらの組み合わせからなる塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドも本発明に含まれ
る。
【００４９】又、ペプチド断片１由来のプライマー及び
ペプチド断片２由来のプライマーを用いてＰＣＲを行
い、遺伝子を増幅することもできる。
ペプチド断片２由来のプライマーを用いてＰＣＲを行
い、遺伝子を増幅することもできる。
【００５０】次に増幅されたＰＣＲ産物をＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ ＳＫＭ１３＋ベクターにクローン化した。Ｄ
ＮＡ塩基配列を決定したところフラグメント１に相当す
るアミノ酸をコードできるＤＮＡが確認された（２カ
所、第５図の１４６番目のアミノ酸がＨであり、ＥとＨ
のｄｉｓｃｒｅｐａｎｃｙが存在した。及びあとの塩基
配列決定の際に、１５１番目のアミノ酸がＲであり、Ｉ
とＲのｄｉｓｃｒｅｐａｎｃｙが存在することが示され
た。）。この５９塩基からなるオリゴヌクレオチドを合
成し、末端を３２Ｐで標識してそれをプローブにしてＫ
ＭＬ１−７ｍＲＮＡに対してノザンハイブリダイゼーシ
ョンを行うと、２．２Ｋ塩基のところにバンドが同定さ
れた。
ｒｉｐｔ ＳＫＭ１３＋ベクターにクローン化した。Ｄ
ＮＡ塩基配列を決定したところフラグメント１に相当す
るアミノ酸をコードできるＤＮＡが確認された（２カ
所、第５図の１４６番目のアミノ酸がＨであり、ＥとＨ
のｄｉｓｃｒｅｐａｎｃｙが存在した。及びあとの塩基
配列決定の際に、１５１番目のアミノ酸がＲであり、Ｉ
とＲのｄｉｓｃｒｅｐａｎｃｙが存在することが示され
た。）。この５９塩基からなるオリゴヌクレオチドを合
成し、末端を３２Ｐで標識してそれをプローブにしてＫ
ＭＬ１−７ｍＲＮＡに対してノザンハイブリダイゼーシ
ョンを行うと、２．２Ｋ塩基のところにバンドが同定さ
れた。
【００５１】
【００５２】他方、ＫＭＬ１−７細胞から常法により調
製したｍＲＮＡより、ｃＤＮＡ合成キット（例えばＡｍ
ｅｒｓｈａｍ社製、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製，Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製等）を用いて、ｃＤＮＡライ
ブラリーを作製しておき、上記５９塩基のＤＮＡ断片を
プローブとして、プラークハイブリダイゼーションでク
ローンを選別、単離した。更に上記と同様にＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ＳＫＭ１３＋でリクローニングを行い（Ｓ
Ｋ−ｃＤＮＡ），ＤＮＡの塩基配列を決定した。図５に
一部の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示す。
製したｍＲＮＡより、ｃＤＮＡ合成キット（例えばＡｍ
ｅｒｓｈａｍ社製、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製，Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製等）を用いて、ｃＤＮＡライ
ブラリーを作製しておき、上記５９塩基のＤＮＡ断片を
プローブとして、プラークハイブリダイゼーションでク
ローンを選別、単離した。更に上記と同様にＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ＳＫＭ１３＋でリクローニングを行い（Ｓ
Ｋ−ｃＤＮＡ），ＤＮＡの塩基配列を決定した。図５に
一部の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示す。
【００５３】図５のアミノ酸配列中にペプチド断片１及
び２に相当する構造が見られる。図５に示す塩基配列
は、下流側に３’末端にポリＡ部分を含む全長２１５６
塩基からなる塩基配列である。その中にＡＴＧに始ま
り、ＴＡＡで終る４５５アミノ酸をコードできるオープ
ンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅ）が存在した。この４５５アミノ酸からなる
分子量５０，４１０ダルトン等電点４．８０の単純蛋白
質には、Ｎ末端に疎水性アミノ酸に富んだリーダーペプ
チドと考えられる領域が存在した。その根拠は、リーダ
ーペプチドに見られる共通性がＰｅｒｌｍａｎらの論文
（Ｄ．Ｐｅｒｌｍａｎｄ ｅｔ ａｌ：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，１６７，３９１−４０９，１９８３），Ｂｌ
ｏｂｅｌらの論文（Ｇ．Ｂｌｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ：
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６７，８３５−８５１，１
９７５），Ｗａｌｔｅｒらの論文（Ｐ．Ｗａｌｔｅｒ
ｅｔ ａｌ：Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９１，５４５
−５５０および５５１−５６５，１９８１）等から次の
ように列挙でき、それら条件が本増強因子ｐ５５にもき
わめてよく該当すると考え得るからである。即ち共通性
として １．リーダーペプチドの中央部分に１２個前後のアミノ
酸からなる疎水性コアが存在する、 ２．疎水性コアの直前に正に荷電したアミノ酸（Ｌｙｓ
またはＡｒｇ）が存在する、 ３．コア部分に続いてβ−ｔｕｒｎを決定する配列があ
る、 ４．リーダーペプチドのＣ末端には側鎖の短いアミノ酸
（Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｃｙｓ，Ｔｈｒ）が存在す
る、 等があり、ｐ５５について見ると ＭＰＴＳＶＰＲＧＡＰＦＬＬＬＰＰＬＬＭＬＳＡＶＬＡ
ＶＰＶＤＲであり、 疎水性コア 切断部位 これら４つの条件を満たすと判断できる。 本増強因子
ｐ５５は２６番目のバリン（Ｖ）をＮ末端とする４３０
残基のアミノ酸が分泌されるタンパク質と考えられる。
このバリン（メチオニン）を１番（２６番）とした時、
３２１番目（３４６番目）から３６３番目（３８８番
目）にかけて７個のロイシン（Ｌ）が７アミノ酸ごとに
繰り返されるロイシンジッパー構造が観察される。又、
塩基性アミノ酸に富む領域は、１４６番目（１７１番
目）から１９２番目（２１７番目）にかけて存在する。
び２に相当する構造が見られる。図５に示す塩基配列
は、下流側に３’末端にポリＡ部分を含む全長２１５６
塩基からなる塩基配列である。その中にＡＴＧに始ま
り、ＴＡＡで終る４５５アミノ酸をコードできるオープ
ンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅ）が存在した。この４５５アミノ酸からなる
分子量５０，４１０ダルトン等電点４．８０の単純蛋白
質には、Ｎ末端に疎水性アミノ酸に富んだリーダーペプ
チドと考えられる領域が存在した。その根拠は、リーダ
ーペプチドに見られる共通性がＰｅｒｌｍａｎらの論文
（Ｄ．Ｐｅｒｌｍａｎｄ ｅｔ ａｌ：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，１６７，３９１−４０９，１９８３），Ｂｌ
ｏｂｅｌらの論文（Ｇ．Ｂｌｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ：
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６７，８３５−８５１，１
９７５），Ｗａｌｔｅｒらの論文（Ｐ．Ｗａｌｔｅｒ
ｅｔ ａｌ：Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９１，５４５
−５５０および５５１−５６５，１９８１）等から次の
ように列挙でき、それら条件が本増強因子ｐ５５にもき
わめてよく該当すると考え得るからである。即ち共通性
として １．リーダーペプチドの中央部分に１２個前後のアミノ
酸からなる疎水性コアが存在する、 ２．疎水性コアの直前に正に荷電したアミノ酸（Ｌｙｓ
またはＡｒｇ）が存在する、 ３．コア部分に続いてβ−ｔｕｒｎを決定する配列があ
る、 ４．リーダーペプチドのＣ末端には側鎖の短いアミノ酸
（Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｃｙｓ，Ｔｈｒ）が存在す
る、 等があり、ｐ５５について見ると ＭＰＴＳＶＰＲＧＡＰＦＬＬＬＰＰＬＬＭＬＳＡＶＬＡ
ＶＰＶＤＲであり、 疎水性コア 切断部位 これら４つの条件を満たすと判断できる。 本増強因子
ｐ５５は２６番目のバリン（Ｖ）をＮ末端とする４３０
残基のアミノ酸が分泌されるタンパク質と考えられる。
このバリン（メチオニン）を１番（２６番）とした時、
３２１番目（３４６番目）から３６３番目（３８８番
目）にかけて７個のロイシン（Ｌ）が７アミノ酸ごとに
繰り返されるロイシンジッパー構造が観察される。又、
塩基性アミノ酸に富む領域は、１４６番目（１７１番
目）から１９２番目（２１７番目）にかけて存在する。
【００５４】ついで本増強因子タンパク質の性質を明ら
かにするために大腸菌等で遺伝子発現により、タンパク
質の生産を行った。Ｎ末端付近に相当するプライマー とＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＭ１３＋中のＴ７ＲＮＡ
ポリメラーゼプライマー（５’ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡ
ＣＴＡＴＡＧ３’）とを用いて、上記ＳＫ−ｃＤＮＡを
鋳型にしてＰＣＲを行ない、増幅されたＤＮＡをＮｃｏ
Ｉで消化後、アガロースゲル電気泳動で上記２．２Ｋ塩
基のＤＮＡ断片を得た。これをＬｅｒｎｅｒによって開
発されたベクターλ Ｌｃｌ（Ｌｅｒｎｅｒ ｖｅｃｔ
ｏｒ λＬｃｌ；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５−
１２８０，１９８９参照）に挿入し、大腸菌にトランス
フォームした。
かにするために大腸菌等で遺伝子発現により、タンパク
質の生産を行った。Ｎ末端付近に相当するプライマー とＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＭ１３＋中のＴ７ＲＮＡ
ポリメラーゼプライマー（５’ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡ
ＣＴＡＴＡＧ３’）とを用いて、上記ＳＫ−ｃＤＮＡを
鋳型にしてＰＣＲを行ない、増幅されたＤＮＡをＮｃｏ
Ｉで消化後、アガロースゲル電気泳動で上記２．２Ｋ塩
基のＤＮＡ断片を得た。これをＬｅｒｎｅｒによって開
発されたベクターλ Ｌｃｌ（Ｌｅｒｎｅｒ ｖｅｃｔ
ｏｒ λＬｃｌ；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５−
１２８０，１９８９参照）に挿入し、大腸菌にトランス
フォームした。
【００５５】Ｌｅｒｎｅｒ ｖｅｃｔｏｒ λ Ｌｃｌ
には、Ｐｅｌ Ｂ リーダーペプチドがあり、そのＣ末
端にＮｃｏＩ切断部位がある。ｐ５５のリーダーペプチ
ドのＣ末端はＰｅｌ Ｂのものとは違うため、２３残基
目の Ｖａｌ ２４残基目のＬｅｕをそれぞれＡｌａ，
Ｍｅｔで、しかもＮｃｏＩ切断部位になるような塩基配
列にして、合成プライマー（Ｎ−ｔｅｒｍ ２７ｍｅ
ｒ）を作製した。Ｎ−ｔｅｒｍ２７ｍｅｒとＴ７プライ
マー（シークエンスに使うもの）を用い、Ｂｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ ＳＫＭ１３＋にｐ５５ｃＤＮＡがクローニン
グされているＤＮＡ（１０ｎｇ）を鋳型にして、ＰＣＲ
（９４℃１分，５５℃２分，７２℃３分を２０サイク
ル）で増幅後Ｎｃｏ Ｉで切断し、約１．９ｋｂの断片
を λ ＬｃｌのＮｃｏ Ｉ切断部位にクローニングし
た。図５に、ＰＣＲを用いたｐ５５ｃＤＮＡのＬｅｒｎ
ｅｒ ｖｅｃｔｏｒへのリクローニングの方法を示す。
このようにしてトランスフォームされた大腸菌をＬＢ＋
アンピシリン培地等で培養し、対数増殖期にＩＰＴＧを
添加することでマウスｐ５５タンパク質を生産した。培
養した大腸菌を低温で遠心し、集菌して得られた菌体ペ
レットをＥＤＴＡや蔗糖を含むトリス−Ｈｃｌ緩衝液に
再度懸濁した。次いで水で希釈した緩衝液を加えて浸透
圧ショックにより、菌体細胞壁と細胞膜の外膜の間のペ
リプラズマ等にあるｐ５５タンパク質を回収した。この
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＰｕａｌ Ｍ
ａｔｕｓｄａｉｒａ法によりＮ末端のアミノ酸配列を調
べると（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２ １００３
５−１００３８）、順にＶａｌ，Ｐｒｏ，Ｖａｌである
ことが確かめられた。
には、Ｐｅｌ Ｂ リーダーペプチドがあり、そのＣ末
端にＮｃｏＩ切断部位がある。ｐ５５のリーダーペプチ
ドのＣ末端はＰｅｌ Ｂのものとは違うため、２３残基
目の Ｖａｌ ２４残基目のＬｅｕをそれぞれＡｌａ，
Ｍｅｔで、しかもＮｃｏＩ切断部位になるような塩基配
列にして、合成プライマー（Ｎ−ｔｅｒｍ ２７ｍｅ
ｒ）を作製した。Ｎ−ｔｅｒｍ２７ｍｅｒとＴ７プライ
マー（シークエンスに使うもの）を用い、Ｂｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ ＳＫＭ１３＋にｐ５５ｃＤＮＡがクローニン
グされているＤＮＡ（１０ｎｇ）を鋳型にして、ＰＣＲ
（９４℃１分，５５℃２分，７２℃３分を２０サイク
ル）で増幅後Ｎｃｏ Ｉで切断し、約１．９ｋｂの断片
を λ ＬｃｌのＮｃｏ Ｉ切断部位にクローニングし
た。図５に、ＰＣＲを用いたｐ５５ｃＤＮＡのＬｅｒｎ
ｅｒ ｖｅｃｔｏｒへのリクローニングの方法を示す。
このようにしてトランスフォームされた大腸菌をＬＢ＋
アンピシリン培地等で培養し、対数増殖期にＩＰＴＧを
添加することでマウスｐ５５タンパク質を生産した。培
養した大腸菌を低温で遠心し、集菌して得られた菌体ペ
レットをＥＤＴＡや蔗糖を含むトリス−Ｈｃｌ緩衝液に
再度懸濁した。次いで水で希釈した緩衝液を加えて浸透
圧ショックにより、菌体細胞壁と細胞膜の外膜の間のペ
リプラズマ等にあるｐ５５タンパク質を回収した。この
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＰｕａｌ Ｍ
ａｔｕｓｄａｉｒａ法によりＮ末端のアミノ酸配列を調
べると（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２ １００３
５−１００３８）、順にＶａｌ，Ｐｒｏ，Ｖａｌである
ことが確かめられた。
【００５６】本増強因子タンパク質を大腸菌以外の酵
母、枯草菌等の微生物、あるいは動物細胞で発現させる
場合には、それに応じたベクターを用いる必要がある。
大腸菌で本増強因子タンパク質を生産することに本発明
者らは成功し、本発明を完成した。
母、枯草菌等の微生物、あるいは動物細胞で発現させる
場合には、それに応じたベクターを用いる必要がある。
大腸菌で本増強因子タンパク質を生産することに本発明
者らは成功し、本発明を完成した。
【００５７】本発明によってマウスより分離、精製さ
れ、更に大腸菌等で遺伝子発現された本増強因子タンパ
ク質は次のような性質を持っていることが明らかにされ
た。 ＫＭＬ１−７細胞培養中に培養液に出現するＤＮＡ
（Ｋ−ＤＮＡ）に結合し、ゲルシフトを起こす性質があ
る。 ＭＲＬ／ｌマウス、脾臓のＢ細胞画分に直接働き細胞
増殖活性を上げる。 ＭＲＬ／ｌマウス脾臓のＢ細胞画分に直接働き、Ｉｇ
Ｇ型の抗ＤＮＡ抗体産生を促進する。 抗ＤＮＡ抗体とＫ−ＤＮＡの結合をｃｏｍｐｅｔｉｔ
ｉｖｅに阻害する。
れ、更に大腸菌等で遺伝子発現された本増強因子タンパ
ク質は次のような性質を持っていることが明らかにされ
た。 ＫＭＬ１−７細胞培養中に培養液に出現するＤＮＡ
（Ｋ−ＤＮＡ）に結合し、ゲルシフトを起こす性質があ
る。 ＭＲＬ／ｌマウス、脾臓のＢ細胞画分に直接働き細胞
増殖活性を上げる。 ＭＲＬ／ｌマウス脾臓のＢ細胞画分に直接働き、Ｉｇ
Ｇ型の抗ＤＮＡ抗体産生を促進する。 抗ＤＮＡ抗体とＫ−ＤＮＡの結合をｃｏｍｐｅｔｉｔ
ｉｖｅに阻害する。
【００５８】そこで本増強因子ｐ５５タンパク質は、Ｄ
ＮＡ等核酸と結合能力を有し、ＭＲＬ／ｌマウス中で抗
ＤＮＡ抗体誘導を促進し、ｌｕｐｕｓ−ａｃｃｅｌｅｒ
ａｔｉｎｇな性質を有するが、広くｎｕｃｌｅｉｃ ａ
ｃｉｄｓとｂｉｎｄｉｎｇするｐｒｏｔｅｉｎであり、
Ｎｕｃｌｅｏｂｉｎｄｉｎ（以下Ｎｕｃと略記する）と
いう一般名を名づけた。
ＮＡ等核酸と結合能力を有し、ＭＲＬ／ｌマウス中で抗
ＤＮＡ抗体誘導を促進し、ｌｕｐｕｓ−ａｃｃｅｌｅｒ
ａｔｉｎｇな性質を有するが、広くｎｕｃｌｅｉｃ ａ
ｃｉｄｓとｂｉｎｄｉｎｇするｐｒｏｔｅｉｎであり、
Ｎｕｃｌｅｏｂｉｎｄｉｎ（以下Ｎｕｃと略記する）と
いう一般名を名づけた。
【００５９】なお大腸菌で生産された本増強因子ｐ５５
Ｎｕｃのアミノ酸配列を、シアノジェンブロマイド（Ｂ
ｒＣＮ）による切断個所など４個所につき決定したとこ
ろ、ＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸はその結果
と一致することが確認された。
Ｎｕｃのアミノ酸配列を、シアノジェンブロマイド（Ｂ
ｒＣＮ）による切断個所など４個所につき決定したとこ
ろ、ＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸はその結果
と一致することが確認された。
【００６０】即ちシアノジェンブロマイドによるｐ５５
タンパク質の加水分解は、７０％のギ酸中１ｍｌに２０
ｍｇのシアノジェンブロマイドを含む溶液中に、ｐ５５
を溶解し、３７℃で一夜反応させる。次にこの反応物を
乾固し、そのペレットを水に溶解し、しかる後ＳＤＳ−
ＰＡＧＥを行なった。この際ＴＥＦＣＯ ＷＩＤＥＰＡ
ＧＥ ｍｉｎｉなどの装置を用いることができる。更に
反応産物中の各切断断片を前記のＰａｕｌ Ｍａｔｓｕ
ｄａｉｒａの方法に従い、ウェスタンブロッティングを
行ない、ついで前記のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍ４７０Ａｏｎ−ｌｉｎｅ １２０Ａ ＰＴＨアミノ
酸アナライザーでアミノ酸配列を決定した（図５）。
タンパク質の加水分解は、７０％のギ酸中１ｍｌに２０
ｍｇのシアノジェンブロマイドを含む溶液中に、ｐ５５
を溶解し、３７℃で一夜反応させる。次にこの反応物を
乾固し、そのペレットを水に溶解し、しかる後ＳＤＳ−
ＰＡＧＥを行なった。この際ＴＥＦＣＯ ＷＩＤＥＰＡ
ＧＥ ｍｉｎｉなどの装置を用いることができる。更に
反応産物中の各切断断片を前記のＰａｕｌ Ｍａｔｓｕ
ｄａｉｒａの方法に従い、ウェスタンブロッティングを
行ない、ついで前記のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍ４７０Ａｏｎ−ｌｉｎｅ １２０Ａ ＰＴＨアミノ
酸アナライザーでアミノ酸配列を決定した（図５）。
【００６１】他方ｐ５５のＣ末端付近のアミノ酸配列も
決定した。即ちｐ５５を８Ｍ尿素に溶解し、ＴＰＣＫ処
理トリプシンを加え、３７℃で一夜加水分解し、しかる
後反応液に１００ｍＭのジイソプロピルフルオロホスフ
ェートを加え、更に１０％の酢酸を加えた。ついでこの
反応液をアンヒドロトリプシン アガロース カラム
（タカラ社製）にかけ加水分解ペプチド断片を分離し
た。非吸着画分をブロッティング装置（Ｍａｒｙｓｏｌ
ＫＳ−８４５１）で、２０Ｖ４時間、４℃，ＰＶＤＦ
メンブレイン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＲ社製）にブロット
した。非吸着画分にはＣ末端の最初のペプチド断片だけ
ではなく、他に２つのペプチド断片が混在していること
がわかった。シークエンシングを行うと、前記のロイシ
ンジッパーよりＣ末端側の３つのペプチド断片の存在が
確認でき、塩基配列から推定されるアミノ酸配列と一致
することが明らかになった（図５）。
決定した。即ちｐ５５を８Ｍ尿素に溶解し、ＴＰＣＫ処
理トリプシンを加え、３７℃で一夜加水分解し、しかる
後反応液に１００ｍＭのジイソプロピルフルオロホスフ
ェートを加え、更に１０％の酢酸を加えた。ついでこの
反応液をアンヒドロトリプシン アガロース カラム
（タカラ社製）にかけ加水分解ペプチド断片を分離し
た。非吸着画分をブロッティング装置（Ｍａｒｙｓｏｌ
ＫＳ−８４５１）で、２０Ｖ４時間、４℃，ＰＶＤＦ
メンブレイン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＲ社製）にブロット
した。非吸着画分にはＣ末端の最初のペプチド断片だけ
ではなく、他に２つのペプチド断片が混在していること
がわかった。シークエンシングを行うと、前記のロイシ
ンジッパーよりＣ末端側の３つのペプチド断片の存在が
確認でき、塩基配列から推定されるアミノ酸配列と一致
することが明らかになった（図５）。
【００６２】Ｎｕｃ ｍＲＮＡは、ＫＭＬ１−７細胞内
で発現し、Ｎｕｃタンパク質が分泌されているが、この
Ｎｕｃ遺伝子の発現は、Ｂａｌｂ／ｃ正常マウスの腎臓
でも起こっていることを発明者らは予期していたとおり
見出した。また脾臓では本Ｎｕｃ遺伝子は少量の発現が
見られた。
で発現し、Ｎｕｃタンパク質が分泌されているが、この
Ｎｕｃ遺伝子の発現は、Ｂａｌｂ／ｃ正常マウスの腎臓
でも起こっていることを発明者らは予期していたとおり
見出した。また脾臓では本Ｎｕｃ遺伝子は少量の発現が
見られた。
【００６３】これらの知見から、ＭＲＬ／ｌマウスにお
いてはＳＬＥと直接関係していると考えられる本Ｎｕｃ
タンパク質は、正常マウスでは、何らかのａｐｏｐｔｏ
ｓｉｓ等細胞死で生ずるＤＮＡの免疫系による処理に関
与していることが推察される。
いてはＳＬＥと直接関係していると考えられる本Ｎｕｃ
タンパク質は、正常マウスでは、何らかのａｐｏｐｔｏ
ｓｉｓ等細胞死で生ずるＤＮＡの免疫系による処理に関
与していることが推察される。
【００６４】更にマウスから単離されたｐ５５タンパク
質ｃＤＮＡクローンをプローブにして、ヒト褐色細胞腫
（ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ）のｃＤＮＡライ
ブラリーをプラークハイブリダイゼーション法でスクリ
ーニングして、ヒトＮｕｃ遺伝子のｃＤＮＡクローンも
得、そのうち最長の約１．５ＫｂのｃＤＮＡ断片（Ｅｃ
ｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片）をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ
ＫＭ１３＋のＥｃｏＲＩ部位にリクローニングし、ジデ
オキシ法によりその塩基配列更にはアミノ酸配列を決定
した。その構造はマウスと非常に相同性が高いことが本
発明によって明らかにされた（図７及び図８）。
質ｃＤＮＡクローンをプローブにして、ヒト褐色細胞腫
（ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ）のｃＤＮＡライ
ブラリーをプラークハイブリダイゼーション法でスクリ
ーニングして、ヒトＮｕｃ遺伝子のｃＤＮＡクローンも
得、そのうち最長の約１．５ＫｂのｃＤＮＡ断片（Ｅｃ
ｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片）をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ
ＫＭ１３＋のＥｃｏＲＩ部位にリクローニングし、ジデ
オキシ法によりその塩基配列更にはアミノ酸配列を決定
した。その構造はマウスと非常に相同性が高いことが本
発明によって明らかにされた（図７及び図８）。
【００６５】即ちヒトのｐ５５Ｎｕｃタンパク質遺伝子
を含む第２４番目の塩基から第１５９６番目の塩基まで
のＤＮＡ断片の塩基配列と、マウスｐ５５Ｎｕｃタンパ
ク質遺伝子を含む第３番目の塩基から第１５５３番目の
塩基までのＤＮＡ断片の塩基配列とは約９０％の高い相
同性があることが明らかにされた。またヒトｐ５５Ｎｕ
ｃタンパク質とマウスｐ５５Ｎｕｃタンパク質の上記塩
基配列に対応するアミノ酸配列は、ヒトでは４６０アミ
ノ酸残基よりなり、マウスでは４５５アミノ酸残基より
なること、ヒト−マウスのそのアミノ酸残基相同性（ｐ
ｅｒｃｅｎｔｉｄｅｎｔｉｔｙ）は約８７％、またその
アミノ酸残基相似性（ｐｅｒｃｅｎｔｓｉｍｉｌａｒｉ
ｔｙ）は約９３％であることが確認された。リーダーペ
プチドについては、ヒト、マウス間で変化は見られる
が、中央部分に疎水性コアが存在し、その直前に正に荷
電したアミノ酸であるアルギニンが、又Ｃ末端には側鎖
の短いアミノ酸であるアラニンが存在するためリーダー
ペプチドの機能は完全に有していると考えられる。
を含む第２４番目の塩基から第１５９６番目の塩基まで
のＤＮＡ断片の塩基配列と、マウスｐ５５Ｎｕｃタンパ
ク質遺伝子を含む第３番目の塩基から第１５５３番目の
塩基までのＤＮＡ断片の塩基配列とは約９０％の高い相
同性があることが明らかにされた。またヒトｐ５５Ｎｕ
ｃタンパク質とマウスｐ５５Ｎｕｃタンパク質の上記塩
基配列に対応するアミノ酸配列は、ヒトでは４６０アミ
ノ酸残基よりなり、マウスでは４５５アミノ酸残基より
なること、ヒト−マウスのそのアミノ酸残基相同性（ｐ
ｅｒｃｅｎｔｉｄｅｎｔｉｔｙ）は約８７％、またその
アミノ酸残基相似性（ｐｅｒｃｅｎｔｓｉｍｉｌａｒｉ
ｔｙ）は約９３％であることが確認された。リーダーペ
プチドについては、ヒト、マウス間で変化は見られる
が、中央部分に疎水性コアが存在し、その直前に正に荷
電したアミノ酸であるアルギニンが、又Ｃ末端には側鎖
の短いアミノ酸であるアラニンが存在するためリーダー
ペプチドの機能は完全に有していると考えられる。
【００６６】次いで、このヒトｐ５５タンパク質Ｎｕｃ
につき、リーダーペプチド切断後のマチュアなタンパク
質を大腸菌で生産した。即ち、Ｎ末端付近に対する合成
ＤＮＡ２７ｍｅｒを作製し、Ｔ７プライマーとの間でＰ
ＣＲ法を用いて増幅後、制限酵素ＮｃｏＩで切断し、λ
ＬｃｌベクターのＮｃｏＩ部位にクローニングした。こ
のヒトＮｕｃ ｃＤＮＡのＰＣＲを用いたＬｅｒｎｅｒ
ベクターへのリクローニングの方法を図９、図１０に示
す。そして、マウスＮｕｃ を大腸菌内で生産させた時
と同様、大腸菌をＬＢ＋アンピシリン培地等で培養し、
ヒトＮｕｃを生産・回収することができた。ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥでタンパクを分離・精製後、Ｐ．Ｍａｔｓｕｄａ
ｉｒａ法によりＮ末端のアミノ酸配列を調べるとＶＰＬ
ＥＲの５残基が検出でき、マチュアなタンパク質が大腸
菌内で生産させることができたと考えられる。
につき、リーダーペプチド切断後のマチュアなタンパク
質を大腸菌で生産した。即ち、Ｎ末端付近に対する合成
ＤＮＡ２７ｍｅｒを作製し、Ｔ７プライマーとの間でＰ
ＣＲ法を用いて増幅後、制限酵素ＮｃｏＩで切断し、λ
ＬｃｌベクターのＮｃｏＩ部位にクローニングした。こ
のヒトＮｕｃ ｃＤＮＡのＰＣＲを用いたＬｅｒｎｅｒ
ベクターへのリクローニングの方法を図９、図１０に示
す。そして、マウスＮｕｃ を大腸菌内で生産させた時
と同様、大腸菌をＬＢ＋アンピシリン培地等で培養し、
ヒトＮｕｃを生産・回収することができた。ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥでタンパクを分離・精製後、Ｐ．Ｍａｔｓｕｄａ
ｉｒａ法によりＮ末端のアミノ酸配列を調べるとＶＰＬ
ＥＲの５残基が検出でき、マチュアなタンパク質が大腸
菌内で生産させることができたと考えられる。
【００６７】かくして組換発現されたヒトＮｕｃタンパ
ク質及びマウスＮｕｃタンパク質を用い、様々な細胞生
物学的研究が進められる。Ｎｕｃは元来、自己免疫応答
増強物質として同定されたが、その化学構造から多様な
作用を持ち、又不特定多数の相手方とのヘテロダイマー
を形成する可能性がある。
ク質及びマウスＮｕｃタンパク質を用い、様々な細胞生
物学的研究が進められる。Ｎｕｃは元来、自己免疫応答
増強物質として同定されたが、その化学構造から多様な
作用を持ち、又不特定多数の相手方とのヘテロダイマー
を形成する可能性がある。
【００６８】実際、血清や細胞抽出液中に存在するＮｕ
ｃは本来の分子量５０，４１０よりもやや大きく、ロイ
シンジッパー部分を使って相手方の生体物質と結合して
いるものと考えられる。
ｃは本来の分子量５０，４１０よりもやや大きく、ロイ
シンジッパー部分を使って相手方の生体物質と結合して
いるものと考えられる。
【００６９】又ＤＮＡ結合能とシグナルペプチドの存在
は、細胞内に蓄積したヌクレオソームやＤＮＡ類のスカ
ベンジャーとして働いている可能性もあり、生体内の代
謝異常や細胞の老化、或はａｐｏｐｔｏｓｉｓ（ｐｒｏ
ｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌｄｅａｔｈ）との関連が指摘
される。
は、細胞内に蓄積したヌクレオソームやＤＮＡ類のスカ
ベンジャーとして働いている可能性もあり、生体内の代
謝異常や細胞の老化、或はａｐｏｐｔｏｓｉｓ（ｐｒｏ
ｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌｄｅａｔｈ）との関連が指摘
される。
【００７０】ＮｕｃはＢ細胞に直接作用し、その増殖と
分化を促進する他に、Ｔ細胞、マクロファージ、樹枝状
細胞等にも作用し、Ｂ細胞を増殖、分化に向かわせる種
々の因子を産生・誘導している。
分化を促進する他に、Ｔ細胞、マクロファージ、樹枝状
細胞等にも作用し、Ｂ細胞を増殖、分化に向かわせる種
々の因子を産生・誘導している。
【００７１】本発明により得られたマウス及びヒトのｐ
５５Ｎｕｃタンパク質の生物活性を担う活性中心部分ペ
プチドの特定の検討も行った。即ちマウスＮｕｃ産生用
プラスミドｍＮＵＣ−λＬｃｌをもとに、数種類の遺伝
子断片欠損変異クローンを作成した。即ちｍＮＵＣ−λ
Ｌｃｌプラスミドを制眼酵素Ｘｂａｌで切断後、Ｓｌヌ
クレアーゼで処理して、末端を揃え、制限酵素ＰｍａＣ
ＩあるいはＥｃｏ４７ＩＩＩで切断した。それらを個々
にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてセルフライゲーションさ
せ、大腸菌ＸＬｌ−ｂｌｕｅを形質転換してクローンと
した（この形質転換した大腸菌はｍＮＵＣ−ｄｅｌＢと
命名され、通商産業省工業技術院生物工業技術研究所に
預託されている《預託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１２５６
６、預託日：平成３年１０月１１日》）。次いで、マウ
スＮｕｃタンパク質を発現させるのと同様にして、大腸
菌を培養し、ＰｍａＣＩで切断したものは、ロイシンジ
ッパーを含めてＣ末端より１５７アミノ酸残基の欠失
（１９９番目から４５５番目まで欠失）が起こり、分子
量３２，６７４、等電点５．０８のタンパク質が生産
し、Ｎｕｃの場合と同様にして分離・精製した。このペ
プチド断片欠損変異タンパク質をＤｅｌＺと名づけた。
またＥｃｏ４７ ＩＩＩで切断したものは、Ｃ末端より
３３アミノ酸残基の欠失が起こり、分子量４４，８６
１、等電点４．８９のタンパク質を生産し、このペプチ
ド断片欠損変異タンパク質をＤｅｌＣと名づけた。尚Ｄ
ｅｌＺ，ＤｅｌＣ共に、終止コドンはλＬｃｌプラスミ
ド内のものを使用するため、終止コドンの一つ前のセリ
ンが余分につくことになった。ロイシンジッパー構造
は、二重体形成のモチーフと考えれらている（図１１、
図１３）。次いで、別の遺伝子断片欠損変異クローンの
作成のためのプラスミド構築の都合上、ＸｂａＩで切断
したｍＮＵＣ−λＬｃｌプラスミドを、更に制限酵素Ａ
ｃｃＩで切断し、その後Ｋｌｅｎｏｗ切断で末端を揃
え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてセルフライゲーション
させ、大腸菌ＸＬｌ−ｂｌｕｅを形質転換してｍＮＵＣ
−λＬｃｌプラスミドを構築した。そして、ＮｕｃのＤ
ＮＡ結合活性部分と考えられる塩基性アミノ酸領域を欠
いたタンパクを作製するために以下の操作を行った。ま
ず、塩基性アミノ酸領域直後に対するＰＣＲプライマー
を作成した。それはマウスＮｕｃのｃＤＮＡに対して１
８塩基の相補性を持ち、かつ制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳ
ａｃＩ部位を持たしたもので５’−ＧＣＧＡＧＣＴＣＧ
ＧＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧ−３’
の３１ｍｅｒである。
５５Ｎｕｃタンパク質の生物活性を担う活性中心部分ペ
プチドの特定の検討も行った。即ちマウスＮｕｃ産生用
プラスミドｍＮＵＣ−λＬｃｌをもとに、数種類の遺伝
子断片欠損変異クローンを作成した。即ちｍＮＵＣ−λ
Ｌｃｌプラスミドを制眼酵素Ｘｂａｌで切断後、Ｓｌヌ
クレアーゼで処理して、末端を揃え、制限酵素ＰｍａＣ
ＩあるいはＥｃｏ４７ＩＩＩで切断した。それらを個々
にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてセルフライゲーションさ
せ、大腸菌ＸＬｌ−ｂｌｕｅを形質転換してクローンと
した（この形質転換した大腸菌はｍＮＵＣ−ｄｅｌＢと
命名され、通商産業省工業技術院生物工業技術研究所に
預託されている《預託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１２５６
６、預託日：平成３年１０月１１日》）。次いで、マウ
スＮｕｃタンパク質を発現させるのと同様にして、大腸
菌を培養し、ＰｍａＣＩで切断したものは、ロイシンジ
ッパーを含めてＣ末端より１５７アミノ酸残基の欠失
（１９９番目から４５５番目まで欠失）が起こり、分子
量３２，６７４、等電点５．０８のタンパク質が生産
し、Ｎｕｃの場合と同様にして分離・精製した。このペ
プチド断片欠損変異タンパク質をＤｅｌＺと名づけた。
またＥｃｏ４７ ＩＩＩで切断したものは、Ｃ末端より
３３アミノ酸残基の欠失が起こり、分子量４４，８６
１、等電点４．８９のタンパク質を生産し、このペプチ
ド断片欠損変異タンパク質をＤｅｌＣと名づけた。尚Ｄ
ｅｌＺ，ＤｅｌＣ共に、終止コドンはλＬｃｌプラスミ
ド内のものを使用するため、終止コドンの一つ前のセリ
ンが余分につくことになった。ロイシンジッパー構造
は、二重体形成のモチーフと考えれらている（図１１、
図１３）。次いで、別の遺伝子断片欠損変異クローンの
作成のためのプラスミド構築の都合上、ＸｂａＩで切断
したｍＮＵＣ−λＬｃｌプラスミドを、更に制限酵素Ａ
ｃｃＩで切断し、その後Ｋｌｅｎｏｗ切断で末端を揃
え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてセルフライゲーション
させ、大腸菌ＸＬｌ−ｂｌｕｅを形質転換してｍＮＵＣ
−λＬｃｌプラスミドを構築した。そして、ＮｕｃのＤ
ＮＡ結合活性部分と考えられる塩基性アミノ酸領域を欠
いたタンパクを作製するために以下の操作を行った。ま
ず、塩基性アミノ酸領域直後に対するＰＣＲプライマー
を作成した。それはマウスＮｕｃのｃＤＮＡに対して１
８塩基の相補性を持ち、かつ制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳ
ａｃＩ部位を持たしたもので５’−ＧＣＧＡＧＣＴＣＧ
ＧＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧ−３’
の３１ｍｅｒである。
【００７２】その３１ｍｅｒと１７プライマー（５’−
ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’）を用い、
ｍＮＵＣ−λＬｃｌプラスミドを鋳型にして、ＰＣＲを
行った。その条件は９４℃ｌｍｉｎ．，５５℃２ｍｉ
ｎ．，７２℃３ｍｉｎ，２５回であった。ＰＣＲの産物
約０．９ＫｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｃＩ及びＸｂ
ａＩで切断し、λＬｃｌプラスミドを制限酵素ＳａｃＩ
及びＸｂａＩで切断したものにクローニングした。その
プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲｌ及びＢａｍＨＩで切断
し、そこにｍＮＵＣ−λＬｃｌプラスミドより切り出し
たＥｃｏＲｌ−Ｓａｕ３Ａｌ断片約０．５Ｋｂをクロー
ニングした。
ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’）を用い、
ｍＮＵＣ−λＬｃｌプラスミドを鋳型にして、ＰＣＲを
行った。その条件は９４℃ｌｍｉｎ．，５５℃２ｍｉ
ｎ．，７２℃３ｍｉｎ，２５回であった。ＰＣＲの産物
約０．９ＫｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｃＩ及びＸｂ
ａＩで切断し、λＬｃｌプラスミドを制限酵素ＳａｃＩ
及びＸｂａＩで切断したものにクローニングした。その
プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲｌ及びＢａｍＨＩで切断
し、そこにｍＮＵＣ−λＬｃｌプラスミドより切り出し
たＥｃｏＲｌ−Ｓａｕ３Ａｌ断片約０．５Ｋｂをクロー
ニングした。
【００７３】かくして塩基性アミノ酸領域に対応する遺
伝子断片欠損変異クローンを得た。このクローンを形質
転換した大腸菌を培養し、塩基性アミノ酸領域６４アミ
ノ酸残基の欠失（１５８番目から２２０番目までの欠
失）した分子量４２，５２８、等電点４．５３のタンパ
ク質が生産され、このペプチド断片欠損変異タンパク質
をＤｅｌＢと名づけた（図１２、図１３）。
伝子断片欠損変異クローンを得た。このクローンを形質
転換した大腸菌を培養し、塩基性アミノ酸領域６４アミ
ノ酸残基の欠失（１５８番目から２２０番目までの欠
失）した分子量４２，５２８、等電点４．５３のタンパ
ク質が生産され、このペプチド断片欠損変異タンパク質
をＤｅｌＢと名づけた（図１２、図１３）。
【００７４】これら変異タンパク質と組換発現Ｎｕｃタ
ンパク質の生物活性をＭＲＬ／ｌマウスのＢ細胞のＩｇ
Ｇ型の抗ＤＮＡ抗体産生、ＩｇＭ及びＩｇＧ抗体、そし
てＢ細胞の増殖につき比較した結果を第１４図に示す。
Ｎｕｃは多様な生物活性を持つが、ロイシンジッパーの
欠損で細胞増殖、ＩｇＭ産生、ＩｇＧ産生の誘導が大き
く損なわれた。また塩基性ペプチド部分の欠損により細
胞増殖やＩｇＭ産生に対するＮｕｃの効果は減弱した。
Ｎｕｃの様々な生物活性に、塩基性ペプチド部分及び特
にロイシンジッパー部分構造の役割は必須のようであっ
た。これらペプチド断片欠損変異タンパク質原末は組換
発現Ｎｕｃタンパク質原末同様に、ＮＭＲ解析あるいは
結晶化してＸ線解折等によるタンパク質の高次構造の決
定に役立つものと考えられる。
ンパク質の生物活性をＭＲＬ／ｌマウスのＢ細胞のＩｇ
Ｇ型の抗ＤＮＡ抗体産生、ＩｇＭ及びＩｇＧ抗体、そし
てＢ細胞の増殖につき比較した結果を第１４図に示す。
Ｎｕｃは多様な生物活性を持つが、ロイシンジッパーの
欠損で細胞増殖、ＩｇＭ産生、ＩｇＧ産生の誘導が大き
く損なわれた。また塩基性ペプチド部分の欠損により細
胞増殖やＩｇＭ産生に対するＮｕｃの効果は減弱した。
Ｎｕｃの様々な生物活性に、塩基性ペプチド部分及び特
にロイシンジッパー部分構造の役割は必須のようであっ
た。これらペプチド断片欠損変異タンパク質原末は組換
発現Ｎｕｃタンパク質原末同様に、ＮＭＲ解析あるいは
結晶化してＸ線解折等によるタンパク質の高次構造の決
定に役立つものと考えられる。
【００７５】本発明により、マウス、ヒト等より検出分
離、精製されあるいはその遺伝子がクローニングされ、
さらに大腸菌等で発現・生産され、アミノ酸配列が明ら
かにされたマウス、ヒト等の本増強因子タンパク質（Ｎ
ｕｃ）は、このタンパク質を抗原として、生体中に産生
・存在する本増強因子に対する抗体を測定するための、
抗体測定用、抗原タンパク質として使用できる。またポ
リクローナル抗体、モノクローナル抗体作製用の抗原と
して利用できる。特にヒトＮｕｃに対するウサギ、ウマ
等のポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、
更にヒト型のモノクローナル抗体を常法により作製し、
それらを用いて、ＲＩＡ，ＥＩＡ，あるいはＦＩＡ等の
測定系を作り、例えば自己免疫疾患患者および動物の血
中、組織細胞内外の本増強因子タンパク質Ｎｕｃの定量
を行うことができ、それによって各種疾患、例えばヒト
の自己免疫疾患、免疫不全症、代謝性疾患、遺伝疾患、
癌等の病態を把握、診断することが可能となる。また自
己免疫疾患患者および動物等の治療に、本ポリクローナ
ル抗体、モノクローナル抗体は適応できる。
離、精製されあるいはその遺伝子がクローニングされ、
さらに大腸菌等で発現・生産され、アミノ酸配列が明ら
かにされたマウス、ヒト等の本増強因子タンパク質（Ｎ
ｕｃ）は、このタンパク質を抗原として、生体中に産生
・存在する本増強因子に対する抗体を測定するための、
抗体測定用、抗原タンパク質として使用できる。またポ
リクローナル抗体、モノクローナル抗体作製用の抗原と
して利用できる。特にヒトＮｕｃに対するウサギ、ウマ
等のポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、
更にヒト型のモノクローナル抗体を常法により作製し、
それらを用いて、ＲＩＡ，ＥＩＡ，あるいはＦＩＡ等の
測定系を作り、例えば自己免疫疾患患者および動物の血
中、組織細胞内外の本増強因子タンパク質Ｎｕｃの定量
を行うことができ、それによって各種疾患、例えばヒト
の自己免疫疾患、免疫不全症、代謝性疾患、遺伝疾患、
癌等の病態を把握、診断することが可能となる。また自
己免疫疾患患者および動物等の治療に、本ポリクローナ
ル抗体、モノクローナル抗体は適応できる。
【００７６】一方また本発明によってマウスおよびヒト
から単離された、ｐ５５Ｎｕｃタンパク質遺伝子ＤＮＡ
断片またはその一部のＤＮＡ断片、あるいはｐ５５Ｎｕ
ｃタンパク質遺伝子を含むより大きなＤＮＡ断片をプロ
ーブとして用い、ヒト、動物の各臓器の組織・細胞、Ｈ
Ｌ−６０やＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等のヒト、
動物由来細胞、血液・体液等ヒト及び各種動植物、微生
物類のｐ５５Ｎｕｃタンパク質と同様の機能を有するか
又は有しないタンパク質類をコードする遺伝子ＤＮＡ断
片、あるいは該遺伝子を含むより大きなＤＮＡ断片を、
ハイブリダイゼーション法により単離することが可能と
なった。
から単離された、ｐ５５Ｎｕｃタンパク質遺伝子ＤＮＡ
断片またはその一部のＤＮＡ断片、あるいはｐ５５Ｎｕ
ｃタンパク質遺伝子を含むより大きなＤＮＡ断片をプロ
ーブとして用い、ヒト、動物の各臓器の組織・細胞、Ｈ
Ｌ−６０やＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等のヒト、
動物由来細胞、血液・体液等ヒト及び各種動植物、微生
物類のｐ５５Ｎｕｃタンパク質と同様の機能を有するか
又は有しないタンパク質類をコードする遺伝子ＤＮＡ断
片、あるいは該遺伝子を含むより大きなＤＮＡ断片を、
ハイブリダイゼーション法により単離することが可能と
なった。
【００７７】更にまた、本発明によって明らかにされた
ヒト及びマウスのｐ５５Ｎｕｃタンパク質遺伝子の塩基
配列の任意の一部を選択して、ＰＣＲ用のＤＮＡプライ
マーを合成して、該プライマーを用いて未知の、各種動
植物、微生物類の遺伝子を増幅合成、単離することも可
能となった。これらの技術も本発明の範囲に包含され
る。
ヒト及びマウスのｐ５５Ｎｕｃタンパク質遺伝子の塩基
配列の任意の一部を選択して、ＰＣＲ用のＤＮＡプライ
マーを合成して、該プライマーを用いて未知の、各種動
植物、微生物類の遺伝子を増幅合成、単離することも可
能となった。これらの技術も本発明の範囲に包含され
る。
【００７８】以下本発明を実施例をもって詳細に説明す
るが、本発明はこれらに限定はされない。
るが、本発明はこれらに限定はされない。
【００７９】
【実施例１】 （ａ）．ＫＭＬ１−７細胞培養上清の大量採取 先ず２５ｃｍ２フラスコ（コーニング、２５１００）に
て完全培地５％牛胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ
ｓｅｒｕｍ，以下ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、１０
ｍＭヘペス、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマ
イシン１００μｇ／ｍｌ、５０μＭ ２−ＭＥ（メルカ
プトエタノール）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ［ＤＭＥＭ］）
（ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）下で，ＫＭＬ１−７細胞を培養
し、コンフルエント（〜１０６／ｍｌ）とした。次に、
７５ｃｍ２フラスコ（コーニング、２５１１０）で拡大
培養した。ついでＫＭＬ１−７細胞を遠心にて集め、無
血清培地（ハイメディム６０６、コージン）に浮遊させ
た（４×１０６ｃｅｌｌｓ／３２ｍｌ）。次に６０ｍｌ
のハイメディウムを含む大型フラスコ（１５６５０２，
ヌンク）に各々１ｍｌ（１．２５×１０７ｃｅｌｌｓ）
を浮遊させ、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２，３
７℃）中で３日間培養した。次に３，０００回転、１５
分の遠心で培養上清を集め、直ちにセリンプロテアーゼ
阻害剤ＰＭＳＦ を０．５ｍＭになるように加えた後、
ステリベックス フィルター（０．２２ミクロン）にて
ろ過し、続いて限外ろ過膜、ＰＭ−１０を用いて約２０
０〜２５０倍に濃縮した。培養上清を集めたときと同様
に遠心・無菌ろ過を行ない、この段階で幾つかのバッチ
を集め、次の精製ステップに進んだ。行ない、この段階
で幾つかのバッチを集め、次の精製ステップに進んだ。
て完全培地５％牛胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ
ｓｅｒｕｍ，以下ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、１０
ｍＭヘペス、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマ
イシン１００μｇ／ｍｌ、５０μＭ ２−ＭＥ（メルカ
プトエタノール）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ［ＤＭＥＭ］）
（ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）下で，ＫＭＬ１−７細胞を培養
し、コンフルエント（〜１０６／ｍｌ）とした。次に、
７５ｃｍ２フラスコ（コーニング、２５１１０）で拡大
培養した。ついでＫＭＬ１−７細胞を遠心にて集め、無
血清培地（ハイメディム６０６、コージン）に浮遊させ
た（４×１０６ｃｅｌｌｓ／３２ｍｌ）。次に６０ｍｌ
のハイメディウムを含む大型フラスコ（１５６５０２，
ヌンク）に各々１ｍｌ（１．２５×１０７ｃｅｌｌｓ）
を浮遊させ、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２，３
７℃）中で３日間培養した。次に３，０００回転、１５
分の遠心で培養上清を集め、直ちにセリンプロテアーゼ
阻害剤ＰＭＳＦ を０．５ｍＭになるように加えた後、
ステリベックス フィルター（０．２２ミクロン）にて
ろ過し、続いて限外ろ過膜、ＰＭ−１０を用いて約２０
０〜２５０倍に濃縮した。培養上清を集めたときと同様
に遠心・無菌ろ過を行ない、この段階で幾つかのバッチ
を集め、次の精製ステップに進んだ。行ない、この段階
で幾つかのバッチを集め、次の精製ステップに進んだ。
【００８０】（ｂ）．ゲルろ過法によるＤＮＡ抗体産生
増強因子の分離 １００〜１５０倍に濃縮した培養上清２ｍｌを２．０×
５５ｃｍのＡｃＡ５４カラム［（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／
１００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液）（ｐＨ８．０）…以下Ａ
液と略記する）にて平衡化したもの］にかけ２ｍｌずつ
採取し、増強活性画分の溶出部位を決定した。
増強因子の分離 １００〜１５０倍に濃縮した培養上清２ｍｌを２．０×
５５ｃｍのＡｃＡ５４カラム［（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／
１００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液）（ｐＨ８．０）…以下Ａ
液と略記する）にて平衡化したもの］にかけ２ｍｌずつ
採取し、増強活性画分の溶出部位を決定した。
【００８１】（ｃ）．陰イオン交換カラムクロマトグラ
フィーによる増強因子の分離 先ずＤＥＡＥ−ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−５０をＡ液にて
平衡化した後、１×１４ｃｍのカラムを作製し、これに
（ｂ）で得られた活性画分をチャージし、Ａ液にてカラ
ムを洗浄し、Ａ２８０が０．１以下になった時点で、増
強活性画分をＡ液中のＮａＣｌが１００ｍＭから６００
ｍＭになるように濃度勾配をかけて分離、溶出した。
フィーによる増強因子の分離 先ずＤＥＡＥ−ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−５０をＡ液にて
平衡化した後、１×１４ｃｍのカラムを作製し、これに
（ｂ）で得られた活性画分をチャージし、Ａ液にてカラ
ムを洗浄し、Ａ２８０が０．１以下になった時点で、増
強活性画分をＡ液中のＮａＣｌが１００ｍＭから６００
ｍＭになるように濃度勾配をかけて分離、溶出した。
【００８２】（ｄ）．増強因子のヘパリンカラム処理
（ｃ）にて得られた増強物質を含む画分をＡ液にて活性
化したヘパリンカラム（１×１０ｃｍ）にチャージし、
増強物質のヘパリンへの吸着性の有無をＡ２８０によっ
て調べた。
（ｃ）にて得られた増強物質を含む画分をＡ液にて活性
化したヘパリンカラム（１×１０ｃｍ）にチャージし、
増強物質のヘパリンへの吸着性の有無をＡ２８０によっ
て調べた。
【００８３】（ｅ）．増強因子のＨＰＬＣによる分離精
製 ０．０５％トリフルオロ酢酸と７％のアセトニトリルを
含む溶液にて逆相カラムＰｈｅｎｙｌ ５ＰＷＲＰを平
衡化した後、（ｄ）にて行ったヘパリンカラム処理増強
物資をインジェクトした後、７％アセトニトリルで溶出
後、７０％までのアセトニトリル濃度勾配にて増強物質
の単離を行なった。
製 ０．０５％トリフルオロ酢酸と７％のアセトニトリルを
含む溶液にて逆相カラムＰｈｅｎｙｌ ５ＰＷＲＰを平
衡化した後、（ｄ）にて行ったヘパリンカラム処理増強
物資をインジェクトした後、７％アセトニトリルで溶出
後、７０％までのアセトニトリル濃度勾配にて増強物質
の単離を行なった。
【００８４】（ｆ）．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （ｅ）によって得られた単一ピークをＳＤＳ加１２％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に
て分析し、その純度を銀染色にて調べた。
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に
て分析し、その純度を銀染色にて調べた。
【００８５】（ｇ）．等電点分画（ｅ）で得られた単一
ピークをＰｈａｓｔ Ｇｅｌ（ＩＥＦ ３〜９Ｇｅｌ
ｓｅｔ）にかけ等電点を調べた。
ピークをＰｈａｓｔ Ｇｅｌ（ＩＥＦ ３〜９Ｇｅｌ
ｓｅｔ）にかけ等電点を調べた。
【００８６】（ｈ）．増強因子活性測定のための反応系 （１）ＭＲＬ／ｌマウス脾細胞浮遊液を用いる反応系 ４〜６月齢のＭＲＬ／ｌマウスの脾細胞をＨａｎｋ’ｓ
ＢａｌａｎｃｅｄＳａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（以下
ＨＢＳＳと略記する。）中で単一浮遊細胞とした後、５
％ＦＢＳ−ＤＭＥＭにて２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに
調製し、増強因子を含む検体を加え４８穴のクラスター
デッシュで４日間培養し、その上清中の抗ＤＮＡ抗体を
以下に述べる方法にて測定した。
ＢａｌａｎｃｅｄＳａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（以下
ＨＢＳＳと略記する。）中で単一浮遊細胞とした後、５
％ＦＢＳ−ＤＭＥＭにて２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに
調製し、増強因子を含む検体を加え４８穴のクラスター
デッシュで４日間培養し、その上清中の抗ＤＮＡ抗体を
以下に述べる方法にて測定した。
【００８７】（２）正常マウスの脾細胞浮遊液を用いる
反応系 雌１０週齢のＢＡＬＢ／ｃをあらかじめｓｓＤＮＡでプ
ライムし、５〜７日後に脾細胞をＨＢＳＳで単一浮遊細
胞とし、（ｈ）−（１）と同様に培養した後、ｓｓＤＮ
ＡをコートしたＳＲＢＣターゲットとしたプラークフォ
ーミング細胞（以下ＰＦＣと略記する。）（後述）を算
定した。
反応系 雌１０週齢のＢＡＬＢ／ｃをあらかじめｓｓＤＮＡでプ
ライムし、５〜７日後に脾細胞をＨＢＳＳで単一浮遊細
胞とし、（ｈ）−（１）と同様に培養した後、ｓｓＤＮ
ＡをコートしたＳＲＢＣターゲットとしたプラークフォ
ーミング細胞（以下ＰＦＣと略記する。）（後述）を算
定した。
【００８８】（ｉ）．増強活性測定法 ＥＬＩＳＡ法 イムロンＮｏ．１ポリスチレン製の９６穴のプレートを
１６時間殺菌燈にさらした後、直ちに１μｇ／ｍｌの一
本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ（仔牛胸線由来）を５０μｌ加え、
室温で２時間孵置した。次に５％ＦＢＳを０．０５％の
Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にてＤＮＡ
の未吸着部位を遮断し、抗原付着プレートとした。
（ｈ）−（１）で得られた培養上清を非働化した後、抗
原付着プレートに５０μｌ加え、型の如く抗原に結合し
た抗体をクラス別にアルカリフォスファターゼ標準二次
抗体で測定した。
１６時間殺菌燈にさらした後、直ちに１μｇ／ｍｌの一
本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ（仔牛胸線由来）を５０μｌ加え、
室温で２時間孵置した。次に５％ＦＢＳを０．０５％の
Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にてＤＮＡ
の未吸着部位を遮断し、抗原付着プレートとした。
（ｈ）−（１）で得られた培養上清を非働化した後、抗
原付着プレートに５０μｌ加え、型の如く抗原に結合し
た抗体をクラス別にアルカリフォスファターゼ標準二次
抗体で測定した。
【００８９】（２）ＰＦＣ クロミウムクロライド法でＳＲＢＣにｓｓＤＮＡをコー
トし、カニンガムの方法で抗ｓｓＤＮＡＰＦＣを算定し
た。この系で最大ＰＦＣの５０％を与える増強活性を１
単位とし、検体の活性を総合単位で表示した。
トし、カニンガムの方法で抗ｓｓＤＮＡＰＦＣを算定し
た。この系で最大ＰＦＣの５０％を与える増強活性を１
単位とし、検体の活性を総合単位で表示した。
【００９０】
【実施例２】 （ａ）．増強因子マウスＮｕｃタンパク質のアミノ酸配
列シークエンシング ＨＰＬＣを用いて精製し、更に乾燥させたｐ５５タンパ
ク質標品７μｇを、５０μｌの８Ｍ尿素に溶解し、３７
℃で１５分保温し、ついで５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ９．０）１５０μｌを加え、しかる後Ａｃｈ
ｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉ即ち、リ
ジルエンドペプチダーゼ（Ｍａｓａｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａ
ｌ；Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４２，１４４
３，１９７８）を１０ｎｇ加え３７℃で一夜分解した。
その分解物をＳｙｎｃｈｒｏｐａｃｋ ＲＰ−８カラム
を用いてＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ４９０）を行い、ト
リフルオロ酢酸−アセトニトリル（０−６０％の濃度勾
配）系で分離した。得られた２つのペプチド断片につい
て、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ４７０Ａ
ｏｎ−ｌｉｎｅ １２０Ａ ＰＴＨアミノ酸アナライザ
ーでアミノ酸配列を決定した。ペプチド断片１はＱＦＥ
ＨＬＤＰＱＮＱＥＴＦＥＡＩＤＬＥＬ、ペプチド断片２
はＬＳＱＥＬＤＦＶＳＨＮＶＲＴＫであった。
列シークエンシング ＨＰＬＣを用いて精製し、更に乾燥させたｐ５５タンパ
ク質標品７μｇを、５０μｌの８Ｍ尿素に溶解し、３７
℃で１５分保温し、ついで５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ９．０）１５０μｌを加え、しかる後Ａｃｈ
ｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉ即ち、リ
ジルエンドペプチダーゼ（Ｍａｓａｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａ
ｌ；Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４２，１４４
３，１９７８）を１０ｎｇ加え３７℃で一夜分解した。
その分解物をＳｙｎｃｈｒｏｐａｃｋ ＲＰ−８カラム
を用いてＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ４９０）を行い、ト
リフルオロ酢酸−アセトニトリル（０−６０％の濃度勾
配）系で分離した。得られた２つのペプチド断片につい
て、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ４７０Ａ
ｏｎ−ｌｉｎｅ １２０Ａ ＰＴＨアミノ酸アナライザ
ーでアミノ酸配列を決定した。ペプチド断片１はＱＦＥ
ＨＬＤＰＱＮＱＥＴＦＥＡＩＤＬＥＬ、ペプチド断片２
はＬＳＱＥＬＤＦＶＳＨＮＶＲＴＫであった。
【００９１】（ｂ）．ＰＣＲ増幅用プライマーの合成 ペプチド１について、その両端に位置する７アミノ酸
（ＱＦＥＨＬＤＰ及びＥＡＩＤＬＥＬ）をコードできる
２０塩基からなる２種類のプライマーＮ及びＣを公知の
常法を用いて合成した。
（ＱＦＥＨＬＤＰ及びＥＡＩＤＬＥＬ）をコードできる
２０塩基からなる２種類のプライマーＮ及びＣを公知の
常法を用いて合成した。
【００９２】（ｃ）．ＫＭＬ１−７細胞のｃＤＮＡライ
ブラリー作製 ＫＭＬ１−７細胞よりＣｈｉｒｇｕｉｎらの方法（Ｃｈ
ｉｒｇｕｉｎ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ；Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，１８，５２９４，１９７９）に従い、全ＲＮ
Ａをグアニジンイソチオシアナート−セシウムクロリド
を使った方法で調製した。ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡはＡ
ｖｉｖ ＆ Ｌｅｄｅｒの方法（Ａｖｉｖ，Ｈ．ｅｔ
ａｌ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３４，７４３，１９
７２）に従ってｏｌｉｇｏ（ｄＴ）セルロースカラムを
数回通して精製した。ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ０．５μ
ｇ、５×ＭＭＬＶ緩衝液（０．２５Ｍトリス−塩酸、ｐ
Ｈ８．３，０．３７５Ｍ塩化カリウム、１５ｍＭ塩化マ
グネシウム、５０ｍＭジチオスレイトール）、１０ｍＭ
ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ）及びｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを水に加え、Ｓ
ｔｒａｔａ ＧｅｎｅｃＤＮＡ合成キットを用いてｃＤ
ＮＡを合成した。このｃＤＮＡを分別してλｇｔｌｌア
ームにライゲーションした。ｃＤＮＡとλｇｔｌｌアー
ムからラムダファージパッケージング抽出液（ギガパッ
クゴールドＩＩ−ストラタジーン社製）を使用してリコ
ンビナントファージのライブラリーを作製した。
ブラリー作製 ＫＭＬ１−７細胞よりＣｈｉｒｇｕｉｎらの方法（Ｃｈ
ｉｒｇｕｉｎ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ；Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，１８，５２９４，１９７９）に従い、全ＲＮ
Ａをグアニジンイソチオシアナート−セシウムクロリド
を使った方法で調製した。ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡはＡ
ｖｉｖ ＆ Ｌｅｄｅｒの方法（Ａｖｉｖ，Ｈ．ｅｔ
ａｌ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３４，７４３，１９
７２）に従ってｏｌｉｇｏ（ｄＴ）セルロースカラムを
数回通して精製した。ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ０．５μ
ｇ、５×ＭＭＬＶ緩衝液（０．２５Ｍトリス−塩酸、ｐ
Ｈ８．３，０．３７５Ｍ塩化カリウム、１５ｍＭ塩化マ
グネシウム、５０ｍＭジチオスレイトール）、１０ｍＭ
ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ）及びｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを水に加え、Ｓ
ｔｒａｔａ ＧｅｎｅｃＤＮＡ合成キットを用いてｃＤ
ＮＡを合成した。このｃＤＮＡを分別してλｇｔｌｌア
ームにライゲーションした。ｃＤＮＡとλｇｔｌｌアー
ムからラムダファージパッケージング抽出液（ギガパッ
クゴールドＩＩ−ストラタジーン社製）を使用してリコ
ンビナントファージのライブラリーを作製した。
【００９３】（ｄ）．ＰＣＲ増幅 Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡＴｈ
ｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用して、ＰＣＲを行っ
た。増幅条件はｄｅｎａｔｕｒｅに９４℃１分→ａｎｎ
ｅａｌｉｎｇに３７℃ ２分→ｅｘｔｅｎｓｉｏｎに７
２℃３０秒で４０サイクル行い、反応液にエタノールを
加え増幅ＤＮＡを沈殿させた。
ｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用して、ＰＣＲを行っ
た。増幅条件はｄｅｎａｔｕｒｅに９４℃１分→ａｎｎ
ｅａｌｉｎｇに３７℃ ２分→ｅｘｔｅｎｓｉｏｎに７
２℃３０秒で４０サイクル行い、反応液にエタノールを
加え増幅ＤＮＡを沈殿させた。
【００９４】（ｅ）．ＤＮＡの精製 （ｄ）で得たＤＮＡをバッファーにとかし、１０％ポリ
アクリルアミドゲルを用いた電気泳動にかけ（ＰＡＧ
Ｅ）、６０塩基近傍のゲルを切り出し、２００μｌのＴ
Ｅ緩衝液を加え、時々振とうしＤＮＡを溶出させた。
アクリルアミドゲルを用いた電気泳動にかけ（ＰＡＧ
Ｅ）、６０塩基近傍のゲルを切り出し、２００μｌのＴ
Ｅ緩衝液を加え、時々振とうしＤＮＡを溶出させた。
【００９５】（ｆ）．再ＰＣＲ （ｅ）で得たＤＮＡを再度、（ｄ）と同様にしてＰＣＲ
増幅した。
増幅した。
【００９６】（ｇ）．ＤＮＡの精製 （ｅ）と同様にＰＡＧＥを行い、（ｅ）同様６０塩基近
傍のゲルを切り出し、２００μｌのＴＥ緩衝液を加え、
ＤＮＡを溶出させた。そしてフェノールとエーテルで処
理し、その後ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。このエ
タノールペレットを１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、ポ
リヌクレオチドキナーゼと［γ−３２ｐ］ＡＴＰでＤＮ
Ａ末端を標識化した。
傍のゲルを切り出し、２００μｌのＴＥ緩衝液を加え、
ＤＮＡを溶出させた。そしてフェノールとエーテルで処
理し、その後ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。このエ
タノールペレットを１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、ポ
リヌクレオチドキナーゼと［γ−３２ｐ］ＡＴＰでＤＮ
Ａ末端を標識化した。
【００９７】ついでシークエンスゲルでＰＡＧＥを行
い、５９塩基対のゲル部分を単離し、２００μｌのＴＥ
緩衝液に溶出した。
い、５９塩基対のゲル部分を単離し、２００μｌのＴＥ
緩衝液に溶出した。
【００９８】（ｈ）．再再度ＰＣＲ （ｇ）で得たＤＮＡ溶液を用いて、再再度ＰＣＲを行っ
た。
た。
【００９９】（ｉ）．ＤＮＡプローブの精製 （ｈ）で得たＰＣＲ産物をＰＡＧＥで分離し、主要バン
ドを４００μｌのＴＥ緩衝液に溶出した。（ｇ）と同様
にフェノールとエーテルで処理し、その後ＤＮＡをエタ
ノールで沈殿させた。ＤＮＡペレットを１０μｌのＴＥ
緩衝液に溶かした。
ドを４００μｌのＴＥ緩衝液に溶出した。（ｇ）と同様
にフェノールとエーテルで処理し、その後ＤＮＡをエタ
ノールで沈殿させた。ＤＮＡペレットを１０μｌのＴＥ
緩衝液に溶かした。
【０１００】（ｊ）．ＤＮＡプローブの塩基配列決定 （ｉ）で得たＤＮＡを常法によりＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫＭ１３＋にｌｉｇａｔｅして、一本鎖ＤＮＡを調製
し、ジデオキシ法でシークエンシングを行った。
ＳＫＭ１３＋にｌｉｇａｔｅして、一本鎖ＤＮＡを調製
し、ジデオキシ法でシークエンシングを行った。
【０１０１】（ｋ）．アマーシャムｃＤＮＡ合成キット
によるｃＤＮＡライブラリー作製 （ｃ）で得たＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ ５μｇを逆転写
酵素により、第１ｃＤＮＡを合成した。ついでＤＮＡポ
リメラーゼＩとＲＮａｓｅＨを用いて第２ｃＤＮＡを合
成した。そしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、さら
にＥｃｏＲＩメチラーゼで処理した。ＥｃｏＲＩリンカ
ーをｃＤＮＡにｌｉｇａｔｅし、その後ＥｃｏＲＩで水
解した。このｃＤＮＡをセファデックスＧ−１５０でゲ
ルろ過して分別し、λｇｔ１０アームにライゲーション
した。ついでラムダファージパッケージング抽出液を使
用してリコンビナントファージライブラリーを作製し
た。
によるｃＤＮＡライブラリー作製 （ｃ）で得たＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ ５μｇを逆転写
酵素により、第１ｃＤＮＡを合成した。ついでＤＮＡポ
リメラーゼＩとＲＮａｓｅＨを用いて第２ｃＤＮＡを合
成した。そしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、さら
にＥｃｏＲＩメチラーゼで処理した。ＥｃｏＲＩリンカ
ーをｃＤＮＡにｌｉｇａｔｅし、その後ＥｃｏＲＩで水
解した。このｃＤＮＡをセファデックスＧ−１５０でゲ
ルろ過して分別し、λｇｔ１０アームにライゲーション
した。ついでラムダファージパッケージング抽出液を使
用してリコンビナントファージライブラリーを作製し
た。
【０１０２】（ｌ）．５９塩基プローブによるプラーク
ハイブリダイゼーション （ｊ）の結果に基づき、５’ＡＧ（ＣＴ）ＴＣ（ＣＧ）
ＡＧ（ＧＡ）ＴＣ（ＧＡ）ＡＴ（ＧＡ）ＧＣ（ＣＴ）Ｔ
ＣＡＡＡＣＧＴＧＴＧＣＴＧＧＴＴＣＴＧＡＧＧ（Ｇ
Ａ）ＴＣ（ＣＧ）ＡＧ（ＧＡ）ＴＧ（ＣＴ）ＴＣ（Ｇ
Ａ）ＡＡ（ＣＴ）ＴＧ３’の配列をもつＤＮＡプローブ
を合成した。（ｋ）．で得たｃＤＮＡライブラリーか
ら、このプローブを用いてプラークハイブリダイゼーシ
ョンを行い、陽性クローンを選別し、増殖させ、Ｂｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＭ１３＋にリクローニングし（Ｓ
Ｋ−ｃＤＮＡ）、ＤＮＡのシークエンシングを行った。
そして３’末端にポリＡ部分を含む２１５９塩基の配列
が決定された。図５に塩基配列を示すが、ＡＴＧに始ま
り、ＴＡＡで終る４５５アミノ酸をコードできるｏｐｅ
ｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅが存在することが明ら
かになった。対応するアミノ酸配列も示す。
ハイブリダイゼーション （ｊ）の結果に基づき、５’ＡＧ（ＣＴ）ＴＣ（ＣＧ）
ＡＧ（ＧＡ）ＴＣ（ＧＡ）ＡＴ（ＧＡ）ＧＣ（ＣＴ）Ｔ
ＣＡＡＡＣＧＴＧＴＧＣＴＧＧＴＴＣＴＧＡＧＧ（Ｇ
Ａ）ＴＣ（ＣＧ）ＡＧ（ＧＡ）ＴＧ（ＣＴ）ＴＣ（Ｇ
Ａ）ＡＡ（ＣＴ）ＴＧ３’の配列をもつＤＮＡプローブ
を合成した。（ｋ）．で得たｃＤＮＡライブラリーか
ら、このプローブを用いてプラークハイブリダイゼーシ
ョンを行い、陽性クローンを選別し、増殖させ、Ｂｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＭ１３＋にリクローニングし（Ｓ
Ｋ−ｃＤＮＡ）、ＤＮＡのシークエンシングを行った。
そして３’末端にポリＡ部分を含む２１５９塩基の配列
が決定された。図５に塩基配列を示すが、ＡＴＧに始ま
り、ＴＡＡで終る４５５アミノ酸をコードできるｏｐｅ
ｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅが存在することが明ら
かになった。対応するアミノ酸配列も示す。
【０１０３】
【実施例３】 本増強因子ｐ５５マウスＮｕｃタンパク質の大腸菌での
生産 （ａ）実施例２の（ｌ）で得たＳＫ−ｃＤＮＡを鋳型と
して、ｐ５５マウスＮｕｃタンパク質のＮ末端付近に相
当する２７ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（第６図）をプ
ライマーとして合成し、これとＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫＭ １３＋中のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプライマ
ー（５’ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ３’）と
を組み合わせＰＣＲを行なった。９４℃１分→５５℃２
分→７２℃３分の反応を２０サイクル行い、ＰＣＲ産物
を得た。これをフェノールとエーテルで処理し、次にエ
タノールでＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡペレットを２０
μｌのＴＥ緩衝液に溶かし、 ＮｃｏＩで消化後、アガ
ロース電気泳動を行ない、２．２Ｋ塩基のバンドを切り
出し、１０μｌのＴＥ緩衝液に溶出した。この２．２Ｋ
のＤＮＡ断片をＬｅｒｎｅｒベクターλＬｃｌにｌｉｇ
ａｔｅし、大腸菌ＸＬｌ−ｂｌｕｅにトランスフォーム
した。この大腸菌Ｍｐ５５マウスＮｕｃ ｃＤＮＡ（Ｘ
Ｌｌ−ｂｌｕｅ／λＬｃｌ−ｃＤＮＡ）［通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所に、ブタペスト条約に基
いて寄託されている（寄託番号：ＦＥＲＭＢＰ−３１７
０ 寄託日：平成２年１１月２２日）。］をＬＢ−Ａｍ
ｐ培地（アンピシリンを５０ｍｇ／ｌ含有）中、３０℃
で培養、増殖させた。
生産 （ａ）実施例２の（ｌ）で得たＳＫ−ｃＤＮＡを鋳型と
して、ｐ５５マウスＮｕｃタンパク質のＮ末端付近に相
当する２７ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（第６図）をプ
ライマーとして合成し、これとＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫＭ １３＋中のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプライマ
ー（５’ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ３’）と
を組み合わせＰＣＲを行なった。９４℃１分→５５℃２
分→７２℃３分の反応を２０サイクル行い、ＰＣＲ産物
を得た。これをフェノールとエーテルで処理し、次にエ
タノールでＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡペレットを２０
μｌのＴＥ緩衝液に溶かし、 ＮｃｏＩで消化後、アガ
ロース電気泳動を行ない、２．２Ｋ塩基のバンドを切り
出し、１０μｌのＴＥ緩衝液に溶出した。この２．２Ｋ
のＤＮＡ断片をＬｅｒｎｅｒベクターλＬｃｌにｌｉｇ
ａｔｅし、大腸菌ＸＬｌ−ｂｌｕｅにトランスフォーム
した。この大腸菌Ｍｐ５５マウスＮｕｃ ｃＤＮＡ（Ｘ
Ｌｌ−ｂｌｕｅ／λＬｃｌ−ｃＤＮＡ）［通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所に、ブタペスト条約に基
いて寄託されている（寄託番号：ＦＥＲＭＢＰ−３１７
０ 寄託日：平成２年１１月２２日）。］をＬＢ−Ａｍ
ｐ培地（アンピシリンを５０ｍｇ／ｌ含有）中、３０℃
で培養、増殖させた。
【０１０４】培養液の６５０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が
０．５の時に、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が１ｍＭになるように
培養液に加え、更に４時間培養を続けた。ついで４℃で
５０００Ｇ，１０分遠心し、集菌して得られた菌体ペレ
ットを０．２Ｍ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．５
ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５Ｍ 庶糖を含むＴＥＳ緩衝
液（もとの培養液１ｌあたり２０ｍｌ量）に再度懸濁し
た。ついでこの菌体懸濁液に、水で１：４ に希釈した
ＴＥＳ緩衝液を加えて浸透圧破壊し、氷上で３０分静置
した。その後、この懸濁液を１０，０００Ｇ １０分遠
心し、上清を分取した。この上清には、もとの培養液１
ｌあたり、本増強因子ｐ５５マウスＮｕｃタンパク質１
０ｍｇが含有されていた。
０．５の時に、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が１ｍＭになるように
培養液に加え、更に４時間培養を続けた。ついで４℃で
５０００Ｇ，１０分遠心し、集菌して得られた菌体ペレ
ットを０．２Ｍ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．５
ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５Ｍ 庶糖を含むＴＥＳ緩衝
液（もとの培養液１ｌあたり２０ｍｌ量）に再度懸濁し
た。ついでこの菌体懸濁液に、水で１：４ に希釈した
ＴＥＳ緩衝液を加えて浸透圧破壊し、氷上で３０分静置
した。その後、この懸濁液を１０，０００Ｇ １０分遠
心し、上清を分取した。この上清には、もとの培養液１
ｌあたり、本増強因子ｐ５５マウスＮｕｃタンパク質１
０ｍｇが含有されていた。
【０１０５】（ｂ）本増強因子ｐ５５マウスＮｕｃのア
ミノ酸配列の確認のための一部シークエンシング‥‥‥
シアノジェンブロマイドによる切断 乾固したｐ５５マウスＮｕｃタンパク質１０μｇを７０
％のギ酸１ｍｌ中に２０ｍｇのシアノジェンブロマイド
を含む溶液５０ｍｌに溶解し、３７℃で一夜反応させ
た。次にこの反応物を乾固し、そのペレットを１０μｌ
の水に溶解し、しかる後ＳＤＳ−ＰＡＧＥをＴＥＦＣＯ
ＷＩＤＥ ＰＡＧＥ ｍｉｎｉを用いて行なった。前
記のＰａｕｌ Ｍａｔｓｕｄａｉｒａの方法に従い、ウ
ェスタンブロッティングを行ない、更にＡｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ４７０Ａｏｎ−ｌｉｎｅ １２
０Ａ ＰＴＨアミノ酸アナライザーでアミノ酸配列を決
定した（図５）。
ミノ酸配列の確認のための一部シークエンシング‥‥‥
シアノジェンブロマイドによる切断 乾固したｐ５５マウスＮｕｃタンパク質１０μｇを７０
％のギ酸１ｍｌ中に２０ｍｇのシアノジェンブロマイド
を含む溶液５０ｍｌに溶解し、３７℃で一夜反応させ
た。次にこの反応物を乾固し、そのペレットを１０μｌ
の水に溶解し、しかる後ＳＤＳ−ＰＡＧＥをＴＥＦＣＯ
ＷＩＤＥ ＰＡＧＥ ｍｉｎｉを用いて行なった。前
記のＰａｕｌ Ｍａｔｓｕｄａｉｒａの方法に従い、ウ
ェスタンブロッティングを行ない、更にＡｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ４７０Ａｏｎ−ｌｉｎｅ １２
０Ａ ＰＴＨアミノ酸アナライザーでアミノ酸配列を決
定した（図５）。
【０１０６】（ｃ）ｐ５５マウスＮｕｃのトリプシン分
解によるアミノ酸配列確認 ｐ５５乾燥原末１００μｇを８Ｍの尿素溶液２５μｌに
溶解し、３７℃で１５分溶解した。これに０．１Ｍ Ｎ
Ｈ４ＨＣＯ３溶液７５μｌを加え、更にＴＰＣＫ処理ト
リプシン１μｇを加え、３７℃で一夜加水分解した。そ
の後この反応液に１００ｍＭのジイソプロピルフルオロ
ホスフェート１μｌを加え、更に１０％の酢酸５μｌを
加えた。ついでこの反応液を１ｍｌの量のアンヒドロト
リプシンアガロースカラム（タカラ社製）にかけ、加水
分解ペプチド断片を分離した。非吸着画分をブロッティ
ング装置（Ｍａｒｙｓｏｌ ＫＳ−８４５１）で，４
℃，２０Ｖ，４時間，ＰＶＤＦメンブレイン（Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅＲ社）にブロットした。非吸着画分にはＣ末
端の最初のペプチド断片だけでなく、他に２つのペプチ
ド断片が混在していることがわかった。シークエンシン
グを行なうと、前記のロイシンジッパーよりＣ末端側の
３つのペプチド断片の存在が確認でき、塩基配列から推
定されるアミノ酸配列と一致することが明らかになった
（図５）。
解によるアミノ酸配列確認 ｐ５５乾燥原末１００μｇを８Ｍの尿素溶液２５μｌに
溶解し、３７℃で１５分溶解した。これに０．１Ｍ Ｎ
Ｈ４ＨＣＯ３溶液７５μｌを加え、更にＴＰＣＫ処理ト
リプシン１μｇを加え、３７℃で一夜加水分解した。そ
の後この反応液に１００ｍＭのジイソプロピルフルオロ
ホスフェート１μｌを加え、更に１０％の酢酸５μｌを
加えた。ついでこの反応液を１ｍｌの量のアンヒドロト
リプシンアガロースカラム（タカラ社製）にかけ、加水
分解ペプチド断片を分離した。非吸着画分をブロッティ
ング装置（Ｍａｒｙｓｏｌ ＫＳ−８４５１）で，４
℃，２０Ｖ，４時間，ＰＶＤＦメンブレイン（Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅＲ社）にブロットした。非吸着画分にはＣ末
端の最初のペプチド断片だけでなく、他に２つのペプチ
ド断片が混在していることがわかった。シークエンシン
グを行なうと、前記のロイシンジッパーよりＣ末端側の
３つのペプチド断片の存在が確認でき、塩基配列から推
定されるアミノ酸配列と一致することが明らかになった
（図５）。
【０１０７】
【実施例４】実施例２および３で得たｐ５５マウスＮｕ
ｃタンパク質３００μｇを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１
００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５ｍＭ ＰＭＳＦを含む
ｐＨ８．０の緩衝液０．５ｍｌに溶解し、これと同量の
フロイントの完全アジュバントを混ぜ合わせ、ｗａｔｅ
ｒ ｉｎ ｏｉｌの状態になるまで充分混和した。ニュ
ージーランド白色雌性ウサギ後肢の四指の足蹠計８ケ所
に、このエマルジョンを計１ｍｌ膨疹を形成するように
注射し、免疫した。３週間後に、フロイントの不完全ア
ジュバントを含む同量の抗原エマルジョンを背部４ケ所
に注射した。１０日後に採血し、抗体価を測定した。そ
の後全採血し、抗血清を得た。ｐ５５マウスＮｕｃタン
パク質に対するポリクローナル抗体を含む本抗血清は、
ＫＭＬ１−７細胞培養上清の抗ＤＮＡ抗体産生増強作用
を完全に阻止した。また、細胞をよく染色した。
ｃタンパク質３００μｇを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１
００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５ｍＭ ＰＭＳＦを含む
ｐＨ８．０の緩衝液０．５ｍｌに溶解し、これと同量の
フロイントの完全アジュバントを混ぜ合わせ、ｗａｔｅ
ｒ ｉｎ ｏｉｌの状態になるまで充分混和した。ニュ
ージーランド白色雌性ウサギ後肢の四指の足蹠計８ケ所
に、このエマルジョンを計１ｍｌ膨疹を形成するように
注射し、免疫した。３週間後に、フロイントの不完全ア
ジュバントを含む同量の抗原エマルジョンを背部４ケ所
に注射した。１０日後に採血し、抗体価を測定した。そ
の後全採血し、抗血清を得た。ｐ５５マウスＮｕｃタン
パク質に対するポリクローナル抗体を含む本抗血清は、
ＫＭＬ１−７細胞培養上清の抗ＤＮＡ抗体産生増強作用
を完全に阻止した。また、細胞をよく染色した。
【０１０８】
【実施例５】実施例２および３で得たｐ５５マウスＮｕ
ｃタンパク質とフロイントの完全アジュバントとを実施
例４と同様にして、等量ずつ混ぜ合わせ、Ｌｅｗｉｓラ
ットに免疫し、脾臓細胞を採取し、マウスミエローマ細
胞と細胞融合し、ハイブリドーマを作製し、しかる後ｐ
５５マウスＮｕｃに対するモノクローナル抗体を得た。
ｃタンパク質とフロイントの完全アジュバントとを実施
例４と同様にして、等量ずつ混ぜ合わせ、Ｌｅｗｉｓラ
ットに免疫し、脾臓細胞を採取し、マウスミエローマ細
胞と細胞融合し、ハイブリドーマを作製し、しかる後ｐ
５５マウスＮｕｃに対するモノクローナル抗体を得た。
【０１０９】
【実施例６】実施例２の（ｌ）で得た２．２Ｋ塩基のｃ
ＤＮＡの塩基配列をもとに、実施例３の（ａ）で作製し
た２．２ＫのＤＮＡ断片をプローブとして、同じく正常
Ｂａｌｂ／ｃマウス腎臓のゲノムＤＮＡをスクリーニン
グした。そしてこの正常Ｂａｌｂ／ｃマウスからも、本
プローブとハイブリダイズする遺伝子をクローニングす
ることができた。
ＤＮＡの塩基配列をもとに、実施例３の（ａ）で作製し
た２．２ＫのＤＮＡ断片をプローブとして、同じく正常
Ｂａｌｂ／ｃマウス腎臓のゲノムＤＮＡをスクリーニン
グした。そしてこの正常Ｂａｌｂ／ｃマウスからも、本
プローブとハイブリダイズする遺伝子をクローニングす
ることができた。
【０１１０】
【実施例７】実施例２の（ｌ）で得た２．２Ｋ塩基のｃ
ＤＮＡの塩基配列をもとに、実施例３の（ａ）で作製し
た２．２ＫのＤＮＡ断片をプローブとして、ヒト褐色細
胞腫（Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ）のｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングした。ｐ５５マウスＮｕ
ｃタンパク質に対応するヒトＮｕｃをコードするヒトｃ
ＤＮＡクローンを得た。その塩基配列を決定したとこ
ろ、マウスｃＤＮＡと相同性がきわめて高く、また対応
するアミノ酸配列の相同性もきわめて高かった（第７及
び８図）。
ＤＮＡの塩基配列をもとに、実施例３の（ａ）で作製し
た２．２ＫのＤＮＡ断片をプローブとして、ヒト褐色細
胞腫（Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ）のｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングした。ｐ５５マウスＮｕ
ｃタンパク質に対応するヒトＮｕｃをコードするヒトｃ
ＤＮＡクローンを得た。その塩基配列を決定したとこ
ろ、マウスｃＤＮＡと相同性がきわめて高く、また対応
するアミノ酸配列の相同性もきわめて高かった（第７及
び８図）。
【０１１１】ヒトｐ５５ＮｕｃｃＤＮＡのクローニング マウスｐ５５Ｎｕｃ ｃＤＮＡをプロープにして、ヒ
ト、フェオクロモサイトーマｃＤＮＡライブラリーをプ
ラークハイブリダイゼーション法でスクリーニングし
た。使用したライブラリーは、ヒト、フェオクロモサイ
トーマの患者より摘出された組織よりｍＲＮＡを常法に
より調整し、ｃＤＮＡ合成キット（アマシャム）を用い
てｃＤＮＡを合成後、λｇｔｌｌに接続し約５０万の個
々のクレーンからなるものであった。なおこのｃＤＮＡ
を合成する際のプライマーは、ランダムヘキサマーを用
いた。プラークハイブリダイゼーションで１０個の陽性
のシグナルを示すクローンを得ることができ、その中で
最長の約１．５ＫｂのｃＤＮＡインサートを持つファー
ジよりＤＮＡをクローニングした後、ｃＤＮＡ断片（Ｅ
ｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片）をＳＫ Ｍ１３＋のＥｃｏ
ＲＩ部位にリクローニングし、ジデオキシ法により帯配
列を決定した。前述の通りプライマーとしてランダムヘ
キサマーを用いたためｐｏｌｙＡ部分を含んでいなかっ
たが、タンパクに翻訳されるコーディング領域は完全に
保持していた。
ト、フェオクロモサイトーマｃＤＮＡライブラリーをプ
ラークハイブリダイゼーション法でスクリーニングし
た。使用したライブラリーは、ヒト、フェオクロモサイ
トーマの患者より摘出された組織よりｍＲＮＡを常法に
より調整し、ｃＤＮＡ合成キット（アマシャム）を用い
てｃＤＮＡを合成後、λｇｔｌｌに接続し約５０万の個
々のクレーンからなるものであった。なおこのｃＤＮＡ
を合成する際のプライマーは、ランダムヘキサマーを用
いた。プラークハイブリダイゼーションで１０個の陽性
のシグナルを示すクローンを得ることができ、その中で
最長の約１．５ＫｂのｃＤＮＡインサートを持つファー
ジよりＤＮＡをクローニングした後、ｃＤＮＡ断片（Ｅ
ｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片）をＳＫ Ｍ１３＋のＥｃｏ
ＲＩ部位にリクローニングし、ジデオキシ法により帯配
列を決定した。前述の通りプライマーとしてランダムヘ
キサマーを用いたためｐｏｌｙＡ部分を含んでいなかっ
たが、タンパクに翻訳されるコーディング領域は完全に
保持していた。
【０１１２】ヒトとマウスで比較してみると、Ｃ末端２
箇所に４アミノ酸残基及び３アミノ酸残基の挿入が、ま
た１箇所に２アミノ酸残基の欠失があり、マウスの４５
５アミノ酸残基に対して４６０アミノ酸残基であった。
タンパクレベルでは、コーディング領域において約９０
％のホモロジーを、また特に中央部分（Ｎｏ４０からＮ
ｏ３４９）においては、９５％以上の高いホモロジーを
有していることがわかった。リーダーペプチドについて
はヒト、マウス間で変化は見られるが、中央部分に疎水
性コアが存在し、その直前に正に荷電したアミノ酸（Ａ
ｒｇ）が、またＣ末端には配列帯の短いアミノ酸（Ａｌ
ａ）が存在するためリーダーペプチドの機能は完全に有
していると考えられた。そこでリーダーペプチド切断機
のマチュアなタンパクを大腸菌内で生成させるため、Ｎ
末端付近に対する合成ＤＮＡ２７ｍｅｒを作成し、Ｔ７
プライマーとの間でＰＣＲ法を用いて増幅後、制限酵素
で切断しλＬｃｌベクターのＮｃｏｌ部位にクローニン
グした。
箇所に４アミノ酸残基及び３アミノ酸残基の挿入が、ま
た１箇所に２アミノ酸残基の欠失があり、マウスの４５
５アミノ酸残基に対して４６０アミノ酸残基であった。
タンパクレベルでは、コーディング領域において約９０
％のホモロジーを、また特に中央部分（Ｎｏ４０からＮ
ｏ３４９）においては、９５％以上の高いホモロジーを
有していることがわかった。リーダーペプチドについて
はヒト、マウス間で変化は見られるが、中央部分に疎水
性コアが存在し、その直前に正に荷電したアミノ酸（Ａ
ｒｇ）が、またＣ末端には配列帯の短いアミノ酸（Ａｌ
ａ）が存在するためリーダーペプチドの機能は完全に有
していると考えられた。そこでリーダーペプチド切断機
のマチュアなタンパクを大腸菌内で生成させるため、Ｎ
末端付近に対する合成ＤＮＡ２７ｍｅｒを作成し、Ｔ７
プライマーとの間でＰＣＲ法を用いて増幅後、制限酵素
で切断しλＬｃｌベクターのＮｃｏｌ部位にクローニン
グした。
【０１１３】
【実施例８】 本増殖因子ｐ５５ヒトＮｕｃタンパク質の大腸菌での生
産 リーダーペプチド切断後のマチュアなｐ５５ヒトＮｕｃ
タンパク質を生産するため、ｐ５５ヒトＮｕｃタンパク
質のＮ末端付近に対する合成ＤＮＡ２７ｍｅｒをプライ
マーとして合成し、実施例３と同様にして、Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラーゼプライマーとの間で、実施例７で得たＳＫ
−ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によりクローンを増幅
し、その後制限酵素ＮｃｏＩで切断し、λＬｃＩベクタ
ーのＮｃｏＩ部位にクローニングした（第９図）。この
大腸菌Ｈｐ５５ｃＤＮＡ（ＸＬｌ−ｂｌｕｅ／λＬｃｌ
−ｃＤＮＡ）〔通商産業省工業技術員微生物工業技術研
究所にブダペスト条約に基づいて預託されている（預託
番号：ＦＥＲＭＢＰ−３２０９預託日平成２年１２月１
９日）。］を実施例３と同様の方法で培養、増殖させ、
後処理として、もとの培養液１ｌ当たり、ｐ５５ヒトＮ
ｕｃタンパク質１０ｍｇを得た。このタンパク質は、ｐ
５５マウスＮｕｃタンパク質に対して実施例４で作製し
たウサギのポリクローナル抗体と交差性を示すことが確
認された。
産 リーダーペプチド切断後のマチュアなｐ５５ヒトＮｕｃ
タンパク質を生産するため、ｐ５５ヒトＮｕｃタンパク
質のＮ末端付近に対する合成ＤＮＡ２７ｍｅｒをプライ
マーとして合成し、実施例３と同様にして、Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラーゼプライマーとの間で、実施例７で得たＳＫ
−ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によりクローンを増幅
し、その後制限酵素ＮｃｏＩで切断し、λＬｃＩベクタ
ーのＮｃｏＩ部位にクローニングした（第９図）。この
大腸菌Ｈｐ５５ｃＤＮＡ（ＸＬｌ−ｂｌｕｅ／λＬｃｌ
−ｃＤＮＡ）〔通商産業省工業技術員微生物工業技術研
究所にブダペスト条約に基づいて預託されている（預託
番号：ＦＥＲＭＢＰ−３２０９預託日平成２年１２月１
９日）。］を実施例３と同様の方法で培養、増殖させ、
後処理として、もとの培養液１ｌ当たり、ｐ５５ヒトＮ
ｕｃタンパク質１０ｍｇを得た。このタンパク質は、ｐ
５５マウスＮｕｃタンパク質に対して実施例４で作製し
たウサギのポリクローナル抗体と交差性を示すことが確
認された。
【０１１４】
【実施例９】実施例８で得たｐ５５ヒトＮｕｃタンパク
質３００μｇを実施例４と全く同様にして、ニュージー
ランド白色雌性ウサギ後肢の四指の足蹠計８カ所に、ア
ジュバントとのエマルジョンの形で注射し、免疫した。
その後数週間ごとに採血、抗体価の測定を行い、抗体価
が上がりきったところで全採血し、抗血清を得た。ｐ５
５ヒトＮｕｃタンパク質に対するポリクローナル抗体を
含む本血清を各種の試験に用いた。
質３００μｇを実施例４と全く同様にして、ニュージー
ランド白色雌性ウサギ後肢の四指の足蹠計８カ所に、ア
ジュバントとのエマルジョンの形で注射し、免疫した。
その後数週間ごとに採血、抗体価の測定を行い、抗体価
が上がりきったところで全採血し、抗血清を得た。ｐ５
５ヒトＮｕｃタンパク質に対するポリクローナル抗体を
含む本血清を各種の試験に用いた。
【０１１５】
【実施例１０】マウス等動物の血清等体液あるいは組
織、ヒトの血清等体液あるいは組織及び各種の動物、ヒ
ト細胞につき、本発明で得られた抗マウスＮｕｃ抗体あ
るいは抗ヒトＮｕｃ抗体を用いて、各々の血液等体液あ
るいは組織・細胞抽出物のウェスタンブロットを行う
と、ｐ５５のマウスＮｕｃ、ヒトＮｕｃに対応する部分
にバンドが見られ、更に高分子量側、例えば分子量にし
て１０，０００高分子量側に位置するバンドが検出され
た。
織、ヒトの血清等体液あるいは組織及び各種の動物、ヒ
ト細胞につき、本発明で得られた抗マウスＮｕｃ抗体あ
るいは抗ヒトＮｕｃ抗体を用いて、各々の血液等体液あ
るいは組織・細胞抽出物のウェスタンブロットを行う
と、ｐ５５のマウスＮｕｃ、ヒトＮｕｃに対応する部分
にバンドが見られ、更に高分子量側、例えば分子量にし
て１０，０００高分子量側に位置するバンドが検出され
た。
【０１１６】
【実施例１１】マウスＮｕｃ生産用プラスミドであるｍ
ＮＵＣ−λＬｃｌプラスミドを制限酵素Ｘｂａｌで切断
後、Ｓｌヌクレアーゼで処理して、末端を揃え、制限酵
素ＰｍａＣＩで切断した。それらを個々にＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いてセルフライゲーションさせ、大腸菌ＸＬ
ｌ−ｂｌｕｅを形質転換してクローンとした（この形質
転換した大腸菌はｍＮＵＣ−ｄｅｌＺと命名され、通商
産業省工業技術院生物工業技術研究所に寄託されている
《寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１２５６８、寄託日：平成
３年１０月１１日》）。次いで、マウスＮｕｃタンパク
質を発現させるのと同様にして、この大腸菌を培養し、
前記切断の行程によって、ロイシンジッパーを含めてＣ
末端より１５７アミノ酸残基の欠失（１９９番目から４
５５番目まで欠失）が起こり、分子量３２，６７４、等
電点５．０８のタンパク質が生産し、Ｎｕｃの場合と同
様にして分離・精製し、これによってペプチド断片欠損
変異タンパク質であるＤｅｌＺを得ることができた。
尚、ＤｅｌＺの生成量は、もとの培養液１ｌ当り１０ｍ
ｇであった。
ＮＵＣ−λＬｃｌプラスミドを制限酵素Ｘｂａｌで切断
後、Ｓｌヌクレアーゼで処理して、末端を揃え、制限酵
素ＰｍａＣＩで切断した。それらを個々にＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いてセルフライゲーションさせ、大腸菌ＸＬ
ｌ−ｂｌｕｅを形質転換してクローンとした（この形質
転換した大腸菌はｍＮＵＣ−ｄｅｌＺと命名され、通商
産業省工業技術院生物工業技術研究所に寄託されている
《寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１２５６８、寄託日：平成
３年１０月１１日》）。次いで、マウスＮｕｃタンパク
質を発現させるのと同様にして、この大腸菌を培養し、
前記切断の行程によって、ロイシンジッパーを含めてＣ
末端より１５７アミノ酸残基の欠失（１９９番目から４
５５番目まで欠失）が起こり、分子量３２，６７４、等
電点５．０８のタンパク質が生産し、Ｎｕｃの場合と同
様にして分離・精製し、これによってペプチド断片欠損
変異タンパク質であるＤｅｌＺを得ることができた。
尚、ＤｅｌＺの生成量は、もとの培養液１ｌ当り１０ｍ
ｇであった。
【０１１７】
【実施例１２】前記実施例１１において、ＰｍａＣＩに
よる切断に代えて、Ｅｃｏ４７ ＩＩＩによって切断し
た場合には、Ｃ末端より３３アミノ酸残基の欠失が起こ
り、分子量４４，８６１、等電点４．８９のタンパク質
を生産し、Ｎｕｃの場合と同様にして分離・精製するこ
とによって、ペプチド断片欠損変異タンパク質であるＤ
ｅｌＣを得ることができた。尚、ＤｅｌＣの生成量は、
もとの培養液１ｌ当り１０ｍｇであった（このＤｅｌＣ
を生産する大腸菌はｍＮＵＣ−ｄｅｌＣと命名され、通
商産業省工業技術院生物工業技術研究所に寄託されてい
る《寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１２５６７、寄託日：平
成３年１０月１１日》）。
よる切断に代えて、Ｅｃｏ４７ ＩＩＩによって切断し
た場合には、Ｃ末端より３３アミノ酸残基の欠失が起こ
り、分子量４４，８６１、等電点４．８９のタンパク質
を生産し、Ｎｕｃの場合と同様にして分離・精製するこ
とによって、ペプチド断片欠損変異タンパク質であるＤ
ｅｌＣを得ることができた。尚、ＤｅｌＣの生成量は、
もとの培養液１ｌ当り１０ｍｇであった（このＤｅｌＣ
を生産する大腸菌はｍＮＵＣ−ｄｅｌＣと命名され、通
商産業省工業技術院生物工業技術研究所に寄託されてい
る《寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１２５６７、寄託日：平
成３年１０月１１日》）。
【０１１８】
【実施例１３】Ｘｂａｌで切断したｍＮＵＣｓ−λＬｃ
ｌプラスミドを、更に制限酵素ＡｃｃＩで切断し、その
後Ｋｌｅｎｏｗ断片で末端を揃え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を用いてセルフライゲーションさせ、大腸菌ＸＬｌ−ｂ
ｌｕｅを形質転換してｍＮＵＣ−λＬｃｌプラスミドを
構築した。そして、ＮｕｃのＤＮＡ結合活性部分と考え
られる塩基性アミノ酸領域を欠いたタンパクを作製する
ために以下の操作を行った。まず、塩基性アミノ酸領域
直後に対するＰＣＲプライマーを作成した。それはマウ
スＮｕｃのｃＤＮＡに対して１８塩基の相補性を持ち、
かつ制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｃｌ部位を持たしたも
ので５’−ＧＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡ
ＧＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧ−３’の３１ｍｅｒである。
ｌプラスミドを、更に制限酵素ＡｃｃＩで切断し、その
後Ｋｌｅｎｏｗ断片で末端を揃え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を用いてセルフライゲーションさせ、大腸菌ＸＬｌ−ｂ
ｌｕｅを形質転換してｍＮＵＣ−λＬｃｌプラスミドを
構築した。そして、ＮｕｃのＤＮＡ結合活性部分と考え
られる塩基性アミノ酸領域を欠いたタンパクを作製する
ために以下の操作を行った。まず、塩基性アミノ酸領域
直後に対するＰＣＲプライマーを作成した。それはマウ
スＮｕｃのｃＤＮＡに対して１８塩基の相補性を持ち、
かつ制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｃｌ部位を持たしたも
ので５’−ＧＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡ
ＧＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧ−３’の３１ｍｅｒである。
【０１１９】その３１ｍｅｒとＴ７プライマー（５’−
ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’）を用い、
ｍＮＵＣｓ−λＬｃｌプラスミドを鋳型にして、ＰＣＲ
を行った。その条件は９４℃ｌｍｉｎ．，５５℃ ２ｍ
ｉｎ．，７２℃ ３ｍｉｎ，２５回であった。ＰＣＲの
産物約０．９ＫｂのＤＮＡ断片を制限酵素Ｓａｃｌ及び
Ｘｂａｌで切断し、λＬｃｌプラスミドを制眼酵素Ｓａ
ｃｌ及びＸｂａｌで切断したものにクローニングした。
そのプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで
切断し、そこにｍＮＵＣ−λＬｃｌプラスミドより切り
出したＥｃｏＲＩ−Ｓａｕ３ＡＩ断片約０．５Ｋｂをク
ローニングした。
ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’）を用い、
ｍＮＵＣｓ−λＬｃｌプラスミドを鋳型にして、ＰＣＲ
を行った。その条件は９４℃ｌｍｉｎ．，５５℃ ２ｍ
ｉｎ．，７２℃ ３ｍｉｎ，２５回であった。ＰＣＲの
産物約０．９ＫｂのＤＮＡ断片を制限酵素Ｓａｃｌ及び
Ｘｂａｌで切断し、λＬｃｌプラスミドを制眼酵素Ｓａ
ｃｌ及びＸｂａｌで切断したものにクローニングした。
そのプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで
切断し、そこにｍＮＵＣ−λＬｃｌプラスミドより切り
出したＥｃｏＲＩ−Ｓａｕ３ＡＩ断片約０．５Ｋｂをク
ローニングした。
【０１２０】かくして塩基性アミノ酸領域に対応する遺
伝子断片欠損変異クローンを得た。このクローンを形質
転換した大腸菌を培養し、塩基性アミノ酸領域６４アミ
ノ酸残基の欠失（１５８番目から２２０番目までの欠
失）した分子量４２，５２８、等電点４．５３のタンパ
ク質が生産され、このようにしてペプチド断片欠損変異
タンパク質であるＤｅｌＢを得ることができた。尚、Ｄ
ｅｌＢの生成量は、もとの培養液１ｌ当り１０ｍｇであ
った（このＤｅｌＢを生産する大腸菌はｍＮＵＣ−ｄｅ
ｌＢと命名され、通商産業省工業技術院生物工業技術研
究所に寄託されている《寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１２
５６６、寄託日：平成３年１０月１１日》）。
伝子断片欠損変異クローンを得た。このクローンを形質
転換した大腸菌を培養し、塩基性アミノ酸領域６４アミ
ノ酸残基の欠失（１５８番目から２２０番目までの欠
失）した分子量４２，５２８、等電点４．５３のタンパ
ク質が生産され、このようにしてペプチド断片欠損変異
タンパク質であるＤｅｌＢを得ることができた。尚、Ｄ
ｅｌＢの生成量は、もとの培養液１ｌ当り１０ｍｇであ
った（このＤｅｌＢを生産する大腸菌はｍＮＵＣ−ｄｅ
ｌＢと命名され、通商産業省工業技術院生物工業技術研
究所に寄託されている《寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１２
５６６、寄託日：平成３年１０月１１日》）。
【０１２１】以上の記載中及び図面におけるアミノ酸配
列でのアルファベットは、以下のアミノ酸をそれぞれ示
す。
列でのアルファベットは、以下のアミノ酸をそれぞれ示
す。
【０１２２】
【発明の効果】本発明によって、抗ＤＮＡ抗体産生を増
強するＤＮＡ結合タンパク質の存在を、単にＭＲＬ／ｌ
マウスＫＭＬ１−７細胞からだけでなく、広く自己免疫
疾患動物のみならず正常動物の組織・細胞内に存在する
ことが明らかにされた。更に本増強因子をコードする遺
伝子がクローニングされ、大腸菌等に組み換えられ、遺
伝子発現が行われ、増強因子タンパク質を生産すること
が可能となった。そしてこのタンパク質を抗原として用
い、生体中に産生・存在する本増強因子に対する抗体を
測定することが可能となった。またこのタンパク質を抗
原として動物に免疫することにより、あるいはｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでポリクロナール抗体、モノクロナール抗体の
製造も可能となり、これらの抗体を用いて前記ＤＮＡ結
合タンパク質の定量を行うことが可能となった。このよ
うにしてかつ自己免疫疾患患者および動物等の病態の把
握、診断、更には治療に、本ｐ５５ヒトＮｕｃタンパク
質、マウスＮｕｃタンパク質あるいはこれに対する抗体
を使用することができることになる。
強するＤＮＡ結合タンパク質の存在を、単にＭＲＬ／ｌ
マウスＫＭＬ１−７細胞からだけでなく、広く自己免疫
疾患動物のみならず正常動物の組織・細胞内に存在する
ことが明らかにされた。更に本増強因子をコードする遺
伝子がクローニングされ、大腸菌等に組み換えられ、遺
伝子発現が行われ、増強因子タンパク質を生産すること
が可能となった。そしてこのタンパク質を抗原として用
い、生体中に産生・存在する本増強因子に対する抗体を
測定することが可能となった。またこのタンパク質を抗
原として動物に免疫することにより、あるいはｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでポリクロナール抗体、モノクロナール抗体の
製造も可能となり、これらの抗体を用いて前記ＤＮＡ結
合タンパク質の定量を行うことが可能となった。このよ
うにしてかつ自己免疫疾患患者および動物等の病態の把
握、診断、更には治療に、本ｐ５５ヒトＮｕｃタンパク
質、マウスＮｕｃタンパク質あるいはこれに対する抗体
を使用することができることになる。
【０１２３】特に、モノクロナール抗体は、ヒトの自己
免疫性疾患、免疫不全症、代謝性疾患、遺伝疾患、癌等
の診断、治療に応用できる。
免疫性疾患、免疫不全症、代謝性疾患、遺伝疾患、癌等
の診断、治療に応用できる。
【０１２４】このように、本願発明は、単に生物科学、
基礎医学上の基礎的研究に資するだけでなく、臨床医学
上の診断、治療にも利用できる点で、本発明の意義は画
期的であると共に極めて重要である。
基礎医学上の基礎的研究に資するだけでなく、臨床医学
上の診断、治療にも利用できる点で、本発明の意義は画
期的であると共に極めて重要である。
【図１】先願ＫＭＬ１−７細胞の無血清培地培養上清の
添加容量と抗ＤＮＡ抗体産生増強活性との関係を示すグ
ラフ
添加容量と抗ＤＮＡ抗体産生増強活性との関係を示すグ
ラフ
【図２】ＡｃＡ５４カラムに本増強因子含有画分をチャ
ージし、ゲルろ過により更に精製を進めた際の各画分の
増強因子によるＰＦＣ活性を示すグラフ
ージし、ゲルろ過により更に精製を進めた際の各画分の
増強因子によるＰＦＣ活性を示すグラフ
【図３】図２に示す本増強因子含有画分をＤＥＡＥ−セ
ファデックスＡ−５０カラムにかけ、更にＮａＣｌを含
む緩衝液により溶出する際の、各画分のＮａＣｌの濃度
とＰＦＣ 活性ならびにタンパク質濃度および核酸濃度
との関係を示すグラフ
ファデックスＡ−５０カラムにかけ、更にＮａＣｌを含
む緩衝液により溶出する際の、各画分のＮａＣｌの濃度
とＰＦＣ 活性ならびにタンパク質濃度および核酸濃度
との関係を示すグラフ
【図４】図３に示す本増強因子含有画分をＰｈｅｎｙｌ
５ＰＷＲＰにインジェクトし、ＨＰＬＣを行い、アセト
ニトリル（ＣＨ３ＣＮ）で溶出する際、本増強因子の溶
出位置と各画分のアセトニトリル濃度を示すグラフ、及
び本増強因子の分子量を求めた電気泳動パターンを示す
グラフ
５ＰＷＲＰにインジェクトし、ＨＰＬＣを行い、アセト
ニトリル（ＣＨ３ＣＮ）で溶出する際、本増強因子の溶
出位置と各画分のアセトニトリル濃度を示すグラフ、及
び本増強因子の分子量を求めた電気泳動パターンを示す
グラフ
【図５】本願発明の実施例において得られた本増強因子
ｐ５５Ｎｕｃをコードするマウス遺伝子を含むＤＮＡ断
片の塩基配列及びこれに対応するアミノ酸配列を示す配
列図
ｐ５５Ｎｕｃをコードするマウス遺伝子を含むＤＮＡ断
片の塩基配列及びこれに対応するアミノ酸配列を示す配
列図
【図６】本増強因子ｐ５５マウスＮｕｃ ｃＤＮＡのＰ
ＣＲを用いたＬｅｒｎｅｒベクターへのリクローニング
の方法を示す図
ＣＲを用いたＬｅｒｎｅｒベクターへのリクローニング
の方法を示す図
【図７】本願発明の実施例において得られた本増強因子
ｐ５５Ｎｕｃをコードするヒト遺伝子を含むＤＮＡ断片
の塩基配列（上段）とマウス遺伝子を含むＤＮＡ断片の
塩基配列（下段）との比較図（図中｜は共通であること
を示す。）
ｐ５５Ｎｕｃをコードするヒト遺伝子を含むＤＮＡ断片
の塩基配列（上段）とマウス遺伝子を含むＤＮＡ断片の
塩基配列（下段）との比較図（図中｜は共通であること
を示す。）
【図８】本増強因子ｐ５５Ｎｕｃのヒトアミノ酸配列
（上段）とマウスアミノ酸配列（下段）との比較図
（上段）とマウスアミノ酸配列（下段）との比較図
【図９】ヒトＮｕｃ ｃＤＮＡのＰＣＲを用いたＬｅｒ
ｎｅｒベクターへのリクローニングの方法を示す図及び
ＬｅｒｎｅｒベクターλＬｃｌ及びヒトＮｕｃ ｃＤＮ
Ａリーダー部分の塩基配列を示す図
ｎｅｒベクターへのリクローニングの方法を示す図及び
ＬｅｒｎｅｒベクターλＬｃｌ及びヒトＮｕｃ ｃＤＮ
Ａリーダー部分の塩基配列を示す図
【図１０】λＬｃｌのＰｅｌＢ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐ
ｔｉｄｅの下流にｍＮＵＣをＰＣＲによって増幅後連結
させることを示す図
ｔｉｄｅの下流にｍＮＵＣをＰＣＲによって増幅後連結
させることを示す図
【図１１】ＤｅｌＺ及びＤｅｌＣの生成行程を示す図
【図１２】ＤｅｌＢの生成行程を示す図
【図１３】ｒＮｕｃ，ＤｅｌＢ，ＤｅｌＺ及びＤｅｌＣ
の各蛋白質の概略構造を示す図
の各蛋白質の概略構造を示す図
【図１４】ｒＮｕｃ，ＤｅｌＢ及びＤｅｌＺの各タンパ
ク質の生物活性を示すグラフ
ク質の生物活性を示すグラフ
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/10 15/12 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 8214−4Ｂ 21/08 8214−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7823−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 三浦 惠二 愛知県名古屋市緑区太子１丁目141 (72)発明者 田沼 靖一 東京都八王子市小門町１−1019号 (72)発明者 黒沢 良和 愛知県名古屋市名東区扇町１−39 (72)発明者 粟屋 昭 神奈川県横浜市戸塚区矢部町1541
Claims (28)
- 【請求項１】 生体組織・細胞由来であり、抗ＤＮＡ抗
体産生を増強し、かつＤＮＡと結合するタンパク質。 - 【請求項２】 生体組織・細胞が、自己免疫疾患動物又
は自己免疫疾患に該当しない動物の組織・細胞であるこ
とを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ結合タンパク質。 - 【請求項３】 生体組織・細胞がヒト及びマウスの臓
器、臓器由来細胞あるいはリンパ系細胞であることを特
徴とする請求項２記載のＤＮＡ結合タンパク質。 - 【請求項４】 生体組織・細胞が、ＭＲＬ／ｌマウスの
リンパ系細胞由来のＫＭＬ１−７細胞株であることを特
徴とする請求項３記載のＤＮＡ結合タンパク質。 - 【請求項５】 ＤＮＡ結合タンパク質がＭＲＬ／ｌマウ
スのリンパ系細胞のＫＭＬ１−７細胞株由来の抗ＤＮＡ
抗体産生増強因子であるタンパク質と相同性の高いヒト
由来であることを特徴とする請求項３記載のＤＮＡ結合
タンパク質。 - 【請求項６】 生体組織・細胞由来であり、抗ＤＮＡ抗
体産生を増強し、ＤＮＡと結合するタンパク質のアミノ
酸配列に対応してコードする塩基配列を有する遺伝子。 - 【請求項７】 請求項６記載の遺伝子を含むＤＮＡ断
片。 - 【請求項８】 中に含まれている遺伝子が請求項４記載
のマウス由来のＤＮＡ結合タンパク質をコードすること
を特徴とする請求項６又は請求項７記載のＤＮＡ断片。 - 【請求項９】 中に含まれている遺伝子が請求項５記載
のヒト由来のＤＮＡ結合タンパク質をコードすることを
特徴とする請求項６又は請求項７記載のＤＮＡ断片。 - 【請求項１０】 請求項６記載の遺伝子の適当な塩基配
列を選択して、その塩基配列ないし近似の塩基配列をプ
ライマーとして用いるＰＣＲ法により増幅して得ること
ができるＤＮＡ断片。 - 【請求項１１】 ＫＭＬ１−７細胞株を血清存在下、コ
ンフルエントになるまで培養した後、無血清培地で大量
に培養した培養上清を濃縮し、陰イオン交換樹脂に吸着
し、０．２Ｍ以上の食塩を加えて、溶出される画分を精
製することを特徴とする請求頂１記載のＤＮＡ結合タン
パク質の製造方法。 - 【請求項１２】 請求項７記載のＤＮＡ断片をプローブ
として用い、プラークハイブリダイゼーションを行った
結果、これに対して、ハイブリダイズしてくることによ
って得られる対象となる遺伝子を含むＤＮＡ断片。 - 【請求項１３】 請求項７記載のＤＮＡ断片をプローブ
として用い、プラークハイブリダイゼーションを行った
結果、これに対して、ハイブリダイズしてくることを利
用することによる対象となる遺伝子を含むＤＮＡ断片を
製造する方法。 - 【請求項１４】 プローブとして請求項８記載のＤＮＡ
断片を選択し、請求項５記載のヒト由来のＤＮＡ結合タ
ンパク質をコードする請求項９記載のＤＮＡ断片を得る
請求項１３記載の製造方法。 - 【請求項１５】 プローブとして請求項９記載のＤＮＡ
断片を選択し、請求項４記載のマウス由来のＤＮＡ結合
タンパク質をコードする請求項８記載のＤＮＡ断片を得
る請求項１３記載の製造方法。 - 【請求項１６】 請求項６記載の遺伝子をプローブとし
て、プラークハイブリダイゼーションを行うことによっ
て対象となる遺伝子をクローニングする方法。 - 【請求項１７】 請求項６記載の遺伝子として請求項５
記載のヒト由来のＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺
伝子を選択することを特徴とする請求項１５記載の方
法。 - 【請求項１８】 請求項６記載の遺伝子として請求項４
記載のマウス由来のＤＮＡ結合タンパク質をコードする
遺伝子を選択することを特徴とする請求項１６記載の方
法。 - 【請求項１９】 請求項４記載のＤＮＡ結合タンパク質
をコードする請求項６記載の遺伝子又は請求項７記載の
ＤＮＡ断片を組み換えた各種の細胞、大腸菌、酵母など
の微生物において発現させることを特徴とする請求項４
記載のＤＮＡ結合タンパク質を製造する方法。 - 【請求項２０】 請求項１記載のＤＮＡ結合タンパク質
を抗原として用い、これによって生体中に存在する該Ｄ
ＮＡ結合タンパク質に対する抗体の存在量を測定する方
法。 - 【請求項２１】 請求項１記載のＤＮＡ結合タンパク質
を抗原として動物に免疫することによってえられる該動
物の抗体。 - 【請求項２２】 ＤＮＡ結合タンパク質として請求項
４、又は請求項５記載のＤＮＡ結合タンパク質を選択す
ることを特徴とする請求項２１記載の抗体。 - 【請求項２３】 抗体がポリクロナール抗体であること
を特徴とする請求項２１記載の抗体。 - 【請求項２４】 抗体がモノクロナール抗体であること
を特徴とする請求項２１記載の抗体。 - 【請求項２５】 請求項１記載のＤＮＡ結合タンパク質
を抗原として動物に免疫することによって得られる該動
物の抗体の調製・製造方法。 - 【請求項２６】 請求項２１記載の抗体を用いて、ＲＩ
Ａ，ＥＩＡ又はＦＩＡ等の測定を行うことによって、動
物の血液、体液、組織におけるＤＮＡ結合タンパク質の
量を測定する方法及びその存在を証明する方法。 - 【請求項２７】 抗体としてポリクロナール抗体又はモ
ノクロナール抗体を選択することを特徴とする請求項２
６記載の測定方法。 - 【請求項２８】 請求項２１記載の抗体を用いた請求項
１記載のＤＮＡ結合タンパク質の過剰生成に伴う疾患に
対する治療剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34930691A JPH0625292A (ja) | 1990-10-31 | 1991-10-30 | タンパク質及びその遺伝子 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29405590 | 1990-10-31 | ||
| JP2-324888 | 1990-11-26 | ||
| JP2324888A JPH0539300A (ja) | 1990-10-31 | 1990-11-26 | タンパク質およびその遺伝子 |
| JP2-294055 | 1990-11-26 | ||
| JP34930691A JPH0625292A (ja) | 1990-10-31 | 1991-10-30 | タンパク質及びその遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0625292A true JPH0625292A (ja) | 1994-02-01 |
Family
ID=27337871
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34930691A Pending JPH0625292A (ja) | 1990-10-31 | 1991-10-30 | タンパク質及びその遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0625292A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000039160A3 (ja) * | 1998-12-24 | 2001-08-23 | Yeda Res & Dev |
-
1991
- 1991-10-30 JP JP34930691A patent/JPH0625292A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000039160A3 (ja) * | 1998-12-24 | 2001-08-23 | Yeda Res & Dev |
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