BRPI0417830B1 - métodos para síntese de uma molécula compreendendo uma porção funcional operativamente ligada a um oligonucleotídeo de codificação - Google Patents

Abstract

"MÉTODOS PARA A SINTESE DE BIBLIOTECAS CODIFICADAS". A presente invenção proporciona um método de síntese de bibliotecas de moléculas as quais incluem um rótulo de oligonucleotídeo de codificação.

Description

MÉTODOS PARA SÍNTESE DE UMA MOLÉCULA COMPREENDENDO UMA PORÇÃO FUNCIONAL OPERATIVAMENTE LIGADA A UM OLIGONUCLEOTÍDEO DE CODIFICAÇÃO Pedidos Relacionados

[0001] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório U.S. N° de série 60/530854, depositado em 17 de Dezembro de 2003; Pedido de Patente Provisório U.S. N° de série 60/540681, depositado em 30 de Janeiro de 2004; Pedido de Patente Provisório U.S. N° de série 60/553.715, depositado em 15 de Março de 2004; e Pedido de Patente Provisório U.S. N° de série 60/588,672, depositado em 16 de Julho de 2004, os conteúdos inteiros de cada um dos quais são incorporados aqui por referência.

Antecedentes da Invenção

[0002] A busca por métodos mais eficientes de identificação de compostos tendo atividades biológicas úteis levou ao desenvolvimento de métodos para seleção de grandes números de compostos distintos, presentes em coleções referidas como bibliotecas combinatoriais. Tais bibliotecas podem incluir 105 ou mais compostos distintos. Existe uma variedade de métodos para a produção de bibliotecas combinatoriais e a síntese combinatorial de peptídeos, peptidomiméticos e pequenas moléculas orgânicas foi reportada.

[0003] Os dois maiores desafios no uso de abordagens combinatoriais na descoberta de fármacos são a síntese de bibliotecas de complexidade suficiente e a identificação de moléculas as quais são ativas nas seleções usadas. Geralmente, sabe-se que quanto maior o grau de complexidade de uma biblioteca, isto é, o número de estruturas distintas presentes na biblioteca, maior a probabilidade de que a biblioteca contenha moléculas com a atividade de interesse. Portanto, a química empregada em síntese de biblioteca deve ser capaz de produzir grandes números de compostos dentro de um período de tempo razoável. Contudo, para uma determinada concentração formal ou global, o aumento do número de membros distintos dentro da biblioteca diminui a concentração de qualquer membro em particular na biblioteca. Isso complica a identificação de moléculas ativas a partir de bibliotecas de alta complexidade.

[0004] Uma abordagem para superar esses obstáculos tem sido o desenvolvimento de bibliotecas codificadas e, particularmente, bibliotecas nas quais cada composto inclui um tag amplificável. Tais bibliotecas incluem bibliotecas DNA-codificadas, nas quais um tag de DNA que identifica um membro da biblioteca pode ser amplificado usando técnicas de biologia molecular, tal como a reação em cadeia de polimerase. Contudo, o uso de tais métodos para a produção de bibliotecas muito grandes ainda tem de ser demonstrado e está claro que métodos aperfeiçoados para a produção de tais bibliotecas são requeridos para a obtenção do potencial dessa abordagem para a descoberta de fármacos.

Sumário da Invenção

[0005] A presente invenção proporciona um método de síntese de bibliotecas de moléculas a qual inclui um tag de oligonucleotídeo de codificação. O método utiliza uma estratégia de "fragmentação e compartilhamento" no qual uma solução compreendendo um iniciador, compreendendo um primeiro bloco de construção ligado a um oligonucleotídeo de codificação, é dividido ("fragmentado") em frações múltiplas. Em cada fração, o iniciador é reagido com um segundo bloco de construção único e um segundo oligonucleotídeo único o qual identifica o segundo bloco de construção. Essas reações podem ser simultâneas ou seqüenciais e, se seqüenciais, qualquer reação pode preceder a outra.

[0006] As moléculas diméricas produzidas em cada uma das frações são combinadas ("compartilhadas") e, então, divididas novamente em frações múltiplas. Cada uma dessas frações é, então, reagida com um terceiro bloco de construção único (fração-específico) e um terceiro oligonucleotídeo único o qual codifica o bloco de construção. O número de moléculas únicas presente na biblioteca resultante é uma função: (1) do número de diferentes blocos de construção usados em cada etapa da síntese e (2) do número de vezes em que o processo de compartilhamento e divisão é repetido.

[0007] Em uma modalidade, a invenção proporciona um método de síntese de uma molécula compreendendo ou consistindo em uma porção funcional a qual é operativamente ligada a um oligonucleotídeo de codificação. O método inclui as etapas de: (1) fornecimento de um composto iniciador consistindo em uma porção funcional compreendendo n blocos de construção, em que n é um número inteiro de 1 ou maior, em que a porção funcional compreende pelo menos um grupo reativo e em que a porção funcional é operativamente ligada a um oligonucleotídeo inicial; (2) reação do composto iniciador com um bloco de construção compreendendo pelo menos um grupo reativo complementar, em que o pelo menos um grupo reativo complementar é complementar ao grupo reativo da etapa (1), sob condições adequadas para reação do grupo reativo e do grupo reativo complementar para formar uma ligação covalente; (3) reação do oligonucleotídeo inicial com um oligonucleotídeo de entrada o qual identifica o bloco de construção da etapa (b) na presença de uma enzima a qual catalisa a ligação do oligonucleotídeo inicial e do oligonucleotídeo de entrada, sob condições adequadas para ligação do oligonucleotídeo de entrada e do oligonucleotídeo inicial, desse modo, produzindo uma molécula a qual compreende ou consiste em uma porção funcional compreendendo n+1 blocos de construção os quais são operativamente ligados a um oligonucleotídeo de codificação. Se a porção funcional da etapa (3) compreende um grupo reativo, as etapas 1-3 podem ser repetidas uma ou mais vezes, desse modo formando, ciclos 1 a i, em que i é um número inteiro de 2 ou maior, com o produto da etapa (3) de um ciclo s, em que s é um número inteiro de i-1 ou menos, se tornando o composto iniciador do ciclo s+1.

[0008] Em uma modalidade, a invenção proporciona um método de síntese de uma biblioteca de compostos, em que os compostos compreendem uma porção funcional compreendendo dois ou mais blocos de construção os quais são operativamente ligados a um oligonucleotídeo o qual identifica a estrutura da porção funcional. O método compreende as etapas de (1) fornecimento de uma solução compreendendo compostos iniciadores, em que n é um número inteiro de 1 ou maior, em que os compostos iniciadores consistem em uma porção funcional compreendendo n blocos de construção, em que n é um número inteiro de 1 ou maior, a qual é operativamente ligada a um oligonucleotídeo inicial o qual identifica os n blocos de construção; (2) dividindo a solução da etapa (1) em r frações, em que r é um número inteiro de 2 ou maior; (3) reação dos compostos iniciadores em cada fração com um dos r blocos de construção, desse modo, produzindo r frações compreendendo compostos consistindo em uma porção funcional compreendendo n+1 blocos de construção operativamente ligada ao oligonucleotídeo inicial; (4) reação do oligonucleotídeo inicial em cada fração com um de um conjunto de r oligonucleotídeos de entrada distintos na presença de uma enzima a qual catalisa a ligação do oligonucleotídeo de entrada e do oligonucleotídeo inicial, sob condições adequadas para ligação enzimática do oligonucleotídeo de entrada e do oligonucleotídeo inicial, desse modo, produzindo r alíquotas compreendendo moléculas consistindo em uma porção funcional compreendendo n+1 blocos de construção operativamente ligada a um oligonucleotídeo alongado o qual codifica os n+1 blocos de construção. Opcionalmente, o método pode incluir ainda a etapa de (5) recombinação das r frações produzidas na etapa (4), desse modo, produzindo uma solução compreendendo compostos consistindo em uma porção funcional compreendendo n + 1 blocos de construção, a qual é operativamente ligada a um oligonucleotídeo alongado. As etapas (1) a (5) podem ser conduzidas uma ou mais vezes para proporcionar ciclos 1 a i, em que i é um número inteiro de 2 ou maior. No ciclo s+1, em que s é um número inteiro de i-1 ou menos, a solução compreendendo m compostos iniciadores da etapa (1) é a solução da etapa (5) do ciclo s. Da mesma forma, os compostos iniciadores da etapa (1) do ciclo s+1 são os compostos da etapa (5) do ciclo s.

[0009] Em uma modalidade preferida, os blocos de construção são acoplados em cada etapa usando reações químicas convencionais. Os blocos de construção podem ser acoplados para produzir polímeros ou oligômeros lineares ou ramificados, tais como peptídeos, peptidomiméticos e peptóides ou moléculas não-oligoméricas, tais como moléculas compreendendo uma estrutura de armação à qual é presa uma ou mais porções químicas adicionais.. Por exemplo, se os blocos de construção são resíduos de aminoácido, os blocos de construção podem ser acoplados usando estratégias-padrão de síntese de peptídeo, tais como síntese em fase sólida ou em fase em solução usando estratégias de proteção/desproteção adequadas, conforme é conhecido no campo. De preferência, os blocos de construção são acoplados usando química em fase em solução. Os oligonucleotídeos de codificação são oligonucleotídeos filamento simples ou filamento duplo, de preferência oligonucleotídeos filamento duplo. Os oligonucleotídeos de codificação são, de preferência, oligonucleotídeos de 4 a 12 bases ou pares de base por bloco de construção; os oligonucleotídeos de codificação podem ser acoplados usando metodologia-padrão de síntese de oligonucleotídeo em fase em solução ou fase sólida, mas são, de preferência, acoplados usando um processo enzimático de fase em solução. Por exemplo, os oligonucleotídeos podem ser acoplados usando uma topoisomerase, uma ligase ou uma DNA polimerase, se a sequência dos oligonucleotídeos de codificação inclui uma sequência de iniciação para ligação através de uma dessas enzimas. Acoplamento enzimático dos oligonucleotídeos de codificação oferece as vantagens de (1) maior precisão de adição comparado ao acoplamento sintético padrão (não-enzimático); e (2) o uso de uma estratégia de proteção/desproteção mais simples.

[00010] Em outro aspecto, a invenção proporciona compostos da Fórmula I:

[00011] em que X é uma porção funcional compreendendo um ou mais blocos de construção; Z é um oligonucleotídeo preso em seu término 3' a B; Y é um oligonucleotídeo o qual é preso em seu término 5' a C; A é um grupo funcional que forma uma ligação covalente com X; B é um grupo funcional que forma uma ligação com a extremidade 3' de Z; C é um grupo funcional que forma uma ligação com a extremidade 5' de Y; D, F e E são cada um, independentemente, um grupo de ligação funcional; e S um átomo ou uma armação molecular. Tais compostos incluem aqueles os quais são sintetizados usando os métodos da invenção.

[00012] A invenção ainda se refere a uma biblioteca de compostos compreendendo compostos compreendendo uma porção funcional compreendendo dois ou mais blocos de construção a qual é operativamente ligada a um oligonucleotídeo o qual codifica a estrutura da porção funcional. Tais bibliotecas podem compreender de cerca de 102 a cerca de 1012 ou mais membros distintos, por exemplo,102,103,104,105,106, 107, 108,109 ,1010, 1011, 1012 ou mais membros distintos, isto é, estruturas moleculares distintas.

[00013] Em uma modalidade, a biblioteca de compostos compreende compostos os quais são cada um, independentemente, da Fórmula I:

[00014] em que X é uma porção funcional compreendendo um ou mais blocos de construção; Z é um oligonucleotídeo preso em seu término 3' a B; Y é um oligonucleotídeo o qual é preso em seu término 5' a C; A é um grupo funcional que forma uma ligação covalente com X; B é um grupo funcional que forma uma ligação com a extremidade 3' de Z; C é um grupo funcional que forma uma ligação com a extremidade 5' de Y; D, F e E são cada um, independentemente, um grupo de ligação funcional; e S um átomo ou uma armação molecular. Tais bibliotecas incluem aquelas as quais são sintetizadas usando os métodos da invenção.

[00015] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para identificação de um composto o qual se liga a um alvo biológico, o referido método compreendendo as etapas de: (a) contato do alvo biológico com uma biblioteca de compostos da invenção, em que a biblioteca de compostos inclui compostos os quais compreendem uma porção funcional compreendendo dois ou mais blocos de construção a qual é operativamente ligada a um oligonucleotídeo o qual codifica a estrutura da porção funcional. Essa etapa é conduzida sob condições adequadas para que pelo menos um membro da biblioteca de compostos se ligue ao alvo; (2) remoção de membros da biblioteca que não se ligam ao alvo; (3) amplificação dos oligonucleotídeos de codificação de pelo menos um membro da biblioteca de compostos o qual se liga ao alvo; (4) seqüenciamento dos oligonucleotídeos de codificação da etapa (3); e uso das sequências determinadas na etapa (5) para determinar a estrutura das porções funcionais dos membros da biblioteca de compostos os quais se ligam ao alvo biológico.

[00016] A presente invenção proporciona várias vantagens na identificação de moléculas tendo uma propriedade desejada. Por exemplo, os métodos da invenção permitem o uso de uma série de reações químicas para construção das moléculas na presença do tag de oligonucleotídeo. Os métodos da invenção também proporcionam um meio com alta fidelidade de incorporação de tags de oligonucleotídeo nas estruturas químicas assim produzidas. Ainda, eles permitem a síntese de bibliotecas tendo um grande número de cópias de cada membro, desse modo, permitindo ciclos múltiplos de seleção contra um alvo biológico, ao mesmo tempo em que deixa um número suficiente de moléculas após o ciclo final para amplificação e seqüenciamento do tags de oligonucleotídeo.

Breve Descrição dos Desenhos

[00017] A Figura 1 é uma representação esquemática da ligação de oligonucleotídeos filamento duplo, na qual o oligonucleotídeo inicial tem uma saliência a qual é complementar à saliência do oligonucleotídeo de entrada. O filamento inicial é representada como livre, conjugada a um ligante de aminohexila ou conjugada a um resíduo de fenilalanina via um ligante de aminohexila.

[00018] A Figura 2 é uma representação esquemática da ligação de oligonucleotídeo usando um filamento entalado. Nessa modalidade, a tala é um oligonucleotídeo de 12-mer com sequências complementares ao oligonucleotídeo inicial filamento simples e ao oligonucleotídeo de entrado filamento simples.

[00019] A Figura 3 é uma representação esquemática da ligação de um oligonucleotídeo inicial e um oligonucleotídeo de entrada, quando o oligonucleotídeo inicial formo filamento duplo com filamentos covalentemente ligados e o oligonucleotídeo de entrada é filamento duplo.

[00020] A Figura 4 é uma representação esquemática do alongamento de oligonucleotídeo usando uma polimerase. O filamento inicial é representada como livre, conjugado a um ligante de aminohexila ou conjugado a um resíduo de fenilalanina via um ligante de aminohexila.

[00021] A Figura 5 é uma representação esquemática de um ciclo de síntese de uma modalidade da invenção.

[00022] A Figura 6 é uma representação esquemática de um processo de seleção com ciclos múltiplos usando as bibliotecas da invenção.

[00023] A Figura 7 é um gel resultante de eletroforese dos produtos de cada um dos ciclos 1 a 5 descritos no Exemplo 1 e após ligação do iniciador de fechamento. Padrões de peso molecular são mostrados na fileira 1 e as quantidades indicadas de um hiperladder, para quantificação de DNA, são mostradas na fileiras 9 a 12.

[00024] A Figura 8 é uma representação esquemática do acoplamento de blocos de construção usando cicloadição com azida-alcino.

[00025] As Figuras 9 e 10 ilustram o acoplamento de blocos de construção via substituição aromática nucleofílica sobre uma triazina clorada.

[00026] A Figura 11 mostra estruturas heteroaromáticas cloradas representativas adequadas para uso na síntese de porções funcionais.

[00027] A Figura 12 ilustram a ciclização de um peptídeo linear usando a reação de cicloadição com azida/alcino.

[00028] A Figura13a é um cromatograma da biblioteca produzida conforme descrito no Exemplo 2 após o Ciclo 4.

[00029] A Figura 13b é um espectro de massa da biblioteca produzida conforme descrito no Exemplo 2 após o Ciclo 4.

Descrição Detalhada da Invenção

[00030] A presente invenção se refere a métodos de produção de compostos e bibliotecas combinatoriais de compostos, os compostos e bibliotecas produzidas via os métodos da invenção e métodos de uso das bibliotecas para identificar compostos tendo uma propriedade desejada, tal como uma atividade biológica desejada. A invenção ainda se refere aos compostos identificados usando esses métodos.

[00031] Uma variedade de abordagens foram usadas para produzir e selecionar bibliotecas químicas combinatoriais. Exemplos incluem métodos nos quais os membros individuais de uma biblioteca são fisicamente separados uns dos outros, tal como quando um único composto é sintetizado em cada um de uma série de vasos de reação. Contudo, essas bibliotecas, tipicamente, selecionam um composto de cada vez ou no máximo, vários compostos de cada vez e nenhum, portanto, resultando em um processo de seleção mais eficiente. Em outros métodos, compostos são sintetizados sobre suportes sólidos. Tais suportes sólidos incluem lascas nas quais compostos específicos ocupam regiões específicas da lasca ou membrana ("posição endereçável"). Em outros métodos, compostos são sintetizados sobre contas, com cada contas contendo uma estrutura química diferente.

[00032] Duas dificuldades que surgem na seleção de grandes bibliotecas são (1) o número de compostos distintos que podem ser selecionados; e (2) a identificação de compostos os quais são ativos na seleção. Em um método, os compostos os quais são ativos na seleção são identificados através de estreitamento da biblioteca original em frações e subfrações ainda menores, em cada caso, selecionando a fração ou subfração a qual contém compostos ativos e subdividindo-se ainda até obter uma subfração ativa a qual contém um conjunto de compostos os quais são suficientemente menores que todos os membros do subconjunto podem ser individualmente sintetizados e avaliados com relação à atividade desejada. Isso é uma atividade tediosa e que consome tempo.

[00033] Outro método de desconvolução dos resultados de uma seleção de uma biblioteca combinatorial é utilizar bibliotecas nas quais os membros da biblioteca são rotulados com um tag de identificação, isto é, cada tag presente em uma biblioteca está associado a uma estrutura de composto distinta presente em uma biblioteca, de modo que a identificação do tag revele a estrutura da molécula rotulada. Uma abordagem para bibliotecas rotuladas utiliza tags de oligonucleotídeo, conforme descrito, por exemplo, nas Patentes US Nos. 5.573.905; 5.708.153; 5.723.598, 6.060.596, pedidos PCT publicados WO93/06121; WO 93/20242; WO 94/13623; WO 00/23458; WO ( 02/074929 e WO 02/103008 e em Brenner e Lerner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5381-5383 (1992); Nielsen e Janda (Methods: A Companion to methods in Enzymology 6,361-371 (1994); e Nielsen, Brenner e Janda (J. Am. Chem. Soc. 115, 9812-9813 (1993) ), cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Tais tags podem ser amplificados usando, por exemplo, reação em cadeia de polimerase, para produzir muitas cópias do tag e identificar o tag através de seqüenciamento. A sequência do tag, então, identifica a estrutura da molécula de ligação, a qual pode ser sintetizada na forma pura e testada. Até o momento, não foi reportado o uso da metodologia descrita por Lerner e outros para preparar grandes bibliotecas. A presente invenção proporciona um aperfeiçoamento em métodos para produzir bibliotecas DNA-codificadas, assim como os primeiros exemplos de grandes (105 membros ou mais) bibliotecas de moléculas DNA-codificadas nas quais a porção funcional é sintetizada usando métodos sintéticos em fase em solução.

[00034] A presente invenção proporciona métodos os quais permitem a síntese fácil de bibliotecas combinatoriais oligonucleotídeo-codificadas e permitem um meio eficiente, com alta fidelidade para adição de tal tag de oligonucleotídeo a cada membro de uma grande coleção de moléculas.

[00035] Os métodos da invenção incluem métodos para a síntese de moléculas bifuncionais os quais compreendem uma primeira porção ("porção funcional") a qual é feita de blocos de construção e uma segunda porção operativamente ligada a primeira porção, compreendendo um tag de oligonucleotídeo o qual identifica a estrutura da primeira porção, isto é, o tag de oligonucleotídeo indica quais blocos de construção foram usados na construção da primeira porção, assim como a ordem na qual os blocos de construção foram ligados. Geralmente, a informação proporcionada pelo tag de oligonucleotídeo é suficiente para determinar os blocos de construção usados para construir uma porção ativa. Em determinadas modalidades, a sequência do tag de oligonucleotídeo é suficiente para determinar a disposição dos blocos de construção em uma porção funcional, por exemplo, para porções peptídicas, a sequência de aminoácido.

[00036] O termo "porção funcional", conforme usado aqui, se refere a uma porção química compreendendo um ou mais blocos de construção. De preferência, os blocos de construção em uma porção funcional não são ácidos nucléicos. Uma porção funcional pode ser um polímero ou oligômero cíclico linear ou ramificado ou uma molécula orgânica pequena.

[00037] O termo "bloco de construção", conforme usado aqui, é uma unidade estrutural química a qual é ligada a outra unidade estrutural química ou pode ser ligada a outras de tais unidades. Quando uma porção funcional é polimérica ou oligomérica, os blocos de construção são as unidades monoméricas do polímero ou oligômero. Blocos de construção podem também incluir uma estrutura de armação ("bloco de construção de armação") a qual é ou pode ser presa a uma ou mais estruturas adicionais ("blocos de construção periféricos").

[00038] Deve ser compreendido que o termo "bloco de construção" é usado aqui para se referir a uma unidade estrutural química conforme ela existe em uma porção funcional e também na forma reativa usada para a síntese de uma porção funcional. Dentro de uma porção funcional, um bloco de construção existirá sem qualquer parte do bloco de construção a qual é perdida como uma consequência de incorporação do bloco de construção em uma porção funcional. Por exemplo, em casos nos quais a reação de formação de ligação libera uma pequena molécula (veja abaixo ), o bloco de construção, conforme ele existe em uma porção funcional, é um "resíduo de bloco de construção", isto é, o restante do bloco de construção usado na síntese após perda dos átomos que ele contribui para a molécula liberada.

[00039] Os blocos de construção podem ser quaisquer compostos químicos os quais são complementares, isto é, os blocos de construção devem ser capazes para reagir juntos para formar uma estrutura compreendendo dois ou mais blocos de construção. Tipicamente, todos os blocos de construção usados terão pelo menos dois grupos reativos, embora seja possível que alguns dos blocos de construção (por exemplo, o último bloco de construção em uma porção funcional oligomérica) usados tenham apenas um grupo reativo cada. Grupos reativos sobre dois blocos de construção diferentes deverão ser complementares, isto é, capazes de reagirem juntos para formar uma ligação covalente, opcionalmente com a concomitante perda de uma pequena molécula, tais como água, HCI, HF e assim por diante.

[00040] Para as presentes finalidades, dois grupos reativos são complementares se eles são capazes de reagirem juntos para formar uma ligação covalente. Em uma modalidade preferida, as reações de formação de ligação ocorrem rapidamente sob condições ambientes sem formação substancial de subprodutos. De preferência, um determinado grupo reativo reagirá com um determinado grupo reativo complementar exatamente uma vez. Em uma modalidade, grupos reativos complementares de dois blocos de construção reagem, por exemplo, via substituição nucleofílica, para formar uma ligação covalente. Em uma modalidade, um membro de um par de grupos reativos complementares é um grupo eletrofílico e o outro membro do par é um grupo nucleofílico.

[00041] Grupos eletrofílicos e nucleofílicos complementares incluem qualquer dois grupos os quais reagem via substituição nucleofílica sob condições adequadas para formar uma ligação covalente. Uma variedade de reações de formação de ligação adequadas são conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, March, Advanced Organic Chemistry, quarta edição, New York: John Wiley e Sons (1992), Capítulos 10 a 16; Carey e Sundberg, Advanced Organic Chemistry, Parte B, Plenum (1990), Capítulos1-11; e Collman e outros, Principles and Applications of Organotransition Metal Chemistry, University Science Books, Mill Valley, Calif. (1987), Capítulos 13 a 20; cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Exemplos de grupos eletrofílicos adequados incluem grupos carbonila reativos, tais como grupos cloreto de acila, grupos éster, incluindo carbonilpentafluorofenil ésteres e succinimida ésteres, grupos cetona e grupos aldeído; grupos sulfonila reativos, tais como grupos cloreto de sulfonila e grupos fosfonila reativos. Outros grupos eletrofílicos incluem os grupos epóxido terminais, grupos isocianato e grupos haleto de alquila. Grupos nucleofílicos adequados incluem grupos amino primários e secundários e grupos hidroxila e grupos carboxila.

[00042] Grupos reativos complementares adequados são apresentados abaixo . Aqueles versados na técnica podem determinar prontamente outros pares de grupos reativos que podem ser usados no presente método e os exemplos proporcionados aqui não se destinam a serem limitativos.

[00043] Em uma primeira modalidade, os grupos reativos complementares incluem grupos carboxila ativados, grupos sulfonila reativos ou grupos fosfonila reativos ou uma combinação dos mesmos e grupos amino primários ou secundários. Nessa modalidade, os grupos reativos complementares reagem sob condições adequadas para formar uma ligação de amida, sulfonamida ou fosfonamidato.

[00044] Em uma segunda modalidade, os grupos reativos complementares incluem grupos epóxido e grupos amino primários ou secundários. Um bloco de construção contendo epóxido reage com um bloco de construção contendo amina sob condições adequadas para formar uma ligação de carbono-nitrogênio, resultando em um β-amino álcool.

[00045] Em outra modalidade, os grupos reativos complementares incluem grupos aziridina e grupos amino primários ou secundários. Sob condições adequadas, um bloco de construção contendo aziridina reage com um bloco de construção contendo amina para formar uma ligação de carbono-nitrogênio, resultando em uma 1,2-diamina. Em uma terceira modalidade, os grupos reativos complementares incluem grupos isocianato e grupos amino primários ou secundários. Um bloco de construção contendo isocianato reagirá com um bloco de construção contendo amino sob condições adequadas para formar uma ligação de carbono-nitrogênio, resultando em um grupo uréia.

[00046] Em uma quarta modalidade, os grupos reativos complementares incluem grupos isocianato e grupos hidroxila. Um bloco de construção contendo isocianato reagirá com um bloco de construção contendo hidroxila sob condições adequadas para formar uma ligação de carbono-oxigênio, resultando em um grupo carbamato.

[00047] Em uma quinta modalidade, os grupos reativos complementares incluem grupos amino groups e grupos contendo carbonila, tais como grupos aldeído ou cetona. Aminas reagem com tais grupos via aminação redutiva para formar uma nova ligação de carbono-nitrogênio.

[00048] Em uma sexta modalidade, os grupos reativos complementares incluem grupos ilídeo de fósforo e grupos aldeído ou cetona. Um bloco de construção contendo ilídeo de fósforo reagirá com um bloco de construção contendo aldeído ou cetona sob condições adequadas para formar uma ligação dupla carbono-carbono, resultando em um alceno.

[00049] Em uma sétima modalidade, os grupos reativos complementares reagem via cicloadição para formar uma estrutura cíclica. Um exemplo de tais grupos reativos complementares são alcinos e azidas orgânicas, as quais reagem sob condições adequadas para formar uma estrutura com anel de triazol. Um exemplo do uso dessa reação para ligar dois blocos de construção é ilustrado na Figura 8. Condições adequadas para tais reações são conhecidas na técnica e incluem aquelas descritas no WO 03/101972, os conteúdos todos do qual são incorporados por referência aqui.

[00050] Em uma oitava modalidade, os grupos reativos complementares são um haleto de alquila e um nucleófilo, tais como um grupo amino, um grupo hidroxila ou um grupo carboxila. Tais grupos reagem sob condições adequadas para formar a carbono-nitrogênio (haleto de alquila mais amina) ou carbono-oxigênio (haleto de alquila mais grupo hidroxila ou carboxila).

[00051] Em uma nona modalidade, os grupos funcionais complementares são um grupo heteroaromático halogenado e um nucleófilo e os blocos de construção são ligados sob condições adequadas via substituição nucleofílica aromática. Grupos heteroaromáticos halogenados adequados incluem pirimidinas, triazinas e purinas cloradas, as quais reagem com nucleófilos, tais como aminas, sob condições suaves, em solução aquosa. Exemplos representativos da reação de uma triclorotriazina oligonucleotídeo-rotulada com aminas são mostrados nas Figuras 9 e 10. Exemplos de grupos heteroaromáticos clorados adequados são mostrados na Figura 11.

[00052] Deve ser compreendido que a síntese de uma porção funcional pode ser processada via um tipo de reação de acoplamento em particular tal como, mas não limitado a, uma das reações discutidas acima ou via uma combinação de duas ou mais reações de acoplamento, tais como duas ou mais das reações de acoplamento discutidas acima. Por exemplo, em uma modalidade, os blocos de construção são unidos através de uma combinação de formação de ligação de amida (grupos complementares amino e ácido carboxílico) e aminação redutiva (grupos complementares amino e aldeído ou cetona). Qualquer química de acoplamento pode ser usada, contanto que ela seja compatível com a presença de um oligonucleotídeo. Tags de oligonucleotídeo filamento duplo (duplex), conforme usado em determinadas modalidades da presente invenção, são quimicamente mais robustos do que tags filamento simples e, portanto, toleram uma faixa de condições de reação mais ampla e permitem o uso de reações de formação de ligação que não seriam possíveis com tags filamento simples.

[00053] Um bloco de construção pode incluir um ou mais grupos funcionais além dos grupo ou grupos reativos empregados para formar uma porção funcional. Um ou mais desses grupos funcionais adicionais podem ser protegidos para impedir reações indesejadas desses grupos funcionais. Grupos de proteção adequados são conhecidos na técnica para uma variedade de grupos funcionais (Greene e Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, segunda edição, New York: John Wiley e Sons (1991), incorporado aqui por referência). Grupos de proteção particularmente úteis incluem t-butil ésteres e éteres, acetais, tritil éteres e aminas, acetil ésteres, trimetila-silil éteres, tricloroetil éteres e ésteres e carbamatos.

[00054] Em uma modalidade, cada bloco de construção compreende dois grupos reativos, os quais podem ser os mesmos ou diferentes. Por exemplo, cada bloco de construção adicionado no ciclo s pode compreender dois grupos reativos os quais são os mesmos, mas os quais são ambos complementares aos grupos reativos dos blocos de construção adicionado nas etapas s-1 e s + 1. Em outra modalidade, cada bloco de construção compreende dois grupos reativos os quais são, em si, complementares. Por exemplo, uma biblioteca compreendendo moléculas de poliamida pode ser produzida via reações entre blocos de construção compreendendo dois grupos amino primários e blocos de construção compreendendo dois grupos carboxila ativados. Nos compostos resultantes não existe N- ou C-término, uma vez que grupos amida alternados têm direcionalidade oposta. Alternativamente, uma biblioteca de poliamida pode ser produzida usando blocos de construção em que cada um compreende um grupo amino e um grupo carboxila ativado. Nessa modalidade, os blocos de construção adicionados na etapa n do ciclo terão um grupo reativo livre, o qual é complementar ao grupo reativo disponível sobre o enéssimo bloco de construção, enquanto que, de preferência, o outro grupo reativo sobre o n-1 bloco de construção é protegido. Por exemplo, se os membros da biblioteca são sintetizados da direção C para N, os blocos de construção adicionados compreenderão um grupo carboxila ativado e um grupo amino protegido.

[00055] As porções funcionais podem ser porções poliméricas ou oligoméricas, tais como peptídeos, peptidomiméticos, ácidos nucléicos de peptídeo ou peptóides ou elas podem ser pequenas moléculas não-poliméricas, por exemplo, moléculas tendo uma estrutura compreendendo uma armação central e estruturas dispostas em torno da periferia da armação. Bibliotecas poliméricas ou oligoméricas lineares resultarão do uso de blocos de construção tendo dois grupos reativos, enquanto que bibliotecas poliméricas ou oligoméricas ramificadas resultarão do uso de blocos de construção tendo três ou mais grupos reativos, opcionalmente em combinação com blocos de construção tendo somente dois grupos reativos. Tais moléculas podem ser representadas pela fórmula geral X1X2... Xn, em que cada X é a unidade monomérica de um polímero compreendendo n unidades monoméricas, em que n é um número inteiro maior do que 1. No caso de compostos oligoméricos ou poliméricos, os blocos de construção terminais não precisam compreender dois grupos funcionais. Por exemplo, no caso de uma biblioteca de poliamida, o bloco de construção C-terminal pode compreender um grupo amino, mas a presença de um grupo carboxila é opcional. Similarmente, o bloco de construção no N-término pode compreender um grupo carboxila, mas não precisa conter um grupo amino.

[00056] Compostos oligoméricos ou poliméricos ramificados também podem ser sintetizados, contanto que pelo menos um bloco de construção compreenda três grupos funcionais os quais são reativos com outros blocos de construção. Uma biblioteca da invenção pode compreender moléculas lineares, moléculas ramificadas ou uma combinação dos mesmos.

[00057] Bibliotecas também podem ser construídas usando, por exemplo, um bloco de construção de armação tendo dois ou mais grupos reativos, em combinação com outros blocos de construção tendo somente um grupo reativo disponível, por exemplo, em que quaisquer grupos reativos adicionais são protegidos ou não-reativos com os outros grupos reativos presentes no bloco de construção de armação. Em uma modalidade, por exemplo, as moléculas sintetizadas podem ser representadas pela fórmula geral X(Y)n, em que X é um bloco de construção de armação; cada Y é um bloco de construção ligado a X e n é um número inteiro de pelo menos dois e, de preferência, um número inteiro de 2 a cerca de 6. Em uma modalidade preferida, o bloco de construção inicial do ciclo 1 é um bloco de construção de armação. Em moléculas da fórmula X(Y)n, cada Y pode ser o mesmo ou diferente mas, na maioria dos membros de uma biblioteca típica, cada Y será diferente.

[00058] Em uma modalidade, as bibliotecas da invenção compreendem compostos de poliamida. Os compostos de poliamida podem ser compostos de blocos de construção derivados de qualquer aminoácido, incluindo os vinte que ∝-aminoácidos ocorrem naturalmente, tais como alanina (Ala; A), glicina (Gli; G), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), ácido glutâmico (Glu; E), histidina (His; H), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), fenilalanina (Phe; F), tirosina (Tyr; Y), treonina (Thr; T), serina (Ser; S), arginina (Arg; R), valina (Val; V), glutamina (Gln; Q), Isoleucina (Ile; I), cisteína (Cys; C), metionina (Met; M), prolina (Pro; P) e triptofano (Trp; W), em que os códigos de três letras e uma letra para cada aminoácido são fornecidos. Em sua forma que ocorre naturalmente, cada um dos aminoácidos precedentes existe na L-configuração, a qual deve ser admitida aqui, a menos que de outro modo observado. No presente método, contudo, as formas em D-configuração desses aminoácidos também podem ser usadas. Esses D-aminoácidos são indicados aqui por códigos com três ou uma letra minúscula, isto é, ala (a), gli (g), leu (l), gln (q), thr (t), ser (s) e assim por diante. Os blocos de construção também podem ser derivados de outros ∝-aminoácidos, incluindo, mas não limitado a, 3-arilalaninas, tais como naftilalanina, fenilalaninas fenila-substituídas, incluindo 4-flúor-, 4-cloro, 4-bromo e 4-metilfenilalanina; 3-heteroarilalaninas, tais como 3-piridilalanina, 3-tienilalanina, 3-quinolilalanina e 3-imidazolilalanina; ornitina; citrulina; homocitrulina; sarcosina; homoprolina; homocisteína; prolina substituída, tal como hidroxiprolina e fluoroprolina; dehidroprolina; norleucina; O-metiltirosina; O-metilserina; O-metiltreonina e 3-ciclohexilalanina. Cada um dos aminoácidos precedentes pode ser utilizado na D- ou L-configuração.

[00059] Os blocos de construção também podem ser aminoácidos os quais não são ∝-aminoácidos, tais como ∝-azaaminoácidos; β, γ, δ, ε-aminoácidos, e aminoáciso N-substituídos tal como glicina N-substituída, em que o N-substituinte pode ser, por exemplo, um grupo alquila, arila, heteroarila, arilalquila ou heteroarilalquila substituído ou não substituído. Em uma modalidade, o N-substituinte é uma cadeia lateral de um ∝-aminoácido que ocorre naturalmente ou que não ocorre naturalmente.

[00060] O bloco de construção pode também ser uma estrutura peptidomimética, tal como um mimético de dipeptídeo, tripeptídeo, tetrapeptídeo ou pentapeptídeo. Tais blocos de construção de peptidomimético são, de preferência, derivados de compostos de amino acila, de modo que a química de adição desses blocos de construção para desenvolver um grupo (poli)aminoacila é a mesma ou similar à química usada para outros blocos de construção. Os blocos de construção podem também ser moléculas as quais são capazes de formar ligações as quais são isostéricas com uma ligação peptídica, para formar porções funcionais de peptidomimético compreendendo uma modificação da parte principal do peptídeo, tal como ψ[CH2S], ψ[CH2NH], ψ[CSNH2], ψ[NHCO], ψ[COCH2] e ψ[(E) ou (Z)CH=CH]. Na nomenclatura usada acima, ψ indica a ausência de uma ligação amida. A estrutura que substitui o grupo amida é especificada entre parênteses.

[00061] Em uma modalidade, a invenção proporciona um método de síntese de um composto compreendendo ou consistindo em uma porção funcional a qual é operativamente ligada a um oligonucleotídeo de codificação. O método inclui as etapas de: (1) fornecimento de um composto iniciador consistindo em uma porção funcional inicial compreendendo n blocos de construção, em que n é um número inteiro de 1 ou maior, em que a porção funcional inicial compreende pelo menos um grupo reativo e em que a porção funcional inicial é operativamente ligada a um oligonucleotídeo inicial o qual codifica os n blocos de construção; (2) reação do composto iniciador com um bloco de construção compreendendo pelo menos um grupo reativo complementar, em que o pelo menos um grupo reativo complementar é complementar ao grupo reativo da etapa (1), sob condições adequadas para reação do grupo reativo e o grupo reativo complementar para formar uma ligação covalente; (3) reação do oligonucleotídeo inicial com um oligonucleotídeo de entrada na presença de uma enzima a qual catalisa ligação do oligonucleotídeo inicial e oligonucleotídeo de entrada, sob condições adequadas para ligação do oligonucleotídeo de entrada e do oligonucleotídeo inicial, desse modo, produzindo a molécula a qual compreende ou consiste em uma porção funcional compreendendo n+1 blocos de construção a qual é operativamente ligada a um oligonucleotídeo de codificação. Se uma porção funcional da etapa (3) compreende um grupo reativo, etapas 1-3 podem ser repetidas uma ou mais vezes, desse modo, formando ciclos 1 a i, em que i é um número inteiro de 2 ou maior, com o produto da etapa (3) de um ciclo s-1, em que s é um número inteiro de i ou menos, se tornando o composto iniciador da etapa (1) do ciclo s. Em cada ciclo, um bloco de construção é adicionado para desenvolver a porção funcional e uma sequência de oligonucleotídeo, o qual codifica o novo bloco de construção, é adicionado para desenvolver oligonucleotídeo de codificação.

[00062] Em uma modalidade preferida, cada bloco de construção individual está associado a um oligonucleotídeo distinto, de modo que a sequência de nucleotídeos in o oligonucleotídeo adicionado em um determinado ciclo identifica o bloco de construção adicionado no mesmo ciclo.

[00063] O acoplamento de blocos de construção e ligação de oligonucleotídeos geralmente ocorrerão em concentrações similares de materiais de iniciação e reagentes. Por exemplo, concentrações de reagentes da ordem de micromolar a milimolar, por exemplo, de cerca de 10 μM a cerca de 10 mM, são preferidas de forma a ter acoplamento eficiente de blocos de construção.

[00064] Em determinadas modalidades, o método ainda compreende, após a etapa (2), a etapa de remoção de qualquer porção funcional inicial não reagida. Remoção de qualquer porção funcional inicial não reagida em um ciclo em particular impede a porção funcional inicial do ciclo de reação de com um bloco de construção adicionado em um ciclo posterior. Tais reações poderão levar à geração de porções funcionais carecendo de um ou mais blocos de construção, levando potencialmente a uma série de estruturas de porção funcional as quais correspondem a uma sequência de oligonucleotídeo em particular. Tal remoção pode ser realizada através de reação de qualquer porção funcional inicial restante com um composto o qual reage com o grupo reativo da etapa (2). De preferência, o composto removedor reage rapidamente com o grupo reativo da etapa (2) e não inclui grupos reativos adicionais que podem reagir com blocos de construção adicionados em ciclos posteriores. Por exemplo, na síntese de um composto em que o grupo reativo da etapa (2) é um grupo amino, um composto removedor adequado é um N-hidróxi-succinimida éster, tal como N-hidróxi-succinimida éster de ácido acético.

[00065] Em outra modalidade, a invenção proporciona um método de produção de uma biblioteca de compostos, em que cada composto compreende uma porção funcional compreendendo dois ou mais resíduos de bloco de construção a qual é operativamente ligada a um oligonucleotídeo. Em uma modalidade preferida, o oligonucleotídeo presente em cada molécula proporciona informação suficiente para identificar os blocos de construção dentro da molécula e, opcionalmente, a ordem de adição dos blocos de construção. Nessa modalidade, o método da invenção compreende um método de síntese de uma biblioteca de compostos, em que os compostos compreendem uma porção funcional compreendendo dois ou mais blocos de construção a qual é operativamente ligada a um oligonucleotídeo o qual identifica a estrutura de uma porção funcional. O método compreende a etapas de (1) fornecimento de uma solução compreendendo compostos iniciadores, em que m é um número inteiro de 1 ou maior, em que os compostos iniciadores consistem em uma porção funcional compreendendo n blocos de construção, em que n é um número inteiro de 1 ou maior, a qual é operativamente ligada a um oligonucleotídeo inicial o qual identifica os n blocos de construção; (2) divisão da solução da etapa (1) em pelo menos r frações, em que r é um número inteiro de 2 ou maior; (3) reação de cada fração com um dos r blocos de construção, desse modo, produzindo r frações compreendendo compostos consistindo em uma porção funcional compreendendo n+1 blocos de construção operativamente ligados ao oligonucleotídeo inicial; (4) reação de cada uma das r frações da etapa (3) com um dos conjuntos de r oligonucleotídeos de entrada distintos sob condições adequadas para ligação enzimática do oligonucleotídeo de entrada a o oligonucleotídeo inicial, desse modo, produzindo r frações compreendendo moléculas consistindo em uma porção funcional compreendendo n+1 blocos de construção operativamente ligados a um oligonucleotídeo alongado o qual codifica os n+1 blocos de construção. Opcionalmente, o método pode ainda incluir a etapa de (5) recombinação das r frações, produzidas na etapa (4), desse modo, produzindo uma solução compreendendo moléculas consistindo em uma porção funcional compreendendo n + 1 blocos de construção, a qual é operativamente ligada a um oligonucleotídeo alongado o qual codifica então n+ 1 blocos de construção. As etapas (1) a (5) podem ser conduzidas uma ou mais vezes para proporcionar ciclos 1 a i, em que i é um número inteiro de 2 ou maior. No ciclo s+1, em que s é um número inteiro de i-1 ou menos, a solução compreendendo compostos iniciadores da etapa (1) é a solução da etapa (5) do ciclo s. Da mesma forma, os compostos iniciadores da etapa (1) do ciclo s+1 são o produtos da etapa (4) no ciclo s.

[00066] De preferência a solução da etapa (2) é dividida em r frações em cada ciclo de síntese da biblioteca. Nessa modalidade, cada fração é reagida com um único bloco de construção.

[00067] Nos métodos da invenção, a ordem de adição do bloco de construção e do oligonucleotídeo de entrada não é crítica e etapas (2) e (3) da síntese de uma molécula e as etapas (3) e (4) na síntese da biblioteca podem ser invertidas, isto é, o oligonucleotídeo de entrada pode ser ligado ao oligonucleotídeo inicial antes que o novo bloco de construção seja adicionado. Em determinadas modalidades, pode ser possível conduzir essas duas etapas simultaneamente.

[00068] Em determinadas modalidades, o método ainda compreende, após a etapa (2), a etapa de remoção de qualquer porção funcional inicial não reagida. Remoção de qualquer porção funcional inicial não reagida em um ciclo em particular impede a porção funcional inicial de um ciclo de reagir com um bloco de construção adicionado em um ciclo posterior. Tais reações poderão levar à geração de porções funcionais carecendo de um ou mais blocos de construção, levando potencialmente a uma série de estruturas de porção funcional as quais correspondem a uma sequência de oligonucleotídeo em particular. Tal remoção pode ser realizada através de reação de qualquer porção funcional inicial restante com um composto o qual reage com o grupo reativo da etapa (2). De preferência, o composto removedor reage rapidamente com o grupo reativo da etapa (2) e não inclui grupos reativos adicionais que podem reagir com blocos de construção adicionado em ciclos posteriores. Por exemplo, na síntese de um composto em que o grupo reativo da etapa (2) é um grupo amino, um composto removedor adequado é um N-hidróxi-succinimida éster, tal como N-hidróxi-succinimida éster de ácido acético.

[00069] Em uma modalidade, os blocos de construção usados na síntese da biblioteca são selecionados de um conjunto de blocos de construção candidatos através de avaliação da capacidade dos blocos de construção candidatos de reagir com grupos funcionais complementares apropriados sob as condições usadas para síntese da biblioteca. Blocos de construção os quais são mostrados como sendo adequadamente reativos sob tais condições podem, então, ser selecionados para incorporação na biblioteca. Os produtos de um determinado ciclo podem, opcionalmente, ser purificados. Quando o ciclo é um ciclo intermediário, isto é, qualquer ciclo antes do ciclo final, esses produtos são intermediários e podem ser purificados antes de início do próximo ciclo. Se o ciclo é o ciclo final, os produtos do ciclo são os produtos finais e podem ser purificados antes de qualquer uso dos compostos. Essa etapa de purificação pode, por exemplo, remover reagentes não reagidos ou em excesso e a enzima empregada para ligação de oligonucleotídeo. Quaisquer métodos os quais são adequados para separação dos produtos de outras espécies presentes em solução podem ser usados, incluindo cromatografia de líquido, tal como cromatografia de líquido de elevado desempenho (HPLC) e precipitação com um co-solvente adequado, tal como etanol. Métodos adequados para purificação dependerão da natureza dos produtos e do sistema de solvente usados para síntese.

[00070] As reações são, de preferência, conduzidas em solução aquosa, tal como uma solução aquosa tamponada, mas podem também ser conduzidas em meios aquosos/orgânicos misturados consistentes com as propriedades de solubilidade dos blocos de construção, dos oligonucleotídeos, dos intermediários e produtos finais e da enzima usados para catalisar a ligação de oligonucleotídeo.

[00071] Deve ser compreendido que o número teórico de compostos produzidos por um determinado ciclo no método descrito acima é o produto do número de diferentes compostos iniciadores, m, usados no ciclo e do número de blocos de construção distintos adicionados no ciclo, r. O número real de compostos distintos produzidos no ciclo pode ser tão alto quanto o produto de r e m (r x m), mas poderia ser menor, dadas as diferenças na reatividade de determinados blocos de construção com determinados outros blocos de construção. Por exemplo, a cinética de adição de um bloco de construção em particular a um composto iniciador em particular pode ser de modo que, sob a escala de tempo do ciclo sintético, pouco a nenhum produto dessa reação possa ser produzido.

[00072] Em determinadas modalidades, um bloco de construção em comum é adicionado antes do ciclo 1, após o último ciclo ou entre qualquer dois ciclos. Por exemplo, quando uma porção funcional é uma poliamida, um bloco de construção N-terminal em comum pode ser adicionado após o ciclo final. Um bloco de construção em comum pode também ser introduzido entre qualquer dois ciclos, por exemplo, para adicionar um grupo funcional, tal como um grupo alcino ou azida, o qual pode ser utilizado para modificar as porções funcionais, por exemplo, através de ciclização, após a síntese da biblioteca.

[00073] O termo "operativamente ligada", conforme usado aqui, significa que duas estruturas químicas são ligadas juntas de uma forma tal a permanecerem ligadas no decorrer das várias manipulações que se espera que elas sofram. Tipicamente, uma porção funcional e o oligonucleotídeo de codificação são ligados covalentemente via um grupo de ligação apropriado. O grupo de ligação é uma porção bivalente com um sítio de fixação para o oligonucleotídeo e um sítio de fixação para uma porção funcional. Por exemplo, quando uma porção funcional é um composto de poliamida, o composto de poliamida pode ser preso ao grupo de ligação em seu N-término, seu C-término ou via um grupo funcional sobre uma das cadeias laterais. O grupo de ligação é suficiente para separar o composto de poliamida e o oligonucleotídeo em pelo menos um átomo e, de preferência, em mais de um átomo, tal como pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis átomos. De preferência, o grupo de ligação é suficientemente flexível para permitir que o composto de poliamida se ligue a moléculas-alvo de uma maneira a qual é independente do oligonucleotídeo.

[00074] Em uma modalidade, o grupo de ligação é preso ao N-término do composto de poliamida e ao grupo 5'-fosfato do oligonucleotídeo. Por exemplo, o grupo de ligação pode ser derivado de um grupo de ligação precursor compreendendo um grupo carboxila ativado sobre uma extremidade e um éster ativado sobre a outra extremidade. Reação do grupo de ligação precursor com o átomo de nitrogênio N-terminal formará uma ligação de amida conectando o grupo de ligação ao composto de poliamida ou bloco de construção N-terminal, enquanto que reação do grupo de ligação precursor com o grupo 5'-hidróxi do oligonucleotídeo resultará em fixação do oligonucleotídeo ao grupo de ligação via uma ligação de éster. O grupo de ligação pode compreender, por exemplo, uma cadeia de polimetileno, tal como uma cadeia de -(CH2)- ou uma cadeia de (poli)etileno glicol, tal como uma cadeia de -(CH2CH2O)- em que, em ambos os casos, n é um número inteiro de 1 a cerca de 20. De preferência, n é de 2 a cerca de 12, mais preferivelmente de cerca de 4 a cerca de 10. Em uma modalidade, o grupo de ligação compreende um grupo hexametileno (-(CH2)6-).

[00075] Quando os blocos de construção são resíduos de aminoácido, a porção funcional resultante é uma poliamida. Os aminoácidos podem ser acoplados usando qualquer química adequada para a formação de ligações de amida. De preferência, o acoplamento dos blocos de construção de aminoácido é conduzida sob condições as quais são compatíveis com ligação enzimática de oligonucleotídeos, por exemplo, em um pH neutro ou próximo de neutro e em solução aquosa. Em uma modalidade, o composto de poliamida é sintetizado da direção C-terminal para N-terminal. Nessa modalidade, o primeiro, ou C-terminal, bloco de construção é acoplado, em seu grupo carboxila, a um oligonucleotídeo via um grupo de ligação adequado. O primeiro bloco de construção é reagido com o segundo bloco de construção o qual, de preferência, tem um grupo carboxila ativado e um grupo amino protegido. Qualquer estratégia de grupo de ativação/proteção a qual é adequada para formação de ligação de amida em fase em solução pode ser usada. Por exemplo, adequadas espécies carboxila ativadas incluem fluoretos de acila (Patente U.S. No. 5.360.928, incorporada aqui por referência em sua totalidade), anidridos simétricos e N-hidróxi-succinimida ésteres. Os grupos acila podem também ser ativados in situ, conforme é conhecido na técnica, através de reação com um composto de ativação adequado. Compostos de ativação adequados incluem diciclohexilcarbodiimida (DCC), diisopropilcarbodiimida (DIC), 1-etóxicarbonila-2-etóxi-1,2-dihidroquinolina (EEDQ), cloridrato de 1-etila-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), anidrido n-propano-fosfônico (PPA), cloreto de N,N-bis(2-oxo-3-oxazolidinil)imido-fosforila (BOP-Cl), hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidinofosfônio (PyBrop), difenilfosforil azida (DPPA), reagente de Castro (BOP, PyBop), sais de O-benzotriazolila-N,N,N',N'-tetrametilurônio (HBTU), cianeto de dietilfosforila (DEPCN), dióxido de 2,5-difenila-2,3-dihidro-3-oxo-4-hidróxi-tiofeno (reagente de Steglich; HOTDO), 1,1'-carbonila-diimidazol (CDI) e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (DMT-MM). Os reagentes de acoplamento podem ser empregados sozinhos ou em combinação com aditivos tais como N. N-dimetila-4-aminopiridina (DMAP), N-hidróxi-benzotriazol (HOBt), N-hidroxibenzotriazina (HOOBt), N-hidróxi-succinimida (HOSu) N-hidróxiazabenzotriazol (HOAt), azabenzotriazolila-tetrametilurônio salts (HATU,HAPiU) ou 2-hidróxipiridina. Em determinadas modalidades, a síntese de uma biblioteca requer o uso de dois ou mais estratégias de ativação, para permitir o uso de um conjunto estruturalmente diverso de blocos de construção. Para cada bloco de construção, aqueles versados na técnica podem determinar a estratégia de ativação apropriada.

[00076] O grupo de proteção N-terminal pode ser qualquer grupo de proteção o qual é compatível com as condições do processo, por exemplo, grupos de proteção os quais são adequados para condições de síntese em fase em solução. Um grupo de proteção preferido é o grupo fluorenilmetóxicarbonila ("Fmoc"). Qualquer grupo funcional potencialmente reativo sobre a cadeia lateral do bloco de construção de aminoacila também pode precisar ser adequadamente protegido. De preferência, o grupo de proteção de cadeia lateral é ortogonal ao grupo N-terminal de proteção, isto é, o grupo de proteção de cadeia lateral, é removido sob condições as quais são diferentes daquelas requeridas para remoção do grupo de proteção N-terminal. Grupos de proteção de cadeia lateral adequados incluem o grupo nitroveratrila, o qual pode ser usado para proteger grupos carboxila de cadeia lateral e grupos amino de cadeia lateral. Outro grupo de proteção de cadeia lateral de amina adequado é o grupo N-pent-4-enoíla.

[00077] Os blocos de construção podem ser modificados após incorporação em uma porção funcional, por exemplo, através de uma reação adequada de envolvendo um grupo funcional sobre um ou mais dos blocos de construção. Modificação do bloco de construção pode ocorrer após adição do bloco de construção final ou em qualquer ponto intermediário na síntese de uma porção funcional, por exemplo, após qualquer ciclo do processo sintético. Quando uma biblioteca de moléculas bifuncionais da invenção é sintetizada, modificação de bloco de construção pode ser realizada sobre a biblioteca inteira ou sobre uma parte da biblioteca, desse modo, aumentando o grau de complexidade da biblioteca. Reações de modificação de bloco de construção adequadas incluem aquelas reações que podem ser realizadas sob condições compatíveis com uma porção funcional e o oligonucleotídeo de codificação. Exemplos de tais reações incluem acilação e sulfonação de grupos amino ou grupos hidroxila, alquilação de grupos amino, esterificação ou tioesterificação de grupos carboxila, amidação de grupos carboxila, epoxidação de alcenos e outras reações, conforme é conhecido na técnica. Quando uma porção funcional inclui um bloco de construção tendo um grupo funcional alcino ou azida, a reação de cicloadição com azida/alcino pode ser usada para derivatizar o bloco de construção. Por exemplo, um bloco de construção incluindo um alcino pode ser reagido com uma azida orgânica ou um bloco de construção incluindo uma azida pode ser reagido com um alcino, em qualquer caso formando um triazol. Reações de modificação de bloco de construção podem ocorrer após adição do bloco de construção final ou em um ponto intermediário no processo sintético e podem ser usadas para anexar uma variedade de estruturas químicas a uma porção funcional, incluindo carboidratos, porções de ligação a metal e estruturas para objetivar determinadas biomoléculas ou tipos de tecido.

[00078] Em outra modalidade, uma porção funcional compreende uma série linear de blocos de construção - e essa série linear é ciclizada usando uma reação adequada. Por exemplo, se pelo menos dois blocos de construção na série linear incluem grupos sulfidrila, os grupos sulfidrila podem ser oxidados para formar uma ligação de dissulfeto, desse modo, ciclizando a série linear. Por exemplo, as porções funcionais podem ser oligopeptídeos os quais incluem duas ou mais porções L ou D-cisteína e/ou L ou D-homocisteína. Os blocos de construção podem também incluir outros grupos funcionais capazes de reagirem juntos para ciclizar a série linear, tal como grupos carboxila e amino ou grupos hidroxila.

[00079] Em uma modalidade preferida, um dos blocos de construção na série linear compreende um grupo alcino e o outro bloco de construção na série linear compreende um grupo azida. Os grupos azida e alcino podem ser induzidos a reagir via cicloadição, resultando na formação de uma estrutura macrocíclica. No exemplo ilustrado na Figura 9, uma porção funcional é um polipeptídeo compreendendo um bloco de construção de propargilglicina em seu C-término e um grupo azidoacetila em seu N-término. Reação do grupo alcino e azida sob condições adequadas resulta em formação de um composto cíclico, o qual inclui uma estrutura de triazol dentro do macrociclo. No caso de uma biblioteca, em uma modalidade, cada membro da biblioteca compreende blocos de construção contendo alcino e azida e pode ser ciclizado dessa forma. Em uma segunda modalidade, todos os membros da biblioteca compreendem blocos de construção contendo alcino e azida, mas apenas uma parte da biblioteca é ciclizada. Em uma terceira modalidade, apenas determinadas porções funcionais incluem blocos de construção contendo alcino e azida e apenas essas moléculas são ciclizadas. Nas segunda e terceira modalidades precedentes, a biblioteca, após a reação de cicloadição, incluirá porções funcionais cíclicas e lineares.

[00080] Os oligonucleotídeos são ligados usando métodos enzimáticos. Em uma modalidade, o bloco de construção inicial é operativamente ligado a um oligonucleotídeo inicial. Antes de ou após acoplamento de um segundo bloco de construção ao bloco de construção inicial, uma segunda sequência de oligonucleotídeo a qual identifica o segundo bloco de construção é ligada ao oligonucleotídeo inicial. Métodos para ligação da sequência inicial de oligonucleotídeo e do oligonucleotídeo de entrada a uma sequência são apresentados nas Figuras 1 e 2. Na Figura 1, o oligonucleotídeo inicial é filamento duplo e um filamento inclui uma sequência de saliência a qual é complementar a uma extremidade do segundo oligonucleotídeo e mantém o segundo oligonucleotídeo em contato com o oligonucleotídeo inicial. De preferência, a sequência de saliência do oligonucleotídeo inicial e a sequência complementar do segundo oligonucleotídeo têm ambas pelo menos cerca de 4 bases; mais preferivelmente, ambas as sequências têm o mesmo comprimento. O oligonucleotídeo inicial e o segundo oligonucleotídeo podem ser ligados usando uma enzima adequada. Se o oligonucleotídeo inicial é ligado ao primeiro bloco de construção na extremidade 5' de uma das filamentos (o "filamento superior"), então, o filamento o qual é complementar à filamento superior (o "filamento inferior") incluirá a sequência de saliência em sua extremidade 5' e o segundo oligonucleotídeo incluirá a sequência complementar em sua extremidade 5'. Após ligação do segundo oligonucleotídeo, um filamento pode ser adicionada, a qual é complementar à sequência do segundo oligonucleotídeo, o qual está 3' à sequência de saliência complementar e o qual inclui a sequência de saliência adicional.

[00081] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo é alongado, conforme apresentado na Figura 2. O oligonucleotídeo ligado à porção funcional em desenvolvimento e ao oligonucleotídeo de entrada é posicionado para ligação através do uso de uma sequência de "tala", a qual inclui uma região a qual é complementar à extremidade 3' do oligonucleotídeo inicial e uma região a qual é complementar à extremidade 5' do oligonucleotídeo de entrada. A tala mantém a extremidade 5' do oligonucleotídeo em proximidade com a extremidade 3' do oligo de entrada e a ligação é realizada usando ligação enzimática. No exemplo ilustrado na Figura 2, o oligonucleotídeo inicial consiste em 16 nucleobases e a tala é complementar às 6 bases na extremidade 3'. O oligonucleotídeo de entrada consiste em 12 nucleobases e a tala é complementar às 6 bases no término 5'. O comprimento da tala e os comprimentos das regiões complementares não são críticos. Contudo, as regiões complementares deverão ser suficientemente longas para permitir formação estável de dímero sob as condições da ligação, mas não tão longa para proporcionar nucleotídeo de codificação excessivamente grande nas moléculas finais. É preferido que as regiões complementares tenham de cerca de 4 bases a cerca de 12 bases, mais preferivelmente de cerca de 5 bases a cerca de 10 bases e ainda mais preferivelmente de cerca de 5 bases a cerca de 8 bases de comprimento.

[00082] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo inicial é filamento duplo e os dois filamentos são covalentemente unidos. Um meio de unir covalentemente os dois filamentos é mostrado na Figura 3, na qual a porção de ligação é usada para ligar os dois filamentos e uma porção funcional. A porção de ligação pode ser qualquer estrutura química a qual compreende um primeiro grupo funcional o qual é adaptado para reagir com um bloco de construção, um segundo grupo funcional o qual é adaptado para reagir com a extremidade 3' de um oligonucleotídeo e um terceiro grupo funcional o qual é adaptado para reagir com a extremidade 5' de um oligonucleotídeo. De preferência, os segundo e terceiro grupos funcionais são orientados de modo a posicionar os dois filamentos de oligonucleotídeo em uma orientação relativa que permite hibridização dos dois filamentos. Por exemplo, a porção de ligação podem ter a estrutura geral (I):

[00083] em que A é um grupo funcional que pode formar uma ligação covalente com um bloco de construção, B é um grupo funcional que pode formar uma ligação com a extremidade 5' de um oligonucleotídeo e C é um grupo funcional que pode formar uma ligação com a extremidade 3' de um oligonucleotídeo. D, F e E são grupos químicos que ligam grupos funcionais A, C e B a S, o qual é um átomo ou armação central. De preferência, D, E e F têm, cada um, independentemente, uma cadeia de átomos, tal como uma cadeia de alquileno ou uma cadeia de (oligo)etileno glicol e D, E e F podem ser os mesmos ou diferentes e são, de preferência, efetivos para permitir a hibridização dos dois oligonucleotídeos e síntese de uma porção funcional. Em uma modalidade, o ligante trivalente tem a estrutura:

[00084] Nessa modalidade, o grupo NH está disponível para fixação a um bloco de construção, enquanto que os grupos fosfatos terminais estão disponíveis para fixação a um oligonucleotídeo.

[00085] Em modalidades nas quais o oligonucleotídeo inicial é filamento duplo, os oligonucleotídeos de entrada são também filamento duplo. Conforme mostrados na Figura 3, o oligonucleotídeo inicial pode ter um filamento a qual é mais longa do que os outros, fornecendo uma sequência de saliência. Nessa modalidade, o oligonucleotídeo de entrada inclui uma sequência de saliência a qual é complementar à sequência de saliência do oligonucleotídeo inicial. Hibridização das duas sequências de saliências complementares mantém o oligonucleotídeo de entrada em posição para ligação ao oligonucleotídeo inicial. Essa ligação pode ser realizada enzimaticamente usando uma DNA ou RNA ligase. As sequências de saliência do oligonucleotídeo de entrada e do oligonucleotídeo inicial são, de preferência, do mesmo comprimento e consistem em dois ou mais nucleotídeos, de preferência de 2 a cerca de 10 nucleotídeos, mais preferivelmente de 2 a cerca de 6 nucleotídeos. Em uma modalidade preferida, o oligonucleotídeo de entrada é um oligonucleotídeo de filamento duplo tendo uma sequência de saliência em cada extremidade. A sequência de saliência em uma extremidade é complementar à sequência de saliência do oligonucleotídeo inicial, enquanto que, após ligação do oligonucleotídeo de entrada e do oligonucleotídeo inicial, a sequência de saliência na outra extremidade se torna a sequência de saliência do oligonucleotídeo inicial do próximo ciclo. Em uma modalidade, as três sequências de saliência têm todas 2 a 6 nucleotídeos de comprimento e a sequência de codificação do oligonucleotídeo de entrada tem de 3 a 10 nucleotídeos de comprimento, de preferência 3 a 6 nucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade em particular, as sequências de saliência têm todas 2 nucleotídeos de comprimento e a sequência de codificação tem 5 nucleotídeos de comprimento.

[00086] Na modalidade ilustrada na Figura 4, o filamento de entrada tem uma região em sua extremidade 3' a qual é complementar à extremidade 3' do oligonucleotídeo inicial, deixando saliências nas extremidades 5' de ambos os filamentos. As extremidades 5' podem ser enchidas usando, por exemplo, uma DNA polimerase, tal como vent polimerase, resultando em um oligonucleotídeo filamento duplo alongado. O filamento inferior desse oligonucleotídeo pode ser removido e uma sequência extra adicionada à extremidade 3' do filamento superior usando o mesmo método.

[00087] O tag do oligonucleotídeo de codificação é formado como o resultado da adição sucessiva de oligonucleotídeos que identificam cada sucessivo bloco de construção. Em uma modalidade dos métodos da invenção, os sucessivos tags de oligonucleotídeo podem ser acopladas através de ligação enzimática para produzir um oligonucleotídeo de codificação.

[00088] Ligação de oligonucleotídeos enzima-catalisada pode ser realizada usando qualquer enzima que tem a capacidade de se ligar a fragmentos de ácido nucléico. Enzimas exemplificativas incluem ligases, polimerases e topoisomerases. Em modalidades específicas da invenção, DNA ligase (EC6.5.1.1), DNA polimerase (EC 2.7.7.7), RNA polimerase (EC 2.7.7.6) ou topoisomerase (EC 5.99.1.2) são usadas para ligar os oligonucleotídeos. Enzimas contidas em cada classe EC podem ser encontradas, por exemplo, conforme descrito em Bairoch (2000) Nucleic Acids Research 28: 304-5.

[00089] Em uma modalidade preferida, os oligonucleotídeos usados nos métodos da invenção são oligodesoxinucleotídeos e a enzima usada para catalisar a ligação de oligonucleotídeo é DNA ligase. De forma que a ligação ocorra na presença da ligase, isto é, para que uma ligação de fosfodiéster seja formada entre dois oligonucleotídeos, um oligonucleotídeo deve ter um grupo fosfato 5' livre e o outro oligonucleotídeo deve ter um grupo hidroxila 3' livre. DNA ligases exemplificativas que podem ser usadas nos métodos da invenção incluem T4 DNA ligase, Taq DNA ligase, T4 RNA ligase, DNA ligase (E. coli) (todas disponíveis, por exemplo, da New England Biolabs, MA).

[00090] Aqueles versados na técnica compreenderão que cada enzima usada para ligação tem atividade ótima sob condições específicas, por exemplo, temperatura, concentração de tampão, pH e tempo. Cada uma dessas condições pode ser ajustada, por exemplo, de acordo com as instruções do fabricante, de modo a se obter ligação ótima dos tags de oligonucleotídeo.

[00091] O oligonucleotídeo de entrada pode ser de qualquer comprimento desejável, mas tem, de preferência, pelo menos três nucleobases de comprimento. Mais preferivelmente, o oligonucleotídeo de entrada tem 4 ou mais nucleobases de comprimento. Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de entrada tem de 3 a cerca de 12 nucleobases de comprimento. É preferido que os oligonucleotídeos das moléculas nas bibliotecas da invenção tenham uma sequência terminal em comum a qual pode servir como um iniciador para PCR, conforme é conhecido na técnica. Tal sequência terminal em comum pode ser incorporada como a extremidade terminal do oligonucleotídeo de entrada adicionado no ciclo final da síntese da biblioteca ou ela pode ser adicionada após síntese da biblioteca, por exemplo, usando os métodos de ligação enzimática descritos aqui.

[00092] Uma modalidade preferida do método da invenção é apresentada na Figura 5. O processo começa com uma sequência de DNA sintetizada a qual é presa em sua extremidade 5' a um ligante o qual termina em um grupo amino. Na etapa 1, essa sequência de DNA de iniciação é ligada a uma sequência de DNA de entrada na presença de um filamento de DNA de compartilhamento, DNA ligase e ditiotreitol em tampão de Tris. Isso proporciona uma sequência de DNA rotulada a qual pode, então, ser usada diretamente na próxima etapa ou purificada, por exemplo, usando HPLC ou precipitação com etanol, antes de prosseguir para a próxima etapa. Na etapa 2, o DNA rotulado é reagido com um aminoácido ativado protegido, nesse exemplo, um fluoreto de aminoácido Fmoc-protegido, proporcionando um conjugado de DNA-aminoácido protegido. Na etapa 3, o conjugado de DNA-aminoácido protegido é desprotegido, por exemplo, na presença de piperidina, e o conjugado desprotegido é, opcionalmente, purificado, por exemplo, através de HPLC ou precipitação com etanol. O conjugado desprotegido é o produto do primeiro ciclo da síntese e se torna o material de iniciação para o segundo ciclo, o que adiciona um segundo resíduo de aminoácido ao grupo amino livre do conjugado desprotegido.

[00093] Em modalidades nas quais PCR tem de ser usada para amplificar os oligonucleotídeos de codificação de moléculas selecionadas, os oligonucleotídeos de codificação incluem, de preferência, sequências de iniciador de PCR. Por exemplo, uma sequência de iniciador de PCR pode ser incluída no oligonucleotídeo inicial antes do primeiro ciclo de síntese ou ela pode ser incluída com o primeiro oligonucleotídeo de entrada. O oligonucleotídeo de codificação pode também incluir uma sequência de revestimento de iniciador de PCR que acompanha as sequências de codificação. A sequência de revestimento pode ser ligada ao oligonucleotídeo de codificação após o ciclo final de síntese da biblioteca ou ela pode ser incluída no oligonucleotídeo de entrada do ciclo final. Em casos nos quais as sequências de iniciador de PCR são incluídas em um oligonucleotídeo de entrada, esses oligonucleotídeos de entrada serão, de preferência, significativamente mais longos do que os oligonucleotídeos de entrada adicionados em outros ciclos, porque eles incluirão uma sequência de codificação e uma sequência de iniciador de PCR.

[00094] Em casos nos quais a sequência de revestimento é adicionada após a adição do bloco de construção final e do oligonucleotídeo de entrada final, a síntese de uma biblioteca conforme apresentado aqui incluirá a etapa de ligação da sequência de revestimento ao oligonucleotídeo de codificação, de modo que a parte de oligonucleotídeo de substancialmente todos os membros da biblioteca termina em uma sequência que inclui uma sequência de iniciador de PCR. Sequências de iniciador de PCR adequadas para uso nas bibliotecas da invenção são conhecidas na técnica; iniciadores e métodos adequados são apresentados, por exemplo, em Innis e outros, eds., PCR Protocols: A Guide to methods and Applications, San Diego: Academic Press (1990), os conteúdos do qual são incorporados aqui por referência em sua totalidade. De preferência, a sequência de revestimento é adicionada através de ligação às frações combinadas as quais são produtos do ciclo sintético final. A sequência de revestimento pode ser adicionada usando o processo enzimático utilizado na construção da biblioteca.

[00095] Conforme indicado acima, a sequência de nucleotídeos do tag de oligonucleotídeo, como parte dos métodos da presente invenção, pode ser determinada através do uso da reação em cadeia de polimerase (PCR).

[00096] O tag de oligonucleotídeo é compreendida dos polinucleotídeos que identificam os blocos de construção que compõem uma porção funcional conforme descrito aqui. A sequência de ácido nucléico do tag de ácido nucléico é determinada submetendo-se o tag de oligonucleotídeo a uma reação de PCR como segue. A amostra apropriada é contatada com um par de iniciador de PCR, cada membro do par tendo uma sequência de nucleotídeos pré-selecionada. O par de iniciador de PCR é capaz de iniciar reações de extensão de iniciador através de hibridização a um sítio de ligação do iniciador de PCR sobre o tag de oligonucleotídeo de codificação. O sítio de ligação do iniciador de PCR é, de preferência, projetado no tag de oligonucleotídeo de codificação. Por exemplo, um sítio de ligação do iniciador de PCR pode ser incorporado no tag de oligonucleotídeo inicial e o segundo sítio de ligação do iniciador de PCR pode ser o tag de oligonucleotídeo final. Alternativamente, o segundo sítio de ligação do iniciador de PCR pode ser incorporado na sequência de revestimento, conforme descrito aqui. Em modalidades preferidas, o sítio de ligação do iniciador de PCR tem pelo menos cerca de 5, 7, 10, 13, 15, 17, 20, 22 ou 25 nucleotídeos de comprimento.

[00097] A reação de PCR é realizada através de mistura do par de iniciador de PCR, de preferência em uma quantidade predeterminada do mesmo, com os ácidos nucléicos do tag do oligonucleotídeo de codificação, de preferência uma quantidade predeterminada dos mesmos, em um tampão de PCR para formar uma mistura de reação de PCR. A mistura é termociclizada por uma série de ciclos os quais são, tipicamente, predeterminados, suficientes para a formação de um produto de reação de PCR. Uma quantidade suficiente de produto é uma que pode ser isolada em uma quantidade suficiente para permitir determinação da sequência de DNA.

[00098] PCR é, tipicamente, realizada através de termociclização, isto é, aumentando e diminuindo repetidamente a temperatura de uma mistura de reação de PCR dentro de uma faixa de temperatura cujo limite mínimo é cerca de 30°C a cerca de 55°C e cujo limite máximo é cerca de 90°C a cerca de 100°C. O aumento e diminuição podem ser contínuos mas, de preferência, são fásicos com os períodos de tempo de estabilidade relativa de temperatura em cada uma das temperaturas que favorecem a síntese, desnaturação e hibridização de polinucleotídeo.

[00099] A reação de PCR é realizada usando qualquer método adequado. Geralmente, ela ocorre em uma solução aquosa tamponada, isto é, um tampão de PCR, de preferência em um pH de 7-9. De preferência, um excesso molar do iniciador está presente. Um grande excesso molar é preferido para melhorar a eficácia do processo.

[000100] O tampão de PCR também contém os tifosfatos de desóxirribonucleotídeos (substratos de síntese de polinucleotídeo) dATP, dCTP, dGTP e dTTP e uma polimerase, tipicamente termoestável, todos em quantidades suficientes para reação de extensão de iniciador (síntese de polinucleotídeo). A solução resultante (mistura de PCR) é aquecida para cerca de 90°C - 100°C durante cerca de 1 a 10 minutos, de preferência de 1 a 4 minutos. Após esse período de aquecimento, a solução é deixada resfriar para 54°C, o que é preferível para hibridização de iniciador. A síntese de reação pode ocorrer em uma temperatura oscilando da temperatura ambiente até uma temperatura acima da qual a polimerase (agente de indução) não funciona mais eficazmente. Assim, por exemplo, se DNA polimerase é usada, a temperatura geralmente não é maior do que cerca de 40°C. A termociclização é repetida até que a quantidade desejada de produto de PCR seja produzida. Um tampão de PCR exemplificativo compreende os seguintes reagentes: KCl a 50 mM; Tris-HCl a 10 mM em um pH de 8,3; MgCl2 a 1,5 mM; 0,001% de gelatina (peso/vol.), dATP a 200 μM; dTTP a 200 μM; dCTP a 200 μM; dGTP a 200 μM; e 2,5 unidades de DNA polimerase I Thermus aquaticus (Taq) por 100 microlitros de tampão.

[000101] Enzimas adequadas para alongamento das sequências de iniciador incluem, por exemplo, DNA polimerase I de E. coli, Taq DNA polimerase, fragmento Klenow de DNA polimerase I de E. coli, T4 DNA polimerase, outras DNA polimerases disponíveis, transcriptase reversa e outras enzimas, incluindo enzimas estáveis ao calor, o que facilitará a combinação dos nucleotídeos de maneira apropriada para formar os produtos de extensão de iniciador os quais são complementares a cado filamento de ácido nucléico. Geralmente, a síntese será iniciada na extremidade 3' de cada iniciador e prossegue na direção 5' ao longo do filamento modelo, até que a síntese termine, produzindo moléculas de comprimentos diferentes.

[000102] O filamento de DNA recentemente sintetizado e seu filamento complementar formam uma molécula de filamento duplo a qual pode ser usada nas etapas sucessivas do processo de análise.

[000103] Métodos de amplificação por PCR são descritos em detalhes nas Patentes U.S. Nos. 4.683.192, 4.683.202, 4.800.159 e 4.965.188 e pelo menos em PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, New York (1989); e PCR Protocols: A Guide to methods and Applications, Innis e outros, eds., Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Os conteúdos de todos os documentos precedentes são incorporados aqui por referência.

[000104] O termo "polinucleotídeo", conforme usado aqui em referência a iniciadores, sondas e fragmentos ou segmentos de ácido nucléico a serem sintetizados através de extensão de iniciador, é definido como uma molécula compreendendo dois ou mais desoxirribonucleotídeos, de preferência mais de três.

[000105] O termo "iniciador", conforme usado aqui, se refere a um polinucleotídeo quer purificado de uma digestão por restrição com ácido nucléico ou produzido sinteticamente, o qual é capaz de atuar como um ponto de início de síntese de ácido nucléico quando colocado sob condições nas quais a síntese de um produto de extensão de um iniciador o qual é complementar a um filamento de ácido nucléico é induzido, isto é, na presença de nucleotídeos e de um agente para polimerização, tal como DNA polimerase, transcriptase reversa e semelhantes, e uma temperatura e pH adequados. De preferência, o iniciador é um polidesóxirribonucleotídeo. O iniciador deve ser suficientemente longo para "iniciar" a síntese de produtos de extensão na presença dos agentes para polimerização. Os comprimentos exatos dos iniciadores dependerão de muitos fatores, incluindo temperatura e a fonte de iniciador.

[000106] Os iniciadores usados aqui são selecionados para serem "substancialmente" complementares aos diferentes filamentos de cada sequência específica a ser amplificada. Isso significa que o iniciador deve ser suficientemente complementar de modo a não se hibridizar aleatoriamente com seu respectivo filamento modelo. Portanto, a sequência do iniciador pode ou não refletir a sequência exata do modelo.

[000107] Os iniciadores de polinucleotídeo podem ser preparados usando qualquer método adequado tal como, por exemplo, os métodos com fosfotriéster ou fosfodiéster descritos em Narang e outros, (1979) Meth. Enzymol., 68: 90; Pat. U.S. No. 4.356.270, Pat. U.S. No. 4.458.066, Pat. U.S. No. 4.416.988, Pat. U.S. No. 4.293.652; e Brown e outros, (1979) Meth. Enzymol., 68: 109. Os conteúdos de todos os documentos precedentes são incorporados aqui por referência.

[000108] Uma vez que o tag de oligonucleotídeo de codificação tenha sido amplificada, a sequência do tag e, por fim, a composição da molécula selecionada, podem ser determinados usando análise de sequência de ácido nucléico, um procedimento bem-conhecido para determinar uma sequência de nucleotídeo. Análise de sequência de ácido nucléico é realizada através de uma combinação de (a) técnicas físico-químicas, baseadas em hibridização ou desnaturação de um filamento de sonda mais seu alvo complementar e (b) reações enzimáticas com polimerase.

[000109] A invenção ainda se refere a compostos os quais podem ser produzidos usando os métodos da invenção e coleções de tais compostos, quer como espécies isoladas ou combinados para formar uma biblioteca de estruturas químicas. Compostos da invenção incluem compostos da fórmula:

[000110] em que X é uma porção funcional compreendendo um ou mais blocos de construção, Z é um oligonucleotídeo preso em seu término 3' a B e Y é um oligonucleotídeo o qual é preso a C em seu término 5'. A é um grupo funcional que forma uma ligação covalente com X, B é um grupo funcional que forma uma ligação com a extremidade 3' de Z e C é um grupo funcional que forma uma ligação com a extremidade 5' de Y. D, F e E são grupos químicos que ligam os grupos funcionais A, C e B a S, o qual é um átomo ou armação central. De preferência, D, E e F têm, cada um, independentemente, uma cadeia de átomos, tal como uma cadeia de alquileno ou uma cadeia de (oligo)etileno glicol e D, E e F podem ser os mesmos ou diferentes e são, de preferência, efetivos para permitir hibridização dos dois oligonucleotídeos e síntese de uma porção funcional.

[000111] De preferência, Y e Z são substancialmente complementares e são orientados no composto de modo a permitir pareamento de base de Watson-Crick e formação de dúplex sob condições adequadas. Y e Z têm o mesmo comprimento ou comprimentos diferentes. De preferência, Y e Z têm o mesmo comprimento ou um de Y e Z é de 1 a 10 bases mais longo do que o outro. Em uma modalidade preferida, Y e Z têm, cada um, 10 ou mais bases de comprimento e têm regiões complementares de dez ou mais pares de base. Mais preferivelmente, Y e Z são substancialmente complementares no decorrer de seu comprimento, isto é, eles não têm mais de uma combinação errônea a cada dez pares de base. Mais preferivelmente, Y e Z são complementares no decorrer de seu comprimento, isto é, exceto com relação a qualquer região de saliência sobre Y ou Z, as filamentos se hibridizam via pareamento de base de Watson-Crick sem nenhuma combinação errônea no decorrer de todo seu comprimento.

[000112] S pode ser um único átomo ou uma armação molecular. Por exemplo, S pode ser um átomo de carbono, um átomo de boro, um átomo de nitrogênio ou um átomo de fósforo ou uma armação poliatômica, tal como um grupo fosfato ou um grupo cíclico, tal como um grupo cicloalquila, cicloalquenila, heterocicloalquila, heterocicloalquenila, arila ou heteroarila. Em uma modalidade, o ligante é um grupo da estrutura:

[000113] em que cada de n, m e p é, independentemente, um número inteiro de 1 a cerca de 20, de preferência de 2 a oito e mais preferivelmente de 3 a 6. Em uma modalidade em particular, o ligante tem a estrutura mostrada abaixo.

[000114] Em uma modalidade, as bibliotecas da invenção incluem moléculas consistindo em uma porção funcional composta de blocos de construção, em que cada porção funcional é operativamente ligada a um oligonucleotídeo de codificação. A sequência de nucleotídeos do oligonucleotídeo de codificação é indicativa dos blocos de construção presentes em uma porção funcional e, em algumas modalidades, a conectividade ou disposição dos blocos de construção. A invenção proporciona a vantagem de que a metodologia usada para construir uma porção funcional e aquela usada para construir o tag de oligonucleotídeo podem ser realizadas no mesmo meio de reação, de preferência um meio aquoso, assim, simplificando o método de preparação de uma biblioteca comparado aos métodos da técnica anterior. Em determinadas modalidades nas quais as etapas de ligação de oligonucleotídeo e as etapas de adição do bloco de construção podem ser ambas conduzidas em meios aquosos, cada reação terá um pH ótimo diferente. Nessas modalidades, a reação de adição do bloco de construção pode ser conduzida em um pH e temperatura adequados em um tampão aquoso adequado. O tampão pode, então, ser trocado para um tampão aquoso, o que proporciona um pH adequado para ligação do oligonucleotídeo.

[000115] Uma vantagem dos métodos da invenção é que eles podem ser usados para preparar bibliotecas compreendendo grandes números de compostos. A capacidade de amplificar sequências de oligonucleotídeo de codificação usando métodos conhecidos, tal como reação em cadeia de polimerase ("PCR"), significa que moléculas selecionadas podem ser identificadas mesmo se relativamente poucas cópias são recuperadas. Isso permite o uso prático de bibliotecas muito grandes as quais, como uma consequência de seu elevado grau de complexidade, compreendem relativamente poucas cópias de qualquer dado membro da biblioteca ou requerem o uso de volumes muito grandes. Por exemplo, uma biblioteca consistindo em 108 estruturas únicas na qual cada estrutura tem 1 x 1012 cópias (cerca de 1 picomol), requer cerca de 100 L de solução em uma concentração eficaz de 1 μM. Para a mesma biblioteca, se cada membro é representado por 1.000.000 cópias, o volume requerido é de 100 μL em uma concentração eficaz de 1 μM.

[000116] Em uma modalidade preferida, a biblioteca compreende de cerca de 103 a cerca de 1015 cópias de cada membro da biblioteca. Dadas as diferenças na eficácia da síntese entre os membros da biblioteca, é possível que diferentes membros da biblioteca tenham diferentes números de cópias em qualquer dada biblioteca. Portanto, embora o número de cópias de cada membro teoricamente presente em uma biblioteca possa ser o mesmo, o número real de cópias de qualquer dada biblioteca é independente do número de cópias de qualquer outro membro. Mais preferivelmente, as bibliotecas de composto da invenção incluem pelo menos cerca de 105, 106 ou 107 cópias de cada membro da biblioteca ou de substancialmente todos membros da biblioteca. Por "substancialmente todos" membros da biblioteca entenda-se pelo menos cerca de 85% dos membros da biblioteca, de preferência pelo menos cerca de 90% e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% dos membros da biblioteca.

[000117] De preferência, a biblioteca inclui uma número de cópias suficiente de cada membro de modo que múltiplos ciclos (isto é, dois ou mais) de uma seleção contra um alvo biológico pode ser realizada, com quantidades suficientes de moléculas de ligação restando após o ciclo final de seleção para permitir amplificação dos tags de oligonucleotídeo das moléculas restantes e, portanto, identificação das porções funcionais das moléculas de ligação. Uma representação esquemática de tal processo de seleção é ilustrado na Figura 6, na qual 1 e 2 representam membros da biblioteca, B é uma molécula alvo e X é uma porção operativamente ligada a B que permite a remoção de B do meio de seleção. Nesse exemplo, o composto 1 se liga a B, enquanto que o composto 2 não se liga a B. O processo de seleção, conforme representado no Ciclo 1, compreende (I) contato de uma biblioteca compreendendo os compostos 1 e 2 com B-X sob condições adequadas para ligação do composto 1 a B; (II) remoção do composto 2 não-ligado; (III) dissociação do composto 1 de B e remoção de BX do meio de reação. O resultado do Ciclo 1 é uma coleção de moléculas, enriquecida em composto 1 com relação ao composto 2. Ciclos subseqüentes empregando as etapas I-III resultam em enriquecimento adicional do composto 1 com relação ao composto 2. Embora três ciclos de seleção sejam mostrados na Figura 6, na prática, qualquer número de ciclos pode ser empregado, por exemplo, de um ciclo a dez ciclos, para se obter o enriquecimento desejado de moléculas de ligação com relação a moléculas de não-ligação.

[000118] Na modalidade mostrada na Figura 6, não existe amplificação (síntese de mais cópias) dos compostos restantes após qualquer um dos ciclos de seleção. Tal amplificação pode levar a uma mistura de compostos a qual não é consistente com as quantidades relativas dos compostos restantes após a seleção. Essa inconsistência é devido ao fato de que determinados compostos podem ser mais prontamente sintetizados do que outros compostos e pode, assim, ser amplificados de uma maneira a qual não é proporcional à sua presença após seleção. Por exemplo, se o composto 2 é mais prontamente sintetizado do que o composto 1, a amplificação das moléculas restantes após o Ciclo 2 resultará em uma amplificação desproporcional do composto 2 com relação ao composto 1 e a mistura resultante de compostos com um enriquecimento muito menor (se houver) do composto 1 com relação ao composto 2.

[000119] Em uma modalidade, o alvo é imobilizado sobre um suporte sólido através de qualquer técnica de imobilização conhecida. O suporte sólido pode ser, por exemplo, uma matriz insolúvel em água contida dentro de uma coluna de cromatografia ou uma membrana. A biblioteca codificada pode ser aplicada a uma matriz insolúvel em água contida dentro de uma coluna de cromatografia. A coluna é, então, lavada para remover os aglutinantes não específicos. Compostos-alvo- ligados podem, então, ser dissociados através de alteração do pH, concentração de sal, concentração de solvente orgânico ou outros métodos, tal como competição com um ligante conhecido pelo alvo.

[000120] Em outras modalidades, o alvo está solto em solução e é incubado com a biblioteca codificada. Compostos os quais se ligam ao alvo (também referidos aqui como "ligantes") são seletivamente isolados por meio de uma etapa de separação por tamanho, tal como filtração em gel ou ultrafiltração. Em uma modalidade, a mistura de compostos codificados e a biomolécula-alvo é passada através de uma coluna de cromatografia de exclusão por tamanho (filtração em gel), a qual separa quaisquer complexos de ligante-alvo dos compostos não-ligados. Os complexos de ligante-alvo são transferidos para uma coluna de cromatografia de fase reversa, a qual dissocia os ligantes do alvo. Os ligantes dissociados são, então, analisados através de amplificação por PCR e análise de sequência dos oligonucleotídeos de codificação. Essa abordagem é particularmente vantajosa em situações em que imobilização do alvo pode resultar em perda de atividade.

[000121] Uma vez que ligantes são identificados por meio dos processos descritos acima, vários níveis de análise podem ser aplicados para proporcionar informação sobre a relação estrutura-atividade e orientar a otimização adicional da afinidade, especificidade e bioatividade do ligante. Para ligantes derivados da mesma armação, modelagem molecular tridimensional pode ser empregada para identificar características estruturais significativas comuns aos ligantes, desse modo, gerando famílias de ligantes de molécula pequena que presumivelmente se ligam a um sítio em comum sobre a biomolécula alvo.

[000122] Uma variedade de abordagens de seleção podem ser usadas para obter ligantes que possuem elevada afinidade por um alvo, mas afinidade significativamente mais fraca por outros alvos intimamente relacionados. Uma estratégia de seleção é identificar ligantes para ambas as biomoléculas em experimentos paralelos e, subseqüentemente, eliminar ligantes em comum através de uma comparação cruzada remissiva. Nesse método, ligantes para cada biomolécula podem ser separadamente identificados, conforme divulgado acima. Esse método é compatível com biomoléculas alvo-imobilizadas e biomoléculas-alvo soltas em solução.

[000123] Para biomoléculas-alvo imobilizadas, outra estratégia é adicionar uma etapa de pré-seleção que elimina todos os ligantes que se ligam à biomolécula não-alvo de uma biblioteca. Por exemplo, uma primeira biomolécula pode ser contatada com uma biblioteca codificadas, conforme descrito acima. Compostos os quais não se ligam a primeira biomolécula são, então, separados de qualquer complexo de primeira biomolécula-ligante que se forma. A segunda biomolécula é, então, contatada com compostos os quais não se ligam à primeiro biomolécula. Compostos os quais se ligam a segunda biomolécula podem ser identificados, conforme descrito acima, e têm afinidade significativamente maior pela segunda biomolécula do que pela primeira biomolécula.

[000124] Um ligante para uma biomolécula de função desconhecida a qual é identificada por meio do método divulgado acima também pode ser usado para determinar a função biológica da biomolécula. Isso é vantajoso porque embora novas sequências de gene continuem a ser identificadas, as funções das proteínas codificadas por essas sequências e a validade dessas proteínas como alvos para a descoberta e desenvolvimento de novos fármacos são difíceis de determinar e representam, talvez, o obstáculo mais significativo para aplicação de informação genômica no tratamento de uma doença. Ligantes-alvo-específicos obtidos através dos processos descritos na presente invenção podem ser eficazmente empregados em ensaios biológicos com células inteiras ou em modelos com animais apropriados para compreender a função da proteína alvo e a validade da proteína-alvo para intervenção terapêutica. Essa abordagem também pode confirmar se o alvo é especificamente passível de descoberta de um fármaco de molécula pequena.

[000125] Em uma modalidade, um ou mais compostos dentro uma biblioteca da invenção são identificados como ligantes para uma biomolécula em particular. Esses compostos podem, então, ser avaliados em um ensaio in vitro com relação à capacidade de se ligar à biomolécula. De preferência, as porções funcionais dos compostos de ligação são sintetizadas sem o tag de oligonucleotídeo ou porção ligante e essas porções funcionais são avaliadas com relação à capacidade de se ligar à biomolécula.

[000126] O efeito da ligação das porções funcionais da biomolécula sobre a função da biomolécula também pode ser avaliado usando ensaios baseados em células ou isento de células in vitro. Para uma biomolécula tendo uma função conhecida, o ensaio pode incluir uma comparação da atividade da biomolécula na presença e ausência de um ligante, por exemplo, através de medição direta da atividade, tal como atividade enzimática ou através de uma medida indireta, tal como uma função celular que é influenciada pela biomolécula. Se a biomolécula tem função desconhecida, uma célula a qual expressa a biomolécula pode ser contatada com o ligante e o efeito do ligante sobre a viabilidade, função, fenótipo e/ou expressão de gene da célula é avaliada. O ensaio in vitro pode ser, por exemplo, um ensaio de morte celular, um ensaio de proliferação celular ou um ensaio de replicação viral. Por exemplo, se a biomolécula é uma proteína expressa por um vírus, uma célula infectada com o vírus pode ser contatada com um ligante para a proteína. O efeito da ligação do ligante à proteína sobre a viabilidade viral pode, então, ser avaliado.

[000127] Um ligante identificado por meio do método da invenção pode também ser avaliado em um modelo vivo ou em um ser humano. Por exemplo, o logante pode ser avaliado em um animal ou em um organismo o qual produz a biomolécula. Qualquer alteração do resultado no estado de saúde (por exemplo, progressão de doença) do animal ou organismo pode ser determinada.

[000128] Para a biomolécula, tal como uma proteína ou uma molécula de ácido nucléico, de função desconhecida, o efeito de um ligante o qual se liga à biomolécula sobre uma célula ou organismo o qual produz a biomolécula pode proporcionar informação com relação à função biológica da biomolécula. Por exemplo, a observação de que um processo celular em particular é inibido na presença do ligante indica que o processo depende, pelo menos em parte, de função da biomolécula.

[000129] Ligantes identificados usando os métodos da invenção podem também ser usados como reagentes de afinidade para a biomolécula à qual eles se ligam. Em uma modalidade, tais ligantes são usados para realizar purificação por afinidade da biomolécula, por exemplo, via cromatografia de uma solução compreendendo a biomolécula usando uma fase sólida à qual um ou mais tais ligantes são presos.

[000130] A presente invenção é ainda ilustrada por meio dos exemplos a seguir os quais não deverão ser construídos como limitativos. Os conteúdos de todas as referências, patentes e pedidos de patente publicados citados no decorrer do presente pedido, assim como as Figuras e a Listagem de Sequência, são aqui incorporados por referência.

Exemplos Exemplo 1: Síntese e Caracterização de uma biblioteca da ordem de 105 membros

[000131] A síntese de uma biblioteca compreendendo da ordem de 105 membros distintos foi realizada usando os seguintes reagentes:

[000132] Composto 1:

[000133] Códigos de uma única letra para desóxriribonucleotídeos:

[000134] A = adenosina

[000135] C = citidina

[000136] G = guanosina

[000137] T = timidina

[000138] Precursores de bloco de construção:

[000139] Tags de oligonucleotídeo:

[000140] Sequência Número do tag

[000141] 5'-PO4-GCAACGAAG (SEQ ID NO:1) 1.1

[000142] ACCGTTGCT-PO3-5'(SEQ ID NO:2)

[000143] 5'-PO3-GCGTACAAG (SEQ ID NO:3) 1.2

[000144] ACCGCATGT-PO3-5' (SEQ ID NO:4)

[000145] 5'-PO3-GCTCTGTAG (SEQ ID NO:5) 1.3

[000146] ACCGAGACA-PO3-5' (SEQ ID NO:6)

[000147] 5'-PO3-GTGCCATAG (SEQ ID NO:7) 1.4

[000148] ACCACGGTA-PO3-5' (SEQ ID NO:8)

[000149] 5'-PO3-GTTGACCAG (SEQ ID NO:9) 1.5

[000150] ACCAACTGG-PO3-5' (SEQ ID NO:10)

[000151] 5'-PO3-CGACTTGAC (SEQ ID NO:11) 1.6

[000152] CAAGTCGCA-PO3-5' (SEQ ID NO:12)

[000153] 5'-PO3-CGTAGTCAG (SEQ ID NO:13) 1.7

[000154] ACGCATCAG-PO3-5' (SEQ ID NO:14)

[000155] 5'-PO3-CCAGCATAG (SEQ ID NO:15) 1.8

[000156] ACGGTCGTA-PO3-5' (SEQ ID NO:16)

[000157] 5'-PO3-CCTACAGAG (SEQ ID NO:17) 1.9

[000158] ACGGATGTC-PO3-5' (SEQ ID NO:18)

[000159] 5'-PO3-CTGAACGAG (SEQ ID NO:19) 1.10

[000160] CGTTCAGCA-PO3-5' (SEQ ID NO:20)

[000161] 5'-PO3-CTCCAGTAG (SEQ ID NO:21) 1.11

[000162] ACGAGGTCA-PO3-5' (SEQ ID NO:22)

[000163] 5'-PO3-TAGGTCCAG (SEQ ID NO:23) 1.12

[000164] ACATCCAGG-PO3-5' (SEQ ID NO:24)

[000165] 5'-PO3-GCGTGTTGT (SEQ ID NO:25) 2.1

[000166] TCCGCACAA-PO3-5' (SEQ ID NO:26)

[000167] 5'-PO3-GCTTGGAGT (SEQ ID NO:27) 2.2

[000168] TCCGAACCT-PO3-5' (SEQ ID NO:28)

[000169] 5'-PO3-GTCAAGCGT (SEQ ID NO:29) 2.3

[000170] TCCAGTTCG-PO3-5' (SEQ ID NO:30)

[000171] 5'-PO3-CAAGAGCGT (SEQ ID NO:31) 2.4

[000172] TCGTTCTCG-PO3-5' (SEQ ID NO:32)

[000173] 5'-PO3-CAGTTCGGT (SEQ ID NO:33) 2.5

[000174] TCGTCAAGC-PO3-5' (SEQ ID NO:34)

[000175] 5'-PO3-CGAAGGAGT (SEQ ID NO:35) 2.6

[000176] TCGCTTCCT-PO3-5' (SEQ ID NO:36)

[000177] 5'-PO3-CGGTGTTGT (SEQ ID NO:37) 2.7

[000178] TCGCCACAA-PO3-5' (SEQ ID NO:38)

[000179] 5'-PO3-CGTTGCTGT (SEQ ID NO:39) 2.8

[000180] TCGCAACGA-PO3-5' (SEQ ID NO:40)

[000181] 5'-PO3-CCGATCTGT (SEQ ID NO:41) 2.9

[000182] TCGGCTAGA-PO3-5' (SEQ ID NO:42)

[000183] 5'-PO3-CCTTCTCGT (SEQ ID NO:43) 2.10

[000184] TCGGAAGAG-PO3-5' (SEQ ID NO:44)

[000185] 5'-PO3-TGAGTCCGT (SEQ ID NO:45) 2.11

[000186] TCACTCAGG-PO3-5' (SEQ ID NO:46)

[000187] 5'-PO3-TGCTACGGT (SEQ ID NO:47) 2.12

[000188] TCAGATTGC-PO3-5' (SEQ ID NO:48)

[000189] 5'-PO3-GTGCGTTGA (SEQ ID NO:49) 3.1

[000190] CACACGCAA-PO3-5' (SEQ ID NO:50)

[000191] 5'-PO3-GTTGGCAGA (SEQ ID NO:51) 3.2

[000192] CACAACCGT-PO3-5' (SEQ ID NO:52)

[000193]

[000194] 5'-PO3-CCTGTAGGA (SEQ ID NO:53) 3.3

[000195] CAGGACATC-PO3-5' (SEQ ID NO:54)

[000196] 5'-PO3-CTGCGTAGA (SEQ ID NO:55) 3.4

[000197] CAGACGCAT-PO3-5' (SEQ ID NO:56)

[000198]

[000199] 5'-PO3-CTTACGCGA (SEQ ID NO:57) 3.5

[000200] CAGAATGCG-PO3-5' (SEQ ID NO:58)

[000201] 5'-PO3-TGGTCACGA (SEQ ID NO:59) 3.6

[000202] CAACCAGTG-PO3-5' (SEQ ID NO:60)

[000203] 5'-PO3-TCAGAGCGA (SEQ ID NO:61) 3.7

[000204] CAAGTCTCG-PO3-5' (SEQ ID NO:62)

[000205] 5'-PO3-TTGCTCGGA (SEQ ID NO:63) 3.8

[000206] CAAACGAGC-PO3-5' (SEQ ID NO:64)

[000207] 5'-PO3-GCAGTTGGA (SEQ ID NO:65) 3.9

[000208] CACGTCAAC-PO3-5' (SEQ ID NO:66)

[000209] 5'-PO3-GCCTGAAGA (SEQ ID NO:67) 3.10

[000210] CACGGACTT-PO3-5' (SEQ ID NO:68)

[000211] 5'-PO3-GTAGCCAGA (SEQ ID NO:69) 3.11

[000212] CACATCGGT-PO3-5' (SEQ ID NO:70)

[000213] 5'-PO3-GTCGCTTGA (SEQ ID NO:71) 3.12

[000214] CACAGCGAA-PO3-5' (SEQ ID NO:72)

[000215] 5'-PO3-GCCTAAGTT (SEQ ID NO:73) 4.1

[000216] CTCGGATTC-PO3-5' (SEQ ID NO:74)

[000217] 5'-PO3-GTAGTGCTT (SEQ ID NO:75) 4.2

[000218] CTCATCACG-PO3-5' (SEQ ID NO:76)

[000219] 5'-PO3-GTCGAAGTT (SEQ ID NO:77) 4.3

[000220] CTCAGCTTC-PO3-5' (SEQ ID NO:78)

[000221] 5'-PO3-GTTTCGGTT (SEQ ID NO:79) 4.4

[000222] CTCAAAGCC-PO3-5' (SEQ ID NO:80)

[000223] 5'-PO3-CAGCGTTTT (SEQ ID NO:81) 4.5

[000224] CTGTCGCAA-PO3-5' (SEQ ID NO:82)

[000225] 5'-PO3-CATACGCTT (SEQ ID NO:83) 4.6

[000226] CTGTATGCG-PO3-5' (SEQ ID NO:84)

[000227] 5'-PO3-CGATCTGTT (SEQ ID NO:85) 4.7

[000228] CTGCTAGAC-PO3-5' (SEQ ID NO:86)

[000229] 5'-PO3-CGCTTTGTT (SEQ ID NO:87) 4.8

[000230] CTGCGAAAC-PO3-5' (SEQ ID NO:88)

[000231] 5'-PO3-CCACAGTTT (SEQ ID NO:89) 4.9

[000232] CTGGTGTCA-PO3-5' (SEQ ID NO:90)

[000233] 5'-PO3-CCTGAAGTT (SEQ ID NO:91) 4.10

[000234] CTGGACTTC-PO3-5' (SEQ ID NO:92)

[000235] 5'-PO3-CTGACGATT (SEQ ID NO:93) 4.11

[000236] CTGACTGCT-PO3-5' (SEQ ID NO:94)

[000237] 5'-PO3-CTCCACTTT (SEQ ID NO:95) 4.12

[000238] CTGAGGTGA-PO3-5' (SEQ ID NO:96)

[000239] 5'-PO3-ACCAGAGCC (SEQ ID NO:97) 5.1

[000240] AATGGTCTC-PO3-5' (SEQ ID NO:98)

[000241] 5'-PO3-ATCCGCACC (SEQ ID NO:99) 5.2

[000242] AATAGGCGT-PO3-5' (SEQ ID NO:100)

[000243] 5'-PO3-GACGACACC (SEQ ID NO:101) 5.3

[000244] AACTGCTGT-PO3-5' (SEQ ID NO:102)

[000245] 5'-PO3-GGATGGACC (SEQ ID NO:103) 5.4

[000246] AACCTACCT-PO3-5' (SEQ ID NO:104)

[000247] 5'-PO3-GCAGAAGCC (SEQ ID NO:105) 5.5

[000248] AACGTCTTC-PO3-5' (SEQ ID NO:106)

[000249] 5'-PO3-GCCATGTCC (SEQ ID NO:107) 5.6

[000250] AACGGTACA-PO3-5' (SEQ ID NO:108)

[000251] 5'-PO3-GTCTGCTCC (SEQ ID NO:109) 5.7

[000252] AACAGACGA-PO3-5' (SEQ ID NO:110)

[000253] 5'-PO3-CGACAGACC (SEQ ID NO:111) 5.8

[000254] AAGCTGTCT-PO3-5' (SEQ ID NO:112)

[000255] 5'-PO3-CGCTACTCC (SEQ ID NO:113) 5.9

[000256] AAGCGATGA-PO3-5' (SEQ ID NO:114)

[000257] 5'-PO3-CCACAGACC (SEQ ID NO:115) 5.10

[000258] AAGGTGTCT-PO3-5' (SEQ ID NO:116)

[000259] 5'-PO3-CCTCTCTCC (SEQ ID NO:117) 5.11

[000260] AAGGAGAGA-PO3-5' (SEQ ID NO:118)

[000261] 5'-PO3-CTCGTAGCC (SEQ ID NO:119) 5.12

[000262] AAGAGCATC-PO3-5' (SEQ ID NO:120)

[000263] 1X tampão ligase: Tris a 50 mM, pH de 7,5; ditiotreitol a 10 mM; MgCl2 a 10 mM; ATP a 2,5 mM; NaCl a 50 mM.

[000264] 10X tampão ligase: Tris a 500 mM, pH de 7,5; ditiotreitol a 100 mM; MgCl2 a 100 mM; ATP a 25 mM; NaCl a 500 mM

[000265] Ciclo 1

[000266] A cada um de vinte tubos de PCR foram adicionados 50 μL de uma solução do Composto 1 a 1 mM em água; 75 μL de uma solução a 0,80 mM de um dos Tags 1.1-1-12; 15 μL 10X tampão ligase e 10 μL de água deionizada. Os tubos foram aquecidos a 95 °C durante 1 minuto e então, resfriados para 16 °C durante 10 minutos. A cada tubo foram adicionadas 5.000 unidades de T4 DNA ligase (2,5 μL de uma solução de 2.000.000 unidades/mL (New England Biolabs, Cat. No. M0202)) em 50 μl de 1X tampão de ligase e as soluções resultantes foram incubadas a16 °C durante 16 horas.

[000267] Após ligação, as amostras foram transferidas para tubos de Eppendorf de 1,5 ml e tratadas com 20 μL de NaCl aquoso a 5 M e 500 μL de etanol gelado (-20 °C) e mantidas a -20' °C durante 1 hora. Após centrifugação, o sobrenadante foi removido e o pélete foi lavado com etanol aquoso a 70% a -20 °C. Cada um dos péletes foi, então, dissolvido em 150 μL de tampão de borato de sódio a 150 mM, pH de 9,4.

[000268] Soluções de estoque compreendendo cada um dos precursores do bloco de construção BB1 a BB12, N,N-diisopropiletanolamina e hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3- tetrametilurônio, cada um em uma concentração de 0,25 M, foram preparadas em DMF e agitadas em temperatura ambiente durante 20 minutos. As soluções do precursor de bloco de construção foram adicionadas a cada uma das soluções de péletes descrita acima a fim de proporcionar um excesso de 10 vezes o precursor de bloco de construção com relação ao ligante. As soluções resultantes foram agitadas. Mais 10 equivalentes de precursor de bloco de construção foram adicionados à mistura de reação após 20 minutos e mais 10 equivalentes após 40 minutos. A concentração final de DMF na mistura de reação era de 22%. As soluções de reação foram, então, agitadas durante a noite a 4 °C. O progresso da reação foi monitorado através de RP-HPLC usando acetato de tetraetilamônio aquoso a 50 mM (pH = 7,5) e acetonitrilo e um gradiente de acetonitrilo a 2-46% durante 14 min. A mistura de reação foi cessada quando ~95% do material de iniciação (ligante) foram acilados. Após acilação, as misturas de reação foram combinadas e liofilizadas até secagem. O material liofilizado foi, então, purificado através de HPLC e as frações correspondendo à biblioteca (produto acilado) foram combinadas e liofilizadas.

[000269] A biblioteca foi dissolvida em 2,5 ml de tampão de fosfato de sódio a 0,01 M (pH = 8,2) e 0,1 ml de piperidina (4% v/v) foi adicionado à mesma. A adição de piperidina resulta em turbidez, a qual não se dissolve quando de mistura. As misturas de reação foram agitadas em temperatura ambiente durante 50 minutos e, então, a solução turva foi centrifugada (14.000 rpm), o sobrenadante foi removido usando uma pipeta de 200 μl e o pélete foi resuspenso em 0,1 ml de água. A lavagem aquosa foi combinada com o sobrenadante e o pélete foi descartado. A biblioteca desprotegida foi precipitada da solução através de adição de etanol gelado em excesso de modo a levar a concentração final de etanol na reação para 70% v/v. Centrifugação da mistura aquosa de etanol proporcionou um pélete branca compreendendo uma biblioteca. O pélete foi lavado uma vez com etanol aquoso gelado a 70%. Após remoção do solvente, o pélete foi seco ao ar (~5 min.) para remover os traços de etanol e, então, usado no ciclo 2. Os tags e precursores de bloco de construção correspondentes usados no Ciclo 1 são apresentados na Tabela 1, abaixo .

Ciclos 2-5

[000270] Para cada um desses ciclos, as soluções resultantes combinadas do ciclo anterior foram divididas em 12 alíquotas iguais de 50 μl cada e colocadas em tubos de PCR. A cada tubo foi adicionada uma solução compreendendo um tag diferente e ligação, purificação e acilação foram realizadas conforme descrito para o ciclo 1 exceto que, para os ciclos 3-5, a etapa de purificação por HPLC descrita para o ciclo 1 foi omitida. A correspondência entre os tags e precursores de bloco de construção para os ciclos 2-5 é apresentada na Tabela 2.

[000271] Os produtos do ciclo 5 foram ligados com o iniciador de fechamento mostrado abaixo, usando os métodos descritos acima para ligação de tags.
5'-P03-GGCACATTGATTTGGGAGTCA
GTGTAACTAAACCCTCAGT-PO3-5'

Resultados:

[000272] Os procedimentos sintéticos descritos acima têm a capacidade de produzir uma biblioteca compreendendo 125 (cerca de 249.000) estruturas diferentes. A síntese da biblioteca foi monitorada via eletroforese em gel do produto de cada ciclo. O resultado de cada um dos cinco ciclos e a biblioteca final após ligação do iniciador de fechamento são ilustrados na Figura 7. O composto rotulado "peça de cabeça" é o Composto 1. A figura mostra que cada ciclo resulta no aumento esperado do peso molecular e que os produtos de cada ciclo são substancialmente homogêneos com relação ao peso molecular.

Exemplo 2: Síntese e Caracterização de uma biblioteca da ordem de 108 membros

[000273] A síntese de uma biblioteca compreendendo da ordem de 108 membros distintos foi realizada usando os seguintes reagentes: Composto 2:

[000274]
Códigos de uma única letra para desóxirribonucleotídeos:

[000275] A = adenosina

[000276] C = citidina

[000277] G = guanosina

[000278] T =timidina

[000279] Precursores de bloco de construção:

1X tampão de ligase: Tris a 50 mM, pH de 7,5; ditiotreitol a 10 mM; MgCl2 a 10 mM; ATP a 2 mM; NaCl a 50 mM.
10X tampão de ligase: Tris a 500 mM, pH de 7,5; ditiotreitol a 100 mM; MgCl2 a 100 mM; ATP a 20 mM; NaCl a 500 mM

Fixação de Espaçador solúvel em água ao Composto 2

[000280] A uma solução do Composto 2 (60 mL, 1 mM) em tampão de borato de sódio (150 mM, pH de 9,4) que foi resfriada para 4 °C foram adicionados 40 equivalentes de ácido N-Fmoc-15-amino-4,7,10,13-tetraoxaoctadecanóico (S-Ado) em N,N-dimetilformamida (DMF) (16 mL, 0,15 M) seguido por 40 equivalentes de hidrato de cloreto de 4-(4,6-dimetóxi[1.3.5]triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (DMTMM) em água (9,6 mL, 0,25 M). A mistura foi ligeiramente agitada durante 2 horas a 4 °C antes que mais 40 equivalentes de S- Ado e DMTMM fossem adicionados e agitada durante mais 16 horas a 4 °C.

[000281] Após acilação, um volume 0,1 X de NaCl aquoso a 5 M e um volume de 2,5 X de etanol gelado (-20 °C) foram adicionados e a mistura foi deixada descansar a -20 °C durante pelo menos uma hora. A mistura foi, então, centrifugada durante 15 minutos a 14.000 rpm em uma centrífuga a 4 °C para proporcionar um pélete branco a qual foi lavado com EtOH gelado e, então, seca em um liofilizador em temperatura ambiente durante 30 minutos. O sólido foi dissolvido em 40 mL de água e purificado através de HPLC em Fase Reversa com uma coluna Waters Xterra RP18. Um perfil de gradiente em fase móvel binário foi usado para eluir o produto usando um tampão aquoso de acetato de trietilamônio a 50 mM em um pH de 7,5 e solução de acetonitrilo a 99%/água a 1%. O material purificado foi concentrado através de liofilização e o resíduo resultante foi dissolvido em 5 mL de água. Um volume de 0,1X de piperidina foi adicionado à solução e a mistura foi ligeiramente agitada durante 45 minutos em temperatura ambiente. O produto foi, então, purificado através de precipitação com etanol conforme descrito acima e isolado através de centrifugação. O pélete resultante foi lavado duas vezes com EtOH gelado e seca através de liofilização a fim de proporcionar o Composto 3 purificado.

Ciclo 1

[000282] A cada cavidade de uma placa com 96 cavidades foram adicionados 12,5 μL de uma solução do Composto 3 a 4 mM em água; 100 μL de uma solução de um dos tags de oligonucleotídeo 1.1 a 1.96 a 1 mM, conforme mostrado na Tabela 3 (a proporção molar do Composto 3 para tags era de 1:2). As placas foram aquecidas para 95 °C durante 1 minuto e, então, esfriadas para 16 °C durante 10 minutos. a cada cavidade foram adicionados 10 μL de 10X tampão de ligase, 30 unidades de T4 DNA ligase (1 μL de uma solução com 30 unidades (FermentasLife Science, Cat. No.EL0013)), 76,5 μl de água e as soluções resultantes foram incubadas a 16 °C durante 16 horas.

[000283] Após a reação de ligação, 20 μL de NaCl aquoso a 5 M foram adicionados diretamente a cada cavidade, seguido por 500 μL de etanol gelado (-20 °C) e mantidos a -20 °C durante 1 hora. As placas foram centrifugadas durante 1 hora a 3200 g em uma centrifuga Beckman Coulter Allegra 6R usando Beckman Microplus Carriers. O sobrenadante foi cuidadosamente removido através de inversão da placa e o pélete foi lavado com etanol aquoso gelado a 70% a -20 °C. Cada uma das péletes foi, então, dissolvido em tampão de borato de sódio (50 pL, 150 mM, pH de 9,4) para uma concentração de 1 mM e resfriado para 4 °C.

[000284] A cada solução foram adicionados 40 equivalentes de um dos 96 precursores de bloco de construção em DMF (13 pL, 0,15 M) seguido por 40 equivalentes de DMT-MM em água (8 pL, 0,25 M) e as soluções foram ligeiramente agitadas a 4 °C. Após 2 horas, mais 40 equivalentes de um de cada um dos precursores de bloco de construção e DMTMM foram adicionados e as soluções foram ligeiramente agitadas durante 16 horas a 4°C. Após acilação, 10 equivalentes de N-hidróxi-succinimida éster de ácido acético em DMF (2 pL, 0,25 M) foram adicionados a cada solução e ligeiramente agitadas durante 10 minutos.

[000285] Após acilação, as 96 misturas de reação foram combinadas e 0,1 volume de NaCl aquoso a 5M e 2,5 volumes de etanol absoluto gelado foram adicionados e a solução foi deixada descansar a-20 °C durante pelo menos uma hora. A mistura foi, então, centrifugada. Após centrifugação, tanto sobrenadante quanto possível foi removido com uma micropipeta, o pélete foi lavado com etanol gelado e centrifugado novamente. O sobrenadante foi removido com uma pipeta de 200 pL. Etanol gelado a 70% foi adicionado ao tubo e a mistura resultante foi centrifugada durante 5 min a 4 °C.

[000286] O sobrenadante foi removido e o etanol restante foi removido através de liofilização em temperatura ambiente durante 10 minutos. O pélete foi, então, dissolvido em 2 mL de água e purificado através de HPLC em Fase Reversa com uma coluna Waters Xterra RP18. Um perfil de gradiente em fase móvel binário foi usado para eluir a biblioteca usando um tampão aquoso de acetato de trietilamônio em um pH de 7,5 e solução de acetonitrilo a 99%/água a 1%. As frações contendo a biblioteca foram coletadas, combinadas e liofilizadas. O resíduo resultante foi dissolvido em 2,5 mL de água e 250 μL de piperidina foram adicionados. A solução foi agitada ligeiramente durante 45 minutos e, então, precipitada com etanol conforme previamente descrito. O pélete resultante foi seco através de liofilização e, então, dissolvida em tampão de borato de sódio (4,8 mL, 150 mM, pH de 9,4) para uma concentração de 1 mM.

[000287] A solução foi resfriada para 4 °C e 40 equivalentes de cada um de N-Fmoc-propargilglicina em DMF (1,2 mL, 0,15 M) e DMT-MM em água (7,7 mL, 0,25 M) foram adicionados. A mistura foi ligeiramente agitada durante 2 horas a 4 °C antes de mais 40 equivalentes de N-Fmoc-propargilglicina e DMT-MM serem adicionados e a solução foi agitada durante mais 16 horas. A mistura foi depois purificada através de precipitação de EtOH e HPLC em Fase Reversa, conforme descrito acima, e o grupo N-Fmoc foi removido através de tratamento com piperidina conforme previamente descrito. Mediante a purificação final através de precipitação com EtOH, o pélete resultante foi seca através de liofilização e levado para o próximo ciclo de síntese.

Ciclos 2-4

[000288] Para cada um desses ciclos, o pélete seco do ciclo anterior foi dissolvido em água e a concentração da biblioteca foi determinada através de espectrofotometria baseada no coeficiente de extinção do componente de DNA da biblioteca, em que o coeficiente de extinção inicial do Composto 2 é 131.500 L/ (mol.cm). A concentração da biblioteca foi ajustada com água de modo que a concentração final na reação de ligação subseqüente fosse de 0,25 mM. A biblioteca foi, então, dividida em 96 alíquotas iguais em uma placa com 96 cavidades. A cada cavidade foi adicionada uma solução compreendendo um tag diferente (proporção molar da biblioteca para tag era 1:2) e as ligações foram realizadas conforme descrito para o ciclo 1. Os tags de oligonucleotídeo usados nos ciclos 2, 3 e 4 são apresentados nas Tabelas 4, 5 e 6, respectivamente. A correspondência entre os tags e os precursores de bloco de construção para cada um dos ciclos 1 a 4 é proporcionada na Tabela 7. A biblioteca foi precipitada através da adição de etanol conforme descrito acima para o ciclo 1 e dissolvida em tampão de borato de sódio (150 mM, pH de 9,4) para uma concentração de 1 mM. Acilações e purificações subseqüentes foram realizadas conforme descrito para o ciclo 1, exceto que purificação por HPLC foi omitida para o Ciclo 3.

[000289] Os produtos do ciclo 4 foram ligados com o iniciador de fechamento mostrado abaixo, usando os métodos descritos acima para ligação de tags.

[000290] 5'-PO3-CAG AAG ACA GAC AAG CTT CAC CTG C (SEQ ID NO: 889) 5'-PO3-GCA GGT GAA GCT TGT CTG TCT TCT GAA (SEQ ID NO: 890)

Resultados

[000291] Os procedimentos sintéticos descritos acima têm a capacidade de produzir uma biblioteca compreendendo 964 (cerca de 108) estruturas diferentes. A síntese da biblioteca foi monitorada via eletroforese em gel e LC/MS do produto de cada ciclo. Quando de término, a biblioteca foi analisada usando diversas técnicas. A Figura 13a é um cromatograma da biblioteca após o Ciclo 4, mas antes de ligação do iniciador de fechamento; A Figura 13b é um espectro de massa da biblioteca no mesmo estágio sintético. O peso molecular médio foi determinado através de análise por LC/MS em íons negativos. O sinal de íons foi de-convoluído usando o software ProMass. Esse resultado é consistente com a massa média prevista da biblioteca.

[000292] O componente de DNA da biblioteca foi analisado através de eletroforese em gel de agarose, o qual mostrou que a maioria do material da biblioteca corresponde ao produto ligado do tamanho correto. Análise de sequência de DNA dos clones moleculares do produto de PCR derivado de uma amostragem da biblioteca mostra que a ligação de DNA ocorreu com alta fidelidade e até próximo de término.

Ciclização da biblioteca

[000293] No término do ciclo 4, uma parte da biblioteca foi revestida no N- término ácido azidoacético sob as condições de acilação usuais. O produto, após purificação através de precipitação com EtOH, foi dissolvido em tampão de fosfato de sódio (150 mM, pH de 8) para uma concentração de 1 mM e 4 equivalentes de cada de CuS04 em água (200 mM), ácido ascórbico em água (200 mM) e uma solução dos compostos mostrados abaixo em DMF (200 mM) foram adicionados. A mistura de reação foi, então, ligeiramente agitada durante 2 horas em temperatura ambiente.

[000294] Para avaliar a extensão de ciclização, alíquotas de 5 μL da reação de ciclização da biblioteca foram removidas e tratadas com uma azida ou alcino fluorescentemente rotulado (1 μL de estoques em DMF a 100 mM) preparadas conforme descrito no Exemplo 4. Após 16 horas, nem os tags de alcino nem azida tinham sido incorporados na biblioteca através de análise por HPLC a 500 nm. Esse resultado indica que a biblioteca não continha mais grupos azida ou alcino capazes de cicloadição e que a biblioteca deve, portanto, ser reagida com ela mesma, através de reações de ciclização ou intermoleculares. A biblioteca ciclizada foi purificada através de HPLC em Fase Reversa conforme previamente descrito. Experimentos de controle usando uma biblioteca não ciclizada mostrou incorporação completa dos tags fluorescentes mencionados acima.

Exemplo 4: Preparo de Tags Fluorescentes para Ensaio de Ciclização:

[000295] Em tubos separados, propargil glicina ou 2-amino-3-fenilpropilazida (8 μmols cada) foi combinada com FAM-OSu (Molecular Probes Inc. ) (1,2 equiv.) em tampão de borato em um pH de 9,4 (250 μL). As reações foram deixadas processar durante 3 h em temperatura ambiente e foram, então, liofilizadas durante a noite. Purificação através de HPLC proporcionou o alcino e azida fluorescentes desejados em um rendimento quantitativo.

Exemplo 5: Ciclização dos compostos individuais usando uma reação de cicloadição com azida/alcino Preparo de Azidoacetila-Gly-Pro-Phe-Pra-NH2:

[000296] Usando 0,3 mmols de resina de Rink-amida, a sequência indicada foi sintetizada usando técnica padrão de síntese em fase sólida com aminoácidos Fmoc-protegidos e HATU como agente de ativação (Pra = C-propargilglicina). Ácido azidoacético foi usado para revestir o tetrapeptídeo. O peptídeo foi clivado a partir da resina com TFA/DCM a 20% durante 4 h. Purificação através de HPLC RP proporcionou o produto como um sólido branco (75 mg, 51%). 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 8,4-7,8 (m, 3H), 7,4-7,1 (m, 7 H), 4,6-4,4 (m, 1H), 4,4-4,2 (m, 2H), 4,0-3,9 (m, 2H), 3,74 (dd, 1H, J = 6 Hz, 17 Hz), 3,5-3,3 (m, 2H), 3,07 (dt, 1H, J = 5 Hz, 14 Hz), 2,92 (dd, 1H, J = 5 Hz, 16 Hz), 2,86 (t, 1H, J = 2 Hz), 2,85-2,75 (m, 1H), 2,6-2,4 (m, 2H), 2,21,6 (m, 4H). IV ("mull") 2900, 2100, 1450, 1300 cm-1. ESIMS 497,4 ([M+H], 100%), 993,4( [2M+H], 50%). ESIMS com fragmentação de fonte de íons: 519,3 ( [M+Na], 100%), 491,3 (100%), 480,1 ([M-NH2], 90%), 452,2 ([M-NH2-CO], 20%), 424,2 (20%), 385,1 ([M-Pra], 50%), 357,1 ([M-Pra-CO], 40%), 238,0 ([M-Pra-Phe], 100%).

[000297] O peptídeo de azidoacetila (31 mg, 0,62 mmols) foi dissolvido em MeCN (30 mL). Diisopropiletilamina (DIEA, 1 mL) e Cu(MeCN)4PF6 (1 mg) foram adicionados. Após agitação durante 1,5 h, a solução foi evaporada e o resíduo resultante foi captado em MeCN/H20 a 20%. Após centrifugação para remover os sais insolúveis, a solução foi submetida a HPLC preparativa em fase reversa. O peptídeo cíclico desejado foi isolado como um sólido branco (10 mg, 32%). 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 8,28 (t, 1H, J = 5 Hz), 7,77 (s,1H), 7,2-6,9 (m, 9H), 4,98 (m, 2H), 4,48 (m, 1H), 4,28 (m, 1H), 4,13,9 (m, 2H), 3,63 (dd, 1H, J = 5 Hz, 16 Hz), 3,33 (m, 2H), 3,0 (m, 3H), 2,48 (dd, 1H, J = 11 Hz, 14 Hz), 1,75 (m, 1HO, 1,55 (m, 1H), 1,32 (m, 1H), 1,05 (m, 1H). IV ("mull") 2900, 1475, 1400 cm-1. ESIMS 497,2 ([M+H], 100%), 993,2 ([2M+H], 30%), 1015,2( [2M+Na], 15%). ESIMS com fragmento de fonte de íons: 535,2 (70%), 519,3 ([M+Na], 100%), 497,2( [M+H], 80%), 480,1 ([M-NH2], 30%), 452,2 ([M-NH2-CO], 40%), 208,1 (60%).

Preparo de Azidoacetila-Gly-Pro-Phe-Pra-Gly-OH:

[000298] Usando 0,3 mmols de resina de Glicina-Wang, a sequência indicada foi sintetizada usando aminoácidos Fmoc-protegidos e HATU como o agente de ativação. Ácido azidoacético foi usado na última etapa de acoplamento para revestir o pentapeptídeo. Clivagem do peptídeo foi obtida usando TFA a 50%/DCM durante 2 h. Purificação através de RP HPLC proporcionou o peptídeo como um sólido branco (83 mg; 50%). 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 8,4-7,9 (m, 4H), 7,2 (m,5H), 4,7-4,2 (m, 3H), 4,0-3,7 (m, 4H), 3,5-3,3 (m, 2H), 3,1 (m, 1H), 2,91 (dd, 1H, J = 4 Hz, 16 Hz), 2,84 (t, 1H, J = 2,5 Hz), 2,78 (m, 1H), 2,6-2,4 (m, 2H), 2,2-1,6 (m, 4H). IV ("mull") 2900, 2100, 1450, 1350 cm-1. ESIMS 555,3 ([M+H], 100%). ESIMS - com fragmentação de fonte de íons: 577,1 ([M+Na], 90%), 555,3 ([M+H], 80%), 480,1 ([M-Gly], 100%), 385,1 ([M-Gly-Pra], 70%), 357,1 ([M-Gly-Pra-CO], 40%), 238,0 ([M-Gly-Pra-Phe], 80%).

Ciclização de Azidoacetila-Gly-Pro-Phe-Pra-Gly-OH:

[000299] O peptídeo (32 mg, 0,058 mmols) foi dissolvido em MeCN (60 mL). Diisopropiletilamina (1 mL) e Cu(MeCN)4PF6 (1 mg) foram adicionados e a solução foi agitada durante 2 h. O solvente foi evaporado e o produto bruto foi submetido a RP HPLC para remover os dímeros e trímeros. O monômero cíclico foi isolado como um vidro incolor (6 mg, 20%). ESIMS 555,6 ([M+H], 100%), 1109,3 ([2M+H], 20%), 1131,2 ([2M+Na], 15%). ESIMS com fragmentação de fonte de íons: 555,3 ([M+H], 100%), 480,4 ([M-Gly], 30%), 452,2 ([M-Gly-CO], 25%), 424,5 ([M-Gly-2CO], 10%, apenas possível em uma estrutura cíclica).

Conjugação de Peptídeo linear a DNA:

[000300] Composto 2 (45 nmols) foi dissolvido em 45 μL de tampão de borato de sódio (pH de 9,4; 150 mM). A 4°C, o peptídeo linear (18 μL de uma solução de estoque a 100 mM em DMF; 180 nmols; 40 equiv.) foi adicionado, seguido por DMT-MM (3,6 μL de um estoque a 500 mM em água; 180 nmols; 40 equiv.). Após agitação durante 2 h, LCMS mostrou reação completa e o produto foi isolado através de precipitação com etanol. ESIMS 1823,0 ([M-3H]/3, 20%), 1367,2 ([M-4H]/4, 20%), 1093,7 ([M-5H]/5, 40%), 911,4 ([M-6H]/6, 100%).

Conjugação de Peptídeo cíclico a DNA:

[000301] Composto 2 (20 nmols) foi dissolvido em 20 μL de tampão de borato de sódio (pH de 9,4, 150 mM). A 4°C, o peptídeo linear (8 μL de um estoque a 100 mM em DMF; 80 nmols; 40 equiv.) foi adicionado, seguido por DMT-MM (1,6 μL de um estoque a 500 mM em água; 80 nmols; 40 equiv.). Após agitação durante 2 h, LCMS mostrou reação completa e o produto foi isolado através de precipitação com etanol. ESIMS 1823,0 ([M-3H]/3, 20%), 1367,2 ([M-4H]/4, 20%), 1093,7 ([M-5H]/5, 40%), 911,4 ([M-6H]/6, 100%).

Ciclização de peptídeo DNA-Ligado:

[000302] Conjugado de peptídeo linear-DNA (10 nmols) foi dissolvido em tampão de fosfato de sódio com pH de 8 (10 μL, 150 mm). Em temperatura ambiente, 4 equivalentes de CuSO4, ácido ascórbico e o ligante de Sharpless foram todos adicionados (0,2 μL de estoques a 200 mM). A reação foi deixada processar durante a noite. RP HPLC mostrou que nenhum peptídeo linear-DNA estava presente e que o produto co-eluiu com peptídeo cíclico-DNA autentico. Nenhum vestígio de dímeros ou outros oligômeros foi observado.

Exemplo 6: Aplicação de reações de substituição nucleofílica aromática à síntese de porção funcional Procedimento geral para arilação de composto 3 com cloreto cianúrico:

[000303] Composto 2 é dissolvido em tampão de borato de sódio com pH de 9.4 em uma concentração de 1 mM. A solução é esfriada para 4°C e 20 equivalentes de cloreto cianúrico são. então. adicionados como uma solução a 500 mM em MeCN. Após 2h. reação completa é confirmada através de LCMS e o conjugado de diclorotriazina-DNA resultante é isolado através de precipitação com etanol.

Procedimento para substituição de amina de Diclorotriazina-DNA:

[000304] O conjugado de diclorotriazina-DNA é dissolvido em tampão de borato com pH de 9.5 em uma concentração de 1 mM. Em temperatura ambiente, 40 equivalentes de uma amina alifática são adicionados como uma solução em DMF. A reação é acompanhada por LCMS e usualmente está completa após 2 h. O conjugado de alquilamino-monoclorotriazina-DNA resultante é isolado através de precipitação com etanol.

Procedimento para substituição de amina de Monoclorotriazina-DNA:

[000305] O conjugado de alquilamino-monoclorotriazina-DNA é dissolvido em tampão de borato com pH de 9,5 em uma concentração de 1 mM. A 42°C, 40 equivalentes de uma segunda amina alifática são adicionados como uma solução em DMF. A reação é acompanhada por LCMS e usualmente está completa após 2 h. O conjugado de diaminotriazina-DNA resultante é isolado através de precipitação com etanol.

Exemplo 7: Aplicação de reações de Aminação Redutiva à síntese de Porção funcional Procedimento Geral para Aminação Redutiva de DNA-Ligante Contendo uma Amina Secundária com um Bloco de construção de Aldeído:

[000306] Composto 2 foi acoplado a um resíduo de prolina N-terminal. O composto resultante foi dissolvido em tampão de fosfato de sódio (50 μL, 150 mM, pH de 5,5) em uma concentração de 1 mM. A essa solução foram adicionados 40 equivalentes de um bloco de construção de aldeído em DMF (8 μL, 0,25 M) e cianoboroidreto de sódio em DMF (8 μL, 0,25 M) e a solução foi aquecida a 80°C durante 2 horas. Após alquilação, a solução foi purificada através de precipitação com etanol.

Procedimento Geral para Aminações Redutivas de DNA-Ligante Contendo um Aldeído com Blocos de construção de Amina:

[000307] Composto 2 acoplado a um bloco de construção compreendendo um grupo aldeído foi dissolvido em tampão de fosfato de sódio (50 μL, 250 mM, pH de 5,5) em uma concentração de 1 mM. A essa solução foram adicionados 40 equivalentes de um bloco de construção de amina em DMF (8 μL, 0,25 M) e cianoboroidreto de sódio em DMF (8 μL, 0,25 M) e a solução foi aquecida a 80°C durante 2 horas. Após alquilação, a solução foi purificada através de precipitação com etanol.
Exemplo 8: Aplicação de Reações de Ligação de Peptóide à Síntese de Porção Funcional
Procedimento Geral para a Síntese de Peptóide sobre um DNA-Ligante:

[000308] Composto 2 foi dissolvido em tampão de borato de sódio (50 μL, 150 mM, pH de 9,4) em uma concentração de 1 mM e resfriado para 4°C. A essa solução foram adicionados 40 equivalentes de bromoacetato de N-hidróxi-succinimidila em DMF (13 μL, 0,15 M) e a solução foi ligeiramente agitada a 4°C durante 2 horas. Após acilação, o DNA-Ligante foi purificado através de precipitação com etanol e dissolvido em tampão de borato de sódio (50 μL, 150 mM, pH de 9,4) em uma concentração de 1 mM e resfriado para 4°C. A essa solução foram adicionados 40 equivalentes de um bloco de construção de amina em DMF (13 μL, 0,15 M) e a solução foi ligeiramente agitada a 4°C durante 16 horas. Após alquilação, o DNA-ligante foi purificado através de precipitação com etanol e redissolvido em tampão de borato de sódio (50 μL, 150 mM, pH de 9,4) em uma concentração de 1 mM e resfriado para 4°C. A síntese de peptóide é continuada através da adição gradual de bromoacetato de N-hidróxi-succinimidila, seguido pela adição de um bloco de construção de amina.

Exemplo 9: Aplicação da Reação de Cicloadição de Azida-Alcino à Síntese de Porção Funcional Procedimento Geral

[000309] Um conjugado de DNA contendo alcino é dissolvido em tampão de fosfato com pH de 8,0 em uma concentração de aproximadamente l mM. A essa mistura são adicionados 10 equivalentes de uma azida orgânica e 5 equivalentes de sulfato de cobre(II), ácido ascórbico e o ligante (tris-((l-benziltriazol-4-il)metil)amina, todos em temperatura ambiente. A reação é acompanhada por LCMS e usualmente está completa após 1-2 h. O conjugado de triazol-DNA resultante pode ser isolado através de precipitação com etanol.

Exemplo 10: Identificação de um ligante para a quinase Abl de uma biblioteca codificada

[000310] A capacidade de enriquecer moléculas de interesse em uma biblioteca DNA-codificada acima dos membros da biblioteca indesejaveis é crucial para identificar compostos únicos com propriedades definidas contra alvos terapêuticos de interesse. Para demonstrar essa capacidade de enriquecimento, uma molécula de ligação conhecida (descrita por Shah e outros, Science 305, 399-401 (2004), incorporado aqui por referência) à quinase rhAbl (GenBank U07563) foi sintetizada. Esse composto foi preso a um oligonucleotídeo de Dna de filamento duplo via o ligante descrito nos exemplos precedentes usando métodos químicos para produzir uma molécula similar (porção funcional ligada a um oligonucleotídeo) àquelas produzidas via os métodos descritos nos Exemplos 1 e 2. Uma biblioteca geralmente produzida conforme descrito no Exemplo 2 e o ligante quinase Abl DNA-ligado foram projetados com sequências de DNA únicas que permitiram análise por qPCR de ambas as espécies. O ligante quinase Abl DNA-ligado foi misturado com a biblioteca em uma proporção de 1:100. Essa mistura foi equilibrada com quinase rhAble e a enzima foi capturada sobre uma fase sólida, lavada para remover membros da biblioteca de não-ligação e as moléculas de ligação foram eluídas. A proporção de moléculas da biblioteca para o inibidor de quinase Abl DNA-ligado no eluato era de 1:1, indicando um enriquecimento de mais de 500 vezes do ligante quinase Abl DNA-ligado em um excesso de 1000 vezes de moléculas da biblioteca.

Equivalentes

[000311] Aqueles versados na técnica reconhecerão ou serão capazes de determinar, usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descrita aqui. Se pretende que tais equivalentes sejam abrangidos pelas reivindicações a seguir.

Claims (42)

1. Método de síntese de uma molécula compreendendo uma porção funcional a qual é operativamente ligada a um oligonucleotídeo de codificação que identifica a estrutura da porção funcional, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   • (a) fornecimento de um composto iniciador consistindo em uma porção funcional inicial compreendendo n blocos de construção, em que n é um número inteiro de 1 ou maior, em que a porção funcional inicial compreende pelo menos um grupo reativo e é operativamente ligada a um oligonucleotídeo inicial; em que a porção funcional inicial e o oligonucleotídeo inicial estão ligados por uma porção ligante e em que o oligonucleotídeo inicial é de fita dupla e a porção ligante é covalentemente acoplada à porção funcional inicial e a ambas as fitas do oligonucleotídeo inicial; em que a fração de ligação compreende um primeiro grupo funcional adaptado para ligação com um bloco de construção, um segundo grupo funcional adaptado para ligação à extremidade 5' de uma fita do oligonucleotídeo inicial e um terceiro grupo funcional adaptado para ligação à extremidade 3' da outra fita do oligonucleotídeo inicial
   • (b) reação do composto iniciador com um bloco de construção compreendendo pelo menos um grupo reativo complementar, em que o pelo menos um grupo reativo complementar é complementar ao grupo reativo da etapa (a), sob condições adequadas para reação do grupo reativo complementar para formar uma ligação covalente;
   • (c) reação do oligonucleotídeo inicial com um oligonucleotídeo de entrada o qual identifica o bloco de construção da etapa (b) na presença de uma enzima a qual catalisa ligação do oligonucleotídeo inicial e do oligonucleotídeo de entrada, sob condições adequadas para ligação do oligonucleotídeo de entrada e do oligonucleotídeo inicial para formar um oligonucleotídeo de codificação;

   desse modo, produzindo uma molécula a qual compreende uma porção funcional da etapa (a) compreendendo n+1 blocos de construção a qual é operativamente ligada a um oligonucleotídeo de codificação que identifica a estrutura da porção funcional,
   em que a porção ligante é da estrutura:

   

   em que cada um de n, m e p é, independentemente, um número inteiro de 1 a cerca de 20.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma porção funcional da etapa (c) compreende um grupo reativo e as etapas (a) a (c) são repetidas uma ou mais vezes, desse modo, formando os ciclos 1 a i, em que i é um número inteiro de 2 ou maior, em que o produto da etapa (c) de um ciclo s, em que s é um número inteiro de i-1 ou menos, é o composto iniciador do ciclo s + 1.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) precede a etapa (b) ou a etapa (b) precede a etapa (c).
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos blocos de construção é um aminoácido ou um aminoácido ativado.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grupo reativo e o grupo reativo complementar são selecionados do grupo consistindo em um grupo amino; um grupo carboxila; um grupo sulfonila; um grupo fosfonila; um grupo epóxido; um grupo aziridina; e um grupo isocianato.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grupo reativo e o grupo reativo complementar são selecionados do grupo consistindo em um grupo hidroxila; um grupo carboxila; um grupo sulfonila; um grupo fosfonila; um grupo epóxido; um grupo aziridina; e um grupo isocianato.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grupo reativo e o grupo reativo complementar são selecionados do grupo consistindo em um grupo amino e um grupo aldeído ou cetona.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a reação entre o grupo reativo e o grupo reativo complementar é conduzida sob condições de redução.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grupo reativo e o grupo reativo complementar são selecionados do grupo consistindo em um grupo ilídeo de fósforo e um grupo aldeído ou cetona.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grupo reativo e o grupo reativo complementar reagem via cicloadição para formar uma estrutura cíclica.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o grupo reativo e o grupo reativo complementar são selecionados do grupo consistindo em um alcino e uma azida.
12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o grupo reativo e o grupo reativo complementar são selecionados do grupo consistindo em um grupo heteroaromático halogenado e um nucleófilo.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o grupo heteroaromático halogenado é selecionados do grupo consistindo em pirimidinas cloradas, triazinas cloradas e purinas cloradas.
14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o nucleófilo é um grupo amino.
15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enzima é selecionada do grupo consistindo em uma DNA ligase, uma RNA ligase, uma DNA polimerase, uma RNA polimerase e uma topoisomerase.
16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo inicial compreende uma sequência de iniciador de PCR.
17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a porção funcional inicial e o oligonucleotídeo inicial são ligados através de uma porção de ligação.
18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo de entrada tem de 3 a 10 nucleotídeos de comprimento.
19. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo de entrada do ciclo i compreende um iniciador de PCR de fechamento.
20. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, no ciclo i, a etapa de:
    (d) ligação de um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de iniciador de PCR de fechamento ao oligonucleotídeo de codificação.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de iniciador de PCR de fechamento é ligado ao oligonucleotídeo de codificação na presença de uma enzima a qual catalisa a referida ligação.
22. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, após o ciclo i, a etapa de:
    (e) ciclização de uma porção funcional.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que uma porção funcional compreende um grupo alquinila e um grupo azido e o composto é submetido a condições adequadas para cicloadição do grupo alquinila e o grupo azido para formar um grupo triazol, desse modo, ciclizando a porção funcional.
24. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda as etapas de:

    • (a) fornecimento de uma solução compreendendo m compostos iniciadores, em que m é um número inteiro de 1 ou maior, e em que o oligonucleotídeo inicial identifica os n blocos de construção;
    • (b) divisão da solução da etapa (a) em r vasos de reação, em que r é um número inteiro de 2 ou maior, desse modo, produzindo r alíquotas da solução;
    • (c) reação dos compostos iniciadores em cada vaso de reação com um dos r blocos de construção, desse modo, produzindo r alíquotas compreendendo compostos consistindo em uma porção funcional compreendendo n+1 blocos de construção operativamente ligada ao oligonucleotídeo inicial; e
    • (d) reação do oligonucleotídeo inicial em cada alíquota com um dos conjuntos de r oligonucleotídeos de entrada distintos na presença de uma enzima a qual catalisa a ligação do oligonucleotídeo de entrada e do oligonucleotídeo inicial, sob condições adequadas para ligação enzimática do oligonucleotídeo de entrada e do oligonucleotídeo inicial;

    desse modo, produzindo r alíquotas compreendendo moléculas consistindo em uma porção funcional compreendendo n+1 blocos de construção operativamente ligada a um oligonucleotídeo alongado o qual codifica os n+1 blocos de construção.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de:
    (e) combinação de duas ou mais das r alíquotas, desse modo, produzindo uma solução compreendendo moléculas consistindo em uma porção funcional compreendendo n + 1 blocos de construção, a qual é operativamente ligada a um oligonucleotídeo alongado o qual codifica os n +1 blocos de construção.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que r alíquotas são combinadas.
27. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) a (e) são conduzidas uma ou mais vezes para proporcionar ciclos 1 a i, em que i é um número inteiro de 2 ou maior, em que no ciclo s+1, em que s é um número inteiro de i-1 ou menos, a solução compreendendo m compostos iniciadores da etapa (a) é a solução da etapa (e) do ciclo s.
28. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que em pelo menos um dos ciclos 1 a i a etapa (d) precede a etapa (c).
29. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos blocos de construção é um aminoácido.
30. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a enzima é DNA ligase, RNA ligase, DNA polimerase, RNA polimerase ou topoisomerase.
31. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada um de n, m e p é independentemente um número inteiro de 2 a 8.
32. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada um de n, m e p é independentemente um número inteiro de 3 a 6.
33. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação tem a estrutura:

    
34. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, após o ciclo i, a etapa de:
    (f) ciclização de uma ou mais das porções funcionais.
35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato d que uma porção funcional da etapa (f) compreende um grupo azido e um grupo alquinila.
36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que uma porção funcional é mantida sob condições adequadas para cicloadição do grupo azido e do grupo alquinila para formar um grupo triazol, desse modo, formando uma porção funcional cíclica.
37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a reação de cicloadição é conduzida na presença de um catalisador de cobre.
38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das uma ou mais porções funcionais da etapa (f) compreende pelo menos dois grupos sulfidrila e a referida porção funcional é mantida sob condições adequadas para reação dos dois grupos sulfidrila para formar um grupo dissulfeto, desse modo, ciclizando uma porção funcional.
39. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo inicial compreende uma sequênciade iniciador de PCR.
40. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo de entrada do ciclo i compreende um iniciador de PCR de fechamento.
41. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, após o ciclo i, a etapa de:
    (d) ligação de um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de iniciador de PCR de fechamento ao oligonucleotídeo de codificação.
42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de iniciador de PCR de fechamento é ligado ao oligonucleotídeo de codificação na presença de uma enzima a qual catalisa a referida ligação.

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