SK762000A3 - Plasmids, their construction and their use in the manufacture of interleukin-4 and interleukin-4 muteins - Google Patents
Plasmids, their construction and their use in the manufacture of interleukin-4 and interleukin-4 muteins Download PDFInfo
- Publication number
- SK762000A3 SK762000A3 SK76-2000A SK762000A SK762000A3 SK 762000 A3 SK762000 A3 SK 762000A3 SK 762000 A SK762000 A SK 762000A SK 762000 A3 SK762000 A3 SK 762000A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- interleukin
- expression
- gene
- plasmid
- muteins
- Prior art date
Links
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 37
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 title abstract description 48
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 title abstract description 47
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 13
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 9
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 6
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 abstract description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 3
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 0 CC1C(C2)*2CC1 Chemical compound CC1C(C2)*2CC1 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000701988 Escherichia virus T5 Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000908115 Bolivar Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000666730 Homo sapiens T-complex protein 1 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100038410 T-complex protein 1 subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 102000006646 aminoglycoside phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 1
- 150000004678 hydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101150078341 rop gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 101150006320 trpR gene Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5406—IL-4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka konštrukcie a použitia expresných plazmidov vo výrobe rekombinantného interleukínu-4 (IL-4) a muteínov interleukínu-4.
Doterajší stav techniky
Zrelý ľudský interleukín-4 (IL-4) je zložený zo 129 aminokyselín a je z 50 % homológny s myším IL-4. IL-4 je jediný známy cytokín, ktorý riadi diferenciáciu pomocných T buniek na fenotyp TH2 (Mosmann a Sad, Immunol. Today 17, 138 - 146, 1996). IL-4 odovzdáva signál lymfocytom a ďalším bunkám cez heterodimerický aggkomplex dvoch receptorov cytokínu, IL-4Ralfa a τ-reťazca (xc). Boli popísaní antagonistickí mutanti IL-4 (Kruse a kol., EMBO
J., 11, 3237 - 3244, 1992). Tri aminokyseliny blízko C-konca (R121, Y124 a S125) sú dôležité pre väzbu k το-reťazcu. Zavedenie Asp (D) do týchto pozícií blokuje dimerizáciu receptoru a prenos signálov cez membránu.
Dvojitý muteín interleukínu-4 (IL-4 DM) je variant IL-4 s dvoma zmenami aminokyselín v pozíciách 121 a 124, nazvaná IL-4 R121D Y124D. IL-4 DM je schopný blokovať obe aktivity IL-4 a IL-3. Na rozdiel od všetkých bodových mutantov žiadne zvyškové agonistické aktivity neboli pre tento muteín nikdy zistené. Predpokladá sa, že tieto antagonistické vlastnosti IL-4 DM sú užitočné na liečenie ochorení, ktoré zahrňujú vývoj TH2 a/alebo produkciu IgE (Ryan, J., Allergy Clin. Immunol. 99,1 -5,1997).
Ako bolo popísané v rôznych publikáciách, na produkciu rekombinantného IL-4 a muteínov IL-4 sa môžu využiť prokaryotické organizmy.
Bohužiaľ, popisované systémy majú rad nedostatkov (nízka hladina expresie,
31389/H nízka stabilita expresného vektoru), ktoré znemožňujú produkciu IL-4 a muteínov IL-4 vo veľkom meradle alebo sú ekonomicky nerealizovateľné.
Hlavné kritériá pre účinný a bezpečný expresný systém sú:
- vysoký výťažok produktu
- regulovateľná stabilná expresia
- stabilita expresného vektoru.
Niekoľko aspektov expresného plazmidu je dôležitých pre vyššie uvedené kritériá (Hannig a kol., TIBTECH. 16, 54 - 60,1998). Sú to:
- promótor
- ribozomálne väzobné miesto (rbs)
- využitie kodónu príslušného génu
- transkripčný terminátor
- gén pre rezistenciu
- regulácia expresie '
- počiatok replikácie (ori).
Podstata vynálezu
Podľa vynálezu boli vytvorené expresné plazmidy pre IL-4 a muteíny IL-4 s modifikáciami vo všetkých príslušných elementoch pre účinný a bezpečný expresný systém. Kvalita a vhodnosť príslušného expresného systému bola klasifikovaná hlavne podľa nasledujúcich kritérií:
- výťažok IL-4 a muteínov IL-4
- stabilita plazmidu
- udržanie indukčnej schopnosti.
Predmetom tohto vynálezu je preto vytvorenie metódy pre konštrukciu na použitie expresného plazmidu na výrobu rekombinantného interleukínu-4 (IL-4)
31389/H a muteínov interleukínu-4 vo veľkom meradle. Navyše by mal novo vytvorený systém hostiteľa/vektoru byť vhodný na expresiu ďalších proteinov (cytokínov, rastových faktorov, rozpustných receptorov, protilátok, atď.). S prekvapením sa zistilo, že baktérie transformované plazmidom podľa tohto vynálezu poskytujú mnohonásobne väčšie rýchlosti expresie a stabilitu plazmidu a expresie ako sa pozorovalo po transformácii rovnakého hostiteľa inými známymi plazmiai'ni. Preto je použitie plazmidov podľa tohto vynálezu oveľa výhodnejšie na produkciu rekombinantného interleukínu-4 a muteínov interleukínu-4 v porovnaní so všetkými prv známymi plazmidmi.
Novo vyvinutý vektorový systém obsahuje nasledujúce prvky:
T5 promótor
Promótor bakteriofága T5 E. coli spoločne s dvoma lac operátorovými sekvenciami je odvodený z plazmidu pQE30 (Qiagen), patriaceho do skupiny plazmidov pDS (Bujard a kol., Methods Enzymol. 155, 416 - 433, 1987 a Stúber a kol., Immunological Methods, I. Lefkowits a B. Pernis, eds., Academic Press, Inc. Vol. IV, 121 - 152, 1990).
T7 g10 ribozomálne väzobné miesto
Väzobné miesto ribozómu (rbs) je odvodené z oblasti pred génom 10 bakteriofága T7 (T7g10 vedúcej sekvencie). Gén 10 fága T7 kóduje plášťový proteín, ktorý je hlavným proteínom exprimovaným po infekcii fágom T7. T7 g10 rbs sa získal z vektoru pET-9a (Studier a kol., Methods Enzymol. 185, 60 89, 1990). T7 g10 vedúca sekvencia zahrňuje oblasť okolo 100 bp (Olins et ak, Gene 227 - 235, 1988). Vo finálnom expresnom konštrukte je oblasť pred Xbal miestom odstránená. T7 g10 vedúca sekvencia teraz teda zahrňuje 42 bp a obsahuje zámenu jednej bázy z G na A v pozícii 3638 v tomto tu popisovanom plazmide.
Využitie kodónov prirodzenej sekvencie IL-4
Ako účinné meradlo využitia synonymných kodónov prirodzenej sekvencie môže byť index adaptácie kodônu (codon adaptation index - CAI) použitý na predpovedanie hladiny expresie daného génu (Sharp a kol., Nucleic
31389/H
Acids Res. 15, 1281 - 1295, 1987 a Apeler a kol., Eur. J. Biochem. 247, 890 895, 1997). CAI sa počíta ako geometrický stred hodnôt relatívneho využitia kodónov (RSCU) zodpovedajúcich každému zkodónov použitých v géne, deleno maximálnym možným CAI pre gén pre rovnaké aminokyselinové zloženie. RSCU hodnoty sú pre každý kodón počítané z veľmi vysoko exprimovaných génov určitého organizmu, napr. E. coli a reprezentujú pozorovanú frekvenciu kodónu delenú frekvenciou očakávanou za predpokladu rovnakého využitia synonymných kodónov pre aminokyselinu. Vysoko exprimované gény, napr. gény kódujúce ribosomálne proteíny, všeobecne majú vysoké hodnoty CAI > 0,46. Slabo exprimované gény ako lacl a trpR v E. coli majú nízke hodnoty CAI < 0,3.
Vypočítaná hodnota CAI v E. coli je pre prirodzenú sekvenciu IL4 0,733. To znamená, že prirodzený gén by mal byť vhodný pre vysokú hladinu expresie v E. coli. Avšak má syntetický gén s optimálnym využitím E. coli kodónov (hodnota CAI = 1) potenciál k ďalšiemu zvýšeniu hladiny expresie. Preto boli navrhnuté a klonované syntetické gény pre IL-4 a muteiny IL-4.
Transkripčný terminátor
Fragment z T7 DNA obsahujúci transkripčný terminátor T0 je odvodený z vektoru pET-9a (Studier a kol., Methods Enzymol. 185, 60 - 89, ICľC). Transkripčné terminátory určujú miesta, kde komplex mRNA - RNA polymeráza - DNA disociuje, a tým končí transkripcia. Prítomnosť transkripčného terminátora na konci vysoko exprimovaného génu má niekoľko výhod. Minimalizuje nedostupnosť RNA polymerázy, ktorá by bola zahrnutá v nadbytočnej transkripcii, obmedzujú dĺžku mRNA na minimálnu potrebnú dĺžku, a tým obmedzuje výdaj energie. Vzhľadom k tomu, že silná transkripcia by mohla interferovať s počiatkom replikácie, zvyšuje terminátor transkripcie stabilitu plazmidu prostredníctvom udržania počtu kópií (Balbas a Bolivar, Methods Enzymol. 185,14 - 37, 1990).
31389/H
Gén kódujúci rezistenciu
Gén kanamycínovej rezistencie je odvodený z vektoru pET-9a (Studier a kol., Methods Enzymol. 185, 60 - 89, 1990). Pôvodne sa jedná o kan gén Tn903 z vektoru pUC4KISS (Barany, Gene 37, 111 - 123, 1985). V tu popisovanom plazmide je kan gén v opačnej orientácii ako gény pre IL-4 a muteín IL-4, takže nedochádza k zvýšeniu množstva produktu kan génu po indukcii v dôsledku prečítania terminátora transkripcie z T5 promótora. Kanamycín bol vybraný ako selekčný markér alebo je preferovaným antibiotikom pre GMP-účely. Navyše sú vektory založené na rezistencii ku kanamycínu stabilnejšie ako plazmidy s ampicilínovou (bla) rezistenciou. Selekcia na ampicilíne má tendenciu k stratám, lebo táto látka je degradovaná sekretovaným enzýmom: beta-laktamázou. Spôsob bakteriálnej rezistencie ku kanamycínu závisí od aminoglykozidovej fosfotransferázy, ktorá inaktivuje antibiotikum.
Regulácia expresie
Kontrolovaná génová expresia je absolútne nevyhnutná na nastavenie stabilného plazmidového systému, najmä ak je požadovaný proteín zhubný pre hostiteľské bunky. Výhodný plazmid podľa predmetného vynálezu využíva indukovateľný systém založený na lac systéme pozostávajúcom z génu pre lac represor (lacl) a dvoch syntetických sekvencii lac operátora predchádzajúcich vo fúzii promótor bakteriofága T5 E. coli. Promótor laclq a štruktúrny gén lácl bol izolovaný z vektoru pTrc99A (Amman et al., Gene 69, 301 - 315, 1988). Iq predstavuje promótorovú mutáciu vedúcu k nadprodukcii lacl represora. Lac represor štandardného typu je tetramérna molekula pozostávajúca zo štyroch identických podjednotiek s 360 aminokyselinami, každá. Tetramér lac represoru je dimér dvoch funkčných dimérov. Štyri podjednotky sú držané spolu zväzkom štyroch helixov tvorených zvyškami 340 - 360. Pri izolácii lacl génu z vektoru pTrc99A pomocou štepu Narl boli zvyšky za aminokyselinou 329 odstránené a pridalo sa 10 aminokyselín, ktoré nie sú normálne kódované lacl génom. Je známe, že mutácie alebo delécie prebiehajúce v C-terminálnej časti lacl, za
31320/11 aminokyselinou 329, poskytujú funkčné diméry, ktoré sa javia ako fenotypovo podobné štandardnému represoru (Pace a kol., TIS 22, 334 - 339,1997).
Počiatok replikácie (ori)
Počiatok replikácie (ori) tu popisovaného plazmidu je odvodený z vektoru pET-9a, ktorého ori pochádza z pBR322. Výhodný plazmid podľa predmetného vynálezu preto nesie pMB1 (ColEl) replikón. Plazmidy s týmto replikónom sú mnohokópiové plazmidy, ktoré sa replikujú „relaxovaným,, spôsobom. Minimálne 15-20 kópií plazmidu sa udržiava v každej bakteriálnej bunke za normálnych rastových podmienok. Bežný počet tu popisovaného plazmidu je v tomto rozmedzí. Replikácia počiatku replikácie ColEl - typu je iniciovaná 555 - nukleotidovým transkriptom RNA, RNAII, ktorý tvorí stabilný hydrid so svojím DNA templátom blízko ori. Hybrid RNAII - DNA je potom štiepený RNázou H v ori za vzniku voľného 3ΌΗ, ktorý slúži ako primér pre DNA polymerázu I. Táto iniciácia syntézy DNA je negatívne regulovaná RNA I, čo je 108 nukleotidová molekula RNA komplementárna k 5' koncu RNA II. Interakcia antisense RNA I s RNA II spôsobuje konformačnú zmenu RNA II, ktorá inhibuje väzbu RNA II k DNA templátu a následne bráni iniciácii syntézy plazmidovej DNA. Väzba medzi RNA I a II je zvýšená malým proteinom s veľkosťou 63 aminokyselín (Rop proteinom, Represor of primer), ktorý je kódovaný génom umiestneným 400 nukleotidov po smere transkripcie od začiatku replikácie (Sambrook a kol., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989). Delécia rop génu vedie k zvýšeniu počtu kópií a prostredníctvom zvýšenia množstva génu k zvýšeniu hladiny expresie heterológnych génov kódovaných plazmidom. Toto sa zistilo rovnako v prípade skúšaných expresných vektorov pre IL-4. Ale ukázalo sa, že rop-plazmidy sú nestabilné a pri fermentácii za neselektívnych podmienok dochádza k ich strate. Preto obsahuje replikón tu popisovaného plazmidu rep gén kvôli zaisteniu vysokej stability plazmidu. V popise predmetného vynálezu popisovanému plazmidu chýba mob gén, ktorý je nutný na mobilizáciu, a preto nie je schopný riadiť svoj vlastný konjugačný prenos z jednej baktérie do inej.
31389/H
Vo výhodnom vyhotovení podľa predmetného vynálezu sú z plazmidu odstránené všetky prvky, ktoré nie sú nevyhnutné na jeho replikáciu, rezistenciu a reguláciu expresie.
V súlade s rozsahom tohto vynálezu, pre konštrukciu expresného plazmidu podľa predmetného vynálezu nemusia byť použité všetky vyššie uvedené znaky. Napríklad gén pre prirodzený interleukín-4 alebo muteín interleukínu-4 sa môže použiť namiesto syntetického génu na optimalizované využitie kodónov v E. coli. Transkripčný terminátor je vo výhodnom vyhotovení Tŕ, ale rovnako možno použiť i ďalšie terminátory ako rrnB T2 alebo aspA. Podobne je možné použiť na konštrukciu výhodného plazmidu podľa predmetného vynálezu prvky z iných ako tu popísaných, komerčne dostupných vektorov.
Metódy použité počas vývoja expresného systému sú uvedené nižšie.
Materiály a metódy
Enzýmy
Reštrikčné endonukleázy, alkalická fosfatáza z teľacieho čreva, T4 polynukleotid kináza a T4 DNA ligáza boli získané od firmy Boehringer Mannheim a GIBCO-BRL a boli použité podľa odporučenia dodávateľa.
Metódy práce s rekombinantnou DNA
Štandardné klonovacie postupy boli popísané vSambrook a kol., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989). Transformácie boli vykonané podľa M. Scott (Seed and Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3365 - 3369, 1987). Kmene E. coli DH5alfa (GIBCO BRL) a W3110 (ATCC 27325) boli použité primárne ako hostiteľské bunky. Genotyp W3110 je K12, F' [N(rrnDmnE)lambda*.
Na izoláciu vo veľkom meradle sa použili špičky „Qiagen-tips„ (Qiagen). Extrakcia fragmentov DNA z agarózových gélov bola vykonaná s použitím Jetsorb (Genomed) podľa odporučenia dodávateľa.
31389/H
Oligonukleotidy pre riadenú mutagenézu, PCR reakcie a sekvenovanie pochádzali od MWG Biotech, Pharmacia Biotech alebo GIBCO BRL.
Experimenty zamerané na mutagenézu použili metódu Denga a Nickoloffa (Deng a Nickoloff, Anál. Biochem. 200, 81 - 88, 1992), používajúcu systém „Mutagenéza s elimináciou unikátneho miesta,, od Pharmacia Biotech. Primer používaný na znovuvytvorenie T7 g10 rbs má nasledujúcu sekvenciu: 5'TCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACATCTAGAAATAATTTTGTTTAA C TTTAAGAA3' (Sekv. 1).
Všetky konštrukty a sekvencie DNA boli potvrdené použitím sekvenovania terminačnou metódou s AmpliTaq DNA polymerázy, FS na ABI 373A sekvenátore (Applied Biosystéms).
Vynález je detailnejšie vysvetlený nasledujúcimi príkladmi, obrázka...: a informáciami o sekvenciách.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 až obr. 4
Konštrukcia tu popisovaného expresného plazmidu. (Skratky: IL-4 TM, trojitý muteín IL-4, IL-4 DM, dvojitý muteín IL-4).
Obr. 5
Plazmidová stabilita expresných vektorov muteínu IL-4 pRO21.1.0 a pRO.2.1.0. Vektor pRO2.1.0 zostáva celkom stabilný cez 78 generácií bez selekcie antibiotikami. Na rozdiel od tohto je expresný vektor pRO21.1.0, ktorý je založený na komerčne dostupnom plazmide pET-30a (Novagen), stret?·; veľmi rýchlo. Iba 16 % kolónií obsahuje plazmid po 78 generáciách bez kanamycínovej selekcie.
Obr. 6
Udržanie schopnosti indukcie a expresie tu popisovaného expresného vektoru IL-4 a muteínu IL-4.
31389/H
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Test stability plazmidu
Testy stability plazmidu boli vždy štartované kultúrou zmrazenou v tekutom dusíku. Po roztavení kultúry bola stanovená ODeoo a kultúra bola zriedená na W4 PBS pufrom a potom bola rozotretá na misky s LB médiom stuženým agarom bez antibiotika.
Pri vykonávaní tohto testu bol 1 ml roztavenej kultúry inokulovaný do 100 ml peptónového média (30 g sójového peptónu, 20 g kvasničného extraktu, 5 g KH2PO4, 20 g glycerolu, 1 mg MgSO4 x 7 H2O na liter, pH 7,0) a inkubovaný pri 37 °C za trepania 280 rpm po dobu 24 hodín.
Stanovila sa ODeoo narastenej kultúry, kultúra bola zriedená az ao koncentrácie 1(74 v PBS pufre a potom bola rozotrená na misky s LB médiom stuženým agarom bez antibiotika, aby sa získali dobre oddelené kolónie.
100 μΙ narastenej kultúry bolo inokulované do 100 ml peptónového média a inkubované pri 37 °C za trepania 280 rpm počas 24 hodín. Tento postup bol opakovaný osemkrát.
100 dobre oddelených kolónií z LB misiek bolo očkované na LB misky s kanamycínom (25 pg/ml) a LB misky bez kanamycínu a inkubované pri 37 °C po dobu cez noc. Percentuálne zastúpenie rezistentných kolónií sa určovalo každý deň.
Počty generácií za deň sa vypočítali podľa nasledujúceho vzorca: log [Οϋβοο END/OD600 BEG]/log 2.
Pre expresné Štúdie bol 1 ml narastenej kultúry zriedený 100-krát LB médiom a nakladalo sa s ním podľa popisu (pozri príklad 2).
31389/H
Príklad 2
Expresia
Pre expresiu interleukínu-4 a muteínu interleukínu-4 v malom meradle boli bunky kultivované vLB médiu (10 g Bacto tryptónu, 5 g kvasničného extraktu, 10 g NaCI na liter, pH 7,5), kým ODeoo nedosiahla 0,8 - 1,0. Expresia bola indukovaná prídavkom IPTG do finálnej koncentrácie 0,5 mM a inkubácia pokračovala počas 5 hodín. Bunky boli z média získané centrifugáciou.
Pre SDS-PAGE analýzu sa bunečné pelety resuspendovali vo vzorkovom pufre pre SDS-PAGE do koncentrácie 1 jednotka ODeoo/100 μΙ.
Sekvencie <110> BayerAG <120> PLAZMIDY, ICH KONŠTRUKCIA A ICH POUŽITIE PRI VÝROBE INTERLEUKÍNU-4 A MUTEÍNOV INTERĽEUKÍNU-4 <130> Plazmidy pre muteíny IL-4 <160>2 <170> Patent In Ver. 2.0 <210>1 <211>60 <212> DNA <213> neznámy <220>
<223> Popis neznámeho organizmu: primér <400>1 tcaattgtga gcggataaca atttcacaca tctagaaata atttgttta actttaagaa 60 <210>2 <211>4202
31389/H
| <212> | DNA |
| <213> | Neznámy |
<220>
| <223> | Popis neznámeho organizmu: Človek |
| <400> | 2 |
| ttagaaaaac | tcatcgacca | tcaaatgaaa | ctccaattta | ttcatatcag | cattaccaat | 60 |
| eccatatttt | tgaaaaagcc | ctttctctaa | tcaaggagaa | aacčcaccga | cgcagttcca | 120 |
| taggatggca | agatcctggt | atcgctctgc | catucccacc | cgtccaacat | caatacaacc | 180 |
| tactaatttc | ccctcgtcaa | aaataaggut | atcaagtcag | aaatcaccat | cagrgaccac | 240 |
| tcaatccggt | gacaatggca | aaaccttatg | catctctttc | cacacttgtt | caacacgcca | 300 |
| gccattacgc | tcgtcatcaa | aatcactccc | atcaaccaaa | cccttattca | ttcctgattg | 360 |
| cgcctgagcg | acacgaaata | cgcgatccc^ | gttaaaagga | caattacaaa | cacgaaccga | 420 |
| atgcaaccgg | cgcagcaaca | ctcccacccc | atcaacaata | tcttcacctg | aatcaccata | 480 |
| ttcttctaat | acctgcaatg | ctcttttccc | ggccatcgca | gtggtcagta | accatgcatc | 540 |
| atcaggagta | cggataaaat | gcttgatcgt | cgcaagaggc | ataaattccg | tcagccagtt | 600 |
| tagtctgacc | atctcatctc | taacatcatt | cccaacgcza | cctttgccat | ctttcagaaa | 660 |
| caactctggc | gcatccggct | tcccatacaa | tccatagatt | cccgcacctg | attgcccgac | 720 |
| attatcgcga | gcccatttat | acccatataa | atcagcatcc | atgttcgaat | ttaatcgcgg | 780 |
| cctcgaccaa | gacgtttccc | gtzgaataxg | gctcataaca | ccccttgtat | tsctg—a^ | 840 |
| ctaagcagac | agttttattg | tccatgacca | aaatccctta | acgtgacttt | tcgttccact | 900 |
| gagcctcaga | ccccgtagaa | aacatcaaag | gatcttcttg | agatcctttt | tttctccgcg | 960 |
| taatctgctc | cttgcaaaca | aaaaaaccac | cgctaccacc | ggtgctttgt | tcgcccgatc | 1020 |
| sagacctacc | aactcctctt | ccgaaggcaa | ccgccttcag | cagaccgcac | ataccaaata | 1080 |
| ccgtcctcct | agtgtagccc | tacxcacgcc | accacttcaa | caactctgtá | ccacccccza | 1140 |
| cacaccúcgc | tctgctaatc | czczcaccag | tgcccgctgc | cactgccgac | cagccgcgcc | 1200 |
| tcaccgggcc | gcacccaaga | cgazagttac | cgcacaagcc | ccaccggccg | cgctgaacgg | 1260 |
| ccggttcgcg | cacacacccc | accztccacc | gaacgaccca | caccgaactg | acacacc~ac | 1320 |
| accgtgagcc | atcacaaagc | cccacgcttc | ccgaacgcag | aaaggcgcac | agctatccgc | 1380 |
| taaccggcac | cgccggaaca | ccagagcgca | cgacggagct | Cccagggcga | aacgcczggc | 1440 |
31389/H
| atctttatag | tcctgtcggg | tttcgccacc | tctgacttga gcgtcgattt | ttgtgatgct | 1500 | |
| cgtcaggggg | gcggagccta | tggaaaaacg | ccagcaacgc | ggccttttta | cgqttcctgq | 1560 |
| ccttttgctg | gccttttgct | cacatgttct | ttcctgcctt | atcccctgat | tctgtggata | 1620 |
| accgtattac | cgcctttgag | tgagctgata | ccgczccccg | cagccgaacc | accgaGCGca | 1630 |
| gccagtcagt | gagcgaggaa | ccggaagagc | gcctgatccg | gtattttctc | cttacgcatc | 1740 |
| tctccggtat | ttcacaccgc | aatggtgcac | tctcagtaca | atctgctctg | atgccgcata | 1300 |
| gztaagccag | tatacactcc | gctatcgcta | cgtcactcgg | tcatgcctgc | gcccccacac | 18 60 |
| ccgccaacac | ccgctgacgc | cccctgacgg | gcztctctgc | tcccggcatc | cgcttacaga | 1920 |
| caagctgtca | ccgtctccgG | cagctgcatg | tctcacagat | tttcaccgcc | atcaccgaaa | 1960 |
| cgcgcgacca | agctgccgta | aagctcatca | ccgtggzcgt | caagcgattc | acagatgtct | 2040 |
| gcctgttcat | ccgcgtccag | ctcgttgagt | ttczccacaa | gcgttaatgz | ctgacttcza | 2100 |
| ataaagccga | ccatcttaag | cccggttttt | tcctgtttgg | tcactgatgc | ctccgtgcaa | 2160 |
| ccccgatttc | tgttcatgcg | ggtaatgata | ccgatcaaac | gagacagcat | gctcaccata | 2220 |
| cccgttaczg | ät^ätCccCc | tgcccggtta | ctgcaacgtt | ctgaggctaa | acaactgGCG | 2280 |
| gtatggatcc | ggcgcgacca | cacaaaaatc | aczcagcctc | aatgccagcg | ctcazgagcc | 2340 |
| cqaagtgqcg | agcccgatct | tccccatccg | tgatgzcccc | gatataggcg | ccagcaaccg | 2400 |
| cacctqtqcc | gccggtgatc | ccggccacga | tccgtcczgc | gtagaggacc | gagatccazť | 2460 |
| tacgttgaca | ccatcgaatg | ctgcaaaacc | ttzcccccta | tgccatgata | qcqcccqcaa | 2520 |
| cagagtcaat | tcacGgtgGt: | CcätlJ lCgSS | ccagzaacgt | tatacgatct | cqcacaczat | 2580 |
| gccqqtatct | cttatcagac | CGtttCGGGC | gtggtcaacc | accccaccca | CGtttCtGCG | 2640 |
| aaaacqcqqg | aaaaagtgga | agcggcgatg | Gcgcagctca | attacatucc | caaccGcc’c | 2700 |
| gcacaacaac | tGGcgcGcaa | acagtcgttg | CwCC ta ta<ta GG^ | ttcccacctc | caqzctqqcG | 2760 |
| czccacqcGG | cgtcgcaaat | tatcgcgccg | aztaaatctc | ccgccgatca | actqcgzqcc | 2820 |
| accctgGtgg | tgtcgatggt | gCgsC^cgCC | cgcgtzgaag | cczgtaaagc | gccgcuGcac | 2SS0 |
| aatcttctcg | cgcaacgcgt | cagtggcctg | gCCSZZččCt | atccGctgga | 2940 | |
| gccaZtgctg | tgcaacctGC | CCCCäCZcc* * | ctzczgccgt | tatttcttga | tgtctctgac | 3000 |
| cacacaccca | tcaacagtat | tatzttczcc | cazgaacacg | czacccgacz | cgccGiccaG | 3G60 |
| CatCtGGvCC | cattgggtca | ccagcaaatc | ccgcZgttag | cggccGaatz | aagttctgzc | 3120 |
| tCGCCGCGtC | tcczzczgcc | tgcczcccat | czcgcaazca | aatzcagccg | 31S0 | |
| ataccaGaäc | CCGČČCCCCČ | czgcaczgcc | azgzccggzt | zzcaacaaac | cäzccaaazg | 3240 |
| CZZcätCôCC | ccatccztcc | caczgccatg | CZ CCta“CCCe | GCCčtCHCs^ | GCCGCCGGGC | 33CC |
| cc==tcccag | ccatzaccga | CZCCGCCCZG | cgcczzggzc | cggazazczz | GGCaGtaGGCa | 3360 |
| tacgacgaza | ccgaacacaG | czcazczzat | aXCCCGCCGt | caaccaczaz | caaacacgaz | 3420 |
| tzzzgcctGG | tGcgcceaac | GSGCC^CGgC | CGCZZgczgc | aaczztctca | CGCCCaCGCG | 3430 |
| grcaaGGcca | atcagctgzt | gzczgtczca | czgczgaaaa | CggSggCCgC | cztccczcza | 3 = 40 |
| caaatcataa | GGGC-ttstL | tgctttctca | CCGGsCäcCô | cug“ggZg^ | äZZ'Zá&ZtZZ | 3600 |
| caccccataa | caatttcaca | catctagaaa | > * - tata * ·. · μ * LGG * . .S « U | 4· ta * ta ta ta ta * m taCäGtatata | ggCCgCsΪϊζ | 3660 |
| acatatgcac | aaatgcgata | zzaccczgca | ccaaazcazc | aaaaccctga | ô^taCCCtataSC | 3720 |
| ccaacagaaa | 2.CCCZCCCC3 | cccaaczgac | cgzzazcgac | azczzcgczg | czzccaaaaa | 37 SO |
| caccaccqaa | gcgCgcSCCZ | zczzczzzcc | 11—r·* a ,-^rwta· u -------------- | czgcctcacz | tczaczczza | 3840 |
| CC3CGBS&&& | CcCôCCC^“u | CCCtCGGtgC | taccgczcac | cacztacaco | czcacaaaca | 3900 |
| cctgatccGt | ttcczcaaac | czctgaaczg | taaczzzzgg | cczctacczz | Gzczcaacac | 3960 |
| CZCCCCGC“- | ÔGcCácCCZG | ACfiG L tofiC | cctzgaaaac | tzcctcgaaz | gzctgaaaac | 4020 |
| cazcatccac | CcSasSCcCu | Gzaaaúgczc | lZCZZgg*gs | cz&tzzzgzz | cczaacaaag | 4080 |
| CCCCgčgCCg | aGczzaqtzg | G GtaGG ta | C ta ta ‘ta ta G W C S | äZäsCCšCCH | taaczcczzg | 4140 |
| gccGctctaa tc | aCGGGCGttC | tcczzaaacg | aggaaczaza | tccggataaz | 4200 4202 |
31389/Η
Claims (4)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Operón na výrobu IL-4 a muteínov IL-4 v kmeni Escherichia coli, pozostávajúci z operatívne spojených elementov v smere 5' k 3': regulovateľný promótor pozostávajúci z promótora fága T5 E. coli a dvoch lac operátorových sekvencii, väzobného miesta pre ribozóm z bakteriofága T7g10 E. coli, iniciačného translačného kodónu, štruktúrneho génu pre IL-4 a muteín IL-4 a transkripčného terminátora za štruktúrnym génom.
- 2. E. co///pRO2.1.0.
- 3. Escherichia coli transformovaná jedným alebo viacerými plazmidmi nárokov 1 alebo 2.
- 4. Použitie plazmidov podľa nárokov 1 alebo 2 v metóde prípravy IL-4 a muteínov IL-4.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99100967A EP1022339B1 (en) | 1999-01-20 | 1999-01-20 | Plasmids, their construction and their use in the manufacture of interleukin-4 and interleukin-4 muteins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK762000A3 true SK762000A3 (en) | 2000-08-14 |
| SK285603B6 SK285603B6 (sk) | 2007-04-05 |
Family
ID=8237378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK76-2000A SK285603B6 (sk) | 1999-01-20 | 2000-01-19 | Vektor na výrobu IL-4 a muteínov IL-4 v kmeni Escherichia coli, vektor obsahujúci DNA sekvenciu, Escherichia coli transformovaná jedným alebo viacerými vektormi a použitie vektora |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6506590B1 (sk) |
| EP (1) | EP1022339B1 (sk) |
| JP (2) | JP2000210091A (sk) |
| KR (1) | KR100665148B1 (sk) |
| AT (1) | ATE334202T1 (sk) |
| AU (1) | AU772897B2 (sk) |
| CA (1) | CA2294575C (sk) |
| CZ (1) | CZ294279B6 (sk) |
| DE (1) | DE69929638T2 (sk) |
| DK (1) | DK1022337T3 (sk) |
| ES (1) | ES2269027T3 (sk) |
| HU (1) | HU224491B1 (sk) |
| NO (1) | NO327317B1 (sk) |
| PT (1) | PT1022337E (sk) |
| SK (1) | SK285603B6 (sk) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10022258A1 (de) | 2000-05-08 | 2001-11-15 | Bayer Ag | Reinigung von Proteineinschlusskörpern durch Querstrom-Mikrofiltration |
| KR100443570B1 (ko) * | 2001-07-31 | 2004-08-09 | 크레아젠 주식회사 | 재조합 인간 인터루킨-4의 제조방법 |
| EP1314739A1 (en) | 2001-11-22 | 2003-05-28 | Bayer Ag | Process for renaturation of recombinant, disulfide containing proteins at high protein concentrations in the presence of amines |
| JP2006055082A (ja) * | 2004-08-20 | 2006-03-02 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 発光甲虫由来赤色発光酵素安定体の生産及び精製法 |
| CN118440969B (zh) * | 2024-07-08 | 2024-10-15 | 天津凯莱英生物科技有限公司 | 可溶性表达质粒突变体库的构建方法及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4689406A (en) * | 1983-08-10 | 1987-08-25 | Amgen | Enhancement of microbial expression of polypeptides |
| HUT43625A (en) * | 1986-03-27 | 1987-11-30 | Monsanto Co | Process for increasing yield of proteins with applying new ribosomal binding positions in bacteria |
| EP0303925B1 (de) * | 1987-08-17 | 1995-06-07 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Hochreprimierbare Expressionskontrollsequenzen |
| FR2724665B1 (fr) * | 1994-09-16 | 1996-12-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de production de proteines recombinantes, plasmides et cellules modifiees |
| MY124565A (en) * | 1996-07-19 | 2006-06-30 | Bayer Corp | High-affinity interleukin-4-muteins |
-
1999
- 1999-01-20 DE DE69929638T patent/DE69929638T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-20 EP EP99100967A patent/EP1022339B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-01-07 ES ES00100129T patent/ES2269027T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-07 PT PT00100129T patent/PT1022337E/pt unknown
- 2000-01-07 AT AT00100129T patent/ATE334202T1/de active
- 2000-01-07 DK DK00100129T patent/DK1022337T3/da active
- 2000-01-14 JP JP2000006477A patent/JP2000210091A/ja active Pending
- 2000-01-14 US US09/483,419 patent/US6506590B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-17 CA CA002294575A patent/CA2294575C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-19 CZ CZ2000214A patent/CZ294279B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 KR KR1020000002310A patent/KR100665148B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-19 SK SK76-2000A patent/SK285603B6/sk unknown
- 2000-01-19 NO NO20000262A patent/NO327317B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-01-20 HU HU0000185A patent/HU224491B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-01-20 AU AU12507/00A patent/AU772897B2/en not_active Ceased
-
2010
- 2010-08-27 JP JP2010190917A patent/JP2010284174A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SK285603B6 (sk) | 2007-04-05 |
| DE69929638D1 (de) | 2006-04-13 |
| KR100665148B1 (ko) | 2007-01-09 |
| EP1022339B1 (en) | 2006-02-01 |
| JP2000210091A (ja) | 2000-08-02 |
| CA2294575A1 (en) | 2000-07-20 |
| AU772897B2 (en) | 2004-05-13 |
| AU1250700A (en) | 2000-07-27 |
| PT1022337E (pt) | 2006-11-30 |
| CZ2000214A3 (cs) | 2000-08-16 |
| ATE334202T1 (de) | 2006-08-15 |
| DE69929638T2 (de) | 2006-09-21 |
| ES2269027T3 (es) | 2007-04-01 |
| KR20000053523A (ko) | 2000-08-25 |
| NO20000262D0 (no) | 2000-01-19 |
| HUP0000185A2 (en) | 2002-09-28 |
| NO20000262L (no) | 2000-07-21 |
| JP2010284174A (ja) | 2010-12-24 |
| EP1022339A1 (en) | 2000-07-26 |
| NO327317B1 (no) | 2009-06-08 |
| HU224491B1 (hu) | 2005-09-28 |
| HU0000185D0 (en) | 2000-04-28 |
| DK1022337T3 (da) | 2006-11-06 |
| CA2294575C (en) | 2009-04-07 |
| US6506590B1 (en) | 2003-01-14 |
| CZ294279B6 (cs) | 2004-11-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6291245B1 (en) | Host-vector system | |
| ZA200404737B (en) | Nano-composite martensitic steels | |
| EP0972838A1 (en) | Escherichia coli host/vector system based on antibiotic-free selection by complementation of an auxotrophy | |
| Horazdovsky et al. | Genetic reconstitution of the high-affinity L-arabinose transport system | |
| JP2010284174A (ja) | プラスミド、それらの構築およびそれらのインターロイキン−４およびインターロイキン−４ムテインの製造における使用 | |
| MXPA04005717A (es) | Sistema de expresion. | |
| KR20010094652A (ko) | 인체 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자를 분비하는 대장균 | |
| TW201738263A (zh) | 一種重組人粒細胞集落刺激因子的製備方法 | |
| US5654169A (en) | Vectors and transformed host cells for recombinant protein production at reduced temperatures | |
| EP1022337B1 (en) | Plasmids, their construction and their use in the manufacture of interleukin-4 and interleukin-4 muteins | |
| EP2109671B1 (en) | Expression cassette, use of the expression cassette, vector, host cell, a method for producing a polypeptide | |
| US20070134217A1 (en) | Plasmids, their derivatives and fragments, their methods of manufacture and application | |
| EP0121569B1 (en) | Novel vector | |
| JPH0335795A (ja) | ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチドの製造法 | |
| EP0105554A1 (en) | DNA and plasmids | |
| EP1461437B1 (en) | Expression vectors and promoters for heterologous gene expression | |
| CN116003570B (zh) | 热稳定性提高的重组hLIF突变体及其制备方法和应用 | |
| KR20190026426A (ko) | 코돈 최적화된 il-21 및 이의 용도 | |
| WO2006097945A2 (en) | A method for achieving high-level expression of recombinant human interleukin-2 upon destabilization of the rna secondary structure | |
| KR100985746B1 (ko) | ｎａｒＫ 프로모터 또는 돌연변이된 ｎａｒＫ 프로모터를포함하는 발현벡터 및 이를 이용한 목적단백질의대량생산방법 | |
| JP2003250543A (ja) | 融合遺伝子の調製方法 |