SK6042002A3 - High order nucleic acid based structures - Google Patents

High order nucleic acid based structures Download PDF

Info

Publication number
SK6042002A3
SK6042002A3 SK604-2002A SK6042002A SK6042002A3 SK 6042002 A3 SK6042002 A3 SK 6042002A3 SK 6042002 A SK6042002 A SK 6042002A SK 6042002 A3 SK6042002 A3 SK 6042002A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
polynucleic acid
molecules
nucleic acid
dimensional
molecule
Prior art date
Application number
SK604-2002A
Other languages
English (en)
Inventor
Frank J Carr
Graham Carter
Original Assignee
Merck Patent Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9926810.4A external-priority patent/GB9926810D0/en
Priority claimed from GB0011126A external-priority patent/GB0011126D0/en
Application filed by Merck Patent Gmbh filed Critical Merck Patent Gmbh
Publication of SK6042002A3 publication Critical patent/SK6042002A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/15—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs
    • C12N2310/151—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs more than 3 strands, e.g. tetrads, H-DNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/52—Physical structure branched

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Oblasť techniky štruktúr na bázi nukleových kyselín viažu molekuly iné ako sú nukleové sa vynález týka molekulových
Vynález sa týka vysokého rádu, ktoré kyseliny samotné. Osobitne štruktúr na bázi nukleových kyselín s farmaceutickou aktivitou prostredníctvom väzby na špecifické molekulárne ciele a teda ovplyvňujúce chorobné stavy. Vynález sa týka tiež molekulových štruktúr na bázi nukleových kyselín s diagnostickou využiteľnosťou.
Doterajší stav techniky
Existuje veľká potreba prostriedkov schopných špecificky meniť aktivitu určitých proteínov alebo meniť expresiu určitých génových produktov. Najmä sú žiadúce molekuly schopné vytvárať špecifické väzobné interakcie s ostatnými molekulami a osobitne molekuly vykazujúce špecifické väzby v prostredí in vivo.
vytvárať knižnice tried kompozície. Príkladom je protilátkovej molekule technológií pre vývoj za pomoci biologických systémov, celkom syntetické väzobné molekuly, z rôznych knižníc podobných alebo istej chemickej triedy a všeobecne
Vedľa týchto snáh boli vyvinuté metodológie na umožnenie molekúl, z ktorých sa vyberajú také výber špecifičnosti väzby nájdený v a existuje dnes . rad významných monoklonálnych protilátok a ich rekombinantných derivátov. Tieto technológie poskytli rad terapeutických drog a mnoho diagnostických a vývojových prostriedkov. Všetky takéto produkty sú proteínové molekuly a ako také sú vyrobiteľné iba Alternatívne boli vyrobené To sú molekuly vybrané variantných molekúl tej vybrané skríningovým systémom poskytujúcim surogát požadovaného terapeutického cieľa alebo'aspektu jeho aktivity. Skrínovanie rozsiahlych chemických knižníc malých molekúl je klasickou cestou pri vývoji liečiv s malou molekulou, avšak knižnice syntetických peptídov a syntetických molekúl nukleových kyselín sa dnes tiež skrínujú z hľadiska potencionálne užitočných liečiv.
U knižníc nukleových kyselín sa týkal technický prístup všeobecne použitia molekúl RNA alebo DNA s jediným reťazcom definovanej jednotkovej dĺžky. Väzba báze na cieľovú molekulu nie je vopred . konfigurovaná a môže byť závislá na vytváraní sekundárnych šruktúr vovnútri molekuly DNA (alebo RNA) samotnej, čo uľahčuje väzbu na inú molekulu (Bock L.C. a kol., Náture 355, str. 564 až 566, 1992 : Kubrik M.F. a kol., Nucleic Acids Res. 22, str. 2619 až 2626, 1994). 0 vytváranie molekúl nukleovej kyseliny obsahujúcich vopred konfigurované trakty štruktúry sekundárnej (alebo vyšších rádov) na terapeutické a diagnostické využitie ako podľa vynálezu sa nikto skôr nepokúsil.
Vynález sa týka nových štruktúr nukleových kyselín vysokých rádov a nového použitia takých štruktúr.
Z doterajšieho stavu techniky sú známe štruktúry nukleových kyselín vysokých rádov. Jeden typ takých nukleových kyselín sa nazýva aptaméry a líši sa od molekúl podľa vynálezu svojím rozmerom, výrobou a topologickou komplexnosťou. Spôsoby, zahrnujúce ich vývoj in vitro alebo selekciu z rozsiahlych náhodných fondov knižníc, boli aplikované na vyvinutie aptamérov RNA a DNA. Molekuly DNA schopné uľahčiť enzýmatický proces, ako je aktivita polynukleotídovej kinázy, boli vyvinuté selekciou iteratívnych cyklov (Lorsch J.R. a Szostak J.W., Náture 371, str. 31 až 36, 1994) a boli vybrané molekuly DNA s krátkym jediným reťazcom schopné vysoko špecifickej inhibície ľudskej fosfolipázy A= (Bennett C.F. a kol., Nucleic Acids Res.
22, str. 3202 až 3209, 1994). Iní pracovníci v obore vyvinuli nezávisle aptaméry na bázi DNA alebo RNA schopné viazať a inhibovať niekoľko funkcií ľudských trombov (Bock L.C. a kol.,
Náture 355, str. 564 až 566, 1992 : Kubrik M.F. >a kol., Nucleic
Acids Res. 22, str. 2619 až 2626, 1994).
I
Medzi ďaľšie typy štruktúr nukleových kyselín vysokých rádov patrí rozvetvená DNA (Horn T. a Urdea M.S. Nucleic Acids Res. 17, str. 6959 až 6967, 1989), pričom jedna alebo niekoľko oblastí molekúl DNA (sonda), ktorá hybridizuje na komplementárnu molekulu ‘ nukleovej kyseliny, môže byť sama predmetom hybridizácie k inej molekule DNA k zosilneniu množstva DNA pridruženej k sonde DNA. Ašak komplexy, ktoré popísali Horn a Urdea, sú lineárne rozšírené, čím nové hybridizované molekuly nukleovej kyseliny nie sú určené k hybridizovaniu na skôr hybridizované molekuly, ale na iné pristupujúce nové molekuly na vytvorenie rozvetvených štruktúr DNA. Takéto komplexy sú v skutočnosti jednoducho určené k vytváraniu čo možno najviacej vetví na poskytnutie viacej miest pre teplotnú hybridizáciu signálnej sondy nukleovej kyseliny.
Iné geometrické štruktúry poskytované charakteristikami párovania báz nukleových kyselín boli využívané v oblasti náuky o materiále a nanotechnológie (Aliviatos A.P. a kol.s Náture 382, str. 609 až 611, 1996 : Mao C,, a kol., Náture 407, str. 493 až 496, 2000 : Zurke B. a kol., Náture 406, str. 605 až 608, 2000). Boli popísané elegantné technické spôsoby výroby a analýzy štruktúr na bázi nukleových kyselín vysokého rádu, vrátane quadrilaterálných, oktaedrových a trojúholníkových motívov mnohonásobne prepojených do mriežky (Chen J. a kol., J. Am. Chem. Soc. 111, str. 6402 až 6407, 1989 : Zhank a kol., J. Am. Chem. Soc. 116, str. 1661 až 1669, 1994 : americké patentové spisy číslo US 5 278051, 5 468851, 5 386020 a 6 072044). Geometrické objekty sú uzavreté štruktúry vyrobené iteratívnymi spôsobmi zahrnujúcimi väzbu reštrikčných enzýmov a
DNA. Nodálne body v obrázkoch môžu byť fixované priečnym prepojením medzi pozíciami na vytvorenie tuhej formy alebo menej flexibilnej vetvy dosiahnutej teplotnou hybridizáciou nespárovaných pozícií. Doterajší stav techniky nezahrnuje geometrické štruktúry, ktoré nie sú uzavreté (teda koncovo viazané). Doterajší stav techniky neobsahuje geometrické štruktúry, ktoré zahrnujú oblasti modifikovaných nukleových kyselín a neobsahuje geometrické štruktúry nukleových kyselín napojené na iné molekulárne jednotky. Doterajší stav techniky nezahrnuje použitie knižníc náhodných alebo polonáhodných štruktúr nukleových kyselín.
V súvislosti s novým použitím štruktúr nukleových kyselín vysokých rádov sa má za to, že nukleové kyseliny nízkeho rádu ako terapeutické a diagnostické molekuly, sú v obore ako také známe. Osobitne je mnoho príkladov molekúl nukleových kyselín s možnou alebo skutočnou terapeutickou aktivitou. Také molekuly nukleových kyselín fungujú či ako antimediátorové bunky, triplexné reakčné činidlá alebo ako molekuly RNA s endoribonukleázovou aktivitou (ribozímy). Vo všetkých týchto prípadoch pôsobí modalita terapeutickej nukleovej kyseliny ako modulátor expresie proteínov mechanizmom činnosti, ktorá znižuje alebo blokuje transláciu proteínov. Špecifičnosť cielenej väzby vo všetkých týchto prípadoch je väzba nukleovej kyseliny k nukleovej kyseline, Tieto význaky (translácia modulácie, vzájomná väzba nukleových kyselín) sú v kontraste s modalitou vynálezu. Odlišným a inventívnym význakom vynálezu je použitie štruktúr nuleových kyselín vysokého rádu s väzobnou aktivitou na cielenú molekulu.
Iné štruktúry, nukleových kyselín (nízkeho rádu), osobitne aptaméry, boli testované ako terapeutické a diagnostické molekuly. Zistilo sa, že niektoré iné molekuly nukleových kyselín, osobitne ribozómov, majú enzýmatické účinky možného farmaceutického významu. Farmaceutické využitie uzavretých geometrických štruktúr nebolo brané do úvahy, aj keď americký patentový spis číslo US 5 278051 naznačuje možné využitie ako rozpúšťadlá alebo riadené uvoľňovacie nosiče pre malomolekulárne liečivá.
Podstata vynálezu
Podstata vynálezu je kyseliny pozostávajúcej z nukleovej kyseliny alebo interakciou báz dvoch trojrozmerná štruktúra polynukleovej mnohých prepojených reťazcov molekúl ich segmentov špecifickou párovacou alebo niekoľkých molekúl, pričom štruktúry nie sú kovalentne uzavreté.
Prvý význak vynálezu sa týka nových štruktúr na báz i nukleových kyselín vysokého rádu, osobitne otvorených geometrických štruktúr. Okrem toho sa vynález týka využiteľnosti takých štruktúr ako farmaceutických a/lebo diagnostických činidiel. Vynález sa týka tiež štruktúr na bázi nukleových kyselín vysokého rádu vrátane nukleotidov s modifikáciami. Vynález sa týka tiež štruktúr na bázi nukleových kyselín vysokého . rádu vrátane polonáhodných nukleotidov. Vynález bázi nukleových kyselín vysokého oblastí náhodných alebo sa týka tiež štruktúr na rádu napojených na iné molekulárne jednotky akc sú proteíny.
Štruktúry podľa vynálezu využívajú Watson-Crickových pravidiel párovania báz v obore konštruovania dvojreťazcových štruktúr. Molekuly jednoreťazcových nukleových kyselín majú schopnosť hybridizácie k iným jednoreťazcovým komplementárnym pôsobením medzi bázami. Zatiaľ hybridizácia dvoch jednoreťazcových štruktúr vedie molekulám kým taká zvyčajne k lineárnej dvojreťazcovej molekule, iné štruktúry môžu byť produkované vlásočnicovými slučkami, kde jedna molekula má internú komplementaritu páru báz a kruhmi, kde obidva konce každej jednoreťazcovej molekuly majú vzájomnú komplementaritu.
Pri stretegickej konštrukcii sekvencií jédnoreťazcových nukleových kyselín, môžu byť skonštruované individuálne molekuly, ktoré môžu súčasne hybridizovať na dve alebo na niekoľko iných molekúl a naopak sa môžu tieto iné molekuly hybridizovať na ďaľšie molekuly vrátane molekúl už začlenených do hybridizácie, potom sa môžu vytvoriť komplexy nukleových kyselín.
Celkové rozmery a topológia dvojreťazčových molekúl DNA sú dobre známe. Dvojreťazcová DNA je dosť flexibilná a skrutkovica je schopná zaujať rad konformácií líšiacich sa v úhle rotácie medzi susednými pármi báz pozdĺž skrutkovice. V prírode sa vyskytujúce jednoreťazcové molekuly nukleových kyselín, ako je RNA, zaujmú výhodné konformácie v roztoku. Konformácia je diktovaná interakciami párovaní báz vovnútri tej istej molekuly a vedie k produkcii stabilizovanej štruktúry pozostávajúcej z dvojreťazcových kmeňov a jednoreťazcových slučiek. Molekuly zaujmú konformáciu najnižšej energie a ich štruktúra pre známu sekvenciu RNA môže byť predpovedaná výpočetnými pochodmi (Jaeger J.A. a kol., Proc. Nat. Acad. Sci USA 86, str. 7706 až 7710, 1989). Boli snahy o vytvorenie predpovedného softwaru na ohýbanie DNA s dosiahli určitý úspech (Nielsen D.A. a kol., Nucleic Acids res. 23, str. 2287 až 2291, 1995). Porovnaním rozmerov medzi nukleovou kyselinou a molekulami proteírcv ukazuje veľmi výrazné rozdiely v štruktúrnom usporiadaní týchto dvoch tried molekúl, podporuje však tiež chápanie, ktoré je podkladom vynálezu. Typický globulárny proteín, ako , je myoglobín s molekulovou hmotnosťou 17 kDa, má veľkosť vo svojom najdlhšom rozmere 3 nm. Veľký globulárny proteín, ako je albumín hovädzieho séra s molekulovou hmotnosťou 68 kDa, je vo svojom najväčšom rozmere dlhý 5 nm (Cohen C. vo Wolstenholme
G.E.W and O'Connor M. (vydávatelia) Ciba Foundation Sympózium, Londýn, J and A. Churchill, 1966). Priemer dvojreťazcovej skrutkovice je ako taký 2 nm a reťazec DNA s malým počtom párov báz, asi 100, by dosahoval dĺžky obvodu približne 30 nm. Preto
Ί aj keď je hustota DNA alebo ktorejkoľvek inej molekuly nukleovej kyseliny dosť menšia ako hustota typického proteínu, topológia mlolekuly DNA aj v najviacej štruktúrovanej natívnej forme, ako je dvojitá skrutkovica, by mohla ľahko pokyrť veľké časti vystaveného povrchu temer každej molekuly proteínu. Osobitne, ak nebola topológia zvyčajne jednovláknovej DNA tak zmenená, mohla by DNA zaujímať veľkú časť priestoru spôsobom viacej sa blížiacim k molekulám proteínu s dosť vyššou hustotou. Dá sa konštatovať, že zostava štruktúr nukleových kyselín, pozostávajúcich z radu prepojených reťazcov, z ktorýcýi je každý iba krátky (50), nukleotídových traktov môže ľahko viesť ku štruktúram s celkovými rozmermi rádovo v 10 až 500 nm. Zvláštnym zámerom vynálezu je poskytnúť takú formuláciu molekuly nukleovej kyseliny.
kyseliny, alebo alternatívne definovaných segmentov vovnútri kyseliny. V využitý nie proteínu, nukleovej k priamemu zvláštneho · založené na vytváraní molekúl štruktúrami vytvorenými ako niekoľkých molekúl nukleovej výsledok interakcie rôzne tomto vynáleze je ako kódujúcej jednotky ani ako blokujúcej kyseliny a zostaveniu génovú trojrozmernej
Štruktúry podľa kyseliny sú
DNA alebo RNA so sekundárnymi výsledok interakcie dvoch alebo ako jednotlivých molekúl nukleovej informačný obsah DNA alebo RNA pre expresiu terapeutického jednotky pre metabolizmus expresiu (pozitívnu), alA molekulovej štruktúry tvaru.
Vynáléz syntetické (nerovinné) vovnútri konštruované tak, aby domén, zahrnuje molekuly molekulové molekúl v molekuly nukleových kyselín, najmä DNA, ktoré vytvárajú trojrozmerné štruktúry párovaním špecifických báz súbore. Špecificky sú molekuly DNA mali jednu alebo niekoľko sekvenčných ktoré sa môžu hybridizovať s inými molekulami v súbore na vytvorenie kompozitovej trojrozmernej štruktúry nukleovej kyseliny. Takou schémou sa môže vytvárať približná krychlová štruktúra hybridizáciou šiestich syntetických molekúl DNA, z ktorých každá obsahuje štyri domény komplementarity, pričom každá molekula je v interakcii so štyrmi inými molekulami a pričom každá molekula pôsobí účinne ako jednotlivá hrana šesťbokej krychle. Štruktúra je otvorená (nie kovalentne uzavretá), flexibilná osobitne pre ďalšie útvary pozmeniteľné k modifikácii pridaním ďalších funkčných alebo štruktúrnych skupín.
V jednej štruktúre na bázi nukleovej kyseliny vysokého rádu podľa vynálezu sú molekuly nukleovej kyseliny, z ktorých každá zaujíma dve alebo viacej domén samokomplementárnej sekvencie umožňujúcej molekule nukleovej kyseliny tvoriť záhyby okolo seba samotné a vytvárať vzájomné interakcie k vytváraniu zvláštnej trojrozmernej molekulárnej štruktúry cestou špecifického párovania báz. U niektorých aplikácií sa zistilo, že chemická .nestabilita molekúl nemodifikovanéj DNA bola špecifickým problémom na použitie takých štruktúr ako liečiva. Dnes je k dispozícii niekoľko spôsobov ako chrániť molekuly DNA pred odbúraním enzýmatickým napadnutím. Patrí k nim použitie modifikovaných fosfodiesterových kostier (metylfosfonát, fosforotioát, peptídové nukleové kyseliny) 'alebo úprava čiapočkou 5' a 3' koncov použitím -väzieb fosforameditu, fosforotioátu alebo fosforoditioátu. Podľa vynálezu je osobitne výhodné použiť modifikované alebo neprírodné nukleové kyseliny v štruktúrach na bázi nukleových kyselín vysokého rádu. Nato je osobitne žiadúcim význakom zvýšená flexibilita špecifičnosti viazania dosiahnutá použitím kombinácie chémie a alternatívnych kostier neprirodných nukleových kyselín.
Štruktúra podjednotiek nukleových kyselín vysokého rádu podľa vynálezu môže byť svojou povahou homotypická alebo heterologová, napríklad DNA obsahujúca trakty RNA. Je známe, že trakty RNA vovnútri skrutkovice DNA menia slučkovanie v roztoku (Wang A. a kol., Náture 299, str. 601 až 604, 1982). Schopnosť poskytovať konformačnú rozmanitosť vovnútri lokalizovaného traktu nukleovej kyseliny môže byť významná menením špecifičnosti cieľového proteínu a tento jav je v obore známy, pričom väzobná špecifičnosť trombínového aptaméru je závislá na krátkom trakte vyššie usporiadanej terciárnej štruktúry(Griffin
L. a kol., Gene 137, str. 25 až 31, 1993). Okrem toho môžu byť analógy neprírodnej fosfátovej kostry využité k zlepšeniu stability a tiež pozmenenia väzobnej špecifičnosti žiadaného cieľového proteínu. Latham a kol. (Lathan J.A. a kol., Nucleic Acids Res. 22, str. 2817 až 2822, 1994) uvádza príklad, v ktorom bol použitý modifikovaný nukleotíd 5-(1-pentinyl)-2'deoxyuridínu namiesto tiamidínu v skupine náhodných oligonukleotídov. Vynález zahrnuje molekuly pozostávajúce z traktov jednoreťazcovej štruktúry nukleovej kyseliny preložených traktami dvojreťazcovej štruktúry a ostatné syntetizované chimérne molekuly, aby obsahovali rôzne chemické subštruktúry, avšak spojené s využitím konvenčných pravidiel párovania báz. Takéto štruktúry môžu tiež kombinovať molekuly DNA a RNA.
, Molekulové štruktúry vyššieho rádu podľa vynálezu pozostávajú z jednotlivých alebo z niekoľkonásobných molekúl nukleových kyselín podľa akejkoľvek schémy v obore a môžu druhy syntetických väčších môžu molekúl, byť alebo nukleových kyselín alebo ako sú stavané uľahčeným
Uľahčené jednotkami fragmenty plazrr.idy. vinutím jednotlivých môže byť rekombinantné samočinným vinutím vinutie (enzýmy ako je ligáza, alebo cestou interakcie zahrnovať z ďaleko Štruktúry (samozostavovaním) lineárnych molekúl DNA. sprostredkované proteínovými topizomeráza, endonukleáza, polymeráza) s neproteínovými fyziochemickými podmienkami (hodnota pH, teplota, iontové podmienky). Alternatívne alebo v kombinácii s uvedeným, sa môžu molekuly spojovať interakciou s molekulami viazanými na pevnej matrici, alebo pokiaľ je DNA podrobená vinutiu do štruktúry vyššieho rádu spletená alebo zakotvená v priestore, počas všetkých združovacích procesov alebo ako ich časť.
Druhým význakom vynálezu je poskytnutie knižníc molekúl nukleových kyselín vytvorených tak, že obsahujú polonahodilé molekuly, z ktorých niektoré môžu mať žiadúcu topológiu schopnú interakcie špecifickým spôsobom s cieľovou molekulou. Ide podľa vynálezu o knižnice molekúl nukleových kyselín vykazujúcich vedúci rámec k uľahčeniu zostavy známej štruktúrnej podjednotky. V každej subjednotke vovnútri náhodného traktu sekvencie je začlenená maximalizujúca rozmanitosť knižnice a potenciálna funkčná užitočnosť s ohľadom na aktivitu v selektívnej väzobnej skúške. V druhom význaku vynálezu je zahrnuté uskutočnenie, v ktorom je knižnica vytvorená zo zmesí n-jednotlivých populácií (súbor) syntetických molekúl DNA (subjednotiek). Z tohoto hľadiska je rozmer populácie subjednotiek syntetických nukleových kyselín veľký a je diktovaný stupňom nahodilosti vovnútri premenného segmentu podjednotky. Ďalej je rozmanitosť subjednotiek začlenených do iných uskutočnení variácií umiestnenia variabilnej domény variácií v počte variabilných domén (interspersiou s traktami pevnej sekvencie) a variácií v dĺžke každej danej variabilnej domény. Je výhodné, že n-jednotlivá subjednotková populácia je zmiešaná do jedného cyklu teplotnou hybridizáciou na vytvorenie knižnice radu štruktúr nukleových kyselín a individuálnej sekvenčnej rozmanitosti. Je zrejmé, že iné uskutočnenia môžu zahrnovať mnohonásobné cykly teplotnej hybridizácie a mnohočetné hodnoty celých čísiel n. Zvláštnym význakom knižnice podľa tejto schémy je schopnosť modulovať stupeň komplexitý interpodjednotkovéj interakcie rozumnou konštrukciou a umiestnením komplementárneho alebo vodčieho sekvenčného traktu.
Tretím význakom vynálezu je nová úžitkovosť štruktúr na bázi nukleových kyselín vysokého rádu, najmä pre farmaceutické a diagnostické použitie. Z tohoto hľadiska sú tieto štruktúry schopné väzby na špecifickú cieľovú molekulu ako proteínu tak proteínovej cieľovej molekuly. Ak zahrnuje výhodné uskutočnenie jediný proteínový cieľ, počíta sa s ďalšími uskutočneniami, pričom cieľom je komplex proteínov pozostávajúci z radu proteínových podjednotiek, ako je bunečný povrchový receptor, kolektívne viazaný molekulou prvého význaku vynálezu. Iné uskutočnenie tretieho význaku zahrnuje väzbu na bunečný cieľ alebo na bunečné druhy identifikované schopnosťou viazať molekulu prvého význaku. K ďaľším uskutočneniam patrí väzba na cieľ alebo cieľový komplex obsahujúci neproteínové zložky napríklad uhľohydráty alebo lipidové zlúčeniny bunky a najmä bunečného povrchu. Proteín, uhľovodík a lipidové jednotky alebo ich komplexy môžu byť jednotkami špecifickými pre chorobu alebo môžu byť prítomné ako normálne zložky tkaniva alebo bunky. Cieľ alebo cieľový komplex by obsahoval vírusové častice alebo zložky od vírusu odvodené, ako sú capsidové proteíny alebo od hostiteľa odvodenej zložky vírusového povlaku. Cieľ alebo cieľové komplexy môžu vo svojom zložení obsahovať kovové ionty alebo iné organické chemikálie alebo chemické skupiny a môžu sa vyskytovať prírodné alebo môžu byť zavedené spracovaním s exogénnymi činidlami. Cieľové receptory môžu zahrnovať napríklad IL-2 receptor alebo iné cytokínové receptory, ako sú receptory napríklad pre IL-3, M-CSF, GM-CSF. Taktiež povrchové molekuly, ako receptor IgE, pričom blokáda IgE viazaná spolu s blokádou zosieťovacej aktivácie u receptorov by bol vysoko žiadúci výsledok. Iné povrchové molekuly vrátane série členov zhlukovej diferenciácie (CD antigény) sú žiadúcimi cieľmi pre moduláciu chorôb a najmä pokiaľ ide c choroby autoimunitnej zložky.
Vynález je orientovaný tak, aby mal osobitne rozšírenú použiteľnosť v oblasti terapeutických molekúl. Molekulové štruktúry podľa vynálezu majú agonizovať alebo antagonizovať zvláštne receptory alebo enzýmatické procesy pre liečebné prednosti, beztoho že prispejú k žiadnej z nevýhod konvenčnej proteínovej liečby ako je imunogenicita. Vynález preto zasahuje do spôsobov liečenia chorôb alebo chorobných stavov a ich prevencie a pozostáva v podávaní jedincom účinného množtva molekulovej štruktúry. Vynález tiež zasahuje do používania takých štruktúr diagnóz in vivo a in vitro.
Štvrtý význak vynálezu sa týka štruktúr na bázi nukleových kyselín vysokého rádu s modifikovanými nukleotídami začlenenými do týchto štruktúr. Oddelene od odlišnosti danej vyššie uvedeným druhým význakom alebo prídavné, je obzvlášť žiadúce uplatniť odlišnosť derivatizácií subjednotiek knižnice alebo začlenením modifikovaných báz počas ich syntézy (tiolované báze, biotinylované báze a epsilon-amino derivatizované báze). Získa sa teda vysoko odlišná knižnica s odlišnosťou v obidvoch úrovniach, ako zloženie sekvencie, tak jej dĺžke. Také parametry môžu byť fixované v definovaných medziach pre rôzne knižnice a rôzne cieľové aplikácie. Štruktúry nukleových kyselín vysokého rádu budú tiež obsahovať modifikované nukleotídy schopné prepožičiavať štruktúre osobitne žiadúce vlastnosti spolu s význakmi zaisťujúcimi stabilitu alebo väzobné modulácie ako je vyššie uvedené. Také prídavné žiadúce modifikácie môžu byť začlenené v prvom alebo v druhom význaku vynálezu a zahrnujú použitie hydrofóbnych traktov, zavedenie psoralenových alebo akridínových skupín, väzobné haptenické skupiny, ako je biotín alebo väzbu na rôzne pridané vedľajšie reťazce, ako sú aminoskupiny alebo karboxylové skupiny, k zaisteniu ľahšej väzby na príslušnú cieľovú molekulu. V ďaľšom výhodnom uskutočnení môžu také skupiny pôsobiť ako miesta na pripojenie iných molekúl ako ďalších molekúl nukleových kyselín alebo proteínov, ako je protilátka alebo enzým.
Požadovanou charakteristikou molekúl podľa vynálezu je vysoká stabilita in vitro a in vivo. Chemické zloženie štruktúr· nukleových kyselín jé vysoko ovplyvniteľné a tiež fyzická veľkosť molekuly vyžaduje riadenie k minimalizácii nebezpečia šmyku v roztoku a k maximalizácii funkčnej užitočnosti in vivo. Z toho dôvodu je podľa vynálezu dávaná prednosť multireťazcovým štruktúram nukleovej kyseliny konštruovaným zo všeobecne malých (<80mer) subjednotiek. Alternatívne môže byť žiadúce využitie štruktúry zložené z veľkých subjednotiek (>80 mer), čo taktiež patrí do rozsahu vynálezu.
Piaty význak vynálezu sa týka štruktúr na bázi nukleových kyselín vysokého rádu spojených s inými molekulovými jednotkami. Osobitne tento význak zahrnuje nukleové kyseliny pripojené k jednému miestu alebo k niekoľkým špecifickým miestam k jednému alebo k niekoľkým špecifickým miestam inej molekulovej jednotky, pričom špecifické pripojenie k nukleovej kyseline je uľahčené modifikovanými nukleotídami ako u štvrtého význaku vynálezu. Tento význak osobitne znamená štruktúry na bázi nukleovej kyseliny vysokého rádu pripojené k farmaceutický alebo diagnosticky významným molekulových jednotkám, pričom nukleová kyselina sa viaže na špecifické molekulové ciele súvisejúce s chorobou a pripojená molekulová jednotka sa potom použije na liečenie choroby alebo k jej zisteniu.
Medzi farmaceutický významné jednotky sa rátajú cytokíny, Fc časť protilátok, iné z protilátok odvodené jednotky, toxíny, enzýmy, drogy a prodrogy, agonisty a antagonisty receptorov, samotné molekuly receptorov (osobitne domény viažúce ligandy), radioizotópy, farmaceutický aktívne nukleové kyseliny, transportné nosiče drog ako sú lipozómy, živé alebo zosilnené mikroorganizmy, svetlom aktivované podiely, a iné molekulové jednotky, ktoré vyvolávajú vakcinačný účinok. Diagnosticky významné jednotky obsahujú radioizotópy, svetlom aktivované podiely, napríklad vytvárajúce chemiluminiscenčný signál, fluórchrómy, enzýmy a signálne transportné nosiče, ako sú perly.
V súhrne sú predmetom vynálezu :
- Trojrozmerná štruktúra polynukleovej kyseliny pozostávajúca z mnohých prepojených reťazcov molekúl nukleovej kyseliny alebo z ich segmentov špecifickou párovacou interkaciou báz dvoch alebo niekoľkých molekúl, pričom štruktúra nie je kovalentne uzavretá.
- Zodpovedajúca štruktúra polynukleovej kyseliny tvorená dvomi alebo niekoľkými reťazcami molekuly nukleovej kyseliny.
- Zodpovedajúca štruktúra polynukleovej kyseliny tvorená tromi alebo niekoľkými reťazcami molekuly nukleovej kyseliny.
- Zodpovedajúca štruktúra polynukleovej kyseliny krychlovej alebo y podstate krychlovej formy.
- Zodpovedajúca štruktúra polynukleovej kyseliny, pričom krychlová štruktúra pozostáva zo šiestich Aolekulových reťazcov nukleovej kyseliny, pričom každý molekulový reťazec pôsobí ako samostatná hrana šesťbokej krychle.
- Zodpovedajúca štruktúra polynukleovej kyseliny, pričom každá nukleová sekvencia obsahuje dve alebo niekoľko domén, ktoré môžu hybridizovať k iným molekulám súboru.
- Zodpovedajúca štruktúra polynukleovej kyseliny, pričom každá nukleová sekvencia obsahuje štyri domény.
- Zodpovedajúca štruktúra polynukleovej kyseliny zahrnujúcej molekuly nukleovej kyseliny, ktoré pozostávajú z traktov . jednoreťazcovej nukleovej kyseliny, preloženej traktami dvojreťazcovej štruktúry.
- Zodpovedajúca štruktúra polynukleovej kyseliny, podľa nároku 1 až 8, pričom každý reťazec nukleovej kyseliny má menej ako 80, s výhodou menej ako 50 nukleotídov.
- Zodpovedajúca štruktúra polynukleovej kyseliny, pričom štruktúra má zostavu (Al + BI + Cl) + (A2 + B2 + C2), ako je vyznačené na obr. 1.
- Vyššie definovaná štruktúra polynukleovej kyseliny, pričom táto štruktúra obsahuje podjednotky pozostávajúce z rozmanité náhodných sekvenčných traktov k vytvoreniu ich polonáhodných molekúl alebo segmentov schopných interakcie s cieľovou molekulou.
- Trojrozmerná štruktúra polynukleovej kyseliny obsahujúca podjednotky pozostávajúce z radu navzájom spojených reťazcov molekúl nukleovej kyseliny alebo z ich segmentov špecifickou párovacou interakciou báz dvoch alebo niekoľkých molekúl, pričom každá štruktúra je kovaletne uzavretá a obsahuje podjednotky, ktoré sú zložené z rozmanité nahodilých sekvenčných traktov k získaniu ich polonáhodných molekúl alebo ich segmentov v interakcii s cieľovou molekulou.
- Vyššie definovaná štruktúra polynukleovej kyseliny, pričom zloženie a dĺžka sekvencie je premenlivá.
- Zodpovedajúca štruktúra polynukleovej 'kyseliny, pričom zloženie premenlivej sekvencie sa dosahuje jednou alebo niekoľkými modifikáciami nukleotídov vovnútri sekvencie.
- Vyššie definovaná štruktúra polynukleovej kyseliny, pričom štruktúra obsahuje miesta alebo skupiny nukleových kyselín, ktoré sa môžu viazať alebo pripojovať k inej molekule alebo k pevnej matrici.
- Zodpovedajúca štruktúra polynukleovej kyseliny, pričom uvedenou druhou molekulou je proteín, enzým, lipoproteín, glykozylovahý proteín, imunoglobulín alebo jeho fragment.
- Zodpovedajúca štruktúra polynukleovej kyseliny, pričom uvedenou druhou molekulou je nukleová kyselina.
- Zodpovedajúca štruktúra- polynukleovej kyseliny, pričom druhá molekula je farmaceutický aktívna.
- Farmaceutický prostriedok zahrnujúci vyššie uvedenú štruktúru polynukleovej kyseliny prípadne s vhodnými nosičmi, excipientami alebo riedidlami a/lebo s inými farmaceutický úč i nnými zlúčeni nami.
- Použitie zodpovedajúcej štruktúry polynukleovej kyseliny ako diagnostického činidla.
- Použitie vyššie definovanej štruktúry polynukleovej kyseliny k získaniu knižnice na ovplyvňovanie rozmanitosti špecificky nahodilých topológií k získaniu rôznych funkčností a/lebo činností.
Popis obrázkov na výkresoch
Obr. 1
Popis postupného zostavovania krychlovej štruktúry nukleovej kyseliny zo šiestich jednotlivých jednoreťazcových molekúl označených Αχ, A2, B ’, B=, C a C2. Zostavovanie postupuje cestou bežného párovania antiparalelných báz medzi molekulami nukleových kyselín. Sú znázornené dimerické medziprodukty vytvorené medzi molekulami Βχ a a tiež Ba a . Znázornené sú trimerické štruktúry vytvorené medzi molekulami Αχ, Βχ a C tiež A^, B2 a C=. Zostavenie krychlovej štruktúry je dosiahnuté spojením dvoch trimerických podielov označených ako molekula (Al + BI + Cl) + (A2 + B2 + C2).
Obr. 2
Sekvencia subjednotiek oligonukleotídov IL2R-1 a IL2R-2 obsahujúca štruktúru DNA s väzobnou aktivitou na receptor IL-2. Obr. 3
Sekvencia subjednotiek oligonukleotídov TBR-1 a TBR-2 obsahujúcich štruktúru DNA s väzobnou aktivitou na ľudský trombín.
Vynález objasňujú, nijako však neobmedzujú nasledujúce príklady praktického uskutočnenia.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Spôsob inhibície bunečnej línie závislej na IL-2 za pomoci štruktúry DNA vybranej z knižnice DNA.
Pripravia sa knižnice syntetikcých molekúl DNA, z ktorých každá obsahuje oblasť náhodnej sekvencie. > .
Knižnica A pozostáva z molekúl o štruktúre :
5'AGTCCCAAGCTGGCT(N) CTCCATCGTGAAGTCAGCCAGCTTTGGACT
Knižnica B pozostáva z molekúl o štruktúre :
5'GACTTCACGATGGAGGTCAGAATGTGAATA(N)χqTATTCACATTCTGAC
Tieto sekvencie boli skonštruované k uľahčeniu crosshybridizácie a predstavujú subjednotky knižnice štruktúr vytvorené zmiešaním a crosshybridizáciou rôznych podjednotiek podľa schémy vynálezu.
Knižnice oligonukleotídov (podjednotiek) sa syntetizujú za účelom maximálnej stability s fosforotioátovými väzbami, aby maximalizovali stabilitu za prítomnosti sérových faktorov a čistia sa chromatografiou HPLC. Vyčistené oligonukléotídy sa získajú od GenóSys Biotechnologies (Camridge, UK). Knižnica DNA sa zostaví použitím jednocyklovej crosshybridizácie. Knižnice podjednotiek A a B sa denaturujú, zmiešajú sa a hybridizujú sa za teploty 37° C v roztoku 50 mM Tris o hodnote pH 7,4, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA. Subjednotkové knižnice A a B sa miešajú v ekvimolárnej koncentrácii (10M). Pri iných pokusoch sa miešajú s použitím rozdielnych molárnych pomerov. Zostavenie subjednotiek sa overuje gélovou elektroforézou.
Knižnica štruktúr DNA sa skrínuje na štruktúry schopné viazať zvláštnu bunečnú doménu receptoru IL-2 (IL2R). Uskutoční sa to za pomoci rozpustného rekombinantu IL2R pripraveného podľa uvedených metód (Meidel M.C. a kol., Biochem. Biophys. res. Commun. 154, str. 372 až 379, 1988 : Meidel M.C. a kol.,
J. Biol. Chem. 264, str. 21097 až 21105, 1989). Rekombinantne IL2R sa kovalentne viaže na povrchovo aktivované magnetické perly podľa protokolov doporučených výrobcom (Bangs Labs. Fishers, IN, USA). Perál IL2R sa použije ako afinitného povrchu k selekcii väzobných štruktúr z knižnice štruktúr DNA. Perly IL2R sa nechajú reagovať s knižnicou za radu experimentálnych podmienok vrátane prítomnosti chaotrópnych solí v riadených reakciách. Koncentrácia knižnice (DNA) je približne 100 nmol v hybridizačnom roztoku ako je vyššie uvedené. Väzobné molekuly sa získajú polymerázovou reťazcovou reakciou (PCR) priamo z perál po rozsiahlom pracom cykle roztokom 75 mM Tris HC1, 200 mM NaCl, 0,5 N-oktylglukozid, hodnota pH 8,0. PCR sa vedie za pomoci primeru PRA1 (5'-AGTCCCAAGCTGGCT) k získaniu zložky knižnice A za pomoci štandardných reakčných systémov a podmienok. V zvláštnych reakciách sa použije primerov PRB1 (5'GACTTCACGATGGAG) a PRB2 (5'GTCAGAATGTGAATA) k získaniu zložiek knižnice B. produkty PCR sa klonujú a sekvencujú za pomoci štandardných reakčných systémov a postupov.
Získa sa rad sekvencii a identifikuje sa ako pochádzajúca z podjednotkovéj knižnice A a z podjednotkovéj knižnice B. Z nich sa syntetizuje pár za pomoci fosforotioátovej chémie ako je vyššie uvedené. Oligonukleotidy IL2-R1 a IL2-R2 (sekvencie na obr. 2) sa čistia a spoja ako je vyššie uvedené a použije sa ich ako bunečné skúšky pre antagonizmus IL-2.
TALL-104 (ATCC CRL-11386) je bunečná línia ľudskej , T-bunečnej leukémie. Bunky rastú v suspenznej kultúre á potrebujú IL-2 k optimálnemu rastu. Bunky sa môžu nechať rásť krátky čas bez IL-2, ich rast je však významne znížený. Bunky sa nechajú rásť v Iscoves modifikovanom médiu Dulbeccosa (Life technologies, Paisley, UK) s 50 až 100 u/ml rekombinantnej ľudskej IL-2 (Life Technologies, Paisley, UK) a doplní sa 10 % (objemovo) tepelne aktivovaným teľacím zárodočným sérom. Bunky sa pestujú v prostredí s 8 až 10 % oxidu uhličitého. Zriedenie hybridizovanej IL2-R1/IL2-R2 DNA preparácie a kontrola vzorky DNA obsahujúcej nahodílú sekvenciu identickej kontúrnej dĺžky sa pripraví v kultivačnom prostredí obsahujúcom IL-2. Pripravia sa paralelné série, zriedenia s použitím prostredia prostého IL-2. Roztoky sú od 500 M DNA do 390 nM DNA. Skúšký sa uskutočnia so subspojenými bunkami TALL-104 nanesenými predchádzajúceho dňa na 96-jamkové mikrotitračné doštičky. Bunky sa zhromaždia odstredením, premyjú sa predhriatou (37° C) soľankou pufrovanou fosfátovým pufrom a DNA obsahujúcim médiom pridaným po 48 hodinách. Pokusy sa uskutočňujú štvornásobne. Proliferácia sa posudzuje na konci 48-hodinovej prestávky kolorimetrickou skúškou za použitia obchodne dostupnej tetrazoliovej zlúčeniny a podľa inštrukcií dodávateľa (Promega, Southampton, UK). Mikrotitračné doštičky sa čítajú pri 540 nm.
Výsledky ukazujú, že hybridizované prostriedky DNA inhibujú rast bunečnej línie TALL-104 za podmienok, kedy boli syntetické oligonukleotídy IL2-R1 a IL2-R2 neaktívne.
Príklad 2
Spôsob selekcie štruktúry DNA viažuce sa na ľudský trombín
Knižnica popísaná v príklade 1 sa použije k selekcii štruktúry DNA schopnej väzby na ľudský trombín. Knižnica sa skriňuje za použitia ľudského trombínového prostriedku (Sigma, Poole, UK) viazaného na povrch aktivovaných magnetických perál ako v príklade 1. Trombínové perly sa nechajú reagovať s knižnicou štruktúr DNA ako v príklade 1 s tou výnimkou, že poväzobné premytie sa uskutoční roztokom 20 mM Tris acetátu, hodnota pH 7,4, 140 mM NaCl, 5 mM KC1, 1 mM MgCl^. Viazané molekuly sa získajú priamo z perál za pomoci PCR použitím reakcií a primerových súborov ako v príklade 1. produkty PCR sa klonujú a sekvencujú štandardnými reakčnými systémami a postupmi.
Získa sa rad sekvencii a identifikuje sa ako pochádzajúci z podjednotkovej knižnice A a z podjednotkovéj knižnice B. Z nich sa syntetizuje pár za pomoci fosforotioátovej chémie ako je vyššie uvedené. Oligonukleotídy TB-R1 a TB-R2 (sekvencie na obr. 3) sa čistia a spoja. Komplex TB-R1/TB-R2 sa použije pri skúške inhibície trombínu. Zrážlivosť sa meria fibrometrom pri teplote 37° C u plazmy čerstvo pripravenej od zdravého darcu. Rozsah inhibície trombínu sa stanoví za pomoci štandcuLdnwj krivky vynesenej zrážlivosti v závislosti na koncentrácii trombínu. Zrážlivosť sä meria cez tri log štruktúry DNÁ v skúške.
Výsledok ukazuje inhibíciu zrážlivosti za prítomnosti
TB-R1/TB-R2 DNA komplexu.
Príklad 3
Spôsob s.elekcie štruktúr DNA viažucich sa na rekombinantné rozpustné CD4
Knižnice popísané v príklade 1 sa použijú k selekcii štruktúry DNA prostriedky CD4 prostriedku CD4 schopnej väzby na rekombinantné rozpustné (rsCD4). Štruktúra DNA sa skriňuje za pomoci (BioDesign, Saco, ME, USA) imobilizovaného na aktivovaných magnetických perlách ako je vyššie uvedené.
Skrínovanie knižnice, premytie a selekcia za pomoci PCR sa uskutoční podľa príkladu 2. Syntetizujú a spojujú sa jednotlivé ologinukleotídové páry pochádzajúce zo subjetnotkových knižníc A a B. Štruktúra sa použije k inhibícii väzby anti CD4 monklonálnej RPAT4 (Serotech., Abinston, UK) v enzýme viazaného imunoabsorbantovou skúškou (ELISA).
Doštičky ELISA s 96 jamkami sa pokryjú cez noc 0,2 mg/ml roztoku rsCD4 v povliekacom pufri (0,05 M karbonát-bikarbonátový pufor, hodnota pH 9,0) za teploty 4° C. Doštičky sa premyjú intenzívne za pomoci TBS-T (tris-pufrovará solanka o hodnote pH 8,0, objemovo 0,05 % Tweenu 20) a testované a kontrolné štruktúry DNA sa zriedia (1:2) a testované a kontrolné štruktúry DNA sa zriedia (1:2). na doštičke v TBS ž východzej koncentrácie 100 £>M. Doštičky sa inkubujú 40 minút za teploty 37° C a premyjú sa TBS. Pridá sa k doštičke 100 ng/ml prípravku protilátky RPAT4 v. PBS a inkubuje sa 40 minút za teploty 37° C. Doštičky sa premyjú a naviazaný RPAT4 sa gistí za pomoci alkalického fosfatázou označeného ovčieho, protimyšacieho prostriedku (Sigma, Poole, UK) a Sigma Fast OPD (Sigma, Poole, UK) ako farebného substrátu. . V niektorých skúškach sa DNA spoločne inkubuje s monoklonálnym
RPAT4. Farebná intenzita sa odčítava doskovým čítacím zariadením a signál sa porovnáva medzi testovanými a kontrolnými jamkami. Výsledky ukazujú významnú inhibíciu väzby RPAT4 na reCDE4 za prítomnosti štruktúry DNA.
Priemyselná využiteľnosť
Štruktúry na bázi nukleových kyselín vysokého rádu na výrobu farmaceutických prostriedkov na liečneie a diagnostiku chorôb.

Claims (22)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Trojrozmerná štruktúra polynukleovej kyseliny pozostávajúcej z mnohých prepojených reťazcov molekúl nukleovej kyseliny alebo ich segmentov špecifickou párovacou interkaciou báz dvoch alebo niekoľkých molekúl, pričom štruktúry nie sú kovalentne uzavreté.
  2. 2. Trojrozmerná štruktúra nároku 1 tvorená dvomi alebo nukleovej kyseliny.
    polynukleovej kyseliny podľa niekoľkými reťazcami molekuly
  3. 3. Trojrozmerná štruktúra nároku 2 tvorená tromi 'alebo nukleovej kyseliny.
    polynukleovej kyseliny podľa niekoľkými reťazcami molekuly
  4. 4. Trojrozmerná štruktúra polynukleovej kyseliny podľa nároku 1 až 3 tvaru krychle alebo v podstate tvaru krychle.
  5. 5. Trojrozmerná štruktúra polynukleovej kyseliny podľa nároku 3 tvorená šiestimi molekulovými reťazcami, pričom každý molekulový reťazec pôsobí ako samostatná hrana šesťbokej krychle.
  6. 6. Trojrozmerná štruktúra polynukleovej kyseliny podľa nároku 1 až 5, pričom každú nukleovú sekvenciu tvorí dve alebo niekoľko domén, ktoré môžu hybridizovať k iným molekulám súboru.
  7. 7. Trojrozmerná štruktúra polynukleovej kyseliny podľa nároku 6, pričom každá nukleová sekvencia pozostáva zo štyroch domén.
  8. 8. Trojrozmerná štruktúra polynukleovej kyseliny podľa nároku 1 až 7 zahrnujúca molekuly nukleovej kyseliny, ktoré pozostávajú z traktov jednoreťazcovej nukleovej kyseliny, preložených traktami dvojreťazcovej štruktúry.
  9. 9. Trojrozmerná štruktúra polynukleovej kyseliny podľa nároku 1 až 8, pričom každý reťazec nukleovej kyseliny má menej ako 80 nukleotidov.
  10. 10. Trojrozmerná štruktúra polynukleovej kyseliny podľa nároku 9, pričom každý reťazec nukleovej kyseliny má menej ako 50 nukleotidov.
  11. 11. Trojrozmerná štruktúra polynukleovej kyseliny podľa nároku 1 až 10 majúci zostavu (Al + BI + Cl) + (A2 + B2 + C2) ako je vyznačené na obr. 1.
  12. 12. Trojrozmerná štruktúra polynukleovej kyseliny podľa nároku 1 až 11 obsahujúca podjednotky pozostávajúce z rozmanité náhodných sekvenčných traktov k vytvoreniu ich semináhodných molekúl alebo segmentov schopných interakcie s cieľovou molekulou.
  13. 13. Trojrozmerná štruktúra polynukleovej kyseliny obsahujúca podjednotky pozostávajúce z radu navzájom spojených reťazcov molekúl nukleovej kyseliny alebo ich segmentov špecifickou párovacou interakciou báz dvoch alebo niekoľkých molekúl, pričom je každá štruktúra kovalentne uzavretá a obsahuje podjednotky, ktoré sú zložené z rozmanité nahodilých sekvenčných traktov k získaniu ich semináhodných segmentov v interakcii s cieľovou· molekulou.
  14. 14. Trojrozmerná štruktúra polynukleovej kyseliny podľa nároku 1 až 13 premenlivého zloženia o dĺžke sekvencie.
  15. 15. Trojrozmerná štruktúra polynukleovej kyseliny podľa nároku 14, pričom zloženie premenlivej sekvencie sa dosahuje jednou alebo niekoľkými modifikáciami nukleotídov vovnútri sekvencie.
  16. 16. Trojrozmerná štruktúra polynukleovej kyseliny podľa nároku 1 až 15 obsahujúca miesta alebo skupiny nukleových kyselín, ktoré sa môžu viazať alebo pripojovať k inej molekule alebo k pevnej matrici.
  17. 17. Trojrozmerná štruktúra polynukleovej kyseliny podľa nároku 16, pričom uvedenou druhou molekulou je proteín, enzým, lipoproteín, glykozylovaný proteín, imunoglobulín alebo jeho f ragment.
  18. 18. Trojrozmerná štruktúra polynukleovej kyseliny podľa nároku 16, pričom druhou molekulou je nukleová kyselina.
  19. 19. Trojrozmerná štruktúra polynukleovej kyseliny podľa nároku 16 až 18, ktorá je farmaceutický účinná.
  20. 20. Farmaceutický prostriedok vyznačujúci sa tým, že obsahuje trojrozmernú štruktúru polynukleovej kyseliny podľa nároku 1 až 19 prípadne s vhodnými nosičmi, excipientami alebo riedidlami a/lebo s inými farmaceutickými účinnými zlúčeninami.
  21. 21. Použitie trojrozmernej štruktúry polynukleovej kyseliny podľa nároku 1 až 18 ako.diagnostické činidlo.
  22. 22. Použitie trojrozmernej štruktúry polynukleovej kyseliny podľa nároku 12 alebo 13 k získaniu knižnice na ovplyvňovanie rozmanitosti špecificky nahodilých topológií k získaniu rôznych funkčností a/lebo činností.
SK604-2002A 1999-11-13 2000-11-13 High order nucleic acid based structures SK6042002A3 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9926810.4A GB9926810D0 (en) 1999-11-13 1999-11-13 High order nucleic acid-based structures
GB0011126A GB0011126D0 (en) 2000-05-10 2000-05-10 High order nucleic acid-based structures
PCT/EP2000/011197 WO2001036624A1 (en) 1999-11-13 2000-11-13 High order nucleic acid based structures

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK6042002A3 true SK6042002A3 (en) 2002-12-03

Family

ID=26244234

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK604-2002A SK6042002A3 (en) 1999-11-13 2000-11-13 High order nucleic acid based structures

Country Status (16)

Country Link
EP (1) EP1228201A1 (sk)
JP (1) JP2003522524A (sk)
KR (1) KR20020059727A (sk)
CN (1) CN1390253A (sk)
AU (1) AU782880B2 (sk)
BR (1) BR0015484A (sk)
CA (1) CA2391084A1 (sk)
CZ (1) CZ20021472A3 (sk)
HK (1) HK1052529A1 (sk)
HU (1) HUP0203914A2 (sk)
MX (1) MXPA02004727A (sk)
NO (1) NO20022231D0 (sk)
PL (1) PL358811A1 (sk)
RU (1) RU2002113755A (sk)
SK (1) SK6042002A3 (sk)
WO (1) WO2001036624A1 (sk)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2487300A (en) 1998-12-31 2000-07-31 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
AU2002320314A1 (en) 2001-07-05 2003-01-21 Chiron, Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
WO2013022694A1 (en) * 2011-08-05 2013-02-14 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods relating to nucleic acid nano-and micro-technology
CN104781416B (zh) 2012-07-24 2017-07-04 哈佛学院院长及董事 核酸纳米结构的自装配
US9975916B2 (en) 2012-11-06 2018-05-22 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods relating to complex nucleic acid nanostructures
JP2017505104A (ja) * 2013-11-08 2017-02-16 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド インビボにおける薬剤送達のための核酸ナノ構造体
TWI621584B (zh) 2014-05-22 2018-04-21 哈佛大學校長及研究員協會 可縮放核酸奈米製造技術
US11414694B2 (en) 2016-03-11 2022-08-16 Children's Medical Center Corporation Nucleic acid nanoswitch catenanes
CN115948505B (zh) 2016-08-02 2025-07-25 哈佛学院院长及董事 交叉协同自组装体
WO2020011248A1 (zh) * 2018-07-12 2020-01-16 百药智达（北京）纳米生物技术有限公司 核酸纳米颗粒、包含其的药物组合物、含阿霉素的药物及其制备方法
CN110711254B (zh) * 2018-07-12 2022-07-26 百药智达（北京）纳米生物技术有限公司 核酸纳米颗粒及包含其的药物组合物
CN110960542B (zh) * 2018-09-30 2022-07-26 百药智达（北京）纳米生物技术有限公司 含吡柔比星的药物、其制备方法、药物组合物及其应用
CN110960534B (zh) * 2018-09-30 2022-07-26 百药智达（北京）纳米生物技术有限公司 含五氟尿嘧啶的药物、其制备方法、药物组合物及其应用
CN110960536B (zh) * 2018-09-30 2022-07-26 百药智达（北京）纳米生物技术有限公司 含阿司匹林的药物、其制备方法、药物组合物及应用
CN110960530B (zh) * 2018-09-30 2022-07-22 百药智达（北京）纳米生物技术有限公司 含他克林的药物、其制备方法、药物组合物及其应用
CN110960690B (zh) * 2018-09-30 2022-07-22 百药智达（北京）纳米生物技术有限公司 含表柔比星的药物、其制备方法、药物组合物及其应用
CN111053765B (zh) * 2018-10-16 2022-07-26 百药智达（北京）纳米生物技术有限公司 含紫杉醇的药物、其制备方法、药物组合物及应用
CN111068065B (zh) * 2018-10-22 2022-07-26 百药智达（北京）纳米生物技术有限公司 含奥沙利铂的药物、其制备方法、药物组合物及其应用
CN111084887B (zh) * 2018-10-23 2022-07-22 百药智达（北京）纳米生物技术有限公司 含黄酮的药物、其制备方法、药物组合物及应用
CN111096965B (zh) * 2018-10-29 2022-07-26 百药智达（北京）纳米生物技术有限公司 含双氢青蒿素的药物、其制备方法、药物组合物及其应用
WO2020210468A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 President And Fellows Of Harvard College Nucleic acid nanostructures crosslinked with oligolysine

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0151631A1 (en) * 1983-08-03 1985-08-21 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acid branched junctions with precisely defined migrational mobility
US5386020A (en) * 1991-01-10 1995-01-31 New York University Multiply connected, three-dimensional nucleic acid structures
US5278051A (en) * 1991-12-12 1994-01-11 New York University Construction of geometrical objects from polynucleotides
US6072044A (en) * 1996-04-26 2000-06-06 New York University Nanoconstructions of geometrical objects and lattices from antiparallel nucleic acid double crossover molecules

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001036624A1 (en) 2001-05-25
AU2000101A (en) 2001-05-30
AU782880B2 (en) 2005-09-08
NO20022231L (no) 2002-05-10
JP2003522524A (ja) 2003-07-29
PL358811A1 (en) 2004-08-23
NO20022231D0 (no) 2002-05-10
CZ20021472A3 (cs) 2002-07-17
CA2391084A1 (en) 2001-05-25
CN1390253A (zh) 2003-01-08
HUP0203914A2 (en) 2003-03-28
RU2002113755A (ru) 2004-01-10
HK1052529A1 (zh) 2003-09-19
BR0015484A (pt) 2002-07-02
MXPA02004727A (es) 2002-08-30
KR20020059727A (ko) 2002-07-13
EP1228201A1 (en) 2002-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK6042002A3 (en) High order nucleic acid based structures
Brown et al. Development of better aptamers: structured library approaches, selection methods, and chemical modifications
US11111495B2 (en) Method for generating aptamers with improved off-rates
US7179894B2 (en) Combinatorial selection of oligonucleotide aptamers
US8404830B2 (en) Method for generating aptamers with improved off-rates
CN101809167B (zh) 产生具有改良的解离速率的适配体的方法
BRPI0417830B1 (pt) métodos para síntese de uma molécula compreendendo uma porção funcional operativamente ligada a um oligonucleotídeo de codificação
JP2001504448A (ja) 核酸の鏡面対称選択および進化
PT1266025E (pt) Esqueletos proteicos para imitadores de anticorpos e outras proteínas de ligação
Kopylov et al. Combinatorial chemistry of nucleic acids: SELEX
KR20040018316A (ko) 스캐폴드 구조의 ｃ-타입 렉틴 유사 도메인을 가지는단백질의 조합 라이브러리
AU2006292524A1 (en) Focused libraries, functional profiling, laser selex and deselex
Lato et al. Screening chemical libraries for nucleic-acid-binding drugs by in vitro selection: a test case with lividomycin
RU2652952C1 (ru) Способ создания и селекции библиотеки модифицированных аптамеров
ZA200204728B (en) High order nucleic acid based structures.
JPH09154585A (ja) マイクロ遺伝子のランダム重合体作成方法
Gat et al. Template‐Directed Ligation: Towards the Synthesis of Sequence Specific Polymers
Polisky Progress towards Therapeutic Application of SELEX-derived Aptamers
POLISKY Progress towards Therapeutic Application of SELEX-derived
Schürmann et al. Aptamer Adaptability: Utilizing Tumor Cell Surface Heterogeneity to Self-Select Appropriate Diagnostic and Therapeutic Agents
WO2005056794A2 (en) Agents for the regulation of transcription via zinc-finger proteins
WO2005010016A2 (en) Thioaptamers enable discovery of physiological pathways and new therapeutic strategies

Legal Events

Date Code Title Description
FC9A Refused patent application