SU1137760A1 - Урокиназа,иммобилизованна на гепарине - Google Patents
Урокиназа,иммобилизованна на гепарине Download PDFInfo
- Publication number
- SU1137760A1 SU1137760A1 SU823551782A SU3551782A SU1137760A1 SU 1137760 A1 SU1137760 A1 SU 1137760A1 SU 823551782 A SU823551782 A SU 823551782A SU 3551782 A SU3551782 A SU 3551782A SU 1137760 A1 SU1137760 A1 SU 1137760A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- urokinase
- heparin
- activity
- enzyme
- immobilized
- Prior art date
Links
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 title claims abstract description 43
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 title claims abstract description 43
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 title claims abstract description 43
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims abstract description 34
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims abstract description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 4
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- FIGKGJVUYAFLBI-VIFPVBQESA-N methyl (2s)-2-[(2-acetamidoacetyl)amino]-6-aminohexanoate Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)OC)NC(=O)CNC(C)=O FIGKGJVUYAFLBI-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002446 thrombocytic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
УРОКИНАЗА,ИШОВИПИЗОВАННАЯ НА ГЕПАРИНЕ, общей формулы ОС-Ш-Ур -, -о он HOgS-O Ш-50зН п где NH - YP - урокиназа, п 27-46, обладакнца пролонгированной тромболитической активностью и антикоагулирующим действием и характеризующа с следующими параметрами: Молекул рна масса 70000+9000 Содержание белка 20-30 масД Сохран ема каталитическа актив70-90% ность . (от исходной) Специфическа I 150000-200000 активность Ш урокиназы (Л lOOOiU гепарина,
Description
Изобретение относитс к биооргани ческой химии а именно к синтезу биологически активных химических соеди нений, обладающих тромболитической и анчНпсоагулирующей активностью, Предлагаемые соединени представл ют собой продзпст св зьшани урокин зы с гепарином. Урокиназа, вл сь активатором плазминоген в организме примен етс как тромболитический агент. Гепарин представл ет собой антикоагулирующее средство. Обычно вс тромболитическа терапи ведетс гепаринизации. Известны производные урокиназы, представл ющие собой комплекс урокиназы с гепарином, основанные на их электростатическом взаимодействии, которые получают инкубацией фермента с гепарином 1. В смес х гепарина и урокиназы образуютс наибольшие количества производных, представл ющих собой урокиназу, электростатически св занную с гепарином. Получаемые таким способом производные представл ют собой урокиназу, электрически св занную с гепарином. Однако стабильность этих производных оказьшаетс сильно зависимой от величии ионной силы и рН раствора , что вл етс преп тствием дл их использовани в терапии. Соотношение активностей компонентов такого комплекса составл ет 30000-100000 IU урокиназы на 100 IU гепарина. Количество гепарина в комплексе (100 IU) недостаточно дл про влени значимого эффекта антикоагул нта в организме. Увеличение дозы препарата гепарината урокиназы приводит к тому, что нар ду с увеличением количества гепарина (и следовательно , антикоагулирующей активности ) увеличиваетс и количество св занной с ним урокиназы. Избыток тромболитика вызывает подавление системы свертывани крови. Таким образом, данный комплекс урокиназы с гепарином не характеризуетс сбалансированным соотношением его компонентов, пролонгированной и повышенной тромболитической активностью . Целью изобретени вл етс получение нового препарата - иммобилизог ванной урокиназы, обладакщей тромболитической активностью и антикоагулирук цим действием. Цель изобретени достигаетс за счет свойств иммобилизованной урокиназы общей формулы 0 C-KlH-Yp где NH-YP - урокиназа, п 27-46, характеризующейс следующими параметрами; Молекул рна масса 70000+9000 Содержание белка 20-30 мас.% Сохран ема каталитическа актив70-90% (от ность исходной) Специфическа 150000-200000 активность IU урокиназы/ 100 IU гепарина (9,3-9,94) 25-29 с-1 7,3-8,5 рН-оптимум и получаемой Св зьшанием урокиназы с гепарином в слабощелочной среде при температуре от О до 25°С в течение 2-20 ч. Значени п, как и в молекуле гепарина, составл ет 27-46. Способ осуществл ют следующим образом. В 0,01-0,1 М фосфатном буфере рН ,5 раствор ют гепарин, к которому затем осторожно добавл ют избыток карбодиимида. Смесь инкубируют в течение получаса на холоду, а затем к ней добавл ют раствор урокиназы и провод т инкубацию еще в течение 2-20 ч при температуре от 4 до 25°С. После этого полученное производное подвергают очистке диализом в течение 6 ч против дистиллированной во- ды и лиофидизируют. Св зьшание урокиназы с гепарином происходит через стадию карбодиимидной активации карбоксильных групп гепарина с последующим взаимодействием с аминогруппами фермента (схема 1).
0 C-0-C-MHRi
0мн
1I
НОзЗ ЗОзН
Полученный продукт представл ет собой урокиназу, ковалентно св занную с гепарином. Синтезированные производные водорастворимы, что весьма удобно ,дл их повседневного клинического использовани . На фоне гепарина заметно эффективнее действует фермент-тромболитик. Модификци урокиназы существенно не мен ет ее кинетических свойств, не измен етс и термостабнльность, зато тромболитическоё действие приобретает пролонгированный характер. Остаточна каталитическа активность производного урокиназы в физиологических услови х составл ет 70-90% от первоначальной активности нативного фермента
Таким образом, преимуществами описываемого препарата следует считать: возрастание тромбойитической активности предлагаемых соединений (в 1,5 раза), придание ей пролонгированного характера, а также по вл
ление у них новых свойств - привитой антикоагулирующей активности. В результате дл медицинской практики предлагаетс новое вещество препарат комплесного пролонгированного действи на ферментной основе. I
Увеличение молекул рной массы
синтезированного препарата способствует увеличению срока его действи в кровотоке.
Пример 1.В4мл 0,05 М фосфатного буфера рН 8,3 раствор ют 8 мг гепарина, к которому осторожно добавл ют на холоду (А°С) 5 мг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида и смесь инкубируют при перемешивании в течение 30 мин. Затем к инкубационной смеси добавл ют 1 МП раствора урокиназы 50.000 IU/мл инкубацию продолжают при 4°С в тёейие 16 ч. После этого раствор диализуют против дистиллированной воды течение 6. ч и лиофилизируют. В результате осуществлени реакции св зы вани с гепарином взаимодействует 90% белка от его исходного количества (п данным гельфильтрации на сефадексе Г-100), при этом фермент сохран ет 90% эстеразной активности от первоначальной. По термостабнльности полученное производное весьма близко к нативному ферменту, известному своей термостойкостью. Специфическа активность полученного производ ного 45000 IU/мл, содержание белка 30 мас.%. Пример 2. Процесс осуществл ют также, как и в примере 1, за исключением того, что реакцию св зывани урокиназы с гепарином провод т в 0,1 М фосфатном буфере рН 8,0. С гепарином св зьтаетс 80% исход ного белка, при этом фермент сохран ет 78% эстефазной активности, и по термостабильности не уступает нативной урокиназе. Специфическа активность полученного производного 39000 IU/мл, содержание белка по весу 26%. Пример 3. Процесс осуществл ют так же, как в примере 1, за исключением того, что реакцию св зывани урокиназы с гепарином провод т в 0,01 М фосфатном буфере рН 8,5. С носителем св зываетс 85% исход ного белка при сохранении 75% исходной эстеразной активности. Специфическа активность 37000 IU/мл,.содер жание белка по весу 24%. Пример 4. Процесс провод т так же, как и в примере 1, за искхпочением того, что реакцию св зьтани урокиназы с гепарином осуществл ют в 0,01 М фосфатном буфере рН 8,3 при 25°С в течение 2 ч. В реакцию св зывани вступает 85% белка от исходного , сохран ема каталитическа эстеразна активность ферментного производного 75%. Кинетические свойства препарата, его термостабильност близки тем, что и в примере 1. Специ фическа активность 38000 IU/мл, содержание белка по весу 25%. Таким образом, из приведенных при меров следует, что количество св зан ного с гепарином фермента мен етс в зависимости от рН инкубации. Диапа зон рН 8,0-8,5 вл етс оптимальным дл протекани двух реакций: активации карбоксильных групп гепарина карбодиимидом и взаимодействи их с аминогруппами урокиназы. Именно полученные при таких значени х рН | ферментные производные (примеры 1-4) обладают наилучшими свойствами. Так, реакци каталитического гидролиза нативной урокиназой метилового эфира ацетилглициллизина осуществл етс по схеме активации хода реакции ее субстратом (схема 2). Ч ES - Е + Р , к; 4 i-A SE + Р Продукты примеров 1-4 осуществл ют катализ этой реакции по той же схеме. При этом модификаци урокиназы гепарином существенно не мен ет кинетические свойства урокиназы.. В табл. 1 приведены кинетические параметры реакции гидролиза метилового эфира ацетилглициллизина нативной и модифицированной урокиназой при 25°С 0,1 М КС и рН 7,8 (оптимум эстеразной активности). Таким образом, каталитические свойства модифицированной урокиназы, изученные на реакции гидролиза метилового эфира ацетилглициллизина, вполне сравнимы с каталитическими свойствами нативной урокиназы. Тромболитическую активность нативной и модифицированной урокиназы определ ли по известной методикеC2j. с добавлением в раствор буфера 0,33 мг/мл плаэминогена человека. Препараты нативной и модифицированной урокиназы используют в соотношении , обеспечивающем .одинаковую оптическуй плотность при 280 нм. Результаты экспериментов приведены в табл. 2 (рН 7,4, комн.температура). tg d представл ет собой отношение прироста оптической плотности раствора (в результате деструкции при тромболизисе нерастворимого фибринового сгустка и перехода его фрагментов в раствор) к величине промежутка времени, за который оно произошло , и характеризует скорость процесса тромболизиса. Представленные в табл. 2 данные показьшают, что в результате модификации урокиназы гепарином тромболитическа активность полученного фер
Claims (1)
- УРОКИНАЗА,ИММОБИЛИЗОВАННАЯ НА ГЕПАРИНЕ, общей формулы где NH - Yp - урокиназа, η = 27-46, обладающая пролонгированной тромболитической активностью и антикоагулирующим действием и характеризующаяся следующими параметрами:Молекулярная масса Содержание белка Сохраняемая каталитическая активностьСпецифическая активность ;КШ рН-оптимум70000+900020-30 мас,%70-90% (от исходной) 150000-200000 §1U урокиназы 1000ϊυ гепарина, (9,3-9,94)х *10'4М 25-29 с4 7,3-8,51 1137760 2Цель изобретения достигается за счет свойств иммобилизованной урокиназы общей формулы
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU823551782A SU1137760A1 (ru) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | Урокиназа,иммобилизованна на гепарине |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU823551782A SU1137760A1 (ru) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | Урокиназа,иммобилизованна на гепарине |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1137760A1 true SU1137760A1 (ru) | 1985-09-07 |
Family
ID=21049460
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU823551782A SU1137760A1 (ru) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | Урокиназа,иммобилизованна на гепарине |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SU (1) | SU1137760A1 (ru) |
-
1982
- 1982-12-27 SU SU823551782A patent/SU1137760A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. Патент US № 4106992, кл. 195-66 В, 1978. 2. Авторское свидетельство СССР № 824053, кл. G 01 N 33/86, 1979. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5969040A (en) | Factor IX -- polymeric conjugates | |
| Marshall | Manipulation of the properties of enzymes by covalent attachment of carbohydrate | |
| US4495285A (en) | Plasminogen activator derivatives | |
| EP1258497B1 (en) | Method to prepare conjugates of factor VIII and a biocompatible polymer | |
| EP0200467B1 (en) | Superoxide dismutase combined with a poly(alkylene oxide) | |
| US5705153A (en) | Glycolipid enzyme-polymer conjugates | |
| CA1217718A (en) | Plasminogen activator derivatives | |
| US4301153A (en) | Heparin preparation | |
| Torchilin | Immobilized enzymes in medicine | |
| US5308617A (en) | Protein heparin conjugates | |
| EP0187658A2 (en) | Method and use for site-specific activation of substances | |
| CA1337796C (en) | Plasminogen activator-heparin conjugates | |
| JP2001502534A (ja) | アンジオスタチン生成のための方法及び組成物 | |
| Maksimenko et al. | Water-soluble urokinase derivatives with increased affinity to the fibrin clot | |
| JPH0751064B2 (ja) | 新規なヒアルロニダ−ゼｓｄ−６７８およびその製造法 | |
| SU1022988A1 (ru) | Стабилизированна урокиназа,обладающа тромболитической активностью,и способ ее получени | |
| US4564596A (en) | Urokinase derivatives covalently bound to fibrinogen | |
| Maksimenko et al. | Water-soluble urokinase derivatives of combined action | |
| CA1336585C (en) | Method of stabilizing urokinase precursor and dry preparation containing said precursor | |
| US4144131A (en) | Immobilization of enzymes on human tissue or erythrocytes | |
| JP2002533473A (ja) | 微生物起源のヒアルロン酸分解酵素を含有する薬学的配合物 | |
| JPS6360938A (ja) | 修飾組織型プラスミノ−ゲン活性化因子およびその製造方法 | |
| JPH0853364A (ja) | 注射用血栓溶解剤 | |
| JPS59118717A (ja) | プラスミノーゲン活性化剤 | |
| EP0151996A2 (en) | Process for the Preparation of a double-chain plasminogen activator |